特許 6870041 Ｌ−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物及びそれを用いたＬ−トリプトファンの製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6870041

(24)【登録日】2021年4月16日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】Ｌ−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物及びそれを用いたＬ−トリプトファンの製造方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/21 20060101AFI20210426BHJP

   C12P 13/22 20060101ALI20210426BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20210426BHJP

   C12R 1/19 20060101ALN20210426BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/21ZNA

   C12P13/22 A

   !C12N15/55

   C12R1:19

【請求項の数】3

【外国語出願】

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2019-142665(P2019-142665)

(22)【出願日】2019年8月2日

(62)【分割の表示】特願2017-555793(P2017-555793)の分割

【原出願日】2016年5月10日

(65)【公開番号】特開2019-213544(P2019-213544A)

(43)【公開日】2019年12月19日

【審査請求日】2019年8月29日

(31)【優先権主張番号】10-2015-0067659

(32)【優先日】2015年5月14日

(33)【優先権主張国】KR

【微生物の受託番号】KCCM  KCCM11636P

(73)【特許権者】

【識別番号】513178894

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】110000796

【氏名又は名称】特許業務法人三枝国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】パク へ ミン

(72)【発明者】

【氏名】イ ペク ソク

(72)【発明者】

【氏名】イ ソク ミョン

(72)【発明者】

【氏名】キム キョンリム

(72)【発明者】

【氏名】イ クァン ホ

(72)【発明者】

【氏名】チョン キ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】イ クン チョル

(72)【発明者】

【氏名】ホン ヒョンピョ

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 Microbial Cell Factories，２０１２年，Vol.11, 30 (9 pages)

【文献】 Journal of Biological Chemistry，２００６年，Vol.281, No.47，p.36149-36161

【文献】 Microbial Cell Factories，２００９年，Vol.8, 19 (12 pages)

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A，２０００年，Vol.97, No.12，6640-6645

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ １３／００−１３／２４

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ９／００−９／９９

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列を含むホスファターゼ（phosphatase）の活性が不活性化されるように変異された、変異されていない微生物に比べて増加されたＬ−トリプトファン生産能を有し、ｐｈｅＡ遺伝子の一部又は全体及びｔｎａＡＢ遺伝子の一部又は全体が欠失し、トリプトファンオペロンが過発現した、エシェリキア属（Escherichia）微生物であって、前記不活性化は天然型菌株または変形前の菌株に比べて活性がないまたは減少された、微生物。

【請求項2】

前記エシェリキア属微生物が、大腸菌（Escherichia coli）である、請求項１に記載のＬ−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物。

【請求項3】

（ｉ）請求項１または２のエシェリキア属微生物を培地で培養する段階；及び
（ｉｉ）前記培養による培地または前記微生物からＬ−トリプトファンを回収する段階を含む、Ｌ−トリプトファンの製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はホスファターゼの活性が不活性化されるように変異された、Ｌ−トリプトファ
ン生産能を有するエシェリキア属微生物、及び前記微生物を用いてＬ−トリプトファンを
製造する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ−トリプトファン（L-tryptophan）は必須アミノ酸の一つであり、飼料添加剤、輸液
剤などの医薬品原料及び健康食品の素材などとして広く使用されてきた。このような、Ｌ
−トリプトファンは、化学合成法、酵素反応法、発酵法などを経て製造されることができ
るが、現在では微生物を用いた直接発酵法が主に用いられている。

【0003】

微生物は、Ｌ−トリプトファン生合成時、解糖過程（glycolysis）の中間物質であるホ
スホエノールピルビン酸（phosphoenol pyruvate、PEP）とペントースリン酸経路（pento
se phosphate pathway）の生成物である、エリスロース-４-リン酸（erythrose-4-phosph
ate、E4P）がＤＡＨＰシンターゼ（3-Deoxy-D-arabinoheptulosonate 7-phosphate synth
ase、EC 2.5.1.54）により重合反応を始める芳香族生合成経路を有している。前記経路上
でＰＥＰとＥ４Ｐはそれぞれリン酸塩（phosphate）と結合されていて、高いエネルギー
を含有した物質である。また、続いた芳香族生合成経路でもＥＰＳＰシンターゼ（5-enol
pyruvylshikimate-3-phosphate synthase、EC 2.5.1.19）反応時ＰＥＰが反応に参加し、
アントラニル酸塩ＰＲＰＰトランスフェラーゼ（anthranilate phosphoribosyl transfer
ase、EC 2.4.2.18）の反応でＰＲＰＰが使用される。このように、トリプトファン生合成
のためには高エネルギーの物質を多く必要とすると知られている。先行研究によると、２
０個のアミノ酸の中トリプトファン生合成時、最も高い水準のエネルギーを必要とするこ
とが細胞内実際定量分析により証明されたことがある（非特許文献１）。ここで、トリプ
トファンを高濃度に生産する菌株でＰＥＰとＥ４Ｐは、前駆体の継続的な供給とエネルギ
ー効率的利用の面で重要な役割をすると考えられる。

【0004】

ここで、Ｅ４Ｐを安定的に供給するためにトランスケトラーゼ（transketolase、EC 2.
2.1.1）をコードするｔｋｔＡ遺伝子（NCBI gene ID: 12931960）の発現を強化させて生
合成を増加させる方法が主に使用されていた（非特許文献２）。また、細胞内エネルギー
水準を維持させるための研究としては高エネルギー物質であるＡＴＰを少なく使用させる
方向の研究が多く進行されていた（非特許文献３）。しかし、依然としてＬ−トリプトフ
ァンを高効率で生産するための方法開発の必要性が高かった。

【0005】

このような背景下、本発明者らはＬ−トリプトファンを高効率で生産するための方法を
開発するために鋭意努力した結果、トリプトファン生産菌株内で合成されるＥ４Ｐの分解
を防ぎ細胞内Ｅ４Ｐ濃度を維持し、付随的に不必要に消費されるエネルギーを保存する方
法を開発し、その結果としてトリプトファン生成能が向上されることを確認して、本発明
を完成した。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】大韓民国特許公開第１０-２０１３-００８２１２１号

【特許文献2】大韓民国特許公開第１０-２００９-００７５５４９号

【特許文献3】大韓民国登録特許第１０-１２６１１４７号

【特許文献4】韓国登録特許第１０-０７９２０９５号

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Proc. Natl. Acad. Sci. USA,(2002) V99, pp3695-3700

【非特許文献2】Current Opinion in Biotechnology, (2009) V20, pp651-658

【非特許文献3】FEMS Microbiol Lett, (2009)V297, pp217-224

【非特許文献4】Proc Natl Acad Sci USA, (2000) 97:6640-6645

【非特許文献5】Gene, （2000）247、255-264

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明の一つの目的は、Ｌ−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物を提
供することにある。

【0009】

本発明のもう一つの目的は、前記Ｌ−トリプトファン生産能を有する微生物を用いてＬ
−トリプトファンを製造する方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0010】

前記目的を達成するために、本発明の一つの様態として、配列番号１のアミノ酸配列を
有するホスファターゼの活性が不活性化されるように変異された、Ｌ−トリプトファン生
産能を有するエシェリキア属（Escherichia）微生物を提供する。例えば、前記Ｌ−トリ
プトファン生産能を有するエシェリキア属微生物は内在的ホスファターゼの活性が不活性
化されるように変異されないＬ−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物に
比べて、トリプトファン生産能が増加された微生物であってもよい。

【0011】

本発明における用語、「Ｌ−トリプトファン（L-tryptophan）」は、α−アミノ酸の一
つで、体内で合成されない必須アミノ酸であり、化学式がＣ_１１Ｈ_１２Ｎ_２Ｏ_２
である芳香族Ｌ−アミノ酸をいう。微生物において、生産能を増加させるために、既存に
はトリプトファン生産菌株からエリスロース-４-リン酸（erythorse-4-phosphate、E4P）
のような前駆体の継続的な供給とエネルギーの効率的な利用のため、ｔｋｔＡ遺伝子の発
現を強化させるか、生合成経路での側枝経路を遮断して生合性を増加させる方法またはＡ
ＴＰを少なく使用する方法などが使用されてきた。

【0012】

本発明における用語、「ホスファターゼ（phosphatase）」は、基質からリン酸基を除
去する反応を触媒するタンパク質であってもよい。本発明における「配列番号１のアミノ
酸配列を有するホスファターゼ」は、遺伝子ｙｉｄＡによりコードされるタンパク質であ
って、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）ＤＢには糖リン酸ホスファターゼと命
名されており、（NCBI gene ID: 12933583）、ＥｃｏＣｙｃＤＢ（http://www.ecocyc.or
g）上には糖ホスファターゼと命名されている。前記タンパク質は糖リン酸を基質として
、糖とリン酸に分解する反応を触媒する。しかし、前記酵素とトリプトファン生産強化に
対する関連性は明らかにされていない。

【0013】

前記酵素は配列番号１で記載したアミノ酸配列だけでなく、前記配列と７０％以上、具
体的には８０％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上、もっと
さらに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示すアミノ酸配列と
して実質的に前記酵素と同一または相応する効能を示す酵素であれば、制限なく含まれる
。また、このような相同性を有し、各酵素に相応する効能を示すアミノ酸配列であれば、
一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列を有する酵素変異体も本発
明の範囲内に含まれることは自明である。

【0014】

前記アミノ酸配列１で記載したホスファターゼをコードする遺伝子は、前記酵素をコー
ドすることができる配列であれば、制限なく含まれてもよく、ｙｉｄＡ遺伝子と表すこと
ができる。具体的に、前記酵素をコードする遺伝子は配列番号２で記載した塩基配列だけ
でなく、前記配列と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さ
らに具体的には９８％以上、最も具体的には９９％以上の相同性を示す塩基配列であって
、実質的に前記酵素を同一または相応する効能を示す酵素をコードする遺伝子配列であれ
ば、制限なく含まれる。また、このような相同性を有する塩基配列であれば、一部の配列
が欠失、変形、置換または付加された塩基配列も本発明の範囲内に含まれることは自明で
ある。

【0015】

本発明における用語、「相同性」は、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド部分
（moiety）との間の同一性のパーセントをいう。一つの部分から、もう一つの部分までの
配列間相同性は、公知となった当該技術により決定することができる。例えば、相同性は
、配列情報を整列し、容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いて２つのポリヌク
レオチド分子または２つのポリペプチド分子間の配列情報、例えば、スコア（score）、
同一性（identity）及び類似度（similarity）などのパラメータ（parameter）を直接整
列して決定することができる（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０）。また、ポリヌクレオチド間
の相同性は、相同領域間の安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドを混成化
した後、一本鎖特異的ヌクレアーゼで分解し、分解された断片の大きさを決定することに
より、決定することができる。

【0016】

本発明における用語、「内在的活性」は、微生物が天然の状態または該当酵素の変形前
に有している酵素の活性状態を意味する。

【0017】

前記「活性が不活性化されるように変異された」は、酵素をコードする遺伝子の発現が
天然型菌株または変形前の菌株に比べて全く発現されない場合及び/または発現してもそ
の活性がないか、減少されたことを意味する。

【0018】

このように活性が内在的活性に比べ不活性化されるのは、本来の微生物が天然の状態ま
たは変形前の状態で有している酵素の活性と比較したとき、その活性がないか、減少され
たことを意味する。前記減少は、前記酵素をコードする遺伝子の変異などにより酵素自体
の活性が本来の微生物が有している酵素の活性に比べて低い場合と、これをコードする遺
伝子の発現阻害または翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的な酵素活性の
程度が、天然型菌株または変形前の菌株に比べて低い場合、これらの組み合わせも含む概
念である。

【0019】

このような酵素活性の不活性化されるように変異させる方法は、当該分野においてよく
知られている様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、前記
酵素の活性が削除された場合を含めて、前記酵素の活性が減少されるように突然変異され
た遺伝子で、染色体上の前記酵素をコードする遺伝子を代替する方法；前記酵素をコード
する遺伝子の一部または全体を欠失させる方法；前記酵素をコードする遺伝子の発現調節
配列を活性が弱いか、またはない配列で交替する方法；前記酵素をコードする染色体上の
遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法；前記酵素をコードする染色体上の遺伝子の
全体または一部を欠失させる方法；前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前
記ｍＲＮＡから酵素への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アン
チセンスＲＮＡ）を導入する方法；前記酵素をコードする遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ
配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造を形成させ、リボソーム（ribosome）の
付着を不可能にする方法及び該当配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転
写されるようにプロモータを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方
法などがあり、これらの組み合わせでも達成することができるが、前記例により、特に制
限されるものではない。

【0020】

具体的には、酵素をコードする遺伝子の一部または全体を欠失する方法は、細胞内染色
体挿入用ベクターを通じて染色体内の内在的目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチ
ドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子で交換するこ
とにより行うことができる。このような遺伝子の一部または全体を欠失する方法の一例と
して、相同組換えにより遺伝子を欠失させる方法を使用することができる。

【0021】

前記において、「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類に応じて異なるが、具体的には
１〜３００個、具体的には１〜１００個、より具体的には１〜５０個であり得るが、特に
これらに制限されるものではない。

【0022】

前記において、「相同組換え（homologous reconbination）」とは、互いに相同性を有
する遺伝子鎖の座位で連結交換を通じて起こる遺伝子組み換えを意味する。

【0023】

具体的には、発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の核酸配列に欠失、挿
入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を
誘導して行うか、またはさらに弱いプロモーターで交替するなどの方法により行うことが
できる。前記発現調節配列にはプロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位を
コードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含む。

【0024】

併せて、染色体上の遺伝子配列を変形する方法は、前記酵素の活性がさらに減少するよ
うに遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによ
り配列上の変異を誘導して行うか、またはさらに弱い活性を有するように改良された遺伝
子配列または活性がないように改良された遺伝子配列で交換することにより行うことがで
きる。

【0025】

本発明の具体的な実施例によると、配列番号１のアミノ酸配列を有するホスファターゼ
の内在的活性を不活性化させるため、当該ホスファターゼをコードする遺伝子であるｙｉ
ｄＡを欠失させた、トリプトファン生産能を有する多様な大腸菌がｙｉｄＡを欠失させな
い親菌株に比べてＬ−トリプトファンの生産能が増加することを確認して、内在的ホスフ
ァターゼの活性を不活性化させた、変異されたＬ−トリプトファン生産能を有するエシェ
リキア属微生物がＬ−トリプトファンを効率的に生産することができることを確認した。

【0026】

本発明で、前記Ｌ−トリプトファン生産能を有する微生物は、前記培地中の炭素源から
Ｌ−トリプトファンを生産することができる微生物をいう。また、前記Ｌ−トリプトファ
ンを生産する微生物は組換え微生物であってもよい。具体的に、Ｌ−トリプトファンを生
産することができれば、その種類が特に制限されないが、エンテロバクタ（Enterbacter
）属、エシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、セラチア（Serrat
ia）属、プロビデンシア（Providencia）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属
及びブレビバクテリウム（Brevibacterium）属に属する微生物であってもよく、具体的に
はエシェリキア（Escherichia）属に属する微生物であってもよい。

【0027】

さらに具体的には、エシェリキア属（Escherichia）微生物は、具体的には大腸菌（Esc
herichia coli）であってもよいが、ホスファターゼ活性が不活性化されＬ−トリプトフ
ァン生産能が増加されることができるエシェリキア属に属する微生物は制限なく含まれる
。

【0028】

具体的に、本発明で前記ホスファターゼの活性の不活性化によりＬ−トリプトファン生
産能を有するエシェリキア属微生物の親菌株は、トリプトファン生産能を有する微生物で
あれば特に制限されない。トリプトファン生産能を有する微生物は、その例として、トリ
プトファン生合成経路を強化するために、競争経路の遺伝子、トリプトファンオペロンの
方向性経路の調節者、トリプトファン流入遺伝子、トリプトファン流入及び分解遺伝子の
活性の弱化または不活性化させるか、及び/またはトリプトファンオペロンの活性を過発
現させた微生物であってもよい。前記活性の弱化または不活性化方法は、前記で説明した
通りであり、公知の方法は制限なく含まれことができる。また、トリプトファンオペロン
活性の過発現は、公知の方法は制限なく含まれるが、その例としてオペロン遺伝子の塩基
配列の一部または全部、そのもの、あるいは外部から導入された発現調節部位を含むポリ
ヌクレオチドをさらに染色体に挿入する方法、ベクターシステムに導入する方法によりコ
ピー数を増加させる方法、遺伝子の発現を調節する発現調節部位を他の調節配列に置換、
発現調節部位の塩基配列の全体または一部の突然変異が誘発された変形、遺伝子自体の変
異導入によるオペロン活性強化などによる方法などを含むことができるが、これに限定さ
れるものではない。具体的には、ｐｈｅＡ、ｔｒｐＲ、ｍｔｒ及びｔｎａＡＢ遺伝子の全
体または一部が欠失、及び/またはトリプトファンオペロンが過発現された大腸菌であっ
てもよい。

【0029】

本発明において、ｐｈｅＡ、ｔｒｐＲ、ｍｔｒ、ｔｎａＡＢ遺伝子及びトリプトファン
オペロン及び、これらがコードするタンパク質配列を初めとして、本発明で使用される遺
伝子及びタンパク質の配列は、公知のデータベースから得ることができ、その例としてＮ
ＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから得られるが、これに限定されない。また、ｐｈｅＡ、ｔ
ｒｐＲ、ｍｔｒ及びｔｎａＡＢ遺伝子に関する具体的な内容は、特許文献４、特許文献１
に記載されている内容を参考にすることができ、前記特許の明細書全体は、本発明の参考
資料として含めることができる。

【0030】

本発明の具体的な実施例に照らして、さまざまな親菌株でホスファターゼの活性を不活
性化させた結果、トリプトファン生産能を有しているエシェリキア属微生物であれば、親
菌株の種類に関係なく、前記ホスファターゼの活性を不活性化させる場合には、Ｌ−トリ
プトファンの生産能が有意に向上することが確認された。

【0031】

本発明のまた他の一態様として、本発明の配列番号１のアミノ酸配列を有するホスファ
ターゼの活性が不活性化されるように変異された、Ｌ−トリプトファン生産能を有するエ
シェリキア属微生物を培地で培養する段階；及び前記培養による培地または前記微生物か
らＬ−トリプトファンを回収する段階を含む、Ｌ−トリプトファンの製造方法を提供する
。

【0032】

本発明の微生物の培養に使用される培地、及びその他の培養条件は、通常のエシェリキ
ア属微生物の培養に使用される培地であれば特に制限なく、いずれも使用することができ
るが、具体的には、本発明の微生物を適切な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミ
ノ酸、及び/またはビタミンなどを含有した通常の培地内で好気性条件の下で温度、ｐＨ
などを調節しながら培養することができる。

【0033】

本発明において、前記炭素源としては、グルコース、フルクトース、スクロース、マル
トース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物；糖アルコール、グリセロール、ピ
ルビン酸、乳酸、クエン酸などのアルコール；有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシ
ンなどのアミノ酸などが含まれることができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラック
ストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス及びトウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄
養源を使用することができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜(すなわ
ち、還元糖に転換された糖蜜)などの炭水化物を使用することができ、その他の滴定量の
炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用したり、
２種以上を組み合わせて使用することができるが、これに限定されるものではない。

【0034】

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム 、塩化アンモニウム、酢酸アン
モニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源
；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、NZ-アミン、肉類
抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類また
はその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源を使用するこ
とができる。これらの窒素源は、単独で使用したり、２種以上を組み合わせて使用するこ
とができるが、これに限定されるものではない。

【0035】

前記リン源には、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、またはこれに対応するナ
トリウム含有塩などが含まれることができる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩
化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなど
が使用されることができ、その他に、アミノ酸、ビタミン、及び/または適切な前駆体な
どが含まれることができる。これらの培地または前駆体は、培養物に回分式または連続式
で添加することができる。

【0036】

本発明において、微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア
、リン酸、硫酸などの化合物を培養物に適切な方法で添加し、培養物のｐＨを調整するこ
とができる。また、培養中には、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用して
気泡の生成を抑制することができる。また、培養物の好気状態を維持するために、培養物
内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体
の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができる。

【0037】

培養物の温度は、具体的には２７℃〜４０℃、より具体的には３０℃〜３７℃であるこ
とができるが、これに限定されない。培養期間は、有用物質の所望の生成量が得られるま
で継続することができ、具体的には１０時間〜１００時間であることができるが、これに
限定されない 。

【0038】

前記Ｌ−トリプトファンを回収する段階は、本発明の微生物の培養方法、例えば、回分
式、連続式または流加式培養方法などにより、当該技術分野において公知となった適切な
方法を用いて培養液から目的とするＬ−トリプトファンを回収することができる。
前記回収段階は、精製工程を含むことができる。前記精製工程は当該技術分野で公知とな
った適合した方法を利用して、回収されたＬ−トリプトファンを精製することができる。

【発明の効果】

【0039】

本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するホスファターゼの活性が不活性化される
ように変異された、Ｌ−トリプトファン生産能を有するエシェリキア属微生物を提供して
、これを利用しＬ−トリプトファンをより高収率で効率的かつ経済的に製造することがで
きる効果を示す。これにより、製造されたＬ−トリプトファンは、動物飼料または飼料添
加剤だけでなく、人間の食品または食品添加物、医薬品などの様々な製品に応用すること
ができる。

【発明を実施するための形態】

【0040】

以下、実施例を挙げて本発明をより詳しく説明する。ただし、これらの実施例は、本発
明を例示的に説明するためのものに過ぎないため、本発明の範囲がこれら実施例により限
定されると解釈されてはならない。

【0041】

実施例１：ｙｉｄＡが欠損された野生型菌株の製作
本実施例では、トリプトファン生産能を有する菌株におけるホスファターゼ活性が不活
性化された菌株を製作しようとした。

【0042】

代表的なエシェリキア属微生物である、大腸菌野生型菌株であるＷ３１１０菌株にトリ
プトファン生産能を強化させるため、コリスミ酸ムターゼ（chorismate mutase）/プレフ
ェン酸脱水酵素（prephenate dehydratase、CM-PDT）をコードするｐｈｅＡ遺伝子（NCBI
gene ID: 12934467）とトリプトファン分解酵素（Tryptophanase）をコードするｔｎａ
Ａ遺伝子（NCBI gene ID: 12933600）、トリプトファンインポーター（importer）をコー
ドするｔｎａＢ遺伝子（NCBI gene ID: 12933602）のオペロン形態であるｔｎａＡＢ遺伝
子が欠失された、トリプトファン生産能が強化されたＷ３１１０ｔｒｐΔ２菌株（特許文
献１）から、ホスファターゼ（phosphotase）をコードするｙｉｄＡ遺伝子を相同組換え
により欠失させた。

【0043】

具体的に、配列番号２の塩基配列を有する遺伝子ｙｉｄＡの欠失のために、Ｄａｔｓｅ
ｎｋｏＫＡなどが開発したラムダレッド組換え酵素（lambda Red recombinase）を用いた
、１段階不活性化（one step inactivation）方法を使用した（非特許文献４）。遺伝子
内部への挿入を確認するためのマーカーとして、ｐＵＣ１９（New England Biolabs (USA
)）にｒｍｆプロモーターをライゲーションさせて、ｐＡＣＹＣ１８４（New England Bio
lab)から収得された突然変異ｌｏｘＰ-Ｃｍ^Ｒ-ｌｏｘＰカセットをライゲーションさせて
収得されたｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰのクロラムフェニコール遺伝子を使用した（特許文
献２）。

【0044】

まず、ｙｉｄＡ遺伝子の一部分とｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰ遺伝子のクロラムフェニコ
ール（chloramphenicol）耐性遺伝子の一部塩基配列を有する配列番号３及び４のプライ
マー組合せを用いてｐＵＣｐｒｍｆｍｌｏｘＰを鋳型とし、９４℃で３０秒間変性、５５
℃で３０秒間アニーリング、７２℃で１分間伸長させることで行われたサイクルを３０回
繰り返す１次ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」）によって、約１．２ｋｂのＰＣＲ
産物ΔｙｉｄＡ１ｓｔを収得した。その後、ＰＣＲを介して得られた１．２ｋｂのＰＣＲ
産物ΔｙｉｄＡ１ｓｔを０．８％アガロースゲルでの電気泳動後、溶離して２次ＰＣＲの
鋳型として使用した。２次ＰＣＲは、１次ＰＣＲで得られたＰＣＲ産物の５’及び３’領
域の２０ｂｐの塩基配列を含む配列番号５及び６プライマーの組合わせを用いて、溶離さ
れた１次ＰＣＲ産物を鋳型とし、９４℃で３０秒間変性、５５℃で３０秒間アニーリング
、７２℃で１分間伸長させることで行われたサイクルを３０回繰り返すことにより実行し
て、約１．３ｋｂのＰＣＲ産物ΔｙｉｄＡを収得した。収得されたＰＣＲ産物を０．８％
アガロースゲルでの電気泳動後、溶離して組換えに使用した。

【0045】

ＤａｔｓｅｎｋｏＫＡなどが開発した１段階不活性化方法（非特許文献４）に基づいて
ｐＫＤ４６ベクターで形質転換された大腸菌Ｗ３１１０ｔｒｐΔ２をコンピテント（comp
etent）の状態で製造した後、１次及び２次ＰＣＲを介して得られた１．３ｋｂの断片Δ
ｙｉｄＡを導入して形質転換させた。以後、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地で培養
し、クロラムフェニコール耐性を有する１次形質転換体を選別した。

【0046】

前記で収得されたクロラムフェニコール耐性を有する１次組換え菌株からｐＫＤ４６を
除去した後、ｐＪＷ１６８ベクター（非特許文献５）を導入してクロラムフェニコールマ
ーカー遺伝子を菌体から除去した（非特許文献５）。最終的に収得された菌体から、配列
番号７と８のプライマーを用いたＰＣＲを介して得られた約０．５ｋｂＰＣＲ産物によっ
てｙｉｄＡ遺伝子が欠失されたことを確認し、前記遺伝子が欠失された菌株をＷ３１１０
ｔｒｐΔ２ｙｉｄＡと命名した。

【0047】

本実施例で使用したプライマー配列は表１に示した。

【0048】

【表1】

【0049】

実施例２：ホスファターゼが不活性化されたトリプトファン生産菌株の製作
本実施例ではトリプトファンを生産する別の代表的な大腸菌であるＫＣＣＭ１１１６６
Ｐ（特許文献３）を親菌株として、前記実施例１で記述された方法と同様にホスファター
ゼ（phosphotase）をコードするｙｉｄＡ遺伝子を相同組換えにより欠失させた。

【0050】

最終的に得られた菌体から、配列番号７と８のプライマーを用いたＰＣＲを通じて得ら
れた約０．５ｋｂＰＣＲ産物によってｙｉｄＡ遺伝子が欠失したことを確認し、ＣＡ０４
-２８０５と命名した。

【0051】

実施例３：ｙｉｄＡ遺伝子が欠失された野生型菌株のトリプトファン生成能の評価
前記実施例１で製造したＷ３１１０ｔｒｐΔ２ｙｉｄＡと親菌株であるＷ３１１０ｔｒ
ｐΔ２のトリプトファン生成能を比較するために、それぞれの菌株にｐＣＬ-Ｄｔｒｐ_ａ
ｔｔ-ｔｒｐＥＤＣＢＡとｐＢＡＣ-Ｄｔｒｐ_ａｔｔ-ｔｒｐＤＣＢＡを形質転換方法によ
り導入した。導入されたベクターは、トリプトファンオペロン調節部位の調節メカニズム
が解除され、トリプトファンを過剰生産できるようにトリプトファンオペロン発現が強化
されたベクターである（特許文献１）。ベクターが導入された菌株は、下記表２の組成に
従って製造されたトリプトファン評価培地で培養してＬ−トリプトファン生産能を比較し
た。

【0052】

【表2】

【0053】

３７℃培養器（incubator）でＬＢ固体培地上に一晩培養した菌株をそれぞれ前記表２
の２５ｍｌ評価培地に一白金耳ずつ接種した後、これを３７℃、２００ｒｐの培養器で４
８時間培養してトリプトファン濃度を比較した（表３）。

【0054】

【表3】

【0055】

前記のような結果は、遺伝子ｙｉｄＡによってコードされるホスファターゼの活性が不活性化された菌株のトリプトファン生成能が、前記ホスファターゼの活性が不活性化されていない菌株に比べて４０％増加したことで、ｙｉｄＡによってコードされるホスファターゼの不活性化によりトリプトファン生成能が向上されることを確認した。これはトリプトファン生合成に主な前駆物質であるＥ４Ｐの分解を防ぎ、細胞内Ｅ４Ｐ濃度を維持し、付随的に無駄に消費されるエネルギーが保存されてトリプトファン生合成に使用されたことと予測できる。

【0056】

実施例４：ｙｉｄＡ遺伝子が欠失された菌株のトリプトファン生成能の評価
前記実施例２で作製したｙｉｄＡ欠損株（ＣＡ０４-２８０５）と親菌株であるＫＣＣ
Ｍ１１１６６Ｐのトリプトファン力価を測定するために下記の表４の組成に従って製造さ
れたトリプトファンの力価培地で培養し、Ｌ−トリプトファン生産効率の向上を確認した
。

【0057】

【表4】

【0058】

３７℃ 培養器（incubator）でＬＢ固体培地上に一晩培養した大腸菌ＫＣＣＭ１１１６
６Ｐ及び大腸菌ＣＡ０４−２８０５をそれぞれ前記表４の２５ｍｌ力価培地に一白金耳ず
つ接種した後、これを３７℃、２００ｒｐｍの培養器で４８時間培養して糖消費速度及び
トリプトファン濃度を比較した。

【0059】

その結果、下記表５に記載されたように、対照群である親菌株であるＫＣＣＭ１１１６６Ｐに比べて遺伝子ｙｉｄＡによってコードされるホスファターゼの活性が不活性化された菌株であるＣＡ０４−２８０５のトリプトファン濃度が約１０％増加する結果を確認した。

【0060】

【表5】

【0061】

本発明者らはＫＣＣＭ１１１６６Ｐ菌株基盤、ホスファターゼをコードするｙｉｄＡが
欠損された不活性化された菌株でトリプトファン生産能力が増加されることを確認し、前
記菌株を「 ＣＡ０４−２８０５」または「 ＣＡ０４−２８０５（ＫＣＣＭ１１１６６Ｐ
_ΔｙｉｄＡ 」と命名した後、ブダペスト条約の下、国際寄託機関である韓国微生物保存
センター（ＫＣＣＭ）に２０１４年１２月５日に寄託し、受託番号 ＫＣＣＭ１１１６６
Ｐ を与えられた。

【0062】

前記のような結果は、本発明のトリプトファン生産エシェリキア属微生物でホスファターゼの活性を不活性化させた菌株が、前記酵素を不活性化させない非変形菌株よりＬ−トリプトファン生産能が増加されることを示唆することである。

【0063】

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は本発明がその技術的思想や必須の
特徴を変更せず、他の具体的な形で実施されることができることを理解できるだろう。こ
れに関連し、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なもの
ではないと理解するべきである。本発明の範囲は、前記の詳細な説明ではなく、後述する
特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるすべての変更または
変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

【受託番号】

【0064】

寄託機関名： 韓国微生物保存センター（国外）
受託番号：ＫＣＣＭ１１１６６Ｐ
受託日付：２０１４１２０５

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]