特許 6863900 新規アマトキシン−抗体コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6863900

(24)【登録日】2021年4月5日

(45)【発行日】2021年4月21日

(54)【発明の名称】新規アマトキシン−抗体コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20210412BHJP

   A61K 38/12 20060101ALI20210412BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20210412BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210412BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210412BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 L

   A61K38/12ZNA

   A61K47/68

   A61K39/395 C

   A61P43/00 105

   A61P35/00

【請求項の数】10

【全頁数】53

(21)【出願番号】特願2017-547478(P2017-547478)

(86)(22)【出願日】2016年3月7日

(65)【公表番号】特表2018-513120(P2018-513120A)

(43)【公表日】2018年5月24日

(86)【国際出願番号】EP2016000397

(87)【国際公開番号】WO2016142049

(87)【国際公開日】20160915

【審査請求日】2019年1月10日

(31)【優先権主張番号】15000681.5

(32)【優先日】2015年3月9日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】505348522

【氏名又は名称】ハイデルベルク ファルマ リサーチ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(74)【代理人】

【識別番号】100203828

【弁理士】

【氏名又は名称】喜多村 久美

(72)【発明者】

【氏名】ヤン アンダール

(72)【発明者】

【氏名】トールシュテン ヘヒラー

(72)【発明者】

【氏名】クリストフ ミュラー

(72)【発明者】

【氏名】アンドレアス パール

【審査官】 大西 隆史

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１５９９８１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５２３８９５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０２３３５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第０８／０７０５９３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／０４３４０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 SHEN, Ben-Quan et al.，Nature Biotechnology，２０１２年 ２月，Vol. 30, No. 2，pp. 184-189 + online methods，DOI: 10.1038/nbt.2108

【文献】 JUNUTULA, Jagath R. et al.，Nature Biotechnology，２００８年 ８月，Vol. 26, No. 8，pp. 925-932，DOI: 10.1038/nbt.1480

【文献】 KLINGUER-HAMOUR, Christine et al.，mAbs，２０１３年，Vol. 6, Issue 1，pp. 18-29，DOI: 10.4161/mabs.27437

【文献】 ELDUQUE, Xavier et al.，Bioconjugate Chemistry，２０１３年 ５月１５日，Vol. 24, No. 5，pp. 832-839，DOI: 10.1021/bc4000614

【文献】 SANCHEZ, Albert et al.，Organic Letters，２０１１年 ８月１９日，Vol. 13, No. 16，pp. 4364-4367，DOI: 10.1021/ol201690b

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−５１／１２

Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の一般式のコンジュゲート：
（Ａｍａ−Ｌ−Ｘ−Ｓ）_ｎ−Ａｂ
（式中、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｌはリンカーであり、Ｘはチオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、Ｓはシステインアミノ酸残基の硫黄原子であり、並びに、Ａｂは当該システイン残基を含む抗体配列又は機能的抗体フラグメントであって、ここで、当該システイン残基は、ＥＵナンバリングシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓであり、ここで、ｎは、１及び１〜４の値から選択される）。

【請求項2】

前記リンカーが、安定なリンカー及び切断可能なリンカーから選択される、請求項１に記載のコンジュゲート。

【請求項3】

前記チオール反応性基が、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ、４−［５−（メチルスルホニル）−１Ｈ−テトラゾール−１−イル］フェニル、２−（メチルスルホニル）−ベンゾ［ｄ］チアゾール−５−イル、４−［５−（メチルスルホニル）−１，３，４−オキサジアゾール−２−イル］−フェニル、２−ピリジルジチオ−，２−（５−ニトロ−ピリジル）ジチオ−，メチルチオスルホニル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎｙｌ）及びマレイミド、特にマレイミドから選択される、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。

【請求項4】

ｎが２である、請求項１から３のいずれか一項に記載のコンジュゲート。

【請求項5】

以下の一般式のコンジュゲート：
（Ａｍａ−Ｌ−Ｘ−Ｓ）_ｎ−Ａｂ
を合成するための方法であって、
化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’（式中、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｌはリンカーであり、Ｘはチオール反応性基Ｘ’へのチオール基のカップリングから生じる部分である）と、
抗体又は機能的抗体フラグメント、Ａｂ−ＳＨ（式中、基−ＳＨはシステインアミノ酸残基のチオールであり、そしてＡｂは当該システイン残基を含む抗体配列又は機能的抗体フラグメントの配列であって、ここで、当該システイン残基は、ＥＵナンバリングシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓであり、ここで、ｎは、１及び１〜４の値から選択される）とを、
反応させることによる、方法。

【請求項6】

ｎが２である、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

（ｉ）化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’（式中、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｌはリンカーであり、Ｘ’はチオール反応性基である）、並びに
（ｉｉ）抗体又は機能的抗体フラグメント、Ａｂ−ＳＨ（式中、基−ＳＨはシステインアミノ酸残基のチオールであり、そしてＡｂは当該システイン残基を含む抗体配列又は機能的抗体フラグメントの配列であって、ここで、当該システイン残基は、ＥＵナンバリングシステムによる重鎖２６５Ｃｙｓである）、
を含む、キット。

【請求項8】

化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’を合成するためのステップをさらに含む、請求項５に記載の方法であって、
式中、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｌはリンカーであり、Ｘ’はマレイミド基であり、
前記方法が、
（ａ）求核基を含むアマトキシンと、
化合物Ｙ−Ｌ−Ｘ’’
（式中、
Ｙは脱離基であり、そして
Ｘ’’は保護されたマレイミド基である）とを、
反応させるステップを含む、方法。

【請求項9】

請求項１から４のいずれか一項に記載のコンジュゲートを含有する、医薬組成物。

【請求項10】

標的を提示する細胞に関連する疾患の治療に使用するための、請求項９に記載の医薬組成物であって、
前記抗体又は機能的抗体フラグメントが当該標的に特異的である、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、アマトキシン及び抗体、特に特定のシステイン残基を含む抗体に結合したアマトキシンを含む、コンジュゲートに関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
アマトキシンは、タマゴテングタケ（Amanita phalloides mushrooms）に見られる、８アミノ酸からなる環状ペプチドである（図１参照）。アマトキシンは哺乳動物細胞のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩを特異的に阻害し、それによって影響を受けた細胞の転写及びタンパク質生合成も阻害する。細胞における転写の阻害は、成長及び増殖の停止を引きおこす。共有結合ではないが、アマニチンとＲＮＡ−ポリメラーゼＩＩとの複合体は非常に強固である（Ｋ_D＝３ｎＭ）。アマニチンの酵素からの解離は非常に遅いプロセスであり、したがって影響を受けた細胞の回復は起こりにくくなる。転写の阻害が非常に長く続くと、細胞はプログラム細胞死（アポトーシス）を受けることになる。

【0003】

腫瘍治療のための細胞毒性部分としてのアマトキシンの使用は、１９８１年に既に検討されており、その使用は、ジアゾ化によって、Ｔｒｐ（アミノ酸４；図１参照）のインドール環に連結されたリンカーを使用して、抗Ｔｈｙ１．２抗体をα−アマニチンにカップリングさせることによる（Davis & Preston、Science 1981、213、1385-1388）。Ｄａｖｉｓ及びＰｒｅｓｔｏｎは連結部位を７’位と同定した。Ｍｏｒｒｉｓ及びＶｅｎｔｏｎも同様に、７’位での置換が細胞毒性活性を維持する誘導体をもたらすことを実証した（Morris & Venton、Int.J.Peptide Protein Res.1983, 21 419-430）。

【0004】

欧州特許出願公開第１８５９８１１Ａ１号明細書（２００７年１１月２８日公開）は、β−アマニチンのアマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子が直接、すなわちリンカー構造なしに、アルブミンにあるいはモノクローナル抗体ＨＥＡ１２５、ＯＫＴ３又はＰＡ−１にカップリングした、コンジュゲートを記載した。さらに、これらのコンジュゲートの、乳癌細胞（ＭＣＦ−７）、バーキットリンパ腫細胞（Ｒａｊｉ）及びＴ−リンパ腫細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の増殖に対する阻害効果が示された。リンカーの使用が示唆され、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの要素を含むリンカーが含まれるが、そのようなコンストラクトは実際に示されておらず、さらなる詳細、例えば、アマトキシン上の連結部位は与えられていない。

【0005】

特許出願、国際公開第２０１０／１１５６２９号及び国際公開第２０１０／１１５６３０号（ともに２０１０年１０月１４日公開）は、抗体、例えば抗ＥｐＣＡＭ抗体、例えばヒト化抗体ｈｕＨＥＡ１２５が、（ｉ）アマトキシンアミノ酸１のγＣ−原子、（ｉｉ）アマトキシンアミノ酸４の６’Ｃ−原子を介して、又は（ｉｉｉ）アマトキシンアミノ酸３のδＣ−原子を介して、いずれの場合も、直接に又は抗体とアマトキシンとの間にリンカーを介して、アマトキシンにカップリングしている、コンジュゲートを記載している。示唆されたリンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などのような要素を含む。さらに、これらのコンジュゲートの、乳癌細胞（細胞株ＭＣＦ−７）、膵臓癌（細胞株Ｃａｐａｎ−１）、結腸癌（細胞株Ｃｏｌｏ２０５）、及び胆管癌（細胞株ＯＺ）の増殖に対する阻害効果が示された。

【0006】

上述のアプローチは、タンパク質性標的結合ドメイン、例えば抗体におけるリシン残基へのカップリングが非特異的であり、満足に制御することのできない様々な薬物−抗体比（ＤＡＲ）を有する混合組成のコンジュゲートをもたらすという欠点がある。例えば、典型的なヒトＩｇＧ１抗体には約７０〜１００リシンアミノ酸残基が存在する。典型的には約４のＤＡＲが、適切に活性化されたアマトキシンコンストラクトとリシン残基との反応によって得られる。さらに、カップリング位置の非常に不均一な混合物が観察され、いくつかはより高い有効性のコンジュゲートをもたらし、いくつかは非常に低い有効性を有する。ここでは特定の程度の制御は利用することができない。

【0007】

同様に、抗体分子中のジスルフィド結合を還元し、次いでチオール反応性基を有するトキシンとカップリングすることによって得られるシステインの使用は、不均一な混合物の形成をもたすが、これはヒトＩｇＧ１には３２個のシステインがあり、そのうち８個が、４つの鎖間ジスルフィド結合の還元後のカップリングに利用可能であるためである。

【0008】

トキシン−抗体コンジュゲートの細胞毒性活性、したがって治療有効性は、ＤＡＲが得られるにつれて増加することが観察され得る。しかしながら、同時に、ＤＡＲの増加に伴って忍容性が低下する。したがって、トキシン−抗体コンジュゲートのプロファイルを最適化するために、抗体にカップリングされているトキシンの数（すなわちＤＡＲ）、並びにトキシンコンジュゲーション（複数）の特定の位置（複数）の両方を制御することが非常に望ましい。そのような状況においてのみ、利用可能な治療濃度域の微調整、及びその結果の再現性を達成することができる。

【0009】

この状況を受けて、特異的かつ制御された薬物−抗体コンジュゲートの生成のために多くの方法が開発されており、例えば、野生型抗体配列に導入された非天然アミノ酸への部位特異的コンジュゲーションが挙げられる（Axupら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.109(2012)16101参照）。

【0010】

代替アプローチは、野生型抗体配列の突然変異誘発によって得られる単一のシステイン残基を含む抗体コンストラクトを使用する。理想的には、２のＤＡＲは、そのような突然変異鎖の２つのコピーを有するＩｇＧの軽鎖又は重鎖における単一アミノ酸残基の突然変異誘発によって達することができ、そして、１のＤＡＲは、そのような突然変異鎖のいずれか１つのコピーを有する一価抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメントの軽鎖又は重鎖における単一アミノ酸残基の突然変異誘発によって達することができる。

【0011】

国際公開第２００６／０３４４８８号は、親抗体の１又は数個のアミノ酸を、非架橋の高度に反応性のシステインアミノ酸で置換することによって操作されている抗体を記載している。本願は、そのような置換が起こり得る、軽鎖及び重鎖両方の様々な位置を記載している。

【0012】

国際公開第２０１１／００５４８１号は、反応性アミノ酸残基による、特にシステイン残基による、抗体配列における野生型アミノ酸残基の置換に使用され得る多数の位置を提示する別の出願である。

【0013】

国際公開第２００８／０７０５９３号は、Ｆｃガンマ受容体結合に関与している、抗体上のＦｃ部分におけるアミノ酸残基が交換され、システイン残基による交換を含む、同様のアプローチを記載する。

【0014】

本分野において既に多くの研究が行われてきたという事実にもかかわらず、アマトキシンは未だに、ＤＡＲ比を制御することによって、例えばそのような定義されたカップリングに特異的なシステインを用いることによって、定義された方法でカップリングされていない。さらに、そのようなシステインベースのコンジュゲーションにどのアミノ酸位置を使用すべきかについての完全な理解は無いようである。特に、操作されたシステイン残基によるアマトキシン及び抗体のコンジュゲートについての情報は未だ得られていない。しかしながら、アマトキシンの高い毒性の観点から、目的の標的細胞に対する高い毒性を示し、同時に優れた安定性及び忍容性を示す、コンストラクトを同定することが非常に重要である。これまでのところ、この目標は未だ達成されていない。

【0015】

発明の目的
したがって、アマトキシン及び抗体、特に特定のシステイン残基を含む抗体に結合したアマトキシンを含むコンジュゲートを合成する、費用効率が高くかつ強固な方法が依然として強く求められており、当該コンジュゲートは標的細胞に対して毒性が高く、同時に安定かつ忍容性が高い。親アミノ酸残基からシステイン残基へと突然変異され得る抗体鎖の位置を同定することが本発明のさらなる目標であり、その結果、そのような毒性の高い、安定かつ忍容性の高いコンジュゲートが形成される。

【発明の概要】

【0016】

発明の概要
本発明は、限られた数の特定の野生型アミノ酸残基を同定することができ、当該アミノ酸残基は単一の不対システイン残基に突然変異させることができ、それは毒性が高く、安定かつ忍容性の高いアマトキシンとのコンジュゲートの形成をもたらすという、予期しない観察に基づいている。

【0017】

したがって、一態様において、本発明は、以下の一般式のコンジュゲート：
Ａｍａ−Ｌ−Ｘ−Ｓ−Ａｂ
（式中、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｌはリンカーであり、Ｘはチオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、Ｓはシステインアミノ酸残基の硫黄原子であり、並びに、Ａｂは当該システイン残基を含む抗体配列又は機能的抗体フラグメントであって、ここで、当該システイン残基は（ｉ）ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択される抗体ドメインに位置し；（ｉｉ）当該抗体ドメインの配列に最も近い相同性を示す生殖系列配列がシステインとは異なるアミノ酸残基を含む位置にあり；そして（ｉｉｉ）溶媒曝露される位置にある）
に関する。

【0018】

別の態様において、本発明は、以下の一般式のコンジュゲート：
Ａｍａ−Ｌ−Ｘ−Ｓ−Ａｂ
（式中、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｌはリンカーであり、Ｘはチオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、Ｓはシステインアミノ酸残基の硫黄原子であり、並びに、Ａｂは当該システイン残基を含む抗体配列又は機能的抗体フラグメントであって、ここで、当該システイン残基は以下のリスト、重鎖１１８Ｃｙｓ、重鎖２３９Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓ、特に：重鎖１１８Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓから選択される）
に関する。

【0019】

第３の態様において、本発明は、以下の一般式コンジュゲート：
Ａｍａ−Ｌ−Ｘ−Ｓ−Ａｂ
を合成するための方法であって、
化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’（式中、Ｘ’はチオール反応性基である）と、
抗体Ａｂ−ＳＨ（式中、基−ＳＨはシステインアミノ酸残基のチオールであり、そしてＡｂは当該システイン残基を含む抗体配列であって、ここで、当該システイン残基は以下のリスト：重鎖１１８Ｃｙｓ、重鎖２３９Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓ、特に：重鎖１１８Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓから選択される）とを、
反応させることによる、方法に関する。

【0020】

第４の態様において、本発明は、以下、
（ｉ）化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’（式中、Ｘ’はチオール反応性基である）、並びに
（ｉｉ）抗体Ａｂ−ＳＨ（式中、基−ＳＨはシステインアミノ酸残基のチオールであり、そしてＡｂは当該システイン残基を含む抗体配列であって、ここで、当該システイン残基は以下のリスト：重鎖１１８Ｃｙｓ、重鎖２３９Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓ、特に：重鎖１１８Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓから選択される）、
を含む、キットに関する。

【0021】

第５の態様において、本発明は、化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’を合成するための方法であって、
式中、Ｘ’はマレイミド基であり、
前記方法が、
（ａ）求核基を含むアマトキシンと、
化合物Ｙ−Ｌ−Ｘ’’
（式中、
Ｙは脱離基であり、そして
Ｘ’’は保護されたマレイミド基である）とを、
反応させるステップを含む、方法に関する。

【0022】

第６の態様において、本発明は、本発明に係るコンジュゲートを含有する医薬組成物に関する。

【0023】

第７の態様において、本発明は、標的を提示する細胞に関連する疾患の処置方法であって、以下のステップ：
当該細胞と、前記抗体が当該標的に特異的である、本発明に係るコンジュゲートとを接触させること、
を含む、方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】図１は、異なるアマトキシンの構造式を示す。太字の番号（１〜８）はアマトキシンを形成する８個のアミノ酸の標準的なナンバリングを示す。アミノ酸１、３及び４における原子の標準的な表示も示されてる（それぞれ、ギリシャ文字α〜γ、ギリシャ文字α〜δ、及び１’〜７’の番号）。

【図2】図２は、ＩｇＧ１分子の概略図、並びにシステイン残基に突然変異された、トキシンカップリングのためのアミノ酸残基の位置を示す。ＨＣ−Ａ１１８Ｃ；ＨＣ−Ｓ１３１Ｃ；ＨＣ−Ｓ２３９Ｃ；ＨＣ−Ｄ２６５Ｃ；ＨＣ−Ｅ２６９Ｃ；ＨＣ−Ｎ２９７Ｃ；ＨＣ−Ａ３２７Ｃ；ＨＣ−Ｉ３３２Ｃ；残基ＨＣ−Ｄ２６５ 及びＨＣ−Ｎ２９７はＦｃγ受容体結合に関与し；置換は、受容体結合及びその後の受容体陽性細胞における取り込みを阻害することになる。

【図3-1】図３は、実施例１に記載のトラスツズマブ（Trastuzumab）重鎖及び軽鎖の産生のための発現ベクターの概略図を示す。

【図3-2】図３は、実施例１に記載のトラスツズマブ（Trastuzumab）重鎖及び軽鎖の産生のための発現ベクターの概略図を示す。

【図4(A)-1】図４（Ａ）は、抗体トラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ及びそのコンジュゲートのデコンボリューションされた質量スペクトル：（ａ）抗体トラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃのデコンボリューションされた質量スペクトル；（ｂ）ＡＤＣトラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ−３０．０８８０のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図4(A)-2】図４（Ａ）は、抗体トラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ及びそのコンジュゲートのデコンボリューションされた質量スペクトル：（ａ）抗体トラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃのデコンボリューションされた質量スペクトル；（ｂ）ＡＤＣトラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ−３０．０８８０のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図4(B)-1】図４（Ｂ）は、抗体トラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ軽鎖（ａ）及び重鎖（ｂ）のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図4(B)-2】図４（Ｂ）は、抗体トラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ軽鎖（ａ）及び重鎖（ｂ）のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図4(C)-1】図４（Ｃ）は、ＡＤＣトラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ−３０．０８８０軽鎖（ａ）及び重鎖（ｂ）のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図4(C)-2】図４（Ｃ）は、ＡＤＣトラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ−３０．０８８０軽鎖（ａ）及び重鎖（ｂ）のデコンボリューションされた質量スペクトルを示す。

【図5(A)-1】図５（Ａ）は、ＬＣ／ＭＳによって決定されたインタクトなＨｅｒ−３０．０６４３の質量スペクトルを示す：薬物−抗体比＝３．７アマトキシン／ＩｇＧ。

【図5(A)-2】図５（Ａ）は、ＬＣ／ＭＳによって決定されたインタクトなＨｅｒ−３０．０６４３の質量スペクトルを示す：薬物−抗体比＝３．７アマトキシン／ＩｇＧ。

【図5(B)-1】図５（Ｂ）は、ＬＣ／ＭＳによって決定されたＨｅｒ−３０．０６４３の軽鎖の質量スペクトルを示す。

【図5(B)-2】図５（Ｂ）は、ＬＣ／ＭＳによって決定されたＨｅｒ−３０．０６４３の軽鎖の質量スペクトルを示す。

【図5(C)-1】図５（Ｃ）は、ＬＣ／ＭＳによって決定されたＨｅｒ−３０．０６４３の重鎖の質量スペクトルを示す。

【図5(C)-2】図５（Ｃ）は、ＬＣ／ＭＳによって決定されたＨｅｒ−３０．０６４３の重鎖の質量スペクトルを示す。

【図6】図６は、親抗体（２つの異なる発現産物）と比較した、ＳＫＯＶ−３細胞上の抗体−標的に対する、４つの例示的なシステイン突然変異体の結合を示す。

【図7(A)】図７（Ａ）は、抗アマニチン抗体で染色されたブロッティング膜上の異なるコンストラクトの分析を示す：レーン１及び３：裸の（naked）抗体トラスツズマブ；レーン２及び４；リシンカップリングによってアマニチンコンストラクトＨｅｒ−３０．０６４３にコンジュゲートした抗体トラスツズマブ；レーン５：ＨＣ−Ａ１１８Ｃ突然変異を有する裸の抗体トラスツズマブ；レーン６；１１８ＣへのシステインカップリングによってアマニチンコンストラクトＨｅｒ−３０．１６１９にコンジュゲートしたＨＣ−Ａ１１８Ｃ突然変異を有する抗体トラスツズマブ（ブロモアセトアミドカップリング、安定なリンカー）；レーン７：１１８ＣへのシステインカップリングによってアマニチンコンストラクトＨｅｒ−３０．１７０４にコンジュゲートしたＨＣ−Ａ１１８Ｃ突然変異を有する抗体トラスツズマブ（ブロモアセトアミドカップリング、切断可能なリンカー）；レーン８：１１８ＣへのシステインカップリングによってアマニチンコンストラクトＨｅｒ−３０．０８８０にコンジュゲートしたＨＣ−Ａ１１８Ｃ突然変異を有する抗体トラスツズマブ（マレイミドカップリング、安定なリンカー）；レーン９；１１８ＣへのシステインカップリングによってアマニチンコンストラクトＨｅｒ−３０．１６９９にコンジュゲートした抗体Ｂ（マレイミドカップリング、切断可能なリンカー）；上部ゲル：変性及び還元条件；曝露時間：６０秒；下部ゲル：変性及び非還元条件；曝露時間：約５秒。

【図7(B)-1】図７（Ｂ）は、変性及び還元条件（左側）：並びに、変性及び非還元条件（右側）下で、（ｉ）クマシータンパク質染色（上半分）；並びに（ｉｉ）抗アマニチン抗体ウェスタンブロット（下半分）を使用する、異なるコンストラクトの分析を示す。

【図7(B)-2】図７（Ｂ）は、変性及び還元条件（左側）：並びに、変性及び非還元条件（右側）下で、（ｉ）クマシータンパク質染色（上半分）；並びに（ｉｉ）抗アマニチン抗体ウェスタンブロット（下半分）を使用する、異なるコンストラクトの分析を示す。

【図8(A)】図８（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｆｃγ受容体陽性ＴＨＰ−１細胞、及び抗体トラスツズマブの異なるシステイン突然変異を有する異なるコンジュゲートを使用する、ＷＳＴ−Ｉ細胞毒性アッセイの結果を示す：図８（Ａ）：１２０時間のインキュベーション時間；図８（Ｂ）：７２時間のインキュベーション時間のトラスツズマブ；いずれの図においても、グラフの右上部分の２つの曲線は突然変異体ＨＣ−Ｄ２６５Ｃ及びＨＣ−Ｎ２９７Ｃに基づくＡＤＣｓに由来する、すなわちＦｃγ受容体結合に関与することが知られている残基の突然変異体由来である；残りのグラフは突然変異体ＨＣ−Ａ１１８Ｃ；ＨＣ−Ｓ２３９Ｃ；ＨＣ−Ｅ２６９Ｃ；ＨＣ−Ａ３２７Ｃ；及びＨＣ−Ｉ３３２Ｃに基づくＡＤＣｓに由来する。

【図8(B)】図８（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｆｃγ受容体陽性ＴＨＰ−１細胞、及び抗体トラスツズマブの異なるシステイン突然変異を有する異なるコンジュゲートを使用する、ＷＳＴ−Ｉ細胞毒性アッセイの結果を示す：図８（Ａ）：１２０時間のインキュベーション時間；図８（Ｂ）：７２時間のインキュベーション時間のトラスツズマブ；いずれの図においても、グラフの右上部分の２つの曲線は突然変異体ＨＣ−Ｄ２６５Ｃ及びＨＣ−Ｎ２９７Ｃに基づくＡＤＣｓに由来する、すなわちＦｃγ受容体結合に関与することが知られている残基の突然変異体由来である；残りのグラフは突然変異体ＨＣ−Ａ１１８Ｃ；ＨＣ−Ｓ２３９Ｃ；ＨＣ−Ｅ２６９Ｃ；ＨＣ−Ａ３２７Ｃ；及びＨＣ−Ｉ３３２Ｃに基づくＡＤＣｓに由来する。

【図9】図９は、マウスにおけるコンジュゲートＡｂトラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ（安定なリンカー；マレイミドカップリング）の忍容性試験の結果を示す。ＢＷＬ：体重減少；ｎｄ＊：不十分なカップリングのために決定されず；ｎｄ＊＊：低用量での罹患率（morbidity）のために決定されず；ｎｄ＊＊＊：材料の不足のために決定されず；Ｔ ＨＣ−Ａ１１８Ｃ−３０．０８８０は３７．５ｍｇ／ｋｇで体重減少を示さない。

【図10-1】図１０は、カニクイザル（cynomolgus monkeys）における異なるアマトキシン−トラスツズマブコンジュゲート忍容性試験の結果を示す：（Ａ）ランダムリシンコンジュゲーション、安定なリンカー：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（Ｂ）ランダムリシンコンジュゲーション、切断可能なリンカー：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（Ｃ）安定なリンカーを有するコンジュゲートＡｂトラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ／マレイミドカップリング：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）３．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１０．０ｍｇ／ｋｇ；（Ｄ）安定なリンカーを有するコンジュゲートＡｂトラスツズマブＨＣ−Ｄ２６５Ｃ／マレイミドカップリング：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）３．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１０．０ｍｇ／ｋｇ。

【図10-2】図１０は、カニクイザル（cynomolgus monkeys）における異なるアマトキシン−トラスツズマブコンジュゲート忍容性試験の結果を示す：（Ａ）ランダムリシンコンジュゲーション、安定なリンカー：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（Ｂ）ランダムリシンコンジュゲーション、切断可能なリンカー：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（Ｃ）安定なリンカーを有するコンジュゲートＡｂトラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ／マレイミドカップリング：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）３．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１０．０ｍｇ／ｋｇ；（Ｄ）安定なリンカーを有するコンジュゲートＡｂトラスツズマブＨＣ−Ｄ２６５Ｃ／マレイミドカップリング：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）３．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１０．０ｍｇ／ｋｇ。

【図10-3】図１０は、カニクイザル（cynomolgus monkeys）における異なるアマトキシン−トラスツズマブコンジュゲート忍容性試験の結果を示す：（Ａ）ランダムリシンコンジュゲーション、安定なリンカー：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（Ｂ）ランダムリシンコンジュゲーション、切断可能なリンカー：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（Ｃ）安定なリンカーを有するコンジュゲートＡｂトラスツズマブＨＣ−Ａ１１８Ｃ／マレイミドカップリング：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）３．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１０．０ｍｇ／ｋｇ；（Ｄ）安定なリンカーを有するコンジュゲートＡｂトラスツズマブＨＣ−Ｄ２６５Ｃ／マレイミドカップリング：（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）３．０ｍｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１０．０ｍｇ／ｋｇ。

【図11】図１１は、異なる抗ＨＥＲ２ ＡＤＣｓ及びＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ−３癌細胞との７２時間のインキュベーション後の細胞生存率の決定のためのＢｒｄＵ−取り込みアッセイの結果を示す。

【図12】図１２は、異なる抗ＨＥＲ２ ＡＤＣｓ及びＨＥＲ２陽性ＮＣＩ−Ｎ８７癌細胞との７２時間のインキュベーション後の細胞生存率の決定のためのＢｒｄＵ−取り込みアッセイの結果を示す。

【図13】図１３は、異なる抗ＰＳＭＡ ＡＤＣｓ及びＰＳＭＡ陽性Ｃ４−２前立腺癌細胞との１２０時間のインキュベーション後の細胞生存率の決定のためのＢｒｄＵ−取り込みアッセイの結果を示す。

【図14】図１４は、抗ＨＥＲ２ベースのＡＤＣｓで処置した皮下ＨＥＲ２陽性ＳＫＯＶ−３異種移植モデルの結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

発明の詳細な説明
本発明を以下で説明する前に、本発明は本明細書に記載された特定の方法、プロトコル及び試薬に限定されず、これらは変動し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は単に特定の実施形態を説明するためのものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。特に定義されない限り、全ての本明細書で使用される科学技術用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

【0026】

好ましくは、本明細書で使用される用語は「A multilingual glossary of biotechnological terms:（IUPAC Recommendations）」、（Leuenberger, H.G.W, Nagel, B.及びKolbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland）に記載されたように定義される。

【0027】

明細書及び添付の特許請求の範囲を通して、文脈が他に要求しない限り、「含む」という語、並びに、「含む」及び「含んでいる」などの変形は、記載された整数、組成物又はステップ、あるいは整数又はステップの群の包含を意味すると理解されることになるが、任意の付加的な整数、組成物又はステップ、あるいは整数、組成物又はステップの群は、場合により存在してもよく、同様に、付加的な整数、組成物又はステップ、あるいは整数、組成物又はステップの群が存在しない実施形態が含まれる。そのような後者の実施形態では、用語「含んでいる」は「からなる」と同一に使用される。

【0028】

いくつかの文書が本明細書の文章中に引用されている。本明細書中で引用された文書の各々（全ての特許、特許出願、科学文献、製造者の仕様書、指示書、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号配列提出物等を含む）は、上記又は下記のいずれかにかかわらず、各特許法の下で可能な程度にその全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書中のいかなるものも、本発明が先行発明によってそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。

【0029】

本発明は、限られた数の特定のアミノ酸残基が親抗体において同定することができ、当該アミノ酸残基は単一の不対システイン残基に突然変異させることができ、それは毒性が高く、安定かつ忍容性の高いアマトキシンとのコンジュゲートの形成をもたらすという予期しない観察に基づいている。

【0030】

したがって、一態様において、本発明は、以下の一般式のコンジュゲート：
Ａｍａ−Ｌ−Ｘ−Ｓ−Ａｂ
（式中、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｌはリンカーであり、Ｘはチオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、Ｓはシステインアミノ酸残基の硫黄原子であり、並びに、Ａｂは当該システイン残基を含む抗体配列又は機能的抗体フラグメントであって、ここで、当該システイン残基は（ｉ）ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から選択される抗体ドメインに位置し；（ｉｉ）当該抗体ドメインの配列に最も近い相同性を示す生殖系列配列がシステインとは異なるアミノ酸残基を含む位置にあり；そして（ｉｉｉ）溶媒曝露される位置にある）
に関する。

【0031】

別の態様において、本発明は、以下の一般式のコンジュゲート：
Ａｍａ−Ｌ−Ｘ−Ｓ−Ａｂ
（式中、Ａｍａはアマトキシンであり、Ｌはリンカーであり、Ｘはチオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分であり、Ｓはシステインアミノ酸残基の硫黄原子であり、並びに、Ａｂは当該システイン残基を含む抗体配列又は機能的抗体フラグメントであって、ここで、当該システイン残基は以下のリスト、重鎖１１８Ｃｙｓ、重鎖２３９Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓ、特に：重鎖１１８Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓから選択される）
に関する。

【0032】

本発明の文脈において、「アマトキシン」という用語は、テングタケ（Amanita）属から単離され、そしてWieland, T.及びFaulstich H.(Wieland T,Faulstich H.,CRC Crit Rev Biochem.1978 Dec;5(3):185-260）に記載された、８個のアミノ酸からなる全ての環状ペプチドを含み、さらにその全ての化学誘導体；さらにその全ての半合成類縁体；さらに天然化合物（環状、８個のアミノ酸）の主要構造に従ってビルディングブロックから構築されたその全ての合成類縁体、さらにヒドロキシル化アミノ酸の代わりに非ヒドロキシル化アミノ酸を含む全ての合成又は半合成類縁体、さらにチオエーテルスルホキシド部分がスルフィド、スルホンによって、又は硫黄とは異なる原子、例えば炭素原子によってアマニチンのカルバ類縁体（carbaanalogue）として置換されている全ての合成又は半合成類縁体を含み、いずれの場合も、任意のそのような誘導体又は類縁体は哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害することによって機能的に活性である。

【0033】

機能的に、アマトキシンは哺乳動物のＲＮＡポリメラーゼＩＩを阻害するペプチド又はデプシペプチドとして定義される。好ましいアマトキシンは、上記で定義されたリンカー分子又は標的結合部分と反応することができる官能基（例えばカルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシ基、チオール又はチオール捕捉基）を有するアマトキシンである。本発明のコンジュゲートに特に適したアマトキシンは、図１に示されたα−アマニチン、β−アマニチン、γ−アマニチン、ε−アマニチン、アマニン、アマニンアミド、アマヌリン及びアマヌリン酸、並びに、その塩、化学誘導体、半合成類縁体、及び合成類縁体である。本発明での使用に特に好ましいアマトキシンは、α−アマニチン、γ−アマニチン、及びε−アマニチン、特にα−アマニチンである。

【0034】

本発明の文脈において「リンカー」は、２つの成分を接続している構造を言い、その成分のそれぞれがリンカーの一端に連結されている。リンカーが結合である場合、抗体へのアマトキシンの直接結合は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用するアマトキシンの能力を低下させ得る。特定の実施形態では、リンカーは２つの成分間の距離を増大し、そして、それらの成分間、例えば、本願の場合、抗体とアマトキシンとの間の立体障害を緩和する。特定の実施形態では、リンカーはその骨格に１〜３０個の原子（例えば １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０個の原子）の連続鎖を有し、すなわちリンカーの長さはアマトキシン部分と抗体との間の原子又は結合の数によって測定される最短の接続として定義され、ここで、リンカー骨格の一方がアマトキシンと反応し、他方が抗体との反応に利用可能であるか、又は反応している。本発明の文脈において、リンカーは好ましくは、場合により置換された、Ｃ_1-20−アルキレン、Ｃ_1-20−ヘテロアルキレン、Ｃ_2-20−アルケニレン、Ｃ_2-20−ヘテロアルケニレン、Ｃ_2-20−アルキニレン、Ｃ_2-20−ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基である。リンカーは、カルボキサミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、尿素、チオ尿素、炭化水素部分などの、１つ以上の構成要素を含み得る。リンカーはまた、これらの構成要素の２つ以上の組み合わせを含み得る。これらの構成要素の各々は、リンカー中に２箇所以上、例えば２箇所、３箇所、４箇所、５箇所又は６箇所に存在してもよい。いくつかの実施形態では、リンカーはジスルフィド結合を含み得る。リンカーは、単一ステップで又は２つ以上の後続ステップのいずれかで、アマトキシン及び抗体に連結される必要があることが理解される。そのためには、リンカーとなるべきものは、好ましくは近位及び遠位の端に、２つの基を有することになり、それは（ｉ）結合されることになる成分の１つに存在する基、好ましくはアマトキシン又は標的結合ペプチド上の活性化された基への共有結合を形成し、あるいは、（ｉｉ）アマトキシン上の基と共有結合を形成するように活性化されるか、活性化され得る。従って、化学基はリンカーの遠位及び近位の端にあり、それがそのようなカップリング反応、例えばエステル、エーテル、ウレタン、ペプチド結合等の結果であることが好ましい。

【0035】

特定の実施形態では、リンカーＬは、Ｃ、Ｏ、Ｎ及びＳから独立して選択される１〜２０個の原子の線状鎖であり、特に２〜１８個の原子、より具体的には５〜１６個の原子、そしてさらにより具体的には６〜１５個の原子の線状鎖である。特定の実施形態では、線状鎖中の原子の少なくとも６０％が、Ｃ原子である。特定の実施形態では、線状鎖中の原子は単結合によって結合されている。

【0036】

特定の実施形態では、リンカーＬは、Ｎ、Ｏ、及びＳから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む、アルキレン、ヘテロアルキレン、アルケニレン、ヘテロアルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、又はヘテロアラルキレン基であり、ここで当該リンカー場合により置換されている。

【0037】

「アルキレン」という用語は、１〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖飽和炭化水素基を指し、１〜１０個の炭素原子を有する基が含まれる。特定の実施形態では、アルキレン基は低級アルキレン基であり得る。「低級アルキレン」という用語は、１〜６個の炭素原子、特定の実施形態では、１〜５個又は１〜４個の炭素原子を有するアルキレン基を指す。アルキレン基の例としては、これらに限定されるものではないが、これらに限定されるものではないが、メチレン（−ＣＨ₂−）、エチレン（−ＣＨ₂−ＣＨ₂−）、ｎ−プロピレン、ｎ−ブチレン、ｎ−ペンチレン、及びｎ−ヘキシレンが挙げられる。

【0038】

「アルケニレン」という用語は、２〜２０個の炭素原子を有する二価の直鎖基を指し、ここで、炭素−炭素結合の少なくとも１つは二重結合であり、一方で他の結合は単結合又はさらに二重結合であり得る。本明細書において「アルキニレン」という用語は、２〜２０個の炭素原子を有する基を指し、ここで、炭素−炭素結合の少なくとも１つは三重結合であり、一方で他の結合は単結合、二重結合又はさらに三重結合であり得る。アルケニレン基の例としては、エテニレン（−ＣＨ＝ＣＨ−）、１−プロペニレン、２−プロペニレン、１−ブテニレン、２−ブテニレン、３−ブテニレンなどが挙げられる。アルキニレン基の例としては、エチニレン、１−プロピニレン、２−プロピニレンなどが挙げられる。

【0039】

本明細書で使用される場合、「シクロアルキレン」は、任意の安定な単環又は多環系の一部である二価の環を指すことを意図し、ここで、そのような環は３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を有さず、そしてそのような環は完全飽和である。並びに「シクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環又は多環系の一部である二価の環を指すことを意図し、ここで、そのような環は３〜１２個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を有さず、そしてそのような環は少なくとも部分的に不飽和である（しかし、任意のアリーレン環を除く）。シクロアルケニレンの例としては、これらに限定されるものではないが、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、及びシクロヘプチレンが挙げられる。シクロアルケニレンの例としては、これらに限定されるものではないが、シクロペンテニレン及びシクロヘキセニレンが挙げられる。

【0040】

本明細書で使用される場合、「ヘテロシクロアルキレン」及び「ヘテロシクロアルケニレン」という用語は、任意の安定な単環又は多環系の一部である二価の環を指すことを意図し、ここで、そのような環は３〜約１２個の原子を有し、そしてそのような環は炭素原子及び少なくとも１つのヘテロ原子、特にＮ、Ｏ及びＳからなる群から独立して選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなり、ヘテロシクロアルキレンは完全飽和であるそのような環を指し、並びにヘテロシクロアルケニレンは少なくとも部分的に不飽和である環を指す（しかし、任意のアリーレン又はヘテロアリーレン環を除く）。

【0041】

「アリーレン」という用語は、任意の安定な単環又は多環系の一部である二価の環又は環系を意味することを意図し、ここで、そのような環又は環系は３〜２０個の炭素原子を有するが、ヘテロ原子を有さず、当該環又は環系は「４ｎ＋２」π電子則によって定義される芳香族部分からなり、フェニレンが含まれる。

【0042】

本明細書で使用される場合、「ヘテロアリーレン」という用語は、任意の安定な単環又は多環系の一部である二価の環又は環系を指し、ここで、そのような環又は環系は３〜２０個の原子を有し、当該環又は環系は「４ｎ＋２」π電子則によって定義される芳香族部分からなり、そして炭素原子及び１つ以上の窒素、硫黄、及び／又は酸素ヘテロ原子を含む。

【0043】

本発明の文脈において、「置換された」という用語は、示された原子の通常の原子価、又は置換されている基の適切な原子の原子価が超過されることなく、かつ置換基が安定な化合物をもたらすことを条件として、リンカーの骨格に存在する１つ以上の水素が示された基（複数）からの選択で置き換えられていることを示すことを意図する。「場合により置換された」という用語は、リンカーが、本明細書に定義された１つ以上の置換基により、本明細書に定義された非置換又は置換のいずれかであることを意味することを意図する。置換基がケト（又はオキソ、すなわち＝Ｏ）基、チオ又はイミノ基等である場合、リンカー骨格原子上の２つの水素が置き換えられる。例示的な置換基としては、例えば、以下が挙げられる：アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキル、ヘテロアラルキル、アシル、アロイル、ヘテロアロイル、カルボキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アシルオキシ、アロイルオキシ、ヘテロアロイルオキシ、アルコキシカルボニル、ハロゲン、（チオ）エステル、シアノ、ホスホリル、アミノ、イミノ、（チオ）アミド、スルフヒドリル、アルキルチオ、アシルチオ、スルホニル、サルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、アジド、ペルフルオロアルキル（例えばトリフルオロメチル）を含むハロアルキル、ハロアルコキシ、アルキルスルファニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アリールスルホノアミノ、ホスホリル、ホスフェート、ホスホネート、ホスフィネート、アルキルカルボキシ、アルキルカルボキシアミド、オキソ、ヒドロキシ、メルカプト、（場合により、例えばアルキル、アリール、又はヘテロアリールによって、一置換又は二置換された）アミノ、イミノ、カロボキサミド、（場合により、例えばアルキル、アリール、又はヘテロアリールによって、一置換又は二置換された）カルバモイル、アミジノ、アミノスルホニル、アシルアミノ、アロイルアミノ、（チオ）ウレイド、（アリールチオ）ウレイド、アルキル（チオ）ウレイド、シクロアルキル（チオ）ウレイド、アリールオキシ、アラルコキシ、又は−Ｏ（ＣＨ₂）_n−ＯＨ、−Ｏ（ＣＨ₂）_n−ＮＨ₂、−Ｏ（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ、−（ＣＨ₂）_nＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ₂）_nＲ、−（ＣＨ₂）_nＮ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）ＯＲ、又は−Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）₂Ｒ、ここで、ｎは１〜４であり、Ｒは、水素、−アルキル、−アルケニル、−アルキニル、−シクロアルキル、−シクロアルケニル、−（Ｃ−結合−ヘテロシクロアルキル）、−（Ｃ−結合−ヘテロシクロアルケニル）、−アリール、及び−ヘテロアリールから独立して選択され、複数の置換が許容される。置換基、例えば、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アルキル、など又は官能基、例えば、−ＯＨ、−ＮＨＲなどが、適切な場合にはそれ自体が置換され得ることを当業者は理解するであろう。置換された部分それ自体が、適切な場合には同様に置換され得ることを当業者は理解するであろう。

【0044】

特定の実施形態では、リンカーＬは、以下の部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、の１つから選択される部分を含む。

【0045】

本発明の特定の実施形態では、リンカーＬは、以下のリスト：アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、ヘテロアルキニレン、ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、アラルキレン、及びヘテロアラルキレン基、から選択される多数のｍ基を含み、ここで、各基は場合により独立して置換されていてもよく、当該リンカーはさらに、以下の部分：ジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）、エーテル（−Ｏ−）、チオエーテル（−Ｓ−）、アミン（−ＮＨ−）、エステル（−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−）、カルボキサミド（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−又は−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−又は−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、及び尿素部分（−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、の１つから独立して選択される多数のｎ部分を含み、ここで、ｍ＝ｎ＋１である。特定の実施形態では、ｍが２でありかつｎが１であるか、あるいはｍが３でありかつｎが２である。特定の実施形態では、リンカーは、２又は３つの非置換アルキレン基、並びに、非置換アルキレン基に結合する、それぞれ１又は２つの、ジスルフィド、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルボキサミド、ウレタン又は尿素部分を含む。

【0046】

特定の実施形態では、線状鎖中のＣ原子は独立して、場合により置換されたメチレン基（−ＣＨ₂−）の一部である。特定のそのような実施形態では、任意の置換基は、ハロゲン及びＣ_1-6−アルキル、特にメチルから独立して選択される。

【0047】

特定の実施形態では、リンカーＬは安定なリンカーである。

【0048】

本発明の文脈において、「安定なリンカー」という用語は、リンカーが（ｉ）酵素、特にリソソームペプチダーゼ、例えばカテプシンＢの存在下で、及び（ｉｉ）細胞内還元環境下で、安定であることを指す。

【0049】

特定の実施形態では、安定なリンカーは、（ｉ）酵素切断可能な部分構造を含まず（特にカテプシンＢによって切断可能なジペプチド配列を含まない）、及び／又は（ｉｉ）ジスルフィド基を含まない。特定のそのような実施形態では、リンカーは最大で１２個の原子、特に２〜１０個、より具体的には４〜９個、及び最も具体的には６〜８個原子の長さを有する。

【0050】

特定の実施形態では、段落［００４３］の一般式に存在する部分Ｌ−Ｘ−Ｓは、以下の部分の群：
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₃−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₄−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₅Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₆−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₇−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₈−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₉−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₁₀−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₁₁−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₁₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₁₆−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；及び
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｏ−（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）、
から選択される。

【0051】

特定の他の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカーである。

【0052】

本発明の文脈において、「切断可能なリンカー」という用語は、（ｉ）酵素によって、又は（ｉｉ）還元環境下で、切断可能であるリンカーを指す。

【0053】

本発明の文脈において、「酵素によって．．．切断可能であるリンカー」という用語は、酵素によって、特にリソソームペプチダーゼ、例えばカテプシンＢによって切断することができ、内在化後に標的抗体にコンジュゲートしたトキシンカーゴ（toxin cargo）の細胞内放出をもたらす、リンカーを指す（Dubowchikら、Bioconjug Chem.13(2002)855-69参照）。特定の実施形態では、切断可能なリンカーは、以下：Ｐｈｅ−Ｌｙｓ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｖａｌ−Ａｌａ、Ｐｈｅ−Ｃｉｔ及びＶａｌ−Ｃｉｔから選択されるジペプチドを含み、特に、当該切断可能なリンカーはｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）スペーサーをジペプチドとアマトキシンとの間にさらに含む。

【0054】

特定の他の実施形態では、リンカーは還元可能なリンカーである。

【0055】

本発明の文脈において、「還元可能なリンカー」という用語は、細胞内還元環境下で切断することができるリンカーを指し、特にジスルフィド基を含み、細胞内還元環境による内在化後に標的抗体にコンジュゲートしたトキシンカーゴの細胞内放出をもたらすリンカーを指す（Shenら(1985)J.Biol.Chem.260、10905-10908参照）。

【0056】

特定の他の実施形態では、リンカーは切断可能なリンカー、特に（ｉ）酵素によって切断可能なリンカー、特にジペプチド、特にカテプシンＢによって切断可能なジペプチドを含むリンカー、又は（ｉｉ）還元可能なリンカー、特にジスルフィド基を含むリンカーである。特定のそのような実施形態では、そのような切断可能なリンカーは最大で２０個の原子、特に６〜１８個、より具体的には８〜１６個、及び最も具体的には１０〜１５個の原子の長さを有する。

【0057】

特定の実施形態では、段落［００４３］の一般式に存在する部分Ｌ−Ｘ−Ｓ中のリンカーＬは、以下の部分の群：
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₂−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₃−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₂−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₃−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₃−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₃−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₄−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₄−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₂−ＣＭｅ₂−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₂−Ｓ−Ｓ−ＣＭｅ₂−（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −（ＣＨ₂）₃−Ｓ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ₂）₅−Ｘ−Ｓ− （抗体側）
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ₂）₅−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ａｌａ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｃｉｔ−Ｐｈｅ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ｍｅｔ−Ｖａｌ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；
（アマトキシン側） −ＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＮＨ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−ＣＯ（ＣＨ₂）₂−Ｘ−Ｓ− （抗体側）；から選択され、
ここで、ジペプチド配列に隣接する−ＮＨ−及び−ＣＯ−は、それぞれ、ジペプチドのカルボキシ末端及びアミノ末端へのアミド結合を形成するリンカーのアミノ及びカルボニル部分を表す。

【0058】

本発明の文脈において、「チオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分」という用語は、（ｉ）システイン残基の硫黄原子によるチオール反応性基中に存在する脱離基Ｙの求核置換、例えばブロモアセトアミド基、ヨードアセトアミド、４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ基、アルキルスルホン、又はヘテロアリールスルホン；（ｉｉ）チオール反応性基、例えばマレイミドの活性化された二重結合への、システイン残基のＨＳ−基の付加、あるいは（ｉｉｉ）システイン残基の硫黄原子での、例えば脱離基としてのピリジン−２−チオール、５−ニトロピリジン−２−チオール又はメタンスルフィナートでの、活性化されたジスルフィド又はメタンチオスルホネートのジスルフィド交換；あるいは（ｉｖ）システイン残基の硫黄原子と、チオール反応性基の一部分である反応性部分との間の安定な結合をもたらす、任意の他の化学反応、によって生じる構造を指す。

【0059】

チオール基のカップリングから生じる主要部分は、場合によりさらに誘導体化されてもよく、例えばマレイミドから生じるスクシンイミジルチオエーテルは、以下の一般構造のスクシンアミド酸チオエーテルに加水分解することができる。

【0060】

【化1】

【0061】

本発明の文脈において、「チオール反応性基」という用語は、特に６．０〜８．０の範囲のｐＨ値で、より具体的には６．５〜７．５の範囲のｐＨ値で、抗体の遊離システインのチオール基と選択的に反応する基を指す。特に、「選択的に」という用語は、チオール反応性基を含む分子と、少なくとも１つの遊離システイン残基を含む抗体とのカップリング反応の１０％未満が、抗体の非システイン残基、例えばリシン残基とのカップリング反応であり、特に５％未満、より具体的には２％未満であることを意味する。

【0062】

特定の実施形態では、チオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分は、以下：１つの硫黄原子が抗体のシステイン残基に由来する、チオール置換アセトアミド；チオール置換スクシンイミド；チオール置換スクシンアミド酸；チオール置換ヘテロアリール、特にチオール置換ベンゾチアゾール、チオール置換フェニルテトラゾール及びチオール置換フェニルオキサジアゾール；及びジスルフィド、から選択される。特定の実施形態では、チオール反応性基へのチオール基のカップリングから生じる部分は、チオール置換スクシンイミドである。

【0063】

「抗体又は機能的抗体フラグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な一部分、すなわち抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子、すなわち少なくとも抗体の抗原結合フラグメントを含む抗体の一部分を指す。例えば、標的分子に、例えば標的タンパク質Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ又はＥｐＣＡＭに、特異的に結合するファージディスプレイを含む技術を介して選択される、免疫グロブリン様タンパク質も含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）あるいはサブクラスの免疫グロブリン分子で有り得る。特定の実施形態では、当該抗体はＩｇＧ１である。本発明における使用に適した「抗体及びその抗原結合フラグメント」には、これらに限定されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、一価、二重特異性、ヘテロコンジュゲート、多重特異性、ヒト、ヒト化（特に、ＣＤＲ−グラフト化）、脱免疫化、またはキメラ抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）₂フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されるフラグメント、ナノボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）、ＦｙｎｏｍＡｂｓ（Brackら、Mol.Cancer Ther.13(2014)2030）、並びに、本発明に係る重鎖フレームワーク位置の少なくとも１つを含む上述のいずれかのエピトープ結合フラグメント、が挙げられる。

【0064】

いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、これらに限定されるものではないが、本発明に係る重鎖フレームワーク位置の少なくとも１つを含む、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）₂、Ｆｄ、及び抗体重鎖の少なくとも一部を含む他のフラグメントが挙げられる。そのような抗原結合抗体フラグメントは、可変ドメイン（複数）を、単独で、以下：ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン、の全体又は一部分と組み合わせて、含んでもよい。可変ドメイン（複数）と、ヒンジ領域、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせも含むそのような抗原結合フラグメントも、本発明に含まれる。

【0065】

本発明に使用可能な抗体は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物起源由来であってもよい。好ましくは、当該抗体は、ヒト、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、またはウサギ）、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌ起源由来である。当該抗体はヒト又はマウス起源であることが特に好ましい。本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、かつ、ヒト免疫グロブリンライブラリーから、又は内在性免疫グロブリンを発現しない１つ以上のヒト免疫グロブリンの遺伝子導入動物から単離された抗体を含み、例えばKucherlapati及びJakobovitsによる米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載される。

【0066】

本明細書で使用される場合、抗体又は機能的抗体フラグメントは、１００μＭ以下、好ましくは５０μＭ以下、好ましくは３０μＭ以下、好ましくは２０μＭ以下、好ましくは１０μＭ以下、好ましくは５μＭ以下、より好ましくは１μＭ以下、より好ましくは９００ｎＭ以下、より好ましくは８００ｎＭ以下、より好ましくは７００ｎＭ以下、より好ましくは６００ｎＭ以下、より好ましくは５００ｎＭ以下、より好ましくは４００ｎＭ以下、より好ましくは３００ｎＭ以下、より好ましくは２００ｎＭ以下、さらにより好ましくは１００ｎＭ以下、さらにより好ましくは９０ｎＭ以下、さらにより好ましくは８０ｎＭ以下、さらにより好ましくは７０ｎＭ以下、さらにより好ましくは６０ｎＭ以下、さらにより好ましくは５０ｎＭ以下、さらにより好ましくは４０ｎＭ以下、さらにより好ましくは３０ｎＭ以下、さらにより好ましくは２０ｎＭ以下、及びさらにより好ましくは１０ｎＭ以下の、標的としての前記抗原に対する解離定数Ｋ_Dを有する場合に、抗原に「特異的に結合する」と考えられる。

【0067】

本願の文脈において、「標的分子」及び「標的エピトープ」という用語はそれぞれ、抗原及び抗原のエピトープを指し、それぞれ、抗体又は機能的抗体フラグメントによって特異的に結合される。好ましくは当該標的分子は腫瘍関連抗原であり、特に、非腫瘍細胞の表面と比較して、増加した濃度で及び／又は異なる立体配置での１つ以上の腫瘍細胞型又は腫瘍関連細胞の表面に存在する、抗原又はエピトープである。好ましくは、前記抗原又はエピトープは１つ以上の腫瘍又は腫瘍間質の細胞型の表面に存在するが、非腫瘍細胞の表面には存在しない。特定の実施形態では、当該抗体はＨＥＲ−２／ｎｅｕ又は上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）のエピトープに特異的に結合する。他の実施形態では、前記抗原又はエピトープは、自己免疫疾患に関与する細胞上で優先的に発現される。特定のそのような実施形態では、当該抗体はＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）のエピトープに特異的に結合する。他の実施形態では、前記抗原又はエピトープは炎症性疾患に関与する細胞上で優先的に発現される。

【0068】

特定の実施形態では、抗体又は機能的抗体フラグメントは、腫瘍細胞上に存在するエピトープに特異的に結合し、ここで、特に抗体はヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）のエピトープに特異的に結合する。

【0069】

特定の実施形態では、抗体は、トラスツズマブ（Trastuzumab）又はＨＥＡ１２５、あるいはトラスツズマブ又はＨＥＡ１２５の抗原結合フラグメントを含む抗体フラグメントである。

【0070】

特定の実施形態では、２つ以上のアマトキシン分子が、１つの抗体又は１つの機能的抗体フラグメントにカップリングされる。コンジュゲートあたりのアマトキシンの数の増加は毒性も増大させることになる。しかしながら、増加は同時に忍容性を低下させる。従って、特定の実施形態では、アマトキシンに対する抗体又は機能的抗体フラグメントの比は、１〜４個のアマトキシン分子、特に１．５〜３．５個のアマトキシン分子、より具体的には１．８〜２．５個のアマトキシン分子、より具体的には約２個のアマトキシン分子に対して、１つの抗体又は１つの機能的抗体フラグメントの間である。抗体二量体、例えばＩｇＧの場合の比率の計算のために、二量体は１つの部分として考えられる。

【0071】

特定の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ダイアボディ、テトラボディ、ナノボディ、キメラ抗体、脱免疫化抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体から選択される。

【0072】

特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、及びジスルフィド結合Ｆｖ（ｄｓＦｖ）からなる群から選択される。

【0073】

本発明の文脈において、「重鎖１１８Ｃｙｓ」、「重鎖２３９Ｃｙｓ」、及び「重鎖２６５Ｃｙｓ」という用語は、ヒトＩｇＧ１抗体配列の重鎖における位置を指し、ここでのナンバリングは、Edelmanらの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA;63(1969)78-85に従ったＥＵナンバリングシステムである。例えば、親ヒトＩｇＧ１配列としてのハーセプチン（Herceptin）（登録商標）（トラスツズマブ）から始まる場合、以下の突然変異のいずれか１つがなされなければならない：ＨＣ−Ａｌａ１１８Ｃｙｓ；ＨＣ−Ｓｅｒ２３９Ｃｙｓ又はＨＣ−Ａｓｐ２６５Ｃｙｓ。

【0074】

第３の態様において、本発明は、以下の一般式コンジュゲート：
Ａｍａ−Ｌ−Ｘ−Ｓ−Ａｂ
を合成するための方法であって、
化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’（式中、Ｘ’はチオール反応性基である）と、
抗体Ａｂ−ＳＨ（式中、基−ＳＨはシステインアミノ酸残基のチオールであり、そしてＡｂは当該システイン残基を含む抗体配列であって、ここで、当該システイン残基は以下のリスト：重鎖１１８Ｃｙｓ、重鎖２３９Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓ、特に：重鎖１１８Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓから選択される）とを、
反応させることによる、方法に関する。

【0075】

第４の態様において、本発明は、以下、
（ｉ）化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’（式中、Ｘ’はチオール反応性基である）、並びに
（ｉｉ）抗体Ａｂ−ＳＨ（式中、基−ＳＨはシステインアミノ酸残基のチオールであり、そしてＡｂは当該システイン残基を含む抗体配列であって、ここで、当該システイン残基は以下のリスト：重鎖１１８Ｃｙｓ、重鎖２３９Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓ、特に：重鎖１１８Ｃｙｓ、及び重鎖２６５Ｃｙｓから選択される）
を含む、キットに関する。

【0076】

特定の実施形態では、チオール反応性基Ｘ’は、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、メチルスルホニルベンゾチアゾール、４，６−ジクロロ−１，３，５−トリアジン−２−イルアミノ基メチルスルホニルフェニルテトラゾール又はメチルスルホニルフェニルオキサジアゾール、ピリジン−２−チオール、５−ニトロピリジン−２−チオール、メタンチオスルホネート、及びマレイミドから選択される。

【0077】

したがって、本発明の特定の実施形態では、Ｘ’は、操作されたシステイン残基の求核基がマレイミドの二重結合にカップリングし得る、マレイミド部分構造である。

【0078】

第５の態様において、本発明は、化合物Ａｍａ−Ｌ−Ｘ’を合成するための方法であって、
式中、Ｘ’はマレイミド基であり、
前記方法が、
（ａ）求核基を含むアマトキシンと、
化合物Ｙ−Ｌ−Ｘ’’
（式中、
Ｙは脱離基であり、そして
Ｘ’’は保護されたマレイミド基である）とを、
反応させるステップを含む、方法に関する。

【0079】

特定の実施形態では、当該方法は、
（ｂ）Ｘ’’から保護基を除去する、
追加のステップを含む。

【0080】

好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、脱離基Ｙが、Ｂｒ、Ｉ、トシレート又はメシレートから選択され、かつ、Ｘ’’が塩基性条件に対して安定である、塩基性条件下で行われる。

【0081】

特定の実施形態では、Ｘ’’は、マレイミドと１，３−ジエンとの反応から得られるディールス・アルダー付加物である。特定の実施形態では、ステップ（ｂ）は、逆ディールス・アルダー反応による保護基の除去を含む。

【0082】

より具体的な実施形態では、Ｘ’’が、ステップ（ａ）におけるマレイミドと、シクロペンタジエン、フラン又は２，５−ジアルキルフランとの反応から得られるディールス・アルダー付加物であり、ここで、脱保護ステップ（ｂ）は高温で極性非プロトン性溶媒中で行われる。

【0083】

最も具体的には、Ｘ’’は、ステップ（ａ）におけるマレイミドと２，５−ジメチルフランとの反応から得られるディールス・アルダーエキソ付加物であり、ここで、脱保護ステップ（ｂ）は８０℃〜１２０℃の温度でジメチルスルホキシド又はＮ−メチルピロリドン中で行われる。

【0084】

【化2】

【0085】

第６の態様において、本発明は、本発明に係るコンジュゲートを含有する、医薬組成物に関する。

【0086】

別の態様では、本発明は、薬剤としての使用のための本発明のコンジュゲートに関する。

【0087】

第７の態様において、本発明は、標的を提示する細胞に関連する疾患の処置方法であって、以下のステップ：
当該細胞と、前記抗体又は前記機能的抗体フラグメントが当該標的に特異的である、本発明に係るコンジュゲートとを接触させること、
を含む、方法に関する。

【0088】

別の態様では、本発明は、患者における疾患の処置における使用のための本発明のコンジュゲートに関し、ここで特に、当該疾患はがん、特に以下、乳癌、膵臓癌、胆管癌、結腸直腸癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、前立腺癌、胃癌、腎臓癌、悪性黒色腫、白血病、および悪性リンパ腫、からなる群から選択されるがんである。

【0089】

本明細書で使用される場合、「患者」とは、本明細書に記載された抗体トキシンコンジュゲートでの処置から恩恵を受け得る、任意の哺乳類又は鳥類を意味する。好ましくは、「患者」は、実験動物（例えばマウス又はラット）、家畜（例えばモルモット、ウサギ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ウシ、ウマ、ロバ、ネコ、又はイヌを含む）、あるいはヒトを含む霊長類、からなるから選択される。「患者」はヒトであることが特に好ましい。

【0090】

本明細書で使用される場合、疾患又は障害の「処置する（treat）」、「処置すること（treating）」又は「処置（treatment）」とは、以下：（ａ）障害の重症度を低減し；（ｂ）処置される障害（複数）に特徴的な症状の発症を制限又は予防し；（ｃ）処置される障害（複数）に特徴的な症状の悪化を阻止し；（ｄ）障害（複数）を以前に有したことがある患者における障害（複数）の再発を制限又は予防し；並びに（ｅ）以前に障害（複数）の症状を呈した患者における症状の再発を制限又は予防すること、の１つ以上を達成することを意味する。

【0091】

本明細書で使用される場合、処置とは、患者に、本発明に係るコンジュゲート又は医薬組成物を投与することを含み得る。ここで、「投与すること」は、生体内投与、並びに生体外組織への直接投与、例えば静脈移植を含む。

【0092】

特定の実施形態では、治療上有効量の本発明のコンジュゲートが使用される。

【0093】

「治療上有効量」とは、意図した目的を達成するのに十分な治療剤の量である。所与の治療剤の有効量は、薬剤の性質、投与の経路、治療剤を受ける動物の大きさ及び種、並びに投与の目的などの要因によって異なることになる。各々の個別の場合における有効量は、当該技術分野において確立された方法に従って当業者により経験的に決定され得る。

【0094】

別の態様では、本発明は、本発明に係るアマトキシンを含有し、さらに、１つ以上の薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、充填剤、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、崩壊剤、吸着剤；及び／又は保存剤を含有する、医薬組成物に関する。

【0095】

「薬学的に許容される」とは、連邦若しくは州政府の規制当局に認可されているか、あるいは、米国薬局方、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用のために一般に認められた他の薬局方に記載されていることを意味する。

【0096】

特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与される薬剤の形態で使用される。これは、非経口を含み、とりわけ注射剤及び注入剤を含む。注射剤は、アンプル又はいわゆるすぐに使える（ready-for-use）注射剤、例えばすぐに使えるシリンジ又は使い捨ての（single-use）シリンジの形態のいずれかで、及びそれに加えて複数回の抜き取りのために穿刺可能なフラスコ中で、製剤化される。注射剤の投与は、皮下（ｓ．ｃ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）又は皮内（ｉ．ｃ．）適用の形態であり得る。特に、結晶の懸濁液、溶液、ナノ粒子又は例えばヒドロゾルのようなコロイド分散系として、それぞれ好適な注射製剤を製造することが可能である。

【0097】

注射用製剤はさらに、水性等張希釈剤により溶解又は分散させることができる濃縮物として製造することができる。注入剤は、等張溶液、脂肪乳剤、リポソーム製剤及びマイクロエマルジョンの形態で調製することもできる。注射剤と同様に、注入製剤は希釈用の濃縮物の形態で調製することもできる。注射用製剤は、例えばミニポンプにより、入院療法及び外来療法双方における持続的な（permanent）注入剤の形態で適用することもできる。

【0098】

例えば、アルブミン、血漿、増量剤（expander）、表面活性物質、有機希釈剤、ｐＨ調整物質、錯化（complexing）物質又は高分子物質を、特に本発明の抗体トキシンコンジュゲートのタンパク質又はポリマーへの吸着に影響を及ぼす物質として、非経口製剤に加えることができ、あるいは、注射器又は包装材料、例えばプラスチック若しくはガラスなどの材料への、本発明の抗体トキシンコンジュゲートの吸着を減少させる目的でこれらを加えることもできる。

【0099】

抗体を含む本発明のアマトキシンは、非経口剤などの中のマイクロ担体又はナノ粒子に、例えば、ポリ（メタ）アクリル酸塩、ポリ乳酸塩、ポリグリコール酸塩、ポリアミノ酸又はポリエーテルウレタンをベースとする微分散粒子に、結合することができる。非経口製剤は、本発明の抗体トキシンコンジュゲートがそれぞれ微分散形態、分散形態及び懸濁形態で導入される場合、例えば「複数単位原理(multiple unit principle）」に基づいてデポー製剤として、あるいは、本発明の抗体トキシンコンジュゲートがその後埋め込まれる製剤中に、例えば錠剤又は棒剤（rod）中に封入される場合、「単一単位原理（single unit principle）」に基づいて、又は薬剤中の結晶の懸濁液として変更することもできる。単一単位製剤及び複数単位製剤でのこれらの埋め込み剤又はデポー製剤は、多くの場合、いわゆる生分解性ポリマー、例えば乳酸及びグリコール酸のポリエステル、ポリエーテルウレタン、ポリアミノ酸、ポリ（メタ）アクリル酸塩又は多糖類などからなる。

【0100】

非経口剤として製剤化される本発明の医薬組成物の製造時に加えられる補助剤及び担体は、好ましくは滅菌水（aqua sterilisata(sterilized water））、ｐＨ値調整物質、例えば有機酸若しくは無機酸若しくは有機塩基若しくは無機塩基及びその塩等、ｐＨ値調整用の緩衝物質、等張化用の物質、例えば塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、グルコース及びフルクトース等、それぞれ界面活性剤（tensides）及び界面活性剤（surfactants）、並びに乳化剤、例えばポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸の部分エステル（例えばＴｗｅｅｎ（登録商標））、若しくは例えばポリオキシエチレンの脂肪酸エステル（例えばＣｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標））等、脂肪油、例えば落花生油、大豆油若しくはヒマシ油等、脂肪酸の合成エステル、例えばオレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び中性油（例えばＭｉｇｌｙｏｌ（登録商標））等、並びに高分子補助剤、例えばゼラチン、デキストラン、ポリビニルピロリドン等、有機溶媒の溶解度を増加させる添加剤、例えばプロピレングリコール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、プロピレングリコール等、又は錯体形成物質、例えばクエン酸塩及び尿素等、保存料、例えば安息香酸ヒドロキシプロピルエステル及びメチルエステル、ベンジルアルコール等、酸化防止剤、例えば亜硫酸ナトリウム等、並びに安定化剤、例えばＥＤＴＡ等である。

【0101】

好ましい実施形態において懸濁剤として本発明の医薬組成物を製剤する場合、本発明の抗体トキシンコンジュゲートの硬化を防止する増粘剤、又は沈殿物の再懸濁を確実にする界面活性剤及び多価電解質、及び／又は、例えばＥＤＴＡ等の錯体形成剤が加えられる。活性成分の様々なポリマーとの錯体を得ることも可能である。そのようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール、ポリスチレン、カルボキシメチルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）又はポリエチレングリコールソルビット脂肪酸エステル（polyethylene glycol sorbit fatty acid ester）である。本発明の抗体トキシンコンジュゲートはまた、例えばシクロデキストリンを用いた封入化合物の形態で液体製剤に取り込まれ得る。特定の実施形態では、分散剤をさらなる補助剤として加えることができる。凍結乾燥物の製造のために、スキャホールド剤（scaffolding agents）、例えばマンニット、デキストラン、サッカロース、ヒトアルブミン、ラクトース、ＰＶＰ又は様々なゼラチンなどを使用することができる。

【実施例】

【0102】

以下に、非限定的な例によって本発明をさらに詳細に説明する。

【0103】

実施例１
システイン突然変異体の操作及びカップリング条件
１．１ 抗体産生
図２は、ＩｇＧ１分子の概略図、並びにシステイン残基に突然変異された、トキシンカップリングのためのアミノ酸残基の位置を示す。全ての抗体は、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを用いて一過性トランスフェクションによって、真核Ｅｘｐｉ２９３細胞（Life Technologies）において産生される（図３）。Ｃｙｓ置換のための突然変異を有する遺伝子配列はＧｅｎｅＡｒｔによって合成され、エンドヌクレアーゼ及びリガーゼ酵素に基づく標準的な分子クローニング方法によって発現プラスミドに導入される。クローニング実験からの結果を、酵素制限分析及びシークエンシング（GATC Biotech、ドイツ）により確認した。トランスフェクションのために、Ｅｘｐｉ２９３細胞をＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒ振とうフラスコ中で、１２５ｒｐｍ及び８％のＣＯ₂で、約３．０ｘ１０⁶細胞／ｍｌの密度まで培養した。ＤＮＡ及びＰＥＩ試薬複合体を２：３の重鎖：軽鎖比を有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地中で生成した。培地へのＤＮＡ：ＰＥＩ複合体の添加後、Ｅｘｐｉ２９３細胞を２４時間インキュベートした。細胞を４６０ｇ及び室温で１５分間遠心分離し、長期生成を確実にするために培地を交換した。細胞生存率をモニターし、４〜６日後に細胞を沈殿させ、タンパク質Ａカラム（Tosoh Biosience）を使用してＢｉｏ−Ｒａｄ ＦＰＬＣシステムによって上清からモノクローナル抗体を精製した。凝集体及びエンドトキシンを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ−２００ゲル濾過カラム（GE Healthcare）を使用する最終精製（polishing）クロマトグラフィーによって除去した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＵＶ分光法、分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣ及びエンドトキシンＥＬＩＳＡを使用して、抗体を特定した。精製された抗体の典型的な収量は凝集体＜１％を有する１リットルの培地あたり約８０〜１２０ｍｇであった。

【0104】

１．２ マレイミド−アマトキシンカップリング
マレイミド−アマトキシン誘導体のコンジュゲーションのために、例えばＨＤＰ３０．０８８０及びＨＤＰ３０．１６９９、システイン置換を有する抗体を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡで５．０ｍｇ／ｍｌに調整し、４０ｅｑｓ．のＴＣＥＰによって３時間３７℃で還元した。還元された抗体を、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡでの２つの連続透析ステップによって精製し、その後、鎖間ジスルフィドを２０ｅｑｓ．のデヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）によって４時間室温で酸化した。置換されたシステインに対するトキシンカップリングを、８〜１５ｅｑｓ．のマレイミド−アマトキシン誘導体を１時間室温で加え、次いで２５ｅｑｓ．のＮ−アセチル−Ｌ−システインで反応をクエンチすることによって行った。アマトキシン−ＡＤＣｓを、ＰＤ−１０カラムを使用するゲル濾過クロマトグラフィー又はＧ−２５ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）クロマトグラフィー（GE Healthcare）によって精製した。ＡＤＣｓの薬物抗体比（ＤＡＲ）を、抗体及びα−アマニチンの吸光係数を使用して２８０ｎｍ及び３１０ｎｍでのＵＶ分光法によって決定した。さらに、ＤＡＲを、ネイティブなＬＣ−ＭＳ（図４（Ａ））及び重鎖／軽鎖ＬＣ−ＭＳ分析（図４（Ｂ）、４（Ｃ））によって決定した。ＬＣ−ＭＳによれば、ＤＡＲはＩｇＧあたり１．８〜２．２個のアマニチンの範囲であり、薬物は重鎖のみに位置している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗アマニチン抗血清を使用するウェスタンブロッティング、分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＨＩＣ−ＨＰＬＣ及びＲＰ−ＨＰＬＣによって、ＡＤＣｓの品質を確認した。ＡＤＣｓを３．０〜５．０ｍｇ／ｍｌに調整し、細胞培養及びイン・ビボモデルでのさらなる使用までｐＨ７．４のＰＢＳ中で４℃で保存した。

【0105】

実施例２
６’（６−Ｎ−マレイミド−ヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．０８８０）
ステップ１：１，７−ジメチル−１０−オキサ−４−アザトリシクロ［５．２．１．０^2,6］デカ−８−エン−３，５−ジオン、エキソ異性体（ＨＤＰ ３０．０８９１）

【0106】

【化3】

【0107】

４．００ｇ（４１．２ｍｍｏｌ）の２，５−ジメチルフラン及び５．９３ｇ（６１．７ｍｍｏｌ、１．５当量）のマレイミドを３０ｍｌのジエチルエーテルに溶解し、Ｐａｒｒ反応器中で１２時間９０℃に加熱した。得られた沈殿物を濾別し、メタノールから再結晶化した：６．６２ｇ（８３％）結晶融点１３７℃。
¹H NMR(CDCl₃, 500 MHz)δ(ppm):8.68(broad singlet, 1H), 6.31(singlet, J, 2H), 2.88(singlet, 2H), 1.73(singlet, 6H).¹³C NMR(CDCl₃, 100 MHz)δ(ppm):175.04, 140.82, 87.68, 53.77, 15.76.

【0108】

ステップ２：４−（６−ブロモヘキシル）−１，７−ジメチル−１０−オキサ−４−アザトリシクロ［５．２．１．０^2,6］デカ−８−エン−３，５−ジオン、エキソ異性体（ＨＤＰ ３０．０９１６）

【0109】

【化4】

【0110】

３８６ｍｇ（２ｍｍｏｌ）のＨＤＰ ３０．０８９１及び１．９５２ｇ（８ｍｍｏｌ）の１，６−ジブロモヘキサンを２０ｍｌのＤＭＦに溶解し、２７６ｍｇ（２ｍｍｏｌ）の炭酸カリウムを添加し、懸濁液を５０℃に３時間加熱した。その後ＤＭＦを蒸発させ、残渣を１００ｍｌのジクロロメタンに取った。無機塩を濾過により除去し、珪藻土（３ｇ）を濾液に加え、溶媒を真空下で除去した。ｎ−ヘキサン−酢酸エチルの勾配で溶離するシリカゲルクロマトグラフィーによって残渣を精製して、ＨＤＰ ３０．０９１６（４８３ ｍｇ）を蝋状結晶として６８％の収率で得た。
¹H NMR(500 MHz, CDCl₃)δ(ppm)6.31(s, 2H), 3.48(t, J=7.2 Hz, 2H), 3.39(t, J=6.8 Hz, 2H), 2.81(s, 1H), 1.90-1.77(m, 2H), 1.70(s, 5H), 1.64-1.52(m, 2H), 1.44(dddd, J=9.2, 7.4, 6.5, 5.4 Hz, 2H), 1.35-1.23(m, 2H).
¹³C NMR(126 MHz, CDCl₃)δ 174.81, 140.81, 87.52, 52.33, 38.42, 33.65, 32.50, 27.54, 27.33, 25.64, 15.87.

【0111】

ステップ３：６´−（６−（１，７−ジメチル−１０−オキサ−４−アザトリシクロ［５．２．１．０^2,6］デカ−８−エン−３，５−ジオン−４−イル−ヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．０９０３）

【0112】

【化5】

【0113】

アルゴン下及び室温で３４．５ｍｇ（３７．５μｍｏｌ）の真空乾燥したα−アマニチンを１０００μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ＨＤＰ ３０．０９１６（１０６．８ｍｇ、８当量）及び１Ｍの水酸化ナトリウム（４１．２μｌ、１．１当量）を添加した。室温で３時間後、反応混合物を、４１．２μｌのＤＭＳＯ中の１Ｍ酢酸溶液でｐＨ＝５に酸性化した。溶媒を真空中で除去し、残渣を５〜１００％メタノールからの勾配を用いてＣ１８カラムでの分取ＨＰＬＣに供した。生成物を含有する画分を蒸発させて、２７．２ｍｇ（５９％）のＨＤＰ ３０．０９０３を白色固体として得た。
MS(ESI⁺)1194.17 [M+H]⁺, 1216.10 [M+Na]⁺

【0114】

ステップ４：６´−（６−Ｎ−マレイミド−ヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．０８８０）

【0115】

【化6】

【0116】

ＨＤＰ ３０．０９０３（２７．２ｍｇ、２２．７μｍｏｌ）を３０００μｌの乾燥ジメチルスルホキシドに溶解した。反応混合物を撹拌しながら１．５時間１００℃に加熱した。４０℃に冷却後、ＤＭＳＯを真空中で除去し、残渣を上述の方法で分取ＨＰＬＣによって精製した。

【0117】

１７．３〜１８．１分の保持時間を有する画分を集め、溶媒を蒸発させた。残渣を３ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノールから凍結乾燥して、２３．６ｍｇ（９４％）のＨＤＰ ３０．０８８０をオフホワイトの粉末として得た。
MS(ESI⁺)1098.29 [M+H]⁺, 1120.36 [M+Na]⁺

【0118】

実施例２の方法を当業者に明らかな変更と共に使用することによって、以下の例を調製した。

【0119】

【表1】

【0120】

実施例１５
６´−Ｏ−（６−（６−（Ｎ−マレイミド）−ヘキサンアミド）ヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１９４８）

【0121】

【化7】

【0122】

１０．０ｍｇ（８．８３μｍｏｌ）の６´−Ｏ−（−６−アミノヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．０１３４、欧州特許出願公開第２６２１５３６号明細書に開示されたように合成した）を、４００μｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、その後ＤＭＦ中の２０ｍＭの６−（マレイミド）ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）の６６３μｌ、及びＤＭＦ中の１ＭのＤＩＰＥＡの１７．７μｌを添加した。室温で５時間後、１００μｌの水を反応混合物に添加し、揮発物を蒸発させた。
粗生成物を水−メタノール勾配でのＲＰ１８ ＨＰＬＣによって精製し、純粋画分をｔ−ブタノール／水から凍結乾燥した：９．０２ｍｇ（８４％）ＨＤＰ ３０．１９４８、無色粉末として。
MS(ESI⁺) found:1210.99; calc.:1211.54 [MH]⁺(C₅₅H₇₉N₁₂O₁₇S)
found:1233.32; calc.:1233.52 [M+Na]⁺(C₅₅H₇₈N₁₂NaO₁₇S)

【0123】

実施例１６
６´−Ｏ−（６−（Ｎ−α−マレイミド）−Ｌ−２，３−ジアミノプロパンアミド）ヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１９５８）

【0124】

【化8】

【0125】

ステップ１：７００μｌのＤＭＦ中の８．２２ｍｇ（１７．６６μｍｏｌ＝２当量）のＭａｌ−Ｌ−Ｄａｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ ｘ ＤＣＨＡに、ＤＭＦ中の１ＭのＤＩＰＥＡの１７．７μｌを添加し、その後９．１９ｍｇ（１７．６６μｍｏｌ＝２当量）のＰｙＢｏｐ及び６．０１μｌ（３５．３３μｍｏｌ＝４当量）のＤＩＰＥＡを添加した。１分後、混合物を、２００μｌの乾燥ＤＭＦで溶解した１０．０ｍｇ（８．８３μｍｏｌ）の６´−Ｏ−（−６−アミノヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．０１３４）に加えた。室温で２時間後、１００μｌの水を反応混合物に添加し、揮発物を蒸発させた。粗生成物をＲＰ１８ ＨＰＬＣにより精製し、純粋画分を蒸発させた：５．４５ｍｇ（４８％）ＨＤＰ ３０．１９５４、非晶質固体として。
MS(ESI⁺) found:1306.58; calc.:1306.54 [M+Na]⁺(C₅₇H₈₁N₁₃NaO₁₉S)

【0126】

ステップ２：Ｂｏｃ−保護されたステップ１生成物を１ｍｌのトリフルオロ酢酸に溶解した。２分後、混合物を室温で蒸発乾固した。メタノールに対する０．０５％ＴＦＡの勾配でＲＰ１８ ＨＰＬＣによって残渣を精製し、純粋画分を蒸発させた：１．７２ｍｇ（３１％）ＨＤＰ ３０．１９５８、非晶質固体として。
MS(ESI⁺) found:1306.58; calc.:1184.50 [M+Na]⁺(C₅₂H₇₄N₁₃O₁₇S)

【0127】

実施例１７
６´−Ｏ−（２−ブロモアセトアミド）ヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１６１９）

【0128】

【化9】

【0129】

４００μｌの乾燥ＤＭＦに溶解した、５．０３ｍｇ（４．４４μｍｏｌ）の６´−Ｏ−（−６−アミノヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．０１３４）に、その後ＤＭＦ中の１００ｍＭのブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの６６．６μｌ、及びＤＭＦ中の１００ｍＭのＤＩＰＥＡの８８．８μｌを添加した。室温で３時間後、５０μｌの水を添加し、反応混合物を１０ｍｌのメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）に滴下した。沈殿物を遠心分離により単離し、１０ｍｌのＭＴＢＥで洗浄した。粗生成物を水−メタノール勾配でＲＰ１８ ＨＰＬＣによって精製し、純粋画分をｔ−ブタノール／水から凍結乾燥した：３．７０（７３％）ＨＤＰ ３０．１６１９、無色粉末として。
MS(ESI⁺) found:1139.58; calc.:1138.39 [M+H]⁺(C₄₇H₆₉BrN₁₁O₁₅S)
found:1160.42; calc.:1160.37 [M+Na]⁺(C₄₇H₆₈BrN₁₁NaO₁₅S))

【0130】

実施例１８
６´−Ｏ−（２−ブロモアセトアミド）プロピル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１６１８）

【0131】

【化10】

【0132】

欧州特許出願公開第２６２１５３６号明細書に開示された、６´−Ｏ−（−３−アミノプロピル）−α−アマニチンへの実施例１６からの方法の適用により、ブロモアセトアミドＨＤＰ ３０．１６１８を合成した：
MS(ESI⁺) found:1096.22; calc.:1096.34 [MH]⁺(C₄₄H₆₃BrN₁₁O₁₅S)
found:1118.45; calc.:1118.32 [M+Na]⁺(C₄₄H₆₂BrN₁₁NaO₁₅S)

【0133】

実施例１９
６’−［６−（６−（４−（５−（メチルスルホニル）−１，２，４−オキサジアゾール−２−イル）−フェニルオキシ）ヘキシルアミノカルボニル）−アミノヘキシル）］−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１９２６）

【0134】

【化11】

【0135】

メチルスルホニル−１，２，４−オキサジアゾールリンカーを、Todaらによって、Angew.Chem.Int.Ed.2013,52,12592 -12596に開示された方法の変化法によって合成した。

【0136】

ステップ１：１−アジド−６−ブロモヘキサン

【0137】

【化12】

【0138】

１，６−ジブロモヘキサン（７．３２ｇ、３０ｍｍｏｌ）を、６０ｍｌのＤＭＦ中のアジ化ナトリウム（１．９５ｍｇ、３０ｍｍｏｌ）と一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を１００ｍｌの酢酸エチルと５分間撹拌した。無機塩を濾別し、ヘキサン中の０〜２０％ジクロロメタン勾配でのシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって、モノアジドをジブロミド及びジアジドから分離して、２．２６ｇ（３７％）の生成物を、油状物として得た。
¹H NMR(500 MHz, CDCl₃)δ 3.42(t, J=6.7 Hz, 2H), 3.28(t, J=6.9 Hz, 2H), 1.88(dt, J=14.6, 6.8 Hz, 2H), 1.62(dt, J=14.3, 7.0 Hz, 2H), 1.53-1.36(m, 4H).
¹³C NMR(126 MHz, CDCl₃)δ 51.43, 33.80, 32.67, 28.82, 27.81, 26.03.

【0139】

ステップ２：エチル ４−［（６−アジドヘキシル）オキシ］ベンゾエート（ＨＤＰ ３０．１８９７）

【0140】

【化13】

【0141】

ＤＭＦ（４０ｍＬ）中のステップ１生成物（４．１２２ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温で４時間、エチル ４−ヒドロキシベンゾエート（３．３２４ｇ、２０ｍｍｏｌ）及びＫ₂ＣＯ₃（５．５２８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を添加した。次に、反応混合物を、２００ｍｌのＭＴＢＥ及び２００μｌの水で希釈した。有機層を分離し、３ｘ１００ｍｌの水で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）及び蒸発乾固させた。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＭＴＢＥ）によって精製して、表題化合物（５．１９９ｇ、８９％）を、無色の油状物として得た。
MS(ESI⁺) found:314.33; calc.:314.15 [M+Na]⁺(C₁₅H₂₁N₃NaO₃)

【0142】

ステップ３：４−［（６−アジドヘキシル）オキシ］ベンゾイルヒドラジド（ＨＤＰ ３０．１８９９）

【0143】

【化14】

【0144】

エタノール（９．０ｍＬ）中のステップ２生成物（５．１９ｇ、１７．８ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒドラジン一水和物（１４５９μＬ、３０ｍｍｏｌ）を室温で添加し、次に混合物を２２時間還流下で撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタンからジクロロメタン／酢酸エチル／メタノール６：３：１勾配）によって精製して、ベンゾイルヒドラジド誘導体ＨＤＰ ３０．１８９９（１．０８ｇ、２２％）を、無色の固体として得た。
MS(ESI⁺) found:278.27; calc.:278.16 [M+H]⁺(C₁₃H₂₀N₅O₂)

【0145】

ステップ４：５−［４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）フェニル］−１，３，４−オキサジアゾール−２−チオール（ＨＤＰ ３０．１９０３）

【0146】

【化15】

【0147】

エタノール（１０．０ｍＬ）中のベンゾイルヒドラジド誘導体（１．０８ｇ、３．８９ｍｍｏｌ）の溶液に、二硫化炭素（１５５２μＬ、２５．６８ｍｍｏｌ）及び粉末ＫＯＨ（２１８ｍｇ、３．８９ｍｍｏｌ）を室温で添加し、次に溶液を８５℃で３時間撹拌した。酢酸エチル及び１ＭのＨＣｌを溶液に添加した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム及びブライン（brine）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル）によって精製して、表題化合物ＨＤＰ ３０．１９０３（１．１８ｇ、９５％収率）を、無色の固体として得た。

【0148】

ステップ５：５−［４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）フェニル］−５−（メチルスルファニル）−１，３，４−オキサジアゾール（ＨＤＰ ３０．１９０５）

【0149】

【化16】

【0150】

ＴＨＦ（１５ｍｌ）中のステップ４のチオール（１．１８ｇ、３．６９ｍｍｏｌ）の溶液に、ヨウ化メチル（２５７μＬ、４．１３ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（６２５μｌ、４．５１ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。次に、混合物を１時間室温で撹拌した。次に水（５０ｍｌ）及び酢酸エチル（１００ｍｌ）を添加し、混合物を１０％のチオ硫酸ナトリウム溶液（１０ｍｌ）で脱色した。有機層を分離し、ブライン（５０ｍｌ）で洗浄し、ＭｇＳＯ₄上で乾燥させた。濾過後、有機溶媒を真空中で除去し、残渣をヘキサン／ＭＴＢＥを用いてシリカゲルで精製して、表題化合物ＨＤＰ ３０．１９０５（１．０３ｍｇ、８４％収率）を、白色固体として得た。
MS(ESI⁺) found:334.27; calc.:334.13 [M+H]⁺(C₁₅H₂₀N₅O₂S)
found:356.29; calc.:356.12 [M+Na]⁺(C₁₅H₁₉N₅NaO₂S)

【0151】

ステップ６：５−［４−（（６−アジドヘキシル）オキシ）フェニル］−５−（メチルスルホニル）−１，３，４−オキサジアゾール（ＨＤＰ ３０．１９１０）

【0152】

【化17】

【0153】

ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のステップ５生成物（１．００ｇ、３．００ｍｍｏｌ）の溶液に、ｍＣＰＢＡ（６８ｗｔ％、２．７９ｍｇ、３．６６ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、次に混合物を２４時間室温で撹拌した。硫酸マグネシウムを添加し、不溶性物質を濾過により除去し、溶媒を真空中で除去した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＭＴＢＥ）によって精製して、表題化合物ＨＤＰ ３０．１９１０（８５８ｍｇ、７８％）を得た。
MS(ESI⁺) found:366.00; calc.:366.12 [M+H]⁺(C₁₅H₂₀N₅O₄S)
found:388.19; calc.:388.11 [M+Na]⁺(C₁₅H₁₉N₅NaO₄S)

【0154】

ステップ７：５−［４−（（（６−スクシンイミジルオキシカルボニルアミノ）ヘキシル）オキシ）フェニル］−５−（メチルスルホニル）−１，３，４−オキサジアゾール（ＨＤＰ ３０．１９１６）

【0155】

【化18】

【0156】

酢酸エチル（１００ｍｌ）中のステップ６生成物（３７０ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（５１９ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ）を添加した。この装置をアルゴンでパージし、パラジウム（活性炭上１０％）を添加し、その後、一晩水素雰囲気下で撹拌した。濾過及び蒸発後、粗生成物を、酢酸エチルに対するヘキサンの勾配を用いてシリカゲルで精製した。純粋画分を合わせ、１，４−ジオキサンから凍結乾燥して、スクシンイミジルカルバメートＨＤＰ ３０．１９１６（２８０ｍｇ、５８％）を、無色の粉末として得た。
MS(ESI⁺) found:481.10; calc.:481.14 [M+H]⁺(C₂₀H₂₅N₄O₈S)
¹H NMR(500 MHz, CDCl₃)d 8.08-8.01(m, 2H), 7.06-6.99(m, 2H), 5.57(t, J=5.9 Hz, 1H), 4.05(t, J=6.4 Hz, 2H), 3.51(s, 3H), 3.28(q, J=6.8 Hz, 2H), 2.83(s, 4H), 1.88-1.77(m, 2H), 1.67-1.39(m, 6H).
¹³C NMR(126 MHz, CDCl₃)d 170.05, 166.73, 163.11, 161.53, 151.44, 129.68, 115.28, 114.03, 68.14, 42.98, 41.90, 29.39, 28.85, 26.23, 25.55, 25.47.

【0157】

ステップ８：６’−［６−（（６−（（４−（５−（メチルスルホニル）−１，２，４−オキサジアゾール−２イル）フェニル）オキシ）ヘキシル）−アミノカルボニルアミノ）ヘキシル］−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１９２６）

【0158】

【化19】

【0159】

５００μｌの乾燥ＤＭＦ中に溶解した、１０．０ｍｇ（８．８３μｍｏｌ）の６´−Ｏ−（−６−アミノヘキシル）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．０１３４、欧州特許出願公開第２６２１５３６号明細書に開示されたように合成した）に、その後５００μｌのＤＭＦに溶解した８．４９ｍｇ（１７．６６μｍｏｌ）、及び６．０１μｌ（３５．３３μｍｏｌ）のＤＩＰＥＡを添加した。室温で１８時間後、揮発物を蒸発させた。粗生成物を水−メタノール勾配を用いてＲＰ１８ ＨＰＬＣにより精製し、純粋画分をｔ−ブタノール／水から凍結乾燥した：７．０４ｍｇ（５８％）ＨＤＰ ３０．１９２６、無色の粉末として。
MS(ESI⁺) found:1383.62; calc.:1383.57 [MH]⁺(C₆₁H₈₇N₁₄O₁₉S₂)
found:1405.54; calc.:1405.55 [M+Na]⁺(C₆₁H₈₆N₁₄NaO₁₉S₂)

【0160】

実施例２０
６’−［（３−マレイミドプロパンアミド）−Ａｈｘ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ］−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１４２６）
ジペプチドｐ−アミノベンジルブロミドを、Ｊｅｆｆｒｅｙらにより、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００５、４８、１３４４−１３５８に開示された方法の適合によって、対応するベンジルアルコールから合成した。一般的な手順は以下のスキームによって例示される。

【0161】

【化20】

【0162】

ステップ１：Ｂｏｃ−Ａｈｘ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ（ＨＤＰ ３０．１２６７）
バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコール（Ｈ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨ）及びＮ−Ｂｏｃ−アミノカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｂｏｃ−Ａｈｘ−ＮＨＳ）の調製は、Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅらによって米国特許第６，２１４，３４５号明細書に開示されている。この方法によって、粗Ｈ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨを、４．７９ｇ（７．９６ｍｍｏｌ）Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＨから調製し、５０ｍｌのＤＭＦに溶解した。Ｂｏｃ−Ａｈｘ−ＮＨＳ（２．８８ｇ、８．７６ｍｍｏｌ）及び１４８９μｌ（８．７６ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミンを添加し、室温で一晩撹拌した。ＤＭＦの蒸発後、残渣を１００ｍｌのＭＴＢＥと共に一晩撹拌し、固体を遠心分離により単離した。ペレットをＭＴＢＥに再懸濁し、再び遠心分離した。生成物を真空乾燥して、４．４４ｇ（９４％収率）のわずかに茶色がかった粉末を得た。
MS(ESI⁺) found:615.19; calc.:615.35 [M+Na]⁺(C₂₉H₄₈N₆NaO₇)

【0163】

ステップ２：Ｂｏｃ−Ａｈｘ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＯＴＢＤＭＳ（ＨＤＰ ３０．１３６２）
ステップ１生成物（４．４４ｇ、７．４９ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのＤＭＦに溶解し、６．３７μｌ（３７．４５ｍｍｏｌ）のＮ−エチルジイソプロピルアミン及び３．３９ｇ（２２．４７ｍｍｏｌ）のｔｅｒｔ−ブチルジメチル−クロロシラン（ＴＢＤＭＳＣｌ）を添加した。３時間後、ＤＭＦを蒸発させ、残渣を１２０ｍｌの酢酸エチル／メタノール５：１と１００ｍｌの０．２Ｍクエン酸との間に分配した。有機層を水及び飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、乾燥させ（ＭｇＳＯ４）、減圧下で濃縮した。粗生成物をジクロロメタン中の０〜１０％メタノールの勾配を用いて１２０ｇシリカゲルから溶離した。純粋画分を合わせ、蒸発させて、２．５０ｇ（４７％）の生成物を固体として得た。
MS(ESI⁺) found:729.29; calc.:729.43 [M+Na]⁺(C₃₅H₆₂N₆NaO₇Si)

【0164】

ステップ３：Ｂｏｃ−Ａｈｘ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ（ＳＥＭ）−ＰＡＢ−ＯＴＢＤＭＳ（ＨＤＰ ３０．１３６８）
ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のステップ２生成物（２．５０ｍｇ、３．５４６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＨ（鉱油中の６０％分散液の１４２ｍｇ、３．５４６ｍｍｏｌ）を添加した。１５分後、純粋な（neat）２−（トリメチルシリル）−エトキシメチルクロリド（ＳＥＭＣｌ）（７０３μｌ、３．５４６ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を８時間撹拌した。珪藻土（１０ｇ）を反応混合物に加え、揮発物を減圧下で除去した。残りの固体をシリカゲルカラムのトップに適用し、ジクロロメタン中の０〜１０％メタノールの勾配を用いて溶離した。純粋画分を合わせ、蒸発させて、非晶質表題化合物の６３７ｍｇ（２１％）を得た。
MS(ESI⁺) found:859.34; calc.:859.52 [M+Na]⁺(C₄₁H₇₆N₆NaO₈Si₂)

【0165】

ステップ４：Ｂｏｃ−Ａｈｘ−Ｖａｌ− Ｃｉｔ（ＳＥＭ）−ＰＡＢ−ＯＨ（ＨＤＰ ３０．１３７０）
ＴＨＦ（２０ｍＬ）中のステップ３生成物（５６７ｍｇ、０．６７７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＢＡＦ（８３３μＬの１．０Ｍ溶液、０．８３３ｍｍｏｌ；１．２当量）を添加した。１時間後、珪藻土（１．５ｇ）を反応混合物に加え、揮発物を減圧下で除去した。残りの固体をシリカゲルカラムのトップに適用し、クロロホルム中の０〜１０％メタノールの勾配を用いて溶離した。純粋画分を合わせ、蒸発させて、２７９ｍｇ（５７％）の生成物を白色固体として得た。
MS(ESI⁺) found:745.28; calc.:745.43 [M+Na]⁺(C₃₅H₆₂N₆NaO₈Si)

【0166】

ステップ５：Ｂｏｃ−Ａｈｘ− Ｃｉｔ（ＳＥＭ）−ＰＡＢ−Ｂｒ（ＨＤＰ ３０．１３８１）
ジクロロメタン（５ｍＬ）中のステップ４生成物（１００ｍｇ、１３９μｍｏｌ）の溶液に、トリフェニルホスフィン（７３ｍｇ、２当量）を添加し、次いで四臭化炭素（９２ｍｇ、２当量）を添加した。１時間後、珪藻土（１ｇ）を反応混合物に加え、揮発物を減圧下で除去した。ジクロロメタン中の０〜１０％メタノールの勾配を用いて１２ｇシリカゲルから溶離して、表題生成物の６１ｍｇ（５６％）を油状物として得る。
MS(ESI⁺) found:807.15/809.17; calc.:807.35/809.34 [M+Na]⁺(C₃₅H₆₁BrN₆NaO₇Si)

【0167】

ステップ６：６’−［Ｂｏｃ−Ａｈｘ− Ｃｉｔ（ＳＥＭ）−ＰＡＢ］−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１３８３）

【0168】

【化21】

【0169】

アルゴン下及び室温で、４４ｍｇ（４７．９μｍｏｌ）の真空乾燥したα−アマニチンを１０００μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。ステップ５生成物（６１ｍｇ、７８．１μｍｏｌ）及び１Ｍ水酸化ナトリウム（５２．７μｌ、１．１当量）を添加した。室温で４時間後、反応混合物をＤＭＳＯ中の１Ｍ酢酸溶液の５２．７μｌでｐＨ＝５に酸性化した。溶媒を真空中で除去し、残渣を、５〜１００％メタノールからの勾配を用いてＣ１８カラム上で分取ＨＰＬＣによって精製した。生成物含有画分を蒸発させて、２５．１ｍｇ（３２％）のＨＤＰ ３０．１３８３を無色の固体として得た。
MS(ESI⁺) found:1646.40; calc.:1645.77 [M+Na]⁺(C₇₄H₁₁₄N₁₆NaO₂₁SSi)

【0170】

ステップ７：６’−［Ｈ−Ａｈｘ− Ｃｉｔ−ＰＡＢ］−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１３８８）

【0171】

【化22】

【0172】

Ｂｏｃ−及びＳＥＭ−保護されたステップ６生成物（１８．４ｍｇ、１１．３μｍｏｌ）を２ｍｌのトリフルオロ酢酸に溶解した。２分後、混合物を室温で蒸発乾固し、２ｍｌの水に再溶解し、３．２％アンモニアを用いてｐＨ１０に滴下調整した。得られた懸濁液を凍結乾燥し、０．０５％ＴＦＡ中の５〜１００％メタノールの勾配を用いてＲＰ１８ ＨＰＬＣに適用し、純粋画分を蒸発させ、２ｍｌの水から凍結乾燥した：１２．１ｍｇ（７１％）ＨＤＰ ３０．１３８８、無色粉末。
MS(ESI⁺) found:1393.42; calc.:1393.66 [M+H]⁺(C₆₃H₉₃N₁₆O₁₈S)

【0173】

ステップ８：

【0174】

【化23】

【0175】

５００μｌの乾燥ＤＭＦに溶解した、９．９８ｍｇ（６．６２μｍｏｌ）のステップ７生成物に、その後５００μｌのＤＭＦ中の５．２９ｍｇ（１９．８６μｍｏｌ）３−（マレイミド）プロパン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＢＭＰＳ）、及び３．３８μｌ（１９．８６μｌ）のＤＩＰＥＡを加えた。室温で２時間後、１００μｌの水を反応混合物に添加し、揮発物を蒸発させた。粗生成物を水−メタノール勾配を用いてＲＰ１８ ＨＰＬＣによって精製し、純粋画分をｔ−ブタノール／水から凍結乾燥した：５．４３ｍｇ（５３％）の表題生成物６’−［（３−マレイミドプロパンアミド）−Ａｈｘ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ］−α−アマニチン、無色の粉末として。
MS(ESI⁺) found:1544.25; calc.:1544.68 [M+H]⁺(C₇₀H₉₈N₁₇O₂₁S)
found:1566.44; calc.:1566.67 [M+Na]+(C₇₀H₉₇N₁₇NaO₂₁S)

【0176】

実施例２１
６’−［Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ］−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１７０２）

【0177】

【化24】

【0178】

出発物質としてＨ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＯＨを用いて実施例２０のステップ１〜７の方法を繰り返すことによって、表題物質を無色の粉末として得た：
MS(ESI⁺) found:1194.58; calc.:1194.53 [M+H]⁺(C₅₄H₇₆N₁₃O₁₆S)
found:1216.75; calc.:1216.51 [M+Na]⁺(C₅₄H₇₅N₁₃NaO₁₆S)

【0179】

出発物質Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ−ＯＨは、ペプチド化学における一般的な方法で調製することができ、Ｈｏｗａｒｄらにより米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５７号明細書に例示されている。

【0180】

実施例２２
６’−（（３−マレイミドプロパンアミド）−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１６９９）

【0181】

【化25】

【0182】

実施例２１からの６’−［Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ］−α−アマニチンを用いて実施例２０のステップ８の方法を使用することによって、表題物質を８１％収率で、無色の粉末として得た：
MS(ESI⁺) found:1345.48; calc.:1345.55 [MH]⁺(C₆₁H₈₁N₁₄O₁₉S)
found:1368.17; calc.:1367.53 [M+Na]⁺(C₆₁H₈₀N₁₄NaO₁₉S)

【0183】

実施例２３
６´−Ｏ−［（（Ｎ−α−マレイミド）−Ｌ−２，３−ジアミノプロパンアミド）−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ］ −α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１９５７）

【0184】

【化26】

【0185】

実施例２１からの６’−［Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ］−α−アマニチンを用いて実施例１６の方法を使用することによって、表題物質を３９％収率で、無色の粉末として得た：
MS(ESI⁺) found:1345.48; calc.:1360,56(C₆₁H₈₂N₁₅O₁₉S)

【0186】

実施例２４
６’−（（２−ブロモアセトアミド）−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１７０４）

【0187】

【化27】

【0188】

実施例２１からの６’−［Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ］−α−アマニチンを用いて実施例１７の方法を使用することによって、表題物質を２６％収率で、無色の粉末として得た：
MS(ESI⁺) found:1314.28; calc.:1314.45 [M+H]⁺(C₅₆H₇₇N₁₃O₁₇S)
found:1336.39; calc.:1336.43 [M+Na]⁺(C₅₆H₇₆N₁₃NaO₁₇S)

【0189】

実施例２５
６’−（（６−（４−（５−（メチルスルホニル）−１，２，４−オキサジアゾール−２−イル）−フェニルオキシ）ヘキシルアミノカルボニル）−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１９１７）

【0190】

【化28】

【0191】

実施例２１からの６’−［Ｈ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ］−α−アマニチンを用いて実施例１９の方法を使用することによって、表題物質を４４％収率で、無色の粉末として得た：
MS(ESI⁺) found:802.63 calc.:802.30 [M+2Na]²⁺(C₇₀H₉₄N₁₆Na₂O₂₁S₂)

【0192】

実施例２６
６’−（（６−（４−（５−（メチルスルホニル）−１，２，４−オキサジアゾール−２−イル）−フェニルオキシ）ヘキシルアミノカルボニル）−Ａｈｘ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ）−α−アマニチン（ＨＤＰ ３０．１９３０）

【0193】

【化29】

【0194】

シトルリンのアラニンへの置換を伴う実施例１９のステップ１〜７の方法によって調製された６’−［Ｈ−Ａｈｘ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ］−α−アマニチンを用いて実施例１９の方法を使用することによって、表題物質を３７％収率で、無色の粉末として得た：
MS(ESI⁺) found:859.02; calc.:858.85 [M+2Na]²⁺(C₇₆H₁₀₅N₁₇Na₂O₂₂S₂)

【0195】

実施例２７
６´−Ｏ−［３−（５−ニトロ−ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル）］−α−アマニチン ＨＤＰ ３０．０９５１
ステップ１：６´−Ｏ−（３−Ｓ−トリチルスルファニル−プロピル）−α−アマニチン ＨＤＰ ３０．０５１７

【0196】

【化30】

【0197】

アルゴン下で４６ｍｇ（５０μｍｏｌ）の真空乾燥したα−アマニチンを２５００μｌの乾燥ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解した。３−（Ｓ−トリチル）−メルカプトプロピル−１−ブロミド（１５９ｍｇ、８当量）を添加し、次いで１Ｍ水酸化ナトリウム溶液の６０μｌを添加した。室温で１．５時間後、反応混合物をＤＭＳＯ中の１Ｍ酢酸の５０μｌでｐＨ＝５に酸性化し、溶媒を蒸発させる。残渣を２００μｌのメタノールに溶解し、１０ｍｌのｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）を満たした遠心管に滴下した。得られた沈殿物を０℃に１０分間冷却し、遠心分離（４０００ｘｇ）によって単離し、その後１０ｍｌのＭＴＢＥで洗浄した。上清を捨て、ペレットを７５０μｌのメタノールに溶解し、Ｃ１８カラム（２５０ｘ２１．２ｍｍ、Ｌｕｎａ ＲＰ−１８、１０μｍ、１００Å）上で分取ＨＰＬＣで３部分に精製した。溶媒Ａ：水、溶媒Ｂ：メタノール；勾配：０分５％Ｂ；５分５％Ｂ；２０分１００％Ｂ；２５分１００％Ｂ；２７分５％Ｂ、３５分５％Ｂ；流量３０ｍｌ／分。２１．１〜２１．８分の保持時間を有する画分を集め、溶媒を蒸発させて、３６．５ｍｇ（５９％）ＨＤＰ ３０．０５１７を、無色の固体として得た。
MS(ESI+)1234.8 [M+H]⁺, 1257.3 [M+Na]⁺

【0198】

ステップ２：６´−Ｏ−［３−（５−ニトロ−ピリジン−２−イルジスルファニル）プロピル）］−α−アマニチン ＨＤＰ ３０．０９５１

【0199】

【化31】

【0200】

ステップ１生成物（５．００ｍｇ、４．０５μｍｏｌ）に、２００μｌのトリフルオロ酢酸に溶解した２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン），ＤＴＮＰ（６．２８ｍｇ、５当量）を添加した。４分後、揮発物を留去し、残渣を１０００μｌのメタノールと共蒸発させた。粗生成物をステップ１と同様にＨＰＬＣ精製した。１８．４６〜１９．２８分の保持時間を有する画分を集め、溶媒を蒸発させ、残渣を２ｍｌのｔｅｒｔ−ブタノールから凍結乾燥して、２．９９ｍｇ（６４％）のＨＤＰ ３０．０９５１をわずかに黄色がかった固体として得た。
MS(ESI⁺)1146.97 [M+H]⁺, 1169.17 [M+Na]⁺

【0201】

実施例２８
図５〜１４に至る実験設定
ＢｒｄＵ取り込みに基づく細胞生存率アッセイ（図１１、１２、１３）
抗原発現腫瘍細胞株に対する化合物の影響を評価するために、２５００細胞／ウェルを９０μｌの培地に播種した。翌日、異なる濃度の抗体−薬物コンジュゲートを含む１０μｌの培地を加えた。ＢｒｄＵ取り込みアッセイ（Cell Proliferation ELISA、BrdU、Roche）を、薬物曝露の７２時間又は９６時間後に実施した。化学発光を、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ化学発光計（BMG LABtech）を使用して測定した。各化合物についてのＥＣ₅₀値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０ソフトウェアを用いたシグモイド用量反応曲線分析によって決定した。

【0202】

ＷＳＴ−Ｉに基づく細胞増殖アッセイ（図８）
Ｆｃｇ−受容体発現ＴＨＰ−１細胞に対する化合物の影響を評価するために、２５００細胞／ウェルを９０μｌの培地に播種した。翌日、異なる濃度の抗体−薬物コンジュゲートを含む１０μｌの培地を加えた。薬物適用の９６時間後、１０μｌの細胞増殖剤ＷＳＴ−１（Roche）を各ウェルに加えた。さらに４時間〜２４時間のインキュベーション後、４４０ｎｍ／６６０ｎｍでの吸光度を、ＦＬＵＯｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ化学発光計（BMG LABtech）を使用して決定した。各化合物のＥＣ₅₀値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ４．０ソフトウェアを使用してシグモイド用量反応曲線分析によって決定した。

【0203】

細胞表面結合アッセイ（図６）
１ｘ１０⁶抗原発現腫瘍細胞を含むＰＢＳ中の１００μｌの細胞懸濁液を、０．１〜５０μｇ／ｍｌの抗体又は抗体−薬物コンジュゲートと共に、又はそれらを含まずに、３０分間４℃でインキュベートした。検出のために、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ Ｆ（ａｂ’）₂−フラグメント（Dianova）を使用した。固定した染色細胞を、ＢＤ ＦＡＣＳｃａｎ装置でＦＡＣＳによって分析した。試料の平均蛍光強度をＢＤ ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ Ｐｒｏソフトウェアを使用して計算し、対照試料値を差し引いた際のＩｇＧ濃度に対してプロットして、結合曲線を得た。

【0204】

クマシーブルー染色でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング（図７）
抗体及び抗体−薬物コンジュゲートを、標準的な方法に従ってアマニチンペイロード（payload）の還元及び非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、次いでクマシーブルー染色、又はウェスタンブロット検出によって分析した。検出のために、タンパク質にコンジュゲートしたアマニチン及びアマニチン−リンカー化合物の検出を可能にする、ポリクローナルウサギ血清を使用した。

【0205】

マウス忍容性及び有効性実験（図９、１４）
１０％を超えない個々の体重減少を引き起こす用量として定義される、最大耐用量（ＭＴＤ）を、抗体−薬物コンジュゲートの単一静脈内用量について評価した。異種移植モデルについて、２４０μｌの培地に懸濁した５ｘ１０⁶個の腫瘍細胞（早期継代数）を、７〜８週齢の雌ＮＭＲＩヌードマウス（Janvier）の右脇腹に皮下注射した。腫瘍が１００〜２００ｍｍ³の平均体積に達したら、動物を、１つの群当たり８匹の動物の処置群に無作為に割り当てた。単回静脈内投与処置を全ての動物に適用した。エンドトキシン濃度＜１ＥＵ（エンドトキシン単位）／ｍｇタンパク質を、Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳシステム（Charles River）を使用することによってイン・ビボの実験に使用した全てのバッチについて実証した。適用量は１０ｍｌ／ｋｇ体重であり、ＰＢＳをビヒクル対照として使用した。腫瘍増殖をキャリパー（caliper）で測定し、腫瘍体積を以下の式を用いて計算した。
Ｔｖｏｌ＝（大径（larger diameter）×（小径（smaller diameter））²×０．５）
マウスを、瀕死状態の時又は示された時点で、ＣＯ₂吸入によって屠殺した。全ての動物実験は、ドイツの動物福祉基準（German animal welfare standards）（ＧＶ−ＳＯＬＡＳ）に従って行われ、責任ある委員会（Regierungsprasidium Karlsruhe、Referat 35）によって承認されている。統計分析をＰｒｉｓｍソフトウェア（GraphPad Software、Inc.）及び１−Ｗａｙ ＡＮＯＶＡを使用して行った。

【0206】

以下の表１は、異なるＨｅｒ２−アマニチン−ＡＤＣｓの治療指数を示す。

【0207】

【表2】

【0208】

カニクイザル（Cynomolgus monkey）忍容性試験（図１０）
非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の毒性試験を、雌のカニクイザル（cynomolgus monkeys）で行った。全ての試験プロトコルは、試験施設動物実験委員会（Animal Care and Use Committee）によって承認された。非ＧＬＰ単回投与毒性試験を３週間間隔で漸増用量の静脈内（ＩＶ）注射を用いて行った。身体検査、体重、摂食量、行動、臨床化学、尿検査および血液学を含む各試験で、総合的な毒性パラメータを評価した。血液試料を様々な時点で採取した。忍容性の例として、血液中のパラメータＬＤＨの経時変化を以下について示す（Ａ）Ｈｅｒ２−３０．０６４３；（Ｂ）Ｈｅｒ２−３０．１４６５；（Ｃ）Ｈｅｒ２−Ａ１１８Ｃ−３０．０８８０；（Ｄ）Ｈｅｒ２−Ｄ２６５Ｃ−３０．０８８０。用量は以下のとおりである（ｉ）０．３ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉ）１ｍｇ／ｋｇ；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ；（ｉｖ）１０ｍｇ／ｋｇ。

【0209】

質量分析（ＬＣ−ＭＳ）（図４、５）
ＭＳ分析の前に、抗体及び抗体薬物コンジュゲートを標準的なプロトコルを用いて脱グリコシル化及び還元した。したがって、ＰＮＧａｓｅ Ｆによる脱グリコシル化及び透析後、抗体及び抗体薬物コンジュゲート溶液をアセトニトリルの添加によって沈殿させ、遠心分離して、沈殿物を６Ｍ塩酸グアニジニウム溶液中に再構成した。軽鎖及び重鎖分析のために、再構成した溶液を２０ｍＭのジチオトレイトールを用いて３０分間５６℃で還元した。次に、脱グリコシル化並びに還元された抗体及び抗体薬物コンジュゲートを、ＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ．イオントラップ質量分析計（Thermo Fisher Scientific）を用いてナノＬＣ−ＭＳによって分析した。方法を分析前にインタクトかつ還元された抗体のために最適化した。最後に得られた質量スペクトルを、データ解析に適切なソフトウェア（ProMass、Thermo Fisher Scientific）によってデコンボリューションした。

【図1】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4(A)-1】

【図4(A)-2】

【図4(B)-1】

【図4(B)-2】

【図4(C)-1】

【図4(C)-2】

【図5(A)-1】

【図5(A)-2】

【図5(B)-1】

【図5(B)-2】

【図5(C)-1】

【図5(C)-2】

【図6】

【図7(A)】

【図7(B)-1】

【図7(B)-2】

【図8(A)】

【図8(B)】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図10-3】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】