特許 6864539 コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法、およびＸ−Ｙ配列量の測定方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6864539

(24)【登録日】2021年4月6日

(45)【発行日】2021年4月28日

(54)【発明の名称】コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法、およびＸ−Ｙ配列量の測定方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/37 20060101AFI20210419BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/37

【請求項の数】6

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2017-87932(P2017-87932)

(22)【出願日】2017年4月27日

(65)【公開番号】特開2018-183106(P2018-183106A)

(43)【公開日】2018年11月22日

【審査請求日】2020年1月30日

(73)【特許権者】

【識別番号】000135151

【氏名又は名称】株式会社ニッピ

(74)【代理人】

【識別番号】100095407

【弁理士】

【氏名又は名称】木村 満

(74)【代理人】

【識別番号】100111464

【弁理士】

【氏名又は名称】齋藤 悦子

(72)【発明者】

【氏名】楠畑 雅

(72)【発明者】

【氏名】寺村 直子

(72)【発明者】

【氏名】飯嶋 克昌

(72)【発明者】

【氏名】林田 治

(72)【発明者】

【氏名】田中 啓友

(72)【発明者】

【氏名】多賀 祐喜

(72)【発明者】

【氏名】服部 俊治

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１５−２１１６５５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１３５２２２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−１３４７５３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−１６９１９９（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）の含有量を測定する工程を含む、前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法。

【請求項2】

ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）の含有量（Ａｓ）を測定する工程と、
前記ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれる前記Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの含有量（Ａｂ）を測定する工程と、
前記含有量（Ａｓ）と前記含有量（Ａｂ）との差を算出する工程とを含む、前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれる潜在的Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法。

【請求項3】

前記Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙが、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐである、請求項１または２に記載の測定方法。

【請求項4】

ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）の含有量を測定し、得られた測定値に、（Ｘ−Ｙの分子量／Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの分子量）を乗じてＸ−Ｙ配列量とする換算工程を含む、前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれるＸ−Ｙ配列量の測定方法。

【請求項5】

ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）の含有量（Ａｓ）およびＸ−Ｙの含有量（Ｂｓ）を測定する工程と、
前記含有量（Ａｓ）に、（Ｘ−Ｙの分子量／Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの分子量）を乗じてＸ−Ｙ配列量（Ｃｓ）とする換算工程と、
前記ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれるＸ−Ｙの含有量（Ｂｂ）を測定する工程と、
含有量（Ｂｓ）＋含有量（Ｃｓ）−含有量（Ｂｂ）を算出する工程とを含む、
前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれる潜在的Ｘ−Ｙ配列量の測定方法。

【請求項6】

前記Ｘ−Ｙが、Ｐｒｏ−Ｈｙｐである、請求項４または５に記載の測定方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法、およびＸ−Ｙ配列量の測定方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ゼラチンやコラーゲンペプチドを経口摂取した場合の血中有効成分や、経口摂取した場合の種々の効果が報告されている。たとえば、平均分子量５，０００〜１２，０００の市販の豚皮由来ゼラチンやトリ由来ゼラチン等を経口摂取して血中ペプチド濃度を経時的に測定し、ゼラチン由来の血中主要ペプチドはＰｒｏ−Ｈｙｐである、とする報告がある（非特許文献１）。実験では、ブタ由来Ｉ型コラーゲンを原料としたゼラチンを経口摂取した場合、血中ジペプチドの９５％がＰｒｏ−Ｈｙｐであり、トリ由来Ｉ型コラーゲンの場合は９２％が、トリ由来ＩＩ型コラーゲンの場合は７０％超がＰｒｏ−Ｈｙｐであると記載する。また、非特許文献２では、ヒト血中のコラーゲン由来Ｐｒｏ−Ｈｙｐが、マウス皮膚由来の線維芽細胞の成長を増殖させる事を報告している。

【0003】

さらに、特許文献１は、コラーゲンやゼラチンをコラゲナーゼで加水分解して得られる（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）（式中、ＸおよびＹは同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドが、コラーゲン産生促進作用、ヒアルロン酸産生促進作用、皮膚コラーゲン合成促進作用、骨折治癒促進作用、腱損傷治癒促進作用等の効果を有すると記載する。

【0004】

非特許文献１によれば、ゼラチンを経口摂取すればコラーゲン由来のジペプチドの効果を得ることができる。しかしながら、ゼラチンは、コラーゲン原料からコラーゲンを抽出し、酸処理、アルカリ処理、酵素処理などによって所定の平均分子量、粘度、ゼリー強度に調整して出荷されたものである。ゼラチンの平均分子量は一般に５，０００〜２０，０００である。コラーゲンは、分子量１００，０００のポリペプチド鎖が３本螺旋状に結合した構造であるから、ゼラチンは、各ポリペプチドがそれぞれ５〜２０に分解された組成物であり、トリペプチドやジペプチドは含まれておらず、含まれる場合もその含有量は微量に過ぎない。

【0005】

一方、コラーゲンおよびゼラチンは、コラゲナーゼなどで分解することができる。例えば、特許文献２の実施例では、高純度ゼラチン５０ｇに１００ｍｇのコラゲナーゼを用いてコラーゲンペプチド粉末を得ている。しかしながらトリペプチド含量は３０％である。また、特許文献３では、ゼラチンまたはコラーゲンをコラゲナーゼその他の酵素で消化して得た水溶液のトリペプチド含有量は２〜２０％であると記載する。このように、従来のコラーゲンをクロストリジウム・ヒストリチカム由来のコラゲナーゼなどは、−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）ｎ−で示されるコラーゲン様配列からＧｌｙ−Ｘ−Ｙを切り出す分解率は低い。

【0006】

なお、非特許文献３では、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ（ジペプチド）を含有しないコラーゲンペプチドを経口摂取しても、消化・吸収により血中にＰｒｏ−Ｈｙｐが見出だされると報告する。経口摂取されたゼラチンは、消化酵素によってＰｒｏ−Ｈｙｐを生成し、腸管吸収され血中に移行することが示唆される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特表２０１２−５０１３２０号公報

【特許文献2】特開２００２−２５５８４７号公報

【特許文献3】特許第４０９９５４１号公報

【特許文献4】特開２０１５−２１１６５５号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｋｏｊｉ Ｉｗａｉ， ｅｔ ａｌ． "Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｏｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ ａｆｔｅｒ Ｏｒａｌ Ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｌａｔｉｎ Ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ "， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ２００５， ５３， ６５３１−６５３６．

【非特許文献2】Ｙａｓｕｔａｋａ Ｓｈｉｇｅｍｕｒａ， ｅｔ ａｌ．， "Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｐｒｏｌｙｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ）， ａ Ｆｏｏｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｂｌｏｏｄ， ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｕｓｅ Ｓｋｉｎ "， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．， ２００９， ５７ （２）， ４４４−４４９．

【非特許文献3】Ｙｕｋｉ Ｔａｇａ， ｅｔ ａｌ．， "Ｈｉｇｈｌｙ Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｌｏｏｄ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｄｉｇｅｓｔ ｏｆ Ｓｔａｂｌｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ−Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎ "， Ｊ． Ａｇｒｉｃ． Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ． ２０１４， ６２， １２０９６−１２１０２．

【非特許文献4】ＭＥＲＯＰＳ、Ｆａｍｉｌｙ Ｍ９， Ｓｕｍｍａｒｙ ｆｏｒ ｆａｍｉｌｙ Ｍ９，［ｏｎｌｉｎｅ］、［平成２９年４月２５日検索］、インターネット〈ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｆａｍｓｕｍ？ｆａｍｉｌｙ＝ｍ９〉

【非特許文献5】Ｎａｏｋｏ Ｔｅｒａｍｕｒａ ｅｔ．ａｌ， ”Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ Ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｇｒｉｍｏｎｔｉａ （Ｖｉｂｒｉｏ） ｈｏｌｌｉｓａｅ １７０６Ｂ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｈｏｓｈｉｎｅｎｓｉｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２０１１，１９３， １２， ｐ３０４９−３０５６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

非特許文献３に記載するように、コラーゲンペプチドにＰｒｏ−Ｈｙｐが含まれていない場合でも、経口摂取により血中にＰｒｏ−Ｈｙｐが見出だされる。いくつかのコラーゲンのアミノ酸配列は公知であり、その配列を参照してＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量やＸ−Ｙ配列量を算出することができる。

【0010】

しかしながら、例えば、工業生産されるゼラチン等は、その製造工程、具体的には、原料の処理方法や使用する分解酵素によって切断位置が異なり、また、工程中の熱履歴によって分子間や分子内結合の一部がランダムに切断される。使用する用途に応じて所定の画分を除去するなどの処理を行い、溶解性や粘度、ゼリー強度等が調整されることも一般的である。したがって、一概に「ゼラチン」と称する市販品であっても、コラーゲンを構成するポリペプチドの全配列を含むものではなく、かつ製品毎に組成も異なる。このため、コラーゲンを構成するアミノ酸配列が公知でもその配列に基づいて、ゼラチンに含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量やＸ−Ｙ配列量を算出することはできない。

【0011】

また、コラーゲンペプチド製造工程で特定のペプチドが減損する可能性や食品加工製造段階で変質する可能性、または人為的なミスによって期待されるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量やＸ−Ｙ配列量が含まれない事もありうる。このような変質等はコラーゲンおよびゼラチンも同様である。

【0012】

更に、プロテインシークエンサーや質量分析器によってゼラチン等のアミノ酸配列を調べ、例えば、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列を含有するペプチドを同定し、定性分析することは可能である。しかしながら、操作が煩雑であり、大量に消費される経口摂取用ゼラチンのトリペプチド配列量やＰｒｏ−Ｈｙｐ配列量の定量には実用的でない。このようにコラーゲンのアミノ酸配列に基づく、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量やＸ−Ｙ配列量の測定は困難である。

【0013】

一方、ゼラチンを分解してトリペプチドやジペプチドを回収し、これらの含有量を測定すれば、ゼラチンから生成しうるトリペプチド量やジペプチド量に換算することができる。しかしながら、コラーゲン様配列から効率的にＧｌｙ−Ｘ−ＹやＸ−Ｙを切り出すことができなければ、Ｇｌｙ−Ｘ−ＹやＸ−Ｙの含有量を正確に測定することはできない。特許文献２や特許文献３に記載のクロストリジウム・ヒストリチカム由来のコラゲナーゼでは分解率が十分でない。

【0014】

ゼラチンやコラーゲン加水分解物は、製品毎に組成が異なるため、簡便な測定方法の開発が望まれる。しかしながら、コラーゲン様配列から効率的にＸ−Ｙを切り出す酵素も知られていない。このような問題は、コラーゲンでも同様である。

【0015】

したがって、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれる、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量やＸ−Ｙ配列量を簡便に測定する方法の開発が望まれる。

【0016】

上記現状に鑑み、本発明は、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量やＸ−Ｙ配列量の測定方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0017】

本発明者等は、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物等に含まれるコラーゲン様配列から、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙを切り出してペプチド溶液を得て、このペプチド溶液に含まれるトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量を測定すれば、ゼラチン等に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量を求められること、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量に（Ｘ−Ｙの質量／Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの質量）を乗ずることで、酵素を使用しなくても全Ｘ−Ｙ配列量を求められること、およびＧｌｙ−Ｘ−Ｙ酵素として、Ｍ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼが好適であることを見出し、本発明を完成させた。

【0018】

本発明は、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、
前記ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）の含有量を測定する工程を含む、前記ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法を提供するものである。

【0019】

また本発明は、前記Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙが、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐである、前記測定方法を提供するものである。

【0020】

また本発明は、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物にＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製し、前記ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは、同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）の含有量を測定し、前記測定値に、（Ｘ−Ｙの分子量／Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの分子量）を乗じてＸ−Ｙ配列量とする換算工程を含む、前記ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるＸ−Ｙ配列量の測定方法を提供するものである。

【0021】

また本発明は、前記Ｘ−Ｙが、Ｐｒｏ−Ｈｙｐである、前記測定方法を提供するものである。

【発明の効果】

【0022】

本発明によれば、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物から生成しうるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量やＰｒｏ−Ｈｙｐ配列量を測定することができる。

【発明を実施するための形態】

【0023】

以下、本発明を詳細に説明する。

【0024】

（１）コラーゲン、ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物
本発明の測定対象は、コラーゲン、ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物である。コラーゲンとしては、サカナ、ウシ、ブタ、ニワトリ、その他の動物のいずれに由来するコラーゲンであってもよい。また、コラーゲン型は現在Ｉ型からＸＸＩＸ型までが知られているが、そのいずれであってもよく、将来発見されるコラーゲンであってもよい。コラーゲンは、分子量約１００，０００のポリペプチド３本が螺旋状に結合した構造であり、ゼラチンとは各ポリペプチドを複数に切断した組成物である。一般に、平均分子量３，０００〜５０，０００、好ましくは５，０００〜２０，０００のペプチドがゼラチンである。また、コラーゲン加水分解物とは、コラーゲンペプチドとも称され、ゼラチンより低分子量で、ゲル化能を有しないまでに分解されたペプチド組成物を意味する。なお、コラーゲン、ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物の調製方法に限定はない。コラーゲン原料を酸やアルカリで処理してコラーゲンを抽出したもの、コラーゲンに各種コラゲナーゼを含むプロテアーゼなどの酵素を作用させ、および／または、酸、アルカリ、その他によってコラーゲンを構成するポリペプチド鎖を切断したものを広く含む。

【0025】

（２）Ｍ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼ
本発明で使用するＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼは、ペプチダーゼデータベースの一つであるＭＥＲＯＰＳの分類によるＭ９Ａに属するバクテリアコラゲナーゼである（非特許文献４参照）。Ｍ９はＭ９ＡとＭ９Ｂに大別され、Ｍ９Ａには、ビブリオおよびビブリオ類縁属コラゲナーゼが含まれ、Ｍ９Ｂには、クロストリディウム属コラゲナーゼが含まれる。ビブリオ類縁属には、グリモンティア・ホリセーなどがある。本発明では、ビブリオやグリモンティア・ホリセーに由来するＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを使用する。本発明で使用するＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼとして、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼがある（非特許文献５）。なお、グリモンティア・ホリセーは、例えばＡＴＣＣ Ｎｏ．３３５６４やＡＴＣＣ Ｎｏ．３３５６５として入手できる。本発明で使用するＭ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼとしては、ビブリオやビブリオ類縁属が産生するコラゲナーゼの他、特許文献４記載の方法を参照し、当該コラゲナーゼ遺伝子で形質転換された組み換え体から得たコラゲナーゼであってもよい。さらに、市販品であってもよい。このような市販品として株式会社ニッピ製のブライターゼＣがある。

【0026】

Ｍ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼは、コラーゲン様配列を分解してＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（式中、ＸおよびＹは同一でも異なってもよいアミノ酸残基を示す。）で示されるトリペプチドを切り出すことができる酵素である。例えば、グリモンティア・ホリセー由来コラゲナーゼは、特許文献４に記載されるように、トリペプチド量を指標として分解率を評価すると、４８時間の作用でウシ皮由来酸抽出Ｉ型コラーゲンを構成するトリペプチド配列の９３％を切り出すことができる。

【0027】

（３）Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列
本発明において、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列とは、ＸおよびＹを同一でも異なってもよいアミノ酸残基とした場合に、Ｎ末端からＧｌｙ、Ｘ、Ｙの順にアミド結合する配列であり、トリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｙの他、ポリペプチドに含まれる−（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）−を含む。コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量は、これらから生成しうる全Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ量である。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量がわかれば、これらを経口摂取した際のＧｌｙ−Ｘ−Ｙなどの効果を予測することができる。

【0028】

Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列としては、例えば、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｈｙｐなどがある。

【0029】

（４）Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法
コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物を緩衝液などの溶液に溶解し、前記Ｍ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを作用させてペプチド溶液を調製する。前記コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物を溶解する緩衝液としては、例えばトリス緩衝液やＧｏｏｄ緩衝液などがある。濃度は、０．１〜１００ｍｇ/ｍｌが好ましく、より好ましくは５〜４０ｍｇ/ｍｌである。得られた溶液に前記Ｍ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼを０．００１〜１ｍｇ/ｍｌ、より好ましくは０．００５〜０．０２ｍｇ/ｍｌ添加し、温度３７℃で、１２〜４８時間、より好ましくは２０〜２４時間反応させる。これにより、前記コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるコラーゲン様配列が分解されたペプチド溶液が得られる。塩酸でｐＨを下げ反応停止後、ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙを定量する。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの定量方法には特に限定はないが、例えば、ＬＣ−ＭＳや、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳで測定することができる。質量分析の際に、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙの分子量を参照して目的の質量のＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量を測定することができる。ＬＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ−ＭＳを適切に設定すれば、質量が同じＧｌｙ−Ｘ−Ｙでもそれぞれ定量することができる。また、酵素分解を行わないコラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物溶液をＬＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ−ＭＳ分析し、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量およびＸ−Ｙ量を測定すれば、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に直接含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量を測定することができる。

【0030】

（５）潜在的Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ量
本発明によって測定したＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量は、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれていたトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｙと、ポリペプチドを構成するＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列との合計量である。これをＡｓとすれば、Ａｓは、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれる全Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量である。一方、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物溶液に含まれるトリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量をＡｂとすれば、Ａｓ−Ａｂは、コラーゲン、ゼラチンまたはコラーゲン加水分解物に含まれておらず、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物が分解された後に生成できるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量を意味する。コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物が潜在的に含有するＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量といえる。本発明では、これを潜在的Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ量と称する。本発明によれば、Ａｓ−Ａｂを算出することで、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれる潜在的Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ量を求めることができる。

【0031】

（６）Ｘ−Ｙ配列
本発明において、Ｘ−Ｙ配列とは、ＸおよびＹを同一でも異なってもよいアミノ酸残基とした場合に、Ｎ末端からＸ、Ｙの順にアミド結合する配列であり、ジペプチドＸ−Ｙの他、ポリペプチドに含まれる−Ｘ−Ｙ−を含む。例えば、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ａｌａ−Ｈｙｐ、Ｌｕｅ−Ｈｙｐなどがある。

【0032】

（７）Ｘ−Ｙ配列量の測定方法
本発明では、上記したＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量の測定方法に準じて、Ｘ−Ｙ配列量を測定することができる。上記と同様にしてペプチド溶液を調製し、ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量を測定し、これをＡｓとする。その後、ＡｓにＸ−Ｙ分子量／Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ分子量を乗じると、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列由来のＸ−Ｙ配列量を算出することができる。これをＣｓとする。本発明によれば、コラーゲン様配列からＸ−Ｙを切り出す酵素を使用することなく、これらに含まれるＸ−Ｙ配列量を測定することができる。一方、前記ペプチド溶液には、Ｍ９Ａタイプバクテリアコラゲナーゼの酵素反応で生じたジペプチドＸ−Ｙが含有する場合がある。そこで、ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量の測定に加えて、Ｘ−Ｙ量も測定する。Ｘ−Ｙ量をＢｓとする。Ｂｓはペプチド溶液に含まれるＸ−Ｙ量であり、Ｃｓは、ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量に由来するＸ−Ｙ量であるから、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれる全Ｘ−Ｙ配列量は、Ｂｓ＋Ｃｓで算出される。なお、酵素分解を行わないコラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物溶液をＬＣ−ＭＳやＬＣ−ＭＳ−ＭＳ等で分析すれば、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれるジペプチドＸ−Ｙ量を測定することができる。

【0033】

（８）潜在的Ｘ−Ｙ量
本発明によって測定したＸ−Ｙ配列量（Ｂｓ＋Ｃｓ）は、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれる全Ｘ−Ｙ配列量である。一方、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれるジペプチドＸ−Ｙ量をＢｂとすれば、（Ｂｓ＋Ｃｓ）−Ｂｂは、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物に含まれておらず、コラーゲン、ゼラチン、またはコラーゲン加水分解物から生成可能なＸ−Ｙ量であり、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物が潜在的に含有するＸ−Ｙ量といえる。本発明では、これを潜在的Ｘ−Ｙ量と称する。本発明によれば、（Ｂｓ＋Ｃｓ）−Ｂｂを算出することで、コラーゲン、ゼラチンおよびコラーゲン加水分解物に含まれる潜在的Ｘ−Ｙ量を求めることができる。

【実施例】

【0034】

次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。

【0035】

（実施例１）
市販のブタ皮由来コラーゲンペプチド（株式会社ニッピ製、商品名「豚皮由来コラーゲンペプチドＰＳ−１」）とテラピア鱗由来コラーゲンペプチド（株式会社ニッピ製、商品名「テラピア鱗由来コラーゲンペプチドＦＣＰ−Ａ」）を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含むｐＨ７．５の反応溶媒に溶解して２％コラーゲンペプチド溶液を調製した。

【0036】

また、４０ｍｇのグリモンティア属由来コラゲナーゼ（株式会社ニッピ製、商品名「Ｂｒｉｇｈｔａｓｅ−Ｃ」）を２ｍｌの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ_２を含む溶媒（ｐＨ７．５）に溶解してコラゲナーゼ溶液を調製した。

【0037】

０．２５ｍｌの前記２％コラーゲンペプチド溶液に、前記コラゲナーゼ溶液０．０１ｍｌ、およびＨＥＰＥＳ緩衝液０．２４ｍｌを添加し、温度３７℃で２４時間反応させた。２４時間後に、０．０４ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌを添加して反応を停止させた。

【0038】

また、各ペプチド溶液に対し、前記コラゲナーゼ溶液に代えて同量のＨＥＰＥＳ緩衝液を添加した以外は、ペプチド溶液の調製と同様に操作して、対照溶液とした。

【0039】

各ペプチド溶液およびコラゲナーゼを添加しなかった対照溶液について、下記条件でＬＣ−ＭＳ分析でＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量およびＰｒｏ−Ｈｙｐ量を測定した。
装置：
液体クロマトグラフ：アジレントテクノロジー社製、「１２００シリーズ」
カラム：Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｆ５（スペルコ社製、φ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
三重連四重極質量分析装置（Ｓｃｉｅｘ社製、「３２００ＱＴＲＡＰ」）
条件：ＭＲＭ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）、イオン化法：ＥＳＩ、ポジティブ
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐの検出条件；Ｑ１＝２８６、Ｑ３＝１２７
Ｐｒｏ−Ｈｙｐの検出条件；Ｑ１＝２２９、Ｑ３＝７０
イオンスプレー電圧：３．５ｋＶ
イオンソース温度：６００℃
移動相：Ａ液；０．１％ギ酸、Ｂ液；１００％アセトニトリル
グラジエント条件：０−２分：Ａ液９８％、２−６分：Ａ液９８−４０％、６．１−８分：Ａ液４０−１０％、８．１−１０分：Ａ液９８％
流速：６００μｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
注入量：１０μｌ

【0040】

ペプチド溶液に含まれるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量をＡｓ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量をＢｓ、対照溶液に含まれるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量をＡｂ、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量をＢｂとし、測定結果と対応する記号を表１に示す。また、Ａｓに（Ｐｒｏ−Ｈｙｐの分子量／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐの分子量）を乗じた算出値をＣｓとする。すなわちＣｓ＝Ａｓ×（Ｐｒｏ−Ｈｙｐの分子量／Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐの分子量）＝Ａｓ×２２８／２８５＝Ａｓ×０．８である。Ｃｓの結果も併せて表１に示す。

【0041】

【表1】

【0042】

コラーゲンペプチドに含まれるトリペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＨｙｐをＡｂとし、コラーゲンペプチドに含まれるＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量をＡｓとすれば、ＡｓとＡｂとの差は、コラーゲンペプチドからから生成可能な潜在的Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量となる。表２に、ＰＳ−１およびＦＣＰ−Ａに含まれるトリペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量（Ａｂ）、全Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量（Ａｓ）、および潜在的Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量（Ａｓ−Ａｂ）を示す。

【0043】

【表2】

【0044】

本発明の測定方法によれば、コラーゲンペプチドに含まれる全Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ配列量と、コラーゲンペプチドが潜在的に含有する潜在的Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ量を算出することができる。表２に示すように、コラーゲンペプチドの種類によって、全Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量は異なり、ブタ由来コラーゲンペプチド＞テラピア鱗由来コラーゲンペプチドであった。コラーゲンペプチド自体に含まれるトリペプチドＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量は０．０１２、０．００１ｇ／ｋｇとごく微量であるが、潜在的Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量は、９９．８８７，７６．８７２ｇ／ｋｇであった。本発明によれば、コラーゲンペプチド自体を試料としても測定できない全Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量およびコラーゲンペプチドの潜在的Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ量を測定することができる。

【0045】

一方、ペプチド溶液に含まれるジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ量をＢｓとし、ペプチド溶液のＧｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列由来のＰｒｏ−Ｈｙｐ配列量をＣｓとすれば、コラーゲンペプチドから生成可能な全Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量はＢｓ+Ｃｓとなる。コラーゲンペプチドに含まれるジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ量をＢｂとすれば、（Ｂｓ+Ｃｓ）とＢｂとの差は、コラーゲンペプチドからから生成可能な潜在的Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量となる。ＰＳ−１およびＦＣＰ−Ａに含まれるジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ量（Ｂｂ）、全Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量（Ｂｓ＋Ｃｓ）、および潜在的Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量を表３に示す。

【0046】

【表3】

【0047】

表３に示すように、コラーゲンペプチド自体に含まれるジペプチドＰｒｏ−Ｈｙｐ量はブタ由来コラーゲンペプチド、テラピア鱗由来コラーゲンペプチドのいずれも０．００２ｇ／ｋｇとごく微量であるが、潜在的Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量は、８０．０３０、６１．６３８ｇ／ｋｇであった。本発明によれば、ペプチド溶液のＧｌｙ−Ｘ−Ｙ量と共にＸ−Ｙ量を測定することで、コラーゲンペプチドに含まれる全Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量およびコラーゲンペプチドの潜在的Ｘ−Ｙ量を求めることができる。

【0048】

なお、ブタ皮由来Ｉ型コラーゲンの配列から予想されるＰｒｏ−Ｈｙｐ量は、８５．８４（ｇ／ｋｇ；水分５〜１０％、灰分１％未満）であるから、上記表３のＰＳ−１の全Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量は、コラーゲンペプチドに含まれるＰｒｏ−Ｈｙｐ配列量を反映する結果となった。また、テラピア鱗由来コラーゲンはブタ由来コラーゲンと比較して０．５〜２モル％Ｈｙｐ量が少ないことは公知である。本願発明の測定方法によれば、グリモンティア属由来コラゲナーゼを使用することで、コラーゲンペプチドに含まれるＰｒｏ−Ｈｙｐ配列量を簡便に定量することができる。

【0049】

（比較例１）
グリモンティア属由来コラゲナーゼに代えて、Ｍ９Ｂに分類されるバクテリアコラゲナーゼであるクロストリジウム属由来コラゲナーゼ（株式会社ロッシュ製、Ｌｉｂｅｒａｓｅ−Ｃ）を使用して、実施例１と同様に操作した。結果を表４、表５およ表６に示す。

【0050】

【表4】

【0051】

【表5】

【0052】

【表6】

【0053】

実施例１の結果を示す表１と、比較例１の結果を示す表４とから、クロストリジウム属由来コラゲナーゼによって生成するＧｌｙ−Ｐｒｏ−ＨｙｐおよびＰｒｏ−Ｈｙｐは、Ｍ９Ａ由来バクテリアコラゲナーゼによる場合の８０〜８６％となる。このため、表５、表６に示すように、全Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量、潜在的Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量、全Ｐｒｏ−Ｈｙｐ配列量、潜在的Ｐｒｏ−Ｈｙｐ量がいずれもグリモンティア属由来コラゲナーゼを使用した場合と比較して低値となった。