特許 6869312 ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３、それを含む組成物及び精神失調を改善する適用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6869312

(24)【登録日】2021年4月15日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３、それを含む組成物及び精神失調を改善する適用

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20210426BHJP

   A23L 33/135 20160101ALI20210426BHJP

   A61P 25/20 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 25/24 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 25/02 20060101ALI20210426BHJP

   A61K 35/747 20150101ALI20210426BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20210426BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20210426BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20210426BHJP

   A61K 9/50 20060101ALI20210426BHJP

   A61K 9/20 20060101ALI20210426BHJP

   A23L 29/00 20160101ALI20210426BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20210426BHJP

   C12R 1/225 20060101ALN20210426BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/20 A

   A23L33/135

   A61P25/20

   A61P25/24

   A61P25/02 103

   A61K35/747

   A61P25/28

   A61K9/08

   A61K9/14

   A61K9/50

   A61K9/20

   A23L29/00

   !C12N15/31

   C12R1:225

【請求項の数】8

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2019-209593(P2019-209593)

(22)【出願日】2019年11月20日

(65)【公開番号】特開2020-80861(P2020-80861A)

(43)【公開日】2020年6月4日

【審査請求日】2019年11月20日

(31)【優先権主張番号】107141359

(32)【優先日】2018年11月21日

(33)【優先権主張国】TW

【微生物の受託番号】CGMCC  CGMCC 15203

(73)【特許権者】

【識別番号】519298765

【氏名又は名称】葡萄王生技股▲フン▼有限公司

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】陳 勁初

(72)【発明者】

【氏名】陳 炎▲錬▼

(72)【発明者】

【氏名】林 詩偉

(72)【発明者】

【氏名】▲呉▼ 思穎

(72)【発明者】

【氏名】陳 ▲彦▼博

(72)【発明者】

【氏名】侯 毓欣

(72)【発明者】

【氏名】王 ▲啓▼憲

(72)【発明者】

【氏名】石 仰慈

(72)【発明者】

【氏名】江 佳琳

【審査官】 山本 匡子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１５−２１３５０１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０９−０２３８４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０１−１９１６８４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Wang T, et al. Lactobacillus fermentum NS9 restores the antibiotic induced physiological and psychological abnormalities in rats. Benef Microbes. 2015;6(5):707-17. doi: 10.3920/BM2014.0177. Epub 2015 Apr 22. PMID: 25869281，２０１５年 ４月２２日

【文献】 Liu YW, et al. Psychotropic effects of Lactobacillus plantarum PS128 in early life-stressed and naive adult mice. Brain Res. 2016 Jan 15;1631:1-12. doi: 10.1016/j.brainres.2015.11.018. Epub 2015 Nov 24. PMID: 26620542.，２０１６年 １月

【文献】 Liang S, et al. Administration of Lactobacillus helveticus NS8 improves behavioral, cognitive, and biochemical aberrations caused by chronic restraint stress. Neuroscience. (2015). 310. 10.1016/j.neuroscience.2015.09.033.，２０１５年

【文献】 Pan DD, et al. Characterisation of Lactobacillus fermentum SM-7 isolated from koumiss, a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects. J Sci Food Agric. 2011 Feb;91(3):512-8. doi: 10.1002/jsfa.4214. Epub 2010 Oct 28. PMID: 21218486. ，２０１１年

【文献】 Luo J, et al. Ingestion of Lactobacillus strain reduces anxiety and improves cognitive function in the hyperammonemia rat. Sci China Life Sci. 2014 Mar;57(3):327-335. doi: 10.1007/s11427-014-4615-4. Epub 2014 Feb 19. PMID: 24554471.，２０１４年

【文献】 Bravo JA, et al. Ingestion of Lactobacillus strain regulates emotional behavior and central GABA receptor expression in a mouse via the vagus nerve. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Sep 20;108(38):16050-5. doi: 10.1073/pnas.1102999108. Epub 2011 Aug 29. PMID: 21876150; PMCID: PMC3179073.，２０１１年

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−７／０８

Ａ２３Ｌ ２９／００

Ａ２３Ｌ ３３／１３５

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

２０１８年０１月１２日に中国一般微生物株保存管理センター（ＣＧＭＣＣ）（連絡先：中国・北京・中国科学院微生物研究所；郵便番号：１００１０１；受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５２０３）に寄託されるラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＧＫＦ３であって、耐熱性を有し、ドーパミン含有量及びセロトニン含有量の向上のために使用される、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３。

【請求項2】

前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、耐酸性及び／又は胆汁酸塩耐性を有する請求項１に記載のラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３。

【請求項3】

２０１８年０１月１２日に中国一般微生物株保存管理センター（ＣＧＭＣＣ）（連絡先：中国・北京・中国科学院微生物研究所；郵便番号：１００１０１；受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５２０３）に寄託されるラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＧＫＦ３を含む、精神失調を改善するための組成物であって、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、耐熱性を有し、ドーパミン含有量及びセロトニン含有量の向上のために使用される、組成物。

【請求項4】

前記組成物は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収促進剤、甘味剤又はそれらの組み合わせの群から選ばれる１つ以上の添加剤を含む請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

前記組成物は、医薬品、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品、高齢者向け食品、離乳食、副食品又は健康食品である請求項３に記載の組成物。

【請求項6】

前記組成物の形態は、粉剤、錠剤、造粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液剤、スプレー剤又は座薬である請求項３に記載の組成物。

【請求項7】

前記精神失調の症状は、不眠症、自律神経障害、集中力低下、うつ病又はそれらの組み合わせを含む請求項３から６の何れか１項に記載の組成物。

【請求項8】

請求項１又は２のラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３を含む、ドーパミン含有量及びセロトニン含有量の向上のための組成物であって、被検者に投与されると、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、被投与者の脳組織におけるドーパミン含有量及びセロトニン含有量を向上する、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、精神失調を改善するための乳酸菌、それを含む組成物及びその適用に関し、より適切に、ラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）を含む組成物、及びその精神失調を改善する組成物の調製への適用に関する。

【背景技術】

【0002】

精神失調

【0003】

現代人の学業や仕事におけるストレスが大きいので、ますます多くの人は、不安の問題を持つようになり、不眠症、自律神経障害等の症状が見られ、集中力低下の問題が引き起こされ、ひいてはうつ病になる可能性がある。

【0004】

ドーパミン

【0005】

ドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）は、動機や駆動力を刺激する脳内分泌物質であり、神経細胞によるパルスの伝達を助けることに使用されることができ、神経伝達物質の一種で、主に、情欲、感覚を担い、興奮や愉快の情報を伝達し、また、依存症にも関わっている。ドーパミンの愉快や興奮を伝達する機能は、医学的にうつ病の治療に使用されている。

【0006】

ドーパミンが不十分又は調節異常になると、モチベーションの欠如、活力の喪失、集中力の欠如、又は筋肉に対する制御能力の欠如を引き起こす可能性がある。より悪くなると、手足が不随意に震え、更にパーキンソン病に進展することもある。しかし、ドーパミンが過剰に分泌されると、体力や熱を過度に消費し、早死に繋がっている。

【0007】

セロトニン

【0008】

セロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ）は、セロトニン５−ヒドロキシトリプタミンも呼ばれ、５−ＨＴと略され、モノアミン神経伝達物質である。セロトニンは、主に、動物の胃腸管、血小板及び中枢神経系に存在し、脳に含まれる含有量が全体量の２％であり、９０％が粘膜の腸クロム親和性細胞と筋層間神経叢にあり、腸運動の調節に関与する。セロトニンは、ヒトを精神的に安定させ平静させ、人々の気分、ストレス、集中力を制御し、一般的に幸福や愉快の感覚への貢献者だと考えられる。セロトニンが低いと、労働者は、不安になって、効率が低下しやすい。

【0009】

セロトニンの減少を引き起こす原因として、ストレスや、睡眠不足、栄養欠乏、運動不足等の多くの理由を含む。セロトニンの含有量が必要量を下回ると、集中力の低下等の問題が発生し、個人の計画や組織化能力に間接的に影響を及ぼし、ストレスや倦怠感を伴うことがよくある。セロトニン含有量が更に低下すると、うつ病を引き起こすことがある。脳内セロトニンのレベルの低下に関連する他の症状としては、怒りっぽさ、不安、疲労、慢性痛、落ち着きの無さ等を含む。症状が悪化すると、最終的に強迫性障害、慢性疲労症候群、関節炎、筋繊維痛、軽躁病及びうつ病を引き起こす可能性がある。

【0010】

ラクトバチルスファーメンタム

【0011】

ラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）は、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ）におけるグラム陽性種であり、動物及び植物を発酵させる材料によく見られ、最初にサワードウから見出された。その中のある株は動物のプロバイオティクスと同定され、且ついくつかの株が女性の泌尿生殖器感染症を治療するために使用されている。

【0012】

ラクトバチルスの適用

【0013】

近年の少数の文献は、腸内微生物がヒトの脳の発達、行為、及び情動能力に影響を与える可能性があることを示している。腸内微生物が腸脳軸によってマウスの気分に影響を与えて、不安様（ａｎｘｉｅｔｙ−ｌｉｋｅ）又はうつ病様（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｌｉｋｅ）の症状を引き起こす（Ｆｏｓｔｅｒ ａｎｄ ＭｃＶｅｙ Ｎｅｕｆｅｌｄ，２０１３）ことは、ある研究で示された。母子分離に起因する不安様及びうつ病様の行為があるマウスに対して、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を与えると、強制水泳試験でのマウスの不動時間を短縮し、マウスの砂糖水に対する好みを向上させることを示す研究もある。この結果によると、ラクトバチルスプランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、マウスの前頭前皮質におけるドーパミンの総量を増加させ、セロトニンの代謝率を低下させることができ、マウスのうつ病様の改善に役立つことが示された（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。他の実験によると、うつ病や不安行動を誘発するようにラットを２１日間拘束した後、ラクトバチルスヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）を与えることで、ラットのうつ病や不安を改善することができることも見出された（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。しかし、現在、市場では、精神失調に関連する疾患を改善するために、他の株を開発する必要性がまだある。

【発明の概要】

【0014】

本発明は、２０１８年０１月１２日に中国一般微生物株保存管理センター（ＣＧＭＣＣ）（連絡先：中国・北京・中国科学院微生物研究所；郵便番号：１００１０１；受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５２０３）に寄託されるラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＧＫＦ３を提供する。

【0015】

好ましくは、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、耐酸性、胆汁酸塩耐性及び／又は耐熱性を有する。

【0016】

本発明は、精神失調を改善する組成物であって、２０１８年０１月１２日に中国一般微生物株保存管理センター（ＣＧＭＣＣ）（連絡先：中国・北京・中国科学院微生物研究所；郵便番号：１００１０１；受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５２０３）に寄託されるラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＧＫＦ３を含む組成物を提供する。

【0017】

好ましくは、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、
ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３コロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を取って液体培地に接種して液体培養を行う工程（ａ）と、
工程（ａ）で培養されたコロニーからなる菌体を含む前記液体培地に対して発酵培養を行って、発酵全液を得る工程（ｂ）と、
で調製される。

【0018】

好ましくは、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、
工程（ｂ）で培養された発酵全液を遠心分離して、菌泥を得る工程（ｃ）と、
工程（ｃ）で得られた菌泥を凍結乾燥する工程（ｄ）と、
で調製される。

【0019】

好ましくは、工程（ａ）では、温度が２５〜４０℃であり、通気量が０〜１単位時間あたりに培地に導入されるガス体積（ａｉｒ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ；ｖｖｍ）の窒素ガス又は二酸化炭素であり、回転速度が２５０〜１０００ｒｐｍであり及び／又は培養時間が１６〜２４時間である。

【0020】

好ましくは、工程（ｃ）の菌泥と保護剤を混合してから凍結乾燥を行う。

【0021】

好ましくは、工程（ｄ）の凍結乾燥の事前凍結温度と時間としては、０〜−２０℃で１〜４時間保存して、次に−１５〜−４０℃で４〜８時間保存して、最後、−１９６〜−４０℃で８時間を超えて凍結させる。

【0022】

好ましくは、前記組成物は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収促進剤、甘味剤又はそれらの組み合わせの群から選ばれる１つ以上の添加剤を含む。

【0023】

好ましくは、前記組成物は、医薬品、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品、高齢者向け食品、離乳食、副食品又は健康食品である。

【0024】

好ましくは、前記組成物の形態は、粉剤、錠剤、造粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル、液剤、スプレー剤又は座薬である。

【0025】

本発明は、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３が精神失調を改善する用途に用いられることが実験的に判明された。

【0026】

好ましくは、前記精神失調の改善としては、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３の投与されていない非被験者に対して、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３の投与された被験者の脳組織におけるドーパミン含有量が向上することである。

【0027】

好ましくは、前記精神失調の改善としては、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３の投与されていない非被験者に対して、前記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３の投与された被験者の脳組織におけるセロトニン含有量が向上することである。

【0028】

好ましくは、前記精神失調の症状は、不眠症、自律神経障害、集中力低下、うつ病又はそれらの組み合わせを含む。

【図面の簡単な説明】

【0029】

下記図面の簡単な説明は、本発明の上記又は他の目的、特徴、メリット、実施例をより分かりやすくするためのものである。

【図1】ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３と他の株のｒｅｃＮ遺伝子の系統樹を示す。

【図2】ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３と他の株の耐酸試験の菌数を示す。

【図3】ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３と他の株の胆汁酸塩耐性試験の菌数を示す。

【図4】ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３と他の株の耐熱試験の菌数を示す。

【図5】マウス脳組織におけるドーパミン含有量を示す。

【図6】マウス脳組織におけるセロトニン含有量を示す。

【発明を実施するための形態】

【0030】

本発明で言及される単数形の「一」、「１つ」及び「前記」は、文脈が明確に別の指定がない限り、複数の引用を含む。特に指定されない限り、数値の範囲（例えば、１０％〜１１％のＡ）は、何れも上限値及び下限値（即ち、１０％≦Ａ≦１１％）を含む。数値の範囲として、下限値が指定されていない場合（例えば、０．２％よりも低いＢ、又は０．２％以下のＢ）、その下限値が０となる可能性があることを意味する（即ち、０％≦Ｂ≦０．２％）。上記の用語は、本発明を限定するためのものではなく、本発明を説明し理解するために使用される。

【0031】

菌種由来

【0032】

本実験に使用される乳酸菌は、ラクトバチルス属のラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）であった。好ましい実施態様において、この菌株は、台湾の新竹にある北埔屋で販売されている伝統的な漬け発酵キムチから収集された。３０日以上自然発酵させた様々な野菜のキムチ製品からサンプリングし、収集して袋詰めした後でラベルを付けて、冷蔵庫で低温保管し、当日に研究室に輸送して菌株分離を行った。

【0033】

スクリーニングと培養

【0034】

検体袋を無菌作業台に置き、滅菌された滅菌ピペットで発酵させた野菜の葉の濾液を抽出し、また検体の１０倍量の滅菌水でホモジナイザーによる均質化処理を行った。１ｍＬの希釈溶液を抽出して、０．１％のブロモクレゾールグリーン（ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ ｇｒｅｅｎ）を含むＭａｎ Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ（ＭＲＳ）培地に入れ、３７℃で増菌培養を１６時間行って、試験品に含まれる乳酸菌の数を増やし、選別試料における少数の乳酸菌株の分離される確率を高めるようにした。増菌培養後の試料を採取し、連続希釈の操作を行った。１００，０００倍及び１００万倍まで希釈した連続希釈の後で、それぞれ０．１ｍＬを取って、無菌培養皿に入れ、培養皿にそれぞれロゴサ寒天、ビフィドバクテリウム培地（ＢＩＭ−２５）の寒天、ジャガイモ澱粉／酵母抽出寒天、ブロモクレゾールグリーンＭＲＳ寒天及びブロモクレゾールパープルＭＲＳ寒天を入れた。３７℃で４０時間嫌気培養された後、各培地に対して１５〜２０株の単一コロニーを選択した。分離された単一株をＭＲＳ培養液で培養し、特定の温度で１６時間培養した後、５０％の菌種の凍結保存液（グリセロール）を添加した。エンドトキシンとしてリポ多糖（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＬＰＳ）をＲＡＷ ２６４．７細胞株に投与するモードで炎症反応を誘導し、分離された単一株の炎症反応に対する阻害効果を試験することで、高機能菌株を選別した。前記高機能菌株とは、ＲＡＷ ２６４．７のＬＰＳにより誘発される一酸化窒素や腫瘍壊死因子−α等の炎症反応指数を効率的に阻害できる株を指し、いわゆる「効率的」とは阻害率が８０％以上であることを意味する。高機能菌株を記録して、約−８０℃の冷蔵庫で冷凍保存して、後の実験で生理的調節の機能的可能性を研究するように用意した。分離された高機能菌株から、トリプトファンデカルボキシラーゼ（Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）活性の高い菌株を選別して、セロトニン前駆体トリプタミン（Ｔｒｙｐｔａｍｉｎｅｓ）の生物での濃度を増加させることで、セロトニン活性を増加させた。

【0035】

遺伝子型分析−系統樹

【0036】

ＧＫＦ３菌株の菌株進化での独自性を研究するために、アメリカンタイプカルチャーコレクションセンター（ＡＴＣＣ）から、ラクトバチルスファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ ９３３８（即ち、台湾新竹食品産業発展研究所生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）、受託番号ＢＣＲＣ １０３６０の菌株）、ＡＴＣＣ １４９３１（即ちＢＣＲＣ １２１９０）、ＡＴＣＣ １１７３９（即ちＢＣＲＣ １２１９４又はＢＣＲＣ １４０５６）、及びＡＴＣＣ ２３２７１という合計５種類の菌株を購入した。前記の５つの菌株とＧＫＦ３に対して、遺伝子配列を比較した。ＧＫＦ３と前記の５つの菌株を活性化して、拡大後にｇＤＮＡを抽出し、下記表１と配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）１、２に示すプライマー対をそれぞれ使用して、９４℃で３分間、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で１分１０秒間反応させるように３５サイクル行って、最後に７２℃で５分間反応させた条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実行した。

【0037】

【表1】

【0038】

反応完了した試料をシーケンスし、ＧＫＦ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）と前記購入した５つの菌株という合計で６つの菌株のｒｅｃＮ配列を取得して、ＭＥＧＡ ＸソフトウェアのＮｅｉｇｈｂｏｒ−Ｊｏｉｎｉｎｇモードで系統樹を描いて、照合結果を図１に示した。図１は、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３と他の株のｒｅｃＮ遺伝子の系統樹を示し、横線が遺伝子多様性を単位として測定された進化の変化を示し、前記横線のスケールが左下に示される。ｒｅｃＮ遺伝子の系統樹において、ＧＫＦ３の系統樹での位置が他の菌株から分離され、自己で一列になってよい。この結果により、ＧＫＦ３は遺伝的違いから見ると、既存のラクトバチルス種類と大きな違いがあり、新規のラクトバチルス株であることが示された。ＧＫＦ３は、新規株であることと確認された後、それぞれ２０１８年０２月１２日生物資源保存及び研究センター（ＢＣＲＣ）（連絡先：台湾・新竹・食品工業発展研究所；郵便番号：３００６２；受託番号：ＢＣＲＣ ９１０８２４）及び２０１８年０１月１２日に中国一般微生物株保存管理センター（ＣＧＭＣＣ）（連絡先：中国・北京・中国科学院微生物研究所；郵便番号：１００１０１；受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５２０３）に寄託された。

【0039】

表現型の分析─耐酸試験

【0040】

ＧＫＦ３及びＡＴＣＣ ２３２７１、ＡＴＣＣ １４９３１（即ちＢＣＲＣ １２１９０）、ＡＴＣＣ １１７３９（即ちＢＣＲＣ １２１９４）とＡＴＣＣ ９３３８（即ちＢＣＲＣ １０３６０）という５つの菌株を活性化した。元のＭＲＳ液体培地のｐＨ値がｐＨ６．５であるが、ＨＣｌをＭＲＳ液体培地に加えることで、前記培地のｐＨ値をｐＨ３．２、ｐＨ２．４、ｐＨ２．０という３つの異なるｐＨに調整した。菌株を異なるｐＨの培地に接種し、３７℃で３時間培養した後で、コロニーの形成数を計数した。実験結果を表２及び図２に示した。

【0041】

図２は、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３と他の株の耐酸試験の菌数を示し、横軸がｐＨを示し、縦軸が単位体積あたりの菌数の対数値（ｌｏｇ ＣＦＵ／ｍＬ）を示し、垂直バー２０１、垂直バー２０３、垂直バー２０５、垂直バー２０７及び垂直バー２０９はそれぞれＧＫＦ３、ＡＴＣＣ ２３２７１、ＡＴＣＣ １４９３１、ＡＴＣＣ １１７３９とＡＴＣＣ ９３３８であり、符号「＊」及び「＃」はそれぞれｐＨ値がｐＨ２．４とｐＨ２．０である場合、ＧＫＦ３と他の菌株との間で菌数に有意差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。

【0042】

結果は表２と図２に示すように、元の約ｐＨ６．５の培養で、ＧＫＦ３（垂直バー２０１）と他の４つの菌株（垂直バー２０３、垂直バー２０５、垂直バー２０７と垂直バー２０９）の菌数は、何れも１０の１０次方（ＣＦＵ／ｍＬ）に達することができた。ｐＨ値が３．２である場合、全部菌株の菌数はやや低下し、ＧＫＦ３は他の４つの菌株と比べると有意差がなかった。ｐＨ値が２．４まで低下する場合、ＡＴＣＣ １４９３１（垂直バー２０５）を除いて、他の菌株（垂直バー２０３、垂直バー２０７、垂直バー２０９）の菌数の何れもＧＫＦ３の菌数（ｐ＜０．０５）よりも大幅に少なかった。ｐＨ値が２．０まで低下する場合、ＡＴＣＣ ２３２７１、ＡＴＣＣ １４９３１、ＡＴＣＣ １１７３９とＡＴＣＣ ９３３８の菌数が約１０の４次方（ＣＦＵ／ｍＬ）まで低下し、菌数が１０の５次方（ＣＦＵ／ｍＬ）に維持されるＧＫＦ３（ｐ＜０．０５）よりも大幅に少なかった。これにより、酸性環境でのＧＫＦ３の生菌数は他の菌株よりも大幅に多く、この実験結果により、ＧＫＦ３の耐酸性能力が他の菌株よりも良いことが判明されるため、ＧＫＦ３が胃を通過する場合に胃酸に抵抗する能力はより優れていた。

【0043】

【表2】

【0044】

表現型の分析─胆汁酸塩耐性試験

【0045】

ＧＫＦ３、ＡＴＣＣ ２３２７１、ＡＴＣＣ １４９３１、ＡＴＣＣ １１７３９とＡＴＣＣ ９３３８という合計で５つの菌株を活性化した。これらの菌株を０．３％の胆汁酸塩を含むＭＲＳ液体培地に接種して、３７℃で半時間浸した後、コロニーの形成数を計数した。実験結果を表３及び図３に示した。

【0046】

図３は、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３と他の株の胆汁酸塩耐性試験の菌数を示し、横軸は培地組成を示し、縦軸は菌数を示し、垂直バー３０１、３０３、３０５、３０７及び３０９はそれぞれＧＫＦ３、ＡＴＣＣ ２３２７１、ＡＴＣＣ １４９３１、ＡＴＣＣ １１７３９とＡＴＣＣ ９３３８であり、符号「＊」はＧＫＦ３と他の菌株との間で菌数に有意差がある（ｐ＜０．０５）ことを示す。

【0047】

結果は表３と図３に示すように、元のＭＲＳ液体培地で培養される場合、ＧＫＦ３（垂直バー３０１）と他の４つの菌株（垂直バー３０３、垂直バー３０５、垂直バー３０７と垂直バー３０９）の菌数の何れも１０^９ＣＦＵ／ｍＬに達することができた。０．３％の胆汁酸塩の加えられたＭＲＳにおいて、ＧＫＦ３以外の菌株は、その菌株の菌数が約１０の７次方（ＣＦＵ／ｍＬ）まで低下し、統計上、何れもＧＫＦ３の１０の８次方（ＣＦＵ／ｍＬ）よりも少なかった（ｐ＜０．０５）。これにより、胆汁酸塩環境でＧＫＦ３の生菌数は他の菌株よりも大幅に多く、この実験結果により、ＧＫＦ３の胆汁酸塩耐性能力が他の菌株よりも良いことが判明されるため、ＧＫＦ３が体内の消化管を通過する場合に胆汁酸塩に抵抗する能力はより優れていた。

【0048】

【表3】

【0049】

表現型の分析─耐熱試験

【0050】

ＧＫＦ３の他の菌株に対する耐熱性を比べた。ＧＫＦ３、ＡＴＣＣ ２３２７１、ＡＴＣＣ １４９３１、ＡＴＣＣ １１７３９とＡＴＣＣ ９３３８という合計で５つの菌株を活性化した。前記菌株を７０℃の水浴で５、１０と１５分間加熱した後で、菌数を観察し計数した。実験結果を表４と図４に示した。

【0051】

図４は、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３と他の株の耐熱試験の菌数を示し、横軸は加熱時間を示し、縦軸は菌数を示し、垂直バー４０１、４０３、４０５、４０７及び４０９はそれぞれＧＫＦ３、ＡＴＣＣ ２３２７１、ＡＴＣＣ １４９３１、ＡＴＣＣ １１７３９とＡＴＣＣ ９３３８であり、符号「＊」及び「＃」はそれぞれ１０分間と１５分間加熱した後、ＧＫＦ３と他の菌株との間で菌数に有意差があった（ｐ＜０．０５）ことを示す。

【0052】

結果は、表４と図４に示すように、加熱されていない場合（０分間）、ＧＫＦ３と他の４つの菌株の菌数は何れも９×１０^９ＣＦＵ／ｍＬに達することができた。７０℃で５分間加熱した後で、全部菌株の菌数は何れも１０の６次方（ＣＦＵ／ｍＬ）まで低下した。７０℃で１５分間加熱した後で、ＡＴＣＣ ２３２７１、ＡＴＣＣ １４９３１、ＡＴＣＣ １１７３９とＡＴＣＣ ９３３８の菌数は約１０の４次方（ＣＦＵ／ｍＬ）に急に低下し、何れも菌数が１０の５次方（ＣＦＵ／ｍＬ）に維持されるＧＫＦ３（ｐ＜０．０５）よりも大幅に少なかった。これにより、高温環境でＧＫＦ３の生菌数は他の菌株よりも大幅に多いことが分かり、ＧＫＦ３の耐熱が優れ、菌株の高温環境での安定性がより優れることが判明された。

【0053】

【表4】

【0054】

菌株培養

【0055】

上記ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３のコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を取って液体培地に接種して、三角フラスコにおいて液体培養を行った。好ましい実施態様において、温度が２５〜４０℃であり、通気量が０〜１単位時間あたりに培地に導入されるガス体積（ａｉｒ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｖｏｌｕｍｅ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ，ｖｖｍ）の窒素ガス又は二酸化炭素であり、速度が２５０ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍである条件で液体培養を行った。好ましい実施態様において、液体培養の時間は１６〜２４時間であり、１８時間であれば、生菌数が最高点に達することができるのでより好ましかった。好ましい実施態様において、液体培地はＭＲＳ液体培地であった。好ましい実施態様において、液体培地のレシピを下記表５に示した。液体培養が完成した後で発酵培養を行った。

【0056】

【表5】

【0057】

凍結乾燥粉末の調製

【0058】

ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３が発酵培養されて生長完了になる後、菌体と培養液を含む発酵全液を収集し遠心分離を行って菌泥を得た。好ましい実施態様において、発酵全液に１５重量％の脱脂粉乳を入れて１〜４時間静置し菌体を団粒状に凝縮させて回収率を上げてから、１０００〜１５０００ｒｐｍの速度で遠心分離を行った。遠心分離後で得られた菌泥と保護剤としての６〜５０重量％の脱脂粉乳を混合した後で凍結乾燥を行った。最後、凍結乾燥後で得られた凍結乾燥粉末を低温で保存した。好ましい実施態様において、凍結乾燥の事前凍結温度としては、順次に０〜−２０℃で１〜４時間保存し、次に−１５〜−４０℃で４〜８時間保存し、最後、−１９６〜−４０℃で８時間を超えて凍結させるような勾配によって設定した。好ましい実施態様において、凍結乾燥温度と時間は、−５℃で約２時間、次に−２０℃で約６時間、最後−５０℃で約１６時間であった。好ましい実施態様において、低温保存の温度は、−３０〜０℃であった。保存される凍結乾燥粉末は、以下の動物実験において動物に投与される摂食試料の原料として使用された。本願で使用されるラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３の使用時の態様は、前記凍結乾燥粉末、前記菌体及び培養液を含む発酵全液、並びに発酵全液の遠心分離後の菌泥を含むが、これらに限定されない。

【0059】

実験動物

【0060】

試験動物は、それぞれ体重が約２０〜２５グラムである３０匹のＩＣＲ雄性マウスであり、ＢｉｏＬＡＳＣＯ（ＬＡＳＣＯバイオテクノロジー、台湾）から購入された。マウスを通常のケージで飼育し、室温を２３±２℃に維持し、湿度を５０±５％にし、１２時間の明暗サイクルで飼育し、飼料及び滅菌逆浸透水の両方がマウスによって自由に摂取されるようにした。研究の前に、マウスを実験室環境に１週間順応させた。全ての動物実験プロセスも弘光科学技術大学の実験動物管理及び使用委員会によって審査及び承認された。

【0061】

試験動物に通常の成体ラットの餌を投与し蒸留水を１週間飲ませ環境に１週間順応させてから、それらをランダムに各群6匹ずつに分け、群別として対照群と実験群Ａ〜実験群Ｄという５つの群に分けた。

【0062】

実験フロー

【0063】

実験群Ａ〜Ｄのマウスに対して、下記表６に従って異なる菌株の凍結乾燥粉末を生理食塩水に溶解し、これを各実験群Ａ〜Ｄのマウスに１日１回給餌するが、対照群に対して、同体積の０．９％の生理食塩水を給餌することを４週間行う。マウスに経管給餌し、通常、ステンレス鋼の給餌針を７５％のアルコール溶液に浸し、使用前に０．９％の生理食塩水で洗浄し湿らせて、１ｍＬの滅菌プラスチックシリンジをステンレス鋼の給餌針に置いて給餌した。

【0064】

【表6】

【0065】

給餌分量の計算は、実験動物と人体の表面積の比の等価分量に基づいて係数を換算し、マウスとヒトとの変換係数が１２．３であった。マウスを週に１回体重を測定し、各群の平均体重を計算した後、マウスの体重として２５グラムで計算した。提供された試料成人（６０ｋｇで計算）に、１０００ｍｇ（１日１人当たり約１０００億の生菌数）の量で毎日投与し、下記の公式（Ｉ）によってマウスへの毎日の経管給餌量に換算した。
マウスへの毎日の経管給餌分量（ｇ）
＝｛成人の毎日の分量／６０ｋｇ（成人体重）｝
×マウス体重（ｋｇ）×１２．３（マウスと人の換算係数） （Ｉ）

【0066】

上記の公式によって計算した実験群の給餌分量が２０５ｍｇ／ｋｇであり、マウスの体重として２５グラムで計算され、毎日５．１２５ｍｇ給餌した。

【0067】

実験の１５日目から、各群のマウスを、精神失調を誘発するために、合計１４日間をかけて毎日閉鎖した。各群マウスを、換気の良い透明なリミッター（１００×４０ｍｍ）に１日１回、２時間閉鎖した。４週間の実験が終了した後で、二酸化炭素（ＣＯ_２）で麻酔した後でマウスを屠殺し、血液をエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）チューブに採取し、４℃で遠心分離し、−８０℃で保存した。マウスの全海馬を迅速に取り出し、低温生理食塩水でホモジナイズし、４℃で１０分間（１３０００×ｇ）遠心分離し、上清を収集して、−８０℃で保存し、後の生化学的評価のために用意しておいた。

【0068】

ドーパミン含有量の測定

【0069】

一般に、ネズミの脳内のドーパミン及び／又はセロトニン含有量が低下すると、ネズミの集中力も低下し、精神失調があると判断される。商業分析ＥＬＩＳＡキット（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）によって大脳におけるドーパミン（ｄｏｐａｍｉｎｅ）含有量を測定した。

【0070】

各群別のマウス脳組織におけるドーパミン含有量の結果を図５に示した。図５は、マウス脳組織におけるドーパミン含有量を示し、縦軸はドーパミン含有量を示し、垂直バー５０１、５０３、５０５、５０７及び５０９はそれぞれ制御群、実験群Ａ、Ｂ、ＣとＤを示し、符号「＊」は有意差を示した（ｐ＜０．０５）。閉鎖によって精神失調が誘発されたマウスの脳組織のドーパミン含有量は有意に低くなり、試験中にラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３が投与される（実験群Ｃ）と、制御群と比べると、マウス脳組織におけるドーパミン含有量（ｐ＜０．０５）を大幅に向上させた。例えばラクトバチルスプランタルムＣＧＭＣＣ １４５６５、ラクトバチルスファーメンタムＡＴＣＣ ２３２７１、ラクトバチルスアシドフィルスＡＴＣＣ ３１４のような他の株の乳酸菌と比べると、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、ドーパミンを向上させる効果の何れも更に顕著であった。

【0071】

セロトニン含有量の測定

【0072】

商業分析ＥＬＩＳＡキット（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ，ＵＳＡ）によって大脳におけるセロトニン（５−ＨＴ）含有量を測定した。各群別のマウス脳組織におけるセロトニン含有量は図６に示された。図６は、マウス脳組織におけるセロトニン含有量を示し、縦軸はセロトニン含有量を示し、垂直バー６０１、垂直バー６０３、垂直バー６０５、垂直バー６０７及び垂直バー６０９はそれぞれ制御群、実験群Ａ、実験群Ｂ、実験群Ｃと実験群Ｄを示し、符号「＊」は有意差を示した（ｐ＜０．０５）。閉鎖によって精神失調が誘発されたマウスの脳組織のセロトニン含有量は有意に低くなり、試験中に同時にラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３が投与される（実験群Ｃ）と、マウス脳組織におけるセロトニン含有量（ｐ＜０．０５）を大幅に向上させた。例えばラクトバチルスプランタルムＢＣＲＣ ９１０７８７、ラクトバチルスファーメンタムＢＣＲＣ ２３２７１、ラクトバチルスアシドフィルスＢＣＲＣ １４０６４のような他の株の乳酸菌と比べると、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３がセロトニンを向上させる効果の何れも更に顕著であった。

【0073】

データ統計分析

【0074】

実験結果は、平均値（Ｍｅａｎｓ）±標準差（ＳＤ）で示され、ＳＰＳＳ（バージョン１２）商用統計ソフトウェアによって分析して、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）で各群平均値の差異性を比較してから、ダンカンの多重比較（Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）で事後検定を行って、ｐ＜０．０５になる場合、統計的に有意な差異性を有することを示した。

【0075】

上記の結果をまとめると、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、閉鎖によって精神失調が誘発されたマウス脳におけるドーパミン及びセロトニン含有量を効果的に向上させ、ストレスによる関連精神失調の発生リスクを低減することができる。

【0076】

本発明は、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３を含む組成物であって、精神失調を改善する効果を有する組成物を提供する。

【0077】

場合によって、前記組成物は、更に添加剤を含んでよい。好ましい実施態様において、前記添加剤は、賦形剤、防腐剤、希釈剤、充填剤、吸収促進剤、甘味剤、又はそれらの組み合わせであってよい。前記賦形剤は、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、スクロース又はそれらの組み合わせから選ばれてよい。前記防腐剤は、組成物の貯蔵寿命を延ばすことができ、例えばベンジルアルコール、パラベン（ｐａｒａｂｅｎｓ）であってよい。前記希釈剤は、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン又はそれらの組み合わせから選ばれてよい。前記充填剤は、ラクトース、ガラクトース、高分子量ポリエチレングリコール又はそれらの組み合わせから選ばれてよい。前記吸収促進剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ラウロカプラム（Ｌａｕｒｏｃａｐｒａｍ）、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール又はそれらの組み合わせから選ばれてよい。前記甘味剤は、アセスルファムＫ（Ａｃｅｓｕｌｆａｍｅ Ｋ）、アスパルテーム（ａｓｐａｒｔａｍｅ）、サッカリン、（ｓａｃｃｈａｒｉｎ）、スクラロース（ｓｕｃｒａｌｏｓｅ）、ネオテーム（ｎｅｏｔａｍｅ）又はそれらの組み合わせから選ばれてよい。上記に示される添加剤に加え、ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３の効果に影響を与えないという前提で、要求に応じて他の添加物を選択してよい。

【0078】

前記組成物は、市場の要求に応じて異なる製品に開発されることができる。好ましい実施態様において、前記組成物は、医薬品、飼料、飲料、栄養補助食品、乳製品、高齢者向け食品、離乳食、副食品又は健康食品である。

【0079】

前記組成物は、被投与者の要求に応じて、異なる形態を採用することができる。好ましい実施態様において、前記組成物の形態は、粉剤、錠剤、造粒、坐剤、マイクロカプセル、アンプル（ａｍｐｏｕｌｅ／ａｍｐｕｌｅ）、液剤、スプレー剤又は座薬である。

【0080】

本発明の組成物は、動物又はヒトに使用されることができる。ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３の効果に影響を与えない前提で、乳酸菌を含む組成物は、任意の薬物の形態として調製され、薬物の形態に応じて適切な方法で動物又はヒトに投与されることができる。

【0081】

組成物の調製

【0082】

本発明のＧＫＦ３は、食品用途に適用されると、以下の組成物１の態様を例示的な実例とした。

【0083】

組成物１：ＧＫＦ３の凍結乾燥粉末（２０ｗｔ％）を取って、防腐剤としてのベンジルアルコール（８ｗｔ％）及び希釈剤としてのグリセリン（７ｗｔ％）を十分に混合して、純水（６５ｗｔ％）に溶解し、使用するために４℃で保存した。前記ｗｔ％とは、各成分の組成物の総重量に対する比率を意味していた。

【0084】

本発明のＧＫＦ３は、液体剤形で医療用途に適用されると、以下の組成物２の態様を例示的な実例とした。

【0085】

組成物２：ＧＫＦ３の凍結乾燥粉末（２０ｗｔ％）を取って、防腐剤としてのベンジルアルコール（８ｗｔ％）、希釈剤としてのグリセリン（７ｗｔ％）及び希釈剤としてのスクロース（１０ｗｔ％）を十分に混合して、純水（５５ｗｔ％）に溶解し、使用するために４℃で保存した。前記ｗｔ％は、各成分の組成物の総重量に対する比率を意味していた。

【符号の説明】

【0086】

２０１／２０３／２０５／２０７／２０９／３０１／３０３／３０５／３０７／３０９／４０１／４０３／４０５／４０７／４０９／５０１／５０３／５０５／５０７／５０９／６０１／６０３／６０５／６０７／６０９：垂直バー
［寄託菌株］

【0087】

ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、中国一般微生物株保存管理センター（ＣＧＭＣＣ）（連絡先：中国・北京・中国科学院微生物研究所（ＣＧＭＣＣ）；郵便番号：１００１０１、保存日：２０１８年０１月１２日、受託番号：ＣＧＭＣＣ Ｎｏ．１５２０３）に寄託されている。ラクトバチルスファーメンタムＧＫＦ３は、別に台湾新竹食品路３３１号財団法人食品産業発展研究所生物資源保存研究センター（ＢＣＲＣ）（保存日：２０１８年２月１２日；受託番号：ＢＣＲＣ ９１０８２４）に保存されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]