特許 6865800 乳がん評価方法、および乳がん評価用の尿検査キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6865800

(24)【登録日】2021年4月8日

(45)【発行日】2021年4月28日

(54)【発明の名称】乳がん評価方法、および乳がん評価用の尿検査キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/493 20060101AFI20210419BHJP

   G01N 33/573 20060101ALI20210419BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20210419BHJP

   C12Q 1/37 20060101ALI20210419BHJP

   C12Q 1/686 20180101ALI20210419BHJP

   C12Q 1/6851 20180101ALI20210419BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20210419BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/493 A

   G01N33/573 A

   G01N33/574 A

   C12Q1/37

   C12Q1/686 Z

   C12Q1/6851 Z

   !C12N15/113 Z

【請求項の数】13

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2019-179510(P2019-179510)

(22)【出願日】2019年9月30日

(65)【公開番号】特開2021-56103(P2021-56103A)

(43)【公開日】2021年4月8日

【審査請求日】2020年1月31日

【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用 令和１年９月１９日 ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ ＲＥＰＯＲＴＳ ９、Ａｒｔｉｃｌｅ ｎｕｍｂｅｒ：１３５９５、２０１９年にて発表

(73)【特許権者】

【識別番号】519353215

【氏名又は名称】岡▲崎▼ 勲

(73)【特許権者】

【識別番号】519353226

【氏名又は名称】菊池 潔

(73)【特許権者】

【識別番号】519353237

【氏名又は名称】安藤 航

(74)【代理人】

【識別番号】110001070

【氏名又は名称】特許業務法人ＳＳＩＮＰＡＴ

(72)【発明者】

【氏名】岡▲崎▼ 勲

(72)【発明者】

【氏名】菊池 潔

(72)【発明者】

【氏名】高後 裕

(72)【発明者】

【氏名】安藤 航

(72)【発明者】

【氏名】植松 崇之

(72)【発明者】

【氏名】尾鳥 勝也

(72)【発明者】

【氏名】横森 弘昭

【審査官】 倉持 俊輔

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１６／１８５５６４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／０４５６６６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／０３６９３５２（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００８／０１０８０６５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１６／００７８１６７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２０１６−０２８５７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 HANNAFON, B. N. et al.，Plasma exosome microRNAs are indicative of breast cancer，Breast Cancer Research，２０１６年 ９月 ８日，vol.18, Article number:90，pp.1-14

【文献】 岡崎勲 ほか，コラゲナーゼから肝線維化と肝癌を考える，G. I. Research，２００６年，Vol.14, No.6，pp.543-551

【文献】 ERBES, T. et al.，Feasibility of urinary microRNA detection in breast cancer patients and its potential as an innovative non-invasive biomarker，BMC Cancer，２０１５年 ３月２８日，Vol.15, No.193，pp.1-9

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／４８ − ３３／９８

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

医中誌ＷＥＢ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象の尿中エクソソームに含まれる活性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）を測定する工程（Ａ１）、エクソソーム特異的タンパク質を測定する工程、及び活性型ＭＭＰ−１／エクソソーム特異的タンパク質を算出する工程を含む、乳がんに関するデータを提供する、乳がんに関する検査方法。

【請求項2】

前記乳がんに関するデータが、乳がんに罹患している可能性を示すデータである、請求項１に記載の乳がんに関する検査方法。

【請求項3】

前記乳がんが、ステージ０またはステージＩの乳がんである、請求項１または２に記載の乳がんに関する検査方法。

【請求項4】

前記工程（Ａ１）は、対象の尿から調製されたエクソソーム調製物中の活性型ＭＭＰ−１を測定するものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の乳がんに関する検査方法。

【請求項5】

さらに、前記対象の尿中エクソソームに含まれるマイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）を測定する工程（Ｂ１）を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の乳がんに関する検査方法。

【請求項6】

前記活性型ＭＭＰ−１の測定は、ウエスタンブロッティングによって行うものである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の乳がんに関する検査方法。

【請求項7】

前記ｍｉＲ２１の測定は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって行うものである、請求項５に記載の乳がんに関する検査方法。

【請求項8】

前記工程（Ａ１）、エクソソーム特異的タンパク質を測定する工程、及び活性型ＭＭＰ−１／エクソソーム特異的タンパク質を算出する工程で得られた活性型ＭＭＰ−１／エクソソーム特異的タンパク質を、健常人の尿中エクソソームに含まれる活性型ＭＭＰ−１／エクソソーム特異的タンパク質と比較する工程（Ａ２）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の乳がんに関する検査方法。

【請求項9】

前記工程（Ｂ１）で得られたｍｉＲ２１の測定結果を、健常人の尿中エクソソームに含まれるｍｉＲ２１の測定結果と比較する工程（Ｂ２）を含む、請求項５または７に記載の乳がんに関する検査方法。

【請求項10】

対象の尿中エクソソームに含まれるマイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）を測定する工程（Ｂ１）を含む、乳がんに関するデータを提供する、乳がんに関する検査方法。

【請求項11】

エクソソーム調製試薬と活性型マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）測定試薬とエクソソーム特異的タンパク質測定試薬とを含む、乳がん評価用の尿検査キット。

【請求項12】

エクソソーム調製試薬とマイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）測定試薬とを含む、乳がん評価用の尿検査キット。

【請求項13】

前記乳がんが、ステージ０またはステージＩの乳がんである、請求項１１または１２に記載の乳がん評価用の尿検査キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳がん評価方法、および乳がん評価用の尿検査キットに関する。

【背景技術】

【0002】

乳がんの罹患率は、日本では徐々に増加しており、日本人女性の部位別がん罹患率の第一位は乳がんであり、死亡率も高い。しかし、早期発見できれば生存率は高くなり、さらに乳房温存等の手術法や治療法の選択肢が増え、入院、治療期間も短くできてメリットは非常に大きい。そのため、早期発見のための乳がん検診は、ピンクリボン運動などにより推奨されている。乳がん検診としては、一般に視診、触診、マンモグラフィー、超音波検査が用いられ、これらを組み合わせることが効果的である。欧米では、乳がんの死亡率が徐々に減少しており、乳がん検診の受診率が約７０％と非常に高いことがその理由の一つとして考えられている。一方、日本では乳がん検診の受診率は約３０％と低い。乳がん検診は乳房を検査の対象とするため恥ずかしく感じる人が多いこと、費用が高額であること、現代女性は忙しく専門の検診施設に行けないこと、さらにマンモグラフィーでは痛みを伴い、放射線被ばくすること等が低受診率の理由として考えられている。

【0003】

従来の方法で乳がん陽性と判断された場合には、通常、乳房の組織の一部を採取する生検を行い、病理診断を行うが、病理組織学的所見だけでは乳がんと確定させることが困難な場合もある。

【0004】

近年、がんを早期発見するために、様々なバイオマーカーとがんとの関連性が研究されている。がん細胞は、自身の生存に有利なタンパク質やマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の分子をエクソソームに内包して分泌することにより、近傍だけでなく遠隔地にある細胞へも情報を伝達し、がん微小環境の形成や前転移ニッチェの形成などを行うことが明らかになってきた。そのため、エクソソームが内包する分子をバイオマーカーとしてがんとの関連を探る研究が行われている。

【0005】

エクソソームに内包されるｍｉＲＮＡについては、例えば、尿中エクソソームのｍｉＲＮＡの発現レベルを測定することにより前立腺がんを早期発見する方法等が報告されている（特許文献１）。また、乳がんとの関連が報告されているｍｉＲＮＡとしては、マイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１、ｍｉＲＮＡ２１ともいう）がある。乳がん患者の血液中のエクソソームにはｍｉＲ２１が少なく、血液中エクソソームのｍｉＲ２１量を測定することが乳がんの診断に有用であると報告されている（非特許文献１）。尿中のｍｉＲ２１についても乳がんとの関連性が報告されているが、ｍｉＲ２１はエクソソームに内包されたものかどうかは不明である（非特許文献２）。

【0006】

エクソソームに内包されるタンパク質については、がん細胞が分泌するエクソソーム中にマトリックスメタロプロテアーゼ等が存在することなどが明らかになっている（非特許文献３）。しかし、体液中のエクソソームに内包されるタンパク質の発現レベルを測定することにより、がんを発見する方法の開発にまでは至っていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】特表２０１８−５０４９１５号公報

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Hannafon BN, Sebastiani P, de las Morenas A, Lu J, Rosenberg CL (2011) Expression of microRNA and their gene targets are dysregulated in preinvasive breast cancer. Breast Cancer Res 13 : R24, 2011.

【非特許文献2】Erbes T, Hirschfeld M, Ruecker G, Jaeger M, Boas J, Iborra S, Mayer S, Gitsh G Stickeler E (2015): Feasibility of urinary microRNA detection in breast cancer patients and its potential as an innovative non-invasive biomarker. BMC Cancer 15:193 DOI 10.1186/s 12885-015-1190-4.

【非特許文献3】SHIMODA and KHOKH (2017): Metalloproteinases in extracellular vesicles., Molecular Cell Research, 1864, 1989-2000.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0009】

本発明者らは、収入が少ないため高額な乳がん検診を受けることができない女性や、忙しく働いているため乳がん検診を受けることができない女性に対し、低費用で気軽に受けることができる乳がん検診を提供したいと考えた。安価で簡便な乳がん検診があれば、まずその検診を受け、乳がんの疑いがあった場合にのみマンモグラフィーや超音波による検査を受ければよいので、従来よりも低費用、かつ短時間で乳がん検診をうけることができるようになる。そこで、本発明は、乳房を検査の対象とせず、簡便かつ非侵襲的に乳がんを評価する方法、および乳がん評価用の尿検査キットを提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した。その結果、以下の構成を有することにより上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、例えば以下の〔１〕〜〔１０〕に関する。
〔１〕対象の尿中エクソソームに含まれるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）を測定する工程（Ａ１）を含む、乳がん評価方法。
〔２〕前記乳がん評価は、対象における乳がん罹患の推定である、〔１〕に記載の乳がん評価方法。
〔３〕前記工程（Ａ１）は、対象の尿から調製されたエクソソーム調製物中のＭＭＰ−１を測定するものである、〔１〕または〔２〕に記載の乳がん評価方法。
〔４〕さらに、前記対象の尿中エクソソームに含まれるマイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）を測定する工程（Ｂ１）を含む、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の乳がん評価方法。
〔５〕前記ＭＭＰ−１の測定は、ウエスタンブロッティングによって行うものである、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の乳がん評価方法。
〔６〕前記ｍｉＲ２１の測定は、定量ＲＴ−ＰＣＲによって行うものである、〔４〕に記載の乳がん評価方法。
〔７〕前記工程（Ａ１）で得られたＭＭＰ−１の測定結果を、健常人の尿中エクソソームに含まれるＭＭＰ−１測定結果と比較する工程（Ａ２）を含む、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の乳がん評価方法。
〔８〕前記工程（Ｂ１）で得られたｍｉＲ２１の測定結果を、健常人の尿中エクソソームに含まれるｍｉＲ２１の測定結果と比較する工程（Ｂ２）を含む、〔４〕または〔６〕に記載の乳がん評価方法。
〔９〕対象の尿中エクソソームに含まれるマイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）を測定する工程（Ｂ１）を含む、乳がん評価方法。
〔１０〕エクソソーム調製試薬とマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）測定試薬とを含む、乳がん評価用の尿検査キット。

【発明の効果】

【0011】

本発明によれば、乳房を検査の対象とせず、簡便かつ非侵襲的に乳がんを評価する方法、および乳がん評価用の尿検査キットが得られる。
本発明の効果は以下の通りである。
１．対象の尿を検査試料とするので、対象は痛みや羞恥心を感じずに検査を受けることができる。
２．放射線被ばくや、傷跡が残る危険性がない。
３．高価で大型の検査機器を必要としない。
４．他のがんマーカーでは検出できない早期がんでも検出が可能である。
５．従来のマンモグラフィー、超音波診断、視診の前に行う、乳がん一次スクリーニングとして行うことにより、忙しい女性や、お金のない女性が乳がん検診を気軽に受けられる。
６．従来のマンモグラフィー、超音波診断、視診、生検による病理組織学的所見等と組み合わせることにより医師による乳がんの確定診断をより的確なものとするための検査データを提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】図１は、尿由来エクソソーム調製物中のエクソソームを電子顕微鏡で観察した写真である。

【図2】図２は、尿由来エクソソーム調製物中のＣＤ６３をウエスタンブロッティングにより検出した図である。

【図3】図３は、健常人と乳がん患者の尿由来エクソソーム調製物中のＭＭＰ−１およびＣＤ６３をウエスタンブロッティングにより検出した図である。

【図4】図４は、尿由来エクソソーム調製物中のＭＭＰ−１発現量（ＭＭＰ−１／ＣＤ６３）を健常人と乳がん患者とで比較した図である。

【図5】図５は、尿由来エクソソーム調製物中のｍｉＲ２１発現量（２Δ^CT）を健常人と乳がん患者とで比較した図である。

【図6】図６は、ＭＭＰ−１発現量（ＭＭＰ−１／ＣＤ６３）を用いた乳がんの検出が妥当であるかを検討したＲＯＣ曲線を示す。

【図7】図７は、ｍｉＲ２１発現量を用いた乳がんの検出が妥当であるかを検討したＲＯＣ曲線を示す。

【図8】図８は、ＭＭＰ−１発現量またはｍｉＲ２１発現量を用いた乳がん検出の感度、特異度およびＡＵＲＯＣを示す。

【図9】図９は、算出したカットオフ値を用いて健常人（図９中で「非がん」と表記）および乳がん患者（図９中で「がん」と表記）をＭＭＰ−１、ｍｉＲ２１について陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）に分類した結果を示す。

【図10】図１０は、乳がん患者７名でのＭＭＰ−１発現量の手術前後での変化を示すグラフである。

【図11】図１１は、乳がん患者７名でのｍｉＲ２１発現量の手術前後での変化を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明は、大きく分けて３つの態様がある。
第一の態様は、対象の尿から調製されたエクソソーム調製物中の、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）を測定する工程（Ａ１）を含む、乳がん評価方法である。第一の態様は、対象の尿から調製されたエクソソーム調製物中の、マイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）を測定する工程（Ｂ１）を含むことが好ましい。

【0014】

第二の態様は、対象の尿から調製されたエクソソーム調製物中の、マイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）を測定する工程（Ｂ１）を含む、乳がん評価方法である。
第三の態様は、エクソソーム調製試薬またはエクソソーム検出試薬と、マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）測定試薬とを含む、乳がん評価用の尿検査キットである。

【0015】

〈対象〉
本発明における対象は、通常ヒトである。
〈尿〉
本発明に用いる尿は、対象から採取された通常の尿であればよく、採取の時刻やタイミングは制限されない。尿道や外陰部からの細菌の混入を防ぐため、中間尿が好ましく、体動や運動の影響が除外され、濃縮尿であるため感度がよいことから、起床後最初に採取した早朝尿が特に好ましい。
採取後の尿は、すぐに工程（Ａ１）に供してもよいし、保存してから供してもよい。尿の保存は通常、−８０℃クラスの超低温層で行う。
工程（Ａ１）に供する尿の量は、ＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の測定ができれば特に制限されないが、２．０ｍＬ〜１５ｍＬが好ましい。

【0016】

〈工程（Ａ１）〉
前記工程（Ａ１）は、対象の尿中エクソソームに含まれるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）を測定する工程である。
採取後の尿は、通常、赤血球や白血球、尿酸結晶、細胞、細菌などの固形物を除くために、工程（Ａ１）を行う前に遠心分離を行う。工程（Ａ１）を行う前に、ＭＭＰ−１の測定に影響しない範囲で、フィルターろ過、濃縮、希釈等の前処理を行ってもよい。

【0017】

〈測定〉
本発明において、測定、または測定するとは、相対存在量または絶対存在量を求めることを意味する。

【0018】

〈エクソソーム〉
エクソソームは細胞から分泌される、直径が２０ｎｍ〜２００ｎｍの膜小胞である。
工程（Ａ１）は、エクソソームの存在を確認できることから、尿からエクソソームを分離、精製したエクソソーム調製物を調製し、そのエクソソーム調製物中のＭＭＰ−１を測定するのが好ましい。

【0019】

尿からエクソソーム調製物を調製する場合、その方法は、特に制限されず、例えば超遠心分離や限外ろ過、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、フィルター法、ポリマーを用いた沈殿法、抗体やレクチンを利用してビーズやカラムに吸着させる方法などが挙げられ、これらを応用した市販品としてＥｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎシリーズ、ＥｘｏＴｒａｐ^TM、ＰｕｒｅＥｘｏ^TM、ＤＩＡＧ Ｅｘｏ^TM等の市販のエクソソーム分離、精製用のスピンカラム、キット等が挙げられる。本発明においてエクソソーム調製物を調製するためには、操作が簡便で、エクソソームの純度が高いことから、ビーズ法を用いることが好ましく、特にＭｙｌｔｅｎｙｉ社製のＥｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いることが好ましい。

【0020】

エクソソームは、その形状が丸いこと、および大きさを確認することが好ましく、その手段としては例えば電子顕微鏡や動的光散乱法が挙げられる。エクソソームの大きさだけでなく形状も目視で確認できることから、電子顕微鏡が特に好ましい。

【0021】

エクソソームは、エクソソーム特異的タンパク質の存在を確認することが好ましく、その手段としては、例えばウエスタンブロッティングが挙げられる。エクソソーム特異的タンパク質としては、例えばエクソソーム表面に発現するテトラスパニンファミリー（ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８１）やエクソソーム内に存在するＨＳＰ７０やＲａｂタンパク質ファミリーが挙げられる。中でもテトラスパニンファミリーを用いることが好ましく、特にＣＤ６３が好ましい。

【0022】

〈マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）〉
本明細書においては、ＭＭＰ−１、ｍｍｐ−１とも称する。
ＭＭＰ−１は、コラゲナーゼ１とも呼ばれる、コラーゲンタイプＩ、ＩＩ、ＩＩＩを分解するプロテアーゼであり、Ｎ末から３：１の部位でコラーゲン分子を切断する。ＭＭＰ−１は、がん細胞周囲のコラーゲンを分解することにより、がん細胞が増殖したり運動したりするスペースを作るといわれており、がん浸潤における細胞外マトリックス（Ｅｘｔｒａ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）分解の中心的な役割を果たす酵素である。

【0023】

ＭＭＰ−１は、まず不活性な潜在型ＭＭＰ−１（ＰｒｏＭＭＰ−１）として発現し、ＰｒｏＭＭＰ−１のプロペプチド部分が切断されて５４ｋＤａの活性型ＭＭＰ−１となる。ＰｒｏＭＭＰ−１、活性型ＭＭＰ−１と、ＭＭＰ−１のインヒビターであるマトリックスメタロプロテアーゼ阻害因子（Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ、ＴＩＭＰｓ）が複合体を形成することにより、ＭＭＰ−１の活性は制御される。

【0024】

本発明において測定するＭＭＰ−１は活性型ＭＭＰ−１である。
本発明においてＭＭＰ−１を測定する方法は、ＭＭＰ−１タンパク質を測定できる方法であれば特に制限されず、例えば、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ等の抗ＭＭＰ−１抗体を用いる方法、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＣ／ＭＣ）、ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｔｉｎｇ（ＭＲＭ）等の質量分析を用いる方法が挙げられる。ＭＭＰ-1を測定する方法は、操作が簡便であることから、抗ＭＭＰ−１抗体を用いるウエスタンブロッティングが好ましく、抗ＭＭＰ−１ウサギポリクローナル抗体であるウサギ由来抗ＭＭＰ−１抗体（ａｂｃａｍ社製、ＮＯ.ａｂ１３４１８４）を用いたウエスタンブロッティングにより５４ｋＤａ付近に検出されるバンドの濃さから測定する方法が特に好ましい。
ＭＭＰ−１の測定値としては、ＭＭＰ−１タンパク質の発現量をＣＤ６３タンパク質の発現量で除した値（ＭＭＰ−１／ＣＤ６３）を用いることが好ましい。

【0025】

〈工程（Ｂ１）〉
前記工程（Ｂ１）は、対象の尿中エクソソームに含まれるマイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）を測定する工程である。
採取後の尿は、通常、赤血球や白血球、尿酸結晶、細胞、細菌などの固形物を除くために、工程（Ｂ１）を行う前に遠心分離を行う。工程（Ｂ１）を行う前に、ＭＭＰ−１の測定に影響しない範囲で、フィルターろ過、濃縮、希釈等の前処理を行ってもよい。
工程（Ｂ１）に用いる尿は、工程（Ａ１）に用いる尿と同一の対象から得られたものであればよく、採取の時期は制限されない。試験を簡便に行うために、工程（Ｂ１）に用いる尿は、工程（Ａ１）に用いる尿と同時に採取されたものであることが好ましい。

【0026】

工程（Ａ１）と工程（Ｂ１）を行う順序は制限されず、２つの工程を同時に行ってもよい。
ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を用いる乳がん評価の感度は９５％であったことから、工程（Ａ１）に加えて工程（Ｂ１）を行うことが好ましい。これにより、さらに高確度で乳がんを評価できる。

【0027】

ＭＭＰ−１の発現量に変化がある場合、既存の情報から肺がん、前立腺がん、肝細胞がん等の疾病も疑われるが、ＭＭＰ−１発現量に加えてｍｉＲ２１発現量を測定することにより、他の疾病よりも優先して乳がんを疑うことが可能になる。

【0028】

〈マイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）〉
マイクロＲＮＡ２１（本明細書においてはｍｉＲ２１、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲＮＡ２１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１、ＭＩＲ２１、ＭＩＲＮ２１、ｍｉｒ−２１、ｍｉｒ２１とも称する）は、ＭＩＲ２１遺伝子によってコードされているマイクロＲＮＡである。

【0029】

Ｐｒｉ−ｍｉｒ２１は核内においてＤｒｏｓｈａによって切断され、Ｐｒｅ−ｍｉｒ２１を生成する。Ｐｒｅ−ｍｉｒ２１はその後、細胞質基質においてＤｉｃｅｒによって切断され、低分子の成熟２本鎖ＲＮＡへとなるが、片方の鎖のみがプロセッシングを受けて成熟ｍｉＲ２１となり、もう片方の鎖は次第に減少していく。

【0030】

工程（Ｂ１）におけるｍｉＲ２１は、成熟ｍｉＲ２１を意味する。成熟ｍｉＲ２１としては、例えば、ヒトのｍｉＲ２１は、miRBase ID：hsa-miR-21-5p、miRBase Accession Number：MIMAT0000076、配列：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGAであるもの、miRBase ID：hsa-miR-21-3p、miRBase Accession Number：MIMAT0004494、配列：CAACACCAGUCGAUGGGCUGUであるものが挙げられ、少なくとも一つを測定すればよい。

【0031】

本発明においてｍｉＲ２１を測定する方法は、ｍｉＲ２１を測定できる方法であれば特に制限されず、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲが挙げられる。ｍｉＲ２１を測定する方法は、操作が簡便であることから、マイクロＲＮＡからｃＤＮＡを逆転写反応により合成し、そのｃＤＮＡを鋳型とする定量ＲＴ−ＰＣＲが好ましく、ｍｉＲ−２１ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いる定量ＲＴ-ＰＣＲがより好ましい。

【0032】

ｍｉＲ２１の測定値としては、定量ＲＴ-ＰＣＲにおける乳がん患者または健常人の個々のｍｉＲ２１のＣＴ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値から、健常人全員でのｍｉＲ２１のＣＴ値の平均値を差し引いて算出したΔＣＴから求めた２Δ^CTの値（２のΔＣＴ乗）を用いることが好ましい。

【0033】

〈乳がん〉
本発明における乳がんとは、乳腺組織に発生したがんである。また、早期乳がんとは、一般的には転移のない乳がんをいう。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）によるＴｕｍｏｒ−Ｌｙｍｐｈ−ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（ＴＮＭ）分類に従って行った病期分類によるステージ０またはステージＩの乳がんは、早期乳がんの中でも初期の乳がんであり、従来の乳がん検査方法での発見が難しい乳がんである。

【0034】

〈乳がん評価方法〉
本発明の乳がん評価方法は、人体等の対象から収集された試料（尿）を用いて分析を行う方法であり、対象が人体である場合であっても、人間を診断する方法（医療目的で人間の病状や健康状態等の身体状態または精神状態について判断する工程を含む方法）を含まない。本発明の乳がん評価方法は、医師が対象の乳がんについて診断を行い、適切な処置を行うための判断材料となる検査結果を提供するものである。

【0035】

すなわち、本発明の第一の態様は、対象の尿中エクソソームに含まれるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）を測定する工程（Ａ１）を含む、乳がんに関するデータを提供する、乳がんに関する検査方法でもある。

【0036】

本発明は、対象の尿中エクソソームに含まれるマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）を測定する工程（Ａ１）を含む、乳がんに罹患している可能性を示すデータを提供する、乳がんに関する検査方法であってもよい。

【0037】

本発明の第二の態様は、対象の尿中エクソソームに含まれるマイクロＲＮＡ２１（ｍｉＲ２１）を測定する工程（Ｂ１）を含む、乳がんに関するデータを提供する、乳がんに関する検査方法でもある。

【0038】

本発明における乳がん評価とは、対象における乳がん罹患の推定、または対象における乳がんに対する治療効果の推定を含む意味であり、好ましくは対象における乳がん罹患の推定を意味する。また、前記乳がん評価は、既に評価又は診断された乳がんを継続的にモニタリングする場合、及び、既に評価又は診断された乳がんを再度確認的に評価する場合も含む。

【0039】

前記乳がん評価方法は、簡便で安価に行うことができることから、マンモグラフィー、超音波検査、または専門の医師による視診もしくは触診の前段階として用いることが好ましい。前記乳がん評価方法は、前記乳がん評価方法により乳がん罹患が推定された場合に、専門の医師による視診、触診さらにはマンモグラフィー、超音波検査を推奨するために用いることがより好ましい。

【0040】

前記乳がん評価方法は、ＭＭＰ−１タンパク質の発現量をＣＤ６３タンパク質の発現量で除した値（ＭＭＰ−１／ＣＤ６３）が特定値以上であればＭＭＰ−１陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、特定値未満であればＭＭＰ−１陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）と判定し、ＭＭＰ−１陽性であれば、対象における早期乳がん罹患を推定するものであることが好ましい。

【0041】

前記ＭＭＰ−１／ＣＤ６３の特定値は、特に制限されず、乳がん患者と健常人の値を比較することにより決定することが好ましい。前記ＭＭＰ−１／ＣＤ６３の特定値は、ＲＯＣ曲線に基づいて決定すればよい。

【0042】

前記乳がん評価方法は、ｍｉＲ２１のコピー数が特定値未満をｍｉＲ２１陽性、特定値以上をｍｉＲ２１陰性と判定し、ｍｉＲ２１陽性であれば、対象における早期乳がん罹患を推定するものであることが好ましい。前記ｍｉＲ２１のコピー数としては、定量ＲＴ-ＰＣＲにおける乳がん患者または健常人の個々のｍｉＲ２１のＣＴ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値から、健常人全員でのｍｉＲ２１のＣＴ値の平均値を差し引いて算出したΔＣＴから求めた２Δ^CTの値（２のΔＣＴ乗）を用いることが好ましい。前記ｍｉＲ２１のコピー数の特定値は、特に制限されず、乳がん患者と健常人の値を比較することにより決定することが好ましい。前記２Δ^CTの特定値は、ＲＯＣ曲線に基づいて決定すればよい。

【0043】

前記乳がん評価方法は、前記ＭＭＰ−１および前記ｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性であれば、対象における乳がん罹患を推定するものであることが好ましく、前記ＭＭＰ−１および前記ｍｉＲ２１が陽性であれば、対象における乳がん罹患を強く推定するものであることが特に好ましい。

【0044】

本発明の乳がん評価方法は、転移のある乳がんでも対象における乳がん罹患を推定することができるが、遠隔転移のない早期乳がんでも、対象における乳がん罹患を推定することができる。前記乳がん評価は、腫瘍サイズがＴ１以下の早期乳がんでも、対象における乳がん罹患を推定することができる。前記乳がん評価は、リンパ節転移がない早期の乳がんでも、対象における乳がん罹患を推定することができる。すなわち、従来の方法では発見することが難しい早期乳がんでも、精度よく対象における乳がん罹患を推定できる。また、前記乳がん評価は、治療が難しいＴｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅサブタイプの乳がんでも発見できる可能性がある。

【0045】

本発明の乳がん評価方法が治療効果の推定である場合、治療とは、手術、薬物、および放射線から選ばれる少なくとも一つによる治療を含み、手術による治療が好ましい。
前記乳がん評価方法は、ＭＭＰ−１タンパク質の発現量をＣＤ６３タンパク質の発現量で除した値（ＭＭＰ−１／ＣＤ６３）が治療前に比べ、治療後に減少すれば対象における治療効果が良好であると推定するものであることが好ましい。ＭＭＰ−１／ＣＤ６３が特定値以上であればＭＭＰ−１陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、特定値未満であればＭＭＰ−１陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）と判定し、治療前にＭＭＰ−１陽性であったが、治療後にＭＭＰ−１陰性になれば、対象における治療効果が良好であると推定するものであることがさらに好ましい。

【0046】

前記乳がん評価方法は、ｍｉＲ２１のコピー数が治療前に比べ、治療後に増加すれば対象における治療効果が良好であると推定するものであることが好ましい。ｍｉＲ２１のコピー数が特定値未満をｍｉＲ２１陽性、特定値以上をｍｉＲ２１陰性と判定し、治療前にｍｉＲ２１陽性であったが、治療後にｍｉＲ２１陰性になれば、対象における治療効果が良好であると推定するものであることがさらに好ましい。 前記乳がん評価方法は、治療前に陽性であった前記ＭＭＰ−１および前記ｍｉＲ２１の少なくとも一方が陰性になれば、対象における治療効果が良好であると推定するものであることが好ましく、前記ＭＭＰ−１および前記ｍｉＲ２１が陰性になれば、対象における治療効果が良好であるとを強く推定するものであることがさらに好ましい。

【0047】

〈工程（Ａ２）〉
工程（Ａ２）は、前記工程（Ａ１）で得られたＭＭＰ−１の測定結果を、健常人の尿中エクソソームに含まれるＭＭＰ−１測定結果と比較する工程である。本発明の乳がん評価方法は、工程（Ａ２）を有することが好ましい。

【0048】

健常人の尿中エクソソームに含まれるＭＭＰ−１測定は、健常人の尿をサンプルとして前記工程（Ａ１）と同様にして行えばよい。
前記健常人とは、視診、乳房マンモグラフィー、乳房超音波の全てにおいて乳がんの疑いがない者、または乳がんと診断されていない者をいう。

【0049】

前記健常人の尿中エクソソームに含まれるＭＭＰ−１測定結果は、好ましくは複数の健常人のグループから得られた複数の測定結果から算出された値、または数値範囲であり、例えば平均値、中央値、平均値±標準偏差等が挙げられる。

【0050】

〈工程（Ｂ２）〉
工程（Ｂ２）は、前記工程（Ｂ１）で得られたｍｉＲ２１の測定結果を、健常人の尿中エクソソームに含まれる、ｍｉＲ２１の測定結果と比較する工程である。本発明の乳がん評価方法は、工程（Ｂ２）を有することが好ましい。

【0051】

健常人の尿中エクソソームに含まれるｍｉＲ２１測定は、健常人の尿をサンプルとして前記工程（Ｂ１）と同様にして行えばよい。
前記健常人とは、視診、乳房マンモグラフィー、乳房超音波の全てにおいて異常がない者をいう。

【0052】

前記健常人の尿中エクソソームに含まれるｍｉＲ２１測定結果は、一人の健常人から得られた測定結果であってもよいが、好ましくは複数の健常人のグループから得られた複数の測定結果から算出された値、または数値範囲であり、例えば平均値、中央値、平均値±標準偏差等が挙げられる。

【0053】

〈エクソソーム調製試薬またはエクソソーム検出試薬〉
前記エクソソーム調製試薬は、尿からエクソソームを分離、精製し、エクソソーム調製物を調製するための試薬であり、その調製方法は特に制限されない。例えば超遠心分離や限外ろ過、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、フィルター法、ポリマーを用いた沈殿法、抗体やレクチンを利用してビーズやカラムに吸着させる方法などが挙げられ、これらを応用した市販品としてＥｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、Ｔｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎシリーズ、ＥｘｏＴｒａｐ^TM、ＰｕｒｅＥｘｏ^TM、ＤＩＡＧ Ｅｘｏ^TM等の市販のエクソソーム分離、精製用のスピンカラム、キット等が挙げられる。

【0054】

前記エクソソーム検出試薬は、エクソソームの分離・精製をせずに尿中から直接エクソソームを検出するための試薬であり、その検出方法は特に制限されない。例えばフローサイトメトリー、マイクロアレイや表面プラズモン共鳴等によりエクソソームを含む画分を機器上で検出するために用いる、エクソソームを特異的に認識する抗体、アプタマー等が挙げられる。
前記エクソソーム調製試薬またはエクソソーム検出試薬は、本発明の効果を妨げない限り、さらに安定化剤、ｐＨ調整剤や乳化剤等の公知の任意成分を含有してもよい。

【0055】

〈ＭＭＰ−１測定試薬〉
前記マトリックスメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）測定試薬は、尿中エクソソームに含まれるＭＭＰ−１を測定するための試薬であり、その測定方法は制限されない。例えばウエスタンブロッティングやＥＬＩＳＡに用いる、ＭＭＰ−１分子を特異的に認識する抗体、アプタマー等が挙げられる。
前記ＭＭＰ−１測定試薬は、本発明の効果を妨げない限り、さらに安定化剤、ｐＨ調整剤や乳化剤等の公知の任意成分を含有してもよい。

【0056】

〈乳がん評価用の尿検査キット〉
前記乳がん評価用の尿検査キットは、前記エクソソーム調製試薬または前記エクソソーム検出試薬と、前記ＭＭＰ−１測定試薬とを含む。前記エクソソーム調製試薬または前記エクソソーム検出試薬としては、エクソソーム調製試薬を用いることが好ましい。前記キットは、エクソソーム調製試薬またはエクソソーム検出試薬と、ＭＭＰ−１測定試薬以外に、洗浄、濃縮、希釈、固定、乾燥、保存、染色、発色、観察等のためのその他の試薬を含んでもよく、必要に応じて実験器具等を含んでもよい。

【実施例】

【0057】

以下、本発明を実施例に基づいて更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。
〔実施例１〕尿中エクソソームに含まれるＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１と乳がんとの関連性
〔対象および尿サンプルの採取〕
本試験は、山王病院、北里大学メディカルセンター、および国際医療福祉大学の倫理委員会の承認を受け、被験者の書面によるインフォームドコンセントを得てから行われた。２２名の乳がん患者および２６名の健常人を被験者とした。乳がんの診断は、マンモグラフィー、超音波、ＭＲＩ、手術前の生検による病理検査、手術時に切除した組織の病理検査により行った。また、乳がん患者は、遠隔転移のある進行がんの患者を除外し、早期乳がん患者のみを被験者とした。また、全ての乳がん患者は、術前化学療法を受けておらず、尿サンプル採取後に乳がんの手術を受けた。乳がん患者のうち７例は、手術の２０〜１３６週後に再度尿サンプルを採取した。

【0058】

健常人は、自覚症状、肥満、高血圧を含む身体所見、末梢血液検査、血液生化学検査、心電図、腹部超音波、上部消化管内視鏡による所見、乳房マンモグラフィー、乳房超音波の全てにおいて異常がなく、がん、異形成、炎症性疾患、自己免疫疾患、および心臓、肝臓病、もしくは腎臓の慢性疾患のいずれの病歴もない者とした。

【0059】

被験者は、体重を測定し、アルコール摂取量(g/日)、喫煙についても事前に調査した。朝食を摂取する前に採取した早朝尿の中間尿をサンプルとした。常法に従い、尿中クレアチニンＣＲＮＮ（ｍｇ/ｄＬ）を検査した。被験者から採血し、血液中の腫瘍マーカーであるＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）とＣＡ１５−３（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ １５３）を測定した。

【0060】

〔乳がんのステージ分類〕
乳がんのステージ分類は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｉｎｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＡＪＣＣ）によるＴｕｍｏｒ−Ｌｙｍｐｈ−ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ（ＴＮＭ）分類に従って行った。
Ｔ因子は、腫瘍径、胸壁、皮膚への浸潤の有無により判定され、基準の概略は以下の通りである。
Ｔｉｓ：非浸潤がん
Ｔ１：腫瘍径２ｃｍ以下
Ｔ１ｍｉ：０．１ｃｍ以下（微浸潤がん）
Ｔ１ａ：０．１ｃｍより大きく０．５ｃｍ以下
Ｔ１ｂ：０．５ｃｍより大きく１．０ｃｍ以下
Ｔ１ｃ：１．０ｃｍより大きく２．０ｃｍ以下
Ｔ２：２．０より大きく５．０ｃｍ以下
Ｔ３：５．０ｃｍより大きい
Ｔ４：皮膚浸潤、胸壁浸潤
Ｔ４ａ：胸壁固定
Ｔ４ｂ：皮膚浸潤
Ｔ４ｃ：Ｔ４ａ、Ｔ４ｂ両者
Ｔ４ｄ：炎症性乳がん
Ｎ因子は、転移の部位（腋窩リンパ節（Ａｘ）、胸骨傍リンパ節（Ｐｓ）、鎖骨下リンパ節（Ｉｃ）、鎖骨上リンパ節（Ｓｃ））、リンパ節の可動性、転移個数により判定される。基準は以下の通りである。
Ｎ０：転移なし
Ｎ１：可動性のあるＡｘ転移
Ｎ２：固定したＡｘ転移、Ｐｓ転移
Ｎ３：ＩｃまたはＳｃ転移、Ａｘ転移＋Ｐｓ転移
病理学的分類によるｐＮ因子は、以下の基準による。
ｐＮ１：Ａｘ１〜３個、Ｐｓ微小転移
ｐＮ２：Ａｘ４〜９個、Ｐｓ転移
ｐＮ３：Ａｘ１０個以上、Ａｘ＋Ｐｓ、Ｉｃ転移、Ｓｃ転移
ステージは、Ｔ因子とＮ因子の組み合わせで０期〜ＩＩＩ期までが決定され、転移がある場合（Ｍ1）にはＩＶ期とする。
０期：非浸潤がん
Ｉ期：２ｃｍ以下、Ｎ０
ＩＩＡ期：Ｔ２Ｎ０、Ｔ１Ｎ１またはＴ０Ｎ１
ＩＩＢ期：Ｔ２Ｎ１またはＴ３Ｎ０
ＩＩＩＡ期：Ｔ３Ｎ１またはＴ０−３Ｎ２
ＩＩＩＢ期：Ｔ４Ｎ０−２
ＩＩＩＣ期：Ｎ３
ＩＶ期：Ｍ１

【0061】

〔乳がんの病理組織学的診断〕
乳がん患者から手術時に切除した組織を病理組織学的に解析した。Scirrhous,Mucinouなどの分類は、病理組織所見の診断基準に基づき定義されている。

【0062】

〔エクソソーム調製物〕
乳がん患者および健常人から採取した尿サンプルは、エクソソーム調製まで−８０℃にて保存した。尿サンプルは溶解後、２ｍＬを４℃にて３０００ｇで１５分遠心分離し、上清を０．２２μｍのナイロンフィルターでろ過した。ろ過後の上清から、Ｅｘｏｓｏｍｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ社製）を用いてエクソソーム調製物を分離、精製した。

【0063】

〔エクソソームの確認〕
得られたエクソソーム調製物は、電子顕微鏡により観察した。エクソソーム調製物はｃａｒｂｏｎ／ＦｏｒｍｖａｒでコートしたＴＥＭグリッド（応研商事株式会社製）にのせ、２％酢酸ウラニルで２分間染色した。電子顕微鏡はＨｉｔａｃｈｉ Ｈ−７６００を用いた。観察の結果、直径１００ｎｍの球形のエクソソームが存在することを確認できた。写真を図１に示す。

【0064】

また、抗ＣＤ６３抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、得られたエクソソーム調製物にエクソソーム特異的タンパク質であるＣＤ６３が存在することを確認した。ビオチン化抗ＣＤ６３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ.３５３０１７）により検出されたバンドの画像を図２に示す。

【0065】

〔ウエスタンブロッティング〕
得られたエクソソーム調製物中のＭＭＰ−１の発現は、抗ＭＭＰ−１抗体（ａｂｃａｍ社製、ＮＯ.ａｂ１３４１８４）を用いたウエスタンブロッティングにより解析した。５４ｋＤａ付近に検出されたバンドの強度をイメージアナライザー（Ｉｍａｇｅ Ｊ １．５２ａ）で定量することにより、ＭＭＰ−１を定量した。同様にビオチン化抗ＣＤ６３抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、ＮＯ.３５３０１７）を用いて、ＣＤ６３も定量した。ＭＭＰ−１の定量結果をＣＤ６３の定量結果で除して、比（ＭＭＰ−１／ＣＤ６３）を算出した。ＭＭＰ−１／ＣＤ６３を以下、ＭＭＰ−１発現量とも称する。
抗ＭＭＰ−１抗体および抗ＣＤ６３抗体により検出されたバンドの画像を図３に示す。

【0066】

〔ＲＴ-ＰＣＲ〕
得られたエクソソーム調製物からＴｏｔａｌ Ｅｘｏｓｏｍｅ ＲＮＡ＆Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡをテンプレートとして、Ｔａｑｍａｎ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、逆転写を行いｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡをテンプレートとし、ｍｉＲ２１の定量ＰＣＲはｍｉＲ−２１ Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、製造者のプロトコールに従って行った。１サンプルあたり、デュプリケートで反応を行った。定量ＰＣＲシステムはＳｔｅｐ Ｏｎｅ Ｐｌｕｓ^TM（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。

【0067】

健常人２６人のｍｉＲ２１のコピー数と、２２人の乳がん患者のｍｉＲ２１のコピー数は、相対値として算出した。ΔＣＴは、乳がん患者または健常人の個々のｍｉＲ２１のＣＴ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ）値から、健常人全員でのｍｉＲ２１のＣＴ値の平均値を差し引いて算出した。２Δ^CTの値（２のΔＣＴ乗）を以下、ｍｉＲ２１発現量とも称する。

【0068】

〔乳がんのサブタイプの決定〕
乳がんのサブタイプは、乳がん患者から手術時に切除した組織をＥｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２、Ｋｉ−６７に対する抗体を用いて免疫染色し、それぞれの分子の発現率を評価して、以下の基準により決定した。
ＬｕｍｉｎａｌＡ：ＥＲ（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）および/またはＰｇＲ（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）陽性、かつ、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ２）陰性、かつ低Ｋｉ−６７（１４％未満）
ＬｕｍｉｎａｌＢ：ＥＲおよび/またはＰｇＲ陽性、かつＨＥＲ２陰性、かつ高Ｋｉ−６７（１４％以上）。または、ＥＲおよび/またはＰｇＲ陽性、かつＨＥＲ２陽性。
Ｈｅｒ２：ＥＲ陰性、かつＰｇＲ陰性、かつＨＥＲ２陽性。
Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅ：ＥＲ陰性、かつＰｇＲ陰性、かつ、ＨＥＲ２陰性。
詳細は以下の文献に記載の通りである。
Ｇｌｕｃｋ Ｓ， ｄｅ Ｓｎｏｏ Ｆ， Ｐｅｅｔｅｒｓ Ｓ， Ｓｔｏｒｋ−Ｓｌｏｏｔｓ Ｌ， Ｓｏｍｉｏ Ｇ （２０１３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｕｂｔｙｐｉｎｇ ｏｆ ｅａｒｌｙ−ｓｔａｇｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｈｏ ｄｏ ｎｏｔ ｂｅｎｅｆｉｔ ｆｒｏｍ ｎｏｎ−ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ Ｔｒｅａｔ １３９： ７５９−７６７．

【0069】

〔統計解析〕
統計解析は、ＰＲＩＳＭ ７ ｆｏｒ Ｍａｃ ＯＳ Ｘ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ｉｎｃ社製）を用いて行った。データは、パラメトリック検定の妥当性を確認するために正規性と等分散性を試験した。正規分布に従うデータは、Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定を行った。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔは、集団間の違いを評価するために用いた。ｐ値０．０５未満を統計学的に有意とした。

【0070】

〔結果〕
〔被験者のプロファイルとＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の発現量〕
乳がん患者のプロファイルとＴＮＭ分類、ステージ、病理組織学的診断、ｍｉＲ２１発現量、ＭＭＰ−１発現量を表１に示す。

【0071】

【表1】

乳がん患者のサブタイプ、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、ＣＲＮＮ、飲酒、喫煙習慣について表２に示す。

【0072】

【表2】

健常人のプロファイルを表３に示す。

【0073】

【表3】

健常人の年齢グループ別のｍｉＲ２１発現量とＭＭＰ−１発現量を表４に示す。

【0074】

【表4】

【0075】

〔乳がん患者と健常人のＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量の違い〕
表４より、健常人のＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を年齢グループ間で比較したところ、６０−７９歳のグループの中央値は３０−３９歳グループに比べて１．８４倍高い傾向にあったが、統計上の有意差はなく、全ての年齢グループ間に統計上の有意な差はなかった。

【0076】

ＭＭＰ−１発現量（ＭＭＰ−１／ＣＤ６３）を、乳がん患者（ＢＣ ｐａｔｉｅｎｔ）と健常人（Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）とで比較した結果を図４に示す。乳がん患者のＭＭＰ−１発現量は健常人に比べて有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。乳がん患者のＭＭＰ−１発現量の中央値は１．７４であり、健常人は０．５４であった（表１、４）。

【0077】

ｍｉＲ２１発現量（２Δ^CT）を、乳がん患者（ＢＣ ｐａｔｉｅｎｔ）と健常人（Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌ）とで比較した結果を図５に示す。乳がん患者のｍｉＲ２１発現量は健常人に比べて有意に低かった（ｐ＝０．００１６）。乳がん患者のｍｉＲ２１発現量の中央値は０．２６であり、健常人は１．００であった（表１、４）。

【0078】

〔ＭＭＰ−１発現量、およびｍｉＲ２１発現量を用いた乳がん検出の妥当性〕
ＭＭＰ−１発現量、およびｍｉＲ２１発現量を用いた乳がんの検出の妥当性をＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｏｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｃｕｒｖｅ、受信者動作特性曲線)を用いて検討した。ＭＭＰ−１発現量のＲＯＣ曲線を図６、ｍｉＲ２１発現量のＲＯＣ曲線を図７に示す。最適カットオフ値は、ＭＭＰ−１発現量については０．９１６、ｍｉＲ２１発現量については０．４１３であった。そこで、ＭＭＰ−１発現量（ＭＭＰ−１／ＣＤ６３）が０．９１６以上をＭＭＰ−１陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、０．９１６未満をＭＭＰ−１陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）と判定した。また、ｍｉＲ２１発現量（２Δ^CT）が０．４１３未満をｍｉＲ２１陽性、０．４１３以上をｍｉＲ２１陰性と判定した。

【0079】

このときの感度、特異度およびＡＵＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ Ｃｕｒｖｅ）［図８では、ＡＵＲＯＣ（Ａｒｅａ Ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ＲＯＣ Ｃｕｒｖｅ）と記す。］を図８に示す。ＭＭＰ−１発現量を用いた判定の感度は０．７８３、特異度は０．８４０、ｍｉＲ２１発現量を用いた判定の感度は０．７０８、特異度は０．７９２と非常に高いものであった。

【0080】

〔ＭＭＰ−１発現量、およびｍｉＲ２１発現量による陽性陰性判定と乳がんの相関〕
このカットオフ値を用いて健常人および乳がん患者をＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１について陽性、陰性に分類した結果を図９に示す。

【0081】

乳がん患者２２例の内、ＭＭＰ−１陽性が１８例、ＭＭＰ−１陰性が４例であり、乳がん罹患の有無とＭＭＰ−１の陽性陰性判定との間には強い相関があることがわかる。このことから、ＭＭＰ−１を測定することにより、乳がんを検出し、対象における乳がん罹患を推定できることがわかった。

【0082】

また、乳がん患者２２例の内、ｍｉＲ２１陽性は１７例、陰性は５例であり、乳がん罹患の有無とｍｉＲ２１の陽性陰性判定との間には強い相関があることがわかる。このことから、ｍｉＲ２１を測定することにより乳がんを検出し、対象における乳がん罹患を推定できることがわかった。

【0083】

ＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性と判定されたのは乳がん患者２２例中２１例であった。このことから、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を用いる判定の感度は９５％であり、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を測定することにより、より高確度で乳がんを検出し、乳がん罹患を推定できることがわかる。

【0084】

〔ＭＭＰ−１発現量、およびｍｉＲ２１発現量による陽性陰性判定と乳がんのＴＮＭ分類、ステージ、病理組織学的所見との相関〕
乳がん患者におけるＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量による陽性陰性判定と、乳がんのＴＮＭ分類、ステージ、病理組織学的所見との相関を表５に示す。

【0085】

【表5】

【0086】

表５中、ｐは陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）、ｎは陰性（ｎｅｇａｔｉｖｅ）の略である。
腫瘍サイズとの相関を見ると、Ｔｉｓ〜Ｔ３までの全ての腫瘍サイズにおいて、大半の乳がん患者はＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性と判定されている。従って、全ての腫瘍サイズにおいてＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を測定することにより乳がん罹患を推定できることがわかる。Ｔｉｓの２例、Ｔ１の９例については、１１例全てにおいて、ＭＭＰ−１陰性のものはなく、ＭＭＰ−１陽性と判定された。従って、特に腫瘍サイズがＴ１以下の乳がんがＭＭＰ-1と強く相関しており、ＭＭＰ−１発現量を測定することが、Ｔ１以下のサイズの乳がん罹患を推定するのに好適であることがわかった。

【0087】

リンパ節転移との相関を見ると、Ｎ０〜Ｎ３までの全てにおいて、大半の乳がん患者はＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性と判定されている。従って、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を測定することにより、リンパ節転移がない早期の乳がんであっても乳がん罹患を推定できることがわかる。また、Ｎ３の症例において、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量の少なくとも一方が陽性と判断された確率は１００％である。従って、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を測定することにより、Ｎ３の乳がん罹患をより高確度で推定できることがわかった。

【0088】

ステージとの相関を見ると、ステージ０〜ＩＩＩまでの全てのステージにおいて、大半の乳がん患者はＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性と判定されている。従って、全てのステージにおいて、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を測定することにより乳がん罹患を推定できることがわかる。乳がんの早期段階であるステージ０、Ｉにおいても、ＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性と判定された確率はそれぞれ１００％、９３％であった。従って、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を測定することにより、ステージ０、Ｉの乳がん罹患をより高確度で推定できることがわかった。

【0089】

病理組織学的所見との相関を見ると、全ての所見において、大半の乳がん患者はＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性と判定されている。従って、いずれかの病理組織学的所見がある場合においても、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を測定することにより乳がん罹患を推定できることがわかる。

【0090】

〔ＭＭＰ−１発現量、およびｍｉＲ２１発現量による陽性陰性判定と乳がんサブタイプとの相関〕
乳がん患者におけるＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量による陽性陰性判定と、乳がんサブタイプとの相関を表６に示す。

【0091】

【表6】

【0092】

全てのサブタイプにおいて、大半の乳がん患者はＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性と判定されており、全てのサブタイプにおいて、ＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量を測定することにより乳がん罹患を推定できることがわかる。また、Ｌｕｍｉｎａｌ Ｂ、Ｈｅｒ２、Ｔｒｉｐｌｅ Ｎｅｇａｔｉｖｅの場合には、全ての症例においてＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方が陽性となった。

【0093】

〔各測定値の相関関係〕
乳がん患者２２例におけるＭＭＰ−１発現量とｍｉＲ２１発現量には逆相関関係があった（ｒ＝−０．６２、ｐ＝０．００２）。ＭＭＰ−１発現量またはｍｉＲ２１発現量と、年齢、体重、クレアチニン、ＣＥＡ、ＣＡ１５−３、Ｋｉ−６７、アルコール摂取量、喫煙との相関を分析した。その結果、ｍｉＲ２１発現量と、体重（ｒ＝−０．４９、ｐ＝０．０２）、Ｋｉ−６７（ｒ＝−０．４５、ｐ＝０．０２）、
クレアチニン（ｒ＝−０．５３、ｐ＝０．０１）との間には相関関係があった。一方、ＭＭＰ−１発現量はどの測定値とも相関関係はなかった。

【0094】

なお、乳がんのマーカーとして汎用されるＣＡ１５−３は、転移のある乳がん、進行乳がん、また再発した乳がんとの関連が強いことが報告されている。転移のない早期がん患者を被験者とした本実施例において、ＣＡ１５−３値が高い被験者はいなかったので、ＣＡ１５−３値がＭＭＰ−１発現量、ｍｉＲ２１発現量のどちらとも相関がなかったことは、ＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方を測定することにより早期乳がん罹患を推定することが可能であることと矛盾しない。ＣＥＡは乳がん特異的ではないので、ＣＥＡ値がＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量のどちらとも相関がなかったことは、ＭＭＰ−１およびｍｉＲ２１の少なくとも一方を測定することにより早期乳がん罹患を推定することが可能であることと矛盾しない。本発明の乳がん評価方法は、既存のがんマーカーであるＣＥＡやＣＡ１５−３では検出できなかった早期の乳がんでも検出することができる有用なものである。

【0095】

〔乳がん患者のＭＭＰ−１発現量、およびｍｉＲ２１発現量の術前術後での変化〕
乳がん患者７名におけるＭＭＰ−１発現量およびｍｉＲ２１発現量の手術前と手術後２０〜１３６週の変化を表７に示す。

【0096】

【表7】

【0097】

また、表７のＭＭＰ−１発現量の手術前後での変化をグラフ化したものが図１０、ｍｉＲ２１発現量の変化をグラフ化したものが図１１である。
手術後（Ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）のＭＭＰ−１発現量は、手術前（Ｐｒｅ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）に比べ、低下する傾向にあった。７例中５例では手術前ＭＭＰ−１陽性であったが、その内３例は手術後にはＭＭＰ−１陰性になった。特にＮＯ．１、１３、１４、１６の患者では、ＭＭＰ−１発現量は手術前に比べて顕著に低下した。

【0098】

手術後（Ｐｏｓｔ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）のｍｉＲ２１発現量は、手術前（Ｐｒｅ−ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）に比べて顕著に増加する傾向にあった。７例中６例では手術前にはｍｉＲ２１陽性であったが、その内３例が手術後にはｍｉＲ２１陰性になった。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】