特許 6867440 三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体系およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6867440

(24)【登録日】2021年4月12日

(45)【発行日】2021年4月28日

(54)【発明の名称】三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体系およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20210419BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210419BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210419BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210419BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210419BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210419BHJP

   C12N 9/16 20060101ALN20210419BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 110

   C12N1/15ZNA

   C12N1/19

   C12N1/21

   C12N5/10

   C12N15/63 Z

   !C12N9/16 Z

【請求項の数】35

【外国語出願】

【全頁数】104

(21)【出願番号】特願2019-118495(P2019-118495)

(22)【出願日】2019年6月26日

(62)【分割の表示】特願2017-566611(P2017-566611)の分割

【原出願日】2016年3月9日

(65)【公開番号】特開2019-176877(P2019-176877A)

(43)【公開日】2019年10月17日

【審査請求日】2019年6月26日

(31)【優先権主張番号】62/132,644

(32)【優先日】2015年3月13日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/221,249

(32)【優先日】2015年9月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】398066918

【氏名又は名称】ザ ジャクソン ラボラトリー

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＪＡＣＫＳＯＮ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】ワン ハオイ

(72)【発明者】

【氏名】アルバート チェン

(72)【発明者】

【氏名】ナサニエル ジレット

【審査官】 松原 寛子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１１／１６００５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／０６８６２７（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 ZALATAN J. G. et al.，Cell，２０１５年 １月，Vol. 160，pp. 339-350

【文献】 MALI P. et al.，Nature Biotechnology，２０１３年，Vol. 31, No. 9，pp. 833-838

【文献】 CHENG A. W. et al.，Cell Research，２０１３年，Vol. 23，pp. 1163-1171

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ １／１５

Ｃ１２Ｎ １／１９

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ１２Ｎ １５／１１

Ｃ１２Ｎ １５／６３

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

三構成要素複合体であって、
（ａ）（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列、および、（ｉｉｉ）ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含む、ポリヌクレオチドと；
（ｂ）該Ｃａｓ９結合配列に結合するＣａｓ９タンパク質と；
（ｃ）該ＰＢＳに結合するＰＵＦドメインと
を含み、該Ｃａｓ９タンパク質または該ＰＵＦドメインが、以下：
メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性
からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合される、
三構成要素複合体。

【請求項2】

細胞中の前記三構成要素複合体が、前記ターゲットＤＮＡを修飾する、または、ターゲットＤＮＡ会合ポリペプチドを修飾する、請求項１に記載の三構成要素複合体。

【請求項3】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質、および、Ｃａｓ９ニッカーゼからなる群より選択される、請求項１または２に記載の三構成要素複合体。

【請求項4】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質である、請求項３に記載の三構成要素複合体。

【請求項5】

前記ｄＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して点突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含む、請求項４に記載の三構成要素複合体。

【請求項6】

前記ポリヌクレオチドが、２またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の三構成要素複合体。

【請求項7】

前記ポリヌクレオチドが、５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項６に記載の三構成要素複合体。

【請求項8】

前記ポリヌクレオチドが、１０またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項７に記載の三構成要素複合体。

【請求項9】

前記ポリヌクレオチドが、２５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項８に記載の三構成要素複合体。

【請求項10】

前記ＰＢＳが、５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’または５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の三構成要素複合体。

【請求項11】

請求項１〜１０のいずれか一項に記載の三構成要素複合体を含む、細胞。

【請求項12】

キットであって、
（ａ）（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列、および、（ｉｉｉ）ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含む、ポリヌクレオチドと；
（ｂ）該Ｃａｓ９結合配列に結合するＣａｓ９タンパク質、または、該Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｃ）該ＰＢＳに結合するＰＵＦドメイン、または、該ＰＵＦドメインをコードするポリヌクレオチドと
を含み、該Ｃａｓ９タンパク質または該ＰＵＦドメインが、以下：
メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性
からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合される、
キット。

【請求項13】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質、および、Ｃａｓ９ニッカーゼからなる群より選択される、請求項１２に記載のキット。

【請求項14】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質である、請求項１３に記載のキット。

【請求項15】

前記ｄＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して点突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含む、請求項１４に記載のキット。

【請求項16】

前記ポリヌクレオチドが、２またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のキット。

【請求項17】

前記ポリヌクレオチドが、５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１６に記載のキット。

【請求項18】

前記ポリヌクレオチドが、１０またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１７に記載のキット。

【請求項19】

前記ポリヌクレオチドが、２５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項１８に記載のキット。

【請求項20】

前記ＰＢＳが、５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’または５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を含む、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載のキット。

【請求項21】

細胞において、ターゲットＤＮＡを修飾する、または、ターゲットＤＮＡ会合ポリペプチドを修飾するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法であって、該方法は、該細胞内に、
（ａ）（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列、および、（ｉｉｉ）ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含む、ポリヌクレオチドと；
（ｂ）該Ｃａｓ９結合配列に結合するＣａｓ９タンパク質、または、該Ｃａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドと；
（ｃ）該ＰＢＳに結合するＰＵＦドメイン、または、該ＰＵＦドメインをコードするポリヌクレオチドと
を導入する工程を含み、該Ｃａｓ９タンパク質または該ＰＵＦドメインが、以下：
メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性
からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合され、そして、（ａ）のポリヌクレオチド、（ｂ）のＣａｓ９タンパク質、および、（ｃ）のＰＵＦドメインが組み立てられて、該細胞内の該ターゲットＤＮＡまたは該ターゲットＤＮＡ会合ポリペプチドを修飾する三構成要素複合体を形成する、方法。

【請求項22】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質、および、Ｃａｓ９ニッカーゼからなる群より選択される、請求項２１に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項23】

前記Ｃａｓ９タンパク質が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質である、請求項２２に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項24】

前記ｄＣａｓ９タンパク質が、野生型Ｃａｓ９タンパク質に対して点突然変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含む、請求項２３に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項25】

前記ポリヌクレオチドが、２またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項26】

前記ポリヌクレオチドが、５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項２５に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項27】

前記ポリヌクレオチドが、１０またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項２６に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項28】

前記ポリヌクレオチドが、２５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項２７に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項29】

前記ＰＢＳが、５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’または５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏの方法。

【請求項30】

ゲノム編集をするための組成物であって、該組成物は、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合されたＰＵＦドメインを含む、融合タンパク質を含み、
該組成物は、以下：
（ａ）（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列、および、（ｉｉｉ）ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含む、ポリヌクレオチド；ならびに、
（ｂ）該Ｃａｓ９結合配列に結合するＣａｓ９タンパク質
と組み合わせて使用されることを特徴とする、組成物。

【請求項31】

ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）を含むガイドＲＮＡを含むゲノム編集をするための組成物であって、
ここで、該ガイドＲＮＡはさらに、（ｉ）ターゲットＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡターゲティング配列、および、（ｉｉ）Ｃａｓ９結合配列を含み、
該組成物は、以下：
（ａ）該Ｃａｓ９結合配列に結合するＣａｓ９タンパク質；および、
（ｂ）該ＰＢＳに結合するＰＵＦドメイン
と組み合わせて使用されることを特徴とし、
ここで、該Ｃａｓ９タンパク質または該ＰＵＦドメインが、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、および、脱ミリストイル化活性からなる群より選択される酵素活性を示す異種ポリペプチドに融合される、
組成物。

【請求項32】

２またはそれより多い、５またはそれより多い、１０またはそれより多い、あるいは、２５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

５またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項３２に記載の組成物。

【請求項34】

１０またはそれより多いコピーの前記ＰＵＦドメイン結合配列を含む、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

前記ＰＢＳが、５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’または５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を含む、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願に対する言及
本発明は、２０１５年３月１３日出願の米国仮出願第６２／１３２，６４４号および２０１５年９月２１日出願の第６２／２２１，２４９号に優先権を請求する国際特許出願であり、前記両出願の全体が本明細書に援用される。

【背景技術】

【0002】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系において、Ｃａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）は、十分な二構成要素ＤＮＡエンドヌクレアーゼを構成し、その特異性は、ｓｇＲＮＡ上のターゲットマッチ配列によって提供される一方、エンドヌクレアーゼ活性はＣａｓ９タンパク質上にある。

【0003】

ヌクレアーゼドメイン上に突然変異を有するヌクレアーゼ欠損またはヌクレアーゼ不全Ｃａｓ９タンパク質（例えばｄＣａｓ９）は、ｓｇＲＮＡと複合体化した際、ＤＮＡ結合活性を保持する。ｄＣａｓ９タンパク質は、エフェクタードメインまたはタンパク質タグを、ｓｇＲＮＡがマッチする部位へのタンパク質融合によって束縛し、そして局在化させることも可能であり、したがって、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合酵素を構成する。ｄＣａｓ９は、転写活性化ドメイン（例えばＶＰ６４）またはリプレッサードメイン（例えばＫＲＡＢ）に融合し、そしてｓｇＲＮＡによってガイドされて、ターゲット遺伝子を、それぞれ、活性化するかまたは抑制することも可能である。ｄＣａｓ９はまた、蛍光タンパク質に融合し、そして染色体領域の生存細胞蛍光標識を達成することも可能である。しかし、こうした系においては、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９対形成が排他的であるため、１つのＣａｓ９−エフェクター融合体しか可能でない。また、何らかの生物学的閾値またはシグナル検出閾値を達成するために、タンパク質タグまたはエフェクター融合の多数のコピーが必要である場合には、ｄＣａｓ９タンパク質との直接融合によるエフェクターまたはタンパク質タグの重合は、こうした融合体をコードする巨大ＤＮＡの送達が困難であること、またはタンパク質サイズのために、こうした巨大タンパク質を翻訳し、そして核に転位置することが困難であることなどの制約によって、技術的に限定される。

【発明の概要】

【0004】

本明細書に記載する発明は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、対象のポリヌクレオチドとしての修飾ｓｇＲＮＡ（例えば「ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ」）、およびエフェクタードメインまたはタンパク質タグを含むＰＵＦドメイン（単数または複数）の１またはそれより多い融合タンパク質（「ＰＵＦドメイン融合体（単数または複数）」）を含む、三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を提供することによって、エフェクターまたはタンパク質タグの多重化および重合を可能にする。ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳは、ｓｇＲＮＡステムループの下流またはターゲットマッチ領域の上流に、小分子ＰＵＦ（例えば８量体）認識配列の多数コピーを挿入することによって、得られうる。各ＰＵＦドメイン−エフェクター融合体のＰＵＦドメインは、対象のポリヌクレオチド上の８量体認識配列を認識するようにプログラム可能であり、したがってＰＵＦドメインに融合した１またはそれより多いエフェクタードメインを、ターゲットマッチｓｇＲＮＡによって認識されるターゲットＤＮＡの特定の領域に運ぶことも可能である。

【0005】

本発明の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、異なる三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を同時に細胞または動物に送達可能であり、そして各々が定義したターゲット部位で直交性に（すなわち他の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系およびそのターゲット部位に干渉せず）作動可能であるため、多重性に関して好適である。ＰＵＦドメインは、任意の８量体ＲＮＡ認識配列を認識するよう容易にプログラム可能であるため、ＲＮＡ認識配列がわずか８量体である場合、この系は、多重化能を４^８（６５５３６）の理論的最大値まで（そしてＲＮＡ認識配列がより長ければ、潜在的にさらに多く）拡大可能である。

【0006】

本発明の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系はまた、重合能に関しても好適である：直鎖８量体配列は単純であるため、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合活性を妨害することなく、大規模な重合が可能である。こうした特徴は、ＰＵＦ融合体の多数の分子が修飾ｓｇＲＮＡ上で組み立てられることを可能にし、したがってエフェクターまたはタンパク質タグの局所濃縮を可能にする。こうした特徴は、蛍光画像化または転写制御などの適用に特に有益であり、この場合、近接相乗作用によって、最大の有効な制御またはシグナル対ノイズ比を可能にする。

【0007】

本発明のさらなる利点は、化学量論的複合体形成に関する。異なる８量体配列を、ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ構築物上に順序だって挿入して、定義した化学量論およびｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ上のＰＵＦ融合体の順序での複合体形成を可能にする。

【0008】

したがって、本発明の１つの側面は：（１）ターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列；（２）Ｃａｓ９結合配列；および（３）１またはそれより多いコピーのＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）、ここで前記の１またはそれより多いコピーのＰＢＳは同じまたは異なるＰＵＦドメインに結合する、を含むポリヌクレオチドであって；Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）が、Ｃａｓ９結合配列に結合することによって、ポリヌクレオチドと複合体を形成可能である、前記ポリヌクレオチドを提供する。

【0009】

本明細書において、「Ｃａｓ９タンパク質」には、野生型Ｃａｓ９タンパク質、エンドヌクレアーゼ活性の２つの触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）の１つが欠損しているかまたは活性を欠くＣａｓ９ニッカーゼ、およびエンドヌクレアーゼ活性の両方の触媒部位が欠損しているかまたは活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質が含まれる。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９である。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ活性を欠くか、ヌクレアーゼ不全である。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質はニッカーゼである（例えばニッカーゼは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９のＤ１０Ａに対応する位で突然変異を有するＣａｓ９ニッカーゼであってもよく；またはニッカーゼは、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９のＨ８４０Ａに対応する位で突然変異を有するＣａｓ９ニッカーゼであってもよい）。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質はｄＣａｓ９である（例えば化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａに対応する位で突然変異を有するｄＣａｓ９）。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質は野生型Ｃａｓ９ではない。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質はニッカーゼではない。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質はｄＣａｓ９ではない。

【0010】

特定の態様において、「修飾Ｃａｓ９タンパク質」は、野生型Ｃａｓ９タンパク質でないＣａｓ９、例えばｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを指す。
特定の態様において、ｄＣａｓ９タンパク質は、ヌクレアーゼ不全であるが、ポリヌクレオチドと複合体化した際のＤＮＡ結合能を保持する。

【0011】

特定の態様において、ＤＮＡターゲティング配列は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）がポリヌクレオチドと複合体化した際、ターゲットポリヌクレオチド配列と塩基対形成する。

【0012】

特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、転写制御要素を含むかまたは該要素に隣接している。例えば、転写制御要素は：コアプロモーター、近位プロモーター要素、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、および遺伝子座調節領域の１またはそれより多くを含んでもよい。

【0013】

特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、テロメア配列、セントロメア、または反復ゲノム配列を含むか、または該配列に隣接している。
特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、ゲノムマーカー配列（または関心対象のゲノム遺伝子座）を含むかまたは該配列に隣接している。

【0014】

特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、５’−ＣＣＮ−３’、式中、Ｎは任意のＤＮＡヌクレオチドである、であってもよい相補鎖のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列のすぐ３’である。

【0015】

特定の態様において、ＤＮＡターゲティング配列は、約１２〜２２ヌクレオチド（ｎｔｓ）、約１４〜２０ｎｔｓ、約１６〜２０ｎｔｓ、約１８〜２０ｎｔｓ、あるいは約１２、１４、１６、１８または２０ｎｔｓに渡って、ターゲットポリヌクレオチド配列に相補的である（好ましくは、相補領域は、好ましくはＤＮＡ結合配列の３’端に、１２〜２２ｎｔｓの連続ストレッチを含む）。例えば、ＤＮＡ結合配列は、ターゲットポリヌクレオチド配列に、５０、６０、７０、８０、９０、または９５〜１００％相補的である。

【0016】

特定の態様において、ＤＮＡ結合配列は、５’端ヌクレオチドＧを有する。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡターゲティング配列をＣａｓ９結合配列に連結するリンカー配列をさらに含む。

【0017】

特定の態様において、Ｃａｓ９結合配列はヘアピン構造を形成する。
特定の態様において、Ｃａｓ９結合配列は約３７〜４７ｎｔ、または約４２ｎｔである。

【0018】

特定の態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼタンパク質は、野生型Ｃａｓ９の一方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）の点突然変異のため、エンドヌクレアーゼ活性を欠く。点突然変異はＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａであってもよい。

【0019】

特定の態様において、ｄＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９の両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）の点突然変異のため、エンドヌクレアーゼ活性を欠く。点突然変異はＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａであってもよい。

【0020】

特定の態様において、１またはそれより多いコピーのＰＢＳは各々、約８ヌクレオチドを有する。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、または５０コピー、あるいは１〜５０、２〜４５、３〜４０、５〜３５、５〜１０、１０〜２０コピーの同一のまたは異なるＰＢＳを含む。

【0021】

特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ＰＵＦドメインＰＵＦ（３−２）が結合可能である配列５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’のＰＢＳを含む。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ＰＵＦドメインＰＵＦ（６−２／７−２）が結合可能である配列５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’のＰＢＳを含む。

【0022】

本発明の別の側面は、対象のポリヌクレオチドのいずれか１つをコードするベクターを提供する。
特定の態様において、ポリヌクレオチドの転写は、恒常的プロモーター、または誘導性プロモーターの制御下にある。

【0023】

特定の態様において、ベクターは、哺乳動物（ヒト；非ヒト霊長類；非ヒト哺乳動物；齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット；家畜哺乳動物、例えばブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ウシ；あるいはペット哺乳動物、例えばネコまたはイヌ）；鳥類、魚類、昆虫、虫（worm）、酵母、または細菌由来の細胞において活性である。

【0024】

関連する側面において、本発明は、ベクターのうちの２つが、それぞれのＤＮＡターゲティング配列にコードされるポリヌクレオチド、Ｃａｓ９結合配列、および／またはＰＢＳのコピー数、同一性、または相対的順序において異なる、複数の任意の１つの対象のベクターを提供する。

【0025】

本発明の別の側面は、任意の１つの対象のポリヌクレオチド、およびＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）を含む、複合体を提供する。

【0026】

特定の態様において、複合体は、前記の１またはそれより多いＰＢＳに結合する、１またはそれより多いＰＵＦドメインをさらに含む。
特定の態様において、前記のＰＵＦドメインの各々は、エフェクタードメインに融合している。

【0027】

特定の態様において、エフェクタードメインは、独立に、転写リプレッサー、転写アクチベーター、蛍光タンパク質、酵素、またはクロマチンリモデリングタンパク質（ＨＤＡＣ／ＨＡＴ）である。

【0028】

特定の態様において、少なくとも２つのＰＵＦドメインは、異なるエフェクタードメインに融合している。
特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、ＰＵＦドメイン、および／またはエフェクタードメインは、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。

【0029】

特定の態様において、複合体は、ＤＮＡターゲティング配列を通じて、ターゲットポリヌクレオチド配列に結合している。
本発明の別の側面は、任意の１つの対象のベクター、または複数の対象のベクターを含む、宿主細胞を提供する。

【0030】

特定の態様において、宿主細胞は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする第二のベクターをさらに含む。
特定の態様において、第二のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合しているエフェクタードメインをさらにコードする。

【0031】

特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）の発現は、恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある。

【0032】

特定の態様において、宿主細胞は、各々、エフェクタードメインに融合している、前記の１またはそれより多いＰＵＦドメインをコードする第三のベクターをさらに含む。
特定の態様において、１またはそれより多いＰＵＦドメインの発現は、独立に、恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある。

【0033】

特定の態様において、エフェクタードメインは、転写リプレッサー、転写アクチベーター、蛍光タンパク質、酵素、またはクロマチンリモデリングタンパク質（ＨＤＡＣ／ＨＡＴ）である。

【0034】

特定の態様において、第二のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）またはエフェクタードメインに融合した核局在化シグナルをさらにコードし、そして／または第三のベクターは、ＰＵＦドメインまたはエフェクタードメインに融合した核局在化シグナルをさらにコードする。

【0035】

特定の態様において、第二のベクターがベクターと同じであり、そして／または第三のベクターがベクターまたは第二のベクターと同じである。
特定の態様において、宿主細胞は生存動物中にある。

【0036】

特定の態様において、宿主細胞は培養細胞である。
本発明の別の側面は、ターゲットポリヌクレオチド配列で、本発明の複合体を組み立てる方法であって、ターゲットポリヌクレオチド配列に：（１）対象のポリヌクレオチドのいずれか１つ、または対象のベクターのいずれか１つ、または対象の複数のベクター；（２）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、または対象の第二のベクターのいずれか１つ；および（３）各々がエフェクタードメインに融合している１またはそれより多いＰＵＦドメイン、または対象の第三のベクターのいずれか１つを接触させるかまたはこれらをその近傍に運ぶ工程を含む、前記方法を提供する。

【0037】

特定の態様において、複合体は、細胞内部で組み立てられ、ターゲットポリヌクレオチド配列は細胞のゲノムＤＮＡの一部であり、そして対象のベクター、対象の第二のベクター、ならびに対象の第三のベクターが細胞内に導入される。

【0038】

特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、ヘテロクロマチンが豊富なゲノム遺伝子座にあるかまたはその近傍にあり、そしてエフェクタードメインは検出可能マーカー（例えば蛍光タンパク質）である。。

【0039】

特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、ターゲット遺伝子の転写制御要素にあるかまたはその近傍にあり、そしてエフェクタードメインは転写調節因子（例えばアクチベーター、サプレッサー）である。

【0040】

特定の態様において、ターゲット遺伝子の転写は、細胞運命決定、細胞分化、代謝流動、あるいは生物学的または生化学的に決定可能な転帰に影響を及ぼす。
本発明の別の側面は、細胞において、複数のターゲット遺伝子の転写を調節する方法であって：細胞内に、複数の対象のベクター、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）のコード配列、および１またはそれより多いＰＵＦドメインのコード配列を導入する工程を含み、ここで前記ターゲット遺伝子の各々は、（１）前記の複数のベクターの１つにコードされるポリヌクレオチド、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、およびＰＵＦドメインの三分子複合体の、ターゲットポリヌクレオチド配列での組み立て；および（２）ターゲットポリヌクレオチド配列を含むターゲット遺伝子の転写調節を可能にする、ターゲットポリヌクレオチド配列を含む、前記方法を提供する。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質はｄＣａｓ９タンパク質である。

【0041】

特定の態様において、少なくとも１つのターゲット遺伝子の転写が増進され／刺激される一方、少なくとも１つの別のターゲット遺伝子が阻害される。
関連する側面において、本発明は、細胞において、複数のターゲット遺伝子でのエピジェネティック調節の方法（例えば転写活性に直接関連しないクロマチンのエピジェネティック状態の調節）であって：細胞内に、複数の対象のベクター、野生型Ｃａｓ９タンパク質またはＣａｓ９ニッカーゼのコード配列、および１またはそれより多いＰＵＦドメイン融合体のコード配列を導入する工程を含み、ここでターゲット遺伝子の各々は、（１）複数のベクターの１つにコードされるポリヌクレオチド、野生型／ニッカーゼＣａｓ９タンパク質、およびＰＵＦドメイン融合体の三分子複合体の、ターゲットポリヌクレオチド配列での組み立て；および（２）ターゲットポリヌクレオチド配列を含むターゲット遺伝子のエピジェネティック調節を可能にする、ターゲットポリヌクレオチド配列を含む、前記方法を提供する。該方法は、例えば、同じ時点で、エピジェネティック状態を変化させ（例えばクロマチンを開放し）、閉鎖クロマチン部位へのＣａｓ９結合のアクセス／安定性を獲得する（例えばこれらの部位での切断およびゲノム編集を増加させるため）ために有用でありうる。

【0042】

本発明の別の側面は：（１）対象のポリヌクレオチド、または対象のベクター；（２）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする対象の第二のベクター；および（３）各々、エフェクタードメインに融合している、１またはそれより多いＰＵＦドメインをコードする対象の第三のベクターを含む、キットを提供する。

【0043】

特定の態様において、キットは、前記ベクターの細胞内への導入を促進する、形質転換、トランスフェクション、または感染試薬をさらに含む。
特定の態様では、例えば以下の項目が提供される：
（項目１）
（１）ターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列；
（２）Ｃａｓ９結合配列；および
（３）１またはそれより多いコピーのＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）、ここで前記の１またはそれより多いコピーのＰＢＳは同じまたは異なるＰＵＦドメインに結合する；
を含むポリヌクレオチドであって；
Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）が、Ｃａｓ９結合配列に結合することによって、当該ポリヌクレオチドと複合体を形成可能である、前記ポリヌクレオチド。
（項目２）
Ｃａｓ９タンパク質が、ポリヌクレオチドと複合体化した際のＤＮＡ結合能を保持する、ヌクレアーゼ不全ｄＣａｓ９タンパク質である、項目１のポリヌクレオチド。
（項目３）
Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）がポリヌクレオチドと複合体化した際、ＤＮＡターゲティング配列がターゲットポリヌクレオチド配列と塩基対形成する、項目１のポリヌクレオチド。
（項目４）
ターゲットポリヌクレオチド配列が、転写制御要素を含むかまたは該要素に隣接している、項目１のポリヌクレオチド。
（項目５）
転写制御要素が：コアプロモーター、近位プロモーター要素、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、および遺伝子座調節領域の１またはそれより多くを含む、項目４のポリヌクレオチド。
（項目６）
ターゲットポリヌクレオチド配列が、テロメア配列、セントロメア、または反復ゲノム配列を含むか、または該配列に隣接している、項目１のポリヌクレオチド。
（項目７）
ターゲットポリヌクレオチド配列が、ゲノムマーカー配列（または関心対象のゲノム遺伝子座）を含むかまたは該配列に隣接している、項目１のポリヌクレオチド。
（項目８）
ターゲットポリヌクレオチド配列が、５’−ＣＣＮ−３’、式中、Ｎは任意のＤＮＡヌクレオチドである、である相補鎖のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列のすぐ３’である、項目１のポリヌクレオチド。
（項目９）
ＤＮＡターゲティング配列が、約１２〜２２ヌクレオチド（ｎｔｓ）、約１４〜２０ｎｔｓ、約１６〜２０ｎｔｓ、約１８〜２０ｎｔｓ、あるいは約１２、１４、１６、１８または２０ｎｔｓに渡って、ターゲットポリヌクレオチド配列に相補的である（好ましくは、相補領域は、好ましくはＤＮＡ結合配列の３’端に、１２〜２２ｎｔｓの連続ストレッチを含む）、項目１のポリヌクレオチド。
（項目１０）
ＤＮＡ結合配列が、ターゲットポリヌクレオチド配列に、５０、６０、７０、８０、９０、または９５〜１００％相補的である、項目９のポリヌクレオチド。
（項目１１）
ＤＮＡ結合配列が、５’端ヌクレオチドＧを有する、項目１のポリヌクレオチド。
（項目１２）
ＤＮＡターゲティング配列をＣａｓ９結合配列に連結するリンカー配列をさらに含む、項目１のポリヌクレオチド。
（項目１３）
Ｃａｓ９結合配列がヘアピン構造を形成する、項目１のポリヌクレオチド。
（項目１４）
Ｃａｓ９結合配列が約３７〜４７ｎｔ、または約４２ｎｔである、項目１のポリヌクレオチド。
（項目１５）
Ｃａｓ９タンパク質が、Ｃａｓ９ニッカーゼ、あるいは野生型Ｃａｓ９の一方または両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）の点突然変異のため、エンドヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質である、項目１のポリヌクレオチド。
（項目１６）
点突然変異がＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａである、項目１５のポリヌクレオチド。
（項目１７）
前記の１またはそれより多いコピーのＰＢＳが約８ヌクレオチドを有する、項目１のポリヌクレオチド。
（項目１８）
１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、または５０コピー、あるいは１〜５０、２〜４５、３〜４０、５〜３５、５〜１０、１０〜２０コピーの同一のまたは異なるＰＢＳを含む、項目１のポリヌクレオチド。
（項目１９）
ＰＵＦドメインＰＵＦ（３−２）が結合可能である配列５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’のＰＢＳを含む、項目１のポリヌクレオチド。
（項目２０）
ＰＵＦドメインＰＵＦ（６−２／７−２）が結合可能である配列５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’のＰＢＳを含む、項目１のポリヌクレオチド。
（項目２１）
項目１〜２０のいずれか一項のポリヌクレオチドをコードするベクター。
（項目２２）
ポリヌクレオチドの転写が、恒常的プロモーター、または誘導性プロモーターの制御下にある、項目２１のベクター。
（項目２３）
哺乳動物（ヒト；非ヒト霊長類；非ヒト哺乳動物；齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット；家畜哺乳動物、例えばブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ウシ；あるいはペット哺乳動物、例えばネコまたはイヌ）；鳥類、魚類、昆虫、虫（ｗｏｒｍ）、酵母、または細菌由来の細胞において活性である、項目２０のベクター。
（項目２４）
ベクターのうちの２つが、それぞれのＤＮＡターゲティング配列にコードされるポリヌクレオチド、Ｃａｓ９結合配列、および／またはＰＢＳのコピー数、同一性、または相対的順序において異なる、項目２１〜２３のいずれか一項の複数のベクター。
（項目２５）
項目１〜２０のいずれか一項のポリヌクレオチド、およびＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）を含む、複合体。
（項目２６）
前記の１またはそれより多いＰＢＳに結合した、１またはそれより多いＰＵＦドメインをさらに含む、項目２５の複合体。
（項目２７）
前記のＰＵＦドメインの各々が、エフェクタードメインに融合している、項目２６の複合体。
（項目２８）
エフェクタードメインが、独立に、転写リプレッサー、転写アクチベーター、蛍光タンパク質、酵素、またはクロマチンリモデリングタンパク質（ＨＤＡＣ／ＨＡＴ）である、項目２７の複合体。
（項目２９）
少なくとも２つのＰＵＦドメインが、異なるエフェクタードメインに融合している、項目２７の複合体。
（項目３０）
Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、ＰＵＦドメイン、および／またはエフェクタードメインが、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む、項目２５〜２９のいずれか一項の複合体。
（項目３１）
ＤＮＡターゲティング配列を通じて、ターゲットポリヌクレオチド配列に結合している、項目２５〜３０のいずれか一項の複合体。
（項目３２）
項目２１〜２３のいずれか一項のベクター、または項目２４の複数のベクターを含む、宿主細胞。
（項目３３）
Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする第二のベクターをさらに含む、項目３２の宿主細胞。
（項目３４）
第二のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合しているエフェクタードメインをさらにコードする、項目３３の宿主細胞。
（項目３５）
Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）の発現が、恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、項目３３の宿主細胞。
（項目３６）
各々エフェクタードメインに融合している、前記の１またはそれより多いＰＵＦドメインをコードする第三のベクターをさらに含む、項目３２〜３５のいずれか一項の宿主細胞。
（項目３７）
前記の１またはそれより多いＰＵＦドメインの発現が、独立に、恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、項目３６の宿主細胞。
（項目３８）
エフェクタードメインが、転写リプレッサー、転写アクチベーター、蛍光タンパク質、酵素、またはクロマチンリモデリングタンパク質（ＨＤＡＣ／ＨＡＴ）である、項目３４〜３７のいずれか一項の宿主細胞。
（項目３９）
第二のベクターが、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）またはエフェクタードメインに融合した核局在化シグナルをさらにコードし、そして／または第三のベクターが、ＰＵＦドメインまたはエフェクタードメインに融合した核局在化シグナルをさらにコードする、項目３３〜３８のいずれか一項の宿主細胞。
（項目４０）
第二のベクターがベクターと同じであり、そして／または第三のベクターがベクターまたは第二のベクターと同じである、項目３３〜３９のいずれか一項の宿主細胞。
（項目４１）
生存動物中にある、項目３２〜４０のいずれか一項の宿主細胞。
（項目４２）
培養細胞である、項目３２〜４０のいずれか一項の宿主細胞。
（項目４３）
ターゲットポリヌクレオチド配列で、項目２６〜３１のいずれか一項の複合体を組み立てる方法であって、ターゲットポリヌクレオチド配列に：
（１）項目１〜２０のポリヌクレオチドのいずれか１つ、または項目２１〜２３のベクターのいずれか１つ、または項目２４の複数のベクター；
（２）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、または項目３３〜３５および３８〜３９の第二のベクターのいずれか１つ；および
（３）各々がエフェクタードメインに融合している１またはそれより多いＰＵＦドメイン、または項目３６〜３８および４０の第三のベクターのいずれか１つ
を接触させるかまたはその近傍に運ぶ工程を含む、前記方法。
（項目４４）
複合体が細胞内部で組み立てられ、ターゲットポリヌクレオチド配列が細胞のゲノムＤＮＡの一部であり、そして項目２１〜２３のベクター、項目３３〜３５および３８〜３９の第二のベクター、ならびに項目３６〜３８および４０の第三のベクターが細胞内に導入される、項目４３の方法。
（項目４５）
ターゲットポリヌクレオチド配列が、ヘテロクロマチンが豊富なゲノム遺伝子座にあるかまたはその近傍にあり、そしてエフェクタードメインが検出可能マーカー（例えば蛍光タンパク質）である、項目４３の方法。
（項目４６）
ターゲットポリヌクレオチド配列が、ターゲット遺伝子の転写制御要素にあるかまたはその近傍にあり、そしてエフェクタードメインが転写調節因子（例えばアクチベーター、サプレッサー）である、項目４３の方法。
（項目４７）
ターゲット遺伝子の転写が、細胞運命決定、細胞分化、代謝流動、あるいは生物学的または生化学的に決定可能な転帰に影響を及ぼす、項目４６の方法。
（項目４８）
細胞において、複数の遺伝子の、それぞれ、転写またはエピジェネティック状態を調節する方法であって：細胞内に、複数の項目２４のベクター、それぞれ、ｄＣａｓ９タンパク質または野生型Ｃａｓ９のコード配列、および１またはそれより多いＰＵＦドメインのコード配列を導入する工程を含み、ここで前記ターゲット遺伝子の各々は、（１）前記の複数のベクターの１つにコードされるポリヌクレオチド、ｄＣａｓ９タンパク質または野生型Ｃａｓ９、およびＰＵＦドメインの三分子複合体の、ターゲットポリヌクレオチド配列での組み立て；および（２）ターゲットポリヌクレオチド配列を含むターゲット遺伝子の転写またはエピジェネティック状態調節；を可能にする、ターゲットポリヌクレオチド配列を含む、前記方法。
（項目４９）
少なくとも１つのターゲット遺伝子の転写が増進され／刺激される一方、少なくとも１つの別のターゲット遺伝子の転写が阻害される、項目４８の方法。
（項目５０）
（１）項目１〜２０のいずれか一項のポリヌクレオチド、または項目２１〜２３のいずれか一項のベクター；
（２）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする第二のベクター；および
（３）各々、エフェクタードメインに融合している、１またはそれより多いＰＵＦドメインをコードする第三のベクター；
を含む、キット。
（項目５１）
前記ベクターの細胞内への導入を促進する、形質転換、トランスフェクション、または感染試薬をさらに含む、項目５０のキット。
本明細書記載のいかなる態様も、実施例セクションのみに記載されるものまたは本発明の１つの側面下のみのものを含めて、特に否定しない限りまたは別の意味で不適切でない限り、１またはそれより多い任意の他の態様と組み合わせ可能であることを理解しなければならない。

【図面の簡単な説明】

【0044】

【図1-1】図１Ａ〜１Ｄは、ｓｇＲＮＡ ３’端へのＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）の挿入が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ機能に実質的に影響を与えず、そして対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を用いて、アクチベーターの独立の補充および多量体化が達成可能であることを示す。図１Ａは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を示す模式図であり、これは慣用的な２ハイブリッドｄＣａｓ９融合設計を、３ハイブリッド系に分割することによって改善し、この中で、ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳは、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡのＤＮＡ結合能を、ＰＵＦ融合体によって提供されるエフェクター機能に橋渡しする。中央のパネルは、代表的なＰＵＦドメインの構造を示し、ＣからＮ方向に、８つのリピートを、そして５’から３’方向に、８量体ターゲットＲＮＡとの対応する相互作用を示す。ＰＵＦ ＲＮＡ認識コード表は、例示的な二残基および対応する認識されるＲＮＡ塩基を示す。下部パネルにおいて、４つのＰＵＦアイソタイプを記載するために単純化のため採用された表記法および対応するｐｕｍｉｌｉｏ結合部位（ＰＢＳ）およびその配列を示す表を示す。

【図1-2】図１Ａ〜１Ｄは、ｓｇＲＮＡ ３’端へのＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）の挿入が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ機能に実質的に影響を与えず、そして対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を用いて、アクチベーターの独立の補充および多量体化が達成可能であることを示す。図１Ｂの上部パネルは、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４が、ｓｇＲＮＡの３’端に多様な数のＰＢＳを挿入した後、ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子に結合しそして活性化する能力を試験する実験、例えばｄＣａｓ９：：ＶＰ６４構築物がＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化する能力に関するｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ（０、５、１５、２５、または４７のＰＢＳを伴う）の影響を試験するための実験的セットアップの模式図である。下部パネルは、プロットの下のレジェンドに示す異なる構築物でトランスフェクションした細胞の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定した際の、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の平均倍変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）（ｄＣａｓ９−ＶＰ６４／ｓｇ対照−０ｘＰＢＳａ対照に比較したもの）を示すカラムプロットである。レジェンドは、３パラメーターで用いたｓｇＲＮＡを記載する：ｓｇＲＮＡマッチはｓｇＲＮＡによって認識されるＤＮＡターゲットを指し；＃ＰＢＳおよびＰＢＳ型は、それぞれ、ｓｇＲＮＡ端に付加されたＰＢＳの数および型を示す。

【図1-3】図１Ａ〜１Ｄは、ｓｇＲＮＡ ３’端へのＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）の挿入が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ機能に実質的に影響を与えず、そして対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を用いて、アクチベーターの独立の補充および多量体化が達成可能であることを示す。図１Ｃにおいて、上部パネルは、異なる数の付加されたＰＢＳを含む、対象のアクチベーターによる、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子の活性化を試験する実験を記載する模式図である。下部パネルは、プロットの下のレジェンドに示す異なる構築物でトランスフェクションした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の倍変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）（ｄＣａｓ９/ＰＵＦｂ−ＶＰ６４／ｓｇ対照−０ｘＰＢＳｂに比較したもの）を示すカラムプロットである。レジェンドは、用いたＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ−ＶＰ６４）ならびにＰＢＳの数および型に関する用いたｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ、ならびに影のボックスで示すｓｇＲＮＡに認識されるＤＮＡターゲットを記載する。

【図1-4】図１Ａ〜１Ｄは、ｓｇＲＮＡ ３’端へのＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）の挿入が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ機能に実質的に影響を与えず、そして対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を用いて、アクチベーターの独立の補充および多量体化が達成可能であることを示す。図１Ｄにおいて、上部パネルは、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化する際の対象のアクチベーターアイソタイプの独立性を試験する実験を例示する模式図である。下部パネルは、プロットの下のレジェンドに示す異なる構築物でトランスフェクションした細胞のｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の平均倍変化（±Ｓ．Ｅ．Ｍ）（ＰＵＦ／ＰＢＳアイソタイプｘに関するそれぞれの対照ｄＣａｓ９／ＰＵＦｘ−ＶＰ６４／ｓｇ対照−５ｘＰＢＳｘに比較したもの）を示すカラムプロットである。レジェンドは、用いたＰＵＦアイソタイプ（ＰＵＦ−ＶＰ６４）、ＰＢＳアイソタイプ（５ｘＰＢＳ；「−」はＰＢＳを含まないｓｇＲＮＡを示す）、および影のボックスで示すＤＮＡターゲット（ｓｇＲＮＡマッチ）を記載する。すべてのプロットは、３つの複製測定の結果を示す。

【図2-1】図２Ａおよび２Ｂは、ＶＰ６４およびＰ６５−ＨＳＦ１を含む対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系の組み立てに関する。図２Ａは、ＰＢＳ３２およびＰＢＳ６２７２の両方を含有するｓｇＲＮＡによる補充を介したＰＵＦ（３−２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６−２／７−２）：：Ｐ６５−ＨＳＦ１の組み立てを試験する実験の模式図である。活性は、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光レポーター活性によって測定された。図２Ｂは、４ｘ［ＰＢＳ３２−ＰＢＳ６２７２］ヘテロ二量体部位を含む非ターゲティング（ｓｇ対照）およびＴｅｔターゲティング（ｓｇＴｅｔＯ）ｓｇＲＮＡを伴うアクチベータータンパク質（単数または複数）をトランスフェクションした結果の相対平均ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を示すカラムチャートである。

【図2-2】図２Ｃは、５ｘＰＢＳａを伴う対照ｓｇＲＮＡ、あるいは０、１、５、１５、または２５コピーのＰＢＳａを伴うＴｅｔＯターゲティングｓｇＲＮＡと組み合わせ、活性化ドメインとしてＶＰ６４（ＰＵＦａ：：ＶＰ６４；赤カラム）対ｐ６５ＨＳＦ１（ＰＵＦａ：：ｐ６５ＨＳＦ１；青カラム）を用いた、対象の三構成要素系アクチベーターの比較を示す。カラムは、対照ｓｇＲＮＡ（ｓｇ対照）を用いた実験に比較した、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の平均倍変化（Ｓ．Ｅ．Ｍ．を伴う；ｎ＝３）を示す。レジェンドは、ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ上のＰＢＳａの数（＃ＰＢＳａ）ならびに影のボックスで示されるＤＮＡマッチを示す。

【図3-1】図３Ａ〜３Ｄは、ロバストな内因性遺伝子活性化を達成するアクチベーターの多量体化を可能にする対象の系を示す。図３Ａ、上部パネル：ＯＣＴ４遺伝子を活性化するために用いるｓｇＲＮＡ−ＰＢＳの相対マッチ位（１〜４とラベルされるストローク）を示す遺伝子モデル。下部パネル：ｄＣａｓ９／ＰＵＦａ−ｐ６５ＨＳＦ１三構成要素系アクチベーターモジュール、あるいはＯＣＴ４ターゲティングｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａまたは対照ｓｇＲＮＡｓ−５ｘＰＢＳａの示すカクテルを伴うｄＣａｓ９−ｐ６５ＨＳＦ１アクチベーターを用いた、ＯＣＴ４発現の活性化に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した平均倍変化（９５％Ｃ．Ｉ．を伴う）（対照試料に比較したもの）。レジェンド中の影のボックスは、対照配列を伴う単一のｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａ、遺伝子モデル中の番号付けしたストロークに対応する個々のＯＣＴ４ターゲティングｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａ、または４つのＯＣＴ４ターゲティングｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａのカクテルの使用を示す。

【図3-2】図３Ａ〜３Ｄは、ロバストな内因性遺伝子活性化を達成するアクチベーターの多量体化を可能にする対象の系を示す。図３Ｂ、上部パネル：ＳＯＸ２遺伝子を活性化するために用いるｓｇＲＮＡ−ＰＢＳの相対マッチ位（１〜４とラベルされるストローク）を示す遺伝子モデル。ｄＣａｓ９／ＰＵＦａ−ｐ６５ＨＳＦ１アクチベーター、あるいはＳＯＸ２ターゲティングｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａまたは対照ｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａの示すカクテルを伴うｄＣａｓ９−ｐ６５ＨＳＦ１アクチベーターを用いた、ＳＯＸ２発現の活性化に関する、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定した平均倍変化（９５％Ｃ．Ｉ．を伴う）（対照試料に比較したもの）。レジェンド中の影のボックスは、対照配列を伴う単一のｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａ、遺伝子モデル中の番号付けしたストロークに対応する個々のＳＯＸ２ターゲティングｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａ、または４つのＳＯＸ２ターゲティングｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａのカクテルの使用を示す。

【図3-3】図３Ａ〜３Ｄは、ロバストな内因性遺伝子活性化を達成するアクチベーターの多量体化を可能にする対象の系を示す。図３Ｃは、１、５、１５、または２５コピーのＰＢＳａを伴うＯＣＴ４ターゲティングｓｇＲＮＡ−ＰＢＳａの示す単一またはカクテルを用いたＯＣＴ４発現の平均倍変化（９５％Ｃ．Ｉ．を伴う）を示す。

【図3-4】図３Ａ〜３Ｄは、ロバストな内因性遺伝子活性化を達成するアクチベーターの多量体化を可能にする対象の系を示す。図３Ｄは、１、５、１５、または２５コピーのＰＢＳａを伴うＳＯＸ２ターゲティングｓｇＲＮＡ−ＰＢＳａの示す単一またはカクテルを用いたＳＯＸ２発現の平均倍変化（９５％Ｃ．Ｉ．を伴う）を示す。

【図4-1】図４Ａおよび４Ｂは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、２つの異なるターゲットレポーター遺伝子の活性化および抑制を同時に可能にすることを示す。図４Ａは、ｄＣａｓ９／ｓｇＴｅｔＯ−ＰＢＳ３２／ＰＵＦ（３−２）：：ＶＰ６４でＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化し、そして同時にｄＣａｓ９／ｓｇＳＶ４０−ＰＢＳ６２７２／ＫＲＡＢ：：ＰＵＦ（６−２／７−２）でＳＶ４０：：ＥＧＦＰ導入遺伝子を抑制する実験を示す模式図である。

【図4-2】図４Ａおよび４Ｂは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、２つの異なるターゲットレポーター遺伝子の活性化および抑制を同時に可能にすることを示す。図４Ｂは、表に示す構築物でトランスフェクションした試料に関する相対平均ＥＧＦＰおよびｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を示すカラムチャートである。

【図4-3】図４Ｃおよび４Ｄは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、異なる遺伝子を同時に活性化し、そして抑制することが可能であることをさらに立証する。図４Ｃ、左パネル：それぞれ、ＰＵＦｃ−ｐ６５ＨＳＦ１およびＫＲＡＢ−ＰＵＦａによる、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏおよびＳＶ４０：：ＥＧＦＰの活性化および抑制を同時に達成する実験を例示する模式図である。右パネル：上部のカラムプロットは、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光の平均倍変化（Ｓ．Ｅ．Ｍ．を伴う）を示し；下部のカラムプロットは、中央のレジェンドに示す構築物でトランスフェクションした細胞のＥＧＦＰ蛍光の平均倍変化（Ｓ．Ｅ．Ｍ．を伴う）を示す。中央のレジェンドは、影により、ＰＵＦｃ−ｐ６５ＨＳＦ１およびＫＲＡＢ−ＰＵＦａのトランスフェクションの包含、ならびに黒い影のボックスにより、ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳｃおよびｓｇＲＮＡ−ＰＢＳａの、対照、ＴｅｔＯまたはＳＶ４０Ｐ１のいずれかへのＤＮＡマッチを示す。

【図4-4】図４Ｃおよび４Ｄは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、異なる遺伝子を同時に活性化し、そして抑制することが可能であることをさらに立証する。図４Ｄ、左パネル：それぞれ、ＰＵＦｂ−ｐ６５ＨＳＦ１およびＢＦＫＲＡＢ−ＰＵＦａによる、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２の活性化および抑制を同時に達成する実験を例示する模式図。右パネル：上部のカラムプロットは、ＯＣＴ４遺伝子発現の平均倍変化（９５％Ｃ．Ｉ．を伴う）を示し；下部のカラムプロットは、中央のレジェンドに示す構築物でトランスフェクションした細胞のＳＯＸ２の遺伝子発現の平均倍変化（９５％Ｃ．Ｉ．を伴う）を示す。中央のレジェンドは、黒い影のボックスにより、ｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳｂおよびｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａの、対照、ＯＣＴ４プロモーター（ＯＣＴ４ｐｐ）またはＳＯＸ２プロモーター（ＳＯＸ２ｐｐ）へのＤＮＡマッチを示す。ＰＵＦｂ−ｐ６５ＨＳＦ１＋ＢＦＰＫＲＡＢ−ＰＵＦａの列は、黄色で強調したボックスで、試料中のアクチベーター−リプレッサーモデルの包含を示す。これらの実験は、ＯＣＴ４およびＳＯＣ２遺伝子両方に関して４つのｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳのカクテルを用いた。

【図5-1】図５Ａ〜５Ｃは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を用いて、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインをエンハンサーに補充し、ターゲット遺伝子発現を活性化可能であることを示す。図５Ａは、ｄＣａｓ９−ＣＢＰＨＡＴ直接融合体、あるいは三構成要素モジュールｄＣａｓ９／ＣＢＰＨＡＴ−ＰＵＦａまたはｄＣａｓ９／ＰＵＦａ−ＣＢＰＨＡＴを用いて、ＯＣＴ４の近位プロモーター（ＰＰ）、近位エンハンサー（ＰＥ）または遠位エンハンサー（ＤＥ）をターゲティングするエンハンサー活性化実験の模式図である。これらの領域各々をターゲティングする４つのガイドを、マッチの位置を示す赤いストロークの上の番号とともに示す。

【図5-2】図５Ａ〜５Ｃは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を用いて、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインをエンハンサーに補充し、ターゲット遺伝子発現を活性化可能であることを示す。図５Ｂは、ｄＣａｓ９−ＣＢＰＨＡＴ、ｄＣａｓ９／ＣＢＰＨＡＴ−ＰＵＦａまたはｄＣａｓ９／ＰＵＦａ−ＣＢＰＨＡＴを発現するプラスミド、および各々ＰＰ、ＰＥまたは遠位エンハンサーＤＥをターゲティングする４つのｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａのカクテルでトランスフェクションした細胞のＯＣＴ４発現（対応するｓｇ対照ターゲティング実験に比較する）の平均倍変化（９５％Ｃ．Ｉ．を伴う）を示す。図５Ｃは、ｄＣａｓ９／ＣＢＰＨＡＴ−ＰＵＦａおよびＯＣＴ４のＰＰ、ＰＥ、ＤＥをターゲティングするｓｇＲＮＡの単一またはカクテルのトランスフェクション後のＯＣＴ４発現（ｓｇ対照実験に比較する）の平均倍変化（９５％Ｃ．Ｉ．を伴う）を示す。レジェンドは、影のボックスで、各領域をターゲティングする個々のガイドまたはガイドのカクテルの包含を示す。

【図6-1】図６Ａ〜６Ｇは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、蛍光タンパク質の多量体化、ならびにテロメアおよびセントロメアの同時標識を可能にすることを示す（スケールバー：５μｍ）。図６Ａは、緑色蛍光でテロメアリピートを標識する、ｄＣａｓ９／ｓｇテロメア−ＰＢＳ３２／クローバー：：ＰＵＦ（３−２）（またはＰＵＦａ）の使用を示す模式図である。

【図6-2】図６Ａ〜６Ｇは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、蛍光タンパク質の多量体化、ならびにテロメアおよびセントロメアの同時標識を可能にすることを示す（スケールバー：５μｍ）。図６Ｂは、クローバー−ＰＵＦ−ａ、および左から右に、増加する数（０、５、１５、２５）のＰＢＳａを装備したｓｇテロメアによるテロメア標識を示す共焦点蛍光顕微鏡画像を示す。図６Ｃは、ｄＣａｓ９／クローバー−ＰＵＦａ／ｓｇテロメア−２５ｘＰＢＳａによる、テロメアの標識の抗ＴＲＦ２免疫染色確認を示す。

【図6-3】図６Ａ〜６Ｇは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、蛍光タンパク質の多量体化、ならびにテロメアおよびセントロメアの同時標識を可能にすることを示す（スケールバー：５μｍ）。図６Ｄは、ｄＣａｓ９／ＰＵＦａ：：クローバー、および０、５、１５または２５のＰＢＳａ部位を含むテロメアターゲティングｓｇＲＮＡでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、蛍光フォーカスの数の定量化を示す。（ｎ＝２０；マン・ホイットニー統計：^＊＊＊＝ｐ＜０．０００５、^＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。図６Ｅは、テロメアをターゲティングするｓｇＲＮＡ上の５、１５、または２５ｘＰＢＳａを含む、対象の三構成要素系による、総核シグナルに対するフォーカスでの総シグナルの比率としての、シグナル対ノイズ比の定量化を示す。（ｎ＝２０；マン・ホイットニー統計：^＊＊＊＊＝ｐ＜０．０００１）。

【図6-4】図６Ａ〜６Ｇは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、蛍光タンパク質の多量体化、ならびにテロメアおよびセントロメアの同時標識を可能にすることを示す（スケールバー：５μｍ）。図６Ｆは、クローバー−ＰＵＦｃ／ｓｇセントロメア−２０ｘＰＢＳｃによるセントロメアの標識の抗ＣＲＥＳＴ確認を示す。図６Ｇは、それぞれ、クローバー−ＰＵＦｃ／ｓｇセントロメア−２０ｘＰＢＳｃおよびｍＲｕｂｙ２−ＰＵＦａ／ｓｇテロメア−２５ｘＰＢＳａによる、セントロメアおよびテロメアの同時標識を示す、代表的な共焦点蛍光顕微鏡画像である。

【図7】図７は、ＭＵＣ４標識の代表的な共焦点顕微鏡画像であり、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、ＭＵＣ４遺伝子座をターゲティングする７ ｓｇＲＮＡ−１５ｘＰＢＳ４３での非反復領域の標識を可能にすることを示す。

【図8】図８Ａ〜８Ｃは対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系のいくつかの特徴を強調するマンガによる例示である。図８Ａは、多重化を例示する；異なるＰＢＳアイソタイプを含むｓｇＲＮＡは、同族ＰＵＦアイソタイプによって束縛されるエフェクターを補充可能であり、異なるエフェクター機能またはタンパク質タグを別個の染色体遺伝子座に局在させるための多重化ｄＣａｓ９の機構を提供する。図８Ｂは、多量体化を例示する：ＰＢＳの短くそして直鎖である特徴によって、ｓｇＲＮＡが多数コピーのＰＢＳを装備することが可能になり、したがって、ターゲット遺伝子座で、多くの分子のＰＵＦ融合体を補充することが可能になる。図８Ｃは、複合体形成を例示する：異なる組み合わせ、順序および数のＰＢＳを装備したｓｇＲＮＡは、望ましい化学量論および立体配置を持つタンパク質複合体の組み立てを導く足場として、潜在的に作用しうる。

【発明を実施するための形態】

【0045】

１．概説
本明細書に記載する発明は、ターゲットポリヌクレオチド配列への結合のため（例えばＤＮＡターゲティング配列）；野生型Ｃａｓ９タンパク質、あるいは減少したまたは欠損したヌクレアーゼ活性を伴う修飾Ｃａｓ９タンパク質（例えばＣａｓ９ニッカーゼまたはｄＣａｓ９）のいずれかに結合するため（例えばＣａｓ９結合配列）；そして各々機能的またはエフェクタードメインに融合した、１またはそれより多いＰＵＦドメインに結合するための、３つの機能的配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、野生型または修飾Ｃａｓ９タンパク質、および１またはそれより多いＰＵＦドメイン融合タンパク質とともに、三構成要素複合体（対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系）を、特定のターゲットＤＮＡ配列で形成して、特定のターゲットＤＮＡ配列で、１またはそれより多い生物学的効果を達成しうる。

【0046】

本発明はまた、こうしたポリヌクレオチドをコードするベクター、ならびにポリヌクレオチド、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、および少なくとも１つのＰＵＦドメイン融合タンパク質によって形成される複合体も提供する。本発明はさらに、ベクターまたはポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。

【0047】

対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、ターゲットＤＮＡ配列で多様な生物学的機能を達成可能であり、これらには、限定されるわけではないが：ノックインの効率を増加させる相同組換え増進、多数のゲノム遺伝子座での同時転写活性化および／または抑制；蛍光画像化または他の検出可能シグナルによるゲノム遺伝子座での特定の配列の検出；ならびに細胞運命決定、細胞分化、代謝流動、あるいは生物学的または生化学的決定可能転帰への影響等が含まれる。

【0048】

本発明は、さらに、本発明の方法を実行するためのキットおよび試薬を提供する。
したがって、１つの側面において、本発明は：（１）ターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列；（２）Ｃａｓ９結合配列；および（３）１またはそれより多いコピーのＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）、ここで１またはそれより多いコピーのＰＢＳは各々、同じまたは異なるＰＵＦドメインに結合する、を含むポリヌクレオチドであって；Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）が、Ｃａｓ９結合配列に結合することによって、ポリヌクレオチドと複合体を形成可能である、前記ポリヌクレオチドを提供する。特定の態様において、ｄＣａｓ９タンパク質は、減少したヌクレアーゼ活性を有するか、またはヌクレアーゼ活性を欠く（例えばヌクレアーゼ不全である）が、対象のポリヌクレオチドと複合体化した際、ＤＮＡ結合能を保持する。特定の態様において、（１）〜（３）は、この順序で５’から３’に配置される。他の態様において、１またはそれより多くのＰＢＳは、ＤＮＡターゲティング配列の５’、および／またはＣａｓ９結合配列の５’であってもよい。

【0049】

ターゲットポリヌクレオチド配列は、任意のＤＮＡ配列であってもよい。特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、１またはそれより多い転写制御要素を含むかまたは該要素に隣接している。特定の態様において、転写制御要素（単数または複数）は：コアプロモーター、近位プロモーター要素、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、および遺伝子座調節領域の１またはそれより多くを含む。別の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、セントロメア配列、テロメア配列、または反復ゲノム配列を含むか、または該配列に隣接している。テロメア配列は、ＴＴＡＧＧＧリピートの５〜１５ｋｂトラックを有することによって特徴付け可能である。さらに別の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、ゲノムマーカー配列または関心対象の任意のゲノム遺伝子座を含むかまたは該配列に隣接している。

【0050】

特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、相補鎖のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列のすぐ３’である。例えば、特定の態様において、相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＮ−３’であり、式中、Ｎは任意のＤＮＡヌクレオチドである。

【0051】

他の態様において、相補鎖のＰＡＭ配列は、用いようとする特定のＣａｓ９タンパク質または相同体またはオルソログにマッチする。
当該技術分野に知られるように、Ｃａｓ９が成功裡にＤＮＡに結合するためには、ゲノムＤＮＡ中のターゲット配列は、ガイドＲＮＡ配列に相補的でなければならず、そしてそのすぐ後には正しいプロトスペーサー隣接モチーフまたはＰＡＭ配列が続かなければならない。ＰＡＭ配列は、ＤＮＡターゲット配列中には存在するが、ガイドＲＮＡ配列中には存在しない。ＰＡＭ配列が続く、正しいターゲット配列を含む任意のＤＮＡ配列は、Ｃａｓ９によって結合されるであろう。

【0052】

ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９が由来する細菌種によって異なる。最も広く用いられるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、化膿性連鎖球菌由来であり、そしてＰＡＭ配列は、ガイドＲＮＡ認識配列のすぐ３’端上に位置する５’−ＮＧＧ−３’（または相補鎖上の５’−ＣＣＮ−３’）である。異なる細菌種由来の他のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＰＡＭ配列を以下の表に列挙する。

【0053】

【表1】

【0054】

特定の態様において、ＤＮＡターゲティング配列は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）がポリヌクレオチドと複合体化した際、ターゲットポリヌクレオチド配列と塩基対形成する。

【0055】

ＤＮＡターゲティング配列は、ターゲットポリヌクレオチド配列と１００％相補的であってもまたはなくてもよいことに注目すべきである。特定の態様において、ＤＮＡターゲティング配列は、約８〜２５ヌクレオチド（ｎｔｓ）、約１２〜２２ヌクレオチド、約１４〜２０ｎｔｓ、約１６〜２０ｎｔｓ、約１８〜２０ｎｔｓ、あるいは約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ｎｔｓに渡って、ターゲットポリヌクレオチド配列に相補的である。特定の態様において、相補領域は、好ましくはＤＮＡターゲティング配列の３’で、約１２〜２２ｎｔｓの連続ストレッチを含む。特定の態様において、ＤＮＡターゲティング配列の５’端は、ターゲットポリヌクレオチド配列と最大８ヌクレオチドのミスマッチを有する。特定の態様において、ＤＮＡ結合配列は、ターゲットポリヌクレオチド配列に、約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％相補的である。

【0056】

関連する態様において、相補的ターゲットポリヌクレオチド配列に比較して、ＤＮＡターゲティング配列の３’端には１５ヌクレオチドを超えるマッチはなく、そして複合体中のＣａｓ９タンパク質は、ある状況下でターゲットＤＮＡに結合するがこれを切断しない、野生型Ｃａｓ９タンパク質である。

【0057】

特定の態様において、ＤＮＡ結合配列は、５’端ヌクレオチドＧを有する。
特定の態様において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡターゲティング配列をＣａｓ９結合配列に連結するリンカー配列をさらに含む。

【0058】

特定の態様において、Ｃａｓ９結合配列はヘアピン構造を形成する。特定の態様において、Ｃａｓ９結合配列は、長さ約３０〜１００ｎｔ、約３５〜５０ｎｔ、約３７〜４７ｎｔ、または約４２ｎｔである。

【0059】

例示的なＣａｓ９結合配列は、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡ ＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡである。別の例示的なＣａｓ９結合配列は、ＧＴＴＴＡＡＧＡＧＣＴＡＴＧＣ ＴＧ ＧＡＡＡＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＴＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡである。

【0060】

修飾Ｃａｓ９タンパク質（ニッカーゼまたはｄＣａｓ９）は、減少したヌクレアーゼ活性を有してもよいし、あるいは一方または両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位のヌクレアーゼ活性を欠く。特定の態様において、ｄＣａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９の両方のエンドヌクレアーゼ触媒部位（ＲｕｖＣおよびＨＮＨ）の点突然変異のため、エンドヌクレアーゼ活性を欠く。例えば、点突然変異は、化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９において、それぞれ、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａであってもよいし、または化膿性連鎖球菌以外の種における対応する残基におけるものであってもよい。特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９の一方の部位でエンドヌクレアーゼ触媒活性を欠くが、両方の部位ではなく、そしてｄｓＤＮＡターゲット上にニックを生成可能である（Ｃａｓ９ニッカーゼ）。

【0061】

特定の態様において、１つまたはそれより多いコピーのＰＢＳは各々、約８ヌクレオチドを有する。１つの例示的なＰＢＳは、ＰＵＦドメインＰＵＦ（３−２）が結合可能な５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’の配列を有しうる。別の例示的なＰＢＳは、ＰＵＦドメインＰＵＦ（６−２／７−２）が結合可能な５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’の配列を有しうる。さらなるＰＢＳおよび対応するＰＵＦドメインを以下に記載する。

【0062】

本発明のポリヌクレオチドは、ＰＢＳの１コピーより多くを有しうる。特定の態様において、ポリヌクレオチドは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、４６、４７、４８、４９、または５０コピーのＰＢＳ、例えば５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５コピーのＰＢＳを含む。特定の態様において、ＰＢＳコピー数の範囲は、ＬからＨであり、式中、Ｌは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、または４０の任意の１つであり、そしてＨがＬより長い限り、Ｈは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、８０、９０、または１００の任意の１つである。各ＰＢＳは、同じであってもまたは異なってもよい。

【0063】

特定の態様において、ポリヌクレオチドは、約５〜１５コピーのＰＢＳ、または約５〜１４コピー、約５〜１３コピー、約５〜１２コピー、約５〜１１コピー、約５〜１０コピー、または約５〜９コピーを含む。

【0064】

特定の態様において、トランスフェクションされるかまたは発現されるｓｇＲＮＡ−ＰＢＳの量および／またはＰＵＦ融合体の量を調整して、ＰＢＳ／ＰＵＦ結合を最大にする。例えば、これは、より強いプロモーターによって、または誘導性プロモーター、例えばＤｏｘ誘導性プロモーターを用いることによって、ＰＵＦアクチベーターの発現を増加させることにより、達成可能である。

【0065】

特定の態様において、ＰＢＳ部位および／またはスペーサー配列の間のスペーシングを最適化して、系の効率を改善する。例えば、スペーシング最適化を特定のＰＵＦ融合体に供することも可能であり、そしてこれは、個々のタンパク質として作用するＰＵＦ融合体および機能するために十分に近く配置する必要がありうるＰＵＦ融合体（例えばタンパク質複合体）の間では異なる可能性もある。

【0066】

本発明の別の側面は、対象のポリヌクレオチドのいずれか１つをコードするベクターを提供する。特定の態様において、ポリヌクレオチドの転写は、恒常的プロモーター、または誘導性プロモーターの制御下にある。特定の態様において、ベクターは、哺乳動物（ヒト；非ヒト霊長類；非ヒト哺乳動物；齧歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、モルモット；家畜哺乳動物、例えばブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ、ウシ；あるいはペット哺乳動物、例えばネコまたはイヌ）；鳥類、魚類、昆虫、虫、酵母、または細菌由来の細胞において活性である。

【0067】

特定の態様において、ベクターはプラスミド、ウイルスベクタ−（例えばアデノウイルス、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクター、あるいはＡＡＶベクター）、またはトランスポゾン（例えばピギーＢａｃトランスポゾン）である。ベクターを一過性に宿主細胞にトランスフェクションしてもよいし、あるいは感染または転位によって、宿主ゲノム内に取り込んでもよい。

【0068】

本発明の関連する側面は、本発明のベクターの任意の１つの多数またはライブラリーを提供し、ここで、ベクターのうちの２つが、それぞれのＤＮＡターゲティング配列にコードされるポリヌクレオチド、Ｃａｓ９結合配列、および／またはＰＢＳのコピー数、同一性（配列、結合特異性等）、または相対的順序において異なる。

【0069】

本発明の別の側面は、任意の１つの本発明のポリヌクレオチド、およびＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）を含む、複合体を提供する。特定の態様において、複合体は、任意の１つの本発明のポリヌクレオチド、およびＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）を含む。特定の態様において、複合体は野生型Ｃａｓ９タンパク質を含まない。特定の態様において、複合体は野生型Ｃａｓ９を含む。

【0070】

特定の態様において、複合体は、１またはそれより多いＰＵＦドメイン、あるいは１またはそれより多いＰＢＳに結合したその融合体をさらに含んでもよい。特定の態様において、ＰＵＦドメインの各々は、エフェクタードメインに融合している。各エフェクタードメインは、独立に（限定されるわけではないが）：転写リプレッサー、転写アクチベーター、蛍光タンパク質、酵素、またはクロマチンリモデリングタンパク質（ＨＤＡＣ／ＨＡＴ）であってもよい。特定の態様において、ＰＵＦドメインの少なくとも２つは、異なるエフェクタードメインに融合している。

【0071】

特定の態様において、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、ＰＵＦドメイン、および／またはエフェクタードメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。

【0072】

特定の態様において、複合体は、ポリヌクレオチドのＤＮＡターゲティング配列を通じて、ターゲットポリヌクレオチド配列に結合している。 本発明の別の側面は、任意の１つの対象のベクター、または複数のベクターを含む、宿主細胞を提供する。

【0073】

特定の態様において、宿主細胞は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする第二のベクターをさらに含む。
特定の態様において、第二のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合しているエフェクタードメインをさらにコードする。Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）の発現は、恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。

【0074】

特定の態様において、宿主細胞は、各々エフェクタードメインに融合している、１またはそれより多いＰＵＦドメインをコードする第三のベクターをさらに含んでもよい。１またはそれより多いＰＵＦドメインの発現は、独立に、恒常的プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあってもよい。

【0075】

エフェクタードメインは、多くの機能または生物学的効果のいずれを有してもよい。単に例示のため、エフェクタードメインは、相同組換えに関与するタンパク質、転写リプレッサー、転写アクチベーター、蛍光タンパク質、酵素、またはクロマチンリモデリングタンパク質（ＨＤＡＣ／ＨＡＴ）等であってもよい。

【0076】

特定の態様において、第二のベクターは、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）またはエフェクタードメインに融合した核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらにコードしてもよく、そして／または第三のベクターは、ＰＵＦドメインまたはエフェクタードメインに融合した核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらにコードしてもよい。

【0077】

特定の態様において、異なるベクターによってコードされうる配列は、同じベクター上にあってもよい。例えば、特定の態様において、第二のベクターはベクターと同じであってもよく、そして／または第三のベクターはベクターまたは第二のベクターと同じであってもよい。

【0078】

宿主細胞は、生存動物中にあってもよいし、または培養細胞であってもよい。
特定の態様において、宿主細胞は、対象の三構成要素系の１またはそれより多い構成要素（例えばｄＣａｓ９、ＰＵＦ融合体）を、恒常的にまたは誘導性に発現してもよい。

【0079】

本発明のさらに別の側面は、ターゲットポリヌクレオチド配列で、本発明の複合体を組み立てる方法であって、ターゲットポリヌクレオチド配列に：（１）任意の１つの対象のポリヌクレオチド、または任意の１つの対象のベクター、または複数のベクター；（２）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、またはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする任意の１つの対象の第二のベクター；および（３）各々がエフェクタードメインに融合している１またはそれより多いＰＵＦドメイン、またはＰＵＦドメイン融合体をコードする第三のベクターを接触させるかまたはその近傍に運ぶ工程を含む、前記方法を提供する。

【0080】

特定の態様において、複合体は、細胞内部で組み立てられ、ターゲットポリヌクレオチド配列は細胞のゲノムＤＮＡの一部であり、そして対象のベクター、第二のベクター、およびの第三のベクターが細胞内に導入される。

【0081】

特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、ヘテロクロマチンが豊富なゲノム遺伝子座にあるかまたはその近傍にあり、そしてエフェクタードメインは検出可能マーカー（例えば蛍光タンパク質）である。別の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、ターゲット遺伝子の転写制御要素にあるかまたはその近傍にあり、そしてエフェクタードメインは転写調節因子（例えばアクチベーター、サプレッサー）である。ターゲット遺伝子の転写は、例えば、細胞運命決定、細胞分化、代謝流動、あるいは生物学的または生化学的に決定可能な転帰に影響を及ぼしうる。

【0082】

本発明の関連する側面は、細胞において、複数のターゲット遺伝子の転写を調節する方法であって：細胞内に、対象の複数のベクター、ｄＣａｓ９タンパク質のコード配列、および１またはそれより多いＰＵＦドメイン融合体のコード配列を導入する工程を含み、ここでターゲット遺伝子の各々は、（１）複数のベクターの１つにコードされるポリヌクレオチド、ｄＣａｓ９タンパク質、およびＰＵＦドメイン融合体の三分子複合体の、ターゲットポリヌクレオチド配列での組み立て；および（２）ターゲットポリヌクレオチド配列を含むターゲット遺伝子の転写調節を可能にする、ターゲットポリヌクレオチド配列を含む、前記方法を提供する。

【0083】

関連する側面において、本発明はまた、細胞における、複数のターゲット遺伝子のエピジェネティック調節の方法（例えば、転写活性に直接関連しないクロマチンのエピジェネティック状態の調節）であって：細胞内に、複数の対象のベクター、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼのコード配列、および１またはそれより多いＰＵＦドメイン融合体のコード配列を導入する工程を含み、ここでターゲット遺伝子の各々は、（１）複数のベクターの１つにコードされるポリヌクレオチド、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼ、およびＰＵＦドメイン融合体の三分子複合体の、ターゲットポリヌクレオチド配列での組み立て；および（２）ターゲットポリヌクレオチド配列を含むターゲット遺伝子のエピジェネティック調節を可能にする、ターゲットポリヌクレオチド配列を含む、前記方法を提供する。該方法は、例えば、同じ時点で、エピジェネティック状態を変化させ（例えばクロマチンを開放し）、閉鎖クロマチン部位へのＣａｓ９結合のアクセス／安定性を獲得する（例えばこれらの部位での切断およびゲノム編集を増加させる）ために有用でありうる。

【0084】

特定の態様において、少なくとも１つのターゲット遺伝子の転写が増進され／刺激される一方、少なくとも１つの別のターゲット遺伝子が阻害される。
本発明はさらに：（１）対象のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドをコードするベクター；（２）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードする第二のベクター；および（３）各々、エフェクタードメインに融合している、１またはそれより多いＰＵＦドメインをコードする第三のベクターを含む、キットを提供する。該キットは、該ベクターの細胞内への導入を促進する、形質転換、トランスフェクション、または感染試薬をさらに含んでもよい。

【0085】

本発明は一般的に上記に記載されてきているが、本発明の多様な特徴を以下にさらに詳述する。別個の態様の背景で、または本発明の異なる側面下での別個の態様で記載した際であっても、本発明の特徴は、単一の態様において、組み合わせて提供可能である。逆に、単一の態様の背景で記載した本発明の多様な特徴もまた、別個に、または任意の適切な下位組み合わせで提供可能である。本発明に関する態様のすべての組み合わせが、本発明に特に含まれ、そしてちょうど、各々およびすべての組み合わせが個々にそして明確に開示されるかのように、本明細書に開示される。さらに、多様な態様およびその要素のすべての下位組み合わせもまた、本発明に特に含まれ、そしてちょうど、各々およびすべての下位組み合わせが個々にそして明確に開示されるかのように、本明細書に開示される。

【0086】

２．本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、３つの配列セグメントを含む：ｉ）ターゲット配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一のセグメント；ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、あるいは減少したヌクレアーゼ活性を有するかまたはヌクレアーゼ活性を欠くｄＣａｓ９タンパク質）と相互作用する第二のセグメント（例えばＣａｓ９結合配列）；およびｉｉｉ）１またはそれより多いコピーのＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）。

【0087】

特定の態様において、ターゲット配列はＲＮＡである。特定の態様において、ターゲット配列はＤＮＡである。本明細書の説明において、第一のセグメントは、ターゲット配列がＤＮＡ（例えばゲノムＤＮＡ）である場合、一般的に、「ＤＮＡターゲティング配列」と称される。ターゲット配列がＲＮＡである関連する態様において、本明細書の説明は、以下で、冗長性を回避するため、「ＤＮＡターゲティング配列」への言及を「ＲＮＡターゲティング配列」で置き換えることを例外として、一般的に同様に適用する。すなわち、第一のセグメントは、ターゲットポリヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に相補的なヌクレオチド配列を含む。

【0088】

特定の態様において、３つのセグメントｉ）〜ｉｉｉ）は、５’から３’に、この順序で配置される。
特定の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、単一のＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であってもよく、これには「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」が含まれうる。別の態様において、本発明のポリヌクレオチドは、２つのＲＮＡ分子を含んでもよい（例えばＣａｓ９結合配列でのハイブリダイゼーションを通じてともに連結される。以下を参照されたい）。したがって、対象のポリヌクレオチドは包含性であり、２分子ポリヌクレオチドおよび単一分子ポリヌクレオチド（例えばｓｇＲＮＡ）の両方を指す。

【0089】

ａ． ＤＮＡターゲティング配列
ＤＮＡターゲティング配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系のｃｒＲＮＡまたはガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと機能的に類似であるかまたは同等である。しかし、本発明の背景において、ＤＮＡターゲティング配列は、任意の特定のｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡから生じなくてもよく、ターゲットポリヌクレオチド配列の配列に基づいて、恣意的に設計されてもよい。

【0090】

ＤＮＡターゲティング配列は、ターゲットＤＮＡ（またはターゲットＤＮＡの相補鎖）内の特定の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。言い換えると、ＤＮＡターゲティング配列は、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対形成）を通じて、配列特異的方式で、ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列と相互作用する。こうしたものとして、ＤＮＡターゲティング配列のヌクレオチド配列は、多様であることも可能であり、そしてこれは、対象のポリヌクレオチドおよびターゲットＤＮＡが相互作用するであろう、ターゲットＤＮＡ内の位置を決定する。ターゲットＤＮＡ内の任意の望ましい配列にハイブリダイズするように、ＤＮＡターゲティング配列を修飾するかまたは設計してもよい（例えば遺伝子操作によって）。特定の態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列は、相補鎖のＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列のすぐ３’であり、これは、５’−ＣＣＮ−３’であってもよく、式中、Ｎは任意のＤＮＡヌクレオチドである。すなわち、この態様において、ターゲットポリヌクレオチド配列の相補鎖は、５’−ＮＧＧ−３’、式中、Ｎは任意のＤＮＡ配列である、である、ＰＡＭ配列のすぐ５’である。関連する態様において、相補鎖のＰＡＭ配列は、野生型またはｄＣａｓ９にマッチする。化膿性連鎖球菌以外の種由来のＰＡＭ配列に関しては、上記を参照されたい。

【0091】

ＤＮＡターゲティング配列は、約１２ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することも可能である。例えば、ＤＮＡターゲティング配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、または約１２ｎｔ〜約１９ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、ＤＮＡターゲティング配列は、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約７０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約８０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約９０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約１００ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することも可能である。

【0092】

ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列のヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列は、少なくとも約１２ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約１８ｎｔ、少なくとも約１９ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約３５ｎｔまたは少なくとも約４０ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１２ｎｔ〜約２０ｎｔ、または約１２ｎｔ〜約１９ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約２５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約３５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約４５ｎｔ、約１９ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１９ｎｔ〜約６０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約４５ｎｔ、約２０ｎｔ〜約５０ｎｔ、または約２０ｎｔ〜約６０ｎｔの長さを有することも可能である。ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列のヌクレオチド配列は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することも可能である。

【0093】

いくつかの場合、ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列は、長さ２０ヌクレオチドである。いくつかの場合、ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列に相補的であるＤＮＡターゲティング配列は、長さ１９ヌクレオチドである。

【0094】

ＤＮＡターゲティング配列およびターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列の間の相補性パーセントは、少なくとも５０％（例えば少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）であってもよい。いくつかの場合、ＤＮＡターゲティング配列およびターゲットポリヌクレオチド配列の間の相補性パーセントは、ターゲットポリヌクレオチド配列の最も５’の７または８の隣接するヌクレオチドに渡って１００％である。いくつかの場合、ＤＮＡターゲティング配列およびターゲットポリヌクレオチド配列の間の相補性パーセントは、約２０の隣接ヌクレオチドに渡って、少なくとも６０％である。いくつかの場合、ＤＮＡターゲティング配列およびターゲットポリヌクレオチド配列の間の相補性パーセントは、ターゲットポリヌクレオチド配列の最も５’の７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の隣接するヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡターゲティング配列の最も３’の７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４の隣接するヌクレオチド）に渡って１００％であり、そして残りに渡って、０％と同程度に低い。こうした場合、ＤＮＡターゲティング配列は、それぞれ、長さ７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４ヌクレオチドと見なすことも可能である。

【0095】

ｂ． Ｃａｓ９結合配列
対象のポリヌクレオチドのタンパク質結合セグメントまたはタンパク質結合配列は、野生型Ｃａｓ９、あるいは減少したエンドヌクレアーゼ活性を持つかまたはエンドヌクレアーゼ活性を欠く修飾ｄＣａｓ９タンパク質（例えばニッカーゼまたはｄＣａｓ９）に結合する。単純化のため、野生型および／または修飾Ｃａｓ９タンパク質に結合可能である、対象のポリヌクレオチドのタンパク質結合配列は、本明細書において、単純に、「Ｃａｓ９結合配列」と称されうる。しかし、本発明のＣａｓ９結合配列がｄＣａｓ９に結合する際、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼへの結合は妨げられないことを理解すべきである。特定の態様において、本発明のＣａｓ９結合配列は、ｄＣａｓ９、ならびに野生型Ｃａｓ９および／またはＣａｓ９ニッカーゼに結合する。

【0096】

Ｃａｓ９結合配列は、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）と相互作用するかまたはこれに結合し、そしてともに、これらは、ＤＮＡターゲティング配列が認識するターゲットポリヌクレオチド配列に結合する。Ｃａｓ９結合配列は、互いにハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する、ヌクレオチドの２つの相補ストレッチを含む。ヌクレオチドのこれらの２つの相補ストレッチは、リンカーまたはリンカーヌクレオチドとして知られる介在ヌクレオチドによって共有結合され（例えば単一分子ポリヌクレオチドの場合）、そしてＣａｓ９結合配列の二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖、または「Ｃａｓ９結合ヘアピン」）を形成するようハイブリダイズし、こうしてステム・ループ構造を生じてもよい。あるいは、いくつかの態様において、ヌクレオチドの２つの相補ストレッチは、共有結合しておらず、その代わり、相補配列間のハイブリダイゼーションによってともに保持されてもよい（例えば本発明の２分子ポリヌクレオチドの場合）。

【0097】

Ｃａｓ９結合配列は、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、例えば約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、Ｃａｓ９結合配列は、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３７ｎｔ〜約４７ｎｔ（例えば４２ｎｔ）、または約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することも可能である。

【0098】

Ｃａｓ９結合配列のｄｓＲＮＡ二重鎖は、約６塩基対（ｂｐ）〜約５０ｂｐの長さを有することも可能である。例えば、Ｃａｓ９結合配列のｄｓＲＮＡ二重鎖は、約６ｂｐ〜約４０ｂｐ、約６ｂｐ〜約３０ｂｐ、約６ｂｐ〜約２５ｂｐ、約６ｂｐ〜約２０ｂｐ、約６ｂｐ〜約１５ｂｐ、約８ｂｐ〜約４０ｂｐ、約８ｂｐ〜約３０ｂｐ、約８ｂｐ〜約２５ｂｐ、約８ｂｐ〜約２０ｂｐまたは約８ｂｐ〜約１５ｂｐの長さを有することも可能である。例えば、Ｃａｓ９結合配列のｄｓＲＮＡ二重鎖は、約８ｂｐ〜約１０ｂｐ、約１０ｂｐ〜約１５ｂｐ、約１５ｂｐ〜約１８ｂｐ、約１８ｂｐ〜約２０ｂｐ、約２０ｂｐ〜約２５ｂｐ、約２５ｂｐ〜約３０ｂｐ、約３０ｂｐ〜約３５ｂｐ、約３５ｂｐ〜約４０ｂｐ、または約４０ｂｐ〜約５０ｂｐの長さを有することも可能である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９結合配列のｄｓＲＮＡ二重鎖は、３６塩基対の長さを有する。ハイブリダイズしてＣａｓ９結合配列のｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少なくとも約６０％であることも可能である。例えば、ハイブリダイズしてＣａｓ９結合配列のｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であることも可能である。いくつかの場合、ハイブリダイズしてＣａｓ９結合配列のｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチド配列間の相補性パーセントは１００％である。

【0099】

リンカーは、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することも可能である。例えば、リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約７０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約６０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約４０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約３０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔまたは約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１０ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、リンカーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することも可能である。いくつかの態様において、リンカーは、４ｎｔである。

【0100】

適切なＣａｓ９結合配列中に含まれてもよいヌクレオチド配列（すなわちＣａｓ９ハンドル）の限定されない例は、本明細書に援用されるＷＯ２０１３／１７６７７２の配列番号５６３〜６８２（例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２の図８および９を参照されたい）に示される。
いくつかの場合、適切なＣａｓ９結合配列は、上に列挙する任意の１つと１、２、３、４、または５ヌクレオチド異なるヌクレオチド配列を含む。

【0101】

ｃ． ＰＵＦドメイン結合配列（ＰＢＳ）
対象のポリヌクレオチドは、１またはそれより多いタンデム配列を含み、その各々は、特定のＰＵＦドメイン（以下）によって特異的に認識され、そして結合されてもよい。ＰＵＦドメインは、ＰＵＦドメインの個々のＰＵＦモチーフおよびこれらが認識する単一ＲＮＡヌクレオチドの間のヌクレオチド特異的相互作用に基づいて、実質的にいかなるＰＢＳにも結合するよう操作可能であるため、ＰＢＳ配列は、対応するＰＵＦドメインに結合する任意の設計配列であってもよい。

【0102】

特定の態様において、本発明のＰＢＳは８量体を有する。他の態様において、本発明のＰＢＳは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６またはそれより多いＲＮＡヌクレオチドを有する。

【0103】

特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＧＵＡＵＡＵＡ−３’を有し、そして野生型ヒトＰｕｍｉｌｉｏ １ ＰＵＦドメインに結合する。
特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ（３−２）に結合する。

【0104】

特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ（６−２／７−２）に結合する。
特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＧＧＡＵＡＵＡ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ（６−２）に結合する。

【0105】

特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＵＵＡＵＡＵＡ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ（７−２）に結合する。
特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＧＵＧＵＧＵＧ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ^５３１に結合する。

【0106】

特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＧＵＡＵＡＵＧ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ（１−１）に結合する。
特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＵＵＡＵＡＵＡ−３’または５’−ＵＡＵＡＵＡＵＡ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ（７−１）に結合する。

【0107】

特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＧＵＡＵＵＵＡ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ（３−１）に結合する。
特定の態様において、本発明のＰＢＳは、配列５’−ＵＵＵＡＵＵＵＡ−３’を有し、そしてＰＵＦドメインＰＵＦ（７−２／３−１）に結合する。

【0108】

本出願者は、６５，５３６の８量体ＰＢＳ、および特定のＰＢＳに結合可能な対応するＰＵＦドメイン配列（以下を参照されたい）を生成した。本出願者はまた、所定の８量体ＰＢＳに結合する６５，５３６の個々のＰＵＦドメイン配列のいずれかを回収するパイソンスクリプトも生成した。例えば、８量体ＵＵＧＡＵＧＵＡに関して、１つのありうるＰＵＦドメイン配列は、以下でありうる：

【0109】

【化1】

【0110】

特定の態様において、１またはそれより多いスペーサー領域は、２つの隣接するＰＢＳ配列を分離する。スペーサー領域は、約３ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチドの長さを有することも可能である。例えば、スペーサーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約９０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約７０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約６０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約５０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約４０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約３０ｎｔ、約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔまたは約３ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１０ｎｔの長さを有することも可能である。例えば、スペーサーは、約３ｎｔ〜約５ｎｔ、約５ｎｔ〜約１０ｎｔ、約１０ｎｔ〜約１５ｎｔ、約１５ｎｔ〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約２５ｎｔ、約２５ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約３５ｎｔ、約３５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの長さを有することも可能である。いくつかの態様において、スペーサーは、４ｎｔである。

【0111】

ｄ． 場合による他の配列
安定性調節配列（例えば転写ターミネーターセグメント）は、ＲＮＡ（例えば対象のポリヌクレオチド）の安定性に影響を及ぼす。適切な安定性調節配列の一例は、転写ターミネーターセグメント（すなわち転写終結配列）である。対象のポリヌクレオチドの転写ターミネーターセグメントは、約１０ヌクレオチド〜約１００ヌクレオチド、例えば約１０ヌクレオチド（ｎｔ）〜約２０ｎｔ、約２０ｎｔ〜約３０ｎｔ、約３０ｎｔ〜約４０ｎｔ、約４０ｎｔ〜約５０ｎｔ、約５０ｎｔ〜約６０ｎｔ、約６０ｎｔ〜約７０ｎｔ、約７０ｎｔ〜約８０ｎｔ、約８０ｎｔ〜約９０ｎｔ、または約９０ｎｔ〜約１００ｎｔの全長を有することも可能である。例えば、転写ターミネーターセグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）〜約８０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約５０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約４０ｎｔ、約１５ｎｔ〜約３０ｎｔまたは約１５ｎｔ〜約２５ｎｔの長さを有することも可能である。

【0112】

いくつかの場合、転写終結配列は、真核細胞において機能するものである。いくつかの場合、転写終結配列は、原核細胞において機能するものである。
安定性調節配列中（例えば転写終結セグメント、または安定性増加を提供する、ＤＮＡターゲティングＲＮＡの任意のセグメント中）に含まれることが可能なヌクレオチド配列の限定されない例には、ＷＯ ２０１３／１７６７７２（本明細書に援用される）の配列番号６８３〜６９６に示される配列が含まれる。例えば、ＷＯ ２０１３／１７６７７２の配列番号７９５、Ｒｈｏ独立性転写終結部位を参照されたい。

【0113】

安定性調節配列は、Ｃａｓ９結合配列の後に、例えばＣａｓ９結合配列および最初のＰＢＳの間、２つの隣接するＰＢＳの間、または最後のＰＢＳの後に配置されてもよい。
いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドまたはその一部（例えばＤＮＡターゲティング配列、Ｃａｓ９結合配列、および／または１またはそれより多いＰＢＳ）、またはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、またはＰＵＦドメイン融合体（以下）の１つをコードするポリヌクレオチドは、さらなる望ましい特徴、例えば修飾されたまたは制御された安定性；細胞内ターゲティング；追跡用、例えば蛍光標識；タンパク質またはタンパク質複合体のための結合部位などを提供する、修飾または配列を含んでもよい。

【0114】

限定されない例には：５’キャップ（例えば７−メチルグアニル酸キャップ（ｍ^７Ｇ））；３’ポリアデニル化テール（すなわち３’ポリ（Ａ）テール）；リボスイッチ配列またはアプタマー配列（例えば制御された安定性および／またはタンパク質およびタンパク質複合体による制御されたアクセス可能性を可能にするもの）；ターミネーター配列；ｄｓＲＮＡ二重鎖（すなわちヘアピン）を形成する配列；ＲＮＡを細胞内位置（例えば核、ミトコンドリア、葉緑体等）にターゲティングする修飾または配列；追跡を提供する修飾または配列（例えば蛍光分子への直接コンジュゲート化、蛍光検出を促進する部分へのコンジュゲート化、蛍光検出を可能にする配列等）；タンパク質に対する結合部位を提供する修飾または配列（例えばＤＮＡに作用するタンパク質、転写アクチベーター、転写リプレッサー、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素等）；増加した、減少した、および／または調節可能な安定性を提供する修飾または配列；ならびにその組み合わせが含まれる。

【0115】

３． Ｃａｓ９タンパク質（野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９）
本発明のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）は：ｉ）対象のポリヌクレオチドのＣａｓ９結合配列と相互作用するＲＮＡ結合部分、およびｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質の同一性に応じて、野生型、減少したエンドヌクレアーゼ（例えばエンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を示すか、エンドヌクレアーゼ（例えばエンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を欠く、活性部分を含む。

【0116】

ポリヌクレオチドのＣａｓ９結合配列およびＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）は、ＤＮＡターゲティング配列およびターゲットポリヌクレオチド配列の間の配列相補性に基づいて、特定のターゲットポリヌクレオチド配列に結合する複合体を形成可能である。対象のポリヌクレオチドのＤＮＡターゲティング配列は、ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列に対する配列相補性を通じて、複合体へのターゲット特異性を提供する。ターゲットポリヌクレオチド配列が、ターゲット遺伝子の転写制御要素またはエピジェネティック修飾部位にあるかまたはこれに隣接している場合、複合体は、ＰＢＳ結合ＰＵＦドメインに融合した転写制御因子またはエピジェネティック修飾を調節するエフェクターとともに、ターゲット遺伝子の転写またはエピジェネティック修飾を選択的に調節可能である。

【0117】

特定の態様において、修飾Ｃａｓ９タンパク質は、減少したエンドヌクレアーゼ（例えばエンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を有するか、または該活性を欠く。例えば、本発明の方法で使用するのに適した修飾Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼであってもよいし、または野生型Ｃａｓ９ポリペプチド、例えばＷＯ２０１３／１７６７７２（本明細書に援用される）の図３および配列番号８に示されるようなアミノ酸配列を含む野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのエンドヌクレアーゼ（例えばエンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性の約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満を示す。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、実質的に、検出可能なエンドヌクレアーゼ（例えばエンドデオキシリボヌクレアーゼ）活性を持たない。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９が減少した触媒活性を有する場合（例えばＣａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７突然変異、例えばＤ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、および／またはＤ９８６Ａを有する場合）、対象のポリヌクレオチドのＣａｓ９結合配列と相互作用する能力を保持する限り、対象のポリヌクレオチドのＤＮＡターゲティング配列によって、ターゲットポリヌクレオチド配列になお導かれるため、ポリペプチドは、なお、部位特異的方式でターゲットＤＮＡに結合可能である。

【0118】

いくつかの場合、適切なＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）は、ＷＯ２０１３／１７６７７２（本明細書に援用される）の図３および配列番号８に示されるようなＣａｓ９／Ｃｓｎｌアミノ酸配列（化膿性連鎖球菌の）のアミノ酸７〜１６６または７３１〜１００３に対して、あるいはＷＯ２０１３／１７６７７２（本明細書に援用される）の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６のアミノ酸配列の任意の１つの対応する部分に対して、好ましくは、化膿性連鎖球菌、淋菌（N. meningitidis）、Ｓ．サーモフィルス（S. thermophilus）およびＴ．デンティコラ（T. denticola）（本明細書に援用されるEsveltら， Nature Methods, 10(11): 1116-1121, 2013を参照されたい）由来の直交性Ｃａｓ９配列のアミノ酸配列の任意の１つの対応する部分に対して、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0119】

いくつかの場合、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ターゲットＤＮＡの相補鎖を切断可能であるが、ターゲットＤＮＡの非相補鎖を切断する能力が減少している。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＲｕｖＣドメインの機能を減少させる突然変異（アミノ酸置換）を有しうる。限定されない例として、いくつかの場合、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＷＯ ２０１３／１７６７７２の図３に示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ（アスパラギン酸からアラニン）突然変異、またはＷＯ ２０１３／１７６７７２の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に示すアミノ酸配列のいずれかの対応する突然変異（こうした配列のすべては本明細書に援用される）である。

【0120】

いくつかの場合、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ターゲットＤＮＡの非相補鎖を切断可能であるが、ターゲットＤＮＡの相補鎖を切断する能力が減少している。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、ＨＮＨドメイン（ＲｕｖＣ／ＨＮＨ／ＲｕｖＣドメインモチーフ）の機能を減少させる突然変異（アミノ酸置換）を有しうる。限定されない例として、いくつかの場合、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｈ８４０Ａ（本明細書に援用されるＷＯ ２０１３／１７６７７２の図８のアミノ酸位８４０でのヒスチジンからアラニン）、またはＷＯ ２０１３／１７６７７２の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する突然変異（こうした配列のすべては本明細書に援用される）である。

【0121】

いくつかの場合、ｄＣａｓ９は、ターゲットＤＮＡの相補鎖および非相補鎖の両方を切断する能力が減少している。限定されない例として、いくつかの場合、ｄＣａｓ９は、ＷＯ ２０１３／１７６７７２の図３に示されるアミノ酸配列のＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ突然変異の両方、またはＷＯ ２０１３／１７６７７２の配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６に示されるアミノ酸配列のいずれかの対応する突然変異（こうした配列のすべては本明細書に援用される）を宿する。

【0122】

他の残基を突然変異させて、同じ効果を達成する（すなわち一方または他方のヌクレアーゼ部分を不活性化する）ことも可能である。限定されない例として、残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、および／またはＡ９８７（または配列番号１〜２５６および７９５〜１３４６として示されるタンパク質セットのいずれかの対応する突然変異）が改変される（すなわち置換される）ことも可能である（Ｃａｓ９アミノ酸残基の変換に関するさらなる情報に関しては、ＷＯ ２０１３／１７６７７２の図３、５、１１Ａおよび表１（すべて本明細書に援用される）を参照されたい）。また、アラニン置換以外の突然変異が適切である。

【0123】

いくつかの場合、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）は、場合によって：ｉ）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）；およびｂ）ＰＵＦドメイン（以下）に融合した融合パートナーと同じであっても異なっていてもよい、共有結合した異種ポリペプチド（また「融合パートナー」とも称される）を含む、融合ポリペプチドである。

【0124】

４． ＰＵＦドメイン（および場合によるＣａｓ９）融合タンパク質
ＰＵＦタンパク質（ショウジョウバエ属（Drosophila）Ｐｕｍｉｌｉｏおよび線虫（C. elegans）ｆｅｒｎ−３結合因子にちなんで名付けられた）は、ｍＲＮＡ安定性および翻訳を仲介する際に関与することが知られる。これらのタンパク質は、ＰＵＦドメインとして知られるユニークなＲＮＡ結合ドメインを含有する。ＲＮＡ結合ＰＵＦドメイン、例えばヒトＰｕｍｉｌｉｏ １タンパク質（本明細書においてＰＵＭとも称される）のものは、逆平行様式で、連続塩基に結合する８リピート（各リピートはＰＵＦモチーフまたはＰＵＦリピートと呼ばれる）を含有し、各リピートは一塩基を認識し、すなわちＰＵＦリピートＲ１〜Ｒ８は、それぞれ、ヌクレオチドＮ８〜Ｎ１を認識する。例えば、ＰＵＭは８つのタンデムリピートで構成され、各リピートは、アルファらせんを構成する緊密にパッキングされたドメインにフォールディングする、３４アミノ酸からなる。

【0125】

各ＰＵＦリピートは、各リピート中央から２つの保存されるアミノ酸を用いて、ＲＮＡ認識配列内の１つの個々の塩基のエッジを特異的に認識し、そして第三のアミノ酸（Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＡｒｇ）を用いて、隣接塩基間にスタッキングして、ＰＵＦドメインおよび８量体ＲＮＡの間に非常に特異的な結合を引き起こす。例えば、塩基Ｕを認識するコードは、アミノ酸配列「ＮＹｘｘＱ」であり、一方「（Ｃ／Ｓ）ＲｘｘＱ」はＡを認識し、そして「ＳＮｘｘＥ」はＧを認識する。これらのアミノ酸は、ヒトＰｕｍｉｌｉｏ １ ＰＵＦモチーフ中の１２、１３、および１６位に対応する。各ＰＵＦ α−α−αリピート中の１２および１６位の２つの認識アミノ酸側鎖は、対応する塩基のワトソン・クリック・エッジを認識し、そしてそのリピートの特異性を大部分決定する。

【0126】

したがって、ＰＵＦドメインの配列特異性は、ＲＮＡ認識配列内の塩基認識に関与する、保存されたアミノ酸を変化させる（例えば部位特異的突然変異誘発によって）ことによって、正確に改変させることも可能である。各リピート中の２つのアミノ酸を変化させることによって、ＰＵＦドメインを修飾して、ほぼいかなる８ｎｔ ＲＮＡ配列に結合するように修飾することも可能である。このユニークな結合様式は、ＰＵＦおよびその誘導体を、対象のポリヌクレオチド上の特定のＰＢＳに任意のエフェクタードメインを運ぶ、ＰＵＦドメイン融合体の一部として、本発明で使用可能なプログラム可能ＲＮＡ結合ドメインにする。

【0127】

本明細書において、「ＰＵＦドメイン」は、野生型または天然存在ＰＵＦドメイン、ならびに天然または現存ＰＵＦドメイン、例えば原型ヒトＰｕｍｉｌｉｏ １ ＰＵＦドメインに基づく／由来するＰＵＦ相同ドメインを指す。本発明のＰＵＦドメインは、ＲＮＡ配列（例えば８量体ＲＮＡ配列）に特異的に結合し、ここで、ＰＵＦドメインおよびＲＮＡ配列間の全体の結合特異性は、ＰＵＦドメイン内の各ＰＵＦモチーフ／ＰＵＦリピートおよび対応する単一ＲＮＡヌクレオチドの間の配列特異的結合によって定義される。

【0128】

特定の態様において、ＰＵＦドメインは、８ ＰＵＦモチーフを含むか、または本質的に該モチーフからなり、各々は、１つのＲＮＡヌクレオチド（例えばＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣ）を特異的に認識し、そしてこれに結合する。

【0129】

本出願者は、６５，５３６の８量体ＰＢＳ、および特定のＰＢＳに結合可能な対応するＰＵＦドメイン配列（各々長さ約３５０アミノ酸）を生成した。本出願者はまた、所定の８量体ＰＢＳに結合する６５，５３６の個々のＰＵＦドメイン配列のいずれかを回収するパイソンスクリプトも生成した。

【0130】

特定の態様において、ＰＵＦドメインは、８より多いまたは少ないＰＵＦモチーフ／リピートを有し、例えばＰＵＦドメインは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれより多いＰＵＦリピート／モチーフを含むかまたは本質的にこれらからなり、ＰＵＦドメインが、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、またはそれより多いヌクレオチドのＲＮＡに結合する限り、各々は、１つのＲＮＡヌクレオチド（例えばＡ、Ｕ、Ｇ、またはＣ）を特異的に認識し、そしてこれに結合する。ＰＵＦモチーフの数を増加させるかまたは減少させることによって、認識されるＲＮＡの長さは、対応して増加するかまたは減少するであろう。各ＰＵＦモチーフは１つのＲＮＡ塩基を認識するため、ドメインを１モチーフ減少させると、認識されるＲＮＡの長さが１塩基減少し；一方、ドメインを１モチーフ増加させると、認識されるＲＮＡの長さが１塩基増加する。任意の数のモチーフが存在可能である。したがって、こうした態様において、本発明のＰＵＦドメイン融合体の特異性は、ＰＵＦドメインの長さの変化によって改変されうる。特定の態様において、元来のＰＵＦモチーフのうち２つの間に、例えば第一のものの前に、第一のものおよび第二のものの間に、第二のものおよび第三のものの間に、第三のものおよび第四のものの間に、第四のものおよび第五のものの間に、第五のものおよび第六のものの間に、第六のものおよび第七のものの間に、第七のものおよび第八のものの間に、または第八のものの後に、さらなるＰＵＦモチーフを挿入する。特定の態様において、上記挿入ポイントのいずれかの間に、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多くの挿入されたＰＵＦモチーフがある。例えば、特定の態様において、第五および第六の元来のＰＵＦモチーフの間に、１、２、３、４、５、６、７、８、またはそれより多くの挿入されたＰＵＦモチーフがある。Ｆｉｌｉｐｏｖｓｋａら（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｄｏｉ： １０．１０３８／ＮＣｈｅｍＢｉｏ．５７７， オンライン公開：２０１１年５月１１日）は、１６のＰＵＦモチーフを含む操作されたＰＵＦドメインを報告し、これには、第五および第六の元来のＰＵＦモチーフの間に挿入された８つのさらなるＰＵＦモチーフが含まれた。

【0131】

特定の態様において、ＰＵＦドメインは、異なるタンパク質由来の異なるＰＵＦドメイン由来のＰＵＦモチーフを含む。例えば、本発明のＰＵＦドメインは、ヒトＰｕｍｉｌｉｏ １タンパク質由来のＰＵＦモチーフ、および１またはそれより多い他のＰＵＦタンパク質、例えばＰｕＤｐまたはＦＢＦに由来する１またはそれより多い他のＰＵＦで構築されてもよい。ＰＵＦドメインのＲＮＡ結合ポケットは、天然のへこんだ屈曲を有する。異なるＰＵＦタンパク質は異なる屈曲を有することも可能であるため、ＰＵＦドメイン中の異なるＰＵＦモチーフを用いて、ＰＵＦドメインの屈曲を改変することも可能である。より平らな屈曲は、より多くのＲＮＡ塩基の認識を可能にしうるため、屈曲の改変は、ＰＵＦドメインの特異性および／または結合アフィニティを改変するための別の方法である。

【0132】

本発明の範囲にやはり含まれるのは、対象のＰＵＦドメインまたはその融合体の機能的変異体である。用語「機能的変異体」は、本明細書において、親ＰＵＦドメインに対する実質的なまたは有意な配列同一性または類似性を有するＰＵＦドメインを指し、この機能的変異体は、これが変異体であるＰＵＦドメインの生物学的活性を保持する、例えばターゲットＲＮＡを認識する能力を、結合アフィニティに関して、親ＰＵＦドメインと、類似の度合い、同じ度合い、またはより高い度合いまで、そして／または実質的に同じまたは同一の結合特異性で、保持するものである。機能的変異体ＰＵＦドメインは、例えば、親ＰＵＦドメインに対して、アミノ酸配列において、少なくとも約３０％、５０％、７５％、８０％、９０％、９８％またはそれより高く同一であることも可能である。機能的変異体は、例えば、少なくとも１つの保存的アミノ酸置換、例えばＰＵＦドメインの足場（すなわちＲＮＡと相互作用しないアミノ酸）における保存的アミノ酸置換を含み、親ＰＵＦドメインのアミノ酸配列を含む。あるいはまたはさらに、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を含み、親ＰＵＦドメインのアミノ酸配列を含むことも可能である。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性に干渉しないかまたはこれを阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性が親ＰＵＦドメインに比較した際に増加するように、機能的変異体の生物学的活性を増進させてもよいし、または、ＰＵＦドメインの安定性を望ましいレベルに（例えば足場中のアミノ酸の置換により）改変してもよい。ＰＵＦドメインは、他の構成要素、例えば他のアミノ酸が機能的変異体の生物学的活性を実質的に改変しないように、特定のアミノ酸配列または本明細書記載の配列から本質的になることも可能である。

【0133】

特定の態様において、ＰＵＦドメインは、Ｐｕｍｉｌｉｏ相同ドメイン（ＰＵ−ＨＵＤ）である。特定の態様において、ＰＵ−ＨＵＤはヒトＰｕｍｉｌｉｏ １ドメインである。ヒトＰＵＭの配列は、当該技術分野に知られ、そして以下に再現される：

【0134】

【化2】

【0135】

野生型ヒトＰＵＭは、Ｎｏｎａｓ反応要素（ＮＲＥ）ＲＮＡに特異的に結合し、コア８ｎｔ配列５’−ＵＧＵＡＵＡＵＡ−３’を所持する。
特定の態様において、本発明のＰＵＦドメインは、Ｐｕｍ−ＨＤドメインを含む任意のＰＵＦタンパク質ファミリーメンバーである。ＰＵＦファミリーメンバーの限定されない例には、線虫におけるＦＢＦ、ショウジョウバエ属におけるＤｓ ｐｕｍ、およびシロイヌナズナ属（Arabidopsis）およびイネ（rice）などの植物におけるＰＵＦタンパク質が含まれる。シロイヌナズナ属、イネおよび他の植物、ならびに非植物種のＰＵＭ−ＨＤの系統樹が、Ｔａｍら（その全内容が本明細書に援用される、「植物におけるＲＮＡ結合タンパク質のＰｕｆファミリー：系統樹、構造モデリング、活性および細胞内局在」BMC Plant Biol. 10:44, 2010）に提供される。

【0136】

ＰＵＦファミリーメンバーは、酵母からヒトまで非常に保存されており、そしてファミリーのすべてのメンバーが、予測可能なコードで、配列特異的方式で、ＲＮＡに結合する。該ドメインの寄託番号は、Ｐｒｏｓｉｔｅデータベース（スイス・バイオインフォマティクス研究所）において、ＰＳ５０３０２であり、そしてこのファミリーのメンバーのいくつかの配列整列は、ＷＯ ２０１１−１６００５２ Ａ２の図５および６に示される（それぞれ、ヒト、マウス、ラットＰｕｍｉｌｉｏ １（ｈｐｕｍ１、Ｍｐｕｍ１、Ｒａｔｐｕｍ１）ならびにヒトおよびマウスＰｕｍｉｌｉｏ ２（ｈｐｕｍ２、Ｍｐｕｍ２）のＣｌｕｓｔａｌＷ多数配列整列）。

【0137】

ショウジョウバエ属Ｐｕｍｉｌｉｏ（ＰｕｍＤｒ）は、他の哺乳動物Ｐｕｍｉｌｉｏ １相同体と長さが非常に異なり、したがって、Ｃ末端ＰＵＦ ＨＵＤドメインのみが、ＷＯ ２０１１／１６００５２Ａ２の図６において、ヒトＰＵＭ１およびＰＵＭ２との配列整列中に示される。ヒトおよびハエＰｕｍタンパク質のＮ末端部分は、弱い相同性（４０％類似性）を示し、そしてサイズおよびタンパク質配列が有意に異なる。Ｃ末端部分は、非常に高い度合いの相同性および進化的保存（ＰＵＭ１に関して７８％同一性、８６％類似性、そしてＰＵＭ２に関して７９％同一性、８８％類似性）、非常に保存されたタンパク質配列およびＰｕｍ ＲＮＡ結合ドメインの構造とともに示す。３つのタンパク質すべてにおいて、ＰＵＭ−ＨＤは、２０アミノ酸のＮ末端保存部分、各３６アミノ酸の８つのＰｕｍリピート、およびＣ末端保存領域で構成される。ヒトＰｕｍｉｌｉｏタンパク質において、Ｃ保存部分は、長さ４４アミノ酸である一方、ショウジョウバエ属のタンパク質は、Ｃ保存領域中にさらなる８５アミノ酸の挿入物を有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、寄託番号ＡＦ３１５５９２（ＰＵＭ１）およびＡＦ３１５５９１（ＰＵＭ２）の下に、ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）データベース中に見出されうる（刊行物および配列の各々の全内容が本明細書に援用される、Spassov ＆ Jurecic，「ＲＮＡ結合タンパク質のＰｕｍｉｌｉｏファミリーのヒトメンバー、ＰＵＭ１およびＰＵＭ２遺伝子のクローニングおよび比較配列分析」 Gene, 299:195-204， ２００２年１０月）。

【0138】

さらに、すべての整列配列、すなわちＷＯ ２０１１／１６００５２Ａ２の配列番号５５〜６０は本明細書に援用される。
いくつかの態様において、本発明のＰＵＦドメインは、８つの３６量体で作製されてもよく、ここで、アミノ酸の３３が保存され、そして３４番目、３５番目、および３６番目のアミノ酸は多様である可能性もあり、ＲＮＡ配列中の特定の塩基に対する特異性を分け与える。特定の態様において、ＲＮＡ結合ドメインは、長さ約３００（例えば３１０、３０９、３０８、３０７、３０６、３０５、３０４、３０３、３０２、３０１、３００、２９９、２９８、２９７、２９６、２９５、２９４、２９３、２９２、２９１、２９０等）アミノ酸である。いくつかの態様において、本発明のＰＵＦドメインは、約８ヌクレオチドの特定のＲＮＡ配列（例えば８〜１６の連続ＲＮＡ塩基）に結合するよう設計されている。特定の態様において、８ｎｔ配列の５番目のヌクレオチドは、ＵまたはＣであり、一方、他の７ヌクレオチドは多様であってもよい。

【0139】

いくつかの態様において、ＰＵＦドメインは、野生型ＰＵＦドメインから修飾されて、非修飾（すなわち野生型）ＲＮＡ結合ＰＵＦドメインが結合するＲＮＡ配列とは異なるＲＮＡ配列に結合する。ＲＮＡ配列は、約８量体（例えば８量体、９量体、１０量体、１１量体、１２量体、１３量体、１４量体、１５量体、１６量体等）であってもよい。ＲＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列に、ターゲットＲＮＡ配列に対する特異性を改変する修飾を導入する能力は、ＲＮＡ結合ドメイン（例えばＰＵＦタンパク質）の異なるアミノ酸側鎖との塩基の既知の相互作用に基づく。ＰＵＦドメインのＲＮＡ認識コードを以下に示し、これは一般的に以下のように書くことが可能である：
Ｇ（グアニン）に対して、ＳｅｒＸＸＸＧｌｕ、例えばＳＮｘｘＥ；
Ａ（アデニン）に対して、ＣｙｓＸＸＸＧｌｎ、例えばＣｙｓＡｒｇＸＸＧｌｎまたはＳｅｒＡｒｇＸＸＧｌｎ（すなわち（Ｃ／Ｓ）ＲｘｘＱ）；
Ｕ（ウラシル）に対して、ＡｓｎＸＸＸＧｌｎ、例えばＮＹｘｘＱ、および
Ｃ（シトシン）に対して、ＳｎＸＸＸＡｒｇ、例えばＳｅｒＴｙｒＸＸＡｒｇ。
式中、Ｘは任意のアミノ酸であり、そしてＳｎは、小分子または求核性残基、例えばＧｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、またはＣｙｓに相当する。

【0140】

上記指針に基づき、少なくとも１つのＰＵＦドメインを、任意の所定の８量体配列に基づいて構築してもよい。特に、５’−Ｎ_１Ｎ_２Ｎ_３Ｎ_４Ｎ_５Ｎ_６Ｎ_７Ｎ_８−３’の８量体ＲＮＡ配列に結合するＰＵＦドメインは、以下の配列式を有してもよく、式中、Ｒ１〜Ｒ８は各々、Ｎ_１〜Ｎ_８位のいずれかでのリボヌクレオチド（すなわちＡ、Ｕ、ＣまたはＧ）の特定の同一性に応じて、以下の表に列挙するＰＵＦモチーフペプチド配列を示す。Ｒ１がＮ_８に結合し、Ｒ２がＮ_７に結合する等であることに注目されたい。

【0141】

【化3】

【0142】

【表2】

【0143】

【表3】

【0144】

【表4】

【0145】

【表5】

【0146】

【表6】

【0147】

【表7】

【0148】

【表8】

【0149】

【表9】

【0150】

上記ＲＮＡ認識コードに基づいて構築された、修飾ＲＮＡ結合特異性を持ついくつかの例示的なＰＵＦドメインを以下に提供し、各々は、本発明のＰＵＦドメイン融合体を構築するために使用可能である。

【0151】

【化4】

【0152】

ＰＵＦ（３−２）は、ＰＵＦリピート３中に２つの点突然変異（Ｃ９３５Ｓ／Ｑ９３９Ｅ）を有し、そしてＮＲＥの６位に突然変異を含む同族ＲＮＡ（Ａ６Ｇ；５’−ＵＧＵＡＵＧＵＡ−３’）を認識する。

【0153】

【化5】

【0154】

ＰＵＦ（６−２／７−２）は、それぞれリピート６および７中に二重点突然変異（Ｎ１０４３Ｓ／Ｑ１０４７ＥおよびＳ１０７９Ｎ／Ｅ１０８３Ｑ）を有し、そしてＮＲＥの２位および３位に２つの突然変異を含む同族ＲＮＡ配列（ＧＵ／ＵＧ；５’−ＵＵＧＡＵＡＵＡ−３’）を認識する。

【0155】

関連するＰＵＦ（６−２）は、リピート６中に点突然変異（Ｎ１０４３Ｓ／Ｑ１０４７Ｅ）を有し、そしてＮＲＥの３位に突然変異を含む同族ＲＮＡ配列（５’−ＵＧＧＡＵＡＵＡ−３’）を認識する。

【0156】

別の関連するＰＵＦ（７−２）は、リピート７中に点突然変異（Ｓ１０７９Ｎ／Ｅ１０８３Ｑ）を有し、そしてＮＲＥの２位に突然変異を含む同族ＲＮＡ配列（５’−ＵＵＵＡＵＡＵＡ−３’）を認識する。

【0157】

【化6】

【0158】

ＰＵＦドメインＰＵＦ^５３１は、野生型ＰＵＦリピート１、３および５中に突然変異（Ｑ８６７Ｅ／Ｑ９３９Ｅ／Ｃ９３５Ｓ／Ｑ１０１１Ｅ／Ｃ１００７Ｓ）を有し、そして配列５’−ＵＧＵＧＵＧＵＧ−３’を認識する。ＰＵＦ^５３１は、野生型ＰＵＦ ＲＮＡに比較して、非常に高いアフィニティでその新規ターゲット配列を認識可能である。

【0159】

別の修飾ＰＵＦドメインＰＵＦ（１−１）は、ＰＵＦリピート１中に１つの点突然変異（Ｑ８６７Ｅ）を有し、そしてＮＲＥの８位に突然変異を含む同族ＲＮＡ（Ａ８Ｇ；５’−ＵＧＵＡＵＡＵＧ−３’）を認識する。

【0160】

さらに別の修飾ＰＵＦドメインＰＵＦ（７−１）は、ＰＵＦリピート７中に１つの点突然変異（Ｅ１０８３Ｑ）を有し、そしてＮＲＥの２位に突然変異を含む同族ＲＮＡ（Ｇ２Ｕ；５’−ＵＵＵＡＵＡＵＡ−３’；またはＧ２Ａ；５’−ＵＡＵＡＵＡＵＡ−３’）を認識する。

【0161】

さらに別の修飾ＰＵＦドメインＰＵＦ（３−１）は、ＰＵＦリピート３中に１つの点突然変異（Ｃ９３５Ｎ）を有し、そしてＮＲＥの６位に突然変異を含む同族ＲＮＡ（Ａ６Ｕ；５’−ＵＧＵＡＵＵＵＡ−３’）を認識する。

【0162】

さらなる修飾ＰＵＦ（７−２／３−１）は、リピート７および３中に点突然変異（Ｃ９３５Ｎ／Ｓ１０７９Ｎ／Ｅ１０８３Ｑ）を有し、そしてＮＲＥの２位および６位に突然変異を含む同族ＲＮＡ配列（５’−ＵＵＵＡＵＵＵＡ−３’）を認識する。

【0163】

特定の修飾ＰＵＦドメインの配列を以下に示す。

【0164】

【化7-1】

【0165】

【化7-2】

【0166】

【化7-3】

【0167】

本発明にしたがって、異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも称される）を、対象のポリヌクレオチド上のＰＢＳの少なくとも１つに結合する、本発明のＰＵＦドメインに融合させてもよい。さらに、望ましい場合、同じまたは異なる融合パートナーをまた、場合によってＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合させてもよい。したがって、本明細書に記載するように、特に否定しない限り、任意の融合パートナーがＰＵＦドメインに融合するよう意図され、そして場合によってまた、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合するよう意図される。ＰＵＦドメインに融合する融合パートナーは、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）に融合する場合による融合パートナーと同じであってもまたは異なってもよい（以下）。

【0168】

融合パートナーは、活性（例えば酵素活性）を示してもよい。適切な融合パートナーには、限定されるわけではないが、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性が含まれ、これらのいずれもＤＮＡの直接修飾に向けられる（例えばＤＮＡのメチル化）ことも可能であるし、またはＤＮＡ会合ポリペプチド（例えばヒストンまたはＤＮＡ結合タンパク質）の修飾に向けられることも可能である。

【0169】

【表10-1】

【0170】

【表10-2】

【0171】

【表10-3】

【0172】

さらなる融合パートナーには、多様な蛍光タンパク質、ポリペプチド、変異体、またはその機能性ドメイン、例えばＧＦＰ、スーパーフォルダーＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１、ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、ＹＦＰ、シトリン、ヴェヌス、Ｙｐｅｔ、ＢＦＰｍｓ１、ｒｏＧＦＰ、およびビリルビン誘導性蛍光タンパク質、例えばＵｎａＧ、ｄｓレッド、ｅｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、ＩｒｉｓＦＰ等が含まれてもよい。

【0173】

さらなる適切な融合パートナーには、限定されるわけではないが、境界要素（例えばＣＴＣＦ）、末梢補充を提供するタンパク質およびその断片（例えばラミンＡ、ラミンＢ等）、ならびにタンパク質ドッキング要素（例えばＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌｌ／Ａｂｙｌ等）が含まれる。

【0174】

転写の増加または減少を達成する融合パートナーのさらなる限定されない例を、以下に列挙し、そしてこれには、転写アクチベーターおよび転写リプレッサードメイン（例えばＫｒｕｐｐｅｌ会合ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）等）が含まれる。

【0175】

いくつかの態様において、異種配列をＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）のＣ末端に融合させてもよい。いくつかの態様において、異種配列をＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）のＮ末端に融合させてもよい。いくつかの態様において、異種配列をＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）の内部部分（すなわちＮまたはＣ末端以外の部分）に融合させてもよい。

【0176】

いくつかの態様において、ＰＵＦドメイン融合体は、ＰＵＦドメインと、細胞内局在を提供する異種配列を融合させることによって生成される（すなわち異種配列は細胞内局在化配列、例えば核にターゲティングするための核局在化シグナル（ＮＬＳ、例えばＰＰＫＫＫＲＫＶ）；ミトコンドリアにターゲティングするためのミトコンドリア局在化シグナル；葉緑体にターゲティングするための葉緑体局在化シグナル；ＥＲ保持シグナル等である）。いくつかの態様において、異種配列は、追跡および／または精製を容易にするためのタグ（例えば蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；ヒスチジンタグ、例えば６ｘＨｉｓタグ；赤血球凝集素（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ等）である（すなわち異種配列は検出可能標識である）。いくつかの態様において、異種配列は、安定性増加または減少を提供しうる（すなわち、異種配列は、安定性調節ペプチド、例えばいくつかの場合調節可能であるデグロン（例えば温度感受性または薬剤調節可能デグロン配列、以下を参照されたい）である）。いくつかの態様において、異種配列は、ターゲットＤＮＡの増加したまたは減少した転写を提供可能である（すなわち異種配列は、転写調節配列、例えば転写因子／アクチベーターまたはその断片、転写因子／アクチベーターを補充するタンパク質またはその断片、転写リプレッサーまたはその断片、転写リプレッサーを補充するタンパク質またはその断片、小分子／薬剤反応性転写制御因子等である）。いくつかの態様において、異種配列は、結合ドメインを提供可能である（すなわち異種配列は、例えばキメラＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）が関心対象の別のタンパク質、例えばＤＮＡまたはヒストン修飾タンパク質、転写因子または転写リプレッサー、補充タンパク質等に結合する能力を提供するタンパク質結合配列である）。

【0177】

増加したまたは減少した安定性を提供する適切な融合パートナーには、限定されるわけではないが、デグロン配列が含まれる。デグロンは、一般の当業者には、それらがその一部であるタンパク質の安定性を調節するアミノ酸配列であることが容易に理解される。例えば、デグロン配列を含むタンパク質の安定性は、少なくとも部分的に，デグロン配列によって調節される。いくつかの場合、適切なデグロンは、デグロンが、実験調節とは独立にタンパク質安定性に影響を発揮するように、恒常的である（すなわち、デグロンは薬剤誘導性、温度誘導性等ではない）。いくつかの場合、ＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）が、望ましい条件に応じて、「オン」（すなわち安定）または「オフ」（すなわち不安定、分解される）になるょうに、デグロンは、ＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）に調節可能安定性を提供する。例えば、デグロンが温度感受性デグロンである場合、ＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）は、閾値温度（例えば４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃等）未満で機能性（すなわち「オン」、安定性）であることが可能であるが、閾値温度より高いと非機能性（すなわち「オフ」、分解される）になる。別の例として、デグロンが薬剤誘導性デグロンである場合、薬剤の存在または非存在が、タンパク質を、「オフ」（すなわち不安定）状態から「オン」（すなわち安定）状態にスイッチするかまたはその逆を行うことも可能である。例示的な薬剤誘導性デグロンは、ＦＫＢＰ１２タンパク質に由来する。デグロンの安定性は、デグロンに結合する小分子の存在または非存在によって調節される。

【0178】

適切なデグロンの例には、限定されるわけではないが、Ｓｈｉｅｌｄ−１、ＤＨＦＲ、オーキシン、および／または温度によって調節されるデグロンが含まれる。適切なデグロンの限定されない例が当該技術分野に知られる（例えばDohmenら， Science, 263(5151): 1273-1276, 1994：「熱誘導性デグロン：温度感受性突然変異体を構築するための方法」； Schoeberら， Am. J. Physiol. Renal. Physiol., 296(l):F204-211, 2009：「Ｓｈｉｅｌｄ−１を用いた、多量体ＴＲＰＶ５チャネルの条件付迅速発現および機能」； Chuら， Bioorg. Med. Chem. Lett., 18(22): 5941-4, 2008：「ＦＫＢＰ由来脱安定化ドメインを用いた、最近の進歩」； Kanemaki, Pflugers Arch., 2012：「条件付デグロンを用いたタンパク質発現調節のフロンティア」； Yangら， Mol. Cell., 48(4):487-8, 2012：「破壊のための装飾（titivated）：メチルデグロン」； Barbourら， Biosci. Rep., 33(1), 2013：「チミジル酸シンターゼのユビキチン独立分解を制御する二分デグロンの性質決定」；およびGreussingら， J. Vis. Exp., (69), 2012：「デグロン（ｄｇｎ）脱安定化緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に基づくレポータータンパク質を用いた生存細胞におけるユビキチンプロテアソーム活性の監視」；すべて、その全体が本明細書に援用される）。

【0179】

典型的なデグロン配列は、細胞および動物の両方において、よく特徴付けられ、そして試験されてきている。したがって、Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）のデグロン配列への融合は、「調節可能」でそして「誘導可能な」ＰＵＦドメインまたはＣａｓ９（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）を生じる。

【0180】

本明細書に記載する融合パートナーはいずれも、任意の望ましい組み合わせで使用可能である。例示するための１つの限定されない例として、各ＰＵＦドメインは、独立に、同じまたは異なる融合パートナーに融合可能であり、そしてこれらは、任意の順序で、対象のポリヌクレオチドの一連のＰＢＳに結合可能である。例えば、１つのＰＵＦドメインが検出のためのＹＦＰ配列に融合し、第二のＰＵＦドメインが安定性のためのデグロン配列に融合し、そして第三のＰＵＦドメインがターゲットＤＮＡの転写を増加させる転写アクチベーター配列に融合してもよい。これらのタイプのＰＵＦドメイン融合体のいずれも、対象のポリヌクレオチド上の１より多い結合部位またはＰＢＳを、任意の望ましい順序で有してもよい。ＰＵＦドメイン融合体で使用可能な融合パートナーの数は、大部分無制限である（例えば少なくとも２、５、１０、２０、３０、４０、５０またはそれより多い）。

【0181】

いくつかの態様において、任意のＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）融合タンパク質は、１またはそれより多い（例えば２またはそれより多い、３またはそれより多い、４またはそれより多い、あるいは５またはそれより多い）異種配列または融合パートナーを含んでもよい。

【0182】

いくつかの態様において、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）またはＰＵＦドメイン融合体は、コドン最適化されていてもよい。このタイプの最適化は当該技術分野に知られ、そして同じタンパク質をコードしながら、意図される宿主生物または細胞のコドン優先性を模倣する、外来由来ＤＮＡの突然変異を含む。したがって、コドンは変化するが、コードされるタンパク質は不変のままである。例えば、意図されるターゲット細胞がヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化ＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）融合体が、より適したＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）融合体であろう。別の限定されない例として、意図される宿主細胞がマウス細胞である場合、マウスコドン最適化ＰＵＦドメイン融合体またはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）が、適切なＰＵＦドメイン融合体またはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）であろう。コドン最適化は必要ではないが、許容可能であり、そして特定の場合には好ましい可能性もある。

【0183】

任意の対象のＰＵＦドメインを、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（キット＃１０００００００５１）で入手可能なＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ組み立てキット（Abilら， Journal of Biological Engineering 8:7, 2014を参照されたい）を用いて作製可能である。

【0184】

５．転写調節
本発明のＰＵＦドメインおよび／またはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）融合タンパク質を、対象のポリヌクレオチドのＤＮＡターゲティング配列によって、ターゲットＤＮＡ中の特定の位置（すなわちターゲットポリヌクレオチド配列）にターゲティングし、そして遺伝子座特異的制御、例えばプロモーターへのＲＮＡポリメラーゼ結合のブロッキング（これは選択的に転写アクチベーター機能を阻害する）、および／または局所クロマチン状態の修飾（例えばターゲットＤＮＡを修飾するかまたはターゲットＤＮＡと会合するポリペプチドを修飾する融合配列を用いる場合）を実行する。いくつかの場合、変化は一過性である（例えば転写抑制または活性化）。いくつかの場合、変化は遺伝性である（例えばターゲットＤＮＡまたはターゲットＤＮＡと会合するタンパク質、例えばヌクレオソームヒストンにエピジェネティック修飾を行う場合）。

【0185】

対象のＰＵＦドメインまたはＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）融合タンパク質を用いる方法の生物学的効果を、任意の好適な方法（例えば遺伝子発現アッセイ；クロマチンに基づくアッセイ、例えばクロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）、クロマチンｉｎ ｖｉｖｏアッセイ（ＣｉＡ）等）によって検出可能である。

【0186】

いくつかの場合、対象の方法は、２またはそれより多い異なるＤＮＡターゲティング配列の使用を伴う。例えば、２つの異なるＤＮＡターゲティング配列を単一の宿主細胞において用いてもよく、ここで、２つの異なるＤＮＡターゲティング配列は、同じターゲット核酸における２つの異なるターゲットポリヌクレオチド配列をターゲティングする。したがって、例えば、対象の転写調節法は、宿主細胞内に、第二のＤＮＡターゲティング配列、または第二のＤＮＡターゲティング配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を導入する工程をさらに含んでもよい。いくつかの場合、同じターゲット核酸中の２つの異なるターゲティング配列をターゲティングする２つの異なるＤＮＡターゲティング配列の使用は、ターゲット核酸の転写における調節（例えば減少または増加）の増加を提供する。

【0187】

別の例として、２つの異なるＤＮＡターゲティング配列を単一の宿主細胞で用いてもよく、ここで２つの異なるＤＮＡターゲティング配列は、２つの異なるターゲット核酸をターゲティングする。

【0188】

したがって、特定の態様において、本発明の転写調節法は、宿主細胞において、ターゲット核酸の選択的調節（例えば減少または増加）を提供する。例えば、ターゲット核酸の転写の「選択的」減少は、ターゲット核酸の転写を、ＤＮＡターゲティング配列／修飾Ｃａｓ９ポリペプチド／ＰＵＦドメイン融合複合体の非存在下でのターゲット核酸の転写レベルに比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または９０％より多く減少させる。ターゲット核酸の転写の選択的減少は、ターゲット核酸の転写を減少させるが、非ターゲット核酸の転写を実質的に減少させず、例えば非ターゲット核酸の転写は、あるとしても、ＤＮＡターゲティング配列／修飾Ｃａｓ９ポリペプチド／ＰＵＦドメイン融合複合体の非存在下での非ターゲット核酸の転写レベルに比較して、１０％未満しか減少させない。

【0189】

一方で、ターゲットＤＮＡの転写の「選択的」増加は、ターゲットＤＮＡの転写を、ＤＮＡターゲティング配列／修飾Ｃａｓ９ポリペプチド／ＰＵＦドメイン融合複合体の非存在下でのターゲットＤＮＡの転写レベルに比較して、少なくとも約１．１倍（例えば少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、または少なくとも約２０倍）増加させる。ターゲットＤＮＡの転写の選択的増加は、ターゲットＤＮＡの転写を増加させるが、非ターゲットＤＮＡの転写を実質的に増加させず、例えば非ターゲットＤＮＡの転写は、あるとしても、ＤＮＡターゲティング配列／修飾Ｃａｓ９ポリペプチド／ＰＵＦドメイン融合複合体の非存在下での非ターゲットＤＮＡの転写レベルに比較して、約５倍未満（例えば約４倍未満、約３倍未満、約２倍未満、約１．８倍未満、約１．６倍未満、約１．４倍未満、約１．２倍未満、または約１．１倍未満）しか増加させない。

【0190】

限定されない例として、増加した転写は、ｄＣａｓ９を異種配列に融合させることによって、そして／または対象のポリヌクレオチドのＰＢＳに結合するＰＵＦドメインの１つに異種配列を融合させることによって、達成可能である。適切な融合パートナーには、限定されるわけではないが、ターゲットＤＮＡに、またはターゲットＤＮＡと会合するポリペプチド（例えばヒストンまたは他のＤＮＡ結合タンパク質）に直接作用することによって、転写を間接的に増加させる活性を提供するポリペプチドが含まれる。適切な融合パートナーには、限定されるわけではないが、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドが含まれる。

【0191】

さらなる適切な融合パートナーには、限定されるわけではないが、ターゲット核酸の転写増加を直接提供するポリペプチド（例えば転写アクチベーターまたはその断片、転写アクチベーターを補充するタンパク質またはその断片、小分子／薬剤反応性転写制御因子等）が含まれる。「ＰＵＦドメイン（および場合によるｄＣａｓ９）融合タンパク質」と題するセクションを参照されたい。

【0192】

原核生物において、転写を増加させるｄＣａｓ９融合タンパク質および／またはＰＵＦドメイン融合タンパク質を用いた対象の方法の限定されない例には、細菌１ハイブリッド（Ｂ１Ｈ）または２ハイブリッド（Ｂ２Ｈ）系の修飾が含まれる。Ｂ１Ｈ系において、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）を細菌転写活性化ドメイン（ＡＤ、例えば大腸菌ＲＮＡポリメラーゼのアルファサブユニット（ＲＮＡＰα））に融合させる。したがって、対象のｄＣａｓ９またはＰＵＦドメインを、ＡＤを含む異種配列に融合させてもよい。対象のｄＣａｓ９またはＰＵＦドメイン融合タンパク質が、プロモーターの上流領域（ＤＮＡターゲティング配列によってそこにターゲティングされる）に到着すると、ｄＣａｓ９またはＰＵＦドメイン融合タンパク質のＡＤ（例えばＲＮＡＰα）が、ＲＮＡＰホロ酵素を補充して、転写活性化を導く。Ｂ２Ｈ系では、ＢＤは、ＡＤに直接融合せず；その代わり、その相互作用は、タンパク質間相互作用（例えばＧＡＬ１１Ｐ−ＧＡＬ４相互作用）によって仲介される。対象の方法で使用するために、こうした系を修飾するため、ｄＣａｓ９またはＰＵＦドメインを、タンパク質間相互作用を提供する第一のタンパク質配列（例えば酵母ＧＡＬ１１Ｐおよび／またはＧＡＬ４タンパク質）に融合させ、そしてＲＮＡＰαを、タンパク質間相互作用を完了させる第二のタンパク質配列に融合させてもよい（例えばＧＡＬ１１ＰをｄＣａｓ９またはＰＵＦドメインに融合させる場合はＧＡＬ４、ＧＡＬ４をｄＣａｓ９またはＰＵＦドメインに融合させる場合はＧＡＬ１１Ｐ等）。ＧＰ１１ＰおよびＧＡＬ４の間の結合アフィニティは、結合の効率および転写速度を増加させる。

【0193】

ｄＣａｓ９および／またはＰＵＦドメイン融合タンパク質を用いて、真核生物において転写を増加させる、対象の方法の限定されない例には、ｄＣａｓ９および／またはＰＵＦドメインの活性化ドメイン（ＡＤ）（例えばＧＡＬ４、ヘルペスウイルス活性化タンパク質ＶＰ１６またはＶＰ６４、ヒト核因子ＮＦ−κＢ ｐ６５サブユニット等）への融合が含まれる。系を誘導性にするため、ｄＣａｓ９／ＰＵＦドメイン融合タンパク質の発現は、誘導性プロモーター（例えばＴｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦ等）によって調節されてもよい。ＤＮＡターゲティング配列が既知の転写反応要素（例えばプロモーター、エンハンサー等）、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）、ターゲットＤＮＡの発現を調節可能であると推測される未知のまたは既知の機能の配列等をターゲティングするように設計することも可能である。

【0194】

いくつかの態様において、多数の対象のポリヌクレオチドを同時に同じ細胞において用いて、同じターゲットＤＮＡまたは異なるターゲットＤＮＡ上の異なる位置で転写を同時に調節する。いくつかの態様において、２またはそれより多い対象のポリヌクレオチドは、同じ遺伝子または転写物または遺伝子座をターゲティングする。いくつかの態様において、２またはそれより多い対象のポリヌクレオチドは、異なる関連しない遺伝子座をターゲティングする。いくつかの態様において、２またはそれより多い対象のポリヌクレオチドは、異なるが関連する遺伝子座をターゲティングする。

【0195】

対象のポリヌクレオチドが小さく、そしてロバストであるため、これらは、同じ発現ベクター上に同時に存在可能であり、そして望ましい場合には、同じ転写調節下にあることさえ可能である。いくつかの態様において、２またはそれより多い（例えば３またはそれより多い、４またはそれより多い、５またはそれより多い、１０またはそれより多い、１５またはそれより多い、２０またはそれより多い、２５またはそれより多い、３０またはそれより多い、３５またはそれより多い、４０またはそれより多い、４５またはそれより多い、あるいは５０またはそれより多い）対象のポリヌクレオチドが、ターゲット細胞において、同じまたは異なるベクターから、同時に発現される。発現される対象のポリヌクレオチドは、異なる細菌、例えば化膿性連鎖球菌、Ｓ．サーモフィルス、Ｌ．イノキュア（Ｌ． ｉｎｎｏｃｕａ）、および淋菌からの直交性ｄＣａｓ９タンパク質によって異なって認識されうる。

【0196】

多数の対象のポリヌクレオチドを発現させるため、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼによって仲介される人工的ＲＮＡプロセシング系を用いてもよい。多数の対象のポリヌクレオチドを、前駆体転写物上のタンデムアレイに連鎖状にし（例えばＵ６プロモーターから発現させ）、そしてＣｓｙ４特異的ＲＮＡ配列によって分離することも可能である。同時発現Ｃｓｙ４タンパク質が前駆体転写物を多数の対象のポリヌクレオチドに切断する。ＲＮＡプロセシング系を用いる利点には、以下が含まれる：まず、多数のプロモーターまたはベクターを用いる必要がなく；次に、すべての対象のポリヌクレオチドが前駆体転写物からプロセシングされるため、これらの濃度が、類似の野生型Ｃａｓ９／Ｃａｓ９ニッカーゼ／ｄＣａｓ９結合に関して規準化される。

【0197】

Ｃｓｙ４は、細菌、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に由来する小分子エンドリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）タンパク質である。Ｃｓｙ４は、最小１７ｂｐ ＲＮＡヘアピンを特異的に認識し、そして迅速で（＜１分間）、そして非常に効率的な（＞９９．９）ＲＮＡ切断を示す。大部分のＲＮアーゼとは異なり、切断されたＲＮＡ断片は、安定であり、そして機能的に活性であるままである。Ｃｓｙ４に基づくＲＮＡ切断は、人工的ＲＮＡプロセシング系に流用することも可能である。この系では、１７ｂｐのＲＮＡヘアピンを、単一プロモーターから前駆体転写物として転写される多数のＲＮＡ断片の間に挿入する。Ｃｓｙ４の同時発現は、個々のＲＮＡ断片を生成する際に有効である。

【0198】

６．宿主細胞
転写を調節する本発明の方法を使用して、ｉｎ ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏで、有糸分裂または有糸分裂後の細胞において、転写調節を誘導することも可能である。対象のポリヌクレオチドは、ターゲットＤＮＡのターゲットポリヌクレオチド配列にハイブリダイズすることによって特異性を提供するため、有糸分裂および／または有糸分裂後の細胞は、多様な宿主細胞のいずれであってもよく、ここで、適切な宿主細胞には、限定されるわけではないが、細菌細胞；古細菌細胞；単細胞真核生物；植物細胞；藻類細胞、例えばボトリオコッカス・ブラウニー（Botryococcus braunii）、クラミドモナス・レインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）、ナノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis gaditana）、クロレラ・ピレノイドーサ（Chlorella pyrenoidosa）、サルガッスム・パテンス（Sargassum patens）、Ｃ．アガーディ（C. agardh）等；真菌細胞；動物細胞；無脊椎動物（例えば昆虫、刺胞動物、棘皮動物、線虫等）由来の細胞；真核寄生虫（例えばマラリア寄生虫、例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）；蠕虫等）；脊椎動物（例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）由来の細胞；哺乳動物細胞、例えば齧歯類細胞、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞等が含まれる。適切な宿主細胞には、天然存在細胞；遺伝子修飾細胞（例えば実験室において、例えば「人の手」によって遺伝的に修飾された細胞）；および何らかの方法でｉｎ ｖｉｔｒｏで操作された細胞が含まれる。いくつかの場合、宿主細胞は単離されているかまたは培養されている。

【0199】

任意のタイプの細胞が関心対象でありうる（例えば幹細胞、例えば胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖系列細胞；体細胞、例えば線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋肉細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞；任意の段階の胚のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ胚性細胞、例えば１細胞、２細胞、４細胞、８細胞等の段階のゼブラフィッシュ胚等）。細胞は、樹立された細胞株由来であってもよいし、またはこれらは初代細胞であってもよく、ここで「初代細胞」、「初代細胞株」、および「初代培養」は、本明細書において交換可能に用いられ、被験体から得られ、そして培養の限定された数の継代、すなわちスプリットに渡って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖を可能にした、細胞および細胞培養を指す。例えば、初代培養には、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されていてもよいが、危機段階を経るほどの回数は継代されていない培養が含まれる。初代細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで１０回未満の継代で維持可能である。ターゲット細胞は、多くの態様において、単細胞生物であるか、または培養中で増殖されている。

【0200】

細胞が初代細胞である場合、こうした細胞は、任意の好適な方法によって、個体から採取されていてもよい。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等によって好適に採取される一方、組織、例えば皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃等由来の細胞は、最も好適には生検によって採取される。採取した細胞の分散または懸濁には、適切な溶液を用いてもよい。こうした溶液は、一般的に、ウシ胎児血清または他の天然存在因子を、低濃度、例えば５〜２５ｍＭの許容されうる緩衝液と組み合わせて、好適に補充した、平衡塩溶液、例えば正常生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液等であろう。好適な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液等が含まれる。細胞を直ちに用いてもよいし、またはこれらを長期間凍結保存し、融解し、そして再使用可能にすることも可能である。こうした場合、細胞は通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝培地、またはこうした凍結温度で細胞を保存するために当該技術分野で一般的に用いられる他の溶液中で凍結され、そして凍結培養細胞を融解するために、当該技術分野に一般的に知られる方式で融解してもよい。

【0201】

７． 宿主細胞への核酸の導入
対象のポリヌクレオチド、これをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、または対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）またはＰＵＦドメイン融合体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、多様な周知の方法のいずれによって宿主細胞に導入してもよい。

【0202】

宿主細胞内に核酸を導入する方法は、当該技術分野に知られ、そして任意の既知の方法を用いて、核酸（例えばベクターまたは発現構築物）を、幹細胞または前駆体細胞内に導入してもよい。適切な方法には、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、コンジュゲート化、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介性トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介性トランスフェクション、リポソーム仲介性トランスフェクション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子仲介性核酸送達等が含まれる（例えばPanyamら， Adv. Drug Deliv. Rev., pii: S0169-409X(12)00283-9.doi:10.1016 / j.addr.2012.09.023を参照されたい）。

【0203】

したがって、本発明はまた、対象のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸も提供する。いくつかの場合、対象の核酸はまた、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）および／または対象のＰＵＦドメイン融合体をコードするヌクレオチド配列も含む。

【0204】

いくつかの態様において、対象の方法は、宿主細胞（または宿主細胞集団）に、対象のポリヌクレオチドおよび／または対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）および／または対象のＰＵＦドメイン融合体をコードするヌクレオチド配列を含む１またはそれより多い核酸（例えばベクター）を導入する工程を含む。いくつかの態様において、ターゲットＤＮＡを含む宿主細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏである。いくつかの態様において、ターゲットＤＮＡを含む宿主細胞はｉｎ ｖｉｖｏである。対象のポリヌクレオチドおよび／または対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）および／または対象のＰＵＦドメイン融合体をコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸には、発現ベクターが含まれ、ここで発現ベクターは、組換え発現ベクターであってもよい。

【0205】

いくつかの態様において、組換え発現ベクターは、ウイルス構築物、例えば組換えアデノ随伴ウイルス構築物（例えば、米国特許第７，０７８，３８７号を参照されたい）、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物等である。

【0206】

適切な発現ベクターには、限定されるわけではないが、ウイルスベクター（例えばワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（例えば、Liら， Invest Opthalmol. Vis. Sci., 35:2543-2549, 1994； Borrasら，Gene Ther., 6:515-524, 1999； LiおよびDavidson， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7700-7704, 1995； Sakamotoら，Hum. Gene Ther., 5:1088-1097, 1999； ＷＯ ９４／１２６４９， ＷＯ ９３／０３７６９； ＷＯ ９３／１９１９１； ＷＯ ９４／２８９３８； ＷＯ ９５／１１９８４およびＷＯ ９５／００６５５を参照されたい）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Aliら， Hum. Gene Ther., 9:81-86, 1998， Flanneryら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:6916-6921, 1997； Bennettら，Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857-2863, 1997； Jomaryら， Gene Ther., 4:683-690, 1997， Rollingら， Hum. Gene Ther., 10:641-648, 1999； Aliら， Hum. Mol. Genet., 5:591-594, 1996； Srivastava、ＷＯ ９３／０９２３９中， Samulskiら， J. Vir., 63:3822-3828, 1989； Mendelsonら， Virol., 166: 154-165, 1988；およびFlotteら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10613-10617, 1993を参照されたい）； ＳＶ４０；ヘルペス・シンプレックス・ウイルス；ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Miyoshiら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 10319-23, 1997； Takahashiら， J. Virol., 73:7812-7816, 1999を参照されたい）；レトロウイルスベクター（例えば、ネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにレトロウイルス、例えばラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、レンチウイルス、ＨＩＶウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルス由来のベクター）に基づくウイルスベクター等が含まれる。

【0207】

多くの適切な発現ベクターが当業者に知られ、そして多くが商業的に入手可能である。以下のベクターを例として提供する；真核宿主細胞に関しては： ｐＸＴｌ、ｐＳＧ５（Stratagene）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬＳＶ４０（Pharmacia）。しかし、宿主細胞と適合する限り、任意の他のベクターを用いてもよい。

【0208】

利用する宿主／ベクター系に応じて、恒常的および誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含む、任意の数の適切な転写および翻訳調節要素を、発現ベクター中で用いてもよい（例えば、Bitterら， Methods in Enzymology, 153:516-544, 1987を参照されたい）。

【0209】

いくつかの態様において、対象のポリヌクレオチドおよび／または対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）および／または対象のＰＵＦドメイン融合体をコードするヌクレオチド配列を、調節要素、例えば転写調節要素、例えばプロモーターに、機能可能であるように連結する。転写調節要素は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞；または原核細胞（例えば細菌または古細菌細胞）のいずれにおいて機能性であってもよい。いくつかの態様において、対象のポリヌクレオチドおよび／または対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）および／または対象のＰＵＦドメイン融合体をコードするヌクレオチド配列を、原核および真核細胞両方において、対象のポリヌクレオチドおよび／または対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）および／または対象のＰＵＦドメイン融合体をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、多数の調節要素に、機能可能であるように連結する。

【0210】

プロモーターは、恒常的に活性なプロモーター（すなわち恒常的に活性／「オン」状態にあるプロモーター）であってもよいし、誘導性プロモーター（すなわちその状態、活性／「オン」または不活性／「オフ」が、外部刺激によって、例えば特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在によって調節されるプロモーター）であってもよいし、空間的に制限されるプロモーター（すなわち転写制御要素、エンハンサー等）（例えば組織特異的プロモーター、細胞タイプ特異的プロモーター等）であってもよいし、そして時間的に制限されるプロモーターであってもよい（すなわちプロモーターは、胚発生の特定の段階中に、または生物学的プロセスの特定の段階中に、例えばマウスにおける毛包周期中に、「オン」状態または「オフ」状態である）。

【0211】

適切なプロモーターは、ウイルスに由来していてもよく、そしてしたがって、ウイルスプロモーターと称されることも可能であるし、またはこれらは原核または真核生物を含む任意の生物に由来していてもよい。適切なプロモーターを用いて、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えばｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）によって発現を駆動することも可能である。例示的なプロモーターには、限定されるわけではないが、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ極初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小分子核プロモーター（Ｕ６）（Miyagishiら， Nature Biotech., 20:497-500, 2002）、増進されたＵ６プロモーター（例えばXiaら， Nucleic Acids Res., 31(17):e100, 2003）、ヒトＨＩプロモーター（ＨＩ）等が含まれる。

【0212】

誘導性プロモーターの例には、限定されるわけではないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）制御プロモーター、ラクトース誘導性プロモーター、熱ショックプロモーター、テトラサイクリン制御プロモーター（例えばＴｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦ等）、ステロイド制御プロモーター、金属制御プロモーター、エストロゲン受容体制御プロモーター等が含まれる。したがって、誘導性プロモーターは、限定されるわけではないが、ドキシサイクリン；ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ；エストロゲン受容体；エストロゲン受容体融合体等を含む分子によって制御されることも可能である。

【0213】

いくつかの態様において、多細胞生物において、プロモーターが特定の細胞サブセットにおいて活性である（すなわち「オン」である）ように、プロモーターは、空間的に制限されるプロモーター（すなわち細胞タイプ特異的プロモーター、組織特異的プロモーター等）である。空間的に制限されるプロモーターはまた、エンハンサー、転写制御要素、調節配列等と称されることも可能である。任意の好適な空間的に制限されるプロモーターを用いてもよく、そして適切なプロモーター（例えば脳特異的プロモーター、ニューロンサブセットにおいて発現を駆動するプロモーター、生殖系列において発現を駆動するプロモーター、肺において発現を駆動するプロモーター、筋肉において発現を駆動するプロモーター、膵臓の膵島細胞において発現を駆動するプロモーター等）の選択は、生物に応じるであろう。例えば、多様な空間的に制限されるプロモーターが、植物、ハエ、虫、哺乳動物、マウス等に関して知られる。したがって、生物に応じて、空間的に制限されるプロモーターを用いて、非常に多様な異なる組織および細胞タイプにおいて、対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）またはＰＵＦドメイン融合体をコードする核酸の発現を制御することも可能である。いくつかの空間的に制限されるプロモーターは、胚発生の特定の段階中、または生物学的プロセスの特定の段階（例えばマウスにおける毛包周期）中、プロモーターが「オン」状態または「オフ」状態にあるように、時間的にも制限されている。

【0214】

例示目的のため、空間的に制限されるプロモーターの例には、限定されるわけではないが、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、光受容体特異的プロモーター等が含まれる。ニューロン特異的な空間的に制限されるプロモーターには、限定されるわけではないが、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮ０２、Ｘ５１９５６を参照されたい）；芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター；ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照されたい）；シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照されたい）；ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Chenら， Cell, 51:7-19, 1987；およびLlewellynら， Nat. Med., 16(10): 1161-1166, 2010を参照されたい）；セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照されたい）；チロシンヒドロキシラーゼプロモーター（ＴＨ）（例えば、Ohら， Gene Ther., 16:437, 2009； Sasaokaら， Mol. Brain Res., 16:274, 1992； Boundyら， Neurosci., 18:9989, 1998；およびKanedaら， Neuron, 6:583-594, 1991を参照されたい）；ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Radovickら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3402-3406, 1991を参照されたい）；Ｌ７プロモーター（例えば、Oberdickら， Science, 248:223-226, 1990を参照されたい）；ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Bartgeら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:3648-3652, 1988を参照されたい）；エンケファリンプロモーター（例えば、Combら， EMBO J., 17:3793-3805, 1988を参照されたい）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター；Ｃａ^２＋カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩアルファ（ＣａｍＫＩＩａ）プロモーター（例えば、Mayfordら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 13250, 1996；およびCasanovaら， Genesis, 31:37, 2001を参照されたい）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来増殖因子βプロモーター（例えば、Liuら， Gene Therapy, 11:52-60, 2004を参照されたい）等が含まれる。

【0215】

脂肪細胞特異的な空間的に制限されるプロモーターには、限定されるわけではないが、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えばヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂ〜＋２１ｂｐの領域（例えば、Tozzoら， Endocrinol. 138: 1604, 1997； Rossら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:9590, 1990；およびPavjaniら， Nat. Med., 11:797, 2005を参照されたい）；グルコース輸送因子４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Knightら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 14725, 2003を参照されたい）；脂肪酸転移酵素（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Kurikiら， Biol. Pharm. Bull., 25: 1476, 2002；およびSatoら， Biol. Chem. 277: 15703, 2002を参照されたい）；ステアロイル−ＣｏＡ脱飽和酵素−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Taborら, Biol. Chem. 274:20603, 1999）；レプチンプロモーター（例えば、Masonら， Endocrinol. 139: 1013, 1998；およびChenら， Biochem. Biophys. Res. Comm., 262: 187, 1999を参照されたい）；アディポネクチンプロモーター（例えば、Kitaら， Biochem. Biophys. Res. Comm., 331 :484, 2005；およびＣhakrabarti， Endocrinol. 151:2408, 2010を参照されたい）；アディプシンプロモーター（例えば、Piattら， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7490, 1989を参照されたい）；レジスチンプロモーター（例えば、Seoら， Molec. Endocrinol., 17: 1522, 2003を参照されたい）等が含まれる。

【0216】

心筋細胞特異的な空間的に制限されるプロモーターには、限定されるわけではないが、以下の遺伝子由来の制御配列が含まれる：ミオシン軽鎖２、ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、心臓アクチン等。Franzら， Cardiovasc. Res., 35:560-566, 1997； Robbinsら， Ann. N.Y. Acad. Sci., 752:492-505, 1995； Linnら， Circ. Res., 76:584-591, 1995； Parmacekら， Mol. Cell. Biol., 14:1870-1885, 1994； Hunterら， Hypertension, 22:608-617, 1993；およびSartorelliら， Proc. Natl. Acad. Sci., 89:4047-4051, 1992。

【0217】

平滑筋特異的な空間的に制限されるプロモーターには、限定されるわけではないが、ＳＭ２２ａプロモーター（例えば、Akyurekら， Mol. Med., 6:983, 2000；および米国特許第７，１６９，８７４号を参照されたい）；スムースリンプロモーター（例えば、ＷＯ ２００１／０１８０４８を参照されたい）；平滑筋アクチンプロモーター等が含まれる。例えば、２つのＣＡｒＧ要素が存在するＳＭ２２ａプロモーターの０．４ｋｂ領域は、血管平滑筋細胞特異的発現を仲介することが示されてきている（例えば、Kimら， Mol. Cell. Biol., 17:2266-2278, 1997； Liら， J. Cell Biol., 132:849-859, 1996；およびMoesslerら， Development, 122:2415-2425, 1996を参照されたい）。

【0218】

光受容体特異的な空間的に制限されるプロモーターには、限定されるわけではないが、ロドプシンプロモーター；ロドプシンキナーゼプロモーター（Youngら， Ophthalmol. Vis. Sci., 44:4076, 2003）；ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Nicoudら， Gene Med., 9: 1015, 2007）；網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Nicoudら， 2007， 上記）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Nicoudら （２００７） 上記）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Yokoyamaら， Exp. Eye Res., 55:225, 1992）が含まれる。

【0219】

８．ライブラリー
本発明はまた、対象のポリヌクレオチド配列の複数またはライブラリー、あるいは該ポリヌクレオチド配列をコードするベクターの複数またはライブラリーも提供する。後者は、対象のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチドを含む組換え発現ベクターのライブラリーを含んでもよい。

【0220】

対象のライブラリーは、約１０の個々のメンバーから約１０^１２の個々のメンバーを含むことも可能であり；例えば対象のライブラリーは、約１０の個々のメンバーから約１０^２の個々のメンバー、約１０^２の個々のメンバーから約１０^３の個々のメンバー、約１０^３の個々のメンバーから約１０^５の個々のメンバー、約１０^５の個々のメンバーから約１０^７の個々のメンバー、約１０^７の個々のメンバーから約１０^９の個々のメンバー、約１０^９の個々のメンバーから約１０^１２の個々のメンバーを含むことも可能である。

【0221】

特定の態様において、ベクターの２つは、それぞれのＤＮＡターゲティング配列、Ｃａｓ９結合配列、および／またはＰＢＳのコピー数、同一性（例えば配列、または結合特異性）、または相対的順序において、コードされるポリヌクレオチドが異なる。

【0222】

例えば、特定の態様において、対象のライブラリーの「個々のメンバー」は、対象のポリヌクレオチドのＤＮＡターゲティング配列のヌクレオチド配列において、ライブラリーの他のメンバーと異なる。したがって、例えば、対象のライブラリーの各個々のメンバーは、ライブラリーの他のすべてのメンバーと、Ｃａｓ９結合配列の同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むことも可能であり；そしてライブラリーの他のすべてのメンバーと、ＰＢＳの同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むことも可能である；が対象のポリヌクレオチドのＤＮＡターゲティング配列のヌクレオチド配列において、ライブラリーの他のメンバーと異なる。この方式で、ライブラリーは、同じターゲット遺伝子上または異なるターゲット遺伝子上のいずれかである、異なるターゲットポリヌクレオチド配列に結合するメンバーを含むことも可能である。

【0223】

関連する態様において、異なるターゲットＤＮＡが独立に制御可能であるよう、例えばいくつかのターゲット遺伝子が転写的に活性化される（そして場合によって第一の蛍光色によって標識される）一方、他のものは転写的に抑制される（そして場合によって第二の蛍光色によって標識される）よう、異なるＤＮＡターゲティング配列が異なるＰＢＳと会合するように、ライブラリーメンバーは異なってもよい。

【0224】

特定の他の態様において、対象のライブラリーの個々のメンバーは、対象のポリヌクレオチドのＣａｓ９結合配列のヌクレオチド配列において、ライブラリーの他のメンバーと異なる。したがって、例えば対象のライブラリーの各個々のメンバーは、ライブラリーの他のすべてのメンバーと、ＤＮＡターゲティング配列の同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むことも可能であり；そしてライブラリーの他のすべてのメンバーと、ＰＢＳの同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むことも可能である；が対象のポリヌクレオチドのＣａｓ９結合配列のヌクレオチド配列において、ライブラリーの他のメンバーと異なる。この方式で、ライブラリーは、異なる種由来の異なる直交性Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）に結合するメンバーを含み、同じ宿主細胞において、別個におよび平行に制御可能な系を可能にしてもよい。

【0225】

特定の他の態様において、対象のライブラリーの個々のメンバーは、対象のポリヌクレオチドのＰＢＳのヌクレオチド配列において、ライブラリーの他のメンバーとは異なる。したがって、例えば対象のライブラリーの各個々のメンバーは、ライブラリーの他のすべてのメンバーと、ＤＮＡターゲティング配列の同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むことも可能であり；そしてライブラリーの他のすべてのメンバーと、Ｃａｓ９結合配列の同じまたは実質的に同じヌクレオチド配列を含むことも可能である；が対象のポリヌクレオチドのＰＢＳのヌクレオチド配列において、ライブラリーの他のメンバーと異なる。

【0226】

９．例示的な有用性
本発明にしたがって、転写を調節するための方法は、研究適用；診断適用；産業適用；および治療適用を含む、多様な適用に使用を見出す。

【0227】

研究適用には、例えば、発生、代謝、下流遺伝子の発現等に対する、ターゲット核酸の転写減少または増加の影響を決定することが含まれうる。
対象の転写調節法を用いて、ハイスループットゲノム分析を行ってもよく、ここで、対象のポリヌクレオチドのＤＮＡターゲティング配列のみを変化させる必要があり、一方、Ｃａｓ９結合配列およびＰＢＳは、（いくつかの場合）一定に保持されていてもよい。ゲノム分析で用いる複数の核酸を含むライブラリー（例えば対象のライブラリー）には：対象のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に機能可能であるように連結されたプロモーターが含まれ、ここで各核酸には、異なるＤＮＡターゲティング配列、共通のＣａｓ９結合配列、および共通のＰＢＳが含まれるであろう。チップは、５ｘ１０^４を超えるユニークな本発明のポリヌクレオチドを含有可能であった。

【0228】

適用には、大規模表現型決定、遺伝子対機能マッピング、およびメタゲノム分析が含まれるであろう。
本明細書に開示する対象の方法はまた、代謝操作の分野においても使用を見出す。転写レベルは、本明細書に開示するように、適切なＤＮＡターゲティングＲＮＡを設計することによって、効率的にそして予測可能に調節可能であるため、代謝経路（例えば生合成経路）の活性は、関心対象の代謝経路内の特定の酵素のレベルを調節することによって（例えば転写増加または減少を通じて）正確に調節し、そして調整することも可能である。関心対象の代謝経路には、化学薬品（ファインケミカル、燃料、抗生物質、毒素、アゴニスト、アンタゴニスト等）および／または薬剤産生に用いるものが含まれる。

【0229】

関心対象の生合成経路には、限定されるわけではないが、（１）メバロン酸経路（例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路）（アセチルＣｏＡをピロリン酸ジメチルアリル（ＤＭＡＰＰ）およびピロリン酸イソペンテニル（ＩＰＰ）に変換し、これらはテルペノイド／イソプレノイドを含む非常に多様な生物分子の生合成に用いられる）、（２）非メバロン酸経路（すなわち「２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸／ｌ−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸経路」または「ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路」または「ＤＸＰ経路」）（メバロン酸経路に対する代替経路を通じて、代わりに、ピルビン酸およびグリセロアルデヒド３−リン酸をＤＭＡＰＰおよびＩＰＰに変換することによって、ＤＭＡＰＰおよびＩＰＰを産生する）、（３）ポリケチド合成経路（多様なポリケチドシンターゼ酵素を通じて、多様なポリケチドを産生する。ポリケチドには、化学療法に用いられる天然存在小分子（例えばテトラサイクリン、およびマクロライド）が含まれ、そして産業的に重要なポリケチドには、ラパマイシン（免疫抑制剤）、エリスロマイシン（抗生物質）、ロバスタチン（抗コレステロール薬剤）、およびエポチロンＢ（抗癌薬剤）が含まれる）、（４）脂肪酸合成経路、（５）ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート７リン酸）合成経路、（６）潜在的な生物燃料（例えば短鎖アルコールおよびアルカン、脂肪酸メチルエステルおよび脂肪性アルコール、イソプレノイド等）が含まれる。

【0230】

また、本明細書に開示する方法を用いて、調節の統合ネットワーク（すなわち単数または複数のカスケード）を設計してもよい。例えば、対象のポリヌクレオチド／Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）／ＰＵＦドメイン融合体を用いて、別のポリヌクレオチド／Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）／ＰＵＦドメイン融合体の発現を制御する（すなわち調節する、例えば増加させる、減少させる）ことも可能である。例えば、第一の対象のポリヌクレオチドは、第二のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）または第一のＰＵＦドメイン誘導体とは異なる機能（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、脱メチル化酵素活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、脱アセチル化酵素活性等）を持つＰＵＦドメイン融合体の転写の調節をターゲティングするように設計されうる。さらに、異なるＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）（例えば異なる種に由来する）は、異なるＣａｓ９ハンドル（すなわちＣａｓ９結合配列）を必要とする可能性もあるため、第二のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）は、第一の上記のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）とは異なる種に由来してもよい。したがって、いくつかの場合、第一の対象のポリヌクレオチドと相互作用不能であるように、第二のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）を選択してもよい。他の場合、第二のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）が第一の対象のポリヌクレオチドと相互作用するように選択してもよい。いくつかのこうした場合、２つ（またはそれより多い）Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）／ＰＵＦドメイン融合体の活性は、競合してもよい（例えばポリペプチドが反対の活性を有する際）し、または相乗作用してもよい（例えばポリヌクレオチドが類似のまたは相乗的活性を有する際）。同様に、上述のように、ネットワーク中の任意の複合体（すなわちポリヌクレオチド／Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）／ＰＵＦドメイン融合体）を設計して、他のポリヌクレオチド／Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）／ＰＵＦドメイン融合体を調節することも可能である。対象のポリヌクレオチド／Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）／ＰＵＦドメイン融合体を任意の望ましいＤＮＡ配列にターゲティングすることが可能であるため、本明細書記載の方法を用いて、任意の望ましいターゲットの発現を調節しそして制御することも可能である。設計可能な統合ネットワーク（すなわち相互作用のカスケード）は、非常に単純なものから非常に複雑なものに渡り、そして限定はない。

【0231】

２またはそれより多い構成要素（例えばポリヌクレオチド／Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）／ＰＵＦドメイン融合体）が、各々、別のポリヌクレオチド／Ｃａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）／ＰＵＦドメイン融合体の制御調節下にあるネットワークにおいて、ネットワークの１つの構成要素の発現レベルは、ネットワークの別の構成要素の発現レベルに影響を及ぼすことも可能である（例えば発現を増加させるかまたは減少させることも可能である）。この機構を通じて、１つの構成要素の発現は、同じネットワーク中の異なる構成要素の発現に影響を及ぼすことも可能であり、そしてネットワークには、他の構成要素の発現を増加させる構成要素、ならびに他の構成要素の発現を減少させる構成要素の混合物が含まれることも可能である。当業者には容易に理解されるであろうように、１つの構成要素の発現レベルが１またはそれより多くの異なる構成要素の発現レベルに影響を及ぼしうる上記例は、例示目的のためのものであり、そして限定しない。１またはそれより多い構成要素を操作可能であるように（すなわち実験的調節下、例えば温度調節；薬剤調節、すなわち薬剤誘導性調節；光調節等）修飾する（上記のとおり）場合、さらなる層の複雑性を、場合によってネットワークに導入してもよい。

【0232】

１つの限定されない例として、第一の対象のポリヌクレオチドを、ターゲット療法／代謝遺伝子の発現を調節する、第二の対象のポリヌクレオチドのプロモーターに結合させてもよい。こうした場合、第一の対象のポリヌクレオチドの条件付発現は、療法／代謝遺伝子を間接的に活性化する。このタイプのＲＮＡカスケードは、例えば、リプレッサーをアクチベーターに容易に変換するために有用であり、そしてこれを用いて、ターゲット遺伝子発現の論理または動力学を調節することも可能である。
対象の転写調節法はまた、薬剤発見およびターゲット検証にも使用可能である。

【0233】

１０．キット
本発明はまた、対象の方法を実行するためのキットも提供する。対象のキットは：ａ）本発明のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えばベクター）；場合によって、ｂ）対象のＣａｓ９タンパク質（例えば野生型、ニッカーゼ、またはｄＣａｓ９タンパク質）、または該タンパク質をコードするベクター（該タンパク質をコードする発現可能ｍＲＮＡを含む）；および場合によって、ｃ）各々、エフェクタードメインに融合したＰＵＦドメインを含む１またはそれより多い対象のＰＵＦドメイン融合体であって、該エフェクタードメインは、異なるＰＵＦドメイン融合体の間で同じであってもまたは異なってもよい、該融合体、または該融合体をコードするベクター（該融合体をコードする発現可能ｍＲＮＡを含む）を含んでもよい。

【0234】

特定の態様において、ａ）〜ｃ）の１またはそれより多くは、同じベクターにコードされてもよい。
特定の態様において、キットはまた、ａ）〜ｃ）のいずれか１つの宿主細胞内への導入を促進する１またはそれより多い緩衝剤または試薬、例えば形質転換、トランスフェクション、または感染のための試薬も含む。

【0235】

例えば、対象のキットには、さらに、１またはそれより多いさらなる試薬が含まれてもよく、ここで、こうしたさらなる試薬は：緩衝剤；洗浄緩衝剤；対照試薬；対照発現ベクターまたはＲＮＡポリメラーゼポリヌクレオチド；野生型またはｄＣａｓ９またはＰＵＦドメイン融合体のＤＮＡからのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生のための試薬等より選択されてもよい。

【0236】

対象のキットの構成要素は、別個の容器中にあってもよいし；または単一の容器中に組み合わされていてもよい。
上述の構成要素に加えて、対象のキットには、さらに、対象の方法を実施するためのキット構成要素の使用のための説明書が含まれてもよい。対象の方法を実施するための説明書は、一般的に、適切な記録媒体上に記録されている。例えば、説明書は、基盤、例えば紙またはプラスチック等の上に印刷されていてもよい。こうしたものとして、説明書は、パッケージ挿入物として、キットまたはその構成要素の容器のラベル中（すなわちパッケージングまたはサブパッケージングと関連して）等に、存在していてもよい。他の態様において、説明書は、適切なコンピュータ読み取り可能保存媒体、例えばＣＤ−ＲＯＭ、ディスケット、フラッシュドライブ等の上に存在する、電子保存データファイルとして存在する。さらに他の態様において、実際の説明書は、キット中には存在せず、遠隔供給源から、例えばインターネットを通じて、説明書を得るための手段が提供される。この態様の例は、説明書を見ることが可能であり、そして／またはそこから説明書をダウンロードすることが可能であるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様、説明書を得るためのこの手段は、適切な基盤に記録される。

【実施例】

【0237】

実施例１ ｓｇＲＮＡ足場は、操作されたＰｕｍｉｌｉｏ結合部位の４７コピーの挿入を伴っても、機能性であるままである
本実施例は、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ複合体の機能に実質的に影響を及ぼすことなく、操作された８量体Ｐｕｍｉｌｉｏ相同体ドメイン結合配列（ＰＢＳ）を少なくとも４７コピー、ｓｇＲＮＡの３’端に有しうることを立証する。

【0238】

特に、ｓｇＲＮＡの３’端にＰＢＳを付加することが、ｓｇＲＮＡ機能に影響を及ぼすかどうかを試験するため、０コピー、５コピー、１５コピー、２５コピー、および４７コピーの、ＰＵＦ（３−２）（単にＰＵＦａとも称される）［ＰＢＳ３２またはＰＢＳａ：５’−ＵＧＵＡＵｇＵＡ−３’］、ＰＵＦ（６−２／７−２）（単にＰＵＦｂとも称される）［ＰＢＳ６２７２またはＰＢＳｂ：５’−ＵｕｇＡＵＡＵＡ−３’］に対する８量体Ｐｕｍｉｌｉｏ相同体ドメイン結合配列（ＰＢＳ）を伴う、一連の修飾Ｔｅｔターゲティング（ｓｇＴｅｔＯ）または非ターゲティング対照（ｓｇ対照）ｓｇＲＮＡを生成した。図１Ａを参照されたい。これらの構築物が、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４転写アクチベーターに、ＨＥＫ２９３Ｔ／ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ細胞株におけるｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化させるように指示する能力を試験した。

【0239】

異なるｓｇＲＮＡ足場を持つｄＣａｓ９−ＶＰ６４で細胞をトランスフェクションし、そしてトランスフェクション２日後、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によって分析した（図１Ｂ）。対照非ターゲティングｓｇＲＮＡはすべて、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化しなかった。一方、異なる数のＰＢＳを含むＴｅｔターゲティングｓｇＲＮＡはすべて、ｄＣａｓ９−ＶＰ６４にｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化させるように指示することが可能であり、少なくとも４７コピーの８量体部位の挿入が、ターゲットへのｄＣａｓ９−ＶＰ６４の方向付けにおいて、ｓｇＲＮＡの活性に実質的に影響を及ぼさないことを示した。

【0240】

試験条件下で、そしてＰＵＦａ−ＶＰ６４／ＰＢＳａおよびＰＵＦｂ−ＶＰ６４／ＰＢＳｂの両方に関して、ｓｇＲＮＡに付加された５〜１０コピーのＰＢＳが、ターゲット導入遺伝子を最適に活性化させることが可能であった。一方、１５、２０、および４７コピーのＰＢＳは、わずかに低いがなお実質的な導入遺伝子活性化を導いた（図１Ｃ）。

【0241】

実施例２ 対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、同族８量体結合部位を含む操作されたＰｕｍｉｌｉｏの特異性のため、互いに直交性である
本実施例は、異なってプログラムされたＰＵＦドメインおよびその同族８量体モチーフを含むその対応するｓｇＲＮＡの間の特異性が、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系各々の間の独立性または直交性を提供することを立証する。

【0242】

それぞれ、５’−ＵＧＵＡＵｇＵＡ−３’結合部位を含むｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ３２）、および５’−ＵｕｇＡＵＡＵＡ−３’結合部位を含むｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ６２７２と相互作用する、ＰＵＦ（３−２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６−２／７−２）：：ＶＰ６４の融合体を生成し、そしてこれらがｄＣａｓ９と組み合わせて、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現をオンにする活性を試験した。さらに、２つのさらなる対、ＰＢＳｗ（５’−ＵＧＵＡＵＡＵＡ−３’）を認識するＰＵＦｗ−ＶＰ６４およびＰＢＳｃ（５’−ＵｕｇＡＵｇＵＡ−３’）を認識するＰＵＦｃ−ＶＰ６４もまた構築して、ｄＣａｓ９と組み合わせて、同じＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化する能力を試験した（図１Ｄ）。

【0243】

図１Ｄに示すように、ＰＵＦ：：ＶＰ６４は、同族結合部位を含むｓｇＲＮＡが提供された場合にのみ、ｔｄＴｏｍａｔｏ発現を活性化可能である。これは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、ＰＵＦドメインおよびｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ上のその８量体結合部位の対形成に基づいて、エフェクター機能の独立性または直交性を提供することを立証する。印象深いことに、ＰＢＳａおよびＰＢＳｗ結合部位は１ヌクレオチドしか異ならないが、その遺伝子活性化はターゲット特異的なままであり、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系の高い特異性を立証する。

【0244】

実施例３ 対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、ターゲット遺伝子座でのタンパク質複合体の組み立てを可能にする
本実施例は、２またはそれより多い異なるタンパク質構成要素を含むタンパク質複合体が、ｓｇＲＮＡ上で組み立て可能であり、そして対象の系を用いて、定義された遺伝子座で作動可能であることを立証する。

【0245】

特に、ｐ６５−ＨＳＦ１は、近年、強力なアクチベータードメインであることが示されてきている。互いに隣接して配置されたＰＢＳ３２およびＰＢＳ６２７２の両方を含むｓｇＲＮＡ、ならびに２つの異なる部位を占めるであろうＰＵＦ（３−２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６−２／７−２）：：ｐ６５−ＨＳＦ１融合体を生成した（図２Ａ）。ＰＵＦ（３−２）：：ＶＰ６４およびＰＵＦ（６−２／７−２）：：ｐ６５−ＨＳＦ１の両方での同時トランスフェクションは、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を誘導し、単一のアクチベーターのみをトランスフェクションすることから生じる蛍光強度のほぼ総計である強度であった。これは、ＰＵＦ（３−２）およびＰＵＦ（６−２／７−２）の両方の結合部位を含むｓｇＲＮＡが、ターゲティングされるゲノム遺伝子座上で、両方のタイプの両方の融合タンパク質が組み立てられることを可能にすることを示す。

【0246】

最近の論文は、転写活性化ドメインとしてのＶＰ６４およびｐ６５ＨＳＦ１の両方を試験し、そしてｐ６５ＨＳＦ１がより強力なアクチベーターであることを見出した。これらの２つの転写活性化ドメインを直接比較するため、ｐ６５ＨＳＦ１ ＰＵＦ融合体（ＰＵＦａ−ｐ６５ＨＳＦ１）およびＶＰ６４ ＰＵＦ融合体（ＰＵＦａ−ＶＰ６４）を用いて、異なる数のＰＢＳａを含むｓｇＲＮＡを用い、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ導入遺伝子を活性化した（図２Ｃ）。ＰＵＦａ−ｐ６５ＨＳＦ１はＰＵＦａ−ＶＰ６４の最大３倍より多い活性化を提供した。活性化は、１つのＰＢＳａであっても観察された（ＰＵＦａ−ＶＰ６４モジュールでは、以前には観察されなかった）。したがって、ｐ６５ＨＳＦ１は、ＶＰ６４よりもより強力な転写活性化ドメインであることが確認される。

【0247】

実施例４ 対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、アクチベーターを含むｄＣａｓ９直接融合体よりも、より効率的に、内因性遺伝子を活性化させることも可能である
本発明者らは、以前、ｄＣａｓ９−ＶＰ１６０直接融合体を用いて、ＯＣＴ４およびＳＯＸ２のロバストな内因性遺伝子活性化を達成するため、遺伝子あたり３〜４のｓｇＲＮＡのカクテルを用い、一方、単一ｓｇＲＮＡは、高い活性化を誘導することに失敗した（データ未提示）。

【0248】

本実施例は、対象の系において、ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ上の多数のＰＢＳを通じた、アクチベータードメインの多数の分子の補充が、トランス活性化活性を増加させ、したがって、より少ないｓｇＲＮＡの使用でも、内因性遺伝子活性化達成を可能にすることを示す。

【0249】

特に、ＨＥＫ２９３Ｔにおける内因性遺伝子ＯＣＴ４およびＳＯＸ２の活性化を、遺伝子あたり４つのｓｇＲＮＡ−ＰＢＳのカクテル、または個々のｓｇＲＮＡ−ＰＢＳのいずれかを用いて、直接ｄＣａｓ９−ｐ６５ＨＳＦ１アクチベーターと、対象の系を比較した（図３Ａおよび３Ｂ）。ＯＣＴ４およびＳＯＸ２活性化実験の両方において、混合ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳカクテルならびに単一ガイド実験における直接融合に比較して、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を用いると、より高い活性化が観察された（図３Ａおよび３Ｂ）。ＯＣＴ４およびＳＯＸ２への直接融合体ｄＣａｓ９−ｐ６５ＨＳＦ１の単一ガイドターゲティングによっては、ほとんどまたはまったく活性が観察されず、一方、対応する三構成要素系実験においては、ロバストな活性化が観察され、直接融合体に勝る、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系アクチベーターの優れた活性が示された。

【0250】

ＯＣＴ４およびＳＯＸ２活性化に関するｓｇＲＮＡ上のＰＢＳａ部位の最適な数を決定するため、１、５、１５または２５コピーのＰＢＳａを含む、ＯＣＴ４またはＳＯＸ２近位プロモーターのいずれかをターゲティングするｓｇＲＮＡ−ＰＢＳを構築した。ＯＣＴ４およびＳＯＸ２実験の両方において、本発明者らは、ｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａカクテル実験および単一ｓｇＲＮＡ−５ｘＰＢＳａ実験のいずれにおいても、５ｘＰＢＳａを用いて、最高の活性化を観察し、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター実験における発見を反復した（図３Ｄおよび３Ｅ）。

【0251】

実施例５ 対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、ターゲット遺伝子の同時の活性化および抑制を可能にする
本実施例は、異なるエフェクター機能を、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系の各々に割り当て可能であることを立証する。

【0252】

ＫＲＡＢ：：ＰＵＦ（６−２／７−２）抑制融合体およびＳＶ４０プロモーターをターゲティングするｓｇＲＮＡをまず生成した。次いで、ＴｅｔＯプロモーターの調節下にあるｔｄＴｏｍａｔｏレポーター、およびＳＶ４０プロモーターの調節下にあるＥＧＦＰレポーターを有する、ＨＥＫ２９３Ｔレポーター細胞株（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＳＶ４０：：ＥＧＦＰ）を用いて、同時の（１）ＴｅｔＯプロモーターへのｄＣａｓ９／ｓｇＴｅｔＯ−ＰＢＳ３２／ＰＵＦ（３−２）：：ＶＰ６４結合を通じたｔｄＴｏｍａｔｏの活性化、および（２）ＳＶ４０プロモーターでのｄＣａｓ９／ｓｇＳＶ４０−ＰＢＳ６２７２／ＫＲＡＢ：：ＰＵＦ（６−２／７−２）の結合を通じたＥＧＦＰ発現の抑制を試験した（図４Ａ）。ｄＣａｓ９、ｓｇＴｅｔＯ−５ｘＰＢＳ３２およびＰＵＦ（３−２）：：ＶＰ６４からなる三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓアクチベーター複合体の発現は、ｔｄＴｏｍａｔｏ蛍光を活性化し（図４Ｂ；試料２）、一方、ｄＣａｓ９、ｓｇＳＶ４０−５×ＰＢＳ６２７２からなる三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓリプレッサー複合体の発現は、ＥＧＦＰ蛍光を減少させた（図４Ｂ；試料４）。アクチベーターおよびリプレッサー複合体両方の同時発現は、それぞれ、同時に、ｔｄＴｏｍａｔｏの活性化およびＥＧＦＰ導入遺伝子の抑制を誘導し（図４Ｂ、試料６）、異なるエフェクター機能を含む対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体が、同じ細胞内で作動可能であり、そしてそのターゲットで、異なるアウトプットを生じうることを立証する。

【0253】

多様なエフェクターを補充する際の対象の系の多用途性をさらに確認するため、ＫＲＡＢ−ＰＵＦａリプレッサー融合体、ならびにＰＵＦｃ−ｐ６５ＨＳＦ１アクチベーター融合体を構築した。レポーター細胞株、ＨＥＫ２９３Ｔ／ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ／ＳＶ４０：：ＥＧＦＰにおいて、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーター遺伝子は、ｄＣａｓ９／ＰＵＦｃ−ｐ６５ＨＳＦ１／ｓｇＴｅｔＯ−ＰＢＳｃによって効率的に活性化されることが可能である一方、ＳＶ４０：：ＥＧＦＰ発現は、ｄＣａｓ９／ＫＲＡＢ−ＰＵＦａ／ｓｇＳＶ４０−ＰＢＳａによって有意に抑制される（図４Ｃ）。両方の系を適用した際、同時の、ＴｅｔＯ：：ｔｄＴｏｍａｔｏ活性化およびＳＶ４０：：ＥＧＦＰ発現抑制が達成された（図４Ｃ）。非ターゲティング（ｓｇ対照）ｓｇＲＮＡを用いた際、またはＰＵＦ融合体を省いた際、それぞれのレポーターの蛍光レベルは影響を受けず、レポーターに対する影響が特異的であり、そしてターゲットでの同族ｄＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳによって補充されるエフェクターの作用によるものであることが示される。

【0254】

次に、この戦略を用いて、多数の内因性遺伝子の発現を独立に制御することが可能であるかどうかを試験した。ＰＵＦｂ−ｐ６５ＨＳＦ１がＯＣＴ４プロモーターに補充され、そしてＢＦＰＫＲＡＢ−ＰＵＦａがＳＯＸ２プロモーターに補充されるように、ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳｂおよびｓｇＲＮＡ−ＰＢＳａのターゲティング配列を変化させることによって、対象の三構成要素モジュールを内因性ターゲット遺伝子に向けた。レポーター遺伝子実験からの結果と同様、エフェクター仲介性の同時のそして独立の、ＯＣＴ４活性化およびＳＯＸ２抑制が達成された（図４Ｄ）。

【0255】

実施例６ 対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系によるヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）ドメインの補充は、エンハンサー活性化を達成する
人工的な転写因子系を用いて、エピジェネティック修飾因子を補充して、遺伝子を活性化するかまたは抑制する。最近の実験は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）を用いて、エンハンサーを活性化している。対象の三構成要素系が、ＨＡＴドメインの多数の分子を補充して、エピジェネティック編集の効率を増加させることが可能であることを立証するため、ＯＣＴ４をモデル遺伝子として用いたが、これはＯＣＴ４のエンハンサーおよびプロモーターがよく定義されており、そしてエンハンサー使用の選択が、胚性幹細胞状態に応じて、生物学的に重要であるためである。

【0256】

この実験において、近位プロモーター（ＰＰ）、近位エンハンサー（ＰＥ）および遠位エンハンサー（ＤＥ）が、各々４つの異なるｓｇＲＮＡ−ＰＢＳでターゲティングされた（図５Ａ）。ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）由来のＨＡＴおよびｄＣａｓ９のＣ末端の間の直接融合体（ｄＣａｓ９：：ＣＢＰＨＡＴ）を構築し、Ｎ末端融合モジュールＣＢＰＨＡＴ：：ＰＵＦａ、およびＣ末端融合モジュールＰＵＦａ：：ＣＢＰＨＡＴもまた構築した。次いで、ＰＰ、ＰＥおよびＤＥへの結合を通じたＯＣＴ４発現の活性化におけるその活性を試験した。

【0257】

図５Ｂに示すように、ｄＣａｓ９：：ＣＢＰＨＡＴおよびＣＢＰＨＡＴ：：ＰＵＦａは、近位プロモーター（ＰＰ）で類似の活性を有する。興味深いことに、ｓｇＲＮＡと５×ＰＢＳａをカップリングした際、対象の三構成要素モジュールは、エンハンサーＰＥおよびＤＥの両方を通じて、ＯＣＴ４遺伝子を活性化する、より高い効率を有し、Ｎ末端融合体ＣＢＰＨＡＴ：：ＰＵＦａが最高の活性化を生じる。次に、単一のｓｇＲＮＡ−５×ＰＢＳａにより、ＰＰ、ＰＥおよびＤＥによって導かれるＣＢＰＨＡＴ：：ＰＵＦａの活性を分析した（図５Ｃ）。４つのｓｇＲＮＡ−５×ＰＢＳａカクテルを用いるよりもより小さい倍変化であったが、単一ｓｇＲＮＡ−５×ＰＢＳａは、これらの要素をターゲティングすることを通じて、ＯＣＴ４遺伝子の発現を活性化させることが可能であった（図５Ｃ）。

【0258】

実施例７ 対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、テロメアの蛍光タグ化を可能にする
転写制御に加えて、ｄＣａｓ９−エフェクターの別の重要な適用は、生存細胞画像化のため、ゲノム遺伝子座を標識することである。本実施例は、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を、染色体遺伝子座の蛍光タグ化、例えばテロメアの標識に使用可能であることを立証する。

【0259】

本発明者らは、ＰＵＦａドメインに融合した蛍光タンパク質を補充するため、テロメアをターゲティングするよう設計したｓｇＲＮＡ（ｓｇテロメア）に、０、５、１５、または２５コピーのＰＢＳａを付加した（図６Ａ）。ｓｇテロメア―５ｘＰＢＳａ、１５ｘＰＢＳａおよび２５ｘＰＢＳａと、ｄＣａｓ９およびクローバー：：ＰＵＦａの発現は、テロメア標識と一致する緑色蛍光フォーカスを生じる一方、ＰＢＳａ部位を持たないｓｇＲＮＡの発現は、いかなるフォーカスも生じなかった（図６Ｂ）。対象の三構成要素系が導く蛍光シグナルが、実際にテロメアに局在することを確認するため、テロメアリピート結合因子ＴＲＦ２に対する抗体を用いた同時標識実験を行った。三構成要素系テロメアシグナルは、ＴＲＦ標識と大部分重複し（図６Ｃ）、クローバー−ＰＵＦａを補充するＰＢＳａ部位が付加されたｓｇＲＮＡによるテロメアの非常に特異的な標識が示された。

【0260】

興味深いことに、テロメア標識の強度は、より多くのコピーのＰＢＳがテロメア−ｓｇＲＮＡに付加されるにつれて増加した（図６Ｂ）。フォーカスの数の定量化およびシグナル対ノイズ比（フォーカス中の％ＧＦＰ／核中の総ＧＦＰ）は、５、１５〜２５ｘＰＢＳａを含むｓｇＲＮＡを用いた実験から進行性の増加が示され（図６Ｄおよび６Ｅ）、ターゲット遺伝子座での標識強度の力価決定を可能にする対象の三構成要素系の多量体化特徴が示された。

【0261】

実施例８ 対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、テロメアおよびセントロメアの同時の蛍光タグ付けを可能にする
本実施例は、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、多重化特徴を用いることによって、１より多い（例えば２つの）ゲノム遺伝子座を、同じ細胞において同時に標識可能であることを立証する。

【0262】

対象の三構成要素系が、２つのゲノム遺伝子座を同時に標識する能力をさらに立証するため、セントロメアをターゲティングするように、ＰＵＦｃに対する結合部位が付加されたｓｇＲＮＡを設計した（ｓｇセントロメア−２０ｘＰＢＳｃ）。対象の三構成要素系によるセントロメアの標識、および抗ＣＲＥＳＴ抗体を用いた免疫染色を観察し、そして確認した（図６Ｆ）。クローバー−ＰＵＦｂ／ｓｇセントロメア−２０ｘＰＢＳｃ、Ｒｕｂｙ−ＰＵＦａ／ｓｇテロメア−２５ｘＰＢＳａおよびｄＣａｓ９をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に同時導入した際、同じ細胞におけるセントロメアおよびテロメア両方の独立の標識が観察され（図６Ｇ）、対象の三構成要素系を用いて、多数のゲノム遺伝子座を独立に標識可能であることが立証された。

【0263】

実施例９ 対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系は、非リピート染色体遺伝子座の蛍光タグ付けを可能にする
ｄＣａｓ９：ＧＦＰを用いて、非反復ＤＮＡを標識する以前の研究は、こうした非リピート領域を標識するために、十分なシグナルを濃縮するには、＞３２のターゲティング事象が必要であると報告した。本実施例は、ＰＵＦ蛍光タンパク質融合体に関する多数の結合部位を取り込むことによって、蛍光シグナルをターゲット部位で濃縮させて、こうして非リピートＤＮＡの検出に必要なターゲティング部位の量を減少させることも可能であることを立証する。

【0264】

ＭＵＣ４遺伝子座での非リピート領域を本実施例で試験した。各々、１５ｘＰＢＳ３２を宿する７つのｓｇＲＮＡ、クローバー：：ＰＵＦ（３−２）およびｄＣａｓ９を用いると、ＭＵＣ４標識のものを反映する標識パターンが成功裡に検出された（図７）。これは、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系を用いて、定義されたゲノム遺伝子座で、タンパク質を「重合」させることが可能であり、これによって、画像化分野において、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系の適用が可能になり、そして非常に拡大されることを立証する。

【0265】

上記実施例は、転写制御因子、エピジェネティック修飾因子、および蛍光タンパク質を含めて、対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系が、多重化（図８Ａ）、複合体形成（図８Ｃ）、およびタンパク質の重合（図８Ｂ）を達成する能力を立証し、そして系は、独立に、これらを定義されたゲノム遺伝子座に導くことが可能である。これによって、多数の遺伝子座での複雑な分子の振る舞いの構築が可能であり、そして定義された化学量論でのタンパク質複合体の研究および再構成が可能になる。対象の三構成要素ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体／系の重合特徴は、定義されたゲノム遺伝子座での酵素活性または他のタンパク質の濃縮を可能にして、酵素活性の効果を増加させるか、または染色体画像化のような適用のためにシグナルを濃縮する。

【0266】

より具体的には、対象の三構成要素系のいくつかの主な利点には、以下が含まれる：（Ａ）多重化。対象の三構成要素系の異なるモジュールを、細胞内に同時に送達することが可能であり、そして各々は、独立に（すなわち他のモジュールおよびそのターゲット部位との干渉を伴わずに）定義されたターゲット部位で作動可能である。ＰＵＦドメインは、任意の８量体ＲＮＡモチーフを認識するために容易にプログラミング可能であるため、これは、独立モジュールの潜在的な数を、４^８（６５５３６）の理論的最大値に拡大する。ＰＵＦアレイを別のものの内部に挿入することによって、認識部位を１６量体ＲＮＡモチーフにプログラムすることも可能であり、配列スペースは４^１６（４２億９千万）となる。（Ｂ）多量体化：直鎖８量体ＰＢＳモチーフの単純性は、ｓｇＲＮＡ転写またはＣａｓ９／ｓｇＲＮＡ ＤＮＡ結合活性を妨害することなく、ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ上のＰＵＦ融合体の拡張された多量体化を可能にする。この特徴は、多数の分子のＰＵＦ融合体が、ｓｇＲＮＡ上で組み立てられることを可能にし、エフェクターまたはタンパク質タグの局在化濃縮を可能にする。これは、蛍光画像化または転写制御のために特に有益である。テロメアのようなリピート配列を標識する上記実験で示されるように、より多くのＰＢＳを含むｓｇＲＮＡ−ＰＢＳは、テロメアフォーカスでのシグナルを増加させる。この特徴は、通常、３０より多いｓｇＲＮＡのタイリングが必要である非リピート配列の標識を容易にしうる。直接ｄＣａｓ９−ＨＡＴ融合体に対して、本系を用いたＨＡＴ仲介エンハンサー活性化のより高い効率が観察された。多量体化は、大きなエピジェネティックドメイン、例えばスーパーエンハンサーまたはインプリンティングされた遺伝子座の再プログラミングに有用な人工的エピジェネティック因子によって導かれるエピジェネティック修飾の伝播を容易にしうることが意図される。（Ｃ）化学量論的に定義された複合体形成：本明細書において、直接試験していないが、ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳが、化学量論的に定義されたタンパク質複合体のＰＵＦ誘導性組み立てのためのＲＮＡ足場として作用しうることが意図される。特に、多様な特異性を持つ多様な数のＰＢＳコピーを、ｓｇＲＮＡに付加させて、定義される化学量論を伴い、同時にｓｇＲＮＡ−ＰＢＳに沿って定義される順序を伴う、多タンパク質複合体形成を可能にすることも可能である。

【0267】

上記実施例で用いる材料および方法を、以下に収集する。
クローニング
ベクター、そのＡｄｄｇｅｎｅ実体への連結のリストを、以下の表Ｓ１に提供する。クローニング戦略の詳細な説明および配列を以下に提供する。

【0268】

Ｎ末端ＮＬＳを含むＰＵＦａ［ＰＵＦ（３−２）］およびＰＵＦｂ［ＰＵＦ（６−２／７−２）］を、これらのコード配列を含有する構築物から、ＳｇｒＡＩおよびＰａｃＩ部位を含有するプライマーで増幅し、そしてｐＡＣ１６４：ｐｍａｘ−ｄＣａｓ９Ｍａｓｔｅｒ＿ＶＰ６４からＳｇｒＡＩ−ｄＣａｓ９−ＦｓｅＩを置換して、ｐＡＣ１３５５：ｐｍａｘ−ＮＬＳＰＵＦａ＿ＶＰ６４およびｐＡＣ１３５６：ｐｍａｘ−ＮＬＳＰＵＦｂ＿ＶＰ６４を生成した。ＮＬＳＰＵＦｂのリピート４までの５’断片およびＮＬＳＰＵＦａのリピート５から末端までの３’断片を用いた融合ＰＣＲを用いて、ｐＡＣ１３５７：ｐｍａｘ−ＮＬＳＰＵＦｗ＿ＶＰ６４を生成した。ＮＬＳＰＵＦａの５’断片とＮＬＳＰＵｂの３’断片の融合ＰＣＲを用いて、ｐＡＣ１３５８：ｐｍａｘ−ＮＬＳＰＵＦｃ＿ＶＰ６４を生成した。

【0269】

ｐ６５ＨＳＦ１アクチベーターＯＲＦを、ＦｓｅＩ ＰａｃＩ部位を含むＭＳ２−Ｐ６５−ＨＳＦ１＿ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ：６１４２３）から増幅し、ｐＡＣ１６４中のＶＰ６４断片を置換して、ｐＡＣ１４１０：ｐｍａｘ−ｄＣａｓ９＿ｐ６５ＨＳＦ１を生成し、そしてｐＡＣ１３５５およびｐＡＣ１３５８中のＶＰ６４を置換して、それぞれ、ｐＡＣ１３９３：ｐｍａｘ−ＮＬＳＰＵＦａ＿ｐ６５ＨＳＦ１およびｐＡＣ１４１１：ｐｍａｘ−ＮＬＳＰＵＦｃ＿ｐ６５ＨＳＦ１を生成した。

【0270】

クローバーおよびｍＲｕｂｙ２を、それぞれ、ｐｃＤＮＡ３−クローバー（Addgene #40259）およびｐｃＤＮＡ３−ｍＲｕｂｙ２（Addgene #40260）から、ＳｇｒＡＩおよびＦｓｅＩクローニング部位を含有するプライマーで増幅し、上記ｐＡＣ１３５６〜１３５８から増幅された多様なＦｓｅＩ−ＰＵＦ−ＰａｃＩおよびｐＡＣ１４９：ｐＣＲ８−ｄＣａｓ９ＶＰ１６０（Addgene #48221）から消化したベクターと連結して、それぞれ、クローバー＿ＰＵＦａおよびクローバー＿ＰＵＦｃ、ｍＲｕｂｙ２＿ＰＵＦａのＯＲＦを含有するゲートウェイドナーベクター、ｐＡＣ１４０２、ｐＡＣ１４０３およびｐＡＣ１４０４を生成した。これらのＯＲＦを次いで、ｐＡＣ１１１９：ＰＢ３−ｎｅｏ（−）−ｐｍａｘＤＥＳＴ（＋）と、ＬＲクロナーゼ（Invitrogen）により組み換えることによって、ＰＢ３−ｎｅｏベクターにトランスファーして、発現ベクターｐＡＣ１３６０（クローバー＿ＰＵＦａ）、ｐＡＣ１３８１（クローバー＿ＰＵＦｃ）およびｐＡＣ１３６２（ｍＲｕｂｙ２＿ＰＵＦａ）を生成した。

【0271】

ＮＬＳＫＲＡＢリプレッサードメインを、ＡｇｅＩ−ＣｌａＩ部位を含有するプライマーを用いて、ＳＯＸ２ ＴＡＬＥリプレッサー（ＫＲＡＢ １−７５）（Ａｄｄｇｅｎｅ ＃４２９４５）から増幅し、そしてＡｃｌＩ ＰａｃＩ部位を含有するプライマーで増幅したＮＬＳＰＵＦａ、およびベクターとしてのＳｇｒＡＩ−ＰａｃＩ消化したｐＡＣ１３６０と連結して、ｐＡＣ１４１２：ＰＢ３−ｎｅｏ（−）−ｐｍａｘ−ＮＬＳＫＲＡＢ＿ＮＬＳＰＵＦａを生成した。

【0272】

ＦｓｅＩ−ｐ６５ＨＳＦ１−ＰａｃＩ断片をｐＡＣ１３９３から放出させて、そしてｐＡＣ１３５６から放出させたＳｇｒＡＩ−ＮＬＳＰＵＭｂ断片、およびベクターとして、ＳｇｒＡＩ−ＰａｃＩで消化したｐＡＣ１３６０と連結して、ｐＡＣ１４１３：ＰＢ３−ｎｅｏ（−）−ｐｍａｘ−ＮＬＳＰＵＦｂ＿ｐ６５ＨＳＦ１を生成した。ＢＦＰＫＲＡＢ断片をｐＨＲ−ＳＦＦＶ−ｄＣａｓ９−ＢＦＰ−ＫＲＡＢ（Addgene #46911）から増幅し、そしてこれを用いてｐＡＣ１３６０からクローバー断片を置換して、ｐＡＣ１４１４：ＰＢ３−ｎｅｏ（−）−ｐｍａｘ−ＢＦＰＫＲＡＢ＿ＮＬＳＰＵＦａを生成した。次いで、ＮｈｅＩ−ＣＡＧＧＳ−ＮＬＳＰＵＦｂ＿ｐ６５ＨＳＦ１−ＮｈｅＩ断片を、ｐＡＣ１４１３から増幅して、そしてＮｈｅＩで消化したｐＡＣ１４１４内に挿入して、ＢＦＰＫＲＡＢ−ＮＬＳＰＵＦａおよびＮＬＳＰＵＦｂ−ｐ６５ＨＳＦ１の二重発現ベクター（ｐＡＣ１４１４：ＰＢ３−ＮＬＳＰＵＦｂ＿ｐ６５ＨＳＦ１（−）ｎｅｏ（−）−ＢＦＰＫＲＡＢ２＿ＮＬＳＰＵＦａ）を生成した。

【0273】

改善されたリンカー配列、およびＰＵＦのＮ末端の３つの過剰なＮＬＳおよびＣ末端の１つのさらなるＮＬＳ、ならびにＮ末端（ＳｇｒＡＩ、ＣｌａＩ）およびＣ末端（ＦｓｅＩ−ＰａｃＩ）挿入のためのクローニング部位を含む４つのゲートウェイドナーベクターを生成した（ｐＡＣ１４０４〜１４０８）。ＦｓｅＩ−ＰａｃＩ部位を含有するプライマーを用いて、マウスｃＤＮＡを用い、マウスＣｒｅｂｂｐ遺伝子からＨＡＴ配列を増幅し、そしてｐＡＣ１６４に挿入して、ｐＡＣ１３６４：ｐｍａｘ−ｄＣａｓ９Ｍａｓｔｅｒ＿ＣＢＰＨＡＴを生成し、そしてｐＡＣ１４０５に挿入して、ｐＡＣ１４１５：ｐＣＲ８−４×ＮＬＳＰＵＦａ＿２×ＮＬＳ＿ＣＢＰＨＡＴを生成した。ＳｇｒＡＩ−ＡｃｌＩ部位を含有するプライマーの別の対を用いて、ＨＡＴ配列を増幅し、そしてｐＡＣ１４０５のＳｇｒＡＩ−ＣｌａＩ部位にクローニングして、ｐＡＣ１４１６：ｐＣＲ８−ＣＢＰＨＡＴ＿４×ＮＬＳＰＵＦａ＿２×ＮＬＳを生成した。ｐＡＣ１４１５およびｐＡＣ１４１６をｐＡＣ９０：ｐｍａｘ−ＤＥＳＴ（Addgene #48222）内に組み換えて、それぞれ、発現ベクターｐＡＣ１４１７：ｐｍａｘ−４×ＮＬＳＰＵＦａ＿２×ＮＬＳ＿ＣＢＰＨＡＴおよびｐＡＣ１４１８：ｐｍａｘ−ＣＢＰＨＡＴ＿４×ＮＬＳＰＵＦａ＿２×ＮＬＳを生成した。ＦｓｅＩ−ｍＣｈｅｒｒｙ−ＰａｃＩ断片を、ｍＣｈｅｒｒｙ配列を含有するプラスミドから増幅し、そしてＳｇｒＡＩ−ｄＣａｓ９−ＦｓｅＩとともに、ＰＢ３−ｎｅｏ（−）−ｐｍａｘに連結させて、ｐＡＣ１４１９：ＰＢ３−ｎｅｏ（−）−ｐｍａｘ−ｄＣａｓ９Ｍａｓｔｅｒ＿ｍＣｈｅｒｒｙを生成した。

【0274】

ｓｇＲＮＡ−ＰＢＳの発現ベクターを以下のように構築した：まず、ガイド配列のオリゴクローニングのためのＢｂｓＩ、およびＰＢＳ挿入のための３’ ＢｓａＩ（ターミネーターの右上流）を含む、ｓｇＦ＋Ｅに基づくｓｇＲＮＡ足場を、ｇＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として注文し、そしてｐＸ３３０（Addgene #42230）にクローニングして、ＡｆｌＩＩＩ−ＮｏｔＩ領域を置換して、ベクターｐＡＣ１３９４：ｐＸ−ｓｇＦＥ−ＢｓａＩ（ＡＧＡＴ）を生成した。次いで、各々、ｇｇｃスペーサーによって分離され、一方で、５’−ＡＧＡＴ−３’オーバーハング、そしてもう一方で５’−ＡＴＣＴ−３’が隣接した５×ＰＢＳａをコードするオリゴを、Ｔ４ＰＮＫで処理し、そしてアニーリングして、そしてＢｓａＩで消化した（適合するオーバーハングを生成するため）ｐＡＣ１３９４内に連結した。次いで、クローンを、１コピー（５×ＰＢＳ）、２コピー（１０×ＰＢＳ）等の、異なる数のＰＢＳのオリゴ挿入物に関してスクリーニングした。１×ＰＢＳおよび２×ＰＢＳベクターに関しては、１つのＰＢＳ部位を含有するオリゴを用いてこれらを構築した。次いで、各ターゲットに関するガイド配列を、先に記載されるように、ＢｂｓＩ部位を通じてｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ発現ベクター上にクローニングした。ＧＦＰ発現マーカーを含むｓｇＲＮＡ発現ベクターに関しては、ｐＸベクター由来のｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ発現カセットを、ＡｓｃＩ部位を通じてＰＢ−ＧＦＰベクター上にトランスファーすることによって、これらを構築した。異なるｓｇＲＮＡ発現構築物を表Ｓ１に列挙する。

【0275】

実験のための細胞培養
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Lonza）、４％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Gibco）、１％ピルビン酸ナトリウム（Gibco）およびペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco）を含むダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Sigma）中で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養した。インキュベーター条件は、３７℃および５％ＣＯ_２であった。活性化実験のため、２００ｎｇのｄＣａｓ９構築物、１００ｎｇの修飾ｓｇＲＮＡおよび１００ｎｇのＰＵＦ融合体で、Ａｔｔｒａｃｔｅｎｅトランスフェクション試薬（Qiagen）を用いてトランスフェクションする前日に、細胞を、１２ウェルプレートに、ウェルあたり１００，０００細胞で植え付けた。トランスフェクション後、細胞を４８時間増殖させ、そしてＲＮＡ抽出または蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）のいずれかのため、採取した。二重活性化抑制実験に関しては、トランスフェクションは同じままであるが、ＦＡＣＳのために採取する前に、細胞を、ウェルあたり１５０，０００細胞で１２ウェルプレートに植え付け、そして７２時間増殖させた。ＯＣＴ４およびＳＯＸ２二重活性化−抑制実験のため、ＲＮＡ抽出前に、細胞をＢＦＰ（アクチベーター−リプレッサーモジュールＰＵＦｂ−ｐ６５ＨＳＦ１／ＢＦＰＫＲＡＢ−ＰＵＦａに関して）、ｍＣｈｅｒｒｙ（ｄＣａｓ９ｍＣｈｅｒｒｙに関して）およびＧＦＰ（ＥＧＦＰを同時発現するベクター上のｓｇＲＮＡ−ＰＢＳに関して）によって三重ソーティングした。画像化実験のため、５０ｎｇのｄＣａｓ９構築物、５００ｎｇの修飾ｓｇＲＮＡ、および５０ｎｇのＰＵＦ蛍光融合体で、Attracteneトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションする前日に、細胞を、ウェルあたり３００，０００細胞で２２ｘ２２ｘ１顕微鏡カバーガラスを含む６ウェルプレート内に植え付けた。トランスフェクション後、細胞を４８時間増殖させて、次いで、免疫染色した。

【0276】

定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
細胞をトリプシンで採取し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ｄＰＢＳ）で洗浄し、１２５ｇで５分間遠心分離し、そして次いで、RNeasy Plusミニキット（Qiagen）を用いてＲＮＡを抽出した。１μｇのＲＮＡとともに、Applied Biosystems高容量ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキットを用いて、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。内因性対照としてＧＡＰＤＨ（Ｈｓ０３９２９０９７、ＶＩＣ）を、そしてターゲットとしてＯＣＴ４（Ｈｓ００９９９６３２、ＦＡＭ）およびＳＯＸ２（Ｈｓ０１０５３０４９、ＦＡＭ）を用いて、ＴａｑＭａｎ遺伝子発現アッセイ（Applied Biosystems）を設計した。２μｌの１：１０希釈ｃＤＮＡを各反応に用いて、ＴａｑＭａｎ普遍的マスターミックスＩＩを、ＵＮＧ（Applied Biosystems）と、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に用いた。Applied Biosystems ＶｉｉＡ７装置を用いて、活性化を分析した。「デルタデルタＣｔ」アルゴリズムによって遺伝子発現レベルを計算し、そして対照試料に対して規準化した。

【0277】

蛍光活性化細胞ソーティング
細胞をトリプシン処理し、そして２％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した。その後、細胞を１２５ｇで５分間遠心分離し、そしてｄＰＢＳ中に再懸濁した。CellQuest Proソフトウェア（BD Bioscience）を用いて、FACScaliburフローサイトメーター上で、試料を分析した。各実行で１０００事象を収集した。

【0278】

免疫染色および顕微鏡検査
カバーガラス上に接着した細胞を、２％パラホルムアルデヒドで固定し、ｄＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で洗浄し、ｄＰＢＳ中の０．４％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で４℃で５分間透過処理し、５％ブロッティング等級ブロッキング緩衝液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）で３０分間ブロッキングし、ブロッキング緩衝液中の一次抗体と４℃で一晩インキュベーションし、ｄＰＢＳで３回洗浄し、次いで、暗所で、それぞれのAlexa蛍光コンジュゲート化二次抗体と室温で３時間インキュベーションし、再び洗浄し、そしてＤＡＰＩで染色した。画像化の前に、カバーガラスを、グリセロールでスライド上にマウントした。テロメアの免疫染色を、抗ＴＲＦ２一次抗体（Novus Biologicals:NB110-57130）の１：１００希釈、およびＡｌｅｘａ蛍光５９４コンジュゲート化抗ウサギＩｇＧ二次抗体（Invitrogen、A11037）の１：５００希釈で行った。ＣＲＥＳＴ抗体（Antibodies Incorporated:15-235-0001）の１：１００希釈を、Alexa蛍光５９４コンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Invitrogen、A11014）の１：５００希釈と組み合わせて用いて、セントロメアを検出した。

【0279】

上記実施例で用いた構築物のいくつかの配列および関連配列を本明細書において以下に列挙する。

【0280】

【化8】

【0281】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基６〜１２であり、ＰＵＦａは残基１５〜３６３であり、そしてＶＰ６４は残基３７１〜４２１である。

【0282】

【化9】

【0283】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基６〜１２であり、ＰＵＦｂは残基１５〜３６３であり、そしてＶＰ６４は残基３７１〜４２１である。

【0284】

【化10】

【0285】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基６〜１２であり、ＰＵＦｗは残基１５〜３６３であり、そしてＶＰ６４は残基３７１〜４２１である。

【0286】

【化11】

【0287】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基６〜１２であり、ＰＵＦｃは残基１５〜３６３であり、そしてＶＰ６４は残基３７１〜４２１である。

【0288】

【化12】

【0289】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基２６４〜２７０であり、ＰＵＦａは残基２７３〜６２１であり、そしてクローバーは残基１〜２５１である。

【0290】

【化13】

【0291】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基２６４〜２７０であり、ＰＵＦｃは残基２７３〜６２１であり、そしてクローバーは残基１〜２５１である。

【0292】

【化14】

【0293】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基２８４〜２９０であり、ＰＵＦａは残基２９３〜６４１であり、そして６ｘＨｉｓ−ｍＲｕｂｙ２は、残基６〜１１に６ｘＨｉｓタグを含み、残基１〜２７１である。

【0294】

【化15】

【0295】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基６〜１２であり、ＰＵＦａは残基１５〜３６３であり、ｐ６５は残基４２７〜５７５であり、そしてＨＳＦ１は残基５８４〜７０７である。

【0296】

【化16】

【0297】

上記配列において、２つのＮＬＳ配列は残基４〜１０および残基９９〜１０５であり、ＰＵＦａは残基１０８〜４５６であり、そしてＫＲＡＢは残基１１〜９２である。

【0298】

【化17】

【0299】

上記配列において、ＮＬＳ配列は残基３７０〜３７６であり、ＰＵＦａは残基３７９〜７２７であり、そしてＨＡ−２ｘＮＬＳ−ＢＦＰＫＲＡＢは、残基３〜１１にＨＡタグを含み、残基１〜３５５である。

【0300】

【化18】

【0301】

上記配列において、２つのＮＬＳ配列は残基３０〜３６および１４０８〜１４１４であり、ｄＣａｓ９は残基４０〜１４０６であり、ｍＣｈｅｒｒｙは残基１４３６〜１６７１であり、そしてＨＡタグは残基２０〜２８である。

【0302】

【化19】

【0303】

上記配列において、６つの７残基ＮＬＳ配列は残基７７３、７８１、７８９、８２６、１１８５、および１１９３で始まり、ＰＵＦａは残基８３５〜１１８３であり、そしてＣＢＰＨＡＴは残基２〜７６４である。

【0304】

【化20】

【0305】

上記配列において、６つの７残基ＮＬＳ配列は残基１０、１８、２６、６３、４２２、および４３０で始まり、ＰＵＦａは残基７２〜４２０であり、そしてＣＢＰＨＡＴは残基４５８〜１２２０である。

【0306】

【表11-1】

【0307】

【表11-2】

【0308】

【表11-3】

【0309】

【表11-4】

【0310】

【表11-5】

【0311】

【表11-6】

【0312】

【表11-7】

【0313】

【表11-8】

【0314】

【表11-9】

【0315】

【表11-10】

【0316】

【表12-1】

【0317】

【表12-2】

【0318】

【表12-3】

【0319】

【表12-4】

【0320】

【表12-5】

【0321】

【表12-6】

【0322】

【表12-7】

【0323】

ベクターのリストおよびそのＡｄｄｇｅｎｅ寄託番号

【0324】

【表13-1】

【0325】

【表13-2】

【0326】

【表13-3】

【0327】

【表13-4】

【0328】

ＰＢＳの数および型によるｓｇＲＮＡ−ＰＢＳ発現ベクターのリスト

【0329】

【表14】

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図3-4】

【図4-1】

【図4-2】

【図4-3】

【図4-4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図6-4】

【図7】

【図8】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]