特許 6870140 生体内レドックス電位測定装置及び生体内レドックス電位測定方法、並びに、生体内レドックス電位検証方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B1)

(11)【特許番号】6870140

(24)【登録日】2021年4月16日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】生体内レドックス電位測定装置及び生体内レドックス電位測定方法、並びに、生体内レドックス電位検証方法

(51)【国際特許分類】

   A61B 5/091 20060101AFI20210426BHJP

   G01N 33/497 20060101ALI20210426BHJP

【ＦＩ】

   A61B5/091

   G01N33/497 A

【請求項の数】14

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2020-76148(P2020-76148)

(22)【出願日】2020年4月22日

【審査請求日】2020年4月27日

(73)【特許権者】

【識別番号】503042303

【氏名又は名称】木山 輝郎

(74)【代理人】

【識別番号】100093067

【弁理士】

【氏名又は名称】二瓶 正敬

(72)【発明者】

【氏名】木山 輝郎

【審査官】 樋口 祐介

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１６−１４８５１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１９−０８６３３８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開昭５６−０７０７５６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５２９４６２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｂ ５／０６−５／２２

Ｇ０１Ｎ ５／００−９／３６

Ｇ０１Ｎ２７／００−２７／４０４

Ｇ０１Ｎ２７／４１４−２７／４１６

Ｇ０１Ｎ２７／４２−２７／４９

Ｇ０１Ｎ３１／００−３１／２２

Ｇ０１Ｎ３３／４８−３３／９８

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

水素ガス指数pH₂は水素ガス分圧(Pa)/101.3kPaの逆数の対数（pH₂＝-log[水素ガス分圧/101.3kPa]）であると定義するとき、測定対象の人の被検体の水素ガス指数pH₂を測定する手段と、
所定の演算式を記憶している記憶手段と、
前記水素ガス指数を測定する手段で測定された水素ガス指数pH₂を用いて、前記記憶手段に記憶されている前記所定の演算式により、レドックス電位を演算する演算手段と、
前記演算手段により演算された前記レドックス電位を表示する表示手段とを、
有する、生体内レドックス電位測定装置。

【請求項2】

前記演算式として、Eをレドックス電位、pH₂を前記水素ガス指数とするとき、E=-0.451+0.031×pH₂ (V)を用いることを特徴とする請求項１に記載の生体内レドックス電位測定装置。

【請求項3】

前記演算式として、Eをレドックス電位、pH を前記被検体の水素イオン指数、pH₂を前記水素ガス指数とするとき、E=-0.061×pH+0.031×pH₂(V)を用いることを特徴とする請求項１に記載の生体内レドックス電位測定装置。

【請求項4】

前記pHとして、７．３〜７．５の値を用いることを特徴とする請求項３に記載の生体内レドックス電位測定装置。

【請求項5】

前記pHとして、７．４の値を用いることを特徴とする請求項４に記載の生体内レドックス電位測定装置。

【請求項6】

前記表示手段が前記水素ガス指数を測定する手段で測定された水素ガス指数pH₂を表示するよう構成されていることを特徴とする請求項１に記載の生体内レドックス電位測定装置。

【請求項7】

水素ガス指数pH₂は水素ガス分圧(Pa)/101.3kPaの逆数の対数（pH₂＝-log[水素ガス分圧/101.3kPa]）であると定義するとき、測定対象の人の被検体の水素ガス指数pH₂を測定するステップと、
所定の記憶手段に記憶されている所定の演算式読み出すステップと、
前記水素ガス指数を測定する手段で測定された水素ガス指数pH₂を用いて、前記記憶手段から読み出された前記所定の演算式により、レドックス電位を演算する演算ステップと、
前記演算ステップにより演算された前記レドックス電位を表示する表示ステップとを、
有する、生体内レドックス電位測定方法。

【請求項8】

前記演算式として、Eをレドックス電位、pH₂を前記水素ガス指数とするとき、E=-0.451+0.031×pH₂ (V)を用いることを特徴とする請求項７に記載の生体内レドックス電位測定方法。

【請求項9】

前記演算式として、Eをレドックス電位、pH を前記被検体の水素イオン指数、pH₂を前記水素ガス指数とするとき、E=-0.061×pH+0.031×pH₂(V)を用いることを特徴とする請求項７に記載の生体内レドックス電位測定方法。

【請求項10】

前記pHとして、７．３〜７．５の値を用いることを特徴とする請求項９に記載の生体内レドックス電位測定方法。

【請求項11】

前記pHとして、７．４の値を用いることを特徴とする請求項１０に記載の生体内レドックス電位測定方法。

【請求項12】

前記表示ステップが前記水素ガス指数を測定するステップで測定された水素ガス指数pH₂を表示するよう構成されていることを特徴とする請求項７に記載の生体内レドックス電位測定方法。

【請求項13】

水素ガス指数pH₂は水素ガス分圧(Pa)/101.3kPaの逆数の対数（pH₂＝-log[水素ガス分圧/101.3kPa]）であると定義するとき、測定された水素ガス指数pH₂と所定の演算式により求めた生体内レドックス電位が実際の生体内レドックス電位に近似していることを検証するための生体内レドックス電位検証方法であって、
バブリング装置を構成する容器にリン酸緩衝液を入れる第１ステップと、
前記容器内のリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPを測定する第２ステップと、
前記バブリング装置に医療用空気を第１の所定流量で第１の所定時間送気する第３ステップと、
前記所定時間の送気終了後に、前記容器内のリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPを再度測定する第４ステップと、
前記医療用空気を送気した後に測定された前記酸化還元電位ORPを、前記医療用空気を送気する前に測定された前記酸化還元電位ORPにより補正する第５ステップと
前記容器内のリン酸緩衝液を排出し、前記容器に新たなリン酸緩衝液を入れる第６ステップと、
前記容器内の前記新たなリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPを測定する第７ステップと、
前記バブリング装置に所定濃度の水素を含んだ標準ガスを第２の所定流量で第２の所定時間送気する第８ステップと、
前記第２の所定時間の送気終了後に、前記容器内の前記新たなリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPを再度測定する第９ステップと、
前記所定濃度の水素を含んだ標準ガスを送気した後に測定された前記酸化還元電位ORPを、前記所定濃度の水素を含んだ標準ガスを送気する前に測定された前記酸化還元電位ORPにより補正する第１０ステップと、
前記２つの補正するステップで得られた補正後の２つの前記酸化還元電位ORPを用いて、前記医療用空気のときは、pH₂が６．２とし、前記所定濃度の水素を含んだ標準ガスのときは、pH₂が４として、pH₂の変化に対する前記酸化還元電位ORPの変化態様を把握する第１１ステップとを、
有する生体内レドックス電位検証方法。

【請求項14】

前記第１ステップから前記第５ステップを複数回繰り返し、複数回の測定結果の平均値を用い、同様に前記第６ステップから前記第１０ステップを複数回繰り返し、複数回の測定結果の平均値を用いることを特徴とする請求項１３に記載の生体内レドックス電位検証方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は生体内レドックス電位測定装置及び生体内レドックス電位測定方法、並びに、生体内レドックス電位検証方法に関する。

【背景技術】

【0002】

生体内の代謝反応の大部分は電子の移動を伴う酸化還元反応に基づいている。レドックス(redox)とは還元(reduction)と酸化(oxidation)の合成語であり、レドックス電位は電子の授受を伴う酸化還元反応の半反応の平衡状態における酸化型と還元型物質（レドックス対）の比率により定義される。ネルンスト(Nernst)の式は電極反応

【0003】

【化1】

【0004】

（OxおよびRedは酸化還元系の酸化体と還元体、e-は電子、a, b, nは分子や電子の数）に対応する平衡電極電位E=E⁰+(RT/nF)ln([Ox]^a/[Red]^b)を示す。E⁰は標準水素電極に対する標準電極電位である。下記の非特許文献１に示されるように、1967年ウィリアムソンらはニコチンアミドジヌクレオチドNADH/NAD⁺の比を各々の代謝産物を測定しレドックス電位を測定した。また、2001年シャピロらはグルタチオン2GSH/GSSGを各々の濃度を直接測定することによりレドックス電位を測定した。下記の非特許文献２に示されるように、2002年ジョーンズらはレドックス電位の生物学的意義に関して培養細胞のレドックス電位は細胞の増殖期で最も低く、分化期（定常状態）では中間となり、細胞死であるアポトーシスでは電位が高くなり、レドックス状態を制御することにより細胞機能の調節が行われることを報告した。

【0005】

下記の非特許文献３に示されるように、2019年羽鳥は細胞内グルタチオンの酸化還元状態と様々な疾患との間に相関が認められ、酸化還元バランスのスケールをグルタチオンの濃度比（％）よりもむしろレドックス電位（ｍV）で扱うほうが直感的に理解でき都合がよいことを指摘している。酸化還元バランスとレドックス状態は活性酸素などによる酸化ストレスとして研究され、GFP蛍光法によりグルタチオン酸化センサーの細胞内局在が検討されている。さらに、レドックス状態により遺伝子の転写や発現、細胞内物質の局在や合成、分解、さらに細胞の増殖、分化、細胞死を制御していることが報告されている。

【0006】

生体内のpHは呼吸による二酸化炭素の調節と腎臓での代謝により厳密に制御されており、正常値は7.35〜7.45である。一方、呼気中の水素は腸内細菌が産生した水素ガスが肺循環に入り排出されたものである。呼気中の水素ガス濃度を測定するための器機は医療機器ClassIIであり、その一つにハンディタイプのGastrolyser（Bedfont社、Kent、英国）がある。呼気中の水素ガス濃度が食事や運動により変動することが指摘されている。下記の非特許文献４に示されるように、消化管疾患の診断のために行われる水素呼気試験は2017年のノースアメリカ・コンセンサスによると食事の影響を除外するため1晩絶食したあと検査食を摂取して安静にした状態で消化管の通過時間である2時間以上呼気中の水素ガス濃度を測定するものである。肺循環の後、肺でのガス交換により混合静脈血中の消化管で産生された水素ガスは肺胞内水素ガス分圧まで低下する。この肺胞内水素ガス分圧は終末呼気水素ガス分圧に等しい。血液中の水素ガスは肺循環から体循環を経て全身の組織に運ばれ、細胞内に拡散する。水素ガスは不活性ガスであり代謝されないので組織中水素ガス分圧は終末呼気水素ガス分圧に等しくなる。不活性ガス（窒素）の体内の半飽和時間は約30分なので、半飽和時間の4倍である2時間でほぼ平衡状態（1-(1/2)⁴=94％）に達する。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Williamson, D. H., Lund, P. & Krebs, H.A. The redox state of free nicotinamide-adenine dinucleotide in the cytoplasm and mitochondria of rat liver. The Biochemical journal 103, 514-527 (1967).

【非特許文献2】Jones, D. P. Redox potential of GSH/GSSG couple: assay and biological significance. Methods in enzymology 348, 93-112 (2002).

【非特許文献3】羽鳥 勇太. 消化管炎症モデルの構築及び細胞内酸化還元センサーの適用. YAKUGAKU ZASSHI 139,1523-1530(2019).

【非特許文献4】Rezaie, A., et al. Hydrogen and Methane-Based Breath Testing in Gastrointestinal Disorders: The North American Consensus. The American journal of gastroenterology 112, 775-784 (2017).

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

レドックス状態は細胞内のレドックス対の比や濃度、蛍光によってレドックス電位として測定される。同じ物質の酸化状態と還元状態を区別できないので代謝産物の比によりNADH/NAD+の比を測定しレドックス電位が測定された。また、グルタチオンは酸化型のグルタチオンジスルフィドでは2量体となるので濃度の測定が必要であった。細胞質内の代謝物の比率や濃度、蛍光の測定を要することから培養細胞では可能であるが、生体内の酸化還元状態を評価するためのレドックス電位の測定が困難であった。人などの生体内でのレドックス電位を直接測定することは、従来から困難であり、人の健康状態を示す指標となるレドックス電位を測定することが求められていた。

【課題を解決するための手段】

【0009】

レドックス電位は生体内のレドックス反応が平衡状態の時測定可能である。レドックス対の一つである水素ガスと水素イオンの平衡状態は

【0010】

【化2】

【0011】

である。標準水素電極は水素ガスを標準圧力P⁰(101.3kPa )で吹き込んだ水素イオン活量１Mol/Lの溶液に浸した白金電極である。この時の標準電極電位E⁰=0Vである。ネルンスト(Nernst)の式は電極反応

【0012】

【化3】

【0013】

（OxおよびRedは酸化還元系の酸化体と還元体、e-は電子、a, b, nは分子や電子の数）に対応する平衡電極電位E=E⁰+(RT/nF)ln([Ox]^a/[Red]^b)である。すなわち、Nernstの式によるレドックス電位Eは温度が37℃（310K）ではE=0-(0.061/2)×(log[H₂]-2log[H⁺])である。水素イオン活量[H⁺]はその逆数の対数がpH=-log[H⁺]である。水素ガスは標準圧力P⁰で吹き込むことが可能であるが、標準圧力未満でもヘンリーの法則から水素ガスは水溶液中に溶存する。したがって、水素ガス活性[H₂]は水素ガス分圧/標準圧力P⁰である。そこで、水素ガス活性[H₂]の逆数の対数である水素ガス指数pH₂=-log[H₂]を定義する。水素/水素イオンのレドックス電位EはE=-0.061×pH+0.031×pH₂(V)となる。レドックス電位はpHとpH₂に依存する。その電位変化の比率は0.061V/pHと0.031 V/pH₂である。

【0014】

本発明では終末呼気中の水素ガス分圧を測定し、水素ガス分圧/標準圧力の逆数の対数である水素ガス指数pH₂を器機で表示する。レドックス電位は体温37℃(310K)と生体のpHの正常値7.4、水素ガス指数pH₂を用い、レドックス電位Eを演算式E=-0.451+0.031×pH₂ (V) により計測する。

【0015】

本発明の生体内レドックス電位測定装置は呼気水素ガス分析により生体内レドックス電位を測定する機器であり、結果を電圧として表示するものであり、本発明の生体内レドックス電位測定方法は呼気水素ガス分析により生体内レドックス電位を測定して、結果を電圧として表示するものである。生体内の水素と水素イオンの比を用いて生体内のレドックス電位(V)を測定する。レドックス電位は電子の授受を伴う酸化還元反応の半反応の平衡状態における酸化型と還元型物質(レドックス対)の比率により定義される。そこで、平衡電極電位に関するネルンスト(Nernst)の式を用いて標準水素電極の電位を基準点０Vとして求める。

【0016】

水素ガス分析は大気圧下での終末呼気による肺胞内水素ガス分圧測定を行う装置を含む。水素ガス活量[H₂] は標準水素電極で標準圧力Ｐ⁰の水素ガスを常時吹き付けた状態が１なので、水素ガス分圧(Pa)/101.3kPa に比例する。水素ガス分析の結果は水素ガス指数pH₂を[H₂]の逆数の対数（pH₂＝-log[H₂]）と定義し表示する。

【0017】

また、本発明の生体内レドックス電位検証方法は、上記本発明の生体内レドックス電位測定装置及び生体内レドックス電位測定方法で測定された生体内レドックス電位が実際の測定値ではなく、所定の演算式によるものであることから、ある意味で推定値に過ぎないので、この推定値が、実測したら得られたであろう実際の生体内レドックス電位に近似するものであることを検証するものである。

【0018】

本発明によれば、水素ガス指数pH₂は水素ガス分圧(Pa)/101.3kPa の逆数の対数（pH₂＝-log[水素ガス分圧/101.3kPa]）であると定義するとき、測定対象の人の被検体の水素ガス指数pH₂を測定する手段と、
所定の演算式を記憶している記憶手段と、
前記水素ガス指数を測定する手段で測定された水素ガス指数pH₂を用いて、前記記憶手段に記憶されている前記所定の演算式により、レドックス電位を演算する演算手段と、
前記演算手段により演算された前記レドックス電位を表示する表示手段とを、
有する、生体内レドックス電位測定装置が提供される。

【0019】

上記本発明の生体内レドックス電位測定装置において、前記演算式として、Eをレドックス電位、pH₂を前記水素ガス指数とするとき、E=-0.451+0.031×pH₂ (V)を用いることは、好ましい実施の形態である。

【0020】

上記本発明の生体内レドックス電位測定装置において、前記演算式として、Eをレドックス電位、pH を前記被検体の水素イオン指数、pH₂を前記水素ガス指数とするとき、E=-0.061×pH+0.031×pH₂(V)を用いることは、好ましい実施の形態である。

【0021】

上記本発明の生体内レドックス電位測定装置において、前記pHとして、７．３〜７．５の値を用いることは、好ましい実施の形態である。

【0022】

上記本発明の生体内レドックス電位測定装置において、前記pHとして、７．４の値を用いることは、好ましい実施の形態である。

【0023】

上記本発明の生体内レドックス電位測定装置において、前記表示手段が前記水素ガス指数を測定する手段で測定された水素ガス指数pH₂を表示するよう構成されていることは、好ましい実施の形態である。

【0024】

本発明によれば、水素ガス指数pH₂は水素ガス分圧(Pa)/101.3kPaの逆数の対数（pH₂＝-log[水素ガス分圧/101.3kPa]）であると定義するとき、測定対象の人の被検体の水素ガス指数pH₂を測定するステップと、
所定の記憶手段に記憶されている所定の演算式読み出すステップと、
前記水素ガス指数を測定する手段で測定された水素ガス指数pH₂を用いて、前記記憶手段から読み出された前記所定の演算式により、レドックス電位を演算する演算ステップと、
前記演算ステップにより演算された前記レドックス電位を表示する表示ステップとを、
有する、生体内レドックス電位測定方法が提供される。

【0025】

上記本発明の生体内レドックス電位測定方法において、前記演算式として、Eをレドックス電位、pH₂を前記水素ガス指数とするとき、E=-0.451+0.031×pH₂ (V)を用いることは、好ましい実施の形態である。

【0026】

上記本発明の生体内レドックス電位測定方法において、前記演算式として、Eをレドックス電位、pH を前記被検体の水素イオン指数、pH₂を前記水素ガス指数とするとき、E=-0.061×pH+0.031×pH₂(V)を用いることは、好ましい実施の形態である。

【0027】

上記本発明の生体内レドックス電位測定方法において、前記pHとして、７．３〜７．５の値を用いることは、好ましい実施の形態である。

【0028】

上記本発明において、前記pHとして、７．４の値を用いることは、好ましい実施の形態である。

【0029】

上記本発明の生体内レドックス電位測定方法において、前記表示ステップが前記水素ガス指数を測定するステップで測定された水素ガス指数pH₂を表示するよう構成されていることは、好ましい実施の形態である。

【0030】

本発明によれば、水素ガス指数pH₂は水素ガス分圧(Pa)/101.3kPaの逆数の対数（pH₂＝-log[水素ガス分圧/101.3kPa]）であると定義するとき、測定された水素ガス指数pH₂と所定の演算式により求めた生体内レドックス電位が実際の生体内レドックス電位に近似していることを検証するための生体内レドックス電位検証方法であって、
バブリング装置を構成する容器にリン酸緩衝液を入れる第１ステップと、
前記容器内のリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPを測定する第２ステップと、
前記バブリング装置に医療用空気を第１の所定流量で第１の所定時間送気する第３ステップと、
前記所定時間の送気終了後に、前記容器内のリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPを再度測定する第４ステップと、
前記医療用空気を送気した後に測定された前記酸化還元電位ORPを、前記医療用空気を送気する前に測定された前記酸化還元電位ORPにより補正する第５ステップと
前記容器内のリン酸緩衝液を排出し、前記容器に新たなリン酸緩衝液を入れる第６ステップと、
前記容器内の前記新たなリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPを測定する第７ステップと、
前記バブリング装置に所定濃度の水素を含んだ標準ガスを第２の所定流量で第２の所定時間送気する第８ステップと、
前記第２の所定時間の送気終了後に、前記容器内の前記新たなリン酸緩衝液のｐHと酸化還元電位ORPを再度測定する第９ステップと、
前記所定濃度の水素を含んだ標準ガスを送気した後に測定された前記酸化還元電位ORPを、前記所定濃度の水素を含んだ標準ガスを送気する前に測定された前記酸化還元電位ORPにより補正する第１０ステップと、
前記２つの補正するステップで得られた補正後の２つの前記酸化還元電位ORPを用いて、前記医療用空気のときは、pH₂が６．２とし、前記所定濃度の水素を含んだ標準ガスのときは、pH₂が４として、pH₂の変化に対する前記酸化還元電位ORPの変化態様を把握する第１１ステップとを、
有する生体内レドックス電位検証方法が提供される。

【0031】

上記本発明の生体内レドックス電位検証方法において，前記第１ステップから前記第５ステップを複数回繰り返し、複数回の測定結果の平均値を用い、同様に前記第６ステップから前記第１０ステップを複数回繰り返し、複数回の測定結果の平均値を用いることは、好ましい実施の形態である。

【発明の効果】

【0032】

生体は環境として温度、栄養素、酸素などの変化を外界からのシグナルとして受ける。また、代謝要求の変化により相対的低酸素状態や基質であるブドウ糖の不足などの変化を内因性のシグナルとして受けて、生体の恒常性ホメオスタシスを維持するために細胞機能が制御されている。こうしたシグナル伝達のひとつに活性酸素種を含む酸化ストレスがある。生体内にはグルタチオン、チオレドキシンなどの還元システムがあり、NADHやNADPHからエネルギー供給を受けて恒常性が維持される。こうした酸化還元反応の状態は生体内ではレドックス状態と呼ばれ、レドックス電位として測定される。レドックス電位は各々のレドックス対により規定されるが、そのひとつであるグルタチオンの細胞内濃度は3-10ｍMであり、大量にあることから緩衝機能がある。一方、NADHの濃度は97-168μMであり、TCAサイクルと電子伝達系の間で常に再利用されている。すなわち、これらのレドックス対を指標とした場合、レドックス電位の変化は鋭敏ではなく、代謝状態が大きく変化する培養細胞の増殖状態、分化、アポトーシスでなければ電位の変化がなかった。

【0033】

本発明では酸化還元状態の指標の一つである水素/水素イオンのレドックス電位を用いて生体内の酸化還元状態を評価する。生体内の水素イオン濃度はpH=7のとき40ｎMである。呼気試験の水素濃度が13ppm（早朝空腹時6-20ppm）のときの生体内水素濃度は水素ガスの溶解度(1282 L×atm/mol)から10ｎMである。すなわち、グルタチオンの100万分の１、NADHの1000分の１以下である。酸塩基バランスにおける血液中の陽イオンでは水素イオン濃度は40nMとナトリウムイオン濃度130mEq/Lの100万分の１と少なく、変化に鋭敏である。酸化還元バランスの指標として水素/水素イオンによるレドックス電位の変化はグルタチオンやNADHを指標とするよりも1000倍から100万倍鋭敏であることが示唆される。

【0034】

本発明により短期的な代謝状態の変化をより鋭敏にとらえることが可能になる。これまでは細胞の増殖、分化、細胞死のような長期的は変化をとらえることしかできなかった。繰り返し測定できる鋭敏な指標であれば、外界である環境や内因性の代謝要求の変化をとらえることが可能である。例えば、絶食と食事、安静と運動により水素呼気試験では変化がみられた。また、約２時間で体内の水素分圧が平衡に達することから疾患や治療するための薬剤による影響を生体内のレドックス電位を指標として測定できる。したがって、レドックス電位の測定が可能になれば、環境や代謝状態の評価だけでなく、疾患の評価や治療法の開発に応用可能と考えられる。

【図面の簡単な説明】

【0035】

【図1】本発明の生体内レドックス電位測定装置の好ましい実施の形態を示すブロック図である。

【図2】本発明の生体内レドックス電位検証方法に用いられるシステムの好ましい実施の形態を示すブロック図である。

【図3】本発明の生体内レドックス電位検証方法を説明するためのグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0036】

以下、図面を参照して本発明の好ましい実施の形態について説明する。
図１は、本発明の生体内レドックス電位測定装置の好ましい実施の形態を示すブロック図である。本発明の生体内レドックス電位測定方法の好ましい実施の形態も図１に従って説明される。

【0037】

本発明では、被測定者である人の生体内のレドックス電位を測定するのであるが、例えば、生体の血液や内臓、筋肉などにおけるレドックス電位を直接測定することは電気抵抗の関係で困難であるから、本発明では被測定者の呼気を用いるようにしている。pH₂測定部１０は、被験者が呼気を吹き込むことにより、呼気中の水素ガス指数pH₂を測定するものである。pH₂測定部１０としては、例えば、半導体式水素濃度計であって、被加熱金属酸化物半導体が水素ガスと接触したときに生じる電気抵抗値の変化を水素ガス濃度として検出するもの、例えば、理研計器株式会社のSG８５４１を使用することができる。pH₂測定部１０の出力信号は、測定された水素ガス指数pH₂を示すものであり、演算・制御部１４に送出される。記憶部１６には、所定の演算式が予め記憶され、必要に応じて、演算・制御部１４での演算結果を記憶する。入力部１２は、演算・制御部１４に演算開始の指示を与えたり、後述する水素イオン指数pHの値を演算・制御部１４に設定するために用いられる。

【0038】

演算・制御部１４で演算されて得られた生体内レドックス電位は表示部１８に送出されて、数値として表示される。なお、上記入力部１２、演算・制御部１４、記憶部１６、表示部１８は、パソコンのキーボード及びマウス、中央演算処理装置（ＣＰＵ）、メモリ（ＲＡＭ、ＲＯＭ）、ディスプレイにより構成することもできる。この場合、pH₂測定部１０の出力信号をパソコンのＵＳＢ入力部に適切な形式で供給するために、必要に応じて図示省略のインターフェースを用いる。表示部１８は、上記生体内レドックス電位を表示する他に、上記測定された水素ガス指数pH₂をも表示することができる。なお、演算・制御部１４は、上記演算以外にも、入力部１２にて入力された装置の操作者からの指示に従い、記憶部１６や表示部１８を制御することができる。

【0039】

記憶部１６には、生体内レドックス電位Eを算出するための演算式が予め記憶されている。演算式の基本はE=-0.061×pH+0.031×pH₂(V)である。ここで、pHは、前述のように、7.35〜7.45であるから、入力部１２により、この範囲内の適切な値を演算部に入力することができる。一方、pHの変化範囲は7.35〜7.45と僅かであるから、これを、例えば、7.4に固定することもできる。したがって、入力部１２により、pHとして7.4を入力したり、この7.4を予め、記憶部１６に記憶しておいて、これを用いることもできるが、pHとして7.4を既に組み込んで、上記基本の演算式を、E=-0.451+0.031×pH₂(V)と簡略化することができる。したがって、pHを7.4に固定する場合は、記憶部１６に基本の演算式に代えて、簡略化された演算式E=-0.451+0.031×pH₂ (V)を記憶しておくことができる。なお、上記基本の演算式と簡略化された演算式の双方を記憶部１６に記憶しておき、必要に応じて、入力部１２からの指示でいずれかの演算式を読み出して演算部１４に与えるようにすることもできる。

【0040】

次に、上記簡略化された演算式を用いて測定したレドックス電位のいくつかの実際の測定例を示す。

測定条件及び測定対象者など

測定日時：２０１８年９月２６日 午前８時〜９時

症例１；23歳女性 朝食あり 水素ガス分圧0.1Ｐａ，水素ガス指数pH₂=6.0、レドックス電位Ｅ＝-0.265Ｖ。

症例２；44歳男性 朝食なし 水素ガス分圧1.9Ｐａ，水素ガス指数pH₂=4.72、レドックス電位Ｅ＝-0.305Ｖ。

症例３；34歳女性 朝食あり 水素ガス分圧4.6Ｐａ，水素ガス指数pH₂=4.34、レドックス電位Ｅ＝-0.317Ｖ。

以下の表は、上記症例１〜３を含む合計１０の症例の測定結果を示すものである。

【0041】

【表1】

【0042】

次に、本発明の生体内レドックス電位検証方法に用いられるシステムの好ましい実施の形態について説明する。
図２は、本発明の生体内レドックス電位検証方法に用いられるシステムの好ましい実施の形態を示すブロック図である。このシステムは、医療用空気源２０と、水素ガス源２２と、２つの流量計２４、２６と、切替弁２８と、バブリング装置３０と、バブリング装置３０を構成する容器３１内に設けられたpH及び電位測定装置３６と、インターフェース４０と、表示器４２と記憶部４４とを有する。バブリング装置３０は、一般に空気加湿器として用いられるものを利用することができ、容器３１内に導管３２を介して外部から供給されたガスを導き、容器３１内の液体中で導入されたガスバブリング（気泡化）し、容３１の上部空間から排出管３４を介して外部に排出する。

【0043】

医療用空気源２０は、医療用空気を200kPaに減圧したものを送出するものである。水素ガス源２２は、10Paの水素を含む空気（標準ガス）を送出するものである。医療用空気源２０から送出される減圧された医療用空気と水素ガス源２２から送出される水素を含む空気は、それぞれ流量計２４、２６を介して、切替弁２８でいずれか一方が選択されて、バブリング装置３０に供給される。バブリング装置３０は、一般に空気加湿器として用いられるものであり、それを構成する容器３１内には、リン酸緩衝液（10ｍＭ、pH7.1）４６を入れることができる。かかるリン酸緩衝液としては、例えば、富士フィルム和光純薬株式会社製166-23555 PBS(-)を用いることができる。図２を用いて本発明の生体内レドックス電位検証方法の好ましい実施の形態について説明する。

【0044】

バブリング装置３０を構成する容器３１にリン酸緩衝液（10ｍＭ、pH7.1）４６を入れる。容器３１内のリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPをpH及び酸化還元電位測定装置３６により測定する。pH及び酸化還元電位測定装置３６としては、例えば、株式会社カスタム製のpH6600及びORP-6600Sを用いることができる。pH及び酸化還元電位測定装置３６の出力信号は信号伝送路３８とインターフェース４０を介して表示部４２と記憶部４４に与えられる。pHと還元電位が測定され、記憶部４４に記憶されると、切替弁２８を操作して、バブリング装置３０に医療用空気を第１の所定流量で第１の所定時間送気する。ここで、第１の所定流量としては、０．５L／分、第１の所定時間としては、１時間とする。医療用空気としては、例えば、エアー・ウォーター社製医療用空気（大気と同様に水素を0.6ppm含む）を用いることができる。

【0045】

第１の所定時間の送気終了後に、容器３１内のリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPをpH及び還元電位測定装置３６で再度測定し、測定された電位を記憶部４４に記憶する。次いで、医療用空気を送気した後に測定された酸化還元電位ORPを、医療用空気を送気する前に測定された酸化還元電位ORPにより補正する。例えば、医療用空気を送気する前に測定された酸化還元電位ORPが230ｍＶとすると、この電位を基準の0mVとすることとなる。すなわち、医療用空気を送気した後に後に測定された酸化還元電位ORPが243ｍＶであれば、この値から230ｍＶを減じて、243ｍＶを13ｍＶに補正する。

【0046】

容器３１内のリン酸緩衝液を排出し、容器３１に新たなリン酸緩衝液を入れる。容器３１内の新たなリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPを前述と同様に測定する。測定と測定値の記憶が終了したら、バブリング装置３０に所定濃度の水素を含んだ標準ガスを第２の所定流量で第２の所定時間送気する。ここで、第２の所定流量としては、０．５L／分、第２の所定時間としては、１時間とする。また、所定濃度としては、例えば、100ppmであり、例えば、エアー・ウォーター社製標準ガスを用いることができる。

【0047】

第２の所定時間の送気終了後に、容器３１内の新たなリン酸緩衝液のpHと酸化還元電位ORPをpH及び電位測定装置３６で再度測定して、記憶する。所定濃度の水素を含んだ標準ガスを送気した後に測定された酸化還元電位ORPを、所定濃度の水素を含んだ標準ガスを送気する前に測定された酸化還元電位ORPにより補正する。ここで測定電位が174ｍＶであれば、前述のように230ｍＶを減じて補正後の電位を−56mVとする。

【0048】

このようにして得られた補正後の２つの酸化還元電位ORPを用いて、医療用空気のときは、pH₂が６．２とし、所定濃度の水素を含んだ標準ガスのときは、pH₂が４として、pH₂の変化に対する酸化還元電位ORPの変化態様を把握する。すなわち、図３のグラフに示すように、pH₂が４のときの酸化還元電位ORPが‐56mV、pH₂が6.2のときの酸化還元電位ORPが13mVであるので、これらの点を結ぶ線分により、図３のグラフが作成される。pHの変化は空気をバブリングした時は0.007±0.021、水素標準ガス（10Ｐａ）のときは0.060±0.008であった。また、酸化還元電位の変化は空気をバブリングした後は13.3±17.6mVであり、標準水素ガスのときは-56.0±13.5mVであった。

【0049】

上記測定による図３のグラフの作成は、測定が１回の場合で説明したが、計測誤差を少なくするために、上記電位の計測を複数回（例えば３回以上）行い、計測結果の平均値をとることが好ましい。図３のグラフにおいて、pH₂が４の電位と、pH₂が６．２の電位を示すグラフの線分の両端の上下に伸びる線分は、それぞれ標準偏差を示している。線形回帰直線は有意であった(y=-180.8+32.2×pH₂, r²=0.83, p=0.011)。リン酸緩衝液のためpH＝7.1でバブリング後の変化は0.1未満であったが、酸化還元電位ORPはバブリングした空気中の水素分圧により32mV/pH₂変化し、ネルンストの式に一致した。したがって、酸化還元電位はpHが一定の時はバブリングする空気中の水素ガス分圧によるpH₂に比例した。

【0050】

この点について検討すると、上記yを与える式において、ｒ^２は決定係数である。回帰によって得られた値が実際にどれくらい一致しているかを評価する指標である。決定係数ｒ^２は普通0〜1の範囲をとり、値が大きいほど適切にデータを表現できていることになる。次に、回帰係数（直線の傾き）が0である確率（無関係）である確率を考える、回帰係数がゼロである確率がｐで表され、今回は有意水準である0.05未満であったので、電位の変化は水素ガス指数pH₂に比例することを示している。決定係数ｒ^２は回帰直線がデータとどれくらい一致しているか、ｐは回帰係数が0である確率を示し、有意水準5％未満なので統計学的に有意であると判断した。

【産業上の利用可能性】

【0051】

本発明の生体内レドックス電位測定装置及び生体内レドックス電位測定方法によれば、人の呼気を用いて水素ガス指数pH₂を測定し、この測定値を用いて直接測定することが困難な生体内レドックス電位を推測することができるので、外来患者や入院患者、その他健康診断を受ける人などの健康状態を簡易に把握することができ、環境や代謝状態の評価だけでなく、疾患の評価や治療法の開発にも応用可能であり、よって、健康診断及び各種疾病の治療を行う、診断・治療産業に有用である。また、本発明の生体内レドックス電位検証方法によれば、標準ガスとリン酸緩衝液などを用いて上述の本発明の生体内レドックス電位測定装置及び生体内レドックス電位測定方法によって測定したレドックス電位が実際の電位に近似していることを簡便に検証することができるので、同様に診断・治療産業に有用である。

【符号の説明】

【0052】

１０ pH₂測定部
１２ 入力部
１４ 演算・制御部
１６ 記憶部
１８ 表示部
２０ 医療用空気源
２２ 水素ガス源
２４、２６ 流量計
２８ 切替弁
３０ バブリング装置
３１ 容器
３２ 導管
３４ 排出管
３６ pH及び電位測定装置
３８ 信号伝送路
４０ インターフェース（Ｉ／Ｆ）
４２ 表示部
４４ 記憶部
４６ リン酸緩衝液

【要約】

【課題】培養細胞では代謝産物や酸化還元物質の濃度測定、蛍光法では細胞内の濃度を測定可能であったが、生体内レドックス電位の測定が困難であった。
【解決手段】ネルンストの式によるレドックス電位Eを与える式に、温度が37℃（310K）を設定し、水素/水素イオンのレドックス電位EはE=-0.061×pH+0.031×pH₂(V)となる。pH＝７．４では、E=-0.451+0.031×pH₂ (V)となる。被検体の水素ガス指数pH₂を測定し、上記式を用いてEを算出する。本発明の電位検証方法によれば、空気と水素ガスを含む空気をリン酸緩衝液に吹き込むことにより、吹き込みの前後での電位を測定し、必要な補正を行い、線形回帰直線を求めることにより、水素ガス指数pH₂の変化に伴う電位の変化を確認可能であり、計算で得たレドックス電位が実際のレドックス電位に近似していることがわかる。
【選択図】図１

【図1】

【図2】

【図3】