特許 6868611 スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）に富むテトラセルミス チュイイ種の微小藻類のバイオマスを得る方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6868611

(24)【登録日】2021年4月14日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）に富むテトラセルミス チュイイ種の微小藻類のバイオマスを得る方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/12 20060101AFI20210426BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20210426BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20210426BHJP

   A61K 36/05 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 39/06 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210426BHJP

   A61K 38/44 20060101ALI20210426BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/12 A

   C12N1/12 C

   C12N9/02

   A23L33/105

   A61K36/05

   A61P39/06

   A61P43/00 111

   A61K38/44

【請求項の数】14

【全頁数】40

(21)【出願番号】特願2018-509988(P2018-509988)

(86)(22)【出願日】2016年5月5日

(65)【公表番号】特表2018-518194(P2018-518194A)

(43)【公表日】2018年7月12日

(86)【国際出願番号】EP2016060131

(87)【国際公開番号】WO2016177853

(87)【国際公開日】20161110

【審査請求日】2019年2月18日

(31)【優先権主張番号】15382235.8

(32)【優先日】2015年5月6日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】517386745

【氏名又は名称】フィトプランクトン マリノ、ソシエダッド リミターダ

【氏名又は名称原語表記】ＦＩＴＯＰＬＡＮＣＴＯＮ ＭＡＲＩＮＯ，Ｓ．Ｌ．

(74)【代理人】

【識別番号】100094640

【弁理士】

【氏名又は名称】紺野 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100103447

【弁理士】

【氏名又は名称】井波 実

(74)【代理人】

【識別番号】100111730

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 武泰

(74)【代理人】

【識別番号】100180873

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 慶政

(72)【発明者】

【氏名】ウナムンサガ エスコスラ、カルロス

(72)【発明者】

【氏名】マンテコン ガルベス、エルラリア

【審査官】 平林 由利子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２００８／０９９９２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００５−５１７２３９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 C-C CHUNG，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，米国，２００３年 ２月，VOL:69, NR:2，PAGE(S):754 - 759，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1128/AEM.69.2.754-759.2003

【文献】 PERFETO PAULO NELO MEDEIROS，UNIALGAL CULTURE OF TETRASELMIS CHUII BUTCHER，１９９７年 ５月，NR:48，PAGE(S):3 - 14

【文献】 MARIN NELLIS，ACTA CIENTIFICA VENEZOLANA，１９９４年，VOL:45, NR:3，PAGE(S):226 - 230

【文献】 DICKSON D M J，NEW PHYTOLOGIST，１９８７年 ８月，VOL:106, NR:4，PAGE(S):657 - 666，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1111/j.1469-8137.1987.tb00166.x

【文献】 Research Journal of Biological Sciences, 2008, 3(3):311-314

【文献】 Botanical Studies, 2012, 53(1):125-133

【文献】 PAUL J JANKNEGT，EUROPEAN JOURNAL OF PHYCOLOGY，ドイツ，２００９年１１月，VOL:44, NR:4，PAGE(S):525 - 539，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1080/09670260902943273

【文献】 SIGAUD-KUTNER T C S，PHYSIOLOGIA PLANTARUM，デンマーク，２００２年 ４月，VOL:114, NR:4，PAGE(S):566 - 571，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1034/j.1399-3054.2002.1140409.x

【文献】 OSWALDO KEITH OKAMOTO，JOURNAL OF PHYCOLGY，１９９６年，VOL:32，PAGE(S):74 - 79，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1111/j.0022-3646.1996.00074.x

【文献】 RANJITH KUMAR R，JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY，２０１１年 ８月２６日，VOL:51, NR:2，PAGE(S):322 - 328，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1007/s13197-011-0501-2

【文献】 JESUS SIMENTAL-MARTINEZ，BIOTECHNOLOGY PROGRESS，米国，２０１４年 ８月３０日，VOL:30, NR:6，PAGE(S):1326 - 1334，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1002/btpr.1979

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ａ２３Ｌ ３１／００−３３／２９

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／０５

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

非生物的ストレス下でテトラセルミス チュイイ種の微小藻類を培養することを含んでなる、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）に富む前記微小藻類のバイオマスを得るための方法であって、前記非生物的ストレスが、培養培地における少なくとも２００ｍＶの酸化還元電位、および前記培養培地における１μＭ未満の硝酸塩濃度からなる群から選択される、方法。

【請求項2】

非生物的ストレス下でテトラセルミス チュイイ種の微小藻類を培養することを含んでなる、前記微小藻類のバイオマスのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を濃縮する方法であって、前記非生物的ストレスが、培養培地における少なくとも１００ｍＶの酸化還元電位、培養培地における２８℃超の温度、窒素飢餓、および培養培地における３５超の塩分濃度からなる群から選択される、方法。

【請求項3】

前記非生物的ストレスが、前記培養培地における５μＭ未満の硝酸塩濃度での窒素飢餓または前記培養培地における４１超の塩分濃度である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

請求項１に記載の方法によって得られたＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス。

【請求項5】

脱水またはブライン処理された、請求項４に記載のバイオマス。

【請求項6】

請求項４または５に記載のＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスからＳＯＤを精製する方法であって、
（ｉ）Ｔ．チュイイ種の微小藻類の前記バイオマスをホモジナイズしてホモジネートを得る工程と、
（ｉｉ）前記工程（ｉ）で得られた前記ホモジネートをポリエチレングリコール／リン酸塩（ＰＥＧ／Ｐｉ）水性二相分配系により分画することによって、リン酸塩水性画分中のＳＯＤに富むタンパク質抽出物を得る工程と
を含んでなり、
前記ポリエチレングリコール／リン酸塩（ＰＥＧ／Ｐｉ）水性二相分配系が、
１，５００Ｄａの平均分子量のＰＥＧを含む１２％ｗ／ｗのＰＥＧ相、１０％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ相から構成される系、および
３，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧを含む１２％ｗ／ｗのＰＥＧ相、３．５％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ相から構成される系から選択される、方法。

【請求項7】

請求項６に記載の方法によって得られた、ＳＯＤに富むタンパク質抽出物。

【請求項8】

請求項４に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス、または請求項５に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水またはブライン処理されたバイオマス、または請求項７に記載のＳＯＤに富むタンパク質抽出物を含んでなる、食品。

【請求項9】

請求項４に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス、または請求項５に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水またはブライン処理されたバイオマス、または請求項７に記載のＳＯＤに富むタンパク質抽出物を含んでなる、医薬組成物。

【請求項10】

化粧品として使用される、請求項４に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス、または請求項５に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水またはブライン処理されたバイオマス、または請求項７に記載のＳＯＤに富むタンパク質抽出物。

【請求項11】

抗酸化剤として使用される、請求項４に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス、または請求項５に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水またはブライン処理されたバイオマス、または請求項７に記載のＳＯＤに富むタンパク質抽出物。

【請求項12】

酸化ストレスおよび／または炎症活性を特徴とする疾患または状態の予防および／または治療に用いられる、または放射線療法に対する耐性を改善する際に用いられる、請求項４に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス、または請求項５に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水またはブライン処理されたバイオマス、または請求項７に記載のＳＯＤに富むタンパク質抽出物、または請求項９に記載の医薬組成物。

【請求項13】

１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの密度を有し、ＳＯＤを含有する微小藻類のバイオマスに含まれるＳＯＤの安定剤として使用されるブラインであって、前記バイオマスが請求項４に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスである、ブライン。

【請求項14】

１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの密度を有するブラインによってＳＯＤが安定化されてなることを特徴とする、請求項４に記載のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）に富むテトラセルミス チュイイ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｃｈｕｉｉ）種の微小藻類のバイオマス、これを得る方法、当該バイオマスからＳＯＤを精製する方法、ＳＯＤに富むタンパク質抽出物、およびそれらの使用に関する。本発明はさらに、ＳＯＤを含有する微小藻類のバイオマスに含まれるＳＯＤの安定剤としてのマグネシウムに富む特定のブライン溶液の使用と、当該ブラインで安定化させたＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスとに関する。

【背景技術】

【0002】

微生物および動物の酵素は、かつて、許容される品質でかつ経済的、機能的な製品を提供する、産業上の第一の選択肢であった。しかし、微生物や動物由来の製品に関連したメディアの否定的な扱いゆえに、消費者は代替品を求めている。今日の食品および化粧品の化学者は、伝統的な動物由来の酵素を、同じ機能を提供するが天然の「環境に優しい」供給源（例えば、藻類）に由来する他の酵素に置き換えるという難題に直面している。微小藻類の多様性は、新しい多様な酵素および生体触媒を提供することを約束し、工業バイオテクノロジーを経済的かつ持続可能な成功とする可能性を持つ。従来、ごくわずかな酵素だけが海洋植物プランクトンから単離され、特性が明らかにされている。研究によれば、藻類中の独自のハロペルオキシダーゼ（例えば、熱および有機溶媒変性に対して高度の安定性を有するバナジウムブロモペルオキシダーゼ）の存在が実証されている。

【0003】

酵素に対する消費者の意見が肯定的であるため、食品および化粧品における新たな領域の用途（機能性食品、栄養化粧品、皮膚保護における酵素等）を見出す努力がなされている。フリーラジカルを捕捉し、それによって環境汚染、細菌、煙、太陽光、または他の有害な要因によって引き起こされる皮膚の損傷を防止する能力を有する酵素を使用することができる可能性がある。この場合、最も防御能があり有望な酵素はスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ、ＥＣ１．１５．１．１）である。

【0004】

ＳＯＤは、スーパーオキシドの酸素および過酸化水素への不均化を触媒し、酸素に曝露された細胞のほとんどで重要な抗酸化防御機構に寄与する酵素である。ＳＯＤは、皮膚へのフリーラジカルによる損傷を低減するために化粧製品に使用される。この酵素は、現在、酸化ストレスを伴う疾患に対する臨床試験にも出現し、強力な抗炎症活性を示す。ウシ肝臓ＳＯＤは、そのような使用のためにいくつかの欧州諸国で規制当局の認可を受けた。しかし、プリオン病に対する懸念により認可が取り消されたようである。局所に適用した場合にＵＶ誘発性紅斑を低減する能力ゆえに、化粧製品中のフリーラジカルスカベンジャーとしてＳＯＤとペルオキシダーゼの組み合わせを使用することが提案されている。

【0005】

微小藻類からの酵素およびそれらを含有する抽出物の製造および精製ならびにそれらの用途が開示されている。例として、西国特許第２２３４５０Ｔ３号明細書は、酸化防止剤および瘢痕治癒活性を有する微小藻類培養培地から熱安定性抽出物を得る方法を開示している。この方法は、照明、温度、ｐＨ、およびＣＯ_２の適切な条件下で当該微小藻類を培養する第一の工程と、当該培地に酸素過飽和を施す第二の工程とを含む。米国特許第５１７９０１２Ａ号明細書は、微小藻類を密閉した光バイオリアクタで培養し、微小藻類による光合成によって産生された酸素を回収し、それを培養培地に再注入する、微小藻類培地から抗酸化物質が豊富な抽出物を製造する方法を教示している。米国特許出願公開２００９／１３０１３９号明細書は、微小藻類抽出物およびアルギニンフェルレートを含む美容活性成分を開示している。Ｏｋａｍｏｔｏら（Ｏｋａｍｏｔｏ，ＯＫら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｃｏｌｏｇｙ １９９６年、３２：７４〜７９）は、重金属であるカドミウムがテトラセルミス グラシリス（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｇｒａｃｉｌｉｓ）の増殖およびＳＯＤ産生に及ぼす影響を教示している。Ｍａｌｉｇａｎら（Ｍａｌｉｇａｎら、２０１１年１０月；５ｔｈ Ｙｏｕｎｇ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ Ｓｅｍｉｎａｒの議事録）は、テトラセルミス チュイイの抽出物の抗酸化および抗菌活性を記載している。Ｍｉｓｒａ＆Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ（Ｍｉｓｒａ，ＨＰ ａｎｄ Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈ Ｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９７年、２５２：６４２１〜６４２３）は、紅藻であるポルフィリジウム クルエンタム（Ｐｏｒｐｈｙｒｉｄｉｕｍ ｃｒｕｅｎｔｕｍ）からのスーパーオキシドジスムターゼの精製方法を記載している。Ｂｏｌａｎｄら（Ｂｏｌａｎｄ ＭＪら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１年、１９：１９〜３３）は、水性二相系を用いた動物組織からのＳＯＤを含む種々の酵素の精製を記載している。Ｕｌｌｏａら（Ｕｌｌｏａ Ｇら、Ｇｒｅｅｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２年、１４：１０４４〜１０５１）は、微小藻類であるテトラセルミス スエシカ（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｅｃｉｃａ）から抗酸化物質を抽出するための界面活性剤／塩の水性二相分配系を記載している。

【0006】

微小藻類からの酵素および酵素を含有する抽出物の製造および精製は知られているが、従来技術の方法で得られるＳＯＤ活性は一般的に少ない。したがって、酵素、特にＳＯＤ活性の製造および精製を、より多量かつより高い収率で可能にする方法を提供する必要性が存在する。

【発明の概要】

【0007】

種々の培養系および条件の下で微小藻類の種々の種におけるＳＯＤの産生が研究されている。その目的で、屋内培養および屋外培養を含む種々の培養系において、種々の非生物的ストレス条件下で合計１１種の微小藻類株を試験し、これらが異なる菌株のＳＯＤ活性にどのように影響するかを調べた。テトラセルミス チュイイは、試験したすべての非生物的条件において最高のＳＯＤ活性を有することが見出されたが、窒素飢餓下で最高の活性が得られた（実施例１）。

【0008】

さらに、Ｔ．チュイイ無細胞抽出物からのＳＯＤ活性の分画および部分精製のための経済的な抽出戦略として、種々のＰＥＧ−リン酸塩水性二相系が開発された。リン酸塩リッチ相におけるスーパーオキシドジスムターゼ活性の分配挙動に対する系のＰＥＧモル質量、濃度、ｐＨ、およびイオン組成の影響を分析するための詳細な研究を行った。ＰＥＧ１５００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、１０％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉと、ＰＥＧ３０００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、３．５％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉとから構成された２種のポリエチレングリコール／リン酸塩（ＰＥＧ／Ｐｉ）の水性二相系は、天然の微小藻類の総タンパク量に対してＳＯＤの選択率が最も高い系として選択された（実施例２）。これらの条件下で、下のリン酸塩相でのＳＯＤについて、高い回収率（８０％超）で十分な精製（２〜４倍）が達成された。加えて、この系は、クロロフィルおよびポリフェノールのような望ましくない低分子量化合物の除去を可能にする。ＳＯＤ／リン酸塩相は、５０℃および６０℃で高い熱安定性を示す。

【0009】

さらに、インビトロ毒性アッセイでは、Ｔ．チュイイ無細胞抽出物が、Ｈ_２Ｏ_２によって引き起こされる酸化損傷からヒト初代皮膚線維芽細胞を効果的に保護できることを実証した（実施例３）。

【0010】

したがって、第一の態様において、本発明は、非生物的ストレス下で当該微小藻類を培養することを含む、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスを得るための方法であって、当該非生物的ストレスは、培養培地における少なくとも１００ｍＶの酸化還元電位、培養培地における２８℃超の温度、窒素飢餓、および培養培地における３５超の塩分濃度からなる群から選択される、方法に関する。

【0011】

第二の態様において、本発明は、非生物的ストレス下で当該微小藻類を培養することを含む、テトラセルミス チュイイ種の微小藻類のバイオマス中のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を濃縮する方法に関する。

【0012】

別の態様において、本発明は、第一の態様の方法によって得られたＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスまたは第二の態様の方法によって得られたＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスに関する。

【0013】

別の態様において、本発明は、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水またはブライン処理されたバイオマスに関する。

【0014】

別の態様において、本発明は、Ｔ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマスからＳＯＤを精製する方法であって、
（ｉ）Ｔ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマスをホモジナイズしてホモジネートを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたホモジネートをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／リン酸塩水性二相分配系により分画することによって、リン酸塩水性画分中のＳＯＤに富むタンパク質抽出物を得る工程と
を含む方法に関する。

【0015】

別の態様において、本発明は、当該ＳＯＤ精製方法によって得られたＳＯＤに富むタンパク質抽出物に関する。

【0016】

別の態様において、本発明は、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマスを含む食品、またはＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該脱水またはブライン処理されたバイオマス、またはＳＯＤに富む当該タンパク質抽出物に関する。

【0017】

別の態様において、本発明は、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマス、またはＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該脱水またはブライン処理されたバイオマス、またはＳＯＤに富む当該タンパク質抽出物を含む医薬組成物に関する。

【0018】

別の態様において、本発明は、化粧品としての、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマス、またはＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該脱水またはブライン処理されたバイオマス、またはＳＯＤに富む当該タンパク質抽出物、または当該医薬組成物の使用に関する。

【0019】

別の態様において、本発明は、抗酸化剤としての、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマス、またはＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該脱水またはブライン処理されたバイオマス、またはＳＯＤに富む当該タンパク質抽出物、または当該医薬組成物の使用に関する。

【0020】

別の態様において、本発明は、医薬品において使用するための、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマス、またはＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該脱水またはブライン処理されたバイオマス、またはＳＯＤに富む当該タンパク質抽出物、または当該医薬組成物に関する。

【0021】

別の態様において、本発明は、酸化ストレスおよび／または炎症活性を特徴とする疾患または状態の予防および／または治療に使用するための、または放射線療法に対する耐性を改善する際に使用するための、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマス、またはＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の当該脱水またはブライン処理されたバイオマス、またはＳＯＤに富む当該タンパク質抽出物、または当該医薬組成物に関する。

【0022】

別の態様において、本発明は、１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの密度を有するブラインの、ＳＯＤを含有する微小藻類のバイオマスに含まれるＳＯＤの安定剤としての使用に関する。特定の実施形態において、ＳＯＤを含有する微小藻類の当該バイオマスは、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスである。

【0023】

別の態様において、本発明は、１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの密度を有するブラインによってＳＯＤが安定化されることを特徴とする、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスに関する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1】第１表（実施例１）に記載されているように異なる処理の下で試験した種々の菌株のＳＯＤ活性を示す棒グラフである。

【図2】ＡＴＰＳ最適化プロセスのワークフローを示す。

【図3】ＰＥＧ１５００から構成されるＡＴＰＳを用いたＳＯＤ精製（精製倍率）に対する異なる条件（第１表）の影響を示す棒グラフである。

【図4】ＰＥＧ３０００から構成されるＡＴＰＳを用いたＳＯＤ精製（精製倍率）に対する異なる条件（第１表）の影響を示す棒グラフである。

【図5】最初のＰＥＧ／Ｐｉスクリーニング（実施例２）後の選択された条件の最終相分離を示す写真であり、上部のＰＥＧ相、細胞破壊片を含む界面、および下部のＰｉ相が示されている。

【図6】種々のｐＨ／ＮａＣｌスクリーニング条件の精製倍率を示す棒グラフである（ＰＥＧ１５００）。

【図7】種々のｐＨ／ＮａＣｌスクリーニング条件の精製倍率を示す棒グラフである（ＰＥＧ３０００）。

【図8】種々のｐＨ／ＮａＣｌスクリーニング条件の精製倍率を示す棒グラフである（ＰＥＧ６０００（１０））。

【図9】スケールアップした選択条件の精製倍率および収率を示す棒グラフである（ＰＥＧ１５００）。

【図10】スケールアップした選択条件の精製倍率および収率を示す棒グラフである（ＰＥＧ３０００）。

【図11】スケールアップした選択条件の精製倍率および収率を示す棒グラフである（ＰＥＧ６０００（１０））。

【図12】ＰＥＧ１５００のスケールアップ（１０ｇ）ＡＴＰＳを示す写真である。

【図13】ＰＥＧ３０００のスケールアップ（１０ｇ）ＡＴＰＳを示す写真である。

【図14】ＰＥＧ６０００（１０）のスケールアップ（１０ｇ）ＡＴＰＳを示す写真である。

【図15】３つの独立した実験から得られたＰＥＧ１５００およびＰＥＧ３０００の精製度（Ａ）および精製収率（Ｂ）を示す棒グラフである。平均値±標準偏差を第５表に示す（実施例２）。

【図16】ＡＴＰＳスケールアップ実験（１００ｇ）の成果を示す棒グラフである。

【図17】４０℃での熱処理後の粗抽出物の時間の関数としてのＳＯＤ比活性（％）を示すグラフである。

【図18】５０℃での熱処理後の粗抽出物の時間の関数としてのＳＯＤ比活性（％）を示すグラフである。

【図19】５０℃での熱処理後のＰＥＧ１５００ Ｐｉ相の時間の関数としてのＳＯＤ比活性（％）を示すグラフである。

【図20】６０℃での熱処理後のＰＥＧ１５００ Ｐｉ相の時間の関数としての特定のＳＯＤ活性（％）を示すグラフである。

【図21】５０℃での熱処理後のＰＥＧ３０００ Ｐｉ相の時間の関数としてのＳＯＤ比活性（％）を示すグラフである。

【図22】６０℃での熱処理後のＰＥＧ３０００ Ｐｉ相の時間の関数としてのＳＯＤ比活性（％）を示すグラフである。

【図23】（Ａ）１，６００ｘｇで１０分間遠心分離し、（Ｂ）１２時間平衡化させた後、最適化されたＡＴＰＳ条件の相形成を示す写真である。

【図24】最終重量約６５ｇで１２時間平衡化した、最適化されたＰＥＧ１５００のＡＴＰＳ条件の相形成を示す写真である。

【図25】培養したＮＨＤＦ細胞に対してＨ_２Ｏ_２によって引き起こされる細胞毒性に対するＴ．チュイイ無細胞抽出物のインビトロ保護アッセイの結果を示す棒グラフである。細胞生存率は、ルシフェラーゼ単位（ＬＵ）として測定されたＡＴＰ含有量によって推定した（実施例３）。

【発明を実施するための形態】

【0025】

ＳＯＤに富むテトラセルミス チュイイ種の微小藻類のバイオマスを得る方法
一つの態様において、本発明は、以下、「本発明の製造方法」と称される、ＳＯＤに富むテトラセルミス チュイイ種の微小藻類のバイオマスを得るための方法であって、当該微小藻類を非生物的ストレス下で培養することを含み、当該非生物的ストレスは、培養培地における少なくとも１００ｍＶの酸化還元電位、培養培地における２８℃超の温度、窒素飢餓、および培養培地における３５超の塩分濃度からなる群から選択される方法に関する。

【0026】

テトラセルミス チュイイ、またはＴ．チュイイは、クロロデンドロン藻綱クロロデンドロン目クロロデンドロン科に属する海洋単細胞藻類（微小藻類）であり、緑色で運動性があり、通常長さ１０μｍ×幅１４μｍに成長する。

【0027】

本発明の製造方法によれば、微小藻類のＴ．チュイイは非生物的ストレス下で培養される。非生物的ストレスを適用する前に、Ｔ．チュイイの培養は、当業者に周知であるように、例えばＦ／２培養培地［Ｇｕｉｌａｒｄ Ｒ．Ｒ．Ｌ．＆Ｒｙｔｈｅｒ、Ｊ．Ｈ、１９６２年、「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ ｄｉａｔｏｍｓ．Ｉ．Ｃｙｃｌｏｔｅｌａ ｎａｎａ Ｈｕｓｔｅｄｔ ａｎｄ Ｄｅｔｏｎｕｌａ ｃｏｎｆｅｒｖａｃｅａｅ （Ｃｌｅｖｅ） Ｇｒａｎ．」Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８、２２９〜２３９］等の適切な培地で、太陽光または適切な照明条件（光度）および制御されたｐＨ、温度、および供給二酸化炭素（ＣＯ_２）の条件下で行う。Ｆ／２培養培地は、水性培地中に窒素源、リン源、微量の元素、例えば、ナトリウム、鉄、銅、亜鉛、コバルト、マンガン、およびモリブデン、ならびにビタミン混合物、例えば、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、チアミン（ビタミンＢ１）、およびビオチンを含む。

【0028】

光度は光合成が可能であるように調整されるため、光度は広い範囲内で変化することができるが、特定の実施形態において、培養培地に適用される光度は、６０〜２０００μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１であり、屋内では典型的には約１５０μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１である。ｐＨは、通常約７〜約８．５で変化し得、典型的には約７．５である。Ｔ．チュイイの増殖を促進する温度は、通常約１７℃〜約２８℃、典型的には約２４℃〜２６℃の間で選択される。培養は通気を伴ってまたは伴わずに、典型的には、大気中で約０．５〜５％、好ましくは約１〜２％ＣＯ_２の通気を用いて行われる。

【0029】

培養培地の細胞密度が至適であるとき、通常は対数増殖期、すなわち指数増殖期、すなわち培養開始後約２〜７日目の間に、非生物的ストレスが培養培地に適用される。そのために、増殖速度は、従来の技術、例えば、顕微鏡での細胞計数によってモニタすることができる。

【0030】

本明細書で使用される場合、語句「非生物的ストレス」は、特定の環境における生物に対する非生物因子の負の影響に関する。非生物変量は、その正常な変動範囲を超えてその環境に影響を与え、生物の個体群のパフォーマンスまたは個々の生理機能に相当の悪影響を及ぼさなければならない。

【0031】

微小藻類、例えばＴ．チュイイの増殖ならびにその化合物および代謝産物の産生に影響を及ぼし得る多くの非生物的ストレス因子が存在するが、本発明の製造方法では、非生物的ストレスは、培養培地における少なくとも１００ｍＶの酸化還元電位、培養培地における２８℃超の温度、窒素飢餓、および培養培地における３５超の塩分濃度からなる群から選択される。

【0032】

本発明によれば、培養培地における少なくとも１００ｍＶの酸化還元電位に基づく非生物的ストレスは、少なくとも１００ｍＶ、少なくとも２００ｍＶ、少なくとも３００ｍＶ、少なくとも４００ｍＶ、少なくとも５００ｍＶ、少なくとも６００ｍＶ、少なくとも７００ｍＶ、少なくとも８００ｍＶ、少なくとも９００ｍＶ、少なくとも１０００ｍＶの酸化還元電位で培養培地を維持することを含み、当該非生物的ストレスは、例えば空気をＵＶと反応させることによってオゾン発生器を使用して通常生成されるオゾンの添加によって等、培養培地中で高い酸化還元電位状態を得るための従来の方法によって得ることができる。添加されるオゾンの量は、酸化還元電位が少なくとも１００ｍＶ、少なくとも２００ｍＶ、少なくとも３００ｍＶ、少なくとも４００ｍＶ、少なくとも５００ｍＶ、少なくとも６００ｍＶ、少なくとも７００ｍＶ、少なくとも８００ｍＶ、少なくとも９００ｍＶ、少なくとも１０００ｍＶである培養培地を得て維持するために必要な量である。

【0033】

本発明によれば、２８℃超の温度に基づく非生物的ストレスは、培養培地を少なくとも２８℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃の温度で維持することを含み、培養培地の当該温度は、従来の方法によって得ることができる。培養は屋内または屋外で行うことができるので、屋内培養では培養室の温度を２８℃超に設定しなければならないのに対し、屋外培養では、培養を適切な場所で行うべきであり、その場合、当該温度は、環境温度により自然に、例えば、南スペイン、例えば、カディス、マラガ、セビリアにおいて春および夏の間に得られる。

【0034】

本発明によれば、培養培地における３５超の塩分濃度に基づく非生物的ストレスは、培養培地を少なくとも３５ＰＳＵ（実用塩分単位）、少なくとも４０ＰＳＵ、少なくとも４１ＰＳＵ、少なくとも４５ＰＳＵ、少なくとも５０ＰＳＵ、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００の塩分濃度で維持することを含む。特定の実施形態において、培養培地の塩分濃度は４１ＰＳＵよりも高い。当業者は、標準的な技術を用いて培養培地の塩分濃度を求める方法を知っている（ＵＮＥＳＣＯ、１９８１、「Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｐａｐｅｒｓ ａｎｄ ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ ｄａｔａ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｓａｌｉｎｉｔｙ ｓｃａｌｅ １９７８」、Ｕｎｅｓｃｏ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｐａｐｅｒｓ ｉｎ ｍａｒｉｎｅ ｓｃｉｅｎｃｅ、３７）。高塩分濃度条件に基づく非生物的ストレスは、例えば、目標の塩分濃度に達するまで自然海水を蒸発させるか、または市販の海塩を添加することによって、当該塩分濃度条件に達するまで当該培養培地に塩を添加することによって容易に得ることができる。

【0035】

本発明によれば、窒素飢餓に基づく非生物的ストレスは、窒素欠乏、制限、または不足の条件下でＴ．チュイイを増殖させることを含み、当該非生物的ストレスは、培養培地への窒素の供給を停止することにより（すなわち、培養培地に窒素を添加することをやめることによって）容易に達成することができる。

【0036】

本発明の製造方法の好ましい実施形態において、非生物的ストレスは窒素飢餓を含む。本明細書で使用する場合、「窒素飢餓」という用語は、窒素の供給が、培養培地中の硝酸塩濃度が２００μＭ未満、１００μＭ未満、１０μＭ未満、５μＭ未満、１μＭ未満、０．１μＭ未満、０．００１μＭ未満になるような条件、または窒素の供給が、培養培地中の窒素濃度が１０μｇ／ｍｌ未満、５μｇ／ｍｌ未満、３μｇ／ｍｌ未満、１μｇ／ｍｌ未満、０．１μｇ／ｍｌ未満、０．０８μｇ／ｍｌ未満、０．０５μｇ／ｍｌ未満、０．００１μｇ／ｍｌ未満になるような条件を意味する。特定の実施形態において、窒素飢餓は、培養培地中の硝酸塩濃度が５μＭ未満であることを意味する。別の特定の実施形態において、窒素飢餓は、培養培地中の窒素濃度が１０μｇ／ｍｌ未満であることを意味する。別の特定の実施形態において、唯一の窒素源が硝酸塩である場合、窒素飢餓とは、２００μＭ未満、１００μＭ未満、１０μＭ未満、５μＭ未満、１μＭ未満、０．１μＭ未満、または０．００１μＭ未満、好ましくは５μＭ未満の培養培地中の硝酸塩濃度を意味する。

【0037】

Ｔ．チュイイの培養は、連続様式、半連続様式、バッチ様式、または流加様式で行うことができる。特定の実施形態において、Ｔ．チュイイの培養は、栄養制限を防止するために、流加様式で行われる。

【0038】

Ｔ．チュイイの培養は屋内または屋外で行うことができる。屋外培養は、開放系または閉鎖系で行うことができる。

【0039】

開放系としては、太陽光への適切な曝露を確実にするために、深さ約２０〜３５ｃｍのレースウェイポンドが挙げられる。パドルホイールは、水中に浮遊している微小藻類に原動力を与え、維持する。ポンドには水および栄養が供給される。

【0040】

閉鎖系としては、水平管型太陽光レシーバを通すように培養培地を駆動するポンプから通常なる管型光バイオリアクタ（ＰＢＲ）が挙げられる。ＰＢＲは、制御された環境を与え、微小藻類の高い生産性を可能にする。閉鎖系であるため、微小藻類のすべての増殖要件が系に導入され、要件に応じて制御される。ＰＢＲは、二酸化炭素の供給、水の供給、最適な温度、光に対する効率的な曝露、培養密度、ｐＨレベル、ガス供給速度、混合方式等の培養環境のより良い制御を促す。

【0041】

本発明の製造方法によれば、Ｔ．チュイイが非生物的ストレス下で培養されると、ＳＯＤに富む微小藻類Ｔ．チュイイのバイオマスが産生される。

【0042】

本明細書で使用する場合、「バイオマス」という用語は、生きている生物または最近生きていた生物を含む生物学的物質を含む。拡大解釈すれば、この用語には、生物を構成する生物学的物質または有機物だけでなく、自然発生的または自然発生的ではない（すなわち、誘発された）生物学的プロセスで生成された生物学的物質または有機物も含まれる。

【0043】

「ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス」という表現は、参照であるＴ．チュイイのバイオマスに対応するＳＯＤ活性よりも高いＳＯＤ活性を有するＴ．チュイイのバイオマスを指す。Ｔ．チュイイは標準的条件下で培養したときにＳＯＤを産生するので、「参照であるＴ．チュイイのバイオマス」は、Ｔ．チュイイを標準的条件下、すなわち１５０μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１、２４℃〜２６℃の温度、ｐＨ７．５、および１〜２％のＣＯ_２に富む大気を用いてＦ／２培養培地中でＴ．チュイイを培養することによって得られるバイオマスである。これらの条件下では、Ｔ．チュイイの培養により、実施例１に記載のように、２１６ｍＭ Ｐｉ、ｐＨ７．８、２５℃でキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼを用いて、結合系におけるシトクロムｃの還元速度の阻害を追跡することにより測定される場合、約１８０ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示すバイオマスが提供される。したがって、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスは、通常、ＳＯＤ活性が上記方法に従ってアッセイされる場合、１８０ＩＵ／ｍｇ以上の可溶性タンパク質、通常は２００ＩＵ／ｍｇ以上の可溶性タンパク質、典型的には２５０ＩＵ／ｍｇ以上の可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。一実施形態において、ＳＯＤ活性が、上記で定義した参照のバイオマスにおけるＳＯＤ活性に対して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも６００％、少なくとも７００％、少なくとも８００％、少なくとも９００％、少なくとも１０００％、またはそれ以上である場合、Ｔ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスはＳＯＤに富む。

【0044】

Ｔ．チュイイが本発明の製造方法に従って非生物的ストレス条件下で培養されると、得られたＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスが培地から回収され、安定化される。そのようにして製造されたＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、例えば濾過または遠心分離等の当業者に公知の従来の方法によって回収することができる。次に、回収されたバイオマスは、非生物学的物質（例えば、無機塩沈殿物等）を除去するために洗浄することが好ましく、かつ有利である。続いて、バイオマスは、脱水により、または当該バイオマスをマグネシウムに富むブライン溶液に添加することによって安定化される。「脱水」という用語は、バイオマスの水の部分的および／または完全な除去を指す。例えば、バイオマスから除去される水の量は、バイオマスに元々含まれる水の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９９％、または１００％であってよい。バイオマスの脱水は、任意の適切な方法、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥によって行うことができる。

【0045】

特定の実施形態において、脱水は凍結乾燥によって行われる。本明細書で使用される場合、「凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇまたはｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｉｏｎ）」という用語は、昇華技術および真空下での水蒸気の除去による水の除去、すなわち、凍結した水の固体状態から蒸気状態への直接の変化およびその後の蒸気の除去を指す。

【0046】

別の特定の実施形態において、脱水は噴霧乾燥によって行われる。「噴霧乾燥」という用語は、液体混合物を小さな液滴へと分解し（霧化）、液滴からの溶媒の蒸発のために強力な推進力がある容器（噴霧乾燥装置）中の混合物から溶媒を迅速に除去することを含む脱水方法を指す。バイオマスの噴霧乾燥は、例えば、ＢＵＣＨＩ社のミニスプレードライヤーＢ−２９０を使用し、４０％速度のポンプを用い、１３０℃の入口温度設定、６０℃未満の出口温度、および１００％速度設定のアスピレータにて、１０％乾燥重量の生成物溶液を噴射して行うことできる。

【0047】

特定の実施形態において、バイオマスは、当該バイオマスをマグネシウムに富むブライン溶液に添加することによって安定化される。当該マグネシウムに富むブライン溶液は、１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの間の密度を有する。したがって、その詳細は以下で記載される当該マグネシウムに富むブライン溶液は、ＳＯＤを含有する微小藻類のバイオマスに含まれるＳＯＤの安定剤として使用できる。

【0048】

微小藻類バイオマスが安定化されると、バイオマスのＳＯＤ活性を測定することができる。特定の実施形態において、ＳＯＤ活性の決定のためのさまざまな方法およびキットを採用できるが、バイオマスのＳＯＤ活性は、実施例１に記載のように、２１６ｍＭ Ｐｉ、ｐＨ７．８、２５℃にてキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼを用いて、結合系におけるシトクロムｃの還元速度の阻害を追跡することによって測定される。

【0049】

本発明の製造方法によれば、使用する非生物的ストレスに応じて、実施例１に記載のように、２１６ｍＭ Ｐｉ、ｐＨ７．８、２５℃でキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼを用いて、結合系におけるシトクロムｃの還元速度の阻害を追跡することにより測定される場合、１８０ＩＵ／ｍｇ超の可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示すＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスが得られ、したがって、図１に示すように、平均して、
− Ｔ．チュイイを窒素飢餓条件下で培養すると、約７００〜約７３０ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示すＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスが得られ、
− Ｔ．チュイイを高温条件下で培養すると、約４８７．５０〜５１２．５ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示すＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスが得られ、
− Ｔ．チュイイを高塩分濃度条件下で培養すると、約３９１．１０〜４２８．９ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示すＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスが得られ、
− Ｔ．チュイイを高酸化還元電位条件下で培養すると、約４５４．７〜４６５．３ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示すＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスが得られる。

【0050】

Ｔ．チュイイのバイオマスのＳＯＤ濃縮方法
別の態様において、本発明は、非生物的ストレス下でテトラセルミス チュイイ種の微小藻類を培養することを含む、以下「本発明の濃縮方法」と称する、当該微小藻類のバイオマスのスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）を濃縮する方法に関する。

【0051】

「Ｔ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス」および「ＳＯＤ」という用語ならびに非生物的ストレス適用前のＴ．チュイイの培養条件は、本発明の製造方法との関連で既に定義されている。

【0052】

「非生物的ストレス」という用語は、特定の環境における生物に対する非生物因子の負の影響に関する。非生物変量は、その正常な変動範囲を超えてその環境に影響を与え、生物の個体群のパフォーマンスまたは個々の生理機能に相当の悪影響を及ぼさなければならない。特定の実施形態において、非生物的ストレスは、高酸化還元電位、高温、高塩分濃度、および窒素飢餓からなる群から選択される。

【0053】

本発明によれば、高酸化還元電位に基づく非生物的ストレスは、少なくとも１００ｍＶ、少なくとも２００ｍＶ、少なくとも３００ｍＶ、少なくとも４００ｍＶ、少なくとも５００ｍＶ、少なくとも６００ｍＶ、少なくとも７００ｍＶ、少なくとも８００ｍＶ、少なくとも９００ｍＶ、少なくとも１０００ｍＶの酸化還元電位で培養培地を維持することを含む。当該非生物的ストレスを得るための方法は、既に定義されている。

【0054】

高温に基づく非生物的ストレスは、少なくとも２８℃、少なくとも３０℃、少なくとも３５℃、少なくとも４０℃、少なくとも４５℃、少なくとも５０℃の温度で培養培地を維持することを含む。当該高温を得るための方法は、既に定義されている。

【0055】

本発明によれば、高塩分濃度に基づく非生物的ストレスは、培養培地を少なくとも３５ＰＳＵ（実用塩分単位）、少なくとも４１ＰＳＵ、少なくとも４０ＰＳＵ、少なくとも４５ＰＳＵ、少なくとも５０ＰＳＵ、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００の塩分濃度で維持することを含む。特定の実施形態において、培養培地の塩分濃度は４１ＰＳＵよりも高い。当該高塩分濃度を得るための方法は、既に定義されている。

【0056】

窒素飢餓に基づく非生物的ストレスは、本発明の製造方法に関連して既に定義されている。

【0057】

ＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマス
別の態様において、本発明は、本発明の製造方法によって得られた、または本発明の濃縮方法によるＳＯＤに富む、以下「本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマス」と称する、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスに関する。

【0058】

上述のように、実施例１に記載のように、２１６ｍＭ Ｐｉ、ｐＨ７．８、２５℃でキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼを用いて、結合系におけるシトクロムｃの還元速度の阻害を追跡することにより測定される場合、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、約１８０ＩＵ／ｍｇ超の可溶性タンパク質、通常、２００ＩＵ／ｍｇ以上の可溶性タンパク質、典型的には２５０ＩＵ／ｍｇ以上、通常３００ＩＵ／ｍｇ以上、好ましくは３５０ＩＵ／ｍｇ以上、より好ましくは４００ＩＵ／ｍｇ以上、さらにより好ましくは４５０ＩＵ／ｍｇ以上、いっそうさらにより好ましくは５００ＩＵ／ｍｇ以上、例えば、５５０ＩＵ／ｍｇ以上、６００ＩＵ／ｍｇ以上、６５０ＩＵ／ｍｇ以上、７００ＩＵ／ｍｇ以上の可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。

【0059】

特定の実施形態において、本発明の製造方法によって得られたＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、Ｔ．チュイイを窒素飢餓条件下、好ましくは培養培地中の硝酸塩濃度が５μＭ未満の条件下で培養することによって得られる。さらなる特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、窒素飢餓条件下、好ましくは培養培地中の硝酸塩濃度が５μＭ未満でＴ．チュイイを培養することによって得られ、約７００〜約７３０ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。

【0060】

別の特定の実施形態において、本発明の製造方法によって得られるＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、２８℃超の温度条件下でＴ．チュイイを培養することによって得られる。さらなる特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、２８℃超の温度条件下でＴ．チュイイを培養することによって得られ、約４８７．５０〜５００．５ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。

【0061】

別の特定の実施形態において、本発明の製造方法によって得られるＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、Ｔ．チュイイを培養培地において３５超の塩分濃度条件下で培養することによって得られる。さらなる特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、Ｔ．チュイイを培養培地において３５超の塩分濃度条件下で培養することによって得られ、約３９１．１０〜４２８．９ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。

【0062】

別の特定の実施形態において、本発明の製造方法によって得られるＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、少なくとも１００ｍＶの酸化還元電位条件下でＴ．チュイイを培養することによって得られる。さらなる特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、少なくとも１００ｍＶの酸化還元電位条件下でＴ．チュイイを培養することによって得られ、約４１７〜４６０ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。

【0063】

特定の実施形態において、本発明の濃縮方法によるＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、Ｔ．チュイイを窒素飢餓条件下、好ましくは培養培地において５μＭ未満の硝酸塩濃度で培養することによって得られる。さらなる特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、窒素飢餓条件下、好ましくは培養培地中の硝酸塩濃度が５μＭ未満でＴ．チュイイを培養することによって得られ、約７００〜約７３０ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。

【0064】

別の特定の実施形態において、本発明の濃縮方法によるＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、高温条件下でＴ．チュイイを培養することによって得られる。さらなる特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、Ｔ．チュイイを高温条件下で培養することによって得られ、約４８７．５０〜約５００．５ＩＵ／ｍｇに含まれる可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。

【0065】

別の特定の実施形態において、本発明の濃縮方法によるＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、高塩分濃度条件下でＴ．チュイイを培養することによって得られる。さらなる特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、Ｔ．チュイイを高塩分濃度条件下で培養することによって得られ、約３９１．１０〜４２８．９／ｍｇの可溶性タンパク質に含まれるＳＯＤ活性を示す。

【0066】

別の特定の実施形態において、本発明の濃縮方法によるＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、高酸化還元電位条件下でＴ．チュイイを培養することによって得られる。さらなる特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、高酸化還元電位条件下でＴ．チュイイを培養することによって得られ、約４１７〜４６０ＩＵ／ｍｇに含まれる可溶性タンパク質のＳＯＤ活性を示す。

【0067】

本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、Ｈ_２Ｏ_２によって誘発される酸化損傷に対して保護効果を発揮する。したがって、美容活性成分として化粧品産業において、または薬学的活性成分として医薬品産業において、抗酸化剤として、抗炎症剤等として使用することができ、さらに、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、当該バイオマスを含む食品の製造に使用することができる。

【0068】

本発明によるＳＯＤに富むＴ．チュイイの安定化されたバイオマス
上述のように、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス、すなわち、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、凍結乾燥により、または当該バイオマスをマグネシウムに富むブライン溶液に添加することによって安定化できる。

【0069】

したがって、別の態様において、本発明は、以下、「本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイの安定化されたバイオマス」と称される、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水またはブライン処理されたバイオマスに関する。

【0070】

本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスの詳細は、既に述べられており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0071】

特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、凍結乾燥によって安定化される。凍結乾燥プロセスは、マニホールド型またはトレー型のいずれかの凍結乾燥機で行うことができる。これらの凍結乾燥機は、周囲圧力よりも低い値へ減圧するための真空ポンプと、−３５〜−８０℃の温度に冷却された凝縮器とを有する。バイオマスは凍結され、凍結乾燥プロセスは−３５℃で開始される。水がすべてバイオマスから除去されるまで、数日間、温度を２０〜３０℃までゆっくりと上昇させる。

【0072】

別の特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスは、当該バイオマスをマグネシウムに富むブライン溶液に添加することによって安定化される。特定の実施形態において、当該マグネシウムに富むブライン溶液は、１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの間の密度を有する。

【0073】

本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイの安定化されたバイオマスは、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスに関連して上述したものと同じ用途で使用することができる。

【0074】

ＳＯＤの精製方法
Ｔ．チュイイバイオマスからのＳＯＤ活性の分画および部分精製のための抽出戦略、すなわち、ポリエチレングリコール／リン酸塩（ＰＥＧ／Ｐｉ）水性二相系（ＡＴＰＳ）に基づく系が発明者らによって開発された。ＡＴＰＳ系は、ＳＯＤ活性を含むリン酸塩画分が、ＳＯＤ調製において望ましくない顔料（クロロフィル）およびポリフェノールのような低分子量化合物を事実上欠いているという利点を有する。

【0075】

このように、別の態様において、本発明は、本発明の製造方法によって得られた、または本発明の濃縮方法によるＳＯＤに富む、以下「本発明のＳＯＤ精製方法」と称する、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスからＳＯＤを精製する方法に関し、当該方法は、
（ｉ）Ｔ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマスをホモジナイズしてホモジネートを得る工程と、
（ｉｉ）工程（ｉ）で得られたホモジネートをポリエチレングリコール／リン酸塩水性二相分配系により分画することによって、リン酸塩水性画分中のＳＯＤに富むタンパク質抽出物を得る工程と
を含む。

【0076】

本発明のＳＯＤ精製方法の文脈内で使用される場合、Ｔ．チュイイ種の微小藻類の当該バイオマスは、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス（すなわち、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマス）、およびＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水またはブライン処理されたバイオマス（すなわち、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイの安定化されたバイオマス）からなる群から選択される。

【0077】

本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスの詳細および本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイの安定化されたバイオマスの詳細は、既に述べられており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0078】

本発明のＳＯＤ精製方法の工程（ｉ）によると、Ｔ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスをホモジナイズすることによって、ホモジネートを得る。Ｔ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスのホモジナイズは、従来の方法、例えば、超音波処理、高圧ホモジナイズ、ビーズ粉砕、または一般に細胞を機械的に溶解する任意の方法によって行うことができる。特定の実施形態において、Ｔ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスのホモジナイズは、抽出緩衝液を当該バイオマスに添加し、微小藻類細胞を溶解することによって実施される。さまざまな抽出緩衝液が使用可能であるが、特定の実施形態において、当該抽出緩衝液は７．８のｐＨを有し、２２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４を含む。微小藻類細胞は、従来の方法、例えば、超音波によって溶解することができ、特定の実施形態において、１０秒間隔で２分間（各３０秒ずつ４サイクル、２０％増幅）超音波を適用することにより細胞を溶解する。次いで、バイオマスを除去し、上清を回収する。バイオマスの除去は、従来の方法、例えば、遠心分離によって行うことができ、特定の実施形態において、バイオマスを室温で１０分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を回収する。

【0079】

本発明のＳＤＯ精製方法の工程（ｉｉ）によれば、工程（ｉ）で得たホモジネートは、時に「ＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳ」と呼ぶポリエチレングリコール／リン酸塩（ＰＥＧ／Ｐｉ）水性二相分配系によって分画され、これにより、リン酸塩水性画分中のＳＯＤに富むタンパク質抽出物を得る。

【0080】

ＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳは、５０％（ｗ／ｗ）ＰＥＧ原液および４０％（ｗ／ｗ）のリン酸カリウム原液、ｐＨ ７．０から調製することができる。

【0081】

ＰＥＧ原液は、計算された量のＰＥＧを脱イオン水に溶解することによって調製することができる。本明細書において、「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」という用語は、２個の炭素原子によって連結されたエーテル基、場合により分岐鎖アルキレン基を含有する水溶性の任意の親水性ポリマーであると理解される。ＰＥＧの構造は次の通りである（括弧内は繰り返し単位である）。
ＨＯ−（ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ−Ｈ
式中、「ｎ」はＥＯモノマーまたは単位の数である。

【0082】

したがって、この定義には、分岐鎖または非分岐鎖のポリエチレングリコール、ならびに当該タイプの単位を含むブロックまたはランダムコポリマーが含まれる。この用語はまた、アルコキシ基、アクリレート基、メタクリレート基、アルキル基、アミノ基、ホスフェート基、イソチオシアネート基、スルフヒドリル基、メルカプト基、およびサルフェート基を導入するように（一端または両端が）修飾されていてもよい末端ヒドロキシル基の誘導体を含む。ポリエチレングリコールはアルキレン基に置換基を有することができる。それらが存在する場合、これらの置換基は好ましくはアルキル基である。

【0083】

本発明のＳＯＤ精製方法において使用されるＰＥＧの平均分子量は、広い範囲で変化してもよい。それにもかかわらず、特定の実施形態において、ＰＥＧは、１５００〜６０００Ｄａ、好ましくは１５００〜３０００Ｄａの平均分子量を有する。好ましい実施形態において、ＰＥＧは３０００Ｄａの平均分子量を有する。

【0084】

リン酸カリウム溶液は、計算された量の無水一塩基性リン酸カリウムおよび無水二塩基性リン酸カリウムを脱イオン水に溶解し、必要に応じて、ＮａＯＨ等の塩基またはＨＣｌ等の酸を使用してｐＨを７．０に調整することにより、７：１８の一塩基性：二塩基性の割合で調製することができる。

【0085】

二相分配系における特定のタンパク質の分布は、サイズ、表面電荷、疎水性等のその独自の物理化学的性質に依存し、例えば、二相分配系の成分の詳細、イオン強度、ｐＨ等のタンパク質の分布に影響を及ぼす因子の慎重な調整によって適切に最適化された場合、抽出の初期段階で一般的に使用される遠心分離および限外濾過の欠点の多くを回避することができ、したがって部分的に精製され濃縮された最終生成物が得られる。

【0086】

一つの実施形態において、工程（ｉ）で得たホモジネートがＡＴＰＳを用いて抽出されると、リン酸塩水性画分中のＳＯＤに富むタンパク質抽出物を含有する相を、ＰＥＧを含有する相から分離しなければならない。一実施形態において、遠心分離を用いて相を分離する。別の実施形態において、２つの相（ＰＥＧおよびＰｉ）ならびにそれらの間の界面は、遠心分離なしで形成される。これは大規模な精製を容易にし、プロセスのコストを下げる。

【0087】

したがって、ＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳのパラメータ、例えば、ＰＥＧのＰＥＧ平均分子量、濃度、ＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳ中の塩組成およびｐＨ濃度が、タンパク質分布（Ｋｐ、分配係数）、すなわち、Ｐｉ相におけるＳＯＤ活性の分配挙動および全収率に大きな影響を有することを考慮して要因実験を設計し、いくつかの異なる条件をスクリーニングした（実施例２）。工程（ｉ）で得られたＴ．チュイイホモジネートに添加して、二相系（ＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳ）を生成させた後、Ｐｉ相におけるＳＯＤ活性について、はっきりと分離されたＰＥＧおよびＰｉ相の形成をもたらす条件を分析した。Ｐｉ相におけるＳＯＤの精製倍率に関する最良の条件は、さらなる改良のために選択された。

【0088】

したがって、最初に、異なる平均分子量のＰＥＧおよび異なるＰＥＧ／Ｐｉ相比を含むさまざまなＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳを試験した。この目的のために、異なる二相系（ＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳ）を生成するための工程（ｉ）で得られたＴ．チュイイホモジネートの存在下で、異なる平均分子量（１５００、３０００、および６０００Ｄａ）を有するＰＥＧならびに１１％〜２０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧおよびＰｉの範囲を試験し、Ｐｉ相をＳＯＤ活性について分析した。続いて、Ｐｉ相におけるＳＯＤ活性の精製倍率に関する最良の条件を選択し、異なるｐＨ値（６．５、７、７．５、８、および８．５）および異なるＮａＣｌの濃度（０％ｗ／ｗ、３．５％ｗ／ｗ、７％ｗ／ｗ、および１０％ｗ／ｗ）を用いて追加のＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳを生成することによってさらなる試験を行った。工程（ｉ）で得たＴ．チュイイホモジネートの添加後、ＳＯＤ活性をＰｉ相で測定した。すべての場合において、異なるＰＥＧ／Ｐｉ ＡＴＰＳは、好ましくは２２℃〜２５℃の温度で穏やかに成分を混合することによって調製した。必要であれば完全な相分離を達成するために低速遠心分離を行ってもよい。

【0089】

実施例２に示されるように、
ＰＥＧ１５００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、１０％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉと、
ＰＥＧ３０００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、３．５％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉと
から構成された２種のＰＥＧ／Ｐｉの水性二相系は、天然の微小藻類の総タンパク量に対してＳＯＤの選択率が最も高い系として選択された。これらの条件下で、下のリン酸塩（Ｐｉ）相でのＳＯＤ活性について、高い回収率（８０％超）で十分な精製（２〜４倍）が達成された。加えて、これらの系は、クロロフィルおよびポリフェノールのような望ましくない低分子量化合物の除去を可能にする。ＳＯＤ／リン酸塩相は、５０℃および６０℃で高い熱安定性を示す。

【0090】

相互汚染を避けるために、上部（ＰＥＧ）および下部（Ｐｉ）の相を注意深くピペット操作することによって、異なる相（ＰＥＧおよびＰｉ）を分離することができる。

【0091】

したがって、特定の実施形態において、ＰＥＧ／Ｐｉ水性二相系のＰＥＧ相は、約１，５００Ｄａ〜約３，０００Ｄａ、好ましくは約３，０００Ｄａの平均分子量のＰＥＧを含む。

【0092】

別の特定の実施形態において、ＰＥＧ／Ｐｉ水性二相系のＰｉ相は、１０％ＮａＣｌ（ｗ／ｗ）を含有するＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７）を含む。

【0093】

本発明のＳＯＤ精製方法によると、リン酸塩水性画分中のＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスからＳＯＤに富むタンパク質抽出物が得られる。

【0094】

本発明の精製方法に従って得た、以下で「本発明のＳＯＤに富むタンパク質抽出物」と称する、Ｔ．チュイイ種の微小藻類のバイオマス由来のＳＯＤに富む当該タンパク質抽出物は、本発明のさらなる発明の態様を構成する。

【0095】

本発明のＳＯＤに富むタンパク質抽出物中のＳＯＤ活性は、広範囲に変化し得る。それにもかかわらず、特定の実施形態において、本発明のＳＯＤに富むタンパク質抽出物中のＳＯＤ活性は、５０％以上、通常６０％以上、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは９０％以上である。

【0096】

本発明のＳＯＤに富むタンパク質抽出物においてＳＯＤ活性が存在するため、当該タンパク質抽出物は、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスに関連して既に述べたものと同じ用途で使用することができる。

【0097】

ＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマス、ＳＯＤに富むＴ．チュイイの微小藻類のブライン処理されたバイオマス、およびＳＯＤに富むタンパク質抽出物の使用
本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマスにＳＯＤ活性が存在するため、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイの当該バイオマスは、抗酸化活性および／または抗炎症活性を示し、栄養活性成分、美容活性成分、または薬学的活性成分としての食品、化粧品、および／または製薬産業において使用することができる。同様に、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイの安定化されたバイオマス（すなわち、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類の脱水されたバイオマスおよびＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のブライン処理されたバイオマス）および本発明のＳＯＤに富むタンパク質抽出物は、抗酸化活性および／または抗炎症活性を示し、食品のサプリメントとして、または美容活性成分として、または薬学的活性成分として、食品、化粧品、および／または製薬産業において使用することができる。

【0098】

簡略さを期して、「本発明の活性生成物」という一般的な用語は、別途明記されない限り、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイのバイオマス、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイの安定化されたバイオマス、および本発明のＳＯＤに富むタンパク質抽出物を指す。

【0099】

したがって、一態様において、本発明は、食品のサプリメントとしての本発明の活性生成物の使用に関する。

【0100】

したがって、別の態様において、本発明は、本発明の活性生成物を含む食品に関する。本明細書で使用する場合、「食品」という用語は、任意の性質、すなわち固体または液体の、天然または加工済みの任意の物質または生成物を指し、当該物質または生成物は、通常、または理想的には、その特性、用途、構成要素、調製、および保存状態ゆえに、ａ）ヒトまたは動物のための通常の栄養として、またはおやつ（ｐｌｅａｓｕｒａｂｌｅ ｆｏｏｄ）として、またはｂ）ヒトまたは動物用食品の特別な場合におけるダイエット用製品としての目的のいくつかのために使用できる。したがって、この定義は、別々にまたは都合よく互いに混合されて、ヒトまたは動物の食餌に適している、任意の起源の天然材料および完成品のすべてを広く包含する。インスタント食品は、例えば消費に適した水溶液によって希釈する必要がないものである。原則として、インスタント食品中に存在する成分はバランスがとれており、当業者によって考慮されるように、食べられるようにするために食品に追加の成分を加える必要はない。濃縮された食品は、１つまたは複数の成分がインスタント食品よりも高い濃度で存在するものであるため、使用のためには、例えば消費に適した水溶液によって希釈する必要がある。本発明によって提供される食品の非限定的な実例としては、牛乳、ヨーグルト、マーガリン等の乳製品、ジュースおよびスポーツドリンク等の飲料、ビスケット、パン、シリアル、パスタ、ソース等のような食品が挙げられる。

【0101】

特定の実施形態において、食品は、０．００１％〜９９．９９８重量％の本発明の活性生成物を含む。

【0102】

本発明の活性生成物を含む食品は、本発明の活性生成物を食品に添加し、得られた混合物を混合することによって容易に調製することができる。

【0103】

別の態様において、本発明は、本発明の活性生成物を含む機能性食品に関する。本明細書で使用される場合、用語「栄養」および「医薬品」に由来する用語「機能性食品」は、食品から製造されるが、通常は食品に関連しないカプセル、粉末、またはその他医薬品形態で見出され、疾患の治療および／または予防に有益な特性を有する製品を指す。したがって、「機能性食品」という用語は、単離または精製された食品、ならびにカプセル、錠剤、サシェ、飲用可能な小瓶等の経口で通常使用される剤形で一般に提示される添加物または食品サプリメントを含み、このような製品は、生理学的効果または疾患に対する保護を提供する。所望であれば、本発明により提供される機能性食品は、本発明の活性生成物に加えて、１つまたは複数の機能性食品（疾患予防または軽減に関連する製品または物質）、例えば、フラボノイド、オメガ−３脂肪酸等、および／または１つまたは複数のプレバイオティクス（プロバイオティクス活性および／または増殖を刺激する非消化性食品成分）、例えば、オリゴフルクトース、ペクチン、イヌリン、ガラクトオリゴ糖、ラクツロース、ヒト乳オリゴ糖、食物繊維等を含む。

【0104】

特定の実施形態において、本発明によって提供される機能性食品は、本発明の活性生成物およびそのための許容される経口担体を含む。別の特定の実施形態において、本発明によって提供される機能性食品組成物は、０．００１重量％〜９９．９９８重量％の本発明の活性生成物を含む。別の特定の実施形態において、本発明によって提供される機能性食品組成物中の活性生成物は、当該組成物の水性相に含まれる。別の特定の実施形態において、本発明によって提供される機能性食品組成物は、水中油型エマルジョンを含む。

【0105】

別の態様において、本発明は、食品サプリメントとしての本発明の活性生成物の使用に関する。本明細書で使用される場合、「食品サプリメント」という用語は、通常の食事を補うことを目的とする、栄養的または生理学的効果を有する栄養素または他の物質の濃縮源を指す。これらは、「投与」形態、すなわち、丸薬、錠剤、カプセル、測定された用量の液体等として市販されている。

【0106】

別の態様において、本発明は化粧品としての本発明の活性生成物の使用に関する。

【0107】

したがって、別の態様において、本発明は、本発明の活性生成物を美容的に許容されるビヒクルと共に含む化粧品組成物に関する。本明細書中で使用される場合、用語「化粧品組成物」または「パーソナルケア組成物」は、ヒトまたは動物の個人衛生における使用に適した、あるいは自然の美しさを向上させ、またはヒトまたは動物の身体の構造または機能に影響を与えずに身体の外観を変化させるための組成物を指し、当該組成物はそのような効果を提供する１つまたは複数の生成物を含む。所望であれば、本発明により提供される化粧品組成物は、本発明の活性生成物に加えて、１つまたは複数の化粧品または化粧製品、すなわち、ヒトまたは動物の体の外部部分（例えば、表皮、毛髪系、爪、唇等）と接触させて、または歯および頬側の粘膜と接触させて、それらのクリーニング、それらに香水をつけること、それらの外観を変化させること、それらの保護、それらを良好な状態で維持すること、または体臭の調整を排他的なまたは主な目的として、意図される物質または混合物を含有できる。化粧製品の実例としては、ＩＮＣＩ（化粧品原料国際命名法）リストに含まれる製品が挙げられる。化粧品組成物またはパーソナルケア組成物としては、バルム、パッド、ポマード、クリーム等の製品が挙げられる。

【0108】

特定の実施形態において、本発明によって提供される化粧品組成物は、本発明の活性生成物およびそのための許容される経口または局所用担体を含む。

【0109】

別の特定の実施形態において、本発明によって提供される化粧品組成物は、０．００１重量％〜９９．９９８重量％の本発明の活性生成物を含む。

【0110】

本発明の活性生成物を含む化粧品組成物は、当該化粧品組成物のさまざまな成分を添加し、混合することによって容易に調製することができる。

【0111】

本発明によって提供される化粧品組成物は、哺乳動物の皮膚の損傷の予防、改善、または治療において、皮膚の水分補給のため、または老化防止剤として使用することができる。

【0112】

別の態様において、本発明は、抗酸化剤としての本発明の活性生成物の使用に関する。

【0113】

別の態様において、本発明は、薬剤としての本発明の活性生成物の使用、または代替的に述べると医薬品において使用するための本発明の活性生成物に関する。

【0114】

したがって、別の態様において、本発明は、本発明の活性生成物を薬剤として許容されるビヒクル、例えば、許容される経口または局所用担体と共に含む医薬組成物に関する。医薬組成物の処方に適した賦形剤および当該医薬組成物の製造に関する情報は、Ｃ．Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ著「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」、第１０版、１９９３年、Ｌｕｚｚｎ ５、Ｓ．Ａ． ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓに見出すことができる。

【0115】

特定の実施形態において、本発明によって提供される医薬組成物は、０．００１重量％〜９９．９９８重量％の本発明の活性生成物を含む。

【0116】

本発明の活性生成物を含む医薬組成物は、当該医薬組成物のさまざまな成分を添加し、混合することによって容易に調製することができる。医薬組成物の処方に適した担体または賦形剤および当該医薬組成物の製造に関する情報は、Ｃ．Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ著「Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ」、第１０版、１９９３年、Ｌｕｚｚｎ ５、Ｓ．Ａ． ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓに見出すことができる。

【0117】

別の態様において、本発明は、酸化ストレスおよび／または炎症活性を特徴とする疾患または状態の予防および／または治療、または放射線療法に対する耐性の改善における使用のための本発明の活性生成物に関し、または代替的に述べると、本発明は、酸化ストレスおよび／または炎症活性を特徴とする疾患または状態の予防および／または治療のために、または放射線療法に対する耐性の改善における医薬組成物の製造における本発明の活性生成物の使用にも関する。

【0118】

本明細書で使用される場合、「酸化ストレス活性を特徴とする疾患または状態」という表現は、酸化ストレスが関与する疾患または状態に関する。酸化ストレスは、活性酸素種の全身的な発現と、反応性中間体を容易に解毒し、または結果として生じる損傷を修復する生体系の能力との間の不均衡を反映する。細胞の正常な酸化還元状態の障害は、タンパク質、脂質、およびＤＮＡを含む細胞のすべての成分に損傷を与える過酸化物およびフリーラジカルの生成を通じて毒性作用を引き起こす可能性がある。さらに、いくつかの活性酸素種は、酸化還元シグナル伝達において細胞メッセンジャーとして機能するため、酸化ストレスは、細胞シグナル伝達の正常な機構における混乱を引き起こし得る。ヒトにおいては、酸化ストレスは癌、神経変性病、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ルーゲーリック病、ハンチントン病、および多発性硬化症、心血管疾患、例えば、アテローム性動脈硬化症、心不全、高血圧、心筋梗塞等、ならびにその他の疾患、例えば、脆弱Ｘ症候群、鎌状赤血球貧血、扁平苔癬、白斑、自閉症、感染症、および慢性疲労症候群等の発症に関与していると考えられている。

【0119】

本明細書で使用される場合、「炎症活性を特徴とする疾患または状態」という表現は、炎症が関与する疾患または状態に関する。炎症は、免疫細胞、血管、および分子メディエータを含む防御免疫血管応答（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）である。炎症の目的は、細胞傷害の初期原因を排除し、元の傷害および炎症過程から損傷を受けた壊死細胞および組織を除去し、組織修復を開始することである。炎症性異常は、広範囲のヒト疾患の根底にある障害の大きなグループである。免疫系は、多くの場合、炎症性障害に関与し、アレルギー反応およびいくつかの筋障害の両方において示され、多くの免疫系障害は異常な炎症をもたらす。炎症過程に病因的起源を有する非免疫疾患としては、癌、アテローム性動脈硬化症、および虚血性心疾患（心筋虚血）が挙げられる。炎症に関連する例示的で非限定的な障害の例としては、尋常性挫瘡、急性腎臓損傷、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、ベーチェット病、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、クローン病、皮膚炎、糖尿病性網膜症、気腫、線維症、糸球体腎炎、過敏症（アレルギー）、炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、筋障害、骨盤内炎症性疾患、ペイロニー病、虚血再潅流傷害、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、硬化症、皮膚障害、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶反応、尿路炎症性疾患、血管炎等が挙げられる。

【0120】

特定の実施形態において、酸化ストレスまたは炎症活性を特徴とする疾患または状態は、癌、パーキンソン病、アルツハイマー病、ルーゲーリック病、ハンチントン病、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、心不全、高血圧、心筋梗塞、脆弱Ｘ症候群、鎌状赤血球貧血、扁平苔癬、白斑、自閉症、感染症、慢性疲労症候群、虚血性心疾患、尋常性挫瘡、急性腎臓損傷、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、ベーチェット病、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、クローン病、皮膚炎、糖尿病性網膜症、気腫、線維症、糸球体腎炎、過敏症（アレルギー）、炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、筋障害、骨盤内炎症性疾患、ペイロニー病、虚血再潅流傷害、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、硬化症、皮膚障害、全身性エリテマトーデス、移植片拒絶反応、尿路炎症性疾患、血管炎からなる群から選択される。

【0121】

本発明はまた、それを必要とする対象に治療有効量の本発明の活性生成物を投与することを含む、酸化ストレスおよび／または炎症活性を特徴とする疾患または状態の予防および／または治療のための方法または放射線療法に対する耐性の改善方法に関する。

【0122】

本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、ヒトを含む任意の哺乳動物を含む。

【0123】

本発明の活性生成物の詳細は、既に上記で定義されており、参照により本明細書に組み込まれる。

【0124】

マグネシウムに富むブライン溶液の使用
別の態様において、本発明は、１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの密度を有するブラインの、ＳＯＤを含有する微小藻類のバイオマスに含まれるＳＯＤの安定剤としての使用に関する。

【0125】

ＳＯＤ活性を含む任意の微小藻類のバイオマスは、当該マグネシウムに富むブライン溶液で安定化させることができる。それにもかかわらず、特定の実施形態において、ＳＯＤを含有する微小藻類の当該バイオマスは、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスである。

【0126】

別の態様において、本発明は、１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの密度を有するブラインによってＳＯＤが安定化されることを特徴とする、本発明のＳＯＤに富むＴ．チュイイ種のバイオマスに関する。

【0127】

特定の実施形態において、得られた生成物、すなわち、ＳＯＤがブラインで安定化されているＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスが、ブラインの組成と本質的に同じ組成を有するように、培養培地を実質的に含まないＳＯＤを含有する微小藻類のバイオマスにブラインを添加する。すなわち、ＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスは、１０〜１８ｇ／Ｌの全硫黄（Ｓ）、４０〜５５ｇ／Ｌの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、６０〜１，５００ｍｇ／Ｌのカルシウム（Ｃａ^２＋）、５２〜７０ｇ／Ｌのマグネシウム（Ｍｇ^２＋）、１５〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｋ^＋）、９〜２０ｇ／Ｌのカリウム（Ｎａ^＋）、１１５〜１８０ｇ／Ｌの塩化イオン（Ｃｌ⁻）を含み、２０℃で１．２５〜１．３０ｇ／ｍｌの密度を有するブラインによってＳＯＤが安定化されることを特徴とする。

【0128】

別の特定の実施形態において、生成物、すなわち、ＳＯＤがブラインで安定化されているＳＯＤに富むＴ．チュイイ種の微小藻類のバイオマスが、ブラインの組成とは本質的に異なる組成を有するように、一定量の培養培地を含むＳＯＤを含有する微小藻類のバイオマスにブラインを添加する。当該得られた生成物の組成は、当該生成物を得るために混合されるブラインとバイオマスとの相対量に依存する。特定の実施形態において、ブラインとＳＯＤを含有する微小藻類のバイオマスとの比は、約１０００：１〜約１：１０００、約１００：１〜約１：１００、約５０：１〜約１：５０、約２５：１〜約１：２５、約１０：１〜約１：１０、約５：１〜約１：５、約１：１である。

【0129】

以下の実施例は本発明を説明するものであり、本発明を限定するものとみなしてはならない。

【0130】

実施例１：
種々の培養系および条件の下の微小藻類の種々の種におけるＳＯＤの産生
このアッセイは、種々の培養系および条件の下で微小藻類の種々の種におけるＳＯＤの産生を研究するために行った。その目的で、屋内培養および屋外培養を含む種々の培養系において、異なる非生物的ストレス条件下で合計１１種の微小藻類株を試験し、これらが異なる菌株のＳＯＤ活性にどのように影響するかを調べた。以下に示すように、テトラセルミス チュイイは、試験したすべての非生物的条件において最高のＳＯＤ活性を有することが見出されたが、窒素飢餓下で最高の活性が得られた。

【0131】

１．材料および方法
１．１ 微小藻類培地
藻類であるクロレラ ブルガリス（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、クロレラ ピレノイドーサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、テトラセルミス スエシカ、テトラセルミス チュイイ、テトラセルミス種、ナンノクロロプシス ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、フェオダクチラム トリコルヌティウム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、イソクリシス ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｇａｌｂａｎａ）（Ｃｌｏｎ Ｔ−ＩＳＯ）、ポルフィリジウム クルエンタム、およびセネデスムス オブリカス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｏｂｌｉｑｕｏｕｓ）はＦｉｔｏｐｌａｎｃｔｏｎ Ｍａｒｉｎｏ，Ｓ．Ｌ．の微小藻類培養コレクションから得た。

【0132】

Ｔ．スエシカ、Ｔ．チュイイ、テトラセルミス種、Ｎ．ガジタナ、Ｉ．ガルバナ（Ｃｌｏｎ Ｔ−ＩＳＯ）、およびＰ．クルエンタムをＦ／２培養培地で培養した［Ｇｕｉｌａｒｄ Ｒ．Ｒ．Ｌ．＆Ｒｙｔｈｅｒ，Ｊ．Ｈ．１９６２年、「Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｐｌａｎｋｔｏｎｉｃ ｄｉａｔｏｍｓ．Ｉ．Ｃｙｃｌｏｔｅｌａ ｎａｎａ Ｈｕｓｔｅｄｔ ａｎｄ Ｄｅｔｏｎｕｌａ ｃｏｎｆｅｒｖａｃｅａｅ（Ｃｌｅｖｅ） Ｇｒａｎ．」Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８、２２９〜２３９］。Ｐ．トリコヌタムをＦ／２＋Ｓｉ培養培地で培養した［上記で引用したＧｕｉｌａｒｄ＆Ｒｙｔｈｅｒ、１９６２年］。Ｃｈ．ブルガリス、Ｃｈ．ピレノイドーサ、およびＳ．オブリカスをビタミン類を含むＢｏｌｄ Ｂａｓａｌ培地で培養した［Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，Ｈ．Ｗ．＆Ｂｏｌｄ，Ｈ．Ｃ．１９６３年「Ｐｈｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ＩＶ．Ｓｏｍｅ Ｓｏｉｌ Ａｌｇａｅ ｆｒｏｍ Ｅｎｃｈａｎｔｅｄ Ｒｏｃｋ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｌｇａｌ Ｓｐｅｃｉｅｓ．」 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．６３１８、テキサス州オースティン；Ｓｔａｒｒ Ｒ．Ｃ．＆Ｚｅｉｋｕｓ Ｊ．Ａ．１９９３年「ＵＴＥＸ−Ｔｈｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｇａｅ ａｔ ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ ａｔ Ａｕｓｔｉｎ」 Ｊ．Ｐｈｙｃｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．２９］。すべての培地は対応する乾燥した化学物質から新しく調製した。

【0133】

５０ｍＬのスタータカルチャー（中間対数期）を１０００ｍＬの三角フラスコ中で８００ｍＬの培地に播種した。三角フラスコを、１５０μｍｏｌ光子ｍ^−２ｓ^−１の連続した白色蛍光下で２５±１℃の温度制御室に置いた。培養液を大気中で約２％ＣＯ_２で通気した。毎週５０ｍＬの培養液を新しい培地を入れた新しいフラスコに移した。これらの培養液は、毎週継代培養することによって維持され、屋内実験および屋外実験の播種材料として使用された。

【0134】

１．２．培養条件
実験培養条件を確立し、それぞれ３つの複製、すなわち、保存培養株の維持条件に対応する対照条件、培養液が高酸化還元条件、高温条件、窒素飢餓条件、および高塩分濃度条件にさらされた屋内条件および屋外条件を維持した。

【0135】

培養液は、栄養制限を防止するために流加様式で操作した。非生物的条件を適用する前に対数期まで培養物を増殖させた。増殖速度を顕微鏡による細胞計数によりモニタした。これは培養されている株に依存するため、増殖段階の特定を確認するために増殖曲線（図示せず）を構築した。

【0136】

培養培地を少なくとも１００ｍＶの酸化還元電位で維持した高酸化還元条件はオゾンの添加により得た。少量の培養では、酸化／還元電位（ＯＲＰ）コントローラを備えたＯＺＡＣ−ＰＬＵＳ ２００オゾン発生器によって培地中でオゾンが生成された。大量の場合、Ｏｘｉｃｏｍ ＳＬＶ ２５０オゾン発生器を使用し、培地中の溶存オゾン濃度を、Ｈａｎｎａｈ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのｍＶ ６００ ＯＲＰデジタルコントローラによってＯＲＰを連続的に測定することによって制御した。

【0137】

培養が維持される高温条件は、２８℃より高い温度で得られた。屋内培養の場合、培養室の温度をこの温度より高く設定した。屋外培養の場合、春期および夏期、すなわち環境温度によって自然に温度に達する間に培養を行わなければならなかった。

【0138】

培養培地を培養する高塩分濃度条件は、培地に塩を添加することにより３５を超える塩分濃度で培養培地を培養することによって得られた。Ｈａｎｎａｈ ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓのＨＩ９８２８マルチパラメータを用いて塩分濃度を測定した。

【0139】

窒素飢餓条件は、培地に窒素を添加しないことによって満たされ、したがって培養物によって消費された。窒素濃度は、ＳｅａｌのＡＱ２自動分析装置によって測定した。

【0140】

１．３． 培養系
屋内培養は、５Ｌの三角フラスコで行った。屋外培養は、開放系または閉鎖系で行った。

【0141】

使用した開放系はレースウェイポンドであった。培養は、５Ｌの培養培地を収容する６Ｌのアクリル開放レースウェイポンドおよび５００Ｌの培養培地を収容する６００Ｌのアクリル開放レースウェイポンドで培養を行った。培養液を１８毎分回転数（ｒｐｍ）で回転するパドルホイールを用いて動かした。このレースウェイポンドは、先行研究から採用された設計で構築した［Ｒａｄｍａｎｎ、Ｅ．Ｍら、２００７年、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ ２００７年、２６５：１１８〜１２６］。

【0142】

使用した閉鎖系は、水平管型太陽光レシーバを通すように培養培地を駆動するポンプからなる管型光バイオリアクタ（ＰＢＲ）であった。バイオリアクタ内の全培養液体積は、６５０Ｌおよび２，０００Ｌであった。

【0143】

使用したレースウェイポンドおよび光バイオリアクタは両方共、純ＣＯ_２注入を使用して、ｐＨコントローラおよび流量計により培地のｐＨを制御した。ｐＨを７．８に設定した。

【0144】

バッチ式遠心分離機で５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した種々の培養液からバイオマスを直接回収した。回収されたバイオマスは８０％の水分を有していた。バイオマスペーストを蒸留水で洗浄して、無機塩沈殿物等の非生体物質を除去した。水性二相系の調製のために、ＳＯＤ活性について分析される微小藻類のバイオマス試料は、凍結乾燥か、またはマグネシウムに富むブライン溶液にペーストを添加することによって安定化された。このブライン溶液は海水蒸発によって得られた。

【0145】

１．４． タンパク質抽出物および測定
タンパク質抽出物およびＳＯＤ抽出物は、１ｍＬの抽出緩衝液（２２０ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４緩衝液、ｐＨ７．８）を０．１ｇの微小藻類のバイオマスに添加することによって得た。１０秒間隔で２分間（各３０秒ずつ４サイクル、２０％増幅）超音波を使用して細胞を溶解した。次いで、バイオマスを室温で１０分間、１６，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を回収する。タンパク質濃度は、従来のブラッドフォード法により測定した［Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．Ｍ．１９７６年、「Ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｇｒａｍ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｙｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．」 Ａｎａｌｙｔ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２、２４８〜２５４］。

【0146】

１．５． 酵素アッセイ
以下のすべての実験におけるＳＯＤ活性を、以下に述べるように、２１６ｍＭ Ｐｉ、ｐＨ７．８でキサンチンおよびキサンチンオキシダーゼを用いて、結合系におけるシトクロムｃの還元速度の阻害後にアッセイした［ＭｃＣｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．およびＦｒｉｄｏｖｉｃｈ，Ｉ．（１９６９年） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４、６０４９ ６０５５；ＳＯＰ１０−３０−６２９９およびＯＰ ＳＰＣＹＴＯ０１により更新された手順］。

【0147】

スーパーオキシドジスムターゼの酵素アッセイ
このアッセイの目的は、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の酵素的測定のための手順を標準化することである。この手順は、酵素的測定によるスーパーオキシドジスムターゼ活性についての規定を有するすべての製品に適用される。

【0148】

定義
精製水＝脱イオンシステムからの水分、抵抗率は２５℃で１８ＭΩ・ｃｍ以上
ユニット定義−１つのユニットは、３．０ｍＬの反応体積中においてｐＨ７．８、２５℃で、キサンチンおよびキサンチンオキシダーゼを用いて、シトクロムｃの還元速度を結合系において５０％阻害する。キサンチンオキシダーゼ濃度では、毎分０．０２５±０．００５の初期（未阻害）ΔＡ_{５５０ｎｍ}を生じるはずである。
ＸＯＤ−キサンチンオキシダーゼ
ＳＯＤ−スーパーオキシドジスムターゼ
Ｏ_２⁻・−スーパーオキシドラジカル

【0149】

考察
スーパーオキシドラジカルは、キサンチンオキシダーゼによって触媒される反応によって酵素的に生成される。

【化1】

酸化されたシトクロムｃは、スーパーオキシドラジカルによって還元される。還元速度は５５０ｎｍにおいて分光光度法で追跡される。
シトクロム^３＋ｃ＋Ｏ_２⁻・→シトクロム^２＋ｃ＋Ｏ_２
スーパーオキシドジスムターゼは、スーパーオキシドラジカルと競合することによってシトクロムｃの還元を阻害する。

【化2】

【0150】

手順
条件Ｔ＝２５℃、ｐＨ＝７．８、Ａ_{５５０ｎｍ}、光路＝１ｃｍ。
方法：連続分光光度計による速度測定
試薬：
Ａ）２５℃で２１６ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）（緩衝液）［４９．３ｍｇ／ｍＬの二塩基性リン酸カリウム三水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｐ５５０４）の精製水溶液を調製し、１ＭのＫＯＨまたは１ＭのＨＣｌを用いて２５℃でｐＨを７．８に調整する］、
Ｂ）１０．７ｍＭのエチレンジアミン四酢酸溶液（ＥＤＴＡ）［４．０ｍｇ／ｍＬのエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈストック番号ＥＤ２ＳＳ）の精製水溶液を調製する］、
Ｃ）１．１ｍＭのシトクロムＣ溶液（Ｃｙｔ Ｃ）［１４．６ｍｇ／ｍｌのシトクロムＣ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｃ７７５２）の精製水溶液を調製する］、
Ｄ）０．１０８ｍＭのキサンチン溶液（キサンチン）［９０ｍＬの精製水に１．６４ｍｇのキサンチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｘ０６２６）を溶解し、撹拌しながら、すべてのキサンチンが溶解するまで少量の１Ｎ ＫＯＨを添加し、溶液を１００ｍＬメスフラスコに定量的に移し、適量の精製水で１００ｍＬにする］、
Ｅ）キサンチンオキシダーゼ酵素溶液（ＸＯＤ）［冷たい精製水中に約５単位／ｍＬのキサンチンオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｘ１８７５）を含む溶液を調製する。氷の上に置き、使用直前にキサンチンオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号Ｘ１８７５）を用いて冷たい精製水中に０．０５単位／ｍＬのキサンチンオキシダーゼを含有する溶液を調製する。この濃度は、アッセイ要件を満たすように調整される必要がある場合がある］、および
Ｆ）スーパーオキシドジスムターゼ酵素溶液［使用直前に、冷たい精製水中に１０単位／ｍＬのスーパーオキシドジスムターゼを含有する溶液を調製する］。

【0151】

アッセイ手順
以下の試薬を適切な容器に（ミリリットル単位で）ピペットで加えることによって反応カクテルを調製する。

【表1】

【0152】

混合してカクテル（「Ｇ」）を得、必要に応じて１Ｍ ＨＣｌまたは１Ｍ ＫＯＨを用いて２５℃でｐＨを７．８に調整する。

【0153】

キサンチンオキシダーゼチェック：
適切なキュベットに以下（ｍＬ単位）をピペットで加える。

【表2】

【0154】

適切に温度調節された分光光度計を使用して２５℃に平衡化させる。５５０ｎｍでの吸光度を一定になるまでモニタし、次に以下を添加する。

【表3】

【0155】

反転させて混合し、約５分間の５５０ｎｍでの吸光度の増加を記録する。未阻害対ブランクの吸光度の変化はこの反応では０．０２５±０．００５であるべきである。そうでない場合は、試薬Ｅ（ＸＯＤ）の濃度を調整し、キサンチンオキシダーゼチェックを繰り返す。

【0156】

以下の試薬を適切なキュベットに（ミリリットル単位で）ピペットで加える。

【表4】

【0157】

適切に温度調節された分光光度計を使用して２５℃に平衡化させる。５５０ｎｍでの吸光度を一定になるまでモニタし、次に以下を添加する。

【表5】

【0158】

反転させて混合し、約５分間の５５０ｎｍでの吸光度の増加を記録する。未阻害反応について１分間隔で最高線形速度を得る。この時間間隔を用いて、各試験およびブランクの速度を得る。

【0159】

各未阻害試験のΔＡ_{５５０ｎｍ}は、未阻害速度の４０〜６０％以内になるはずである。この範囲外のいかなる値も無効とみなされる。

【0160】

計算

【表6】

【表7】

ＤＦ＝希釈係数
５０％＝単位定義あたりのシトクロムｃ還元速度の阻害率
０．１０＝各試験で使用した酵素の体積（ｍＬ単位）

【0161】

最終アッセイ濃度
３．００ｍｌの反応混合物において、最終濃度は５０ｍＭ リン酸カリウム、０．１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、０．０１ｍＭ シトクロムｃ、０．０５ｍＭ キサンチン、０．００５単位のキサンチンオキシダーゼ、および１単位のスーパーオキシドジスムターゼであった。

【0162】

定義：
ａ）収率（％）＝精製画分中の総酵素活性×１００
粗抽出物中の総酵素活性
ｂ）酵素の比活性は以下のように定義される。
比活性（Ｕ／ｍｇ）＝活性（単位）／タンパク質（ｍｇ）
ｃ）酵素純度＝所望の酵素（タンパク質）の量
総タンパク量

【0163】

各精製工程の比活性、精製倍率および％収率を最初の出発粗抽出物と比較した。酵素純度は、精製倍率というパラメータを用いて測定した。精製倍率は、粗抽出物と比較した精製工程後の標的タンパク質（すなわち、ＳＯＤ）がどれだけより純粋であるかの尺度である。精製倍率は、精製された工程の比活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）を粗抽出物の比活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）で除することによって計算できる。

【0164】

２．結果
上記の種々の菌株のＳＯＤの生産性を、第１表に示す種々の非生物的条件および系の下で試験した。

【表8】

【0165】

標準条件下または非生物的ストレス下で試験した種々の株の平均産生量は、図１に示すように、微小藻類Ｔ．チュイイによって得られたものと比較してＳＯＤ産生量の有意な増加を示さなかった。

【0166】

Ｔ．チュイイおよび他のテトラセルミス属を除くすべての菌株は、１０〜６０ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質の範囲でＳＯＤ活性の値を示した。Ｐ．トリコルヌタムおよびＮ．ガジタナのようないくつかの種は、約１００ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質というより高いＳＯＤ活性を示した。しかしながら、Ｔ．チュイイは、標準条件下で約１８０ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質という高いＳＯＤ活性に達したが、これは、窒素飢餓の非生物的ストレス下で培養した場合、７１５±１５ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質という最大ＳＯＤ活性まで増加し、次いで、Ｔ．チュイイを高温ストレス条件下で培養した場合、５００±１２．５ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質のＳＯＤ活性であり、高塩分濃度条件下で培養した場合、４１０±１８．９ＩＵ／ｍｇの可溶性タンパク質というＳＯＤ活性に達した。結果を図１に示す。したがって、Ｔ．チュイイは、窒素飢餓下で最高活性が得られたが、試験したすべての非生物的条件において最高ＳＯＤ活性を有することが判明した。これらの理由から、Ｔ．チュイイは、さらなるアッセイにおいてＳＯＤ活性の産生のための微小藻類として選択された。

【0167】

屋外培養で得られたＳＯＤ活性の結果は、試験した種々の培養体積について有意差がなかった。

【0168】

実施例２：
微小藻類Ｔ．チュイイ無細胞抽出物からのＳＯＤ活性の分画および部分精製
この研究は、微小藻類Ｔ．チュイイ無細胞抽出物からのＳＯＤ活性の分画および部分精製のための経済的な抽出戦略を開発することを目的とした。この目的のために、ポリエチレングリコール／リン酸塩（ＰＥＧ／Ｐｉ）水性二相系を開発した。リン酸塩リッチ相におけるＳＯＤ活性の分配挙動に対する系のＰＥＧモル質量、濃度、ｐＨ、およびイオン組成の影響を分析するための詳細な研究を行った。以下に示されるように、
ＰＥＧ１５００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、１０％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉと、
ＰＥＧ３０００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、３．５％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉと
から構成された２種のＰＥＧ／Ｐｉの水性二相系は、天然の微小藻類の総タンパク量に対してＳＯＤの選択率が最も高い系として選択された。これらの条件下で、下のリン酸塩相でのＳＯＤについて、高い回収率（８０％超）で十分な精製（２〜４倍）が達成された。加えて、この系は、クロロフィルおよびポリフェノールのような望ましくない低分子量化合物の除去を可能にする。ＳＯＤ／リン酸塩相は、５０℃および６０℃で高い熱安定性を示す。

【0169】

材料および方法
抽出物
すべての場合について、実施例１に記載されるようにして得られた微小藻類Ｔ．チュイイ無細胞抽出物を使用した。

【0170】

水性二相系の調製
ポリエチレングリコール／リン酸塩（ＰＥＧ／Ｐｉ）水性二相系は、５０％（ｗ／ｗ）のＰＥＧ１５００、ＰＥＧ３０００、およびＰＥＧ６０００原液ならびに４０％（ｗ／ｗ）のリン酸カリウム原液（ｐＨ７．０）から調製した。ＰＥＧ原液は、計算された量のＰＥＧを脱イオン水に溶解することによって調製した。リン酸カリウム溶液は、計算された量の無水一塩基性リン酸カリウムおよび無水二塩基性リン酸カリウムを脱イオン水に溶解し、１Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）または１Ｍの塩酸（ＨＣｌ）を使用してｐＨを７．０に調整することにより、７：１８の一塩基性：二塩基性の割合で調製した。

【0171】

異なる濃度のＮａＣｌを含有するリン酸カリウム緩衝液は、２５ｇの原液のリン酸カリウム緩衝液に、０．８７５ｇのＮａＣｌ（３．５％ｗ／ｗ）、１．７５ｇのＮａＣｌ（７％ｗ／ｗ）、２．５ｇのＮａＣｌ（１０％ｗ／ｗ）を添加して調製した。１ＭのＮａＯＨまたは１ＭのＨＣｌを使用してｐＨを７．０に調整した。

【0172】

ポリマー（ＰＥＧ）の分子量、塩の組成、およびｐＨ等の種々の系パラメータは、タンパク質分布および全収率に大きな影響を有する。

【0173】

必要量のＰＥＧ、食塩水、Ｔ．チュイイ無細胞抽出物（微小藻類の上清、全系の１０％）、および総重量のバランスを取るための脱イオン水を含有する２〜１００ｇの質量のＡＴＰＳをプラスチック管で調製した。試験管を２２〜２５℃で１時間穏やかに混合することによりＡＴＰＳを調製した。完全な相分離を達成するために、１５００ｒｐｍで１０分間の低速遠心分離を行った。相互汚染を避けるために、上部および下部の相を注意深くピペット操作することによって、相を分離した。各相の体積を測定し、収集した。

【0174】

種々のｐＨ（６．５、７、７．５、８、および８．５）および種々の濃度のＮａＣｌ（０％ｗ／ｗ、３．５％ｗ／ｗ、７％ｗ／ｗ、および１０％ｗ／ｗ）を用いた様々な量および分子量のＰＥＧ（１５００Ｄａ、３０００Ｄａ、および６０００Ｄａ）およびＫ_２ＨＰＯ_４を微小藻類の抽出物に添加して二相系を生成した。ＫＨ_２ＰＯ_４の量は、すべての条件において一定であった。

【0175】

結果
２．１ 微小藻類抽出物のためのＡＴＰＳの最適化
特定のタンパク質の分布は、サイズ、表面電荷、疎水性等のその独自の物理化学的性質に依存する。適切に最適化された場合、タンパク質の分布に影響を与える因子（例えば、ＰＥＧ分子量、イオン強度、ｐＨ）を慎重に調整することによって、遠心分離および限外濾過の欠点の多くを回避することができ、抽出の初期段階で一般的に使用され、部分的に精製され濃縮された最終生成物を提供する。

【0176】

ＡＴＰＳのパラメータ、例えば、ポリマー（ＰＥＧ）の平均分子量、濃度、塩組成、およびｐＨが、タンパク質分布（Ｋｐ、分配係数）および全収率に大きな影響を有することを考慮して、要因実験を設計し、いくつかの異なる条件をスクリーニングした（図２）。ＰＥＧおよびＰｉの両方の試験範囲は１１〜２０％（ｗ／ｗ）であった。３つのＰＥＧ分子量、すなわち１５００、３０００、および６０００を試験した。ＰＥＧおよびＰｉの原液は、それぞれ５０％ｗ／ｗおよび４０％ｗ／ｗ、ｐＨ７であった。その後、Ｐｉ相におけるＳＯＤの精製倍率に関する最良の条件は、さらなる改良のために選択された（図２）。すべての場合について、Ｔ．チュイイ無細胞抽出物を使用した。第２表は、最初に試験したＰＥＧ／Ｐｉ条件を示す。

【0177】

【表9】

【0178】

別個の分離されたＰＥＧ相およびＰｉ相の形成をもたらす条件をＰｉ相のＳＯＤ活性について分析した。結果を図３および図４に示す。

【0179】

最初のスクリーニング後に得られた結果に基づいて、以下の条件をさらなる分析のために選択した。
ａ） ＰＥＧ１５００：ラン１０回、すなわち、１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、２０％ｗ／ｗのＰｉ［ＰＥＧ１５００（１０）］
ｂ） ＰＥＧ３０００：ラン１０回、すなわち、１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、２０％ｗ／ｗのＰｉ［ＰＥＧ３０００（１０）］

【0180】

選択された条件は、第３表に示されるように、より正確な結果を得るために１０ｇの最終重量までスケールアップした。

【表10】

【0181】

ＰＥＧ１５００およびＰＥＧ３０００についてはＳＯＤ比活性（Ｓ．Ａ．、単位／ｍｇタンパク質）の改善が再現された。図５は、選択された条件のＰＥＧ相およびＰｉ相が分離しているＦａｌｃｏｎチューブを示す。

【0182】

次の工程は、種々のｐＨおよびＮａＣｌ濃度を試験する追加のスクリーニング工程を含んでいた。上記の選択された条件は、ＳＯＤ純度のさらなる改善のために使用された。第４表は、試験したｐＨ／ＮａＣｌ条件を示す。

【表11】

【0183】

図６〜図８は、ｐＨ／ＮａＣｌスクリーニング条件の精製改善を示す。

【0184】

上記の結果に基づいて、スケールアップのために次の条件を選択した。
ａ） ＰＥＧ１５００：１、２、およびＣ４
ｂ） ＰＥＧ３０００：１、１０、およびＣ２
ｃ） ＰＥＧ６０００（１０）：１、７、およびＣ３

【0185】

図９〜図１１は、上記の選択された条件のスケールアップ実験（１０ｇ）の結果を示す。

【0186】

最良のｐＨ／ＮａＣｌ条件を最終重量１０ｇで試験した場合、すべてのＰＥＧ６０００（１０）条件はＰｉ相でクロロフィル汚染（図１２、１３、および１４）を示したため、ＰＥＧ１５００およびＰＥＧ３０００のみがさらなる改善のために選択された。

【0187】

最終的に、スケールアップ試験後の最終選択条件は、以下の通りであった。
ＰＥＧ１５００：Ｃ４、すなわち、１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、１０％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ、ｐＨ７
ＰＥＧ３０００：Ｃ２、すなわち、１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、３．５％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗＰｉ、ｐＨ７

【0188】

これらの２種のＰＥＧ／Ｐｉの水性二相系は、天然の微小藻類Ｔ．チュイイの総タンパク量に対してＳＯＤの選択率が最も高い系として選択された。これらの条件下で、下のリン酸塩相でのＳＯＤについて、高い回収率（８０％超）で十分な精製（２〜４倍）が達成された。加えて、両方の系は、クロロフィルおよびポリフェノールのような望ましくない低分子量化合物の除去を可能にする。

【0189】

２．２．最適化されたＡＴＰＳの再現性
ＡＴＰＳに最良の条件の再現性を調査した。３つの独立した実験を連続３日間で行った。リン酸塩およびＰＥＧ原液を毎回新しく調製した。Ｔ．チュイイ細胞（０．１ｇ）を２２０ｍＭのＰｉ緩衝液（ｐＨ７．８）１ｍＬに再懸濁し、超音波（各３０秒ずつ４サイクル、２０％増幅）を適用することにより溶解した。細胞を沈降させ（１６，０００ｘｇで２０分間）、上清をＡＴＰＳ分配に付した。ＡＴＰＳの最終重量は１０ｇであり、最終濃度は、
− ＰＥＧ１５００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、１０％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ（最終濃度）
− ＰＥＧ３０００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、３．５％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ（最終濃度）

【0190】

Ｐｉ相の精製度および精製収率は実験毎に計算した。結果を第５表および図１５に示す。

【表12】

【0191】

２．３．ＡＴＰＳスケールアップ実験
最適化されたＡＴＰＳ条件の再現性を１００ｇの最終調製物で試験した。最良の精製度および精製収率の向上を示した条件は以下の通りであった。
− ＰＥＧ１５００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、１０％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ（最終濃度）
− ＰＥＧ３０００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、３．５％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ（最終濃度）

【0192】

手順：
１ｇの凍結乾燥Ｔ．チュイイ細胞を１０ｍＬの２２０ｍＭ Ｐｉ（ｐＨ７．８）に溶解した。氷中で４０秒を１０回、小チップを用いて４０％振幅で超音波を適用することによって細胞を溶解した。続いて、細胞を１６，０００ｘｇで２０分間遠心分離し、ＡＴＰＳをセットアップするために上清を使用した。最終的なＡＴＰＳは、２４ｇのＰＥＧ、５０ｇのＰｉ、１０ｇの細胞抽出物、および１６ｇのｄｄＨ_２Ｏからなっていた。混合物を室温で１時間回転させた後、相分離を促進するために１５００ｒｐｍで１０分間穏やかに遠心分離した。

【0193】

シトクロムｃアッセイ（実施例１）を用いてＰｉ相のＳＯＤ活性を測定した（実施例１）。総タンパク濃度をブラッドフォード法（上記引用）により測定した。精製度および精製収率を計算した。結果を図１６に示す。当該図１６に示されているように、下部リン酸塩相でのＳＯＤについても、高い収率（８０％以上）で十分な精製（３〜５倍）が達成された。

【0194】

２．４．比活性の向上を目的とした粗抽出物およびＰｉ相の熱処理
この実験の目的は、ＡＴＰＳへの適用前の粗抽出画分の熱処理がＳＯＤ比活性を向上できるかどうかを調査することであった。

【0195】

粗抽出物の熱処理のために、０．１ｇのＴ．チュイイ細胞を上記のように溶解し、１６．０００ｘｇで２０分間遠心分離した。その後、上清の粗抽出物を４０℃および５０℃の２つの異なる温度で熱インキュベーションした。異なる時点でアリコートを除去し、総ＳＯＤ活性をシトクロムｃアッセイを用いて測定した。さらに、総タンパク濃度をブラッドフォード法（上記引用）により測定した。結果を図１７および図１８に示す。

【0196】

ＡＴＰＳ後のＰｉ相の熱処理のために、２つの最適化されたＡＴＰＳ条件のＰｉ相（ＰＥＧ１５００およびＰＥＧ３０００）を用いて同じ仮説を試験した。ＡＴＰＳ後、Ｐｉ相を５０℃および６０℃で熱処理した。ＰＥＧ１５００のＰｉ相の結果を図１９および図２０に示す。ＰＥＧ３０００のＰｉ相の結果を図２１および図２２に示す。これらの結果は、ＳＯＤ／リン酸塩相が５０℃および６０℃で高い熱安定性を示すことを示している。

【0197】

２．５． 遠心分離なしのＡＴＰＳにおける相形成
２つの最適化されたＡＴＰＳ条件を用いて、遠心分離なしで２つの相（ＰＥＧおよびＰｉ）ならびにそれらの間の界面が形成される可能性を調査した。これは大規模な精製を容易にし、プロセスのコストを下げる。条件は以下である。
− ＰＥＧ１５００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、１０％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ（最終濃度）
− ＰＥＧ３０００：１２％ｗ／ｗのＰＥＧ、３．５％ｗ／ｗのＮａＣｌを補充した２０％ｗ／ｗのＰｉ（最終濃度）
混合物（最終重量約４０ｇ）を１時間回転させた後、室温に置き平衡化させた。一晩のインキュベーション後にＰＥＧ１５００の場合にのみ相分離が観察された。結果は６５ｇの系を用いて再現された。２つの系の写真を図２３および図２４に示す。比較のために、遠心分離されたバージョンの試料が含まれる。

【0198】

実施例３：
ＮＨＤＦ細胞におけるＨ_２Ｏ_２に対するＴ．チュイイ無細胞抽出物の保護効果のインビトロ評価
材料および方法
抽出物：Ｔ．チュイイ無細胞抽出物（実施例１に記載されるようにして得られた）
インビトロ毒性アッセイ
正常なヒト成人の皮膚から単離した初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、Ｌｏｎｚａ Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）（Ｌｏｎｚａ、米国ウォーカーズヴィル）から入手した。２％血清を含む推奨培地ＦＧＭ（商標）−２ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）を使用して、細胞を３７℃、５％ＣＯ_２雰囲気中で培養した。Ｈ_２Ｏ_２により誘発される酸化損傷に対するＴ．チュイイ無細胞抽出物の保護効果の評価のために、ＮＨＤＦ細胞を、３００μｇ／ｍｌ（ｗ／ｖ）の最終濃度にて（実施例１に記載のようにして得られた）Ｔ．チュイイ無細胞抽出物を含有する増殖培地中で４８時間予めインキュベートした。Ｈ_２Ｏ_２処理の前に、抽出化合物とＨ_２Ｏ_２との間の直接的な細胞外相互作用を防止するために、細胞を１ｘＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４）で２回洗浄した。最後に、Ｈ_２Ｏ_２を最終濃度０．５ｎＭで培地に加え、細胞を３７℃で３時間インキュベートした。細胞毒性を、ＡＴＰ Ｖｉａｌｉｇｈｔ ｐｌｕｓキット（Ｌｏｎｚａ、米国ウォーカーズヴィル）を用いて製造業者の標準プロトコルに従ってＡＴＰレベルを測定することによって評価した。

【0199】

結果
単離された初代ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）に対するインビトロ毒性アッセイを用いて、Ｈ_２Ｏ_２によって誘発された酸化損傷に対するＴ．チュイイ無細胞抽出物の保護効果を研究した。ＮＨＤＦ細胞は、Ｔ．チュイイを含む増殖培地中で４８時間予めインキュベートし、０．５ｎＭ Ｈ_２Ｏ_２の添加により酸化ストレスを誘発した。細胞毒性を評価するために、ＮＨＤＦ細胞はさらに予めＴ．チュイイ無細胞抽出物を添加することなくＨ_２Ｏ_２で処理し、未処理ＮＨＤＦ細胞を対照として用いた。細胞毒性は、細胞ＡＴＰレベルを測定することによって評価した（図２５）。この分析により、ＮＨＤＦ細胞をＴ．チュイイ無細胞抽出物で前処理すると、予め抽出物を添加することなくＨ_２Ｏ_２に曝露された細胞と比較して、細胞生存性の有意な保護がもたらされることが明らかになった。したがって、Ｔ．チュイイ無細胞抽出物は、Ｈ_２Ｏ_２によって引き起こされる酸化損傷に対して、ヒト初代皮膚線維芽細胞を効果的に保護する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】