特許 6862355 低酸素シグナリング遺伝子を阻害するためにＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を標的とする方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6862355

(24)【登録日】2021年4月2日

(45)【発行日】2021年4月21日

(54)【発明の名称】低酸素シグナリング遺伝子を阻害するためにＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を標的とする方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/192 20060101AFI20210412BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20210412BHJP

   A61K 31/18 20060101ALI20210412BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210412BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210412BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/192

   A61K45/00

   A61K31/18

   A61P35/00

   A61P43/00 111

   A61P43/00 121

【請求項の数】4

【全頁数】31

(21)【出願番号】特願2017-559690(P2017-559690)

(86)(22)【出願日】2016年5月5日

(65)【公表番号】特表2018-515546(P2018-515546A)

(43)【公表日】2018年6月14日

(86)【国際出願番号】US2016030904

(87)【国際公開番号】WO2016186853

(87)【国際公開日】20161124

【審査請求日】2019年4月16日

(31)【優先権主張番号】62/164,795

(32)【優先日】2015年5月21日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/307,000

(32)【優先日】2016年3月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507277642

【氏名又は名称】インディアナ ユニバーシティー リサーチ アンド テクノロジー コーポレーション

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＩＡＮＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ

(74)【代理人】

【識別番号】100106002

【弁理士】

【氏名又は名称】正林 真之

(74)【代理人】

【識別番号】100120891

【弁理士】

【氏名又は名称】林 一好

(72)【発明者】

【氏名】ケリー マーク アール．

(72)【発明者】

【氏名】フィッシェル メリッサ

【審査官】 鳥居 福代

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５４０５４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１３−５３２１５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０２６８１８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Cancer Research [online]，２０１２年 ４月，Vol.72, Issue 8 Supplement，Abstract 1769，[2020年3月2日検索], インターネット＜ＵＲＬ：https://cancerres.aacrjournals.org/content/72/8_Supplement/1769＞

【文献】 PLOS ONE，２０１２年，Vol.7, Issue 10，e47462(13pages)

【文献】 Molecular Cancer Research，２０１５年 ４月 １日，Vol.13, No.7，pp.1149-1160

【文献】 Molecular Cancer Therapeutics，２０１１年，Vol.10, No.9，pp.1698-1708

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ４５／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）を阻害する必要がある対象において、ＭＰＮＳＴを阻害するための医薬組成物であって、
Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する有効量の３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル−１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸、薬学的に許容されるその塩または薬学的に許容されるその溶媒和物を含む医薬組成物。

【請求項2】

少なくとも１つの追加治療剤をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記少なくとも１つの追加治療剤が、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の阻害剤、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）の阻害剤、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）の阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記少なくとも１つの追加治療剤が、ＳＬＣ−０１１１、ＦＣ１３−５５５Ａ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）阻害剤である、請求項２に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０１６年３月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／３０７，０００号および２０１５年５月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／１６４，７９５号に基づく優先権を主張し、前記特許出願のそれぞれは参照によりそのまま本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、概して、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１／酸化還元エフェクター因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１；ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｎｉｃ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ １／ｒｅｄｏｘ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆａｃｔｏｒ １）を標的とする方法を対象とする。より具体的には、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を阻害することにより、低酸素媒介シグナリングが阻害され、それによって、低酸素状態に曝露された腫瘍細胞の生存および浸潤を減少させる。一特定実施形態において、本開示は、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の阻害剤と炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ（ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ）９）の阻害剤との組み合わせを投与する方法を対象とする。

【背景技術】

【0003】

膵管腺癌（ＰＤＡＣ（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｄｕｃｔａｌ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ））と診断された全患者の半数は、その疾患により、１年以内に死亡する。化学治療による処置は、この疾患の自然経過を変化させなかった。低酸素への適応を含むいくつかの機序が、ＰＤＡＣの侵襲性・処置抵抗性表現型に関与すると提唱されている。この低酸素への適応は、転移能の増加につながり、化学治療および放射線治療の効力を損なう。細胞中の酸素の主要センサーの一つは、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ（Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｆａｃｔｏｒ）−１α）であり、これは、正常酸素条件下では迅速に分解されるが、低酸素条件下では、腫瘍微小環境における生存、転移、および血管新生シグナリングに寄与するいくつかの遺伝子をアップレギュレートする転写因子である。最も注目に値するＨＩＦ標的の一つは、微小環境を酸性化し、それによって上皮間葉転換を促し、細胞外マトリックス分解に寄与しつつ、定常的な細胞内ｐＨを維持することにより、腫瘍細胞の生存および転移を促進する、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）である

【0004】

脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１／酸化還元エフェクター因子（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）は、塩基除去修復におけるＤＮＡ修復機能、および転写因子を還元してそれらがそれぞれのＤＮＡ標的配列に結合することを可能にする能力を有する、多機能タンパク質である。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１は、アポトーシスの防止、生存機序、および低酸素シグナリングに関与する、ＨＩＦ−１αを含むいくつかの転写因子を制御する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

上記に基づいて、本開示は、ＡＰＥ−１／Ｒｅｆ−１を妨害することで、さらにＨＩＦ−１α媒介シグナリングを妨害し、よって低酸素状態に曝露された腫瘍細胞の生存および浸潤の減少をもたらすことを対象とする。

【0006】

本開示は、概して、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１／酸化還元エフェクター因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）を標的とする方法を対象とする。より具体的には、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を阻害することにより、低酸素媒介シグナリングが阻害され、それによって、低酸素状態に曝露された腫瘍細胞の生存および浸潤を減少させる。

【0007】

したがって、一態様において、本開示は、低酸素シグナリング遺伝子を阻害する必要がある対象において、低酸素シグナリング遺伝子を阻害するための方法を対象とする。本方法は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する有効量の３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル−１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸、薬学的に許容されるその塩または薬学的に許容されるその溶媒和物を、対象に投与する工程を含む。

【0008】

別の一態様において、本開示は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を阻害する必要がある対象において、ＰＤＡＣを阻害するための方法を対象とする。本方法は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する有効量の３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル−１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸、薬学的に許容されるその塩または薬学的に許容されるその溶媒和物を、対象に投与する工程を含む。

【0009】

さらに別の一態様において、本開示は、がん細胞の成長を阻害する必要がある対象において、がん細胞の成長を阻害するための方法を対象とする。本方法は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する有効量の３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル−１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸、薬学的に許容されるその塩または薬学的に許容されるその溶媒和物を、対象に投与する工程、および少なくとも１つの追加治療剤を対象に投与する工程を含む。一特定実施形態において、対象は膵管腺癌（ＰＤＡＣ）を有する。別の一実施形態において、対象は、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｎｅｒｖｅ ｓｈｅａｔｈ ｔｕｍｏｒｓ））（シュワン腫または肉腫とも呼ばれ、神経線維肉腫の一形態（ＮＦ１）に関連しうる）を有する。

【0010】

さらに別の一態様において、本開示は、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）を阻害する必要がある対象において、ＭＰＮＳＴを阻害するための方法を対象とする。本方法は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能を選択的に阻害する有効量の３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル−１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸、薬学的に許容されるその塩または薬学的に許容されるその溶媒和物を、対象に投与する工程を含む。

【0011】

本開示は、本開示の以下の詳細な説明を検討すれば、よりよく理解され、上述したもの以外の特徴、態様および利点が明らかになるであろう。そのような詳細な説明では以下の図面を参照する。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】実施例１において調製されたＨＩＦ−１ −／− ＭＥＦ生成におけるＨＩＦの欠失を表す図である。Ａｄ−ＣＭＶ−Ｃｒｅ（Ｃｒｅアデノウイルス）ベクターまたはＡｄ−ＧＦＰ（対照）ベクターのどちらか一方が形質導入されたＨＩＦ−１−ｆｌｏｘマウス胚性線維芽（ＭＥＦ（ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ））細胞から収集されたＤＮＡを使って、２−ｌｏｘＰ／１−ｌｏｘＰ ＰＣＲを行った。

【図2】図２Ａ〜２Ｄは、細胞株におけるＨＩＦ１α、ＳＴＡＴ３、およびＮＦκＢの存在、ならびに実施例１において分析された低酸素条件下での、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の、ＳＴＡＴ３およびＨＩＦ１αとの相互作用を表す図である。具体的には、ＰＤＡＣ細胞において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の、ＨＩＦ１αおよびＳＴＡＴ３との相互作用は、低酸素によって刺激される。Ｐａｎｃ１０．０５細胞（図２Ａ）およびＰａ０３Ｃ細胞（図２Ｂ）を、正常条件下または低酸素（０．２％酸素）条件下で２４時間インキュベートした後、内因性に発現したＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の収集および免疫沈降を行った。ｗｔ−ＡＰＥ／Ｌｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＧＦＰを使ってＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を過剰発現する安定細胞株を生成させて、それらをＬｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＧＦＰ、「ベクター」（図２Ｃ：１０．０５；図２Ｄ：Ｐａ０３Ｃ）と比較し、０．２％酸素への２４時間の曝露後にＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１免疫沈降を行った。ＨＩＦ１α抗体、ＳＴＡＴ３抗体、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１抗体、ＮＦκＢ抗体、およびＳＴＡＴ１抗体によるＩＰのウェスタン分析を行った。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、正常酸素条件下でＴＮＦαまたはＩＬ−６によって処理された細胞におけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１と転写因子との間の相互作用を表す図である。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を過剰発現する安定Ｐａｎｃ１０．０５細胞株（ｗｔ−ＡＰＥ／Ｌｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＧＦＰ対Ｌｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＧＦＰ、「ベクター」）を、表示の時間にわたってＩＬ−６（図３Ａ）またはＴＮＦα（図３Ｂ）に曝露し、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を免疫沈降させた。ＳＴＡＴ３抗体、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１抗体、およびＮＦκＢ抗体によるＩＰのウェスタン分析を行った。

【図4】図４Ａ〜４Ｃは、がん関連線維芽（ＣＡＦ（Ｃａｎｃｅｒ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ））細胞においてＨＩＦ１αおよびＳＴＡＴ３とのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の相互作用が、低酸素によって刺激されることを示す図である。具体的には、ＵＨ１３０３−０２ ｈＴＥＲＴ（ＣＡＦ）細胞を正常酸素下または低酸素（０．２％酸素）下で２４時間インキュベートしてから、内因性に発現したＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の収集および免疫沈降を行った（図４Ａ）。ｗｔ−ＡＰＥ／Ｌｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＧＦＰを使ってＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を過剰発現する安定細胞株を生成させ（対Ｌｅｎｔｉ−ＣＭＶ−ＧＦＰ、「ベクター」）（図４Ｂおよび図４Ｃ）、正常酸素中（図４Ｂ）または０．２％酸素中（図４Ｃ）での２４時間のインキュベーション後に、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１免疫沈降を行った。ＨＩＦ１α抗体、ＳＴＡＴ３抗体、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１抗体、およびＮＦκＢ抗体によるＩＰのウェスタン分析を行った。

【図5A】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。具体的には、ＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞を、スクランブル（ＳＣ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ））ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡと共に、ＨＩＦ１α駆動ルシフェラーゼおよびレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）リポーターコンストラクトで同時トランスフェクトした。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のノックダウンをウェスタンブロットによって確認した。

【図5B】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。具体的には、ＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞を、スクランブル（ＳＣ（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ））ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡと共に、ＨＩＦ１α駆動ルシフェラーゼおよびレニラリポーターコンストラクトで同時トランスフェクトした。トランスフェクションの３〜４日後、低酸素状態（０．２％酸素、対正常酸素対照）における２４時間後に、ＨＩＦ１α駆動ルシフェラーゼ発現を評価した。^＊ｐ＜０．００１（テューキーの多重比較検定）。

【図5C】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。ＳＣ ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび表示のとおりの低酸素状態における２４時間後に収集した試料を使って、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、記載の細胞株において、ｑＰＣＲによって評価した。＃ｐ＜０．００１（ＡＮＣＯＶＡ）。

【図5D】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。ＳＣ ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび表示のとおりの低酸素状態における２４時間後に収集した試料を使って、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、記載の細胞株において、ｑＰＣＲによって評価した。^＊＊ｐ＜０．０１（ＡＮＣＯＶＡ）。

【図5E】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。ＳＣ ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび表示のとおりの低酸素状態における２４時間後に収集した試料を使って、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、記載の細胞株において、ｑＰＣＲによって評価した。＃ｐ＜０．００１（ＡＮＣＯＶＡ）。

【図5F】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。３つの異なるｓｉＲＮＡによるＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞におけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンをウェスタンブロットによって確認した。

【図5G】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。低酸素状態（０．２％酸素、対正常酸素対照）における２４時間後に、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、ＳＣ試料および３つのｓｉＲＮＡのすべてからのノックダウン試料において、ｑＰＣＲによって評価した（図５Ｇ−ｎ＝３の代表的実験）。^＊ｐ＜０．００１（テューキーの多重比較検定）。

【図5H】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。ＳＣ ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび１％酸素における２４時間のインキュベーション後に、ＣＡ９タンパク質レベルを、１０．０５細胞において、ウェスタンブロットによって評価した。ＣＡ９ウェスタンブロットについては、低酸素下では、ｓｉＡＰＥに対して、ＳＣについてｐ＜０．０５（テューキーの多重比較検定）。

【図5I】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現が、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与することを示す図である。ＳＣ ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび１％酸素における２４時間のインキュベーション後に、ＣＡ９タンパク質レベルを、ＣＡＦ１９細胞において、ウェスタンブロットによって評価した（図５Ｈ〜５Ｉ）。ＣＡ９ウェスタンブロットについては、低酸素下では、ｓｉＡＰＥに対して、ＳＣについてｐ＜０．０５（テューキーの多重比較検定）。

【図6A】さらなるＰＤＡＣ細胞株において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現がＣＡ９ ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすことを示す図である。具体的には、ＳＣ ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび表示のとおりの低酸素状態における２４時間後に収集した試料を使って、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、Ｐａｎｃ１０．０５細胞において、ｑＰＣＲによって評価した。＃ｐ＜０．００１（ＡＮＣＯＶＡ）。

【図6B】さらなるＰＤＡＣ細胞株において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現がＣＡ９ ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすことを示す図である。具体的には、ＳＣ ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡのトランスフェクションおよび表示のとおりの低酸素状態における２４時間後に収集した試料を使って、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、Ｐａ０２Ｃ（図６Ｂ）細胞において、ｑＰＣＲによって評価した。^＊＊ｐ＜０．０１および^＃ｐ＜０．００１（ＡＮＣＯＶＡ）。

【図7A】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元シグナリングがＨＩＦ−１依存的にＣＡ９転写に影響を及ぼすことを示す図である。具体的には、ＨＩＦ−１非欠損（＋／＋）およびＨＩＦ−１欠損（−／−）マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）を０．２％酸素に２４時間曝露し、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって評価した。

【図7B】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元シグナリングがＨＩＦ−１依存的にＣＡ９転写に影響を及ぼすことを示す図である。ＨＩＦ−１ −／− ＭＥＦを、ＳＣ ｓｉＲＮＡまたはＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１指向ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、０．２％酸素において２４時間インキュベートしてから、収集およびｑＰＣＲによるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルの評価を行った（ｎ＝３の代表的実験）。

【図7C】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元シグナリングがＨＩＦ−１依存的にＣＡ９転写に影響を及ぼすことを示す図である。ＡＰＸ３３３０および１％酸素への２４時間の曝露後に収集した試料を使って、記載の細胞株において、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって評価した（ｎ＝３の代表的実験）。^＊＊ｐ＜０．００１（テューキーの多重比較検定）。

【図7D】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元シグナリングがＨＩＦ−１依存的にＣＡ９転写に影響を及ぼすことを示す図である。ＡＰＸ３３３０および１％酸素への２４時間の曝露後に収集した試料を使って、記載の細胞株において、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルをｑＰＣＲによって評価した（ｎ＝３の代表的実験）。^＊ｐ＜０．０１（テューキーの多重比較検定）。

【図7E】ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元シグナリングがＨＩＦ−１依存的にＣＡ９転写に影響を及ぼすことを示す図である。表示のとおりのＡＰＸ３３３０による処理後にＣＡＦの存在下または非存在下で成長させた単層（２Ｄ）培養物および３Ｄ腫瘍スフェロイド培養物からＰａ０３Ｃ細胞を収集し、ＣＡ９タンパク質レベルをウェスタンブロットによって評価した。

【図8A】低酸素下でＣＡ９タンパク質レベルは増加するが、ＡＰＥ１レベルは増加しないことを示す図である。具体的には、表示の時間にわたってＰＤＡＣ細胞を０．２％酸素に曝露し、ＣＡ９タンパク質レベルをウェスタンブロットによって評価した。

【図8B】低酸素下でＣＡ９タンパク質レベルは増加するが、ＡＰＥ１レベルは増加しないことを示す図である。具体的には、表示の時間にわたってＰＤＡＣ細胞を０．２％酸素に曝露し、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質レベルをウェスタンブロットによって評価した。

【図9A】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が、低酸素下でＰＤＡＣ細胞を酸性化し、細胞増殖を阻害することを示す図である。Ｐａｎｃ１０．０５細胞を表示の濃度のＡＰＸ３３３０およびＳＬＣ−０１１１で処理し、４８時間にわたって低酸素（０．２％Ｏ_２）に曝露してから、細胞内ｐＨを分析した。^＊ｐ＞０．０５（ダネットの多重比較検定）。処置群間の非線形回帰曲線の差異は、各実験において余分平方和（ｅｘｔｒａ−ｓｕｍ−ｏｆ−ｓｑｕａｒｅｓ）Ｆ検定とそれに続くボンフェローニ補正とを使って確認された（単剤曲線に対してすべての二重処理曲線についてｐ＜０．０５）。

【図9B】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が、低酸素下でＰＤＡＣ細胞を酸性化し、細胞増殖を阻害することを示す図である。Ｐａ０２Ｃ細胞を表示の濃度のＡＰＸ３３３０およびＳＬＣ−０１１１で処理し、６日間にわたって低酸素（０．２％）に曝露した。^＊ｐ＞０．０５および^＊＊ｐ＜０．０１（ダネットの多重比較検定）。処置群間の非線形回帰曲線の差異は、各実験において余分平方和（ｅｘｔｒａ−ｓｕｍ−ｏｆ−ｓｑｕａｒｅｓ）Ｆ検定とそれに続くボンフェローニ補正とを使って確認された（単剤曲線に対してすべての二重処理曲線についてｐ＜０．０５）。

【図9C】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が、低酸素下でＰＤＡＣ細胞を酸性化し、細胞増殖を阻害することを示す図である。Ｐａ０２Ｃ細胞を表示の濃度のＡＰＸ３３３０およびＦＣ１３−５５５Ａで処理し、６日間にわたって低酸素（０．２％）に曝露した。^＃ｐ＞０．０５および^＃＃ｐ＜０．０１（シダックの多重比較検定）。処置群間の非線形回帰曲線の差異は、各実験において余分平方和（ｅｘｔｒａ−ｓｕｍ−ｏｆ−ｓｑｕａｒｅｓ）Ｆ検定とそれに続くボンフェローニ補正とを使って確認された（単剤曲線に対してすべての二重処理曲線についてｐ＜０．０５）。

【図10A】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が３Ｄ共培養モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害することを示す図である。具体的には、Ｐａ０３Ｃ腫瘍細胞（Ｔｄｔｏｍａｔｏが形質導入されたもの）を、ＣＡＦ（ＥＧＦＰが形質導入されたもの）の存在下および非存在下で、３Ｄ培養物において成長させた。スフェロイドをＳＬＣ−０１１１単独で処理し、１２日間の培養後に腫瘍およびＣＡＦの面積を定量した。二重処理実験では処置群間の非線形回帰曲線の差異が、余分平方和Ｆ検定とそれに続くボンフェローニ補正を使って確認された（腫瘍細胞単独におけるＡＰＸ３３３０単独に関する曲線に対して、各曲線についてｐ＜０．０１、腫瘍＋ＣＡＦ共培養物におけるＡＰＸ３３３０単独に関する曲線に対して、５０μＭ ＳＬＣ−０１１１による曲線についてｐ＜０．０１）。

【図10B】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が３Ｄ共培養モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害することを示す図である。具体的には、Ｐａｎｃ１０．０５腫瘍細胞（Ｔｄｔｏｍａｔｏが形質導入されたもの）を、ＣＡＦ（ＥＧＦＰが形質導入されたもの）の存在下および非存在下で、３Ｄ培養物において成長させた。スフェロイドをＳＬＣ−０１１１単独で処理し、１２日間の培養後に腫瘍およびＣＡＦの面積を定量した。二重処理実験では処置群間の非線形回帰曲線の差異が、余分平方和Ｆ検定とそれに続くボンフェローニ補正を使って確認された（腫瘍細胞単独におけるＡＰＸ３３３０単独に関する曲線に対して、各曲線についてｐ＜０．０１、腫瘍＋ＣＡＦ共培養物におけるＡＰＸ３３３０単独に関する曲線に対して、５０μＭ ＳＬＣ−０１１１による曲線についてｐ＜０．０１）。

【図10C】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が３Ｄ共培養モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害することを示す図である。具体的には、Ｐａ０３Ｃ腫瘍細胞（Ｔｄｔｏｍａｔｏが形質導入されたもの）を、ＣＡＦ（ＥＧＦＰが形質導入されたもの）の存在下および非存在下で、３Ｄ培養物において成長させた。スフェロイドをＳＬ−０１１１とＡＰＸ３３３０との組み合わせで処理し、１２日間の培養後に腫瘍およびＣＡＦの面積を定量した。二重処理実験では処置群間の非線形回帰曲線の差異が、余分平方和Ｆ検定とそれに続くボンフェローニ補正を使って確認された（腫瘍細胞単独におけるＡＰＸ３３３０単独に関する曲線に対して、各曲線についてｐ＜０．０１、腫瘍＋ＣＡＦ共培養物におけるＡＰＸ３３３０単独に関する曲線に対して、５０μＭ ＳＬＣ−０１１１による曲線についてｐ＜０．０１）。

【図10D】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が３Ｄ共培養モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害することを示す図である。具体的には、Ｐａｎｃ１０．０５腫瘍細胞（Ｔｄｔｏｍａｔｏが形質導入されたもの）を、ＣＡＦ（ＥＧＦＰが形質導入されたもの）の存在下および非存在下で、３Ｄ培養物において成長させた。スフェロイドをＳＬ−０１１１とＡＰＸ３３３０との組み合わせで処理し、１２日間の培養後に腫瘍およびＣＡＦの面積を定量した。二重処理実験では処置群間の非線形回帰曲線の差異が、余分平方和Ｆ検定とそれに続くボンフェローニ補正を使って確認された（腫瘍細胞単独におけるＡＰＸ３３３０単独に関する曲線に対して、各曲線についてｐ＜０．０１、腫瘍＋ＣＡＦ共培養物におけるＡＰＸ３３３０単独に関する曲線に対して、５０μＭ ＳＬＣ−０１１１による曲線についてｐ＜０．０１）。

【図10E】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が３Ｄ共培養モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害することを示す図である。具体的には、Ｐａ０３Ｃ腫瘍細胞（Ｔｄｔｏｍａｔｏが形質導入されたもの）を、ＣＡＦ（ＥＧＦＰが形質導入されたもの）の存在下および非存在下で、３Ｄ培養物において成長させた。二重処理実験からの代表的な画像を示す。

【図10F】ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化が３Ｄ共培養モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害することを示す図である。具体的には、Ｐａｎｃ１０．０５腫瘍細胞（Ｔｄｔｏｍａｔｏが形質導入されたもの）を、ＣＡＦ（ＥＧＦＰが形質導入されたもの）の存在下および非存在下で、３Ｄ培養物において成長させた。二重処理実験からの代表的な画像を示す。

【図11A】ＡＰＥ１発現がＰＤＡＣにおける生存率の減少と相関すること、およびＣＡ９がＰＤＡＣではアップレギュレートされることを示す図である。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ ｍＲＮＡの発現量が低いＰＤＡＣ患者と高いＰＤＡＣ患者における総生存率の比較は、がんゲノムアトラス（Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ）（ＴＣＧＡ）データベースから得られた。

【図11B】ＡＰＥ１発現がＰＤＡＣにおける生存率の減少と相関すること、およびＣＡ９がＰＤＡＣではアップレギュレートされることを示す図である。正常膵臓とＰＤＡＣとにおけるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルの比較は、Ｌｏｇｓｄｏｎらによって提供されたデータを使って、Ｏｎｃｏｍｉｎｅから得られた。

【図11C】ＡＰＥ１発現がＰＤＡＣにおける生存率の減少と相関すること、およびＣＡ９がＰＤＡＣではアップレギュレートされることを示す図である。膵がん前駆症とＰＤＡＣとにおけるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルの比較は、Ｌｏｇｓｄｏｎらによって提供されたデータを使って、Ｏｎｃｏｍｉｎｅから得られた。

【図11D】ＡＰＥ１発現がＰＤＡＣにおける生存率の減少と相関すること、およびＣＡ９がＰＤＡＣではアップレギュレートされることを示す図である。正常膵臓とＰＤＡＣとにおけるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルの比較は、Ｐｅｉらによって提供されたデータを使って、Ｏｎｃｏｍｉｎｅから得られた。

【図12A】ＰＧ−Ｓ３−００１によるＳＴＡＴ３阻害なしでの共培養腫瘍スフェロイドの共焦点像である。

【図12B】ＰＧ−Ｓ３−００１によるＳＴＡＴ３阻害ありでの共培養腫瘍スフェロイドの共焦点像である。

【図13】Ｔｈｅｒｍｏ ＡｒｒａｙＳｃａｎを使った３Ｄ細胞プレーティングを表す図である。ここでは、各細胞集団の総強度および総面積の差異を定量するために、３Ｄ構造物の二次元投影図が処理される。１０日目：腫瘍＝Ｐａ０３Ｃ赤色、ＣＡＦ＝ＣＡＦ１９緑色。下側の行は腫瘍殺滅を示し、ここでは、赤色（腫瘍）が消失し、緑色（ＣＡＦ）が残っている。パネルの右側の黄色は赤色（腫瘍）と緑色（ＣＡＦ）とのオーバーラップの結果である。提出された図面ではすべての色が示されているわけではない。

【図14】ＣＡＦとの共培養物において評価されたＰＤＡＣ細胞の薬効を表す図である。

【図15】腫瘍殺滅に対するＲＵＸとＡＰＸ３３３０との併用の効果を表す図である。

【図16】ＰＤＡＣの生存に対するＲＵＸとＡＰＸ３３３０との併用の二重標的化効果を表す図である。

【図17】ＳＴ８８１４ ＭＰＮＳＴ細胞株における腫瘍形成に対するＥ３３３０の効果を表す図である。腫瘍成長を４日間および７日間にわたって監視した。対物１０倍。

【図18A】ＳＴ８８１４ ＭＰＮＳＴ細胞株の創傷閉鎖に対するＥ３３３０の効果を表す図である。擦過面積を経時的に表している。スケールバーは、倍率１０倍の顕微鏡上に描かれた２５０μｍ／セルを表す。

【図18B】ＳＴ８８１４ ＭＰＮＳＴ細胞株の創傷閉鎖に対するＥ３３３０の効果を表す図である。移動した細胞のパーセンテージを表すグラフである。

【図19A】Ｓ４６２ ＭＰＮＳＴ細胞株の創傷閉鎖に対するＥ３３３０の効果を表す図である。擦過面積を経時的に表している。スケールバーは、倍率１０倍の顕微鏡上に描かれた２５０μｍ／セルを表す。

【図19B】Ｓ４６２ ＭＰＮＳＴ細胞株の創傷閉鎖に対するＥ３３３０の効果を表す図である。移動した細胞のパーセンテージを表す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語、表記および他の科学的用語は、本発明が関係する技術分野における通常の技能を有する者によって一般に理解されている通常の意味を有することが意図されている。一部の例では、一般に理解されている意味を持つ用語が、明瞭さのためにおよび／またはすぐに参照できるように、本明細書において定義されるが、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野において広く理解されているものとの実質的差異を表すとみなされるべきでない。本明細書において記載されまたは参照される技法および手順は、広くよく理解されており、当業者により従来の方法論を使って一般に使用されている。適宜、市販のキットおよび試薬の使用を伴う手順は、別段の注記がある場合を除き、一般的には、製造者が定めたプロトコールおよび／またはパラメータに従って実行される。

【0014】

Ａ．定義
本明細書において使用される場合、用語「試料」は、物理的特徴、生化学的特徴、化学的特徴および／または生理学的特徴などに基づいて特徴づけられおよび／または同定されるべき細胞実体および／または他の分子実体を含有する関心対象から得られたまたは誘導された組成物を指す。例えば、語句「疾患試料」およびその変形は、特徴づけられるべき細胞実体および／もしくは分子実体を含有すると予想されるまたは含有することがわかっている関心対象から得られる任意の試料を指す。「組織」または「細胞試料」は、対象または患者の組織から得られた類似する細胞の収集物を指す。組織試料または細胞試料の供給源は、対象からの血液または任意の血液構成成分（例えば全血、血漿、血清）でありうる。組織試料は、初代細胞もしくは培養細胞または細胞株であることもできる。場合により、組織試料または細胞試料は患部組織／器官から得られる。組織試料は、自然において当該組織と本来は混ざっていることのない化合物、例えば保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などを含有することができる。

【0015】

本明細書において使用される場合、用語「対照」、「対照コホート」、「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「対照試料」、「対照細胞」、および「対照組織」は、同定を行うために本開示の方法または組成物が使用されているその疾患または状態を患っていないことがわかっている、または患っていないと信じられる、供給源から得られた試料、細胞または組織を指す。対照は１つの対照または複数の対照を包含することができる。一実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、本開示の組成物または方法を使って同定が行われている疾患または状態を有する対象または患者と同じ対象または患者の身体の健常部分から得られる。一実施形態において、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、本開示の組成物または方法を使って同定が行われている疾患または状態を有する対象または患者ではない個体の身体の健常部分から得られる。

【0016】

用語「対象」は、本明細書においては、処置されるべき個体を指すために、「患者」と相互可換的に使用される。対象は哺乳動物（例えばヒト、非ヒト霊長類、ラット、マウス、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコなど）である。対象は、臨床患者、臨床治験ボランティア、実験動物などである。対象は、ある状態（例えばＰＤＡＣまたはＭＰＮＳＴ）を有すると疑われうる、もしくは有するリスクがありうるか、またはある状態（例えばＰＤＡＣまたはＭＰＮＳＴ）を有すると診断されうる。対象は、また、ＰＤＡＣ、ＭＰＮＳＴ、腎がん、および膀胱がんを有すると疑われうる、または有するリスクがありうる。一実施形態によれば、本発明に従って処置されるべき対象はヒトである。

【0017】

用語「阻害する」およびその派生語は、進行または重症度を低減し、妨げ、防止し、制約し、および減速し、停止させ、または反転させることを含む、広く受け入れられているその意味を包含する。したがって本方法は、適宜、医療上の治療的投与と予防的投与をどちらも包含する。したがって、その必要がある対象は、本明細書における治療的使用に関する場合、医療介入を必要とするまたは医療介入を望むと同定された者である。

【0018】

「有効量」は、本明細書に記載する病理学的な疾患および障害を阻害するのに必要な薬剤の量である。少なくとも１つの追加治療剤が対象に投与される場合、そのような薬剤は、当該薬剤の利益を得るために、逐次的に、並行して、または同時に投与されうる。

【0019】

本明細書において使用される場合、「処置すること」、「処置」、「緩和すること」、「緩和する」、および「緩和」は、目的が、標的とされた病理学的状態または障害を防止しもしくは減速させ（減らし）、または障害の症状の一部を軽減することである手段を指す。処置を必要とする者は、既に障害を持っている者、ならびに障害を有しやすい者、障害を有するリスクがある者、および障害が防止されるべき者を包含することができる。

【0020】

多くの腫瘍（例えば膵腫瘍、脳、卵巣、膀胱、腎臓、前立腺および肉腫）における低酸素状態は予後不良と関連している。酸素枯渇は、腫瘍細胞における薬物耐性、増殖、および遊走／浸潤の増加に寄与するさまざまな因子をアップレギュレートする転写因子である低酸素誘導因子１アルファ（ＨＩＦ１α）の安定化につながる。ＨＩＦ−１転写活性は、正常酸素条件下でプロリンヒドロキシル化とそれに続くフォンヒッペル・リンダウタンパク質（ＶＨＬ（ｖｏｎ Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ））媒介ユビキチン化による分解の標的となるそのαサブユニットの安定化に依存する。安定なＨＩＦ１αは構成的に発現されるβサブユニットと二量体化して、それぞれのプロモーター中に低酸素応答エレメント（ＨＲＥ（ｈｙｐｏｘｉａ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ））を持つ遺伝子を活性化する。ＨＩＦ−１特異的阻害剤は今のところ存在しないので、その極めて重要な転写標的およびＨＩＦ−１活性を制御する酵素を標的とすることは、がん細胞における低酸素シグナリングを調節するための有望な方法である。

【0021】

本開示は、概して、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１／酸化還元エフェクター因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）を標的とする方法に関する。より具体的には、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を阻害することにより、低酸素媒介シグナリングが阻害され、それによって、低酸素状態に曝露された腫瘍細胞の生存および浸潤を減少させる。一特定実施形態において、本開示は、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の阻害剤と追加治療剤とを投与する方法を対象とする。実施例において示すように、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の阻害剤および追加治療剤で複数の低酸素シグナリング経路を遮断すると、腫瘍成長は、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の存在下でさえ、劇的に低減される。

【0022】

Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能は、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル−１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロペン酸（ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）（以下、「Ｅ３３３０」または「３３３０」または「ＡＰＸ３３３０」という）によって選択的に阻害されることが見いだされた。ＡＰＸ３３３０に関するさらなる情報は、本明細書と矛盾しないかぎり参照により本明細書に組み込まれるＡｂｅらの米国特許第５，２１０，２３９号に見いだされうる。

【0023】

【化1】

【0024】

興味深いことに、下記の実施例は、Ａｐｅ１／Ｒｅｆ−１の酸化還元機能の選択的遮断が、正常細胞において、いかなるアポトーシスも、または認知しうるいかなるアポトーシスも、引き起こさないことを示している。がん性細胞におけるアポトーシスの増加をもたらす選択的遮断は正常細胞も損なうと、当然、予想されるであろう。しかしそれは当てはまらないことが見いだされた。

【0025】

本応用が考えられる場合、特にヒトでは、意図される応用に適した形態で薬学的組成物を調製する必要があるだろう。概して、これは、対象にとって有害であるかも知れない不純物を本質的に含まない組成物を調製する工程を必然的に伴うであろう。

【0026】

薬剤は、対象の体重および疾患進行の程度に基づく用量で、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、胸膜内投与、または腹腔内投与することができ、１日あたり１回、２回、さらには４回の投与で与えられうる。

【0027】

一般的には、薬剤を安定にし、標的細胞による取り込みを可能にするために、適当な塩および緩衝剤を使用することが望まれるであろう。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された有効量の薬剤を含む。そのような組成物は無害（ｉｎｎｏｃｕｏｕｓｌｙ）とも呼ばれる。語句「薬学的に」または「薬理学的に許容される」は、対象に投与されたときに、有害なアレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において使用される場合、薬学的に許容される担体は、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などを包含する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は当技術分野ではよく知られている。補助活性成分も組成物に組み入れられうる。

【0028】

本開示において使用するための組成物は、古典的な薬学的調製物を包含しうる。本開示によるこれらの組成物の投与は、標的組織が当該経路によって利用可能であるかぎり、任意の一般的な経路によるであろう。これは、経口、鼻腔、口腔粘膜、直腸、膣または外用を包含する。もう一つの選択肢として、投与は、同所性注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、または静脈内注射によることができる。そのような組成物は、通常は、本明細書に記載するように、薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。

【0029】

例えば、化合物は一般的な賦形剤、希釈剤、または担体と調合され、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、粉末剤などに成形されうる。そのような製剤に適した賦形剤、希釈剤、および担体の例には、次に挙げるものがある：充填剤および増量剤、例えばデンプン、糖類、マンニトール、およびケイ酸誘導体；結合剤、例えばカルボキシメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギナート、ゼラチン、およびポリビニルピロリドン；保湿剤、例えばグリセロール；崩壊剤、例えば炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウム；溶解を遅延させるための薬剤、例えばパラフィン；再吸収促進剤、例えば４級アンモニウム化合物；表面活性剤、例えばセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール；吸着担体、例えばカオリンおよびベントナイト；ならびに潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、および固形ポリエチルグリコール。

【0030】

活性化合物は非経口投与または腹腔内投与することもできる。遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中に調製されうる。分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコールまたはそれらの混合物中に、および油中に調製されうる。通常の貯蔵条件および使用条件下で、これらの調製物は微生物の成長を防止するための保存剤を含有する。

【0031】

注射可能な使用に適した剤形は、滅菌水性溶液剤または滅菌水性分散剤および滅菌注射可能溶液剤または滅菌注射可能分散剤の即時調製用の滅菌粉末剤を包含する。特に適切な実施形態において、剤形は滅菌されており、シリンジによる容易な投与が実現する程度に流動性である。これは、製造条件下および貯蔵条件下で安定であることができ、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されうる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油を含有する溶媒または分散媒でありうる。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングの使用によって、分散剤の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持されうる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされうる。多くの場合、等張化剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射可能組成物の長時間にわたる吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを、組成物中に使用することによってもたらされうる。

【0032】

滅菌注射可能溶液剤は、必要量の活性化合物を、適当な溶媒に、必要に応じて、上に列挙したさまざまな他の成分と共に組み入れてから濾過滅菌することによって、調製することができる。概して分散剤は、さまざまな滅菌活性成分を、基礎分散媒と上に列挙したもののうちの必要な他の成分とを含有する滅菌媒体に組み入れることによって調製される。滅菌注射可能溶液剤を調製するための滅菌粉末剤の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥技法および凍結乾燥技法である。これらの技法では、活性成分と任意の望ましい追加成分との粉末が、前もって滅菌濾過しておいたその溶液から得られる。

【0033】

経口投与の場合、本開示の薬剤を、賦形剤と共に組み入れて、非摂取用含嗽剤および歯磨剤の形態で使用しうる。含嗽剤は必要量の活性成分を適当な溶媒、例えばホウ酸ナトリウム溶液（ドーベル液）などに組み入れることで調製されうる。もう一つの選択肢として、活性成分は、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含有する殺菌洗浄剤に組み込まれうる。活性成分は、ゲル剤、ペースト剤、粉末剤およびスラリー剤を含む歯磨剤に分散されうる。活性成分は、水、結合剤、研磨材、着香剤、起泡剤、および保水剤を含みうる練り歯磨剤に、治療有効量で添加されうる。

【0034】

本開示において使用するための組成物は、中性の形態または塩の形態で調合されうる。薬学的に許容される塩は、例えば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸を使って形成される酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基を使って形成されるもの）を包含する。遊離カルボキシル基を使って形成される塩も、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄（ＩＩＩ）などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されうる。

【0035】

製剤化が終わったら、溶液剤は、その剤形に適した方法で、治療的に有効であるような量で投与されることになる。製剤は、注射可能溶液剤、薬物放出カプセル剤などのさまざまな剤形で、容易に投与される。例えば、水性溶液剤として非経口投与する場合、溶液は必要に応じて適切に緩衝化されるべきであり、液状希釈剤はまず十分量の食塩水またはグルコースで等張性にされる。これら特定の水性溶液剤は静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与にとりわけ適している。これに関して、使用することのできる滅菌水性媒体は、本開示を考慮すれば、当業者にはわかるであろう。例えば、１回量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、それを１０００ｍｌの皮下注入液に添加するか、注入候補部位に注射することができる（例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版の１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。処置される対象の状態に依存して、投薬量にはある程度の変動が必然的に生じるであろう。いずれにせよ、投薬責任者は個々の対象にとって適当な用量を決定することになる。さらに、ヒト投与の場合、調製物は、ＦＤＡおよびそれに相当する外国機関が要求する滅菌性、一般的安全性および純度の基準を満たすべきである。

【0036】

いくつかの態様では、上記のように、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、１つ以上の追加治療剤と組み合わせて投与される。例示的追加治療剤には、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）３）の阻害剤（例えば２−ヒドロキシ−４−（（（４−メチルフェニル）スルホニルオキシ）アセチル）アミノ）−安息香酸／Ｓ３Ｉ−２０１、６−ニトロベンゾ［ｂ］チオフェン−１，１−ジオキシド／ｓｔａｔｔｉｃ、オクロマイシノン、４−［［（４−シクロヘキシルフェニル）メチル］［２−［メチル［（２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェニル）スルホニル］アミノ］アセチル］アミノ］−安息香酸（ＳＨ−４−５４）、４−（Ｎ−（４−シクロヘキシルベンジル）−２−（２，３，４，５，６−ペンタフルオロ−Ｎ−メチルフェニルスルホンアミド）アセトアミド）−２−ヒドロキシ安息香酸（ＢＰ−１−１０２）、およびＢＰ−１−１０２構造に基づく他の阻害剤（例えばＫａｒａｎら，Ｍｏｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ． ２０１６ Ｆｅｂ １２．，ｐｉｉ：ｍｏｌｃａｎｔｈｅｒ．０００３．２０１５に記載されているＰＧ−Ｓ３−００１、ＰＧ−Ｓ２−００２およびＰＧ−Ｓ３−００３（以下に示す構造）、ならびにＤＲ−４−８９））、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）の阻害剤、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ））の阻害剤および／またはＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ）の阻害剤（例えばアバスチン（登録商標）／ベバシズマブ（ＶＥＧＦ抗体阻害剤）、ザルトラップ（登録商標）／ｚｉｖ−アフリベルセプト、ＣＥＤＩＲＡＮＩＢ（登録商標）／ＡＺＤ−２１７１（リセンチン（Ｒｅｃｅｎｔｉｎ））（ＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤）、ヴォトリエント（登録商標）／パゾパニブ／ＧＷ７８６０３４（ＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤）、ＮＥＶＡＸＡＲ（登録商標）／ソラフェニブ（ＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤）、スーテント（登録商標）／リンゴ酸スニチニブ（ＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤）、サイラムザ（登録商標）／ラムシルマブ（ＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤）、およびスチバーガ（登録商標）／レゴラフェニブ）（ＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤）、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ（Ｊａｎｕｓ ｋｉｎａｓｅ））の阻害剤（例えばルキソリチニブ（「ＲＵＸ」）、エルロチニブ、ＬＹ３００９１０４、トファシチニブ（ｔｏｆａｃｉｔｉｂｎｉｂ）、バリシチニブ、ＣＹＴ３８７、フィルゴチニブ、レスタウルチニブ、パクリチニブ）、ならびにそれらの組み合わせがある。

【0037】

【化2】

【0038】

特に好適な一実施形態において、追加治療剤は炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）阻害剤である。例示的ＣＡ９阻害剤には、ＳＬＣ−０１１１（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、ブリティッシュコロンビア州リッチモンド）およびその類似体ＦＣ１３−５５５Ａがある。ＳＬＣ−０１１１およびＦＣ１３−５５５Ａの構造を以下に示す。

【0039】

【化3】

【0040】

特に好適な別の一実施形態において、追加治療剤はヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）阻害剤、特にＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナリング経路を妨害するものである。例示的ＪＡＫ阻害剤には、ルキソリチニブ（ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤）、エルロチニブ（ＪＡＫ２阻害剤）、ＬＹ３００９１０４（ＪＡＫ２阻害剤）、トファシチニブ（ＪＡＫ３阻害剤）、バリシチニブ（ＪＡＫ１／ＪＡＫ２阻害剤）、ＣＹＴ３８７（ＪＡＫ２阻害剤）、フィルゴチニブ（ＪＡＫ１阻害剤）、レスタウルチニブ（ＪＡＫ２阻害剤）、パクリチニブ（ＪＡＫ２阻害剤）、およびそれらの組み合わせがある。

【0041】

ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質のノックダウンは、ＨＩＦ媒介転写、ならびにＣＡ９およびアンジオポエチン様４（ＡＮＧＰＴＬ４）を含むＨＩＦ−１αによって誘導される下流標的を減じることが、ここに見いだされた。具体的には、ＨＩＦ−１αは、ＳＴＡＴ３と共に、低酸素によって誘導されるＣＡ９転写における決定的因子である。ＣＡ９は、細胞内ｐＨを制御して細胞生存を促すために、低酸素に対する細胞応答の一部として機能する。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を介して、ＣＡ９活性とＣＡ９転写との両方を遮断することにより、低酸素条件下でのＰＤＡＣ細胞増殖の減少が見られることが、ここに見いだされた。

【0042】

本明細書ではＰＤＡＣに関して説明するが、本開示の方法は、低酸素媒介シグナリングを阻害し、それによって低酸素状態に曝露された腫瘍細胞の生存および浸潤を減少させるために、ＰＤＡＣ以外でも使用されうることを認識すべきである。特に本方法は、脳がん、卵巣がん、膀胱がん、腎がん、前立腺がん、肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）などを阻害するために使用されうる。

【0043】

本開示は、本発明を開示すると共に、当業者がだれでも、任意のパネルまたはデバイスを製作し、それらを使用すること、および組み込まれた任意の方法を行うことを含めて、本発明を実施することができるようにするために、実施例を使用する。本発明の特許性の範囲は、請求項によって画定され、当業者が想到する他の例も包含しうる。そのような他の例は、それらが請求項の文言と相違しない構造要素を有する場合、またはそれらが請求項の文言との差異が本質的でない等価な構造要素を含む場合には、請求項の範囲内にあるものとする。

【実施例】

【0044】

実施例１
この実施例では、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１がＨＩＦ１α媒介転写による低酸素シグナリングを制御する機序を分析する。さらに、腫瘍サイズおよび腫瘍増殖に対する、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤およびＣＡ９阻害剤による併用処置の効果も分析する。

【0045】

材料および方法
細胞培養：細胞は、Ｊｉａｎｇ，Ｚｈｏｕら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２８（９）：８８５−８９５、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｊｉａｎｇら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １０（９）：１６９８−１７０８、Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｊｉａｎｇら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ４７４６２、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８に記載されているように、培養維持した。患者由来の腫瘍細胞およびＣＡＦ１９細胞は、Ａｎｉｒｂａｎ Ｍａｉｔｒａ博士の研究室（ジョンズ・ホプキンス大学（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））から得た（Ｊｏｎｅｓ，Ｚｈａｎｇら ２００８）。がん関連線維芽細胞ＵＨ１３０３−０２は、Ｗａｌｔｅｒ，Ｏｍｕｒａら（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ７（６）：８８２−８８８に記載されているように、患者腫瘍組織からアウトグロース法を使って単離した。すべての細胞株をＳＴＲ分析によって鑑定し（ＩＤＥＸＸ ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、マイコプラズマ汚染について日常的にチェックした。低酸素曝露は、Ｒｕｓｋｉｎｎ Ｉｎｖｉｖｏ_２ ２００低酸素ワークステーションを使って達成した。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を過剰発現させるために、Ｋｉｍ，Ｇｕｏら（２０１５）Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ７７９：９６−１０４に記載されているように、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ−ＷＴ ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１およびＣＭＶ−ＥＧＦＰレンチウイルスコンストラクトを使用した。イメージング用の細胞を検出するために、ＣＭＶ−ＥＧＦＰレンチウイルスコンストラクトを使用した。さらに、１５０ｐｆｕ／細胞のｐＣＬ７ＴｄＴＯＭｗｏレンチウイルスベクターをＰａ０３Ｃ細胞およびＰａｎｃ１０．０５細胞と共に４８時間インキュベートすることで、ＴｄＴｏｍａｔｏを安定に発現する細胞を作成した。

【0046】

ウェスタンブロット分析：ウェスタンブロットは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ；コロラド州リトルトン）、ＨＩＦ１α（ＧｅｎｅＴｅｘ；カリフォルニア州アービン）、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；マサチューセッツ州ダンバーズ）、ＮＦκＢ（アブカム（ａｂｃａｍ）；マサチューセッツ州ケンブリッジ）、ＣＡ９（サンタクルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；テキサス州ダラス）およびビンキュリン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）；ミズーリ州セントルイス）に対する抗体で、Ｗａｎｇ，Ｌｕｏら（２００４）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ３（６）：６７９−６８６、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｈｅら（２００８）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）７（２）：１７７−１８６、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｃｏｌｖｉｎら（２０１０）Ｈｅｍａｔｏｌ ３８（１２）：１１７８−１１８８、Ｊｉａｎｇ，Ｚｈｏｕら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２８（９）：８８５−８９５、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｊｉａｎｇら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １０（９）：１６９８−１７０８、Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｊｉａｎｇら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ４７４６２、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８に記載されているように行った。

【0047】

共免疫沈降：ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）Ｃｏ−ＩＰキット（サーモサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を使用し、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８に記載の変更を加えて、試料を共免疫沈降した。

【0048】

トランスフェクション：ＰＤＡＣ細胞およびＣＡＦ細胞を、Ｗａｎｇ，Ｌｕｏら（２００４）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ３（６）：６７９−６８６、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｈｅら（２００８）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）７（２）：１７７−１８６、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｃｏｌｖｉｎら（２０１０）Ｈｅｍａｔｏｌ ３８（１２）：１１７８−１１８８、Ｊｉａｎｇ，Ｚｈｏｕら（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ２８（９）：８８５−８９５、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｊｉａｎｇら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １０（９）：１６９８−１７０８、Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｊｉａｎｇら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ４７４６２、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８に記載されているように、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。使用したｓｉＲＮＡは＃１またはスクランブル対照（既報）および２つのＬｉｆｅＴｅｃｈ検証済ｓｉＲＮＡ（＃２、ｓ１４４５および＃４、ｓ１４４７）（Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８）である。別段の指定がある場合を除き、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ ｓｉＲＮＡ＃１を標準ｓｉＲＮＡとして使用した。

【0049】

一過性ルシフェラーゼリポーターアッセイ：ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞を、Ｌｕｏ，Ｄｅｌａｐｌａｎｅら（２００８）Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ １０（１１）：１８５３−１８６７、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８に記載されているように、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ９ ＤＮＡトランスフェクション試薬（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、インディアナ州インディアナポリス）を使って、上述のｓｉＲＮＡと一緒に、ＨＩＦ１αによって駆動されるルシフェラーゼを含有するコンストラクトおよびレニラ・ルシフェラーゼ対照リポーターベクターで同時トランスフェクトした。ホタル・ルシフェラーゼ活性およびレニラ・ルシフェラーゼ活性は、以前のように、デュアル・ルシフェラーゼ・リポーター・アッセイ・システム（Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．））を使用することによってアッセイした（Ｌｕｏ，Ｄｅｌａｐｌａｎｅら（２００８）Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ １０（１１）：１８５３−１８６７、Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｊｉａｎｇら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ４７４６２、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８）。

【0050】

ｑＲＴ−ＰＣＲ反応：Ｆｉｓｈｅｌ，Ｊｉａｎｇら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １０（９）：１６９８−１７０８に記載されているように、ＣＡ９のｍＲＮＡ発現レベルを測定するために、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用した。細胞を、低酸素（１％および０．２％Ｏ_２）の存在下または非存在下で、２４時間にわたって、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ ｓｉＲＮＡで処理するか、一連の量のＡＰＸ３３３０で処理した後、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（カリフォルニア州バレンシア）を使って、全ＲＮＡを細胞から抽出した。第１鎖ｃＤＮＡ合成および定量ＰＣＲは、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｖａｓｋｏら（２００７）Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ６１４（１−２）：２４−３６、Ｊｉａｎｇ，Ｇｕｏら（２００９）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）８（１１）：１２７３−１２８２、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｊｉａｎｇら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １０（９）：１６９８−１７０８に記載されているとおりに行った。１８Ｓ ｒＲＮＡ、ＲＰＬＰＯ、およびＢ２Ｍを参照遺伝子として使用し、比較Ｃｔ法を使って、相対定量的ｍＲＮＡレベルを決定した（ＬｉｖａｋおよびＳｃｈｍｉｔｔｇｅｎ（２００１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ２５（４）：４０２−４０８、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｖａｓｋｏら（２００７）Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ６１４（１−２）：２４−３６、Ｊｉａｎｇ，Ｇｕｏら（２００９）ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）８（１１）：１２７３−１２８２）。ＣＡ９用、１８Ｓ用、ＲＰＬＰＯ用、およびＢ２Ｍ用のプライマーは市販されている（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））。

【0051】

阻害剤：化合物は、以前に記載されたように調製し、使用した：ＡＰＸ３３３０（Ｌｕｏ，Ｄｅｌａｐｌａｎｅら（２００８）Ａｎｔｉｏｘｉｄ Ｒｅｄｏｘ Ｓｉｇｎａｌ １０（１１）：１８５３−１８６７、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｃｏｌｖｉｎら（２０１０）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ３８（１２）：１１７８−１１８８、Ｎｙｌａｎｄ，Ｌｕｏら（２０１０）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５３（３）：１２００−１２１０、Ｓｕ，Ｄｅｌａｐｌａｎｅら（２０１１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５０：８２−９２）およびＳＬＣ−０１１１（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ、Ｎｉｓｈｉｍｏｒｉ，Ｍｉｎａｋｕｃｈｉら（２００６）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ４９（６）：２１１７−２１２６、Ｐａｃｃｈｉａｎｏ，Ａｇｇａｒｗａｌら（２０１０）Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）４６（４４）：８３７１−８３７３、Ｌｏｕ，ＭｃＤｏｎａｌｄら（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ７１（９）：３３６４−３３７６、Ｐａｃｃｈｉａｎｏ，Ｃａｒｔａら（２０１１）Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ５４（６）：１８９６−１９０２、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｗｉｎｕｍら（２０１２）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ３（１）：８４−９７、Ｓｕｐｕｒａｎ（２０１５）Ｊ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ：１−１６、ＳｕｐｕｒａｎおよびＷｉｎｕｍ（２０１５）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １０（６）：５９１−５９７）。加えて、ＳＬＣ−０１１１類似体ＦＣ１３−５５５Ａを以下に記載するように合成した。

【0052】

４−［３−（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−ウレイド］−ベンゼンスルホンアミド ＦＣ１３−５５５Ａの合成

【0053】

【化4】

【0054】

スルファニルアミド ２（１．０等量）のＡＣＮ溶液に１−クロロ−２−イソシアナト−４−ニトロ−ベンゼン １（１．０等量）を加えた。その溶液を室温で３時間撹拌した。白色沈殿物が生成した。それを濾過によって収集し、ジエチルエーテルで摩砕し、減圧下で乾燥することにより、標題化合物を淡黄色固形物として得た。
４−［３−（２−クロロ−５−ニトロ−フェニル）−ウレイド］−ベンゼンスルホンアミド ＦＣ１３−５５５Ａ：収率８９％；シリカゲルＴＬＣ Ｒ_ｆ ０．２８（酢酸エチル／ｎ−ヘキサン ３０％ｖ／ｖ）；δ_Ｈ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）７．２８（２Ｈ，ｂｒｓ，Ｄ_２Ｏとの交換，ＳＯ_２ＮＨ_２），７．７８（２Ｈ，ｄ，Ｊ ８．８，ＡｒＨ），７．８３（３Ｈ，ｍ，ＡｒＨ），７．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ ８．８，ＡｒＨ），８．８２（１Ｈ，，ｂｒｓ，Ｄ_２Ｏとの交換，ＮＨ），９．２１（１Ｈ，ｓ，ＡｒＨ），１０．００（１Ｈ，ｓ；ＡｒＨ）；δ_Ｃ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）１１５．６，１１８．５，１１８．８，１２７．８，１２８．９，１３１．３，１３７．７，１３８．６，１４２．９，１４７．５，１５２．７；ｍ／ｚ（ＥＳＩ−ＭＳ−正イオン）３７１．０１（Ｍ＋Ｈ）；元素分析理論値：Ｃ，４２．１１；Ｈ，２．９９；Ｓ，８．６５；元素分析実測値：Ｃ，４２．１５；Ｈ，３．０４；Ｓ，８．６２。

【0055】

細胞増殖：単層におけるＰＤＡＣ細胞増殖は、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８に記載されているように、アラマーブルーアッセイを使って測定した。ＡＰＸ３３３０およびＳＬＣ−０１１１で処理した細胞を６日間にわたって低酸素に曝露してからアラマーブルー試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を添加し、続いて蛍光分析を行った。倍率変化は、正常培地中で成長する細胞と比較した、表示の阻害剤で処理した細胞についての蛍光の読みを表す。

【0056】

ｐＨアッセイ：細胞内ｐＨは、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ細胞内ｐＨ指示薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を使って評価した。ＡＰＸ３３３０およびＳＬＣ−０１１１で処理したＰＤＡＣ細胞を４８時間にわたって低酸素に曝露した後、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ色素による分析を行った。細胞内ｐＨ較正緩衝液（ＬｉｆｅＴｅｃｈ）を使って、ｐＨ値を決定するための蛍光強度の標準曲線を作成した。増殖の変化を説明するために、結果をＭＴＳ分析に標準化した。

【0057】

統計分析．Ｙｕａｎ，Ｒｅｅｄら（２００６）ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：８５、Ｆｉｓｈｅｌ，Ｗｕら（２０１５）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９０（５）：３０５７−３０６８に記載されているように、２^{−ΔΔＣＴ}法および共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）モデルを使って、スクランブル、ｓｉＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１、および低酸素処理に関するｑＰＣＲデータポイントを分析した。処理群が複数ある試験におけるデータポイントは、事後多重比較検定（適宜、テューキー、ダネット、またはシダック）を使って分析した。複数の薬物を使ったデータ曲線の評価には、群間で共有される非線形回帰曲線の適合度を各群に関する独立した曲線のそれと比較するために、余分平方和Ｆ検定を使用した。処置群と対照群との間の差異は、適宜、ボンフェローニ補正後に、ｐ＜０．０５であれば、有意とみなした。統計分析は、ＳＡＳ（バージョン９．３、著作権（著作権）２０１０、サスインスティチュート社（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｉｎｃ．）、ノースカロライナ州ケアリー）およびＰｒｉｓｍ（バージョン６．０ｆ、著作権（著作権）２０１４、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ラホーヤ）を使って行った。

【0058】

ＨＩＦ−１ −／− ＭＥＦ生成：ＨＩＦ−１欠損細胞を生じさせるために、ＨＩＦ−１−ｆｌｏｘマウス胚性線維芽（ＭＥＦ）細胞に、Ａｄ−ＣＭＶ−Ｃｒｅ（Ｃｒｅアデノウイルス）またはＡｄ−ＧＦＰ（対照）ベクター（ＢｉｏＬａｂｓ、ペンシルバニア州マルバーン）を、５ｎｇ／ｍＬポリブレンを使って、２４時間、形質導入した（Ａｔｔａｒｄｉ，Ｌｏｗｅら（１９９６）Ｅｍｂｏ ｊ １５（１４）：３６９３−３７０１、Ｒａｎｋｉｎ，Ｗｕら（２０１２）Ｃｅｌｌ １４９（１）：６３−７４）。ＰＣＲを使ってＨＩＦの欠損を確かめた（図１）。

【0059】

３Ｄ共培養物：以前に記載されているように（Ｓｅｍｐｅｒｅ，Ｇｕｎｎら（２０１１）Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １２（３）：１９８−２０７、Ａｒｐｉｎ，Ｍａｃら（２０１５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＣＡＦ（７５μＬ／ウェル）の存在下および非存在下で３次元的腫瘍スフェロイドを生成させるために、超低接着性９６ウェルプレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．），Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。低継代数患者細胞の遺伝的特徴を保存するために、表示のとおり、ＥＧＦＰ（緑色）またはＴｄＴｏｍａｔｏ（赤色）を、細胞に安定形質導入した（Ｊｏｎｅｓ，Ｚｈａｎｇら（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１（５８９７）：１８０１−１８０６）。３％成長因子低含有マトリゲル（Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（ＲＧＦ、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））および５％ＦＢＳを含有する無色のＤＭＥＭ成長培地に、細胞を再懸濁した。プレーティングに続いて、４日目および８日目に、５％血清、３％ＲＧＦマトリゲル、および表示の阻害剤を含有する培地で細胞を処理した。１２日目に、Ｔｈｅｒｍｏ ＡｒｒａｙＳｃａｎハイコンテントイメージングシステムを使ってスフェロイドを分析した（Ｌｏｖｂｏｒｇ，Ｎｙｇｒｅｎら（２００４）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ３（５）：５２１−５２６、Ｌｉｎｄｂｌｏｍ，Ｂｅｒｇら（２０１２）Ｔｏｘｉｃｏｌ Ｐａｔｈｏｌ ４０（１）：１８−３２）。ＡｒｒａｙＳｃａｎにより、ＴｄＴｏｍａｔｏおよびＥＧＦＰに関して、２．５倍対物レンズを使って３Ｄ構造物の画像をキャプチャし、次に２Ｄ投影図を処理することで、ＣＡＦと腫瘍との両方の総強度および総面積の差異を定量した。

【0060】

結果
ＨＩＦ１αおよびＳＴＡＴ３とのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の相互作用は低酸素によって刺激される
以前に公表されたデータは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のノックダウンおよび／または選択的阻害剤ＡＰＸ３３３０（ＡＰＸ３３３０ともいう）によるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元シグナリングの阻害に続いて、ＳＴＡＴ３、ＨＩＦ１α、およびＮＦκＢ活性の減少が起こることを証明した（Ｆｉｓｈｅｌ，Ｊｉａｎｇら（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ １０（９）：１６９８−１７０８、Ｃａｒｄｏｓｏ，Ｊｉａｎｇら（２０１２）ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０：ｅ４７４６２）。同様に、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の阻害は、細胞内の主要ＨＩＦ−１標的である炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡ９）の減少につながることが見いだされた。低酸素シグナリングにおけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の役割をさらに精査し、低酸素がＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１とその酸化還元標的との間の相互作用を刺激するかどうかをより明確に決定するために、正常酸素条件下および低酸素（０．２％Ｏ_２）条件下の２つの低継代数ＰＤＡＣ細胞株（Ｐａｎｃ１０．０５およびＰａ０３Ｃ）の溶解物から、内在性ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を免疫沈降させた。ＩＰをＨＩＦ１α、ＳＴＡＴ３、およびＮＦκＢについてプローブした。低酸素条件下ではプルダウン画分中にＨＩＦ１αおよびＳＴＡＴ３が検出され、ＮＦκＢは検出されなかったが、正常酸素条件下では、これらの相互作用は検出されなかった（図２Ａおよび図２Ｂ）。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１とそれが制御する転写因子との間の相互作用が、適当な刺激により、正常酸素条件下で実際に起こることを示すために、ＴＮＦα（ＮＦκＢ）およびＩＬ−６（ＳＴＡＴ３）の対照を行った（図３Ａおよび図３Ｂ）。ＨＩＦ１αおよびＳＴＡＴ３とのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の相互作用は低酸素条件下では明白である。

【0061】

ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の過剰発現は、低酸素への曝露後にＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１と共に免疫沈降したＨＩＦ１αおよびＳＴＡＴ３のどちらについても、より強いシグナルをもたらした（図２Ｃおよび図２Ｄ）。低酸素への曝露後の、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を過剰発現する細胞からのＩＰ中に、ＮＦκＢは、依然として検出されなかった。これは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の量が上記のパネル（図２Ｃおよび図２Ｄ）を制限しているわけではないことを示している。転写因子とのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の相互作用が低酸素におけるシグナリングに特異的であることを証明するために、別のＳＴＡＴファミリーメンバーであるＳＴＡＴ１をプローブした。Ｐａｎｃ１０．０５細胞からのＩＰをＳＴＡＴ１についてプローブしたが、ＳＴＡＴ１は、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のレベルまたは酸素条件とは無関係に検出されなかった（図２Ｃ）。膵腫瘍微小環境における疾患およびさまざまな細胞タイプ間のシグナリングの複雑さゆえに、ＣＡＦにおけるＨＩＦ１α、ＳＴＡＴ３およびＮＦκＢとのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の相互作用を調べた。結果は、ＰＤＡＣ細胞での結果と同一であった。すなわち、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１は、低酸素下でＨＩＦ１αおよびＳＴＡＴ３と相互作用するが、ＮＦκＢとは相互作用しない（図４Ａ〜４Ｃ）。臨床治験が始まったＣＡ９阻害剤と、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１遮断に続くＣＡ９の転写制御を証明する以前のデータ（Ｆｉｓｈｅｌら，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １０（９）：１６９８−１７０８）とを考慮して、この実施例では、ＨＩＦ１αシグナリングと、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１を介した下流分子ＣＡ９の制御とに焦点を合わせた。

【0062】

ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現は、低酸素によって誘発されるＨＩＦ１α媒介転写に寄与した
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１とＨＩＦ１αとの間の相互作用が機能的に重要であることを示すために、ＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞を、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ ｓｉＲＮＡまたはスクランブル対照と並行して、ＨＩＦ１α駆動ホタル・ルシフェラーゼまたはｐＬｕｃ−ＭＣＳ（ベクター対照）で同時トランスフェクトし、細胞を２４時間にわたって低酸素に曝露することによって、ＨＩＦ−１転写活性へのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の寄与を評価した。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンは、低酸素によって誘導されるＨＩＦ１α活性の有意な低減（約４７％）をもたらした（図５Ａおよび図５Ｂ）。

【0063】

ＨＩＦ−１標的ＣＡ９の低酸素媒介転写を調べることによって、ＨＩＦ転写活性に対するＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の効果をさらに評価した。２つのＰＤＡＣ細胞株および１つの膵がんＣＡＦ細胞株におけるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンおよび低酸素への曝露後に比較した。低酸素によって誘導されるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルは、どちらの低酸素レベルでもすべての細胞株において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンによって減弱された（図５Ｃ〜５Ｅ）。異なる細胞株における誘導の量の変動は、正常酸素条件下での極端に低いベースラインＣＡ９発現に原因の一部があると考えうる。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンは、２つの追加初代ＰＤＡＣ細胞株において、低酸素（ｈｙｐｏｘｉｄ）条件下でのＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、同様に減弱した（図６Ａおよび６Ｂ）。これらの結果を、低酸素に曝露されたＭＩＡ ＰａＣａ−２細胞において、２つの追加ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１標的ｓｉＲＮＡを使って検証し、同様の結果を得た（図５Ｆ〜５Ｇ）。ＣＡ９の低減がタンパク質レベルでも起こったことを確かめるために、低酸素によって誘導されるＣＡ９タンパク質レベルを、ＰＤＡＣ細胞および膵ＣＡＦ細胞において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウン後に、ウェスタンブロットによって評価した。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンは、低酸素によって誘導されるＣＡ９タンパク質レベルの約７０％の低減をもたらした（図５Ｈ〜５Ｉ）。

【0064】

低酸素によって誘導されるＣＡ９転写はＨＩＦ−１依存的である
ＣＡ９転写に対するＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１および低酸素の効果がＨＩＦ−１活性によって媒介されることを確認するために、低酸素によって誘導されるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、ＨＩＦ−１欠損（−／−）ＭＥＦにおいて、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウン後に評価した。予想どおり、ＨＩＦ−１非欠損ＭＥＦでは、ＣＡ９が、正常酸素対照と比較して３０倍誘導された。ＨＩＦ−１ −／− ＭＥＦでは、ＣＡ９ ｍＲＮＡレベルは、低酸素への曝露によって誘導されず（図７Ａ）、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１ノックダウンによる影響も受けなかった（図７Ｂ）。これは、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１発現レベルまたは酸素レベルとは関わりなく、ＣＡ９転写がＨＩＦ−１依存的であることを示している。これらの細胞におけるＨＩＦ−１枯渇はＰＣＲによって確認した（図１）。

【0065】

ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元シグナリングの阻害はＣＡ９転写に影響を及ぼす
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１は、多機能性タンパク質として、ＤＮＡ損傷の塩基除去修復（ＢＥＲ（Ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ））、ＲＮＡ品質管理、および還元−酸化（酸化還元）制御にも関与する。ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のノックダウンはこれらの機能のすべてに影響を及ぼす。酸化還元機能が低酸素シグナリング経路のＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１媒介制御を担っていることを決定するために、他のＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１機能には影響を及ぼさないＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１特異的酸化還元阻害剤であって、２０１６年の夏に臨床治験が予定されているものを使って、酸化還元機能を調べた。ＡＰＸ３３３０が、低酸素に曝露されたＰａｎｃ−１細胞およびＭＩＡ−ＰａＣａ２細胞におけるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを減少させることは、以前に示されている。ここでは、これらの結果が、初代細胞およびＣＡＦ細胞、ならびに３Ｄ共培養物に拡張される。ＡＰＸ３３３０による処理および低酸素への曝露後に、Ｐａ０３Ｃ細胞および膵ＣＡＦ細胞におけるＣＡ９ ｍＲＮＡレベルは、用量依存的に減弱された（図７Ｃおよび７Ｄ）。加えて、３Ｄ共培養モデルにおいて、ＡＰＸ３３３０によるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の阻害後に、ＣＡ９タンパク質発現を測定した。単層における患者由来Ｐａ０３Ｃ細胞の場合、正常酸素条件下ではＣＡ９は検出されなかったが、スフェロイドとして成長させると、これらの細胞はＣＡ９を発現した。ＣＡＦの存在下で成長させた腫瘍スフェロイドは、より強くＣＡ９発現をアップレギュレートした（約３倍）。これはおそらく、大きなスフェロイドほど大きな低酸素領域を含むと共に、間質要素にはより複雑なシグナリングが存在するからであろう。ＡＰＸ３３３０によるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元シグナリングの阻害は、ＣＡＦ細胞の存在下でも非存在下でも、３Ｄ腫瘍培養物における用量依存的なＣＡ９発現の減少につながった（図７Ｅ）。これらのデータは、ＰＤＡＣにおけるＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のような、新規な標的を検証する前臨床試験のための３Ｄ共培養系の使用を支持している。

【0066】

３つのＰＤＡＣ細胞株において低酸素（０．２％酸素）への曝露後にＣＡ９タンパク質発現およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１タンパク質発現を評価したところ、ＣＡ９レベルは経時的に増加するが、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１レベルは有意に変化しないことが見いだされた。（図８Ａおよび図８Ｂ）。これは、低酸素によって誘導されるＣＡ９発現が、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１のアップレギュレーションに続発するわけではないことを示している。

【0067】

ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化はＰＤＡＣ細胞を酸性化し、低酸素下での細胞増殖を阻害する
ＣＡ９は低酸素条件下で細胞内ｐＨを制御し、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元活性は、低酸素によって誘導されるＣＡ９発現に寄与する。低酸素条件下での炭酸脱水素活性に関する機能的エンドポイントとして、ｐＨｒｏｄｏ Ｒｅｄ ＡＭ蛍光ｐＨ指示薬を使って、ＣＡ９阻害剤ＳＬＣ−０１１１およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元阻害剤ＡＰＸ３３３０による処理後に、低酸素に曝露されたＰＤＡＣ細胞における細胞内（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｌｕｌａｒ）ｐＨを分析した。ＳＬＣ−０１１１およびＡＰＸ３３３０による二重処理は、どちらかの阻害剤単独による処理と比較して、より大きな細胞内ｐＨの減少をもたらした（図９Ａ）。

【0068】

ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元活性の阻害は、ＡＰＸ３３３０および低酸素による細胞の処理後に、ＰＤＡＣ細胞増殖の用量依存的減少をもたらした。細胞生存性に対するＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害の効果は、ＡＰＸ３３３０処理に加えてＣＡ９阻害剤ＳＬＣ−０１１１によって処理することにより、低酸素下で、著しく強化された（図９Ｂ）。さらに、ＡＰＸ３３３０とＳＬＣ−０１１１類似体ＦＣ１３−５５５Ａとの組み合わせも、単層におけるＰＤＡＣ細胞を殺すのに著しく有効であることが見いだされた。（図９Ｃ）。これは、低酸素シグナリングタンパク質の遮断がＰＤＡＣ細胞にとって有害であるだろうという仮説を支持している。これらの結果を支持して、新しいＣＡ９阻害剤が開発されている。

【0069】

ＣＡ９およびＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の二重標的化は３Ｄ共培養モデルにおけるＰＤＡＣ腫瘍成長を阻害した
腫瘍微小環境をより正確に模倣するために、低継代数患者由来腫瘍細胞とがん関連線維芽細胞とを含むＰＤＡＣの三次元共培養モデルを利用した。上で証明されたとおり、これらの腫瘍スフェロイドにおいて、ＣＡ９のレベルは、ＣＡＦ細胞と共に成長させた場合の方が高く、ＣＡ９発現はＡＰＸ３３３０での処理によって減弱される（図７Ｅ）。３Ｄモデルでは、ＳＬＣ−０１１１によるＣＡ９の阻害が、より強力であり、患者由来細胞の面積の低減によって測定した場合、腫瘍細胞殺滅に対する劇的な効果は、単層の場合より低い用量で観察された（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。細胞殺滅はＣＡＦより腫瘍細胞の方が劇的であり、ＣＡＦ１９細胞がＰａ０３Ｃ細胞と共培養された場合は、とりわけそうであった。蛍光強度を測定した場合にも同様の傾向が見られた（データ省略）。重要なことに、ＣＡ９の阻害は、ＣＡＦの防御的環境にある場合でさえ、腫瘍細胞を効果的に殺すことができた。

【0070】

ＣＡ９活性の阻害に並行するＳＴＡＴ３媒介転写およびＨＩＦ媒介転写の遮断がＰＤＡＣ細胞死を増強するかどうかを決定するために、３Ｄ共培養モデルにおいて、ＡＰＸ３３３０とＳＬＣ−０１１１とを併用した。各細胞タイプにおける蛍光ラベルが異なるので、腫瘍単独でも、共培養された腫瘍およびＣＡＦでも、二重標的化の効果を評価することができた。低酸素に曝露された２Ｄ培養物で見られたように、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１酸化還元阻害へのＣＡ９阻害の追加は、腫瘍スフェロイドにおける細胞殺滅の劇的な増強をもたらした。患者由来ＰＤＡＣ細胞（Ｐａ０３ＣまたはＰａｎｃ１０．０５）およびＣＡＦ細胞で構成されるスフェロイドを、ＡＰＸ３３３０およびＳＬＣ−０１１１で処理し（図１０Ｅおよび１０Ｆ）、各細胞タイプのマーカーとして蛍光面積を個別に評価した（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。ＣＡ９阻害の追加によって、ＡＰＸ３３３０が誘発するスフェロイド成長阻止の劇的な強化が観察された。ＡＰＸ３３３０処理で観察される腫瘍細胞面積の減少はＳＬＣ−０１１１の存在下では有意に相違し、これにより、低酸素に曝露された２Ｄ培養物において見られた効果が検証された。赤色蛍光強度および緑色蛍光強度を測定した場合にも同様の傾向が見られた（データ省略）。

【0071】

考察
ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１発現の上昇は、膵がん、卵巣がん、胃がん、乳がん、肺がん、膠芽腫、肝臓がん、大腸がんを含む多くのがんに関連し、がんゲノムアトラス（ＴＣＧＡ、ｃａｎｃｅｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から公的に入手できるデータの分析により、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１発現の上昇に伴うＰＤＡＣ患者の生存率の有意な減少が明らかになる（図１１Ａ）。腫瘍細胞において、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１による、ＳＴＡＴ３、ＮＦκＢ、およびＨＩＦ−１などのさまざまな腫瘍促進転写因子（ＴＦ）におけるシステインのチオールの還元−酸化（酸化還元）は、これらの因子の活性化における決定的ステップである。これらのＴＦはいずれも、がん治療における、特にＰＤＡＣにおける重要な標的であるが、特に創薬困難であることが示されている。

【0072】

ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１はＰＤＡＣ細胞におけるＳＴＡＴ３活性化およびその結果生じるＳＴＡＴ３の腫瘍促進効果に寄与する。ＳＴＡＴ３とＨＩＦ−１の協同的活性はさまざまながんにおいて証明されているが、ＳＴＡＴ３へのＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１の結合がＰＤＡＣ細胞における低酸素への曝露によって刺激されるという本開示における発見は、ＰＤＡＣにおける潜在的治療標的として、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１とＳＴＡＴ３との両方が重要であることを示している。これらの発見は、最終的な臨床治験のために開発されている前臨床ＳＴＡＴ３阻害剤を使って、さらに探求されるであろう。さらにまた、低酸素によって誘導されるＨＩＦ−１転写活性およびＣＡ９ ｍＲＮＡレベルを、ＡＰＸ３３３０処理が減少させることを証明している上記の結果は、刺激的である。というのも、ＣＡ９阻害剤は臨床治験に入るところであるか、または臨床治験中だからである。この、後者の発見は、患者への応用により近いだけでなく、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１による影響を受ける経路に沿って複数のポイントでさまざまなシグナリング経路を遮断するという戦略に基づいているので、大変興味深い。

【0073】

ＨＩＦ−ＣＡ９軸を、ＡＰＸ３３３０によるＣＡ９のＨＩＦ−１生産の遮断、およびＳＬＣ−０１１１を使用することでもたらされる任意のＣＡ９活性の遮断という、２つのポイントで阻害する本開示の戦略は、低酸素ＰＤＡＣ細胞の標的化のための新規なアプローチである。とはいえ、ＡＰＸ３３３０とＳＬＣ−０１１１との併用に対して感受性であるのは、低酸素ＰＤＡＣ細胞だけではないだろう。ＡＰＸ３３３０は、十分に酸素供給されている腫瘍細胞において活性化される他のシグナリング経路も標的としており、ＳＬＣ−０１１１は別の腫瘍関連炭酸脱水酵素であるＣＡ１２も阻害することができる。上記の発見は、追加の細胞酸性化および低酸素ＰＤＡＣ細胞増殖の阻害をもたらすこの戦略を確立する。

【0074】

結論として、ここに提示した実施例は、ＰＤＡＣにおけるＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１、ＳＴＡＴ３およびＨＩＦ−１シグナリングとＣＡ９生産との間の密接な関係の引き続いての証拠、およびそれぞれは最低限の毒性を示す２つの小分子阻害剤の併用が、効果的な処置の達成が今なお困難な疾患であるＰＤＡＣの処置において、重要な次のステップになりうることの初めての証拠を提供する。

【0075】

実施例２
この実施例では、細胞の生存および増殖に対するＲｅｆ−１／ＳＴＡＴ３の二重標的化効果を分析した。

【0076】

材料および方法
三次元成長アッセイ．９６ウェルプレートを１％ノーブル寒天（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））（５０μＬ／ウェル）でコーティングした。ｍＣｈｅｒｒｙ標識ＰＤＡＣ細胞およびＥＧＦＰ標識ＣＡＦを、３％マトリゲル（ＢＤバイオサイエンス）を含有する通常成長培地に、１：４（腫瘍：ＣＡＦ）の細胞比で再懸濁し、固化した１％ノーブル寒天の上にプレーティングした。プレーティング後の４日目および８日目に、５％血清＋３％マトリゲル＋試験対象薬を含有する培地を細胞に供給した。

【0077】

ＡＰＸ３３３０、ＪＡＫ２阻害剤（ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４；フィッシャーサイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））（「ＲＵＸ」））およびリードＳＴＡＴ３阻害剤（ＰＧ−Ｓ３−００１、ＤＲ−４−８９）を利用して、ＰＤＡＣ低継代数患者由来細胞株（Ｐａ０３ＣおよびＰａｎｃ１０．０５）におけるＲｅｆ−１／ＳＴＡＴ３阻害の効果を評価した。増殖に基づく３Ｄ共培養アッセイ、および相乗作用、相加作用または拮抗作用を評価するための統計分析を使って、応答を、シュー・タラレイ（Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ）法を使って評価した。

【0078】

この実施例は、１２日間にわたって同じ生共培養物が視覚化されるように計画し、８日間および１２日間共培養した時点でＴｈｅｒｍｏ ＡｒｒａｙＳｃａｎによって画像をキャプチャした。このモデルでは、細胞集団を識別し、定量することができるように、がん細胞および間質細胞に、別個の蛍光タンパク質（腫瘍はｍＣｈｅｒｒｙ、そしてＣＡＦはＥＧＦＰ）で印をつけた。有効な組み合わせをスクリーニングするために、３Ｄ培養およびイメージング用の適当なプレート（９６ウェルプレート）、安定な構造物を形成させるのに必要な１ウェルあたりの腫瘍細胞数（１０００細胞）、およびＣＡＦに対する腫瘍の最適な比（１：４）を含む、３Ｄ共培養の使用を可能にするいくつかの因子を、前もって最適化した（図１２Ａおよび図１２Ｂ）。Ｔｈｅｒｍｏ ＡｒｒａｙＳｃａｎを使って、３Ｄ構造物の二次元投影図をすぐに処理して各細胞集団の総強度および総面積の差異を定量することができるセミハイスループットシステムを開発した（図１３）。こうして、天然のインビボＰＤＡＣ環境をより忠実に模倣するＣＡＦとの共培養物において、ＰＤＡＣ細胞の薬効を評価することができた。

【0079】

結果
単剤ＡＰＸ３３３０、ＲＵＸ、ＰＧ−Ｓ３−００１、およびＤＲ−４−８９は、３Ｄアッセイにおいて既に試験されている。これらの薬剤は、単独の腫瘍スフェロイドも、ＣＡＦと共に培養された腫瘍スフェロイドも、効果的に殺した。特に、リード化合物ＰＧ−Ｓ３−００１およびＤＲ−４−８９によるＳＴＡＴ３の阻害は、ＣＡＦの存在下でさえ、ＰＤＡＣ細胞における細胞死をもたらし、単剤として、いくらかの活性がインビボで観察された（図１４）。

【0080】

このモデルを使って、ＡＰＸ３３３０とＳＴＡＴ３阻害との組み合わせを試験した。ＡｒｒａｙＳｃａｎおよび９６ウェルプレートフォーマットを使って開発されたこのシステムのセミハイスループット性ゆえに、各薬物の組み合わせおよび用量を数多く実行することができる。ＰＧ−Ｓ３−００１およびＤＲ−４−８９ならびにＲＵＸによるＳＴＡＴ３経路をどちらも使用することは、直接的なＳＴＡＴ３阻害がＪＡＫ２によるＳＴＡＴ３の上流阻害より強力であるかどうかを確かめるのに役立つであろう。

【0081】

図１５に示すように、ＡＰＸ３３３０と組み合わされたＲＵＸは、単独の腫瘍スフェロイドも、ＣＡＦと共に培養された腫瘍スフェロイドも、効果的に殺した。

【0082】

実施例３
この実施例では、ＰＤＡＣの生存に対するＡＰＸ３３３０とルキソリチニブ（ＲＵＸ）との組み合わせのインビボ効果を分析した。

【0083】

ＡＰＸ３３３０およびＲＵＸを利用して、低継代数患者由来細胞株（Ｐａ０３Ｃ）がＣＡＦと同時注入されるインビボ共培養モデルにおいて、Ｒｅｆ−１／ＳＴＡＴ３阻害の効果を評価した。具体的には、ＮＳＧマウス（１処置群につきｎ＝５）を、５日間投薬、２日間休薬で、２週間にわたって、５０ｍｇ／ｋｇのＡＰＸ３３３０により、１日２回（ＢＩＤ）、腹腔内（ＩＰ）処置し、かつ／または各午後の処置時に１日１回（ＳＩＤ）、腹腔内（ＩＰ）投与される５０ｍｇ／ｋｇのＲＵＸで処置した。図１６に示すように、ＡＰＸ３３３０＋ＲＵＸの同時処置は、この共培養インビボモデルにおける腫瘍成長を強力に阻害した。併用処置の効果を見るために亜致死量の単剤（５０ｍｇ／ｋｇ）を使用し、併用処置はマウスにおいて忍容性が高かった。

【0084】

上述したことによれば、これら２つのタンパク質の二重標的化は、ＰＤＡＣ細胞に対して合成的致死事象に相当する。

【0085】

実施例４
この実施例では、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ）細胞株における細胞の生存および増殖に対するＲｅｆ−１阻害の効果を分析した。

【0086】

方法および材料
ＮＦ１患者に由来するＳＴ８８１４ ＭＰＮＳＴ細胞はＡＴＣＣ（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、英国ミドルセックス）から購入した。ＭＰＮＳＴ ２４４７２から樹立された細胞株であるＳ４６２ ＭＰＮＳＴ細胞株は、１９歳の女性ＮＦ１患者から採取された。言及した細胞株はすべて、７５ｃｍ^２フラスコにおいて、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ Ｓｔｒｅｐ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を使って培養した。細胞株は５％ＣＯ_２下、３７℃でインキュベートした。

【0087】

軟寒天腫瘍形成アッセイ
６ウェルプレートにおいて二層軟寒天アッセイを企てた。簡単に述べると、０．６％寒天層上の、０．３５％寒天を含有する完全培地に、１０^３個のＭＰＮＳＴ細胞をプレーティングした。寒天に完全培地を重層し、細胞コロニーを５％ＣＯ_２中、３７℃で７日間成長させた。培地を週に３回変え、培地を変える度にプレートを５０μＭのＥ３３３０で処理した。オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）カメラを装着したＡＭＧ ＥＶＯＳ倒立顕微鏡を使って、代表的な位相差像を撮影した（図１７）。

【0088】

創傷治癒
細胞を３５ｍｍプレートに播種し、８０〜９０％コンフルエントに到達させた。次に、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ ＤＭＥＭ中で２４時間にわたって細胞を同期させ、ピペットチップで擦過することによって「傷つけた」。死細胞をＰＢＳ洗浄で除去した後、ＤＭＥＭ（１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）で置き換えた。細胞を５０μＭ Ｅ３３３０で処理し、１８時間、インキュベーター（５％ＣＯ_２／３７℃）に入れておいた。ＩｍａｇｅＪを使って擦過面積を測定した。オリンパスカメラを装着したＡＭＧ ＥＶＯＳ倒立顕微鏡を使って、処理の前および処理の１８時間後に、写真を撮影した（図１８Ａおよび図１９Ａ）。次に、移動した細胞のパーセンテージを算出した（図１８Ｂおよび図１９Ｂ）。有意性を決定するためにＰｒｉｓｍを使ってＴ検定を行った。３回の独立した実験を行った。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図7E】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18A】

【図18B】

【図19A】

【図19B】