特許 6870178 卵細胞質内注入法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6870178

(24)【登録日】2021年4月19日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】卵細胞質内注入法

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/00 20060101AFI20210426BHJP

   G02B 21/32 20060101ALI20210426BHJP

   B25J 7/00 20060101ALI20210426BHJP

【ＦＩ】

   C12M1/00 A

   G02B21/32

   B25J7/00

【請求項の数】12

【全頁数】30

(21)【出願番号】特願2020-24006(P2020-24006)

(22)【出願日】2020年2月17日

(65)【公開番号】特開2020-130181(P2020-130181A)

(43)【公開日】2020年8月31日

【審査請求日】2020年9月28日

(31)【優先権主張番号】特願2019-27726(P2019-27726)

(32)【優先日】2019年2月19日

(33)【優先権主張国】JP

【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「成育疾患克服等総合研究事業」「高齢不妊克服のための卵子・卵巣機能改善法」「卵・胚の新規品質評価法の開発と顕微授精技術の改善・標準化」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】500362442

【氏名又は名称】プライムテック株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100007983

【弁理士】

【氏名又は名称】笹川 拓

(72)【発明者】

【氏名】岩元 正樹

(72)【発明者】

【氏名】高山 径子

【審査官】 坂崎 恵美子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１８／０２１１０３（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００９−１４５２６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開平０６−０９０７７０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０４６６４０９７（ＵＳ，Ａ）

【文献】 特開２００４−３２５８３６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００５−０７４５８６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−２０４９４５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１９−１５４３０７（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００

Ｂ２５Ｊ ７／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＷＰＩＤＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

圧電素子の駆動によって当該圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されるインジェクションピペットを用いて行う哺乳類における卵細胞質内注入法であって、
前記インジェクションピペットは、先端側の外周面及び内周面がテーパ状に構成された主テーパ部、
当該主テーパ部よりさらに先端側において、当該インジェクションピペットの内周面のテーパ角度が前記主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を有し、
当該インジェクションピペットの先端を卵細胞質膜に押し当てて当該卵細胞質膜を伸展させ、
その後、当該インジェクションピペットを微小駆動して前記卵細胞質膜を破り、精子を卵細胞質内に注入することを特徴とする卵細胞質内注入法。

【請求項2】

前記先端テーパ部は、当該先端テーパ部の先端に熱を加えて当該ガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部を有することを特徴とする請求項１に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項3】

前記先端テーパ部は、さらに前記熱収縮部と前記主テーパ部との間において、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面を有し、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面を有する副テーパ部を有することを特徴とする請求項２に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項4】

前記先端テーパ部は、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面からなり、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面からなることを特徴とする請求項１に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項5】

前記インジェクションピペットの最先端に位置する卵細胞の透明体又は卵細胞質膜に接する円環部は、前記インジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、前記インジェクションピペットの前記円環部から前記外周面及び前記内周面への移行部は面取りがなされていることを特徴とする請求項１乃至請求項４のうち、いずれか１に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項6】

前記インジェクションピペットの内部に注入する衝撃伝達液として培養液を利用可能であることを特徴とする請求項１乃至請求項５のうち、いずれか１に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項7】

前記インジェクションピペットの内部に注入された前記衝撃伝達液の当該インジェクションピペット先端側に隣接してミネラルオイルを吸引し、さらに当該ミネラルオイルの前記インジェクションピペット先端側に隣接して卵細胞質内に注入する液体を吸引することを特徴とする請求項６に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項8】

前記インジェクションピペットの内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きいことを特徴とする請求項１乃至請求項７のうち、いずれか１に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項9】

前記インジェクションピペットの先端の内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きく、かつ、当該精子を前記インジェクションピペットの先端から出し入れするのに最低限必要な所定のクリアランスを前記精子の頭部の直径の値以外に有することを特徴とする請求項１乃至請求項７のうち、いずれか１に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項10】

前記熱収縮部は前記主テーパ部によりも外径に対する内径の割合が小さいことを特徴とする請求項２に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項11】

前記インジェクションピペットの前記主テーパ部における外径に対する内径の割合は８０％以上１００％未満であることを特徴とする請求項１乃至請求項１０のうち、いずれか１に記載の卵細胞質内注入法。

【請求項12】

前記圧電素子に置換して、電歪素子の駆動によって当該電歪素子に連結された慣性体による衝撃力により前記インジェクションピペットを微小駆動することを特徴とする請求項１乃至請求項１１のうち、いずれか１に記載の卵細胞質内注入法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、卵子、細胞等に穿刺するインジェクションピペットに関し、特に、卵細胞質内注入法に使用し、圧電素子の駆動によって微小駆動されるインジェクションピペットを用いた卵細胞質内注入法に関する。

【背景技術】

【0002】

従来、バイオテクノロジーにおいては、遺伝子・細胞等に人工的操作を加え、新しい遺伝情報体、受精卵を作成することが行われている。光学顕微鏡で観察することできる細胞、核、受精胚等に対して、物理的・機械的操作を加えるマイクロマニピュレータが用いられている。マイクロマニピュレータは、細胞等の人工的操作に不可欠なものとなっている。

【0003】

マイクロマニピュレータには、微小器具（マイクロピペット）が装備され、マイクロピペットを直線方向に移動させる微小移動装置が備えられている。尚、マイクロピペットは、インジェクションピペットともいう。

【0004】

［コンベンショナル法による卵子細胞質内への顕微注入操作］
図１３は、卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのコンベンショナル法を説明する図である。図１３（ａ）に示すように、コンベンショナル法では、ホールディングピペット６８に固定された卵子６０の破膜に先端が鋭利なスパイク加工されたマイクロピペット（以下、「コンベンショナルピペットＣＶ」と記す。）が用いられている。精子７０は、コンベンショナルピペットＣＶの内部に吸引されている。

【0005】

このため、図１３（ｂ）に示すように、卵子６０の透明帯６１をコンベンショナルピペットＣＶが貫通する間、卵子全体が内側に変形して、透明帯６１が押されることにより卵細胞質６５への内圧上昇が発生することがある。

【0006】

また、コンベンショナルピペットの尖端部７５（図１３（ａ））は鋭利にスパイク加工されているため、図１３（ｃ）に示すように卵細胞質膜６４の伸展が十分にされないままに、矢印で示す箇所にストレスがかかり破膜する割合が上昇する。

【0007】

また、図１３（ｄ）に示すように、卵細胞質膜６４の穿刺では、コンベンショナルピペットＣＶの内部に卵細胞質６５の一部を吸引するため、卵細胞質６５に攪拌が起こることがある。

【0008】

このため、鋭利な先端を有するマイクロピペットを用いるコンベンショナル法に代えて、圧電素子を使用して先端がフラットなマイクロピペットで卵子を穿刺する圧電微小駆動装置（ピエゾマイクロマニピュレータ（「ＰＭＭ」ともいう））が知られている。

【0009】

特許文献１には、圧電微小駆動装置が開示されている。特許文献１によれば、圧電微小駆動装置は、保持体に当接部材を介して適切な摩擦力で支持されるマイクロピペット微小器具と、該微小器具に形成される鍔部と、該鍔部に設けられ、かつ微小器具と同心円状に配置される圧電素子と、該圧電素子に取り付けられ、圧電素子の駆動により微小器具に衝撃力を付与する慣性体とを具備するものであり、圧電素子の駆動により、慣性体による衝撃力を発生させ、これを利用して卵子を穿刺することが開示されている。

【0010】

また、特許文献２乃至特許文献４においても、圧電素子の駆動により、慣性体による衝撃力を発生させ、これを利用して卵子を穿刺することが開示されている。

【0011】

このように、所謂ピエゾＩＣＳＩ法における圧電微小駆動装置においては、先行技術文献に記したような、圧電素子の後端部に固定される慣性体が設けられている。

【0012】

［ピエゾＩＣＳＩ法による卵子細胞質内への顕微注入操作］
ここで、圧電微小駆動装置を用いた精子の卵子細胞質内への顕微注入操作について説明する。図１４は、卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾＩＣＳＩ法を説明する図である。

【0013】

図１４（ａ）に示すように、注入操作を行う卵子６０の第一極体６６を６時もしくは１２時の位置にホールディングピペット６８によって保持し、卵子６０の穿刺を行う際に極体の直下の卵子核にダメージを与えないようにする。

【0014】

図１４（ｂ）に示すように、透明帯６１にインジェクションピペットＰＩの先端を軽く押し当てる。このときの精子７０は、インジェクションピペットＰＩ先端から少し離れたインジェクションピペットＰＩの内部に位置するようにする。

【0015】

インジェクションピペットＰＩ先端が透明帯６１に軽く接触した状態で、圧電素子（ピエゾ）を駆動させ、インジェクションピペットＰＩが透明帯６１に刺さり最後の一層までインジェクションピペットＰＩを押し進める。最後の一層を残し、圧電素子を止めて、手動で押し開ける。

【0016】

尚、圧電素子の駆動設定は、圧電素子の振動回数、振動の強度の大きさについて行う。また、圧電素子の駆動設定は、透明帯６１等の穿刺状況に応じて変更する。インジェクションピペットＰＩ内に透明帯６１の断片が入っている場合は、卵子６０の外もしくは囲卵腔６７に排出する。

【0017】

図１４（ｃ）に示すように、精子７０をインジェクションピペットＰＩの先端までに移動させ、インジェクションピペットＰＩの先端を卵細胞質膜６４に押し当てて、卵細胞質膜６４を伸展させる。卵細胞質６５の半分から２／３の位置まで針先を進める。

【0018】

このとき、卵細胞質膜６４は伸展して、図１４（ｃ）に示すように、変形する。卵細胞質６５の半分から２／３の位置で圧電素子４８を駆動させる。即ち、圧電微小駆動装置を用いて顕微授精操作における卵細胞質膜６４を穿刺する際、インジェクションピペットＰＩの先端を卵細胞質膜６４に接触させて押すように移動させて、卵細胞質膜６４を充分伸展させた後に圧電微小駆動装置の圧電素子を稼働させて破膜し、精子７０を卵子６０に注入して操作を完了させる。

【0019】

卵細胞質膜６４を穿破（破膜）した後、なるべく培養液を注入しないように精子７０を注入する。このとき、図１４（ｄ）に示すように、卵細胞質６５は、元の状態に復元するように矢印で示す方向に移動する。

【0020】

尚、卵子細胞質膜６４を充分に伸展できず、卵子細胞質膜６４の伸展開始個所から中心に向けて伸展する途中で破膜した場合には、圧電微小駆動装置を稼働させずに精子７０を注入するようにする。精子７０を注入後、ゆっくりインジェクションピペット等を引き抜くようにする。これにより、ブタの卵子細胞質内への顕微注入操作が完了する。

【0021】

この場合、卵細胞質内注入法にあたり、精子注入用のインジェクションピペットのセッティングは、ピペットホルダ３５（図３に示す）に取り付ける前に、予めオペレーションリキッド（フロリナート）を吸引した充填器であるマイクロピペッターを用いてインジェクションピペットの中心付近にオペレーションリキッド（フロリナート）を約１から１．５ｃｍの幅で充填しておく。尚、充填器は、マイクロピペッターに限らず、インジェクションピペット内にオペレーションリキッドを充填できる器具であればよい。

【0022】

このオペレーションリキッド（フロリナート）のインジェクションピペットへの充填は、圧電素子からの衝撃力をインジェクションピペットの先端に効率よく伝えるために行うものであり、衝撃伝達液として作用するものである。

【0023】

尚、これら所謂ピエゾＩＣＳＩ法のマイクロマニピュレータにおいて、圧電微小駆動装は卵子を穿刺する際に使用するものであり、通常、インジェクションピペットは圧電素子の駆動による慣性体からの衝撃力による卵子を穿刺する際の微小駆動の他、他のマニピュレータによってその他の位置決め操作が可能である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0024】

【特許文献1】特公平６−９８５８２

【特許文献2】特公平６−４８９７５

【特許文献3】特公平６−９８５８３

【特許文献4】特公平７−７３８３０

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0025】

上述したように、精子注入用のインジェクションピペットのセッティングは、圧電素子からの衝撃力をインジェクションピペットの先端に効率よく伝えるために、ピペットホルダに取り付ける前に、予めオペレーションリキッド（フロリナート）を吸引したマイクロピペッターを用いてインジェクションピペットの中心付近にオペレーションリキッド（フロリナート）を約１から１．５ｃｍの幅で充填する。これによりピペットホルダに取り付ける前にインジェクションピペット内にオペレーションリキッドを充填する必要があり、操作に時間を要していた。

【0026】

このため、フロリナート等のオペレーションリキッドを使用することなく、インジェクションピペットに関する操作を簡略化してＰＭＭの効率的な駆動を実現することが求められている。

【0027】

このように、オペレーションリキッドを使用することなしに穿刺性、操作性及び膜高伸展性に優れたインジェクションピペットが求められている。

【0028】

そこで、本発明は、哺乳類における卵細胞質内注入法であって、かつ、圧電素子の駆動によって圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されるインジェクションピペットを用いるものであり、インジェクションピペットの中心付近にオペレーションリキッド（フロリナート）を充填する必要がなく、既存の構成要素を用いることにより、ＰＭＭの効率的な駆動を実現することができ、さらに操作性が向上し、圧電素子を駆動する前のインジェクションピペットによる卵子の膜の伸展性、穿刺性に優れ、胚盤胞発生率を向上させることが可能であって、それにより卵子生存率の向上に繋げることが可能なインジェクションピペットを用いた卵細胞質内注入法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0029】

上記目的達成のため、本発明に係る卵細胞質内注入法は、圧電素子の駆動によって当該圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されるインジェクションピペットを用いて行う哺乳類における卵細胞質内注入法であって、前記インジェクションピペットは、先端側の外周面及び内周面がテーパ状に構成された主テーパ部、当該主テーパ部よりさらに先端側において、当該インジェクションピペットの内周面のテーパ角度が前記主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を有し、当該インジェクションピペットの先端を卵細胞質膜に押し当てて当該卵細胞質膜を伸展させ、その後、当該インジェクションピペットを微小駆動して前記卵細胞質膜を破り、精子を卵細胞質内に注入することを特徴とする。

【0030】

また、前記先端テーパ部は、当該先端テーパ部の先端に熱を加えて当該ガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部を有することを特徴とする。

【0031】

また、前記先端テーパ部は、さらに前記熱収縮部と前記主テーパ部との間において、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面を有し、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面を有する副テーパ部を有することを特徴とする。

【0032】

また、前記先端テーパ部は、テーパ角度が前記主テーパ部の外周面のテーパ角度よりも大きい外周面からなり、かつ、前記主テーパ部の内周面のテーパ角度よりも大きい内周面からなることを特徴とする。

【0033】

また、前記インジェクションピペットの最先端に位置する卵細胞の透明体又は卵細胞質膜に接する円環部は、前記インジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、前記インジェクションピペットの前記円環部から前記外周面及び前記内周面への移行部は面取りがなされていることを特徴とする。

【0034】

また、前記インジェクションピペットの内部に注入する衝撃伝達液として培養液を利用可能であることを特徴とする。

【0035】

また、前記インジェクションピペットの内部に注入された前記衝撃伝達液の当該インジェクションピペット先端側に隣接してミネラルオイルを吸引し、さらに当該ミネラルオイルの前記インジェクションピペット先端側に隣接して卵細胞質内に注入する液体を吸引することを特徴とする。

【0036】

また、前記インジェクションピペットの内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きいことを特徴とする

【0037】

また、前記インジェクションピペットの先端の内径は、卵細胞質の中に注入する精子の頭部の最大直径よりも大きく、かつ、当該精子を前記インジェクションピペットの先端から出し入れするのに最低限必要な所定のクリアランスを前記精子の頭部の直径の値以外に有することを特徴とする。

【0038】

また、前記熱収縮部は前記主テーパ部によりも外径に対する内径の割合が小さいことを特徴とする。

【0039】

また、前記インジェクションピペットの前記主テーパ部における外径に対する内径の割合は８０％以上１００％未満であることを特徴とする。

【0040】

また、前記圧電素子に置換して、電歪素子の駆動によって当該電歪素子に連結された慣性体による衝撃力により前記インジェクションピペットを微小駆動することを特徴とする。

【発明の効果】

【0041】

本発明の卵細胞質内注入法によれば、卵細胞質内注入法という非常に微小な領域での作業について、原理が未知の部分が多いものの、発明者は試行錯誤の結果、以下のような効果を得られることを見出したものである。

【0042】

即ち、本発明によれば、先端側に主テーパ部を有するインジェクションピペットは、主テーパ部よりさらに先端側において、内周面のテーパ角度が主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を設けることにより、内周面が先端に向かって縮径されるため、インジェクションピペット内の培養液等の流れを調整することできインジェクタの操作性が向上する。

【0043】

また、インジェクションピペットの先端テーパ部は、先端に熱を加えてガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部を有し、熱収縮部は先端を丸めた曲面となって先端の内径が狭くなるため、インジェクタによる培養液等の吸引と吐出とを微妙に調節できるようになり、ピエゾＩＣＳＩ法におけるマイクロマニピュレータのインジェクタの操作性が向上する。

【0044】

本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは、最先端に位置する円環部がインジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、インジェクションピペットの円環部から外周面及び内周面への移行部は面取りがなされていることにより、試行錯誤の結果、卵細胞質への内圧上昇が発生することがないことが判明した。これにより、穿刺性、操作性及び膜高伸展性に優れたインジェクションペットを用いた卵細胞質内注入法を提供することができる。

【0045】

また、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは、そもそもの構成要素である培養液を衝撃伝達液として利用することによって、フロリナート等のオペレーションリキッドを殊更用意することなく、従来と同様のピエゾＩＣＳＩ法による卵細胞質内の注入が可能となる。

【0046】

また、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットによれば、インジェクションピペット内にオペレーションリキッドを注入する必要がなく、卵細胞質内の注入工程を簡素化することができる。

【0047】

また、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは、ＰＭＭによる卵子・胚に対して操作を行う際に確実な穿刺性能を有している。即ち、コンベンショナル法は、ピペットの形状、卵子の質および操作者の熟練度により穿刺もばらつきが発生する恐れがあるが、本発明に係るインジェクションピペットは、安定した穿刺性能により膜を十分に伸展して毎回同じような穿刺を行うことが可能である。

【0048】

また、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは先端形状を丸めることで、老化卵子の脆弱な卵細胞質膜を十分に伸展させることが可能となり、精子注入後の卵子生存率の向上が期待できる。

【図面の簡単な説明】

【0049】

【図1】本発明に用いるインジェクションピペットの外観、構成を示す図であり、（ａ）は、インジェクションピペットの全体を示す図、（ｂ）はインジェクションピペットの主テーパ部と主テーパ部の先端側に位置する先端テーパ部の外形を示す図、（ｃ）は、図１（ｂ）に示す破線円内の領域Ａの先端テーパ部の構成を示す拡大断面図である。

【図2】ＩＣＳＩ操作に用いるインジェクションピペットの熱収縮部における先端の側面の形状及び各部の大きさを示す拡大した断面図であり、（ａ）は先端をフラットにした形状、（ｂ）は先端を小さく丸めた熱収縮部の形状、（ｃ）は先端を大きく丸めた熱収縮部の形状を示す。

【図3】本発明に用いるインジェクションピペットが接続された圧電微小駆動装置の構成を示すブロック図である。

【図4】インジェクションピペットによるブタ卵子透明体への穿刺性、操作性の測定評価フローを示す図である。

【図5】インジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はコントローラのスピード２における穿刺の測定結果、（ｂ）はコントローラのスピード５における穿刺の測定結果である。

【図6】図５に示すインジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによるインジェクタの操作性の評価結果を示す図である。

【図7】オペレーションリキッド無しでのブタ卵子透明体の穿刺性の測定結果を示す図である。

【図8】各種インジェクションピペットの穿刺性、操作性の測定評価結果を示す図である。

【図9】各種インジェクションピペットの卵細胞質膜の伸展性の測定結果を示す図である。

【図10】インジェクションピペット内にオペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果を示す図である。

【図11】７種類の形状のインジェクションピペットによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における生存卵子数とその割合（卵子生存率（％））及び胚盤胞発生数とその割合（胚盤胞発生率（％））の結果を示す図である。

【図12】図１１に示す７種類の形状のインジェクションピペットによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における胚盤胞発生率の結果をグラフで示す図である。

【図13】卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのコンベンショナル法を説明する図である。

【図14】卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾＩＣＳＩ法を説明する図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

以下、図面を参照して、本発明による卵細胞質内注入法を実施するための形態について説明する。尚、本発明は、哺乳類における卵細胞質内注入法（ＩＣＳＩ）であって、圧電素子の駆動によって圧電素子に連結された慣性体による衝撃力により微小駆動されるインジェクションピペットを用いた卵細胞質内注入法に関するものであり、本発明に用いるインジェクションピペットは、主テーパ部よりさらに先端側において、インジェクションピペットの内周面のテーパ角度が主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を有することにより、オペレーションリキッド無しで内部に注入する培養液を衝撃伝達液として利用可能であることを発明者が試行錯誤の結果見出したものである。

【0051】

［インジェクションピペットの構成］
図１は、本発明に用いるインジェクションピペットの外観、構成を示す図であり、図１（ａ）はインジェクションピペットの全体を示す図、図１（ｂ）はインジェクションピペットの主テーパ部と主テーパ部の先端側に位置する先端テーパ部の外形を示す図、図１（ｃ）は、図１（ｂ）に示す破線円内の領域Ａの先端テーパ部の構成を示す拡大断面図である。

【0052】

尚、本発明は図１４において説明した卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾＩＣＳＩ法のインジェクションピペットＰＩの形状及びその運用方法について改良を行ったものであり、図１４と同じ内容については同じ符合を使用して説明する。

【0053】

図１（ａ）に示すように、インジェクションピペット１は、ガラス管から成り、テーパ状に形成された主テーパ部３と、主テーパ部３の先端側に位置する先端テーパ部７と、開口された先端から所定の距離に設けられた曲げ部２５と、ピペットホルダ３５（図３に示す）に取り付けられ所定の長さを有し、外径が一定である直管状の基部２７とを有している。図１（ａ）では、主テーパ部３と基部２７との境界を破線で示す。

【0054】

図１（ｂ）に示すように、インジェクションピペット１の主テーパ部３は、インジェクションピペット１の先端から例えば、約１５ｍｍの長さを有しており、先端に向かって縮径するテーパ状に形成され、テーパ角度θ１を有している。

【0055】

主テーパ部３よりさらに先端側に先端テーパ部７が設けられている。主テーパ部３の先端側に位置する先端テーパ部７は、テーパ角度θ２を有している。また、先端テーパ部７は、先端を熱で収縮加工した熱収縮部１２を有している。図１（ｂ）では、主テーパ部３と先端テーパ部７との境界を破線で示す。

【0056】

図１（ｂ）に示すように、主テーパ部３の先端側に位置する先端テーパ部７におけるテーパ角度（図１（ｂ）に示すθ２）は、主テーパ部３のテーパ角度（図１（ｂ）に示すθ１）よりも大きくなっている。

【0057】

図１（ｂ）に示す先端テーパ部７は、さらに熱収縮部１２と主テーパ部３との間において、テーパ角度θ２が主テーパ部３の外周面４のテーパ角度θ１よりも大きい外周面１０を有し、かつ、テーパ角度（図示せず）が主テーパ部３の内周面（図示せず）のテーパ角度（図示せず）よりも大きい内周面１１（図１（ｃ）に示す）を有する副テーパ部９を有している。副テーパ部９は、インジェクションピペット１の先端から例えば、約０．２５ｍｍの長さを有している。

【0058】

このように、先端テーパ部７は、熱収縮部１２と副テーパ部９からなり、副テーパ部９はテーパ角度θ２が主テーパ部３の外周面のテーパ角度θ１よりも大きい外周面１０からなり、かつ、主テーパ部３の内周面のテーパ角度（図示せず）よりも大きい内周面１１（図１（ｃ）に示す）からなる。これにより、主テーパ部３から先端テーパ部７に向かって急激に先細状態となっている。尚、先端テーパ部７を有するインジェクションピペット１をラディッシュタイプ（ＲＤと記す）と称する。

【0059】

また、先端テーパ部７における外周面及び内周面のテーパ角度が、主テーパ部３の外周面及び内周面のテーパ角度と同じ大きさの角度で形成している場合には、インジェクションピペット１は、主テーパ部３のみで構成される。以後、主テーパ部３のみで構成されるインジェクションピペット１をパラレルタイプ（Ｐと記す）と称する。尚、パラレルタイプでも熱収縮部１２が形成されることがある。

【0060】

図１（ｃ）に示すインジェクションピペット１の熱収縮部１２は、ファイアーポリシュによってインジェクションピペット１の先端に熱を加えてガラス管を収縮させたものである。先端に熱を加えることにより表面が溶けて、熱収縮部１２の先端に周囲が面取りされた円環部１４が形成される。

【0061】

即ち、円環部１４はインジェクションピペット１の先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、インジェクションピペット１１の円環部１４から外周面９への移行部１９の端面は面取りがされている。また、インジェクションピペット１は、先端の円環部１４から内周面１１への移行部２１の端面は面取りがされている。換言すれば、図１（ｃ）において、移行部１９と移行部２１に挟まれた頂部分が円環部１４となる。

【0062】

これにより、円環部１４は卵細胞質内注入における卵細胞の透明体又は卵細胞質膜に接して、卵細胞質への内圧上昇の発生を防止し、卵細胞質膜の伸展が十分に図られることが発明者の試行錯誤の結果判明した。

【0063】

図１（ｃ）に示すインジェクションピペット１の内径（図１（ｃ）に示すｄｉ）の大きさは、卵細胞質６５（図１２に示す）の中に注入する精子頭部の最大直径よりも大きくなっている。例えば、豚の精子頭部の直径が、約３．５マイクロンメータ（μｍ）前後であり、豚（ブタとも記す）に用いるインジェクションピペット１の内径は、ブタの精子特有の粘着性から、ピペットや、他の精子との癒着を防止するべく、精子頭部の最大直径以外のクリアランスが必要となり、その結果、ブタに用いるインジェクションピペット１の最低限必要な内径は、最小値が約６μｍとなり、インジェクションピペット１を操作する者の経験や操作特性によって必要となるクリアランスも異なるため、最大値が約９μｍとなる。

【0064】

また、人の精子の頭部の直径は、やはり約３．５マイクロンメータ（μｍ）前後であり、ブタのような粘着性もないことからクリアランスを大きく設定する必要もなく、人（ヒトとも記す）に用いるインジェクションピペット１の最低限必要な内径の最小値は、約３．５μｍを超える大きさである。

【0065】

そのため、通常、精子の頭部の直径に対して、インジェクションピペット１の内径に対するクリアランスを０％超６５％以下に保ったインジェクションピペット１であれば、インジェクションピペット１の内部に対して哺乳類の精子の出し入れが可能であり、インジェクションピペット１の内径は哺乳類の精子頭部の直径と、この直径以外のクリアランス（内径−精子頭部の最大直径）を考慮して設定される。

【0066】

即ち、インジェクションピペット１の内径は、動物種による精子の特性（精子の先体反応などによる粘着性や、例えば、マウスの精子頭部のような鈎状等の精子頭部の形状）により、精子頭部の最大直径よりも余裕を持った大きさが必要となる。また、インジェクションピペット１を操作する者の経験や操作特性によって必要となるクリアランスも異なる。このため、インジェクションピペット１の内径のクリアランスは、内径に対して最大で６５％である。一方、インジェクションピペット１の内径が、精子の頭部の最大直径の大きさとほぼ同じ大きさであってもよい場合もあることから、インジェクションピペット１の内径のクリアランスは、内径に対して最小で０％超（精子頭部の最大直径をわずかに超える値）である。

【0067】

図１（ａ）に示すように、開口された先端から所定の距離に設けられた曲げ部２５は、インジェクションピペット１の先端から例えば、１から５ｍｍの距離に曲げ位置が設けられており、曲げ部２５における曲げ角度は、例えば２０度である。

【0068】

曲げ角度は、インジェクションピペット１の基体を成す基部２７からの曲げ角度が０度のときは、インジェクションピペット１全体がストレートに形成されている。尚、インジェクションピペット１は、曲げ角度を有するものに限らず、ストレートのものを使用してもよい。

【0069】

ピペットホルダ３５に取り付けられる基部２７は、例えば約５０ｍｍの長さを有しており、先端に位置する熱収縮部１２と連通した内部空間を有している。直管状の基部２７の一方の端部は、主テーパ部３と連接されており、他の端部は、ピペットホルダ３５に固定される。

【0070】

［インジェクションピペットの先端の形状］
次に、ブタ用のＩＣＳＩ操作に用いるインジェクションピペットの熱収縮部における先端の形状について説明する。

【0071】

図２は、ブタ用のＩＣＳＩ操作に用いるインジェクションピペットの熱収縮部における先端の側面の形状及び各部の大きさを示す拡大した断面図であり、図２（ａ）は先端をフラットにした形状、図２（ｂ）は先端を小さく丸めた熱収縮部の形状、図２（ｃ）は先端を大きく丸めた熱収縮部の形状を示す。

【0072】

図２（ａ）に示す先端をフラットにしたインジェクションピペット１の外径ｄｏ１は、１０μｍ（マイクロンメータ）であり、内径ｄｉ１は９μｍである。尚、先端がフラットのインジェクションピペットをフラットＦと記す。尚、先端がフラットのインジェクションピペットの外径ｄｏ１は、先端外径ともいう。

【0073】

図２（ｂ）は、外径ｄｏ２が１１μｍのガラス管の先端をファイアーポリシュにより、先端外径ｄｆ１が１０μｍ、内径ｄｉ２が８μｍとなるように先端を小さく丸め加工を行ったものである。また、インジェクションピペット１の最先端に位置する熱収縮部１２の円環部１４から軸方向に２５から３０μｍ（図２（ｂ）に示すｔ１）に対応する副テーパ部９の外周面１０までが、移行部１９である。先端を小さく丸め加工した熱収縮部１２を有するインジェクションピペット１を少ない丸めタイプＲと記す。

【0074】

図２（ｃ）は、外径ｄｏ３が１２μｍのガラス管の先端をファイアーポリシュにより、先端外径ｄｆ２が１０μｍ、内径ｄｉ３が６．８μｍとなるように先端を大きく丸め加工を行ったものである。また、インジェクションピペット１の最先端に位置する熱収縮部１２の円環部１４から軸方向に３５から４０μｍ（図２（ｃ）に示すｔ２）に対応する副テーパ部９の外周面までが、移行部１９である。先端を大きく丸め加工した熱収縮部１２を有するインジェクションピペット１を大きい丸めタイプＨＲと記す。

【0075】

図２（ｂ）、図２（ｃ）に示すように、インジェクションピペット１の先端を丸め加工することにより、先端の熱収縮部１２のガラス管の厚みが増加している。尚、上述したインジェクションピペットの寸法は、一例であり、これに限定するものではない。

【0076】

［顕微授精用ピペットの作製］
次に、インジェクションピペット１の作成について述べる。図１に示すインジェクションピペット１の作成には、素材がガラス管からなり、外径１ｍｍ、ガラス管肉厚約５０μｍ、即ち、ガラス管の外径に対する内径の割合が９０％のガラス管（以下、「９０管」と記す。）、ガラス管肉厚約７５μｍ（以下、「８５管」と記す。）、ガラス管肉厚約１２５μｍ（以下、「７５管」と記す。）を用いる。ガラス管をガラス管引き伸ばし機にセッティングし、目的の形状に合わせたプログラムにより、ガラス管を細く引き伸ばす。

【0077】

引き伸ばしたガラス管は、ガラス管加工機のピペットホルダに装着する。ガラス管加工機は、ヒーターに取り付けられた白金線上のガラスの玉を加熱して各種の加工を行うものである。ガラス管加工機によって、ガラス管の所定の太さの部分に加熱したガラスの玉を素早く接着させることで、ガラス管を折るようにする。折ったガラス管は、先端から１ｍｍ以上の長さの部分にガラス管加工機の加熱したガラス玉の位置を調整して、必要があれば所定の角度に曲げるようにする。

【0078】

また、ガラス管からなるインジェクションピペット１は、ファイアーポリシュよって先端に熱を加えて表面を溶解させることにより、熱収縮部１２が形成される。また、ファイアーポリシュによってインジェクションピペット１の外周面１０から円環部１４への移行する部分である移行部１９及び円環部１４から内周面１１への移行する部分である移行部２１が形成される。尚、ファイアーポリシュの加熱時間等を調整することにより、図２（ｂ）、図２（ｃ）に示す先端形状が得られる。

【0079】

［圧電微小駆動装置の構成］
次に、インジェクションピペット１が接続された圧電微小駆動装置の構成について説明する。

【0080】

図３は、インジェクションピペット１が接続された圧電微小駆動装置の構成を示すブロック図である。図３に示すように、圧電微小駆動装置３０は、インジェクションピペット１を取り付けるピペットホルダ３５と、圧電微小駆動装置３０を顕微鏡のＸＹＺθマニピュレータ５５に取り付ける器具であるスライドベース４０と、圧電素子４８を内蔵したドライブユニット４５とを有している。

【0081】

ピペットホルダ３５は、先端にインジェクションピペット１を取り付けて固定するホルダグリップ３６を備えている。ホルダグリップ３６の内部に、O（オー）リングが設けられており、インジェクションピペット１の直管状の基部２７における端部をピペットホルダ３５に挿入して、O（オー）リングで締めてインジェクションピペット１を固定する。

【0082】

尚、本発明に用いるインジェクションピペット１は、オペレーションリキッド無しで使用するが、従来のように、インジェクションピペット１内にオペレーションリキッドを充填して使用することも可能である。

【0083】

図３に示すように、ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６とスライドベース４０との間には、ドライブユニット４５が取り付けられている。スライドベース４０に設けられているクランプネジ４１により、ピペットホルダ３５をスライドベース４０に固定する。スライドベース４０には、顕微鏡に備えられたＸＹＺθマニピュレータ５５に接続するための接続部（図示せず）を有している。スライドベース４０の接続部と顕微鏡のＸＹＺθマニピュレータ５５とを接続することにより、インジェクションピペット１の先端が、ＸＹＺθマニピュレータ５５の動きに連動して移動する。

【0084】

尚、本発明の所謂ピエゾＩＣＳＩ法のマイクロマニピュレータにおいて、圧電微小駆動装置３０は卵子を穿刺する際に使用するものであり、インジェクションピペット１は圧電素子の駆動による慣性体からの衝撃力による卵子を穿刺する際の微小駆動の他、ＸＹＺθマニピュレータ５５の動きによってその他の位置決め操作が可能である。

【0085】

このように、インジェクションピペット１が接続された圧電微小駆動装置３０は、スライドベース４０を介して顕微鏡のXYZθマニピュレータ５５に接続される。尚、圧電微小駆動装置と顕微鏡のＸＹＺθマニピュレータ５５の接続は、スライドベース４０を使用することに限定するものではなく、他のものであってもよい。

【0086】

ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６とスライドベース４０との間に位置するドライブユニット４５は、圧電素子４８の一方の主面（振動する面）に連結された慣性体４９を内蔵し、圧電素子４８の他方の主面を結合した鍔部４７を介してピペットホルダ３５のパイプに固定されている。ドライブユニット４５がピペットホルダ３５のホルダグリップ３６とスライドベース４０との間に位置することにより、インジェクションピペット１の先端に効率的に力を伝えることができる。尚、ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６とドライブユニット４５との間に、スライドベース４０を取り付けるようにしてもよい。

【0087】

圧電微小駆動装置３０には、圧電素子４８を制御するコントローラ５４と、コントローラ５４に接続され、圧電素子４８の駆動条件を設定する表示パネル（図示せず）と、圧電素子４８を駆動するスイッチ（図示せず）とが備えられている。

【0088】

コントローラ５４は、例えば圧電素子４８に印加する振動数であるスピード(図面にSpeedと記す。)と、圧電素子４８に印加する振動の大きさであるインテンシティー（図面にIntensityと記す。）によって圧電素子４８を制御する。コントローラ５４は、一例としてスピードが１から１６、インテンシティーが１から１６を設定することができ、出力の最小値は１であり、最大値は１６である。コントローラ５４の設定値に対する圧電素子４８への出力は、リニアに変化する。

【0089】

インジェクションピペット１は、圧電素子４８の駆動によって圧電素子４８に連結された慣性体４９による衝撃力により微小駆動される。尚、圧電素子４８の駆動による慣性体４９によるインジェクションピペット１に発生する衝撃力に関する詳細は公知であり、特許文献１の特公平６−９８５８２等に開示されているため、説明は省略する。尚、圧電素子４８は、電歪素子であっても同様にインジェクションピペット１を慣性体４９の衝撃力により微小駆動が可能である。

【0090】

また、図３に示すように、ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６と反対側の端部には、チューブ５３を介して空圧式インジェクタ５２が接続されている。空圧式インジェクタ５２から供給される空気は、ドライブユニット４５、ピペットホルダ３５を流れてインジェクションピペット１の他端に供給される。

【0091】

空圧式インジェクタ５２は、チューブ５３をドライブユニット４５に接続するのみであり、吸引と吐出を微妙に調整することが可能である。このため、インジェクタとして空圧式インジェクタは好適である。尚、インジェクタとして空圧式インジェクタに代えて、液圧式インジェクタを用いてもよい。

【0092】

以上の構成からなる圧電微小駆動装置３０では、インジェクションピペット１は先端側に主テーパ部を有し、主テーパ部よりさらに先端側において、内周面のテーパ角度が主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を設けることにより、内周面が先端に向かって縮径されるため、インジェクションピペット内の培養液等の流れを調整することできインジェクタの操作性が向上する。

【0093】

また、インジェクションピペット１の先端テーパ部は、先端に熱を加えてガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部を有し、熱収縮部は先端を丸めた曲面となって先端の内径が狭くなるため、インジェクタによる培養液等の吸引と吐出とを微妙に調節できるようになり、ピエゾＩＣＳＩ法におけるマイクロマニピュレータのインジェクタの操作性が向上する。

【0094】

［培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性の測定］
次に、本発明に用いるインジェクションピペットについて培養液量の違いによるＰＭＭの卵子透明体への穿刺性、操作性の実験評価について述べる。尚、以下に示す穿刺性の測定は、インジェクションピペットにオペレーションリキッドを使用することなしに、培養液量等で卵子透明体に穿刺可能であるかを測定したものである。

【0095】

図４は、本発明に用いるインジェクションピペットによるブタ卵子透明体への穿刺性、操作性の測定評価フローを示す図である。

【0096】

最初に、哺乳類おける卵細胞質内注入法での卵子透明体への穿刺の準備及び操作について述べる。尚、以下に述べる卵細胞質内注入法での卵子透明体は、哺乳類としてブタを用いたものである。卵細胞質内注入法は、圧電素子４８（ピエゾ）を使用した圧電微小駆動装置３０を用いており、圧電微小駆動装置３０は、顕微鏡に設けられたＸＹＺθマニピュレータ５５に取り付けられている。

【0097】

使用する卵子６０（図１２に示す）を固定するためのホールディングピペット６８をピペットホルダ（図示せず）に取り付ける。その際、液圧式タイプのインジェクタに接続されている場合には、ピペットホルダ内のオイルを排出し気泡をしっかりと排出した後にホールディングピペット６８を取り付けるが、空圧式インジェクタ５２の場合はそのまま取り付ける。

【0098】

図４に示すように、インジェクションピペット１をＰＭＭに取り付ける（ステップＳ１）。使用したインジェクションピペット１は２種類であり、一方のインジェクションピペット１は、８５管、先端外径の大きさが６μｍ、主テーパ部３のみのパラレルタイプP、先端形状がフラットＦであり、これを８５−６−P−Ｆと称す。

【0099】

他方のインジェクションピペット１は、９０管、先端外径の大きさが５μｍ、主テーパ部３の先端側に先端テーパ部７を有するラディッシュタイプＲＤ、先端形状が少ない丸めタイプＲであり、これを９０−５−ＲＤ−Ｒと称す。

【0100】

図３に示すように圧電微小駆動装置３０の先端には、インジェクションピペット１とピペットホルダ３５とを接続するホルダグリップ３６が設けられている。圧電微小駆動装置３０に取り付けられたピペットホルダ３５のホルダグリップ３６をインジェクションピペット１を取り付けるために緩める。

【0101】

ピペットホルダ３５のホルダグリップ３６と反対側に位置する端部側に空圧式インジェクタ５２が接続されている場合には、圧電微小駆動装置３０が取り付けてあるピペットホルダ３５のホルダグリップ３６を緩めて、そのままインジェクションピペット１を取り付ける。

【0102】

インジェクションピペット１をホルダグリップ３６内の４連になっているO（オー）リングを貫通するように挿入してホルダグリップ３６をしっかりと締め付ける。最初に、ＰＭＭに取り付けた８５−６−Ｐ−Ｆのインジェクションピペット１を７％ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）液でリンスし、リンス後にＰＶＰ液を吐き出す（ステップＳ２）。

【0103】

ＰＶＰ液を吐き出した後に、培養液であるＰＺＭドロップに移動して、空圧式インジェクタ５２を操作して、培養液であるＰＺＭ（Porcine Zygote Medium）をインジェクションピペット１先端から５ｍｍ吸引する（ステップＳ３）。

【0104】

次に、インジェクションピペット１の先端にミネラルオイルを吸引する（ステップＳ４）。吸引したミネラルオイルは、異なる液の境界を示す指標としてオイル玉の形状を有している。

【0105】

ミネラルオイルを吸引後に、インジェクションピペット１の先端からインジェクションピペット１の曲げ部２５の１ｍｍの位置までＰＶＰ液を吸引する（ステップＳ５）。

【0106】

次に、ブタ卵子透明体に穿刺の測定を行う（ステップＳ６）。穿刺の測定は、最初に注入操作を行う卵子６０の第一極体６６（図１２（ａ）参照）を６時もしくは１２時の位置にホールディングピペット６８によって保持する。

【0107】

コントローラ５４により圧電素子４８の振動回数、振動の強度の大きさの駆動設定を行う。最初に圧電素子４８の振動回数であるスピード（Speed）を２に設定する。インジェクションピペット１先端が透明帯６１に軽く接触した状態で、圧電素子（ピエゾ）４８を駆動させ、インジェクションピペット１が透明帯６１に刺さり、透明帯６１に穴が開くことを確認し、透明帯６１に穴が開いたときのインテンシティー（Intensity）の値を測定する。インジェクションピペット１の先端にＰＶＰ液を吸引した状態をＰＶＰ＋と記す。

【0108】

さらに、透明帯６１にインジェクションピペット１の先端を軽く押し当てた状態でのインジェクタの操作性の確認を行って、インジェクタの操作性を１から５の５段階で評価をする（ステップＳ７）。５段階の評価は、５については何の問題もなくインジェクションピペット１内に精子等を吸引したり、ピペット外に排出したりする操作が行えることを示す。４は、操作に多少の注意が必要であることを示す。３は、４や５に比べると注意を払いながら操作が必要になるが、穿刺操作等のコントロールが可能であることを示す。２や１は、穿刺操作等のコントロールが難しく操作ができないレベルを示す。

【0109】

次に、オイル玉を指標に、インジェクションピペット１からＰＶＰ液を排出し、先端を培養液（ＰＺＭ）に置き換える（ステップＳ８）。ＰＶＰ液を排出して先端を培養液（ＰＺＭ）に置き換えた状態をＰＶＰ−と記す。

【0110】

次に、ステップＳ６と同様の操作により穿刺の測定を行う（ステップＳ９）。ステップＳ７と同様の操作によりインジェクタの操作性の確認を行って、５段階の評価をする（ステップＳ１０）。

【0111】

次に、ステップＳ３に移行して先端からＰＺＭを７ｍｍ吸引する。以下同様に先端からＰＺＭを１０、１２、１３、１５ｍｍ吸引するようにして穿刺性の測定をステップＳ３から繰り返す（ステップＳ１１）。

【0112】

また、圧電素子４８の振動回数であるスピードを５に設定して、ステップＳ３から同様の実験評価を行う。

【0113】

さらに、９０−５−ＲＤ−Ｒのインジェクションピペット１についても、同様の卵子透明体への穿刺性、インジェクタの操作性の実験評価を行う。

【0114】

［培養液量の違いによる穿刺性の測定の結果］
以下にインジェクションピペット毎の先端から培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性の測定結果を図５を用いて説明する。図５は、インジェクションピペット１内に吸引した培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はコントローラのスピード２における穿刺可能なコントローラのインテンシティー値の測定結果、（ｂ）はコントローラのスピード５における穿刺可能なコントローラのインテンシティー値の測定結果である。

【0115】

図５に示すＰＭＭの穿刺性の測定結果を示すグラフの横軸は、吸引した培養液量のインジェクションピペット１の先端からの各距離（幅）を示し、グラフの縦軸は、コントローラのインテンシティーの数値を示す。

【0116】

図５（ａ）に８５−６−Ｐ−Ｆ／ＰＶＰ＋で示すように、８５−６−Ｐ−ＦのインジェクションピペットではSpeed値２の設定条件で、インジェクションピペット先端からの培養液の量を５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１６．０、培養液の量を７ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１５．０、培養液の量を１０ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１１．０、培養液の量を１２ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が６．５、培養液の量を１３ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が５．５、培養液の量を１５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が５．０の設定でブタ卵子への穿刺が行えた。

【0117】

図５（ａ）に８５−６−Ｐ−Ｆ／ＰＶＰ−で示すように、８５−６−Ｐ−Ｆのインジェクションピペット内のオイル玉の前のＰＶＰ液を排出して培養液（ＰＺＭ）に置き換えた場合、Speed値２の設定条件で、インジェクションピペット先端からの培養液の量を５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１４．０、培養液の量を７ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が７．０、培養液の量を１０ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が４．０、培養液の量を１２ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が２．５、培養液の量を１３ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が２．０、培養液の量を１５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１．５の設定でブタ卵子への穿刺が行えた。

【0118】

また、図５（ｂ）に８５−６−Ｐ−Ｆ／ＰＶＰ＋で示すように、８５−６−Ｐ−Ｆのインジェクションピペットは、Speed値５の設定条件で、インジェクションピペット先端からの培養液の量を５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１４．０、培養液の量を７ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１２．０、培養液の量を１０ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が９．０、培養液の量を１２ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が６．０、培養液の量を１３ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が５．０、培養液の量を１５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が４．５の設定でブタ卵子への穿刺が行えた。

【0119】

図５（ｂ）に８５−６−Ｐ−Ｆ／ＰＶＰ−で示すように、８５−６−Ｐ−Ｆのインジェクションピペット内のオイル玉の前のＰＶＰ液を排出して培養液（ＰＺＭ）に置き換えた場合、Speed値５の設定で、インジェクションピペット先端からの培養液の量を５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１２．０、培養液の量を７ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が６．０、培養液の量を１０ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が３．０、培養液の量を１２ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が２．０、培養液の量を１３ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１．５、培養液の量を１５ｍｍの幅で吸引した場合には、Intensity値が１．５の設定でブタ卵子への穿刺が行えた。

【0120】

同様に、図５（ａ）、図５（ｂ）にインジェクションピペット９０−５−ＲＤ−ＲのＰＶＰ＋の測定結果を９０−５−ＲＤ−Ｒ／ＰＶＰ＋で、ＰＶＰ−の測定結果を９０−５−ＲＤ−Ｒ／ＰＶＰ−で示す。

【0121】

図５に示す穿刺性の測定結果からオペレーションリキッド無しで取り付けた８５−６−Ｐ−Ｆは、インジェクションピペット先端からの培養液の吸引量が１２ｍｍの幅未満の場合には、コントローラ５４のIntensity値が高くなり穿刺性が極端に低下した。また、培養液の吸引量が１２ｍｍの幅以上吸引してＰＶＰ液が含まれた場合には、穿刺性がやや改善することが確認された。

【0122】

オペレーションリキッド無しで取り付けた９０−５−ＲＤ−Ｒは、培養液の吸引量が７ｍｍの幅以上あれば穿刺性が向上し、ＰＶＰ液が含まれていても穿刺性は安定していた。

【0123】

以上述べたように、試験によりオペレーションリキッド無しで取り付けたインジェクションピペットのセッティング条件として培養液の吸引量による影響を調べた結果、培養液を１２ｍｍの幅以上吸引すれば、両ピペットともに穿刺性が安定したものの、９０−５−ＲＤ−Ｒは培養液の吸引量が７ｍｍの幅以上で穿刺性が向上して安定するため、９０−５−ＲＤ−Ｒが８５−６−Ｐ−Ｆと比較して優位であることが分かった。

【0124】

供試した２種類のインジェクションピペットの差は、ガラス管肉厚、テーパ部分の形状および先端形状が異なるが、テーパ部がラディッシュタイプＲＤのインジェクションピペットである９０−５−ＲＤ−Ｒはオペレーションリキッド無しでの穿刺性が格段に安定している。

【0125】

８５−６−Ｐ−Ｆは、テーパ部分が緩やかに細くなる形状により、先端からの吸引している培養液の幅は９０−５−ＲＤ−Ｒと同じでも、実際の培養液容量は少なくなるため穿刺性が低くなることが実験結果から分かった。

【0126】

さらに、９０−５−ＲＤ−Ｒ及び８５−６−Ｐ−Ｆの両インジェクションピペットピペットは、培養液を多く吸引すれば穿刺性を得ることはできるものの、ＰＶＰ液が含まれる条件でのインテンシティーの値が低いこと等の安定性と、培養液を吸引する時間等のセッティングに要する手間を考慮すると９０−５−ＲＤ−Ｒの方が実用性が格段に高い。

【0127】

［培養液量の違いによる操作性］
次に、図５に示すインジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによるインジェクタの操作性について説明する。このインジェクタの操作性とはインジェクタによるインジェクションピペット内への培養液等の吸引と吐出といった微妙な操作についての操作性を意味する。

【0128】

図６は、インジェクションピペット内に吸引した培養液量の違いによる空圧式インジェクタの操作性の評価結果を示す図である。

【0129】

図６に示すように、評価したインジェクションピペット８５−６−Ｐ−Ｆ、９０−５−ＲＤ−Ｒにおける培養液の吸引量に対する先端にＰＶＰ液を吸引した場合（ＰＶＰ＋と記す）とＰＶＰ液を排出した場合（ＰＶＰ−と記す）での評価結果を１から５までの５段階で示す。

【0130】

図６に示すように、空圧式インジェクタでの操作について培養液の吸引量による差は認められなかったが、ＰＶＰ液が含まれない場合には、８５−６−Ｐ−Ｆの方がインジェクタの操作性がやや低下し、９０−５−ＲＤ−Ｒの方が安定していた。

【0131】

これにより、ブタ卵子透明体に対する穿刺性、インジェクタの操作性とも９０−５−ＲＤ−Ｒが８５−６−Ｐ−Ｆより優れていることが判明した。即ち、９０管、先端テーパ部がラディッシュタイプＲＤ、先端形状が少ない丸めタイプＲを有するインジェクションピペットが好適である。

【0132】

以上のように、図５及び図６に示すインジェクションピペット１内に吸引した培養液量の違いによるＰＭＭの穿刺性及びインジェクタの操作性の測定結果を考慮すると、培養液はこれまでのオペレーションリキッドと同程度（インジェクションピペット内で１０〜１５ｍｍに相当する量）の量を用いれば、本発明に係るインジェクションピペット１の形状と組み合わせることにより、オペレーションリキッド無しで穿刺効果を発揮することが確認できた。

【0133】

尚、培養液については、ブタ穿刺用のＰＺＭを用いた例を説明したが、哺乳種によって培養液の種類は異なるものの、本発明に係るインジェクションピペット１は培養液の違いによる穿刺性能にほとんど影響を与えないことを確認した。

【0134】

［インジェクションピペットの穿刺性能評価］
次に、超薄肉ガラス９０管を用いて作製した９０−５−ＲＤ−Ｒのインジェクションピペット１をオペレーションリキッド無しの条件でピエゾマイクロマニピュレータ（ＰＭＭ）に使用した場合の穿刺性能を評価した。同様に８５管で作製した先端外径の大きさが６μｍ、主テーパ部のみで構成されたパラレルタイプＰ、先端形状が大きい丸めタイプＨＲからなる８５−６−Ｐ−ＨＲのインジェクションピペットについてもオペレーションリキッド無しの条件でＰＭＭの穿刺性能の評価試験を行った。穿刺性能の評価は、図７に示すように、Ｃ１、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４の５つの試験区に区分して、各試験区でのブタ卵子透明帯への穿刺操作のコントローラ５４のSpeed、Intensityの数値を調査した。

【0135】

セッティングが完了したインジェクションピペット９０−５−ＲＤ−Ｒを用いてブタ卵子に対して試験区Ｃ１、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３の設定条件で穿刺操作を行った。

【0136】

各試験区の概要をまず説明する。試験区Ｃ１は、９０−５−ＲＤ−Ｒのインジェクションピペット１の先端に少量のオイル玉（小オイル玉とも記す。)を吸引し、小オイル玉を吸引後にさらに多量の培養液を吸引して、小オイル玉をインジェクションピペット曲げ位置部分で保持した状態である。曲げ位置部分とは、インジェクションピペットの先端から約１ｍｍであり、以下及び図７において「後方」として示す。試験区Ｔ１では、小オイル玉のインジェクションピペット内での位置を後方のみならず、インジェクションピペットの先端付近にした状態でも穿刺操作をおこなった。インジェクションピペットの先端付近とは、インジェクションピペットの先端から約５００μｍであり、以下及び図７において「前方」として示す。試験区Ｔ２は、オイル玉の量を試験区Ｃ１の１０倍に増やして、インジェクションピペット内のオイル玉が前方及び後方に位置する状態である。試験区Ｔ３は、インジェクションピペット内に培養液の代わりにＰＶＰ液を多量に吸引した場合の状態である。このように、試験区Ｔ３は、試験区Ｃ１の多量の培養液に代えて多量のＰＶＰ液を吸引した状態である。

【0137】

次に、セッティングが完了したインジェクションピペット８５−６−Ｐ−ＨＲを用いて試験区Ｔ４の条件でのブタ卵子透明帯への穿刺操作を行いSpeedおよびIntensityの数値を調査した。また、先端形状が小さい丸めタイプＲからなる８５−６−Ｐ−Ｒのインジェクションピペットについても、ブタ卵子透明帯への穿刺性を有するかの確認を行った。試験区Ｔ４は、吸引する培養液の各量、オイル玉の各液量及びインジェクションピペット内のオイル玉が後方に位置する状態である。

【0138】

次に、各試験区の詳細な結果を説明する。図７は、オペレーションリキッド無しでのブタ卵子透明体の穿刺性の測定結果を示す図である。図７に示すように、試験区Ｃ１では、９０管を用いて作製した９０−５−ＲＤ−Ｒのインジェクションピペットをオペレーションリキッド無しでＰＭＭに取り付けた場合、インジェクションピペット内に多量の培養液を吸引し、少量のオイル玉（小オイル玉）を吸引し、小オイル玉の位置を後方とした条件で、Intensity値３．５−４．５、Speed値５の設定でブタ卵子への穿刺でき、インジェクタの操作性も安定させることができた。

【0139】

試験区Ｔ１では、インジェクションピペット内の小オイル玉の位置を（Ａ）の後方で保持した場合には、Intensity値１．５、Speed値８で穿刺ができたが、オイル玉の位置を（Ｂ）の前方で保持した場合には、Intensity値１．５、Speed値８で穿刺できず、同等の穿刺性は得られなかった。

【0140】

試験区Ｔ２では、インジェクションピペット内のオイル玉の量が試験区Ｃ１の約１０倍であってもオイル玉の位置を（Ａ）の後方で保持すれば、少量のオイル玉と同様の穿刺性能が得られた。オイル玉が大きい場合も、オイル玉の位置を（Ｂ）の前方で保持した場合には、穿刺できず穿刺性能が低下したが、（Ｃ）のようにオイル玉の位置を前方としてもコントローラ５４のIntensityの設定値を３．５に上げることで穿刺することができた。

【0141】

試験区Ｔ３では、（Ａ）のようにインジェクションピペット内の培養液をＰＶＰ液に入れ換えて小オイル玉の位置が後方の場合には、Intensity値５．０、Speed値３であり培養液の場合に比べて穿刺性能が低下した。また、（Ｂ）は同様に小オイル玉の位置が後方で、Intensity値３．５、Speed値８であり培養液の場合に比べて穿刺性能が低下した。

【0142】

試験区Ｔ４では、８５管を用いて作製した８５−６−Ｐ−ＨＲを用い、かつ、（Ａ）から（Ｅ）の何れもオイル玉の位置を後方として穿刺操作を行った。ピペット内環境（Ａ）のオペレーションリキッド無し大量の培養液と少量のオイル玉（小オイル玉）を吸引した条件で穿刺テストを行った結果、Intensity値は４．５、Speed値５で穿刺ができた。ピペット内環境（Ｂ）のさらに培養液を多量に吸引することでIntensity値３．０、Speed値５の設定で穿刺でき、ピペット内環境（Ｃ）のようにSpeed値を８まで上げた場合、Intensity値２．０から２．５で穿刺が行えた。さらにピペット内環境（Ｄ）のように、オイル玉の量を試験区Ｃ１の２倍とすると、Speed値を８まで上げた場合、Intensity値２．５から３．０で穿刺が行えた。これら（Ａ）から（Ｄ）に対してピペット内環境（Ｅ）に示すように、小オイル玉で、培養液を少量にした場合には、Intensity値８．０、Speed値８まで上げても穿刺できなかった。

【0143】

また、８５管を用いて作製した８５−６−Ｐ−Ｒを用いてオペレーションリキッド無しで、図７に示す試験区Ｔ４におけるピペット内環境（Ａ）と同一条件で穿刺テストを行った結果、Intensity値は４．５から５．５、Speed値５で穿刺が行えた。

【0144】

このように、９０−５−ＲＤ−Ｒのインジェクションピペットを使用した試験区Ｃ１と試験区Ｔ３との結果から、インジェクションピペット内に培養液を多量に吸引した場合には、インジェクションピペット内にＰＶＰ液を多量に吸引した場合と比較して、穿刺性能が高いことが分かった。

【0145】

また、試験区Ｔ１と試験区Ｔ２との結果から、ミネラルオイルからなるオイル玉のインジェクションピペット内での位置によって、卵子への穿刺性に影響を及ぼすことが判明した。即ち、オイル玉の位置がインジェクションピペットの先端付近である前方では、穿刺性が低下する。そのため、実際の運用にあたってはこの点について留意する。

【0146】

また、試験区Ｔ４の結果から、インジェクションピペット内に少量の培養液を吸引した場合には、穿刺できないことが分かった。

【0147】

次に、各種のガラス管素材におけるインジェクションピペット１の穿刺性、インジェクタの操作性の測定評価結果について述べる。

【0148】

図８は、各種のインジェクションピペット１の穿刺性、インジェクタの操作性の測定評価結果を示す図である。尚、測定評価は、７５管、８５管、９０管について行った。

【0149】

ＰＭＭに７５管で作製した７５−７−Ｐ−Ｆインジェクションピペットをオペレーションリキッド無しで取り付けて、インジェクションピペット先端から多量の培養液を吸引し、少量のオイルを吸引した後にＰＶＰ液を曲げ部２５まで吸引してブタ卵子透明帯へ穿刺テストを行った。図８に示すように、ＰＶＰの有無の欄に＋と記す７５−７−Ｐ−Ｆの先端にＰＶＰ液を吸引した状態では、Speed値２、Intensity値１６．０の設定でブタ卵子への穿刺でき、Speed値を５まで上げた場合、Intensity値１５．０で穿刺できた。ＰＶＰの有無の欄に−と記すＰＶＰ液を排出して先端を培養液（ＰＺＭ）に置き換えた状態では、Speed値２、Intensity値１２．０の設定でブタ卵子への穿刺でき、Speed値を５まで上げた場合、Intensity値９．０で穿刺できた。

【0150】

また、図８に示すように、８５管で作製したインジェクションピペットの先端の形状がフラットＦを有する８５−６−Ｐ−Ｆと先端の形状が少ない丸めタイプＲを有する８５−６−Ｐ−Ｒとでは、先端を丸めた８５−６−Ｐ−Ｒが、先端がフラットＦの８５−６−Ｐ−Ｆに比べてIntensity値が低くなり、穿刺性が向上した。

【0151】

また、図８に示すように、９０管で作製したインジェクションピペット９０−５−ＲＤ−Ｒは、オペレーションリキッド無しでＰＭＭに取り付けた場合、ＰＶＰが＋では、Speed値２、Intensity値４．５で穿刺でき、Speed値を５まで上げた場合、Intensity値３．０で穿刺できた。ＰＶＰが−では、Speed値２、Intensity値２．５の設定でブタ卵子への穿刺でき、Speed値を５まで上げた場合、Intensity値２．０で穿刺できた。

【0152】

このように、ＰＭＭにオペレーションリキッド無しで取り付けた７５−７−Ｐ−Ｆの穿刺性が、他のピペットに対して極端に低下した。一方、インジェクションピペット９０−５−ＲＤ−Ｒは、穿刺性能が他のインジェクションピペットと比べて高いことが確認できた。

【0153】

また、図８に示すように、インジェクタの操作性については、７５管、８５管、９０管とも培養液の注入、抽出等のコントロールが可能であった。

【0154】

これにより、インジェクションピペット９０−５−ＲＤ−Ｒはコントローラ５４のインテンシティーが小さい値で使用することができるため穿刺性が良く、インジェクタの操作性も良いことが判明した。

【0155】

［各種インジェクションピペットによる卵細胞質膜の伸展性の測定］
次に、各種のインジェクションピペットによる卵細胞質膜の伸展性に関する測定結果について述べる。

【0156】

図９は、各種のインジェクションピペットの卵細胞質膜の伸展性の測定結果を示す図である。 卵細胞質膜の伸展性の測定は、インジェクションピペット１にオペレーションリキッドを使用すること無く、培養液等で行ったものである。

【0157】

図９に示すように、使用したインジェクションピペット１は、素材が９０管、先端外径が１０μｍであり、主テーパ部３の形状はＲＤ（ラディッシュタイプ）とＰ（パラレルタイプ）とであり、それぞれの先端形状がＦ、Ｒ、ＨＲであり、合計６種類からなる。それぞれのインジェクションピペット１に対して試験を４回行い、オペレーションリキッド無しでの穿刺操作を行い、操作卵子数、生存卵子数を集計して、膜脆弱の卵子の数を数えた。

【0158】

図９に示すように、インジェクションピペット１にオペレーションリキッドを使用しないＰＭＭでは、「膜脆弱の穿刺％」はテーパ形状がＲＤで先端形状がＦでは、４０％以上であったが、先端形状がＲ、ＨＲでは、先端形状がＦの半分の２０％前後であった。また、テーパ形状がＰで先端形状がＲ、ＨＲでは、先端形状Ｆと比較して、「膜脆弱の穿刺％」が低い割合であり、特に、先端形状がＨＲでは、優位性が見られた。

【0159】

また、卵子数の「生存率」は、テーパ形状がＲＤ、Ｐで、その先端形状がＲ、ＨＲのインジェクションピペットが高い割合であり、テーパ形状がＲＤでは、９９．０％である。

【0160】

これにより、インジェクションピペット１にオペレーションリキッドを使用しないＰＭＭでは、テーパ形状がＲＤであり、又は、先端形状がＲ、ＨＲのインジェクションピペット１が卵子生存率の向上に有効であることが確認された。

【0161】

また、インジェクションピペットの先端形状を丸めることで、顕微授精を行う際に老化卵子（高齢の女性に見られる卵子）の脆弱な卵細胞質膜を十分に伸展させることが可能となり、精子注入後の卵子生存率が低下するとの課題を改善することが期待できる。

【0162】

［オペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果］
次に、インジェクションピペット内にオペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果について説明する。

【0163】

図１０は、インジェクションピペット内にオペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精の結果を示す図である。インジェクションピペット１は、先端をファイアーポリッシュにより少ない丸め加工を行った９０−１０−ＲＤ−Ｒと先端をファイアーポリッシュにより大きい丸め加工を行った９０−１０−ＲＤ−ＨＲの２種類を用いた。

【0164】

図１０に示すように、９０管を用いて作製した９０−１０−ＲＤ−Ｒおよび９０−１０−ＲＤ−ＨＲを用いてオペレーションリキッドを充填せずに培養液を吸引した条件で顕微受精を行った結果、ブタ卵子透明帯（zona)を穿刺できたＰＭＭの条件は、両ピペットともにIntensity値は３．５−５．０、Speed値５−８だった。卵細胞質膜(membrane)は、両ピペットともにIntensity値は４．０、Speed値１で穿刺が行えた。

【0165】

また、顕微受精後の生存率は両ピペットともに、１００％だった。顕微受精した卵子を６日間体外培養した結果、両区ともに胚盤胞まで発生した胚が観察された。胚盤胞発生率は、９０−１０−ＲＤ−Ｒの方が高い結果となった。

【0166】

これにより、オペレーションリキッド無しでのブタ顕微授精を行った結果、インジェクションピペットとして９０−１０−ＲＤ−Ｒが優位であることが分かった。

【0167】

［オペレーションリキッドの有無でのインジェクションピペットの形状の違いによる胚盤胞発生率の差異について］
更に、ピエゾＩＣＳＩ法におけるオペレーションリキッドの有無でのインジェクションピペットの形状の違いによる胚盤胞発生の優位性を明確にすべく、PMMを用いたブタ顕微授精を行い、ブタ顕微授精後における胚盤胞発生率の測定を基にインジェクションピペットの評価を行った。

【0168】

評価に用いたインジェクションピペット１は、９０管、先端外径が１０μｍ、テーパ形状がＲＤ、Ｐであり、それぞれの先端形状がＨＲ、Ｒ、Ｆからなる９０−１０−ＲＤ−ＨＲ、９０−１０−ＲＤ−Ｒ、９０−１０−ＲＤ−Ｆ、９０−１０−Ｐ−ＨＲ、９０−１０−Ｐ−Ｒ、９０−１０−Ｐ−Ｆの６種類及び、７５管、先端外径が１２μｍ、テーパ形状がＰであり先端形状がＦからなる７５−１２−Ｐ−Ｆの１種類の合計７種類である。７種類のインジェクションピペット１でオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精を行い、胚盤胞発生率の評価を行った。

【0169】

［ブタ顕微授精の操作手順］
以下にオペレーションリキッドの有無でのインジェクションピペットによるブタ顕微授精の操作手順の概要を説明する。

【0170】

オペレーションリキッド有りのインジェクションピペットで使用するＩＣＳＩ用のシャーレは、その中心に１０−２０μｌの高浸透圧ＰＺＭ（ｈＰＺＭ）のドロップを１つ、リンス用、精子懸濁用の７％ＰＶＰ液のドロップを２つ作製し、ミネラルオイルでカバーして作製した。

【0171】

オペレーションリキッド無しのインジェクションピペットで使用するＩＣＳＩ用のシャーレは、その中心に１０−２０μｌのｈＰＺＭのドロップを１つ、インジェクションピペットのセッティング用ＰＺＭのドロップを1つ、リンス用、精子懸濁用の７％ＰＶＰ液のドロップを２つ作製し、ミネラルオイルでカバーして作製した。

【0172】

尚、高浸透圧ＰＺＭ（ｈＰＺＭ）は、ＰＺＭにソルビトールを添加して、浸透圧をＰＺＭより多少高めたものである。顕微授精操作で、卵子が入った培養液に高浸透圧ＰＺＭ（ｈＰＺＭ）を使用する理由は、卵細胞質を少し収縮させて、第一極体の観察と卵子核の位置の把握とを容易にするためであり、また、透明帯と卵細胞質との隙間に位置する囲卵腔を大きくするためである。囲卵腔を大きくすることにより、ＰＭＭを駆動させて透明帯を穿刺した際に、囲卵腔が衝撃をやわらげて卵細胞質膜にダメージを与えるのを防ぐことができる。通常のＰＺＭは、オペレーションリキッド無しでのセッティングにインジェクションピペット内に大量に吸引して培養液として使用される。

【0173】

作製したシャーレは、使用する１−２時間前にはインキュベータ内で３７−３８．５℃に保温し、保温したシャーレのｈＰＺＭのドロップに操作するブタ体外成熟卵子を移した。また、精子懸濁用の７％ＰＶＰ液のドロップに精子液を適量入れて懸濁し、ＩＣＳＩ操作のシャーレを準備した。

【0174】

オペレーションリキッド有りのインジェクションピペットのセッティングは、圧電素子からの衝撃力をインジェクションピペットの先端に効率よく伝えるために、ピペットホルダに取り付ける前に、予めオペレーションリキッド（フロリナート）を吸引したマイクロピペッターを用いてインジェクションピペットの中心付近にオペレーションリキッド（フロリナート）を約１から１．５ｃｍの幅で充填した。

【0175】

オペレーションリキッド有りのインジェクションピペットは、ピペットホルダに取り付け後に、最初にリンス用の７％ＰＶＰ液のドロップに落としこみ、インジェクタにより吸引・排出を繰り返し、操作性を確認すると同時にインジェクションピペットの内外をリンスした。

【0176】

オペレーションリキッド無しのインジェクションピペットは、ピペットホルダに取り付け後に、インジェクションピペット内にＰＺＭを吸引し、その後ミネラルオイルを吸引し、液境界用のオイル玉を形成した。リンス用７％ＰＶＰ液のドロップに移動し、インジェクタにより吸引・排出を繰り返し、オイル玉の動きを指標にして操作性を確認すると同時にインジェクションピペットの内外をリンスした。

【0177】

以下の操作は、オペレーションリキッド有りのインジェクションピペット、オペレーションリキッド無しのインジェクションピペットとも同様である。

【0178】

インジェクションピペットを精子が懸濁された７％ＰＶＰ液のドロップに移動して、精子不動化の操作を開始した。精子は、動きが活発で頭部および尾部に付着物がない物を選別した。精子の不動化は、インジェクションピペット内に精子を尾部から吸引して排出する際、尾部にインジェクションピペット先端を触れさせながら、ＰＭＭを駆動し、精子を不動化する方法を用いた。

【0179】

完全に動きの止まったことを確認した精子をインジェクションピペット内に吸引し、卵子への注入操作に用いた。

【0180】

精子をインジェクションピペット内に吸引後に、精子が含まれる７％ＰＶＰ液から卵子への注入操作を行うｈＰＺＭドロップへ移動した。

【0181】

卵子への穿刺は、図１２に示す卵細胞質内注入法におけるマイクロピペットのピエゾＩＣＳＩ法により、卵子細胞質内への顕微注入操作を行った。

【0182】

卵子に精子を注入後、インジェクションピペットを引き抜き、生存した卵子の数を確認した。生存した卵子は培養用のＰＺＭドロップに移し、５％Ｏ₂、５％ＣＯ₂、２０％Ｎ₂の条件のインキュベータで６日間体外培養した。体外培養したＩＣＳＩ胚は、６日目で顕微鏡観察し、胚盤胞まで発生した個数を計数した。

【0183】

［ブタ顕微授精での胚盤胞発生率の評価結果］
次に、インジェクションピペットの形状の違いによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における胚盤胞発生率の評価結果について説明する。

【0184】

図１１は、７種類の形状のインジェクションピペットによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における生存卵子数とその割合（卵子生存率（％））及び胚盤胞発生数とその割合（胚盤胞発生率（％））の結果を示す図である。図１２は、図１１に示す７種類の形状のインジェクションピペットによるオペレーションリキッドの有無でのブタ顕微授精における胚盤胞発生率の結果をグラフで示す図である。

【0185】

尚、図１１におけるＯＬの有無の＋及び図１２に示すＯＬ＋は、ブタ顕微授精でインジェクションピペット内部にオペレーションリキッドを充填して穿刺操作を行ったこと（ＯＬ有りと記す）を示し、図１１におけるＯＬの有無の−及び図１２に示すＯＬ−は、インジェクションピペット内部にオペレーションリキッドを使用しないで穿刺操作を行ったこと（ＯＬ無しと記す）を示す。

【0186】

［インジェクションピペット毎のＯＬの有無による胚盤胞発生率の影響］
図１１に、テーパ形状及び先端形状の異なる各種のインジェクションピペットにおけるＯＬの有無におけるＩＣＳＩ操作に使用した卵子数（図１１に示す操作卵子数）及び生存した卵子の数（図１１に示す生存卵子数）とその割合（卵子生存率（％））を示す。また、胚発生の欄には、使用した培養胚数及び胚盤胞発生数とその割合（胚盤胞発生率）を示す。

【0187】

図１１及び図１２に示すように、９０−１０−ＲＤ−ＨＲ、９０−１０−ＲＤ−Ｒ、９０−１０−Ｐ−ＨＲ及び９０−１０−Ｐ−ＲにおけるそれぞれのＯＬ有り（ＯＬ＋）とＯＬ無し（ＯＬ−）でのブタ顕微授精後の胚盤胞発生率は、ＯＬ有りとＯＬ無しとの差が少なく、ほぼ同一の値であった。

【0188】

また、９０−１０−ＲＤ−Ｆ及び９０−１０−Ｐ−ＦにおけるそれぞれのＯＬ有りとＯＬ無しでのブタ顕微授精後の胚盤胞発生率は、顕著な差はなかったが、９０−１０−ＲＤ−Ｆ及び９０−１０−Ｐ−Ｆはともに、胚盤胞発生率はＯＬ有りの方が高くなる傾向が見られた。

【0189】

また７５−１０−Ｐ−Ｆにおいては、ＯＬ有りとＯＬ無しでのブタ顕微授精後の胚盤胞発生率は、顕著な差があり、胚盤胞発生率は、ＯＬ有りが高くなることが明らかとなった。一方、７５−１２−Ｐ−ＦのＯＬ無しは、卵子への穿刺能が低く、作出できた顕微授精胚は、胚盤胞まで発生しなかった。

【0190】

［インジェクションピペットの形状及びＯＬの有無の組み合わせによる胚盤胞発生率の影響］
９０−１０−ＲＤ−ＨＲ及び９０−１０−ＲＤ−Ｒは、それぞれのＯＬ有り、ＯＬ無しともに、胚盤胞発生率が高くなった。特に、９０−１０−ＲＤ−ＨＲのＯＬ有り、ＯＬ無し及び９０−１０−ＲＤ−ＲのＯＬ無しにおける胚盤胞発生率は、９０−１０−Ｐ−ＦのＯＬ有り、ＯＬ無しの胚盤胞発生率及び７５−１２−Ｐ−ＦのＯＬ無しの胚盤胞発生率と比較して、顕著に高くなることが確認された。即ち、胚盤胞発生率に対して９０−１０−ＲＤ−ＨＲ及び９０−１０−ＲＤ−Ｒは、ＯＬ無しでも効果があることが確認された。

【0191】

また、７５−１２−Ｐ−ＦのＯＬ有りの胚盤胞発生率は、９０−１０−ＲＤ-ＨＲ及び９０−１０−ＲＤ-ＲのＯＬの有無の胚盤胞発生率と同様に高い割合であり、９０−１０−Ｐ-ＦのＯＬの有無の胚盤胞発生率及び７５−１２−Ｐ−ＦのＯＬ無しの胚盤胞発生率に比べて顕著に高くなった。

【0192】

また、７５−１２−Ｐ−ＦのＯＬ無しの胚盤胞発生率は、卵子への穿刺能が低く、作出できた顕微授精胚は、胚盤胞まで発生しなかった。

【0193】

このように、オペレーションリキッド（ＯＬ）を充填しないＯＬ無しの９０−１０−ＲＤ−ＨＲ、９０−１０−ＲＤ−Ｒ、９０−１０−Ｐ−ＨＲ及び９０−１０−Ｐ-Ｒを用いたピエゾＩＣＳＩ法は、従来のオペレーションリキッドＯＬを充填したインジェクションピペットの場合と同等の結果であり、先端をポリッシュするＨＲ、Ｒの形状は、ＯＬ無しでもピエゾマイクロマニピュレータ(ＰＭＭ)で有効に使用できることが確認できた。

【0194】

特に、９０−１０−ＲＤ−ＨＲ及び９０−１０−ＲＤ−Ｒでは、ＯＬ有り、ＯＬ無しともに胚盤胞発生率が高く、ＯＬ無しはＯＬ有りと同等以上であることから、テーパ形状がラディッシュタイプ（大根型）であるＲＤの優位性が認められた。さらに、先端形状は先端を大きく丸め加工した熱収縮部であるＨＲ、先端を小さく丸め加工した熱収縮部であるＲが優位であることが分かった。

【0195】

即ち、ＯＬ無しの９０−１０−ＲＤ−ＨＲ及び９０−１０−ＲＤ−Ｒは、穿刺性能及びインジェクタ―の操作が、従来のＯＬ有りの条件と遜色なくＩＣＳＩ操作が可能となること、さらに、ＯＬ有りのようにインジェクションピペット内にオペレーションリキッドを充填する操作が必要なく、セッティングの確認に要する時間を短縮できるため、体外（インキュベータの外）での卵子及び精子の取り扱い時間を最小限にすることが可能となり、胚発生に良い結果をもたらしたものと推測される。

【0196】

一方、９０管を用いた先端がフラットの形状のピペット９０−１０−ＲＤ−Ｆ及び９０−１０−Ｐ−Ｆが、９０−１０−ＲＤ−ＨＲ、９０−１０−ＲＤ−Ｒ、９０−１０−Ｐ−ＨＲ及び９０−１０−Ｐ−Ｒに比べて胚盤胞発生率が低下した原因は、ガラス管の素材及び先端の形状が考えられる。即ち、９０管のガラス管は超薄肉のため、先端加工がフラットの９０−１０−ＲＤ−Ｆ及び９０−１０−Ｐ−Ｆの場合には、鋭利な形状となりＰＭＭの穿刺性能は高くなるが、卵細胞質膜に影響を与えていると考えられる。

【0197】

尚、９０−１０−ＲＤ−Ｆ及び９０−１０−Ｐ−ＦのＯＬ有りの方が無しに比べて、胚盤胞発生率がやや高くなったのは、ＯＬが充填されることでインジェクタの操作性が、安定したことが考えられる。さらに９０−１０−ＲＤ−Ｆの方が９０−１０−Ｐ−Ｆよりも胚盤胞発生率が高くなる傾向が認められたが、これは、ラディッシュタイプ（大根型）であるＲＤがＩＣＳＩに適したインジェクタの操作性が得られているためと推察される。このように、９０−１０−ＲＤ-ＨＲ及び９０−１０−ＲＤ−Ｒにおける胚盤胞発生率の結果からも大根型であるＲＤが有効であることが認められた。

【0198】

また、従来、マニピュレーション操作に用いられている７５管からなる先端形状がフラットな７５−１２−Ｐ−Ｆについては、ガラス管の肉厚が薄肉ではあるが、薄過ぎないため、先端形状は９０管ほど鋭利ではない。そのため、オペレーションリキッドを充填する従来のＰＭＭの使用方法であれば、十分な穿刺性能が得られ、卵細胞質膜にも影響を及ぼすことなく操作できたため、ＩＣＳＩ後、良好な胚発生が得られたものと考えられた。ただし、７５管からなるインジェクションピペットは、ガラス管の肉厚が少し厚い分、オペレーションリキッド無しの条件ではＰＭＭによる穿刺性能が大きく低下し、正確な顕微授精操作ができなかったため、その後胚盤胞まで発生しなかったと推察される。この結果からインジェクションピペットにおけるガラス管の肉厚が、穿刺性能にとって重要であることが明確となった。

【0199】

以上述べたように、本発明によれば、先端側に主テーパ部を有するインジェクションピペットは、主テーパ部よりさらに先端側において、内周面のテーパ角度が主テーパ部のテーパ角度よりも大きい先端テーパ部を設けることにより、内周面が先端に向かって縮径されるため、インジェクションピペット内の培養液等の流れを調整することできインジェクタの操作性が向上する。

【0200】

また、インジェクションピペットの先端テーパ部は、先端に熱を加えてガラス管を収縮させることにより形成される熱収縮部を有し、熱収縮部は先端を丸めた曲面となって先端の内径が狭くなるため、インジェクタによる培養液等の吸引と吐出とを微妙に調節できるようになり、ピエゾＩＣＳＩ法におけるマイクロマニピュレータのインジェクタの操作性が向上する。

【0201】

本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは、最先端に位置する円環部がインジェクションピペットの先端側の軸方向に対して直交する方向に形成されてなり、かつ、インジェクションピペットの円環部から外周面及び内周面への移行部は面取りがなされていることにより、試行錯誤の結果、卵細胞質への内圧上昇が発生しないことが判明した。これにより、穿刺性、操作性及び膜高伸展性に優れたインジェクションペットを用いた卵細胞質内注入法を提供することができる。

【0202】

また、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは、そもそもの構成要素である培養液を衝撃伝達液として利用することによって、フロリナート等のオペレーションリキッドを殊更用意することなく、従来と同様のピエゾイクシー法による卵細胞質内の注入が可能となる。

【0203】

また、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットによれば、インジェクションピペット内にオペレーションリキッドを注入する必要がなく、卵細胞質内の注入工程を簡素化することができる。

【0204】

また、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは、ＰＭＭによる卵子・胚に対して操作を行う際に確実な穿刺性能を有している。即ち、コンベンショナル法は、ピペットの形状、卵子の質および操作者の熟練度により穿刺もばらつきが発生する恐れがあるが、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは、安定した穿刺性能により膜を十分に伸展して毎回同じような穿刺を行うことが可能である。

【0205】

また、本発明の卵細胞質内注入法に用いるインジェクションピペットは先端形状を丸めることで、老化卵子の脆弱な卵細胞質膜を十分に伸展させることが可能となり、精子注入後の卵子生存率の向上が期待できる。

【0206】

本発明に係るインジェクションピペットは、特に、穿刺性とインジェクタの操作性が重要なＤＮＡ、ＲＮＡ注入や胚盤胞へのＥＳ細胞注入に有効である。また、それらのみならず、卵細胞質内注入法に換えて、核移植における除核操作、バイオプシーによる核球採取にも有効に使用可能である。

【0207】

本発明のインジェクションピペットによれば、卵子透明帯および卵細胞質膜を穿刺することが可能となることで、精子の注入のみならず、核置換技術、体細胞クローンを作出する目的での体細胞核移植、遺伝子発現制御のためのＲＮＡ注入、遺伝子組換え動物を作出するためのＥＳ細胞注入およびＤＮＡ注入やゲノム編集技術にも応用することが可能となる。

【0208】

この発明は、その本質的特性から逸脱することなく数多くの形式のものとして具体化することができる。よって、上述した実施形態は専ら説明上のものであり、本発明を制限するものではないことは言うまでもない。

【符号の説明】

【0209】

１ インジェクションピペット
３ 主テーパ部
４ 主テーパ部の外周面
７ 先端テーパ部
９ 副テーパ部
１０ 副テーパ部の外周面
１１ 副テーパ部の内周面
１２ 熱収縮部（先端部）
１４ 円環部
１９、２１ 移行部
２５ 曲げ部
２７ 基部（直管部）
３０ 圧電微小駆動装置（ＰＭＭ）
３５ ピペットホルダ
３６ ホルダグリップ
４０ スライドベース
４１ クランプネジ
４５ ドライブユニット
４７ 鍔部
４８ 圧電素子（ピエゾ）
４９ 慣性体
５２ 空圧式インジェクタ
５３ チューブ
５４ コントローラ
５５ ＸＹＺθマニピュレータ
６０ 卵子
６１ 透明帯
６４ 卵細胞質膜
６５ 卵細胞質
６６ 第一極体
６７ 囲卵腔
６８ ホールディングピペット
７０ 精子
７５ コンベンショナルピペットの尖端部
ＣＶ コンベンショナルピペット
ＰＩ インジェクションピペット
Ｆ フラットタイプ
Ｒ 小さい丸めタイプ
ＨＲ 大きい丸めタイプ
ｄｏ１、ｄｏ２、ｄｏ３ インジェクションピペットの外径
ｄｉ、ｄｉ１、ｄｉ２、ｄｉ３ インジェクションピペットの内径
ｄｆ１、ｄｆ２ インジェクションピペットの先端外径
ｔ１、ｔ２ 移行部の長さ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】