特許 6863892 脳卒中を治療又は予防する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6863892

(24)【登録日】2021年4月5日

(45)【発行日】2021年4月21日

(54)【発明の名称】脳卒中を治療又は予防する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20210412BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20210412BHJP

   A61K 38/43 20060101ALN20210412BHJP

   A61K 38/49 20060101ALN20210412BHJP

   C07K 16/22 20060101ALN20210412BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 NZNA

   A61P9/10

   !A61K38/43

   !A61K38/49

   !C07K16/22

【請求項の数】19

【全頁数】48

(21)【出願番号】特願2017-526138(P2017-526138)

(86)(22)【出願日】2015年11月17日

(65)【公表番号】特表2017-535551(P2017-535551A)

(43)【公表日】2017年11月30日

(86)【国際出願番号】AU2015050720

(87)【国際公開番号】WO2016077878

(87)【国際公開日】20160526

【審査請求日】2018年10月24日

(31)【優先権主張番号】2014904606

(32)【優先日】2014年11月17日

(33)【優先権主張国】AU

(73)【特許権者】

【識別番号】516179960

【氏名又は名称】シーエスエル リミティド

(73)【特許権者】

【識別番号】516179971

【氏名又は名称】ベー−クリエイティブ スウェーデン アクティエボラーグ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100077517

【弁理士】

【氏名又は名称】石田 敬

(74)【代理人】

【識別番号】100087871

【弁理士】

【氏名又は名称】福本 積

(74)【代理人】

【識別番号】100087413

【弁理士】

【氏名又は名称】古賀 哲次

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100197169

【弁理士】

【氏名又は名称】柴田 潤二

(72)【発明者】

【氏名】ウルフ エリクソン

(72)【発明者】

【氏名】イングリッド ニルソン

(72)【発明者】

【氏名】ダニエル ローレンス

(72)【発明者】

【氏名】エンミーン ジョー スゥ

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００９／１２６６９８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Vascular Cell，２０１３年，Vol.5, No.8，pp.1-5，<doi:10.1186/2045-824X-5-8>

【文献】 Mayo clinic proceedings，１９９６年，Vol.71，pp.801-812

【文献】 The journal of clinical investigation，１９９９年１２月，Vol.104, No.11，pp.1613-1620

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４５／００

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ ９／１０

Ｃ０７Ｋ １６／２２

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

糖尿病及び／又は肥満に罹患している対象における脳卒中の効果を低減させるための医薬組成物であって、前記医薬組成物は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を含み、ここで前記ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は
ＶＥＧＦ−Ｂに結合するか、又はＶＥＧＦ−Ｂに特異的に結合し、かつ、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を中和する、抗体可変領域を含むタンパク質である、
医薬組成物。

【請求項2】

前記脳卒中の前又は後に投与される、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

前記脳卒中の前に投与され、かつ、脳卒中を有するリスクがある対象に投与される、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記糖尿病が、２型糖尿病である、請求項３に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記対象が、以下の特徴：
・ 脳卒中及び／又は一時的な虚血発作に既に罹患している；
・ 脳卒中の家族歴がある；
・ 心臓病を罹患している；
・ 高血圧を有する；
・ 高血漿低密度リポタンパク質レベルを有する；
・ メタボリックシンドロームを有する；
・ 心臓の異常を有する；
・ 心臓手術又は股関節置換手術（ｈｉｐ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｓｕｒｇｅｒｙ）を受けている、
の１つ以上を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記脳卒中後に投与され、かつ、前記医薬組成物が、血栓溶解性化合物と組み合わせて使用される、請求項２に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記血栓溶解性化合物の前に投与される、請求項６に記載の医薬組成物。

【請求項8】

前記血栓溶解性化合物が前記対象に安全に投与され得る時間を延長する、請求項７に記載の医薬組成物。

【請求項9】

前記血栓溶解性化合物が、脳卒中の症状の発症の２時間以上後に投与される、請求項６〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項10】

前記血栓溶解性化合物が、脳卒中の症状の発症の２〜６時間後に投与される、請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

前記対象が、４００ｍｇ／ｄＬを超える血糖レベルを有する、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

前記血栓溶解性化合物が、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、デスモテプラーゼ及びウロキナーゼからなる群より選択される、請求項６〜１１のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

以下の効果：
・ 前記対象の梗塞サイズを縮小する；
・ 前記対象の脳内出血スコアによって評価される出血スコアを低下させる；
・ 前記対象の出血の発生を減少させる；
・ 対象の致死的出血の可能性を減少させる；
・ 脳卒中後の前記対象の脳浮腫を減少させる；及び／又は
・ 脳卒中後の前記対象の血液脳関門の損傷又は漏出を減少させる、
の１つ以上を有するのに十分な前記ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物の量を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記脳卒中が、虚血性脳卒中である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物が、Ｆｖを含むタンパク質である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記タンパク質が、以下：
（ｉ）単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）ダイアボディ；
（ｉｖ）トリアボディ；
（ｖ）テトラボディ；
（ｖｉ）Ｆａｂ；
（ｖｉｉ）Ｆ（ａｂ’）₂；
（ｖｉｉｉ）Ｆｖ；
（ｉｘ）抗体、Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（Ｃ_H）２及び／又はＣ_H３の定常領域に連結された（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）の１つ；及び
（ｘ）抗体
からなる群から選択される、請求項１５に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物が、配列番号２に記載の配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_H）及び配列番号３に記載の配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む抗体のＶＥＧＦ−Ｂへの結合を競合的に阻害する抗体可変領域を含むタンパク質である、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項18】

前記ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物が、ＶＥＧＦ−Ｂに対する前記抗体の可変領域のヒト化形態を含むタンパク質であるか、又は前記ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物が、ＶＥＧＦ−Ｂに対する前記抗体のヒト化形態である、請求項１６に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物が、配列番号５に記載の配列を含むＶ_H及び配列番号６に記載の配列を含むＶ_Lを含む抗体である、請求項１８に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願データ
本出願は、２０１４年１１月１７日に出願された「脳卒中を治療又は予防する方法」という名称のオーストラリア特許出願第２０１４９０４６０６号の優先権を主張している。その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

配列表

【0002】

本出願は、電子形式で配列表が提出される。配列表の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

技術分野

【0003】

本開示は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）−Ｂに拮抗することによって対象における脳卒中の効果を治療又は予防する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

脳卒中は、心臓病後の死亡原因の第２位の原因であり、オーストラリアにおける主要な障害原因である。これは、米国で３番目に大きな死亡原因であり、毎年１４万人以上が脳卒中で死亡する。それはまた、米国における深刻な、長期的な障害の主要な原因でもある。米国における２００５年から２０５０年の脳卒中に対する見積コストは２．２兆ドルである。

【0005】

障害は、脳卒中生存者の７５％に雇用可能性を低下させるほど十分に影響を及ぼす。脳卒中は、対象に物理的、精神的、感情的、又はその３つの組み合わせで影響を与え得る。

【0006】

脳卒中に起因し得る身体障害の一部には、筋力低下、しびれ、褥瘡、肺炎、失禁、失行症（学習運動不能（ｉｎａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｅｒｆｏｒｍ ｌｅａｒｎｅｄ ｍｏｖｅｍｅｎｔｓ））、日常活動の困難性、食欲喪失、失語症（ｓｐｅｅｃｈ ｌｏｓｓ）、視力喪失（ｖｉｓｉｏｎ ｌｏｓｓ）、及び疼痛を含む。脳卒中が十分に重度である場合、又は脳幹の一部などの特定の部位である場合、昏睡又は死亡が起こり得る。

【0007】

脳卒中に起因する感情的な問題は、脳内の感情中心への直接的な損傷、又は新たな限界に適応することのフラストレーション及び困難性から生じる可能性がある。脳卒中後の感情的な困難性には、うつ（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、不安（ａｎｘｉｅｔｙ）、パニック発作、平坦な情動（ｆｌａｔ ａｆｆｅｃｔ）（感情を表現できない）、躁病（ｍａｎｉａ）、無感情（ａｐａｔｈｙ）、及び精神障害（ｐｓｙｃｈｏｓｉｓ）が含まれる。

【0008】

脳卒中に起因する認知障害（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ ｄｅｆｉｃｉｔ）には、知覚障害、発声障害、認知症（ｄｅｍｅｎｔｉａ）、注意及び記憶に関する問題（ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｍｏｒｙ）が含まれる。脳卒中患者は、自分自身の身体障害、すなわち病態失認（ａｎｏｓｏｇｎｏｓｉａ）と呼ばれる状態に気がついていないのかもしれない。半側空間無視（ｈｅｍｉｓｐａｔｉａｌ ｎｅｇｌｅｃｔ）と呼ばれる状態において、患者は、損傷した半球の反対側の空間サイドに何も注意を払うことができない。

【0009】

全ての脳卒中患者の１０％までが発作（ｓｅｉｚｕｒｅｓ）を発症し、最も一般的には事象に続く週に発症する。脳卒中の重篤度は、てんかん発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）の可能性を高める。

【0010】

脳卒中とは、脳への血液供給障害により脳機能（単数又は複数）が急速に失われることである。これは、閉塞（血栓症、動脈塞栓症）又は出血（血液の漏出）によって引き起こされる虚血（血流の欠如）に起因し得る。結果として、脳の患部が機能しなくなり、身体の片側の１つ以上の手足を動かすことができない、言語を理解できない若しくは組み立てることができない、又は視野の片側を見ることができない、などの結果を引き起こし得る。脳卒中はしばしばニューロンの細胞死をもたらし、死につながる可能性がある。

【0011】

脳卒中には２つの一般的なタイプがある：（ｉ）虚血性脳卒中（脳への一時的又は永続的な閉塞によって引き起こされ、脳卒中症例の８５％を占める）、及び（ｉｉ）出血性脳卒中（破裂した血管によって引き起こされ、残りの症例の大部分を占める）。虚血性脳卒中の最も一般的な原因は、中大脳動脈（内頸動脈から下流の頭蓋内動脈（ｉｎｔｒａ−ｃｒａｎｉａｌ ａｒｔｅｒｙ））の閉塞であり、大脳（例えば、大脳皮質）、例えば、脳のモーター及び感覚皮質（ｓｅｎｓｏｒｙ ｃｏｒｔｉｃｅｓ）に損傷を与える。このような損傷は、半身麻痺、片側感覚消失（ｈｅｍｉ−ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ）、及び損傷した大脳半球に応じて、言語又は視覚−空間的欠損をもたらす。

【0012】

Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体アンタゴニスト（ルベルゾール（ｌｕｂｅｌｕｚｏｌｅ）を含む）、ナルメフェン、クロメチアゾール、カルシウムチャンネルブロッカー（ａ−アミノ−３−ヒドロキシ−５−ルネチルイソキサゾール−４−プロピオン酸アンタゴニスト（ａ−ａｍｉｎｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｒｎｅｔｈｙｌｉｓｏｘａｚｏｌｅ−４−ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）、セロトニンアゴニスト（例えば、レピノタン（ｒｅｐｉｎｏｔａｎ））、及び膜貫通カリウムチャネルモジュレータを含む）、チリラザド、抗ＩＣＡＭ−Ｉ抗体、ヒト抗白血球抗体（Ｈｕ２３Ｆ２Ｇ）、抗血小板抗体（例えば、アブシキシマブ）、シチコリン（シチジン−５’−ジホスホコリンの外因性形態（ｅｘｏｇｅｎｅｏｕｓ ｆｏｒｍ））、及び塩基性線維芽細胞増殖因子を含む、いくつかの神経保護剤は、脳卒中の治療における有効性が試験されており、失敗している。

【0013】

当技術分野において、脳卒中のための治療薬が必要であることは上記から明らかであろう。

【0014】

成長因子ＶＥＧＦ−Ｂは、脳卒中後を含む、神経細胞生存における効果についても研究されている。Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂ．，２４：１１４６−１１５２，２００４は、ＶＥＧＦ−Ｂを欠損したマウスで脳卒中を研究し、この成長因子の欠如が、有意に、より大きい梗塞体積及び神経学的障害をもたらすことを見出した。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１８：９１３−９２３，２００８は、脳卒中が誘導されたマウスの脳へのＶＥＧＦ−Ｂの注入が、ニューロンをアポトーシスから救済したことを示し、脳卒中後の治療的利益を提供する上での、この成長因子の役割を示唆している。これらの研究の延長である、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，３：３２２−３２７，２００９は、ＶＥＧＦ−Ｂがニューロンをアポトーシスから保護し、この成長因子が神経変性疾患の治療において治療上の価値がある可能性があることを示唆した。

概要

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0015】

本発明の製造において、本発明者らは、脳卒中、例えば虚血性脳卒中が承認されたマウスモデルにおけるＶＥＧＦ−Ｂのシグナル伝達を阻害する効果を研究した。本発明者らは、脳卒中の誘発の前又は後に、ＶＥＧＦ−Ｂのアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト抗体）を投与することにより、この成長因子の効果を研究した。上述の研究に示唆されたことに反して、本発明者らは、脳卒中、例えば、梗塞サイズ、脳内出血スコア又は血液脳関門破壊の影響を軽減することができた。これは、脳卒中の発生を防止することとは異なる。本発明者らはまた、例えば、梗塞サイズ、出血（例えば、脳内出血）及び致死的出血の数を減少させることによって、脳卒中の血栓溶解療法の転帰を改善することもできた。本発明者らはまた、脳卒中後にＶＥＧＦ−Ｂのアンタゴニスト（例えば、アンタゴニスト抗体）を投与することにより、血栓溶解剤が対象に安全に投与され得る時間が延長されることも示した。

【課題を解決するための手段】

【0016】

本発明者らの知見は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害することによって対象における脳卒中の影響を低減する方法の基礎を提供する。この知見はまた、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害することによって対象における脳卒中の効果の予防又は治療方法の基礎を提供する。

【0017】

例えば、本開示は、対象における脳卒中の効果を低減させる方法を提供するものであって、該方法は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む。

【0018】

本発明者らは、脳卒中を患った対象における出血の発生率を低下させることができることも見出した。従って、本開示は、脳卒中に罹患した対象における出血の発生率を低下させる方法をさらに提供するものであって、該方法は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を投与することを含む。一例では、該方法はさらに、血栓溶解性化合物を投与することを含む。

【0019】

この知見はまた、出血、例えば脳出血を予防するために、脳卒中を患っている対象の治療を継続する、又は開始する方法の基礎を提供するものであり、該方法は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を投与することを含む。例えば、対象は、出血、例えば、脳内出血のリスクを低減するか、又は予防するために、本明細書に開示された方法を実施した後に、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物で再治療され得る。

【0020】

本発明者らは、脳卒中に罹患した対象における致死的出血の可能性を減少させることができることも見出した。従って、本開示は、脳卒中に罹患した対象における致死的出血の可能性を低減する方法をさらに提供するものであって、該方法は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を投与することを含む。一例では、該方法はさらに、血栓溶解性化合物を投与することを含む。

【0021】

本発明者らはまた、それらが血液脳関門の損傷又は漏出を減少させることができることを見出した。従って、本発明者らはまた、血液脳関門破壊又は漏出を予防するための方法を提供し、該方法は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を投与することを含む。一例では、血液脳関門の損傷又は漏出は浮腫と関連する。一例では、血液脳関門の損傷又は漏出は、傷害（ｉｎｓｕｌｔ）、例えば外傷及び／又は虚血によって引き起こされる。

【0022】

本明細書中に記載される任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、脳卒中の前又は後に投与される。例えば、化合物は、予防的又は治療的に投与される。一例では、化合物は、脳卒中の前に投与される。一例では、化合物は脳卒中後に投与される。

【0023】

本明細書に記載される任意の方法の一例では、化合物は脳卒中の前に投与され、かつ、脳卒中を有するリスクのある対象に投与される。

【0024】

脳卒中のリスクがある例示的な対象は、糖尿病及び／又は肥満に罹患している。例えば、糖尿病は２型糖尿病である。

【0025】

脳卒中に罹患するリスクがある対象の追加的又は代替的な特徴には、以下の特徴の１つ以上が含まれる：
・脳卒中及び／又は一時的な虚血発作を既に罹患している；
・脳卒中の家族歴がある；
・心臓病に罹患する；
・高血圧を有する；
・高血漿低密度リポタンパク質レベルを有する；
・メタボリックシンドロームを有する；
・心臓の異常を有する；及び／又は
・手術を受けたことがある。

【0026】

一例では、対象は、さらに５５歳以上、例えば６５歳以上、又は７５歳以上である。

【0027】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、脳卒中後に投与され、該方法は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物と血栓溶解性化合物との組み合わせを投与することを含む。従って、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は治療的に投与される。

【0028】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、脳卒中症状の発症の約１〜１０時間後に投与される。例えば、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、脳卒中症状の発症の約１〜５時間後に投与される。ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、脳卒中症状の発症後約１〜４時間の間に投与される。ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、脳卒中症状の発症の約１時間後に投与される。

【0029】

脳卒中の症状は、当業者には明らかであり、例えば、顔面脱力（ｆａｃｉａｌ ｗｅａｋｎｅｓｓ）、腕の脱力（ａｒｍ ｗｅａｋｎｅｓｓ）及び／又は発声の困難性（ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙ ｗｉｔｈ ｓｐｅｅｃｈ）のうちの１つ以上を含む。

【0030】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、血栓溶解性化合物の前に投与される。例えば、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、血栓溶解性化合物の約１時間前〜約１０時間前に投与される。例えば、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、血栓溶解性化合物の約１時間〜約６時間前に投与される。例えば、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、血栓溶解性化合物の約２時間前〜約６時間前に投与される。例えば、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、血栓溶解性化合物の約３時間前〜約５時間前に投与される。例えば、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、血栓溶解性化合物の約４時間前に投与される。

【0031】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、脳卒中症状の発症後約１時間及び血栓溶解性化合物の約４時間前に投与される。

【0032】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物の投与は、血栓溶解性化合物が対象に安全に投与され得る時間を延長する。従って、本開示はまた、血栓溶解性化合物が対象に安全に投与され得る時間を延長する方法を提供するものであって、当該方法は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を投与し、次いで、血栓溶解性化合物を投与することを含む。

【0033】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症の２時間以上後に投与される。例えば、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症後３時間以上後に投与される。例えば、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症後４時間以上後に投与される。例えば、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症後５時間以上後に投与される。

【0034】

本明細書に記載のいずれかの方法の一例では、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の約開始〜脳卒中の症状の発症後約１０時間の間に投与される。例えば、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症後約４時間〜約１０時間の間に投与される。例えば、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症後約４時間〜約８時間の間に投与される。例えば、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症後約３時間〜約６時間の間に投与される。例えば、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症後約４時間〜約６時間の間に投与される。例えば、血栓溶解性化合物は、脳卒中の症状の発症の約５時間後に投与される。

【0035】

本明細書中に記載される任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、脳卒中症状の発症の約１時間後に投与され、血栓溶解性化合物は、脳卒中症状の発症の約５時間後に投与される。

【0036】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、血栓溶解性化合物は、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ラノテプラーゼ、レテプラーゼ、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、デスモテプラーゼ及びウロキナーゼからなる群より選択される。

【0037】

本明細書に記載のいずれかの方法の一例では、対象は、空腹時血糖レベルが上昇している。例えば、対象は、１５０ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血糖レベルを有する。例えば、対象は、１８０ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血糖レベルを有する。例えば、対象は、２００ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血糖レベルを有する。例えば、対象は、３００ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血糖レベルを有する。例えば、対象は、４００ｍｇ／ｄＬを超える空腹時血糖レベルを有する。

【0038】

一例では、脳卒中の症状は、以下：
・梗塞サイズ；
・対象における出血の発生率の減少；
・対象の致命的な出血の可能性の減少；及び／又は
・対象の脳内出血スコアによって評価される出血スコア；及び／又は
・脳卒中後の対象における血液脳関門の損傷又は漏出、
から選択される。

【0039】

本明細書に記載のいずれかの方法の一例では、脳卒中後の対象における血液脳関門の損傷又は漏出は、脳浮腫をもたらし得る。

【0040】

上記のそれぞれを評価するための方法は、当技術分野で公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。

【0041】

脳卒中のさらなる効果は、当技術分野で知られており、及び／又は本明細書に記載されており、例えば、麻痺、部分麻痺、不明瞭発語（ｓｌｕｒｒｅｄ ｓｐｅｅｃｈ）、非協調運動（ｕｎｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）、筋力低下、低緊張性（ｈｙｐｏｔｏｎｉｃｉｔｙ）、過緊張性（ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃｉｔｙ）又は非自発的異常運動（ｉｎｖｏｌｕｎｔａｒｙ ａｂｎｏｒｍａｌ ｍｏｖｅｍｅｎｔ）などの運動障害を含む。

【0042】

本明細書に記載される任意の方法の一例において、化合物（単数又は複数）は、以下の効果の１つ以上を有するのに十分な量で投与される：
・対象における梗塞サイズの縮小；
・対象の脳内出血スコアによって評価される出血スコアの低下；
・対象の血液脳関門の損傷又は漏出の減少；及び／又は
・脳卒中後の対象の脳浮腫の減少。

【0043】

本明細書に記載の任意の方法の一例では、脳卒中は虚血性脳卒中である。例えば、脳卒中は脳虚血性脳卒中である。

【0044】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、ＶＥＧＦ−Ｂに結合する。

【0045】

例えば、化合物は、ＶＥＧＦ−Ｂに結合するか、又はＶＥＧＦ−Ｂに特異的に結合し、かつ、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を中和する、抗体可変領域を含むタンパク質である。

【0046】

本明細書に記載の任意の方法の一例では、化合物は、抗体模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）である。例えば、化合物は、免疫グロブリンの抗原結合ドメイン、例えば、ＩｇＮＡＲ、ラクダ抗体又はＴ細胞受容体を含む、タンパク質である。

【0047】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、化合物は、ドメイン抗体（例えば、ＶＥＧＦ−Ｂに結合する重鎖可変領域のみ又は軽鎖可変領域のみを含む）又は重鎖のみの抗体（例えば、ラクダ抗体又はＩｇＮＡＲ）又はその可変領域である。

【0048】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、化合物は、Ｆｖを含むタンパク質である。例えば、タンパク質は、以下からなる群より選択される：
（ｉ）単鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；又は
（ｉｖ）ダイアボディ；
（ｖ）トリアボディ；
（ｖｉ）テトラボディ；
（ｖｉｉ）Ｆａｂ；
（ｖｉｉｉ）Ｆ（ａｂ’）₂；
（ｉｘ）Ｆｖ；又は
（ｘ）抗体の定常領域、Ｆｃ又は重鎖定常ドメイン（Ｃ_H）２及び／若しくはＣ_H３、に連結された（ｉ）〜（ｉｘ）の１つ。

【0049】

本明細書に記載の任意の方法の別の例において、化合物は抗体である。例示的な抗体は、完全長及び／又はネイキッド抗体（ｎａｋｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）である。

【0050】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、化合物は、組換え、キメラ、ＣＤＲ移植、ヒト化、合成ヒト化（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、霊長類化、脱免疫化又はヒトのタンパク質である。

【0051】

本明細書に記載のいずれかの方法の一例において、化合物は、ＶＥＧＦ−Ｂへの抗体２Ｈ１０の結合を競合的に阻害する抗体可変領域を含むタンパク質である。一例において、タンパク質は、配列番号３に記載の配列を含む重鎖可変領域（Ｖ_H）及び配列番号４に記載の配列を含む軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含む。

【0052】

一例において、化合物は、抗体２Ｈ１０のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、タンパク質は、抗体２Ｈ１０のＶ_H及び／又はＶ_Lの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む。例えば、タンパク質は以下を含む：
（ｉ）以下を含むＶ_H：
（ａ）配列番号３のアミノ酸２５〜３４に示される配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸４９〜６５に示される配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号３のアミノ酸９８〜１０８に示される配列を含むＣＤＲ３；
及び／又は、
（ｉｉ）以下を含むＶ_L：
（ａ）配列番号４のアミノ酸２３〜３３に示される配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸４９〜５５に示される配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号４のアミノ酸８８〜９６に示される配列を含むＣＤＲ３。

【0053】

本明細書に記載の任意の方法の一例では、化合物は、Ｖ_H及びＶ_Lを含むタンパク質であり、該Ｖ_H及びＶ_Lは、抗体２Ｈ１０のヒト化可変領域である。例えば、該タンパク質は、以下を含む：
（ｉ）以下を含むＶ_H：
（ａ）配列番号３のアミノ酸２５〜３４に示される配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３のアミノ酸４９〜６５に示される配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号３のアミノ酸９８〜１０８に示される配列を含むＣＤＲ３；
及び、
（ｉｉ）以下を含むＶ_L：
（ａ）配列番号４のアミノ酸２３〜３３に示される配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号４のアミノ酸４９〜５５に示される配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号４のアミノ酸８８〜９６に示される配列を含むＣＤＲ３。

【0054】

当業者には明らかであるように、核酸によってコードされる配列は、発現中に産生され得るその配列の全ての変異体を含む。

【0055】

本明細書中に記載される任意の方法の一例では、前記パラグラフのいずれかの可変領域又はＶ_Hは、配列番号５に記載の配列を含む。

【0056】

本明細書中に記載される任意の方法の一例では、前記パラグラフのいずれかの可変領域又はＶ_Lは、配列番号６に記載の配列を含む。

【0057】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、化合物は抗体である。

【0058】

本明細書に記載される任意の方法の一例において、化合物は、配列番号５に記載の配列を含むＶ_H及び配列番号６に記載の配列を含むＶ_Lを含む抗体である。

【0059】

一例では、タンパク質又は抗体は、前述のタンパク質又は抗体のいずれかをコードする核酸によってコードされるタンパク質又は抗体の任意の形態である。

【0060】

一例において、タンパク質又は抗体は、以下を含む：
（ｉ）以下を含むＶ_H：
（ａ）配列番号１２を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１３を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１４を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
及び／又は
（ｉｉ）以下を含むＶ_L：
（ａ）配列番号１５を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１６を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１７を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。

【0061】

一例において、タンパク質又は抗体は、以下を含む：
（ｉ）以下を含むＶ_H：
（ａ）配列番号２４を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号２５を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号２６を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
及び／又は
（ｉｉ）以下を含むＶ_L：
（ａ）配列番号２７を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１
（ｂ）配列番号２８を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号２９を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。

【0062】

一例において、タンパク質又は抗体は、以下を含む：
（ｉ）以下を含むＶ_H：
（ａ）配列番号３６を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３７を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号３８を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；
及び／又は
（ｉｉ）以下を含むＶ_L：
（ａ）配列番号３９を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号４０を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号４１を含む核酸によってコードされる配列を含むか、又は配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。

【0063】

一例では、化合物は組成物内に存在する。例えば、組成物は、本明細書に記載の抗体可変領域又はＶ_H又はＶ_L又は抗体を含むタンパク質を含む。一例では、組成物は、タンパク質又は抗体の１つ又は複数の変異体をさらに含む。例えば、コードされるＣ末端リジン残基を欠く変異体、脱アミド化変異体及び／又はグリコシル化変異体及び／又はピログルタミン酸を含む変異体（例えばタンパク質のＮ末端において）及び／又はＮ末端残基（例えば、抗体若しくはＶ領域のＮ末端グルタミン）欠損変異体及び／又は分泌シグナルの全部又は一部を含む変異体、を含む。コードされたアスパラギン残基の脱アミド化変異体は、イソアスパラギン酸及びアスパラギン酸アイソフォームが生成され、又は隣接するアミノ酸残基を含むスクシンアミドさえももたらし得る。コードされたグルタミン残基の脱アミド化変異体は、グルタミン酸を生じ得る。そのような配列及び変異体の異種混合物を含む組成物は、特定のアミノ酸配列が参照される場合に含まれることが意図される。

【0064】

本明細書中に記載される任意の方法の一例では、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、ＶＥＧＦ−Ｂの発現を阻害又は防止する。例えば、化合物は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム及びＤＮＡザイムの群から選択される。

【0065】

本明細書に記載の任意の方法の一例において、ＶＥＧＦ−Ｂは、哺乳動物ＶＥＧＦ−Ｂ、例えば、ヒトＶＥＧＦ−Ｂである。

【0066】

本明細書中に記載される任意の方法の一例では、対象は哺乳動物、例えばヒトなどの霊長類である。

【0067】

本明細書に記載の治療方法は、脳卒中の効果を軽減、治療又は予防するためのさらなる化合物の投与を、追加的に含み得る。

【0068】

本開示はまた、脳卒中の効果を低減するのに使用するためのＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を提供する。

【0069】

本開示はまた、脳卒中の効果を低減するための医薬の製造におけるＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物の使用を提供する。

【0070】

本開示はまた、脳卒中の効果を減少させるのに使用するための説明書と共にパッケージングされた、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を含むキットを提供する。任意に、キットは追加的に、血栓溶解性化合物を含む。

【0071】

本開示はまた、血栓溶解性化合物と組み合わせて、脳卒中に罹患した対象に化合物を投与するための説明書とともにパッケージングされた、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を含むキットを提供する。

【0072】

本開示はまた、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物と組み合わせて、脳卒中を罹患した対象に化合物を投与するための説明書と共にパッケージングされた血栓溶解性化合物を含むキットを提供する。

【0073】

脳卒中及び化合物の例示的な効果は、本明細書に記載されており、前の６パラグラフに記載された開示の実施例に必要な変更を加えて適用されるものとする。

【図面の簡単な説明】

【0074】

【図1】図１Ａは、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質による処理した２時間後の、内皮細胞の脂肪酸取り込みが有意に増加することを、ＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２トレーサーを用いて測定した結果を示すグラフ表示である。値は、対照に対して正規化された取り込みの比率である。対照と比較して、^*Ｐ＜０．０５、^***Ｐ＜０．００１。 図１Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質による処理した２時間後の、内皮細胞のグルコース取り込みが、有意に減少することを、蛍光グルコースアナログ（２−ＮＢＤＧ）を用いて測定した結果を示すグラフ表示である。値は、対照に対して正規化された取り込みの比率である。対照と比較して、^*Ｐ＜０．０５、^**Ｐ＜０．０１、^***Ｐ＜０．００１。 図１Ｃは、脂肪酸（ＦＡ；２５μＭパルミチン酸ナトリウム及び２５μＭオレイン酸ナトリウム）に２時間又は一晩（ｏ／ｎ）暴露した初代内皮細胞が、グルコースを取り込む能力が減少することを示す（２−ＮＢＤＧを使用して測定）。値は平均±ＳＥＭである。対照と比較して、^**Ｐ＜０．０１。

【図2】図２Ａは、食餌誘発肥満（ＤＩＯ）マウスにおける血糖レベルの上昇を、正常飼料での年齢適合マウスと比較して示すグラフ表示である。値は平均±ＳＥＭである。対照と比較して^***Ｐ＜０．００１。 図２Ｂは、正常飼料での虚血性脳卒中後の年齢適合マウスと比較した、ＤＩＯマウスにおける、より大きな梗塞体積を示すグラフ表示である。梗塞体積は、ＴＴＣ染色により７２時間で測定した。値は平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０／群である。対照と比較して^*Ｐ＜０．０１。 図２Ｃは、正常飼料での虚血性脳卒中後の年齢適合マウスと比較した、ＤＩＯマウスにおける出血スコアの増加を示すグラフ表示である。出血はスコアリングシステムにより７２時間で評価した。値は平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０／群である。対照と比較して^*Ｐ＜０．０１。 図２Ｄは、Ｖｅｇｆｂ及びその受容体Ｖｅｇｆｒ１（Ｆｌｔ１）の転写レベルが反対の対照とは有意に異ならないが、ｑＰＣＲによって測定されたＮｒｐ１発現が、虚血性脳卒中の３時間後にＤＩＯマウスで増加することを示すグラフ表示である。値は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３／群である。コントロールと比較して^**Ｐ＜０．０１。

【図3A-3D】図３Ａは、２Ｈ１０を用いたＶＥＧＦ−Ｂ拮抗作用が、アイソタイプ対照ＩｇＧで処置したマウスと比較して、ＤＩＯマウスの脳におけるグルコースアナログ¹⁸Ｆ−デオキシグルコース（１８ＦＤＧ）取り込みを改善することを示すグラフ表示である。２Ｈ１０処置した食餌誘発肥満マウスにおけるグルコースアナログ取り込みは、痩せたマウスで観察されたものに匹敵した。ｎ＝２〜５／群、平均±ＳＥＭ。^#ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１。 図３Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体２Ｈ１０での前処置が、虚血性脳卒中後の正常な飼料での年齢適合マウスと比較して、ＤＩＯマウスにおける梗塞体積を減少させることを示すグラフ表示である。梗塞体積は、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）染色により７２時間で測定した。値は平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０／群である。コントロールと比較して^**Ｐ＜０．０１。 図３Ｃは、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体２Ｈ１０による前処置が、虚血性脳卒中後の正常な食餌での年齢適合マウスと比較して、ＤＩＯマウスにおける出血スコアを減少させることを示すグラフ表示である。出血はスコアリングシステムにより７２時間で評価した。値は平均±ＳＥＭ、ｎ＝１０／群である。コントロールと比較して＊＊Ｐ＜０．０１。 図３Ｄは、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体２Ｈ１０による予防的処置後の虚血性脳卒中１時間後の虚血の周辺部（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｐｅｎｕｍｂｒａ）におけるグルコーストランスポーターＧｌｕｔ−１の保持された発現を示すグラフ表示である。Ｎ＝５／グループ。平均±ＳＥＭ、^*ｐ＜０．０５ 対 対照、^#ｐ＜０．０５ 対 対照。

【図3E-3G】図３Ｅは、ＤＩＯマウスにおける抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体２Ｈ１０による予防的治療が、虚血性脳卒中１時間後の血液脳関門漏出（デキストラン溢出によって測定）を減少させることを示すグラフ表示である。Ｎ＝５／群、平均±ＳＥＭ、^**ｐ＜０．０１。 図３Ｆは、ＩｇＧ対照処置マウスと比較した、ＤＩＯマウスにおける虚血性脳卒中後の予防的な抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体処置が、オクルディンセリンリン酸化（セリン残基４９０）の減少を示すグラフ表示である。反対側半球及び同側半影領域におけるホスホセリン特異的抗オクルディン抗体による染色を定量化し、ピクセル強度として表した。Ｎ＝３、^*ｐ＜０．０５。 図３Ｇは、ＤＩＯマウスにおける虚血性脳卒中３時間後の脳血管における脂質蓄積（血管アディポフィリン免疫染色によって測定）が、アイソタイプ対照（ＩｇＧ）と比較して、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体２Ｈ１０による予防的処置によってブロックされることを示すグラフ表示である。平均±ＳＥＭ、^**ｐ＜０．０１。

【図4】図４Ａは、２Ｈ１０抗体によるＶＥＧＦ−Ｂの阻害が、虚血性脳卒中後のＤＩＯマウスにおける後期血栓溶解後の脳卒中体積を有意に減少させることを示すグラフ表示である。ＴＴＣ染色による虚血性脳卒中の７２時間後の梗塞体積を測定した。Ｎ＝６〜１０／群、平均±ＳＥＭ、^**ｐ＜０．０１。 図４Ｂは、２Ｈ１０抗体によるＶＥＧＦ−Ｂの阻害が、虚血性脳卒中後のＤＩＯマウスにおける後期血栓溶解後の出血スコアを有意に減少させることを示すグラフ表示である。出血スコアは、虚血性脳卒中の７２時間後に組織学的に測定した。Ｎ＝６〜１０／群、平均±ＳＥＭ、^**ｐ＜０．０１。 図４Ｃは、２Ｈ１０抗体によるＶＥＧＦ−Ｂの阻害が、虚血性脳卒中後の食餌誘発性肥満マウスにおける後期血栓溶解後の生存転帰を改善することを示すカプラン・マイヤー生存分析である。Ｎ＝１０／群、平均±ＳＥＭ、^*ｐ＜０．０５。

【発明を実施するための形態】

【0075】

配列表への鍵
配列番号１は、２１アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含むヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号２は、２１アミノ酸のＮ末端シグナル配列を含むヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇アイソフォームのアミノ酸配列である。
配列番号３は、抗体２Ｈ１０のＶ_H由来のアミノ酸配列である。
配列番号４は、抗体２Ｈ１０のＶ_L由来のアミノ酸配列である。
配列番号５は、抗体２Ｈ１０のヒト化形態のＶ_H由来のアミノ酸配列である。
配列番号６は、抗体２Ｈ１０のヒト化形態のＶ_L由来のアミノ酸配列である。
配列番号７は、抗体４Ｅ１２のＶ_H由来のアミノ酸配列である。
配列番号８は、抗体４Ｅ１２のＶ_Lのアミノ酸配列である。
配列番号９は、抗体２Ｆ５のＶ_H由来のアミノ酸配列である。
配列番号１０は、抗体２Ｆ５のＶ_Lのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、組換えヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ１由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ２由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ３由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ１由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１６は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ２由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１７は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ３由来のヌクレオチド配列である。
配列番号１８は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ１由来のアミノ酸配列である。
配列番号１９は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ２由来のアミノ酸配列である。
配列番号２０は、抗体２Ｈ１０のＶ_L ＣＤＲ３由来のアミノ酸配列である。
配列番号２１は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ１由来のアミノ酸配列である。
配列番号２２は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ２由来のアミノ酸配列である。
配列番号２３は、抗体２Ｈ１０のＶ_H ＣＤＲ３由来のアミノ酸配列である。
配列番号２４は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ１由来のヌクレオチド配列である。
配列番号２５は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ２由来のヌクレオチド配列である。
配列番号２６は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ３由来のヌクレオチド配列である。
配列番号２７は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ１由来のヌクレオチド配列である。
配列番号２８は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ２由来のヌクレオチド配列である。
配列番号２９は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ３由来のヌクレオチド配列である。
配列番号３０は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ１由来のアミノ酸配列である。
配列番号３１は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ２由来のアミノ酸配列である。
配列番号３２は、抗体２Ｆ５のＶ_L ＣＤＲ３由来のアミノ酸配列である。
配列番号３３は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ１由来のアミノ酸配列である。
配列番号３４は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ２由来のアミノ酸配列である。
配列番号３５は、抗体２Ｆ５のＶ_H ＣＤＲ３由来のアミノ酸配列である。
配列番号３６は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ１由来のヌクレオチド配列である。
配列番号３７は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ２由来のヌクレオチド配列である。
配列番号３８は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ３由来のヌクレオチド配列である。
配列番号３９は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ１由来のヌクレオチド配列である。
配列番号４０は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ２由来のヌクレオチド配列である。
配列番号４１は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ３由来のヌクレオチド配列である。
配列番号４２は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ１由来のアミノ酸配列である。
配列番号４３は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ２由来のアミノ酸配列である。
配列番号４４は、抗体４Ｅ１２のＶ_L ＣＤＲ３由来のアミノ酸配列である。
配列番号４５は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ１由来のアミノ酸配列である。
配列番号４６は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ２由来のアミノ酸配列である。
配列番号４７は、抗体４Ｅ１２のＶ_H ＣＤＲ３由来のアミノ酸配列である。

概要
一般

【0076】

本明細書を通して、別段の記載がない限り、又は文脈上他の意味を必要としない限り、単独工程、物質の組成物、物質群、工程群又は物質の組成物群に対する参照は、それらの工程、物質の組成物、物質群、工程群又は物質の組成物群の１つ又は複数（すなわち、１つ以上）を包含するものとする。

【0077】

当業者であれば、本開示は、具体的に記載されたもの以外の変形及び変更を受け易いことを理解するであろう。本開示は、そのような全ての変形及び修正を含むことが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書で個別に又は集合的に言及される又は示される工程、特徴、組成物及び化合物の全て、及び前記工程又は特徴のいずれか及び全て又は任意の２つ以上の組み合わせを含む。

【0078】

本開示は、本明細書に記載された特定の例によって限定されるものではなく、例示のみを目的とするものである。機能的に同等の製品、組成物及び方法は、明らかに本開示の範囲内にある。

【0079】

本明細書中の本開示のいずれの例も、他に特に断らない限り、本開示の任意の他の例について準用するものとする。

【0080】

特に明記しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有すると解釈される（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学）。

【0081】

他に示されない限り、本開示において利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者に周知の標準的な手順である。このような技術は、例えば、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（編者），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ａｎｄ ２，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１），Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ ａｎｄ Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（編者），ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １−４，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９５ ａｎｄ １９９６），ａｎｄ Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改訂版を含む），Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編者）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８），ａｎｄ Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．（編者）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（現在までの全ての改訂版を含む）などのソースの文献を通して記載され、説明される。

【0082】

本明細書の可変領域及びその部分、免疫グロブリン、抗体及びそのフラグメントの説明及び定義は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１，Ｂｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４２，３０９−３２０，１９９４，Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７，Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３，１９８９ ａｎｄ／ｏｒ ｏｒ Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３，９２７−９４８，１９９７における議論によって、されに明らかにされ得る。

【0083】

本明細書のタンパク質又は抗体の議論は、製造及び／又は保存の間に産生されるタンパク質又は抗体の任意の変異体を含むと理解される。例えば、製造又は保存中に、抗体は脱アミド化され得（例えば、アスパラギン又はグルタミン残基で）、及び／又は変化したグリコシル化を有し得、及び／又はピログルタミン酸に変換されたグルタミン残基を有し得、及び／又は除去された若しくは「クリッピング」されたＮ−末端又はＣ−末端残基を有し得、及び／又は不完全に処理された一部又は全部のシグナル配列を有し得、結果として抗体の末端に残る。特定のアミノ酸配列を含む組成物は、記載された若しくはコードされた配列及び／又はその記載された若しくはコードされた配列の変異体の異種混合物であり得ることが理解される。

【0084】

用語「及び／又は」、例えば「Ｘ及び／又はＹ」は、「Ｘ及びＹ」又は「Ｘ又はＹ」のいずれかを意味すると理解され、両方の意味、又はいずれかの意味を明確に支持するために提供されるものとする。

【0085】

本明細書を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された要素、整数又は工程、又は、要素、整数若しくは工程の群を含むことを意味すると理解され、他の要素、整数若しくは工程、又は要素、整数若しくは工程の群を排除するものではない。

【0086】

本明細書で使用する場合、「由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ）」という用語は、特定の整数が、必ずしもその供給源から直接ではないが、特定の供給源から得られ得ることを示すために用いられる。

選択された定義

【0087】

ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆及びＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇と呼ばれる２つの主要なアイソフォームにおいて存在することが知られている。分類のみの目的であり、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の非限定的な例示の配列として、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３３６８．１、ＮＣＢＩタンパク質受入番号ＮＰ＿００３３６８、Ｐ４９７６５及びＡＡＬ７９００１、及び配列番号１に記載されている。本開示の文脈において、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆の配列は、２１アミノ酸のＮ末端シグナル配列を欠いていてもよい（例えば、配列番号１のアミノ酸１〜２１に示されるように）。分類のみの目的であり、ヒトＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の非限定的な例示の配列として、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１２３０６６２．１、ＮＣＢＩタンパク質受入番号ＡＡＬ７９０００及びＡＡＢ０６２７４及び配列番号２に記載されている。本開示の文脈において、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇の配列は、２１アミノ酸のＮ末端シグナル配列を欠いていてもよい（例えば、配列番号２のアミノ酸１〜２１に示されるように）。ＶＥＧＦ−Ｂのさらなる配列は、本明細書及び／又は公的に入手可能なデータベースに提供される配列を用いて決定され得る、及び／又は標準的な技術を用いて決定され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改訂版を含む）、又は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））。ヒトＶＥＧＦ−Ｂへの言及は、ｈＶＥＧＦ−Ｂと省略することができる。一例では、ＶＥＧＦ−Ｂへの言及は、ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇アイソフォームに対するものである。

【0088】

ＶＥＧＦ−Ｂに対する本明細書の言及は、国際公開第２００６／０１２６８８号に記載のＶＥＧＦ−Ｂ_10-108ペプチドも包含する。

【0089】

本明細書中で使用される場合、用語「脳卒中（ｓｔｏｋｅ）」は、脳又は脳幹への血流の障害による、脳機能（単数又は複数）の喪失（通常は急速に進行する）を意味すると解釈されるものとする。障害（ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）は、例えば、血栓症又は塞栓症によって引き起こされる虚血（血液欠乏）であり得るか、又は出血に起因し得る。一例では、脳機能の喪失には、神経細胞死が伴う。一例では、脳卒中は、大脳又はその領域からの血液の障害又は損失によって引き起こされる。一例では、脳卒中は、２４時間を超えて持続するか、又は２４時間以内に死亡により中断される脳血管障害の神経学的欠損である（世界保健機関によって定義される）。２４時間を超える症状の持続は、症状が２４時間未満持続する一過性虚血発作（ＴＩＡ）と脳卒中を分ける。脳卒中の症状には、半身麻痺（ｈｅｍｉｐｌｅｇｉａ）（身体の片側の麻痺）；不全片麻痺（ｈｅｍｉｐａｒｅｓｉｓ）（身体の片側の脱力（ｗｅａｋｎｅｓｓ ｏｎ ｏｎｅ ｓｉｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ｂｏｄｙ）；顔面の筋肉脱力（ｍｕｓｃｌｅ ｗｅａｋｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆａｃｅ）；しびれ；感覚の減少；変化した嗅覚、味覚、聴覚、又は視覚；嗅覚、味覚、聴覚、又は視力の喪失；まぶたの垂れ下がり（眼瞼下垂）；眼筋の検出可能な衰弱；咽頭反射（ｇａｇ ｒｅｆｌｅｘ）の低下；嚥下能力の低下；光に対する瞳孔反応性の低下；顔面の感覚の減少；バランスの低下；眼振；呼吸数の変化；心拍数の変化；頭を片側に回す能力の減少又は回すことができない胸鎖乳突筋の衰弱；舌の脱力（ｗｅａｋｎｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｏｎｇｕｅ）；失語症（言語を話すことや理解できない）；失行症（変化した随意運動）；視野欠損；記憶欠損；半ネグレクト（ｈｅｍｉｎｅｇｌｅｃｔ）又は片側空間のネグレクト（ｈｅｍｉｓｐａｔｉａｌ ｎｅｇｌｅｃｔ）（病変の反対側の視野側の空間への注意力欠損）；混乱した思考（ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚｅｄ ｔｈｉｎｋｉｎｇ）；混乱（ｃｏｎｆｕｓｉｏｎ）；過剰性的ジェスチャーの発症（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｙｐｅｒｓｅｘｕａｌ ｇｅｓｔｕｒｅｓ）；疾病失認（ａｎｏｓｏｇｎｏｓｉａ）（欠陥の存在の永続的否定）；歩行困難；運動協調性の変化；めまい；不均衡（ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）；意識の喪失；頭痛；及び／又は嘔吐、を含む。

【0090】

「脳卒中の効果」という用語は、梗塞サイズ、出血スコア及び／又は血液脳関門の損傷若しくは漏出の１つ以上を含むと理解される。しかしながら、この用語は、これらの効果に限定されるものではなく、対象における任意の臨床的変化などの対象における任意の変化、例えば、脳卒中に起因する、神経学的又は身体的な変化などを包含する。このような変化又は効果には、本明細書に記載の運動障害、脳機能の喪失又は症状のいずれかが含まれる。

【0091】

「脳卒中症状の発症」という用語は、対象又は他の人が、脳卒中の１つ又は複数の症状を認識する時間を指すと理解される。適切な症状が本明細書に記載される。

【0092】

本明細書で使用される用語「出血の発生（ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）」は、対象又は対象の集団で罹患した出血の数又は大きさを意味すると理解される。従って、対象における出血の発生の減少とは、対象における出血の数又はサイズの減少、又は対象が脳卒中の結果として１つ以上の出血に罹患する可能性の低下であり得る。

【0093】

「致死的出血の可能性（ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｏｆ ｌｅｔｈａｌ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）」という用語は、化合物（単数又は複数）が投与された対象が、化合物（単数又は複数）が投与されていない脳卒中に罹患した対象よりも、出血の結果として死亡する可能性が低いことを意味すると理解される。明らかに、そのような可能性は、各対象のための並列比較を必要とするのではなく、母集団データに基づいて計算することができる。この用語は、脳卒中の結果としての死の可能性を低減するための明示的な支援も提供する。すなわち、本開示は、脳卒中の結果として死亡の可能性を低減する方法をさらに提供する。脳卒中の影響を低減することに関して上述の全ての方法工程は、そのような方法に等しく適用されるとみなされる。

【0094】

用語「血液脳関門（ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅ）」は、中枢神経系の脳外細胞液から循環血液を分離する高度に選択的な透過性障壁を意味するものと解釈すべきである。血液脳関門の損傷（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）又は漏出（ｌｅａｋａｇｅ）は、脳の細胞外空間又は脳浮腫における体液の蓄積をもたらし得る。血液脳関門の損傷は、外傷性脳損傷又は虚血性脳卒中、癌、又は髄膜炎（ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｓ）若しくは脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）による脳炎症（ｂｒａｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）などの非外傷性損傷に起因し得る。

【0095】

用語「血栓溶解性化合物」は、血管の閉塞を制限するために１つ又は複数の血栓の破壊を誘発又は仲介又は増強する化合物を意味すると解釈される。血栓溶解性化合物は、プラスミンによる二次線維素溶解を刺激することによって作用し得る。例示的な血栓溶解剤には、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、アニストレプラーゼ（ＡＰＳＡＣ）、ストレプトキナーゼ（ＳＫ）、スタフィロキナーゼ（ＳＡＫ）、デスモテプラーゼ又はウロキナーゼ（ｕＰＡ）が含まれる。

【0096】

一例において、血栓溶解性化合物は、「組織プラスミノーゲン活性化因子」又はｔＰＡである。ｔＰＡは、プラスミノーゲンのプラスミンへの変換を触媒することによって血栓の分解に関与するセリンプロテアーゼである。一例において、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、組換え技術を用いて製造することができる。従って、それは、例えば、配列番号１１に記載の配列を含む組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｒ−ｔＰＡ）であり得る。例示的なｔＰＡには、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、ラノテプラーゼ又はテネクテプラーゼが含まれる。

【0097】

本明細書中で使用される場合、血栓溶解性化合物の「有効な投与」（又は類似）との言及は、血栓溶解性化合物の投与が、臨床的に有効な結果、すなわち、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達の阻害剤が投与されるとともに、同一の血栓溶解性化合物が同じ様式（例えば、同じ時間で、及び／又は類似の血糖レベルを有する患者で）で投与される対象又は対象の集団に見られるものと比較して、脳卒中の効果を低下させる改善を提供すること、を意味する。

【0098】

本明細書の記載に基づいて当業者に明らかであるように、化合物の「組み合わせ」を投与することを検討する場合、本開示は、化合物を単一の組成物として投与すること、化合物を同時に投与すること（ただし、別々の組成物として）又は化合物を順次投与することを意図する。

【0099】

「組換え」という用語は、人工的な遺伝子組換えの産物を意味すると理解されるべきである。従って、抗体可変領域を含む組換えタンパク質という文脈において、この用語は、Ｂ細胞の成熟の間に生じる天然の組換えの産物である、対象の体内で天然に存在する抗体を包含しない。しかし、そのような抗体が単離された場合、それは抗体可変領域を含む単離されたタンパク質と考えられるべきである。同様に、タンパク質をコードする核酸が単離され、組換え手段を用いて発現される場合、得られるタンパク質は抗体可変領域を含む組換えタンパク質である。組換えタンパク質はまた、例えばそれが発現する細胞、組織又は対象内に存在する場合、人工的組換え手段によって発現されるタンパク質を包含する。

【0100】

「タンパク質」という用語は、単一のポリペプチド鎖、すなわち、ペプチド結合によって連結された一連の連続アミノ酸又は互いに共有結合若しくは非共有結合した一連のポリペプチド鎖（すなわち、ポリペプチド複合体）、を含む。例えば、一連のポリペプチド鎖は、適切な化学的又はジスルフィド結合を用いて共有結合させることができる。非共有結合の例には、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が含まれる。

【0101】

用語「ポリペプチド」又は「ポリペプチド鎖」は、先のパラグラフから、ペプチド結合によって連結された一連の連続したアミノ酸を意味すると理解される。

【0102】

当業者であれば、「抗体」は、一般に、複数のポリペプチド鎖、例えば、軽鎖可変領域（Ｖ_L）を含むポリペプチド及び重鎖可変領域（Ｖ_H）を含むポリペプチドからなる可変領域を含むタンパク質であると考えられることを認識するであろう。抗体はまた、一般に定常ドメインを含み、その一部は定常領域に配置することができ、重鎖の場合には定常領域には定常フラグメント又は結晶化可能フラグメント（Ｆｃ）が含まれる。Ｖ_H及びＶ_Lは、１つ又はいくつかの密接に関連する抗原に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むＦｖを形成するように相互作用する。一般に、哺乳類の軽鎖は、κ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかであり、哺乳類の重鎖はα、δ、ε、γ又はμである。抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ₃、ＩｇＧ₄、ＩｇＡ₁及びＩｇＡ₂）又はサブクラスであり得る。用語「抗体」は、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ヒト抗体、合成ヒト化抗体（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）及びキメラ抗体も包含する。

【0103】

「完全長抗体」、「無処理抗体（ｉｎｔａｃｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」又は「全抗体（ｗｈｏｌｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」という用語は、抗体の抗原結合フラグメントとは対照的に、その実質的にインタクトな形態の抗体を指すために、交換可能に使用される。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、野生型配列定常ドメイン（例えば、ヒト野生型配列定常ドメイン）又はそのアミノ酸配列改変体であり得る。

【0104】

本明細書中で使用される場合、「可変領域」は、抗原に特異的に結合することができ、かつ、相補性決定領域（ＣＤＲ）；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、及びフレームワーク領域（ＦＲｓ）を含む、本明細書で定義される抗体の軽鎖及び／又は重鎖の部分を指す。例示的な可変領域は、３つのＣＤＲと共に、３つ又は４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意にＦＲ４）を含むものである。ＩｇＮＡＲに由来するタンパク質の場合は、当該タンパク質はＣＤＲ２を欠いていてもよい。Ｖ_Hは重鎖の可変領域を指す。Ｖ_Lは軽鎖の可変領域を指す。

【0105】

本明細書中で使用される場合、用語「相補性決定領域」（別名ＣＤＲ；すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）は、その存在が抗原結合に必要な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは、典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲ領域を有する。ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられたアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７ ａｎｄ １９９１ ｏｒ ｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ，ｅ．ｇ．，ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３４２，８７７−８８３，１９８９；及び／又は、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８，１９９７；ｔｈｅ ＩＭＧＴ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌ．Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７：５５−７７，２００３；又は、ｔｈｅ ＡＨＯ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｋｔｈｕｎ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０，２００１に従って定義され得る。

【0106】

「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。

【0107】

本明細書中で使用される場合、用語「Ｆｖ」は、Ｖ_L及びＶ_Hが会合し、抗原結合部位を有する、すなわち、抗原に特異的に結合することができる複合体を形成する、複数のポリペプチド又は単一のポリペプチドを含む、任意のタンパク質を意味するものである。抗原結合部位を形成するＶ_H及びＶ_Lは、単一のポリペプチド鎖又は異なるポリペプチド鎖に存在し得る。さらに、本開示のＦｖ（及び本開示の任意のタンパク質）は、同一の抗原に結合してもよい、又は、結合しなくてもよい複数の抗原結合部位を有してもよい。この用語は、抗体から直接得られたフラグメント、並びに組換え手段を用いて産生されたそのフラグメントに対応するタンパク質を包含するものと解すべきである。いくつかの例において、Ｖ_Hは重鎖定常ドメイン（Ｃ_H）１に連結されない、及び／又はＶ_Lは軽鎖定常ドメイン（Ｃ_L）に連結されない。例示的なＦｖ含有ポリペプチド又はタンパク質には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ若しくはより高次の複合体、又は定常領域若しくはそのドメイン（Ｃ_H２又はＣ_H３ドメイン）に連結された前述の任意のもの、例えば、ミニボディ、を含む。「Ｆａｂフラグメント」は、抗体の一価抗原結合フラグメントからなり、全抗体を酵素パパインで消化してインタクトな軽鎖と重鎖の一部からなるフラグメントを得ることにより製造され得る、又は、組換え手段を用いて生産され得る。抗体の「Ｆａｂ’フラグメント」は、全抗体をペプシンで処理した後、還元して、インタクトな軽鎖並びにＶ_H及び単一の定常ドメインを含む重鎖の一部からなる分子を得ることにより得ることができる。この方法で処理された抗体当たり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントはまた、組換え手段によって産生され得る。抗体の「Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント」は、２つのジスルフィド結合によって共に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体からなり、還元を伴わずに抗体分子全体を酵素ペプシンで処理することによって得られる。「Ｆａｂ₂」フラグメントとは、例えば、ロイシンジッパー又はＣ_H３ドメインを用いて連結された２つのＦａｂフラグメントを含む組換えフラグメントである。「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」とは、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域が、適切な柔軟性ポリペプチドリンカーによって共有結合された、抗体の可変領域フラグメント（Ｆｖ）を含む組換え分子である。

【0108】

本明細書中で使用される場合、タンパク質又はその抗原結合部位と抗原との相互作用に関して「結合する」という用語は、相互作用が、抗原上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、一般にタンパク質ではなく、特定のタンパク質構造を認識し、結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、エピトープ「Ａ」（又は遊離の非標識「Ａ」）を含有する分子が標識「Ａ」及びタンパク質を含む反応において存在すると、抗体に結合する標識「Ａ」の量を減少させる。

【0109】

本明細書中で使用される場合、用語「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄｓ）」又は「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」とは、本開示のタンパク質が、より高頻繁に、より迅速に、より長い期間及び／又はより高い親和性で、抗原又はそれを発現する細胞に、別の抗原又は細胞よりも、反応する又は会合することを意味するものである。例えば、タンパク質は、ＶＥＧ−Ｂに、他の増殖因子（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）に対するものより、又は、多反応性天然抗体（すなわち、ヒトにおいて天然に見出される様々な抗原に結合することが知られている天然に存在する抗体）によって一般的に認識される抗原よりも、実質的により高い親和性で（例えば、２０倍又は４０倍又は６０倍又は８０倍〜１００倍又は１５０倍又は２００倍）結合する。一般的に、ただし必ずしも必要ではないが、結合への言及は、特異的結合を意味し、各用語は他の用語に対し、明示的な支持を提供するものと理解される。

【0110】

本明細書中で使用される場合、用語「中和する」は、タンパク質が、ＶＥＧＦ−Ｒ１を介して細胞内でＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を遮断、低減又は妨げることができることを意味すると解釈されるべきである。中和を決定するための方法は、当該分野で公知であり、及び／又は本明細書に記載されている。

【0111】

本明細書で使用する「予防すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」又は「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」という用語は、本開示の化合物を投与することによって、状態の少なくとも１つの症状の発症をそれによって停止又は妨害することを含む。

【0112】

本明細書中で使用される場合、用語「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、本明細書に記載のタンパク質を投与して、それによって、特定の疾患若しくは状態の少なくとも１つの症状を軽減若しくは排除するか、又はその疾患若しくは状態の進行を遅延させることを含む。

【0113】

本明細書中で使用される場合、用語「対象」は、ヒトを含む任意の動物、例えば哺乳動物を意味すると解釈されるものとする。例示的な対象としては、ヒト及び非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されない。例えば、対象はヒトである。

脳卒中の影響の低減

【0114】

本明細書の開示は、例えば、対象における脳卒中の１つ以上の効果を減少させる方法を提供するものであって、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物を対象に投与することを含む。

【0115】

一例では、対象は、糖尿病に罹患している。例えば、糖尿病に罹患している対象は、臨床的に承認された糖尿病のマーカーを有し、例えば：
・空腹時血糖レベルが、７ｎｍｏｌ／Ｌ又は１２６ｍｇ／ｄｌ以上であること；
・糖尿病の症状を伴う１１．１ｎｍｏｌ／Ｌ又は２００ｍｇ／ｄｌ以上の普段の（ｃａｓｕａｌ）血漿グルコース（１日のうちの任意の時間に採取）。
・２時間間隔で測定した経口糖負荷試験（ＯＧＴＴ）値が１１．１ｎｍｏｌ／Ｌ又は２００ｍｇ／ｄｌ以上。ＯＧＴＴは、２時間又は３時間の時間間隔にわたって行われる。

【0116】

一例では、対象は１型糖尿病に罹患している。

【0117】

一例では、対象は２型糖尿病に罹患している。

【0118】

本開示の方法は、中枢神経系における任意の形態の虚血に容易に適用され得る。例えば、対象は、網膜虚血の徴候（単数又は複数）及び／又は症状を呈し得る。従って、本開示の方法は、中枢神経系における虚血、例えば、網膜虚血の影響を低減することに適用されると考えられる。

【0119】

一例では、対象は、脳卒中のリスクがあるが、脳卒中の発症はまだ起こっていない。対象は、対照集団よりも脳卒中発症のリスクが高い場合、リスクがある。対照集団は、診断されていないか、又は脳卒中の家族歴を有する一般集団（例えば、年齢、性別、人種及び／又は民族によって一致）から無作為に選択された１人又は複数の対象を含み得る。対象は、その脳卒中に関連する「リスク因子」がその対象に関連することが判明した場合、脳卒中のリスクがあるとみなすことができる。リスク因子は、例えば対象の集団に関する統計的又は疫学的研究を通じて、所与の障害に関連する任意の活動、形質（ｔｒａｉｔ）、事象又は特性を含み得る。従って、潜在的なリスク因子を特定する研究が、対象が具体的に含まれていなくても、対象は脳卒中のリスクがあると分類することができる。例えば、心臓外科手術を受けていない対象と比較して心臓外科手術を受けた対象の集団において、一過性の脳虚血発作の頻度が増加しているので、心臓手術を受けた対象は、一過性の脳虚血発作（又は脳卒中）のリスクがある。

【0120】

一例では、脳卒中のリスクがある対象には、脳又は中枢神経系の外科的処置、例えば血管内手術、クリッピング、ステント留置又はマイクロカテーテル法が施されることが含まれる。このような対象はまた、脳に供給する血管（すなわち、頚動脈及び頸静脈などの脳を心臓に接続する血管）又は網膜に血液を供給する動脈に影響を及ぼす身体の他の場所の手術を受ける患者も含まれる。例示的なクラスの対象は、脳動脈瘤を治療するための血管内手術を受ける対象である。これらのタイプの外科手術を受けている対象は、脳卒中リスクが高い。

【0121】

一例では、脳卒中のリスクがある対象には、喫煙者、高血圧、糖尿病、高コレステロール血症の患者も含まれる。特に高リスクの対象は、前脳卒中（ｐｒｉｏｒ ｓｔｒｏｋｅ）、軽度脳卒中（ｍｉｎｏｒ ｓｔｒｏｋｅ）、又は一過性虚血発作を有する者である。

【0122】

上述のように、本開示の方法は、以下の効果の１つ以上を達成する：
・対象の梗塞サイズの縮小；
・対象の脳内出血スコアによって評価される出血スコアの低下；及び／又は
・対象の血液脳関門の損傷又は漏出の減少；及び／又は
・脳卒中後の対象の大脳浮腫の減少。

【0123】

梗塞サイズを評価するための方法は、当技術分野で公知であり、例えば、ｅｃｈｎｅｔｉｕｍ−９９ｍ ｓｅｓｔａｍｉｂｉ単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影法、又は磁気共鳴画像法が挙げられる。

【0124】

脳内出血スコアを評価する方法は、例えば、Ｈｅｍｐｈｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ，３２：８９１−８９７、２００１に記載されている。脳出血、例えば脳内出血の存在は、例えばＭＲＩ又はＣＴスキャンを使用して、測定され得る。

【0125】

血液脳関門の損傷／漏出／浸透性は、ＭＲＩを用いて、場合によりトレーサーを用いて検出することもできる。

【0126】

一例では、本開示の方法は、当技術分野で知られているか、又は本明細書に記載されている任意の脳卒中症状を軽減する。

【0127】

当業者には明らかであるように、対象における脳卒中の症状又は効果における「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」とは、脳卒中に罹患しているが本明細書に記載の方法で治療を受けていない別の対象と比較される。これは、必ずしも２つの対象を並べて比較する必要はない。むしろ集団データは信頼され得る。例えば、本明細書に記載された方法を用いて治療を受けていない脳卒中に罹患している対象の集団（任意に、治療された対象に対する類似の対象の集団（例えば、年齢、体重、糖尿病状態、血糖レベル））が評価され、平均値は、本明細書に記載の方法で治療された対象又は対象の集団の結果と比較される。

ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達阻害剤
抗体可変領域を含むタンパク質

【0128】

例示的なＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達阻害剤は、抗体可変領域を含み、例えば、ＶＥＧＦ−Ｂに結合し、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を中和する抗体若しくは抗体フラグメントである。

【0129】

一例では、抗体可変領域は、ＶＥＧＦ−Ｂに特異的に結合する。

【0130】

適切な抗体及びその可変領域を含むタンパク質は、当技術分野で公知である。

【0131】

例えば、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体及びそのフラグメントは、国際公開第２００６／０１２６８８号に記載されている。

【0132】

一例において、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体又はそのフラグメントは、ＶＥＧＦ−Ｂへの２Ｈ１０の結合を競合的に阻害する抗体又はその抗原結合フラグメントである。一例では、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体又はそのフラグメントは、抗体２Ｈ１０又はそのキメラ、ＣＤＲ移植若しくはヒト化版（ｖｅｒｓｉｏｎ）又はその抗原結合フラグメントである。これに関して、抗体２Ｈ１０は、配列番号３に示される配列を含むＶ_H、及び配列番号４に示される配列を含むＶ_Lを含む。この抗体の例示的なキメラ及びヒト化版は、国際公開第２００６／０１２６８８号に記載される。

【0133】

一例では、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体又はそのフラグメントは、配列番号５に示される配列を含むＶ_H、及び配列番号６に示される配列を含むＶ_Lを含む。

【0134】

一例において、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体又はそのフラグメントは、ＶＥＧＦ−Ｂへの４Ｅ１２の結合を競合的に阻害する抗体、又はその抗原結合フラグメントである。一例では、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体又はそのフラグメントは、抗体４Ｅ１２又はそのキメラ、ＣＤＲ移植若しくはヒト化版又はその抗原結合フラグメントである。これに関して、抗体４Ｅ１２は、配列番号７に示される配列を含むＶ_H、及び配列番号８に示される配列を含むＶ_Lを含む。

【0135】

一例では、化合物は、抗体４Ｅ１２のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、タンパク質は、抗体４Ｅ１２のＶ_H及び／又はＶ_Lの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む。例えば、タンパク質は、以下を含む：
（ｉ）以下を含むＶ_H：
（ａ）配列番号７のアミノ酸２５〜３４に示される配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸４９〜６５に示される配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号７のアミノ酸９８〜１０５に示される配列を含むＣＤＲ３；
及び／又は
（ｉｉ）以下を含むＶ_L：
（ａ）配列番号８のアミノ酸２４〜３４に示される配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号８のアミノ酸５０〜５６に示される配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号８のアミノ酸８９〜９７に示される配列を含むＣＤＲ３。

【0136】

一例では、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体又はそのフラグメントは、ＶＥＧＦ−Ｂへの２Ｆ５の結合を競合的に阻害する抗体又はその抗原結合フラグメントである。一例では、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体又はそのフラグメントは、抗体２Ｆ５又はそのキメラ、ＣＤＲ移植若しくはヒト化版又はその抗原結合フラグメントである。これに関して、抗体２Ｅ５は、配列番号９に示される配列を含むＶ_H、及び配列番号１０に示される配列を含むＶ_Lを含む。

【0137】

一例において、化合物は、抗体２Ｆ５のヒト化可変領域を含むタンパク質である。例えば、タンパク質は、抗体２Ｆ５のＶ_H及び／又はＶ_Lの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変領域を含む。

【0138】

例えば、タンパク質は、以下を含む：
（ｉ）以下を含むＶ_H：
（ａ）配列番号９のアミノ酸２５〜３４に示される配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号９のアミノ酸４９〜６５に示される配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号９のアミノ酸９８〜１０７に示される配列を含むＣＤＲ３；
及び／又は
（ｉｉ）以下を含むＶ_L：
（ａ）配列番号１０のアミノ酸２４〜３４に示される配列を含むＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号１０のアミノ酸５０〜５６に示される配列を含むＣＤＲ２；及び
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸８９〜９６に示される配列を含むＣＤＲ３。

【0139】

別の例では、抗体又はその可変領域を含むタンパク質は、例えば当技術分野で知られているか、又は本明細書に簡単に記載されているような標準的な方法を用いて産生される。

免疫ベース方法

【0140】

抗体を産生するために、任意に適切な又は所望のアジュバント及び／又は医薬的に許容される担体で任意に製剤化された、ＶＥＧＦ−Ｂ又はそのエピトープ含有フラグメント若しくは部分又はその修飾形態又はそれをコードする核酸（「免疫原」）は、注射可能な組成物の形態で対象（例えば、非ヒト動物対象（例えば、マウス、ラット、ニワトリなど））に投与される。例示的な非ヒト動物は、マウス動物（例えば、ラット又はマウス）などの哺乳動物である。注射は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、又は他の既知の経路であり得る。必要に応じて、免疫原は、何回も投与される。抗体の調製及び特徴付けのための手段は、当技術分野で公知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照）。マウスにおいて抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体を産生する方法は、国際公開第２００６／０１２６８８号に記載されている。

【0141】

ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の様々な時点で、免疫した動物の血液をサンプリングすることによってモニターすることができる。所望の抗体力価を達成するために必要であれば、第２のブースター注射を行ってもよい。適切な力価が達成されるまで、ブースティング及び力価測定の工程を繰り返す。所望のレベルの免疫原性が得られたら、免疫した動物から採血し、単離して保存した血清、及び／又は動物を用いてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する。

【0142】

モノクローナル抗体は、本開示によって企図される例示的な抗体である。一般に、モノクローナル抗体の産生は、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で対象（例えば、げっ歯類、例えばマウス又はラット）を免疫原で免疫することを含む。いくつかの例では、ヒト抗体を発現するように遺伝子操作され、マウス抗体タンパク質を発現しないマウスを免疫して、抗体を産生する（例えば、ＰＣＴ／ＵＡ２００７／００８２３１及び／又はＬｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６８（１９９４）：８５６−８５９に記載されるように）。免疫後、抗体を産生する体細胞（例えば、Ｂリンパ球）を、不死細胞、例えば、不死性骨髄腫細胞と融合させる。そのような融合細胞（ハイブリドーマ）を産生するための種々の方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９７５に記載されている。次いで、ハイブリドーマ細胞を、抗体産生に十分な条件下で培養することができる。

【0143】

本開示は、抗体を産生するための他の方法、例えばＡＢＬ−ＭＹＣ技術（例えば、Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６，９１−９６，１９９０に記載されている）を企図する。

ライブラリベースの方法

【0144】

本開示はまた、ＶＥＧＦ−Ｂ結合抗体又はその可変領域を含むタンパク質を同定するために、抗体又はその抗原結合ドメイン（例えば、それらの可変領域を含む）を含むタンパク質のライブラリーのスクリーニングを包含する。

【0145】

本開示によって企図されるライブラリーの例には、ナイーブライブラリー（非暴露対象由来）、免疫化ライブラリー（抗原で免疫された対象由来）又は合成ライブラリーが含まれる。抗体又はその領域（例えば、可変領域）をコードする核酸は、従来の技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ，ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）でクローニングし、当技術分野で公知の方法を用いてタンパク質のコード化及びディスプレイに使用した。タンパク質のライブラリーを作製するための他の技術は、例えば、米国特許第６３０００６４号明細書（例えば、Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ ＡＧのＨｕＣＡＬライブラリー）；米国特許第５８８５７９３号明細書；米国特許第６２０４０２３号明細書；米国特許第６２９１１５８号明細書；又は米国特許第６２４８５１６号明細書に記載されている。

【0146】

本開示のタンパク質は、可溶性分泌タンパク質であってもよく、又は細胞又は粒子（例えば、ファージ又は他のウイルス、リボソーム又は胞子）の表面上の融合タンパク質として提示されてもよい。種々のディスプレイライブラリーフォーマットは当該分野で公知である。例えば、ライブラリーは、インビトロディスプレイライブラリー（例えば、リボソームディスプレイライブラリー、共有ディスプレイライブラリ（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｒｙ）又はｍＲＮＡディスプレイライブラリ、例えば米国特許第７２７０９６９号明細書に記載されている）である。さらに別の例では、ディスプレイライブラリは、抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質が、ファージ上で発現されるファージディスプレイライブラリーであり、例えば、米国特許第６３０００６４号明細書；米国特許第５８８５７９３号明細書；米国特許第６２０４０２３号明細書；米国特許第６２９１１５８号明細書；又は米国特許第６２４８５１６号明細書に記載される。他のファージディスプレイ方法は、当技術分野で公知であり、本開示によって企図される。同様に、細胞ディスプレイの方法は、例えば、米国特許第５５１６６３７号明細書に記載されているような、細菌ディスプレイライブラリ；例えば米国特許第６４２３５３８号明細書に記載されているような、酵母ディスプレイライブラリ；又は哺乳類ディスプレイライブラリなどの開示によって企図される。

【0147】

ディスプレイライブラリをスクリーニングするための方法は、当技術分野で公知である。一例では、本開示のディスプレイライブラリは、例えばＳｃｏｐｅｓ（Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されているように、親和性精製を用いてスクリーニングされる。親和性精製の方法は、典型的には、ライブラリーによってディスプレイされた抗原結合ドメインを含むタンパク質を標的抗原（例えば、ＶＥＧＦ−Ｂ）と接触させ、洗浄後、抗原に結合したままのドメインを溶出することを含む。

【0148】

スクリーニングによって同定された任意の可変領域又はｓｃＦｖは、必要に応じて、完全抗体に容易に修飾される。可変領域又はｓｃＦｖを完全抗体に改変又は再フォーマットするための例示的な方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．３５４：８５−９０，２０１０；又はＪｏｓｔｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８９：６５−８０，２００４に記載されている。或いは、又は追加的に、標準的なクローニング方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎ：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＩＳＢＮ ０４７ １５０３３８，１９８７）及び／又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ ２００１）に記載されているようなものが使用される。

脱免疫化、キメラ化、ヒト化、合成ヒト化、霊長類化及びヒトタンパク質

【0149】

本開示のタンパク質は、ヒト化タンパク質であってもよい。

【0150】

「ヒト化タンパク質」という用語は、ヒト様可変領域を含むタンパク質を指すものと理解されるものであって、それは、ヒト抗体由来のＦＲ上に移植された又は挿入された、非ヒト種（例えば、マウス又はラット又は非ヒト霊長類）由来の抗体由来のＣＤＲを含むものである（このタイプの抗体は、「ＣＤＲ移植抗体」とも呼ばれる）。ヒト化タンパク質は、ヒトタンパク質の１つ以上の残基が、１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されているタンパク質、及び／又はヒトタンパク質の１つ以上のＦＲ残基が対応する非ヒト残基によって置換されているタンパク質も含む。ヒト化タンパク質はまた、ヒト抗体又は非ヒト抗体のいずれにも見出されない残基を含み得る。タンパク質の任意のさらなる領域（例えば、Ｆｃ領域）は、一般にヒトである。ヒト化は、当該分野で公知の方法、例えば米国特許第５２２５５３９号明細書、米国特許第６０５４２９７号明細書、米国特許第７５６６７７１号明細書又は米国特許第５５８５０８９号明細書を使用して実施することができる。用語「ヒト化タンパク質」はまた、例えば、米国特許第７７３２５７８号明細書に記載されるような超ヒト化タンパク質（ｓｕｐｅｒ−ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）も包含する。

【0151】

本開示のタンパク質は、ヒトタンパク質であってもよい。本明細書で使用される「ヒトタンパク質」という用語は、ヒトにおいて、例えばヒト生殖系列又は体細胞において見出される可変、及び任意に定常抗体領域を有する、又はそのような領域を用いて作製されたライブラリー由来のタンパク質を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によってコードされていないアミノ酸残基、インビトロでのランダム又は部位特異的変異（特にタンパク質の少数の残基、例えばタンパク質の１、２、３、４又は５残基における、保存的置換又は変異を含む変異）によって導入される変異を含むことができる。これらの「ヒト抗体」は、必ずしもヒトの免疫応答の結果として生成する必要はなく、組換え手段（例えば、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング）、及び／又はヒト抗体定常領域及び／又は可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物によって（例えば、マウス）、及び／又はガイドされた選択を使用して（例えば、又は米国特許第５５６５３３２号明細書に記載されているように）、生成され得る。この用語はまた、そのような抗体の親和性成熟形態も包含する。本開示の目的のために、ヒトタンパク質はまた、１以上のＣＤＲが、例えば米国特許第６３０００６４号明細書及び／又は米国特許第６２４８５１６号明細書に記載されているようにランダム若しくはセミランダムである、ヒト抗体由来のＦＲ、又はヒトＦＲのコンセンサス配列由来の配列を含むＦＲを含むタンパク質を含むと考えられる。

【0152】

本開示のタンパク質は、合成ヒト化タンパク質であってもよい。用語「ヒト化タンパク質（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」は、国際公開第２００７／０１９６２０号に記載の方法によって調製されたタンパク質を指す。合成ヒト化タンパク質は、抗体の可変領域を含み、ここで可変領域は、新世界霊長類（Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ ｐｒｉｍａｔｅ）抗体可変領域由来のＦＲ及び非新世界霊長類（ｎｏｎ−Ｎｅｗ Ｗｏｒｌｄ ｐｒｉｍａｔｅ）抗体可変領域由来のＣＤＲを含む。例えば、合成ヒト化タンパク質は、抗体の可変領域を含み、ここで可変領域は、新世界霊長類抗体可変領域由来のＦＲ及びマウス若しくはラット抗体由来のＣＤＲを含む。

【0153】

本開示のタンパク質は、霊長類化タンパク質であってもよい。「霊長類化タンパク質（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザル）の免疫後に生成される抗体由来の可変領域（単数又は複数）を含む。任意に、非ヒト霊長類抗体の可変領域をヒト定常領域に連結して、霊長類化抗体を産生する。霊長類化抗体を産生するための例示的な方法は、米国特許第６１１３８９８号明細書に記載されている。

【0154】

一例において、本開示のタンパク質は、キメラタンパク質である。「キメラタンパク質」という用語は、抗原結合ドメインが特定の種（例えば、マウス又はラットのようなネズミ）又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属するタンパク質であって、タンパク質の残りの部分は他の種（例えば、ヒト又は非ヒト霊長類など）に由来するタンパク質又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属するタンパク質であるものを指す。一例において、キメラタンパク質は、非ヒト抗体（例えばマウス抗体）由来のＶ_H及び／又はＶ_Lを含み、抗体の残りの領域はヒト抗体由来であるキメラ抗体である。そのようなキメラタンパク質の産生は、当技術分野で公知であり、標準的な手段（例えば、米国特許第６３３１４１５号明細書；米国特許第５８０７７１５号明細書；米国特許第４８１６５６７号明細書及び米国特許第４８１６３９７号明細書に記載されている）によって達成され得る。

【0155】

本開示はまた、例えば国際公開第２０００／３４３１７号及び国際公開第２００４／１０８１５８号に記載されるような脱免疫化タンパク質も企図する。脱免疫された抗体及びタンパク質は、１つ又は複数のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープ又はＴ細胞エピトープが除去されている（すなわち変異している）ことにより、対象が抗体又はタンパク質に対する免疫応答を起こす可能性を低減する。

抗体可変領域を含む他のタンパク質

【0156】

本開示はまた、以下のような抗体の可変領域又は抗原結合ドメインを含む他のタンパク質を企図する：
（ｉ）抗体のＶ_H又はＶ_Lの全部又は一部を含む単一ポリペプチド鎖である、単一ドメイン抗体（例えば、米国特許第６２４８５１６号明細書を参照）；
（ｉｉ）ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ（例えば米国特許第５８４４０９４号明細書及び／又は米国特許出願公開第２００８１５２５８６号に記載されているような）；
（ｉｉｉ）ｓｃＦｖ（例えば米国特許第５２６０２０３号明細書に記載されているような）；
（ｉｖ）ミニボディ（例えば米国特許第５８３７８２１号明細書に記載されているような）；
（ｖ）「キー及びホール（ｋｅｙ ａｎｄ ｈｏｌｅ）」二重特異性タンパク質（米国特許第５７３１１６８号明細書に記載されるような）；
（ｖｉ）ヘテロコンジュゲートタンパク質（例えば米国特許第４６７６９８０号明細書に記載されているような）；
（ｖｉｉ）例えば米国特許第４６７６９８０号明細書に記載されているような、化学的架橋剤を用いて産生されたヘテロコンジュゲートタンパク質；
（ｖｉｉｉ）Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント（例えば、Ｓｈａｌａｂｙ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：２１７−２２５，１９９２に記載されるような）；又は
（ｉｘ）Ｆａｂ₃（例えば、ＥＰ１９９３０３０２８９４に記載のような）。

定常ドメイン融合

【0157】

本開示は、抗体の可変領域及び定常領域又はＦｃ又はそのドメイン、例えばＣ_H２及び／又はＣ_H３ドメイン、を含むタンパク質を包含する。適切な定常領域及び／又はドメインは当業者には明らかであり、及び／又はこのようなポリペプチドの配列は公的に入手可能なデータベースから容易に入手可能である。Ｋａｂａｔらはまた、いくつかの好適な定常領域／ドメインの記載を提供する。

【0158】

定常領域及び／又はそのドメインは、二量体化、例えばＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に結合することによる血清半減期の延長、抗原依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗原依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）などの、生物学的活性を提供するために有用である。

【0159】

本開示はまた、変異型定常領域又はドメインを含むタンパク質を企図する（例えば、米国特許第７２１７７９７号明細書；米国特許第７２１７７９８号明細書；又は米国特許出願公開第２００９００４１７７０号（増加した半減期を有する）、或いは、米国特許出願公開第２００５０３７０００号（増加したＡＤＣＣ）に記載されているような）。

安定化タンパク質

【0160】

本開示の中和タンパク質は、ＩｇＧ４定常領域又は安定化ＩｇＧ４定常領域を含み得る。「安定化された（ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）ＩｇＧ４定常領域」という用語は、Ｆａｂアーム交換、半抗体（ｈａｌｆ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）のＦａｂアーム交換若しくは形成を生じる傾向、又は半抗体を形成する傾向を減少させるために改変されたＩｇＧ４定常領域を意味すると理解される。「Ｆａｂアーム交換（Ｆａｂ ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ）」とは、ＩｇＧ４重鎖及び結合された軽鎖（半分子）が、別のＩｇＧ４分子由来の重鎖−軽鎖対と交換されている、ヒトＩｇＧ４のタンパク質改変の一種を指す。従って、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを獲得し得る（その結果、二重特異性分子が得られる）。Ｆａｂアーム交換は、インビボで自然に起こり、精製血球又は還元型グルタチオンなどの還元剤によってインビトロで誘導することができる。「半抗体（ｈａｌｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、ＩｇＧ４抗体が解離してそれぞれ単一の重鎖及び単一の軽鎖を含む２つの分子を形成する場合に形成される。

【0161】

一例において、安定化されたＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔの系（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８７ ａｎｄ／ｏｒ １９９１）に従って、位置２４１のヒンジ領域のプロリンを含む。この位置は、ＥＵナンバリングシステムによるヒンジ領域の位置２２８に対応する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，２００１ ａｎｄ Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５，１９６９）。ヒトＩｇＧ４では、この残基は、一般にセリンである。プロリンに対するセリンの置換後、ＩｇＧ４ヒンジ領域は配列ＣＰＰＣを含む。これに関して、当業者は、「ヒンジ領域」が、抗体の２つのＦａｂアーム上に可動性を付与するＦｃ領域及びＦａｂ領域を連結する抗体重鎖定常領域のプロリンリッチ部分であることを認識するであろう。ヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。それは、一般に、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムに従って、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３への伸長として定義される。重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することによって、他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域をＩｇＧ１配列と整列させることができる（例えば国際公開第２０１０／０８０５３８号を参照）。

追加のタンパク質ベースＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達阻害剤

【0162】

ＶＥＧＦ−Ｂとその受容体との生産的相互作用を妨害し得る他のタンパク質には、変異型ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質が含まれる。

【0163】

一例では、阻害剤は、ＶＥＧＦ−Ｂに結合する（及び、例えば、ＶＥＧＦ−Ａに実質的に結合しない）ＶＥＧＦ−Ｒ１の１つ以上のドメインを含む可溶性タンパク質である。一例では、可溶性タンパク質は、ＩｇＧ１抗体などの、抗体の定常領域をさらに含む。例えば、可溶性タンパク質は、抗体のＦｃ領域、及び任意に抗体（例えばＩｇＧ１抗体）のヒンジ領域、をさらに含む。

【0164】

一例において、タンパク質阻害剤は、抗体模倣物、例えば、抗体に類似した様式で標的タンパク質に結合する可変領域を含むタンパク質スキャフォールド（ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃａｆｆｏｌｄ）である。例示的な抗体模倣物の説明は、以下の通りである。

免疫グロブリン及び免疫グロブリンフラグメント

【0165】

本開示の化合物の例は、免疫グロブリンの可変領域、例えば、Ｔ細胞受容体又は重鎖免疫グロブリン（例えば、ＩｇＮＡＲ、ラクダ科動物抗体（ｃａｍｅｌｉｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ））を含むタンパク質である。

重鎖免疫グロブリン

【0166】

重鎖免疫グロブリンは、重鎖を含むが軽鎖を含まない限りにおいて、免疫グロブリン（例えば、抗体）の多くの他の形態とは構造的に異なる。従って、これらの免疫グロブリンは、「重鎖のみ抗体（ｈｅａｂｙ ｃｈａｉｎ ｏｎｌｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」とも呼ばれる。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類において見出される（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）。

【0167】

天然に存在する重鎖免疫グロブリンに存在する可変領域は、従来の４鎖（４−ｃｈａｉｎ）抗体に存在する重鎖可変領域（「Ｖ_Hドメイン」と称される）及び従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変領域（「Ｖ_Lドメイン」と称される）と区別するために、一般的には、ラクダ科動物Ｉｇでは「Ｖ_HHドメイン」及びＩｇＮＡＲ中ではＶ−ＮＡＲと呼ばれる。

【0168】

重鎖免疫グロブリンは、関連抗原に高親和性でかつ高い特異性で結合するためには、軽鎖の存在を必要としない。これは、単一ドメイン結合フラグメントが、発現が容易であり、一般に安定で可溶性である、重鎖免疫グロブリンに由来し得ることを意味する。

【0169】

ラクダ科動物由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域、並びにその産生及び／又は単離及び／又は使用のための方法の一般的な記載は、とりわけ、以下の参考文献：国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９７／４９８０５号及び国際公開第９７／４９８０５号に見出される。

【0170】

軟骨魚類由来の重鎖免疫グロブリン及びその可変領域、並びにそれらの産生及び／又は単離及び／又は使用のための方法の一般的な説明は、とりわけ、国際公開第２００５／１１８６２９号に見出される。

Ｖ様（Ｖ−Ｌｉｋｅ）タンパク質

【0171】

本開示の化合物の例は、Ｔ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体は、抗体のＦｖモジュールと同様の構造に結合する２つのＶドメインを有する。Ｎｏｖｏｔｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８６４６−８６５０，１９９１は、いかにしてＴ細胞受容体の２つのＶドメイン（アルファ及びベータと呼ばれる）を融合させて、一本鎖ポリペプチドとして発現させることができ、そしてさらに、抗体ｓｃＦｖに直接類似した疎水性を減少させるために表面残基をどのように改変するか、について記載している。２つのＶα及びＶβドメインを含む一本鎖Ｔ細胞受容体又は多量体Ｔ細胞受容体の産生を記載する他の刊行物には、国際公開第１９９９／０４５１１０又は国際公開第２０１１／１０７５９５が含まれる。

【0172】

抗原結合ドメインを含む他の非抗体タンパク質には、一般に単量体であるＶ様ドメインを有するタンパク質が含まれる。そのようなＶ様ドメインを含むタンパク質の例には、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８及びＩＣＯＳが含まれる。このようなＶ様ドメインを含むタンパク質のさらなる開示は、国際公開第１９９９／０４５１１０に含まれる。

アドネクチン（Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ）

【0173】

一例において、本開示の化合物は、アドネクチンである。アドネクチンは、ループ領域が抗原結合を与えるように改変されている、ヒトフィブロネクチンの１０番目のフィブロネクチンＩＩＩ型（¹⁰Ｆｎ３）ドメインをベースにしている。例えば、¹⁰Ｆｎ３ドメインのβサンドイッチの一端の３つのループは、アドネクチンが抗原を特異的に認識することを可能にするように設計され得る。さらなる詳細については、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号明細書又は国際公開第２００５／０５６７６４号を参照されたい。

アンチカリン（Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ）

【0174】

さらなる例において、本開示の化合物は、アンチカリンである。アンチカリンは、ステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質などの小さな疎水性分子を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである、リポカリンに由来する。リポカリンは、抗原に結合するように設計され得る円錐構造の開放端に複数のループを有する、強固なβシート二次構造を有する。そのような設計されたリポカリンは、アンチカリンとして知られている。アンチカリンのさらなる説明については、米国特許第７２５０２９７Ｂ１又は米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。

アフィボディ

【0175】

さらなる例において、本開示の化合物は、アフィボディである。アフィボディは、抗原に結合するように設計され得る、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡのＺドメイン（抗原結合ドメイン）に由来するスキャフォールドである。Ｚドメインは、約５８個のアミノ酸の３つのらせん状束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって生成されている。さらなる詳細については、欧州特許第１６４１８１８号明細書を参照されたい。

アビマー（Ａｖｉｍｅｒｓ）

【0176】

さらなる例において、本開示の化合物は、アビマー（Ａｖｉｍｅｒ）である。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリー由来のマルチドメインタンパク質である。約３５アミノ酸の天然ドメインは、規定されたジスルフィド結合構造をとる。多様性（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）は、Ａドメインのファミリーによって示される自然の変種（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）をシャッフルすることによって生成される。さらなる詳細については、国際公開第２００２０８８１７１号を参照されたい。

ＤＡＲＰｉｎｓ

【0177】

さらなる例において、本開示の化合物は、設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）である。ＤＡＲＰｉｎは、内在性膜タンパク質（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）の細胞骨格への付着を媒介するタンパク質ファミリーであるアンキリン（Ａｎｋｙｒｉｎ）に由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのαヘリックスとβターンからなる３３残基のモチーフである。それらは、各リピートの最初のαヘリックス及びβターンの残基をランダム化することによって、異なる標的抗原に結合するように設計され得る。それらの結合界面は、モジュールの数を増加させることによって増加させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号明細書を参照されたい。

タンパク質の生産方法
組換え発現

【0178】

組換えタンパク質の場合、組換えタンパク質をコードする核酸を発現ベクターにクローニングすることができ、次いでそれを宿主細胞、例えば、抗体を別に産生しない大腸菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、又はサルＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又は骨髄腫細胞にトランスフェクトされる。本開示のタンパク質を発現するために使用される例示的な細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞又はＨＥＫ細胞である。これらの目的を達成するための分子クローニング技術は当該分野で公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編者），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８，現在までの全ての改訂版を含む）、又はＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。多種多様なクローニング及びインビトロ増幅法は、組換え核酸の構築に適している。組換え抗体を産生する方法も当技術分野で公知である。米国特許第４８１６５６７号明細書又は米国特許第５５３０１０１号明細書を参照のこと。

【0179】

単離後、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は無細胞系若しくは細胞における発現のために、核酸が、発現構築物又は発現ベクター中のプロモーターに作動可能に連結されて挿入される。

【0180】

本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、その最も広い意味で取られ、例えば、発生の及び／又は外部の刺激に応答して、又は組織特異的様式で、核酸の発現を変化させるさらなる調節エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー及びサイレンサー）を伴う又は伴わず、正確な転写開始に必要なＴＡＴＡボックス又は開始因子エレメントを含むゲノム遺伝子の転写調節配列を含む。本文脈において、用語「プロモーター」はまた、作動可能に連結される核酸の発現を付与、活性化又は増強する組換え、合成又は融合核酸、又は誘導体を記載するためにも使用される。例示的なプロモーターは、前記核酸の発現をさらに増強するための、並びに／又は前記核酸の空間的発現及び／若しくは一時的発現を変化させるための、１つ又は複数の特異的調節エレメントのさらなるコピーを含むことができる。

【0181】

本明細書中で使用される場合、用語「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ）」とは、核酸の発現がプロモーターによって制御されるように、核酸にプロモーターを配置することを意味する。

【0182】

細胞における発現のための多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、一般に、以下の１つ以上を含むが、これに限定されない：シグナル配列、抗体をコードする配列（例えば、本明細書で提供される情報に由来する）、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。当業者は、抗体の発現に適した配列を知っているであろう。例示的なシグナル配列は、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、又は熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、α因子リーダー又は酸性ホスファターゼリーダー）又は哺乳動物分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）を含む。

【0183】

哺乳動物細胞において活性な例示的プロモーターは、サイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−αプロモーター（ＥＦ１）、小型核ＲＮＡプロモーター（Ｕ１ａ及びＵ１ｂ）、α−ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｍａｊｏｒ ｌａｔｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、β−アクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／β−アクチンプロモーター若しくは免疫グロブリンプロモーター若しくはその活性フラグメントを含むハイブリッド調節エレメントを含む。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞、又は懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；又はチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）である。

【0184】

酵母細胞における、例えば、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及びサッカロマイセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）を含む群から選択される酵母細胞などにおける発現に適した典型的なプロモーターには、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、又はＴＥＦ１プロモーターを含むが、これらに限定されない。

【0185】

単離された核酸又はそれを含む発現構築物を、発現のために細胞に導入するための手段は、当業者に公知である。所与の細胞に使用される技法は、既知の成功した技法に依存する。組換えＤＮＡを細胞に導入するための手段には、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、米国）及び／又はセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ、ＭＤ、米国）を使用するなどのリポソームによって媒介されるトランスフェクション、ＰＥＧ媒介ＤＮＡ取り込み、エレクトロポレーション及びＤＮＡコーティングしたタングステン若しくは金粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ Ｉｎｃ．、ＷＩ、米国）などを使用するなどの微粒子衝突を含む。

【0186】

抗体を産生するために使用される宿主細胞は、使用される細胞のタイプに依存して、様々な培地中で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ Ｆｌ０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（（ＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ））、ＲＰＭ１−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ変法イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、哺乳類細胞の培養に適している。本明細書で論じる他の細胞タイプを培養するための方法は、当技術分野で公知である。

タンパク質の精製

【0187】

産生／発現後、本開示のタンパク質は、当該分野で公知の方法を用いて精製される。そのような精製は、非特異的タンパク質、酸、脂質、炭水化物などを実質的に含まない本開示のタンパク質を提供する。一例では、タンパク質は、調製物中のタンパク質の約９０％超（例えば、９５％、９８％又は９９％）が本開示のタンパク質である調製物中に存在する。

【0188】

ペプチド生成の標準的な方法は、本開示の単離されたタンパク質を得るために採用され、限定されないが、様々な高圧（又は高速）液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び非ＨＰＬＣポリペプチド単離プロトコル、例えば分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、相分離法（ｐｈａｓｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ）、電気泳動分離、沈殿法、塩析イン／アウト法（ｓａｌｔｉｎｇ ｉｎ／ｏｕｔ ｍｅｔｈｏｄｓ）、イムノクロマトグラフィー法、及び／又は他の方法が含まれる。

【0189】

一例において、アフィニティー精製は、標識を含む融合タンパク質を単離するために有用である。アフィニティークロマトグラフィーを使用してタンパク質を単離する方法は、当技術分野で公知であり、例えばＳｃｏｐｅｓ（Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９９４）に記載されている。例えば、標識に結合する抗体又は化合物（ポリヒスチジンタグの場合、これは、例えばニッケル−ＮＴＡであり得る）は、固体支持体上に固定化される。次いで、タンパク質を含む試料を、結合が起こるのに十分な時間及び条件下で、固定された抗体又は化合物に接触させる。未結合又は非特異的に結合したタンパク質を洗浄するために洗浄した後、タンパク質は溶出される。

【0190】

抗体のＦｃ領域を含むタンパク質の場合、プロテインＡ又はプロテインＧ又はその改変形態をアフィニティー精製に使用することができる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖Ｆｃ領域を含む精製タンパク質を単離するのに有用である。プロテインＧは全てのマウスＦｃアイソタイプ及びヒトγ３に推奨される。

核酸ベースＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達阻害剤

【0191】

本開示の一例では、本開示の任意の実施例による本明細書に記載の治療及び／又は予防方法は、ＶＥＧＦ−Ｂの発現を減少させることを含む。例えば、このような方法は、核酸の転写及び／又は翻訳を減少させる化合物を投与することを含む。一例では、化合物は、核酸、例えば、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＰＮＡ、干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡである。

アンチセンス核酸

【0192】

「アンチセンス核酸」という用語は、本開示の任意の例において本明細書に記載されるポリペプチドをコードする特異的ｍＲＮＡ分子の少なくとも一部に相補的であって、ｍＲＮＡ翻訳のような転写後事象を妨害することができるＤＮＡ又はＲＮＡ又はその誘導体（例えば、ＬＮＡ又はＰＮＡ）、又はその組み合わせを意味すると解釈されるべきである。アンチセンス法の使用は、当技術分野で公知である（例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ ａｎｄ Ｅｎｄｒｅｓ（編者）、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ、Ｋｌｕｗｅｒ（１９９９）参照）。

【0193】

本開示のアンチセンス核酸は、生理学的条件下で標的核酸にハイブリダイズする。アンチセンス核酸は、構造遺伝子又はコード領域に対応する配列、又は遺伝子発現若しくはスプライシングを制御する配列に対応する配列を含む。例えば、アンチセンス核酸は、ＶＥＧＦ−Ｂ、又は５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）又は３’−ＵＴＲ又はこれらの組み合わせをコードする核酸の標的コード領域に対応してもよい。それは転写中又は転写後に、例えば標的遺伝子のエキソン配列にのみスプライスされ得るイントロン配列に部分的に相補的であってもよい。アンチセンス配列の長さは、例えばＶＥＧＦ−Ｂをコードする核酸の少なくとも１９個の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも５０個のヌクレオチド、少なくとも１００、２００、５００又は１０００ヌクレオチドであるべきである。全遺伝子転写物に相補的な全長配列が使用されてもよい。長さは１００〜２０００ヌクレオチドであり得る。標的転写物に対するアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも９０％、例えば９５〜１００％であるべきである。

【0194】

ＶＥＧＦ−Ｂに対する例示的なアンチセンス核酸は、例えば国際公開第２００３／１０５７５４号に記載されている。

触媒核酸

【0195】

「触媒核酸（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）」という用語は、明確な基質を特異的に認識し、この基質の化学修飾を触媒する、ＤＮＡ分子若しくはＤＮＡ含有分子（当該技術分野では「デオキシリボザイム」又は「ＤＮＡザイム（ＤＮＡｚｙｍｅ）」としても知られている）又はＲＮＡ若しくはＲＮＡ含有分子（「リボザイム」又は「ＲＮＡザイム（ＲＮＡｚｙｍｅ）」としても知られる）をいう。触媒核酸中の核酸塩基は、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ（及びＲＮＡの場合はＵ）であり得る。

【0196】

典型的には、触媒核酸は、標的核酸の特異的認識のためのアンチセンス配列、及び核酸切断酵素活性（本明細書では「触媒ドメイン」とも呼ばれる）を含む。本開示において有用なリボザイムのタイプは、ハンマーヘッドリボザイム及びヘアピンリボザイムである。

ＲＮＡ干渉

【0197】

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、特定のタンパク質の産生を特異的に阻害するために有用である。理論によって制限されることなく、この技術は、目的の遺伝子のｍＲＮＡ又はその一部（本件の場合、ＶＥＧＦ−ＢをコードするｍＲＮＡ）と本質的に同一の配列を含むｄｓＲＮＡ分子の存在に依存する。好都合なことに、ｄｓＲＮＡは、組換えベクター宿主細胞中の単一のプロモーターから産生され得、ここで、センス及びアンチセンス配列は、ループ構造を形成する無関係な配列を伴って、センス及びアンチセンス配列がハイブリダイゼーションしてｄｓＲＮＡ分子を形成することを可能にする無関係の配列に隣接する。本開示の適切なｄｓＲＮＡ分子の設計及び産生は、特に国際公開第９９／３２６１９号、国際公開第９９／５３０５０号、国際公開第９９／４９０２９号及び国際公開第０１／３４８１５号を考慮すると、当業者の能力の範囲内である。

【0198】

ハイブリダイズするセンス配列及びアンチセンス配列の長さはそれぞれ、少なくとも１９の連続したヌクレオチド、例えば、少なくとも３０又は５０ヌクレオチド、例えば少なくとも１００、２００、５００又は１０００ヌクレオチドであるべきである。全遺伝子転写物に対応する全長配列を使用してもよい。長さは、１００〜２０００ヌクレオチドであり得る。標的とされる転写物に対するセンス配列及びアンチセンス配列の同一性の程度は、少なくとも８５％、例えば少なくとも９５％、例えば９５〜１００％であるべきである。

【0199】

例示的な低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）分子は、標的ｍＲＮＡの約１９〜２１個の連続したヌクレオチドと同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、ｓｉＲＮＡ配列は、ジヌクレオチドＡＡで始まり、約３０〜７０％（例えば、３０〜６０％、例えば４０〜６０％、例えば約４５〜５５％）のＧＣ含有量を含み、それが導入される哺乳動物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列に対して、例えば標準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定されるように、高いパーセンテージ同一性を有さないものである。ＶＥＧＦ−Ｂの発現を低下させる典型的なｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ又はＮｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから市販されている。

【0200】

ＶＥＧＦ−Ｂの発現を低下させる短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）も当技術分野で公知であり、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販されている。

スクリーニングアッセイ

【0201】

ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、例えば、以下に記載するように、当該分野で公知の技術を用いて同定することができる。同様に、本明細書に記載の方法での使用に適したＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達阻害剤の量は、例えば以下に記載するように、当技術分野で公知の技術を用いて決定又は推定することができる。

中和アッセイ

【0202】

ＶＥＧＦ−Ｂに結合し、シグナル伝達を阻害する化合物については、中和アッセイを使用することができる。

【0203】

一例では、中和アッセイは、検出可能に標識された可溶性ＶＥＧＦ−Ｒ１の存在下若しくは非存在下で、ＶＥＧＦと化合物とを接触させること、或いは、ＶＥＧＦ−Ｒ１を発現する細胞若しくは可溶性ＶＥＧＦ−Ｒ１の存在下又は非存在下で、検出可能に標識されたＶＥＧＦ−Ｂと化合物とを接触させること、を含む。次いで、ＶＥＧＦ−Ｒ１に結合したＶＥＧＦ−Ｂのレベルを評価する。化合物の非存在下と比較した、化合物の存在下での結合したＶＥＧＦ−Ｂのレベル低下は、化合物がＶＥＧＦ−Ｒ１とＶＥＧＦ−Ｂの結合を阻害し、結果としてＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害することを示す。

【0204】

別の中和アッセイは、国際公開第２００６／０１２６８８に記載されており、固体支持体上に固定化された第二のＩｇ様ドメインを含むＶＥＧＦ−Ｒ１のフラグメントを、化合物とプレインキュベートした組換えＶＥＧＦ−Ｂの亜飽和濃度と接触させることを含む。未結合タンパク質を除去するために洗浄した後、固定化されたタンパク質を抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体と接触させ、結合した抗体の量（固定化したＶＥＧＦ−Ｂの指標）を決定する。化合物の非存在下でのレベルと比較した結合抗体のレベルを低下させる化合物は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達の阻害剤と考えられる。

【0205】

別の例では、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物は、増殖することについてＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達に依存する細胞、例えば、ヒトエリスロポエチン受容体の細胞内ドメイン及びＶＥＧＦ−Ｒ１の細胞外ドメインを含むキメラ受容体を発現するために、国際公開第２００６／０１２６８８に記載のように改変されたＢａＦ３細胞を用いて同定される。細胞は、ＶＥＧＦ−Ｂの存在下、かつ、化合物の存在下又は非存在下で培養される。次に、標準的な方法、例えばコロニー形成アッセイ、チミジン取り込み又は細胞増殖の別の適切なマーカー（例えば、ＭＴＳ色素還元アッセイ）の取り込みを使用して、細胞増殖は評価される。ＶＥＧＦ−Ｂの存在下での増殖レベルを低下させる化合物は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達の阻害剤と考えられる。

【0206】

化合物は、標準的な方法を用いてＶＥＧＦ−Ｂに結合する能力についても評価することができる。タンパク質への結合を評価するための方法は、例えばＳｃｏｐｅｓ（Ｉｎ：Ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９９４）に記載されているように、当技術分野で公知である。そのような方法は、一般に、化合物を標識し、固定化したＶＥＧＦ−Ｂと接触させることを含む。非特異的に結合した化合物を除去するために洗浄した後、標識の量及び結果として結合した化合物が検出される。もちろん、化合物を固定化し、ＶＥＧＦ−Ｂ標識することができる。パンニング型アッセイもまた使用することができる。あるいは、又はさらに、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することができる。

発現アッセイ

【0207】

ＶＥＧＦ−Ｂの発現を低減又は防止する化合物は、細胞を化合物と接触させ、ＶＥＧＦ−Ｂの発現レベルを決定することによって同定される。核酸レベルでの遺伝子発現を決定するための適切な方法は、当該分野で公知であり、例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）又はマイクロアレイアッセイを含む。タンパク質レベルでの発現を決定するための適切な方法はまた、当技術分野で公知であり、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、免疫蛍光又はウェスタンブロッティングを含む。

インビボアッセイ

【0208】

本明細書に記載の化合物は、動物モデルにおける活性について試験することができる。一例では、動物モデルは、代謝機能不全及び高血糖のモデルである。例えば、食餌誘発肥満（ＤＩＯ）マウスモデルである。これは、十分に確立された実験的例（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐａｒａｄｉｇｍ）であり、マウスは、インスリン感受性及びグルコース取り込みの低下の障害と関連する末梢組織における過度又は異所性の脂質沈着を発症し、マウスは肥満、高インスリン血症、高血糖、脂質異常症及び高血圧を示す（Ｈａｒｂｅｒｇ，Ｃ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４９０，４２６−４３０；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｙｓｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ８１，２４３−２４８）。

【0209】

非ヒト動物対象において虚血性脳卒中を誘発するための様々な既知の技術が存在し、例えば、大動脈／大静脈閉塞、外頚部結紮（ｅｘｔｅｍａｌ ｎｅｃｋ ｔｏｒｎｉｑｕｅｔ）若しくはカフ（ｃｕｆｆ）、出血若しくは低血圧、頭蓋内圧亢進若しくは総頸動脈閉塞、２血管閉塞（ｔｗｏ−ｖｅｓｓｅｌ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）及び低血圧、４血管閉塞（ｆｏｕｒ−ｖｅｓｓｅｌ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、片側総頚動脈閉塞（ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）（一部の種のみ）、エンドセリン−１誘発動脈及び静脈狭窄、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）、自然発症の脳梗塞（高血圧ラットで自発的に）、マクロ球塞栓術、血栓塞栓術又は微小球塞栓術である。出血性脳卒中は、コラゲナーゼを脳内に注入することによってモデル化することができる。

【0210】

一例では、脳卒中のモデルは、以前にＳｕ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００８；１４：７３１−７３７に記載されているように、虚血性脳卒中を生じる、中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）を含む。

医薬組成物及び治療方法

【0211】

ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物（別名、活性成分）は、予防的又は治療的処置のために、非経口、局所、経口又は局所投与、エアロゾル投与、又は経皮投与に有用である。一例において、化合物は、非経口的に、例えば皮下又は静脈内に投与される。

【0212】

投与される化合物の製剤は、選択される投与経路及び製剤（例えば、溶液、エマルジョン、カプセル）に応じて変化する。投与すべき化合物を含む適切な医薬組成物は、生理学的に許容される担体中に調製され得る。溶液又はエマルションの場合、適切な担体としては、例えば、生理食塩水及び緩衝媒体を含む、水性又はアルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液が挙げられる。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンガー又は固定油を含み得る。水、緩衝化水、緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液及びグリシンを含む、様々な適切な水性担体が当業者に知られている。静脈内ビヒクルは、様々な添加剤、防腐剤、又は液体、栄養素又は電解質補充剤を含むことができる（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ，Ｅｄ．１９８０を参照のこと）。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤及び毒性調整剤、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムのような生理学的条件に近づけるのに必要とされる医薬的に許容される補助物質を任意に含み得る。化合物は、当技術分野で知られている凍結乾燥及び再構成技術に従って、保存のために凍結乾燥され、使用する前に適当な担体中で再構成することができる。

【0213】

選択された培地中の活性成分（単数又は複数）の最適濃度は、当業者に公知の手順に従って経験的に決定することができ、所望の最終的な医薬製剤に依存する。

【0214】

本開示の化合物の投与のための投与量範囲は、所望の効果を生じるのに十分なものである。例えば、組成物は、治療上又は予防上有効な量の化合物を含む。

【0215】

本明細書中で使用される場合、用語「有効量」は、対象におけるＶＥＧＦ−Ｂのシグナル伝達を阻害／低減／予防するのに十分な量の化合物を意味すると解釈されるものとする。当業者は、そのような量は、例えば、化合物及び／又は特定の対象及び／又は治療される脳卒中の種類及び／又は重症度に依存して変化することを認識するであろう。従って、この用語は、本開示を特定の量、例えば化合物の重量又は数に限定するように解釈されるべきではない。

【0216】

本明細書中で使用される場合、用語「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、脳卒中の１つ以上の症状を軽減又は阻害するのに十分な量の化合物を意味すると解釈される。

【0217】

本明細書中で使用される場合、用語「予防有効量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、脳卒中の１つ以上の検出可能な症状の発症を予防又は阻害又は遅延させるのに十分な量の化合物を意味すると解釈される。

【0218】

一例では、化合物は、以下の効果の１つ以上を有するのに有効な量で投与される：
・ 血液脳関門の損傷を軽減する、又は予防する；
・ 脳の血管透過性を低下させる、又は予防する；
・ 脳の梗塞サイズを縮小させる、又は予防する；及び／又は
・ 頭蓋内出血を軽減する、又は予防する。

【0219】

投薬量は、過粘稠度症候群、肺水腫、鬱血性心不全などの有害な副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般に、投薬量は、患者の年齢、状態、性別及び疾患の程度によって変化し、当業者によって決定され得る。投薬量は、合併症の場合には、個々の医師が調整することができる。

【0220】

投与量は、１日又は複数日に１回又は複数回の投与において、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇに変えることができる。

【0221】

いくつかの例では、化合物は、その後（維持用量（ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｄｏｓｅｓ））より高い初期（又は負荷）用量にて投与される。例えば、化合物は、約１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの初期用量で投与される。次いで、化合物は、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇの維持用量で投与される。維持用量は、７日〜３５日ごと、例えば、１４日又は２１日又は２８日ごとに投与されてもよい。

【0222】

いくつかの例では、用量漸増法（ｄｏｓｅ ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅ）が使用され、化合物は、その後の用量で使用されるよりも低い用量で最初に投与される。この投薬計画は、対象が最初に罹患した有害事象の場合に有用である。

【0223】

治療に十分に応答していない対象の場合、１週間に複数の用量が投与されてもよい。あるいは、又はそれに加えて、増加する用量が投与されてもよい。

【0224】

一例では、本開示の化合物（単数又は複数）は、現在使用されているか、又は脳卒中の予防又は治療のために開発中の少なくとも１つの追加の既知の化合物と組み合わせて使用される。このような既知の化合物の例には、組織プラスミノーゲンアクチベーター（例えば、アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ）、アニストレプラーゼ、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼ、ラノテプラーゼ、デスモテプラーゼ及びスタフィロキナーゼなどの一般的な血栓溶解剤が含まれるが、これらに限定されない。

【0225】

さらに、本開示の方法は、これらに限定されないが、異常脂質血症、高血圧、肥満、神経障害及び／又は網膜症などを含む、脳卒中に直接的又は間接的に関連する他の疾患の治療のための少なくとも１つの他の治療剤の同時投与を含んでもよい。本発明の化合物（単数又は複数）と同時投与することができる薬剤のさらなる例は、コルチコステロイド；免疫抑制薬；抗生物質；抗高血圧及び利尿薬（例えばＡＣＥ阻害薬）；胆汁捕捉レジン（ｂｉｌｅ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ ｒｅｓｉｎ）、コレスチラミン、ニコチン酸、及びとりわけコレステロール及びトリグリセリドを減少させるために使用される剤（ｄｒｕｇｓ）及び薬剤（ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ）などの脂質低下剤（例えば、フィブラート（例えば、ジェムフィブロジル（商標））及び、ロバスタチン（商標）、アトルバスタチン（商標）、フルバスタチン（商標）、レスコール（商標）、リピトール（商標）、メバコール（Ｍｅｖａｃｏｒ）（商標）、プラバコール（Ｐｒａｖａｃｈｏｌ）（商標）、プラバスタチン（Ｐｒａｖａｓｔａｔｉｎ）（商標）、シンバスタチン（Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）（商標）、ゾコー（Ｚｏｃｏｒ）（商標）、セリバスタチン（Ｃｅｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）（商標）などのＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤）；脂質の腸内吸収を阻害する化合物（例えば、エゼチミンデ（ｅｚｅｔｉｍｉｎｄｅ））；ニコチン酸；ビタミンＤ、である。

【0226】

上記から明らかなように、本開示は、対象の併用治療的処置（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）の方法を提供するものであり、それを必要とする対象に、有効量の第１の化合物及び第２の化合物を投与することを含み、ここで、前記薬剤は、本開示の化合物（すなわち、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達阻害剤）であり、第２の薬剤は、脳卒中の予防又は治療のためのものである。

【0227】

本明細書で使用される場合、「併用治療（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という語句中のように、「併用（ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ）」という用語は、第２の薬剤の存在下で第１の薬剤を投与することを含む。併用治療的処置方法は、第１、第２、第３又は追加の薬剤を同時投与する方法を含む。併用治療的処置方法はまた、第１の又は追加の薬剤を、第２又は追加の薬剤の存在下で投与する方法を含み、ここで、第２又は追加の薬剤は、例えば、以前に投与されていてもよい。併用治療的処置方法は、異なる行為者によって段階的に実施されてもよい。例えば、ある行為者が第１の薬剤（ａｇｅｎｔ）を対象に投与するものであり、第２の行為者が対象に第２の薬剤を投与してもよく、第１の薬剤（及び／又は追加の薬剤）が第２の薬剤（及び／又は追加の薬剤）の存在下での投与後である限り、投与工程は、同時に又はほぼ同じ時間に、又は離れた時間に実行されてもよい。行為者と対象は同じ実体（ｅｎｔｉｔｙ）（例えば、人間）であってもよい。

【0228】

さらなる治療剤の投与時間は、本発明の化合物の投与時間から測定することができる。間隔は、例えば、５分〜２４時間又は４８時間とすることができる。間隔は、例えば、１５分〜６時間、１５分〜４．５時間、１５分〜３時間、１５分〜１時間、３０分〜６時間、又は３０分〜３時間、又は３０分〜４．５時間、又は１〜３時間、又は１〜４．５時間、又は１〜５時間、又は１〜６時間、又は１〜７時間、又は１〜８時間、又は１〜９時間、又は１〜１０時間であってもよい。

【0229】

一例において、本開示はまた、対象における脳卒中の効果を低減する方法、又は脳卒中を治療する方法を提供するものであって、前記方法は、前記対象に血栓溶解剤を投与することを含み、ここで、前記対象は、脳卒中に罹患している対象に、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達阻害剤の投与を受けている、又は（脳卒中の症状の発症後に）以前受けたことがあり、かつ、別の治療を受けている。

キット

【0230】

本開示の別の例は、上記のような脳卒中の治療に有用な化合物を含むキットを提供する。

【0231】

一例において、キットは、（ａ）本明細書に記載のＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物及び／又は本明細書に記載の血栓溶解性化合物を、任意に医薬的に許容される担体若しくは希釈剤中に、含む容器；及び（ｂ）対象の脳卒中の影響を軽減するための指示（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を有する添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）、を含む。

【0232】

本開示のこの実施例によれば、添付文書は、容器上又は、容器に同封される。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されてもよい。容器は、脳卒中の治療に有効な組成物を保持又は含有し、滅菌アクセスポートを備えてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達を阻害する化合物である。ラベル又は添付文書は、提供されている化合物及び他の薬剤の投与量並びに間隔に関する具体的な指針と共に、組成物が、治療に適する対象（例えば、脳卒中を有するか又は発症しやすい患者）を治療するために使用されることを示す。キットはさらに、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及び／又はデキストロース溶液などの医薬的に許容される希釈剤緩衝液を含む容器をさらに含んでもよい。該キットは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針及び注射器を含む、商業的及びユーザーの観点から望ましい他の物質をさらに含み得る。

【0233】

本開示は、以下の非限定的な実施例を含む。

【実施例】

【0234】

実施例１：インビトロでのヒト初代脳由来内皮細胞における脂肪酸取り込みの増加は、グルコース取り込みを減少させた

ＶＥＧＦ−Ｂで刺激された初代内皮細胞は、脂肪酸取り込みを増加させ、グルコース取り込みを減少させた

【0235】

ヒト初代脳微小血管内皮細胞、ＨＢＭＥＣ（継代数＜５）を、３７℃、５％ＣＯ₂で細胞培養インキュベーター中、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む補体パック（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐａｃｋ）を備える内皮基礎培地中にて、２４ウェルプレートで培養した。刺激の６時間前に、ＦＣＳを、脂肪酸を含まないウシ血清アルブミン（ＦＡＦ−ＢＳＡ）で置換することにより、内皮細胞を飢餓状態にした。ビヒクル（対照）、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇（Ｂ１６７）、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆（Ｂ１８６）又は２μｇ／ｍｌの抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体２Ｈ１０を２時間添加することにより、細胞を刺激した。

【0236】

刺激後、ＢＯＤＩＰＹ標識脂肪酸（ＦＡ）又は蛍光グルコースアナログ（２−ＮＢＤＧ）の取り込みを測定した。２−ＮＢＤＧをグルコース取り込みのマーカーとして使用した。細胞をＢＯＤＩＰＹ−Ｃ１２又は２−ＮＢＤＧトレーサーと共に５又は２０分間それぞれインキュベートした。２−ＮＢＤＧを添加する前に、細胞をＫｒｅｂ’ｓ Ｒｉｎｇｅｒ緩衝液で１０分間洗浄して、培養培地由来グルコースを除去した。ＦＡ又はグルコーストレーサーとのインキュベーション後、細胞を洗浄し、画像取得及び定量化の前に固定した。

【0237】

１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｂアイソフォーム（ＶＥＧＦ−Ｂ₁₆₇又はＶＥＧＦ−Ｂ₁₈₆）のいずれかによる刺激は、脂肪酸（ＦＡ）取り込みを有意に増加させ、グルコース取り込みを有意に減少させた。ブロッキングＶＥＧＦ−Ｂ抗体２Ｈ１０単独での処理は、脂肪酸又はグルコース取り込みを有意に変化させなかったが、培養した内皮細胞におけるＶＥＧＦ−Ｂの内因性産生及び分泌を示すＦＡ取り込み及びグルコース取り込みの減少傾向が観察された。

【0238】

これらのデータは、脳血管内皮細胞が、ＦＡ取り込みの増加及びグルコース取り込みの減少を伴ってＶＥＧＦ−Ｂに応答することができ、脂質及びグルコースの取り込みが脳内皮において相互に関連し得ることを示唆している。

【0239】

図１Ａ及び１Ｂは、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質で処置した初代脳由来内皮細胞におけるＦＡ取り込みの増加及びグルコース取り込みの減少を示す。

初代内皮細胞の脂肪酸への暴露は、グルコース取り込みを減少させる

【0240】

ヒト初代内皮細胞を、パルミチン酸ナトリウムとオレイン酸ナトリウム（５０μＭ）の混合物の存在下又は非存在下で２時間又は一晩培養し、その後２−ＮＢＤＧトレーサーに供し、グルコース取り込みについてアッセイした。

【0241】

ＦＡリッチ環境及び脂質負荷に曝された内皮細胞は、インビトロでグルコースを取り込む能力が有意に低下したことを示す。これは、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）モデルなどのように、高脂質環境での内皮細胞が同様に応答し、これはインビボでのＤＩＯの設定において、組織グルコース取り込みの減少につながることを示唆する。

【0242】

図１Ｃは、脂肪酸に暴露された初代内皮細胞におけるグルコース取り込みの減少を示す。脂質負荷に曝された内皮細胞は、グルコースを取り込む能力が有意に低下し、内皮細胞におけるＦＡの曝露及び取り込みが、グルコース取り込みを減少させることを示唆している。

実施例２：食餌誘発性肥満を有するマウスは、血糖レベルが上昇し、虚血性脳卒中の発生率が増加した

食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）を有するマウスは、血糖レベルが上昇した

【0243】

３週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスに、高脂肪食（脂肪から６０％のカロリー）又は低脂肪対照食（通常の餌、脂肪から１０％のカロリー）を１５週間与えた。血中グルコースレベルを安定化させる手段として、２時間にわたり食物を回収した後の日の同時刻における血糖レベルを測定した。尾の先端を切断し、血液一滴を、グルコースメーターを用いて測定した。

【0244】

ＤＩＯマウスは、以前の研究（Ｈａｇｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２０１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｅｈａｖｉｏｒ ２００４）に従って、年齢が一致したマウスと比較して、正常な飼料で血糖レベルの上昇を示した。

【0245】

図２Ａは、ＤＩＯを有するマウスが、年齢が一致したマウスと比較して、正常な飼料で血糖レベルが上昇したことを示す。

ＤＩＯを有するマウスは、より重度の脳卒中を有し、自発的出血及びより大きい梗塞の発生率が増加した

【0246】

３週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、脳虚血（中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデル）を誘発する最低１２週間前に、高脂肪食（脂肪から６０％カロリー）又は低脂肪対照食（通常の飼料、脂肪から１０％カロリー）上に置いた。

【0247】

ＭＣＡＯモデルを用いて脳虚血を誘導するために、マウスを抱水クロラール（４５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、解剖顕微鏡下にしっかりと置いた。左のＭＣＡは開頭術により露出され、レーザードップラーフロープローブは、ＭＣＡの分岐部から１．５ｍｍ背側の中線（ｄｏｒｓａｌ ｍｅｄｉａｎ）の大脳皮質の表面上に置かれた。プローブは、流量計に接続され、連続データ収集プログラムを用いて記録された組織灌流単位（ＴＰＵ）から相対的脳血流（ＣＢＦ）を決定した。３．５ｍＷの５４０ｎｍレーザーをＭＣＡに６ｃｍの距離から当て、ローズベンガル染料（ＲＢ）（５０ｍｇ／ｋｇ）を尾静脈から注入した。安定閉塞は、ＴＰＵが閉塞前レベルの２０％未満に低下し、レーザー中止の１０分以内にリバウンドしない場合に達成された。

【0248】

梗塞体積を測定するために、脳を取り出し、２ｍｍ厚の冠状切片に切断し、４％の２，３，５−トリフェニルテトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）で染色した。脳全体の５つの冠状レベルにおける梗塞領域を同定し、梗塞及び半球体積を測定した。梗塞体積は、対側半球の体積からの非梗塞同側半球の体積を測定し、差し引くことによって計算した。

【0249】

ＤＩＯを有するマウスは、痩せたマウスよりも重度の脳卒中を有し、自発的出血及びより大きな梗塞の発生率が有意に増加した。脳卒中の結果は、ＤＩＯモデルでは、梗塞サイズ及び自発的脳内出血（ＩＣＨ）の発生率の増加の両方において、正常な食餌対照マウスよりも有意に悪かった。

【0250】

図２Ｂ及び２Ｃは、ＤＩＯを有するマウスが、虚血性脳卒中後、脳卒中体積が大きく、出血が増加したことを示している。

ＤＩＯを有するマウスは、脳虚血後にＶＥＧＦ−Ｂ受容体Ｎｒｐ１の発現を有意に増加させた

【0251】

ＤＩＯマウスを上記のようにＭＣＡＯに供した。虚血３時間後に、マウスを灌流し、屠殺し、同一（ｉｐｓｉ−）及び対側半球をホモジェナイズし、全ＲＮＡを調製した。Ｖｅｇｆｂ及びその受容体Ｖｅｇｆｒ１（Ｆｌｔ１）及びニューロピリン−１（Ｎｒｐ１）の転写産物レベルをｑＰＣＲにより定量した。

【0252】

Ｖｅｇｆｂ及びＶｅｇｆｒ１の発現は、非虚血の対側半球と比較して虚血の３時間で有意に増加しなかったが、Ｎｒｐ１の発現がＭＣＡＯの３時間後に虚血半球において、ほぼ３倍に増加したことから、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達が、脳虚血の間に局所的に増加し得ることを示唆している。

【0253】

図２Ｄは、Ｖｅｇｆ−ｂ又はＦｌｔ１発現ではなく、Ｎｒｐ１発現が、虚血性脳卒中後に、ＤＩＯを有するマウスにおいて有意に増加することを示す。

実施例３：中和抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体（２Ｈ１０）による予防的処置は、ＤＩＯを有するマウスにおける虚血性脳卒中の進行を予防する

ＶＥＧＦ−Ｂ拮抗作用は、ＤＩＯを有するマウスの脳におけるグルコース取り込みを改善する

【0254】

Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに通常の飼料（除脂肪（ｌｅａｎ））又は高脂肪飼料（ＤＩＯ）を与え、ＤＩＯマウスをアイソタイプ対照又は抗ＶＥＧＦ−Ｂ ２Ｈ１０抗体（１６ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで週２回３０日間処理し、その後［¹⁸Ｆ］−ＤＧ ＰＥＴイメージングを行った。

【0255】

ＤＩＯは、除脂肪対照マウスと比較して、脳におけるグルコース取り込みを減少させ（標識グルコースアナログを用いて測定した）、ＤＩＯを有するマウスにおけるＶＥＧＦ−Ｂの長期阻害が、脳におけるグルコース取り込みを有意に改善した。これらのデータは、末梢組織と同様に、ＤＩＯに関連する全身代謝障害が、脳が血液からグルコースを取り込む能力を低下させ、ＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達がＤＩＯモデルにおけるＣＮＳグルコース代謝の調節において役割を果たす可能性があることを示唆する。

【0256】

図３Ａは、２Ｈ１０を用いたＶＥＧＦ−Ｂアンタゴニズムが、ＤＩＯを有するマウスの脳におけるグルコース取り込みを改善することを示す。

予防的抗ＶＥＧＦ−Ｂ処置は、ＤＩＯを有するマウスにおける虚血性脳卒中の重篤度を有意に低下させる

【0257】

ＶＥＧＦ−Ｂが神経血管機能障害を促進し、代謝障害のバックグラウンドにおける虚血性脳卒中の重篤度を増加させるかどうかを直接試験するために、ＶＥＧＦ−Ｂに対するモノクローナル抗体、２Ｈ１０、又はアイソタイプ対照の処理の有無で、ＤＩＯを有するマウスにおいて、血栓性脳卒中（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）を誘導した。

【0258】

いずれかの抗体１６ｍｇ／ｋｇを、ＭＣＡＯの−７日、−３日、及び１時間前に３回注射（Ｉ．Ｐ．）して、マウスを１週間処置した。次いで、マウスに光血栓性ＭＣＡＯを供し、上述のように分析した。ＤＩＯバックグラウンドにおいて、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体、２Ｈ１０による治療は、梗塞サイズ及びＩＣＨの両方を有意に減少させる。

【0259】

図３Ｂ及び３Ｃは、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体（２Ｈ１０）での予防的処置が、ＤＩＯを有するマウスにおける虚血性脳卒中後の転帰を改善することを示す。

抗ＶＥＧＦ−Ｂで予防的に処置したＤＩＯを有するマウスは、脳虚血後のグルコーストランスポーターＧｌｕｔ−１の発現を保持する

【0260】

３週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに高脂肪食を１７週間与えた後、それらを、ＭＣＡＯの−７日、−３日、及び１時間前にＩＰ注射により１６ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照又は抗ＶＥＧＦ−Ｂ ２Ｈ１０抗体のいずれかで１週間前処理した。

【0261】

対照又は２Ｈ１０抗体で前処理したＤＩＯマウスを、ＭＣＡＯの１時間後にＰＦＡ中で灌流して固定し、脳にビブラトーム切片を施した。切片をＧｌｕｔ−１に対する抗体で染色し、免疫蛍光で検出した。

【0262】

ＤＩＯを用いたマウスの脳血管におけるグルコーストランスポーターＧｌｕｔ−１の染色は、虚血ゾーンの境界において、ＭＣＡＯの早くも１時間後、非虚血性半球（対照）の同様の血管と比較して、Ｇｌｕｔ−１染色の顕著な喪失があったことを示した。

【0263】

ＭＣＡＯの前の、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体２Ｈ１０での１週間の前処置は、境界部（ｐｅｎｕｍｂｒａ）の血管におけるＧｌｕｔ−１抗原を部分的に保護する。これは、２Ｈ１０によるＶＥＧＦ−Ｂシグナル伝達の遮断が、Ｇｌｕｔ−１グルコーストランスポーター機能を保持することによって虚血境界部における血管によるより良好なグルコース取り込みを促進することを示唆しており、これにより、この血流減少領域における血管が、境界部の低酸素及び低血糖環境を改善させることができる。

【0264】

図３Ｄは、非虚血性対側半球と比較して、虚血脳半球におけるＧｌｕｔ−１の保持された細胞膜発現と相関する、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体２Ｈ１０で前処理したＤＩＯマウスを示す。免疫蛍光の相対的な領域がプロットされている。

予防的抗ＶＥＧＦ−Ｂ処置は、脳虚血後のＤＩＯを有するマウスにおける血液脳関門漏出を減少させる

【0265】

ＤＩＯマウスを、上記のように２Ｈ１０又はアイソタイプ対照抗体で前処理し、続いてＭＣＡＯを行った。ＭＣＡＯ誘導の直前に、７０ｋＤａの蛍光デキストラントレーサーをマウスに注射し（ＩＶ）、ＢＢＢ透過性の分析を可能にした。ＭＣＡＯ誘導の１時間後、マウスを灌流し、軽く後固定し、ＢＢＢ透過性について脳を解析した。

【0266】

ＭＣＡＯの１時間後には、ＤＩＯを有するマウスにおいてＢＢＢ完全性の劇的な消失が観察された。これは、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体２Ｈ１０による処理によって有意に減少した。これは、ＶＥＧＦ−Ｂの遮断が、虚血の最初の１時間の間にＤＩＯを有するマウスにおいて脳血管機能を改善することを示唆している。

【0267】

図３Ｅは、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体２Ｈ１０による前処理が、ＤＩＯを有するマウスにおいて虚血性脳卒中１時間後の血液脳関門漏出を減少させることを示す。

予防的抗ＶＥＧＦ−Ｂ処置は、脳虚血後のＤＩＯを有するマウスにおけるオクルディンリン酸化の誘導を減少させる

【0268】

ＤＩＯマウスを、２Ｈ１０又はアイソタイプ対照抗体で前述のように１週間前処理し、続いてＭＣＡＯを行った。虚血３時間後、マウスを灌流し、脳を収集し、直ちに凍結させた。凍結切片を得て、ホスホセリン特異的抗オクルディン抗体（セリン残基４９０）で免疫蛍光染色し、蛍光強度を定量した。

【0269】

オクルディンは、ＭＣＡＯ及び虚血再灌流傷害後に急速にリン酸化されるタイトジャンクションタンパク質である（Ｍｕｔｈｕｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ２０１４）。セリン残基４９０上のオクルディンのリン酸化は、ＢＢＢ破壊及び透過性に関与することが以前に示されている（Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２０１２；Ｍｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００９）。

【0270】

ＭＣＡＯの３時間後の対側半球（対照）と比較して、アイソタイプ対照（ＩｇＧ）処置ＤＩＯマウスは、境界部（同一（ｉｐｓｉ））におけるオクルディンセリンリン酸化（ｐＳ４９０）の増加を示し、虚血半球における内皮タイトジャンクション分解及び血管透過性の増加を示した。抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体２Ｈ１０による治療は、同側半球境界領域におけるオクルディンリン酸化の誘導を減少させ、それは、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体２Ｈ１０での治療がＢＢＢ完全性の向上をもたらすという概念を支持する。

【0271】

図３Ｆは、抗ＶＥＧＦ−Ｂ処置が、ＤＩＯを有するマウスにおける虚血性脳卒中後のオクルディンリン酸化を減少させることを示す。

予防的抗ＶＥＧＦ−Ｂ処理は、脳虚血後のＤＩＯを有するマウスの脳血管における脂質蓄積を阻止する

【0272】

ＶＥＧＦ−Ｂシグナルがグルコース取り込みをダウンレギュレートし、脂質取り込みを増加させるので（上に示したように）、脳血管を、痩せたマウス及び肥満マウスにおいて、及び２Ｈ１０抗体で処置した肥満マウスにおいて、ＭＣＡＯ後の脂質蓄積について調べた。

【0273】

ＤＩＯマウスを、上記で詳述した２Ｈ１０又はアイソタイプ対照抗体で前処理し、続いてＭＣＡＯを行った。前処置無し及び除脂肪年齢調整対照のＤＩＯマウスもＭＣＡＯに供した。虚血の３時間後、マウスを灌流し、脳を収集し、直ちに凍結させた。凍結切片を得、脂質液滴コーティングタンパク質、アディポフィリン／ペリリピン２に対する抗体で染色し、定量した。

【0274】

ＭＣＡＯの３時間以内に、虚血半球の脳血管への脂質の有意な取り込みが観察された。アディポフィリン染色がほとんど観察されない非虚血性の対側半球と比較して、痩せたマウスの虚血性半球における血管周囲の脂質の有意な取り込みがあった。しかし、これはＤＩＯを有するマウスよりも有意に少なく、これらの肥満マウスでは、血管周囲の脂質蓄積の増加は、２Ｈ１０処置によって大きく阻止された。

【0275】

これらのデータは、痩せたマウスにおいてさえ、ＭＣＡＯが脂質摂取を迅速に誘発し、おそらくは虚血組織の代謝要求を満たすのに役立ち、ＤＩＯがこの応答を劇的に強化することを示唆する。しかしながら、脳血管床における過剰かつ異所性の脂質蓄積は、特にＭＣＡＯ後の酸素及びグルコース欠乏の状況において有害であり得る。

【0276】

図３Ｇは、虚血性脳卒中後の脳血管における脂質蓄積が、抗ＶＥＧＦ−Ｂ抗体２Ｈ１０による予防的処置によって阻止されることを示す。

実施例４：ｔＰＡ血栓溶解と組み合わせた治療上の抗ＶＥＧＦ−Ｂ処置は、ＤＩＯを揺するマウスの梗塞サイズ、出血を減少させ、及び生存を伸ばす

【0277】

ＤＩＯを有するマウスをＭＣＡＯに供し、上記で詳述したように、２Ｈ１０又はアイソタイプ対照抗体（１６ｍｇ／ｋｇ）で脳卒中の１時間後に処置した。さらに４時間後、ｔＰＡ（Ａｌｔｅｐｌａｓｅ、１０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注入によって血栓溶解療法を受け、誘発された血栓を溶解した。生存している動物の単離された脳を上記のように分析した。

【0278】

典型的には、血栓溶解性ｔＰＡ治療の有効性は時間とともに減少し、出血性転化のリスクは上昇する（Ａｈｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２０１０）。本結果は、２Ｈ１０処置された動物の生存率が、後のｔＰＡ血栓溶解に供したアイソタイプ処置対照と比較して有意に高かったので、ＭＣＡＯ後に１時間遅れで２Ｈ１０での処置し、４時間後にｔＰＡ血栓溶解を行うと、梗塞サイズを減少させ、出血を減少させ、致死的出血を防ぐことを示す。

【0279】

この結果は、出血性合併症を軽減することによってｔＰＡ血栓溶解の安全性を改善し得る、及び／又は、ｔＰＡの治療ウィンドウ（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｎｄｏｗ）を延長し得る、ｔＰＡ処置に対する潜在的アジュバント療法としての、脳卒中におけるＶＥＧＦ−Ｂアンタゴニストの治療可能性を示唆する。臨床状況では、治療ウィンドウの延長は、血栓溶解療法を受けているより多くの患者の治療に対する最も重要な工程である。

【0280】

図４Ａ−Ｃは、ＶＥＧＦ−Ｂブロッキング抗体２Ｈ１０でＶＥＧＦ−Ｂを阻害することにより、後期血栓溶解後の転帰を改善することを示す。

【図1】

【図2】

【図3A-3D】

【図3E-3G】

【図4】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]