特許第6862845号(P6862845)IP Force 特許公報掲載プロジェクト 2022.1.31 β版

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特許6862845可溶性インターロイキン−2受容体の測定方法及び測定用試薬
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6862845
(24)【登録日】2021年4月5日
(45)【発行日】2021年4月21日
(54)【発明の名称】可溶性インターロイキン−2受容体の測定方法及び測定用試薬
(51)【国際特許分類】
   G01N 33/53 20060101AFI20210412BHJP
   G01N 33/543 20060101ALI20210412BHJP
   G01N 33/545 20060101ALI20210412BHJP
【FI】
   G01N33/53 D
   G01N33/543 581D
   G01N33/545 B
【請求項の数】6
【全頁数】20
(21)【出願番号】特願2017-8108(P2017-8108)
(22)【出願日】2017年1月20日
(65)【公開番号】特開2017-134067(P2017-134067A)
(43)【公開日】2017年8月3日
【審査請求日】2019年12月3日
(31)【優先権主張番号】特願2016-10360(P2016-10360)
(32)【優先日】2016年1月22日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】000162478
【氏名又は名称】日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(72)【発明者】
【氏名】古池 真司
(72)【発明者】
【氏名】守田 和樹
【審査官】 三好 貴大
(56)【参考文献】
【文献】 特開2014−059299(JP,A)
【文献】 特開2012−026975(JP,A)
【文献】 国際公開第2015/166790(WO,A1)
【文献】 国際公開第02/079782(WO,A1)
【文献】 国際公開第2011/010673(WO,A1)
【文献】 特開2014−186041(JP,A)
(58)【調査した分野】(Int.Cl.,DB名)
G01N 33/48−33/98
JSTPlus/JMEDPlus/JST7580(JDreamIII)
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
試料と、第1緩衝剤を含む第1試薬と、を混合する第1手順;ここで、前記第1緩衝剤は、乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤及びグリシン緩衝剤から選択されるいずれか一以上であり、と、
前記第1手順の混合液と、
可溶性インターロイキン−2受容体(以下、sIL−2Rと記す)に結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していないラテックス粒子と、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していないラテックス粒子と、第2緩衝剤と、含む第2試薬と、
を混合し、反応させる第2手順;ここで、前記第2緩衝剤は、2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝剤、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−Tris)緩衝剤、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)緩衝剤、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)緩衝剤、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)緩衝剤、2−[N−(2−アセトアミド)アミノ]エタンスルホン酸(ACES)緩衝剤、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)緩衝剤、2−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]エタンスルホン酸(BES)緩衝剤、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)緩衝剤、2−{N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸(TES)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジン(HEPES)緩衝剤、3−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)緩衝剤、2−ヒドロキシ−3−{[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸(TAPSO)緩衝剤、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパン−3−スルホン酸)(POPSO)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)ピペラジン(HEPPSO)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(3−スルホプロピル)ピペラジン(EPPS)緩衝剤、[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン](Tricine)緩衝剤、[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン](Bicine)緩衝剤、3−[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノプロパンスルホン酸(TAPS)緩衝剤、2−(N−シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)緩衝剤、3−(N−シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)緩衝剤及び3−(N−シクロヘキシルアミノ)プロパンスルホン酸(CAPS)緩衝剤から選択されるいずれか一以上のグッド緩衝剤であり、
抗原抗体反応によって生じた凝集を測定する第3手順と、
を含むことを特徴とする、試料中のsIL−2Rの測定方法。
【請求項2】
第1抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第2抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】
第1抗体及び第2抗体が共にモノクローナル抗体である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項4】
第1緩衝剤を含む第1試薬;ここで、前記第1緩衝剤は、乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤及びグリシン緩衝剤から選択されるいずれか一以上であり、と、
可溶性インターロイキン−2受容体(以下、sIL−2Rと記す)に結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していないラテックス粒子と、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していないラテックス粒子と、第2緩衝剤と、を含む第2試薬;ここで、前記第2緩衝剤は、2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝剤、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−Tris)緩衝剤、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)緩衝剤、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)緩衝剤、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)緩衝剤、2−[N−(2−アセトアミド)アミノ]エタンスルホン酸(ACES)緩衝剤、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)緩衝剤、2−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]エタンスルホン酸(BES)緩衝剤、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)緩衝剤、2−{N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸(TES)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジン(HEPES)緩衝剤、3−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)緩衝剤、2−ヒドロキシ−3−{[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸(TAPSO)緩衝剤、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパン−3−スルホン酸)(POPSO)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)ピペラジン(HEPPSO)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(3−スルホプロピル)ピペラジン(EPPS)緩衝剤、[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン](Tricine)緩衝剤、[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン](Bicine)緩衝剤、3−[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノプロパンスルホン酸(TAPS)緩衝剤、2−(N−シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)緩衝剤、3−(N−シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)緩衝剤及び3−(N−シクロヘキシルアミノ)プロパンスルホン酸(CAPS)緩衝剤から選択されるいずれか一以上のグッド緩衝剤である、
を含むことを特徴とする、試料中のsIL−2Rの測定用試薬。
【請求項5】
第1抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第2抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、請求項に記載の試薬。
【請求項6】
第1抗体及び第2抗体が共にモノクローナル抗体である、請求項又はに記載の試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、可溶性インターロイキン−2受容体の測定方法、及び、可溶性インターロイキン−2受容体の測定用試薬に関する。
【背景技術】
【0002】
インターロイキン−2受容体(以下、IL−2Rと記す)はα鎖、β鎖、γ鎖から構成されているが、α鎖の一部が細胞上から遊離した可溶性インターロイキン−2受容体(以下、sIL−2Rと記す)が血中に存在することが知られている(特許文献1、非特許文献1参照)。sIL−2Rは活性化T細胞、B細胞によって産生されるために、生体の免疫防御機構の活性化、T細胞系及びB細胞系などの活性化に伴い血中のsIL−2Rが上昇することが報告されている。血清中のsIL−2R濃度は、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(SLE)などの自己免疫疾患や、ウイルス性肝炎、後天性免疫不全症候群(AIDS)などのウイルス感染症の患者で高値を示し、体内の活性化リンパ球量の指標の1つとなることが報告されている(非特許文献2参照)。また腫瘍細胞がsIL−2Rを産生し、成人T細胞白血病(ATL)や非ホジキンリンパ腫の進行と血清中のsIL−2R濃度の変動が良く相関することが知られている(非特許文献3、非特許文献4参照)。このようにsIL−2Rに関して、様々な免疫系の疾患や病態との関連が報告されており、なかでも造血疾患の有望な血液中のマーカーと認識されている。血清中のsIL−2R濃度は成人T細胞白血病においては病態モニタリングの指標など、非ホジキンリンパ腫においては治療効果の判定、寛解後のモニタリング、再発の早期発見の指標などとして臨床的に有効活用されている。
【0003】
血清や血漿等の試料中のsIL−2Rの測定方法としては、sIL−2Rに結合する抗体を用いる免疫測定法によるsIL−2Rの測定方法が知られており、sIL−2Rに結合する抗体を担持する不溶性担体として、プレートを用いる方法(特許文献2)や磁性粒子を用いる方法(特許文献3)等が知られている。これらの方法においては、sIL−2Rに結合する抗体とsIL−2Rとを抗原抗体反応させ免疫複合体を形成させたのち、免疫複合体中の標識の量を測定することにより、血清又は血漿等の試料中のsIL−2R濃度を測定することを原理とする標識法が用いられている。しかしながら、これらの標識法は、一般的に、免疫複合体中の標識の量を測定する前に、血清又は血漿等の試料中に含まれるsIL−2R以外の物質を取り除くために、洗浄液を用いて洗浄(B/F分離)を行う必要があり、測定に時間を要する。
【0004】
一方、標識を使用しない免疫測定法の1つにラテックス凝集比濁法がある(特許文献4、5)。ラテックス凝集比濁法は、測定対象成分に結合する抗体または抗原を結合したラテックス粒子を用いて、検体中の測定対象成分と抗原抗体反応を起こさせ、ラテックス粒子の凝集による濁度変化を吸光度として測定する方法であり、B/F分離が不要な方法であるため、生化学検査用の汎用自動分析機での測定にも適用されている。しかしながら、ラテックス凝集比濁法は測定感度が悪いという問題があり、高感度が必要とされる測定対象成分の測定には適用が難しい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開昭62−70761号公報
【特許文献2】WO2005/121795号パンフレット
【特許文献3】WO2012/029837号パンフレット
【特許文献4】特開2006−017745号公報
【特許文献5】特開2014−153102号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】The Journal of Immunology, vol.135, No.5, p.3172〜3177 (1985).
【非特許文献2】Clinical immunology and immunopathology, vol.50, No.3, p.321〜332 (1989).
【非特許文献3】臨床病理,vol.42, No.8, p.834-842 (1994).
【非特許文献4】臨床検査,vol.35, No.1, p.87-91 (1991).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明の目的は、簡便で、かつ、高感度な試料中のsIL−2Rの測定方法及び測定用試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、試料を、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子と反応させる免疫凝集法により、簡便かつ高感度に、試料中のsIL−2Rを測定できる、という知見を見出して本発明を完成させた。すなわち、本発明は、以下の[1]〜[8]に関する。
[1] 試料と、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子と、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させ、抗原抗体反応によって生じた凝集を測定することを特徴とする、試料中のsIL−2Rの測定方法。
[2] 第1抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第2抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、[1]に記載の方法。
[3] 第1抗体及び第2抗体が共にモノクローナル抗体である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4] sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子が、共にラテックス粒子である、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
【0009】
[5] sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子と、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子とを含むことを特徴とする、試料中のsIL−2Rの測定用試薬。
[6] 第1抗体と不溶性担体粒子との結合、及び、第2抗体と不溶性担体粒子との結合が共に化学結合である、[5]に記載の試薬。
[7] 第1抗体及び第2抗体が共にモノクローナル抗体である、[5]又は[6]に記載の試薬。
[8] sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子が、共にラテックス粒子である、[5]〜[7]のいずれかに記載の試薬。
【発明の効果】
【0010】
本発明により簡便で、かつ、高感度な試料中のsIL−2Rの測定方法及び測定用試薬が提供される。
【発明を実施するための形態】
【0011】
(測定方法)
本発明の測定方法は、試料と、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子と、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させ、抗原抗体反応によって生じた凝集を測定することを特徴とする、試料中のsIL−2Rの測定方法である。
【0012】
本発明のsIL−2Rの測定方法としては、例えば以下の工程を含有する方法等が挙げられる。
[1]試料と、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子とを反応させる工程;
[2]工程[1]の反応液に、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子を添加し、試料と、当該第1抗体、及び、当該第2抗体とを反応させ凝集を生成させる工程;
[3]工程[2]で生成した凝集を測定する工程;
[4]既知濃度のsIL−2Rを試料として用いて、上記[1]〜[3]を行うことにより、予め作成した、sIL−2R濃度と凝集との関係を表す検量線と、工程[3]で測定された凝集の測定値とから、試料中のsIL−2R濃度を決定する工程。
【0013】
工程[1]及び工程[2]は順次行っても、同時に行ってもよい。工程[1]及び工程[2]の反応、すなわち、抗原抗体反応は水性媒体中で行うことができる。水性媒体としては、本発明の測定方法を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば後述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、後述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。また、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子は、抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方(A)が結合した第1抗体と、一組の親和性物質のもう一方(a)が結合した不溶性担体粒子とを反応させることにより、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子を生成することができる。同様に、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子は、抗原抗体反応の反応液中で生成されてもよく、この場合、一組の親和性物質の片方(B)が結合した第2抗体と、一組の親和性物質のもう一方(b)が結合した不溶性担体粒子とを反応させることにより、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子を生成することができる。ここで、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子と、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子とが同一の反応液中で生成する場合には、A及びaからなる一組の親和性物質は、B及びbからなる一組の親和性物質とは異なっていることが好ましい。一組の親和性物質としては、例えばアビジン類(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等)とビオチンとの組み合わせ、抗体のFc領域と、Fc領域と結合する抗体との組み合わせ等が挙げられる。A−aの組み合わせとB−bの組み合わせとが異なる場合における、A−aの組み合わせ、及び、B−bの組み合わせとしては、例えば以下の組み合わせが挙げられる。
・ビオチン−アビジン類、又は、アビジン類−ビオチンの組み合わせ;第2抗体のFc領域と、当該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ。
・第1抗体のFc領域と、当該Fc領域と結合する抗体との組み合わせ;ビオチン−アビジン類、又は、アビジン類−ビオチンの組み合わせ。
【0014】
工程[1]及び工程[2]における抗原抗体反応の反応温度は、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、20〜40℃が特に好ましい。工程[1]及び工程[2]における抗原抗体反応の反応時間は、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、1分間〜1時間であり、2〜20分間が好ましい。
【0015】
工程[1]において、試料を予め後述の水性媒体で希釈して保持した後に抗原抗体反応に供することもできる。水性媒体には、後述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。試料を予め水性媒体で希釈して保持する温度は、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、通常、0〜50℃であり、4〜45℃が好ましく、20〜40℃が特に好ましい。試料を予め水性媒体で希釈して保持する時間は、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする時間であれば特に制限はなく、通常、1分間〜1時間であり、2〜20分間が好ましい。
【0016】
工程[3]において、工程[2]で生成した凝集を測定する方法としては、工程[2]で生成した凝集を測定し得る方法であれば特に制限はなく、例えば特定の波長での吸光度を測定する方法等が挙げられる。波長としては、工程[2]で生成した凝集を測定し得る波長であれば特に制限はなく、例えば570nm等が挙げられる。
【0017】
工程[4]において、既知濃度のsIL−2Rを試料として用いて工程[1]〜[3]を行うことにより、予め作成した、sIL−2R濃度と凝集との関係を表す検量線と、工程[3]で測定した凝集とから、試料中のsIL−2R濃度を決定することができる。
【0018】
本発明における試料としては、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする試料であれば特に制限はなく、例えば全血、血漿、血清、髄液、唾液、羊水、尿、汗、膵液等が挙げられるが、全血、血漿、血清等が好ましい。
【0019】
sIL−2Rに結合する抗体(第1抗体及び第2抗体)と不溶性担体粒子との間の結合としては、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする結合であれば特に制限はなく、物理吸着、化学結合等が挙げられる。物理吸着としては、例えば静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、例えば共有結合、配位結合等が挙げられる。
【0020】
sIL−2Rに結合する抗体(第1抗体及び第2抗体)は、前述の物理吸着及び/又は化学結合を利用して、直接、不溶性担体粒子に固定化してもよいし、間接的に不溶性担体粒子に固定化してもよい。間接的な固定化方法としては、例えばビオチンとアビジン類(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等)との特異的結合を介して、抗体を不溶性担体粒子に固定化する方法が挙げられる。あるいは、抗体は、リンカーを介した共有結合により不溶性担体粒子に固定化してもよい。
【0021】
リンカーとしては、不溶性担体粒子表面の官能基と抗体の側鎖の官能基の両者を共有結合できる分子等が挙げられ、例えば、抗体が有する官能基と反応することができる第1の反応活性基と、不溶性担体粒子表面の官能基と反応することができる第2の反応活性基とを同時に持つ分子であって、第1の反応活性基と第2の反応活性基が異なる基である分子が好ましく用いられる。抗体の官能基および不溶性担体粒子がその表面に保持している官能基としては例えば、カルボキシ基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、N−ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、例えば、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステル、ペンタフルオロフェニル(PFP)エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。
【0022】
本発明における水性媒体としては、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする水性媒体であれば特に制限はなく、例えば脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、緩衝能を有するものならば特に制限されないが、pH1〜11の例えば乳酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、フタル酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、トリエタノールアミン緩衝剤、ジエタノールアミン緩衝剤、リジン緩衝剤、バルビツール緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、リンゴ酸緩衝剤、シュウ酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、ホウ酸緩衝剤、炭酸緩衝剤、グリシン緩衝剤、グッド緩衝剤等が挙げられる。
【0023】
グッド緩衝剤としては、例えば2−モルホリノエタンスルホン酸(MES)緩衝剤、ビス(2−ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン(Bis−Tris)緩衝剤、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)緩衝剤、N−(2−アセトアミド)イミノ二酢酸(ADA)緩衝剤、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)緩衝剤、2−[N−(2−アセトアミド)アミノ]エタンスルホン酸(ACES)緩衝剤、3−モルホリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)緩衝剤、2−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]エタンスルホン酸(BES)緩衝剤、3−モルホリノプロパンスルホン酸(MOPS)緩衝剤、2−{N−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}エタンスルホン酸(TES)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−スルホエチル)ピペラジン(HEPES)緩衝剤、3−[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)アミノ]−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(DIPSO)緩衝剤、2−ヒドロキシ−3−{[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ}プロパンスルホン酸(TAPSO)緩衝剤、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパン−3−スルホン酸)(POPSO)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)ピペラジン(HEPPSO)緩衝剤、N−(2−ヒドロキシエチル)−N’−(3−スルホプロピル)ピペラジン(EPPS)緩衝剤、[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン](Tricine)緩衝剤、[N,N−ビス(2−ヒドロキシエチル)グリシン](Bicine)緩衝剤、3−[N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノプロパンスルホン酸(TAPS)緩衝剤、2−(N−シクロヘキシルアミノ)エタンスルホン酸(CHES)緩衝剤、3−(N−シクロヘキシルアミノ)−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(CAPSO)緩衝剤、3−(N−シクロヘキシルアミノ)プロパンスルホン酸(CAPS)緩衝剤等が挙げられる。
【0024】
本発明における金属イオンとしては、例えばマグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。本発明における糖類としては、例えばマンニトール、ソルビトール等が挙げられる。本発明における防腐剤としては、例えばアジ化ナトリウム、抗生物質(ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシン等)、バイオエース、プロクリン300、プロキセル(Proxel)GXL等が挙げられる。本発明における蛋白質としては、例えばウシ血清アルブミン(BSA)、ウシ胎児血清(FBS)、カゼイン、ブロックエース(DSファーマバイオメディカル社製)等が挙げられる。本発明における界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。
【0025】
本発明における凝集促進剤としては、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルセルロース、デキストラン、Lipidure類(Lipidure BL-206等;日油社製)、Ficoll類(Ficoll 400等;GEヘルスケア社製)等が挙げられる。
【0026】
本発明における不溶性担体粒子としては、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする不溶性担体粒子であれば特に制限はなく、例えば、ラテックス粒子、磁性粒子等が挙げられ、ラテックス粒子が好ましい。ラテックス粒子の素材としては、例えばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン等が挙げられる。
【0027】
本発明における反応溶液中の不溶性担体粒子の形状は、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする形状であれば特に制限はなく、例えば球状、円柱状等が挙げられ、球状が好ましい。球状の粒子の粒径としては、通常、平均粒径30〜800nmであり、平均粒径100〜500nmが好ましく、平均粒径150〜450nmがより好ましい。本発明における反応溶液中の不溶性担体粒子の濃度は、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、通常、0.0001〜10重量%であり、0.0005〜5重量%が好ましく、0.001〜0.1重量%がより好ましい。
【0028】
sIL−2Rに結合する第1抗体を結合させる不溶性担体粒子と、sIL−2Rに結合する第2抗体を結合させる不溶性担体粒子とは同じであっても異なっていてもよいが、同じである方が好ましい。
【0029】
本発明におけるsIL−2Rに結合する抗体(第1抗体及び第2抗体)は、sIL−2Rに結合し、本発明のsIL−2Rの測定を可能とする抗体であれば特に制限はなく、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれも使用できるが、モノクローナル抗体が好ましい。また、本発明においては、全長の抗体のみならず、抗体フラグメントを用いることもできる。抗体フラグメントとしては、例えば、抗体をパパイン処理により得られるFab、ペプシン処理により得られるF(ab’)、ペプシン処理−還元処理により得られるFab’等のFc部分を除去した抗体フラグメント等が挙げられる。不溶性担体粒子として、アビジン、ニュートラアビジン又はストレプトアビジンがその表面に固定化された不溶性担体粒子を用いる場合には、第1抗体にビオチンが結合したビオチン結合第1抗体及び第2抗体にビオチンが結合したビオチン結合第2抗体を用いることができる。
【0030】
本発明において使用される、sIL−2Rに結合する第1抗体が認識するsIL−2Rの部位と、sIL−2Rに結合する第2抗体が認識するsIL−2Rの部位とは同じであっても、異なっていてもよいが、異なっていることが好ましい。
【0031】
本発明において使用される、sIL−2Rに結合する抗体は、sIL−2Rそのもの、又は、sIL−2R中のエピトープに相当するペプチドを抗原として用いる通常の抗体の製造方法により製造することができるが、市販品としても入手可能である。sIL−2Rに結合する抗体の市販品としては、例えばモノクローナル抗体AM92.3(ピアース社製)、モノクローナル抗体7G7/B6(ピアース社製)等が挙げられる。
【0032】
(測定用試薬)
本発明の試料中のsIL−2R測定用試薬は、本発明のsIL−2Rの測定方法に使用される試薬であり、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子、及び、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子を含有する。
【0033】
本発明の測定用試薬は凍結乾燥状態でも液状でもよい。凍結乾燥状態の測定用試薬を用いる場合には、予め水性媒体で溶解した後、測定に供する。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、前述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。液状の測定用試薬には、水性媒体が含まれている。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、前述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。
【0034】
本発明の測定用試薬における、不溶性担体粒子、sIL−2Rに結合する抗体(第1抗体、第2抗体)としては、前述の不溶性担体粒子、sIL−2Rに結合する抗体(第1抗体、第2抗体)がそれぞれ挙げられる。本発明の測定用試薬における不溶性担体粒子の含量は、水性媒体で溶解された時の濃度または、水性媒体中の濃度が、通常0.0001〜10重量%となる含量であり、0.0005〜5重量%となる含量が好ましく、0.001〜0.1重量%となる含量がより好ましい。
【0035】
本発明の測定用試薬において、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子は、抗原抗体反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の試薬には、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子の代わりに、一組の親和性物質の片方(A)が結合した第1抗体と、一組の親和性物質のもう一方(a)が結合した不溶性担体粒子を含む。同様に、本発明の測定用試薬において、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子は、抗原抗体反応液中で生成されてもよい。この場合、本発明の試薬には、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子の代わりに、一組の親和性物質の片方(B)が結合した第2抗体と、一組の親和性物質のもう一方(b)が結合した不溶性担体粒子を含む。ここで、(A)が結合した第1抗体と(a)が結合した不溶性担体粒子とから、第1抗体が結合した不溶性担体粒子を生成させる反応と、(B)が結合した第2抗体と(b)が結合した不溶性担体粒子とから、第2抗体が結合した不溶性担体粒子を生成させる反応とが、同一の反応液中で行われる試薬の場合、A及びaからなる一組の親和性物質は、B及びbからなる一組の親和性物質とは異なっていることが好ましい。一組の親和性物質としては、例えば前述の親和性物質等が挙げられ、A−aの組み合わせとB−bの組み合わせとが異なる場合における、A−aの組み合わせ、及び、B−bの組み合わせとしては、例えば前述の組み合わせ等が挙げられる。
【0036】
本発明の測定用試薬において、試料を前処理するための試料前処理試薬が含まれていてもよい。前処理としては、例えば希釈、可溶化、変性等が挙げられる。試料前処理試薬としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、前述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。試料前処理試薬は液状でも凍結乾燥状態でもよい。凍結乾燥状態の試料前処理試薬を用いる場合には、予め水性媒体で溶解した後、試料の前処理に用いることができる。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体等が挙げられる。水性媒体には、前述の金属イオン、糖類、防腐剤、蛋白質、界面活性剤、凝集促進剤等が含有されてもよい。
【0037】
本発明の測定用試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態と取ることもできる。キットの形態としては、sIL−2Rの測定を可能とする形態であれば特に制限はなく、例えば2試薬系のキット、3試薬系のキット等が挙げられる。sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子として、一組の親和性物質の片方(A)が結合した第1抗体と、一組の親和性物質のもう一方(a)が結合した不溶性担体粒子を用いる場合には、一組の親和性物質の片方(A)が結合した第1抗体と、もう一方の(a)が結合した不溶性担体粒子とは、同一の試薬に含まれても、別々の試薬に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。また、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子として、一組の親和性物質の片方(B)が結合した第2抗体と、一組の親和性物質のもう一方(b)が結合した不溶性担体粒子を用いる場合には、一組の親和性物質の片方(B)が結合した第1抗体と、もう一方の(b)が結合した不溶性担体粒子とは、同一の試薬に含まれても、別々の試薬に含まれてもよいが、別々の試薬に含まれることが好ましい。
【0038】
本発明の測定用キットの具体的態様を以下に例示する。
・測定用キット1
sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子と、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子とを含む第1試薬;及び、
試料前処理試薬を含む第2試薬
を含む、試料中のsIL−2R測定用キット。
・測定用キット2
sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第1試薬;及び、
sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第2試薬
を含む、試料中のsIL−2R測定用キット。
・測定用キット3
sIL−2Rに結合する第1抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第2抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第1試薬;
sIL−2Rに結合する第2抗体が結合しており、かつ、sIL−2Rに結合する第1抗体が結合していない不溶性担体粒子を含む第2試薬;及び、
試料前処理試薬を含む第3試薬
を含む、試料中のsIL−2R測定用キット。
【0039】
以下、実施例により本発明を実施例、比較例、参考例により、更に詳細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限するものではない。尚、以下の実施例、比較例、参考例においては、次のメーカーの試薬類を使用した。
【0040】
カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス(粒径330nm、藤倉化成社製)、抗sIL−2Rモノクローナル抗体AM92.3(ピアース社製)、抗sIL−2Rモノクローナル抗体7G7/B6(ピアース社製)、Sulfo-NHS(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)、1-[3-(ジメチルアミノ)プロピル]-3-エチルカルボジイミド(WSC)(和光純薬工業社製)、リン酸水素二ナトリウム・12水和物(関東化学社製)、リン酸二水素ナトリウム・2水和物(関東化学社製)、HEPES (同仁化学研究所社製)、塩化ナトリウム(和光純薬工業社製)、BSA(Bovogen社製)、ツイーン20(非イオン性界面活性剤;シグマ−アルドリッチ社製)、ヒドロキシエチルセルロース(同仁化学研究所社製)。
【実施例1】
【0041】
以下の組成のsIL−2R測定用試薬を調製した。
〔第1試薬〕
リン酸緩衝液(pH8.0) 0.1 mol/L
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.15 mol/L
ヒドロキシエチルセルロース 0.15%
〔第2試薬〕
HEPES(pH7.7) 0.01 mol/L
BSA 0.1%
第1抗体結合ラテックス粒子1(参考例1で製造) 0.01重量%
第2抗体結合ラテックス粒子1(参考例2で製造) 0.01重量%
【0042】
[比較例1]
実施例1おける第1抗体結合ラテックス粒子1及び第2抗体結合ラテックス粒子1に代えて、同一のラテックス粒子上に第1抗体及び第2抗体が結合した、第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子1を含有する以下の組成のsIL−2R測定用試薬を調製した。
〔第1試薬〕
リン酸緩衝液(pH8.0) 0.1 mol/L
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.15 mol/L
ヒドロキシエチルセルロース 0.15%
〔第2試薬〕
HEPES(pH7.7) 0.01 mol/L
BSA 0.1%
第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子1(参考例3で製造) 0.02重量%
【実施例2】
【0043】
第1抗体結合ラテックス粒子1及び第2抗体結合ラテックス粒子1を含有する実施例1のsIL−2R測定用試薬と、第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子1を含有する比較例1のsIL−2R測定用試薬を用いて、sIL−2Rの測定感度を比較した。
(1)sIL−2R溶液の調製
抗原用希釈液(4%BSA、0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)を用いて300000U/mL sIL−2R溶液を希釈し、1000U/mLのsIL−2R溶液を調製した。
(2)sIL−2Rの測定
分光光度計U−3000(日立ハイテクノロジーズ社製)を使用し、反応温度37℃にて、前記sIL−2R溶液5μLと第1試薬150μLとをセルに加えて均一攪拌した後、5分間保持した。その後、37℃で保持しながら、第2試薬50μLを当該反応液に加えて均一攪拌した後、30秒経過後の反応液の570nmでの吸光度と300秒経過後の反応液の570nmでの吸光度との差(ΔAbs)を測定した。ΔAbsが高い程、高感度で測定できることを意味する。実施例1の試薬又は比較例1の試薬を用いて測定した結果を表1に示す。表1から、本発明の実施例1のsIL−2R測定用試薬は、比較例1のsIL−2R測定用試薬と比較して、試料中のsIL−2Rを高感度で測定できることがわかる。
【0044】
【表1】
【実施例3】
【0045】
以下の組成のsIL−2R測定用試薬を調製した。
〔第1試薬〕
リン酸緩衝液(pH8.0) 0.1 mol/L
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.6 mol/L
ヒドロキシエチルセルロース 0.225%
〔第2試薬〕
HEPES(pH7.7) 0.01 mol/L
BSA 0.1%
第1抗体結合ラテックス粒子1(参考例1で製造) 0.01重量%
第2抗体結合ラテックス粒子1(参考例2で製造) 0.01重量%
【実施例4】
【0046】
不溶性担体としてプレートを用いる、体外診断用医薬品であるsIL−2R測定用試薬「セルフリーN IL−2R」(協和メデックス社製)及び実施例3のsIL−2R測定用試薬を用いて、それぞれの試薬を用いた場合のsIL−2R濃度を比較した。
(1)測定試料
sIL−2Rを含有する3種の血清(血清1、血清2、血清3:アリエス社より購入)、セルフリーN IL−2R付属の較正試薬レベルI、IIを測定試料とした。
【0047】
(2)セルフリーN IL−2Rを用いた試料中sIL−2R濃度の測定
セルフリーN IL−2Rに付属の添付文書に記載の方法に従い、(1)の試料中のsIL−2R濃度を測定した。その結果を表2に示す。
【0048】
(3)実施例3の試薬を用いた試料中sIL−2R濃度の測定
(3)−A 検量線の作成
WO2005/121795に記載された方法によって製造したsIL−2Rを、抗原用希釈液(4%BSA、0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)により、sIL−2R濃度が186 U/mL、590 U/mL、1763 U/mL、5307 U/mL、10564 U/mLになるように希釈したsIL−2R溶液、及び抗原用希釈液(sIL−2R濃度 0 U/mL)を標準試料とした。
【0049】
日立7170型自動分析装置(日立ハイテクノロジーズ社製)を使用し、反応温度37℃にて、前記標準試料5μLと第1試薬150μLとをセルに加えて均一攪拌した後、5分間保持した。その後、37℃で保持しながら、第2試薬50μLを当該反応液に加えて均一攪拌した後、36秒経過後の反応液の570nmでの吸光度と324秒経過後の反応液の570nmでの吸光度との差(ΔAbs)を測定した。各濃度のsIL−2R標準試料を測定した際のΔAbsを縦軸、sIL−2R標準試料の濃度を横軸にプロットし、sIL−2R濃度とΔAbsとの関係を示す検量線を作成した。
【0050】
(3)−B (1)の試料の測定
(1)の試料について、実施例3のsIL−2R測定用試薬を用いて、以下の方法で、各試料のΔAbsを測定した。
日立7170型自動分析装置を使用し、反応温度37℃にて、(1)の試料5μLと第1試薬150μLとをセルに加えて均一攪拌した後、5分間保持した。その後、37℃で保持しながら、第2試薬50μLを当該反応液に加えて均一攪拌した後、36秒経過後の反応液の570nmでの吸光度と324秒経過後の反応液の570nmでの吸光度との差(ΔAbs)を測定した。
【0051】
(3)−C 試料中のsIL−2R濃度の算出
(3)−Aで作成した検量線を用いて、(3)−Bにより得られた各試料のΔAbsから、各試料中のsIL−2R濃度を算出した。その結果を表2に示す。
【0052】
表2に示すように、実施例3の本発明のsIL−2R測定用試薬を用いて測定した場合のsIL−2R濃度は、セルフリーN IL−2Rを用いて測定した場合のsIL−2R濃度とほぼ一致しており、実施例3のsIL−2R測定用試薬を用いて、sIL−2R濃度を正確に測定できることがわかる。
【0053】
【表2】
【実施例5】
【0054】
以下の組成のsIL−2R測定用試薬を調製した。
〔第1試薬〕
リン酸緩衝液(pH8.0) 0.1 mol/L
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.3 mol/L
ヒドロキシエチルセルロース 0.075%
〔第2試薬〕
HEPES(pH7.7) 0.01 mol/L
BSA 0.1%
第1抗体結合ラテックス粒子2(参考例4で製造) 0.01重量%
第2抗体結合ラテックス粒子2(参考例5で製造) 0.01重量%
【実施例6】
【0055】
本発明の、抗体とラテックス粒子とが物理吸着した抗体結合ラテックス粒子を含む、実施例5のsIL−2R測定用試薬を用いて、sIL−2Rを測定した。
(1)sIL−2R溶液の調製
抗原用希釈液(4%BSA、0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)を用いて、10000U/mLのsIL−2R溶液を調製した。
(2)sIL−2Rの測定
分光光度計U−3000を使用し、波長570nmおよび反応温度37℃にて、前記sIL−2R溶液5μLと第1試薬150μLとをセルに加えて均一攪拌した後、5分間保持した。その後、37℃で保持しながら、第2試薬50μLを当該反応液に加えて均一攪拌した後、30秒経過後の反応液の570nmでの吸光度と300秒経過後の反応液の570nmでの吸光度との差(ΔAbs)を測定した。その結果を表3に示す。
【0056】
【表3】
【実施例7】
【0057】
以下の組成のsIL−2R測定用試薬を調製した。
〔第1試薬〕
リン酸緩衝液(pH8.0) 0.1 mol/L
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.3 mol/L
ヒドロキシエチルセルロース 0.2%
〔第2試薬〕
HEPES(pH7.7) 0.01 mol/L
BSA 0.1%
第1抗体結合ラテックス粒子1(参考例1で製造) 0.01重量%
第2抗体結合ラテックス粒子1(参考例2で製造) 0.01重量%
【実施例8】
【0058】
実施例7における第1抗体結合ラテックス粒子1及び第2抗体結合ラテックス粒子1に代えて、第1抗体結合ラテックス粒子2及び第2抗体結合ラテックス粒子2を含有する以下の組成のsIL−2R測定用試薬を調製した。
〔第1試薬〕
リン酸緩衝剤(pH8.0) 0.1 mol/L
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.3 mol/L
ヒドロキシエチルセルロース 0.2%
〔第2試薬〕
HEPES緩衝剤(pH7.7) 0.01 mol/L
BSA 0.1%
第1抗体結合ラテックス粒子2(参考例4で製造) 0.01重量%
第2抗体結合ラテックス粒子2(参考例5で製造) 0.01重量%
【0059】
[比較例2]
実施例7おける第1抗体結合ラテックス粒子1及び第2抗体結合ラテックス粒子1に代えて、同一のラテックス粒子上に第1抗体及び第2抗体が結合した、第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子2を含有する以下の組成のsIL−2R測定用試薬を調製した。
〔第1試薬〕
リン酸緩衝剤(pH8.0) 0.1 mol/L
BSA 0.1%
塩化ナトリウム 0.3 mol/L
ヒドロキシエチルセルロース 0.2%
〔第2試薬〕
HEPES緩衝剤(pH7.7) 0.01 mol/L
BSA 0.1%
第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子2(参考例6で製造) 0.02重量%
【実施例9】
【0060】
第1抗体結合ラテックス粒子1及び第2抗体結合ラテックス粒子1を含有する実施例7のsIL−2R測定用試薬と、第1抗体結合ラテックス粒子2及び第2抗体結合ラテックス粒子2を含有する実施例8のsIL−2R測定用試薬と、第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子2を含有する比較例2のsIL−2R測定用試薬を用いて、sIL−2Rの測定感度を比較した。
【0061】
(1)sIL−2R溶液の調製
実施例2の抗原用希釈液を用いて300000U/mL sIL−2R溶液を希釈し、100000U/mLのsIL−2R溶液を調製した。
【0062】
(2)sIL−2Rの測定
分光光度計U−3000(日立ハイテクノロジーズ社製)を使用し、波長570nmおよび反応温度37℃にて、前記sIL−2R溶液5μLと第1試薬150μLとをセルに加えて均一攪拌した後、5分間保持した。その後、37℃で保持しながら、第2試薬50μLを当該反応液に加えて均一攪拌した後、30秒経過後の反応液の570nmでの吸光度と300秒経過後の反応液の570nmでの吸光度との差(ΔAbs)を測定した。ΔAbsが高い程、高感度で測定できることを意味する。実施例7、実施例8又は比較例2の各sIL−2R測定用試薬を用いて測定した結果を表4に示す。表4から、本発明の実施例7および実施例8のsIL−2R測定用試薬は、比較例2のsIL−2R測定用試薬と比較して、試料中のsIL−2Rを高感度で測定できることがわかる。さらに、ラテックス粒子と抗体との結合が物理吸着であるラテックス粒子を含む実施例8のsIL−2R測定用試薬を用いるよりも、ラテックス粒子と抗体との結合が化学結合であるラテックス粒子を含む実施例7のsIL−2R測定用試薬を用いる方が、より高感度に、試料中のsIL−2Rを測定できることがわかる。
【0063】
【表4】
【0064】
このように、1つのラテックス粒子上に2種類の抗体が結合するラテックス粒子を用いてsIL−2R測定する方法に比べて、1つのラテックス粒子上に1種類の抗体のみが結合するラテックス粒子を用いてsIL−2R測定する方法の方が、試料中のsIL−2Rを高感度で測定できることが判明した。また、1つのラテックス粒子上に1種類の抗体のみが結合するラテックス粒子を用いてsIL−2Rを測定する方法において、ラテックス粒子と抗体との結合が化学結合である場合、さらに、試料中のsIL−2Rを高感度で測定できることが判明した。
【0065】
[参考例1]
(第1抗体結合ラテックス粒子1の調製)
0.5%(w/v)カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス(粒径330nm)懸濁液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)1mLに2mg/mL WSC溶液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)150 μLと4 mg/mL Sulfo−NHS溶液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)150 μLを順に加え、25℃で15分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、1.9 mg/mL抗sIL−2Rモノクローナル抗体AM92.3(第1抗体)溶液(0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)を158 μL添加し、25℃で60分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた後、25℃で60分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液(0.1%BSA、0.1%ツイーン20を含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁し、第1抗体結合ラテックス粒子1の溶液とした。
【0066】
[参考例2]
(第2抗体結合ラテックス粒子1の調製)
0.5%(w/v)カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス(粒径330nm)懸濁液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)1mLに2mg/mL WSC溶液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)150 μLと4 mg/mL Sulfo−NHS溶液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)150 μLを順に加え、25℃で15分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、1.9 mg/mL抗sIL−2Rモノクローナル抗体7G7/B6(第2抗体)溶液(0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)を158 μL添加し、25℃で60分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた後、25℃で60分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液(0.1%BSA、0.1%ツイーン20を含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁し、第2抗体結合ラテックス粒子1の溶液とした。
【0067】
[参考例3]
(第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子1の調製)
0.5%(w/v)カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス(粒径330nm)懸濁液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)1mLに2mg/mL WSC溶液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)150 μLと4 mg/mL Sulfo−NHS溶液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)150 μLを順に加え、25℃で15分間攪拌してカルボキシル基を活性化させた。当該反応液に、1.9 mg/mL抗sIL−2Rモノクローナル抗体AM92.3溶液 79 μL(0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)と、1.9 mg/mL抗sIL−2Rモノクローナル抗体7G7/B6溶液 79 μL(0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)とを添加し、25℃で60分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を化学結合させた。当該反応液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた後、25℃で60分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液(0.1%BSA、0.1%ツイーン20を含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁し、第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子1の溶液とした。
【0068】
[参考例4]
(第1抗体結合ラテックス粒子2の調製)
0.5%(w/v)カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス(粒径330nm)懸濁液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)1mLに、1.9 mg/mL抗sIL−2Rモノクローナル抗体AM92.3(第1抗体)溶液(0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)を158 μL添加し、25℃で60分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた後、25℃で60分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液(0.1%BSA、0.1%ツイーン20を含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁し、第1抗体結合ラテックス粒子2の溶液とした。
【0069】
[参考例5]
(第2抗体結合ラテックス粒子2の調製)
0.5%(w/v)カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス(粒径330nm)懸濁液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)1mLに、1.9 mg/mL抗sIL−2Rモノクローナル抗体7G7/B6(第2抗体)溶液(0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)を158 μL添加し、25℃で60分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた後、25℃で60分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液(0.1%BSA、0.1%ツイーン20を含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁し、第2抗体結合ラテックス粒子2の溶液とした。
【0070】
[参考例6]
(第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子2の調製)
0.5%(w/v)カルボキシル基修飾ポリスチレンラテックス(粒径330nm)懸濁液(0.01mol/L HEPES緩衝液、pH7.7)1mLに、1.9 mg/mL抗sIL−2Rモノクローナル抗体AM92.3(第1抗体)溶液(0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)と、1.9 mg/mL抗sIL−2Rモノクローナル抗体7G7/B6溶液 79 μL(0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01 mol/Lリン酸緩衝液、pH7.4)79 μLとを添加し、25℃で60分間攪拌しながら反応させ、ラテックス粒子に抗体を物理吸着させた。当該反応液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿にブロッキング液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた後、25℃で60分間攪拌して、ラテックス粒子表面をブロッキングした。当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)した後に上清を除去し、沈殿物に洗浄液(0.1%BSA、0.1%ツイーン20を含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁させた。この後、当該懸濁液を遠心分離(15000rpm、4℃、20分間)し、上清を除去した。この洗浄操作をもう一回行った後、沈殿物に希釈液(0.1%BSAを含有する10 mmol/L HEPES緩衝液、pH7.7)を1 mL添加し、超音波処理(50 W、30秒間)によって懸濁し、第1抗体及び第2抗体結合ラテックス粒子2の溶液とした。
【産業上の利用可能性】
【0071】
本発明により、成人T細胞白血病や非ホジキンリンパ腫における病態モニタリング等に有効な、試料中のsIL−2Rの簡便で、かつ、高感度な測定方法、及び、測定用試薬が提供される。