特許 6863888 ポリペプチドをコンジュゲートさせる方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6863888

(24)【登録日】2021年4月5日

(45)【発行日】2021年4月21日

(54)【発明の名称】ポリペプチドをコンジュゲートさせる方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/00 20060101AFI20210412BHJP

   C07K 1/113 20060101ALI20210412BHJP

   A61K 38/05 20060101ALN20210412BHJP

   A61P 35/00 20060101ALN20210412BHJP

   A61K 39/395 20060101ALN20210412BHJP

   A61K 47/50 20170101ALN20210412BHJP

   A61K 47/60 20170101ALN20210412BHJP

   A61K 47/68 20170101ALN20210412BHJP

   A61K 31/537 20060101ALN20210412BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/00

   C07K1/113ZNA

   !A61K38/05

   !A61P35/00

   !A61K39/395 D

   !A61K39/395 E

   !A61K39/395 N

   !A61K39/395 T

   !A61K39/395 C

   !A61K39/395 L

   !A61K47/50

   !A61K47/60

   !A61K47/68

   !A61K31/537

【請求項の数】17

【全頁数】95

(21)【出願番号】特願2017-517647(P2017-517647)

(86)(22)【出願日】2015年10月1日

(65)【公表番号】特表2017-535526(P2017-535526A)

(43)【公表日】2017年11月30日

(86)【国際出願番号】US2015053397

(87)【国際公開番号】WO2016054315

(87)【国際公開日】20160407

【審査請求日】2018年9月27日

(31)【優先権主張番号】62/058,502

(32)【優先日】2014年10月1日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】504333972

【氏名又は名称】メディミューン，エルエルシー

(74)【代理人】

【識別番号】100100158

【弁理士】

【氏名又は名称】鮫島 睦

(74)【代理人】

【識別番号】100150500

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 靖

(74)【代理人】

【識別番号】100176474

【弁理士】

【氏名又は名称】秋山 信彦

(72)【発明者】

【氏名】ロナルド・ジェイムズ・クリスティー

(72)【発明者】

【氏名】チャンショウ・ガオ

(72)【発明者】

【氏名】ナッツァレーノ・ディマージ

【審査官】 鈴木 崇之

(56)【参考文献】

【文献】 BIOCONJUGATE CHEMISTRY，２００８年，Vol. 19，pp. 759-765

【文献】 JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS，１９７９年，Vol. 28, No. 3-4，pp. 233-242

【文献】 JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY，２０００年，Vol. 43，pp. 1253-1256

【文献】 JOURNAL OF DRUG TARGETING，２０１１年，Vol. 19, No. 7，pp. 497-505

【文献】 FEBS LETTERS，１９８６年，Vol. 202, No. 2，pp. 197-201

【文献】 JOURNAL OF BIOCHEMISTRY，１９７６年，Vol. 79, No. 1，pp. 233-236

【文献】 BIOCONJUGATE CHEMISTRY，１９９３年，Vol. 4，pp. 212-218

【文献】 DRUG DELIVERY，１９９９年，Vol. 6, No. 2，pp. 89-95

【文献】 JOURNAL OF DRUG TARGETING，２００７年，Vol. 15, No. 3，pp. 190-198

【文献】 JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，２０１０年，Vol. 285, No. 43，pp. 33144-33153

【文献】 BIOCONJUGATE CHEMISTRY，２０１１年，Vol. 22，pp. 1946-1953

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗体コンジュゲートを調製する方法であって、
ａ）
（ｉ）式（ＩＩａ）：

【化1】

（ｉｉ）式（ＩＩｂ）：

【化2】

または
（ｉｉｉ）式（ＩＩＩａ）：

【化3】

［式中、
フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有し；
ｍは、０または１であり；
ｑは、０または１から１２の範囲内の整数であり；
Ｑは、結合またはコンジュゲーション構成要素からの残基であり；
Ｚは、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜３０アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のＣ＝Ｏを適宜有していてもよく；
Ｒ^１は、Ｈ、固体表面またはペイロード分子であり；
Ｒ^３は、ＨまたはＣ_１〜６アルキルであり；
Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１〜６アルキルであり；
Ｒ^５は、ＨまたはＣ_１〜６アルキルである］
のいずれかで示される分子中のマレイミド実体と、少なくとも１つのチオール基を含む抗体分子とのマイケル付加反応を実施するステップ、
ｂ）Ｒ^１がペイロード分子または固体表面である場合、式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、または（ＩＩＩａ）の化合物と、前記抗体との反応により形成された得られたチオ−スクシンイミド実体を加水分解するステップ、または
ｃ）Ｒ^１がＨである場合、ペイロード、コンジュゲーション構成要素または固体表面とのコンジュゲーションを実施し、次いで式（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、または（ＩＩＩａ）の化合物と、前記抗体との反応により形成されたチオ−スクシンイミド実体を加水分解するステップ
を含む方法。

【請求項2】

前記分子が、式（ＩＩａ）で表されるものであり、前記基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−が、式（ＩＩａａ）：

【化4】

の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に示されるパラ位で存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記分子が、式（ＩＩａ）で表されるものであり、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−が、式（ＩＩａａ’）：

【化5】

の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に示されるメタ位で存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記マレイミド分子が、式（ＩＩａａａ）：

【化6】

［式中、
Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のＣ＝Ｏを適宜有していてもよい］
の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記基Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＣ（Ｏ）−が、メタまたはパラ位で存在する、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記分子が、式（ＩＩｂ）で表されるものであり、前記基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−が、式（ＩＩｂｂ）：

【化7】

の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に示されるパラ位で存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記分子が、式（ＩＩｂ）で表されるものであり、前記基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−が、式（ＩＩｂｂ’）：

【化8】

の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に示されるメタ位で存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記マレイミド実体が、式（ＩＩｂｂｂ）：

【化9】

［式中、
Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のＣ＝Ｏを適宜有していてもよい］
の分子中に存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記基Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＣ（Ｏ）−が、前記フェニル環のメタまたはパラ位で存在する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記分子が、式（ＩＩＩａ）で表されるものであり、前記基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍ−が、式（ＩＩＩａａ）：

【化10】

の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に示されるパラ位で存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記分子が、式（ＩＩＩａ）で表されるものであり、前記基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍ−が、式（ＩＩＩａａ’）：

【化11】

の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に示されるメタ位で存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記マレイミド分子が、式（ＩＩＩａａａ）：

【化12】

［式中、
Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のＣ＝Ｏを適宜有していてもよい］
の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に存在する、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

ＺまたはＺ’が、−Ｃ_１〜１２アルキレン−または−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１〜８−を表す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

Ｒ^１が、毒素、薬物分子、ポリマー、抗体またはその結合断片を含む群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記薬物分子が、アウリスタチンである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記薬物分子が、チューブリシン、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）およびＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）を含む群から選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

式（ＩＶ）：

【化13】

［式中、
ｍは、０または１であり；
Ｑは、結合またはコンジュゲーション構成要素からの残基であり；
Ｚは、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜３０アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のＣ＝Ｏを適宜有していてもよく；
Ｒ^１は、Ｈ、固体表面またはペイロード分子であり、
−（Ｙ）_ｎ−Ｘ−は、下記式：

【化14】

［式中、波線は、各式の結合部位を表し、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
から選択されるリンカーであり、
Ｒ^６は、Ｈまたは少なくとも１つのチオール基を含む抗体分子であり、Ｒ^７は、Ｈまたは少なくとも１つのチオール基を含む抗体分子であり、Ｒ^６またはＲ^７の少なくとも一方は、前記少なくとも１つのチオール基を含む抗体分子であり、他方は、Ｈであって、前記抗体分子が式（ＩＶ）の分子の残りの部分に前記少なくとも１つのチオール基を介して結合している］
の分子または薬学的に許容可能なその塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、ポリペプチド、例えば、タンパク質をペイロードに、ポリペプチドを損傷させない条件下でコンジュゲートさせて安定分子を提供する方法に関する。本開示はまた、前記方法により調製され、または得られる分子およびそれを含む組成物に関する。本開示はさらに、治療法、例えば、免疫療法および／または癌治療法における、その方法から調製され、または得られた分子の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

コンジュゲーション技術は医薬に関して極めて重要であり、例えば、多数の市販の薬物／生物剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子にコンジュゲートされる。ＰＥＧは、一部の分子の免疫原性を低減させ、および／または分子の半減期を増加させると考えられるという点でいくつかの機能の１つを有する。市販の治療剤の例としては、ペギネサチド、ペグロチカーゼ、セルトリズマブペゴル（Ｃｉｍｚｉａ）、メトキシポリエチレングリコール−エポエチンベータ（Ｍｉｒｃｅｒａ）、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ）、ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ）、ペグビソマント（Ｓｏｍａｖｅｒｔ）、ペグインターフェロンアルファ−２ａ（Ｐｅｇａｓｙｓ）、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム（Ｄｏｘｉｌ／Ｃａｅｌｙｘ）、ペグインターフェロンアルファ−２ｂ（ＰｅｇＩｎｔｒｏｎ）、ペガスパルガーゼ（Ｏｎｃａｓｐａｒ）、およびウシペグアデマーゼ（Ａｄａｇｅｎ）が挙げられる。

【0003】

抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）も、治療分子の重要なカテゴリーである。これらは、高度に強力であり、抗体構成要素が、意図される標的に抗体構成要素により誘導されるペイロード、例えば、細胞毒素にコンジュゲートしているという点で「誘導ミサイル」と類似する。ＡＤＣの例としては、ブレンツキシマブベドチンおよびトラスツズマブエムタンシンが挙げられる。コンジュゲーション化学において形成されるリンカーは、ＡＤＣにおいて極めて重要である。

【0004】

コンジュゲーション技術の多くは、コンジュゲート分子中のスクシンイミド構成要素を与える１，４マイケル付加反応におけるマレイミド要素を用いる。しかしながら、国際公開第２０１３／１７３３３７号パンフレットにおいて考察されるとおり、この反応は可逆的であり、動的平衡として存在すると考えられる。すなわち、精製は、単一の純粋な実体を提供するという問題を解決しない。

【0005】

これが血漿中で生じ、コンジュゲート分子の一部が血清アルブミンにより置き換えられ得ることを示唆する一部の刊行物が存在する（Ａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００８，１９，７５９−７６５）。これは、特にＡＤＣに関して問題である。

【0006】

１つの回答は、得られたスクシンイミドを加水分解することである。しかしながら、これは、相対的に苛酷な条件、例えば、５０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ９．２および４５℃、約１２時間を要求する。これは、抗体凝集／分解、ならびにさらにはペイロードおよび弾頭の分解を引き起こし得る。

【0007】

この問題の解決法が、国際公開第２０１３／１７３３３７号パンフレット（Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ）に開示されており、それはマレイミド環中の窒素に対してベータ位におけるアミン置換基を有するマレイミド誘導体を用いる。得られたスクシンイミドは、より軽度な条件下で加水分解することができる。しかしながら、チオールコンジュゲーションステップ前に顕著なマレイミド加水分解が生じると考えられる。さらに、コンジュゲーションステップは約８の塩基性ｐＨにおいて実施される。この条件は、タンパク質性材料、例えば、抗体および抗体断片の凝集を促進し、それによりコンジュゲーションステップにおいてこの貴重な材料の損失を引き起こし得る。さらに、ペイロードと抗体との比は、一般に、全ての抗体がコンジュゲートされることを確保するように増加させなければならない。

【0008】

アミン触媒脱コンジュゲーション機序が、Ｍｄ．Ｒｏｗｓｈｏｎ Ａｌａｍ ｅｔ ａｌ（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ ２０１１，２２，１６７３−１６８１）による論文に開示されており、それは、Ｓｅａｔｔｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ方針が普遍的に適用可能でないことを示す（論文中のスキーム２参照）。

【0009】

代替的な解決法は、国際公開第２０１３／１２１１７５号パンフレットに提供されており、それは、いわゆるＳＮ２反応におけるマレイミドのブロモ誘導体の使用を開示している。しかしながら、低いｐＨ条件下で、反応種、すなわち、無水マレイン酸が再形成される、例えば、５４頁参照：

【化1】

「次いで、ｐＨを限外濾過・・・によりｐＨ４．５変化させる。抗体コンジュゲートを３７℃においてインキュベートし、アリコートを２、６、２４、４８および７２時間後にＬＣＭＳにより分析した。ドキソルビシンがリンカー上で分解して放出され、トラスツズマブ−Ｆａｂ−無水マレイン酸が形成された。」

【0010】

本発明者らは、コンジュゲートのこの不安定性、すなわち、マレイン酸環を形成する能力は、不利であると考える。それというのも、体内に多数の低ｐＨ環境が存在し、ペイロードが脱離し得るためにそれが国際公開第２０１３／１２１１１７５号パンフレットの分子の有用性を制限するためである。

【0011】

本開示は、調製後に安定であり、したがって、インビボ投与に好適な、特に、治療法における使用に好適な分子を提供する軽度条件を用いる方法を提供する。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0012】

したがって、ペイロードにコンジュゲートしているポリペプチドを調製する方法であって、
ａ）式（Ｉ）：

【化2】

［式中、式（Ｉ）において、
ｎは、０または１であり；
ｍは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｑは、０または１から１２の範囲内の整数、例えば、１から６、例えば、２または３であり；
Ｑは、結合またはコンジュゲーション構成要素からの残基であり；
Ｘは、Ｃ_０〜１８アルキレンＣ_６〜３６アリール（＝ＣＲ^２＝ＣＨ−）_ｐ、Ｃ_０〜１８アルキレンＣ_６〜３６アリール−ＣＨ_２＝ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１８アルキレン５〜３６員ヘテロアリール（−ＣＲ＝ＣＨ−）_ｐ、Ｃ_０〜１８アルキレン５〜３６員ヘテロアリール−ＣＨ_２ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１８アルキレン−ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１８アルキレン−Ｃ≡Ｃ−であり、
アリールまたはヘテロアリールは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有し；
Ｙは、オキソであり；
Ｚは、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜３０アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ）が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）のオキソ置換基を適宜有していてもよく；
Ｒ^１は、Ｈ、固体表面またはペイロード分子であり；
Ｒ^２は、例えば、Ｈ、ハロゲン、ヒドロキシル、−Ｃ_１〜６アルキル、−Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、Ｃ_６〜１０アリールＣ_０〜６アルキレン−、６〜１０員ヘテロアリールＣ_０〜６アルキレン−から選択される置換基であり；
Ｒ^３は、ＨまたはＣ_１〜６アルキルであり；
Ｒ^４は、ＨまたはＣ_１〜６アルキルであり；
Ｒ^５は、ＨまたはＣ_１〜６アルキルである］
で示される分子およびおよび薬学的に許容可能なその塩中のマレイミド実体と、少なくとも１つのチオール基を含むポリペプチド分子とのマイケル付加反応を実施するステップを含み、
ｂ）Ｒ^１がペイロード分子または固体表面である場合、式（Ｉ）の化合物と、前記ポリペプチドとの反応により形成された得られたチオ−スクシンイミド実体を加水分解するさらなるステップを含み、または
ｃ）Ｒ^１がＨである場合、ペイロードまたは固体表面とのコンジュゲーションを実施し、次いで式（Ｉ）の化合物と、前記ポリペプチドとの反応により形成されたチオ−スクシンイミド実体を加水分解するさらなるステップを含む方法が提供される。

【0013】

有利には、本開示のコンジュゲートは、酸性ｐＨ、例えば、約ｐＨ５において調製することができ、チオ−スクシンイミド加水分解は、軽度条件下で実施することができる。ある実施形態において、コンジュゲート中のチオ−スクシンイミドは、軽度条件下で急速に加水分解することができる。さらに、一度調製すると、本開示の分子は使用において安定であり、例えば、血清中で安定である。

【0014】

理論により拘束されるものではないが、不飽和系、例えば、アリール、フェニル、ビニル、アルキニルまたはそれらの組合せの共鳴能が重要であることが仮定される。それというのも、それらは軽度加水分解を容易にするためである。図１の模式図は、スクシンイミド環中の窒素に付着している不飽和系が、環中のカルボニルのいずれかにおける水による求核攻撃をいかに容易にし得るかを示す。

【0015】

一実施形態において、アリールは、１、２、３または４つのフルオロ置換基を有する。

【0016】

本明細書の開示は、前記方法から得られた、または得られる化合物／生成物にも及び、例えば、コンジュゲーション後に得られた生成物またはスクシンイミドの加水分解後に得られた生成物に及ぶ。

【0017】

一態様において、ポリペプチドおよび／またはペイロードにコンジュゲートしている本明細書に開示の化合物、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩａａ）、（ＩＩａａ’）、（ＩＩａａａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｂｂ）、（ＩＩｂｂ’）、（ＩＩＩｂｂｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｃｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｄｄ）、（ＩＩｄｄｄ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩａ）、（ＩＩＩａａ）、（ＩＩＩａａ’）、（ＩＩＩａａａ）、（ＩＩＩｂ）、（ＩＩＩｂｂ）、（ＩＩＩｃ）、（ＩＩＩｃｃ）および（ＩＩＩｃｃ’）の化合物またはそれらの誘導体が提供される。

【0018】

一実施形態において、本明細書に例示される分子／化合物が提供される。

【0019】

一態様において、コンジュゲーション化学における、本明細書に開示の化合物の使用も提供される。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】本開示の化合物の加水分解の模式的表示である。

【図1A】未反応ｍＡｂのスペクトルを示す。

【図1B】アルキルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチンコンジュゲートのスペクトルを示す。

【図2A】アルキルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチン（比較物）のスペクトルを示す。

【図2B】フェニルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチンのスペクトルを示す。

【図2C】フルオロフェニルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチンのスペクトルを示す。

【図3】２２℃におけるＴ２８９Ｃ ｍＡｂへのｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンのコンジュゲーション効率を示す。

【図4】２２℃におけるＴ２８９Ｃ ｍＡｂへのｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンのコンジュゲーション効率を示す。

【図5】ｐＨ５．５、２２℃におけるＴ２８９Ｃ ｍＡｂに対するｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンのコンジュゲーションキネティクスを示す。

【図6】ｐＨ７．４、２２℃におけるＴ２８９Ｃ ｍＡｂに対するｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンのコンジュゲーションキネティクスを示す。

【図7】ｐＨ８．６、２２℃におけるＴ２８９Ｃ ｍＡｂに対するｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンのコンジュゲーションキネティクスを示す。

【図8】プレインキュベーション後のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンとＴ２８９Ｃ ｍＡｂとの反応キネティクス：マレイミド加水分解の間接的計測を示す。

【図9】ｐＨ５．５、２２℃におけるマレイミド加水分解キネティクスを示す。

【図10】ｐＨ７．４、２２℃におけるマレイミド加水分解キネティクスを示す。

【図11】ｐＨ８．６、２２℃におけるマレイミド加水分解キネティクスを示す。

【図12】ＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのｐＨ７．４、２２℃におけるチオスクシンイミド加水分解を示す。

【図13】ＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂについてのｐＨ７．４、３７℃におけるチオスクシンイミド加水分解を示す。

【図14】ＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂについてのｐＨ８．６、２２℃におけるチオスクシンイミド加水分解を示す。

【図15】１時間のインキュベーション後のＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ−ｍＡｂコンジュゲートについてのｘ−チオスクシンイミド加水分解、ｎ＝３を示す。

【図16】モリブデン酸ナトリウムの存在下のＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのｘ−チオスクシンイミド−ＰＥＧ−ビオチン加水分解を示す。

【図17】チオールを含有する緩衝液中のチオール交換に対するＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの感受性を示す。

【図18】ＢＭＥを含有する緩衝液中のＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの安定性を示す。

【図19】ＢＭＥ負荷アッセイにおいて観察されたＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのｐＨ７．２、３７℃におけるチオスクシンイミド加水分解を示す。

【図20】ＢＭＥ負荷アッセイにおいて観察されたチオスクシンイミド脱コンジュゲーションおよび加水分解間の関係を示す。

【図21】軽度加水分解後の緩衝液中のチオール交換に対するＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの感受性を示す。

【図22】ｍｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂ ＡＤＣの分析を示す。

【図23】チオール（ＢＭＥ）を含有する緩衝液中のＭＭＡＥ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの安定性を示す。

【図24】Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲート中のＭＭＡＥ−チオスクシンイミドの加水分解を示す。

【図25】チオール（ＢＭＥ）を含有する緩衝液中のＭＭＡＥ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの安定性を示す。

【図26】ＢＭＥ負荷において観察されたＰＥＧ−ビオチンおよびＭＭＡＥチオスクシンイミド加水分解の比較を示す。

【図27】β−メルカプトエタノールの存在下の脱コンジュゲーションの比較：ＰＥＧ−ビオチン対ＭＭＡＥペイロードを示す。

【図28】マウス血清中のＭＭＡＥ−Ｔ２８９Ｃ ＡＤＣの安定性を示す。

【図29】マウス血清中のＭＭＡＥ−Ｔ２８９Ｃ ＡＤＣの安定性を示す。

【図30】マウス血清中のインキュベーション後のＭＤＡ−ＭＢ−３６１癌細胞に対するＡＤＣの活性を示す。

【図31】チオール結合ＡＤＣの安定化のための代替フォーマットを示す。

【図32】Ｎ−フェニルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートの質量分析を示す。

【図33】Ｎ−フルオロフェニルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートの質量分析を示す。

【図34】Ｎ−アルキルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートの質量分析を示す。

【図35】Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂへのｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮのコンジュゲーション効率を示す。

【図36】ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮコンジュゲートについてのチオスクシンイミド加水分解キネティクスを示す。

【図37】ｍＡｂ−ＢＣＮ−Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚコンジュゲートの分析を示す。

【図38】貯蔵後のｍＡｂ−ＢＣＮコンジュゲートの反応性を示す。

【図39】ｍＡｂ−ＰＢＤコンジュゲートの分析を示す。

【図40】ＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳癌細胞に対するｍＡｂ−ＢＣＮ−ＰＢＤ ＡＤＣのインビトロ活性を示す。

【発明を実施するための形態】

【0021】

一実施形態において、ｎは、０である。一実施形態において、ｎは、１である。一実施形態において、ｍは、０である。一実施形態において、ｍは、１である。一実施形態において、ｐは、０である。一実施形態において、ｐは、１である。

【0022】

一実施形態において、Ｘは、Ｃ_０〜１８アルキレンＣ_６〜１０アリール（＝ＣＲ^２＝ＣＨ−）_ｐ、Ｃ_０〜１８アルキレンＣ_６〜１０アリール−ＣＨ_２＝ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１８アルキレン５〜１０員ヘテロアリール（−ＣＲ＝ＣＨ−）_ｐ、Ｃ_０〜１８アルキレン５〜１０員ヘテロアリール−ＣＨ_２ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１８アルキレン−ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１８アルキレン−Ｃ≡Ｃ−であり、
アリールまたはヘテロアリールは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する。

【0023】

一実施形態において、Ｘは、Ｃ_０〜１５アルキレンＣ_６〜１０アリール（−ＣＲ^２＝ＣＨ−）_ｐ、Ｃ_０〜１５アルキレンＣ_６〜１０アリール−ＣＨ_２−ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１８アルキレン５〜１０員ヘテロアリール（−ＣＲ＝ＣＨ−）_ｐ、Ｃ_０〜１５アルキレン５〜１０員ヘテロアリール−ＣＨ_２ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１５アルキレン−ＣＲ^２＝ＣＨ−、Ｃ_０〜１５アルキレン−Ｃ≡Ｃ−であり、
アリールまたはヘテロアリールは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、−（ＣＨ_２−Ｏ−ＣＨ_２）_ｑ−Ｏ−Ｒ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する。

【0024】

一実施形態において、Ｘは、Ｃ_０〜１５アルキレンＣ_６〜１０アリール（−ＣＲ_２＝ＣＨ−）_ｐであり、アリールは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する。

【0025】

一実施形態において、Ｘは、Ｃ_０〜１５アルキレンＣ_６〜１０アリール（−ＣＨ_２ＣＲ^２ＣＨ_２−）_ｐ、例えば、Ｃ_０〜６アルキレンＣ_６〜１０アリール、例えば、Ｃ_６〜１０アリール、特にフェニルである。

【0026】

Ｚは、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２５アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素（例えば、１、２、３、４、５、６、７または８つ）が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置換されていてもよく、該鎖が１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）のオキソ置換基を有していてもよい。

【0027】

一般に、アリール、例えば、フェニルは、ｐが１である場合を除き、マレイミド環の窒素に共有結合により直接結合している。

【0028】

一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、置換基をオルト、メタまたはパラ位、例えば、メタまたはパラ、例えば、パラ位で含有する「Ｒ^１−Ｑ−（Ｚ）_ｍ」を有する。

【0029】

一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、電子供与、電子吸引および中性置換基から独立して選択される１、２、３または４つの置換基により置換されていてよい。一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、１、２、３または４つの電子吸引基により置換されている。一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、１、２、３または４つの電子供与基により置換されている。一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、中性電子特性を有する１、２、３または４つの基により置換されている。類似の置換パターンは、ヘテロアリールにも適宜当てはめることができる。

【0030】

一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、例えば、ハロゲン、Ｃ_１〜３アルキル、トリフルオロメチル、例えば、クロロまたはフルオロから独立して選択される１、２、３または４つの置換基、特に、１、２、３または４つのフルオロ原子により置換されている。１つ以上のフルオロ原子を含有する分子は、イメージング技術、例えば、ポジトロン放出断層撮影において有用であり得る。

【0031】

一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、１つの置換基をオルト、メタまたはパラ位で、例えば、マレイミドに連結されている環のメタまたはパラ位で有する。

【0032】

一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、２つの置換基を、例えば、マレイミドに連結されている環のメタ、パラ位；メタ、オルト位；オルトパラ位；メタ、メタ位；またはオルト、オルト位で有する。

【0033】

一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、３つの置換基を、例えば、マレイミドに連結されている環のオルト、メタおよびパラ位；オルト、メタ、メタ位；オルト、オルト、パラ位；またはメタ、メタ、パラ位で有する。

【0034】

一実施形態において、アリール、例えば、フェニルは、置換基を有さない。

【0035】

本開示は、ヘテロアリールに適用されるアリールおよびフェニルに関する上記の置換基パターンにも及ぶ。

【0036】

一実施形態において、ヘテロアリールは、ピリジンでない。

【0037】

固体表面へのコンジュゲーションは、本開示の重要な態様である。それというのも、それはポリペプチドを、例えば、合成材料、例えば、プラスチックまたは樹脂のビーズまたはプレートに付着させて精製またはスクリーニング、例えば、高スループットスクリーニングを容易にするためである。

【0038】

一実施形態において、Ｒ^１は、ペイロード分子であり、その例は、定義セクションにおいて以下に挙げられる。一実施形態において、Ｒ^１は、Ｈである。一実施形態において、Ｒ^１は、固体表面である。

【0039】

一実施形態において、ｎが１である本開示による方法は、式（ＩＩ）：

【化3】

［式中、Ｒ^１、Ｑ、Ｚ、Ｘおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義される］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩を用いる。

【0040】

一実施形態において、ｎが０である本開示による方法は、式（ＩＩＩ）：

【化4】

［式中、Ｒ^１、Ｑ、Ｚ、Ｘおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義される］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩を用いる。

【0041】

一実施形態において、マレイミド分子は、式（ＩＩａ）：

【化5】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、Ｚおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に存在する。

【0042】

一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−は、式（ＩＩａａ）：

【化6】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、Ｚおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３の群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に示されるパラ位で存在する。

【0043】

一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−は、式（ＩＩａａ’）：

【化7】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、Ｚおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３の群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に示されるメタ位で存在する。

【0044】

一実施形態において、マレイミド分子は、式（ＩＩａａａ）：

【化8】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、およびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有し、Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のオキソ置換基を適宜有していてもよい］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に存在する。一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＣ（Ｏ）−は、パラ位で存在する。一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＣ（Ｏ）−は、メタ位で存在する。

【0045】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩｂ）：

【化9】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、Ｚおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の分子および薬学的に許容可能なその塩中に存在する。

【0046】

一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−は、式（ＩＩｂｂ）：

【化10】

［式中、Ｑ、Ｚ、Ｘ、Ｒ^１およびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義される］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に示されるパラ位で存在する。

【0047】

一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−は、式（ＩＩｂｂ’）：

【化11】

［式中、Ｑ、Ｚ、Ｘ、Ｒ^１およびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義される］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に示されるメタ位で存在する。

【0048】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩｂｂｂ）：

【化12】

［式中、
Ｒ^１、Ｑおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有し、
Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のオキソ置換基を適宜有していてもよい］
の分子および薬学的に許容可能なその塩中に存在する。一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＣ（Ｏ）−は、フェニル環のパラ位で存在する。一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＣ（Ｏ）−は、フェニル環のメタ位で存在する。

【0049】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩｃ）：

【化13】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）−は転位され、Ｑ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義される］
の分子またはその異性体および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。

【0050】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩｃｃ）：

【化14】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）−は転位され、
Ｑ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、請求項１に上記に定義され、Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のオキソ置換基を適宜有していてもよい］
の分子またはその異性体および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。

【0051】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩｄ）：

【化15】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）Ｐｈ−は転位され、
またはＱ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、請求項１に上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の分子またはその異性体および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。

【0052】

一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−は、式（ＩＩｄｄ）：

【化16】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）−は転位され、
Ｑ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、請求項１に上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の化合物またはその異性体および薬学的に許容可能なそれらの塩中に示されるパラ位で存在する。

【0053】

一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍＣ（Ｏ）−は、式（ＩＩｄｄ’）：

【化17】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）−は転位され、
Ｑ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、請求項１に上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の化合物またはその異性体および薬学的に許容可能なそれらの塩中に示されるパラ位で存在する。

【0054】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩｄｄｄ）：

【化18】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）−は転位され、
フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有し、
Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のオキソ置換基を適宜有していてもよい］
の分子またはその異性体および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＣ（Ｏ）−は、フェニル環のパラ位で存在する。一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＣ（Ｏ）−は、フェニル環のメタ位で存在する。

【0055】

一実施形態において、式ＩＩｃ、ＩＩｃｃ、ＩＩｄ、ＩＩｄｄの化合物またはそれらの誘導体は、Ｅ異性体として提供される。

【0056】

一実施形態において、式ＩＩｃ、ＩＩｃｃ、ＩＩｄ、ＩＩｄｄの化合物またはそれらの誘導体は、Ｚ異性体として提供される。

【0057】

一実施形態において、マレイミド分子は、式（ＩＩＩａ）：

【化19】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、Ｚおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に存在する。

【0058】

一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍ−は、式（ＩＩＩａａ）：

【化20】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、Ｚおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の化合物または薬学的に許容可能なその塩中に示されるパラ位で存在する。

【0059】

一実施形態において、基Ｒ^１Ｑ（Ｚ）_ｍ−は、式（ＩＩＩａａ’）：

【化21】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、Ｚおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル，Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に示されるメタ位で存在する。

【0060】

一実施形態において、マレイミド分子は、式（ＩＩＩａａａ）：

【化22】

［式中、
Ｒ^１、Ｑ、およびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４、および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有し、
Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のオキソ置換基を適宜有していてもよい］
の化合物および薬学的に許容可能なその塩中に存在する。一実施形態において、Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨ−は、フェニル環のパラ位で存在する。一実施形態において、Ｒ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨ−は、フェニル環のメタ位で存在する。

【0061】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩＩｂ）の分子：

【化23】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）−は転位され、Ｑ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、式（Ｉ）の化合物について定義される］
またはその異性体および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。

【0062】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩＩｂｂ）：

【化24】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）−は転位され、
Ｑ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、式（Ｉ）の化合物について定義され、Ｚ’は、飽和または不飽和分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２４アルキレン鎖であって、１つ以上の炭素が−Ｏ−またはＮにより適宜独立して置き換えられていてもよく、該鎖が１つ以上のオキソ置換基を適宜有していてもよい］
の分子またはその異性体、および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。

【0063】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩＩｃ）：

【化25】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）Ｐｈ−は転位され、
またはＱ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、式（Ｉ）の化合物について定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の分子またはその異性体、および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。

【0064】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩＩｃｃ）：

【化26】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）Ｐｈ−は転位され、
またはＱ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、式（Ｉ）の化合物について定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の分子またはその異性体および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。

【0065】

一実施形態において、マレイミド実体は、式（ＩＩＩｃｃ’）：

【化27】

［式中、
Ｒ^２およびＲ^１Ｑ（Ｚ’）_ｍＮＨＣ（Ｏ）Ｐｈ−は転位され、
またはｎ、Ｑ、Ｚ、Ｒ^１、Ｒ^２およびｍは、式（Ｉ）の化合物について定義され、フェニルは、ハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１〜６アルキル、Ｃ_１〜６アルコキシ、−ＣＯＯＲ^３、−ＣＯＲ^３、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＳＯ_２、−ＳＯ_３、−ＮＲ^４Ｒ^５、−ＰＯ_４および−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｑ−ＯＲ^３を含む群から独立して選択される０、１、２、３または４つの置換基を有する］
の分子またはその異性体、および薬学的に許容可能なそれらの塩中に存在する。

【0066】

一実施形態において、式ＩＩｃ、ＩＩｃｃ、ＩＩｄ、ＩＩｄｄ、ＩＩｄｄ’、ＩＩｄｄｄ、ＩＩＩｂ、ＩＩＩｂｂ、ＩＩＩｃ、ＩＩＩｃｃ、ＩＩＩｃｃｃ、ＩＩＩｄの化合物またはそれらの誘導体は、Ｅ異性体として提供される。

【0067】

一実施形態において、式ＩＩｃ、ＩＩｃｃ、ＩＩｄ、ＩＩｄｄ、ＩＩｄｄ’、ＩＩｄｄｄ、ＩＩＩｂ、ＩＩＩｂｂ、ＩＩＩｃ、ＩＩＩｃｃ、ＩＩＩｃｃｃ、ＩＩＩｄの化合物またはそれらの誘導体は、Ｚ異性体として提供される。

【0068】

一実施形態において、Ｒ^２は、フルオロである。

【0069】

一実施形態において、所与の構造内で適宜、断片−ＱＺ（すなわち、ｍは１である）または−ＱＺ’ＮＨ（ｍは１である）は、−ＱＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１〜８（ＣＨ_２）_０〜１ＮＨ、例えば、−ＱＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１〜６（ＣＨ_２）_０〜１ＮＨ、例えば、−ＱＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_{２、３、４、５}（ＣＨ_２）_０〜１ＮＨ、より具体的には、−ＱＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４ＮＨを表す。

【0070】

一実施形態において、Ｑは、結合である。一実施形態において、Ｑは、コンジュゲーション構成要素である。コンジュゲーション構成要素は、ある分子または断片を別の分子または断片にコンジュゲートさせるために用いることができる実体である。

【0071】

一実施形態において、Ｑは、例えば、テトラジン、官能化テトラジン、ＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシミド（ｓｕｃｃｉｍｉｄｅ）エステル）、テトラフルオロフェニルエステル、およびそれらの組合せを含む群から選択される官能基を含み、またはそれである。

【0072】

一実施形態において、Ｑは、例えば、アルキン、テトラジン、誘導体化テトラジン、脂質、ナノ粒子、デンドリマー、金属キレート剤およびそれらの組合せを含む群から選択される重合性官能基である。

【0073】

一実施形態において、コンジュゲーション構成要素Ｑは、クリック化学構成要素である。クリック化学構成要素の例としては、残基Ｃｌｉｃｋ−ｍａｔｅｓ（商標）コレクション、例えば：
・Ｃｌｉｃｋ−ｍａｔｅｓ（商標）アルキン、例として５−プロパルギルオキシ−ｄＵ ＣＥＰ、５−オクタジイニル−ｄｕ ＣＥＰ、アルキニル−修飾因子−Ｃ６−ｄＴ ＣＥＰ、５−（プロパルギルオキシ）−２’−デオキシウリジン、５−（１，７−オクタジイン−１−イル）−２’−デオキシウリジン、５−オクタジイニル−ＴＭＳ−ｄＵ ＣＥＰ、５−オクタジイニル−ＴＭＳ−ｄＣ ＣＥＰ、５−オクタジイニル−ｄＣ ＣＥＰ、５−オクタジイニル−ＴＩＰＳ−ｄＵ ＣＥＰが挙げられ；
・Ｃｌｉｃｋ−ｅａｓｙ（登録商標）アルキン（銅フリークリック修飾用）、例として、ＢＣＮ ＣＥＰ Ｉ、ＢＣＮ ＣＥＰ ＩＩ、ＢＣＮ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩ、ＢＣＮ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルＩＩ、ＭＦＣＯ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよびＭＦＣＯ ＣＥＰが挙げられる。本明細書において用いられる残基は、分子を１つ以上の他の分子断片（構成要素）に結合させるための関連反応が生じた後に残る構造を指す。

【0074】

一実施形態において、コンジュゲーション構成要素は、ＢＣＮである。

【0075】

一実施形態において、コンジュゲーション構成要素Ｑは、ビオチンである。一実施形態において、Ｑは、断片：

【化28】

である。

【0076】

一実施形態において、Ｚは、−Ｃ_１〜１２アルキレン、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１〜８（ＣＨ_２）_０〜１ＮＨ、例えば、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１〜６（ＣＨ_２）_０〜１ＮＨ、例えば、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_{２、３、４、５}（ＣＨ_２）_０〜１ＮＨ、より具体的には、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４ＮＨから独立して選択される。

【0077】

一実施形態において、Ｚ’は、−Ｃ_１〜１２アルキレン、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１〜８（ＣＨ_２）_０〜１、例えば、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_１〜６（ＣＨ_２）_０〜１、例えば、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_{２、３、４、５}（ＣＨ_２）_０〜１、より具体的には、−ＯＣ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_４から独立して選択される。

【0078】

一実施形態において、式（Ｉ）で示される分子中のＹ−Ｘは、Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２フェニル（マレイミドまたはスクシンイミド）であり、ｍは、０であり、Ｑは、結合であり、ペイロードは、アミド結合を介して断片Ｙ−Ｘ中のオキソ基と結合している。

【0079】

一実施形態において、ペイロードは、不安定結合、例えば、ヒドラゾン（低ｐＨ放出）、ジスルフィド、イミンまたはそれらの類似物などを介して結合している。

【0080】

本明細書において式（Ｉ）の化合物について挙げられる優先事項は、本明細書に記載の他の式の化合物にも同様に適宜当てはまる。

【0081】

薬学的に許容可能な塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩および硫酸塩、または有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩を使用することができる。

【0082】

一実施形態において、マレイミド実体は、ポリペプチド中の天然システインを介してコンジュゲートしている。一実施形態において、マレイミドは、ポリペプチド中に遺伝子操作されたシステイン（本明細書において遺伝子操作システインとも称される）を介してコンジュゲート中に存在する。一実施形態において、システインは、溶媒露出システインである。

【0083】

一実施形態において、１つ以上のコンジュゲーションステップ、例えば、ポリペプチドへのマレイミドのコンジュゲーションは、５から９の範囲内のｐＨ、例えば、ｐＨ５．５から８．６、例えば、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５もしくは８．６または前記ｐＨ値の１つ以上の組合せにおいて実施する。

【0084】

一実施形態において、１つ以上のコンジュゲーションステップ、例えば、ポリペプチドへのマレイミドのコンジュゲーションは、約４から約３７℃の範囲内の温度、例えば、８から３７℃、８から３０℃、８から２５℃または２１から３１℃、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６もしくは３７℃または１つ以上の前記温度の組合せにおいて実施する。

【0085】

一実施形態において、１つ以上のコンジュゲーションステップは、好適な緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸））、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸））を含む群から選択される緩衝液、例えば、リン酸緩衝液中で実施する。

【0086】

一実施形態において、緩衝液は、第１級アミン、例えば、ＴＲＩＳなどを含まない。

【0087】

一実施形態において、１つ以上のコンジュゲーション反応、例えば、ポリペプチドへのマレイミドコンジュゲーションの効率は、５０％以上、例えば、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％である。

【0088】

したがって、一実施形態において、反応後に低い割合、例えば、５％以下、例えば、４、３、２、１％以下の非コンジュゲートポリペプチド（例えば、抗体）が存在する。

【0089】

一実施形態において、コンジュゲーションステップにおける式（Ｉ）の化合物および本明細書に記載の他の式の化合物とポリペプチドとの比は、１：１から５：１までそれぞれ、例えば、２：１、３：１または４：１である。

【0090】

一実施形態において、チオール−コンジュゲートは、ペイロード、ナノ粒子、または固体表面と、銅塩、還元剤、例えば、アスコルビン酸ナトリウム、および／またはＣｕ（Ｉ）安定化リガンド、例えば、２−［４−｛（ビス［（１−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミノ）−メチル｝−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル］エチルハイドロジェンサルフェート（ＢＴＴＥＳ）；トリス［（１−ベンジル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＢＴＡ）；トリス［（１−ヒドロキシプロピル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メチル］アミン（ＴＨＴＰＡ）などを使用するＣｕ（Ｉ）触媒アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）によりさらに反応させてトリアゾール結合を形成させる。

【0091】

一実施形態において、チオール−コンジュゲートは、ペイロード、ナノ粒子、または固体表面と、環式アルキン、例えば、ビアリールアザシクロオクチノン（ＢＡＲＡＣ）；ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、ビシクロ［６．１．０］ノニン（ＢＣＮ）などを使用する歪みにより促進されるアジド−アルキン付加環化（ＳＰＡＡＣ）によりさらに反応させてトリアゾール結合を形成させる。

【0092】

一実施形態において、チオール−コンジュゲートは、ペイロード、ナノ粒子、または固体表面と、テトラジン−トランスシクロオクテン反応によりさらに反応させてジヒドロピラジン結合を形成させる。

【0093】

一実施形態において、本方法において用いられる加水分解ステップ、例えば、得られたスクシンイミドの加水分解は、７から１２の範囲内のｐＨ、例えば、ｐＨ７．４から９、例えば、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９もしくは９．０または１つ以上のそれらの組合せにおいて実施する。

【0094】

一実施形態において、緩衝液を加水分解ステップにおいて用い、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸））、ＰＩＰＥＳ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−エタンスルホン酸））、ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸））を含む群から選択される緩衝液、例えば、リン酸緩衝液を用いる。

【0095】

一実施形態において、１つ以上の加水分解ステップ、例えば、スクシンイミドの加水分解は、約４から約３７℃の範囲内の温度、例えば、８から３７℃、８から３０℃、８から２５°Ｃまたは２１から３１℃、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６もしくは３７℃または１つ以上の前記温度の組合せにおいて実施する。

【0096】

一実施形態において、本方法における１つ以上の反応、例えば、コンジュゲーション反応は、触媒の存在下で実施する。触媒の例としては、遷移金属触媒、例えば、銅、スズ、無機酸化物、例えば、モリブデン酸塩が挙げられる。

【0097】

一実施形態において、本方法における１つ以上の反応、例えば、コンジュゲーション反応は、触媒を用いない。

【0098】

広範な条件下で、加水分解がコンジュゲーション後に高度に効率的に生じるため、コンジュゲーションおよび加水分解が同一反応において連続的に生じるように条件を容易に選択することができることにも留意すべきである。実際、ステップの数を最小化する場合にこれは望ましい。あるいは／さらに、下流ステップ（例えば、濾過、貯蔵、緩衝液交換、カラム上での精製）のための条件は、コンジュゲートが加水分解されることを確保するように選択することができる。一実施形態において、加水分解は、低ｐＨおよび低温の組合せを用いない。

【0099】

本開示はまた、加水分解された分子、例えば、本方法から調製された、または得られる分子に及ぶ。一実施形態において、分子は、式（ＩＶ）：

【化29】

［式中、
Ｑ、Ｒ^１、Ｚおよびｍは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義され、
Ｒ^６は、Ｈまたはポリペプチド残基であり、Ｒ^７は、Ｈまたはポリペプチド残基であり、Ｒ^６またはＲ^７の少なくとも一方は、ポリペプチド残基であり、他方は、Ｈである］
のものおよび薬学的に許容可能なその塩である。

【0100】

加水分解は、スキーム１：

【化30】

［式中、Ｐは、ポリペプチドを表す］
に示される２つの位置の１つにおいて生じ得る。

【0101】

本開示は、本明細書の方法から得られた、または得られる化合物／分子に及ぶ。

【0102】

一実施形態において、調製された分子は、安定であり、または例えば、物理的、化学的および熱的に安定である。物理的不安定性の証拠は、例えば、定型的な技術、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより計測することができる凝集である。化学的不安定性の証拠は、例えば、分子の分解または崩壊、例えば、ペイロードの脱離である。熱的不安定性の証拠は、例えば、変性である。

【0103】

一実施形態において、本開示の加水分解された分子において、ベータ−メルカプトエタノールとのインキュベーション後のペイロードの２０％以下の損失、例えば、１０％以下の損失、例えば、５％以下の損失が存在する。一実施形態において、損失は、１から３６時間、例えば、２から２４時間の期間にわたり生じる。

【0104】

一実施形態において、本開示の加水分解された分子において、血清（例えば、ネズミ血清またはウシ血清）とのインキュベーション後のペイロードの２０％以下の損失、例えば、１０％以下の損失、例えば、５％以下の損失が存在する。一実施形態において、損失は、１から３６時間、例えば、２４時間の期間にわたり生じる。

【0105】

一実施形態において、例えば、血清のインキュベーション時のＩＣ５０により計測される効力の低減は、２０％以下、例えば、１０％以下、例えば、５％以下、より具体的には、４％、３％、２％または１％である。

【0106】

定義
マイケル付加（本明細書におい、１，４−マイケル付加とも称される）は、アルファ−ベータ不飽和カルボニル化合物へのカルボアニオンまたは他のアニオンの求核付加である。

【0107】

本明細書において使用されるアルキルは、直鎖または分枝鎖アルキル、例えば、限定されるものではないが、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ブチル、およびｔｅｒｔ−ブチルを指す。一実施形態において、アルキルは、直鎖アルキルを指す。アルキルは、末端基、すなわち、鎖の末端における基である。Ｃ_１〜６アルキルは、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５およびＣ_６を含む。

【0108】

本明細書において使用されるアルコキシは、直鎖または分枝鎖アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシを指す。本明細書において用いられるアルコキシは、酸素原子がアルキル鎖内に局在する実施形態、例えば、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３または−ＣＨ_２ＯＣＨ_３にも及ぶ。一実施形態において、アルコキシは、酸素を介して分子の残部に結合している。一実施形態において、本開示は、直鎖アルコキシに関する。

【0109】

本明細書において用いられるアリールは、少なくとも１つの芳香環を含むＣ_６からＣ_３６炭素環系、例えば、Ｃ_６からＣ_１０炭素環系、例えば、ナフチレン、フェニル、インデン、インダン、１，２，３，４−テトラヒドロナフチレン、アズレン、例えば、ナフチレンまたはフェニル、例えば、フェニルを指す。

【0110】

ヘテロアリールは−Ｏ−またはＮおよびＳから独立して選択される１つ以上（例えば、１、２、３または４つ）のヘテロ原子を含む５〜３６員芳香族炭素環または二環系である。ヘテロアリールの例としては、ピロール、オキサゾール、チアゾール、イソチアゾール、イミダゾール、ピラゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、または１、２、３および１、２、４トリアゾールが挙げられる。二環系において、ヘテロアリールの定義は、少なくとも１つの環がヘテロ原子を含有し、少なくとも１つの環が芳香族である場合に充足する。ヘテロアリールは、分子の残部に炭素環またはヘテロ原子を含む環を介して結合していてよい。

【0111】

本明細書において使用されるオキソは、Ｃ＝Ｏを指し、通常、Ｃ（Ｏ）として表される。

【0112】

少なくとも１つの炭素（例えば、１、２または３つの炭素、好適には、１または２つ、特に１つ）がＯ、Ｎから選択されるヘテロ原子により置き換えられており、該鎖が１つ以上の基、オキソ基により適宜置換されている飽和または不飽和、分枝鎖または非分枝鎖Ｃ_１〜２５アルキレン鎖に関して、ヘテロ原子は第１級、第２級または第３級炭素、すなわち、ＣＨ_３、−ＣＨ_２−または−ＣＨ−または分枝鎖炭素基を技術的に適宜置き換えることができることは当業者に明らかである。この定義は、この言語が１から２５の炭素以外の長さの鎖に関して用いられる場合にも当てはまる。

【0113】

アルキレンは、結合基、すなわち、分子の他の部分／構成要素にそれぞれの末端において結合している基である。Ｃ_１〜２５アルキレンは、Ｃ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８またはＣ_９、Ｃ_１０、Ｃ_１１、Ｃ_１２、Ｃ_１３、Ｃ_１４、Ｃ_１５、Ｃ_１６、Ｃ_１７、Ｃ_１８、Ｃ_１９、Ｃ_２０、Ｃ_２１、Ｃ_２２、Ｃ_２３、Ｃ_２４およびＣ_２５を含む。

【0114】

Ｃ_０は、「特徴部」が不存在である場合である。

【0115】

本明細書において用いられるハロまたはハロゲンは、ヨード、ブロモ、クロロまたはフルオロ、例えば、フルオロを指す。

【0116】

本明細書において用いられるコンジュゲートは、２つの化合物または分子または断片を一緒に結合させることにより形成される化合物／分子を指す。

【0117】

本明細書において用いられる加水分解は、水分子の添加により環または分子を開裂させる反応を指す。

【0118】

本明細書において用いられる電子吸引基は、それが付着している実体から電子を吸引（または電子を誘引）する置換基を指す。

【0119】

本明細書において用いられる電子供与基は、それが付着している実体に電子を「供与」する置換基を指す。

【0120】

本開示に関する中性基は、変化自体に関連しないが、電子供与または吸引特性を指す。これらの基は、それらが付着している実体に対する電子特性に影響しない。

【0121】

本開示において使用されるポリペプチド
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。ポリマーは、直鎖でも分枝鎖でもよく、それは、改変アミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸により中断されていてよい。この用語は、天然にまたは介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識構成要素とのコンジュゲーションにより改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例として、例えば、非天然アミノ酸など）および当分野において公知の他の改変を含有するポリペプチドも含まれる。これは、本開示のポリペプチドが抗体をベースとするためであることが理解される。

【0122】

本明細書において用いられるポリペプチドは、少なくとも１つのチオール基を含む二次または三次構造を有し、または有さない５つ以上のアミノ酸の配列を指す。したがって、本開示において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を含む。これらは、特に記載のない限り、互換的に使用される。

【0123】

一実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質である。タンパク質は、一般に、二次および／または三次構造を含有し、単量体または多量体の形態であり得る。

【0124】

一実施形態において、タンパク質は、単鎖または会合鎖としての抗体またはその結合断片である。

【0125】

本明細書において互換的に使用される用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、全抗体および任意の抗原結合断片またはそれらの単鎖を含む。

【0126】

典型的な抗体は、ジスルフィド結合により相互連結されている少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨ、ＶＨ領域、またはＶＨドメインとして略記）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３または４つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４を含む。Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチド、およびその断片を含む。したがって、ＩｇＧについて、「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２およびＣＨ３ならびに場合により、それらのドメインに対するフレキシブルヒンジ領域Ｎ末端の全部または一部を指す。用語「Ｆｃ領域」は、単離されたこの領域、または抗体、抗体断片、もしくはＦｃ融合タンパク質に関するこの領域を指し得る。

【0127】

それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬ、ＶＬ領域、またはＶＬドメインとして略記）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。

【0128】

ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と称されるより保存されている領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに下位分類することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＷから構成される：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。フレームワーク領域は、それらのそれぞれのＶＨおよびＶＬ領域により指定することができる。したがって、例えば、ＶＨ−ＦＷ１は、ＶＨの第１のフレームワーク領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主組織または因子、例として、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。

【0129】

用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位（結合部位とも称される）を介して標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上記の組合せを認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子またはその抗原結合断片を意味する。本明細書において使用される用語「抗体」は、インタクトポリクローナル抗体、インタクトモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片）、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖおよびジスルフィド安定化ｓｃＦｖ（ｄｓＦｖ））、少なくとも２つの異なる抗体から生成される多重特異的抗体、例えば、二重特異的抗体または抗体断片から形成される多重特異的抗体（例えば、ＰＣＴ出願公開の国際公開第９６／２７０１１号パンフレット，国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレット国際公開第２００９０１８３８６号パンフレット、国際公開第２００９／０８０２５１号パンフレット、国際公開第２０１３００６５４４号パンフレット、国際公開第２０１３／０７０５６５号パンフレット、および国際公開第２０１３／０９６２９１号パンフレット参照）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質、および抗原結合断片を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子を、その抗体が所望の生物学的活性を示す限り、包含する。

【0130】

抗体は、任意の５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、またはアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａまたはｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、またはｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、およびＫｍ（１、２または３））のものであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元立体配置を有する。抗体は、任意の哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなど、または他の動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ）から誘導することができる。

【0131】

用語「抗原結合断片」は、インタクト抗体の抗原決定可変領域を含む断片を指す。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片により実施され得ることは、当分野において公知である。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、直鎖抗体、単鎖抗体、および抗体断片から形成される多重特異的抗体が挙げられる。

【0132】

したがって、一実施形態において、本発明において使用される抗体は、全長重鎖および軽鎖を有する完全抗体分子またはその断片を含み得、限定されるものではないが、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨまたはＶＬまたはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価または四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、それらの組合せおよび上記のいずれかのエピトープ結合断片であり得る。

【0133】

具体的に企図される他の抗体は、区別されるモノクローナル抗体の所定の混合物である「オリゴクローナル」抗体である。例えば、ＰＣＴ出願公開の国際公開第９５／２０４０１号パンフレット；米国特許第５，７８９，２０８号明細書および米国特許第６，３３５，１６３号明細書参照。好ましくは、オリゴクローナル抗体は、１つ以上のエピトープに対する抗体の所定の混合物からなり、単一細胞中で生成される。より好ましくは、オリゴクローナル抗体は、共通の軽鎖と対合して複数の特異性を有する抗体を生成し得る複数の重鎖を含む（例えば、ＰＣＴ出願公開の国際公開第０４／００９６１８号パンフレット）。単一標的分子上の複数のエピトープを標的化することが望ましい場合、オリゴクローナル抗体は特に有用である。当業者は、どのタイプの抗体または抗体の混合物が意図される目的および所望の必要性に適用可能であるかを知っており、または決定し得る。

【0134】

本開示における使用に具体的に企図される他の部分は、小型遺伝子操作タンパク質ドメイン、例えば、足場（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８２６３０号明細書および米国特許出願公開第２００３／０１５７５６１号明細書参照）である。足場は、公知の天然存在、非抗体ドメインファミリー、具体的には、タンパク質細胞外ドメインをベースとし、典型的には、小サイズ（約１００から約３００ＡＡ）で、挿入、欠失または他の置換を可能とする高い立体構造トレランスの可変ドメインと会合している高度に構造化されたコアを含有する。これらの可変ドメインは、任意の標的化タンパク質のための推定結合界面を作出し得る。一般に、一般的なタンパク質足場の設計は、２つの主要なステップからなる：（ｉ）所望の特徴部を有する好適なコアタンパク質の選択および（ｉｉ）高い構造可変性を許容するドメインの一部または全部の突然変異誘発による複雑なコンビナトリアルライブラリーの生成、適切なフォーマット（すなわち、ファージ、リボソーム、細菌、または酵母）のこれらのライブラリーのディスプレイおよび所望の結合特徴（例えば、標的特異性および／または親和性）を有する突然変異誘発足場についてのライブラリーのスクリーニング。親足場の構造は、高度に多様であり得、高度に構造化されたタンパク質ドメイン、例として、限定されるものではないが、ＦｎＩＩＩドメイン（例えば、ＡｄＮｅｃｔｉｎ、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５−４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８／００１３９７９１号明細書、および国際公開第２００５／０５６７６４号パンフレット参照、ＴＮ３、例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレットおよび国際公開第２０１１／１３０３２４号パンフレット参照）；プロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７，４５５−４６２（２００４）および欧州特許出願公開第１６４１８１８Ａ１号明細書参照）；ＬＤＬ受容体からのドメインＡ（アビマー、例えば、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２），１５５６−１５６１（２００５）およびＥｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ １６（６）、９０９−９１７（Ｊｕｎｅ ２００７）参照）；アンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９−５０３（２００３）、ＰＮＡＳ（２００３）およびＢｉｏｌ．３６９、（２００７）および国際公開第０２／２０５６５号パンフレット）；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン、例えば、国際公開第０２／４８１８９号パンフレット参照）を含む。所望により、２つ以上のそのような遺伝子操作足場ドメインを一緒に結合させて多価結合タンパク質を形成させることができる。個々のドメインは、使用／疾患適応症に応じて単一タイプのタンパク質またはいくつかのタンパク質を標的化し得る。

【0135】

実質的に任意の分子（またはその一部、例えば、サブユニット、ドメイン、モチーフまたはエピトープ）は、部分、例として、限定されるものではないが、内在性膜タンパク質、例として、イオンチャネル、イオンポンプ、Ｇタンパク質共役受容体、構造タンパク質；接着タンパク質、例えば、インテグリン；トランスポーター；シグナル伝達に関与するタンパク質および脂質固定タンパク質、例として、Ｇタンパク質、酵素、例えば、キナーゼ、例として、膜固定キナーゼ、膜結合酵素、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、脂肪酸合成酵素、消化酵素、例えば、ペプシン、トリプシン、およびキモトリプシン、リゾチーム、ポリメラーゼ；受容体、例えば、ホルモン受容体、リンホカイン受容体、モノカイン受容体、成長因子受容体、サイトカイン受容体；サイトカインなどにより標的化し、および／またはそれに取り込むことができる。

【0136】

一部の態様において、本開示において用いられるポリペプチドは、例えば、、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＣＳＦ１（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲＬ１、ＦＧＦＲ６、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷ１、ＦＩＬ１、ＦＩＬ１（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＩＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ２８ＲＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＡＣＶＲＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ベータ）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−アルファ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（Ｔｒａｉｌ受容体）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（Ｔｒａｉｌ受容体２）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（Ｔｒａｉｌ受容体３）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（Ｔｒａｉｌ受容体４）、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＮＲＰ１、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、ＡＬＫおよびＴＨＰＯの中から選択される成長因子、サイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、成長因子、受容体リガンドまたは受容体の全部または一部（例えば、サブユニット、ドメイン、モチーフまたはエピトープ）を標的化し、および／または取り込む。

【0137】

一部の態様において、本開示において用いられるポリペプチドは、例えば、ＣＣＬ１（Ｉ−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス（ｅｘｏｄｕｓ）−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１）、ＳＣＹＥ１、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−１ｂ）、ＢＬＲ１（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲ１（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−１ＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒａ）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒｂ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＩＦ１Ａ、ＩＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、およびＶＨＬの中から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、またはケモカイン関連タンパク質の全部または一部（例えば、サブユニット、ドメイン、モチーフまたはエピトープ）を標的化し、および／または取り込む。

【0138】

一部の態様において、本開示において用いられるポリペプチドは、例えば、レニン；成長ホルモン、例として、ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンウィルブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファおよびベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化調節型の正常Ｔ細胞発現および分泌物（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管阻害因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ−ラクタマーゼ；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；細胞毒性Ｔリンパ球性関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、または神経成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ８０およびＣＤ１４７；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；ウイルス抗原、例えば、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部、例えば、ｇｐ１２０；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ １、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３およびＶＣＡＭ、ａ４／ｐ７インテグリン、および（Ｘｖ／ｐ３インテグリン、例として、その１つまたは複数のサブユニットのいずれか、インテグリンアルファサブユニット、例えば、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、アルファ７、アルファ８、アルファ９、アルファＤ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４１、アルファＩＩｂ、アルファＩＥＬｂ；インテグリンベータサブユニット、例えば、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ベータ５、ベータ６、ベータ７およびベータ８；インテグリンサブユニット組合せ、例として、限定されるものではないが、αＶβ３、αＶβ５およびα４β７；アポトーシス経路のメンバー；ＩｇＥ；血液群抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；Ｅｐｈ受容体例えば、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ２など；ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）例えば、ＨＬＡ−ＤＲ；補体タンパク質、例えば、補体受容体ＣＲ１、Ｃ１Ｒｑおよび他の補体因子、例えば、Ｃ３、およびＣ５；糖タンパク質受容体、例えば、ＧｐＩｂα、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａおよびＣＤ２００の中から選択されるタンパク質の全部または一部（例えば、サブユニット、ドメイン、モチーフまたはエピトープ）を標的化し、および／または取り込む。

【0139】

癌抗原、例として、限定されるものではないが、ＡＬＫ受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、ＫＳ１／４汎癌抗原；卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）；前立腺酸性ホスフェート（ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；黒色腫関連抗原ｐ９７；黒色腫抗原ｇｐ７５；高分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）；前立腺特異的膜抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；多形上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；結腸直腸腫瘍関連抗原、例えば、ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＩＣＡ１９−９、ＣＴＡ−１およびＬＥＡ；バーキットリンパ腫抗原−３８．１３；ＣＤ１９；ヒトＢリンパ腫抗原−ＣＤ２０；ＣＤ３３；黒色腫特異的抗原、例えば、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２およびガングリオシドＧＭ３；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）；ウイルス誘導腫瘍抗原、例として、Ｔ抗原、ＤＮＡ腫瘍ウイルスおよびＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原；癌胎児性抗原−アルファ−フェトプロテイン、例えば、結腸のＣＥＡ、５Ｔ４癌胎児性栄養芽層糖タンパク質および膀胱腫瘍癌胎児性抗原；分化抗原、例えば、ヒト肺癌抗原Ｌ６およびＬ２０；線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７；ネオ糖タンパク質；スフィンゴ脂質；乳癌抗原、例えば、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）；ＮＹ−ＢＲ−１６、ＮＹ−ＢＲ−１６；ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）およびＨＥＲ３；多形上皮ムチン（ＰＥＭ）；悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１；分化抗原、例えば、胎児赤血球中に見出されるＩ抗原；成人赤血球中に見出される一次内胚葉Ｉ抗原；着床前胚；胃腺癌中に見出されるＩ（Ｍａ）；乳房上皮中に見出されるＭ１８、Ｍ３９；骨髄性細胞中に見出されるＳＳＥＡ−１；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；Ｍｙｌ；ＶＩＭ−Ｄ５；結腸直腸癌中に見出されるＤ１５６−２２；ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）；精巣および卵巣癌中に見出されるＳＣＰ−１；結腸腺癌中に見出されるＣ１４；肺腺癌中に見出されるＦ３；胃癌中に見出されるＡＨ６；Ｙハプテン；胚性癌細胞中に見出されるＬｅｙ；ＴＬ５（血液型Ａ）；Ａ４３１細胞中に見出されるＥＧＦ受容体；膵臓癌中に見出されるＥ１系列（血液型Ｂ）；胚性癌細胞中に見出されるＦＣ１０．２；胃腺癌抗原；腺癌中に見出されるＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）；腺癌中に見出されるＮＳ−１０；ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）；Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体中に見出されるＧ４９；結腸腺癌中に見出されるＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）；結腸癌中に見出される１９．９；胃癌ムチン；骨髄性細胞中に見出されるＴ５Ａ７；黒色腫中に見出されるＲ２４；胚性癌細胞中に見出される４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、およびＭ１：２２：２５：８ならびに４〜８細胞期胚中に見出されるＳＳＥＡ−３およびＳＳＥＡ−４；皮膚Ｔ細胞リンパ腫抗原；ＭＡＲＴ−１抗原；シアリ（Ｓｉａｌｙ）Ｔｎ（ＳＴｎ）抗原；結腸癌抗原ＮＹ−ＣＯ−４５；肺癌抗原ＮＹ−ＬＵ−１２バリアントＡ；腺癌抗原ＡＲＴ１；腫瘍随伴性脳−精巣−癌抗原（腫瘍および神経細胞の共通抗原（ｏｎｃｏｎｅｕｒｏｎａｌ ａｎｔｉｇｅｎ）ＭＡ２；傍腫瘍性神経抗原）；神経腫瘍腹側抗原２（Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｖｅｎｔｒａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ２）（ＮＯＶＡ２）；肝細胞癌抗原遺伝子５２０；腫瘍関連抗原ＣＯ−０２９；腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１（癌／精巣抗原ＣＴ７）、ＭＡＧＥ−Ｂ１（ＭＡＧＥ−ＸＰ抗原）、ＭＡＧＥ−Ｂ２（ＤＡＭ６）、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＡＧＥ−４ｂおよびＭＡＧＥ−Ｘ２；癌−精巣抗原（ＮＹ−ＥＯＳ−１）；ならびに上記に列記されたポリペプチドのいずれかの断片に特異的に結合し、および／またはそれを含む部分も企図される。

【0140】

一実施形態において、用いられるポリペプチドは、組換え体である。「組換え」ポリペプチドまたはタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を介して産生されるポリペプチドまたはタンパク質を指す。遺伝子操作宿主組織中で発現される組換え産生ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の好適な技術により分離され、分別され、または部分的もしくは実質的に精製された天然または組換えポリペプチドと同様に本開示の目的のために単離されているとみなす。本明細書に開示のポリペプチドは、当分野において公知の方法を使用して組換え産生することができる。あるいは、本明細書に開示のタンパク質およびペプチドは、化学合成することができる。

【0141】

ペイロード分子
本明細書において用いられるペイロードは、ポリペプチドへのコンジュゲーションによる標的領域位置への「送達」を目的とする分子または構成要素を指す。一般に、ペイロードは、一般に、例えば、毒素、例えば、細胞毒素、例えば、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、酵素、免疫調節剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、抗体またはその断片、合成また天然存在ポリマー、核酸およびその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの断片（例えば、アンチセンス分子または遺伝子）、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子およびレポーター基、例えば、蛍光化合物またはＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法により検出することができる化合物からなる群から選択されるエフェクター分子である。

【0142】

一実施形態において、ペイロードは、毒素、薬物、放射性核種、免疫調節剤、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、成長因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、非天然アミノ酸、ペプチド、脂質、ポリマー、炭水化物、足場分子、蛍光タグ、可視化ペプチド、ビオチン、血清半減期延長剤、捕捉タグ、キレート剤、固体担体、またはそれらの組合せを含む群から選択される。

【0143】

一実施形態において、ペイロードは、薬物分子（本明細書において薬物とも称される）である。本開示において使用される薬物分子の例としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸アナログ、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、ドキソルビシン、ドキソルビシンアナログ、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進剤、メトトレキセート、ＣＰＴ−１１、またはそれらの組合せが挙げられ、それらにおいてコンジュゲーションが存在する。

【0144】

特定の態様において、薬物は、アミフォスチン、シスプラチン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ドキソルビシンリポ、ゲムシタビン、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ゲフィチニブ、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルアロマターゼ阻害剤、およびそれらの組合せである。

【0145】

一実施形態において、薬物は、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイドおよびスラミンを含む群から選択される。

【0146】

一実施形態において、毒素は、細胞毒素または細胞毒性剤、例として、細胞に有害な（例えば、細胞を殺傷する）任意の薬剤を含む。例としては、アプリジン、アナストロゾール、アザシチジン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、コンブレスタチン、カルムスチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムプロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロールおよびピューロマイシンならびにそれらのアナログまたはホモログが挙げられる。

【0147】

一実施形態において、薬物（この場合、細胞毒素とも）は、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、カルボプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）およびドキソルビシンまたはドキソルビシングルクロニド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシンまたはデュオカルマイシン）、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）を含む。

【0148】

一部の態様において、薬物は、アウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号明細書；米国特許第５，７８０，５８８号明細書）、例えば、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）またはＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）である。他の態様において、薬物は、ドラスタチンまたはドラスタチンペプチド性アナログまたは誘導体である。ドラスタチンおよびアウリスタチンは、微小管ダイナミクス、ＧＴＰ加水分解、ならびに核および細胞分裂を妨害し（Ｗｏｙｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：３５８０−３５８４（２００１））、抗癌活性を有することが示されている（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）。ドラスタチンまたはアウリスタチン薬物部分は、コンジュゲート化合物にペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）末端またはＣ（カルボキシル）末端を介して付着させることができる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願公開の国際公開第２００２／０８８１７２号パンフレット参照。

【0149】

他の態様において、薬物は、メイタンシノイドである。一部の態様において、メイタンシノイドは、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初に西アフリカ低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。続いて、ある微生物も、メイタンシノイド、例えば、メイタンシノールおよびＣ−３メイタンシノールエステルを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成メイタンシノールならびにその誘導体およびアナログは、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第４，１３７，２３０号明細書；米国特許第４，２４８，８７０号明細書；米国特許第４，２５６，７４６号明細書；米国特許第４，２６０，６０８号明細書；米国特許第４，２６５，８１４号明細書；米国特許第４，２９４，７５７号明細書；米国特許第４，３０７，０１６号明細書；米国特許第４，３０８，２６８号明細書；米国特許第４，３０８，２６９号明細書；米国特許第４，３０９，４２８号明細書；米国特許第４，３１３，９４６号明細書；米国特許第４，３１５，９２９号明細書；米国特許第４，３１７，８２１号明細書；米国特許第４，３２２，３４８号明細書；米国特許第４，３３１，５９８号明細書；米国特許第４，３６１，６５０号明細書；米国特許第４，３６４，８６６号明細書；米国特許第４，４２４，２１９号明細書；米国特許第４，４５０，２５４号明細書；米国特許第４，３６２，６６３号明細書；および米国特許第４，３７１，５３３号明細書に開示されている。

【0150】

メイタンシノイド薬物部分は、抗体薬物コンジュゲート中の魅力的な薬物部分である。それというのも、それらは（ｉ）発酵または化学改変、発酵産物の誘導体化による調製に相対的に利用しやすいため、（ｉｉ）抗体への非ジスルフィドリンカーを介するコンジュゲーションに好適な官能基による誘導体化を受けやすいため、（ｉｉｉ）血漿中で安定であるため、および（ｉｖ）種々の腫瘍細胞系に対して有効であるためである。メイタンシノイドを含有するコンジュゲート、それを作製する方法、およびその治療的使用は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号明細書、米国特許第５，４１６，０６４号明細書および欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号明細書；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：８６１８−８６２３（１９９６）（ＤＭ１と命名されるメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載）；ならびにＣｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されている。

【0151】

メイタンシノイドは当分野において周知であり、公知技術により合成し、または天然源から単離することができる。好適なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書に開示されている。例示的なメイタンシノイド薬物部分としては、改変芳香族環を有するもの、例えば、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号明細書）（アンサマイトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元により調製）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号明細書および米国特許第４，３０７，０１６号明細書）（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）またはアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を使用する脱メチル化またはＬＡＨを使用する脱塩素化により調製）；およびＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号明細書）（塩化アシルを使用するアシル化により調製）ならびに他の位置における改変を有するものが挙げられる。例示的なメイタンシノイド薬物部分としては、改変を有するもの、例えば、メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応により調製されるＣ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号明細書）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号明細書）；ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製されるＣ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号明細書）；ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの変換により調製されるＣ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号明細書）；トレウイア・ヌディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離されるＣ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号明細書および米国特許第４，３１５，９２９号明細書）；ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの脱メチル化により調製されるＣ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第，３６２，６６３号明細書および米国特許第４，３２２，３４８号明細書）；およびメイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号明細書）も挙げられる。メイタンシン化合物上の多くの位置は、結合のタイプに応じて結合位置として有用であることが公知である。例えば、エステル結合の形成のため、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルにより修飾されているＣ−１４位、ヒドロキシル基により修飾されているＣ−１５位およびヒドロキシル基を有するＣ−２０位が全て好適である。

【0152】

一部の態様において、薬物は、カリケアミシンである。抗生物質のカリケアミシンファミリーは、サブピコモル濃度において二本鎖ＤＮＡ分解を産生し得る。カリケアミシンファミリーのコンジュゲートの調製については、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，７１２，３７４号明細書、米国特許第５，７１４，５８６号明細書、米国特許第５，７３９，１１６号明細書、米国特許第５，７６７，２８５号明細書、米国特許第５，７７０，７０１号明細書、米国特許第５，７７０，７１０号明細書、米国特許第５，７７３，００１号明細書、米国特許第５，８７７，２９６号明細書を参照。使用することができるカリケアミシンの構造的アナログとしては、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧおよびθ１１が挙げられる（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：２９２５−２９２８（１９９８）およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄの上記米国特許）。

【0153】

一部の態様において、薬物は、チューブリシンである。チューブリシンは、粘液細菌種から単離された天然生成物のクラスのメンバーである（Ｓａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５３：８７９−８８５（２０００））。細胞骨格相互作用剤として、チューブリシンは、チューブリン重合を阻害し、細胞周期停止およびアポトーシスをもたらす有糸分裂毒である（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：４８８８−４８９２（２００４）；Ｋｈａｌｉｌ ｅｔ ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．７：６７８−６８３（２００６）；Ｋａｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９６：２３５−２４２（２００６））。チューブリシンは、任意の臨床関連慣習的化学療法薬、例えば、エポチロン、パクリタキセル、およびビンブラスチンの細胞成長阻害を上回る非常に強力な細胞毒性分子である。さらに、これらは多剤耐性細胞系に対して強力である（Ｄｏｍｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ９：１４１−１４７（２００５））。これらの化合物は、癌細胞系のパネルに対して試験される高い細胞毒性を示し、ＩＣ_５０値は低ピコモル範囲内であり；したがって、それらは、抗癌治療薬として興味深い。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願公開の国際公開第２０１２０１９１２３号パンフレット参照。チューブリシンコンジュゲートは、例えば、米国特許第７，７７６，８１４号明細書に開示されている。

【0154】

一部の態様において、薬物は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。ＰＢＤは、比較的小さい分子であり、一部は、ＤＮＡの副溝中の特異的配列を認識し、それに共有結合する能力を有し、したがって、抗生物質／抗腫瘍活性を示す。多数のＰＢＤおよびそれらの誘導体、例えば、ＰＢＤ二量体（例えば、ＳＪＧ−１３６またはＳＧ２０００）、Ｃ２−不飽和ＰＢＤ二量体、Ｃ２アリール置換を有するピロロベンゾジアゼピン二量体（例えば、ＳＧ２２８５）、加水分解により活性化されるＰＢＤ二量体プロドラッグ（例えば、ＳＧ２２８５）、およびポリピロール−ＰＢＤ（例えば、ＳＧ２２７４）が、当分野において公知である。ＰＢＤは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願公開の国際公開第２０００／０１２５０７号パンフレット、国際公開第２００７／０３９７５２号パンフレット、国際公開第２００５／１１０４２３号パンフレット、国際公開第２００５／０８５２５１号パンフレット、および国際公開第２００５／０４０１７０号パンフレット、ならびに米国特許第７，６１２，０６２号明細書にさらに開示されている。

【0155】

一部の態様において、毒素は、例えば、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽菌毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、アルファ毒素、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、リシン、ストリキニーネ、テトロドトキシン、サポニン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、緑膿菌外毒素、緑膿菌内毒素、またはそれらの組合せを含む。他の態様において、毒素は、例えば、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、トリコテセン、またはそれらの組合せを含む。例えば、国際特許出願公開の国際公開第１９９３／０２１２３２号パンフレット参照。

【0156】

一部の態様において、キレート剤は、ＤＴＰＡ、ＥＣ、ＤＭＳＡ、ＥＤＴＡ、Ｃｙ−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＭＰ、ＤＴＰＡ、ＣｙＤＴＰＡ、Ｃｙ２ＤＴＰＡ、ＢＯＰＴＡ、ＤＴＰＡ−ＭＡ、ＤＴＰＡ−ＢＡ、ＤＴＰＭＰ、ＤＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＴＥＴＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡ−ＭＡ、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ｐＮＢ−ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＰ、ＤＯＴＥＰ、ＤＯＴＰＰ、ＤＯＴＢｚＰ、ＤＯＴＰＭＥ、ＨＥＤＰ、ＤＴＴＰ、Ｎ３Ｓトリアミドチオール、ＤＡＤＳ、ＭＡＭＡ、ＤＡＤＴ、Ｎ２Ｓ４ジアミンテトラチオール、Ｎ２Ｐ２ジチオール−ビスホスフィン、６−ヒドラジノニコチン酸、プロピレンアミンオキシム、テトラアミン、シクラム、またはそれらの組合せである。

【0157】

一実施形態において、薬物は、アウリスタチン、チューブリシンまたはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。

【0158】

一実施形態において、アウリスタチンは、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）またはＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）である。

【0159】

一実施形態において、薬物は、メイタンシノイド、例えば、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。

【0160】

放射性核種の例としては、^３Ｈ、^１１Ｃ、^１３Ｎ、^１５Ｏ、^１８Ｆ、^３２Ｐ、^３３Ｐ、^３５Ｓ、^４７Ｓｃ、^５１Ｃｒ、^５４Ｍｎ、^５７Ｃｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^６２Ｃｕ、^６５Ｚｎ、^６７Ｃｕ、^６７Ｇａ、^６８Ｇｅ、^７５Ｂｒ、^７５Ｓｅ、^７６Ｂｒ、^７７Ｂｒ、^７７Ａｓ、^８０ｍＢｒ、^８５Ｓｒ、^８９Ｓｒ、^９０Ｙ、^９５Ｒｕ、^９７Ｒｕ、^９９Ｍｏおよび^９９ｍＴｃ、^１０３Ｐｄ、^１０３ｍＲｈ、^１０３Ｒｕ、^１０５Ｒｈ、^１０５Ｒｕ、^１０７Ｈｇ、^１０９Ｐｄ、^１０９Ｐｔ、^１１１Ａｇ、^１１１Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１３ｍＩｎ、^１１３Ｓｎ、^１１５Ｉｎ、^１１７Ｓｎ、^１１９Ｓｂ、^１２１ｍＴｅ、^１２１Ｉ、^１２２ｍＴｅ、^１２５ｍＴｅ、^１２５Ｉ、^１２６Ｉ、^１３１Ｉ、^１３３Ｉ、^１３３Ｘｅ、^１４０Ｌａ、^１４２Ｐｒ、^１４３Ｐｒ、^１４９Ｐｍ、^１５２Ｄｙ、^１５３Ｓｍ、^１５３Ｇｄ、^１５９Ｇｄ、^１６１Ｈｏ、^１６１Ｔｂ、^１６５Ｔｍ、^１６６Ｄｙ、^１６６Ｈｏ、^１６７Ｔｍ、^１６８Ｔｍ、^１６９Ｅｒ、^１６９Ｙｂ、^１７５Ｙｂ、^１７７Ｌｕ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^１８８Ｗ、^１８９ｍＯｓ、^１８９Ｒｅ、^１９２Ｉｒ、^１９４Ｉｒ、^１９７Ｐｔ、^１９８Ａｕ、^１９９Ａｕ、^２０１Ｔｌ、^２０３Ｈｇ、^２１１Ａｔ、^２１１Ｂｉ、^２１１Ｐｂ、^２１２Ｐｂ、^２１２Ｂｉ、^２１３Ｂｉ、^２１５Ｐｏ、^２１７Ａｔ、^２１９Ｒｎ、^２２１Ｆｒ、^２２３Ｒａ、^２２４Ａｃ、^２２５Ａｃ、^２２５Ｆｍ、^２５２Ｃｆならびにそれらの組合せが挙げられる。

【0161】

一実施形態において、放射性核種は、クロム（^５１Ｃｒ）、コバルト（^５７Ｃｏ）、フッ素（^１８Ｆ）、ガドリニウム（^１５３Ｇｄ、^１５９Ｇｄ）、ゲルマニウム（^６８Ｇｅ）、ホルミウム（^１６６Ｈｏ）、インジウム（^１１５Ｉｎ、^１１３Ｉｎ、^１１２Ｉｎ、^１１１Ｉｎ）、ヨウ素（^１３１Ｉ、^１２５Ｉ、^１２３Ｉ、^１２１Ｉ）、ランタン（^１４０Ｌａ）、ルテチウム（^１７７Ｌｕ）、マンガン（^５４Ｍｎ）、モリブデン（^９９Ｍｏ）、パラジウム（^１０３Ｐｄ）、リン（^３２Ｐ）、プラセオジム（^１４２Ｐｒ）、プロメチウム（^１４９Ｐｍ）、レニウム（^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ）、ロジウム（^１０５Ｒｈ）、ルテニウム（^９７Ｒｕ）、サマリウム（^１５３Ｓｍ）、スカンジウム（^４７Ｓｃ）、セレン（^７５Ｓｅ）、ストロンチウム（^８５Ｓｒ）、硫黄（^３５Ｓ）、テクネチウム（^９９Ｔｃ）、タリウム（^２０１Ｔｌ）、スズ（^１１３Ｓｎ、^１１７Ｓｎ）、トリチウム（^３Ｈ）、キセノン（^１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（^１６９Ｙｂ、^１７５Ｙｂ）、イットリウム（^９０Ｙ）、亜鉛（^６５Ｚｎ）、またはそれらの組合せを含み、またはそれからなる群から選択される。

【0162】

一実施形態において、放射性核種は、本開示のコンジュゲート化合物にキレート剤により付着している。

【0163】

一実施形態において、Ｒ^１は、例えば、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ＸＴＥＮ、アルブミン結合小分子、またはそれらの組合せを含む血清半減期延長剤である。

【0164】

エフェクター分子がポリマーである場合、それは、一般に、合成または天然存在ポリマー、例えば、適宜置換されている直鎖もしくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマーまたは分枝鎖もしくは非分枝鎖多糖、例えば、ホモもしくはヘテロ多糖であり得る。

【0165】

上記合成ポリマー上に存在し得る具体的な任意選択置換基としては、１つ以上のヒドロキシ、メチルまたはメトキシ基が挙げられる。

【0166】

具体的な天然存在ポリマーとしては、ラクトース、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸塩、セルロースアミロース、デキストラン、グリコゲンまたはそれらの誘導体が挙げられる。

【0167】

一部の実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分枝鎖ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシルエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−ｃｏ−無水マレイン酸、ポリスチレン−ｃｏ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート（ＭＰＣ）である。一部の実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。本発明の一実施形態において、ポリエチレングリコールは、３００から１０，０００，０００、５００から１００，０００、１０００から５０，０００、１５００から３０，０００、２，０００から２０，０００Ｄａ、３，０００から５，０００Ｄａ、および４，０００から５，０００Ｄａの分子量範囲を有する。他の実施形態において、ポリエチレングリコールは、約１，０００Ｄａ、約１，５００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、または約２０，０００Ｄａの分子量を有する。

【0168】

一実施形態において、Ｒ^１またはポリペプチド（特にＲ^１）は、可視化標識を含む。可視化標識としては、限定されるものではないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、リン光色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素、放射性同位体、またはそれらの組合せが挙げられる。

【0169】

一実施形態において、可視化標識は、可視化ペプチドである。一部の態様において、可視化ペプチドは、インビトロ、インビボ、エクスビボ、または任意のそれらの組合せのコンジュゲート化合物の可視化または局在化を可能とする。一部の態様において、可視化ペプチドは、例えば、ビオチンアクセプターペプチド、リポ酸アクセプターペプチド、蛍光タンパク質、重ヒ素色素のライゲーションまたは準安定テクネチウムをコンジュゲートさせるためのシステイン含有ペプチド、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベース近接アッセイのためのユーロピウム包接化合物をコンジュゲートさせるためのペプチド、または任意のそれらの組合せである。一部の態様において、蛍光タンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、または任意のそれらの組合せである。一部の態様において、蛍光タンパク質は、フィコビリタンパク質、またはその誘導体である。

【0170】

蛍光タンパク質、特にフィコビリタンパク質は、タンデム色素により標識された標識試薬を作出するために有用である。これらのタンデム色素は、蛍光タンパク質および発光スペクトルが蛍光タンパク質吸収スペクトルの波長からさらにシフトする場合により大きいストークスシフトを得る目的のためのフルオロフォアを含む。これは、発光蛍光が最大に最適化される場合、換言すると、皆無かそれに近い発光が蛍光タンパク質により再吸収される場合、試料中の低い量の標的を検出するために有効であり得る。この作業のため、蛍光タンパク質およびフルオロフォアは、エネルギー移動ペアとして機能し、蛍光タンパク質はフルオロフォアが吸収する波長において発光し、次いでフルオロフォアが、蛍光タンパク質のみを用いて得ることができたものよりも蛍光タンパク質から遠い波長において発光する。機能的組合せは、当分野において公知のフィコビリタンパク質およびスルホローダミンフルオロフォア、またはスルホン化シアニンフルオロフォアであり得る。フルオロフォアはエネルギードナーとして機能することもあり、蛍光タンパク質はエネルギーアクセプターである。

【0171】

他の態様において、重ヒ素色素は、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン（ＦｌＡｓＨ）である。一部の態様において、ビオチンアクセプターペプチドは、アビジンおよびストレプトアビジンベース試薬のコンジュゲーションを容易にする。一部の態様において、リポ酸アクセプターペプチドは、結合したリポ酸へのチオール反応性プローブのコンジュゲーションまたは蛍光リポ酸アナログの直接的ライゲーションを容易にする。

【0172】

一実施形態において、Ｒ^１またはポリペプチド（特にＲ^１）は、蛍光タグを含む。一部の態様において、蛍光タグは、例えば、フルオレセイン型色素、ローダミン型色素、ダンシル型色素、リサミン型色素、シアニン型色素、フィコエリスリン型色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ型色素、または任意のそれらの組合せを含む。本明細書に開示のシステイン遺伝子操作抗体またはその抗原結合断片へのコンジュゲーションに好適なフルオロフォアとしては、限定されるものではないが、ピレン（対応する誘導体化合物のいずれかを含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドールまたはベンズインドール、オキサゾールまたはベンズオキサゾール、チアゾールまたはベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（任意の対応する化合物を含む）、カルボシアニン（任意の対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（任意の対応する化合物を含む）、キサンテン（任意の対応する化合物を含む）、オキサジン（任意の対応する化合物を含む）またはベンズオキサジン、カルバジン（任意の対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（対応する開示化合物を含む）、ベンゾフラン（対応する化合物を含む）およびベンズフェナレノン（任意の対応する化合物を含む）ならびにそれらの誘導体が挙げられる。本明細書において使用されるオキサジンとしては、レゾルフィン（任意の対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、およびそれらのベンゾ置換アナログ、または任意のそれらの組合せが挙げられる。

【0173】

ある態様において、フルオロフォアとしては、例えば、、キサンテン（ロドール、ローダミン、フルオレセインおよびそれらの誘導体）クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン、ボラポリアザインダセン、または任意のそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態において、このようなフルオロフォアは、例えば、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリン、スルホン化シアニン、または任意のそれらの組合せである。ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲ（登録商標）、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）、ＣＹ ＤＹＥＳ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ ＧＲＥＥＮ（登録商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＬＵＥ（登録商標）、ＩＲＤＹＥＳ（登録商標）、ＦＡＭ（登録商標）、ＦＩＴＣ（登録商標）、およびＲＯＸ（登録商標）の商品名のもと販売され、一般に公知の色素も挙げられる。

【0174】

本明細書に開示のリンカー「Ｚ」を介して付着しているフルオロフォアの選択は、最終化合物の吸収および蛍光発光特性を決定する。使用することができるフルオロフォア標識の物理的特性としては、限定されるものではないが、スペクトル特徴（吸収、発光およびストークスシフト）、蛍光強度、寿命、分極および光退色速度、またはそれらの組合せが挙げられる。これらの物理的特性の全てを使用してあるフルオロフォアを別のものから区別し、それにより多重化分析を可能とすることができる。ある態様において、フルオロフォアは、４８０ｎｍよりも長い波長における吸収最大を有する。一部の態様において、フルオロフォアは、４８８ｎｍから５１４ｎｍ（特にアルゴンイオンレーザー励起源の出力による励起に好適）においてもしくはその近くで、または５４６ｎｍ（特に水銀アークランプによる励起に好適）の近くで吸収する。一部の態様において、フルオロフォアは、組織または生物全体の適用についてＮＩＲ（近赤外領域）中で発光し得る。蛍光標識の他の所望の特性としては、例えば、抗体の標識を細胞または生物（例えば、生存動物）中で実施すべき場合、細胞浸透性および低い毒性を挙げることができる。

【0175】

一実施形態において、Ｒ^１またはポリペプチド（特にＲ^１）は、捕捉タグを含む。一部の態様において、捕捉タグは、ビオチンまたはＨｉｓ６タグである。ビオチンは、有用である。それというのも、それは酵素系中で機能して検出可能なシグナルをさらに増幅させ得、単離目的のための親和性クロマトグラフィー中で使用することができるタグとしても機能し得るためである。検出目的のため、ビオチンについての親和性を有する酵素コンジュゲート、例えば、アビジン−ＨＲＰを使用することができる。

【0176】

続いて、ペルオキシダーゼ基質を添加して検出可能なシグナルを生成することができる。ビオチンに加え、他のハプテン、例として、ホルモン、天然存在および合成薬物、汚染物質、アレルゲン、エフェクター分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間産物、ヌクレオチドなどを使用することができる。

【0177】

一実施形態において、Ｒ^１は、酵素を含む。酵素は、有効な標識である。それというのも、検出可能なシグナルの増幅を得ることができ、アッセイ感度の増加をもたらすためである。酵素自体は検出可能な応答を生成しないことが多いが、それが適切な基質により接触される場合に基質を分解するように機能し、その結果、変換された基質が蛍光、発色または発光シグナルを生成する。酵素は、検出可能なシグナルを増幅させる。それというのも、標識試薬上の１つの酵素が、検出可能なシグナルに変換される複数の基質をもたらし得るためである。酵素基質は、計測可能な生成物、例えば、発色、蛍光または化学ルミネセンスを生じさせるように選択する。このような基質は、当分野において広く使用され、当分野において公知である。

【0178】

一部の実施形態において、発色または蛍光発生基質および酵素の組合せは、酸化還元酵素、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび基質、例えば、区別される色を生じさせる３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）および３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）（それぞれ、褐色および赤色）を使用する。検出可能産物を生じさせる他の発色オキシドレダクターゼ基質としては、限定されるものではないが、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトールが挙げられる。蛍光発生基質としては、限定されるものではないが、ホモバニリン酸または４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元フェノキサジンおよび還元ベンゾチアジン、例として、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬およびそのバリアントならびに還元ジヒドロキサンテン、例として、ジヒドロフルオレセインおよびジヒドロローダミン、例として、ジヒドロローダミン１２３が挙げられる。

【0179】

本開示は、チラミド試薬であるペルオキシダーゼ基質を用いることに及び、それは、酵素の作用前に固有に検出可能であり得るが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）として記載される方法におけるペルオキシダーゼの作用により「位置固定される」という点で、ペルオキシダーゼ基質のユニーククラスを表す。これらの基質は、顕微鏡観察、フローサイトメトリー、光学走査および蛍光光度法によるそれらの後続の検出のために細胞、組織またはアレイである試料中の標的を標識するために広く活用される。

【0180】

本開示は、発色（および一部の場合、蛍光発生）基質および酵素組合せに及び、それは、ホスファターゼ酵素、例えば、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、またはそのようなホスファターゼの組換え型を、発色基質、例えば、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルホスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、もしくはｏ−ニトロフェニルホスフェートとの、または蛍光発生基質、例えば、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号明細書）フルオレセインジホスフェート、３−Ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、レゾルフィンホスフェート、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート（ＤＤＡＯホスフェート）、もしくはＥＬＦ９７、ＥＬＦ３９もしくは関連ホスフェートとの組合せで使用することもある。

【0181】

本開示はまた、グリコシダーゼ、特にベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼおよびベータ−グルコシダーゼを含むＲ^１に及び、それらは追加の好適な酵素である。適切な発色基質としては、限定されるものではないが、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）および類似のインドリルガラクトシド、グルコシド、ならびにグルクロニド、ｏ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）およびｐ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。一部の実施形態において、蛍光発生基質としては、レゾルフィンベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニドおよびそれらの構造バリアント、４−メチルウンベリフェリルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドならびにフッ素化クマリンベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。

【0182】

追加の酵素としては、限定されるものではないが、ヒドロラーゼ、例えば、コリンエステラーゼおよびペプチダーゼ、オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼおよびシトクロムオキシダーゼ、ならびに好適な基質が公知のレダクターゼが挙げられる。

【0183】

酵素および化学ルミネセンスを生成するその適切な基質は、本開示の分子中への取り込みに有用である。これらとしては、限定されるものではないが、天然および組換え形態のルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。ホスファターゼ、グリコシダーゼおよびオキシダーゼのための化学ルミネセンス生成基質、例えば、安定なジオキセタン、ルミノール、イソルミノールおよびアクリジニウムエステルを含有するものは、さらに生産性がある。そのような異種部分は核酸である。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、ヘアピンまたは核酸模倣体、例えば、ペプチド核酸からなる群から選択することができる。ある態様において、コンジュゲート核酸は、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００以上の塩基対である。コンジュゲート核酸は、一本鎖であり得る。種々の態様において、コンジュゲート核酸は、二本鎖であり得る。一部の態様において、コンジュゲート核酸は、オープンリーディングフレームをコードする。一部の態様において、コンジュゲート核酸によりコードされるオープンリーディングフレームは、アポトーシス誘導タンパク質、ウイルスタンパク質、酵素、または腫瘍抑制タンパク質に対応する。細胞へのこのような核酸の送達のための技術は、当分野において公知である。

【0184】

他の定義
提供される実施形態を詳述する前に、本開示は具体的な組成物にもプロセスステップにも限定されるものではなく、それ自体変動し得ることを理解すべきである。本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が特に明示しない限り、複数の参照物を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）は、ならびに用語「１つ以上の」および「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。

【0185】

さらに「および／または」は、本明細書で使用される場合、他方を伴ってまたは伴わずに、２つの規定の特徴部または構成要素のそれぞれを具体的に開示すると解釈すべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用されるおよび／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される用語「および／または」は、以下の態様のそれぞれを包含するものとする：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。

【0186】

特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関する技術分野の当業者が一般に理解するものと同一の意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ、２ｎｄ ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，１９９９、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ Ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓは、本開示において使用される用語の多くについて一般的辞書を当業者に提供する。

【0187】

単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）により容認された形式で表示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を包含する。特に記載のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右に記載される。本明細書に提供される見出しは、本開示の種々の態様を限定するものではなく、本明細書を全体として参照することにより把握され得るものである。したがって、この直後に定義される用語は、本明細書を全体として参照することにより、さらに完全に定義される。

【0188】

アミノ酸は、それらの一般に公知の三文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨される一文字記号のいずれかにより、本明細書において言及される。同様にヌクレオチドは、それらの一般に認められた一文字コードにより言及される。

【0189】

用語「対象」は、特定の治療のレシピエントになり得る任意の動物（例えば、哺乳動物）、例として、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを指す。典型的には、用語「対象」および「患者」は、ヒト対象への言及において互換的に使用することができる。

【0190】

用語「医薬組成物」は、活性成分（例えば、本明細書に開示のコンジュゲート化合物）の生物学的活性が有効であることを許容するような形態であり、組成物が投与される対象に対して許容されない毒性である追加の構成要素を含有しない製剤を指す。このような組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。このような組成物は、無菌であり得る。

【0191】

本明細書に開示のコンジュゲート化合物の「有効量」は、具体的に記述される目的を実施するために十分な量である。「有効量」は、記述される目的に関して経験的に、および定型的に決定することができる。

【0192】

用語「治療有効量」は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「治療する」ために有効な本明細書に開示のコンジュゲート化合物または他の薬物の量を指す。

【0193】

語「標識」は、本明細書において使用される場合、「標識された」コンジュゲート化合物を生成するために本明細書に開示の遺伝子操作抗体またはその断片（例えば、システイン遺伝子操作抗体またはその断片）に直接または間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体により検出可能であり得（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能である基質化合物または組成物の化学変化を触媒し得る。

【0194】

例えば、「治療する」または「治療」または「治療すること」という用語は、（１）診断された病態または障害の症状を治癒し、減速させ、軽減し、および／またはその進行を停止させる治療的措置、ならびに（２）標的化される病状または障害の発症を予防し、および／または遅延させる予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）的措置の両方を指す。したがって、治療を必要とされる者としては、すでに障害を有する者；障害に罹患しやすい者；および障害を予防すべき者が挙げられる。ある態様において、患者が、例えば、疾患または病態、例えば、あるタイプの癌の完全、部分的または一過的寛解を示す場合、対象は、本開示の方法により疾患または病態、例えば、癌について良好に「治療」される。

【0195】

用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー、例として、ＤＮＡおよびＲＮＡを指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはそれらのアナログ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびそれらのアナログを含み得る。

【0196】

本明細書において使用される用語「ベクター」は、宿主細胞中に目的の１つ以上の遺伝子または配列を送達し、一部の態様において、発現し得る構築物を指す。ベクターの例としては、限定されるものではないが、ウイルス性ベクター、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン縮合剤と会合しているＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、ならびにある真核細胞、例えば、プロデューサー細胞が挙げられる。

【0197】

本明細書において使用される用語「〜を含む」は、本明細書に関して「例として、〜が挙げられる」と解釈すべきである。

【0198】

本明細書において使用される「本開示において用いられる」は、本開示の方法において用いられること、本開示の中間体を含む分子中で用いられること、またはその両方を、使用される用語の文脈に応じて適宜指す。

【0199】

言語「含む」によりどの態様が本明細書に記載されようとも、「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」に関して記載される他の点で類似の態様も提供されることが理解される。

【0200】

本明細書に記載の任意の積極的実施形態またはそれらの組合せは、消極的除外、すなわち、ディスクレーマーを基礎とし得る。

【0201】

組成物
本開示は、本明細書に記載の分子（例えば、本開示の加水分解された分子）を含む組成物、特に、本開示の分子および医薬賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物（または診断組成物）に及ぶ。

【0202】

組成物は、通常、薬学的に許容可能な担体を通常含む無菌医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、ワクチン配合物に関して薬学的に許容可能なアジュバントをさらに含み得る。

【0203】

本開示はまた、前記組成物を調製する方法、例えば、本開示の分子、例えば、本開示の加水分解された分子を、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤または担体の１つ以上と一緒に添加し、混合することを含む、医薬または診断組成物の調製に及ぶ。

【0204】

本開示の抗体は、医薬もしくは診断組成物中の唯一の活性成分であり得、または他の活性成分を伴い得る。

【0205】

医薬組成物は、好適には、治療有効量の本開示による分子を含む。本明細書において使用される用語「治療有効量」は、標的疾患もしくは病態を治療、改善もしくは予防するため、または検出可能な治療もしくは予防効果を示すために必要とされる治療剤の量を指す。治療有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、通常、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタもしくは霊長類のいずれかにおいて最初に推定することができる。動物モデルを使用して適切な濃度範囲および投与経路を決定することもできる。次いで、このような情報を使用してヒトにおける有用な用量および投与経路を決定することができる。

【0206】

ヒト対象のための正確な治療有効量は、病状の重症度、対象の全身健康状態、対象の年齢、体重および性別、食事ならびに投与時間および頻度、薬物の組合せ、反応感受性および治療法に対するトレランス／応答に依存する。この量は定型的な実験により決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇである。医薬組成物は、所定量の本発明の活性薬剤を用量ごとに含有する単位投与形態で簡便に提供することができる。本開示の分子が投与される実際の用量は、治療すべき病態の性質、例えば、存在する疾患／炎症の程度および分子が予防的に使用されるか既存の病態を治療するために使用されるかに依存する。

【0207】

組成物は、患者に個々に投与することができ、または他の薬剤、薬物もしくはホルモンとの組合せで（例えば、同時に、連続的にまたは別個に）投与することができる。

【0208】

薬学的に許容可能な担体は、それ自体、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導すべきでなく、毒性であるべきでない。好適な担体は、大型の緩慢に代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子であり得る。

【0209】

治療組成物中の薬学的に許容可能な担体は、液体、例えば、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールをさらに含有し得る。さらに、助剤物質、例えば、湿潤剤および乳化剤またはｐＨ緩衝物質がそのような組成物中に存在し得る。このような担体により、医薬組成物を患者による摂取のために錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤および懸濁液として配合することができる。

【0210】

好適な投与形態としては、非経口投与に好適な形態、例えば、注射または注入によるもの、例えば、ボーラス注射または連続注入によるものが挙げられる。生成物が注射または注入用である場合、それは油性または水性ビヒクル中の懸濁液剤、液剤、またはエマルジョンの形態をとり得、それは配合剤、例えば、懸濁化剤、保存剤、安定剤および／または分散剤を含有し得る。あるいは、本開示の分子は、適切な無菌液体による使用前の再構成のための乾燥形態であり得る。

【0211】

本開示による配合物において、好適には、最終配合物のｐＨは、抗体の等電点の値と類似せず、例えば、配合物のｐＨが７である場合、８〜９以上のｐＩが適切であり得る。理論により拘束されるものではないが、これは、最終的に、改善された安定性を有する最終配合物を提供し得、例えば、抗体は溶液中で残留することが考えられる。

【0212】

本発明の医薬組成物は、任意数の経路、例として、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、国際公開第９８／２０７３４号パンフレット参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内または直腸経路により投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物は、注射剤として、溶液剤または懸濁液剤のいずれかとして調製することができる。注射前の液体ビヒクル中の液剤、または懸濁液剤に好適な固体形態を調製することもできる。

【0213】

組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内送達により達成することができ、または組織の間質腔に送達される。組成物は、病変中に投与することもできる。投薬治療は、単回用量スケジュールまたは複数回用量スケジュールであり得る。

【0214】

組成物はポリペプチドを含み、したがって、それは消化管中の分解を受けやすい場合があることが認識される。したがって、消化管を使用する経路により組成物を投与すべき場合、組成物は、ポリペプチドを分解から保護するが、組成物が消化管から吸収されたら抗体を放出する薬剤を含有することが必要である。

【0215】

薬学的に許容可能な担体の詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。

【0216】

一実施形態において、配合物は、吸入を含む局所投与のための配合物として提供される。

【0217】

好適な吸入製剤としては、吸入散剤、噴射ガスを含有する計量エアロゾルまたは噴射ガスを有さない吸入液剤が挙げられる。活性物質を含有する本開示による吸入散剤は、上記の活性物質のみからなり、または上記の活性物質と生理学的に許容可能な賦形剤との混合物からなり得る。

【0218】

これらの吸入散剤は、単糖（例えば、グルコースまたはアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖および多糖（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム）またはこれらと互いとの混合物を含み得る。好適には単糖または二糖が使用され、特にラクトースまたはグルコースが使用されるが、それらの水和物の形態に限らない。

【0219】

肺中の堆積のための粒子は、１０ミクロン未満、例えば、１〜９ミクロン、例えば、０．１から５μｍ、特に１から５μｍの粒子サイズを要求する。活性成分（例えば、抗体）の粒子サイズは、最重要である。

【0220】

吸入エアロゾルを調製するために使用することができる噴射ガスは、当分野において公知である。好適な噴射ガスは、炭化水素、例えば、ｎ−プロパン、ｎ−ブタンまたはイソブタンおよびハロ炭化水素、例えば、メタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンまたはシクロブタンの塩素化および／またはフッ素化誘導体の中から選択される。上記の噴射ガスは、それら自体で、またはそれらの混合物で使用することができる。

【0221】

特に好適な噴射ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａおよびＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上記のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）およびそれらの混合物が特に好適である。

【0222】

噴射ガスを含有する吸入エアロゾルは、他の成分、例えば、共溶剤、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、酸化防止剤、滑沢剤およびｐＨ調整手段も含有し得る。これら全ての成分は当分野において公知である。

【0223】

本発明による噴射ガスを含有する吸入エアロゾルは、最大５重量％の活性物質を含有し得る。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２から５重量％、０．０１から３重量％、０．０１５から２重量％、０．１から２重量％、０．５から２重量％または０．５から１重量％の活性成分を含有する。

【0224】

あるいは、肺への局所投与は、例えば、デバイス、例えば、噴霧器、例えば、圧縮器に接続された噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｖａ．により製造されたＰａｒｉ Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮器に接続されたＰａｒｉ ＬＣ−Ｊｅｔ Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）を用いる溶液剤または懸濁液剤配合物の投与によるものでもあり得る。

【0225】

本開示の分子は、溶媒中で分散させて、例えば、液剤または懸濁液剤の形態で送達することができる。これは、適切な生理学的溶液、例えば、生理食塩水または他の薬理学的に許容可能な溶媒または緩衝溶液中で懸濁させることができる。

【0226】

治療懸濁液剤または液剤配合物は、１つ以上の賦形剤も含有し得る。賦形剤は当分野において周知であり、それとしては、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液および重炭酸緩衝液）、アミノ酸、ウレア、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールが挙げられる。液剤または懸濁液剤は、リポソームまたは生分解性マイクロスフェア中に封入することができる。配合物は、一般に、無菌製造プロセスを用いて実質的に無菌形態で提供される。

【0227】

これは、当業者が精通する方法による、配合物のために使用される緩衝溶媒／溶液の濾過による産生および滅菌、無菌緩衝溶媒溶液中の分子の無菌懸濁、および無菌容器中への配合物の分散を含み得る。

【0228】

治療
本開示はまた、治療有効量の本開示による分子または組成物、例えば、それを含む医薬組成物を投与することにより、治療が必要とされる患者を治療する方法に及ぶ。

【0229】

一実施形態において、治療において使用される、特に、本明細書に記載の疾患または病態、例えば、癌の治療において使用される本開示の分子またはそれを含む組成物が提供される。

【0230】

一実施形態において、本明細書に記載の病態または疾患、例えば、癌を治療するための医薬品の製造における、本開示の分子またはそれを含む組成物の使用が提供される。

【0231】

したがって、本発明の分子は、病態の治療および／または予防において有用である。

【0232】

したがって、例えば、医薬配合物中で治療有効量を投与することにより治療において使用される本発明による分子が提供される。一実施形態において、本開示による分子は、例えば、吸入により肺に局所投与される。

【0233】

本発明により提供される抗体は、疾患または障害、例として、炎症疾患および傷害、免疫疾患および障害、線維障害および癌の治療において有用である。

【0234】

用語「炎症疾患」または「障害」および「免疫障害または障害」は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、マックス・ウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植および移植片対宿主病を含む。

【0235】

用語「線維障害」は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（または強皮症）、腎線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧症、末期腎不全、腹膜線維症（連続携行式腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、心反応性線維症、瘢痕化、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠状動脈バイパス外科手術、関節形成および白内障手術を含む。

【0236】

用語「癌」は、皮膚中に見出される上皮、またはより一般に、身体器官の内層、例えば、乳房、卵巣、前立腺、結腸、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱または腸から生じる悪性新生物を含む。癌は、隣接組織中に浸潤し、遠位器官、例えば、骨、肝臓、肺または脳に拡散（転移）する傾向がある。

【0237】

治療すべき対象は、動物であり得る。しかしながら、１つ以上の実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適合される。

【実施例】

【0238】

以下の実施例は、本明細書においてＴ２８９Ｃと称されるモノクローナル抗体を用いる。
ＡＣ_４ＧｌｃＮＡｚ テトラアシル化Ｎ−アジドアセチルグルコサミン
ＡＤＣ 抗体薬物コンジュゲート
ＢＣＮ ビシクロ［６．１．０］ノニン
ＢＭＥ β−メルカプトエタノール
ＤＴＴ ジチオトレイトール
ＭＭＡＥ トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン
ＰＡＢ パラ−アミノベンジルアルコール

【0239】

実施例１ マレイミドプロピオニル−ＰＥＧ_７−ビオチンの合成

【化31】

ビオチン−ＰＥＧ７アミン（１）（１００ｍｇ、０．１６８ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（７ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｎ２下で室温においてマレイミドプロピオン酸ＮＨＳエステル（２）（４９．２ｍｇ、０．１８６ｍｍｏｌ、１．１当量）を添加した。１時間撹拌した後、ＴＬＣ分析は反応の完了を示し、そのとき１ＮのＨＣｌ（２ｍＬ）を添加した。有機溶液を分離し、塩水により洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。真空下での蒸発後に得られた粗製生成物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、ジクロロメタン中ＭｅＯＨの段階勾配（ｖ／ｖ＝１：３０、１：２０および１：１０）により溶出させて目的化合物マレイミドプロプリオニル（ｐｒｏｐｒｉｏｎｙｌ）−ＰＥＧ７−ビオチン（３）（６５ｍｇ、０．０８７ｍｍｏｌ、５２％の収率）ワックス状固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）ｄ ７．０１（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、６．９６（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、６．７０（ｓ，２Ｈ）、５．８６（ｓ，１Ｈ）、５．０６（ｓ，１Ｈ）、４．５１（ｍ，１Ｈ）、４．３３（ｍ，１Ｈ）、３．８４（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、３．６２−３．６６（ｍ、２４Ｈ）、３．５３（ｍ，４Ｈ）、３．４０（ｍ，４Ｈ）、３．１５（ｍ，１Ｈ）、２．８８−２．９６（ｍ，１Ｈ）、２．７３（ｄ，Ｊ＝１２．６Ｈｚ，１Ｈ）、２．５２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）、２．２４（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ）、１．６６（ｍ，４Ｈ）、１．４５（ｍ，２Ｈ）。

【0240】

実施例２ マレイミドフェニルアセチル−ＰＥＧ_７−ビオチンの合成

【化32】

ビオチン−ＰＥＧ_７−ＮＨ_２（１）（０．２５ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびマレイミドフェニル酢酸ＮＨＳエステル（４）（０．２ｇ、０．６０９ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１０ｍＬ）中混合物を、Ｎ_２下で周囲温度において一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、得られた残留物をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製し、ｖ／ｖ １：３０、１：２０、１：１０：１および１：５の比におけるジクロロメタンからジクロロメタン中ＭｅＯＨ）の段階勾配により溶出させて油状物（７０ｍｇ、．０８７ｍｍｏｌ、２１％の収率）としての標的生成物マレイミドフェニルアセチル−ＰＥＧ_７−ビオチン（５）を^１Ｈ ＮＭＲにより示される３：１の比における所望生成物および加水分解形態の１９０ｍｇの混合物ならびに１５ｍｇの１：２混合物とともに得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）ｄ ７．４１、７．３０（ＡＢ型、Ｊ_ＡＢ＝８．３Ｈｚ，４Ｈ）［７．６４、７．２４（ＡＢ型、Ｊ_ＡＢ＝９．２Ｈｚ，４Ｈ）微量構成要素］、６．８５（ｓ，２Ｈ）［６．２３（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、６．４７（ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ）、微量構成要素］、６．６３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、６．５５（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、５．８３（ｓ，１Ｈ）、５．１８（ｓ，１Ｈ）、４．４９（ｍ，１Ｈ）、４．３１（ｍ，１Ｈ）、３．６３−３．４０（ｍ，３４Ｈ）、３．１５（ｍ，１Ｈ）、２．９０（ｄ−ＡＢ型、Ｊ_ＡＢ＝１２．９、Ｊ＝４．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．７２（ＡＢ型、Ｊ_ＡＢ＝１２．９Ｈｚ，１Ｈ）、２．２２（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．６８（ｍ，４Ｈ）、１．４６（ｍ，２Ｈ）．ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ８３０（Ｍ＋Ｎａ）、８２５（Ｍ＋ＮＨ_４、ベースピーク）、８０８（Ｍ＋１）。

【0241】

実施例３ ２−フルオロ−５−マレイミドフェニル−ＰＥＧ_７−ビオチンの合成

【化33】

ビオチン−ＰＥＧ７−ＮＨ２（１）（０．１ｇ、０．１６８ｍｍｏｌ、１当量）および２−フルオロ−５−マレイミドフェノール酸ＮＨＳエステル（６）（０．０８４ｇ、０．２５２ｍｍｏｌ、１．５当量）のジクロロメタン（１ｍＬ）中混合物を、Ｎ２下で周囲温度において一晩撹拌した。溶媒を真空下で除去し、得られた残留物をＬＨ２０カラム上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製し、ＭｅＯＨ／ジクロロメタン（ｖ／ｖ １：１）により溶出させてＨＰＬＣにより示される約１０％の加水分解形態を含有する油状物（２８ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ、２０．５％の収率）としての標的生成物２−フルオロ−５−マレイミドフェニル−ＰＥＧ７−ビオチン（７）を得た。３：２の比における所望生成物および加水分解形態の追加の９０ｍｇの混合物も得た。１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）ｄ ８．０５（ｄｄ，Ｊ＝６．７、２．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．４７（ｄｄ，Ｊ＝４．５、２．７Ｈｚ，１Ｈ）、７．２３（ｍ，１Ｈ）［８．２０（ｍ，１Ｈ）、７．４６（ｍ，１Ｈ）、７．１９（ｍ，１Ｈ）、微量構成要素］、６．８８（ｓ，２Ｈ）［６．４５、６．２４（ＡＢ型、ＪＡＢ＝１２．９Ｈｚ，２Ｈ）、微量構成要素］、６．６３（ｂｒ ｓ，１Ｈ）、６．０５（ｓ，１Ｈ）、４．４９（ｍ，１Ｈ）、４．３１（ｍ，１Ｈ）、３．６６−３．５４（ｍ、３２Ｈ）、３．４３（ｍ，２Ｈ）、３．１４（ｍ，１Ｈ）、２．９０（ｄ−ＡＢ型、ＪＡＢ＝１２．７、Ｊ＝５．０Ｈｚ，１Ｈ）、２．７３（ＡＢ型、ＪＡＢ＝１２．７Ｈｚ，１Ｈ）、２．２２（ｍ，２Ｈ）、１．７３（ｍ，４Ｈ）、１．４４（ｍ，２Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ８３５（Ｍ＋Ｎａ）、８２９（Ｍ＋ＮＨ４）、８１３（Ｍ＋１、ベースピーク）。

【0242】

実施例４ ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンをｍＡｂにコンジュゲートさせるための一般手順

【化34】

式中、ｘは、式（Ｉ）の化合物について上記に定義されるＸを表し、場合により、式（Ｉ）の化合物について定義されるＹをさらに含む。

【0243】

ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンを、いくつかのステップでｍＡｂ（ＦｃのＴ２８９Ｃ突然変異を含む）にコンジュゲートさせた。最初に、５ｍＬの１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．２中１．６ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ溶液（８ｍｇのｍＡｂ、５３．３ｎＭ、１当量）を４３μＬの水中５０ｍＭのＴＣＥＰ溶液（２．１５μｍｏｌ、４０当量）と合わせ、次いで３７℃において１時間穏やかに混合することにより、ｍＡｂを軽度に還元して遊離スルフヒドリルを生成した。還元ｍＡｂをｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｉｚｅｒ透析カセット（１０ＫのＭＷＣＯ）に移し、ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．８に対して数回の緩衝液交換で４℃において２４時間透析した。ジヒドロアスコルビン酸（２１μＬのＤＭＳＯ中５０ｍＭの原液、１．１μｍｏｌ、２０当量）を添加し、次いで室温において４時間穏やかに混合することにより、還元ｍＡｂを酸化して内部ジスルフィドを再形成した。１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．５について一塩基性、ｐＨ８．６について二塩基性、またはｐＨ７．４に調整された原液）を、１００ｍＭの最終リン酸塩濃度および１．３ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ濃度まで添加することにより、酸化ｍＡｂ溶液を所望ｐＨに調整した。次に、１．１５ｍＬのｍＡｂ溶液（１．５ｍｇ、１０ｎｍｏｌ、１当量）をバイアル中にアリコート化し、次いでｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン原液（２μＬのＤＭＡｃ中１０ｍＭの原液、２０ｎｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を短時間ボルテックスに供し、さらに所望の時間量インキュベートし、次いでＮ−アセトリ（ａｃｅｔｌｙ）システイン（１０μＬの水中１００ｍＭの溶液、１μｍｏｌ、１００当量）を添加し、さらに１５分間インキュベートして未反応マレイミドをクエンチした。全てのコンジュゲーション反応は、周囲雰囲気下で室温（２２℃）において実施した。ｍＡｂに対する２当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン＝ｍＡｂ中に含有される遊離システインに対する１当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンであることに留意されたい。この一般手順を、必要に応じて改変して所望の反応化学量論（すなわち、異なるマレイミド：ｍＡｂフィード）を達成した。

【0244】

ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ ３００ＳＢ−Ｃ３；５ｕｍ、２．１ｍｍ×７５ｍｍ；部品番号６６０７５０−９０９）を備えるＡｇｉｌｅｎｔ ６５２０Ｂ Ｑ−ＴＯＦ質量分析計を使用してＡＤＣ試料を分析した。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）パラメータは以下のとおりであった：流速、０．４ｍｌ／分；移動相ＡはＨＰＬＣグレードＨ_２Ｏ中０．１％（ｖ／ｖ）のギ酸であり、移動相Ｂはアセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸であった。カラムを９０％のＡ／１０％のＢ中で平衡化し、さらにそれを使用してＡＤＣ試料を脱塩し、次いで４０％のＡ／６０％のＢ中で溶出させた。質量スペクトルデータを１００〜３０００ｍ／ｚ、陽性極性、３５０℃のガス温度、４８ｌｂ／ｉｎ^２の噴霧器圧、および５，０００Ｖのキャピラリー電圧について収集した。販売業者により供給された（Ａｇｉｌｅｎｔ ｖ．Ｂ．０４．００）ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用してデータを分析し、デコンボリュートスペクトルからのピーク強度を使用して反応物質および生成物の相対比率；ならびに反応キネティクスを導出した。

【0245】

実施例５ コンジュゲーション効率および加水分解の割合の計算
コンジュゲーション効率の計算
デコンボリュート質量スペクトルのピーク強度から以下の数式：

【数1】

を使用してコンジュゲーション効率および薬物：抗体比（ＤＡＲ）を計算した。

【0246】

Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲーションチオスクシンイミドについての加水分解率の計算方法
デコンボリュート質量スペクトルのピーク強度から以下の数式：

【数2】

を使用して加水分解率値を計算した。

【0247】

実施例６ 半減期計算
導出された速度定数から数式４を使用して偽一次反応（加水分解および脱コンジュゲーション）について、および数式５を使用して二次反応（コンジュゲーション）について半減期を計算した：

【数3】

【0248】

実施例７ １当量のマレイミド：チオールにおけるｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンコンジュゲーションの分析
ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンｍＡｂコンジュゲートをＬＣ／ＭＳ分析のために、ＰＢＳ ｐＨ７．２により０．２ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いで５０μＬのｍＡｂ溶液を５μＬのＴＣＥＰ（水中０．５Ｍ）と合わせることにより調製した。この混合物を室温において５分間インキュベートしてジスルフィド結合を還元してからＬＣ／ＭＳ中のインジェクトした（１５μＬ）。代表的なデータを図１Ａおよび１Ｂに示す。

【0249】

【表1】

【0250】

実施例８ ０．５当量のマレイミド：チオールにおけるｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンコンジュゲーションの分析
ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンｍＡｂコンジュゲートを、実施例７に上記のとおり調製し、ただし、１当量のマレイミド：ｍＡｂを使用した。１当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンは、０．５当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン：チオールに等しいことに留意されたい。

【0251】

１）アルキルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチン（比較物）図２Ａ参照

【0252】

【表2】

【0253】

２）フェニルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチン 図２Ｂ参照

【0254】

【表3】

【0255】

３）フルオロフェニルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチン 図２Ｃ参照

【0256】

【表4】

【0257】

このデータは、分析方法が信頼性があること、すなわち、５０％の反応フィードが約５０％のコンジュゲーションを生じさせたことを示す。

【0258】

実施例９ ２２℃におけるＴ２８９Ｃ ｍＡｂへのｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンのコンジュゲーション効率
ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンｍＡｂコンジュゲートを上記のとおり調製し、２当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン：ｍＡｂを使用した。２当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン：ｍＡｂは、１当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン：チオールに等しいことに留意されたい。反応生成物を還元グリコシル化質量分析により分析し、数式１を使用してコンジュゲーション効率を計算した。結果を図３および図４に示す。

【0259】

実施例１０ ｐＨ５．５、２２℃におけるｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンとＴ２８９Ｃ ｍＡｂとのコンジュゲーションキネティクス
コンジュゲーションデータをモル濃度の単位で分析して速度定数を決定した。二次速度定数を１／［ＳＨ］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図５に示す。

【0260】

実施例１１ ｐＨ７．４、２２℃におけるｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンとＴ２８９Ｃ ｍＡｂとのコンジュゲーションキネティクス
コンジュゲーションデータをモル濃度の単位で分析して速度定数を決定した。二次速度定数を、１／［ＳＨ］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図６に示す。

【0261】

実施例１２ ｐＨ８．６、２２℃におけるｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンとＴ２８９Ｃ ｍＡｂとのコンジュゲーションキネティクス
コンジュゲーションデータをモル濃度の単位で分析して速度定数を決定した。二次速度定数を、１／［ＳＨ］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図７に示す。

【0262】

Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂへのコンジュゲーションについてのｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンキネティクスのまとめ

【0263】

【表5】

【0264】

文献比較：
１）ｐＨ７．０におけるＮ−エチルマレイミドとシステインとの反応、ｋ_２＝１．６２×１０^３Ｍ^−１ｓ^−１
Ｌｉ，Ｊ．；Ｘｕ，Ｑ．；Ｃｏｒｔｅｓ，Ｄ．；ｅｔ ａｌ．Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎｓ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔａｉｌ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ．ＰＮＡＳ ２００２，９９（１８），１１６０５−１１６１０．
２）ｐＨ７．０におけるＮ−エチルマレイミドとβ−メルカプトエタノールとの反応、ｋ_２＝０．７１×１０^３Ｍ^−１ｓ^−１
Ｍｏｓｓｅｒ，Ｇ．Ｎ−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ｔａｓｔｅ ｃｅｌｌ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．１９７６，７（５），４５７−４６８．

【0265】

実施例１３ プレインキュベーション後のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンとＴ２８９Ｃ ｍＡｂとの反応キネティクス：マレイミド加水分解の間接的計測
ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンを、異なるｐＨの緩衝溶液中でプレインキュベートしてそれらの経時的な安定性およびチオールコンジュゲーション効率を評価した。このアッセイは、マレイミド加水分解を間接的にモニタリングする。それというのも、加水分解されたマレイミドはチオールに対して反応性でないためである。Ｔ２８９Ｃ ＦＣ突然変異を有する抗体を上記のとおり還元および酸化し、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４を含有するＰＢＳ中で１．５ｍｇ／ｍＬに調整した。２０μＬのｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン溶液（ＤＭＡｃ中１０ｍＭ溶液）を所望のｐＨにおいて１８０μＬの緩衝液と合わせることにより、マレイミド溶液を緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ５．５、７．４、８．６）中で調製し（最終ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン濃度＝１ｍＭ）、２２℃において所定の時間間隔インキュベートしてからｍＡｂと反応させた。コンジュゲーション反応のため、２６７μＬのｍＡｂ（１．５ｍｇ／ｍＬ、２．７ｎｍｏｌ、１当量）を５．３μＬの緩衝液インキュベートされたｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン溶液（５．４ｎｍｏｌ、２当量）と合わせた。マレイミド溶液の添加は、ｍＡｂ溶液のｐＨに影響を与えなかった。コンジュゲーション反応を２２℃においてｐＨ７．４において１．５時間進行させた。反応後、試料をＤＴＴにより室温において５分間還元し、質量分析により分析した。数式１を使用してコンジュゲーション率を計算した。結果を図８に示す。

【0266】

このデータは、マレイミド反応性が加水分解に起因して経時的に消失することを示す。マレイミド加水分解の速度は、Ｎ−アリールマレイミドの場合に増加する。全体として、マレイミド加水分解はチオール−マレイミドコンジュゲーションよりも緩慢であり、それはなぜＮ−アリールマレイミドについての効率的なコンジュゲーションがｐＨ８．６において観察されたかを説明する。以下のデータを使用して半減期を比較することができる。

【0267】

実施例１４ ｐＨ５．５、２２℃におけるマレイミド加水分解キネティクス
マレイミド加水分解データをモル濃度の単位でも分析して速度定数を決定した。偽一次速度定数をｌｎ［マレイミド］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図９に示す。

【0268】

実施例１５ ｐＨ７．４、２２℃におけるマレイミド加水分解キネティクス
マレイミド加水分解データをモル濃度の単位でも分析して速度定数を決定した。偽一次速度定数をｌｎ［マレイミド］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図１０に示す。

【0269】

実施例１６ ｐＨ８．６、２２℃におけるマレイミド加水分解キネティクス
マレイミド加水分解データをモル濃度の単位でも分析して速度定数を決定した。偽一次速度定数をｌｎ［マレイミド］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図１１に示す。

【0270】

ｘ−マレイミド加水分解キネティクスのまとめ

【0271】

【表6】

【0272】

文献比較：
１）ｐＨ７．６、２５℃におけるＮ−フェニルマレイミドの加水分解ｋ_ｏｂｓ＝７×１０^−５ｓ^−１
Ｏｌｅｋｓａｎｄｒ，Ｋ．；Ｌｅｒｉｃｈｅ，Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｃｙｓｔｅｉｎ ｗｉｔｈ ３−ａｒｙｌｐｒｏｐｉｏｌｏｎｉｔｒｉｌｅｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２０１４，２５、２０２−２０６．
２）ｐＨ８．３８、３０℃におけるマレイミド（非置換）の加水分解、ｋ_ｏｂｓ＝１．５１×１０^−４ｓ^−１
Ｋｈａｎ，Ｍ．Ｎ．Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ａｌｋａｌｉｎｅ ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍａｌｅｉｍｉｄｅ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９８４，７３（１２），１７６７−１１７１．

【0273】

このデータは、マレイミド加水分解がチオール−マレイミドコンジュゲーションよりもかなり緩慢であることを示し、したがって、Ｎ−アリールマレイミドは、コンジュゲーションに有用な試薬である。ｐＨ８．６におけるＦ−フェニルマレイミドの最も極端な例においても、マレイミド加水分解半減期は６分である一方、チオールコンジュゲーションは１５秒で完了する。

【0274】

実施例１７ ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのチオスクシンイミド加水分解キネティクス
ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンｍＡｂコンジュゲートを緩衝溶液中でインキュベートし、ＬＣ／ＭＳにより経時的にモニタリングしてチオスクシンイミド加水分解を観察した。最初に、Ｔ２８９Ｃ Ｆｃ突然変異を含有するｍＡｂ（０．７５ｍｇ、５ｎｍｏｌ、１当量）を、５７７ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．２中のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン（５０ｎｍｏｌ、５ｍＬのＤＭＡＣ中１０ｍＭの原液、１０当量）と反応させた。コンジュゲーション反応を５分間進行させ、次いでＮ−アセチルシステイン（５００ｎｍｏｌ、４ｍＬの水中１００ｍＭの原液、１００当量）によりクエンチし、さらに５分間インキュベートした。次いで、反応混合物を、所望のｐＨにおいて０．５ｍＭのＥＤＴＡおよび１Ｍのリン酸ナトリウムを含有するＰＢＳと合わせて０．６５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ、１００ｍＭのリン酸塩、０．５ＭのＥＤＴＡおよび１５０ｍＭのＮａＣｌの最終濃度を達成した。試料調製後、アリコートを取り出し、７５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ５．５により１：３希釈して初回時点試料を得た。次いで、試料を、所定の時点において取り出されたアリコートと所望の条件においてさらにインキュベートした。全ての試料を、７５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ５．５により直ちに１：３希釈して加水分解反応を停止させた。次いで、試料を滅菌濾過し、ＴＣＥＰにより還元し、ＬＣ／ＭＳにより分析した。チオスクシンイミド加水分解を、質量スペクトル中のｍＡｂコンジュゲートピークへの１８ａｍｕの付加により確認した。デコンボリュート質量スペクトル中のピーク強度および数式３を使用して加水分解の半定量的分析を実施し、それはＴ＝０計測値を使用するバックグラウンドサブトラクションを含む。次いで、データをチオスクシンイミド（Ｍ）の経時的損失に変換し、ｌｎ［チオスクシンイミド］対秒としてプロットした。ベストフィット直線の傾きは、チオスクシンイミド加水分解についての偽一次速度定数を生じさせた。１時間、ｎ＝３におけるチオスクシンイミド加水分解を決定するための追加の実験を実施した。

【0275】

実施例１８ ＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのｐＨ７．４、２２℃におけるチオスクシンイミド加水分解
チオスクシンイミド加水分解データをモル濃度の単位でも分析して速度定数を決定した。偽一次速度定数をｌｎ［マレイミド］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図１２に示す。

【0276】

実施例１９ ＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのｐＨ７．４、３７℃におけるチオスクシンイミド加水分解
チオスクシンイミド加水分解データをモル濃度の単位でも分析して速度定数を決定した。偽一次速度定数をｌｎ［マレイミド］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図１３に示す。

【0277】

実施例２０ ＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのｐＨ８．６、２２℃におけるチオスクシンイミド加水分解
チオスクシンイミド加水分解データをモル濃度の単位でも分析して速度定数を決定した。偽一次速度定数をｌｎ［マレイミド］対時間のプロットから作成された曲線の傾きおよび線形回帰分析から決定した。結果を図１４に示す。

【0278】

Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂ−ＰＥＧ−ビオチンコンジュゲートについてのチオスクシンイミド加水分解キネティクスのまとめ

【0279】

【表7】

【0280】

このデータは、Ｎ−アリールチオスクシンイミドの加水分解が、標準的なコンジュゲーション手順の大幅な変更なしで製造に容易に適用することができるタイムスケールで生じることを示す。例えば、ｐＨ７．４、２２℃における２４時間のペイロードコンジュゲーションの実施は、コンジュゲーションおよびチオスクシンイミド加水分解の両方を１ステップで可能とする。

【0281】

実施例２１ １時間のインキュベーション後のＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ−ｍＡｂコンジュゲートについてのｘ−チオスクシンイミド加水分解、ｎ＝３
結果を、平均±標準偏差、ｎ＝３としてプロットされた図１５に示す。このデータは、単一試料キネティクス実験について観察された傾向を拡張された試料セットについて裏付ける。チオスクシンイミド加水分解の容易性は、以下のとおり環上部の窒素に付着している化学物質に依存する：Ｎ−アルキル＜＜Ｎ−フェニル＜Ｎ−フルオロフェニル。これらの実験についての相対誤差は、典型的には、５％未満であった。

【0282】

実施例２２ モリブデン酸ナトリウムの存在下のＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのｘ−チオスクシンイミド加水分解
モリブデン酸ナトリウムを含有する緩衝溶液中でｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンｍＡｂコンジュゲートをインキュベートしてこの化合物がチオスクシンイミド加水分解を増加させ得るか否かを調査した。試料を上記のとおりＬＣ／ＭＳにより経時的にモニタリングしてチオスクシンイミド加水分解を観察した。最初に、Ｔ２８９Ｃ Ｆｃ突然変異を含有するｍＡｂ（０．５ｍｇ、３．３ｎｍｏｌ、１当量）をｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチン（５０ｎｍｏｌ、５ｍＬのＤＭＡＣ中１０ｍＭの原液、１５当量）と０．３６５ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．２中で反応させた。コンジュゲーション反応を５分間進行させ、次いでＮ−アセチルシステイン（５００ｎｍｏｌ、４ｍＬの水中１００ｍＭの原液、１５１当量）によりクエンチし、さらに５分間インキュベートした。次いで、反応混合物を、所望のｐＨにおいて１Ｍのモリブデン酸ナトリウムを含有する１ＭのＰＢＳと合わせて１００ｍＭのリン酸塩および１００ｍＭのモリブデン酸塩の最終濃度を達成した。モリブデン酸塩の添加後、混合物を２２℃において１時間インキュベートした。１時間後、試料を７５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．５により１：５希釈して加水分解を停止させた。次いで、試料を滅菌濾過し、ＴＣＥＰにより還元し、ＬＣ／ＭＳにより分析した。チオスクシンイミド加水分解を、質量スペクトル中のｍＡｂコンジュゲートピークへの１８ａｍｕの付加により確認した。デコンボリュート質量スペクトル中のピーク強度および数式３を使用して加水分解の半定量的分析を実施した。結果を図１６に示す。

【0283】

加水分解の顕著な向上が２つの試料について観察された：
Ａ）Ｆ−フェニルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチン ｐＨ５．５
Ｂ）Ｆ−フェニルマレイミド−ＰＥＧ−ビオチン ｐＨ７．４

【0284】

【表8】

【0285】

このデータは、Ｎ−フルオロフェニルチオスクシンイミドのみがモリブデン酸塩触媒加水分解に応答性であり、他のものは応答性でないことを示す。さらに、触媒効果は、予測されるとおり高ｐＨにおいて縮小する。

【0286】

実施例２３ チオールを含有する緩衝液中のチオール交換に対するＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの感受性
β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含有する水性緩衝液とビオチン−ｍＡｂコンジュゲートをインキュベートして脱コンジュゲーションに対するチオスクシンイミド結合を負荷した。上記のとおりＴ２８９Ｃ突然変異を含有するｍＡｂにｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンをコンジュゲートさせたが、わずかに改変した。コンジュゲーション反応を、１当量のｘ−ＰＥＧ−マレイミド：チオールにおいて２２℃において１５分間実施し、次いで直ちに０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳ ｐＨ７．２により０．２ｍｇ／ｍＬ（１．３３μＭのｍＡｂ）に希釈した。Ｎ−アセチルシステインクエンチングステップは省略した。ＢＭＥ含有試料のため、ＢＭＥを１％ｖ／ｖ（１４３ｍＭ）の最終濃度まで添加した。試料を周囲雰囲気下で撹拌せずに３７℃においてさらにインキュベートした。アリコートを種々の時点において取り出し、滅菌濾過し、ＤＴＴにより還元し、次いでＬＣ／ＭＳにより分析した。コンジュゲートｍＡｂおよびチオスクシンイミド加水分解の率を質量スペクトルのピーク高さからそれぞれ数式１および数式２を使用して決定した。脱コンジュゲートｍＡｂおよびチオスクシンイミド加水分解データをｌｎ［濃度］対時間（秒）としてプロットして偽一次速度定数をベストフィット直線の傾きから得た。結果を図１７に示す。

【0287】

実施例２４ ＢＭＥを含有する緩衝液中のＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの安定性

【0288】

【表9】

【0289】

【表10】

【0290】

結果を図１８に示す。このデータは、１）遊離チオールの存在下で異なるチオスクシンイミドタイプ間で変動安定性が観察されたことを示す。より速く加水分解する種は、より少ない脱コンジュゲーションを示し、２）Ｎ−アルキルチオスクシンイミドは、遊離チオールを欠く単純緩衝液中で脱コンジュゲートした。

【0291】

さらに、このデータはＮ−フルオロフェニルチオスクシンイミドの場合に急速な脱安定化をいかなる特別な処理もなしでコンジュゲーション直後に達成することができることを示す。

【0292】

実施例２５ ＢＭＥ負荷アッセイにおいて観察されたＰＥＧ−ビオチンＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについてのｐＨ７．２、３７℃におけるチオスクシンイミド加水分解
結果を図１９に示す。

【0293】

【表11】

【0294】

このデータは、Ｎ−フェニルおよびＮ−フルオロフェニルチオスクシンイミドが最初の２４時間で完全に加水分解することを示し、他の加水分解データと一致する。Ｎ−アルキルチオスクシンイミドはより緩慢に加水分解する。

【0295】

実施例２６ ＢＭＥ負荷アッセイにおいて観察されたチオスクシンイミド脱コンジュゲーションおよび加水分解間の関係
結果を図２０に示す。

【0296】

【表12】

【0297】

このデータを、左軸上に脱コンジュゲーションとして、および右軸上に加水分解としてプロットする。加水分解および脱コンジュゲーションは、明確に関連する。より高速の加水分解は、脱コンジュゲーションの最大量を制限する。

【0298】

実施例２７ 軽度加水分解後の遊離チオールの存在下のｍＡｂ−ビオチンコンジュゲートの安定性
β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含有する水性緩衝液中でビオチン−ｍＡｂコンジュゲートをインキュベートして脱コンジュゲーションに対するチオスクシンイミド結合を負荷した。この実験において、チオスクシンイミドコンジュゲートを、軽度塩基性条件における短時間のインキュベーションに供して安定性負荷前のチオスクシンイミド加水分解を容易にした。上記のとおりＴ２８９Ｃ突然変異を含有するｍＡｂにｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ビオチンをコンジュゲートさせたが、わずかに改変した。コンジュゲーション反応を１当量のｘ−ＰＥＧ−マレイミド：チオールにおいて２２℃において１５分間実施し、次いで、Ｎ−アセチルシステイン（ｍＡｂに対して１００当量）によりクエンチし、さらに５分間反応させた。反応混合物を、１０％ｖ／ｖのリン酸ナトリウム（１Ｍ、二塩基性）の添加によりｐＨ８．６に調整し、次いで３７℃において１時間インキュベートした。次いで、反応物を、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対して４℃において２４時間透析した。透析後、ｍＡｂ濃度をＡ２８０計測値（ＮａｎｏＤｒｏｐ）により確認し、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳ ｐＨ７．２により試料を０．２ｍｇ／ｍＬ（１．３３μＭのｍＡｂ）に希釈した。ＢＭＥ含有試料のため、ＢＭＥを１％ｖ／ｖ（１４３ｍＭ）の最終濃度まで添加した。試料を周囲雰囲気下で撹拌せずに３７℃においてさらにインキュベートした。アリコートを種々の時点において取り出し、滅菌濾過し、ＤＴＴにより還元し、次いでＬＣ／ＭＳにより分析した。コンジュゲートｍＡｂおよびチオスクシンイミド加水分解の率を質量スペクトルのピーク高さからそれぞれ数式１および数式２を使用して決定した。脱コンジュゲートｍＡｂおよびチオスクシンイミド加水分解データをｌｎ［濃度］対時間（秒）としてプロットして偽一次速度定数をベストフィット直線の傾きから得た。

【0299】

実施例２８ 軽度加水分解後の緩衝液中のチオール交換に対するＴ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの感受性

【0300】

【表13】

【0301】

【表14】

【0302】

このデータは、１）軽度加水分解によりＮ−アリールチオスクシンイミドが完全に安定化したが、Ｎ−アルキルチオスクシンイミドによっては完全に安定化しなかったことを示す。さらに、この実験からのＮ−アルキルチオスクシンイミドのチオール媒介脱コンジュゲーションについての偽一次速度定数は、前加水分解なしの実験からの値に密接に一致する（データは再現性を示した）。

【0303】

実施例２９ Ｎ−アルキルマレイミド−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの合成

【化35】

マレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルカルボニル−モノ−メチル−アウリスタチン−Ｅ（ｍｃ−ＶａｌＣｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ）を、改変を有する文献の方法^１により調製した。したがって、文献方法^２に従って新たに調製されたｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ｐ−アミノベンジルアルコールｐ−ニトロフェニルカルボネート（８）（２６５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ、１．５当量）、ＭＭＡＥ（９）（１６９ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１当量）およびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）（６．４８ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ、０．２当量）の混合物をＤＭＦ（５ｍＬ）中で室温で２分間撹拌し、次いでピリジン（３８ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。２４時間撹拌した後、揮発性有機物を真空下で除去した。得られた残留物を酢酸エチルおよびメタノール（１Ｌ）により粉砕してｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（１０）を白色粉末（２２０ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、７１％の収率）として得、それは通常、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析による＞９５％の純度であった。必要に応じて、さらなる精製をＣ１８逆相分取ＨＰＬＣまたはサイズ排除カラムクロマトグラフィーにより実施することができる。エレクトロスプレー（ＥＳ）−ＭＳ ｍ／ｚ１３３９（Ｍ＋Ｎａ、ベースピーク）、１３１７（Ｍ＋１）。

【0304】

参照文献：１）Ｄｏｒｏｎｉｎａ ＳＯ，Ｔｏｋｉ ＢＥ，Ｔｏｒｇｏｖ ＭＹ，Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ ＢＡ，Ｃｅｒｖｅｎｙ ＣＧ，Ｃｈａｃｅ ＤＦ，ＤｅＢｌａｎｃ ＲＬ，Ｇｅａｒｉｎｇ ＲＰ，Ｂｏｖｅｅ ＴＤ，Ｓｉｅｇａｌｌ ＣＢ，Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＪＡ，Ｗａｈｌ ＡＦ、Ｍｅｙｅｒ ＤＬ，Ｓｅｎｔｅｒ ＰＤ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｐｏｔｅｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３；２１：７７８−７８４．
２）Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ ＧＭ，Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅ ＲＡ，Ｐａｄｉｌｌａ Ｌ，Ｗｉｌｌｎｅｒ Ｄ，Ｈｏｆｓｔｅａｄ ＳＪ，Ｍｏｓｕｒｅ Ｋ，Ｋｎｉｐｅ ＪＯ，Ｌａｓｃｈ，ＳＪ，Ｔｒａｉｌ ＰＡ．Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｂ−ｌａｂｉｌｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｎｋｅｒｓ ｆｏｒ ｌｙｓｏｓｏｍａｌ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ ｆｒｏｍ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ｍｏｄｅｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｄｒｕｇ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．２００２；１３：８５５−８６９．

【0305】

実施例３０ Ｎ−フェニルアセチルマレイミド−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの合成

【化36】

Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（１００ｍｇ、０．０８９ｍｍｏｌ）およびマレイミドフェニル酢酸ＮＨＳエステル（４）（４３．８ｍｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１ｍＬ）中撹拌溶液に、Ｎ_２下で周囲温度においてＤＩＰＥＡ（５７．５ｍｇ、０．４４５ｍｍｏｌ）を添加した。一晩撹拌した後、ＭＳ分析は、生成物形成を示し、少量の出発材料が存在することを示した。混合物をＬＨ−２０カラム上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により最初に分離し、ＭｅＯＨ／ジクロロメタン（ｖ／ｖ１：１）により溶出させた。分画をＭＳによりモニタリングし、所望の生成物を有する分画を合わせた。真空下の蒸発乾固後、２５ｍｇ（０．０１８７ｍｍｏｌ、２１％の収率）の油状材料を得た。ＭＳは、ｍ／ｚ１３９１（Ｍ＋Ｃｌ＋Ｎａ）、１３６９（Ｍ＋Ｃｌ、ベースピーク）、１３６０（Ｍ＋Ｎａ）および１３３７（Ｍ＋１）においてイオンのクラスターを示した一方、ＨＰＬＣは、約２：１の比における２つのピークを示した。半分取ＨＰＬＣによるさらなる精製により、それぞれ５ｍｇおよび６ｍｇの２つの主要な分画を蒸発後に得た。しかしながら、これら２つの試料は、本質的に同一のＨＰＬＣおよびＭＳを示した。

【0306】

実施例３１ Ｎ−フェニルマレイミドＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの調製

【化37】

Ｎ−フェニルアセチルマレイミド−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを、いくつかのステップでｍＡｂ（ＦｃのＴ２８９Ｃ突然変異を含む）にコンジュゲートさせた。最初に、５ｍＬの１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．２中１．６ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ溶液（８ｍｇのｍＡｂ、５３．３ｎＭ、１当量）を４３μＬの水中５０ｍＭのＴＣＥＰ溶液（２．１５μｍｏｌ、４０当量）と合わせ、次いで３７℃において１時間穏やかに混合することにより、ｍＡｂを軽度に還元して遊離スルフヒドリルを生成した。還元ｍＡｂをｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｉｚｅｒ透析カセット（１０ＫのＭＷＣＯ）に移し、ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．８に対して数回の緩衝液交換で４℃において２４時間透析した。ジヒドロアスコルビン酸（２１μＬのＤＭＳＯ中５０ｍＭの原液、１．１μｍｏｌ、２０当量）を添加し、次いで室温において４時間穏やかに混合することにより、還元ｍＡｂを酸化して内部ジスルフィドを再形成した。酸化ｍＡｂ溶液（２．５ｍＬ、２７ｎｍｏｌ、１当量）を、１０％ｖ／ｖのＤＭＳＯと合わせ、次いでＮ−フェニルアセチルマレイミド−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（２７μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭの原液、２７０ｎｍｏｌ、１０当量）を添加した。反応を１時間混合しながら室温において進行させ、次いでＮ−アセチルシステイン（２１μＬの水中１００ｍＭの原液、２．２μｍｏｌ、８０当量）を添加して反応を停止させた。次いで、反応混合物を蒸留水により３倍希釈し、ＣＨＴクロマトグラフィーに供して遊離非コンジュゲート薬物を除去した（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ Ｍｉｎｉ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ ＣＨＴ Ｔｙｐｅ ＩＩ４０μｍ媒体カラム）。ＡＤＣを、緩衝液Ａ（１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．０）から緩衝液Ｂ（２ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．０）への勾配により２５分間にわたり溶出させた。ＣＨＴクロマトグラフィー後、試料を０．５ｍＭのＥＤＴＡが補給された１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２にｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット中の４℃における透析により緩衝液交換した。軽度加水分解に供された試料のため、１０％ｖ／ｖのリン酸ナトリウム溶液（１Ｍ、二塩基性）を添加し、その溶液を３７℃において１時間インキュベートした。次いで、加水分解された試料を、０．５ｍＭのＥＤＴＡが補給された１×ＰＢＳ（ｐＨ７．２）に対する透析により緩衝液交換した。ＡＤＣを、上記のとおり還元グリコシル化ＬＣ／ＭＳにより特徴付けした。それぞれ数式１および数式２を使用してコンジュゲーション効率およびＤＡＲを計算した。

【化38】

Ｎ−アルキルマレイミド−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥを、Ｎ−フェニルマレイミド−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ（上記参照）と同一の様式でｍＡｂ（ＦｃのＴ２８９Ｃ突然変異を含む）にコンジュゲートさせた。

【0307】

実施例３２ ｍｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂ ＡＤＣの分析
ｘ−マレイミド−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ−Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートについての代表的な還元グリコシル化質量分析データを、図２２に示す。

【0308】

【表15】

【0309】

ＭＭＡＥ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲーションデータのまとめ

【0310】

【表16】

【0311】

【表17】

【0312】

【表18】

【0313】

実施例３２ チオールを含有する緩衝液中のＭＭＡＥ−Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの安定性
β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含有する水性緩衝液中でＭＭＡＥ−ｍＡｂコンジュゲートをインキュベートしてチオール交換反応に対するチオスクシンイミド結合を負荷した。上記のとおりＴ２８９Ｃ突然変異を含有するｍＡｂにＭＭＡＥをコンジュゲートさせた。コンジュゲーション後、コンジュゲートをＣＨＴクロマトグラフィーにより直ちに精製して非コンジュゲート薬物を除去した。次いで、試料を短時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｉｚｅｒカセット、１０ｋＤａのＭＷＣＯ、４℃、２時間）に供して０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２に緩衝液を交換した。透析後、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳ ｐＨ７．２により試料を０．２ｍｇ／ｍＬ（１．３３μＭのｍＡｂ）に希釈した。ＢＭＥ含有試料のため、ＢＭＥを１％ｖ／ｖ（１４３ｍＭ）の最終濃度まで添加した。試料を周囲雰囲気下で撹拌せずに３７℃においてさらにインキュベートした。アリコートを種々の時点において取り出し、滅菌濾過し、ＤＴＴにより還元し、次いでＬＣ／ＭＳにより分析した。コンジュゲートｍＡｂおよびチオスクシンイミド加水分解の率を質量スペクトルのピーク高さからそれぞれ数式１および数式２を使用して決定した。脱コンジュゲートｍＡｂおよびチオスクシンイミド加水分解データをｌｎ［濃度］対時間（秒）としてプロットして偽一次速度定数をベストフィット直線の傾きから得た。

【0314】

実施例３３ チオール（ＢＭＥ）を含有する緩衝液中のＭＭＡＥ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの安定性
結果を図２３に示す。

【0315】

【表19】

【0316】

【表20】

【0317】

このデータは、ＭＭＡＥがチオール含有緩衝液中で脱コンジュゲートすること、およびＮ−アルキルマレイミドを用いて調製されたコンジュゲートが、Ｎ−フェニルマレイミドとコンジュゲートしているＭＭＡＥよりも安定でないことを示す。

【0318】

実施例３４ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲート中のＭＭＡＥ−チオスクシンイミドの加水分解
結果を図２４に示す。

【0319】

【表21】

【0320】

このデータは、Ｎ−アルキルマレイミドとコンジュゲートしているＭＭＡＥが、遊離チオールの存在下でＮ−フェニルマレイミドとコンジュゲートしているＭＭＡＥよりも安定でないことを示す。速度定数を計算するために使用されたｌｎプロットは示さない。

【0321】

実施例３５ チオール（ＢＭＥ）を含有する緩衝液中のＭＭＡＥ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートの安定性
結果を図２５に示す。

【0322】

【表22】

【0323】

このデータは、１）Ｎ−アルキルマレイミドとコンジュゲートしているＭＭＡＥが、遊離チオールの存在下でＮ−フェニルマレイミドとコンジュゲートしているＭＭＡＥよりも安定でないこと、２）Ｎ−アルキルマレイミドＭＭＡＥコンジュゲートが、ＰＥＧ−ビオチンアナログよりも軽度加水分解に感受性でないこと、３）軽度加水分解がＮ−アルキルマレイミド−ＭＭＡＥコンジュゲートの安定性を改善しないこと、４）Ｎ−フェニルマレイミド−ＭＭＡＥコンジュゲートが軽度加水分解に極めて応答性であるが、このステップは高い安定性を達成するために必要ではないこと、５）Ｎ−フェニルマレイミドが、Ｎ−アルキルマレイミドよりも、同一の精製プロセスに供した場合に有意に自然に加水分解することを示す。

【0324】

実施例３６ ＢＭＥ負荷において観察されたＰＥＧ−ビオチンおよびＭＭＡＥチオスクシンイミド加水分解の比較
結果を図２６に示す。

【0325】

【表23】

【0326】

このデータは、緩慢に加水分解するチオスクシンイミドが、マレイミド上流の化学物質により有意に影響を受けることを示す。親水性ＰＥＧ−ビオチン化学物質が、疎水性ＭＭＡＥペイロードと比較して加水分解速度を約３〜５倍増加させた。

【0327】

実施例３７ β−メルカプトエタノールの存在下の脱コンジュゲーションの比較：ＰＥＧ−ビオチン対ＭＭＡＥペイロード
結果を図２７に示す。

【0328】

【表24】

【0329】

実施例３８ マウス血清中のＭＭＡＥ−Ｔ２８９Ｃ ＡＤＣの安定性
ＭＭＡＥ ＡＤＣをマウス血清中でインキュベートして脱コンジュゲーションに対するチオスクシンイミド結合を負荷した。Ｔ２８９Ｃ突然変異を含有するｍＡｂにＭＭＡＥをコンジュゲートさせて上記の所望のＡＤＣを生成した。薬物コンジュゲーション後、ＡＤＣをＣＨＴクロマトグラフィーにより直ちに精製して非コンジュゲート薬物を除去した。次いで、試料を短時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｉｚｅｒカセット、１０ｋＤａのＭＷＣＯ、４℃、２時間）に供して０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２に緩衝液を交換した。透析後、ｍＡｂ濃度をＡ２８０計測値（ＮａｎｏＤｒｏｐ）により決定し、次いで正常マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）に添加して最終濃度の０．２ｍｇ／ｍＬ（１．３３μＭのｍＡｂ）を達成した。血清に添加されたＡＤＣの総容量は、１０％未満であった。ＡＤＣ血清混合物を滅菌濾過し、密封容器中で撹拌せずに３７℃においてインキュベートした。アリコートを種々の時点において取り出し、冷凍した。コンジュゲートおよび非コンジュゲートヒト抗体をマウス血清から、ＦＣ特異的抗ヒトＩｇＧ−アガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用する免疫沈降により回収した。最初に、樹脂をＰＢＳにより２回、ＩｇＧ溶出緩衝液により１回リンスし、次いでＰＢＳによりさらに２回リンスした。次いで、ＡＤＣ−マウス血清試料を抗ヒトＩｇＧ樹脂（１００μＬのＡＤＣ−血清混合物、５０μＬの樹脂スラリー）と合わせ、室温において１５分間穏やかに混合した。樹脂を遠心分離により回収し、次いでＰＢＳにより２回洗浄した。樹脂ペレットを１００μＬのＩｇＧ溶出緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で再懸濁させ、室温において５分間さらにインキュベートした。樹脂を遠心分離により除去し、次いで２０μＬの１Ｍのトリス、ｐＨ８．０を上清に添加した。回収されたヒト抗体溶液を滅菌濾過し、ＤＴＴにより還元し、次いでＬＣ／ＭＳにより分析した。コンジュゲートｍＡｂおよびチオスクシンイミド加水分解の率を質量スペクトルのピーク高さからそれぞれ数式１および数式２を使用して決定した。脱コンジュゲートｍＡｂおよびチオスクシンイミド加水分解データをｌｎ［濃度］対時間（秒）としてプロットして偽一次速度定数をベストフィット直線の傾きから得た。

【0330】

結果を図２８に示す。

【0331】

【表25】

【0332】

このデータは、１）Ｎ−フェニルマレイミドを用いて調製されたＡＤＣがＮ−アルキルマレイミドを用いて調製されたＡＤＣよりも安定であること、２）Ｎ−フェニルチオスクシニド（ｔｈｉｏｓｕｃｃｉｎｉｄｅ）の加水分解がＮ−アルキルチオスクシンイミドの加水分解よりも早く生じること、３）Ｎ−アルキルチオスクシンイミドについてチオール脱コンジュゲーションがチオスクシンイミド加水分解よりもわずかに緩慢に生じることを示し、したがって、完全な脱コンジュゲーションは観察されず、速度は可溶性および不溶性ペイロードについて類似である。可溶性ペイロードの場合、観察された最大脱コンジュゲーションはより低く、これはより高いチオスクシンイミド加水分解速度に起因すると推定される。

【0333】

図２９Ａは、ｐＨ７．２、３７℃＋ＢＭＥにおけるアルキルチオスクシンイミド脱コンジュゲーションおよび加水分解を示す。このデータは、脱コンジュゲーションがチオスクシンイミド加水分解に結びつくことを示す。最大チオスクシンイミド加水分解後の脱コンジュゲーションのプラトーが達成され、それはＢＭＥ負荷実験と一致する。

【0334】

図２９Ｂは、平均＋／−標準偏差（ｎ＝３）としての３７℃における７日間のマウス血清中のＡＤＣ脱コンジュゲーションを示す。この実験は、１つの時点について三つ組で実施された上記と同一の血清安定性アッセイである。データは、Ｎ−アルキルマレイミドＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ ＡＤＣがＮ−フェニルマレイミドＶａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ ＡＤＣよりも安定でないことを示す。この実験についての相対誤差は、典型的には、１０％未満であった。

【0335】

実施例３９ マウス血清中のインキュベーション後のＭＤＡ−ＭＢ−３６１癌細胞に対するＡＤＣの活性
高い５Ｔ４発現を有するＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳癌細胞をこれらの試験に使用した。１０％のＦＢＳを有する８０μＬのＲＰＭＩ１６４０中で細胞を９６ウェル平底プレート中に２，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞／ウェルにおいてプレーティングした。細胞を一晩接着させた。被験物質を培養培地中で希釈することにより、５×濃度のそれぞれのＡＤＣを調製した。５０ｎｇ／ｍＬの最終用量曲線範囲が０．７６ｐｇ／ｍＬに段階的な１：４段階希釈系列で下がるように、２０マイクロリットルのそれぞれの被験物質を細胞に二つ組で添加した。処理細胞を３７℃／５％のＣＯ_２において６日間培養し、細胞生存率をＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙにより評価した。１００μＬの再構成されたＣＴＧ試薬をそれぞれのウェルに添加し、室温において１０分間軽度に振盪させ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎルミノメーターを使用して５６０ｎｍにおけるそれぞれの試料の吸光度を読み取った。細胞生存率を以下の式：（処理試料の平均ルミネセンス／未処理対照試料の平均ルミネセンス）×１００により計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりロジスティック非線形回帰分析を使用してＩＣ_５０値を決定した。

【0336】

結果を、平均±相対誤差、ｎ＝２として示される図３０に示す。このデータは、ＡＤＣ効力が安定な（Ｎ−フェニル）ＡＤＣについて保存され、不安定な（Ｎ−アルキルマレイミド）ＡＤＣにおいて損失することを示す。

【0337】

実施例４０ チオスクシンイミド安定化およびペイロードコンジュゲーションのためのヘテロ二官能性リンカー

【化39】

【0338】

アルキル−またはＮ−アリールベースマレイミドおよびＰＥＧ−ＢＣＮ官能性の両方を含む一連のヘテロ二官能性リンカーを調製した。ＢＣＮ基は、「銅フリークリックコンジュゲーション」として公知の反応においてアジドに対して反応性である。

【0339】

実施例４１ Ｎ−フルオロフェニルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮの合成

【化40】

還流下の氷冷ＡｃＯＨ中の無水マレイン酸（１０ａ、０．３１３ｇ、３．１９ｍｍｏｌ）および５−アミノ−２−フルオロ安息香酸（１１ｂ、０．５ｇ、３．２２ｍｍｏｌ）の反応により、粗製９ｃ（０．７２ｇ）を黄色固体として後処理後に提供した。粗製生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによりさらに精製して０．２１ｇ（０．８９ｍｍｏｌ、２８％の収率）の９ｃを淡黄色固体として得た。

【化41】

ＮＨＳ活性化マレイミド（６）を（１３）から現場調製し、精製せずに使用した。したがって、（１３）（０．１３７ｇ、０．５８２ｍｍｏｌ）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．０７４ｇ、０．６４ｍｍｏｌ）とＤＭＥ（５ｍＬ）中のＤＣＣ（０．１４４ｇ、０．６９８ｍｍｏｌ）の存在下で室温において１時間反応させた。濾過による沈殿固体（ＤＣＵ）の除去後、活性化エステル（６）を含有する濾液を、エンド−２（０．２ｇ、０．４８５ｍｍｏｌ）のＤＭＥ（２ｍＬ）中溶液中に室温において滴加しながらＮ_２下で撹拌した。１時間後、ＴＬＣおよびＭＳ分析は、反応の完了を示した。過剰のＤＭＥを真空下で濃縮し、得られた粗製残留物をＮ_２下でシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチルにより溶出させ、次いでＤＣＭ中４％のＭｅＯＨにより溶出させて（１４）（０．２４ｇ、０．３８ｍｍｏｌ、７８．６％の収率）を淡黄色油状物として提供した。^１Ｈ ＮＭＲおよびＭＳデータは、化学構造を裏付けた：ＨＰＬＣは、９４％の純度を示した。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ６２９．３（Ｍ＋１）、６４７．８（Ｍ＋Ｈ_２Ｏ）、６５２．８（Ｍ＋Ｎａ、ベースピーク）。

【0340】

実施例４２ Ｎ−フェニルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ合成

【化42】

ＤＭＥ（５ｍＬ）中の（４）（０．１９１ｇ、０．５８２ｍｍｏｌ）およびエンド−２（０．２ｇ、０．４８５ｍｍｏｌ）間の反応を室温においてＮ_２下で１時間で完了させ、それはＴＬＣおよびＭＳの両方により示された。過剰ＤＭＥを真空下で除去し、粗製残留物をＮ_２圧下でシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、酢酸エチルにより溶出させ、次いでＤＣＭ中４％のＭｅＯＨにより溶出させた。生成物を含有する分解をプールし、真空下で濃縮した。残留物をＤＣＭ中に溶解させ、Ｎ_２下でバイアルに移した。過剰の溶媒をＮ_２バブリングにより除去して（１５）（０．２６ｇ、８５％の収率）を淡黄色油状物として提供した。^１Ｈ ＮＭＲおよびＭＳデータは、化学構造を裏付け、残留溶媒の汚染物質が伴った。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ ６２６．５（Ｍ＋１）、６４３．５（Ｍ＋Ｈ_２Ｏ）、６４８．８（Ｍ＋Ｎａ、ベースピーク）。

【0341】

実施例４３ ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮをｍＡｂにコンジュゲートさせるための一般手順

【化43】

ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮを、いくつかのステップでｍＡｂ（ＦｃのＴ２８９Ｃ突然変異を含む）にコンジュゲートさせた。最初に、５ｍＬの１．６ｍｇ／ｍＬの１０ｍＭのＰＢＳ、ｐＨ７．２中ｍＡｂ溶液（８ｍｇのｍＡｂ、５３．３ｎＭ、１当量）を４３μＬの水中５０ｍＭのＴＣＥＰ溶液（２．１５μｍｏｌ、４０当量）と合わせ、次いで３７℃において１時間穏やかに混合することにより、ｍＡｂを軽度に還元して遊離スルフヒドリルを生成した。還元ｍＡｂをｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｉｚｅｒ透析カセット（１０ＫのＭＷＣＯ）に移し、ＰＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．８に対して数回の緩衝液交換で４℃において２４時間透析した。ジヒドロアスコルビン酸（２１μＬのＤＭＳＯ中５０ｍＭの原液、１．１μｍｏｌ、２０当量）を添加し、次いで室温において４時間穏やかに混合することにより、還元ｍＡｂを酸化して内部ジスルフィドを再形成した。酸化ｍＡｂ溶液をＰＢＳの添加により１．３ｍｇ／ｍＬのｍＡｂに調整した。次に、１．１５ｍＬのｍＡｂ溶液（１．５ｍｇ、１０ｎｍｏｌ、１当量）をバイアル中にアリコート化し、次いでｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ原液（ＤＭＡｃ中１０ｍＭの原液、２０ｎｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を短時間ボルテックスに供し、２２℃において１時間インキュベートし、次いでＮ−アセトリ（ａｃｅｔｌｙ）システイン（１０μＬの水中１００ｍＭの溶液、１μｍｏｌ、１００当量）を添加し、さらに１５分間インキュベートして未反応マレイミドをクエンチした。全てのコンジュゲーション反応は、周囲雰囲気下で室温（２２℃）において実施した。ｍＡｂに対する２当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ＝ｍＡｂ中に含有される遊離システインに対する１当量のｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮであることに留意されたい。この一般手順を、必要に応じて改良して所望の反応化学量論（すなわち、異なるマレイミド：ｍＡｂフィード）を達成した。コンジュゲートを還元グリコシル化質量分析により分析し、数式１を使用してコンジュゲーション効率を決定した。

【0342】

実施例４４ Ｎ−フェニルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートの質量分析
４当量の架橋剤において調製されたＮ−フェニル−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートについての代表的な質量分析データを、図３１および表２５に示す。

【0343】

【表26】

【0344】

Ｎ−フェニル−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮは、Ｔ２８９Ｃ突然変異を含むｍＡｂに効率的および特異的にコンジュゲートした。最大１０モル当量の架橋剤について重鎖に対しても軽鎖に対しても追加のコンジュゲーションは観察されなかった。

【0345】

実施例４５ Ｎ−フルオロフェニルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートの質量分析
４当量の架橋剤において調製されたＮ−フルオロフェニル−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートについての代表的な質量分析データを、図３２および表２６に示す。

【0346】

【表27】

【0347】

Ｎ−フルオロフェニル−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮは、Ｔ２８９Ｃ突然変異を含むｍＡｂに効率的および特異的にコンジュゲートした。最大１０モル当量の架橋剤について重鎖に対しても軽鎖に対しても追加のコンジュゲーションは観察されなかった。

【0348】

実施例４６ Ｎ−アルキルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートの質量分析
４当量の架橋剤において調製されたＮ−アルキル−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートについての質量分析データのまとめを、図３３および以下に示す。

【0349】

【表28】

【0350】

Ｎ−アルキル−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮは、Ｔ２８９Ｃ突然変異を含むｍＡｂに効率的および特異的にコンジュゲートした。最大１０モル当量の架橋剤について重鎖に対しても軽鎖に対しても追加のコンジュゲーションは観察されなかった。

【0351】

実施例４７ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂへのｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮのコンジュゲーション効率
結果を図３５に示す。全ての架橋剤は、Ｔ２８９Ｃ突然変異を含むｍＡｂに効率的にコンジュゲートした。完全なコンジュゲーションは、２当量超のマレイミドで観察される。

【0352】

実施例４８ ＰＥＧ−ＢＣＮコンジュゲートについてのチオスクシンイミド加水分解キネティクス
ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲートを緩衝溶液中でインキュベートし、ＬＣ／ＭＳにより経時的にモニタリングしてチオスクシンイミド加水分解を観察した。０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２によりコンジュゲートＴ２８９Ｃ ｍＡｂを０．２２ｍｇ／ｍＬに希釈し、次いでジチオトレイトールを添加（水中０．５Ｍの原液）して４２ｍＭの最終濃度を達成した。試料をＬＣ／ＭＳオートサンプラー中に２２℃において配置し、定期的にインジェクトした。チオスクシンイミド加水分解を、質量スペクトル中のｍＡｂコンジュゲートピークへの１８ａｍｕの付加により確認した。デコンボリュート質量スペクトル中のピーク強度および数式３を使用して加水分解の半定量的分析を実施し、それはＴ＝０計測値を使用するバックグラウンドサブトラクションを含む。次いで、データをチオスクシンイミド（Ｍ）の経時的損失に変換し、ｌｎ［チオスクシンイミド］対秒としてプロットした。ベストフィット直線の傾きは、チオスクシンイミド加水分解についての偽一次速度定数を生じさせた。これらの結果を図３６および表２８に示す。

【0353】

【表29】

【0354】

Ｘ−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮコンジュゲートは、ＰＥＧ−ビオチンコンジュゲートについて観察されたものと同様の傾向で加水分解し；すなわち、Ｆ−フェニルチオスクシンイミド＞フェニルチオスクシンイミド＞＞アルキルチオスクシンイミドである。

【0355】

実施例４９ Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂへのペイロードの逐次付加

【化44】

Ｎ−フェニル−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−ｍＡｂコンジュゲート（１００μＬの０．５ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ中１．３、ｍｇ／ｍＬの溶液、０．８７ｎｍｏｌ）を、ＡＣ_４ＧｌｃＮＡｚ（１μＬのＤＭＳＯ中５００ｍＭの原液、５００ｎｍｏｌ）と合わせた。反応溶液を撹拌せずに室温において２２℃において１時間インキュベートした。長期反応性試験のため、０．５ｍＭのＥＤＴＡを有するＰＢＳ、ｐＨ７．２中で４℃においてｍＡｂ−ＢＣＮコンジュゲートを貯蔵し、アリコートを取り出し、上記のとおりＡＣ_４ＧｌｃＮＡｚと反応させた。コンジュゲートを還元グリコシル化質量分析により分析し、数式１を使用してコンジュゲーション効率を決定した。

【0356】

ｍＡｂ−ＢＣＮ−Ａｃ４ＧｌｃＮＡｚコンジュゲートの分析を、図３７に示す。ＢＣＮ基は、ＡＣ_４ＧｌｃＮＡｚと完全に反応した。

【0357】

実施例５０ 貯蔵後のｍＡｂ−ＢＣＮコンジュゲートの反応性
結果を図３８および表２９に示す。

【0358】

【表30】

【0359】

ＢＣＮの定量的反応は、全ての試料について観察された。未反応ｍＡｂ−ＢＣＮは、質量分析により検出することができなかった。ＢＣＮ基は、コンジュゲーションおよび４℃における貯蔵の２１日後を超えて反応性の損失を示さない。

【0360】

実施例５１ ＢＣＮ修飾ｍＡｂへのアジド−ＰＢＤのコンジュゲーション

【化45】

Ｎ−フェニル−マレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮ−Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂコンジュゲートを上記のとおり調製し（１．５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ）、アジド−ＰＢＤとの反応まで４℃において貯蔵した。ＰＢＤコンジュゲーションのため、ｍＡｂ溶液を最初にＤＭＳＯと合わせて３０％ｖ／ｖのＤＭＳＯおよび１．０５ｍｇ／ｍＬのｍＡｂ−ＢＣＮの最終濃度を達成した。次に、ｍＡｂ−ＢＣＮ／ＤＭＳＯ溶液（１．８９ｍＬ、１３ｎｍｏｌのｍＡｂ、１当量）をバイアルに移し、アジド−ＰＢＤを添加した（１６μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭの原液、１６０ｎｍｏｌ、１２当量）。反応混合物を３７℃において１時間インキュベートし、次いで２２℃において１８時間インキュベートした。反応混合物を最初に透析（１０ＫのＭＷＣＯのｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセット、０．５ｍＭのＥＤＴＡを有する１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２、４℃、１８時間）により精製し、次いで上記のとおりＣＨＴクロマトグラフィーにより精製した。反応生成物を還元グリコシル化質量分析により分析した。それぞれ数式１および数式２を使用してコンジュゲーション効率およびＤＡＲを計算した。

【0361】

実施例５２ ｍＡｂ−ＰＢＤコンジュゲートの分析
５Ｔ４標的化Ｔ２８９Ｃ ｍＡｂ−Ｎ−フェニルマレイミド−ＰＥＧ−ＢＣＮコンジュゲートについての代表的な質量分析データを、図３８に示す。

【0362】

【表31】

【0363】

実施例５３ ＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳癌細胞に対するｍＡｂ−ＢＣＮ−ＰＢＤ ＡＤＣのインビトロ活性
高い５Ｔ４発現を有するＭＤＡ−ＭＢ−３６１乳癌細胞をこれらの試験に使用した。１０％のＦＢＳを有する８０μＬのＲＰＭＩ１６４０中で細胞を９６ウェル平底プレート中に２，０００個のＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞／ウェルにおいてプレーティングした。細胞を一晩接着させた。被験物質を培養培地中で希釈することにより、５×濃度のそれぞれのＡＤＣを調製した。５０ｎｇ／ｍＬの最終用量曲線範囲が０．７６ｐｇ／ｍＬに段階的な１：４段階希釈系列で下がるように、２０マイクロリットルのそれぞれの被験物質を細胞に三つ組で添加した。処理細胞を３７℃／５％のＣＯ_２において６日間培養し、細胞生存率をＰｒｏｍｅｇａからのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙにより評価した。１００μＬの再構成されたＣＴＧ試薬をそれぞれのウェルに添加し、室温において１０分間軽度に振盪させ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＥｎＶｉｓｉｏｎルミノメーターを使用して５６０ｎｍにおけるそれぞれの試料の吸光度を読み取った。細胞生存率を以下の式：（処理試料の平均ルミネセンス／未処理対照試料の平均ルミネセンス）×１００により計算した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアによりロジスティック非線形回帰分析を使用してＩＣ_５０値を決定した。

【0364】

結果を図４０および表２５に示す。

【0365】

【表32】

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】