特許 6865507 多能性幹細胞の無染色評価支援方法、プログラム、演算装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6865507

(24)【登録日】2021年4月8日

(45)【発行日】2021年4月28日

(54)【発明の名称】多能性幹細胞の無染色評価支援方法、プログラム、演算装置

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20210419BHJP

   G01N 21/41 20060101ALI20210419BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20210419BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210419BHJP

   C12N 5/0735 20100101ALI20210419BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/02

   G01N21/41 Z

   C12M1/34 B

   C12N5/10

   C12N5/0735

【請求項の数】10

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2016-128881(P2016-128881)

(22)【出願日】2016年6月29日

(65)【公開番号】特開2018-48(P2018-48A)

(43)【公開日】2018年1月11日

【審査請求日】2019年6月10日

(73)【特許権者】

【識別番号】000000376

【氏名又は名称】オリンパス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100074099

【弁理士】

【氏名又は名称】大菅 義之

(74)【代理人】

【識別番号】100121083

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 宏義

(74)【代理人】

【識別番号】100138391

【弁理士】

【氏名又は名称】天田 昌行

(72)【発明者】

【氏名】石渡 裕

【審査官】 小倉 梢

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−２０９０８５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PLoS ONE，２０１０年，Vol. 5:e14095，p. 1-9

【文献】 STEM CELLS AND DEVELOPMENT，２０１５年，Vol. 24，p. 1366-1373

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００ − １／７０

Ｃ１２Ｍ １／００ − １／４２

Ｃ１２Ｎ ５／００ − ５／２８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

位相分布を像強度分布に変換する光学顕微鏡によって撮像された生体標本の画像信号から前記生体標本の第１の位相分布を算出する工程と、
前記第１の位相分布から特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する工程と、
前記特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、前記生体標本の分化多能性をユーザが評価するための指標となる評価情報を作成し、前記評価情報を提示する工程と、を含み、
前記特定の位相量は、体細胞のミトコンドリアの位相量であり、
前記評価情報は、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域とその他の領域の割合を比較することができる情報である、
ことを特徴とする多能性幹細胞の無染色評価支援方法。

【請求項2】

請求項１に記載の無染色評価支援方法であって、
前記第１の位相分布の画像中の前記特定の位相量以上の位相量を有する領域を他の領域と区別することで、前記評価情報を作成する
ことを特徴とする多能性幹細胞の無染色評価支援方法。

【請求項3】

請求項１に記載の無染色評価支援方法であって、
前記生体標本の特定の領域において、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域が占有する面積比率を算出することで、前記評価情報を作成する
ことを特徴とする多能性幹細胞の無染色評価支援方法。

【請求項4】

請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の無染色評価支援方法であって、
位相分布を像強度分布に変換する前記光学顕微鏡として微分干渉顕微鏡を用いる
ことを特徴とする多能性幹細胞の無染色評価支援方法。

【請求項5】

請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の無染色評価支援方法であって、
位相分布を像強度分布に変換する前記光学顕微鏡として位相差顕微鏡を用いる
ことを特徴とする多能性幹細胞の無染色評価支援方法。

【請求項6】

請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の無染色評価支援方法であって、
位相分布を像強度分布に変換する前記光学顕微鏡として偏斜照明顕微鏡を用いる
ことを特徴とする多能性幹細胞の無染色評価支援方法。

【請求項7】

請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の無染色評価支援方法であって、
位相分布を像強度分布に変換する前記光学顕微鏡として偏心開口顕微鏡を用いる
ことを特徴とする多能性幹細胞の無染色評価支援方法。

【請求項8】

請求項１に記載の無染色評価支援方法であって、
閾値として体細胞の位相量を測定して取得し、
前記特定の位相量は、予め前記体細胞の位相量を測定して取得した位相量である
ことを特徴とする多能性幹細胞の無染色評価支援方法。

【請求項9】

コンピュータを、
位相分布を像強度分布に変換する光学顕微鏡によって撮像された生体標本の画像信号を受信する手段と、
前記画像信号から前記生体標本の第１の位相分布を算出する手段と、
前記第１の位相分布から特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する手段と、
前記特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、前記生体標本の分化多能性をユーザが評価するための指標となる評価情報を作成し、前記評価情報を出力する手段として機能させ、
前記特定の位相量は、体細胞のミトコンドリアの位相量であり、
前記評価情報は、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域とその他の領域の割合を比較することができる情報である、
ことを特徴とするプログラム。

【請求項10】

位相分布を像強度分布に変換する光学顕微鏡によって撮像された生体標本の画像信号を受信し、表示媒体へデータを出力する通信部と、
前記画像信号から前記生体標本の第１の位相分布を算出する演算部と、を備え、
前記演算部は、前記第１の位相分布から特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出し、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、前記生体標本の分化多能性をユーザが評価するための指標となる評価情報を作成し、
前記通信部は、前記評価情報を前記表示媒体へ出力し、
前記特定の位相量は、体細胞のミトコンドリアの位相量であり、
前記評価情報は、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域とその他の領域の割合を比較することができる情報である、
ことを特徴とする演算装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

多能性幹細胞の位相分布を用いた多能性幹細胞の無染色評価支援方法、プログラム、演算装置に関する。

【背景技術】

【0002】

ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）やＥＳ細胞（embryonic stem cells）は、様々な組織への分化多能性を有することから、生体移植等を行う再生医療の分野において注目が集まっている。

【0003】

一方で、ｉＰＳ細胞を培養する過程では、培養環境の変化や細胞分裂過程等によってｉＰＳ細胞の変異が生じ得る。ｉＰＳ細胞が変異した細胞には分化多能性がなく、ｉＰＳ細胞としての機能が失われている。そのため、状態の良いｉＰＳ細胞を選択的に抽出するためには、変異した細胞をいかに識別するかが重要となる。従来においても、変異した細胞の識別を行うことを視野に入れた、細胞の状態を推定する技術が知られている。

【0004】

例えば、特許文献１では、ｉＰＳ細胞とフィーダー細胞における、コロニーの大きさや外周の長さといった形態的特徴量の変化を抽出し、その特徴量のうち、ｉＰＳ細胞の情報を反映する特徴量を指定することで、ｉＰＳ細胞の状態を推定する技術が記載されている。

【0005】

特許文献２には、デフォーカスした画像成分を低減し焦点近傍の情報のみを抽出することで、細胞等の３次元的構造を有する位相物体の正確な位相分布を算出し、無染色で細胞や組織の３次元的な構造を精度良く検査する技術が記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開2011−229409号公報

【特許文献2】特開2014−209085号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

特許文献１のように、コロニー単位で特徴量を推定しても、コロニー内部において生じるｉＰＳ細胞の変異を推定するには至らない。従って、従来の技術では、ｉＰＳ細胞の良否判断を行うには不十分な側面がある。そのため、より良好にｉＰＳ細胞の良否判断を行うことを可能とする技術が望まれており、本願における発明では、そうした技術の提供を課題としている。

【0008】

また、本願における発明では、上記課題を解決する上で、特許文献２に記載の細胞等の３次元的構造を有する位相物体の正確な位相分布を取得する技術を応用することで、ｉＰＳ細胞のより具体的な良否判断を行う指標を確立することに着目した。

【課題を解決するための手段】

【0009】

本発明の一態様における無染色評価支援方法は、位相分布を像強度分布に変換する光学顕微鏡によって撮像された生体標本の画像信号から前記生体標本の第１の位相分布を算出する工程と、前記第１の位相分布から特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する工程と、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、前記生体標本の分化多能性をユーザが評価するための指標となる評価情報を作成し、前記評価情報を提示する工程と、を含み、前記特定の位相量は、体細胞のミトコンドリアの位相量であり、前記評価情報は、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域とその他の領域の割合を比較することができる情報であることを特徴とする。

【0010】

本発明の一態様におけるプログラムは、コンピュータを、位相分布を像強度分布に変換する光学顕微鏡によって撮像された生体標本の画像信号を受信する手段と、前記画像信号から前記生体標本の第１の位相分布を算出する手段と、前記第１の位相分布から特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する手段と、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、前記生体標本の分化多能性をユーザが評価するための指標となる評価情報を作成し、前記評価情報を出力する手段として機能させ、前記特定の位相量は、体細胞のミトコンドリアの位相量であり、前記評価情報は、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域とその他の領域の割合を比較することができる情報であることを特徴とする。

【0011】

本発明の一態様における演算装置は、位相分布を像強度分布に変換する光学顕微鏡によって撮像された生体標本の画像信号を受信し、表示媒体へデータを出力する通信部と、前記画像信号から前記生体標本の第１の位相分布を算出する演算部と、を備え、前記演算部は、前記第１の位相分布から特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出し、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、前記生体標本の分化多能性をユーザが評価するための指標となる評価情報を作成し、前記通信部は、前記評価情報を前記表示媒体へ出力し、前記特定の位相量は、体細胞のミトコンドリアの位相量であり、前記評価情報は、前記特定の位相量以上の位相量を有する領域とその他の領域の割合を比較することができる情報であることを特徴とする。

【発明の効果】

【0012】

本願の発明によれば、良好にｉＰＳ細胞の良否判断を行うための指標となる情報を提供する多能性幹細胞の無染色評価支援方法、プログラム、演算装置を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】第１の実施形態における顕微鏡と演算装置の構成を示す図。

【図2】第１の実施形態における演算装置の機能構成を示す図。

【図3】第１の実施形態における無染色評価支援方法のフローチャート。

【図4】第１の位相分布画像の一例を示す図。

【図5】図４の第１の位相分布画像について生体細胞が存在する領域と存在しない領域とを２値化した画像を示す図。

【図6】図５の２値化画像について特定の位相量以上の位相量を有する領域と有しない領域とを２値化した画像を示す図。

【図7】図４と、図６の画像を重畳した画像を示す図。

【図8】第１の実施形態の変形例の無染色評価支援方法のフローチャート。

【図9】第２の実施形態における顕微鏡と演算装置の構成を示す図。

【図10】第３の実施形態における顕微鏡と演算装置の構成を示す図。

【図11】第３の実施形態のＬＥＤを示す図。

【図12】第４の実施形態における顕微鏡と演算装置の構成を示す図。

【図13】第４の実施形態の偏心開口を示す図。

【発明を実施するための形態】

【0014】

以下、図面を参照しつつ第１の実施形態における多能性幹細胞（以下ｉＰＳ細胞とも表記する）の無染色評価支援方法を実施する顕微鏡１と演算装置２０の構成について説明する。図１は、顕微鏡１と演算装置２０の構成を示す図である。

【0015】

顕微鏡１は、生体細胞等の位相物体の構造を像強度分布として表す光学像を結像する微分干渉顕微鏡である。顕微鏡１は、照明光学系２と、標本Ｓを固定する図示しないステージと、結像光学系３と、撮像素子１５を備えている。また、顕微鏡１は、演算装置２０と接続されている。

【0016】

標本Ｓは、ｉＰＳ細胞等の生体細胞を含むコロニーや、培養液等を含む生体標本であり、光を透過し、透過する光に位相差を生じさせる位相物体である。標本Ｓを固定する不図示のステージは、各種光学系の光軸方向及びその直交する面上を移動可能に制御される。

【0017】

照明光学系２は、光源４と、コレクタレンズ５と、ミラー７と、偏光板８と、λ／４板１６と、微分干渉(Differential interference contrast microscope; DIC)プリズム９と、コンデンサレンズ６とを備えている。結像光学系３は、対物レンズ１０と、DICプリズム１２と、偏光板１３と、ミラー１１と、結像レンズ１４を備えている。撮像素子１５は、例えばＣＣＤカメラであり、光を画像信号に変換する。尚、DICプリズム９、１２はそれぞれコンデンサレンズ６、対物レンズ１０の瞳位置、若しくは瞳共役位置に配置される。

【0018】

照明光学系２において、偏光板８は、入射する光を単一の振動面をもつ偏光に変換する。DICプリズム９は、ノマルスキープリズムとも呼ばれ、偏光板８を介して入射してきた光を互いに直交する振動面を持つ2つの偏光に分割する。この２偏光は、標本Ｓのわずかに異なるズレ量（以下シアー量とも記載する）だけずれた位置に入射する。そのため、２偏光は、それぞれ標本Ｓの厚みや屈折率が異なる位置を通過し、異なる光学的光路長を経て結像光学系３において結像されることから、この２偏光間には位相差が生じる。この位相差をリターデーションとも記載する。また、この２偏光のずれる方向をシアー方向とも記載する。

【0019】

結像光学系３において、DICプリズム１２は、入射してきた２偏光を単一振動面の光に統合する。この過程で光の干渉が起こり、２偏光が有する位相差に基いてコントラストが形成された微分像として、撮像素子１５に結像される。即ち、顕微鏡１は、標本Ｓが有する構造を、位相分布を像強度分布に変換することで画像化することができる顕微鏡である。

【0020】

さらに、DICプリズム９、１２はそれぞれ回転制御されることでシアー方向を変更するように制御される。また、偏光板８も回転制御されることで、リターデーションを変更するように制御される。より詳しくは、偏光板８は、リターデーションを変更することで、撮像素子１５に結像される像コントラストを変化するように制御される。即ち、顕微鏡１は、特開２０１４−２０９０８５号公報に記載される顕微鏡システム１００の構成と同様に、シアー方向が切り替え可能な顕微鏡であり、像コントラストの異なる複数の画像を取得するように機能する顕微鏡である。尚、上記DICプリズム９、１２、偏光板８について行われる制御は、例えば、顕微鏡１に接続されるコンピュータによって連動して行われてもよい。

【0021】

演算装置２０は、撮像素子１５に接続されており、撮像素子１５が撮像した画像信号を演算する機能を有するコンピュータである。また、演算装置２０は、不図示のモニタ等の画像表示媒体と接続され、演算処理をした画像信号を画像表示媒体へ出力することで画像表示を行う。尚、上記DICプリズム９、１２、偏光板８の制御を実施するコンピュータと演算装置２０が一つのコンピュータであってもよい。即ち、一つのコンピュータが演算装置２０の機能を有し、また、上記DICプリズム９、１２、偏光板８の制御を実行するものとしてもよい。

【0022】

図２は、演算装置２０の機能構成を示す図である。演算装置２０は、その機能構成として、通信部２１と、記憶部２２と、演算部２３とにわけられる。

【0023】

通信部２１は、撮像素子１５が撮像した画像信号を受信し、演算装置２０によって演算処理をした画像信号等のデータを、画像表示媒体へ出力する処理を行う。

【0024】

記憶部２２は、通信部２１が受信した画像信号を演算部２３へ送信し、また、演算部２３から受信した画像信号を通信部へ送信する。また、記憶部２２は、一時的に画像信号を記憶する記憶手段として機能する。

【0025】

演算部２３は、記憶部２２から受信した画像信号を用いて演算処理を実行する。演算部２３が実行する演算処理は、大きく分けて三つであり、一つ目は、標本Ｓの複数の画像信号から標本Ｓの位相分布である第１の位相分布を算出する処理である。二つ目は、第１の位相分布から、特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する処理である。三つ目は、特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、標本Ｓの状態をユーザが評価するための指標となる評価情報を作成する処理である。

【0026】

特定の位相量とは、ｉＰＳ細胞が変異することで体細胞となった場合に、その細胞が有する位相量である。即ち、特定の位相量以上の位相量を有する領域とは、ｉＰＳ細胞が変異している等によって、分化多能性を有するｉＰＳ細胞が存在しない領域に等しい。尚、本実施形態では、特定の位相量として体細胞のミトコンドリアの位相量を用いている。この理由として、ｉＰＳ細胞は、ｉＰＳ細胞が変異し得るその他の体細胞と比べてミトコンドリアの代謝が異なり、結果として細胞が有する位相量が変わることから、ｉＰＳ細胞の変異の有無を判別する判断基準となり得るためである。

【0027】

通常の体細胞では、ミトコンドリアの中でエネルギーが生み出されるプロセスであるＴＣＡサイクルが活発に行われる。一方で、ｉＰＳ細胞では、ミトコンドリアの働きが活発ではなく、体細胞に比べてミトコンドリアの形態や数量が異なることが知られている。そのため、ｉＰＳ細胞と、ｉＰＳ細胞が変異し得るその他の体細胞とでは、ミトコンドリアの形態や数量の違いに起因して、位相量に違いが生じる。

【0028】

従って、特定の位相量（体細胞のミトコンドリアの位相量）以上の位相量を有する領域を算出し、特定の位相量以上の位相量を有する領域とから体細胞のミトコンドリアの細胞内分布量に基づいた生体標本の状態を評価するための評価情報を作成することで、ユーザはｉＰＳ細胞の変異の有無を判別することが可能となる。具体的なｉＰＳ細胞の評価方法については後述する。

【0029】

以上の構成を有する顕微鏡１と演算装置２０を用いて、標本Ｓに含まれるｉＰＳ細胞の良否を判断するための指標となる情報（評価情報）をユーザに提供する無染色の評価支援方法を実行する。具体的には、その評価支援方法は、ｉＰＳ細胞の変異を識別するための評価情報を提供することで、ユーザが行うｉＰＳ細胞の良否判断を支援するものである。図３は、本実施形態におけるｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法の手順を示すフローチャートである。以下図３を用いてｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法を説明する。尚、ステップＳ１からステップＳ４までの第１の位相分布を算出する工程は、特開２０１４−２０９０８５号公報に記載される技術を用いて実行することが可能である。

【0030】

ステップＳ１では、顕微鏡１によって標本Ｓの像コントラストの異なる複数の位相分布画像を取得する。より具体的には、ある特定のシアー方向において、リターデーションが±θとなるように偏光板８が制御されることで、計２枚の位相分布画像を取得する。さらに、DICプリズム９、１２によってシアー方向を変更された状態で、同様に偏光板８が制御されることで計２枚の位相分布画像を取得する。即ち、ステップＳ１では、顕微鏡１によってシアー方向毎に像コントラストの異なる２枚の位相分布画像がそれぞれ取得される。尚、取得された位相分布画像は、いずれも演算装置２０に送信され、通信部２１と記憶部２２を介して、演算部２３へ送信される。

【0031】

ステップＳ２では、演算部２３が、ステップＳ１で得られた位相分布画像から差演算画像と和演算画像を形成し、差演算画像を和演算画像で割ることで、規格化された位相分布画像を算出する。差演算画像は、リターデーションが対称（±θ）な画像を差演算することで得られる画像であり、ｉＰＳ細胞の位相分布に対応した画像成分である。和演算画像は、リターデーションが対称（±θ）な画像を和演算することで得られる画像であり、ｉＰＳ細胞を観察するときの照明分布等を表す画像成分である。従って、差演算画像を和演算画像で割ることで、差演算画像が規格化され、標本Ｓの位相分布と顕微鏡１の光学的応答特性（ＯＴＦ：Optical Transfer Function光学的伝達関数ともいう）がコンボリューションされた像成分のみを抽出することができる。尚、演算部２３は、各シアー方向毎に、規格化された位相分布画像を算出するため、ここでは二枚の規格化された位相分布画像が得られる。

【0032】

ステップＳ３では、演算部２３が、規格化された位相分布画像に対し、大きさの異なる複数のカーネルを用いた演算処理を行うことで、位相分布画像を三つの空間周波数成分に分解する。分解される空間周波数成分は、空間周波数が最も低い背景成分と、標本Ｓ内部で屈折する光によって形成される屈折成分と、標本Ｓの内部の構造で回折する光によって形成される空間周波数が最も高い構造成分とにわけられる。まず、大きいカーネルサイズ（例えばカーネルサイズが100×100）の平均化フィルターによって平均化処理を複数回行い、位相分布画像の背景成分を算出する。次に、規格化された位相分布画像から背景成分を引き算した視野ムラ等の外乱が除去された画像に対し、小さいカーネルサイズ（例えばカーネルサイズが20×20）の平均化フィルターによって平均化処理を複数回行い、位相分布画像の屈折成分を算出する。そして、規格化された位相分布画像から背景成分と、屈折成分を引き算することで、位相分布画像の構造成分を算出する。尚、演算部２３は、ステップＳ２で得られた、シアー方向の異なる二枚の規格化された位相分布画像をそれぞれ分解して、背景成分と屈折成分と構造成分を算出する。

【0033】

ステップＳ４では、ステップＳ３で求めた構造成分に対し、対応したＯＴＦを用いてデコンボリューション処理を実行することで、構造成分の位相分布を算出する。尚、演算部２３は、シアー方向毎に、視野ムラなどの外乱等（背景成分、屈折成分）を取り除いた構造成分の位相分布を算出する。最後に、各シアー方向において算出された構造成分の位相分布を合成することでシアー方向の影響が排除された標本Ｓの第１の位相分布を算出する。ステップＳ１からＳ４の演算処理で算出された第１の位相分布は、合焦位置近傍に存在する構造成分の位相分布である。尚、この段階で一度、通信部２１によって第１の位相分布から生成される第１の位相分布の画像が画像表示媒体へ出力されてもよい。

【0034】

図４は、第１の位相分布の画像を画像表示媒体へ出力した画像の一例を示す図である。ミトコンドリアは、微細な構造をもつことが知られているため、以下のステップでは、ステップＳ１からＳ４までで算出した構造成分の位相分布（第１の位相分布）からミトコンドリアに対応した位相量の抽出を実行する。

【0035】

ステップＳ５では、演算部２３は、第１の位相分布から特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する。特定の位相量は、上述したように体細胞のミトコンドリアの位相量である。ここでいう、特定の位相量以上の位相量を有する領域とは、分化多能性を有するｉＰＳ細胞が存在しない領域のことを示す。

【0036】

ステップＳ５では、例えば、予め体細胞のサンプルの位相量を顕微鏡１と演算装置２０を用いて測定し、体細胞のミトコンドリアに対応する位相量の値を算出しておき、その値を閾値として構造成分の位相分布における閾値以上の特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出すればよい。

【0037】

尚、特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する範囲を計測範囲としたとき、その計測範囲は、設定により変更が可能である。例えば、ステップＳ４の段階で出力された第１の位相分布の画像（例えば図４に示したような画像）をユーザが視認して画像内の領域を指定することで計測範囲を決定してもよい。計測範囲は、細胞が形成する集合体の輪郭や、輪郭内部の任意の範囲とすることもできる。特に、計測範囲を細胞一個の画像面積に設定すれば、細胞単位での評価を行うことが可能となる。

【0038】

また、特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する計測範囲は、ユーザが任意に決定した範囲に限らず、第１の位相分布から生体細胞が存在する範囲を求めてその範囲を計測範囲としてもよい。例えば、生体細胞が存在しない範囲は、位相分布に変化がなく、像コントラストは低くなる。そのため、規格化された位相分布画像にシアー方向に微分する行列演算子でコンボリューション処理を行うことで、像コントラストの低い生体細胞の存在しない範囲を抽出することができる。即ち、生体細胞の存在する範囲を抽出でき、その範囲を計測範囲とすることができる。

【0039】

図５は、図４に示した第１の位相分布において、生体細胞が存在する範囲を計測範囲として設定した場合の計測範囲を示す画像であり、計測範囲（画素）を１、それ以外の部分（画素）を０として２値化した画像である。図中の領域Ａは、計測範囲を示し、領域Ｂがそれ以外の領域を示している。

【0040】

図６は、図５の計測範囲において、ステップＳ５を実行して算出した特定の位相量以上の位相量を有する領域を示す画像であり、特定の位相量以上の位相量を有する領域（画素）を１、それ以外の部分（画素）を０として２値化した画像である。図中の領域Ｃは、特定の位相量以上の位相量を有する領域を示し、領域Ｄは、それ以外の領域を示している。尚、ステップＳ５における計測範囲を設定する工程と特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する工程は、演算装置２０で内部処理されるため、実際には図５、６で示すような画像を画像表示媒体に出力する必要はないが、ここでは説明の都合上、対応する画像を示した。

【0041】

ステップＳ６では、演算部２３は、第１の位相分布から作られる画像中の特定の位相量以上の位相量を有する領域を他の領域と区別した画像を生成する。例えば、第１の位相分布の画像に特定の位相量以上の位相量を有する領域を重畳した画像信号を作成し、通信部２１を介して画像表示媒体へ出力する。図７は、図６の特定の位相量以上の位相量を有する領域を特定の色で図４に示す第１の位相分布の画像に重畳して画像表示媒体へ出力したときの画像を示す。以上の工程により、フローチャートを終了する。

【0042】

ステップＳ６によって画像表示媒体に表示された画像によれば、ｉＰＳ細胞が変異したために分化多能性が低くなっている箇所が特定の色で区別されて示されているため、ｉＰＳ細胞が変異した箇所を容易に判別することができる。言い換えるならば、ｉＰＳ細胞が分化多能性を維持している領域を容易に判別することが可能となる。即ち、ステップＳ６の工程は、第１の位相分布の画像と、特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、ユーザが標本Ｓの状態を評価するための指標となる画像（評価情報）を作成して、その画像をユーザに提示する工程である。

【0043】

以上の本実施形態の無染色評価支援方法によれば、良好にｉＰＳ細胞の良否判断を行うための指標となる評価情報を提供することができる。本実施形態では、第１の位相分布の画像に特定の位相量以上の位相量を有する領域を重畳した画像から、分化多能性を失った細胞が存在する箇所をコロニー内部において、容易に判別することが可能となる。

【0044】

また、生体細胞が存在する範囲を計測範囲として設定した場合、生体細胞を含まない範囲を自動的に除外することから、計測範囲がユーザにより任意に設定される場合よりも正確にｉＰＳ細胞が変異した割合を算出することができる。

【0045】

以下、第１の実施形態の変形例である無染色評価支援方法を以下に示す。図８は、変形例であるｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法の手順を示すフローチャートである。尚、図８におけるステップＳ１からＳ５までの工程（第１の位相分布を算出し、特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する工程）は、図３に示したステップＳ１からＳ５までの工程と等しいため、説明を省略する。

【0046】

ステップＳ７では、演算部２３は、特定の位相量以上の位相量を有する領域が画像の計測範囲内において占有する面積を算出する。その面積を算出するにあたり、例えば、図６に示すように特定の位相量以上の位相量を有する部分（画素）を１、それ以外の部分（画素）を０として画像信号中の領域を２値化する。１が割り当てられた画素の面積を算出することで特定の位相量以上の位相量を有する領域が占有する面積を算出することができる。

【0047】

ステップＳ８では、演算部２３は、計測範囲において、特定の位相量以上の位相量を有する領域が占有する面積の比率を算出して、その面積比率を通信部２１を介して画像表示媒体へ出力する。

【0048】

ステップＳ８によって画像表示媒体に表示される面積比率を参照することで、ｉＰＳ細胞が変異した領域の割合を把握することができる。言い換えるならば、計測範囲内においてｉＰＳ細胞が分化多能性を維持している領域の割合を把握することができ、その割合の大小から標本Ｓに含まれるｉＰＳ細胞の良否判断を行うことができる。即ち、ステップＳ８の工程は、特定の位相量以上の位相量を有する領域を用いて、ユーザが標本Ｓの状態を評価するための指標となる面積比率（評価情報）を生成して、ユーザに提示する工程である。

【0049】

以上の変形例である無染色評価支援方法によっても、良好にｉＰＳ細胞の良否判断を行うための指標となる評価情報を提供することができる。特に本変形例では、ｉＰＳ細胞が変異した領域の面積と計測範囲の面積の比を算出することで、計測範囲の中でｉＰＳ細胞が変異した割合を具体的な数値として表すことができるため、ユーザはより客観的な指標によってｉＰＳ細胞の良否判断を行うことが可能となる。また、計測範囲の中でｉＰＳ細胞が変異した領域の単位面積当たりの比率を知ることで、細胞単位での比率を近似的に求めることもできる。

【0050】

さらに、上記の第１の実施形態と変形例を組み合わせることでｉＰＳ細胞の良否判断を行うための無染色評価支援方法を実施してもよい。例えば、演算装置２０が、第１の位相分布の画像に特定の位相量以上の位相量を有する領域を重畳した画像を作成して画像表示媒体へ表示し、表示された画像からユーザがさらに特定の領域（例えば特定のコロニーまたは細胞）を指定して、演算装置２０が、その領域において特定の位相量以上の位相量を有する領域が占有する面積の比率を算出し、その面積比率を画像表示媒体へ表示してもよい。この方法によれば、第１の位相分布に特定の位相量以上の位相量を有する領域を重畳した画像から、ユーザは分化多能性を失った細胞が存在する箇所を判断できるとともに、その画像の中からより客観的な評価を実施したい特定の細胞やコロニーにおいて、特定の位相量以上の位相量を有する領域の面積比率を得ることでより客観的なｉＰＳ細胞の良否判断を行うことが可能となる。

【0051】

以下、図９を用いて第２の実施形態におけるｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法を実施する顕微鏡３０と演算装置４３の構成について説明する。図９は、顕微鏡３０と演算装置４３の構成を示す図である。

【0052】

顕微鏡３０は、生体細胞等の位相物体の構造を像強度分布として表す光学像を結像する位相差顕微鏡である。顕微鏡３０は、照明光学系３１と、標本Ｓを固定する図示しないステージと、結像光学系３７と、撮像素子４２を備えている。また、顕微鏡３０は、演算装置４３と接続されている。標本Ｓは、第１の実施形態で説明したものと同様、標本Ｓは、ｉＰＳ細胞等の生体細胞を含むコロニーや、培養液等を含む生体標本である。

【0053】

顕微鏡３０は、照明光学系３１として、光源３２と、コレクタレンズ３３と、ミラー３６と、リングスリット３５と、コンデンサレンズ３４と、を備えている。また顕微鏡３０は、結像光学系３７として、対物レンズ３８と、液晶素子４０と、ミラー３９と、結像レンズ４１を備えている。撮像素子４２は、例えばＣＣＤカメラであり、光を画像信号に変換する。

【0054】

液晶素子４０は、リングスリット３５と共役な位置に配置されており、顕微鏡３０では、液晶素子４０の位相量を変化させることで結像される像のコントラストを変化させる。

【0055】

演算装置４３は、演算装置２０と同様の機能構成を有しており、顕微鏡３０によって撮像された標本Ｓの画像信号から第１の位相分布算出し、特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する。

【0056】

従って、位相差顕微鏡である顕微鏡３０を用いても顕微鏡１と同様に、液晶素子４０の位相量を±ψに変化させたときの２枚の像コントラストの異なる画像を撮像し、それらの画像から差演算画像と和演算画像を算出し、規格化された位相分布画像を算出することができる（図３のステップＳ２までの工程に相当）。以下、第１の実施形態と同様の手順により、演算装置４３によってｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法を実施することが可能である。尚、本実施形態の顕微鏡３０では、標本Ｓの異なる位置に照射した２偏光から像コントラストを変化させた画像を算出していないため、シアー方向の影響を排除する工程が含まれない点で第１の実施形態の無染色評価支援方法とは異なる。

【0057】

以上の本実施形態の無染色評価支援方法によっても、良好にｉＰＳ細胞の良否判断を行うための指標となる評価情報を提供することができる。

【0058】

以下、図１０を用いて第３の実施形態におけるｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法を実施する顕微鏡５０と演算装置６２の構成について説明する。図１０は、顕微鏡５０と演算装置６１の構成を示す図である。

【0059】

顕微鏡５０は、生体細胞等の位相物体の構造を像強度分布として表す光学像を結像する偏斜照明顕微鏡である。顕微鏡５０は、照明光学系５１と、標本Ｓを固定する図示しないステージと、結像光学系５５と、撮像素子５９を備えている。また、顕微鏡５０は、演算装置６０と接続されている。標本Ｓは、第１の実施形態で説明したものと同様、標本Ｓは、ｉＰＳ細胞等の生体細胞を含むコロニーや、培養液等を含む生体標本である。

【0060】

顕微鏡５０は、照明光学系５１として、光源であるＬＥＤ５２と、コンデンサレンズ５３と、ミラー５４を備えている。また顕微鏡５０は、結像光学系５５として、対物レンズ５６と、ミラー５７と、結像レンズ５８を備えている。撮像素子５９は、例えばＣＣＤカメラであり、光を画像信号に変換する。

【0061】

ＬＥＤ５２は、図１１に示すように照明光学系５１の光軸から偏心した４つの位置に配置された４枚のＬＥＤ６１、６２、６３、６４から構成されており、それぞれ光の発光と消灯を制御する。即ち、顕微鏡５０では、図１１に示す水平方向（Ｘ方向）と垂直方向（Ｙ方向）で計４つの方向から偏斜照明を行うことができる。

【0062】

演算装置６０は、演算装置２０と同様の機能構成を有しており、顕微鏡５０によって撮像された標本Ｓの画像信号から第１の位相分布を算出し、特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する。

【0063】

従って、偏斜照明顕微鏡である顕微鏡５０を用いても顕微鏡１と同様に、水平方向に配置されたＬＥＤ６１、６２による偏斜照明（それぞれ±ωの角度で標本Ｓに照明される）により画像を撮像し、それらの画像から差演算画像と和演算画像を算出し、規格化された位相分布画像を算出することができる（図３のステップＳ２までの工程に相当）。また、垂直方向に配置されたＬＥＤ６５、６６からも偏斜照明によって同様に規格化された位相分布画像を算出する。そして、図３のステップＳ３、Ｓ４の工程のように、規格化された位相分布画像から背景成分と、屈折成分と、構造成分とを抽出し、構造成分の位相分布を算出することができる。そして、第１の位相分布は、それぞれ垂直方向と水平方向とから求められた構造成分の位相分布をベクトル合成して求めることができる。以下、第１の実施形態と同様の手順により、演算装置６０によってｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法を実施することが可能である。

【0064】

尚、本実施形態の顕微鏡５０においても、第１の実施形態のように標本Ｓの異なる位置に照射した２偏光から像コントラストを変化させた画像を算出していないため、シアー方向の影響を排除する工程が含まれない点で第１の実施形態の無染色評価支援方法とは異なる。

【0065】

以上の本実施形態の無染色評価支援方法によっても、良好にｉＰＳ細胞の良否判断を行うための指標となる評価情報を提供することができる。

【0066】

以下、図１２を用いて第４の実施形態におけるｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法を実施する顕微鏡７０と演算装置８３の構成について説明する。図１２は、顕微鏡７０と演算装置８３の構成を示す図である。

【0067】

顕微鏡７０は、生体細胞等の位相物体の構造を像強度分布として表す光学像を結像する偏心開口顕微鏡である。顕微鏡７０は、照明光学系７１と、標本Ｓを固定する図示しないステージと、結像光学系７７と、ＣＣＤカメラ等の撮像素子８２を備えている。また、顕微鏡７０は、演算装置８３と接続されている。また、標本Ｓは、第１の実施形態で説明したものと同様、ｉＰＳ細胞等の生体細胞を含むコロニーや、培養液等を含む生体標本である。

【0068】

顕微鏡７０は、照明光学系７１として、光源７２と、コレクタレンズ７３と、ミラー７５と、コンデンサレンズ７６を備えている。また、顕微鏡７０は、結像光学系７７として、対物レンズ７８と、ミラー７９と、結像レンズ８１を備えている。また、顕微鏡７０は、照明光学系７１中に開口絞り７４を備え、標本Ｓと撮像素子８２との間であって、対物レンズ７８の瞳位置に遮光手段８０を備えている。

【0069】

遮光手段８０は、標本Ｓからの光を遮断する遮光手段であり、結像光学系７７の光軸から偏心した位置に、偏心開口である開口部８０ａを有している。また、遮光手段８０は、結像光学系７７の光軸を中心軸として回転制御され、結像光学系７７の光軸に垂直な平面上で開口部８０ａの位置を変更することができる。

【0070】

図１３は、遮光手段８０と、開口部８０ａとの位置関係を示す図である。ハッチングで記載した領域８５は、照明光学系７１により照明された標本Ｓからの光であって、標本Ｓによって回折されない光、すなわち位相物体である標本Ｓがない、または、標本Ｓの位相が均一であるとしたときの光（０次光）が対物レンズ７８の瞳８４へ到達する領域を示している。即ち、図１３における開口部８０ａは、０次光が開口部８０ａの一部分を通過するような位置に設けられている。そのため、標本Ｓによって回折された特定方向の１次回折光が開口部８０ａを通過する。また、照明光学系７１の開口絞り７４と対物レンズ７８の瞳８４は、ほぼ光学的に共役な位置に配置されており、領域８５は、開口絞り７４の投影像を示している。そのため、開口絞り７４を所定の径に絞ることによって、対物レンズ７８の瞳８４で光束の径を調節することができ、ここでは図１３のように、瞳８４のすべてを満たさない所定の径になるよう設定される。

【0071】

上記のような構成では、標本Ｓに対して垂直に照明光が照明される場合であっても、遮光手段８０が有する開口部８０ａを標本Ｓで回折した特定方向の１次回折光が通過するような構成となる。従って、偏斜照明を行うときと同様に標本Ｓの特定方向のコントラストを際立たせるような像を撮像素子８２に結像させることができる。

【0072】

演算装置８３は、演算装置２０と同様の機能構成を有しており、顕微鏡７０によって撮像された標本Ｓの画像信号から第１の位相分布を算出し、特定の位相量以上の位相量を有する領域を抽出する。

【0073】

以上から、顕微鏡７０と演算装置８３を用いた場合でも、遮光手段８０を回転制御し、図１３のＸ軸上の対称な２方向と、図１３のＹ軸上の対称な２方向と、の４方向の一次回折光による像を取得することができるため、第３の実施形態と同様の手順で第１、２の位相分布を算出し、演算装置８３によってｉＰＳ細胞の無染色評価支援方法を実施することが可能である。

【0074】

上述した実施形態は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではない。上記の無染色評価支援方法、演算装置、及びプログラムは、特許請求の範囲に記載した本発明を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

【符号の説明】

【0075】

１、３０、５０、７０ 顕微鏡
２、３１、５１、７１ 照明光学系
３、３７、５５、７７ 結像光学系
４、３２、５２、７２ 光源
５、３３、７３ コレクタレンズ
６、３４、５３、７６ コンデンサレンズ
７、１１、３６、３９、５３、５７、７５、７９ ミラー
８、１３ 偏光板
９、１２ ＤＩＣプリズム
１０、３８、５６、７８ 対物レンズ
１４、４１、５８、８１ 結像レンズ
１５、４２、５９、８２ 撮像素子
１６ λ／４板
２０、４３、６０、８３ 演算装置
２１ 通信部
２２ 記憶部
２３ 演算部
３５ リングスリット
８０ 遮光手段
８０ａ 開口部
８４ 瞳
８５、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ 領域

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】