特許 6864585 ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6864585

(24)【登録日】2021年4月6日

(45)【発行日】2021年4月28日

(54)【発明の名称】ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12P 7/62 20060101AFI20210419BHJP

【ＦＩ】

   C12P7/62

【請求項の数】4

【全頁数】12

(21)【出願番号】特願2017-165515(P2017-165515)

(22)【出願日】2017年8月30日

(65)【公開番号】特開2019-41606(P2019-41606A)

(43)【公開日】2019年3月22日

【審査請求日】2020年6月23日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000941

【氏名又は名称】株式会社カネカ

(72)【発明者】

【氏名】西海 薫

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００７−５２４３４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６０−１４５０９７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１２−１１５１４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−１９１８９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５２−０３００４６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１０−０６９３８９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭６３−０４９２９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Journal of Bioscience and Bioengineering，２０１７年，124(2)，250-254

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

Ｃ１２Ｎ １／００− ７／０８

Ｂ０１Ｄ ２１／００−２１／０１

Ｃ０２Ｆ １／５２− １／５６

Ｃ０２Ｆ ３／００− ３／３４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

脂肪酸石鹸の存在下、ポリヒドロキシアルカノエートを含む微生物細胞の破砕又は可溶化処理を実施する工程（ａ）と、
工程（ａ）で得られた組成物から、ポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程（ｂ）とを有し、
前記脂肪酸石鹸は、炭素数８〜３０の脂肪酸のアルカリ金属塩であり、
前記脂肪酸は、融点が３０℃以上の脂肪酸である、
ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。

【請求項2】

前記脂肪酸石鹸が、炭素数１０〜１８の飽和脂肪酸のアルカリ金属塩である請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。

【請求項3】

前記破砕又は可溶化処理が、化学的処理及び物理的破砕処理からなる群より選択される少なくとも一種の処理を含む請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。

【請求項4】

前記化学的処理が、アルカリ、蛋白質分解酵素及び細胞壁分解酵素からなる群より選択される少なくとも一種による化学的処理である請求項３に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物によって生産されるポリヒドロキシアルカノエートの製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ポリヒドロキシアルカノエート（以後、ＰＨＡと略す）は、多くの微生物種の細胞内にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルである。微生物によって天然の有機酸や油脂を炭素源に生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解され、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになるため、生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチック材料と言える。近年、合成プラスチックが環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から深刻な社会問題となるに至り、ＰＨＡが環境に優しいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体などの生体適合性プラスチックとして利用が可能と考えられており、実用化が期待されている。

【0003】

微生物が生産するＰＨＡは、通常顆粒体として微生物細胞内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物細胞内からＰＨＡを分離して取り出すという工程が必要である。ＰＨＡの分離方法として、例えば、ＰＨＡ以外の細胞構成成分を可溶化させて除く方法が開示されている（例えば、特許文献１参照）。この方法は酵素処理を行った後、アルカリと界面活性剤を添加し、常温で高圧破砕を行い、遠心分離で回収する方法である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１２−１１５１４５号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

特許文献１に開示された方法は、当該方法では製品の純度も高く、低温で酵素処理するためにＰＨＡの分子量をあまり低下させないことから、工業化可能な方法と考えられる。しかしながら、当該方法では微生物の細胞を可溶化、乳化させているため、その成分を最終的に排水として処理しなければならない。当該方法の排水処理においては、排水中のＴＯＣ（全有機炭素）成分を凝集沈殿により除くことが難しいという問題があり、この点で上記方法はさらなる改善の余地があった。また、上記方法においては、添加している界面活性剤が発泡や活性汚泥の微生物を阻害する場合があるため、排水処理の処理効率の低下や処理設備の大型化の必要性から、安価な排水処理を実施することが難しいという問題もあった。

【0006】

したがって、本発明の目的は、高純度で加工性に優れたＰＨＡを効率的に回収でき、なおかつ排水の処理効率にも優れたＰＨＡの製造方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明者は上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、特定の脂肪酸石鹸を用いる特定の製造方法によると、高純度で加工性に優れたＰＨＡを効率的に回収でき、なおかつ排水の処理効率にも優れることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0008】

すなわち、本願は、例えば、以下の発明を提供する。

【0009】

［１］脂肪酸石鹸の存在下、ポリヒドロキシアルカノエートを含む微生物細胞の破砕又は可溶化処理を実施する工程（ａ）と、
工程（ａ）で得られた組成物から、ポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程（ｂ）とを有し、
前記脂肪酸石鹸は、炭素数８〜３０の脂肪酸のアルカリ金属塩であり、
前記脂肪酸は、融点が３０℃以上の脂肪酸である、
ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。

【0010】

［２］前記脂肪酸石鹸が、炭素数１０〜１８の飽和脂肪酸のアルカリ金属塩である［１］に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。

【0011】

［３］前記破砕又は可溶化処理が、化学的処理及び物理的破砕処理からなる群より選択される少なくとも一種の処理を含む［１］又は［２］に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。

【0012】

［４］前記化学的処理が、アルカリ、蛋白質分解酵素及び細胞壁分解酵素からなる群より選択される少なくとも一種による化学的処理である［３］に記載のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。

【発明の効果】

【0013】

本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法によると、微生物が産生したＰＨＡ含有微生物細胞から、高純度で加工性の良いＰＨＡを効率的に回収できる。さらに、本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、製造工程において排出される排水の処理において界面活性剤による問題点が生じず、排水の処理効率にも優れる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例２、比較例１において測定したＴＯＣの経時変化を示す図である。

【図2】実施例１において得られたフロックの写真である。

【図3】実施例２において得られたフロックの写真である。

【図4】実施例３において得られたフロックの写真である。

【図5】比較例１において得られたフロックの写真である。

【図6】比較例２において得られたフロックの写真である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明のポリヒドロキシアルカノエートの製造方法は、下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を必須の工程として含む方法である。
工程（ａ）：脂肪酸石鹸の存在下、ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと称する場合がある）を細胞内に含む微生物細胞の破砕又は可溶化処理を実施する工程
工程（ｂ）：工程（ａ）で得られた組成物（破砕又は可溶化処理の組成物）から、ポリヒドロキシアルカノエートを分離する工程

【0016】

［工程（ａ）］
本発明におけるＰＨＡとは、ヒドロキシアルカノエート（ヒドロキシアルカン酸）の重合体の総称である。ヒドロキシアルカノエートとしては特に限定されないが、例えば、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）、３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、３−ヒドロキシプロピオネート、４−ヒドロキシブチレート（４ＨＢ）、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシペンテノエート、３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナエート、３−ヒドロキシドカネートなどが挙げられる。

【0017】

本発明におけるＰＨＡは、これらヒドロキシアルカノエートの単独重合体であってもよいし、２種以上のヒドロキシアルカノエートが共重合した共重合体であってもよい。例えば、３ＨＢの単独重合体であるＰＨＢや、３ＨＢと３ＨＶの２成分共重合体であるＰＨＢＶ、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体であるＰＨＢＨ（特許第２７７７７５７号公報参照）または、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体であるＰＨＢＨＶ（特許第２７７７５７号公報参照）、３ＨＢと４ＨＢの２成分共重合体であるＰ３ＨＢ４ＨＢなどが例示できる。特に、加熱などで分子量が低下しやすい傾向にある共重合体の場合、後述するように加熱時の分子量の低下がしにくいという点で本発明は適している。

【0018】

特に、生分解性ポリマーとしての分解性と、柔らかい性質を持つ点で、モノマーユニットとして３ＨＨを有する共重合体が好ましく、より好ましくは、ＰＨＢＨである。このときＰＨＢＨを構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、良好な加工性を示す点から３ＨＨユニットが１〜９９ｍｏｌ％のものが好ましく、より好ましくは３〜３０ｍｏｌ％である。また、ＰＨＢＨＶの場合、構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含量は１〜９５ｍｏｌ％、３ＨＶユニットの含量は１〜９６ｍｏｌ％、３ＨＨユニットの含量は１〜３０ｍｏｌ％といった範囲のものが好適である。

【0019】

ＰＨＡを実用化するためには、加工品が使用に耐え得る物性を示す必要があり、ゲルクロマトグラフィー法でポリスチレンを分子量標準としたＰＨＡの重量平均分子量が１万以上であることが好ましい。より好ましくは５万以上、より好ましくは１０万以上、さらに好ましくは２０万以上、特に好ましくは２０万〜２００万、極めて好ましくは２０万〜１５０万、最も好ましくは２０万〜１００万である。分子量が２００万を超えると、溶融して加工する際に流動性が低下し、ハンドリングが悪い場合がある。

【0020】

本発明における微生物は、細胞内にＰＨＡを生成する微生物である限りにおいて、特に限定されない。天然から単離された微生物や菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、または、それらから調製し得る変異体や形質転換体等を使用できる。例えばカプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の菌等が挙げられる。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ．ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ．ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネケータ（Ｃ．ｎｅｃａｔｏｒ）等の菌株が好ましい。また、微生物が、本来ＰＨＡの生産能力を有しない場合、もしくは生産量が低い場合には、該微生物に目的とするＰＨＡの合成酵素遺伝子及び／又はその変異体を導入し、得られる形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体の作製に用いるＰＨＡの合成酵素遺伝子としては特に限定はないが、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素の遺伝子が好ましい。これら微生物を適切な条件で培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積させた微生物菌体を得ることができる。その培養方法については特に限定はないが、例えば特開平０５−９３０４９号公報等に挙げられる方法が用いられる。

【0021】

微生物細胞からＰＨＡを回収する上において、培養後の微生物細胞（ＰＨＡを含む微生物細胞）中のＰＨＡ含有率は、高い方が好ましいのは当然であり、工業レベルでの適用においては乾燥細胞中のＰＨＡ含有率は５０重量％以上であることが好ましく、以後の分離操作、分離ポリマーの純度等を考慮するとＰＨＡ含有率は６０重量％以上が好ましく、さらに好ましくは７０重量％以上である。

【0022】

微生物により産生したＰＨＡは、以下のような工程により回収される。

【0023】

工程（ａ）においては、特定の脂肪酸石鹸の存在下、ＰＨＡを含む微生物細胞の破砕又は可溶化処理を実施する。破砕処理と可溶化処理の両方を実施してもよく、これら処理を実施する順番も特に限定されない。工程（ａ）において破砕又は可溶化処理を実施する対象としては、ポリヒドロキシアルカノエートを含む微生物細胞の水性懸濁液を使用することが好ましい。当該水性懸濁液としては、培養完了後のＰＨＡ含有微生物細胞を含む培養ブロスをそのまま用いることもできるし、当該培養ブロスから回収した菌体に水を添加する等して調製したＰＨＡ含有微生物細胞の水性懸濁液を用いることもできる。培養ブロスから菌体を回収する方法としては、遠心分離や膜分離など当業者に周知の方法を用いることができる。また、菌体の回収に際して加熱などにより菌体を死滅させてもよい。ここで、加熱する場合の温度は５０℃〜８０℃が好ましい。破砕又は可溶化処理に際しては、微生物は死滅させることが好ましい。

【0024】

上記破砕又は可溶化処理としては、化学的処理及び物理的破砕処理からなる群より選択される少なくとも一種の処理を含むことが好ましい。中でも、化学的処理及び物理的破砕処理の両方を含むことがより好ましい。

【0025】

ＰＨＡを含む微生物細胞の可溶化処理としては、酵素処理、アルカリ処理、界面活性剤処理等の化学的処理が挙げられる。これらの可溶化処理は、１種のみを実施してもよいし、２種以上を組み合わせて実施してもよい。これら可溶化処理の２種以上を実施する場合、これらを実施する順番は特に限定されない。中でも、酵素処理、アルカリ処理及び界面活性剤処理からなる群より選択される２種以上（特に、少なくともアルカリ処理及び界面活性剤処理）を実施することが好ましく、３種全てを実施することが好ましい。本発明の製造方法における工程（ａ）は、特定の脂肪酸石鹸の存在下で処理を実施するため、当該脂肪酸石鹸を用いた界面活性剤処理は必須として実施するものである。

【0026】

上記酵素処理は、従来公知の方法に従って実施でき、その方法は特に限定されないが、例えば、特開２０１２−１１５１４５号公報に記載の方法（ＰＨＡ含有微生物細胞を酵素処理することで、細胞壁を分解してより高い純度を得る方法）等を利用することができる。酵素としては、工業的な製品に用いられ得るものであれば特に限定はないが、蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）、細胞壁分解酵素が好ましい。酵素の添加量は、適宜選択可能である。

【0027】

上記アルカリ処理は、例えば、ＰＨＡを含む微生物細胞の水性懸濁液にアルカリを添加することにより実施できる。当該アルカリとしては、従来公知のものを用いることができるが、ＰＨＡ含有微生物の細胞壁を破壊して細胞中のＰＨＡを細胞外に流出できるものであれば特に限定されるものではない。例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム等を含めたアルカリ金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩；炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩；酢酸ナトリウム、酢酸カリウム等の有機酸のアルカリ金属塩；ホウ砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸３ナトリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸３カリウム、リン酸水素２カリウム等のアルカリ金属のリン酸塩；水酸化バリウムなどのアルカリ土類金属の水酸化物；アンモニア水等が挙げられる。アルカリ処理における水性懸濁液のｐＨは、特に限定されないが、８．０〜１２．０の範囲で調整することが好ましい。

【0028】

上記界面活性剤処理は、例えば、ＰＨＡを含む微生物細胞の水性懸濁液に界面活性剤を添加することにより実施できる。当該工程（ａ）では、界面活性剤として特定の脂肪酸石鹸を使用した処理を実施する。この特定の脂肪酸石鹸とは、炭素数８〜３０のアルカリ金属塩であり、これを構成する脂肪酸が融点が３０℃以上の脂肪酸である、脂肪酸石鹸である。このような脂肪酸石鹸としては、例えば、ベヘン酸のアルカリ金属塩、ヘンイコシル酸のアルカリ金属塩、アラキジン酸のアルカリ金属塩、ノナデシル酸のアルカリ金属塩、ステアリン酸のアルカリ金属塩、マルガリン酸のアルカリ金属塩、パルミチン酸のアルカリ金属塩、ペンタデシル酸のアルカリ金属塩、ミリスチン酸のアルカリ金属塩、トリデシル酸のアルカリ金属塩、ラウリン酸のアルカリ金属塩、ウンデシル酸のアルカリ金属塩、カプリン酸のアルカリ金属塩等が挙げられる。中でも、炭素数１０〜１８の飽和脂肪酸のアルカリ金属塩が好ましく、コストの点からステアリン酸のアルカリ金属塩、パルミチン酸のアルカリ金属塩、ミリスチン酸のアルカリ金属塩、ラウリン酸のアルカリ金属塩、カプリン酸のアルカリ金属塩がより好ましい。当該界面活性剤処理は、アルカリ条件下で実施することが好ましく、即ち、アルカリ処理と共に実施することが好ましい。

【0029】

界面活性剤処理における界面活性剤の添加量は、特に制限されないが、ＰＨＡ重量１００重量部に対して、０．００１〜１０重量部が好ましく、さらにはコストの点から、５重量部以下が好ましい。

【0030】

上記物理的破砕処理としては、従来公知の方法を適用して実施でき、細胞中のＰＨＡ以外の細胞を引き剥がし、微細化できるような物理的処理であればよく、限定されることはない。物理破砕処理に用いられる装置としては、例えば、高圧ホモジナイザー、超音波破砕機、乳化分散機、ビーズミル等が挙げられる。

【0031】

［工程（ｂ）］
工程（ｂ）では、工程（ａ）で得られた破砕又は可溶化処理後の組成物（破砕液）から、ポリヒドロキシアルカノエートを分離する。上記破砕液からＰＨＡを分離する方法としては、遠心分離や膜分離など、従来公知の方法が使用できるが、工業的に大量処理が可能で連続使用できる遠心分離が好ましい。遠心分離機のなかでは、孔なし回転容器をもつ遠心沈降機が好ましく、種類としては分離板型、円筒型、デカンター型などがある。ＰＨＡ粒子は水との比重差が小さいので、分離沈降面積が大きく、高い加速度が得られる分離板型（間欠排出型、ノズル排出型）が好ましく、破砕処理液に含まれるＰＨＡ濃度が高い場合は特にノズル排出型が好ましい。また、デカンター型は一般的に加速度が低く、固液の比重差が小さい場合は不向きであるが、ＰＨＡの粒子径を変化させる等することでデカンター型も使用可能である。また、デカンター型には分離板を有し、分離沈降面積を大きくした機種もあり、このような機種であれば特に粒子径を変化させなくても使用可能な場合がある。

【0032】

上述の様な分離方法により、破砕処理液からＰＨＡを分離、回収した後、例えば、水でＰＨＡを懸濁させて水洗し、ＰＨＡ以外の細胞物質を排除することができる。この水洗時のｐＨは８．０〜１２．５（即ち、当該水洗はアルカリ水による洗浄であること）が好ましい。

【0033】

本発明の製造方法は、工程（ａ）及び工程（ｂ）以外のその他の工程を有していてもよい。その他の工程としては、例えば、工程（ａ）の前工程であるポリヒドロキシアルカノエートを含む微生物細胞を得る工程（例えば、ＰＨＡを生産する微生物を培養する工程等）、工程（ａ）や工程（ｂ）等で得られる排水を処理する工程、得られるＰＨＡを乾燥させる工程等の各種工程が挙げられる。ＰＨＡを生産する微生物及びその培養は、公知乃至慣用の技術に従って実施でき、特に限定されないが、例えば、国際公開第０８／０１０２９６号に記載の微生物及び培養方法を使用できる。

【0034】

本発明の製造方法によると、高純度のポリヒドロキシアルカノエートが得られる。当該ポリヒドロキシアルカノエートに残存する蛋白質含量の指標である残存窒素量は、特に限定されないが、２０００ｐｐｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１８００ｐｐｍ以下である。上記残存窒素量は、実施例に記載の方法で測定できる。

【0035】

本発明の製造方法によると、加工性（特に、溶融押出等での成形加工性）に優れたポリヒドロキシアルカノエートが得られる。当該ポリヒドロキシアルカノエートは加熱時の分子量低下が少ないものである。例えば、当該ポリヒドロキシアルカノエートの分子量保持率（１６０℃で７分間加熱した後、１６０℃、５ＭＰａにて２０分間加熱した場合の分子量保持率）は、６０％以上であることが好ましく、より好ましくは６５％以上である。上記分子量保持率は、実施例に記載の方法で測定できる。

【0036】

本発明の製造方法は、製造工程で発生した排水の処理効率にも優れる。一般に、上記工程で発生した排水は、中和後、活性汚泥処理を行うことにより処理される。本発明によると、活性汚泥処理における発泡が抑制され、消泡剤なしでも処理することが可能となる。これにより、活性汚泥の処理能力が上がり、活性汚泥槽容積の小型化が可能になる。そのため、活性汚泥の設備コストとランニングコストを両方下がることとなる。

【0037】

嫌気処理を実施する場合も同様で発泡は発生しないが、嫌気菌の活性を阻害しなくなることで処理能力が上がり、槽容積が小型化が可能になる。硫黄分も含まれていないため、硫化水素の発生が抑えられる。

【0038】

上述の排水処理以上に効果を発揮するのが、ＴＯＣ（全有機炭素）成分の凝集沈殿であり、排水中の有機物の凝集が阻害されず、フロックを大型化することが可能になる。そのため、固液分離まで行うことが可能になり、凝集沈殿法の適用ができるようになる。一方、従来の方法によるとフロックが微細化し、固液分離ができなくなる。

【実施例】

【0039】

以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。

【0040】

＜蛋白質含量の測定方法＞
ＰＨＡ（ＰＨＢＨ）に残存する蛋白質含量は、残存窒素量を測定することにより評価した。
精製ＰＨＢＨを測定サンプルとして、この残存窒素量を次の呈色法により算出した。まず各測定サンプルに対して５ＭのＮａＯＨ水溶液を添加し、９５℃で加水分解反応を実施した。この加水分解液を等量の６０％酢酸水溶液で中和し、さらに、酢酸緩衝液とニンヒドリン溶液を添加し１００℃で呈色反応を行った。この呈色反応液の吸光度を日立製作所社製レシオビーム分光光度計「Ｕ−１８００形」により測定し、この吸光度とロイシン試料を用いて作成した検量線とを比較することで、残存窒素量を算出した。
測定サンプル中の残存窒素量が多いほど残存する蛋白質が多いことを示し、当該残存窒素量が２０００ｐｐｍ以下であると高純度と言える。

【0041】

＜重量平均分子量の測定方法＞
実施例で得られた精製ＰＨＢＨ１０ｍｇを、クロロホルム５ｍｌに溶解させた後、不溶物を濾過により除いた。この溶液を「Ｓｈｏｄｅｘ Ｋ８０５Ｌ（３００ｍｍ×８ｍｍ、２本連結）」（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用い、クロロホルムを移動相として測定した。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレンを用いた。上記測定結果から、標準ポリスチレン換算の重量平均分子量を算出した。

【0042】

＜分子量保持率の測定＞
実施例で得られた精製ＰＨＢＨ３．０ｇを、１５ｃｍ四方の金属板で挟み、さらに金属板の四隅に厚さ０．５ｍｍの金属板を挿入して、これを実験用小型プレス機（高林理化株式会社製Ｈ−１５型）にセットして、１６０℃にて７分間加温後、１６０℃、約５ＭＰａにて２０分間加熱しながらプレスした。プレス後、室温に放置して固化させた後、１０ｍｇ分を切り取り、クロロホルム５ｍｌに溶解したものの重量平均分子量を測定した。この値とプレス前の重量平均分子量を用いて、下記式により分子量保持率を測定した。
分子量保持率（％）＝プレス後の重量平均分子量／プレス前の重量平均分子量×１００

【0043】

実施例１
国際公開第０８／０１０２９６号の［００４９］に記載のラルストニア・ユートロファＫＮＫ−００５株を、同［００５０］〜［００５３］に記載の方法で培養し、３−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロキシヘキサノエートの共重合体であるポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＢＨ）を菌体内に含有する菌体の培養液（菌体培養液）を得た。培養終了時点でのＰＨＢＨの重量平均分子量は１１１万であった。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネケータに分類されている。

【0044】

得られた菌体培養液１０００ｇを７０〜７５℃で１時間加熱して滅菌し、５０℃に冷却後、リゾチーム（山東省華源経貿製）を２５ｍｇ添加し、ｐＨ６〜７で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。その後、アルカラーゼを５００ｍｇ添加し、ｐＨ８．０〜８．５で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。このようにして得られた酵素処理液にステアリン酸Ｋ（関東化学製）を１０ｇ添加し、ｐＨが１２になるようにＮａＯＨ水溶液を添加した後に、ホモジナイザー（シルバーソン製Ｌ５）で攪拌し、細胞の破砕処理を行った。その後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁させる操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを３．５〜４．０に調整して６０℃で約３０分間攪拌後、１１５℃で５分間加熱してＰＨＢＨを凝集させ、次いで、脱水した。脱水後のＰＨＢＨに再び水を加え、次いで、脱水した。その後、得られたＰＨＢＨを７０℃で２４時間乾燥させて、精製ＰＨＢＨを得た。

【0045】

実施例１の排水である遠心分離上清を攪拌しながらそのｐＨを３．０に調整したところ、固液分離可能な大きなフロックが得られた。図２に得られたフロックの写真を示す。

【0046】

実施例２
実施例１と同様の操作により菌体培養液を調製した。この菌体培養液１０００ｇを７０〜７５℃で１時間加熱して滅菌し、５０℃に冷却後、リゾチーム（山東省華源経貿製）を２５ｍｇ添加し、ｐＨ６〜７で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。その後、アルカラーゼを５００ｍｇ添加し、ｐＨ８．０〜８．５で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。このようにして得られた酵素処理液にミリスチン酸Ｋ（日油製）を６ｇ添加し、ｐＨが１２になるようにＮａＯＨ水溶液を添加した後にホモジナイザー（シルバーソン製Ｌ５）で攪拌し、細胞の破砕処理を行った。その後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁させる操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを３．５〜４．０に調整して６０℃で約３０分間攪拌後、１１５℃で５分間加熱してＰＨＢＨを凝集させ、次いで、脱水した。脱水後のＰＨＢＨに再び水を加え、次いで、脱水した。その後、得られたＰＨＢＨを７０℃で２４時間乾燥させて、精製ＰＨＢＨを得た。

【0047】

実施例２の排水である遠心分離上清を攪拌しながらそのｐＨを３．０に調整したところ、固液分離可能な大きなフロックが得られた。図３に得られたフロックの写真を示す。

【0048】

実施例２の排水である遠心分離上清をＴＯＣ（全有機炭素量）１０００ｐｐｍになるように希釈したもの２０００ｇを、遠心分離で沈降させた活性汚泥の上清を廃棄したものに添加して、標準的な活性汚泥菌の濃度が３５００ｍｇ／Ｌとなるように調整した。当該排水について、ｐＨを７〜７．５にコントロールしながら２Ｌ／分の曝気を行い、ＴＯＣの経時変化を記録した。

【0049】

実施例３
実施例１と同様の操作により菌体培養液を調製した。この菌体培養液１０００ｇを７０〜７５℃で１時間加熱して滅菌し、５０℃に冷却後、リゾチーム（山東省華源経貿製）を２５ｍｇ添加し、ｐＨ６〜７で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。その後、アルカラーゼを５００ｍｇ添加し、ｐＨが８．０〜８．５で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。このようにして得られた酵素処理液にカプリン酸Ｎａ（関東化学製）を１０ｇ添加し、ｐＨが１２になるようにＮａＯＨ水溶液を添加した後にホモジナイザー（シルバーソン製Ｌ５）で攪拌し、細胞の破砕処理を行った。その後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁させる操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを３．５〜４．０に調整して６０℃で約３０分間攪拌後、１１５℃で５分間加熱してＰＨＢＨを凝集させ、次いで、脱水した。脱水後のＰＨＢＨに再び水を加え、次いで、脱水した。その後、得られたＰＨＢＨを７０℃で２４時間乾燥させて、精製ＰＨＢＨを得た。

【0050】

実施例３の排水である遠心分離上清を攪拌しながらそのｐＨを３．０に調整したところ、固液分離可能な大きなフロックが得られた。図４に得られたフロックの写真を示す。

【0051】

比較例１
実施例１と同様の操作により菌体培養液を調製した。この菌体培養液１０００ｇを７０〜７５℃で１時間加熱して滅菌し、５０℃に冷却後、リゾチーム（山東省華源経貿製）を２５ｍｇ添加し、ｐＨ６〜７で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。その後、アルカラーゼを５００ｍｇ添加し、ｐＨ８．０〜８．５で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。このようにして得られた酵素処理液にドデシル硫酸Ｎａ（和光純薬製）を６ｇ添加し、ｐＨが１２になるようにＮａＯＨ水溶液を添加した後にホモジナイザー（シルバーソン製Ｌ５）で攪拌し、細胞の破砕処理を行った。その後、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁させる操作を３回繰り返した。この後、懸濁液のｐＨを３．５〜４．０に調整して６０℃で約３０分間攪拌後、１１５℃で５分間加熱してＰＨＢＨを凝集させ、次いで、脱水した。脱水後のＰＨＢＨに再び水を加え、次いで、脱水した。その後、得られたＰＨＢＨを７０℃で２４時間乾燥させて、精製ＰＨＢＨを得た。

【0052】

比較例１の排水である遠心分離上清を攪拌しながらそのｐＨを３．０に調整したところ、細かく脆いフロックが得られ、これは固液分離が困難なものであった。図５にそのフロックの写真を示す。

【0053】

比較例１の排水である遠心分離上清をＴＯＣ１０００ｐｐｍになるように希釈したもの２０００ｇを、遠心分離で沈降させた活性汚泥の上清を廃棄したものに添加して、標準的な活性汚泥菌の濃度が３５００ｍｇ／Ｌとなるように調整した。当該排水について、ｐＨを７〜７．５にコントロールしながら２Ｌ／分の曝気を行い、ＴＯＣの経時変化を記録した。

【0054】

図１に実施例２と比較例２のＴＯＣの経時変化を示す。

【0055】

比較例２
実施例１と同様の操作により菌体培養液を調製した。この菌体培養液１０００ｇを７０〜７５℃で１時間加熱して滅菌し、５０℃に冷却後、リゾチーム（山東省華源経貿製）を２５ｍｇ添加し、ｐＨ６〜７で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。その後、アルカラーゼを５００ｍｇ添加し、ｐＨ８．０〜８．５で５０〜５５℃にコントロールしながら２時間攪拌した。このようにして得られた酵素処理液にオレイン酸Ｎａ（和光純薬製）を６ｇ添加し、ｐＨが１２になるようにＮａＯＨ水溶液を添加した後にホモジナイザー（シルバーソン製Ｌ５）で攪拌し、細胞の破砕処理を行った。続いて、遠心分離によりＰＨＢＨを回収し、水を加えてＰＨＢＨを懸濁させた。
以上の操作で発生した排水である遠心分離上清のｐＨを、攪拌しながら３．０に調整したところ、固液分離が困難な細かく脆いフロックが得られた。図６にそのフロックの写真を示す。

【0056】

【表1】

【0057】

表１に示すように、実施例１〜３に記載の方法によると、十分に残存窒素量を低減され、かつ加熱によっても分子量低下が小さい加工性に優れたＰＨＢＨを得ることが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】