特許 6869303 細胞増殖の刺激のための方法及び組成物、ならびにＦＧＦ２アイソフォームの生物学的に活性な混合物の提供

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6869303

(24)【登録日】2021年4月15日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】細胞増殖の刺激のための方法及び組成物、ならびにＦＧＦ２アイソフォームの生物学的に活性な混合物の提供

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20210426BHJP

   A61K 38/18 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20210426BHJP

   C12N 5/0797 20100101ALN20210426BHJP

   C12N 5/077 20100101ALN20210426BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/28

   A61K38/18

   A61P43/00 121

   A61P43/00 107

   A61P25/00

   A61P9/10

   !C12N5/0797

   !C12N5/077

【請求項の数】9

【外国語出願】

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2019-168177(P2019-168177)

(22)【出願日】2019年9月17日

(62)【分割の表示】特願2017-549807(P2017-549807)の分割

【原出願日】2016年4月1日

(65)【公開番号】特開2020-23502(P2020-23502A)

(43)【公開日】2020年2月13日

【審査請求日】2019年10月17日

(31)【優先権主張番号】62/178,190

(32)【優先日】2015年4月1日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/204,776

(32)【優先日】2015年8月13日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】503235673

【氏名又は名称】サンバイオ，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】アイズマン，イリナ

(72)【発明者】

【氏名】ベイツ，ダミアン

【審査官】 池上 文緒

(56)【参考文献】

【文献】 特許第６６６３４４５（ＪＰ，Ｂ２）

【文献】 米国特許出願公開第２０１１／００２０２９１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 特開２００５−２０６５５９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 PLoS ONE, 2012, Vol.7, No.6, e39500

【文献】 Tissue Engineering Part A, 2012, Vol.18, No.11-12, pp.1264-1272

【文献】 Tissue Engineering Part A, 2014(online), Vol.21, No.1-2, pp.214-223

【文献】 Stem Cell Research & Therapy, 2014, 5:29

【文献】 Jounal of Cellular Biochemistry, 2007, Vol.100, pp.1100-1108

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／２８

Ａ６１Ｋ ３８／１８

Ｃ１２Ｎ ５／

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

インビトロで、細胞または組織に対してＦＧＦ２アイソフォームの混合物を提供するための調製物の使用であって、前記調製物は、ノッチ細胞内ドメインをコードする配列で一過的にトランスフェクトされた間葉系幹細胞の子孫から得られた可溶性無細胞抽出物であり、前記ＦＧＦ２アイソフォームの混合物が：
（ａ）１８ｋＤの分子量を有するＦＧＦ２アイソフォーム；
（ｂ）２２ｋＤの分子量を有するＦＧＦ２アイソフォーム；
（ｃ）２２．５ｋＤの分子量を有するＦＧＦ２アイソフォーム；及び
（ｄ）２４ｋＤの分子量を有するＦＧＦ２アイソフォーム、
から成る群から選択される１又は複数のＦＧＦ２アイソフォームを含む、使用。

【請求項2】

前記混合物が、組み換えＦＧＦ２よりも大きい生物学的な活性を有する、請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記細胞が神経前駆細胞である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項4】

前記細胞が内皮細胞である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項5】

前記組織が壊死性である、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項6】

壊死が、梗塞または外傷から生じる、請求項５に記載の使用。

【請求項7】

前記組織が、虚血性傷害を受けている、請求項１又は２に記載の使用。

【請求項8】

前記虚血性傷害が脳卒中である、請求項７に記載の使用。

【請求項9】

前記調製物が神経前駆細胞又は内皮細胞の増殖を刺激する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願に対する相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）のもとで、米国仮特許出願第６２／１７８，１９０号（２０１５年４月１日出願）、及び米国仮特許出願第６２／２０４，７７６号（２０１５年８月１３日出願）の恩典を請求し；それらの開示は、全ての目標のためにその全体が参照によって本明細書に援用される。

【0002】

（連邦政府の支援に関する声明）
該当せず。

【0003】

本開示は、増殖因子、ならびに細胞、特に神経細胞及び神経系に関連する細胞の増殖及び発達に対するそれらの効果の分野にある。

【背景技術】

【0004】

間葉細胞移植
間葉系間質細胞（ＭＳＣ）及びそれらの誘導体の移植は、中枢神経系（ＣＮＳ）の種々の変性障害の処置として発達している。ＣＮＳへのＭＳＣ移植から生じる治療効果は、組織の防御、再生及び免疫調節性の刺激を提供する、生きている移植された細胞からの可溶性因子の分泌に主に起因すると考えられる［非特許文献１〜３］。しかし、逆説的には、移植後のＣＮＳ中のＭＳＣの生着率は低く［非特許文献４、５］；そして治療上の利点は、移植された細胞がもはや検出できなくなった後も長く続くことが観察された。種々の説明が、移植されたＭＳＣの生着が劣ることについて説明するために提唱されている。研究者の中には、移植片喪失を説明するための先天性免疫及びその後の適応免疫の免疫応答の誘導を示唆するものもいるが、他の研究者らは、ＨＬＡ適合状態にかかわらず移植片細胞喪失が同様の率であることを見出している［非特許文献６、７］。さらなる研究によって、同種異系のＭＳＣは、移植後に有意な免疫応答を惹起しないという証明が得られている（［非特許文献８］で概説される）。成体の脳に移植された、細胞内で標識されたＭＳＣ（生きているか死んでいるかいずれか）は、レシピエントの周囲の細胞及び遠位の細胞に対して標識を移行し得、かつその標識は、そのレシピエントの細胞に組み込まれるようになり得ることも報告されている［非特許文献９、１０］。

【0005】

ＦＧＦ−２
ＦＧＦ２（塩基性線維芽細胞増殖因子、すなわちｂＦＧＦとしても公知）は、幹細胞の主要な増殖因子、血管形成の強力な誘導因子、必須の創傷治癒媒介因子であり、ならびに神経系の発達及び再生の主要なプレイヤーである（［非特許文献１１］で概説される）。５つのＦＧＦ２アイソフォームは、選択的翻訳開始によって固有のＦＧＦ２のｍＲＮＡから翻訳される：１８ｋＤの低分子量（ＬＭＷ）のアイソフォーム；ならびに２２、２２．５、２４及び３４ｋＤの分子量を含む高分子量（ＨＭＷ）のアイソフォーム。ＬＭＷのＦＧＦ２は、ほとんどが細胞質内であり、かつ分泌されるが、ＨＭＷアイソフォームは主に核であって、しかし任意のアイソフォームが、特定の条件下で、核、細胞質、または細胞外基質中で見出され得る。全てのアイソフォームは、小胞体−ゴルジ経路を通じた分泌を指向するシグナルペプチドを欠く。初期の研究では、内皮細胞の機械的に損傷された単層は、高レベルのＦＧＦ２を放出することが実証された［非特許文献１２、１３］。これらの研究、及び分泌用のシグナルペプチドの欠失に基づいて、細胞死または致死未満の損傷でさえ、ＦＧＦ２放出の主要な機構として記載されている［非特許文献１４］。従って、ＦＧＦ２は、「組織の完全性の慣用的な維持及び／または受傷後の修復に必要な細胞増殖を迅速に開始するための創傷ホルモン」として推薦されている［非特許文献１５］。

【0006】

多くの報告によって、ＭＳＣによるＦＧＦ２のｍＲＮＡの発現が証明され、かつ細胞内ＦＧＦ２タンパク質の存在が実証されているが［非特許文献１１、１２、１６］、分泌されるＦＧＦ２の濃度が極めて低いので［非特許文献１７、１８］、ＦＧＦ２分泌の測定を示す報告は極めて少ない。おそらく、これらの理由のために、ＦＧＦ２は、周囲の神経組織に対する移植されたＭＳＣの再生効果を媒介するための主な候補であるとは考えられていなかった。

【0007】

ＤＮＴＴ−ＭＳＣ
ＤＮＴＴ−ＭＳＣ（「ＮＩＣＤ一過性トランスフェクトのＭＳＣの子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔｓ ｏｆ ＮＩＣＤ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＭＳＣ）」）とは、ノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）；例えば、ヒトＮｏｔｃｈ１細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ１）をコードするベクターを用いたＭＳＣの一過性のトランスフェクション、つづいて、選択及びその後の増殖によるヒト骨髄ＭＳＣに由来し得る細胞の集団である。この過程によって、親のＭＳＣと比較して、インビトロで優れた血管形成性及び神経新生性（すなわち、神経前駆細胞の増殖及び分化）特性を示す細胞集団が生じる［非特許文献１９〜２１］。ＤＮＴＴ−ＭＳＣの神経新生性効果は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、及びＢＭＰ発現の増大、及び対応する分泌の増大に寄与していた［非特許文献１９、２２］。

【0008】

しかし、ＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣによって分泌されるのは極めて低レベルのＦＧＦ２である。非特許文献２２。従って、ＦＧＦ２が原因である場合、全体あってもまたは一部であっても、ＭＳＣ及び／またはＤＮＴＴ−ＭＳＣの神経新生性効果に関して、その供給源は理解しにくいままである。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】カプラン・エーアイ（Ｃａｐｌａｎ ＡＩ）、デニス・ジェイイー（Ｄｅｎｎｉｓ ＪＥ）：メセンカイマル・ステム・セルズ・アズ・トロピック・メディエーターズ（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｓ ｔｒｏｐｈｉｃ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）．ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）．２００６年，９８：ｐ１０７６〜１０８４．

【非特許文献2】ジョイス・エヌ（Ｊｏｙｃｅ Ｎ）、アネット・ジー（Ａｎｎｅｔｔ Ｇ）、ウィルスリン・エル（Ｗｉｒｔｈｌｉｎ Ｌ）、オルソン・エス（Ｏｌｓｏｎ Ｓ）、バウアー・ジー（Ｂａｕｅｒ Ｇ）、ノルタ・ジェイエー（Ｎｏｌｔａ ＪＡ）：メセンカイマル・ステム・セルズ・フォー・ザ・トリートメント・オブ・ニューロデジェネレーティブ・ディジーズ（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）．リジェネレーティブ・メディスン（Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）．２０１０年，５：ｐ９３３〜９４６．

【非特許文献3】チェン・ジェイ（Ｃｈｅｎ Ｊ）、ベンカタ・ピー（Ｖｅｎｋａｔ Ｐ）、ザカレク・エー（Ｚａｃｈａｒｅｋ Ａ）、チョップ・エム（Ｃｈｏｐｐ Ｍ）：ニューロレストレーティブ・テラピー・フォー・ストローク（Ｎｅｕｒｏｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｓｔｒｏｋｅ）．フロンティアーズ・イン・ヒューマン・ニューロサイエンス（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）．２０１４年，８：ｐ３８２．

【非特許文献4】バン・オーワイ（Ｂａｎｇ ＯＹ）、リー・ジェイエス（Ｌｅｅ ＪＳ）、リー・ピーエイチ（Ｌｅｅ ＰＨ）：オートロゴス・メセンカイマル・ステム・セル・トランスプランテーション・イン・ストローク・ペーシェンツ（Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｓｔｒｏｋｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ）．アナルズ・オブ・ニューロロジー（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）．２００５年，５７：ｐ８７４〜８８２．

【非特許文献5】イサコワ・アイエー（Ｉｓａｋｏｖａ ＩＡ）、ベーカー・ケー（Ｂａｋｅｒ Ｋ）、デュフール・ジェイ（Ｄｕｆｏｕｒ Ｊ）、ガウプ・ディー（Ｇａｕｐｐ Ｄ）、フィンネイ・ディージー（Ｐｈｉｎｎｅｙ ＤＧ）：プレクリニカル・エバルエーション・オブ・アダルト・ステム・セル・エングラフトメント・アンド・トキシシティ・イン・ザ・シーエヌエス・オブ・リーサス・マカク（Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ＣＮＳ ｏｆ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ）．モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ）．２００６年，３：ｐ１１７３〜１１８４．

【非特許文献6】ウェストリッチ・ジェイ（Ｗｅｓｔｒｉｃｈ Ｊ）、イエーガー・ピー（Ｙａｅｇｅｒ Ｐ）、ホー・シー（Ｈｅ Ｃ）、スチュワート・ジェイ（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｊ）、チェン・アール（Ｃｈｅｎ Ｒ）、セレツニック・ジー（Ｓｅｌｅｚｎｉｋ Ｇ）、ラルソン・エス（Ｌａｒｓｏｎ Ｓ）、ウェントワース・ビー（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ Ｂ）、オーキャラハン・エム（Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ Ｍ）、ウォズワース・エス（Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ Ｓ）、アキタ・ジー（Ａｋｉｔａ Ｇ）、モリナール・ジー（Ｍｏｌｎａｒ Ｇ）：ファクターズ・アフェクティング・レジデンス・タイム・オブ・メセンカイマル・ストローマル・セルズ（エムエスシー）インジェクテッド・インツー・ザ・マイオカルディウム（Ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ ｔｉｍｅ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ （ＭＳＣ） ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）．セル・トランスプランテーション（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）．２０１０年，１９：ｐ９３７〜８４８．

【非特許文献7】チェン・エル（Ｃｈｅｎ Ｌ）、トレッドゲット・イーイー（Ｔｒｅｄｇｅｔ ＥＥ）、リュー・シー（Ｌｉｕ Ｃ）、ウー・ワイ（Ｗｕ Ｙ）：アナリシス・オブ・アロジェニシティ・オブ・メセンカイマル・ステム・セルズ・イン・エングラフトメント・アンド・ワウンド・ヒーリング・イン・マイス（Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｅ）．プロス・ワン（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．）２００９年，４（９）：ｅ７１１９．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００７１１９．

【非特許文献8】グリフィン・エムディー（Ｇｒｉｆｆｉｎ ＭＤ）、ライアン・エーイー（Ｒｙａｎ ＡＥ）、アラゲサン・エス（Ａｌａｇｅｓａｎ Ｓ）、ローアン・ピー（Ｌｏｈａｎ Ｐ）、トレーシー・オー（Ｔｒｅａｃｙ Ｏ）、リッター・ティー（Ｒｉｔｔｅｒ Ｔ）：アンチドナー・イムノ・レスポンシーズ・エリサイテッド・バイ・アロゲネイック・メセンカイマル・ステム・セルズ：ファット・ハブ・ウイ・ラーンド・ソー・ファー？（Ａｎｔｉ−ｄｏｎｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ｗｈａｔ ｈａｖｅ ｗｅ ｌｅａｒｎｅｄ ｓｏ ｆａｒ？）イムノロジー・アンド・セル・バイオロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．２０１３年，９１：ｐ４０−５１．

【非特許文献9】コイン・ティーエム（Ｃｏｙｎｅ ＴＭ）、マーカス・エージェイ（Ｍａｒｃｕｓ ＡＪ）、ウッドベリ・ディー（Ｗｏｏｄｂｕｒｙ Ｄ）、ブラック・アイビー（Ｂｌａｃｋ ＩＢ）：マロウ・ストローマ・セルズ・トランスプランテッド・ツー・ザ・アダルト・ブレイン・アー・リジェクテッド・バイ・アン・インフラメトリー・レスポンス・アンド・トランスファー・ドナー・ラベルズ・ツー・ホスト・ニューロンズ・アンド・グリア（Ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｂｒａｉｎ ａｒｅ ｒｅｊｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄｏｎｏｒ ｌａｂｅｌｓ ｔｏ ｈｏｓｔ ｎｅｕｒｏｎｓ ａｎｄ ｇｌｉａ）。ステム・セルズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）．２０１３年２４：ｐ２４８３〜２４９２．

【非特許文献10】バーンズ・ティーシー（Ｂｕｒｎｓ ＴＣ）、オルティス・ゴンザレス・エックスアール（Ｏｒｔｉｚ−Ｇｏｎｚａｅｌｅｚ ＸＲ）、グティエレス・ペレス・エム（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｐｅｒｅｚ Ｍ）、キーン・シーディー（Ｋｅｅｎｅ ＣＤ）、シャルダ・アール（Ｓｈａｒｄａ Ｒ）、デモレスト・ゼットエル（Ｄｅｍｏｒｅｓｔ ＺＬ）、チャン・ワイ（Ｊｉａｎｇ Ｙ）、ネルソン・ホルテ・エム（Ｎｅｌｓｏｎ−Ｈｏｌｔｅ Ｍ）、ソリアーノ・エム（Ｓｏｒｉａｎｏ Ｍ）、ナカガワ・ワイ（Ｎａｋａｇａｗａ Ｙ）、ルクイン・エムアール（Ｌｕｑｕｉｎ ＭＲ）、ガルシア・ベルヅゴ・ジェイエム（Ｇａｒｃｉａ−Ｖｅｒｄｕｇｏ ＪＭ）、プロエスパー・エフ（Ｐｒｏｅｓｐｅｒ Ｆ）、ロウ・ダブリュシー（Ｌｏｗ ＷＣ）、ヴェルファイリー・シーエム（Ｖｅｒｆａｉｌｌｉｅ ＣＭ）：チミジン・アナログズ・アー・トランスファード・フローム・プレラベルド・ドナー・ツー・ホスト・セルズ・イン・ザ・セントラル・ナーバス・システム・アフター・トランスプランテーション：ア・ワード・オブ・コーション（Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ａｎａｌｏｇｓ ａｒｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ｐｒｅｌａｂｅｌｅｄ ｄｏｎｏｒ ｔｏ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ： ａ ｗｏｒｄ ｏｆ ｃａｕｔｉｏｎ）．ステム・セルズ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）．２００６年，２４：ｐ１１２１〜１１２７．

【非特許文献11】ユー・ピー・ジェイ（Ｙｕ ＰＪ）、フェラーリ・ジー（Ｆｅｒｒａｒｉ Ｇ）、ギャロウェー・エーシー（Ｇａｌｌｏｗａｙ ＡＣ）、ミグナッチ・ピー（Ｍｉｇｎａｔｔｉ Ｐ）、ピントゥッチ・ジー（Ｐｉｎｔｕｃｃｉ Ｇ）：ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター（エフギーエフ−ツー）：ザ・ハイ・モレキュラー・ウェイト・フォームズ・カム・オブ・エージ（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ （ＦＧＦ−２）：ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｆｏｒｍｓ ｃｏｍｅ ｏｆ ａｇｅ）．ジャーナル・オブ・セルラー・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）．２００７年、１００：ｐ１１００−１１０８．

【非特許文献12】ガデュセック・シーエム（Ｇａｊｄｕｓｅｋ ＣＭ）、カーボン・エス（Ｃａｒｂｏｎ Ｓ）：インジャリー・インデュースド・リリース・オブ・ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・フローム・ボバイン・アオルテック・エンドセリウム・（Ｉｎｊｕｒｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ａｏｒｔｉｃ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ）．ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）．１９８９年、１３９：ｐ５７０〜５７９．

【非特許文献13】マクネイル・ピーエル（ＭｃＮｅｉｌ ＰＬ）、ムスクリシュナン・エル（Ｍｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎ Ｌ）、ワルダー・イー（Ｗａｒｄｅｒ Ｅ）、ディー・アモーレ・ピーエー（Ｄ’Ａｍｏｒｅ ＰＡ）：グロース・ファクター・アー・リリースド・バイ・メカニカリー・ワウンデッド・エンドセリアル・セルズ（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｒｅ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｂｙ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌｌｙ ｗｏｕｎｄｅｄ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）．ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．１９８９年、１０９：ｐ８１１〜８２２．

【非特許文献14】ディー・アモーレ・ピーエー（Ｄ’Ａｍｏｒｅ ＰＡ）：モーズ・オブ・エフジーエフ・リリース・イン・ビボ・アンド・イン・ビトロ（Ｍｏｄｅｓ ｏｆ ＦＧＦ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）．キャンサー・アンド・メタスタシス・レビューズ（Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖｉｅｗｓ）．１９９０年、９：ｐ２２７〜２３８．

【非特許文献15】ムスクリシュナン・エル（Ｍｕｔｈｕｋｒｉｓｈｎａｎ Ｌ）、ウェルダー・イー（Ｗａｒｄｅｒ Ｅ）、マクネイル・ピーエル（ＭｃＮｅｉｌ ＰＬ）：ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・イズ・エフィシエントリー・リリースド・フローム・ア・サイトルソリック・ストレージ・サイト・スルー・プラズマ・メンブラン・ディスラプションズ・オブ・エンドリアル・セルズ（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃｙｔｏｌｓｏｌｉｃ ｓｔｏｒａｇｅ ｓｉｔｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｐｌａｓｍａ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）．ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）．１９９１年、１４８：ｐ１〜１６．

【非特許文献16】ブルナー・ジー（Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｇ）、ガブリラブ・ジェイ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｅ Ｊ）、リフキ・ディービー（Ｒｉｆｋｉｎ ＤＢ）、ウィルソン・イーエル（Ｗｉｌｓｏｎ ＥＬ）：ホスホリパーゼ・シー・リリース・オブ・バーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・フローム・ヒューマン・ボーン・マロウ・カルチャーズ・アズ・ア・バイオロジカリー・アクティブ・コンプレックス・ウイズ・ア・ホスファチジルイノシトール・アンカード・ヘパラン・サルフェート・プロテオグリカン（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ｃ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ａｓ ａ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ａ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ−ａｎｃｈｏｒｅｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）．ジャーナル・オブ・セルラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．１９９１年、１１４：ｐ１２７５〜１２８３．

【非特許文献17】ブルンナー・ジー（Ｂｒｕｎｎｅｒ Ｇ）、グエン・エイチ（Ｎｇｕｙｅｎ Ｈ）、ガブリラブ・ジェイ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｅ Ｊ）、リフキン・ディービー（Ｒｉｆｋｉｎ ＤＢ）、ウィルソン・イーエル（Ｗｉｌｓｏｎ ＥＬ）：ベージック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・エクスプレッション・イン・ヒューマン・ボーン・マロウ・アンド・ペリフェラル・ブラッド・セルズ（Ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）．ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）．１９９３年、８１：ｐ６３１〜６３８．

【非特許文献18】ベナベンテ・シーエー（Ｂｅｎａｖｅｎｔｅ ＣＡ）、シエラルタ・ダブルディー（Ｓｉｅｒｒａｌｔａ ＷＤ）、コンゲット・ピーエー（Ｃｏｎｇｅｔ ＰＡ）、ミングエル・ジェイジェイ（Ｍｉｎｇｕｅｌｌ ＪＪ）：サブセルラー・ディストリビューション・アンド・マイトジェニック・エフェクト・オブ・ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・イン・メセンカイマル・アンコミッテッド・ステム・セルズ（Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｔｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）．グロース・ファクターズ（Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ）．２００３年、２１：ｐ８７〜９４．

【非特許文献19】アイズマン・アイ（Ａｉｚｍａｎ Ｉ）、チルマラシェティ・ビージェイ（Ｔｉｒｕｍａｌａｓｈｅｔｔｙ ＢＪ）、マグロガン・エム（ＭｃＧｒｏｇａｎ Ｍ）、カセ・シーシー（Ｃａｓｅ ＣＣ）：コンパリソン・オブ・ザ・ニューロポイエティック・アクティビティ・オブ・ジーン・モディファイド・バーサス・パレンタル・メセンカイマル・ストローマル・セルズ・アンド・ザ・アイデンティフィケーション・オブ・ソルブル・アンド・エクストラセルラー・マトリックス・リレーテッド・ニューロポイエティック・メディエーターズ（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｖｅｒｓｕｓ ｐａｒｅｎｔａｌ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ−ｒｅｌａｔｅｄ ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｔｉｃ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）．ステム・セル・リサーチ・アンド・セラピー（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｓｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ）．２０１４年，５：ｐ２９．

【非特許文献20】ダオ・エム（Ｄａｏ Ｍ）、テート・シーシー（Ｔａｔｅ ＣＣ）、マグロガン・エム（ＭｃＧｒｏｇａｎ Ｍ）、ケース・シーシー（Ｃａｓｅ ＣＣ）：コンペアリング・ザ・アンギオゲニック・ポテンシー・オブ・ナイーブ・マロウ・ストローマル・セルズ・アンド・ノッチ・トランスフェクテッド・マロウ・ストローマル・セルズ（Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｃｙ ｏｆ ｎａｉｖｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｎｏｔｃｈ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ）．ジャーナル・オブ・トランスレーショナル・メディスン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）．２０１３年，１１：ｐ８１．

【非特許文献21】アイズマン・アイ（Ａｉｚｍａｎ Ｉ）、テート・シーシー（Ｔａｔｅ ＣＣ）、マクロガン・エム（ＭｃＧｒｏｇａｎ Ｍ）、ケース・シーシー（Ｃａｓｅ ＣＣ）：エクストラセルラー・マトリックス・プロデュースド・バイ・ボーン・マロウ・ストローマル・セルズ・アンド・バイ・ゼア・デリバティブ・エスビー６２３・セルズ・サポーツ・ニューラル・セル・グロース（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｂｙ ｔｈｅｉｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ，ＳＢ６２３ ｃｅｌｌｓ，ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ）．ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）．２００９年，８７：ｐ３１９８〜３２０６．

【非特許文献22】テート・シーシー（Ｔａｔｅ ＣＣ）、フォンク・シー（Ｆｏｎｃｋ Ｃ）、マグロガン・エム（ＭｃＧｒｏｇａｎ Ｍ）、ケース・シーシー（Ｃａｓｅ ＣＣ）：ヒューマン・メセンカイマル・ストローマル・セルズ・アンド・ゼア・デリバティブ・エスビー６２３・セルズ・レスキュー・ニューラル・セルズ・ビア・トロフィック・サポート・フォローイング・イン・ビトロ・イスケミア（Ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ，ＳＢ６２３ ｃｅｌｌｓ，ｒｅｓｃｕｅ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ ｖｉａ ｔｒｏｐｈｉｃ ｓｕｐｐｏｒｔ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｓｃｈｅｍｉａ）．セル・トランスプランテーション（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）．２０１０年，１９：ｐ９７３〜９８４．

【非特許文献23】アイズマン・アイ（Ａｉｚｍａｎ Ｉ）、マグロガン・エム（ＭｃＧｒｏｇａｎ Ｍ）、ケース・シーシー（Ｃａｓｅ ＣＣ）：クアンティタティブ・マイクロプレート・アッセイ・フォー・スタディイング・メセンカイマル・ストローマル・セル・インデュースド・ニューロポイエシス（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙｉｎｇ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）．ステム・セルズ・トランスレーショナル・メディシン（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）．２０１３年，２：ｐ２２３−２３２．

【非特許文献24】シィオン・ワイ（Ｘｉｏｎｇ Ｙ）、マムード・エー（Ｍａｈｍｏｏｄ Ａ）、チョップ・エム（Ｃｈｏｐｐ Ｍ）：アンギオゲネシス・ニューロジェネシス・アンド・ブレイン・リカバリー・オブ・ファンクション・フォローイング・インジャリー（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｒａｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｉｎｊｕｒｙ）．カレント・オピニオン・イン・インベスティゲーショナル・ドラッグス（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｄｒｕｇｓ）．２０１０年，１１：ｐ２９８−３０８．

【非特許文献25】ゴンザレス・エーエム（Ｇｏｎｚａｌｅｚ ＡＭ）、カーマン・エルエス（Ｃａｒｍａｎ ＬＳ）、オング・エム（Ｏｎｇ Ｍ）、レイ・ジェイ（Ｒａｙ Ｊ）、ゲージ・エフエイチ（Ｇａｇｅ ＦＨ）、シュルツ・シーダブリュ（Ｓｈｕｌｔｓ ＣＷ）、ベアード・エー（Ｂａｉｒｄ Ａ）：ストラージ・メタボリズム・アンド・プロセシング・オブ・１２５アイ−フィブロブラスト・グロース・ファクター−２・アフター・イントラセレブラル・インジェクション（Ｓｔｏｒａｇｅ，ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ １２５Ｉ−ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）．ブレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）．１９９４年、６６５：ｐ２８５−２９２．

【非特許文献26】リーケンズ・エス（Ｌｉｅｋｅｎｓ Ｓ）、クレルク・イーディー（Ｃｌｅｒｃｑ ＥＤ）、ネイツ・ジェイ（Ｎｅｙｔｓ Ｊ）：アンギオゲネシス：レギュレーターズ・アンド・クリニカル・アプリケーションズ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）．バイオケミカル・ファーマコロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）２００１年６１：ｐ２５３−２７０

【非特許文献27】リウ・エー（Ｌｉｅｗ Ａ）、オー・ブレイン・ティー（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ Ｔ）：セラピウティック・ポテンシャル・フォー・メセンカイマル・ステム・セル・トランスプランテーション・イン・クリティカル・リム・イスケミア（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｌｉｍｂ ｉｓｃｈｅｍｉａ）．ステム・セル・リサーチ・セラピー（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｈｅｒｅｒａｐｙ）．２０１２，３：ｐ２８．

【非特許文献28】マドリガル・エム（Ｍａｄｒｉｇａｌ Ｍ）、ラオ・ケーエス（Ｒａｏ ＫＳ）、リオーダン・エヌエイチ（Ｒｉｏｒｄａｎ ＮＨ）：ア・レビュー・オブ・セラピウティック・エフェクツ・オブ・メセンカイマル・ステム・セル・セクレションズ・アンド・インダクション・オブ・セクレタリー・モディフィケーション・バイ・ディファレント・カルチャー・メソッズ（Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄｓ）．ジャーナル・オブ・トランスレーショナル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）．２０１４年，１２：ｐ２６０．

【非特許文献29】ウイッテ・エル（Ｗｉｔｔｅ Ｌ）、フックス・ゼット（Ｆｕｋｓ Ｚ）、ハイモヴィッツ・フリードマン・エー（Ｈａｉｍｏｖｉｔｚ−Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ａ）、ブロダフスキー・アイ（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ Ｉ）、グッドマン・ディエス（Ｇｏｏｄｍａｎ ＤＳ）、エルド・エー（Ｅｌｄｏｒ Ａ）：エフェクツ・オブ・イラディエーション・オン・ザ・リリース・オブ・グロース・ファクターズ・フロム・カルチャード・ボバイン，ポーシン・アンド・ヒューマン・エンドセリアル・セルズ（Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｏｖｉｎｅ，ｐｏｒｃｉｎｅ，ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９８９年、４９：ｐ５０６６−５０７２．

【非特許文献30】ハートネット・エムイー（Ｈａｒｔｎｅｔｔ ＭＥ）、ガルシア・シーエム（Ｇａｒｃｉａ ＣＭ）、ディー・アモーレ・ピーエー（Ｄ’Ａｍｏｒｅ ＰＡ）：リリース・オブ・ビーエフジーエフ・アン・エンドセリアル・セル・サバイバル・ファクター・バイ・オスモティック・ショック（Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂＦＧＦ，ａｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｆａｃｔｏｒ，ｂｙ ｏｓｍｏｔｉｃ ｓｈｏｃｋ）．インベスティゲーティブ・オプサルモロジー・アンド・ビジュアル・サイエンス（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）１９９９，４０：ｐ２９４５−２９５１．

【非特許文献31】ベンザケン・エルアール（Ｂｅｎｚａｑｕｅｎ ＬＲ）、ニコルソン・ウェラー・エー（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ−Ｗｅｌｌｅｒ Ａ）、ハルパリン・ジェイエー（Ｈａｌｐｅｒｉｎ ＪＡ）：ターミナル・コンプリメント・プロテインズ・シー５ｂ−９・リリース・ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・アンド・プラテレット−デライブド・グロース・ファクター・フロム・エンドセリアル・セルズ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｃ５ｂ−９ ｒｅｌｅａｓｅ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｆｒｏｍ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ）．ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）．１９９４年、１７９：ｐ９８５−９９２．

【非特許文献32】チェン・ジーシー（Ｃｈｅｎｇ ＧＣ）、ブリッグス・ダブリュエイチ（Ｂｒｉｇｇｓ ＷＨ）、ゲルソン・ディーエス（Ｇｅｒｓｏｎ ＤＳ）、リビー・ピー（Ｌｉｂｂｙ Ｐ）、ゴジンスキ・エージェイ（Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｙ ＡＪ）、グレイ・エムエル（Ｇｒａｙ ＭＬ）、リー・アールティ（Ｌｅｅ ＲＴ）：メカニカル・ストレイン・タイトリィ・コントロールズ・フィブロブラスト・グロース・ファクター２・リリース・フロム・カルチャード・ヒューマン・バスキュラー・スムース・マッスル・セルズ（Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｔｒａｉｎ ｔｉｇｈｔｌｙ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ２ ｒｅｌｅａｓｅ ｆｒｏｍ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｈｕｍａｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）．サーキュレーション・リサーチ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）．１９９７，８０：ｐ２８−３６．

【非特許文献33】フクオ・ケー（Ｆｕｋｕｏ Ｋ）、イノウエ・ティ（Ｉｎｏｕｅ Ｔ）、モリモト・エス（Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｓ）、ナカハシ・ティ（Ｎａｋａｈａｓｈｉ Ｔ）、ヤスダ・オー（Ｙａｓｕｄａ Ｏ）、キタノ・エス（Ｋｉｔａｎｏ Ｓ）、ササダ・アール（Ｓａｓａｄａ Ｒ）、オギハラ・ティ（Ｏｇｉｈａｒａ Ｔ）：ニトリック・オキシド・メディエーツ・サイトトキシティ・アンド・ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・リリース・イン・カルチャード・バスキュラー・スムース・マッスル・セルズ：ア・ポッシブル・メカニズム・オブ・ネオバスキュラリゼーション・イン・アテロスクレロティック・プラークズ（Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ： ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｐｌａｑｕｅｓ）．ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ）．１９９５年、９５：ｐ６６９−６７６．

【非特許文献34】ケー・ディー（Ｋａｙｅ Ｄ）、ピメンタル・ディ（Ｐｉｍｅｎｔａｌ Ｄ）、プラサード・エス（Ｐｒａｓａｄ Ｓ）、マエキ・ティー（Ｍａｅｋｉ Ｔ）、バーガー・エイチジェイ（Ｂｅｒｇｅｒ ＨＪ）、マクネイル・ピーエル（ＭｃＮｅｉｌ ＰＬ）、スミス・ティーダブリュ（Ｓｍｉｔｈ ＴＷ）、ケリー・アールエー（Ｋｅｌｌｙ ＲＡ）：ロール・オブ・トランジエントリー・オルタード・サルコレンマル・メンブラン・パーメアビリティ・アンド・ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・リリース・イン・ザ・ハイパートロピック・レスポンス・オブ・アダルト・ラット・ベントリクユラー・マイオサイツ・ツー・インクリーズド・メカニカル・アクティビティ・イン・ビトロ（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ ａｌｔｅｒｅｄ ｓａｒｃｏｌｅｍｍａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ａｄｕｌｔ ｒａｔ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｍｙｏｃｙｔｅｓ ｔｏ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ）．ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔａｔｉｏｎ）．１９９６年、９７：ｐ２８１〜２９１．

【非特許文献35】クラーク・エムエスエフ（Ｃｌａｒｋｅ ＭＳＦ）、カルドウェル・アール・ダズリュ（Ｃａｌｄｗｅｌｌ ＲＷ）、チャオ・エイチ（Ｃｈｉａｏ Ｈ）、ミヤケ・ケー（Ｍｉｙａｋｅ Ｋ）、マクネイル・ピーエル（ＭｃＮｅｉｌ ＰＬ）：コントラクション・インデュースド・セル・ワンディング・アンド・リリース・オブ・フィブロブラスト・グロース・ファクター・イン・ハート（Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｗｏｕｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｈｅａｒｔ）．Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．１９９５年、７６：ｐ９２７−９３４．

【非特許文献36】スパジアリ・ジーエム（Ｓｐａｇｇｉａｒｉ ＧＭ）、カポビアンコ・エー（Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ Ａ）、ベチエッティ・エス（Ｂｅｃｃｈｅｔｔｉ Ｓ）、ミンガリ・エムシー（Ｍｉｎｇａｒｉ ＭＣ）、モレッタ・エル（Ｍｏｒｅｔｔａ Ｌ）：メセンカイマル・ステム・セル・ナチュラル・キラー・セル・インタラクションズ：エビデンス・ザット・アクチベーテッド・エヌケー・セルズ・アー・ケイパブル・オブ・キリング・エムエスシーズ、ホウェアアズ、エムエスシーズ・キャン・インヒビット・アイエル・ツー・インデュースド・エヌケー・セル・プロリフェラーション（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ−ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｔｈａｔ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＮＫ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｋｉｌｌｉｎｇ ＭＳＣｓ， ｗｈｅｒｅａｓ ＭＳＣｓ ｃａｎ ｉｎｈｉｂｉｔ ＩＬ−２−ｉｎｄｕｃｅｄ ＮＫ−ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）．ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）．２０１３年１０７：ｐ１４８４−１４９０．

【非特許文献37】レーマーリング・ヴァン・リジン・エム（Ｒｏｅｍｅｌｉｎｇ−ｖａｎ Ｒｈｉｊｎ Ｍ）、レインダーズ・エムイー（Ｒｅｉｎｄｅｒｓ ＭＥ）、フランケサ・エム（Ｆｒａｎｑｕｅｓａ Ｍ）、エンゲラ・エーユー（Ｅｎｇｅｌａ ＡＵ）、コレバール・エスエス（Ｋｏｒｅｖａａｒ ＳＳ）、ロエロフス・エイチ（Ｒｏｅｌｏｆｓ Ｈ）、ジェネバー・ピージー（Ｇｅｎｅｖｅｒ ＰＧ）、イジェルマンズ・ジェイエヌ（Ｉｊｚｅｒｍａｎｓ ＪＮ）、ベジェス・エムジー（Ｂｅｔｊｅｓ ＭＧ）、バーン・シーシー（Ｂａａｎ ＣＣ）、ワイマール・ダブリュ（Ｗｅｉｍａｒ Ｗ）、フーグドゥイジン・エムジェイ（Ｈｏｏｇｄｕｉｊｎ ＭＪ）：ヒューマン・アロゲネニック・ボーン・マロウ・アンド・アディポーズ・ティッシュー・デライブド・メセンカイマル・ストローマル・セルズ・インデュース・ＣＤ８＋・サイトトキシック・ティー・セル・リアクティビティ（Ｈｕｍａｎ Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ ａｎｄ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｄｕｃｅ ＣＤ８＋ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）．ジャーナル・オブ・ステム・セル・リサーチ・アンド・セラピー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ）．２０１３年３（補遺６）：００４．

【非特許文献38】バーム・ケーピー（Ｂｒｕｍｍ ＫＰ）、ペルテン・ジェイイー（Ｐｅｒｔｈｅｎ ＪＥ）、リウ・ティーティー（Ｌｉｕ ＴＴ）、ハイスト・エフ（Ｈａｉｓｔ Ｆ）、アヤロン・エル（Ａｙａｌｏｎ Ｌ）、ラブ・ティ（Ｌｏｖｅ Ｔ）：アン・アーテリアル・スピン・ラベリング・インベスティゲーション・オブ・セレブラル・ブラッド・フロー・デフィシッツ・イン・クロニック・ストローク・サバイバーズ（Ａｎ ａｒｔｅｒｉａｌ ｓｐｉｎ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｏｋｅ ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ）．ニューロイメージ（Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｅ）．２０１０年，５１：ｐ９９５−１００５．

【非特許文献39】リチャードソン・ジェイディ（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ＪＤ）、ベーカー・ジェイエム（Ｂａｋｅｒ ＪＭ）、モルガン・ピーエス（Ｍｏｒｇａｎ ＰＳ）、ローデン・シー（Ｒｏｒｄｅｎ Ｃ）、ボーニヤ・エル（Ｂｏｎｉｌｈａ Ｌ）、フレドリクソン・ジェイ（Ｆｒｉｄｒｉｋｓｓｏｎ Ｊ）．セレブラル・パーフュージョン・イン・クロニック・ストローク：インプリケーションズ・フォー・リージョン・シンプトム・マッピング・アンド・ファンクショナル・エムアールアイ（Ｃｅｒｅｂｒａｌ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎ ｃｈｒｏｎｉｃ ｓｔｒｏｋｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｌｅｓｉｏｎ−ｓｙｍｐｔｏｍ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＭＲＩ）．ビヘビオウラル・ニューロロジー（Ｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）．２０１１年、２４：ｐ１１７−１２２．

【非特許文献40】イケダ・エヌ（Ｉｋｅｄａ Ｎ）、ノノグチ・エヌ（Ｎｏｎｏｇｕｃｈｉ Ｎ）、チャオ・エムゼット（Ｚｈａｏ ＭＺ）、ワタナベ・ティ（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ）、カジモト・ワイ（Ｋａｊｉｍｏｔｏ Ｙ）、フルタマ・ディ（Ｆｕｒｕｔａｍａ Ｄ）、キムラ・エフ（Ｋｉｍｕｒａ Ｆ）、デザワ・エム（Ｄｅｚａｗａ Ｍ）、コフィン・アールエス（Ｃｏｆｆｉｎ ＲＳ）、オオツキ・ワイ（Ｏｔｓｕｋｉ Ｙ）、クロイワ・ティ（Ｋｕｒｏｉｗａ Ｔ）、ミヤタケ・エス（Ｍｉｙａｔａｋｅ Ｓ）：ボーン・マロウ・ストローマル・セルズ・ザット・エンハンスド・フィブロブラスト・グロース・ファクター−２・セクレション・バイ・ヘルペス・シンプレックス・ウイルス・ベクター・インプルーブ・ニューロロジカル・アウトカム・アフター・トランジエント・フォーカル・セレブラル・イスケミア・イン・ラッツ（Ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−２ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｂｙ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔｓ）．ストローク（Ｓｔｒｏｋｅ）．２００５年３６：ｐ２７２５−２７３０．

【非特許文献41】フジワラ・ケイ（Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｋ）、データ・アイ（Ｄａｔｅ Ｉ）、シンゴ・ティ（Ｓｈｉｎｇｏ Ｔ）、ヨシダ・エイチ（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｈ）、コバヤシ・ェイ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｋ）、タケウチ・エー（Ｔａｋｅｕｃｈｉ Ａ）、ヤノ・エー（Ｙａｎｏ Ａ）、タミヤ・ティ（Ｔａｍｉｙａ Ｔ）、オオモト・ティ（Ｏｈｍｏｔｏ Ｔ）：リダクション・オブ・インファークト・ボリューム・アンド・アポトーシス・バイ・グラフティング・オブ・エンカプスレーテッド・ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・セクレチング・セルズ・イン・ア・モデル・オブ・ミドル・セレブラル・アーテリイ・オクルージョン・イン・ラッツ（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｂｙ ｇｒａｆｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｉｎ ｒａｔｓ）．ジャーナル・オブ・ニューロサージェリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ）．２００３年、９９：ｐ１０５３−１０６２．

【非特許文献42】ワタナベ・ティ（Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ）、オクダ・ワイ（Ｏｋｕｄａ Ｙ）、ノノグチ・エヌ（Ｎｏｎｏｇｕｃｈｉ Ｎ）、チャオ・エムゼット（Ｚｈａｏ ＭＺ）、カジモト・ワイ（Ｋａｊｉｍｏｔｏ Ｙ）、フルタマ・ディ（Ｆｕｒｕｔａｍａ Ｄ）、ユカワ・エイチ（Ｙｕｋａｗａ Ｈ）、シバタ・エムエー（Ｓｈｉｂａｔａ ＭＡ）、オオツキ・ワイ（Ｏｔｓｕｋｉ Ｙ）、クロイワ・ティ（Ｋｕｒｏｉｗａ Ｔ）、ミヤタケ・エス（Ｍｉｙａｔａｋｅ Ｓ）．ポストイスケミック・イントラベントリキュラー・アドミニストレーション・オブ・エフジーエフ−２・エクスプレッシング・アデノバイラル・ベクターズ・インプローブズ・ニューロロジック・アウトカム・アンド・レデューシズ・インファークト・ボリューム・アフター・トランジエント・フォーカル・セレブラル・イスケミア・イン・ラッツ（Ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＦＧＦ−２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｆａｒｃｔ ｖｏｌｕｍｅ ａｆｔｅｒ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔｓ）．ジャーナル・オブ・セレブラル・ブラッド・フロー・アンド・メタボリズム（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）．２００４年，２４：ｐ１２０５−１２１３．

【非特許文献43】ワン・ゼットエル（Ｗａｎｇ ＺＬ）、チェン・エスエム（Ｃｈｅｎｇ ＳＭ）、マ・エムエム（Ｍａ ＭＭ）、マ・ワイピー（Ｍａ ＹＰ）、ヤン・ジェイピー（Ｙａｎｇ ＪＰ）、スー・ジーエル（Ｘｕ ＧＬ）、リュー・エックスエフ（Ｌｉｕ ＸＦ）：イントラナーザリイ・デリヴァード・ビーエフジーエフ・エンハンシーズ・ニューロジェネシス・イン・アダルト・ラッツ・フォローイング・セレブラル・イスケミア（Ｉｎｔｒａｎａｓａｌｌｙ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ｂＦＧＦ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ａｄｕｌｔ ｒａｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ）．ニューロサイエンス・レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ）．２００８ ４４６：ｐ３０−３５．

【非特許文献44】リー・キュー（Ｌｉ Ｑ）、ステファンソン・ディー（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｄ）：ポストイスケミック・アドミニストレーション・オブ・ベーシック・フィブロブラスト・グロース・ファクター・インプルーブス・センソリモーター・ファンクション・アンド・レデューシズ・インファークト・サイズ・フォローイング・パーマネント・フォーカル・セレブラル・イスケミア・イン・ザ・ラット（Ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｓｅｎｓｏｒｉｍｏｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｆａｒｃｔ ｓｉｚｅ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｐｅｒｍａｎｅｎｔ ｆｏｃａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ）．エクスペリメンタル・ニューロロジー（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）．２００２，１７７：ｐ５３１−５３７．

【非特許文献45】ボグスラフスキー・ジェイ（Ｂｏｇｏｕｓｓｌａｖｓｋｙ Ｊ）、ビクター・エスジェイ（Ｖｉｃｔｏｒ ＳＪ）、サリナス・イーオー（Ｓａｌｉｎａｓ ＥＯ）、パライ・エー（Ｐａｌｌａｙ Ａ）、ドナン・ジーエー（Ｄｏｎｎａｎ ＧＡ）、フィエスキ・シー（Ｆｉｅｓｃｈｉ Ｃ）、カステ・エム（Ｋａｓｔｅ Ｍ）、オルゴゴソ・ジェイエム（Ｏｒｇｏｇｏｚｏ ＪＭ）、チャモロ・エー（Ｃｈａｍｏｒｒｏ Ａ）、デスメット・エー（Ｄｅｓｍｅｔ Ａ）；ヨーロピアン・オーストリアン・フィブラスト（トラフェルミン）イン・アキュート・ストローク・グループ）：フィブラスト（トラフェルミン）イン・アキュート・ストローク：リザルツ・オブ・ザ・ヨーロピアン−オーストラリアン・フェーズＩＩ／ＩＩＩ・セーフティ・アンド・エフィカシー・トライアル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ−Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｆｉｂｌａｓｔ（Ｔｒａｆｅｒｍｉｎ） ｉｎ Ａｃｕｔｅ Ｓｔｒｏｋｅ Ｇｒｏｕｐ）： Ｆｉｂｌａｓｔ （ｔｒａｆｅｒｍｉｎ） ｉｎ ａｃｕｔｅ ｓｔｒｏｋｅ： ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ−Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ ｐｈａｓｅ ＩＩ／ＩＩＩ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｔｒｉａｌ．セレブロバスキュラー・ディジーズ（Ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ）．２００２年，１４：ｐ２３９−２５１．

【非特許文献46】ブ・キュー（Ｖｕ Ｑ）、シェ・ケー（Ｘｉｅ Ｋ）、エッカート・エム（Ｅｃｋｅｒｔ Ｍ）、チャオ・ダブリュ（Ｚｈａｏ Ｗ）、クラーマー・エスシー（Ｃｒａｍｅｒ ＳＣ）：メタ−アナリシス・オブ・プレクリニカル・スタディーズ・オブ・メセンカイマル・ストローマル・セルズ・フォー・イスケミック・ストローク（Ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｓｔｒｏｋｅ）．ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）．２０１４年，８２：ｐ１２７７−１２８６．

【非特許文献47】ミシュラ・ピージェイ（Ｍｉｓｈｒａ ＰＪ）、ミシュラ・ピージェイ（Ｍｉｓｈｒａ ＰＪ）、バネルジー・ディ（Ｂａｎｅｒｊｅｅ Ｄ）：セル・フリー・デリバティブズ・フロム・メセンカイマル・ステム・セルズ・アー・エフェクティブ・イン・ワウンド・セラピー（Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｗｏｕｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ）．ワールド・ジャーナル・オブ・ステム・セルズ（Ｗｏｒｌｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ）．２０１２年，４：ｐ３５−４３。

【非特許文献48】パレカダン・ビー（Ｐａｒｅｋｋａｄａｎ Ｂ）、ヴァン・ポール・ディ（ｖａｎ Ｐｏｌｌ Ｄ）、サガヌマ・ケイ（Ｓｕｇａｎｕｍａ Ｋ）、カーター・イーエー（Ｃａｒｔｅｒ ＥＡ）、バーサウム・エフ（Ｂｅｒｔｈｉａｕｍｅ Ｆ）、チッレス・エーダブリュ（Ｔｉｌｌｅｓ ＡＷ）、ヤルムシュ・エムエル（Ｙａｒｍｕｓｈ ＭＬ）：メセンカイマル・ステム・セル−デライブド・モレキュラーズ・リザーブ・フルミナント・ヘパティック・フェイラー（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｆｕｌｍｉｎａｎｔ Ｈｅｐａｔｉｃ Ｆａｉｌｕｒｅ）．プロス・ワン（ＰＬｏＳ ＯＮＥ）．２００７年、２：ｅ９４１．

【非特許文献49】チャオ・ジェイ（Ｊｉａｏ Ｊ）、ミルウィド・ジェイエム（Ｍｉｌｗｉｄ ＪＭ）、ヤルムシュ・エムエル（Ｙａｒｍｕｓｈ ＭＬ）、パレカダン・ビー（Ｐａｒｅｋｋａｄａｎ Ｂ）：ア・メセンカイマル・ステム・セル・ポテンシー・アッセイ（Ａ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｏｔｅｎｃｙ Ａｓｓａｙ）．メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）．２０１１年、６７７：ｐ２２１−２３１．

【非特許文献50】リュー・エス（Ｌｉｕ Ｓ）、チャン・エル（Ｊｉａｎｇ Ｌ）、リー・エイチ（Ｌｉ Ｈ）、シャイ・エイチ（Ｓｈｉ Ｈ）、ルオ・エイチ（Ｌｕｏ Ｈ）、チャン・ワイ（Ｚｈａｎｇ Ｙ）、ユー・シー（Ｙｕ Ｃ）、ジン・ワイ（Ｊｉｎ Ｙ）：メセンカイマル・ステム・セルズ・プレベント・ハイパートロピック・スカー・フォーメーション・ビア・インフラマトリー・レギュレーション・フェン・アンダーゴーイング・アポトーシス（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｖｅｎｔ ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｖｉａ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｗｈｅｎ ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）．ジャーナル・オブ・インベスティゲーティブ・デルマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）．２０１４年，１３４：ｐ２６４８−２６５７．

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ）は、ＦＧＦ２の細胞内貯蔵庫を備える；しかし、培養中では極めてわずかな細胞内ＦＧＦ２しか分泌されない。むしろ、間葉細胞に対する損傷、またはその死滅は、それらの細胞内ＦＧＦ２の放出を生じる。研究者らは、間葉細胞がＦＧＦ２の特に大きい細胞内貯蔵庫を備え、これは、放出の際、多数のインビトロのモデル系において隣接の細胞または組織に対して神経新生性及び血管形成性効果の効果を発揮し得ることを発見した。さらに、間葉細胞は、ＦＧＦ２アイソフォームの混合物を含み、アイソフォームのこの混合物は、単一のアイソフォーム（すなわち、組み換えＦＧＦ２）よりも大きい生物学的活性を保有する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

従って、本開示は、とりわけ、以下の実施形態を提供する。

【0012】

１．神経前駆細胞または内皮細胞の増殖を誘導するための方法であって、細胞溶解液、可溶性無細胞抽出物及び不溶性細胞残渣からなる群より選択される、間葉細胞から得られる調製物と、神経前駆細胞または内皮細胞とを接触させるステップを包含する、方法。

【0013】

２．星状細胞前駆細胞の星状細胞への発達を誘導するための方法であって、上記星状細胞前駆細胞と、生きた間葉細胞及び間葉細胞の細胞溶解液の混合物とを接触させるステップを包含する、方法。

【0014】

３．細胞または組織に対してＦＧＦ２アイソフォームの混合物を提供するための方法であって、細胞溶解液、可溶性無細胞抽出物及び不溶性細胞残渣からなる群より選択される、間葉細胞から得られる調製物と、上記細胞または組織とを接触させるステップを包含す
る、方法。

【0015】

４．その必要な被験体に対してＦＧＦ２アイソフォームの混合物を送達するための方法であって、細胞溶解液、可溶性無細胞抽出物及び不溶性細胞残渣からなる群より選択される、間葉細胞から得られる調製物を、上記被験体に導入するステップを包含する、方法。

【0016】

５．上記混合物が、１８、２２、２２．５及び２４ｋＤの分子量を有するＦＧＦ２アイソフォームを含む、実施形態３に記載の方法。

【0017】

６．上記混合物が、１８、２２、２２．５及び２４ｋＤの分子量を有するＦＧＦ２アイソフォームを含む、実施形態４に記載の方法。

【0018】

７．上記混合物が、組み換えＦＧＦ２の活性よりも大きい生物学的活性を有する、実施形態３に記載の方法。

【0019】

８．上記混合物が、組み換えＦＧＦ２の活性よりも大きい生物学的活性を有する、実施形態４に記載の方法。

【0020】

９．上記細胞が、神経前駆細胞である、実施形態３に記載の方法。

【0021】

１０．上記細胞が、内皮細胞である、実施形態３に記載の方法。

【0022】

１１．上記被験体が、虚血性傷害を受けた、実施形態４に記載の方法。

【0023】

１２．上記虚血性傷害が、脳卒中である、実施形態１１に記載の方法。

【0024】

１３．上記組織が、壊死性である、実施形態３に記載の方法。

【0025】

１４．壊死が、梗塞または外傷から生じる、実施形態１３に記載の方法。

【0026】

１５．上記間葉細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、実施形態１に記載の方法。

【0027】

１６．上記間葉細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、実施形態２に記載の方法。

【0028】

１７．上記間葉細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、実施形態３に記載の方法。

【0029】

１８．上記間葉細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、実施形態４に記載の方法。

【0030】

１９．生物学的に活性なＦＧＦ２アイソフォームの混合物を組織に対して送達するための方法であって：
上記組織と間葉細胞とを接触させるステップを包含し；
上記接触が、間葉細胞の溶解または破裂を生じる、方法。

【0031】

２０．上記ＦＧＦ２アイソフォームが１８、２２、２２．５及び２４ｋＤの分子量を有する、実施形態１９に記載の方法。

【0032】

２１．上記混合物が、組み換えＦＧＦ２の活性よりも大きい生物学的な活性を有する、実施形態１９に記載の方法。

【0033】

２２．上記組織が、１つ以上の神経前駆細胞を含む、実施形態１９に記載の方法。

【0034】

２３．上記組織が、１つ以上の内皮細胞を含む、実施形態１９に記載の方法。

【0035】

２４．上記組織が、虚血性傷害を受けた被験体に存在する、実施形態１９に記載の方法。

【0036】

２５．上記虚血性傷害が脳卒中である、実施形態２４に記載の方法。

【0037】

２６．上記組織が壊死性である、実施形態１９に記載の方法。

【0038】

２７．壊死が、梗塞または外傷から生じる、実施形態２６に記載の方法。

【0039】

２８．上記間葉細胞が、線維芽細胞、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、実施形態１９に記載の方法。

【0040】

２９．神経前駆細胞または内皮細胞の増殖を刺激する方法における使用のための間葉細胞の無細胞抽出物であって、上記間葉細胞が、線維芽細胞、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、無細胞抽出物。

【0041】

３０．神経前駆細胞または内皮細胞の増殖を刺激する方法における使用のための間葉細胞の細胞溶解液であって、上記間葉細胞が、線維芽細胞、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、間葉細胞の細胞溶解液。

【0042】

３１．神経前駆細胞または内皮細胞の増殖を刺激する方法における使用のための間葉細胞の不溶性細胞残渣であって、上記間葉細胞が、線維芽細胞、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、間葉細胞の不溶性細胞残渣。

【0043】

３２．神経前駆細胞または内皮細胞の増殖を刺激する方法における使用のための組み合わせであって：
（ａ）線維芽細胞増殖因子−２（ＦＧＦ２）と、
（ｂ）間葉細胞由来の馴化培地と、を含み、ここで上記間葉細胞が線維芽細胞、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ＿ＭＳＣからなる群より選択される、組み合わせ。

【0044】

３３．上記ＦＧＦ２が、組み換え体である、実施形態３２に記載の組み合わせ。

【0045】

３４．上記ＦＧＦ２が、１８ｋｄのアイソフォームであり、実施形態３２に記載の組み合わせ。

【0046】

３５．星状細胞前駆細胞の星状細胞への発達を誘導する方法における使用のための組み合わせであって、上記組合せが：
（ａ）生きた間葉細胞であって、線維芽細胞、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される間葉細胞と；
（ｂ）間葉細胞から得られる調製物であって、細胞溶解液及び可溶性無細胞抽出物からなる群より選択される調製物と、
を含む、組み合わせ。

【0047】

３６．生細胞に対する上記溶解細胞等価物の比が、３：１である、実施形態３５に記載の組み合わせ。

【0048】

３７．その必要な細胞、組織または被験体に対して、ＦＧＦ２アイソフォームの混合物を提供する方法における使用のための間葉細胞から得られた調製物であって、
上記調製物は、細胞溶解液、可溶性無細胞抽出物及び不溶性細胞残渣からなる群より選択され；
さらに、ここで上記間葉細胞は、線維芽細胞、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからなる群より選択される、調製物。

【0049】

３８．上記ＦＧＦ２アイソフォームの混合物が、１８、２２、２２．５及び２４ｋＤの分子量を有するＦＧＦ２アイソフォームを含む、実施形態３７に記載の調製物。

【0050】

３９．上記ＦＧＦ２アイソフォームの混合物が、組み換えＦＧＦ２よりも大きい生物学的な活性を有する、実施形態３７に記載の調製物。

【0051】

４０．上記細胞が、神経前駆細胞または内皮細胞である、実施形態３７に記載の調製物。

【0052】

４１．上記組織が、１つ以上の神経前駆細胞及び／または内皮細胞を含む、実施形態３７に記載の調製物。

【0053】

４２．上記組織または被験体が、虚血性傷害を受けた、実施形態３７に記載の調製物。

【0054】

４３．上記虚血性傷害が脳卒中である、実施形態４２に記載の調製物。

【0055】

４４．上記組織が壊死性である、実施形態３７に記載の調製物。

【0056】

４５．壊死が、梗塞または外傷から生じる、実施形態４４に記載の方法。

【0057】

４６．神経前駆細胞または内皮細胞の増殖を刺激する方法であって；神経前駆細胞または内皮細胞と、実施形態３２の組み合わせとを接触させるステップを包含する、方法。

【図面の簡単な説明】

【0058】

【図1】図１Ａ〜図１Ｃは、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣから得られた抽出物または馴化培地中のＦＧＦ２及びＬＤＨのレベルを示し、全ての値は、百万個の細胞から得ており、図１Ａは、ＦＧＦ２のＥＬＩＳＡによって測定した、ＭＳＣ（左側のバー）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ（右側のバー）からの凍結−解凍無細胞抽出物（Ｅ０抽出物）中のＦＧＦ２のレベルを示し、図１Ｂは、ＨＳ−ＦＧＦ２のＥＬＩＳＡによって測定した、ＭＳＣ（左側のバー）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ（右側のバー）由来の馴化培地（ＣＭ）中のＦＧＦ２のレベルを示し、図１Ｃは、ＭＳＣ（バーの左側の対）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ（バーの右側の対）における無細胞Ｅ０抽出物（各々の対における左側のバー）及び無細胞Ｅ１抽出物（各々の対における右側のバー）中のＬＤＨレベルを示し、バーは、７つの細胞ロットにまたがる平均に相当する。エラーバーは、標準偏差に相当する。

【図2】図２Ａ及び図２Ｂは、ＢＲＤＵ取り込みによってアッセイした神経細胞増殖の測定を示し、図２Ａは、ＭＳＣ由来の無細胞Ｅ０抽出物（黒塗り四角）または馴化培地（白抜き丸印）の漸増濃度に曝された神経細胞によるＢＲＤＵ取り込みのレベルを示し、図２Ｂは、抗ＦＧＦ２抗体（ｂＦＭ１）または対照の免疫グロブリン（ＩｇＧ１）の存在下で、０、５、または１５％の無細胞Ｅ０抽出物（それぞれ、０、０．０７または０．２ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２に対して等価）に暴露された神経細胞によるＢＲＤＵ取り込みのレベルを示す。

【図3】図３Ａ及び図３Ｂは、ＢＲＤＵ取り込みによってアッセイされる内皮細胞増殖の測定を示し、図３Ａは、ＭＳＣ由来の漸増濃度の無細胞Ｅ０抽出物（黒塗り四角）または馴化培地（ｆｉｌｌｅｄ ｔｒｉａｎｇｌｅｓ）に対して暴露されたＨＵＶＥＣによるＢＲＤＵ取り込みのレベルを示す。ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ（ＮＢ）培地（白抜き丸印）を、陰性対照として用い、図３Ｂは、対照のＨＵＶＥＣ（最も左側のバー）、１０ｎｇ／ｍｌの組み換え血管内皮増殖因子に暴露されたＨＵＶＥＣ（ｒＶＥＧＦ、左から２番目のバー）、及び１ｎｇ／ｍｌの組み換え線維芽細胞増殖因子−２に暴露されたＨＵＶＥＣ（ｒＦＧＦ２、左から３番目のバー）、によるＢＲＤＵ取り込みのレベルを示す。また、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の１５％無細胞Ｅ０抽出物に暴露されたＨＵＶＥＣ（右から三番目のバー）、対照の免疫グロブリンの存在下でＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の１５％無細胞Ｅ０抽出物に暴露されたＨＵＶＥＣ（ＩｇＧ１、右から二番目のバー）、または抗ＦＧＦ２抗体の存在下におけるＤＮＴＴ−ＭＳＣの由来の１５％無細胞Ｅ０抽出物に暴露されたＨＵＶＥＣ（ｂＦＭ１、最も右側のバー）、によるＢＲＤＵ取り込みのレベルも示される。

【図4】図４Ａ〜図４Ｅは、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の生細胞、死滅細胞懸濁物（すなわち、細胞溶解液）及び無細胞抽出物によって誘導された神経及びグリアのマーカーの発現レベルを示し、図４Ａは、生きたＤＮＴＴ−ＭＳＣ（Ａ）、死滅（凍結−解凍した）ＤＮＴＴ−ＭＳＣ（すなわち、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ細胞溶解液）（Ｄ）、またはＤＮＴＴ−ＭＳＣの無細胞抽出物（Ｅ）を含むラット皮質細胞培養物中で発現されるラットネスチンのレベルを示す。各々のアッセイで用いられるＤＮＴＴ−ＭＳＣまたは細胞等価物の数は、示したとおり１２５、２５０または５００であり、図４Ｂは、生きたＤＮＴＴ−ＭＳＣ（Ａ）、死滅（凍結−解凍した）ＤＮＴＴ−ＭＳＣ（すなわち、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ細胞溶解液）（Ｄ）、またはＤＮＴＴ−ＭＳＣの無細胞抽出物（Ｅ）を含むラット皮質細胞培養物（図４Ａでアッセイされたのと同じ培養物）中で発現されるラットＧＦＡＰのレベルを示す。各々のアッセイで用いられるＤＮＴＴ−ＭＳＣまたは細胞等価物の数は、示したとおり１２５、２５０または５００であり、図４Ｃは、生きたＤＮＴＴ−ＭＳＣ（Ａ）、死滅（凍結−解凍した）ＤＮＴＴ−ＭＳＣ（すなわち、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ細胞溶解液）（Ｄ）、またはＤＮＴＴ−ＭＳＣの無細胞抽出物（Ｅ）を含むラット皮質細胞培養物（図４Ａでアッセイされたのと同じ培養物）中で発現されるヒトＧＡＰのレベルを示す。各々のアッセイで用いられるＤＮＴＴ−ＭＳＣまたは細胞等価物の数は、示したとおり１２５、２５０または５００であり、図４Ｄは、生きたＤＮＴＴ−ＭＳＣ（Ａ）、死滅（凍結−解凍した）ＤＮＴＴ−ＭＳＣ（すなわち、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ細胞溶解液）（Ｄ）、または生きた及び死滅のＤＮＴＴ−ＭＳＣの混合物（Ｄ／Ａ）を含むラット皮質細胞培養物中で発現されるラットＧＦＡＰのレベルを示す。ＤＮＴＴ−ＭＳＣまたは細胞等価物の数は、Ｘ軸にそって示し、図４Ｅは、生きたＤＮＴＴ−ＭＳＣ（Ａ）、死滅ＤＮＴＴ−ＭＳＣ（すなわち、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ細胞溶解液）（Ｄ）、または生きた及び死滅のＤＮＴＴ−ＭＳＣの混合物（Ｄ／Ａ）を含むラット皮質細胞培養物（図４Ｄでアッセイしたのと同じ培養物）中で発現されるヒトＧＡＰのレベルを示す。ＤＮＴＴ−ＭＳＣまたは細胞等価物の数は、Ｘ軸に沿って示す。

【図5】図５Ａ及び図５Ｂは、細胞溶解（ＬＤＨの放出によって測定した）ならびにＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ（ＰＢＭＣと同時培養した）からのＦＧＦ２放出の程度を示し、図５Ａは、１８時間の間、ＰＢＭＣとの標的細胞の同時培養後、標的細胞由来の培養培地中に放出された総細胞内ＬＤＨのパーセンテージ（最も左側、各々の対における影付きのバー）、及び標的細胞の同じ調製物由来の培養培地中へ放出された総細胞内ＦＧＦ２のパーセンテージ（最も右側、各々の対における黒塗りのバー）を示す。標的細胞は、ＭＳＣ（Ｍ）及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ（Ｓ）であった。ＰＢＭＣは、３０：１（３０×Ｐ）及び１０：１（１０×Ｐ）というＰＢＭＣ：標的細胞比で標的細胞と同時培養し、図５Ｂは、標的細胞、溶解された標的細胞及び同時培養の培養物中のＦＧＦ２濃度を示す。インタクトな標的細胞は、ＭＳＣ（Ｍ）またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ（Ｓ）であった。標的細胞は、１％のＴｒｉｔｏｎ中で溶解した（「Ｍ溶解」及び「Ｓ溶解」）。同時培養物は、標的細胞に対して１０倍（１０×Ｐ）または３０倍（３０×Ｐ）過剰のいずれかのＰＢＭＣを含んだ。ＦＧＦ２濃度はまた、３０×Ｐ同時培養サンプル（３０×ＰＢＭＣ）中に存在したのと同じ数のＰＢＭＣを含むＰＢＭＣのサンプル中でも測定した。

【図6】図６Ａ及び図６Ｂは、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの低酸素培養物中の細胞内及び細胞外のＦＧＦ２及びＬＤＨのレベルを示し、図６Ａは、低酸素条件下での培養開始（「０ｈ」）及びその後の種々の時点（４時間、２０時間、２日及び５日）の際のＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの培養物中の細胞内ＦＧＦ２（「ＦＧＦ２細胞内」、斜交平行線のバー）及び細胞外ＦＧＦ２（「ＦＧＦ２ ＣＭ」、黒塗りのバー）の濃度を示し、図６Ｂは、低酸素条件下での培養の開始（「０ｈ」）及びその後の種々の時点（４時間、２０時間、２日及び５日）の際のＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの培養物中の細胞内乳酸脱水素酵素（「細胞内ＬＤＨ」斜交平行線のバー）及び細胞外乳酸脱水素酵素（「ＬＤＨ ＣＭ」、黒塗りのバー）の濃度を示す。

【図7】図７Ａ及び図７Ｂは、ＢＲＤＵ取り込みによってアッセイした神経細胞増殖の測定を示し、図７Ａは、漸増濃度の組み換えＦＧＦ２に暴露された神経細胞による（ｒＦＧＦ２、三角）、及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の７５％馴化培地の存在下で漸増濃度の組み換えＦＧＦ２に暴露された神経細胞による（丸印）、ＢＲＤＵ取り込みのレベルを示す。また、ｒＦＧＦ２及びＣＭに対する応答が相加的であるという仮定に基づいて算出された仮説曲線（四角）を示し、図７Ｂは、漸増濃度のｒＦＧＦ２（０−１０ｎｇ／ｍｌ）；ＤＮＴＴ−ＭＳＣ（ＤＮＴＴ−ＭＳＣ−ＣＭ、７５％）由来の７５％馴化培地と一緒の漸増濃度のｒＦＧＦ２（０−１０ｎｇ／ｍｌ）、または漸増濃度のＤＮＴＴ−ＭＳＣ凍結／解凍抽出物（ＤＮＴＴ−ＭＳＣ−Ｅ０）に暴露された神経細胞によるＢＲＤＵ取り込みのレベルを示す。

【図8】図８は、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の細胞内ＦＧＦ２の、タンパク質ブロッティングによる解析を示す。ＦＧＦ２は、ｂＦＭ２抗ＦＧＦ２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いる、変性Ｔｒｉｓ−グリシンポリアクリルアミドゲルのブロットにおいて特定した。レーン１は、ＳＤＳ含有緩衝液中で細胞を溶解することによって得られた、ＳＢ６２３細胞由来の細胞丸ごとの細胞溶解液を含んだ。レーン２は、組み換えＦＧＦ２（約１ｎｇ／ｍｌ）を含んだ。ゲルの別のレーンで流れる、分子量マーカーの位置は、レーン１の左に示される。

【図9】図９は、変性ポリアクリルアミドゲルのタンパク質ブロットによって解析された、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ中のＦＧＦ２アイソフォームの細胞下分布を示し、レーン１は、３×１０４個のＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の総細胞溶解液を含んだ；レーン２は、１．５×１０４個のＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の細胞質画分を含んだ；レーン３は、１．５×１０４個のＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の核画分を含んだ；及びレーン４は、４×１０４個のＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の無細胞Ｅ０抽出物を含んだ。ゲルの別のレーンで流れる、分子量マーカーの位置は、レーン１の左に示される。上側のパネルは、抗ｈｓｐ９０抗体（Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いて検出された、細胞質マーカー、熱ショックタンパク質９０（ＨＳＰ９０）のレベルを示す。中央のパネルは、抗ＮＵＰ６２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を用いて検出された核マーカー、ヌクレオポリンｐ６２（ＮＵＰ６２）のレベルを示す。下側のパネルは、ｂＦＭ２抗ＦＧＦ２抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて検出されたＦＧＦ２アイソフォームのレベルを示す。

【図10A】ＭＳＣ及びヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）の比較を示し、ＨＦＦ及びＭＳＣ（Ｄ９４Ｍ）由来の画分中のＦＧＦ２のレベルを示す。アッセイされた画分は、細胞溶解液（「死滅（Ｄｅａｄ）」）、無細胞抽出物（「Ｅ０」）及び細胞残渣（「ペレット（Ｐｅｌｌｅｔ）」）である。

【図10B】ＭＳＣ及びヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）の比較を示し、ＨＦＦ及びＭＳＣ（Ｄ９４Ｍ）由来の、漸増濃度の細胞溶解液（「死滅懸濁（Ｄｅａｄ ｓｕｓｐ）」）、無細胞Ｅ０抽出物（「Ｅ０」）、及び再懸濁された細胞残渣（「ペレット懸濁物（Ｐｅｌｌｅｔ ｓｕｓｐ）」）に暴露された神経細胞中の神経細胞増殖（ＢｒｄＵ取り込みによって測定した）を示す。「添加無し（Ｎｏ ａｄｄ）」とは添加がないことを示す。

【図10C】ＭＳＣ及びヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）の比較を示し、ＭＳＣ細胞溶解液（Ｄ９４Ｍ−死滅（Ｄｅａｄ））、ＨＦＦ細胞溶解液（ＨＦＦ−死滅懸濁物（Ｄｅａｄ ｓｕｓｐ））及びＭＳＣ細胞残渣（Ｄ９４Ｍ−ペレット（ｐｅｌｌｅｔ））によって誘導される神経前駆細胞増殖に対するノギン（５０ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す（バーの各対の最も右側）。「添加無し（Ｎｏ ａｄｄ）」とは添加がないことを示す。

【図11】図１１は、生きたＭＳＣ、ならびにＭＳＣ及びＨＦＦ由来の無細胞凍結／解凍（Ｅ０）抽出物に暴露された皮質細胞の培養物中のネスチン（Ｎｅｓ，上側の左のパネル）、グリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、上側の右側パネル）、２’，３’−環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰ、下側の左側のパネル）及びダブルコルチン（ｄｃｘ、下側の右側のパネル）のレベルを示す。

【図12】神経前駆細胞の増殖の３倍の刺激をもたらす、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の無細胞Ｅ０抽出物中のＦＧＦ２レベルと、抽出物の有効濃度との間の関係を示す。

【発明を実施するための形態】

【0059】

本開示の実施には、他に示さない限り、細胞生物学、毒性学、分子生物学、生化学、細胞培養、免疫学、腫瘍学、組み換えＤＮＡの分野、及び当該分野の技術の範囲内である関連の分野における標準的な方法及び従来の技術を使用する。このような技術は、文献に記載されており、それによって、当業者に利用可能である。例えば、Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ」、第５版，Ｇａｒｌａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００８；Ｖｏｅｔ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｌｉｆｅ ａｔ ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｅｖｅｌ」、第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」，第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期的更新；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，第４版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｓｏｍｅｒｓｅｔ，ＮＪ，２０００；ならびにシリーズ「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと。

【0060】

本開示の目的に関しては、「血管形成」とは、新しい血管（例えば、血管；例えば、静脈、動脈、細静脈、細動脈、毛細血管）の形成を指す。血管形成は、既存の血管からの新規の血管の出芽によって、及び／または新しい血管を形成するための内皮細胞のインサイチュでの合体によって生じ得る。血管形成とはまた、マトリックスリモデリング及び細胞動員の付随するプロセス（例えば、平滑筋細胞、単球及び／または周皮細胞の動員）を含む。血管形成はさらに内皮細胞の増殖及び／または遊走を包含する。

【0061】

「神経新生」とは、ニューロン及び／またはグリア細胞（例えば、星状細胞、乏突起膠細胞）への神経前駆細胞（ＮＰＣ）の増殖及び／または分化を指す。神経新生過程の例としては、限定するものではないが、ＮＰＣ増殖、神経形成（例えば、新しいニューロンの形成）及びグリア細胞産生（例えば、星状細胞及び／または乏突起膠細胞の形成）が挙げられる。神経の発達に関連する他の過程としては、例えば、神経突起成長、軸索の成長、及び樹状突起の成長が挙げられる。

【0062】

「間葉細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｃｅｌｌ）」とは、間葉組織の細胞（例えば、軟骨芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨細胞、脂肪細胞）及びそれらの前駆体を指し、これ
には、例えば、線維芽細胞（例えば、ヒト包皮線維芽細胞）、ＭＳＣ（本明細書に定義される）、及びＭＳＣ由来の細胞、例えば、本明細書に定義されるＤＮＴＴ−ＭＳＣなどが挙げられる。

【0063】

「ＭＳＣ」（「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」）とは、骨髄から得られた付着の非造血性、多能性細胞を指す。これらの細胞は、間葉系幹細胞、間葉系間質細胞、骨髄付着間質細胞、骨髄付着幹細胞及び骨髄間質細胞として様々に公知である。ＭＳＣはまた、例えば、臍帯血、脂肪組織、歯髄、ウォートン・ジェリー及び種々の結合組織からも得られ得る。

【0064】

「ＤＮＴＴ−ＭＳＣ」（「ＮＩＣＤ一過性トランスフェクトＭＳＣの子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔｓ ｏｆ ＮＩＣＤ ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ＭＳＣ）」）及び「ＳＢ６２３細胞」という用語は、ＭＳＣにおける外因性ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の一過性の発現後に得られた細胞の集団を指す。例えば、ＤＮＴＴ−ＭＳＣの集団は、ＮＩＣＤ（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ１タンパク質由来）をコードするが、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質はコードしない配列を含むベクターを用いるＭＳＣの一過性のトランスフェクションによって、続いて選択によって（例えば、Ｇ４１８を用いる）得られ得る。この選択された細胞はさらに、なんら添加された増殖因子も分化因子も（もし血清が培養培地中に存在する場合、血清中に存在し得るもの以外は）存在せずに、必要に応じて血清を補充した、標準の培養培地中で培養される。

【0065】

「馴化培地」（ＣＭ）とは、細胞がインキュベートされ、引き続き、インキュベーション後に除去された細胞培養物培地を指す。除去とは、培地からの細胞の除去、または細胞からの培地の除去のいずれを含んでもよい。培地中のインキュベーションの間、細胞増殖は、培地の組成次第で、存在してもよいし、またはしなくてもよい。例えば、細胞は、無血清培地中で生きたまま残るが、増殖はしない。細胞が除去前に培地中でインキュベートされる時間の長さは、本明細書のいずれか他に示される。馴化培地は、その中でインキュベートされた細胞によって合成されるか、及び／または分泌される分子を含んでもよく、また培地中での細胞のインキュベーションの前に培地中に存在した成分を必要に応じて欠いてもよい。

【0066】

本開示の目的に関して、「死滅した細胞（ｄｅａｄ ｃｅｌｌ）」及び「細胞溶解液（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）」という用語は、細胞内容物が、もはやインタクトな細胞膜の内側に保持されないような、細胞の膜の完全性の破壊から生じる組成物を指して用いられる。上記細胞膜の破壊は、当該分野で公知の任意の方法によって、すなわち、機械的に（例えば、凍結−解凍、超音波、混合、剪断、ホモジナイズなどによって）、熱的に、化学的に、生化学的に、浸透圧的に、免疫学的に、細胞毒性的に、及びエバポレーションなどによって、生じ得る。従って、細胞溶解液は、種々の不溶性細胞構造及び可溶性細胞材料から構成される。従って、細胞溶解液の組成はさらに、２つのカテゴリー（「不溶性画分」及び「可溶性画分」）に分類され得る。この可溶性及び不溶性の成分は、例えば、遠心分離または濾過によって分離され得る。不溶性の成分は、遠心分離によってペレットにされるか、及び／またはフィルターによって保持されるが；可溶性の成分は、遠心分離及び／またはフィルターの通過の後に上清中に保持される。その不溶性成分はまた、「ペレット」画分と呼ばれても、または「細胞残渣」と呼ばれてもよい。同様に、可溶性成分はまた、「上清」画分と呼ばれても、または「無細胞抽出物」と呼ばれてもよい。

【0067】

「移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」及び「移植術（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、被験体への外因性細胞の導入を指して用いる。外因性細胞は、同種（すなわち、被験体から得られる）であっても、または異種（すなわち、被験体以外の個体から得られる）であってもよい。

【0068】

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
本開示は、とりわけ、被験体におけるＣＮＳ障害の部位に間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）を移植することにより生物学的に活性なＦＧＦ２を提供するための方法を提供する。ＭＳＣは、骨髄から付着細胞（すなわち、組織培養プラスチックに付着する細胞）を選択することにより（例えば、培養中での増殖により）得られる。治療における使用のための十分な数の細胞を有するＭＳＣ集団を得るには、付着細胞の集団を、付着についての選択後に培養中で増殖させる。混入する細胞（例えば、単球）は、培養条件下では増殖しないために、培養中での増殖はまた、ＭＳＣも富化する。

【0069】

ＭＳＣの例示的な開示は、米国特許出願公開第２００３／０００３０９０号；Ｐｒｏｃｋｏｐ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７１−７４及びＪｉａｎｇ（２００２）Ｎａｔｕｒｅ４１８：４１−４９において提供される。ＭＳＣの単離及び精製の方法は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号；Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１４３−１４７及びＤｅｚａｗａら（２００１）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：１７７１−１７７６に見ることができる。ヒトＭＳＣは、市販されているか（例えば、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）または例えば、骨髄吸引、その後の付着性骨髄細胞の培養及び選択によりドナーから得てもよい。例えば、国際公開第２００５／１００５５２号を参照のこと。

【0070】

ＭＳＣは、臍帯血から単離してもよい。例えば、Ｃａｍｐａｇｎｏｌｉら（２００１）Ｂｌｏｏｄ９８：２３９６〜２４０２；Ｅｒｉｃｅｓら（２０００）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１０９：２３５〜２４２及びＨｏｕら（２００３）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７８：２５６〜２６１を参照のこと。ＭＳＣの追加の供給源としては、例えば、脂肪組織、歯髄及びホウォートン・ゼリーが挙げられる。

【0071】

Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン
Ｎｏｔｃｈタンパク質（例えば、Ｎｏｔｃｈ１）は、すべての後生動物で見られる、細胞内シグナル伝達を通じて細胞分化に影響を及ぼす膜貫通受容体である。Ｎｏｔｃｈ細胞外ドメイン（例えば、Ｎｏｔｃｈ１タンパク質の細胞外ドメイン）のＮｏｔｃｈリガンド（例えば、デルタ（Ｄｅｌｔａ）、セレート（Ｓｅｒｒａｔｅ）、ジャグド（Ｊａｇｇｅｄ））との接触は、Ｎｏｔｃｈタンパク質の２つのタンパク質分解切断をもたらし、その２番目は、γ−セクレターゼにより触媒され、そして細胞質中にＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を放出する。マウスＮｏｔｃｈタンパク質において、この切断は、アミノ酸ｇｌｙ １７４３とｖａｌ １７４４との間で起こる。ＮＩＣＤは、核に移行し、そこで転写因子として働き、さらなる転写調節タンパク質（例えば、ＭＡＭ、ヒストンアセチラーゼ）を動員して、様々な標的遺伝子（例えば、Ｈｅｓ１）の転写抑制を緩和する。

【0072】

Ｎｏｔｃｈシグナル伝達に関するさらなる詳細及び情報は、例えば、Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８：２２５−２３２；Ｍｕｍｍ及びＫｏｐａｎ（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｂｉｏｌ．２２８：１５１〜１６５ならびにＥｈｅｂａｕｅｒら（２００６）Ｓｃｉ．ＳＴＫＥ ２００６（３６４），ｃｍ７．［ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｔｋｅ．３６４２００６ｃｍ７］において見出される。

【0073】

細胞培養及びトランスフェクション
細胞培養のための標準的な方法が、当該技術分野において公知である。例えば、Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ 「Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」，第５版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００５を参照のこと。

【0074】

細胞への外因性ＤＮＡの導入方法（すなわち、トランスフェクション）及びトランスフェクトされた細胞の分泌はまた、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７及び定期更新を参照のこと。

【0075】

ＤＮＴＴ−ＭＳＣ
ＤＮＴＴ−ＭＳＣは、ＭＳＣにおいてＮｏｔｃｈタンパク質の細胞内ドメインを一過性に発現することによって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）としても公知である、骨髄付着間質細胞から得られる。ＭＳＣにおけるＮｏｔｃｈ細胞内ドメイン（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ１タンパク質由来のＮＩＣＤ）の一過性発現は、ＭＳＣの集団をＤＮＴＴ−ＭＳＣの集団へ変換するのに十分である；増殖因子及び／または分化因子によるさらなる処置は必要とされない。従って、ＭＳＣの集団は、ＮＩＣＤをコードする（ただし全長Ｎｏｔｃｈタンパク質はコードしない）配列を含むベクターを用いるＭＳＣの一過性トランスフェクションにより、続いてベクターを含む細胞についての選択及び血清含有培地中での選択された細胞のさらなる培養により、追加の増殖及び／または分化の因子に対して曝されることなく、ＤＮＴＴ−ＭＳＣの集団に変換され得る。

【0076】

ＤＮＴＴ−ＭＳＣの調製に関する一実施形態では、ＭＳＣの培養物を、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）をコードする配列を含むポリヌクレオチドと接触させる；例えば、トランスフェクションによって；続いて、薬物選択及びさらなる培養によるトランスフェクトされた細胞の富化によって。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（２０１０年、３月、２３日）；米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）；及びＷＯ２００９／０２３２５１（２００９年２月１９日）（その全ての開示は、間葉系幹細胞の単離、及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ（それらの文書において「神経前駆細胞」及び「神経再生細胞」と示される）への間葉系幹細胞の変換を記述する目的のために、それらの全体が参照によって援用される。

【0077】

これらの方法では、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする任意のポリヌクレオチド（例えば、ベクター）を用いてもよく、トランスフェクトされた細胞の選択及び富化のための任意の方法を用いてもよい。例えば、特定の実施形態では、ＭＳＣは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ１細胞内ドメイン）をコードする配列を含み、かつ選択マーカーをコードする配列も含む（例えば、薬物耐性；例えば、Ｇ４１８に対する耐性）ベクターでトランスフェクトされる。追加の実施形態では、２つのベクター（１つは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含み、もう一方は、薬物耐性マーカーをコードする配列を含む）を、ＭＳＣのトランスフェクションに用いる。これらの実施形態では、ベクターを含まない細胞を殺傷するがベクターを含む細胞を殺さないのに十分な量で細胞培養物に対して選択剤（例えば、Ｇ４１８）を添加することによって、ベクター（単数または複数）を用いて細胞培養物のトランスフェクション後に、選択が達成される。選択がなければ、ベクターを含まない細胞を殺傷しないレベルまで、その選択剤の除去、またはその濃度の低下を必要とする。選択後（例えば、７日間）、選択剤は除去されて、細胞はさらに血清含有培養培地中で（例えば、２継代にわたって）培養される。

【0078】

用いられる選択マーカーの性質及び／または選択剤の濃度次第で、選択マーカーをコードするベクターを欠くあらゆる細胞が選択過程の間に殺傷されるのではないことも可能である。例えば、選択剤は、選択マーカーを含まない細胞の増殖を阻害し得、選択剤の除去後、細胞は、増殖を回復及び修復し得る。

【0079】

したがって、ＤＮＴＴ−ＭＳＣの調製は、ＭＳＣ中での外因性のＮｏｔｃｈ細胞内ドメインの一過性の発現を包含する。この目的を達成するために、ＭＳＣは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメイン（例えば、ヒトＮｏｔｃｈ１細胞内ドメイン）をコードする配列（この配列は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしない）を含むベクターでトランスフェクトされてもよい。このような配列の全てが周知であり、かつ当業者に容易に利用可能である。例えば、Ｄｅｌ Ａｍｏ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １５：２５９−２６４は、マウスＮｏｔｃｈタンパク質の完全なアミノ酸配列を示す；一方で、Ｍｕｍｍ及びＫｏｐａｎ（２０００）Ｄｅｖｅｌ．Ｂｉｏｌ．２２８：１５１〜１６５は、細胞内ドメインを放出する、いわゆるＳ３切断部位の周囲の、マウスＮｏｔｃｈタンパク質由来のアミノ酸配列を示す。まとめると、これらの引用文献は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質ではないＮｏｔｃｈ細胞内ドメインを含む各々のかつあらゆるペプチドを当業者に提供する；それによってまた、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしないＮｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含むあらゆるポリヌクレオチドを当業者に提供する。前述の文書（Ｄｅｌ Ａｍｏ及びＭｕｍｍ）は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列及びＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアミノ酸配列をそれぞれ開示する目的に関してその全体が参照によって援用される。

【0080】

同様の情報は、ラット、Ｘｅｎｏｐｕｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びヒトなどの追加の種由来のＮｏｔｃｈのタンパク質及び核酸に関して利用可能である。例えば、Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１３：１９９−２０５；Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９３：３８２−３８６；ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｎｏ． ＮＭ＿０１７１６７（及びその中で引用される引用文献）；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｐ４６５３１（及びその中で引用される引用文献）；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ０１７０５（及びその中で引用される引用文献）；及びＧｅｎＢａｎｋ ＣＡＢ４０７３３（及びその中で引用される引用文献）を参照のこと。前述の引用文献は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質のアミノ酸配列及びＮｏｔｃｈ細胞内ドメインのアミノ酸配列を多数の異なる種の中で開示する目的のためにその全体が参照によって援用される。

【0081】

追加の実施形態では、ＤＮＴＴ−ＭＳＣは、ＭＳＣ中へ、ＭＳＣが外因性のＮｏｔｃｈ細胞外ドメインを発現しないような、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列を含む核酸を導入することによって調製される。このようなことは、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインをコードする配列（この配列は、全長Ｎｏｔｃｈタンパク質をコードしない）を含むベクターでＭＳＣをトランスフェクトすることによって、例えば、達成され得る。

【0082】

ＤＮＴＴ−ＭＳＣの調製に対するさらなる詳細、及び本明細書に開示される方法で用いられ得るＤＮＴＴ−ＭＳＣの特性と同様の特性を有する細胞を作製するための方法は、米国特許第７，６８２，８２５号；及び米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４号（２０１０年１０月２１日）及び２０１１／０２２９４４２（２０１１年９月２２日）；その開示は、ＤＮＴＴ−ＭＳＣに対する追加の詳細、及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの調製のための代替法を提供する目的のために、ならびにＤＮＴＴ−ＭＳＣのものと同様の特性を有する細胞を作製するための方法を提供するために、本明細書において参照によって援用される。また、Ｄｅｚａｗａ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：１７０１−１７１０も参照のこと。

【0083】

間葉細胞のＦＧＦ２含量
ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの抽出物中のＦＧＦ２のレベルは、これらの細胞由来の馴化培地中でかなり高く、これによって、そのほとんどが分泌されない、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ中の生物学的に活性なＦＧＦ２の大きい細胞内デポの存在が示される。機械的に破裂されたＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣから得られた抽出物は、皮質神経前駆体細胞の
、及び臍静脈内皮細胞の濃度依存性の増殖を誘導し；かつＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ抽出物によって誘導される増殖は、抗ＦＧＦ２中和抗体によって阻害された。

【0084】

間葉細胞損傷に対する分泌によってＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣのいずれかから放出されるＦＧＦ２の量を測定して比較した。機械的な細胞損傷によって放出される内容物は、神経前駆細胞及び内皮細胞の両方の増殖を刺激するのにおいて高度に活性であることが本明細書で開示される。さらに、これらの細胞内の内容物の分裂促進活性は、細胞内ＦＧＦ２の放出に起因することが示された。脳内移植後にＭＳＣ死滅をもたらし得る、代替的な非機械的細胞損傷のモデルによって、かなりの量のＦＧＦ２がまたこれらのモデルで放出されること、及びＦＧＦ２放出がＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣの死滅と相関していることが実証された。最終的に、機械的に損傷された、及び生きた間葉細胞の同時培養は、相乗作用的に作用して、神経前駆体の分化に影響することが観察された。

【0085】

したがって、本開示は、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣは、例えば、機械的損傷、細胞媒介性の細胞毒性及び低酸素など種々の細胞損傷後に放出され得る、生物学的に活性なＦＧＦ２の大きい細胞内貯蔵を含み；その際、放出されるＦＧＦ２は、細胞増殖、壊死及び血管形成を刺激し得ることが示される。従って、とりわけ、神経前駆細胞の増殖及び分化を刺激するための方法、ならびに内皮細胞の増殖を刺激するための方法が、死滅間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ及び／またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）の提供によって、または間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ及び／またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）の可溶性及び／もしくは不溶性の細胞内抽出物の提供によって、提供される。神経及び内皮細胞の増殖を刺激するための、死滅間葉細胞（すなわち、細胞溶解液）、間葉細胞の可溶性無細胞抽出物、及び間葉細胞の不溶性細胞残渣もまた提供される。

【0086】

さらなる実施形態では、細胞、組織または被験体に対する生物学的に活性なＦＧＦ２（例えば、２つ以上のＦＧＦ２アイソフォームの混合物）を提供するための方法及び粗が提供される；ここで、この方法は、細胞、組織または被験体と、間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ及び／またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）由来の可溶性無細胞抽出物または不溶性細胞残渣とを接触させるステップを包含する；あるいは細胞、組織または被験体と死滅間葉細胞（例えば、死滅線維芽細胞、死滅ＭＳＣ及び／または死滅ＤＮＴＴ−ＭＳＣ）とを接触させることによる。

【0087】

追加の実施形態では、生きた間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ及び／またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）、及び間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ及び／またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）の無細胞抽出物の混合物を用いて、星状細胞への星状細胞前駆の分化を誘導してもよい。さらなる実施形態では、生きた間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ及び／またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）、及び間葉細胞の無細胞抽出物の混合物を含む組成物が提供される。

【0088】

さらなる実施形態では、生きた間葉細胞及び死滅間葉細胞（例えば、線維芽細胞、ＭＳＣ及び／またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）の混合物を用いて、星状細胞の発達を刺激してもよい。従って、生きた間葉細胞及び死滅間葉細胞の混合物もまた提供される。

【0089】

さらなる実施形態では、ＦＧＦ２（例えば、組み換えＦＧＦ２）及び間葉細胞由来の馴化培地の混合物を用いて、神経前駆細胞及び／または内皮細胞の増殖を刺激してもよい。従って、ＦＧＦ２（例えば、組み換えＦＧＦ２）及び間葉細胞由来の馴化培地の混合物もまた提供される。

【0090】

本明細書に開示される組成物は、虚血障害（例えば、脳卒中）の処置のため、及び壊死の処置のために用いられ得る。壊死は、とりわけ、梗塞（例えば、例えば、脳卒中後に生
じるような虚血）または損傷（例えば、外傷性脳損傷）によって生じ得る。従って、壊死組織の存在によって特徴付けられる壊死性の組織及び障害は、本明細書で開示される組成物で処置され得る。特定の実施形態では、本明細書で開示されるような組成物は、壊死性組織に隣接する可変組織へ（例えば、注射によって）移植される。従って、梗塞の場合は、その組成物は、梗塞の周囲の組織に移植される。

【0091】

製剤、キット及び投与経路
本明細書に開示されるような、間葉細胞を含む治療用組成物もまた、提供される。そのような組成物は、典型的には間葉細胞及び医薬的に許容される担体を含む。本明細書に開示される治療組成物は、とりわけ、梗塞、虚血損傷、壊死及び外傷後に必要であり得るような、神経前駆細胞及び／または内皮細胞の増殖及び分化の刺激のために有用である。従って、間葉細胞を含む組成物の「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、これらの目的に適切な任意の量であってもよく、かつその損傷の性質及び重篤度、被験体の体重及び全身的健康、ならびに当業者に公知である他の基準に基づいて決定され得る。例えば、投与量は、約１００；５００；１，０００；２，５００；５，０００；１０，０００；２０，０００；５０，０００；１００，０００；５００，０００；１，０００，０００；５，０００，０００〜１０，０００，０００個以上の細胞（またはそれらの間の任意の整数値）で変化し得；例えば、体重、投与経路、疾患の重篤度などに依存して、例えば、単回用量、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、１月に２回、１月に１回の投与頻度である。

【0092】

様々な医薬組成物ならびにそれらの調製及び使用のための技術は、本開示に照らして、当業者に公知である。適切な薬理的な組成物の詳細な列挙及びそれらの投与のための技術に関しては、テキスト、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１７版．１９８５；Ｂｒｕｎｔｏｎら、「Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，２００５；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（編集），「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ」、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５；及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（編集），「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００８を参照してもよい。

【0093】

本明細書に記載された間質細胞は、移植に関して生理学的に適合性の担体中に懸濁してもよい。本明細書で使用される場合、「生理学的に適合性の担体（ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）」という用語は、製剤の他の成分と適合し、かつそのレシピエントに有害でない担体を指す。当業者は、生理学的に適合性の担体には精通している。適切な担体の例としては、細胞培養培地（例えば、イーグル最小必須培地）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス平衡塩溶液＋／−グルコース（ＨＢＳＳ）、及び複数の電解質溶液、例えば、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ）が挙げられる。

【0094】

被験体に投与される間葉細胞懸濁液の容積は、移植部位、治療目標及び溶液中の細胞数に依存して変化する。典型的には、投与する細胞の量は、治療有効量である。本明細書で使用される場合、「治療有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」または「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」とは、特定の疾患の処置を達成するために、すなわち障害に関連する症状の量及び／または重症度の低減を生み出すために、必要とされる移植される細胞数を指す。治療有効量は、損傷の種
類及び程度で変化し、そしてまた、被験体の全身の状態に依存しても変化し得る。

【0095】

開示した治療用組成物は、医薬的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒または封入材料、すなわち、担体をさらに含んでもよい。これらの担体は、例えば、体内で、間葉細胞を安定させるか、及び／または間葉細胞の生存を容易にすることができる。それぞれの担体は、製剤の他の成分に適合し、かつ被験体に有害でないという意味において「許容される（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」べきである。医薬的に許容される担体として役に立つことができる材料のいくつかの例としては、糖、例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース；デンプン、例えば、トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；トラガカント粉末；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び坐薬ワックス；油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；グリコール、例えば、プロピレングリコール；ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル、例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱性物質除去水；等張食塩水；リンガー溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤に使用される他の無毒性適合物質が挙げられる。湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤及び芳香剤、保存剤及び抗酸化剤もまた、組成物中に存在してもよい。

【0096】

例示的な製剤としては、限定するものではないが、非経口投与、例えば、肺内、静脈内、動脈内、眼内、頭蓋内、髄膜下（ｓｕｂ−ｍｅｎｉｎｇｉａｌ）または皮下投与に適切な製剤、例としては、ミセル、リポソームまたは薬物放出カプセル（徐放のために設計された生体適合性コーティング中に組み込まれた活性薬剤）中に封入された製剤；摂取可能な製剤；局所使用のための製剤、例えば、点眼薬、クリーム、軟膏及びゲル；ならびに他の製剤、例えば、吸入、エアロゾル及びスプレーが挙げられる。本開示の組成物の投与量は、処置の必要性の程度及び重症度、投与された組成物の活性、被験体の全体的な健康状態、ならびに当業者に周知の他の判断に従って変化する。

【0097】

さらなる実施態様において、本明細書に記載される組成物は、局所的に送達される。局所送達は、非全身的に組成物を送達することを可能にし、それによって、全身送達と比較して、体に対する組成物の負担を軽減する。そのような局所送達は、例えば、様々な医療的な埋め込み装置、例としては、限定するものではないが、ステント及びカテーテルの使用を通じて達成でき、または吸入、静脈切開術、もしくは手術によって達成できる。コーティング、移植、包埋方法、ならびに医療装置、例えばステント及びカテーテルに所望する薬剤を取り付ける他の方法は、当該技術分野において確立されており、そして本明細書において考慮される。

【0098】

本開示の別の態様は、被験体に対して、間葉細胞の投与を実施するためのキットに関する。１つの実施態様において、キットは、１つ以上の個別の医薬調合物において、必要に応じて処方された（例えば、薬学的な担体の中で）、間葉細胞の組成物を備える。

【実施例】

【0099】

実施例１：ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ中の細胞内ＦＧＦ２及び分泌されたＦＧＦ２のレベル
ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の細胞抽出物及び馴化培地は、凍結保存された細胞から調製した。細胞アリコートを解凍し、洗浄し、胚性神経細胞の基本培地（ＮｅｕｒｏＢａｓａｌ，（ＮＢ），Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）
中に再懸濁して、２回洗浄した。ＭＳＣの供給源及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの調製を記載した。例えば、米国特許第７，６８２，８２５号（ここでは、ＭＳＣは、「骨髄間質細胞」と呼ばれ、ＤＮＴＴ−ＭＳＣは、「神経前駆細胞」と呼ばれる）、及び米国特許出願公開第２０１０／０２６６５５４（ここではＭＳＣは「骨髄付着幹細胞」と呼ばれ、及びＤＮＴＴ−ＭＳＣは「神経再生細胞」と呼ばれる）を参照のこと。また、Ａｉｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．８７：３１９８〜３２０６も参照のこと。前述の引用文献の全ての開示は、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣについての産生の供給源及び方法を記述する目的のため、その全体が本明細書において参照によって援用される。

【0100】

Ｅ０と呼ばれる無細胞抽出物の調製のために、２×１０６個の細胞を、−８０℃で１〜２時間の間、４ｍｌのＮＢ中で凍結させ、次いで解凍して、全部で１０ｍｌのＮＢ培地中に再懸濁し、その懸濁物を３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離によって清浄化した。この過程は本質的に細胞膜を破壊し、その結果細胞内容物の放出が生じる。その上清をアリコートに分配して、−８０℃で保管した。

【0101】

馴化培地（ＣＭ）の調製のために、２×１０６個の細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）及びペニシリン／ストレプトマイシン（αＭＥＭ／ＦＢＳ／ＰＳ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したα−最小必須培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｉｎｃ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）中で、Ｔ７５フラスコに入れて、一晩培養した。翌日、培地を１時間ＮＢに変換し、次いで廃棄して１０ｍｌの新鮮ＮＢで置き換えた、培養を２４時間続けた；その後、馴化培地を取り出して、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、アリコートに分配して、−８０℃で保管した。

【0102】

馴化培地の除去後、培地が取り出されたフラスコ（細胞の層を含む）を凍結して解凍し、細胞の残遺物を１０ｍｌのＮＢで抽出し、その抽出物を遠心分離して、その上清をアリコートに分配して、−８０℃で保管した。これらの無細胞抽出物を、Ｅ１抽出物と命名した。予備的な実験によって、凍結／解凍の手順を生残した細胞はなかったことが示された。他に示さない限り、Ｅ０及びＣＭは、培地に対して同じ割合の細胞（５ｍｌのＮＢあたり百万個の細胞）を用いて産生した。

【0103】

ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）及び他のサイトカインのレベルを、ＥＬＩＳＡによって測定した。塩基性ＦＧＦ（ＦＧＦ２）、高感度（ＨＳ）塩基性ＦＧＦ、ＶＥＧＦ及び酸性ＦＧＦ（ＦＧＦ１）についてのＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓを、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得た。ＭＣＰ−１ ＥＬＩＳＡキットを、Ｂｏｓｔｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）から得た。ＥＬＩＳＡは、ＦＧＦ２のＥＬＩＳＡについてサンプルを一晩インキュベートした以外は、製造業者の指示に従って行った。これによって、製造業者によって推奨されるように、２時間のインキュベーションで得たものと匹敵した結果が提供された。ＦＧＦ２検出の最適の希釈は、予備的実験で決定されたとおり、Ｅ０抽出物については１／１０であり、ＣＭについては１／２かまたは希釈なしであった。

【0104】

ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣにおける細胞内ＦＧＦ２のレベルは、単一の凍結／解凍サイクルに供された無細胞抽出物（Ｅ０抽出物）中のＦＧＦ２についてアッセイすることによって決定した。細胞を、７ドナーから得て、結果を平均した。図１Ａによって、百万個のＭＳＣが平均で３．９ｎｇのＦＧＦ２を放出することが示される；一方で、百万個のＤＮＴＴ−ＭＳＣは、平均で７．２ｎｇのＦＧＦ２を放出することが示される。１つの凍結／解凍サイクルは、全ての細胞を殺傷するのに十分であった（トリパンブルー染色及び細胞プレーティングで試験した場合）が、各々の追加の凍結／解凍サイクルによって、ＦＧＦ２濃度は約２０％まで低下された。

【0105】

対照的に、同じ数のＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣのいずれかから得られるＣＭは、約０．０２ｎｇのＦＧＦ２を含んだ（図１Ｂ）。従って、ＭＳＣ及びＳＢ６２３細胞は、ＦＧＦ２の大きい細胞内リザーバを含むが、そのごくわずかしか分泌しない。

【0106】

細胞の代謝活性における潜在的な相違について制御するために、ＬＤＨ活性（細胞数についての代用マーカー）を、洗浄された凍結保存されたＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの無細胞抽出物（Ｅ０抽出物）中で、ならびに細胞増殖及びＣＭの産生後で得られた無細胞抽出物（Ｅ１抽出物）中で測定した。活性を、ＬＤＨ細胞毒性検出キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて１：２及び１：４希釈で、細胞抽出物中で検出して、平均した。ウシＬＤＨ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を標準として用いた。

【0107】

ＬＤＨアッセイの結果により、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの両方について、ＬＤＨ活性は、Ｅ１抽出物（０．１３Ｕ／１０６細胞）中よりもＥ０抽出物（０．３Ｕ／１０６細胞）中で高かったことが示され；これによって、凍結保存後に破壊された細胞と比較して飢餓細胞中で代謝活性が低下したことが示される（図１Ｃ）。しかし、ＬＤＨのレベルは、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来のＥ０抽出物中で（約０．３Ｕ／１０６細胞）、ならびにＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来のＥ１抽出物中で（０．１３Ｕ／１０６細胞）同様であって、これによって、同様の代謝レベル（すなわち、同様の細胞数）が、両方の細胞種において、ＣＭを生成するための培養の前後の両方で示される（図１Ｃ）。

【0108】

これらの結果によって、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣでは、ＦＧＦ２は、主に細胞内であるが、分泌されるのはごくわずかであることが示される。ＦＧＦ１の細胞分布、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及び単球走化性因子タンパク質−１（ＭＣＰ１）もまた検討した。細胞内区画化はまた、ＭＳＣ中において、ＦＧＦ１についてはあてはまるようであったが、ＶＥＧＦ及びＭＣＰ１についてはあてはまらなかった（表１）。

【0109】

【表1】

【0110】

ＦＧＦ２レベルはまた、他のヒト間葉細胞（ヒト包皮線維芽細胞、ＨＦＦ）及びヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））由来の凍結／解凍（すなわち、Ｅ０）抽出物中で、及びヒ
ト非間葉細胞（すなわち、神経前駆細胞（ＮＰＣ）株ＥＮＳｔｅｍ及びＲｅＮｃｅｌｌ）中でも測定した。表２に示されるとおり、ＨＦＦは、より多くのＦＧＦ２を放出したが、ＨＵＶＥＣ及びヒト神経幹細胞株は、ＭＳＣよりも放出するＦＧＦ２が少なかった。

【0111】

【表2】

【0112】

実施例２：ＭＳＣの抽出物は、神経前駆細胞の増殖を促進する
ラット胚性皮質細胞集団は、ＦＧＦ２に応答して増殖する、大きい割合の神経前駆細胞（ＮＰＣ）を含む。ＭＳＣ中の細胞内ＦＧＦ２の生物学的効果は、ラット皮質細胞と、０〜７５％にわたって変化するＭＳＣ由来Ｅ０及びＣＭの希釈物とを接触させること、ならびにＢＲＤＵ取り込みを用いて増殖アッセイを行うことによって特徴付けられた。

【0113】

皮質細胞アッセイが記載されている。例えば、Ａｉｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２：２２３−２３２及び米国特許出願公開第２０１３／０２１００００（Ａｕｇ．１５，２０１３）を参照のこと。要するに、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、オルニチン／フィブロネクチン（Ｏｒｎ／Ｆｎ，両方ともＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）でコーティングした。ラット胚性Ｅ１８皮質対を、ＢｒａｉｎＢｉｔｓ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ）から購入し；神経細胞は、Ａｉｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（前出）に記載のとおり単離した。アッセイ培地は、Ｂ２７及び０．５ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（ＧｌｕｔａＭＡＸ）（ＮＢ／Ｂ２７／ＧＬＸ，全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＮＢから構成された。神経細胞を、６．７×１０３細胞／ウェルでプレートし；次いで種々の濃度（０％〜７５％の範囲）のＥ０またはＣＭを、三連でウェルに添加した。抗体中和実験では、中和抗ＦＧＦ２抗体クローンｂＦＭ１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）または対照のマウスＩｇＧ１（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）もまた、各々２ｕｇ／ｍｌで添加した。培地を含むが細胞を含まないウェルをブランクとして用いた。抽出物の添加後、神経細胞を５日間培養した。

【0114】

増殖を定量するために、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢＲＤＵ）標識を２時間行い、次いでそのプレートを、製造業者の指示に従って、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ（Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて処理した。標準は、１：１０００で開始する抗ＢＲＤＵ試薬の連続希釈によって作成した。最高の標準値は、恣意的に１００と設定し、比色定量解析の結果をこれらの単位で表した。色の発色は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて定量した。

【0115】

これらの実験の結果、ＭＳＣからのＥ０無細胞抽出物による神経細胞の処置は、用量依存性の方式で神経細胞増殖を増大したが；一方で、ＭＳＣ馴化培地（すなわち、分泌された分子）による神経細胞の処置は、増殖に影響がなかった（図２Ａ）ことが示された。さらなる実験では、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来のＥ０抽出物に対する増殖応答は、中和抗ＦＧＦ２（ｂＦＭ１）抗体の存在下で低下したが、対照の抗体は影響がなかったことが示された（図２Ｂ）。従って、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣから放出された細胞内ＦＧＦ２は、神経細胞の増殖を促進する。

【0116】

神経前駆細胞増殖を刺激するのにおける細胞内ＦＧＦ２の役割に対する補足的な支持は、図１２に示される。この実験では、異なるロットのＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来のＥ０抽出物を、ＥＬＩＳＡによってＦＧＦ２含量についてアッセイし（実施例１に記載のとおり）、これらのＥ０抽出物の希釈を、上記の増殖アッセイで試験した。各々のロットの細胞について、次いで、バックグラウンド（抽出物なし）を３倍超えて細胞増殖を刺激した抽出物の有効濃度（希釈後）を、その抽出物中のＦＧＦ２濃度に対してプロットした。その結果、ＦＧＦ２含量と増殖の３倍刺激に必要な抽出物の有効濃度との間の逆相関；すなわち、抽出物中のＦＧＦ２レベルと、増殖を刺激する能力との間の直接相関が示される。

【0117】

神経前駆細胞に加えて、胚性ラット皮質細胞集団は、未熟なニューロンを含む。細胞のどの小集団が、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ抽出物に応答して増殖したかを特定するために、神経細胞を、ＤＮＴＴ−ＭＳＣからのＥ１抽出物（すなわち、馴化培地を提供するために培養された細胞から得た無細胞抽出物）の有無で５日間培養し、次いで、ｄｃｘ（未熟なニューロンのマーカー）及びネスチン（神経前駆細胞マーカー）について免疫染色し、またＢＲＤＵで標識した。免疫染色の解析によって、抽出物で処置した培養物中で、ＤＣＸ＋またはＢＲＤＵ＋／ＤＣＸ＋細胞中で増大がなかったこと；対照的に、ネスチン陽性細胞中で劇的な増大があったこと；そして実質的に全てのネスチン陽性細胞もまたＢＲＤＵ陽性であったことが明らかになった。これらの結果、培養の５日後、神経前駆細胞は、抽出物に応答して増殖した主要な細胞小集団であったことが示される。

【0118】

実施例３：ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの抽出物が、内皮細胞の増殖を促進する
ＦＧＦ２の報告された血管形成性活性に照らして、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの抽出物を、それらが、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖を誘導する能力について試験した。これらの実験について、ＨＵＶＥＣは、内皮増殖培地中で培養し、ＥＧＭ（商標）に、ウシ脳抽出物（両方がＬｏｎｚａ由来）及び２％のＦＢＳを２〜４継代の間、補充し、アリコートに分配して、凍結保存して保管した。アッセイに関して、９６ウェルのプレートを４０μｇ／ｍｌのラット尾コラーゲンＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて２時間コーティングし、次いで吸引し、乾燥して、使用するまで−２０℃で洗浄または保管した。アッセイ培地は、０．５％ＦＢＳを補充したＭｅｄｉｕｍ １９９（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。ＨＵＶＥＣ（新鮮に解凍するか、または一晩培養後のいずれか）を、三連で陰性対照としてＮＢのみを用いて、種々の希釈の抽出物及びＣＭの存在下で２．５×１０３細胞／ウェルでプレートした。いくつかの実験では、抗ＦＧＦ２抗体ｂＦＭ１または対照のマウスＩｇＧ１を（各々２μｇ／ｍｌの濃度で）、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の１５％のＥ０抽出物（約０．２ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む）の存在下で含んだ。追加の実験では、組み換えヒトＶＥＧＦ１６５（ｒＶＥＧＦ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または組み換えＦＧＦ２（ｒＦＧＦ２）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ，ＵＳＡ）を、抽出物またはＣＭの代わりに、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ及び１ｎｇ／ｍｌの濃度で含んだ。培養の２日後、細胞を、ＢＲＤＵを用いて２時間標識し；そしてＢＲＤＵ取り込みを、実施例２に記載のとおり定量した。

【0119】

その結果を図３に示す。ＭＳＣ Ｅ０抽出物はＨＵＶＥＣの増殖を強力に誘導したが、ＭＳＣ−ＣＭ及びＮＢ培地は、影響を有さなかった（図３Ａ）。別の実験では、ＨＵＶＥＣを、ＦＧＦ２中和抗体及び対照抗体の有無において、ｒＶＥＧＦ、ｒＦＧＦ２、またはＤＮＴＴ−ＭＳＣ−Ｅ０抽出物（１５％）とともにインキュベートした（図３Ｂ）。Ｅ０抽出物に対する応答は、抗ＦＧＦ２中和抗体ｂＦＭ１によって阻害されたが、対照のマウスＩｇＧ１では阻害されず、このことは、このアッセイにおけるＨＵＶＥＣ増殖がＦＧＦ２で駆動されたことを示している。とりわけ、天然及び組み換えの両方のＦＧＦ２の活性は、このアッセイで同様であった；実際、バックグラウンド（Ｅ０抽出物なし、組み換え増殖因子なし、図３Ｂ、最も左側のバー）を差引きすれば、１５％のＥ０抽出物（これは、このＥ０調製物中の０．２ｎｇ／ｍｌの最終ＦＧＦ２濃度に相当する）によって誘導される応答は、１ｎｇ／ｍｌのｒＦＧＦ２によって誘導された応答よりも約４倍小さかった。

【0120】

実施例４：生細胞、死滅細胞及び細胞抽出物の神経原性活性
神経原性因子及びグリア分化性（ｇｌｉｏｇｅｎｉｃ）因子に関する定量的アッセイ（共有に係る米国特許出願公開第２０１３／０２１００００号に記載）を用いて、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣにおいて神経新生性活性を特徴付けた。このアッセイを用いて、（ａ）抽出物の活性を評価し、かつ（ｂ）抽出物の活性と、生細胞及び死滅細胞の活性とを比較した。これらの実験のために、ＮＢ中のＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣのいずれかの作業懸濁物を３つのアリコートに分けた。１つのアリコートは、さらなる処置を受けず、生細胞と命名された（「Ａ」と表示）。残りの２つのアリコートを凍結し、次いで解凍して、これから細胞溶解液を生じた（すなわち、死滅細胞、「Ｄ」と表示）。次いで、これらの２つの細胞溶解液のうちの１つを、遠心分離によって浄化して、無細胞抽出物を得た（「Ｅ」と表示）。

【0121】

神経新生アッセイは、細胞増殖のための基質として、ＭＳＣ由来ＥＣＮでコーティングされたＣｅｌｌＢＩＮＤ Ｓｕｒｆａｃｅ ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を利用した。３つのアリコート（生細胞、死滅細胞及び無細胞抽出物）のいずれかを、同一の希釈でプレートし、これは、１ウェルあたり５００、２５０、または１２５個の生きたＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣに相当した。皮質細胞（５０００細胞／ウェル）を、全てのウェルに添加した。培養後、ラットネスチン、ラットグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、及びヒトグリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）の発現を、Ｔａｑｍａｎアッセイ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｑＲＴ−ＰＣＲによって定量した。

【0122】

その結果を図４に示す。以前の結果（実施例２，上記）を確認すれば、ネスチン発現は、無細胞抽出物によって；ただし、生細胞または細胞溶解液よりも少ない程度まで誘導された（図４Ａ）。その細胞溶解液は、生細胞の懸濁物が発現するよりもわずかに強力なネスチン発現を誘導した。対照的に、ＧＦＡＰ発現は、生細胞によって誘導されるが、無細胞抽出物によっては誘導されず、細胞溶解液ではごくわずかにのみ誘導された（図４Ｂ）。細胞溶解液で処置された培養物中のヒトＧＡＰ発現がないことによって、生残しているヒト細胞がないことが確認された（図４Ｃ）。

【0123】

ネスチン発現を誘導する無細胞抽出物、生細胞及び細胞溶解液の能力の相違は、Ｎｅｓ＋ＧＦＡＰ＋前駆体の増殖を支持することにより、神経細胞とＭＳＣとの同時培養が漸増的なネスチン発現を誘導するという以前の観察によって説明され得る。Ａｉｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．（２０１３） Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２：２２３−２３２。可溶性無細胞抽出物は、細胞質ＦＧＦ２の豊富な供給源であるが、細胞溶解液はまた、細胞残遺物（例えば、核）も含み、これは、追加のＦＧＦ２を放出し得、かつ細胞増殖及びネスチン発現のさらなる刺激を提供し得る。

【0124】

最終的に、この実験で用いられる無細胞抽出物は、上記の実験で用いられるＥ０抽出物
よりも４０倍大きい希釈であったことに注目すべきである：実際、これらの実験で用いられるほとんどの濃縮抽出物（すなわち、１００μｌの培養物培地中の５００個の細胞からの抽出物）は、上記で調製された２．５％希釈のＥ０に相当する（１０６細胞／５ｍｌ培地）。

【0125】

実施例５：グリア細胞前駆体の誘導
脳内移植後、大多数の移植された細胞がその後まもなく死ぬことは、まれなことではない。従って、上記の実施例４に記載のように調製した、生きたＤＮＴＴ−ＭＳＣ及び死滅ＤＮＴＴ−ＭＳＣ（すなわち、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ細胞溶解液）の組み合わせを、実施例４に記載の神経新生アッセイで試験した。この目的を達成するために、細胞溶解液（すなわち、死滅細胞、Ｄ）及び生細胞（Ａ）を、生細胞に対して死滅細胞を３：１という比で混合し、この混合されたサンプルの活性を、死滅細胞または生細胞のいずれかの同じ総細胞数を含むサンプルの活性と比較した。

【0126】

実施例２及び４に記載の結果から予想されるとおり、ネスチン発現は、３つの全てのサンプルによって同様に誘導された。図４Ｄによって、死滅細胞及び生細胞の混合物が、星状細胞マーカーであるグリア細胞繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現に相乗作用的効果を有したことが示される。この相乗作用は、ＭＳＣ由来のサンプル及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来のサンプルの両方で観察された。死滅細胞サンプルと生細胞サンプルとの間の相乗作用は、混合されたＤ／Ａ調製物中の過剰な生きたヒト細胞の存在には起因しなかった。なぜなら、同様のヒトＧＡＰレベルが、生細胞サンプル及び死滅細胞／生細胞混合物の両方で検出されたからである（図４Ｅ）。従って、生きたＭＳＣもしくはＤＮＴＴ−ＭＳＣ、それらの抽出物、または単回の凍結／解凍サイクルによって殺傷された細胞の懸濁物は全てが、神経前駆体成長を促進し；ただし、堅調な星状細胞産生には、生きたＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣの存在を必要とした。

【0127】

実施例６：ＰＢＭＣの細胞毒性活性から生じるＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の細胞内ＦＧＦ２の放出
細胞が脳に注射されたとき、脳の小血管に対する損傷が生じ得る；そして脈管構造のこの破壊によって、局所の末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に対する移植細胞の暴露、及びそれらに関連する細胞毒性の影響が生じ得る。生物学的に活性なＦＧＦ２の細胞内貯蔵庫が、ＰＢＭＣ細胞毒性の天然に存在する過程によってＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣから放出され得るかを試験するために；ＰＢＭＣ媒介性細胞溶解、及びＦＧＦ２の放出は、ＰＢＭＣ（ＩＬ２の非存在下で７日間予備培養された）及び標的細胞（ＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣのいずれか）の１８時間の同時培養中で評価した。

【0128】

これらのアッセイに関しては、ＰＢＭＣは、全血のバフィーコート調製物から、製造業者の指示に従って、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて得た。リンパ球／単球／血小板画分を収集して、遠心分離（６００ｒｐｍで２０分間）によって洗浄して、ほとんどの血小板を除去した。エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、標的細胞（ＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）に対して１０または３０倍過剰のＰＢＭＣで１８時間、その標的細胞との同時培養前に７日間培養した。対照の培養物は、ＰＢＭＣのみ、ＭＳＣのみ、ＤＮＴＴ−ＭＳＣのみ、及び培地のみを含んだ。ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣをまた、別々にプレートして、標的細胞中の総ＬＤＨ活性の決定のために培養の最終の３０分の間、培養物に対して最終濃度１％（ｗ／ｖ）までのＴｒｉｔｏｎの添加によって溶解した。各々の条件の５つの複製を行った。

【0129】

培養後、そのプレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。５つの複製のうち３つから、２５μｌの上清を、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、ＬＤＨ活性の測定のために各々のウェルから取り出した。細胞毒性は、以下の式（数１）に従って、エフェクター標識同時培養において「ＬＤＨ活性の放出比」として表した。

【0130】

【数1】

【0131】

上清（ＦＧＦ２の予想濃度次第で１０〜５０μｌ）を、ＦＧＦ２ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅアッセイ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いて、ＦＧＦ２の測定のために残りの２つのサンプルから取り出した。同時培養中の標的細胞由来のＦＧＦ２放出比を、ＬＤＨの放出比と同じ方式で算出した；すなわち、標的細胞中の総ＦＧＦ２のパーセンテージとして；そして標的細胞及びエフェクター細胞からの自然なバックグラウンドＦＧＦ２放出を計上する。

【0132】

代表的な結果を図５Ａに示す。ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの溶解は、ＬＤＨ放出比によって測定されるように、エフェクター細胞：標的細胞比に比例し、ＭＳＣ、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ、及びＰＢＭＣの異なるドナーについて３０：１のＰＢＭＣ：標的細胞比で３０〜９０％で変化した。標的細胞からのＦＧＦ２の放出パーセンテージは、溶解の程度と相関したが、ＦＧＦ２放出比のパーセンテージは、ＬＤＨのものよりも約２〜２．５倍低かった。

【0133】

この実験でのＭＳＣ／ＰＢＭＣの同時培養中の溶解比は、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ／ＰＢＭＣ同時培養におけるよりも高かったが（図５Ａ）、より多くのＦＧＦ２が、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ中のＦＧＦ２のより高い細胞内レベルに起因して、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ同時培養において放出された（図５Ｂは、「Ｓ溶解（Ｓ ｌｙｓｅｄ）」サンプルと「Ｍ溶解（Ｍ ｌｙｓｅｄ）」サンプルとを比較）。さらに、ＤＮＴＴ−ＭＳＣは、ＭＳＣが放出するよりもＰＢＭＣの非存在下でより多くのＦＧＦ２を放出する（図５Ｂは、「Ｓ」サンプルと「Ｍ」サンプルとを比較）。

【0134】

結論として、これらの結果、かなりの量のＦＧＦ２が、ＰＢＭＣの細胞毒性効果の結果としてＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの両方によって放出され得ることが示される。

【0135】

実施例７：ＦＧＦ２は、高密度、低酸素、栄養素に乏しい培養物中のＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣから放出される。
細胞が組織損傷のゾーンに移植されるとき（例えば、梗塞に対して二次的）、それらは、酸素及び栄養素の限られた拡散によって特徴付けられる、低酸素である場合が多い環境に高密度で沈着される。移植後の脳内微小環境をモデリングするため、ＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣを、０．３５×１０６／３５０μｌ／ウェルの濃度でＮＢ／Ｂ２７／ＧＬＸ中で９６ウェルプレートの丸底ウェルにプレートした。そのウェルをＰＣＲテープで緊密にシールして、ガス交換を妨げた。培地は、急速に酸性になり、これによって、低酸素環境が示される。ほとんどの細胞は、非接着のままであった；しかし、この環境における培
養の５日後でさえ、培養物は、正常な増殖条件下で再プレートされたとき、結合、成長及び増殖できた、含んでいる生細胞がやはり少なかった。

【0136】

ウェルの内容物をいくつかの時点で回収し、遠心分離して細胞及び細片からＣＭを分離し、その細胞ペレットを、凍結／解凍サイクルに供して、生残細胞から細胞内容物を放出した。従って、各々の時点で、上清を収集し（３００μｌ／ウェル、ここではＣＭと呼ばれる）、ペレットを、３００μｌのＮＢ中に再懸濁し；両方の上清及び再懸濁されたペレットを凍結した。全ての時点が収集された後、全てのサンプルを解凍して、遠心分離によって清澄化した（１０分間２００ｇ）。次いで、ＬＤＨ活性及びＦＧＦ２濃度を、ＣＭ中で、及び細胞ペレットの凍結−解凍抽出物中で、決定した（実施例６に記載のとおり）。これらの実験では、ＣＭ及び細胞抽出物は、１ｍｌのＮＢあたり百万個の細胞を用いて生成した。

【0137】

この結果は図６に示す。細胞内ＦＧＦ２含量は、ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣの両方において、最初のプレートの２０時間内に急速に低下したが、放出されたＦＧＦ２のレベル（ＣＭ中）は、４時間から２日まで一定に保持された（図６Ａ）。実質的に高いＦＧＦ２レベルがＤＮＴＴ−ＭＳＣからは、ＭＳＣからよりも多く放出された（それぞれ、百万個の細胞あたり、約２対０．５ｎｇ）。ＣＭ中のＦＧＦ２のレベルの低下は、５日で検出された。放出されたＦＧＦ２は、低酸素培養条件下である程度の時間、安定であったようであった。

【0138】

ＭＳＣ及びＤＮＴＴ−ＭＳＣからのＬＤＨの放出は、瀕死の細胞の集団について期待されるとおり、低酸素培養の経過にまたがって増大した（図６Ｂ）。しかし、細胞内ＬＤＨレベルは、細胞内ＦＧＦ２レベルが低下するにつれて、高いまま残った。これによって、低酸素条件下では、生残細胞は、細胞内ＦＧＦ２のそれらの産生を低下することが示唆される。さらに、ＤＮＴＴ−ＭＳＣは典型的には、後の時点でＤＮＴＴ−ＭＳＣ中のより高いレベルの細胞内ＬＤＨによって示されるとおり、これらの条件下でＭＳＣよりもよく生存した。

【0139】

したがって、細胞内ＦＧＦ２は、低酸素培養の経過にわたって瀕死の細胞から放出されるが、生残細胞は、細胞内ＦＧＦ２のそれらの産生を低下するようである。従って、培養された細胞（ＭＳＣまたはＤＮＴＴ−ＭＳＣ）の抽出物の移植は、移植後のそれらの細胞内ＦＧＦ２貯蔵を低下する可能性が高い、移植された細胞よりも高い量の生物学的に活性なＦＧＦ２を提供する可能性が高い。

【0140】

実施例８：ＤＮＴＴ−ＭＳＣから放出されたＦＧＦ２と追加の分子との間の相乗作用
組み換えＦＧＦ２（ｒＦＧＦ２，Ｐｅｐｒｏｐｔｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，ＮＪ）の効果を、単独で、及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ由来の順化培地を組み合わせて、ラット胚性皮質細胞の増殖に対して、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ凍結／解凍無細胞（Ｅ０）抽出物の効果と評価して比較した。細胞増殖は、上記の実施例２に記載のように測定した。

【0141】

図７Ａによって、ｒＦＧＦは、皮質細胞増殖に対してわずかに刺激性の効果を有する（図７Ａ、三角）が；ｒＦＧＦ２及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ ＣＭの組み合わせでは、かなり高い割合の増殖が生じた（図７Ａ、丸印）ことが示される。この結果、１つ以上の成分の存在が、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ馴化培地中で、ＦＧＦ２と呼応して、皮質細胞増殖を刺激することが示される。相加的効果を仮定する算出された用量応答に対して比較して（図７Ａ，四角）、ｒＦＧＦ２及びＣＭの効果が相乗作用的であることが示される。

【0142】

ｒＦＧＦ２及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ ＣＭの相乗作用的組み合わせを、皮質細胞増殖アッセイにおいてＤＮＴＴ−ＭＳＣ無細胞Ｅ０抽出物と比較した。この実験のために、皮質細
胞を、種々の濃度のｒＦＧＦ２に対して、単独で、または７５％に希釈されたＤＮＴＴ−ＭＳＣ ＣＭと組み合わせて、及びＤＮＴＴ−ＭＳＣ Ｅ０抽出物の一連の希釈に対して暴露した。ＥＬＩＳＡによるＥ０抽出物中のＦＧＦ２レベルのアッセイによって、未希釈のＥ０抽出物中の３．５ｎｇ／ｍｌというＦＧＦ２濃度が示された。

【0143】

その結果を図７Ｂに示す。前に注記されるとおり、ｒＦＧＦ２及びＣＭは、相乗作用的に作用して、増殖を刺激した。ＤＮＴＴ−ＭＳＣ無細胞Ｅ０抽出物もまた、増殖を刺激した。特に、半分強度のＥ０抽出物（約１．７５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を含む）は、馴化培地（これは一般には２０ｐｇ／ｍｌ以下のＦＧＦ２を含む）の存在下で、２．５ｎｇ／ｍｌのｒＦＧＦ２とほぼ同じ増殖誘導活性を有した。

【0144】

これらの結果、ＤＮＴＴ−ＭＳＣは、神経細胞の増殖を刺激するために、ＦＧＦ２と相乗作用的に作用する１つ以上の分子を含むこと、及びこのような分子は分泌され得ることが示される。

【0145】

実施例９：ＤＮＴＴ−ＭＳＣ中の細胞内ＦＧＦ２の特徴付け
天然に存在するＦＧＦ２は、１８ｋＤ、２２ｋＤ、２２．５ｋＤ、２４ｋＤ、及び３４ｋＤという少なくとも５つのアイソフォームで存在する。組み換えＦＧＦ２は、低分子量（１８ｋＤ）のアイソフォームのみを含む（図８，レーン２）。対照的に、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて調製され、変性Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳポリアクリルアミドゲルで解析されたＤＮＴＴ−ＭＳＣの細胞丸ごとの溶解液は、モノクローナル抗ＦＧＦ２抗体（ｂＦＭ２，（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて検出されたとおり、少なくとも３つのＦＧＦ２アイソフォームを含む（図８，レーン１）。

【0146】

ＤＮＴＴ−ＭＳＣ中の種々のＦＧＦ２アイソフォームの細胞内分布を、種々の細胞溶解液及び抽出調製物を解析することによって検討した。ＤＮＴＴ−ＭＳＣからの総細胞溶解液を、ＲＩＰＡ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中で細胞を溶解することによって得た。この緩衝液は、イオン性及び非イオン性の両方の界面活性剤を含み、核及び細胞膜を溶解し、それによって、細胞質、核及び細胞成分に結合した膜を放出する。細胞質溶解液は、等張性緩衝液中に細胞を溶解すること、核酸及び細胞細片をペレット化すること、ならびに上清を回収することによって調製した。細胞質溶解液の調製の間に得られたペレットを、ＲＩＰＡ緩衝液で抽出して、核溶解液を得た。これらの溶解液を、培養された細胞を凍結／解凍サイクルに供すること、次いで遠心分離によって浄化することによって、以前に記載されたとおり調製された、ＤＮＴＴ−ＭＳＣの無細胞Ｅ０抽出物と比較した。従って、Ｅ０抽出物は、膜の破裂のような機械的な損傷によって放出される可溶性細胞成分を含む。

【0147】

サンプルは、変性Ｔｒｉｓ−グリシン−ＳＤＳポリアクリルアミドゲルでの電気泳動によって解析し、タンパク質は、免疫ブロットによって検出した。図９に示される結果によって、ほとんどのＦＧＦ２が、ＤＮＴＴ−ＭＳＣの細胞質に存在すること；ならびに無細胞Ｅ０抽出物が主に細胞質物質を含むことが示される。

【0148】

ＤＮＴＴ−ＭＳＣのような間葉細胞がＦＧＦ２のいくつかのアイソフォームを含むという事実によって、組み換えＦＧＦ２と比較して、ＤＮＴＴ−ＭＳＣ抽出物の優れた増殖誘導活性が説明できた。例えば、図７Ｂ、実施例８を参照のこと。

【0149】

実施例１０：線維芽細胞の抽出は、神経前駆細胞の増殖及び分化を促進する。
ヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦ，ＡＴＣＣ １０４１）を用いて、実施例１に記載のような、凍結−解凍無細胞抽出物及び不溶性細胞残渣画分を調製した。これらの画分における
、及びＨＦＦ細胞溶解液における、ＦＧＦ２のレベルを、実施例１に記載のとおり測定し、これらの画分が、神経細胞の増殖を刺激する能力を、実施例２に記載のとおりアッセイした。

【0150】

図１０Ａによって、ＨＦＦが、ＭＳＣよりもいくぶん高いレベルの細胞内ＦＧＦ２を含むことが示される。図１０Ｂによって、全ての画分（細胞溶解液、無細胞（Ｅ０）抽出物、及び細胞残渣）が、神経前駆細胞の増殖を刺激することが示される。ＨＦＦ及びＭＳＣの両方の刺激効果は、ＢＭＰインヒビターであるノギンに対して非感受性である（図１０Ｃ）。星状細胞前駆体の分化は、ＢＭＰによって刺激されるので、この結果は、神経の前駆体の増殖と一致する。

【0151】

ＨＦＦの画分をまた、それが神経前駆細胞の分化を促進する能力について、実施例４に記載の方法を用いて試験した。図１１に示される結果によって、ＨＦＦ由来の無細胞（Ｅ０）抽出物が、皮質細胞のネスチン陽性神経前駆細胞、ＧＦＡＰ陽性の星状細胞及びＣＮＰ陽性乏突起膠細胞への分化を促進することが示された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11】

【図12】