特許 6868060 皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物、およびその抽出物を含む医薬組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6868060

(24)【登録日】2021年4月13日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物、およびその抽出物を含む医薬組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/287 20060101AFI20210426BHJP

   A61K 31/352 20060101ALI20210426BHJP

   C12P 17/06 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 37/08 20060101ALN20210426BHJP

   A61P 17/06 20060101ALN20210426BHJP

   A61K 9/06 20060101ALN20210426BHJP

   A61K 9/08 20060101ALN20210426BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/287

   A61K31/352

   C12P17/06

   A61P17/00

   !A61P37/08

   !A61P17/06

   !A61K9/06

   !A61K9/08

【請求項の数】21

【全頁数】22

(21)【出願番号】特願2019-114564(P2019-114564)

(22)【出願日】2019年6月20日

(65)【公開番号】特開2021-1127(P2021-1127A)

(43)【公開日】2021年1月7日

【審査請求日】2019年6月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】390023582

【氏名又は名称】財團法人工業技術研究院

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110002837

【氏名又は名称】特許業務法人アスフィ国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】潘 一紅

(72)【発明者】

【氏名】姚 心然

(72)【発明者】

【氏名】呂 居勳

(72)【発明者】

【氏名】▲温▼ 淑芳

(72)【発明者】

【氏名】許 博堯

(72)【発明者】

【氏名】李 明翰

(72)【発明者】

【氏名】莊 凱安

(72)【発明者】

【氏名】張 志萱

【審査官】 深草 亜子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１４−１３２８９４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１５−０６３４９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１９／０７００５６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２０１５−２１２２３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００７−１９７３４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０５−０８５９３４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平１１−２４６４５５（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

皮膚疾患の治療効果を有するキク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）抽出物の作製方法であって、
（ａ）抽出溶媒を用いてキクに抽出工程を行って抽出液を得るステップと、
（ｂ）少なくとも１つの糖質加水分解酵素（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）を前記抽出液に加え、酵素反応を起こしてルテオリンおよびアピゲニンの含有量が高まった沈殿物を生成するステップと、
を含み、
前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素が、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼおよびグルクロニダーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つであって、
前記沈殿物が前記皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物である、
皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項2】

前記抽出溶媒が水またはアルコールを含む、請求項１に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項3】

前記抽出工程の温度が７０〜１００℃である、請求項１または２に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項4】

前記抽出工程に要する時間が１〜３時間である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項5】

前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素がグルコシダーゼであり、前記グルコシダーゼがβ-グルコシダーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項6】

前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素がグルコシダーゼおよびグルクロニダーゼであり、かつ前記グルコシダーゼがβ-グルコシダーゼであり、前記グルクロニダーゼがβ-グルクロニダーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項7】

前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素と前記キクとの重量比が１：２００〜１００００である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項8】

前記酵素反応の温度が２５〜４５℃である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項9】

前記酵素反応に要する時間が５〜３０時間である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項10】

前記抽出液が水である、請求項１〜４、７〜９のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項11】

前記抽出工程の温度が７０〜１００℃である、請求項１０に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項12】

前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素がβ-グルコシダーゼである、請求項１０または１１に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項13】

前記β-グルコシダーゼと前記キクとの重量比が１：２００〜１００００である、請求
項１２に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項14】

前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素がβ-グルコシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼである、請求項１０または１１に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項15】

前記β−グルコシダーゼおよび前記β−グルクロニダーゼと前記キクとの重量比が１：２００〜１００００である、請求項１４に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項16】

前記β−グルコシダーゼと前記β−グルクロニダーゼとの重量比が１〜２：１〜２である、請求項１４に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項17】

前記ステップ（ｂ）において、前記酵素反応の後、冷却工程をさらに行って沈殿物の生成を促進する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項18】

前記冷却工程の温度が約２〜１５℃であり、前記冷却工程に要する時間が２〜２４時間である、請求項１７に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項19】

前記ステップ（ｂ）の後に、前記沈殿物に洗浄工程を行うステップをさらに含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項20】

前記洗浄工程が、
（ｉ）前記沈殿物をアルコール溶媒で再溶解して混合溶液を作製するステップであって、前記混合溶液が溶液部分および不溶物を含む、ステップと、
（ｉｉ）前記溶液部分に濃縮および乾燥プロセスを行って洗浄した沈殿物を得るステップと、
を含む、請求項１９に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【請求項21】

前記アルコール溶媒がメタノールまたはエタノールを含む、請求項２０に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本技術分野は植物抽出物の作製方法に関し、より詳細には、皮膚疾患の治療効果を有するキク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）抽出物の作製方法、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物、およびこの抽出物を含む皮膚疾患の治療に用いる医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

皮膚疾患は全世界で最もよく見られる疾患であり、人口の約３分の１が、一生の間に病理上の皮膚疾患を患う。保健医療支出において、皮膚関連の医療コストは２５％にも達する。

【0003】

皮膚疾患は４つの主要なカテゴリー、つまり皮膚炎（例えばアレルギー性および接触性）、癌（例えばメラノーマ）、免疫疾患（例えば乾癬）、ならびに感染性皮膚疾患（例えば細菌、真菌、およびウィルス感染）に分けることができる。

【0004】

ステロイド外用薬は、様々な皮膚の状態、特にアトピー性皮膚炎および乾癬に広く用いられている。深刻な皮膚炎患者にはより高い用量でステロイドが用いられる。ステロイドに分類される多くの化合物、例えばベタメタゾンまたはプレドニゾロンは、炎症性疾患の治療に非常に効果的である。しかし、これら化合物の長期間にわたる使用は、患者の皮膚萎縮を引き起こす可能性もある。ステロイド治療中に皮膚萎縮が生じた患者は通常、ステロイドレスポンダー（ｓｔｅｒｏｉｄ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）と見なされる。すでに皮膚疾患の症状のある患者（例えば乾癬患者）に対する皮膚萎縮の影響が懸念されている。しかし、正常な皮膚であっても、ステロイドを長期間使用するケースでは、皮膚損傷などの副作用が生じ得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

よって、ステロイドに代わり得る安全な皮膚用薬、特に植物性の薬の開発が、重要課題となっている。

【0006】

本開示は、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法であって、（ａ）抽出溶媒を用いてキクに抽出工程を行って抽出液を得るステップと、（ｂ）少なくとも１つの糖質加水分解酵素（ｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ）を抽出液に加え酵素反応を起こして沈殿物を生成するステップとを含み、該沈殿物が皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物である方法を提供する。

【0007】

本開示はまた、上述の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法を用いて得られる、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物も提供する。

【0008】

本開示はまた、次の２つの指標成分（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ）、つまりルテオリンおよびアピゲニンを少なくとも含む皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物であって、該キク抽出物中、ルテオリンとアピゲニンとの含有量比が約１：１〜３０である、キク抽出物も提供する。

【0009】

本開示は、皮膚疾患の治療に用いる医薬組成物であって、任意の上述した皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物と、薬学的に許容されるビヒクル、担体または塩と、を含む医薬組成物をさらに提供する。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明は、以下の通りである。
［１］皮膚疾患の治療効果を有するキク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）抽出物の作製方法であって、
（ａ）抽出溶媒を用いてキクに抽出工程を行って抽出液を得るステップと、
（ｂ）少なくとも１つの糖質加水分解酵素を前記抽出液に加え、酵素反応を起こして沈殿物を生成するステップと、
を含み、
前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素が、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼおよびグルクロニダーゼからなる群より選ばれた少なくとも１つであって、
前記沈殿物が前記皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物である、
皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0011】

［２］前記抽出溶媒が水またはアルコールを含む、［１］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0012】

［３］前記抽出工程の温度が７０〜１００℃である、［１］または［２］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0013】

［４］前記抽出工程に要する時間が１〜３時間である、［１］〜［３］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0014】

［５］前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素がグルコシダーゼであり、前記グルコシダーゼがβ-グルコシダーゼである、［１］〜［４］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0015】

［６］前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素がグルコシダーゼおよびグルクロニダーゼであり、かつ前記グルコシダーゼがβ-グルコシダーゼであり、前記グルクロニダーゼがβ-グルクロニダーゼである、［１］〜［４］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0016】

［７］前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素と前記キクとの重量比が１：２００〜１００００である、［１］〜［６］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0017】

［８］前記酵素反応の温度が２５〜４５℃である、［１］〜［７］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0018】

［９］前記酵素反応に要する時間が５〜３０時間である、［１］〜［８］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0019】

［１０］前記抽出液が水である、［１］〜［４］、［７］〜［９］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0020】

［１１］前記抽出工程の温度が７０〜１００℃である、［１０］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0021】

［１２］前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素がβ-グルコシダーゼである、［１０］または［１１］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0022】

［１３］前記β-グルコシダーゼと前記キクとの重量比が１：２００〜１００００である、［１２］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0023】

［１４］前記少なくとも１つの糖質加水分解酵素がβ-グルコシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼである、［１０］または［１１］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0024】

［１５］前記β−グルコシダーゼおよび前記β−グルクロニダーゼと前記キクとの重量比が１：２００〜１００００である、［１４］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0025】

［１６］前記β−グルコシダーゼと前記β−グルクロニダーゼとの重量比が１〜２：１〜２である、［１４］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0026】

［１７］前記ステップ（ｂ）において、前記酵素反応の後、冷却工程をさらに行って沈殿物の生成を促進する、［１］〜［１６］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0027】

［１８］前記冷却工程の温度が約２〜１５℃であり、前記冷却工程に要する時間が２〜２４時間である、［１７］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0028】

［１９］前記ステップ（ｂ）の後に、前記沈殿物に洗浄工程を行うステップをさらに含む［１］〜［１８］のいずれかに記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0029】

［２０］前記洗浄工程が、
（ｉ）前記沈殿物をアルコール溶媒で再溶解して混合溶液を作製するステップであって、前記混合溶液が溶液部分および不溶物を含む、ステップと、
（ｉｉ）前記溶液部分に濃縮および乾燥プロセスを行って洗浄した沈殿物を得るステップと、
を含む、［１９］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0030】

［２１］前記アルコール溶媒がメタノールまたはエタノールを含む、［２０］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法。

【0031】

［２２］下記２つの指標成分：
ルテオリン、および
アピゲニン
を少なくとも含む皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物であって、
前記ルテオリンおよび前記アピゲニンの含有量の和が約１５〜８５ｗｔ％である、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物。

【0032】

［２３］［２２］に記載の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物と、薬学的に許容されるビヒクル、担体または塩と、を含む皮膚疾患の治療に用いる医薬組成物。

【0033】

［２４］前記医薬組成物が局所剤形（ｔｏｐｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ）であり、前記局所剤形は軟膏、クリーム、液剤またはゲルを含む、［２３］に記載の皮膚疾患の治療に用いる医薬組成物。

【0034】

［２５］前記皮膚疾患がアレルギー性皮膚炎もしくは接触性皮膚炎、または乾癬を含む、［２３］または［２４］に記載の皮膚疾患の治療に用いる医薬組成物。

【発明の効果】

【0035】

ステロイドに代わり得る安全な植物性の皮膚疾患用治療薬を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1A】図１Ａは、未処置群（処理を施していない）、対照群（５０ｍｇイミキモド（ＩＭＱ）クリーム）、イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋軟膏のビヒクル）および実験群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋ＰＴＢＸ軟膏）のマウスの背中の皮膚の紅斑スコアを示している。平均±標準偏差。＃＃＃：ｐ＜０．００１（未処置群と比較）、φφ：ｐ＜０．０１（対照群と比較）。Ｔ検定。

【図1B】図１Ｂは、未処置群（処理を施していない）、対照群（５０ｍｇイミキモド（ＩＭＱ）クリーム）、イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋軟膏のビヒクル）および実験群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋ＰＴＢＸ軟膏）のマウスの背中の皮膚の落屑スコアを示している。平均±標準偏差。＃＃＃：ｐ＜０．００１（未処置群と比較）。φφφ：ｐ＜０．００１（対照群と比較）。＊：ｐ＜０．０５（イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群と比較）。Ｔ検定。

【図1C】図１Ｃは、未処置群（処理を施していない）、対照群（５０ｍｇイミキモド（ＩＭＱ）クリーム）、イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋軟膏のビヒクル）および実験群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋ＰＴＢＸ軟膏）のマウスの背中の皮膚の累積スコア（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｓｃｏｒｅ）を示している。平均±標準偏差。＃＃＃：ｐ＜０．００１（未処置群と比較）。φφφ：ｐ＜０．００１（対照群と比較）。＊：ｐ＜０．０５（イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群と比較）。Ｔ検定。

【図1D】図１Ｄは、未処置群（処理を施していない）、対照群（５０ｍｇイミキモド（ＩＭＱ）クリーム）、イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋軟膏のビヒクル）および実験群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋ＰＴＢＸ軟膏）のマウスの背中の皮膚の写真およびＨ＆Ｅ染色の結果を示している。

【図1E】図１Ｅは、未処置群（処理を施していない）、対照群（５０ｍｇイミキモド（ＩＭＱ）クリーム）、イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋軟膏のビヒクル）および実験群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋ＰＴＢＸ軟膏）のマウスの背中の皮膚の厚みを示している。平均±標準偏差。＃＃＃：ｐ＜０．００１（未処置群と比較）。＊：ｐ＜０．０５（イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群と比較）。Ｔ検定。

【図1F】図１Ｆは、未処置群（処理を施していない）、対照群（５０ｍｇイミキモド（ＩＭＱ）クリーム）、イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋軟膏のビヒクル）および実験群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋ＰＴＢＸ軟膏）のマウスの背中の皮膚のケラチン（Ｋ１４）遺伝子発現量を示している。平均±標準偏差。＃＃＃：ｐ＜０．００１（未処置群と比較）。＊：ｐ＜０．０５（イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群と比較）。Ｔ検定。

【図1G】図１Ｇは、未処置群（処理を施していない）、対照群（５０ｍｇイミキモド（ＩＭＱ）クリーム）、イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋軟膏のビヒクル）および実験群（５０ｍｇイミキモドクリーム＋ＰＴＢＸ軟膏）のマウスの背中の皮膚のフィラグリン（ＦＬＧ）遺伝子発現量を示している。平均±標準偏差。＃：ｐ＜０．０５（未処置群と比較）。＊＊：ｐ＜０．０１（イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群と比較）。Ｔ検定。

【発明を実施するための形態】

【0037】

以下の詳細な記載においては、説明の目的で、開示される実施形態が十分に理解されるよう、多数の具体的な詳細が記載される。しかしながら、これら具体的な説明が無くとも１つまたはそれ以上の実施形態が実施可能であることは、明らかであろう。また、図を簡潔とするため、周知の構造および装置は概略的に示される。

【0038】

添付の図面を参照しながら、以下の実施形態において詳細な説明を行う。添付の図面ならびに以下の詳細な説明および実施例の開示より、本発明をより十分に理解することができる。

【0039】

（１）キク抽出物の作成方法
本開示は、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法を提供する。本明細書に記載される皮膚疾患に特定の限定はなく、例として皮膚炎（例えばアレルギー性または接触性）、免疫疾患（例えば乾癬）、感染性皮膚疾患（例えば細菌、真菌、ウィルス感染）であり得る。

【0040】

上記方法は、限定はされないが、次のステップを含み得る。

【0041】

先ず、抽出溶媒を用いてキクに抽出工程を行って抽出液を得る。前記抽出液は、抽出工程から直接得た抽出液であってもよいし、あるいは水または緩衝液を用い上述の抽出工程から直接得られた抽出液をさらに乾燥させることにより形成された粉末を再溶解してなる溶液であってもよく、特に限定はない。緩衝液の例には、限定はされないが、酢酸緩衝液が含まれ得る。

【0042】

本発明のキク抽出物の作成に用いられるキクは、キク属のキク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）である。キク属の中でも後述するシマカンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ、金門油菊）、シロバナムシヨケギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉｉｆｏｌｉｕｍ）およびオッタチカンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ、台湾小油菊）等のキクでは、所望のキク抽出物は得られない。

【0043】

また、上述した抽出溶媒の例には水およびアルコールが含まれ得るが、これらに限定はされない。一実施形態では、抽出溶媒は水であってよい。

【0044】

抽出工程の温度は約７０〜１００℃であるが、これに限定されない。一実施形態では、抽出工程の温度は約８０〜９５℃である。また、抽出工程に要する時間は約１〜３時間であり得るが、これに限定はされない。一実施形態では、抽出工程に要する時間は約１〜２時間であり得る。

【0045】

次いで、少なくとも１つの糖質加水分解酵素を抽出液に加え、酵素反応を起こして沈殿物を生成する。得られた沈殿物が、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物である。

【0046】

上記糖質加水分解酵素と上記キクとの重量比は約１：２００〜１００００、例えば１：３０００〜８０００、１：１５００〜４０００、１：７５０〜２０００、１：３００〜８００であってよいが、これらに限定されることはない。一実施形態では、上記糖質加水分解酵素と上記キクとの重量比は約１：３０００〜８０００であってよい。別の実施形態では、上記糖質加水分解酵素と上記キクとの重量比は約１：１５００〜４０００であってよい。また別の実施形態では、上記糖質加水分解酵素と上記キクとの重量比は約１：７５０〜２０００であってよい。さらに別の実施形態では、上記糖質加水分解酵素と上記キクとの重量比は約１：３００〜８００であってよい。

【0047】

また、上記酵素反応に要する温度は約２５〜４５℃、例えば２５℃、３０℃、３５℃、３６℃、３７℃、３７．５℃、３８℃、３９℃、４０℃であってよいが、これらに限定はされない。一実施形態では、上記酵素反応の温度は約３７℃であり得る。加えて、上記酵素反応に要する時間は約５〜３０時間、例えば５〜２５時間、１０〜２４時間であってよいが、これらに限定はされない。一実施形態では、上記酵素反応に要する時間は約１６〜２４時間であり得る。

【0048】

上記糖質加水分解酵素は、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、およびこれら任意の組み合わせが含まれる。上記グルコシダーゼにはα-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。上記ガラクトシダーゼにはα-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。さらに、上記グルクロニダーゼにはα-グルクロニダーゼ、β-グルクロニダーゼ、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。

【0049】

一実施形態では、上記少なくとも１つの糖質加水分解酵素はグルコシダーゼであり得、この実施形態において、上記グルコシダーゼはβ−グルコシダーゼである。また、この実施形態において、上記β−グルコシダーゼと上記キクとの重量比は約１：２００〜１００００、例えば１：３０００〜８０００、１：１５００〜４０００、１：７５０〜２０００、１：３００〜８００であってよいが、これらに限定はされない。一実施形態では、上記β−グルコシダーゼと上記キクとの重量比は約１：３０００〜８０００であってよい。別の実施形態では、上記β−グルコシダーゼと上記キクとの重量比は約１：１５００〜４０００であってよい。また別の実施形態では、上記β−グルコシダーゼと上記キクとの重量比は約１：１５００であってよい。さらに別の実施形態では、上記β−グルコシダーゼと上記キクとの重量比は約１：７５０〜２０００であり得る。さらにまた別の実施形態では、上記β−グルコシダーゼと上記キクとの重量比は約１：３００〜８００であり得る。

【0050】

一実施形態では、上記少なくとも１つの糖質加水分解酵素はグルコシダーゼおよびグルクロニダーゼであり得る。この実施形態において、グルコシダーゼとグルクロニダーゼとの重量比は約１〜２：１〜２、例えば１：１、１．５：１、２：１、１：１．５、１：２などであってよいが、これらに限定はされない。また、この実施形態において、グルコシダーゼおよびグルクロニダーゼと上記キクとの重量比は約１：２００〜１００００、例えば１：３０００〜８０００、１：１５００〜４０００、１：７５０〜２０００、１：３００〜８００であってよいが、これらに限定はされない。一実施形態では、グルコシダーゼおよびグルクロニダーゼと上記キクとの重量比は約１：１５００〜４０００であり得る。

【0051】

さらに、上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法では、一実施形態において、水を用いてキクに抽出工程を行って、キクの水抽出物を得る。

【0052】

また、この実施形態において、上記抽出工程の温度は約７０〜１００℃であってよく、かつ上記抽出工程に要する時間は約１〜３時間であり得る。

【0053】

さらに、水を抽出溶媒として用いる上記実施形態のうち、特定の一実施形態では、少なくとも１つの糖質加水分解酵素を抽出液に加え酵素反応を起こして沈殿物を生成するステップにおいて、用いられる少なくとも１つの糖質加水分解酵素はグルコシダーゼである。このグルコシダーゼはβ−グルコシダーゼであってよい。さらに、上記酵素反応の温度は２５〜４５℃、例えば２５℃、３０℃、３５℃、３６℃、３７℃、３７．５℃、３８℃、３９℃、４０℃であってよいが、これらに限定はされない。特定の一実施形態では、上記酵素反応の温度は約３７℃であり得る。加えて、上記酵素反応に要する時間は約５〜３０時間、例えば５〜２５時間、１６〜２４時間であってよいが、これらに限定はされない。特定の一実施形態では、上記酵素反応に要する時間は約１６〜２４時間であり得る。用いられる少なくとも１つの糖質加水分解酵素がβ−グルコシダーゼであるとき、β−グルコシダーゼとキクとの重量比は１：２００〜１００００であることが好ましく、約１：３００〜１００００、例えば１：３０００〜８０００、１：１５００〜４０００、１：７５０〜２０００、１：４００〜８００とすることができるが、これらに限定されることはない。

【0054】

加えて、水を抽出溶媒として用いる上記実施形態のうち、別の特定の実施形態では、少なくとも１つの糖質加水分解酵素を抽出液に加え酵素反応を起こして沈殿物を生成するステップにおいて、用いられる少なくとも１つの糖質加水分解酵素はグルコシダーゼおよびグルクロニダーゼである。このグルコシダーゼはβ-グルコシダーゼであってよく、また、このグルクロニダーゼはβ−グルクロニダーゼであってよい。さらに、上記酵素反応の温度は３５〜４０℃、例えば３５℃、３６℃、３７℃、３７．５℃、３８℃、３９℃、４０℃であってよいが、これらに限定はされない。特定の一実施形態では、上記酵素反応の温度は約３７℃であり得る。加えて、上記酵素反応に要する時間は約５〜３０時間、例えば５〜２５時間、１６〜２４時間であってよいが、これらに限定はされない。特定の一実施形態では、上記酵素反応に要する時間は約１６〜２４時間であり得る。用いられる少なくとも１つの糖質加水分解酵素がβ−グルコシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼであるとき、β−グルコシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼとキクとの重量比は、１：２００〜１００００であることが好ましく、約１：５００〜５０００、例えば１：１５００〜４０００であってよいが、これに限定はされない。さらに、β−グルコシダーゼとβ−グルクロニダーゼとの重量比は約１〜２：１〜２、例えば１：１、１．５：１、２：１、１：１．５、１：２などであり得る。

【0055】

上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法に関し、別の実施形態では、少なくとも１つの糖質加水分解酵素を抽出液に加え酵素反応を起こして沈殿物を生成するステップにおいて、酵素反応後に、冷却工程をさらに行って沈殿物の生成を促進することができる。冷却工程の温度は約２〜１５℃、例えば４℃とすることができるが、これに限定はされない。冷却工程に要する時間は約２〜２４時間、例えば２４時間であり得る。

【0056】

別の実施形態では、上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法は、少なくとも１つの糖質加水分解酵素を抽出液に加え酵素反応を起こして沈殿物を生成するステップの後に、沈殿物に洗浄工程を行うステップをさらに含んでいてよい。

【0057】

上記洗浄工程は次のステップを含み得るが、これらに限定はされない。

【0058】

先ず、上記沈殿物をアルコール溶媒で再溶解して混合溶液を作製する。この混合溶液には溶解部分と不溶物とが含まれる。一実施形態では、上記アルコール溶媒の例には、限定はされないが、メタノールおよびエタノールが含まれ得る。一実施形態では、上記アルコール溶媒はメタノールであり得る。

【0059】

その後、溶解部分を濃縮、乾燥し、洗浄された沈殿物を得る。この沈殿物は皮膚疾患の治療効果を有する。

【0060】

任意の上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法を用いることにより、キク抽出物に酵素処理を施してバイオコンバージョン（ｂｉｏ−ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）が生じると、キク抽出物の活性成分の含量が高まると共に、溶媒に対するキク抽出物の成分の溶解度が変化し、沈殿精製の目的を達成できるようになる。

【0061】

さらに、任意の上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法を用いることにより、キク抽出物の２つの指標成分、つまりルテオリンおよびアピゲニンの総含有量が大幅に高まると共に、１ステップの酵素処理のみによって高純度のキク抽出物が得られ、１ステップ精製の効果が達せられる。任意の上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法により得られたキク抽出物中、ルテオリンおよびアピゲニンの含有量の和は約１５〜８５ｗｔ％、例えば約１５〜８０ｗｔ％、約２０〜８５ｗｔ％、約２５〜８０ｗｔ％、約３０〜８５ｗｔ％、約３５〜７５ｗｔ％、約４０〜７０ｗｔ％、約４０〜６５ｗｔ％、約４５ｗｔ％、約５０ｗｔ％、約５５ｗｔ％、約６０ｗｔ％、約６５ｗｔ％、約７０ｗｔ％、約７５ｗｔ％、約８０ｗｔ％、約８５ｗｔ％であってよいが、これらに限定はされない。

【0062】

ルテオリンとアピゲニンの含有量比は約１：１〜３０であってよいが、これに限定はされない。一実施形態では、ルテオリンとアピゲニンの含有量比は約１：１〜３０、例えば１：１〜２５とすることができるが、これらに限定はされない。

【0063】

（２）キク抽出物
したがって、本開示が、任意の上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法により得られる、皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物をも提供できることが理解され得る。

【0064】

上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法により得られるキク抽出物は、２つの指標成分、つまりルテオリンおよびアピゲニンを少なくとも含む。上記キク抽出物中、ルテオリンおよびアピゲニンの含有量の和は約１５〜８５ｗｔ％であり、例えば約１５〜８０ｗｔ％、約２０〜８５ｗｔ％、約２５〜８０ｗｔ％、約３０〜８５ｗｔ％、約３５〜７５ｗｔ％、約４０〜７０ｗｔ％、約４０〜６５ｗｔ％、約４５ｗｔ％、約５０ｗｔ％、約５５ｗｔ％、約６０ｗｔ％、約６５ｗｔ％、約７０ｗｔ％、約７５ｗｔ％、約８０ｗｔ％、約８５ｗｔ％であってよいが、これらに限定はされない。

【0065】

上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物の作製方法により得られるキク抽出物中、ルテオリンとアピゲニンとの含有量比は約１：１〜３０であってよいが、これに限定はされない。１実施形態では、ルテオリンとアピゲニンとの含有量比は約１：１〜３０、例えば１：１〜２５であってよいが、これに限定はされない。

【0066】

さらに、本開示は、別の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物であって、限定はされないが２つの指標成分、つまりルテオリンおよびアピゲニンを少なくとも含み得ると共に、ルテオリンとアピゲニンとの含有量比が約１：１〜３０であり得るがこれに限定されない、キク抽出物も提供し得る。

【0067】

一実施形態では、ルテオリンとアピゲニンとの含有量比は約１：１〜３０、例えば１：１〜２５であってよいが、これに限定はされない。

【0068】

（３）医薬組成物
加えて、本開示は、皮膚疾患を治療するのに用いる医薬組成物をさらに提供する。本開示の皮膚疾患を治療するのに用いる医薬組成物は、任意の上述した本開示の皮膚疾患の治療効果を有するキク抽出物と、薬学的に許容されるビヒクル、担体または塩と、を含み得る。

【0069】

薬学的に許容されるビヒクルは、活性成分の希釈剤、分散剤または担体として機能し得る。薬学的に許容されるビヒクルには、水、液体または固体皮膚軟化剤、シリコーン油、乳化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤、粉末、噴射剤および類似のスキンケア製品によく用いられる材料が含まれ得る。

【0070】

ビヒクルは、上記した組成物の重量の８０％〜９９．９ｗｔ％、好ましくは９０〜９９ｗｔ％を占めてよく、かつ他の補助剤（ａｄｊｕｎｃｔｓ）が存在しない場合に、組成物の残りの部分を形成することができる。

【0071】

また、肌に有益なその他の特定の成分、例えば日焼け止め、美白剤およびタンニング剤（ｓｋｉｎ ｔａｎｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）が、上記組成物中に含まれてもよい。ビヒクルには、例えば抗酸化剤、香料、 乳白剤、防腐剤、着色料および緩衝剤のような補助剤がさらに含まれていてもよい。

【0072】

加えて、一実施形態では、上述した組成物はいずれも、限定はされないが、クリーム、軟膏、ゲル、液剤、スプレー、ローション、化粧水（ｓｋｉｎ ｔｏｎｉｃｓ）、シャンプーまたはムースなどが含まれる皮膚塗布形式（ｓｋｉｎ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ ｆｏｒｍ）に製造することができる。スキンスプレーは一般に、エアロゾル化コポリマー、例えばポリビニルピロリドン、酢酸ビニル、および類似のものから構成され、かつセットローション（ｓｅｔｔｉｎｇ ｌｏｔｉｏｎ）としても機能し得る。組成物において、スキンゲルの作製方法はスプレーと類似するが、ゲル状かつアルコールフリーの形態で、皮膚をコートすることができる。スキンムースは、加圧下でエアロゾル化缶（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ ｃａｎ）から放出される泡沫である。スキンクリームは、疎水性もしくは親水性クリーム、軟膏、ゲル、軟化剤、スプレー、ローション、スキントニック、シャンプーまたはムースであってよく、当該分野において既知のタイプのスキンクリームに用いるのに適したさらなる成分が追加されても好ましく、かかるさらなる成分には、ワセリン、ワックス、ラノリン、シリコーン、リポソーム、野菜、ミネラルオイル、可塑剤、香料、防腐剤、浸透増強剤（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、ｐＨ調整剤またはスキンクリームに適したその他の成分が含まれ得る。これら成分は、肌に潤いを与え、活性成分を安定させ、組成物と皮膚との接触を増やすことができ、ひいては局所の濃度を高めると共に、組成物の放出をコントロールすることができる。

【0073】

上述の薬学的に許容される担体には、限定はされないが、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、または等張化および吸収遅延剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ａｎｄ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）などが含まれてよく、これらは薬学的投与に適したものである。医薬組成物は、従来の方法を用い、それぞれ異なる投与経路に適した剤形に製剤化することができる。

【0074】

さらに、上述の薬学的に許容される塩には、限定はされないが、無機カチオン、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはアミン塩のようなアルカリ金属塩、例えばマグネシウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、例えば亜鉛塩、アルミニウム塩またはジルコニウム塩のような２価または４価のカチオンを含む塩、を含む塩が含まれ得る。また、薬学的に許容される塩は、有機塩、例えばジシクロヘキシルアミン塩、メチル−Ｄ−グルカミン、およびアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはグルタミンのようなアミノ酸塩であってもよい。

【0075】

本開示の医薬組成物は、経口で、吸入スプレー用いて非経口で、または埋め込み型リザーバー（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を介して、投与することができる。非経口の方法には、患部への塗布、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ）、筋肉内（ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ）、関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ）、動脈内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｅｒｉａｌ）、滑膜内（ｉｎｔｒａｓｙｎｏｖｉａｌ）、胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）、髄腔内（ｉｎｔｒａｔｈｅｃａｌ）、および病巣内（ｉｎｔｒａｌｅｓｉｏｎａｌ）注射ならびに注入（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）技術が含まれ得る。

【0076】

経口用組成物（ｏｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）には、限定はされないが、錠剤、カプセル、乳剤（ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）、ならびに水性懸濁液、分散液および溶液が含まれ得る。

【0077】

局所塗布用組成物の形式には、軟膏、クリーム、液剤、ゲルなどが含まれ得るが、これらに限定はされない。

【0078】

本開示の皮膚疾患を治療するのに用いる医薬組成物は、局所剤形または全身剤形とすることができるが、これらに限定はされない。一実施形態では、本開示の皮膚疾患を治療するのに用いる医薬組成物は局所剤形であってよく、かつこの局所剤型の例には、限定はされないが、軟膏、クリーム、液剤、およびゲルが含まれ得る。

【0079】

任意の上述した本開示の皮膚疾患を治療するのに用いる医薬組成物は、各種皮膚疾患を治療するのに用いることができ、特に限定はない。また、上述の本開示の皮膚疾患を治療するのに用いる医薬組成物はすべて、各種皮膚疾患に対する優れた治療効果を有しており、皮膚炎症を治療および／または軽減する効果に特に優れている。

【0080】

一実施形態では、任意の上述した本開示の皮膚疾患を治療するのに用いる医薬組成物は、アレルギー性皮膚炎または接触性皮膚炎を治療するのに用いることができる。別の実施形態では、任意の上述した本開示の皮膚疾患を治療するのに用いる医薬組成物は、自己免疫性皮膚疾患、例えば乾癬を治療するのに用いることができる。

【実施例】

【0081】

実施例１
粗抽出物ＰＴＢ１の作製

【0082】

キク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ）およびその１５倍の重量の水とを混合して混合物を作製した。その混合物を加熱して沸騰させ（約９０〜１００℃）、加熱抽出を１時間行ってから、その中の固体残留物を除去して抽出液を得た。その抽出液に真空濃縮および乾燥工程を行い、粗抽出物ＰＴＢ１を得た。得られた粗抽出物ＰＴＢ１の重量と元の薬草材料の重量との比は約１：１．５〜４であった。

【0083】

実施例２
酵素処理抽出物ＰＴＢＸの作製

【0084】

キクおよびその１５倍の重量の水とを混合して混合物を作製した。その混合物を加熱して沸騰させ（約９０〜１００℃）、加熱抽出を１時間行ってから、その中の固体残留物を除去して抽出液を得た。

【0085】

その抽出液を室温まで冷却した後、酵素であるβ−グルコシダーゼをその中に加えた。加えた酵素の重量と元の薬草材料の重量との比は１：１５００であった。次いで、その酵素含有抽出液を３７℃のインキュベーターに入れ、１６〜２４時間反応させた。反応が完了した後、その酵素反応抽出液を４℃の冷蔵庫に２４時間入れ、沈殿物の生成を促進させた。

【0086】

その溶液を固液分離して沈殿物を取り出し、その沈殿物をメタノールで再溶解して混合溶液を作製した。その混合溶液は溶液部分と不溶物とを含んでいた。次いで、溶液部分を取り出し、真空濃縮および乾燥工程を行って、酵素処理抽出物ＰＴＢＸを得た。

【0087】

実施例３
１．ＰＴＢＸ軟膏の作製

【0088】

ＰＴＢＸ乾燥粉末（１ｇ）、ならびに９５％エタノール（１．４ｇ）、ポリエチレングリコール４００（１０ｇ）、ポリエチレングリコール４０００（４．５ｇ）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）（０．１５ｇ）および高純度脱イオン水（２．９５ｍｌ）の混合物を６０℃に加熱し、均一に混ざるまで攪拌して、外用軟膏剤形を作製した。このうち、９５％エタノール、ポリエチレングリコール４００、ポリエチレングリコール４０００、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油および高純度脱イオン水はビヒクルの成分である。

【0089】

２．純ビヒクル（ｓｉｍｐｌｅ ｖｅｈｉｃｌｅ）の作製

【0090】

９５％エタノール（１．４ｇ）、ポリエチレングリコール４００（１０ｇ）、ポリエチレングリコール４０００（４．５ｇ）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ｅｔｈｏｘｙｌａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ ｃａｓｔｏｒ ｏｉｌ）（０．１５ｇ）および高純度脱イオン水（２．９５ｍｌ）の混合物を６０℃に加熱し、均一に混ざるまで攪拌した。

【0091】

実施例４
酵素処理前後におけるキク抽出物の化学成分の変化

【0092】

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、酵素処理前後における抽出物中の指標成分の含有量の変化を確認した。

【0093】

この実験では、２つのフラボノイド成分、ルテオリンおよびアピゲニンをキク抽出物の指標成分として選んだと共に、これら２つの指標成分にそれぞれ対応する１つの糖誘導体、ルテオリン７−Ｏ−グルコシドおよびアピゲニン−７−Ｏ−グルコシドの含有量の変化も同時に観察し、高速液体クロマトグラフィーで各成分の含有量分析を行った。

【0094】

酵素処理前後におけるキク抽出物の高速液体クロマトグラフィーの結果を表１に示す。

【0095】

【表1】

【0096】

表１より、キク抽出物のルテオリンおよびアピゲニンの総含有量が、酵素処理前の０．０６３％（ｗ／ｗ、乾燥量基準）から、酵素処理後の６０．８４８％（ｗ／ｗ、乾燥量基準）まで高まったことがわかる。言い換えると、本開示で用いる酵素処理は、ルテオリンおよびアピゲニンの総含有量を大幅に高めることができると共に、１ステップ精製の効果を達成することができる。

【0097】

実施例５
酵素処理前後のキク抽出物の生物活性の変化

【0098】

１．酵素処理抽出物ＰＴＢＸのｉｎ ｖｉｔｒｏ角化細胞増殖抑制活性の評価

【0099】

５×１０³のＨａＣａＴ角化細胞を９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ₂のインキュベーターに入れて培養した。１６時間培養した後、この時点（Ｔ₀）での細胞数を細胞増殖の基準点として用い、異なる工程から得たキク抽出物であるＰＴＢ１またはＰＴＢＸを細胞に加えて共培養した。４８時間（Ｔ₄₈）共培養した後、プレート中の上清を除去し、５０μＬのＭＴＴ溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）を細胞に加えた。その後、プレートを３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターに入れて１．５時間培養してから、１５０μＬのＤＭＳＯをプレートに加え、プレートを５分振とうした。次いで、連続波長マイクロプレートアナライザー（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ａｎａｌｙｚｅｒ）で５７０ｎｍの吸光度を測定し、かつ下式により細胞増殖活性を計算した。

【0100】

細胞増殖活性＝ＯＤ_Ｔ0／ＯＤ_Ｔ48×１００

【0101】

実験結果を表２に示す。

【0102】

２．リポ多糖（ＬＰＳ）で誘発された炎症に対する酵素処理抽出物ＰＴＢＸのｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制の評価

【0103】

５×１０⁵細胞／ｍＬのＲＡＷ２６４．７細胞を、９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ₂でオーバーナイト培養した。プレート中の上清を除去し、リポ多糖（５０ｎｇ／ｍＬ）および異なる濃度のＰＴＢ１またはＰＴＢＸを細胞に加えた。

【0104】

２４時間反応させた後、プレート中の上清を採取し、Ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｃａｔ． Ｎｏ． Ｇ２９３０）で上清中のＮＯの含有量を調べた。

【0105】

また、５０μＬのＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）含有培地をプレート中の細胞部分に加えた。その後、プレートを３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターに入れ、１５〜２０時間培養し、次いで１５０μＬのＤＭＳＯをプレートに加えて５〜１０分振とうした。最後に、連続波長マイクロプレートアナライザーでＯＤ₅₇₀を読み取り、下式により細胞生存率を計算した。

【0106】

細胞生存率（％）＝（実験群のＯＤ値／対照群のＯＤ値）×１００

【0107】

実験結果を表２に示す。

【0108】

３．ＤＮＦＢで誘発したアレルギーに対する酵素処理抽出物ＰＴＢＸのｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性の評価

【0109】

２×１０⁴正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫｓ）を９６ウェルプレートに接種してから、ＴＮＦ−α組換え体（１００ｎｇ／ｍＬ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｃａｔ．Ｎｏ．３００−０１Ａ）をプレートに加え、細胞と共培養した。６時間共培養した後、ＤＮＦＢ（１μＭ、Ｓｉｇｍａ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｄ１５２９）および異なる濃度のＰＴＢ１またはＰＴＢＸをプレートに加え、４８時間培養を続けた。その後、プレート中の上清を収集し、Ｈｕｍａｎ ＩＬ−１β ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＢＭＳ２２４）を、メーカーの推奨する手順に従って用い、上清中のＩＬ−１β含有量を分析し、細胞のＩＬ−１β発現量を確認した。

【0110】

実験結果を表２に示す。

【0111】

４．ＩＬ−３１に引き起こされた掻痒に対する酵素処理抽出物ＰＴＢＸのｉｎ ｖｉｔｒｏ抑制活性の評価

【0112】

２×１０⁴正常ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫｓ）を９６ウェルプレートに接種してから、ＴＬＲ１／２刺激剤、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−（Ｌｙｓ）４（１μｇ／ｍＬ; Ａｂｃａｍ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１４２０８）をプレートに加えて細胞と共培養した。６時間共培養した後、ＩＬ−３１の組換え体（１００ｎｇ／ｍｌ; ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；Ｃａｔ．Ｎｏ．２００−３１）および異なる濃度のＰＴＢ１またはＰＴＢＸをプレートに加え、４８時間培養を続けた。その後、プレート中の上清を収集し、Ｈｕｍａｎ ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１ ＤｕｏＳｅｔ ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹ２７９）を、メーカーの推奨する手順に従って用い、上清中のＭＣＰ−１含有量を分析し、細胞のＭＣＰ−１発現量を確認した。

【0113】

実験結果を表２に示す。

【0114】

【表2】

【0115】

表２より、酵素処理抽出物ＰＴＢＸによる角化細胞増殖、炎症および接触性アレルギーの抑制、ならびに痒み緩和の効果が著しく向上していることがわかる。

【0116】

実施例６
マウスの類乾癬の皮膚炎に対する酵素処理抽出物ＰＴＢＸの軽減効果の評価

【0117】

Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜８週齢）の背中の毛を剃毛し、それらマウスを未処置群、対照群、イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群、および実験群の４つの群に分けた。未処置群ではマウスに処理を施していない。対照群では、５０ｍｇのイミキモド（ＩＭＱ）クリーム（Ａｌｄａｒａ；３Ｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）をマウスの背中に塗布した。１日に１回、６日間連続でイミキモドクリームを投与して、類乾癬の症状をマウスの皮膚に誘発した。イミキモド（ＩＭＱ）＋ビヒクル群では、５０ｍｇのイミキモドクリーム（Ａｌｄａｒａ；３Ｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）をマウスの背中に塗布してから、軟膏のビヒクルを局所に塗布した。１日に１回、６日間連続でイミキモドクリームおよび軟膏のビヒクルを投与した。実験群では、５０ｍｇイミキモドクリーム（Ａｌｄａｒａ；３Ｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）をマウスの背中に塗布してから、ＰＴＢＸ軟膏を局所に塗布した（５０ｍｇ）。１日に１回、６日間連続でイミキモドクリームおよびＰＴＢＸ軟膏を投与した。

【0118】

その後、マウスの背中の皮膚の炎症の程度を採点した。皮膚炎症の程度の採点項目には紅斑（ｅｒｙｔｈｅｍａ）および落屑（ｓｃａｌｉｎｇ）が含まれる。紅斑および落屑の重症度に基づいてマウスの背中の皮膚に０点（無症状）から４点（重症）までのスコアをつけ、紅斑および落屑のスコアを合計して、累積スコア（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ｓｃｏｒｅｓ）を算出した。各群のマウスの背中の皮膚の紅斑スコア、落屑スコアおよび累積スコアを図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃにそれぞれ示す。

【0119】

マウスを屠殺する前に、マウスの背中の皮膚の乾癬病巣を写真に撮影すると共に記録した。屠殺後、マウスの背中の皮膚を切り取り、その表皮の厚みを測定すると共に、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。各群のマウスの背中の皮膚の写真およびＨ＆Ｅ染色の結果、ならびに各群のマウスの皮膚の厚さをそれぞれ図１Ｄおよび図１Ｅに示す。

【0120】

加えて、マウスの背中の皮膚の組織の一部に対し、ケラチン（Ｋ１４）およびフィラグリン（ＦＬＧ）の遺伝子発現量の検出を行った。その結果を図１Ｆおよび図１Ｇに示す。

【0121】

図１Ａ〜図１Ｅに示するように、対照群では、イミキモド５０ｍｇの投与によりマウスの背中に紅斑、落屑が生じ、マウスの背中の皮膚の厚みが増加しているが、実験群では、ＰＴＢＸ軟膏５０ｍｇの塗布により、皮膚の紅斑および落屑が軽減されると共に、皮膚の厚みを減少させることができている。

【0122】

遺伝子発現量については、図１Ｆおよび図１Ｇに示すように、未処置群に比べて、対照群のＫ１４発現は有意に増加した（＃＃＃：ｐ＜０．００１）が、ＰＴＢＸ軟膏５０ｍｇの塗布によりＫ１４発現を抑制する効果が生じた（＊：ｐ＜０．０５）。また、イミキモドはＦＬＧ発現を減少させた（＃：ｐ＜０．０５）が、ＰＴＢＸ軟膏５０ｍｇの塗布により、ＦＬＧ発現を維持する保護活性が生じた（＊＊：ｐ＜０．０１）。実験結果は平均±標準偏差で示している。

【0123】

実施例７
酵素処理プロセスの研究（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）：酵素と抽出物との比率

【0124】

粗抽出物ＰＴＢ１の乾燥粉末約１ｇを酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）５０ｍｌで再溶解してから、０．１、０．５、１、２または５ｍｇのβ−グルコシダーゼをそれぞれ加えた。次いで、その酵素含有溶液を３７℃のインキュベーター中に入れて１６〜２４時間反応を進行させた。反応が完了した後、その溶液を４℃の冷蔵庫に２４時間入れ、沈殿物の生成を促進させた。

【0125】

その溶液を固液分離して沈殿物を取り出し、その沈殿物をメタノールで再溶解して混合溶液を作製した。次いで、その混合溶液に高速液体クロマトグラフィーを行った。その結果を表３に示す。

【0126】

【表3】

【0127】

表３に示す結果から、０．１ｍｇの酵素では沈殿物を生成し得ないが、その他の量の酵素はいずれも沈殿物を生成する効果があることがわかる。

【0128】

実施例８

【0129】

酵素処理プロセスの研究：酵素の種類

【0130】

粗抽出物ＰＴＢ１の乾燥粉末約１ｇを酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）５０ｍｌで再溶解してから、１ｍｇのβ−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼまたはβ−グルクロニダーゼをそれぞれ加えた。加えた酵素の重量と元の薬草材料の重量との比は約１：１５００〜４０００であった（粗抽出物ＰＴＢ１の重量と元の薬草材料の重量との比は約１：１．５〜４）。次いで、その酵素含有溶液を３７℃のインキュベーターに入れて１６〜２４時間反応を進行させた。反応が完了した後、その溶液を４℃の冷蔵庫に２４時間入れ、沈殿物の生成を促進させた。

【0131】

その溶液を遠心分離機にかけて沈殿物を分離し、その沈殿物をメタノールで再溶解して混合溶液を作製した。次いで、その混合溶液に高速液体クロマトグラフィーを行って、酵素処理前後の指標成分含有量の相違を比較した。結果を表４に示す。

【0132】

【表4】

【0133】

表４の結果から、β-グルコシダーゼおよびβ-グルクロニダーゼはいずれも生物変換によりキク抽出物中のルテオリンおよびアピゲニンの含有量を増加させ得るということがわかる。

【0134】

実施例９
酵素処理プロセスの研究：酵素の組み合わせ

【0135】

粗抽出物ＰＴＢ１の乾燥粉末約１ｇを酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）５０ｍｌで再溶解してから、β−グルコシダーゼ１ｍｇおよびα−ガラクトシダーゼ１ｍｇ、またはβ−グルコシダーゼ１ｍｇおよびβ−グルクロニダーゼ１ｍｇを同時に加えた。加えた酵素の重量と元の薬草材料の重量との比は約１：７５０〜２０００であった（粗抽出物ＰＴＢ１の重量と元の薬草材料の重量との比は約１：１．５〜４）。次いで、その酵素含有溶液を３７℃のインキュベーターに入れて１６〜２４時間反応を進行させた。反応が完了した後、その溶液を４℃の冷蔵庫に２４時間入れ、沈殿物の生成を促進させた。

【0136】

その溶液を遠心分離機にかけて沈殿物を分離し、その沈殿物をメタノールで再溶解して混合溶液を作製した。次いで、その混合溶液に高速液体クロマトグラフィーを行って、酵素処理前後の指標成分含有量の相違を比較した。結果を表５に示す。

【0137】

【表5】

【0138】

表５の結果から、β−グルコシダーゼおよびβ−グルクロニダーゼが同時に存在するとき、ルテオリン７−Ｏ−グルコシドおよびアピゲニン−７−Ｏ−グルコシドのそれぞれルテオリンおよびアピゲニンへの変換が増加し得ることがわかる。

【0139】

実施例１０
酵素処理プロセスの研究：キク属の異なる植物

【0140】

シマカンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ、金門油菊）、シロバナムシヨケギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉｉｆｏｌｉｕｍ）またはオッタチカンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ、台湾小油菊）とその１５倍の水とを混合して混合物を作製した。その混合物を加熱して沸騰させ（約９０〜１００℃）、加熱抽出を１時間行ってから、その中の固体残留物を除去して抽出液を得た。

【0141】

その抽出液を室温まで冷却した後、酵素であるβ-グルコシダーゼをその中に加えた。加えた酵素の重量と元の薬草材料の重量との比は約１：１５００であった。次いで、その酵素含有抽出液を３７℃のインキュベーターに入れ、１６〜２４時間反応させた。反応が完了した後、その酵素反応抽出液を４℃の冷蔵庫に２４時間入れ、沈殿物の生成を促進させた。

【0142】

その後、その溶液を遠心分離機にかけ、上清および沈殿物に高速液体クロマトグラフィーを行って、キク属のその他の植物でも酵素処理により沈殿精製の効果が達成され得るか否かを評価した。沈殿物について、ｉｎ ｖｉｔｒｏ角化細胞増殖抑制活性の分析を行った。その結果を表６に示す。

【0143】

【表6】

【0144】

表６の結果から、シマカンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ Ｌ）、シロバナムシヨケギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｃｉｎｅｒａｒｉｉｆｏｌｉｕｍ）およびオッタチカンギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ）のようなキク属の別の植物はいずれも、酵素処理により沈殿および精製され得ず、それらの角化細胞増殖抑制活性は酵素処理により向上し得ないということがわかる。

【0145】

開示された実施形態に各種修飾および変更を加え得ることは、当業者には明らかであろう。明細書および実施例は単に例示として見なさるよう意図されており、本開示の真の範囲は以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物によって示される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】