特許 6868541 修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6868541

(24)【登録日】2021年4月14日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C07H 19/10 20060101AFI20210426BHJP

   C07H 19/20 20060101ALI20210426BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20210426BHJP

   C12M 1/00 20060101ALN20210426BHJP

   C12M 1/34 20060101ALN20210426BHJP

   C12N 15/00 20060101ALN20210426BHJP

   C12P 19/34 20060101ALN20210426BHJP

【ＦＩ】

   C07H19/10CSP

   C07H19/20

   C12Q1/6869

   !C12M1/00 A

   !C12M1/34 Z

   !C12N15/00

   !C12P19/34 A

【請求項の数】22

【外国語出願】

【全頁数】35

(21)【出願番号】特願2017-233295(P2017-233295)

(22)【出願日】2017年12月5日

(62)【分割の表示】特願2015-561957(P2015-561957)の分割

【原出願日】2013年3月15日

(65)【公開番号】特開2018-39842(P2018-39842A)

(43)【公開日】2018年3月15日

【審査請求日】2018年1月4日

【審判番号】不服2019-13260(P2019-13260/J1)

【審判請求日】2019年10月3日

(73)【特許権者】

【識別番号】502279294

【氏名又は名称】イルミナ ケンブリッジ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100107489

【弁理士】

【氏名又は名称】大塩 竹志

(72)【発明者】

【氏名】シャオハイ リュー

(72)【発明者】

【氏名】シャオリン ウー

(72)【発明者】

【氏名】ジョフリー ポール スミス

【合議体】

【審判長】 瀬良 聡機

【審判官】 大熊 幸治

【審判官】 冨永 保

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００６−５０９０４０（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

C07D

A61K

ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸塩基と、３’−炭素原子に共有結合した構造−Ｏ−ＣＨ（Ｒ）Ｎ_３を形成する除去可能な３’−ヒドロキシ保護基を有する２’−デオキシリボースの糖部分とを含む修飾されたヌクレオチド分子であって、ここで
Ｒは、−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎおよび−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^４Ｒ^５からなる群から選択され、
Ｒ^１は、水素であり、
Ｒ^２は、ハロゲンであり、
Ｒ^４は、水素であり、
Ｒ^５は、Ｃ_１〜６アルキルであり、
ｍは、１または２の整数であり、
ｎは、１または２の整数であり、但し、ｍ＋ｎの合計は３に等しく、かつ
前記核酸塩基は、プリン、デアザプリン、シトシン、チミン、またはウラシルを含み、ここで、検出可能な標識は、プリンまたはデアザプリンの７位においてリンカーを介して前記プリンまたはデアザプリンに結合するか、あるいは、シトシン、チミンまたはウラシルの５位においてリンカーを介して前記シトシン、チミンまたはウラシルに結合する、修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項2】

前記核酸塩基がデアザプリンである、請求項１に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項3】

Ｒが、−ＣＨＦ_２または−ＣＨ_２Ｆである、請求項１または２に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項4】

Ｒが、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^４Ｒ^５であり、Ｒ^４は水素であり、Ｒ^５はＣ_１〜６アルキルである、請求項１または２に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項5】

前記核酸塩基が、切断可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項6】

前記切断可能なリンカーは、酸に不安定であるか、光に不安定であるか、またはジスルフィド部分を含有する、請求項５に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項7】

前記切断可能なリンカーがジスルフィド部分を含有する、請求項６に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項8】

前記切断可能なリンカーが、前記３’−ヒドロキシ保護基に類似する部分を含む、請求項５に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項9】

前記切断可能なリンカーが、前記３’−ヒドロキシ保護基と同じ条件下で切断される、請求項５〜８のいずれか１項に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項10】

前記検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項５〜９のいずれか１項に記載の修飾されたヌクレオチド分子。

【請求項11】

ヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチドであって、該ヌクレオチド残基が、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の修飾されたヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチド。

【請求項12】

前記オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合している、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。

【請求項13】

配列決定反応における標的一本鎖ポリヌクレオチドと相補的な成長中のポリヌクレオチドを調製する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子を該成長中の相補的なポリヌクレオチドに取り込む工程を含み、ここで、該修飾されたヌクレオチド分子の取り込みは、該成長中の相補的なポリヌクレオチドへのいかなるその後のヌクレオチドの導入も防止する、方法。

【請求項14】

前記修飾されたヌクレオチド分子の取り込みが、末端トランスフェラーゼ、末端ポリメラーゼまたは逆転写酵素によって達成される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記修飾されたヌクレオチド分子の取り込みが、末端ポリメラーゼによって達成される、請求項１３または１４に記載の方法。

【請求項16】

標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
相補的なヌクレオチド分子の連続的な取り込みをモニターする工程であって、ここで、取り込まれる少なくとも１つの相補的なヌクレオチド分子が、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子である工程、および
該修飾されたヌクレオチド分子のアイデンティティーを検出する工程
を含む、方法。

【請求項17】

前記修飾されたヌクレオチドのアイデンティティーが、前記検出可能な標識を検出することによって判定される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記３’−ヒドロキシ保護基および前記検出可能な標識が、次の相補的なヌクレオチド分子を導入する前に除去される、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

前記３’−ヒドロキシ保護基および前記検出可能な標識が、単一工程の化学反応において除去される、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

複数の請求項１〜１０のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子を含み、該修飾されたヌクレオチド分子のそれぞれは異なる検出可能な標識を含む、キット。

【請求項21】

４つの修飾されたヌクレオチド分子を含む、請求項２０に記載のキット。

【請求項22】

酵素と、該酵素の作用に適した緩衝液とをさらに含む、請求項２０または２１に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

背景
発明の分野
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、３’−ヒドロキシ保護基を含む修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシド、およびポリヌクレオチド配列決定方法における該ヌクレオチドまたはヌクレオシドの使用に関する。本明細書に記載するいくつかの実施形態は、３’−ヒドロキシ保護したヌクレオチドまたはヌクレオシドを調製する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

関連技術の記載
分子の研究の進歩は、一部は、分子または分子の生物学的反応を特徴づけるのに使用される技術の改良によってもたらされてきた。特に、核酸であるＤＮＡおよびＲＮＡの研究は、配列分析におよびハイブリッド形成事象の研究に使用される技術を開発することによって利益を受けてきた。

【0003】

核酸研究を改良してきた技術の一例は、作製された固定した核酸のアレイの開発である。これらのアレイは典型的には、固体支持材料上に固定したポリヌクレオチドの高密度マトリックスからなる。例えば、Ｆｏｄｏｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：１９〜２６、１９９４を参照のこと。この文献は、マスクによって保護されているが、適切に修飾されたヌクレオチドホスホルアミダイトの結合を許容するよう規定された領域で曝露されている、化学的に増感されたガラス表面を用いて核酸をアセンブリする方法を記載している。作製されたアレイはまた、事前に決めておいた位置で固体支持体上に既知のポリヌクレオチドを「点形成する」技術によって製造することができる（例えば、Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６３７９〜６３８３、１９９５）。

【0004】

アレイに結合した核酸のヌクレオチド配列を決定する１つの方法は、「合成による配列決定」または「ＳＢＳ」と呼ばれる。ＤＮＡの配列を決定するためのこの技術は、理想的には、配列決定中の核酸とは反対側の正しい相補的ヌクレオチドの制御された（すなわち、一度に１つの）取り込みを必要とする。このことによって、各ヌクレオチド残基が一度に１つ配列決定されるため、複数サイクルにおいてヌクレオチドを付加することによる正確な配列決定が可能となり、したがって、制御されていない一連の取り込みが生じることを防止する。取り込まれたヌクレオチドは、標識部分の除去およびその後の次のラウンドの配列決定の前に、該ヌクレオチドに結合する適切な標識を用いて読み取られる。

【0005】

単一の取り込みのみが生じることを確実にするために、構造修飾（「保護基」）が、成長している鎖に付加される各標識されたヌクレオチドに付加され、ヌクレオチドが１つだけ取り込まれることを確実にする。保護基を有するヌクレオチドが付加された後、次に保護基は、配列決定中のＤＮＡの完全性を妨げない反応条件下で除去される。次に、配列決定サイクルは、次の保護され標識されたヌクレオチドの取り込みを続行することができる。

【0006】

ＤＮＡ配列決定において有用であるために、ヌクレオチド、より一般的にはヌクレオチドトリホスフェートは、概して、ヌクレオチド上の塩基が一度付加されたとき、ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に取り込むのに使用されるポリメラーゼが複製し続けることを防止するような３’−ヒドロキシ保護基を必要とする。ヌクレオチドに付加することができ、かつ依然として適切であり得る基の種類には、多くの制限がある。保護基は、ポリヌクレオチド鎖への損傷を生じることなく糖部分から容易に除去できるとともに、同時に追加的なヌクレオチド分子がポリヌクレオチド鎖に付加されることを防止すべきである。さらに、修飾されたヌクレオチドは、該ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖に取り込むのに使用されるポリメラーゼまたは他の適切な酵素によって許容される必要がある。理想的な保護基はそれゆえ、長期間の安定性を呈し、ポリメラーゼ酵素によって効率的に取り込まれ、二次的なもしくはさらなるヌクレオチドの取り込みの遮断を生じ、ポリヌクレオチド構造に対する損傷を生じない温和な条件下（好ましくは水性条件下）で除去される能力を有する。
可逆的保護基は、以前に記載されている。例えばＭｅｔｚｋｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２（２０）：４２５９〜４２６７、１９９４）は、８個の３’修飾した２−デオキシリボヌクレオシド５’−トリホスフェート（３’修飾したｄＮＴＰ）の合成および使用、ならびに取り込み活性についての２つのＤＮＡテンプレートアッセイにおける検査を開示している。ＷＯ２００２／０２９００３は、ポリメラーゼ反応において成長中のＤＮＡ鎖上で３’−ＯＨ基をキャッピングするためのアリル保護基の使用を含み得る配列決定方法を記載している。
加えて、本発明者らは、その全体が参照により本明細書により組み込まれる国際出願公開ＷＯ２００４／０１８４９７号において、いくつかの可逆的保護基の開発、およびＤＮＡ適合条件下でそれらを脱保護する方法を既に報告した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0007】

【特許文献1】国際公開第２００２／０２９００３号

【特許文献2】国際公開第２００４／０１８４９７号

【非特許文献】

【0008】

【非特許文献1】Ｆｏｄｏｒら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：１９〜２６、１９９４

【非特許文献2】Ｓｔｉｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９２：６３７９〜６３８３、１９９５

【非特許文献3】Ｍｅｔｚｋｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２（２０）：４２５９〜４２６７、１９９４）

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0009】

要旨
本明細書に記載するいくつかの実施形態は、プリン塩基またはピリミジン塩基と、３’−炭素原子に共有結合した構造−Ｏ−Ｃ（Ｒ）_２Ｎ_３を形成する除去可能な３’−ヒドロキシ保護基を有するリボースまたはデオキシリボースの糖部分とを含む、修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子に関し、ここで、
Ｒは、水素、−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^３、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^４Ｒ^５、−Ｃ（Ｒ^６）_２Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８および−Ｃ（Ｒ^９）_２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^１０Ｒ^１１からなる群から選択され、
各Ｒ^１およびＲ^２は、水素、任意に置換されたアルキル、またはハロゲンから独立して選択され、
Ｒ^３は、水素または必要に応じて置換されたアルキルから選択され、
各Ｒ^４およびＲ^５は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、または必要に応じて置換されたアラルキルから独立して選択され、
各Ｒ^６およびＲ^９は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、またはハロゲンから選択され、
各Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^１０およびＲ^１１は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、または必要に応じて置換されたアラルキルから独立して選択され、
ｍは、０〜３の整数であり、かつ
ｎは、０〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎの合計は３に等しく、かつ
ｐは、０〜６の整数であり、但し、
Ｒ^１およびＲ^２は両方ともハロゲンであることはできず、かつ
少なくとも１つのＲは水素ではない。

【0010】

本明細書に記載するいくつかの実施形態は、本明細書に記載する修飾されたヌクレオチド分子を成長中の相補的なポリヌクレオチドに取り込む工程を含む、配列決定反応における標的一本鎖ポリヌクレオチドと相補的な成長中のポリヌクレオチドを調製する方法に関し、ここで、修飾されたヌクレオチドの取り込みは、成長中の相補的なポリヌクレオチドへのいかなるその後のヌクレオチドの導入も防止する。

【0011】

本明細書に記載するいくつかの実施形態は、相補的なヌクレオチドの連続的な取り込みをモニターする工程であって、ここで、取り込まれる少なくとも１つの相補的なヌクレオチドは、本明細書に記載する修飾されたヌクレオチド分子である工程、および修飾されたヌクレオチド分子のアイデンティティーを検出する工程を含む、標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法に関する。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオチド分子の取り込みは、末端トランスフェラーゼ、末端ポリメラーゼまたは逆転写酵素によって達成される。

【0012】

本明細書に記載するいくつかの実施形態は、本明細書に記載する複数の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子、およびそのための包装材料を含むキットに関する。いくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオチドのアイデンティティーは、塩基に結合した検出可能な標識を検出することによって決定される。いくつかのこのような実施形態において、３’−ヒドロキシ保護基および検出可能な標識は、次の相補的なヌクレオチドを導入する前に除去される。いくつかのこのような実施形態において、３’−ヒドロキシ保護基および検出可能な標識は、単一工程の化学反応において除去される。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
プリン塩基またはピリミジン塩基と、３’−炭素原子に共有結合した構造−Ｏ−Ｃ（Ｒ）_２Ｎ_３を形成する除去可能な３’−ヒドロキシ保護基を有するリボースまたはデオキシリボースの糖部分とを含む修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子であって、ここで
Ｒは、水素、−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^３、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^４Ｒ^５、−Ｃ（Ｒ^６）_２Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８および−Ｃ（Ｒ^９）_２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^１０Ｒ^１１からなる群から選択され、
各Ｒ^１およびＲ^２は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、またはハロゲンから独立して選択され、
Ｒ^３は、水素または必要に応じて置換されたアルキルから選択され、
各Ｒ^４およびＲ^５は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、または必要に応じて置換されたアラルキルから独立して選択され、
各Ｒ^６およびＲ^９は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、またはハロゲンから選択され、
各Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^１０およびＲ^１１は、水素、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換されたヘテロアリール、または必要に応じて置換されたアラルキルから独立して選択され、
ｍは、０〜３の整数であり、
ｎは、０〜３の整数であり、但し、ｍ＋ｎの合計は３に等しく、かつ
ｐは、０〜６の整数であり、但し、
Ｒ^１およびＲ^２は両方ともハロゲンであることはできず、かつ
少なくとも１つのＲは水素ではない、修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎである、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目３）
−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎが、−ＣＨＦ_２、−ＣＨ_２Ｆ、−ＣＨＣｌ_２または−ＣＨ_２Ｃｌから選択される、項目１または２に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目４）
−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎが−ＣＨＦ_２である、項目１〜３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目５）
−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎが−ＣＨ_２Ｆである、項目１〜３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目６）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^３である、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目７）
Ｒ^３が水素である、項目６に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目８）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^４Ｒ^５である、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目９）
Ｒ^４およびＲ^５が両方とも水素である、項目１または８に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１０）
Ｒ^４が水素であり、Ｒ^５がＣ_１−６アルキルである、項目１または８に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１１）
Ｒ^４およびＲ^５が両方ともＣ_１−６アルキルである、項目１または８に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１２）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ^６）_２Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８である、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。（項目１３）
Ｒ^６が両方とも水素である、項目１または１２に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１４）
Ｒ^７およびＲ^８が両方とも水素である、項目１、１２および１３のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１５）
ｐが０である、項目１および１２〜１４のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１６）
ｐが６である、項目１および１２〜１４のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１７）
Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ^９）_２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^１０Ｒ^１１である、項目１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１８）
Ｒ^９が両方とも水素である、項目１または１７に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目１９）
Ｒ^１０およびＲ^１１が両方とも水素である、項目１、１７および１８のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２０）
Ｒ^１０が水素であり、Ｒ^１１がアミノ置換アルキルである、項目１、１７および１８のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２１）
前記３’−ヒドロキシ保護基が、ホスフィンを用いた脱保護反応において除去される、項目１〜１４のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２２）
前記ホスフィンが、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）である、項目２１に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２３）
前記塩基が、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合している、項目１〜２２のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２４）
前記３’−ヒドロキシ保護基が、切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合している、項目１〜２２のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２５）
前記リンカーが切断可能である、項目２３または２４に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２６）
前記検出可能な標識がフルオロフォアである、項目２３〜２５のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２７）
前記リンカーは、酸に不安定であるか、光に不安定であるか、またはジスルフィド結合を含有する、項目２３〜２６のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子。
（項目２８）
配列決定反応における標的一本鎖ポリヌクレオチドと相補的な成長中のポリヌクレオチドを調製する方法であって、項目１〜２７のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子を該成長中の相補的なポリヌクレオチドに取り込む工程を含み、ここで、該修飾されたヌクレオチドの取り込みは、該成長中の相補的なポリヌクレオチドへのいかなるその後のヌクレオチドの導入も防止する、方法。
（項目２９）
前記修飾されたヌクレオチド分子の組み込みが、末端トランスフェラーゼ、末端ポリメラーゼまたは逆転写酵素によって達成される、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
標的一本鎖ポリヌクレオチドの配列を決定するための方法であって、
相補的なヌクレオチドの連続的な取り込みをモニターする工程であって、ここで、取り込まれる少なくとも１つの相補的なヌクレオチドが、項目２３〜２７のいずれか一項に記載の修飾されたヌクレオチド分子である工程、および
該修飾されたヌクレオチド分子のアイデンティティーを検出する工程
を含む、方法。
（項目３１）
前記修飾されたヌクレオチドのアイデンティティーが、前記塩基に結合した前記検出可能な標識を検出することによって判定される、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
前記３’−ヒドロキシ保護基および前記検出可能な標識が、次の相補的なヌクレオチドを導入する前に除去される、項目３０または３１に記載の方法。
（項目３３）
前記３’−ヒドロキシ保護基および前記検出可能な標識が、単一工程の化学反応において除去される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
項目１〜２７のいずれか一項に記載の複数の修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子と、そのための包装材料とを含む、キット。
（項目３５）
酵素と、該酵素の作用に適した緩衝液とをさらに含む、項目３４に記載のキット。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1A】図１Ａは、種々の３’−ＯＨ保護基を図示する。

【0014】

【図1B】図１Ｂは、種々の３’−ＯＨ保護基の熱安定性を図示した。

【0015】

【図2A】図２Ａは、３つの異なる３’−ＯＨ保護基の脱保護速度曲線を図示する。

【0016】

【図2B】図２Ｂは、３つの異なる３’−ＯＨ保護基の脱保護半減期のチャートを示す。

【0017】

【図3】図３は、比較における熱安定性の３’−ＯＨ保護基および標準的な保護基を有する種々の修飾されたヌクレオチドの位相化（ｐｈａｓｉｎｇ）値および前位相化（ｐｒｅｐｈａｓｉｎｇ）値を示す。

【0018】

【図4A】図４Ａは、取り込み混合物（ＩＭＸ）におけるｍｏｎｏ−Ｆ ｆｆＮｓ−Ａ異性体の２×４００ｂｐ配列決定データを示す。

【0019】

【図4B】図４Ｂは、取り込み混合物（ＩＭＸ）におけるｍｏｎｏ−Ｆ ｆｆＮｓ−Ｂ異性体の２×４００ｂｐ配列決定データを示す。

【発明を実施するための形態】

【0020】

詳細な説明
一実施形態は、３’−ＯＨ保護基を含む修飾されたヌクレオチドまたはヌクレオシドである。一実施形態において、３’−ＯＨ保護基は、モノフルオロメチル置換したアジドメチル保護基である。別の実施形態において、３’−ＯＨ保護基は、Ｃ−アミド置換したアジドメチル保護基である。さらに別の実施形態は、ジフルオロメチル置換したアジドメチル３’−ＯＨ保護基を有する修飾されたヌクレオチドに関する。
定義

【0021】

別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。用語「を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「を含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、限定的でない。用語「を有している（ｈａｖｉｎｇ）」、ならびに「を有する（ｈａｖｅ）」、「を有する（ｈａｓ）」、および「を有した（ｈａｄ）」などの他の形態の使用は、限定的でない。本明細書で使用する場合、移行句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ ｐｈｒａｓｅ）においても特許請求の範囲の本文においても、用語「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、解放端の意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、句「少なくとも有している（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」または句「少なくとも含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」と同義に解釈されるべきである。例えば、プロセスとの関連で使用する場合、用語「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、該プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加的な工程を含むかもしれないことを意味する。化合物、組成物、またはデバイスとの関連で使用する場合、用語「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、該化合物、組成物、またはデバイスが少なくとも列挙された特徴または構成要素を含むが、追加的な特徴または構成要素も含むかもしれないことを意味する。

【0022】

本明細書で使用する場合、一般的な有機物の略語を次のとおり定義する。
Ａｃ アセチル
Ａｃ_２Ｏ 無水酢酸
ａｑ． 水性（ａｑｕｅｏｕｓ）
Ｂｎ ベンジル
Ｂｚ ベンゾイル
ＢＯＣまたはＢｏｃ ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル
Ｂｕ ｎ−ブチル
ｃａｔ． 触媒的
Ｃｂｚ カルボベンジルオキシ
℃ 摂氏温度
ｄＡＴＰ デオキシアデノシントリホスフェート
ｄＣＴＰ デオキシシチジントリホスフェート
ｄＧＴＰ デオキシグアノシントリホスフェート
ｄＴＴＰ デオキシチミジントリホスフェート
ｄｄＮＴＰ（ｓ） ジデオキシヌクレオチド（類）
ＤＢＵ １，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＡ ジクロロ酢酸
ＤＣＥ １，２−ジクロロエタン
ＤＣＭ 塩化メチレン
ＤＩＥＡ ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡ ジメチルアセトアミド
ＤＭＥ ジメトキシエタン
ＤＭＦ Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＡ ジフェニルホスホリルアジド
Ｅｔ エチル
ＥｔＯＡｃ 酢酸エチル
ｆｆＮ 完全機能性ヌクレオチド
ｇ グラム
ＧＰＣ ゲル浸透クロマトグラフィー
ｈまたはｈｒ 時間
ｉＰｒ イソプロピル
ＫＰｉ ｐＨ７．０の１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液
ＫＰＳ 過硫酸カリウム
ＩＰＡ イソプロピルアルコール
ＩＭＸ 取り込み混合物
ＬＣＭＳ 液体クロマトグラフィー−質量分析
ＬＤＡ ジイソプロピルアミドリチウム
ｍまたはｍｉｎ 分
ｍＣＰＢＡ メタ−クロロペルオキシ安息香酸
ＭｅＯＨ メタノール
ＭｅＣＮ アセトニトリル
Ｍｏｎｏ−Ｆ −ＣＨ_２Ｆ
Ｍｏｎｏ−Ｆ ｆｆＮ アジドメチル３’−ＯＨ保護基のメチレン位において置換した−ＣＨ_２Ｆを有する修飾されたヌクレオチド
ｍＬ ミリリットル
ＭＴＢＥ メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル
ＮａＮ_３ アジ化ナトリウム
ＮＨＳ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＰＧ 保護基
Ｐｈ フェニル
ｐｐｔ 沈殿物
ｒｔ 室温
ＳＢＳ 合成による配列決定
ＴＥＡ トリエチルアミン
ＴＥＭＰＯ （２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イル）オキシル
ＴＣＤＩ １，１’−チオカルボニルジイミダゾール
Ｔｅｒｔ、ｔ 三級
ＴＦＡ トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ テトラヒドロフラン
ＴＥＭＥＤ テトラメチルエチレンジアミン
μＬ マイクロリットル

【0023】

本明細書で使用する場合、用語「アレイ」とは、１つもしくはそれより多くの基質に結合している異なるプローブ分子の集団であって、この異なるプローブ分子が、相対的な位置に従って互いに区別することができるような、プルーブ分子の集団を指す。アレイには、基質上の異なるアドレス指定可能な位置に各々位置付けられる異なるプローブ分子が含まれ得る。あるいは、またはさらに、アレイは、異なるプローブ分子を各々担持する個別の基質を含むことができ、ここで、この異なるプローブ分子は、基質が結合している表面上の基質の位置、もしくは液体中の基質の位置によって識別することができる。個別の基質が表面上に位置付けられている例示的なアレイとして、例えば、米国特許第６，３５５，４３１Ｂ１号、ＵＳ２００２／０１０２５７８およびＰＣＴ公開ＷＯ００／６３４３７号に記載されるような、ウェル中にビーズを含むものが挙げられるが、これに限定されない。液体アレイ（例えば、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）などのマイクロ流体デバイスを用いたもの）中のビーズを区別するために本発明で使用することができる例示的なフォーマットは、例えば、米国特許第６，５２４，７９３号に記載されている。本発明において使用することができるアレイのさらなる例としては、米国特許第５，４２９，８０７号、第５，４３６，３２７号、第５，５６１，０７１号、第５，５８３，２１１号、第５，６５８，７３４号、第５，８３７，８５８号、第５，８７４，２１９号、第５，９１９，５２３号、第６，１３６，２６９号、第６，２８７，７６８号、第６，２８７，７７６号、第６，２８８，２２０号、第６，２９７，００６号、第６，２９１，１９３号、第６，３４６，４１３号、第６，４１６，９４９号、第６，４８２，５９１号、第６，５１４，７５１号および第６，６１０，４８２号、ならびにＷＯ９３／１７１２６、ＷＯ９５／１１９９５、ＷＯ９５／３５５０５、欧州特許第７４２ ２８７号および欧州特許第７９９ ８９７号に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0024】

本明細書で使用する場合、用語「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ａｔｔａｃｈｅｄ）」または「共有結合した（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｂｏｎｄｅｄ）」とは、原子間における電子対の共有を特徴とする化学結合の形成を指す。例えば、共有結合したポリマー被膜とは、他の手段、例えば付着または静電相互作用による表面への結合と比較して、基質の官能化した表面との化学結合を形成するポリマー被膜を指す。表面に共有結合したポリマーは、共有結合に加えた手段によって結合することもできることが認識される。

【0025】

本明細書で使用する場合、あらゆる「Ｒ」基（例えば、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、およびＲ^８であるが、これらに限定されない）は、示される原子に結合することができる置換基を表す。Ｒ基は、置換されていても、非置換であってもよい。２つの「Ｒ」基が「一体となって」いると記載される場合、該Ｒ基および該Ｒ基が結合する原子は、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、または複素環を形成することができる。例えば、限定されないが、Ｒ^２およびＲ^３、またはＲ^２、Ｒ^３、もしくはＲ^４と、これらが結合する原子とが「一体となって」いるまたは「互いに結合して」いると示される場合、それらは環を形成するように互いに共有結合していることを意味し、その一例を以下に示す。

【化1】

【0026】

基が「必要に応じて置換されて」いると記載される場合は常に、該基は、非置換であってもよく、または示される置換基のうちの１つもしくはそれより多くで置換されていてもよい。同様に、基が「非置換または置換」と記載される場合、置換されているとき、置換基は、１つもしくはそれより多くの示される置換基から選択されてよい。置換基が示されていない場合、示された「必要に応じて置換された」または「置換された」基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、ヘテロアラルキル、（ヘテロアリシクリル）アルキル、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アシル、メルカプト、アルキルチオ、アリールチオ、シアノ、ハロゲン、チオカルボニル、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、保護されたＣ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、ニトロ、シリル、スルフェニル、スルフィニル、スルホニル、ハロアルキル、ハロアルコキシ、トリハロメタンスルホニル、トリハロメタンスルホンアミド、アミノ、一置換アミノ基、二置換アミノ基、およびこれらの保護された誘導体を含むがそれらに限定されない官能基の群から個々にかつ独立して選択される１つもしくはそれより多くの基で、個々にかつ独立して置換されていてもよいことが意味される。

【0027】

本明細書で使用する場合、「アルキル」とは、完全に飽和した（二重結合も三重結合もない）炭化水素基を含む直鎖または分岐鎖炭化水素鎖を指す。いくつかの実施形態において、アルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有してもよい（これが本明細書で現れる場合は常に、「１〜２０」などの数値範囲は、終点（ｅｎｄｐｏｐｉｎｔ）を含む与えられた範囲における各整数を指し、例えば、「１〜２０個の炭素原子」とは、該アルキル基は１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、最多２０個の（かつ２０を含む）炭素原子からなっていてもよいことを意味するが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「アルキル」の出現時にもあてはまる）。アルキル基はまた、約７〜約１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキルであってよい。アルキル基はまた、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルであってよい。化合物のアルキル基は、「Ｃ_１−Ｃ_４アルキル」または類似の呼称で指定されてもよい。例に過ぎないが、「Ｃ_１−Ｃ_４アルキル」は、アルキル鎖中に１〜４個の炭素原子がある、すなわち、該アルキル鎖がメチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルから選択されることを示す。典型的なアルキル基として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、およびヘキシルが挙げられるが、決してこれらに限定されない。該アルキル基は、置換または非置換であってよい。

【0028】

本明細書で使用する場合、「アルケニル」とは、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖において１つもしくはそれより多くの二重結合を含有するアルキル基を指す。アルケニル基は、非置換または置換されていてよい。

【0029】

本明細書で使用する場合、「アルキニル」とは、直鎖または分岐鎖の炭化水素鎖において１つもしくはそれより多くの三重結合を含有するアルキル基を指す。アルキニル基は、非置換または置換されていてよい。

【0030】

本明細書で使用する場合、「シクロアルキル」とは、完全に飽和した（二重結合も三重結合もない）単環式または多環式の炭化水素環系を指す。２つもしくはそれより多くの環から構成される場合、該環は縮合した様式で互いに結合していてもよい。シクロアルキル基は、環の中に３〜１０個の原子を含有することができる。いくつかの実施形態において、シクロアルキル基は、環の中に３〜８個の原子を含有することができる。シクロアルキル基は非置換または置換されていてよい。典型的なシクロアルキル基として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられるが、決してこれらに限定されない。

【0031】

本明細書で使用する場合、「アリール」とは、その環のうちの少なくとも１つの全体にわたって完全に非局在化したπ電子系を有する炭素環式（すべて炭素）、単環式、または多環式の芳香環系（例えば、２つの炭素環式環が化学結合を共有する、縮合環系、架橋環系またはスピロ環系（例えば、１つもしくはそれより多くのアリール環とともに、１つもしくはそれより多くのアリール環もしくは非アリール環）が挙げられる）を指す。アリール基における炭素原子の数は、変化し得る。例えば、いくつかの実施形態において、アリール基は、Ｃ_６−Ｃ_１４アリール基、Ｃ_６−Ｃ_１０アリール基、またはＣ_６アリール基であることができる。アリール基の例としては、ベンゼン、ナフタレン、およびアズレンが挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は、置換または非置換であってよい。

【0032】

本明細書で使用する場合、「ヘテロシクリル」とは、少なくとも１つのヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、Ｓ）を含む環系を指す。このような系は、不飽和であることができ、何らかの不飽和を含むことができ、または何らかの芳香族ポーションを含有することができ、もしくは全部芳香族であることができる。ヘテロシクリル基は、非置換または置換されていてよい。

【0033】

本明細書で使用する場合、「ヘテロアリール」とは、１つもしくはそれより多くのヘテロ原子、すなわち、窒素、酸素、および硫黄を含むがこれらに限定されない炭素以外の元素と、少なくとも１つの芳香環とを含有する単環式もしくは多環式の芳香環系（完全に非局在化したπ電子系を有する少なくとも１つの環を有する環系）を指す。ヘテロアリール基の環における原子の数は、変化し得る。例えば、いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、その環に４〜１４個の原子を、その環に５〜１０個の原子を、またはその環に５〜６個の原子を含有することができる。さらに、用語「ヘテロアリール」は、少２つの環（例えば、なくとも１つのアリール環および少なくとも１つのヘテロアリール環、または少なくとも２つのヘテロアリール環）が少なくとも１つの化学結合を共有する縮合環系を含む。ヘテロアリール環の例としては、フラン、フラザン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フタラジン、ピロール、オキサゾール、ベンゾオキサゾール、１，２，３−オキサジアゾール、１，２，４−オキサジアゾール、チアゾール、１，２，３−チアジアゾール、１，２，４−チアジアゾール、ベンゾチアゾール、イミダゾール、ベンズイミダゾール、インドール、インダゾール、ピラゾール、ベンゾピラゾール、イソキサゾール、ベンゾイソキサゾール、イソチアゾール、トリアゾール、ベンゾトリアゾール、チアジアゾール、テトラゾール、ピリジン、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、プリン、プテリジン、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、シンノリン、およびトリアジンが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロアリール基は、置換または非置換であってよい。

【0034】

本明細書で使用する場合、「複素脂環式」または「ヘテロアリシクリル」とは、３員、４員、５員、６員、７員、８員、９員、１０員、最大１８員の単環式、二環式、および三環式の環系を指し、ここで、炭素原子は１〜５個のヘテロ原子とともに、該環系を構成する。しかしながら、複素環は、完全に非局在化したπ電子系が全ての環全体にわたっては生じないような方法で置かれた１つもしくはそれより多くの不飽和結合を必要に応じて含有してもよい。ヘテロ原子は、酸素、硫黄、および窒素から独立して選択される。複素環はさらに、オキソ系およびチオ系（例えば、ラクタム、ラクトン、環状イミド、環状チオイミド、および環状カルバマート）を定義に含めるように、１つもしくはそれより多くのカルボニル官能基またはチオカルボニル官能基を含有してもよい。２つもしくはそれより多くの環から構成される場合、該環は、縮合した様式で互いに結合していてもよい。追加的に、複素脂環式中のいずれの窒素も四級化されていてよい。ヘテロアリシクリル基または複素脂環式基は、非置換または置換されていてよい。このような「複素脂環式」基または「ヘテロアリシクリル」基の例としては、１，３−ジオキシン、１，３−ジオキサン、１，４−ジオキサン、１，２−ジオキソラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキソラン、１，３−オキサチアン、１，４−オキサチイン、１，３−オキサチオラン、１，３−ジチオール、１，３−ジチオラン、１，４−オキサチアン、テトラヒドロ−１，４−チアジン、２Ｈ−１，２−オキサジン、マレイミド、スクシンイミド、バルビツール酸、チオバルビツール酸、ジオキソピペラジン、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、トリオキサン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、イソキサゾリン、イソキサゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、オキサゾリジノン、チアゾリン、チアゾリジン、モルフォリン、オキシラン、ピペリジンＮ−オキシド、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、ピロリドン、ピロリジオン、４−ピペリドン、ピラゾリン、ピラゾリジン、２−オキソピロリジン、テトラヒドロピラン、４Ｈ−ピラン、テトラヒドロチオピラン、チアモルフォリン、チアモルフォリンスルホキシド、チアモルフォリンスルホン、およびこれらのベンゾ縮合類似体（例えば、ベンズイミダゾリジノン、テトラヒドロキノリン、３，４−メチレンジオキシフェニル）が挙げられるが、それらに限定されない。

【0035】

本明細書で使用する場合、「アラルキル」および「アリール（アルキル）」とは、低級アルキレン基を介して置換基として結合したアリール基を指す。アラルキルの低級アルキレン基およびアリール基は、置換または非置換であってよい。例としては、ベンジル、２−フェニルアルキル、３−フェニルアルキル、およびナフチルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。

【0036】

本明細書で使用する場合、「ヘテロアラルキル」および「ヘテロアリール（アルキル）」とは、低級アルキレン基を介して置換基として結合したヘテロアリール基を指す。ヘテロアラルキルの低級アルキレン基およびヘテロアリール基は、置換または非置換であってよい。例としては、２−チエニルアルキル、３−チエニルアルキル、フリルアルキル、チエニルアルキル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキル、ならびにこれらのベンゾ縮合類似体が挙げられるが、それらに限定されない。

【0037】

本明細書で使用する場合、「アルコキシ」とは、式−ＯＲを指し、式中Ｒはアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはシクロアルキニルであり、上記のとおり定義される。アルコキシの非限定的なリストは、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシである。アルコキシは、置換または非置換であってよい。

【0038】

本明細書で使用する場合、「Ｃ−アミド」基とは、「−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ_ａＲ_ｂ）」基を指し、式中、Ｒ_ａおよびＲ_ｂは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルであることができる。Ｃ−アミドは、置換または非置換であってよい。

【0039】

本明細書で使用する場合、「Ｎ−アミド」基とは、「ＲＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ_ａ）−」基を指し、式中、ＲおよびＲ_ａは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルであることができる。Ｎ−アミドは、置換または非置換であってよい。

【0040】

用語「ハロゲン原子」、「ハロゲン」または「ハロ」は、本明細書で使用する場合、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素などの、元素周期表の７列目の放射線安定性原子のうちのいずれか１つを意味する。

【0041】

用語「アミン」とは、本明細書で使用する場合、−ＮＨ_２基を指し、式中、１つもしくはそれより多くの水素はＲ基によって必要に応じて置換することができる。Ｒは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルであることができる。

【0042】

用語「アルデヒド」とは、本明細書で使用する場合、−Ｒ_ｃ−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を指し、式中Ｒ_ｃは、存在しなくてもよく、またはアルキレン、アルケニレン、アルキニレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、シクロアルキニレン、アリーレン、ヘテロアリーレン、ヘテロアリシクリレン、アラルキレン、もしくは（ヘテロアリシクリル）アルキレンから独立して選択されてもよい。

【0043】

用語「アミノ」とは、本明細書で使用する場合、−ＮＨ_２基を指す。

【0044】

用語「ヒドロキシ」とは、本明細書で使用する場合、−ＯＨ基を指す。

【0045】

用語「シアノ」基とは、本明細書で使用する場合、「−ＣＮ」基を指す。

【0046】

用語「アジド」とは、本明細書で使用する場合、−Ｎ_３基を指す。

【0047】

用語「チオール」とは、本明細書で使用する場合、−ＳＨ基を指す。

【0048】

用語「カルボン酸」とは、本明細書で使用する場合、−Ｃ（Ｏ）ＯＨを指す。

【0049】

用語「チオシアネート」とは、本明細書で使用する場合、−Ｓ−Ｃ≡Ｎ基を指す。

【0050】

用語「オキソアミン」とは、本明細書で使用する場合、−Ｏ−ＮＨ_２基を指し、式中−ＮＨ_２のうちの１つもしくはそれより多くの水素は、Ｒ基によって必要に応じて置換することができる。Ｒは、独立して、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリシクリル、アラルキル、または（ヘテロアリシクリル）アルキルであることができる。

【0051】

本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環式塩基、糖、および１つもしくはそれより多くのリン酸基を含む。これらは、核酸配列の単量体単位である。ＲＮＡにおいて、この糖はリボースであり、ＤＮＡにおいて、デオキシリボース、すなわちリボース中に存在するヒドロキシル基を欠いている糖である。この窒素含有複素環式塩基は、プリン塩基またはピリミジン塩基であることができる。プリン塩基として、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにこれらの修飾された誘導体もしくは類似体が挙げられる。ピリミジン塩基として、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにこれらの修飾された誘導体もしくは類似体が挙げられる。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。

【0052】

本明細書で使用する場合、「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造上類似しているが、リン酸部分を失っている。ヌクレオシド類似体の一例は、標識がその塩基に結合していて、その糖分子に結合したリン酸基がないものである。用語「ヌクレオシド」は、本明細書において、当業者によって理解されるとおりの通常の意味で使用される。例としては、リボース部分を含むリボヌクレオシドおよびデオキシリボース部分を含むデオキシリボヌクレオシドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾されたペントース部分は、酸素原子が炭素と置換されており、そして／または炭素が硫黄または酸素原子と置換されている、ペントース部分である。「ヌクレオシド」は、置換された塩基および／または糖部分を有することができる単量体である。追加的に、ヌクレオシドは、より大きなＤＮＡおよび／またはＲＮＡのポリマーおよびオリゴマーへと取り込まれていてよい。

【0053】

用語「プリン塩基」は、本明細書において、当業者によって理解されるとおりの通常の意味で使用され、その互変異性体を含む。同様に、用語「ピリミジン塩基」は、本明細書において、当業者によって理解されるとおりの通常の意味で使用され、その互変異性体を含む。必要に応じて置換されたプリン塩基の非限定的なリストとして、プリン、アデニン、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、アロキサンチン、７−アルキルグアニン（例えば、７−メチルグアニン）、テオブロミン、カフェイン、尿酸およびイソグアニンが挙げられる。ピリミジン塩基の例としては、シトシン、チミン、ウラシル、５，６−ジヒドロウラシルおよび５−アルキルシトシン（例えば、５−メチルシトシン）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0054】

本明細書で使用する場合、「誘導体」または「類似体」は、修飾された塩基部分および／または修飾された糖部分を有する合成ヌクレオチド誘導体または合成ヌクレオシド誘導体を意味する。このような誘導体および類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎ，１９８０）およびＵｈｌｍａｎら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０：５４３〜５８４、１９９０において論議されている。ヌクレオチド類似体はまた、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、ホスホルアニリデートおよびホスホルアミデート結合を含む修飾されたホスホジエステル結合を含むことができる。「誘導体」、「類似体」および「修飾された」は、本明細書で使用する場合、交換可能に使用してもよく、本明細書に定義される用語「ヌクレオチド」および「ヌクレオシド」によって包含される。

【0055】

本明細書で使用する場合、用語「ホスフェート」は、当業者によって理解されるとおりの通常の意味で使用され、そのプロトン化形態（例えば、

【化2】

）を含む。本明細書で使用する場合、用語「モノホスフェート」、「ジホスフェート」、および「トリホスフェート」は、当業者によって理解されるとおりの通常の意味で使用され、プロトン化形態を含む。

【0056】

用語「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）」および「保護基（ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ）」とは、本明細書で使用する場合、分子中に存在する基が望まない化学反応を起こすことを防止するために、分子に付加される任意の原子または原子の群を指す。「保護基」および「ブロッキング基」は、交換可能に使用することができる場合がある。

【0057】

本明細書で使用する場合、接頭辞「光（ｐｈｏｔｏ）」または「光（ｐｈｏｔｏ−）」は、光または電磁放射に関することを意味する。この用語は、スペクトルの放射線部分、マイクロ波部分、赤外線部分、可視光線部分、紫外線部分、Ｘ線もしくはγ線部分として一般に公知の範囲のうちの１つもしくはそれより多くを含むがこれらに限定されない電磁スペクトルの全部または一部を包含することができる。スペクトルの部分は、本明細書に示す金属などの、表面の金属領域によって遮断されるものであることができる。あるいは、またはさらに、スペクトルの部分は、表面の介在性領域（例えば、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に示す他の材料でできた領域）を通過するものであることができる。特定の実施形態において、金属を通過できる放射線を使用することができる。あるいは、またはさらに、ガラス、プラスチック、シリカ、または本明細書に示す他の材料によって遮蔽される放射線を使用することができる。

【0058】

本明細書で使用する場合、用語「位相化」とは、３’終結因子およびフルオロフォアの不完全な除去、ならびに与えられた配列決定サイクルにおいてポリメラーゼによるクラスター内へのＤＮＡ鎖のポーションの取り込みを完了し損ねることによって生じる、ＳＢＳにおける現象を指す。前位相化は、有効な３’終結因子なしでのヌクレオチドの取り組みによって生じ、そしてこの取り込み事象は１サイクルだけ進める。位相化および前位相化が原因となり、特定のサイクルについて抽出した強度は、現行サイクルのシグナルならびにその前後のサイクルからのノイズからなるようになる。サイクル数が増すにつれ、位相化によって影響を受けるクラスター当たりの配列の割合が増え、正しい塩基の識別を妨害する。前位相化は、合成による配列決定（ＳＢＳ）の間に保護されていないもしくはブロックされていない微量の３’−ＯＨヌクレオチドの存在によって生じ得る。保護されていない３’−ＯＨヌクレオチドは、製造プロセス中に、またはおそらくは保管プロセスおよび試薬取り扱いプロセスの間に生じ得る。したがって、前位相化の発生を減少させるヌクレオチド類似体の発見は、驚くべきことであり、既存のヌクレオチド類似体を上回る、ＳＢＳ適用における優れた利点を提供する。例えば、提供されるヌクレオチド類似体は結果的に、ＳＢＳサイクル時間をより短くさせることができ、位相化値および前位相化値を低下させることができ、配列決定読み取り長を長くすることができる。
３’−ＯＨ保護基−Ｃ（Ｒ）_２Ｎ_３

【0059】

本明細書に記載するいくつかの実施形態は、除去可能な３’−ヒドロキシ保護基−Ｃ（Ｒ）_２Ｎ_３を有する修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子に関し、式中Ｒは、水素、−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^３、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^４Ｒ^５、−Ｃ（Ｒ^６）_２Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８および−Ｃ（Ｒ^９）_２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^１０Ｒ^１１からなる群から選択され、ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７、Ｒ^８、Ｒ^９、Ｒ^１０、Ｒ^１１、ｍ、ｎおよびｐは上記に定義されている。

【0060】

いくつかの実施形態において、Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎである。いくつかのこのような実施形態において、−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎは、−ＣＨＦ_２、−ＣＨ_２Ｆ、−ＣＨＣｌ_２または−ＣＨ_２Ｃｌから選択される。一実施形態において、−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎは、−ＣＨＦ_２である。別の実施形態において、−Ｃ（Ｒ^１）_ｍ（Ｒ^２）_ｎは、−ＣＨ_２Ｆである。

【0061】

いくつかの実施形態において、Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^３である。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^３は水素である。

【0062】

いくつかの実施形態において、Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^４Ｒ^５である。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^４およびＲ^５は両方とも水素である。いくつかの他のこのような実施形態において、Ｒ^４は水素でありかつＲ^５はＣ_１−６アルキルである。さらにいくつかの他の実施形態において、Ｒ^４およびＲ^５は両方ともＣ_１−６アルキルである。一実施形態において、Ｒ^５はｎ−ブチルである。別の実施形態において、Ｒ^４およびＲ^５は両方ともメチルである。

【0063】

いくつかの実施形態において、Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ^６）_２Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８である。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^６は両方とも水素である。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^７およびＲ^８は両方とも水素である。いくつかのこのような実施形態において、ｐは０である。いくつかの他のこのような実施形態において、ｐは６である。

【0064】

いくつかの実施形態において、Ｒのうちの１つは水素であり、他方のＲは−Ｃ（Ｒ^９）_２Ｏ−Ｐｈ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^１０Ｒ^１１である。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^９は両方とも水素である。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ^１０およびＲ^１１は両方とも水素である。いくつかの他のこのような実施形態において、Ｒ^１０は水素でありかつＲ^１１は置換アルキルである。一実施形態において、Ｒ^１１はアミノ置換アルキルである。
３’−ＯＨ保護基の脱保護

【0065】

いくつかの実施形態において、３’−ＯＨ保護基は、ホスフィンを用いた脱保護反応において除去される。−Ｃ（Ｒ）_２Ｎ_３におけるアジド基は、修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子をホスフィンと接触させることによって、アミノ基へと転換することができる。あるいは、−Ｃ（Ｒ）_２Ｎ_３におけるアジド基は、このような分子をチオール、特にジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの水溶性チオールと接触させることによって、アミノ基へと転換され得る。一実施形態において、ホスフィンは、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）である。別段の指示がない限り、ヌクレオチドに対する言及はまた、ヌクレオシドにも適用可能であることが意図される。
検出可能な標識

【0066】

本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、従来の検出可能な標識の使用に関する。検出は、蛍光分光法または他の光学手段を含む任意の適切な方法によって実施することができる。好ましい標識は、フルオロフォアであり、これはエネルギー吸収後に規定の波長の放射線を放射する。多くの適切な蛍光標識が公知である。例えば、Ｗｅｌｃｈら（Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．５（３）：９５１〜９６０、１９９９）は、本発明において使用することができるダンシル官能化蛍光部分を開示している。Ｚｈｕら（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２８：２０６〜２１１、１９９７）は、また本発明において使用することができる蛍光標識Ｃｙ３およびＣｙ５の使用を記載している。使用に適した標識はまた、Ｐｒｏｂｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：３３６〜３４１、１９８７）、Ｃｏｎｎｅｌｌら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ５（４）：３４２〜３８４、１９８７）、Ａｎｓｏｒｇｅら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５（１１）：４５９３〜４６０２、１９８７）およびＳｍｉｔｈら（Ｎａｔｕｒｅ ３２１：６７４、１９８６）において開示されている。他の市販の蛍光標識として、フルオレセイン、ローダミン（ＴＭＲ、テキサスレッドおよびＲｏｘを含む）、アレクサ、ボディパイ、アクリジン、クマリン、ピレン、ベンズアントラセンおよびシアニンが挙げられるがこれらに限定されない。

【0067】

複数の標識、例えば、二重フルオロフォアＦＲＥＴカセット（Ｔｅｔ．ｌｅｔ．４６：８８６７〜８８７１、２０００）もまた、本出願において使用することができる。多重蛍光デンドリマー系（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３：８１０１〜８１０８、２００１）も使用することができる。蛍光標識が好ましいが、他の形態の検出可能な標識は、当業者に有用であるものとして明らかであろう。例えば、量子ドット（Ｅｍｐｏｄｏｃｌｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３９９：１２６〜１３０、１９９９）、金ナノ粒子（Ｒｅｉｃｈｅｒｔら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２：６０２５〜６０２９、２０００）、およびマイクロビーズ（Ｌａｃｏｓｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７（１７）：９４６１〜９４６６、２０００）を含む微小粒子はすべて使用することができる。

【0068】

多成分標識も本出願において使用することができる。多成分標識は、検出のためのさらなる化合物との相互反応に依存しているものである。生物学において使用される最も一般的な多成分標識は、ビオチン−ストレプトアビジン系である。ビオチンは、ヌクレオチド塩基に結合する標識として使用される。次いでストレプトアビジンが個別に添加されて、検出が生じることを可能にする。他の多成分系が利用可能である。例えば、ジニトロフェノールは、検出に使用することができる市販の蛍光抗体を有する。

【0069】

別段の指示がない限り、ヌクレオチドに対する言及はまた、ヌクレオシドにも適用可能であることが意図される。本出願はまた、ＤＮＡに対する言及を用いてさらに記載されるが、該記載は、別段の指示がない限り、ＲＮＡ、ＰＮＡおよび他の核酸にも適用可能である。
リンカー

【0070】

本明細書に記載するいくつかの実施形態において、修飾されたヌクレオチド分子または修飾されたヌクレオシド分子のプリン塩基またはピリミジン塩基は、上記のような検出可能な標識に結合することができる。いくつかのこのような実施形態において、使用されるリンカーは切断可能である。切断可能なリンカーの使用は、標識を必要であれば検出後に除去することができることを確実にし、その後に取り込まれるあらゆる標識されたヌクレオチドもしくはヌクレオシドに対するあらゆる干渉シグナルを回避する。

【0071】

いくつかの他の実施形態において、使用されるリンカーは、切断不可能である。本発明の標識されたヌクレオチドが取り込まれるそれぞれの場合において、ヌクレオチドはその後に取り込まれることを必要としないので、標識は、ヌクレオチドから除去する必要がない。

【0072】

当業者は、特定の型のヌクレオチドにおける無作為な鎖終結に依存するいわゆるサンガー配列決定法および関連プロトコル（サンガー型）におけるジデオキシヌクレオシドトリホスフェートの有用性に気付いている。サンガー型配列決定プロトコルの一例は、Ｍｅｔｚｋｅｒによって記載されたＢＡＳＳ法である。

【0073】

サンガー法およびサンガー型の方法は概して、８種類のヌクレオチドが提供される実験の実施によって動作し、該ヌクレオチドのうちの４つは、３’−ＯＨ基を含有しており、かつ該ヌクレオチドのうちの４つは、ＯＨ基がなく、互いに異なって標識されている。３’−ＯＨ基のない、使用されるヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）である。当業者によって公知のように、ｄｄＮＴＰは異なって標識されているので、取り込まれた末端のヌクレオチドの位置を決定し、この情報を合わせることによって標的オリゴヌクレオチドの配列が決定され得る。

【0074】

本出願のヌクレオチドは、サンガー法及び関連プロトコルにおいて有用であり得ると認識され、その理由は、ｄｄＮＴＰを用いることによって達成される同じ効果が、本明細書で記載される３’−ＯＨ保護基を用いることによって達成され得るからであり、両方ともその後のヌクレオチドの取り込みを防止する。

【0075】

その上、３’−ＯＨ保護されたヌクレオチドの取り込みのモニタリングが、結合したリン酸基における放射性^３２Ｐの使用によって決定され得ることが認識される。これらは、ｄｄＮＴＰ自体、または伸長に使用されるプライマーのいずれかに存在し得る。

【0076】

切断可能なリンカーは、当該技術分野で公知であり、慣用的な化学反応を適用して、リンカーをヌクレオチド塩基および標識に結合させることができる。リンカーは、酸、塩基、求核試薬、求電子試薬、ラジカル、金属、還元剤または酸化剤、光、温度、酵素などへの曝露を含む任意の適切な方法によって切断することができる。本明細書で論議されるリンカーはまた、３’−Ｏ−保護基結合を切断するのに使用されるものと同じ触媒を用いて切断してもよい。適切なリンカーは、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓにおいて開示されているように、標準的な化学保護基から適応させることができる。固相合成において使用されるさらに適切な切断可能なリンカーは、Ｇｕｉｌｌｉｅｒら（Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１００：２０９２〜２１５７、２０００）において開示されている。

【0077】

用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体が例えばヌクレオチド塩基から除去される必要があることを暗示することを意図するものではない。検出可能な標識が塩基に結合している場合、ヌクレオシド切断部位が、リンカーの一部が切断後にヌクレオチド塩基に結合したままであることを保証するリンカー上の位置にあることができる。

【0078】

検出可能な標識が塩基に結合している場合、リンカーは、ヌクレオチド塩基上のいかなる位置に結合していてもよく、但し、ワトソン・クリック塩基対形成を依然として実施することができることを条件とする。プリン塩基との関連において、プリンまたは好ましいデアザプリン類似体の７位を介して、８修飾したプリンを介して、Ｎ−６修飾したアデノシンもしくはＮ−２修飾したグアニンを介してリンカーが結合している場合が好ましい。ピリミジンについては、結合は好ましくは、シトシン、チミジンまたはウラシル上の５位およびシトシン上のＮ−４位を介したものである。
Ａ．求電子的に切断されるリンカー

【0079】

求電子的に切断されるリンカーは、典型的には、プロトンによって切断され、酸に対して感受性のある切断を含む。適切なリンカーとして、トリチル、ｐ−アルコキシベンジルエステルおよびｐ−アルコキシベンジルアミドなどの修飾されたベンジル系が挙げられる。他の適切なリンカーとして、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基およびアセタール系が挙げられる。

【0080】

チオアセタールもしくは他の含硫保護基の切断におけるチオ親和性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）金属（ニッケル、銀または水銀など）の使用も、適切なリンカー分子の調製のために考慮することができる。
Ｂ．求核的に切断されるリンカー

【0081】

求核的切断も、リンカー分子の調製において十分に認識された方法である。水中で不安定な（すなわち、塩基性ｐＨにおいて単純に切断することができる）エステルなどの基、および非水性求核試薬に対して不安定な基を使用することができる。フッ化物イオンは、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）またはｔ−ブチルジメチルシラン（ＴＢＤＭＳ）などの基におけるケイ素−酸素結合を切断するために使用することができる。
Ｃ．光切断可能なリンカー

【0082】

光切断可能なリンカーは、炭化水素化学において広く使用される。切断を活性化させるのに必要とされる光は、修飾されたヌクレオチドの他の成分に影響しないことが好ましい。例えば、フルオロフォアを標識として使用する場合、これが、リンカー分子を切断するのに必要とされるものとは異なる波長の光を吸収することが好ましい。適切なリンカーとして、Ｏ−ニトロベンジル化合物およびニトロベラトリル化合物に基づくものが挙げられる。ベンゾイン化学に基づくリンカーも使用することができる（Ｌｅｅら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６４：３４５４〜３４６０、１９９９）。
Ｄ．還元条件下での切断

【0083】

還元的切断を受けやすいことが公知の多くのリンカーがある。パラジウムベースの触媒を用いた触媒的水素化は、ベンジル基およびベンジルオキシカルボニル基を切断するために使用される。ジスルフィド結合の還元も当該技術分野で公知である。
Ｅ．酸化条件下での切断

【0084】

酸化に基づくアプローチは、当該技術分野で周知である。これらには、ｐ−アルコキシベンジル基の酸化ならびに硫黄およびセレンのリンカーの酸化が含まれる。ジスルフィドおよび他の硫黄ベースもしくはセレンベースのリンカーを切断するためのヨウ素水溶液の使用も本発明の範囲内である。
Ｆ．セーフティーキャッチリンカー

【0085】

セーフティーキャッチリンカーは、２工程で切断するものである。好ましい系において、第一の工程は、反応性求核中心の生成であり、それに続く第二の工程は、切断をもたらす分子内環化に関する。例えば、レブリン酸エステル結合は、活性のあるアミンを放出させるためにヒドラジンまたは光化学反応を用いて処理することができ、これは次に、環化してエステルを該分子中の他の箇所にあるエステルを切断することができる（Ｂｕｒｇｅｓｓら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：５１６５〜５１６８、１９９７）。
Ｇ．脱離機構による切断

【0086】

脱離反応も使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃおよびシアノエチルなどの基の塩基触媒による脱離、ならびにパラジウム触媒によるアリル系の還元的脱離を使用することができる。

【0087】

いくつかの実施形態において、リンカーは、スペーサー単位を含むことができる。リンカーの長さは重要ではなく、但し、ヌクレオチドと酵素との間のいかなる相互作用をも妨げることがないよう、標識がヌクレオチドから十分な距離で保持されていることを条件とする。

【0088】

いくつかの実施形態において、リンカーは、３’−ＯＨ保護基と類似の官能基からなってもよい。このことは、単一の処理のみが標識および保護基の両方を除去するのに必要とされるので、脱保護および脱保護プロセスをより効率的にする。特に好ましいリンカーは、ホスフィン切断可能なアジド含有リンカーである。
配列決定方法

【0089】

本明細書に記載する修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、種々の配列決定技術とともに使用することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸のヌクレオチド配列を決定するためのプロセスは、自動化されたプロセスであることができる。

【0090】

本明細書において提供されるヌクレオチド類似体は、合成による配列決定（ＳＢＳ）技術などの配列決定手順において使用することができる。簡潔には、ＳＢＳは、標的核酸を１つもしくはそれより多くの標識されたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどと接触させることによって開始することができる。プライマーが標的核酸をテンプレートとして用いて伸長するという特徴によって、検出することができる標識されたヌクレオチドが取り込まれる。必要に応じて、標識されたヌクレオチドは、一度ヌクレオチドがプライマーに付加されたときにさらなるプライマー伸長を終結させる可逆的終結特性をさらに含むことができる。例えば、脱ブロッキング剤が可逆的終結因子部分を除去するために送達されるまで、その後の伸長が生じ得ないように、該部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加することができる。したがって、可逆的終結を使用する実施形態については、脱ブロッキング試薬をフローセルへと（検出が生じる前または後に）送達することができる。洗浄は、種々の送達工程の間に実施することができる。次に、サイクルは、プライマーをｎ個のヌクレオチドだけ伸長させるようにｎ回反復することができ、それにより、長さｎの配列を検出する。本開示の方法によって生じるアレイを伴う使用に容易に適応させることができる例示的なＳＢＳ手順、流体系および検出プラットフォームは、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれるＢｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ ４５６：５３〜５９（２００８）、ＷＯ０４／０１８４９７、ＷＯ９１／０６６７８、ＷＯ０７／１２３７４４、米国特許第７，０５７，０２６号、第７，３２９，４９２号、第７，２１１，４１４号、第７，３１５，０１９号または第７，４０５，２８１号、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２ Ａ１号に記載されている。

【0091】

ピロ配列決定などの、サイクル的な反応を使用する他の配列決定手順を使用することができる。ピロ配列決定は、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖へと取り込まれるときの無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（各々が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｎａｇｈｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１）、８４〜９（１９９６）、Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１）、３〜１１（２００１）、Ｒｏｎａｇｈｉら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５）、３６３（１９９８）、米国特許第６，２１０，８９１号、第６，２５８，５６８号および第６，２７４，３２０号）。ピロ配列決定において、放出されるＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）へと転換することによって検出することができ、結果として生じるＡＴＰは、ルシフェラーゼ産生光子を介して検出することができる。したがって、配列決定反応は、ルミネセンス検出系を介してモニターすることができる。蛍光に基づく検出系に使用される励起放射線源は、ピロ配列決定手順に必要ではない。本開示のアレイへのピロ配列決定の適用に使用することができる有用な流体系、検出器および手順は、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれるＷＩＰＯ特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８ Ａ１号、米国特許第７，５９５，８８３号、および米国特許第７，２４４，５５９号に記載されている。

【0092】

例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれるＳｈｅｎｄｕｒｅら Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１７２８〜１７３２（２００５）、米国特許第５，５９９，６７５号、および米国特許第５，７５０，３４１号に記載されるものを含むライゲーション反応による配列決定も有用である。いくつかの実施形態として、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれるＢａｉｎｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３５（３）、３０３〜７（１９８８）、Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６、５４〜５８（１９９８）、Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１（４９９５）、７６７〜７７３（１９９５）、およびＷＯ１９８９／１０９７７に記載されるようなハイブリッド形成による配列決定手順が挙げられ得る。ライゲーションによる配列決定およびハイブリッド形成による配列決定の両手順において、ゲル含有ウェル（または他の凹状特徴物）の中に存在する核酸は、オリゴヌクレオチド送達および検出の反復サイクルに供される。本明細書または本明細書に引用される参考文献において示すようなＳＢＳ法のための流体系は、ライゲーションによる配列決定またはハイブリッド形成による配列決定の手順のための試薬の送達に容易に適合させることができる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、蛍光標識されており、本明細書または本明細書に引用される参考文献におけるＳＢＳ手順に関して記載したものと類似の蛍光検出器を用いて検出することができる。

【0093】

いくつかの実施形態には、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムでのモニタリングに関する方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγリン酸標識されたヌクレオチドとの間の蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）相互作用を通じて、またはゼロモードの導波管を用いて検出することができる。ＦＲＥＴに基づく配列決定のための技術および試薬は、例えば、それらの開示が参照により本明細書に組み込まれるＬｅｖｅｎｅら Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９、６８２〜６８６（２００３）、Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３、１０２６〜１０２８（２００８）、Ｋｏｒｌａｃｈら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５、１１７６〜１１８１（２００８）に記載されている。

【0094】

いくつかのＳＧＳ実施形態には、伸長生成物へのヌクレオチドの取り込みの際に放出されるプロトンの検出が含まれる。例えば、放出されたプロトンの検出に基づく配列決定には、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気的な検出器および関連技術、または各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００２６０８２ Ａ１号、第２００９／０１２７５８９ Ａ１号、第２０１０／０１３７１４３ Ａ１号、または第２０１０／０２８２６１７ Ａ１号に記載される配列決定方法および配列決定系を使用することができる。

【実施例】

【0095】

追加的な実施形態は、以下の実施例においてさらに詳細に開示され、これは、決して特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。保護された３’−ヒドロキシ基を有する種々の修飾されたヌクレオチドの合成を実施例１〜３において実証する。

【0096】

【化3】

スキーム１は、３’−ＯＨ保護基としてモノフルオロメチル置換アジドメチルを有する修飾されたヌクレオチドの調製のための合成経路を示す。化合物１ａ〜１ｆは、修飾されたチミン（Ｔ−ＰＡ）を塩基として使用する。使用することができる塩基の他の非限定的な例としては、Ｃｂｚ−ＰＡ、ＡＤＭＦ−ＰＡ、およびＧＰａｃ−ＰＡが挙げられ、それらの構造は、スキーム１において上記に示す。
実験手順

【0097】

無水ＣＨ_３ＣＮ（２５ｍｌ）中の出発ヌクレオシド１ａ（１．５４ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に、２，６−ルチジン（０．８７ｍＬ、７．５ｍｍｏｌ）、（２−フルオロエチル）（４−メトキシフェニル）スルファン（ＭＰＳＦ）（３．２６ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）および次にＢｚ_２Ｏ_２（純度５０％、８．４７ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）を４℃で添加した。反応混合物を室温へと徐々に加温した。この混合物をさらに６時間撹拌した。ＴＬＣで、出発ヌクレオシドの完全な消費を確認するためにモニターした（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ＝２：８ｖ／ｖ）。次に、反応物を減圧下で油状の残渣へと濃縮した。この混合物に、石油エーテル（５００ｍｌ）を添加し、１０分間激しく撹拌した。石油エーテル層をデカントし、残渣を繰り返し石油エーテルで処理した（２回）。油状残渣をＤＣＭとＮａＨＣＯ_３（１：１）（３００ｍＬ）との間で分画した。有機層を分離し、水層をさらにＤＣＭ（２×１５０ｍＬ）の中へと抽出した。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物１ｃを、石油エーテルから石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝１：１（ｖ／ｖ）へと至る勾配を用いてＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（５０ｇ）によって精製し、１．６３ｇのヌクレオシド１ｂを淡黄色の泡状物（ジアステレオマー、８２％収率）として得た。
¹H NMR (d₆ DMSO, 400 MHz): δ, 0.95 (s, 9H, tBu), 2.16 − 2.28 (m, 2H, H-2’), 3.67 (s, OMe), 3.65 -3.85 (m, 2H, HH-5’), 3.77 (dd, J = 11.1, 4.5 Hz, 1H, HH-5’), 3.95-3.98 (m, 1H, H-4’), 4.04 (m, 2H, CH₂F), 4.63-4.64 (m, 1H, H-3’), 5.01-5.32 (s, 1H, CH), 6.00 (m, 1H, H-1’), 6.72-6.87 (m, 3H, Ar), 7.35-7.44 (m, 7H, Ar), 7.55-7.60 (m, 4H, Ar), 7.88 (s, 1H, H-6), 9.95 (brt, 1H, NH), 11.70 (s, 1H, NH)

【0098】

Ｎ_２下で分子ふるい（４Å）含有の無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（１４ｍＬ）中の出発ヌクレオシド１ｂ（１．１４ｇ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、シクロヘキセン（１．４４ｍＬ、１４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物をドライアイス／アセトン浴で−７８℃まで冷却した。ＤＣＭ（１４ｍｌ）中の塩化スルフリルの溶液（５８０μＬ、７．２ｍｍｏｌ）を９０分にわたってＮ_２下で緩徐に添加した。その温度で２０分後、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル＝１：１ｖ／ｖ）で、出発ヌクレオシドの完全な消費を示した。揮発性物質を減圧下（および２５℃の室温）で蒸発させ、油状残渣を発泡するまでさらに１０分間高真空へ迅速に供した。粗生成物をＮ_２でパージした後、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、ＮａＮ_３（４７０ｍｇ、７ｍｍｏｌ）を一度に添加した。結果として生じた懸濁液を、２時間またはＴＬＣが反応の完了および２つの異性体（ａおよびｂ）としての１ｃの形成を示すまで、室温で撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃとＮａＨＣＯ_３（１：１）（２００ｍＬ）との間で分画した。有機層を分離し、水層をさらにＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）の中へと抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。石油エーテルから石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝１：１（ｖ／ｖ）に至る勾配を用いて１ｃの２つのジアステレオ異性体（ＡおよびＢ）をＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（２５ｇ）によって淡黄色の泡状物として分離した。

【0099】

異性体Ａ（３７０ｍｇ、収率：３８％）。
¹H NMR (d₆ DMSO, 400 MHz): δ 1.02 (s, 9H, tBu), 2.35 − 2.43 (m, 2H, H-2’), 3.76-3.80 (m, 1H, H-5’), 3.88 - 3.92 (m, 1H, H-5’), 4.10 - 4.12 (m, 1H, H-4’), 4.14 (d, J = 4.1 Hz 2H, NHCH₂), 4.46-4.60 (m, 3H, H-3’, CH2F), 5.05-5.09 (m, 1H, CHN₃), 6.11 (t, J = 6.1 Hz, 1H, H-1’), 7.47 - 7.51 (m, 6H, Ar), 7.64 - 7.68 (m, 4H, Ar), 7.97 (s, 1H, H-6), 10.03 (bt, 1H, J = 10.0 Hz, NH), 11.76 (s, 1H, NH). ¹⁹F NMR: -74.3 (CF₃), -230.2 (CH₂F)

【0100】

異性体Ｂ（２５３ｍｇ、収率：２６％）。
¹H NMR (d₆ DMSO, 400 MHz): δ 1.01 (s, 9H, tBu), 2.38 − 2.42 (m, 2H, H-2’), 3.74-3.78 (m, 1H, H-5’), 3.86-3.90 (m, 1H, H-5’), 4.00-4.05 (m, 1H, H-4’), 4.12 (d, J = 4.1 Hz 2H, NHCH₂), 4.45-4.60 (m, 3H, H-3’, CH2F), 5.00-5.14 (m, 1H, CHN₃), 6.09 (t, J = 6.1 Hz, 1H, H-1’), 7.41 - 7.50 (m, 6H, Ar), 7.63-7.66 (m, 4H, Ar), 7.95 (s, 1H, H-6), 10.01 (bs, 1H, NH), 11.74 (s, 1H, NH). ¹⁹F NMR: -74.5 (CF3), -230.4 (CH2F)

【0101】

出発材料１ｃ（異性体Ａ）（５００ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３ｍＬ）中に溶解し、氷浴中で４℃へと冷却した。次に、ＴＢＡＦ（ＴＨＦ中で１．０Ｍ、５重量％水、１．０７ｍＬ、１．０７ｍｍｏｌ）を５分間の時間をかけて緩徐に添加した。反応混合物を室温へと緩徐に加温した。反応の進行は、ＴＬＣ（石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝３：７（ｖ／ｖ））によってモニターした。反応を、出発材料がもはやＴＬＣによって可視ではない１時間後に停止させた。反応溶液をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に溶解し、ＮａＨＣＯ_３（６０ｍＬ）に添加した。２つの層を分離し、水層を追加的なＤＣＭ（５０ｍＬ×２）で抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、蒸発させて、黄色の油を得た。粗生成物１ｄ（異性体Ａ）をＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１０ｇ）によって、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ＝８：２（ｖ／ｖ）からＥｔＯＡｃへと至る勾配を用いて、白色の固体（１８３ｍｇ、収率：５６％）として精製した。

【0102】

異性体Ａ：
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO): δ 2.24-2.35 (m, 2H, H-2’), 3.56-3.66 (m, 2H, H-5’), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4’), 4.23 (s, 2H, CH₂NH), 4.33-4.37 (m, 1H, H-3’), 4.43-4.51 (m, CH2F), 5.12 (br.s, 1H, CHN₃), 5.23 (br.s, 1H, 5’-OH), 6.07 (t, J=6.7 Hz, 1H, H-1’), 8.26 (s, 1H, H-6), 10.11 (br s, 1H, NH), 11.72 (br s, 1H, NH). ¹⁹F NMR: -74.3 (CF3), -230.5 (CH2F)

【0103】

同じ反応を１ｃ（異性体Ｂ）について３６０ｍｇ規模で実施し、対応する生成物１ｄ（異性体Ｂ、１５０ｍｇ、６３％）を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO): δ 2.24-2.37 (m, 2H, H-2’), 3.57-3.70 (m, 2H, H-5’), 3.97-4.01 (m, 1H, H-4’), 4.23 (br.s, 2H, CH₂NH), 4.33-4.37 (m, 1H, H-3’), 4.44-4.53 (m, CH2F), 5.11-5.21 (br.s, 1H, CHN₃), 5.23 (br.s, 1H, 5’-OH), 6.07 (t, J=6.6 Hz, 1H, H-1’), 8.23 (s, 1H, H-6), 10.09 (br s, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). ¹⁹F NMR: -74.1 (CF3), -230.1 (CH2F)

【0104】

対応するトリホスフェート１ｅの調製、および完全に機能性のヌクレオシドトリホスフェート（ｆｆＮ）１ｆを生じるための核酸塩基への色素のさらなる結合は、ＷＯ２００４／０１８４９７において報告されており、概して当業者に公知である。

【0105】

【化4】

スキーム２は、３’−ＯＨ保護基としてＣ−アミド置換アジドメチルを有する修飾されたヌクレオチドの調製のための合成経路を示す。化合物２ａ〜２ｉは、修飾されたチミン（Ｔ−ＰＡ）を塩基として使用する。使用することができる塩基の他の非限定的な例としては、Ｃｂｚ−ＰＡ、ＡＤＭＦ−ＰＡ、およびＧＰａｃ−ＰＡが挙げられ、これらの構造は、上記スキーム１に示されている。実験手順において、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｃ（＝Ｏ）−置換アジドメチル保護基（Ｒ＝ＮＭｅ_２）を有する化合物２ｆおよびその後の反応を報告した。Ｎ−エチル−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｒ＝ＮＨＥｔ）などの、他のＣ−アミド基を有する化合物も調製した。
実験手順

【0106】

無水ＣＨ_３ＣＮ（５０ｍｌ）中の出発ヌクレオシド２ａ（４．２７ｇ、６．９ｍｍｏｌ）の溶液に、２，６−ルチジン（２．４ｍＬ、２０．７ｍｍｏｌ）、Ｓ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＡｃ）_２（１２．２ｇ、６９ｍｍｏｌ）および次いでＢｚ_２Ｏ_２（純度５０％、３３．４ｇ、６９ｍｍｏｌ）を４℃で添加した。反応混合物を室温まで緩徐に加温した。この混合物をさらに１２時間撹拌した。ＴＬＣで、出発ヌクレオシドの完全な消費を確認するためにモニターした（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ＝４：６ｖ／ｖ）。反応物を次に減圧下で油状残渣へと濃縮した。この混合物に、石油エーテル（８００ｍｌ）を添加し、１０分間激しく撹拌した。石油エーテル層をデカントし、残渣を繰り返し石油エーテルで処理した（２回）。油状残渣を次に、ＤＣＭとＮａＨＣＯ_３（１：１）（１０００ｍＬ）との間で分画した。有機層を分離し、水層をＤＣＭの中へとさらに抽出した（２×５００ｍＬ）。合わせた有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物２ｂをＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１００ｇ）によって、石油エーテルから石油エーテル：ＥｔＯＡｃ２：８（ｖ／ｖ）に至る勾配を用いて、淡黄色の泡状物（４．１７ｇ、収率：７４％、ジアステレオ異性体）として精製した。

【0107】

Ｎ_２下の分子ふるい（４Å）含有無水ＣＨ_２Ｃｌ_２（５６ｍＬ）中の出発ヌクレオシド２ｂ（４．５４ｇ、５．５６ｍｍｏｌ）の溶液に、シクロヘキセン（５．６２ｍＬ、５６ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を氷浴で４℃まで冷却した。ＤＣＭ（２５ｍｌ）中の塩化スルフリル（１．１３ｍＬ、１３．９ｍｍｏｌ）の溶液を９０分かけてＮ_２下で緩徐に添加した。その温度で３０分後、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ＝４：６ｖ／ｖ）は、出発ヌクレオシド２ｂの１０％が残っていることを示した。追加的な塩化スルフリル（０．１ｍＬ）を反応混合物中に添加した。ＴＬＣで、２ｂの完全な転換を示した。揮発性物質を減圧下（および２５℃の室温）で蒸発させ、油状残渣を発泡するまでさらに１０分間高真空へ迅速に供した。粗生成物をＮ_２でパージした後、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解し、ＮａＮ_３（１．８ｇ、２７．８ｍｍｏｌ）を一度に添加した。結果として生じた懸濁液を、室温で２時間、またはＴＬＣで反応の完了および２つの異性体（ＡおよびＢ）としての２ｃの形成を示すまで、撹拌した。反応混合物をＥｔＯＡｃとＮａＨＣＯ_３（１：１）（１０００ｍＬ）との間で分画した。有機層を分離し、水層をさらにＥｔＯＡｃ（２×３００ｍＬ）中へと抽出した。合わせた有機抽出物を次に、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。２つのジアステレオ異性体２ｃ（異性体ＡおよびＢ）をＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１００ｇ）によって、石油エーテルから石油エーテル：ＥｔＯＡｃ１：１（ｖ／ｖ）に至る勾配を用いて、淡黄色の泡状物として分離した。異性体Ａ：１．６８ｇ、収率：４０．７％。異性体Ｂ：１．７９ｇ、収率：４３．２％。

【0108】

ＭｅＯＨ／ＴＨＦ（１：１）（２０ｍＬ）中の出発ヌクレオシド２ｃ（異性体Ａ）（１．６３ｇ、２．２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＨ（１Ｍ水溶液）（２．２ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）を緩徐に添加し、４℃で撹拌した。反応の進行はＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ＝４：６ｖ／ｖ）によってモニターした。反応は、出発材料がもはやＴＬＣによって可視ではない１時間後に停止させた。反応混合物をＤＣＭとＮａＨＣＯ_３（１：１）（１５０ｍＬ）との間で分画した。有機層を分離し、水層をさらにＤＣＭ（２×７０ｍＬ）の中へと抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物２ｄを、Ｂｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１０ｇ）によって、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（８：２）（ｖ／ｖ）からＥｔＯＡｃに至る勾配を用いて淡黄色の泡状物（１．１ｇ、収率：７１％）として精製した。

【0109】

同じ反応を２ｃ（異性体Ｂ、１．５７ｇ）について繰り返し、対応する生成物２ｄ（異性体Ｂ、１．０１ｇ、６９％収率）を得た。

【0110】

ＣＨ_３ＣＮ（１０ｍＬ）中の出発ヌクレオシド２ｄ（異性体Ａ）（７００ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液を、ＴＥＭＰＯ（６３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびＢＡＩＢ（６４４ｍｇ、２ｍｍｏｌ）で室温で処理した。反応の進行はＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ＝７：３ｖ／ｖ）によってモニターした。反応は、出発材料がもはやＴＬＣによって可視ではない２時間後に停止させた。反応混合物をＤＣＭとＮａ_２Ｓ_２Ｏ_３（１：１）（１００ｍＬ）との間で分画した。有機層を分離し、水層をさらにＤＣＭ（２×７０ｍＬ）中へ抽出した。合わせた有機抽出物を次に、ＮａＣｌ（飽和液）で洗浄した。生成物が沈殿することを防止するために、ＭｇＳＯ_４での乾燥無しで、有機層を減圧下で蒸発させた。粗生成物２ｅを、Ｂｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１０ｇ）によって、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（１：１）（ｖ／ｖ）からＥｔＯＡｃさらにはＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ（１：９）へと至る勾配を用いて、淡黄色の泡状物（異性体Ａ、４８２ｍｇ、６８％収率）として精製した。

【0111】

同じ反応を２ｄ（異性体Ｂ、７００ｍｇ）について実施し、対応する生成物２ｅ（異性体Ｂ、４８８ｍｇ、６９％収率）を得た。

【0112】

ＣＨ_３ＣＮ（１０ｍＬ）中の出発ヌクレオシド２ｅ（異性体Ａ）（２３３ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）の溶液に、ヒューニッヒ塩基（１７３μＬ、１ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ（１６５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を室温で添加した。５分間撹拌した後、溶液をＭｅ２ＮＨ（２ＭのＴＨＦ溶液）（０．４１ｍｌ、０．８２ｍｍｏｌ）で処理した。反応の進行は、ＴＬＣ（ＭｅＯＨ：ＤＣＭ＝１：９ｖ／ｖ）によってモニターした。反応は、出発材料がもはやＴＬＣによって可視ではない２時間後に停止させた。反応混合物をＤＣＭとＮａＨＣＯ_３（１：１）（５０ｍＬ）との間で分画した。有機層を分離し、水層をさらにＤＣＭ（２×３０ｍＬ）中へ抽出した。合わせた有機抽出物をＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、揮発性物質を減圧下で蒸発させた。粗生成物２ｆ（Ｒ＝ＮＭｅ_２）をＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１０ｇ）によって、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ（８：２）（ｖ／ｖ）からＥｔＯＡｃへと至る勾配を用いて、淡黄色の泡状物（異性体Ａ、２２０ｍｇ、９０％収率）として精製した。

【0113】

同じ反応を２ｅ（異性体Ｂ、２４９ｍｇ）について実施し、対応する生成物２ｆ（異性体Ｂ、２４０ｍｇ、９２％収率）を得た。

【0114】

出発材料２ｆ（異性体ＡおよびＢの混合物）（４５５ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、氷浴で４℃へと冷却した。次に、ＴＢＡＦ（１．０ＭのＴＨＦ溶液、５重量％水、１．０ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を５分間の時間をかけて緩徐に添加した。反応混合物を室温へと緩徐に加温した。反応の進行は、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）によってモニターした。反応は、出発材料がもはやＴＬＣによって可視ではない１時間後に停止させた。反応溶液をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に溶解し、ＮａＨＣＯ_３（３０ｍＬ）に添加した。２つの層を分離し、水層を追加的なＤＣＭ（３０ｍＬ×２）で抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、蒸発させて、黄色のオイルを得た。粗生成物２ｇをＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１０ｇ）によって、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ８：２（ｖ／ｖ）からＥｔＯＡｃさらにはＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ（２：８）へと至る勾配を用いて、白色の固体（５２％収率、１６０ｍｇ）として精製した。

【0115】

完全に機能性のヌクレオシドトリホスフェート（ｆｆＮ）２ｉを得るための、対応するトリホスフェート２ｈの調製、および核酸塩基への色素のさらなる結合は、ＷＯ２００４／０１８４９７に報告されており、概して、当業者に公知である。

【0116】

【化5】

スキーム３は、ジフルオロメチル置換アジドメチル３’−ＯＨ保護基を有する修飾されたヌクレオチドの調製のための合成経路を示す。化合物３ａ〜３ｉは、修飾されたチミン（Ｔ−ＰＡ）を塩基として使用する。使用することができる塩基の他の非限定的な例としては、Ｃｂｚ−ＰＡ、ＡＤＭＦ−ＰＡ、およびＧＰａｃ−ＰＡが挙げられ、これらの構造は、前記スキーム１において示されている。３ｂ、３ｃおよび３ｄの合成のための手順は実施例２に記載した。
実験手順

【0117】

無水ＤＣＭ（５ｍＬ）中の出発ヌクレオシド３ｄ（異性体Ａ）（４９０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＤＢＵ（２０９μＬ、１．４ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ＤＣＭ（２ｍｌ）中の塩化Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルベンゼンスルフィンイミドイル（１８１ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の溶液を−７８℃で緩徐に添加した。この反応混合物を−７８℃で２時間撹拌した。反応の進行はＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：ＤＣＭ＝４：６ｖ／ｖ）によってモニターした。反応は、１０％の出発材料が依然としてＴＬＣによって残っている２時間後に停止させて、過剰反応を防止した。この反応混合物をＤＣＭとＮａＨＣＯ_３（１：１）（５０ｍＬ）との間で分画した。水層をさらにＤＣＭ中へと抽出した（２×３０ｍＬ）。有機抽出物を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、蒸発させて、黄色のオイルを得た。粗生成物３ｅをＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１０ｇ）によって、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（８：２）（ｖ／ｖ）から石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（２：８）（ｖ／ｖ）への勾配を用いて、淡黄色の泡状物（異性体Ａ、２５０ｍｇ、５１％収率）として精製した。

【0118】

同じ反応を３ｄ（異性体Ｂ、４８０ｍｇ）について実施し、対応する生成物３ｅ（異性体Ｂ、２４０ｍｇ、５０％収率）を得た。

【0119】

ＤＣＭ（２．５ｍＬ）中の出発ヌクレオシド３ｅ（異性体Ａ）（３４２ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）、ＥｔＯＨ（１５μＬ、０．２５ｍｍｏｌ）の溶液を、ＤＣＭ（２．５ｍＬ）中のＤＡＳＴ（１８１ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の溶液に４℃（氷浴）で緩徐に添加した。反応混合物を４℃で１時間撹拌した。反応の進行はＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ：石油エーテル＝３：７ｖ／ｖ）によってモニターした。反応は、１時間後に停止させた。反応混合物をＤＣＭとＮａＨＣＯ_３（１：１）（５０ｍＬ）との間で分画した。水層をさらにＤＣＭ（２×３０ｍＬ）中へ抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、蒸発させて、黄色のオイルを得た。粗生成物３ｆをＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（１０ｇ）によって、石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（９：１）（ｖ／ｖ）から石油エーテル：ＥｔＯＡｃ（２：８）（ｖ／ｖ）へと至る勾配を用いて、淡黄色の泡状物（異性体Ａ、１００ｍｇ、２８％）として精製した。

【0120】

同じ反応を３ｅ（異性体Ｂ、４８０ｍｇ）について実施し、対応する生成物３ｆ（異性体Ｂ、２４０ｍｇ、５０％収率）を得た。

【0121】

出発材料３ｆ（異性体Ａ）（１２４ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２ｍＬ）中に溶解し、氷浴で４℃まで冷却した。次に、ＴＢＡＦ（１．０ＭのＴＨＦ溶液、５重量％の水、２５５μＬ、１０．２５５ｍｍｏｌ）を５分間の時間にわたって緩徐に添加した。反応混合物を室温へと緩徐に加温した。反応の進行は、ＴＬＣ（ＥｔＯＡｃ）によってモニターした。反応は、出発材料がもはやＴＬＣによって可視ではない１時間後に停止させた。反応溶液をＤＣＭ（３０ｍＬ）中に溶解し、ＮａＨＣＯ_３（３０ｍＬ）に添加した。２つの層を分離し、水層を追加的なＤＣＭ（３０ｍＬ×２）で抽出した。有機抽出物を合わせ、乾燥させ（ＭｇＳＯ_４）、濾過し、蒸発させて、黄色のオイルを得た。粗生成物３ｇをＢｉｏｔａｇシリカゲルカラム（４ｇ）によって、ＤＣＭ：ＥｔＯＡｃ＝８：２（ｖ／ｖ）からＥｔＯＡｃさらにはＭｅＯＨ：ＥｔＯＡｃ（２：８）へと至る勾配を用いて、淡黄色の泡状物（異性体Ａ、５４％収率、４４ｍｇ）として精製した。

【0122】

異性体Ａ：
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO): δ 2.24-2.35 (m, 2H, H-2’), 3.56-3.66 (m, 2H, H-5’), 3.96-4.00 (m, 1H, H-4’), 4.23 (s, 2H, CH₂NH), 4.33-4.37 (m, 1H, H-3’), 4.85 (s, 2H, OCH₂N₃), 5.23 (t, J=5.1 Hz, 1H, 5’-OH), 6.07 (t, J=6.7 Hz, 1H, H-1’), 8.19 (s, 1H, H-6), 10.09 (br s, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). ¹⁹F NMR: -74.4 (CF3), -131.6 (CH2F).

【0123】

同じ反応を３ｆ（異性体Ｂ、１３３ｍｇ）について実施し、対応する生成物３ｇ（異性体Ｂ、４８ｍｇ、５４％収率）を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO): δ 2.27-2.44 (m, 2H, H-2’), 3.58-3.67 (m, 2H, H-5’), 4.00-4.02 (m, 1H, H-4’), 4.24 (d, J=4.1 Hz, 2H, CH₂NH), 4.57-4.58 (m, 1H, H-3’), 5.24-5.29 (m, 2H, 5’-OH, OCHN₃), 6.07-6.34 (m, 2H, H-1’, CHF₂), 8.19 (s, 1H, H-6), 10.09 (br s, 1H, NH), 11.70 (br s, 1H, NH). ¹⁹F NMR: -74.2 (CF3), -131.4 (CH2F).

【0124】

完全に機能性のヌクレオチド（ｆｆＮ）３ｉを得るための、対応するトリホスフェート３ｈの調製、および核酸塩基への色素のさらなる結合は、ＷＯ２００４／０１８４９７に報告されており、概して、当業者に公知である。
実施例４
３’−ＯＨ保護基の熱安定性試験

【0125】

種々の３’−ＯＨ保護基をそれらの熱安定性に関して調査した（図１Ａ）。熱安定性は、ｐＨ＝９の緩衝液（トリス−ＨＣｌ５０ｍＭ、ＮａＣｌ５０ｍＭ、ｔｗｅｅｎ０．０５％、Ｍｇ_２ＳＯ_４６ｍＭ）中のそれぞれの３’−ＯＨ保護されたヌクレオチド０．１ｍＭを６０℃で加熱することによって評価した。種々の時点を取り、ＨＰＬＣを用いて、ブロックされていない材料の形成を分析した。−ＣＨ_２Ｆおよび−Ｃ（Ｏ）ＮＨＢｕの安定性は、標準的なアジドメチル（−ＣＨ_２Ｎ_３）保護基よりも約２倍大きいことが判った。−ＣＦ_２Ｈ基の安定性は、標準物質よりも約１０倍大きいことが判った（図１Ｂ）。
実施例５
３’−ＯＨ保護基の脱保護

【0126】

いくつかの３’−ＯＨ保護基の脱保護反応速度も試験した。標準的なアジドメチル保護基の脱保護速度を−ＣＨ_２Ｆ置換アジドメチルおよび−Ｃ（Ｏ）ＮＨＢｕ置換アジドメチルと比較した。より熱安定性の高い３’−ＯＨブロッキング基は両方とも、脱保護剤としてのホスフィン（１ｍＭ ＴＨＰ）を用いて、標準的なアジドメチル保護基よりも迅速に除去されることが観察された。図２Ａを参照されたい。例えば、−ＣＨ_２Ｆおよび−Ｃ（Ｏ）ＮＨＢｕの半減期は、２０．４分というアジドメチルの半減期と比較して、それぞれ８．９分および２．９分であった（図２Ｂ）。
実施例６
配列決定試験

【0127】

−ＣＨ_２Ｆ（ｍｏｎｏ−Ｆ）置換アジドメチル３’−ＯＨ保護基を有する修飾されたヌクレオチドを調製し、該ヌクレオチドの配列決定性能をＭｉｓｅｑプラットフォーム上で評価した。３’−ＯＨ保護基の熱安定性の増大は、配列決定化学反応についてより高品質なヌクレオチドをもたらし、夾雑する３’ブロックされていないヌクレオチドはより少ないと予想された。ＳＢＳ配列決定キットにおける３’ブロックされていないヌクレオチドの存在はそれゆえ、前位相化値として数値化される前位相化事象をもたらしたことであろう。

【0128】

短い１２サイクルの配列決定実験を、位相化値および前位相化値を生成するために最初に使用した。ｍｏｎｏ−Ｆ置換アジドメチルで保護したｆｆＮを、以下の濃度、すなわち、ｆｆＡ−色素１（２ｕＭ）、ｆｆＴ−色素２（１０ｕＭ）、ｆｆＣ−色素３（２ｕＭ）およびｆｆＧ−色素４（５ｕＭ）に従って用いた。ｍｏｎｏ−Ｆ置換アジドメチル基は、異性体ＡおよびＢを両方含んでいる。２つの色素、すなわち、標準的なＭｉｓｅｑキットにあるような色素２、および色素５を使用して、ｆｆＴを標識した。表１は、位相化および前位相化への影響に関して評価した、ｍｏｎｏ−Ｆ置換アジドメチルのＡ異性体およびＢ異性体と種々のヌクレオチドとの組み合わせを示す。すべての場合において、前位相化値は、標準的なＶ２ Ｍｉｓｅｑキットのヌクレオチドを使用した対照よりも実質的に低かった（図３）。

【表1】

【0129】

（配列決定品質検査）
２×４００ｂｐの配列決定をＭｉｓｅｑ上で実施して、配列決定の品質改善についてのこれらのヌクレオチドの能力を評価した。配列決定ランを製造元（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社、カリフォルニア州サンディエゴ市）の説明書に従って実施した。標準的な取り込み緩衝液をすべてのｍｏｎｏ−ＦブロックしたＦＦＮ（各々は、個別の色素標識、すなわちｆｆＡ−色素１（２ｕＭ）、ｆｆＴ−色素２（１ｕＭ）、ｆｆＣ−色素３（２ｕＭ）およびｆｆＧ−色素４（５ｕＭ）を有する）を含有する取り込み緩衝液で置換した。使用したＤＮＡライブラリは、Ｂ ｃｅｒｅｕｓゲノムＤＮＡから標準的なＴｒｕＳｅｑＨＴプロトコルに従って作製した。

【0130】

両配列決定実験（ｍｏｎｏ−ＦブロックＡおよびＢ異性体を用いた）において、非常に低い前位相化値を観察した。低い位相化値と結びつけて考えると、これらの新たなヌクレオチドの適用は、優れた２×４００ｂｐ配列決定データを生じ、両方の場合において８０％超の塩基がＱ３０を上回った（異性体ＡのＱスコアについては図４Ａを、異性体ＢのＱスコアチャートについては図４Ｂを参照されたい）。これらの結果は、Ｍｉｓｅｑバージョン２キット（２×２５０ｂｐ、典型的なＲ＆Ｄ配列決定実験においては８０％塩基＞Ｑ３０、または記載したスペックのように７０％塩基＞Ｑ３０）と比較して大きな改善を実証している。以下に示すように、表２は、ＩＭＸにおける全てのｍｏｎｏ−Ｆ ｆｆＮ−Ａ−異性体を用いた場合の配列決定データを要約している。表３は、ＩＭＸにおける全てのｍｏｎｏ−Ｆ ｆｆＮ−Ｂ−異性体を用いた配列決定データを要約している。

【表2】

【表3】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【図4A】

【図4B】