特許 6871260 改良された植物形質転換の方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6871260

(24)【登録日】2021年4月19日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】改良された植物形質転換の方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/82 20060101AFI20210426BHJP

   A01H 1/00 20060101ALI20210426BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/82 ZZNA

   A01H1/00 A

【請求項の数】4

【全頁数】120

(21)【出願番号】特願2018-542121(P2018-542121)

(86)(22)【出願日】2016年8月26日

(65)【公表番号】特表2018-537123(P2018-537123A)

(43)【公表日】2018年12月20日

(86)【国際出願番号】US2016049132

(87)【国際公開番号】WO2017078836

(87)【国際公開日】20170511

【審査請求日】2019年8月5日

(31)【優先権主張番号】62/252,229

(32)【優先日】2015年11月6日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】500207899

【氏名又は名称】パイオニア ハイ−ブレッド インターナショナル， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】アナンド， アジス

(72)【発明者】

【氏名】ベース， スティーブン ヘンリー

(72)【発明者】

【氏名】チョ， ヒョン−ジェ

(72)【発明者】

【氏名】クライン， セオドア ミッチェル

(72)【発明者】

【氏名】ラスナー， マイケル

(72)【発明者】

【氏名】マクブライド， ケビン イー．

【審査官】 西 賢二

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１５７５４１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００９／００７５３５８（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Database: GenBank, [online], Cloning vector pCAMBIA5105, complete sequence, EF042581, 29-OCT-2006 uploaded, [retrieved on 2020-09-03], Internet，ＵＲＬ，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EF042581

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｎ ７／００−７／０８

Ａ０１Ｈ １／００−１７／００

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号３５の配列を含むベクター。

【請求項2】

植物を形質転換する方法であって、
（ａ）植物由来の組織を、請求項１に記載の第１のベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および前記植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と接触させる工程と；
（ｂ）前記組織を前記アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株または前記オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と共培養する工程と；
（ｃ）前記目的ポリヌクレオチド配列を発現する前記組織から形質転換された植物体を再生する工程と
を含む方法。

【請求項3】

（ａ）請求項１に記載のベクターと；
（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を使用した植物形質転換に用いるための使用説明書とを含むキット。

【請求項4】

植物細胞を形質転換するためのベクターシステムであって、
ａ）請求項１に記載の第１のベクターと
ｂ）Ｔ−ＤＮＡ境界配列および目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターと
を含む、ベクターシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は一般に、植物遺伝子操作などの分子生物学の分野に関する。より具体的には、本開示は、共組み込み型ベクターを作製するため、ターナリーヘルパーベクターとして、使用することができるベクターを含む、植物形質転換のための方法および組成物に関する。

【0002】

関連出願の相互参照
本願は、２０１５年１１月６日に出願された米国仮特許出願第６２／２５２２２９号の優先権を主張するものであり、その内容は全て参照により本明細書に組み込まれる。

【0003】

テキストファイルとしてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、２０１６年８月２３日作成の２０１６０８２６＿６４６９ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔのファイル名を備え、４８５ＫＢのサイズを有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩフォーマットの文書内に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0004】

天然植物病原体のアグロバクテリウムは、双子葉植物の形質転換に広く使用されており、最近では、単子葉植物でも使用されている。アグロバクテリウム媒介遺伝子導入システムの利点は、植物体の再生速度を大幅に低下させずに、比較的高い頻度で、トランスジェニック細胞を再生する可能性を与えることである。さらに、植物ゲノムへのＤＮＡ導入プロセスは、他のＤＮＡデリバリー方法と比べてよく特徴付けられている。アグロバクテリウムを介して導入されるＤＮＡは、直接デリバリーで導入されるＤＮＡより、広範な再配列を受ける可能性が少なく、多くの場合、１つ、または低コピー数で植物ゲノムに組み込まれる。

【0005】

最も広く使用されているアグロバクテリウム媒介遺伝子導入システムは、アグロバクテリウムを、ＤＮＡ導入に必要なｖｉｒ機能をコードする非武装もしくは非発癌性のＴｉヘルパープラスミドと、導入ＤＮＡまたはＴ−ＤＮＡ領域を運ぶ、バイナリーベクタープラスミドと称する非常に小さな分離プラスミドを含むように遺伝子操作するバイナリー形質転換ベクターシステムである。Ｔ−ＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡの産生およびその導入プロセスで重要な役割を担う、Ｔ−ＤＮＡ境界と称する各末端の配列によって定義される。

【0006】

バイナリーベクターは、Ｔ−ＤＮＡ領域を持つプラスミドと異なるプラスミドにビルレンス遺伝子が位置しているベクターである（Ｂｅｖａｎ，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１）。Ｔ−ＤＮＡバイナリーベクターは遺伝子組み換えを必要としないため、その開発により植物細胞の形質転換は容易なものとなった。ビルレンス遺伝子のいくつかが遺伝子量効果を示したという発見（Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９：４４１７−４４２５）が、さらなるビルレンス遺伝子を持つスーパーバイナリーベクターの開発に繋がった（Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９９０），９：３０３−３０６）。これらの初期のスーパーバイナリーベクターは、ハイパービルレンスＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２由来の大きな「ｖｉｒ」断片（約１４．８ｋｂｐ）を有しており、その断片が標準のバイナリーベクターに導入されていた（同上）。これらのスーパーバイナリーベクターにより、植物の形質転換が大幅に改善された。例えば、Ｈｉｅｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９４）６：２７１−２８２）は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によるイネの効率のよい形質転換を報告しており、その後には、トウモロコシ、オオムギおよびコムギにこのシステムを使用した報告があった（Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）１４：７４５−７５０；Ｔｉｎｇａｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９７）１１：１３６９−１３７６；およびＣｈｅｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７）１１５：９７１−９８０；Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌによる米国特許第５，５９１，６１６号明細書も参照されたい）。従来のスーパーバイナリーベクターの例としては、ｐＴＯＫ１６２（特開平４−２２２５２７号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−５０４，８６９号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−６０４，６６２号明細書および米国特許第５，５９１，６１６号明細書）、およびｐＴＯＫ２３３（Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．，（同上）およびＩｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（同上）を参照されたい）が挙げられる。

【0007】

しかしながら、従来のスーパーバイナリーベクターの設計には、いくつかの欠点がある。例えば、大きなｖｉｒ断片およびベクター骨格は、相当量の必須ではないＤＮＡを持つ。さらに、ｔｅｔＡテトラサイクリン耐性遺伝子の使用は、細菌の増殖を抑え、また、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の菌株Ｃ５８は、この抗生物質に対する部分耐性を既に有しているので、この菌株では選択マーカーにならない。さらに、大きな複製起点／分割領域（ＲＫ２由来、約１５ｋｂｐの大きさ）はかなり大きいベクターをもたらすが、そのようなベクターはさらなる操作が容易ではなく、かつ不安定さの変化を伴う。
さらなる操作に対する制約は、スーパーバイナリーＴ−ＤＮＡベクターの再構築に、相同組み換えを受容可能なレシピエントのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＬＢＡ４４０４またはＣ５８などの菌株において、スーパーバイナリーベクターとＴ−ＤＮＡベクター間の相同組み換えを行う必要があるという事実によってさらに増幅した。相同組み換えプロセスはかなり非効率的であり、得られる共組み換えベクターは、しばしば予期しない欠失を含んだ。さらに、好適なアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の分離株を特定するために、多くの候補クローンをスクリーニングする必要があった。Ｃ５８、ＥＨＡ１０１などの菌株においては、テトラサイクリンに対し耐性を有する自然発生突然多様体が高頻度で発生することが知られており（Ｌｕｏ、Ｚ．Ｑ． ａｎｄ Ｆａｒｒａｎｄ、Ｓ．Ｋ．、（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：６１８−６２６）、これが、組み換えクローン特定のさらなる障害となっていた。
植物分子生物学、特に、植物形質転換およびそれに有用なベクターが進歩しているにもかかわらず、トランスジェニック植物を効率よく作製する形質転換技術が依然として求められている。特に、最小限の非必須配列を含む最適サイズのｖｉｒ遺伝子を有する改良されたスーパーバイナリーベクター、改善されたビルレンス用のｖｉｒの最適混合物、より小さい複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）選択のための改善された選択マーカーが依然として求められている。理想的には、そのような改良ベクターは、共組み換えベクターの生成に容易に使用することができ、あるいは、植物形質転換用のターナリーヘルパーベクターとして使用することができるであろう。本開示は、これらの要求などに対処している。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】米国特許第５，５９１，６１６号明細書

【特許文献2】特開平４−２２２５２７号明細書

【特許文献3】欧州特許出願公開第Ａ−５０４，８６９号明細書

【特許文献4】欧州特許出願公開第Ａ−６０４，６６２号明細書

【特許文献5】米国特許第５，５９１，６１６号明細書

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｂｅｖａｎ，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１

【非特許文献2】Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８７）１６９：４４１７−４４２５

【非特許文献3】Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９９０），９：３０３−３０６

【非特許文献4】Ｈｉｅｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９４）６：２７１−２８２

【非特許文献5】Ｉｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９６）１４：７４５−７５０

【非特許文献6】Ｔｉｎｇａｙ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｊ．（１９９７）１１：１３６９−１３７６

【非特許文献7】Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９７）１１５：９７１−９８０

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本開示は、ｖｉｒ遺伝子を含むベクターのための方法および組成物を含む。各種態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１；ｖｉｒＣ１〜Ｃ２；ｖｉｒＤ１〜Ｄ２；およびｖｉｒＧ遺伝子を含むベクターを提供する。一態様において、ベクターは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰもしくはｖｉｒＱ、またはその組み合わせをさらに含む。一態様において、ベクターは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１（それぞれ、配列番号４〜１４）、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２（それぞれ、配列番号１６〜１７）；ｖｉｒＤ１〜Ｄ２（それぞれ、配列番号１８〜１９）、およびｖｉｒＧ（配列番号１５）遺伝子を含む。一態様において、ベクターは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ（配列番号２６）、ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１（それぞれ、配列番号４〜１４）、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２（それぞれ、配列番号１６〜１７）；ｖｉｒＤ１〜Ｄ５（それぞれ、配列番号１８〜２２）、ｖｉｒＥ１〜Ｅ３（配列番号２３−２５）、ｖｉｒＧ（配列番号１５）、およびｖｉｒＪ（配列番号２７）遺伝子を含む。

【0011】

一態様において、本開示は、さらに、植物を形質転換する方法であって、（ａ）植物由来の組織を、（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１；ｖｉｒＣ１〜Ｃ２；ｖｉｒＤ１〜Ｄ２；およびｖｉｒＧ遺伝子を含む第１のベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を提供する。

【0012】

一態様において、本開示は、さらに、（ａ）（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１；ｖｉｒＣ１〜Ｃ２；ｖｉｒＤ１〜Ｄ２；およびｖｉｒＧ遺伝子を含むベクターと；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用した植物形質転換に用いるための使用説明書とを含むキットを提供する。

【0013】

本開示は、ｖｉｒ遺伝子を含むベクターのための方法および組成物を含む。各種態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１もしくはｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２もしくはｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２もしくはｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｖｉｒＧもしくはｒ−ｖｉｒＧ遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらにｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターを提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種のビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９、６０もしくは１０２、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由

来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、ｎｐｔ１選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１も、その多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、その多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【0014】

他の態様において、本開示はさらに、（ａ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｂ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｃ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターを提供する。

【0015】

他の態様において、本開示はさらに、（ａ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｂ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｃ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくは、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターを提供する。

【0016】

他の態様において、本開示はさらに、（ａ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｂ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｃ）配列番号１を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターを提供する。

【0017】

一態様において、本開示は、さらに、植物を形質転換する方法であって、（ａ）植物由来の組織を、（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１もしくはｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２もしくはｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２もしくはｒ−ｖｉｒＤ１−Ｄ２、およびｖｉｒＧもしくはｒ−ｖｉｒＧ、またはそれらの多様体および誘導体を含む第１のベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらにｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子またはその多様体および誘導体を含むベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための

複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、ｎｐｔ１選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【0018】

一態様において、本開示は、さらに、植物を形質転換する方法であって、（ａ）植物由来の組織を、（ｉ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｉｉ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｉｉｉ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくは、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持され

るための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、ｎｐｔ１選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【0019】

一態様において、本開示は、さらに、植物を形質転換する方法であって、（ａ）植物由来の組織を、（ｉ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｉｉ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｉｉｉ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。
一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【0020】

一態様において、本開示はさらに、植物を形質転換する方法であって、（ａ）植物由来の組織を、（ｉ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｉｉ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｉｉｉ）配列番号１を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、配列番号２６を有するｖｉｒＡ遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡ遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号： １０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム

属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１、またはその多様体もしくは断片を含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【0021】

一態様において、本開示はさらに、（ａ）（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１もしくはｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２もしくはｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２もしくはｒ−ｖｉｒＤ１−Ｄ２、およびｖｉｒＧもしくはｒ−ｖｉｒＧ、またはそれらの多様体および誘導体を含むベクターと；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を使用した植物形質転換に用いるための使用説明書とを含むキットを提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。
一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【0022】

一態様において、本開示はさらに、（ａ）（ｉ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｉｉ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｉｉｉ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターと；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を使用した植物形質転換に用いるための使用説明書とを含むキットを提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は

、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【0023】

一態様において、本開示はさらに、（ａ）（ｉ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｉｉ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｉｉｉ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくは、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターと；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を使用した植物形質転換に用いるための使用説明書とを含むキットを提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくは、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇ

ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【0024】

一態様において、本開示はさらに、（ａ）（ｉ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｉｉ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｉｉｉ）配列番号１を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくは、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、および配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｒ−ｖｉｒＥ３およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらに、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含むベクターと；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはオクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）を使用した植物形質転換に用いるための使用説明書とを含むキットを提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）のビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ビルレンス遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、もしくは、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９４〜９５を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１５を有するｖｉｒＧビルレンス遺伝子、もしくは配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰ、ｖｉｒＱ、ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含む。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号２６を有するｖｉｒＡビルレンス遺伝子、もしくは配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２０〜２２を有するｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、もしくはそれぞれ配列番号９６〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３ビルレンス遺伝子、もしくは配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、それぞれ配列番号４２〜４３を有するｖｉｒＨ〜Ｈ１ビルレンス遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４５を有するｖｉｒＫビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４６を有するｖｉｒＬビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４７を有するｖｉｒＭビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４８を有するｖｉｒＰビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、配列番号４９を有するｖｉｒＱビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体である。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５およびｒ−ｖｉｒＥ３、またはそれらの多様体および誘導体を含む。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｃｏｌ Ｅ１複製起点に由来する。一態様において、ＣｏｌＥ１複製起点に由来する複製起点は、配列番号２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する。一態様において、ｐＳＣ１０１複製起点に由来する複製起点は、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐ１５Ａ複製起点に由来する。一態様において、ｐ１５Ａ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する。一態様において、Ｒ６Ｋ複製起点に由来する複製起点は、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、高コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、中間コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、変異型のｐＲＫ２複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５３、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のい

ずれか１つを有する複製起点である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。一態様において、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片のいずれか１つを有する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。一態様において、マイクロｐＲＫ２複製起点は、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ミニｐＲＫ２複製起点である。一態様において、ミニｐＲＫ２複製起点は、配列番号６６、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、ｔｒｆＡおよびＯｒｉＶ配列を含む。一態様において、ｐＲＫ２複製起点は、配列番号６４および６５、またはそれらの多様体および断片を含む。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、ｐＳａ複製起点は、配列番号５３、またはその多様体および断片を有する。一態様において、複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。一態様において、ｐａｒ ＤＥオペロンは、配列番号５５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ａａｃＣ１遺伝子、ｎｐｔ１遺伝子、ｎｐｔ２遺伝子、ｈｐｔ遺伝子、ａａｄＡ遺伝子、ＳｐｃＮ遺伝子またはａｐｈ遺伝子である。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｃＣ１である。一態様において、ａａｃＣ１選択マーカー遺伝子は、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａａｄＡである。一態様において、ａａｄＡ選択マーカー遺伝子は、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ１である。一態様において、選択マーカー遺伝子は、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｎｐｔ２である。一態様において、ｎｐｔ２選択マーカー遺伝子は、配列番号４１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はｈｐｔである。一態様において、ｈｐｔ選択マーカー遺伝子は、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はＳｐｃＮである。一態様において、ＳｐｃＮ選択マーカー遺伝子は、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子はａｐｈである。一態様において、ａｐｈ選択マーカー遺伝子は、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカー遺伝子は、テトラサイクリンに対する耐性を付与しない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、ｔｅｔＡＲ遺伝子ではない。一態様において、選択マーカー遺伝子は、対抗選択マーカー遺伝子である。一態様において、対抗選択マーカー遺伝子は、ｓａｃＢ遺伝子、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）遺伝子、ｌａｃＹ遺伝子、Ｇａｔａ−１遺伝子、ｃｃｄＢ遺伝子またはｔｈｙＡ遺伝子である。一態様において、ベクターは、配列番号６１も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６２も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、ｔｒａオペロン配列もしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号６３も、またその多様体もしくは断片も含まない。一態様において、ベクターは、配列番号３４、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３５、またはその多様体および断片を有する。一態様において、ベクターは、配列番号３６、またはその多様体および断片を有する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、ベクターｐＳＢ１のプラスミドマップを示す。

【図2】図２は、配列番号３４の配列を有するベクターｐＰＨＰ７０２９８のプラスミドマップを示す。

【図3】図３は、配列番号３５の配列を有するベクターｐＰＨＰ７１５３９のプラスミドマップを示す。

【図4】図４は、固有の制限酵素部位の位置を含む、配列番号 ３６の配列を有するベクターｐＰＨＰ７９７６１のプラスミドマップを示す。これらの制限部位は、他の機能的に同等の要素との置換を促進するために、機能要素間に含まれた。

【図5】図５は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＴｉプラスミドｐＴｉＢｏ５４２、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿０１０９２９．１からの３７，１７１ｂｐの断片上の表示遺伝子間の関係を示す図である。

【図6】図６は、ｐＶＳ１複製起点を含む、全長２，６００ｂｐの断片上の表示遺伝子間の関係を示す図である。

【図7A】図７Ａは、ＡＧＬ１株感染１５日後のコムギ品種ＨＣ０４５６Ｄにおける一過性ＲＦＰ（Ｄｓ−ＲＥＤ）発現を示す。

【図7B】図７Ｂは、ＬＢＡ４４０４Ｔｈｙ−７１５３９株感染１５日後の一過性ＲＦＰ発現を示す。矢印は、Ｄｓ−ＲＥＤが強く発現した領域を示す。スケールバーは２ｍｍに相当する。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下に、添付の図面を参照しながら本明細書中の開示をより詳しく説明するが、図面は可能な態様のいくつかを示すものであって全部ではない。実際、開示は、多くの異なる形態で具体化可能であり、本明細書中に記載した態様に限られると解釈すべきではなく、むしろ、これらの態様は、本開示が適用法的要件を満たすために提供される。

【0027】

本明細書に開示する多くの変更および他の態様は、本発明の組成物および方法が関連する分野の当業者であって、前述の説明や添付の図面に提示された教示を利用できる者であれば、思い付くであろう。したがって、開示が、本明細書に開示した特定の態様に限定されるべきではなく、また、変更やその他の態様が添付の請求項の範囲に含まれることを意図していることは理解されるべきである。本明細書中には特定の用語が使用されるが、それらは、一般的かつ記述的意味でのみ使用されものであって、限定を目的として使用されるものではない。

【0028】

また、本明細書に使用される専門用語は、単に特定の態様を説明するためのものであって、限定を目的とするものではないことも理解されるべきである。本明細書および特許請求の範囲で使用する用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」には、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」態様が含まれ得る。他に定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明の組成物および方法が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。この後に続く本明細書および特許請求の範囲においては、本明細書で定義する多くの用語について言及するであろう。

【0029】

Ｉ．Ｖｉｒ遺伝子を含むベクターを改良するための方法および組成物
本開示は、ｖｉｒ遺伝子を含むベクターのための方法および組成物を提供する。

【0030】

本明細書で使用する場合、「ｐＰＨＰ」はプラスミドＰＨＰを指し、その後には番号数字が続く。例えば、ｐＰＨＰ７０２９８は、プラスミドＰＨＰ７０２９８を指す。例えば、ｐＶＩＲ７は、プラスミドＶＩＲ７を指す。

【0031】

表２３に、本開示に示されている配列番号（配列番号）表を示す。

【0032】

一態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ、もしくはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、ｒ−ｖｉｒＧおよびｒ−ｇａｌｌｓ、またはそれらの多様体および誘導体を含むベクターを提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１は、それぞれ配列番号４〜１４を有する、もしくはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１−Ｂ１１は、それぞれ配列番号８０〜９０を有する、またはその多様体および誘導体；リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＣ１〜Ｃ２は、それぞれ配列番号１６〜１７を有する、もしくはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２は、それぞれ配列番号９２〜９３を有する、またはその多様体および誘導体；リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ１〜Ｄ２は、それぞれ配列番号１８〜１９を有する、もしくはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２は、それぞれ配列番号９４〜９５を有する、またはその多様体および誘導体；リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＧは、配列番号１５を有する、もしくはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＧは、それぞれ配列番号９１を有する、またはその多様体および誘導体；ならびに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｇａｌｌｓは、配列番号１０１を有する、またはその多様体および誘導体。

【0033】

態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種またはブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、リゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、メソリゾビウム属（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、フィロバクテリウム属（Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、オクロバクテリウム属（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）種遺伝子である。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、ブラディリゾビウム属（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種遺伝子である。

【0034】

一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子である。
一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子は、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｅｒｔｉｍａｇｎｉ）、アグロバクテリウム・ラリームーレイ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｒｒｙｍｏｏｒｅｉ）、アグロバクテリウム・ラディオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビー（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはアグロバクテリウム・ビティス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ）遺伝子である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子は、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）である。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である。

【0035】

ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびアグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）の多くの野生型および非武装（非病原性）株を、植物への遺伝子導入に使用することができる。ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドを有する野生型のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）のＴ−ＤＮＡに位置する植物ホルモン合成遺伝子が、形質転換後、植物細胞内で発現し、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）の菌種もしくは菌株に応じて、腫瘍の形成、または毛状根表現型を引き起こす。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌のＴ−ＤＮＡを遺伝子操作して、その毒性および病原性の決定因子の多くを（非武装化によって）１つ以上の目的配列に置き換え、改変したＴ−ＤＮＡを植物細胞に導入し、ゲノムに組み込む能力を維持するようにすることができる。そのような非武装Ｔｉプラスミドを含む菌株を、植物形質転換に広く使用することができる。

【0036】

いくつかの態様において、コンストラクトはＴｉプラスミド（アクロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））またはＲｉプラスミド（アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ））を含む。いくつかの態様において、コンストラクトは、１つ以上のビルレンス遺伝子を含む。ビルレンス遺伝子は、Ｔｉプラスミドからのものであり得、本明細書では、配列番号４〜２７および配列番号４２〜４９として示される。ビルレンス遺伝子は、Ｒｉプラスミドからのものであり得、本明細書では、配列番号７９〜１０１として示される。本明細書に開示のＲｉプラスミドビルレンス遺伝子は、ｖｉｒ遺伝子名の前に「ｒ」を用いて示される。例えば、ｒ−ｖｉｒＡ（配列番号７９）、ｒ−ｖｉｒＢ１（配列番号８０）、ｒ−ｖｉｒＢ２（配列番号８１）、ｒ−ｖｉｒＢ３（配列番号８２）、ｒ−ｖｉｒＢ４（配列番号８３）、ｒ−ｖｉｒＢ５（配列番号８４）、ｒ−ｖｉｒＢ６（配列番号８５）、ｒ−ｖｉｒＢ７（配列番号８６）、ｒ−ｖｉｒＢ８（配列番号８７）、ｒ−ｖｉｒＢ９（配列番号８８）、ｒ−ｖｉｒＢ１０（配列番号８９）、ｒ−ｖｉｒＢ１１（配列番号９０）、ｒ−ｖｉｒＧ（配列番号９１）、ｒ−ｖｉｒＣ１（配列番号９２）、ｒ−ｖｉｒＣ２（配列番号９３）、ｒ−ｖｉｒＤ１（配列番号９４）、ｒ−ｖｉｒＤ２（配列番号９５）、ｒ−ｖｉｒＤ３（配列番号９６）、ｒ−ｖｉｒＤ４（配列番号９７）、ｒ−ｖｉｒＤ５（配列番号９８）、ｒ−ｖｉｒＦ（配列番号９９）、ｒ−ｖｉｒＥ３（配列番号１００）およびｒ−ｇａｌｌｓ（配列番号１０１）。本明細書の表２３を参照されたい。本明細書では、ビルレンス遺伝子の様々な組み合わせが使用され得る。毒性には、ｒ−ｇａｌｌｓ遺伝子（配列番号１０１）が、本明細書に記載のＲｉプラスミドｖｉｒ遺伝子と共に必要である。

【0037】

Ｔｉ／Ｒｉプラスミド上のＶｉｒ領域は、その集約した機能が、プラスミドのＴ−ＤＮＡ領域を切除し、それを植物ゲノムへ導入し組み込むのを促進することにある遺伝子の集まりである。ｖｉｒシステムは、植物が損傷すると生じるシグナルによって誘導される。アセトシリンゴン、シリンガアルデヒドまたはアセトバニロンなどのフェノール化合物は、構成的に発現した膜貫通タンパク質であるレセプターをコードするｖｉｒ遺伝子を活性化する。活性化したｖｉｒ遺伝子はキナーゼとして作用し、ｖｉｒＧ遺伝子をリン酸化する。リン酸化した形態のｖｉｒ遺伝子は、転写活性化因子として、残りのｖｉｒ遺伝子オペロンに作用する。ｖｉｒＢオペロンは、気孔／線毛様構造を形成するタンパク質をコードする。ＶｉｒＣは、オーバードライブ配列に結合する。ＶｉｒＤ１およびｖｉｒＤ２は、エンドヌクレアーゼ活性を有し、左境界配列および右境界配列内で一本鎖切断を行い、そして、ｖｉｒＤ４は、共役タンパク質である。ＶｉｒＥは、一本鎖Ｔ−ＤＮＡに結合し、本プロセスの輸送段階の間、それを保護する。植物細胞に導入されると直ちに、Ｔ−ＤＮＡの相補鎖が合成される。

【0038】

これらのｖｉｒ遺伝子や他のｖｉｒ遺伝子は移行中に機能し、そのため、これらの遺伝子はクローニングベクター内で含ませる必要はない。例えば、改変アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株は、Ｔ−ＤＮＡ領域が削除されたプラスミドに必要なＶｉｒ機能を全て提供することができ、細胞はＴ−ＤＮＡ導入のためのｖｉｒ機能を提供することができる。一例として、ｐＢＲ３２２の一部がＴ−ＤＮＡ領域の置換に使用され、アンピシリンに対する耐性が付与されたＣ５８由来株がある。

【0039】

細胞ゲノムで発現および／または挿入されるための１つ以上の目的配列を含むコンストラクトが提供される。コンストラクトは、バイナリーベクター、ターナリーベクターまたはＴ−ＤＮＡベクターなどのベクターに含まれ得る。コンストラクトとは、様々な機能および／または活性を有する様々なタイプのヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド分子を指す。様々なタイプの配列としては、リンカー、アダプター、調節領域、イントロン、調節部位、エンハンサー、インシュレーター、スクリーニングマーカー、選択マーカー、プロモーター、発現カセット、コードポリヌクレオチド、サイレンシングポリヌクレオチド、終止配列、複製起点、組み換え部位、切除カセット、リコンビナーゼ、細胞増殖因子、ベクターの構築もしくは分析に役立つその他の部位、またはこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの例では、コンストラクトは、１つ以上の発現カセットを含み。そこでは、ポリヌクレオチドが調節配列に作動可能に連結している。作動可能に連結されるのは、２つ以上の要素間の機能的連結である。例えば、コードポリヌクレオチドを調節配列（例えば、プロモーター）間の作動可能な連結は、コードポリヌクレオチドを発現させる機能的連結である。作動可能に連結した要素は、隣接していても隣接していなくてもよい。２つのタンパク質コード領域の連結を指すために使用する場合、作動可能に連結されるとは、コード領域が同じリーディングフレームにあることが意図されている。コードポリヌクレオチドとしては、ポリペプチドをコードするか、または標的遺伝子の発現を低減するサイレンシングポリヌクレオチドをコードする任意のポリヌクレオチドが挙げられる。サイレンシングポリヌクレオチドの非限定的な例としては、低分子干渉ＲＮＡ，マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ヘアピン構造などが挙げられる。コンストラクトはまた、植物細胞の形質転換を促進するか、または任意の構造核酸配列の発現を制御する多くの遺伝子成分を含有し得る。いくつかの例では、遺伝子成分は、ｍＲＮＡを発現するように配向されており、任意選択により、ｍＲＮＡはタンパク質に翻訳される。二本鎖形態で存在する植物構造コード配列（遺伝子、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、またはその他のＤＮＡ）の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤＮＡの一本鎖からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写、およびその後の核内でのｍＲＮＡ一次転写物のプロセシングを含む。このプロセシングは、ｍＲＮＡの３’末端をポリアデ二ル化する３’末端非翻訳領域を含む。

【0040】

一態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１；ｖｉｒＣ１〜Ｃ２；ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ、もしくはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、ｒ−ｖｉｒＧおよびｒ−ｇａｌｌｓ、またはそれらの多様体および誘導体を含むベクターを提供する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１は、それぞれ配列番号４〜１４、またはその多様体および誘導体を有し；アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＣ１〜Ｃ２は、それぞれ配列番号１６〜１７、またはその多様体および誘導体を有し；アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ１〜Ｄ２は、それぞれ配列番号１８〜１９、またはその多様体および誘導体を有し；アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＧは、配列番号１５、またはその多様体および誘導体を有するか；あるいは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１は、それぞれ配列番号８０〜９０、またはその多様体および誘導体を有し；ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２は、それぞれ配列番号９２〜９３、またはその多様体および誘導体を有し；ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２は、それぞれ配列番号９５〜９６、またはその多様体および誘導体を有し；ｒ−ｖｉｒＧは、配列番号９１、またはその多様体および誘導体を有し；ならびに、ｒ−ｇａｌｌｓは、配列番号１０１、またはその多様体および誘導体を有する。

【0041】

一態様において、ベクターはさらに、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＪ、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰもしくはｖｉｒＱ、またはその多様体および誘導体の１種以上、あるいは、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上を含み、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３を含むベクターはさらに、ｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含む。したがって、一態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ、もしくはそれらの多様体および誘導体、またはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｒ−ｖｉｒＧ、もしくはそれらの多様体および誘導体、そして、ｒ−ｇａｌｌｓ、もしくはその多様体および誘導体、任意選択により、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＪ、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰもしくはｖｉｒＱ、またはその多様体および誘導体の１種以上、あるいは、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上、そしてｒ−ｇａｌｌｓ、またはその多様体および誘導体を含むベクターを提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡは、配列番号２６、またはその多様体および誘導体を有し、あるいはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡは、配列番号７９、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号２０〜２２、またはそれらの多様体および誘導体を有し、あるいはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号９４〜９６、またはそれらの多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＥ１〜Ｅ３は、それぞれ配列番号２３〜２５、またはそれらの多様体および誘導体を有し、あるいはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＥ３は、配列番号１００、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＨ〜Ｈ１は、それぞれ配列番号４２〜４３、またはそれらの多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＪは、配列番号２７、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＫは、配列番号４５、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＬは、配列番号４６、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＭは、配列番号４７、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＰは、配列番号４８、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＱは、配列番号４９、またはその多様体および誘導体を有する。

【0042】

一態様において、ベクターはさらに、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＪ、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰもしくはｖｉｒＱ、またはその多様体および誘導体の１種以上、あるいは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上、ならびにｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子、またはその多様体および誘導体を含む。したがって、一態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ、もしくはそれらの多様体および誘導体、またはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、ｒ−ｖｉｒＧおよびｒ−ｇａｌｌｓ、もしくはそれらの多様体および誘導体、任意選択により、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＤ３、ｖｉｒＤ４、ｖｉｒＤ５、ｖｉｒＥ１、ｖｉｒＥ２、ｖｉｒＥ３、ｖｉｒＨ、ｖｉｒＨ１、ｖｉｒＨ２、ｖｉｒＪ、ｖｉｒＫ、ｖｉｒＬ、ｖｉｒＭ、ｖｉｒＰもしくはｖｉｒＱ、またはその多様体および誘導体の１種以上、あるいは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡ、ｒ−ｖｉｒＤ３、ｒ−ｖｉｒＤ４、ｒ−ｖｉｒＤ５、ｒ−ｖｉｒＥ３もしくはｒ−ｖｉｒＦ、またはその多様体および誘導体の１種以上、そしてｒ−ｇａｌｌｓ、またはその多様体および誘導体を含むベクターを提供する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡは、配列番号２６、またはその多様体および誘導体を有し、あるいはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＡは、配列番号７９、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号２０〜２２、またはそれらの多様体および誘導体を有し、あるいはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＤ３〜Ｄ５は、それぞれ配列番号９４〜９６、またはそれらの多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＥ１〜Ｅ３は、それぞれ配列番号２３〜２５、またはそれらの多様体および誘導体を有し、あるいはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＥ３は、配列番号１００、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＨ〜Ｈ２は、それぞれ配列番号４２〜４３、またはそれらの多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＪは、配列番号２７、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＫは、配列番号４５、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＬは、配列番号４６、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＭは、配列番号４７、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＰは、配列番号４８、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＱは、配列番号４９、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＦは、配列番号９９、またはその多様体および誘導体を有する。一態様において、リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｇａｌｌｓは、配列番号１０１、またはその多様体および誘導体を有する。

【0043】

一態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｖｉｒＥ１−Ｅ３およびｖｉｒＧ、もしくはそれらの多様体および誘導体、またはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子の、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、それぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、それぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３、配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧ、および配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓ、もしくはそれらの多様体および誘導体を含むベクターを提供する。

【0044】

一態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｖｉｒＥ１〜Ｅ３およびｖｉｒＧ、もしくはそれらの多様体および誘導体、またはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、ｒ−ｖｉｒＧおよびｒ−ｇａｌｌｓ、またはそれらの多様体および誘導体を含むベクターを提供する。

【0045】

一態様において、本開示は、（ａ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｃ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＡ、ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、ｖｉｒＥ１〜Ｅ３、ｖｉｒＧおよびｖｉｒＪ、もしくはそれらの多様体および誘導体、またはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子の、配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡ、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、それぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、それぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３、配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧ、配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓ、もしくはそれらの多様体および誘導体を含むベクターを提供する。

【0046】

本開示は、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＳＣ１０１、ｐ１５ＡもしくはＲ６Ｋ複製起点、またはその機能的多様体および誘導体に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含むベクターを提供する。一態様においては、本開示のベクターの構築に、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）で機能する複製起点を使用することができる。例えば、種々の頻度および質（単一Ｔ−ＤＮＡコピー、骨格なし）の形質転換イベントを得るために、種々の複製起点を選択することができる。一態様において、複製起点は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）またはその両方で機能する複製起点である。一態様において、複製起点は、ｐＶＳ１、ｐＳａ、ＲＫ２、ｐＲｉ、ｉｎｃＰａ、ｉｎｃＷ、Ｃｏｌ Ｅ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１またはそれらの機能的多様体および誘導体からなる群から選択される。

【0047】

一態様において、ベクターは、Ｃｏｌ Ｅ１に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含む。さらなる態様において、ベクターは、配列番号２、またはその多様体および断片を有する、Ｃｏｌ Ｅ１に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含む。

【0048】

一態様において、ベクターは、ｐＳＣ１０１に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含む。さらなる態様において、ベクターは、配列番号５０、またはその多様体および断片を有する、ｐＳＣ１０１に由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含む。

【0049】

一態様において、ベクターは、ｐ１５Ａに由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含む。さらなる態様において、ベクターは、配列番号５１、またはその多様体および断片を有する、ｐ１５Ａに由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含む。

【0050】

一態様において、ベクターは、Ｒ６Ｋに由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含む。さらなる態様において、ベクターは、配列番号５２、またはその多様体および断片を有する、Ｒ６Ｋに由来する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点を含む。

【0051】

種々の態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、低コピー数複製起点、中間コピー数複製起点、または高コピー数複製起点であり得る。低コピー数複製起点は、１細胞当たり約１〜２コピー数のベクターを与えると理解されている（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ（２０１５）３４：７４５−５４；およびＣｈｏ ａｎｄ Ｗｉｎａｎｓ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００５）１０２：１４８４３−８４８を参照）。さらに、中間コピー数複製起点は、１細胞当たり約７〜１２コピー数のベクターを与えると理解されている（例えば、Ｏｌｔｍａｎｎｓ、ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０１０）１５２：１１５８−１１６６を参照。）中間コピー数複製起点の例としては、非限定的な例であるが、ｐＲＫ２由来のもの、およびｐＶＳ１のコピーダウン変異型が挙げられる。高コピー数複製起点は、１細胞当たり約１５〜２０以上のコピー数のベクターを与えると理解されるべきである（例えば、Ｏｌｔｍａｎｎｓ、ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２０１０）１５２：１１５８−１１６６；およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔ（２０１５）３４：７４５−５４を参照）。中間コピー数複製起点の例としては、非限定的な例であるが、ｒｅｐＡＢＣ由来のもの、およびｐＶＳ１のコピーアップ変異型が挙げられる。

【0052】

一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ｐＲＳＦ１０１０、ｐＲＫ２、ｐＳａまたはｐＢＢＲ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＫ２複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＶＳ１複製起点に由来する。一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。種々の態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３、３７、３８、５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片を有する。

【0053】

一態様において、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点である。ｒｅｐＡＢＣ適合複製起点は、配列番号５７、５８、５９もしくは６０、またはその多様体および断片を有し得る。

【0054】

いくつかの態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、同じ複製起点である。例えば、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＫ２複製起点、ｐＳａ複製起点またはｐＲＳＦ１０１０複製起点由来であり得る。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＫ２複製起点由来であり得る。さらなる態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、配列番号３８、またはその多様体および断片を有するｐＲＫ２複製起点由来であり得る。一態様において、複製起点は、ｐＳａ複製起点に由来する。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＳａ複製起点（配列番号５３）、またはその多様体および断片由来であり得る。さらなる態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、ｐＲＳＦ１０１０複製起点由来であり得る。さらなる態様において、ｐＲＳＦ１０１０複製起点は、配列番号３７、またはその多様体および断片を有する。

【0055】

ｐＲＫ２複製起点の多様体としては、ミニまたはマイクロｐＲＫ２複製起点が挙げられる。一態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点である。さらなる態様において、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点、およびアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点は、マイクロｐＲＫ２複製起点であり、配列番号５４、またはその多様体および断片を有する。

【0056】

いくつかの態様において、本開示のベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。さらなる態様において、ｐＲＫ２複製起点、特にマイクロまたはミニｐＲＫ２複製起点を含む本開示のベクターはさらに、ｐａｒ ＤＥオペロン由来の配列を含む。ｐａｒ ＤＥオペロン配列は、配列番号５５、またはその多様体および断片を有し得る。

【0057】

一態様において、選択マーカーは、ゲンタマイシン、ネオマイシン／カナマイシン、ハイグロマイシンまたはスペクチノマイシンに対する耐性を付与するさらなる態様において、選択マーカーは、ａａｃＣ１、ｎｐｔ１、ｎｐｔ２、ｈｐｔ、ａａｄＡ、ＳｐｃＮまたはａｐｈである。一態様において、選択マーカーは、配列番号１、３９、４０、４１、６７、７７もしくは７８（それぞれａａｃＣ１、ａａｄＡ、ｎｐｔ１、ｎｐｔ２、ｈｐｔ、ＳｐｃＮおよびａｐｈに対応）、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカーは、ａａｃＣ１である。さらなる態様において、選択マーカーは、ａａｃＣ１であり、配列番号１、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカーは、ａａｄＡである。さらなる態様において、選択マーカーは、ａａｄＡであり、配列番号３９、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカーは、ｎｐｔ１である。さらなる態様において、選択マーカーは、ｎｐｔ１であり、配列番号４０、またはその多様体および断片を有する。一態様において、選択マーカーは、ｎｐｔ２である。さらなる態様において、選択マーカーは、ｎｐｔ２であり、配列番号４１を有する。一態様において、選択マーカーは、ｈｐｔである。さらなる態様において、選択マーカーは、ｈｐｔであり、配列番号６７、またはその多様体および断片を有する。さらなる態様において、選択マーカーは、ＳｐｃＮであり、配列番号７７、またはその多様体および断片を有する。さらなる態様において、選択マーカーは、ａｐｈであり、配列番号７８、またはその多様体および断片を有する。種々の態様において、選択マーカーは、テトラサイクリン選択マーカーではない。一態様において、選択マーカーは、ｔｅｔＡＲではない。

【0058】

一態様において、選択マーカーは、対抗選択マーカーまたはネガティブ選択マーカーである。以上から理解できるように、本開示のベクターは、ビルレンス（ｖｉｒ）遺伝子、複製起点および選択マーカーを含み得る。下の表１は、限定するものではないが、ビルレンス遺伝子、選択マーカーおよび複製起点を含む組み合わせの例である。一態様において、対抗選択マーカーは、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ（ｓｔｒＡ）、ｐｈｅＳ、ｄｈｆｒ（ｆｏｌＡ）、ｌａｃＹ、Ｇａｔａ−１、ｃｃｄＢまたはｔｈｙＡである。

【0059】

【表1】

【0060】

【表2】

【0061】

一態様において、本開示は、配列番号６１も、またその多様体および断片も含まないベクターを提供する。

【0062】

一態様において、本開示は、配列番号６２も、またその多様体および断片も含まないベクターを提供する。

【0063】

一態様において、本開示は、ｔｒａもしくはｔｒｂオペロン配列も、またその多様体もしくは断片も含まないベクターを提供する。さらなる態様において、本開示は、ｔｒａもしくはｔｒｂオペロン配列（ここで、ｔｒａもしくはｔｒｂオペロン配列は配列番号６３を有する）も、またその多様体もしくは断片も含まないベクターを提供する。

【0064】

一態様において、本開示は、配列番号３４、３５もしくは３６、またはその多様体および断片を有するベクターを提供する。

【0065】

一態様において、本開示は、（ａ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｂ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｃ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号１８〜１９を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ２、もしくはその多様体および誘導体、そして配列番号１５を有するｖｉｒＧ、もしくはその多様体および誘導体、またはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号９５〜９６を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、もしくはその多様体および誘導体、配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧ、もしくはその多様体および誘導体、そして配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓ、もしくはその多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターを提供する。

【0066】

一態様において、本開示は、（ａ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｂ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｃ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号４〜１４を有するｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、もしくはその多様体および誘導体；それぞれ配列番号１６〜１７を有するｖｉｒＣ１〜Ｃ２、もしくはその多様体および誘導体；それぞれ配列番号１８〜２２を有するｖｉｒＤ１〜Ｄ５、もしくはその多様体および誘導体；それぞれ配列番号２３〜２５を有するｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはその多様体および誘導体；配列番号１５を有するｖｉｒＧ、もしくはその多様体および誘導体、またはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子である、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、もしくはその多様体および誘導体、配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３、もしくはその多様体および誘導体、配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧ、もしくはその多様体および誘導体、そして配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓ、もしくはその多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターを提供する。

【0067】

一態様において、本開示は、（ａ）配列番号２、またはその多様体および断片を有する、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖するための複製起点；（ｂ）配列番号３、またはその多様体および断片を有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖するための複製起点；（ｃ）配列番号１、またはその多様体および断片を有する選択マーカー遺伝子；ならびに（ｄ）配列番号２６を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｖｉｒＡ、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号４〜１４を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号１６〜１７を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号１８〜２２を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号２３〜２５を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｖｉｒＥ１〜Ｅ３、もしくはその多様体および誘導体；配列番号１５を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｖｉｒＧ、もしくはその多様体および誘導体、そして配列番号２７を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｖｉｒＪ、もしくはその多様体および誘導体、あるいは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子である、配列番号７９を有するｒ−ｖｉｒＡ、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号８０〜９０を有するｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号９２〜９３を有するｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、もしくはその多様体および誘導体、それぞれ配列番号９４〜９８を有するｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ５、もしくはその多様体および誘導体、配列番号１００を有するｒ−ｖｉｒＥ３、もしくはその多様体および誘導体、配列番号９１を有するｒ−ｖｉｒＧ、もしくはその多様体および誘導体、そして配列番号１０１を有するｒ−ｇａｌｌｓ、もしくはその多様体および誘導体を含むビルレンス遺伝子を含むベクターを提供する。

【0068】

一態様において、本開示は、さらに、植物の形質転換方法であって、（ａ）植物由来の組織を、（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ遺伝子、もしくはリゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１−Ｃ、ｒ−ｖｉｒＤ１−Ｄ２、ｒ−ｖｉｒＧおよびｒ−ｇａｌｌｓ、またはそれらの多様体および誘導体を含む第１のベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を提供する。

【0069】

一態様において、本開示は、さらに、植物の形質転換方法であって、（ａ）植物由来の組織を、（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点．；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ遺伝子、もしくはアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１−Ｃ、ｒ−ｖｉｒＤ１−Ｄ２、ｒ−ｖｉｒＧおよびｒ−ｇａｌｌｓ、またはそれらの多様体および誘導体を含む第１のベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を提供する。

【0070】

一態様において、本開示は、さらに、（ａ）（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ遺伝子、またはそれらの多様体および誘導体を含むベクターと、（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用した植物形質転換に用いるための使用説明書とを含むキットを提供する。

【0071】

一態様において、本開示は、さらに、（ａ）（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点．；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ遺伝子、もしくはそれらの多様体および誘導体、または、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、ｒ−ｖｉｒＧおよびｒ−ｇａｌｌｓを含むベクターと、（ｂ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を使用した植物形質転換に用いるための使用説明書とを含むキットを提供する。

【0072】

「植物」には、全植物、植物器官、植物組織、種子および植物細胞、ならびにそれらの子孫が含まれる。再生植物の子孫、多様体および変異体もまた、これらの部分が、導入されたポリヌクレオチドを含むか、または本開示のベクターを使用して形質転換されているなら、本開示の範囲に含まれる。植物細胞としては、限定はされないが、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉および小胞子由来の細胞が挙げられる。

【0073】

本明細書で使用する場合、「再生」とは、植物細胞または細胞群（例えば、植物プロトプラスト、カルスまたは外植体）から植物を成長させるプロセスを指す。

【0074】

本明細書で使用する場合、用語「プロトプラスト」は、細胞培養物または全植物に成長する能力を有する、細胞壁のない単離植物細胞を指す。

【0075】

植物部には、分化組織および未分化組織が含まれ、それらの組織としては、限定はされないが、根、茎、シュート、葉、花粉、種子、腫瘍組織、および様々な形態の細胞および培養物（例えば、単細胞、プロトプラスト、胚およびカルス組織）が挙げられる。植物組織は、植物であっても、植物の器官、組織、もしくは細胞培養物であってもよい。

【0076】

本開示はまた、本明細書に開示した、任意の方法により、または任意の組成物から得られる植物も含む。

【0077】

本開示はまた、本明細書に開示した、任意の方法により、または任意の組成物から得られる植物由来の種子も含む。

【0078】

多様体および断片
「断片」は、ポリヌクレオチドの一部またはアミノ酸配列の一部を意味し、したがって、それにコードされたタンパク質を意味する。ポリヌクレオチドの断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持しているタンパク質断片をコードし得る。したがって、ヌクレオチド配列の断片は、少なくとも約１０個のヌクレオチド、少なくとも約１５個のヌクレオチド、少なくとも約１６個のヌクレオチド、少なくとも約１７個のヌクレオチド、少なくとも約１８個のヌクレオチド、少なくとも約１９個のヌクレオチド、少なくとも約２０個のヌクレオチド、少なくとも約２２個のヌクレオチド、少なくとも約５０個のヌクレオチド、少なくとも約７５個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、少なくとも約３００個のヌクレオチド、少なくとも約４００個のヌクレオチド、少なくとも約５００個のヌクレオチド、少なくとも約６００個のヌクレオチドから、使用する全長のポリヌクレオチドまでの幅があり得る。

【0079】

「誘導体」は、参照ポリヌクレオチドの生物学的活性と実質的に類似した活性を有するポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの一部を意味する。ビルレンス遺伝子ポリヌクレオチドの誘導体は、機能的であり、ビルレンス遺伝子活性を保持している。

【0080】

「多様体」は、実質的に類似の配列を意味するものである。ポリヌクレオチドでは、多様体は、天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の内部部位で１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加および／または置換を含むか、あるいは、天然ポリヌクレオチドにおける１つ以上の部位で１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。ビルレンス遺伝子ポリヌクレオチドの多様体は、ビルレンス遺伝子活性を保持している。本明細書で使用する場合、「天然の」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ天然に存在するヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む。ポリヌクレオチドでは、保存多様体として、遺伝コードの縮重のため、ビルレンス遺伝子によってコードされたポリペプチドのアミノ酸配列をコードする配列が挙げられる。ポリヌクレオチド多様体としてはまた、例えば、部位特異的変異誘発法によって生成されたものであるが、所望の活性を継続して保持しているポリヌクレオチドなど、合成的に誘導されたポリヌクレオチドが挙げられる。一般に、開示した特定のポリヌクレオチド（すなわち、ビルレンス遺伝子）の多様体は、本明細書の他の箇所で記載したシーケンスアライメントプログラムによる決定で、特定のポリヌクレオチドに対し、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有している。

【0081】

開示した特定のポリヌクレオチド（すなわち、参照ポリヌクレオチド）の多様体はまた、ポリヌクレオチド多様体によってコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとの間のパーセント配列同一性を比較することによっても評価することができる。任意の２つのポリペプチド間のパーセント配列同一性は、本明細書の他の箇所で記載したシーケンスアライメントプログラムおよびパラメータを使用して算出することができる。使用した開示ポリヌクレオチドの任意の所与の対を、それらがコードする２つのポリペプチドが共有するパーセント配列同一性を比較することによって評価する場合、２つのコードされたポリペプチド間のパーセント配列同一性は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性である。

【0082】

以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を記載するために使用される：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較窓」、（ｃ）「配列同一性」および（ｄ）配列同一性のパーセンテージ」。

【0083】

（ａ）本明細書で使用する場合、「参照配列」は、配列比較の基礎として使用される定義された配列である。参照配列は、特定の配列の一部または全部、例えば、完全長のｃＤＮＡもしくは遺伝子の配列の一部、または、全ｃＤＮＡもしくは全遺伝子の配列であり得る。

【0084】

（ｂ）本明細書で使用する場合、「比較窓」は、ポリヌクレオチド配列の連続する特定の一部を指し、比較窓内のポリヌクレオチド配列は、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較したとき、これら２種のポリヌクレオチドを最適にアラインさせるため、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含む場合がある。一般に、比較窓は、ヌクレオチドが少なくとも２０個連続する長さがあり、場合により、少なくとも３０個、４０個、５０個、１００個またはそれ以上であり得る。当業者であれば、ポリヌクレオチド配列にギャップを含むことによって、参照配列に対し高い類似性を有することを避けるために、通常、ギャップペナルティが導入され、マッチ数から差し引かれる。

【0085】

別段に記載がない限り、本明細書に示されている配列同一性／類似性値は、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０により、以下のパラメータを用いて得られた値である：ヌクレオチド配列の％同一性および％類似性は、ギャップ・ウエイト（ＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔ）５０、レングス・ウエイト（Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ）３、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリクスを使用；アミノ酸配列の％同一性および％類似性は、ギャップ・ウエイト（ＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔ）８、レングス・ウエイト（Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ）２、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクスを使用；またはそれらと等価の任意のプログラム。「等価のプログラム」とは、任意の２つの対象配列について、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０で作成された対応アライメントと比較したとき、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチングが同じで、かつパーセント配列同一性が同じアライメントが作成されるシーケンス比較プログラムを意味する。

【0086】

（ｃ）２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関連した「配列同一性」または「同一性」は、本明細書で使用する場合、特定の比較窓全体にわたり最大の一致が得られるようにアラインしたときに同じとなる２つの配列中の残基を指す。タンパク質に関連して、配列同一性のパーセンテージの用語を使用する場合、同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なっていることが多く、そこでは、アミノ酸残基は、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に代替し、したがって、分子の機能特性は変わらないと認められる。保存的置換で配列が異なる場合、置換に保存的性質を補正するために、パーセント配列同一性を高める方向に調節してもよい。そのような保存的置換によって相異する配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。このような調節を行う方法は、当業者にはよく知られている。典型的には、これには、保存的置換を、完全ミスマッチとしてではなく部分的ミスマッチとして採点し、それにより、パーセント配列同一性を高める方法が含まれる。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１点を与え、非保存的置換に０点を与える場合、保存的置換に０〜１点を与える。保存的置換の採点は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で行われるように算出する。

【0087】

（ｄ）本明細書で使用する場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓全体にわたり２種の適切にアラインされた配列を比較することにより決定される値を意味しており、比較窓内のポリヌクレオチド配列の部分は、これら２種の配列を最適にアラインさせるために、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して、付加または欠失（すなわっち、ギャップ）を含む場合がある。パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両配列内で発生する位置の数を決定して、マッチした位置数を得、そのマッチした位置数を比較窓内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることにより、算出される。

【0088】

配列番号４〜２７および４２〜４９に記載のビルレンス遺伝子多様体、またはその多様体および誘導体を同定する方法が、さらに提供される。そのような方法は、対象ビルレンス遺伝子の活性を保持するのに十分な長さを有する、配列番号４〜２７および４２〜４９、またはそれらの多様体および誘導体のいずれか１つの候補誘導体を得る工程と；コントロールベクターの関連ビルレンス遺伝子を置換して候補多様体ベクターを作製する工程と；その候補ビルレンスポリヌクレオチド誘導体が関連ビルレンス遺伝子の活性を有し、それにより本明細書に記載のベクターの所望の形質転換機能を提供するか否かを決定する工程とを含む。本明細書に示した教示に照らせば、所望の形質転換効果に基づいて、そのような候補多様体を同定する方法は知られている。種々の態様において、「…配列番号４〜２７および４２〜４９、またはそれらの多様体もしくは誘導体…」という用語は、それらの開示の配列が、配列番号４〜２７および４２〜４９、ならびに／または配列番号４〜２７および４２〜４９の誘導体、配列番号４〜２７および４２〜４９の多様体、ならびに／または配列番号４〜２７および４２〜４９の誘導体、列挙した配列を個々に、または列挙した配列のいくつかもしくは全てを包括的に含んでいることを意味するように意図されていることは理解されるべきである。

【0089】

ＩＩ．植物の形質転換
いくつかの態様において、本開示の方法は、植物細胞へポリヌクレオチドを導入することを含む。「導入する」は、ポリヌクレオチドを植物細胞へ、配列が植物細胞内部に侵入するように送り込むことを意味するものである。本開示の方法は、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換（米国特許第５，５６３，０５５号明細書および米国特許第５，９８１，８４０号明細書）などの方法を用いて、植物細胞へポリヌクレオチドを導入することを含む。

【0090】

いくつかの態様において、植物細胞へのポリヌクレオチドの導入効率および導入速度を向上させるために、本開示のベクターを使用することができる。

【0091】

いくつかの態様において、本開示のベクターは、外植体の１つ以上の細胞の形質転換に有用である。胚発生材料または体細胞胚を形成することができれば、外植体、例えば、成熟および未成熟の体細胞植物組織を、本開示のソースまたは外植体材料として使用することができる。好適な体細胞植物組織としては、雄花（ｓｔａｍｉｎａｔｅ）（すなわち、雄花）、雌花（ｐｉｓｔｏｌａｔｅ）（すなわち、雌花）、完全花、球茎ディスク（ｃｏｒｍ ｄｉｓｃ）、花茎、包葉などに由来する組織が挙げられる。未成熟の花および球茎ディスク（ｃｏｒｍ ｄｉｓｃ）は、好適な体細胞植物組織源である。一態様において、形質転換に使用する植物由来の外植体としては、未成熟胚、１〜５ｍｍの接合胚、および３．５〜５ｍｍの胚が挙げられる。

【0092】

本開示の方法に使用される外植体は、限定はされないが、オオムギ、トウモロコシ、キビ、カラスムギ、イネ、ライムギ、セタリア属（Ｓｅｔａｒｉａ）種、ソルガム、サトウキビ、スイッチグラス、ライコムギ、シバ（ｔｕｒｆｇｒａｓｓ）またはコムギなどの単子葉植物由来であり得る。あるいは、本開示の方法に使用される外植体は、限定はされないが、ケール、カリフラワー、ブロッコリー、カラシナ、キャベツ、エンドウ、クローバ、アルファルファ、ソラマメ、トマト、キャッサバ、ダイズ、キャノーラ、アルファルファ、ベニバナ、タバコ、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）またはワタなどの双子葉植物由来であり得る。

【0093】

さらなる態様において、本開示の方法に使用される外植体は、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）に属する植物由来であり得る。本開示の外植体が由来し得る好適な植物の非限定的な例としては、限定はされないが、オオムギ、トウモロコシ（トウモロコシ）、カラスムギ、イネ、ライムギ、ソルガム、コムギ、キビ、ライコムギなどの穀類；限定はされないが、タケ、マーラム、タチイチゴツナギ、アシ、ライグラス、サトウキビなどの葉茎作物；シバ（ｌａｗｎ ｇｒａｓｓ）、パンパスグラス、ならびに、スイッチグラスおよびシバ（ｔｕｒｆｇｒａｓｓ）などのその他の草が挙げられる。

【0094】

さらなる態様において、本開示の方法に使用される外植体は、高等植物、例えば、被子植物綱（Ａｎｇｉｏｓｐｅｒｍａｅ）および裸子植物綱（Ｇｙｍｎｏｓｐｅｒｍａｅなどを含む任意の植物由来であり得る。双子葉植物亜綱および単子葉植物亜綱の植物が好適である。好適な種は、キツネノマゴ科（Ａｃａｎｔｈａｃｅａｅ）、ネギ科（Ａｌｌｉａｃｅａｅ）、ユリズイセン科（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａｃｅａｅ）、ヒガンバナ科（Ａｍａｒｙｌｌｉｄａｃｅａｅ）、キョウチクトウ科（Ａｐｏｃｙｎａｃｅａｅ）、ヤシ科（Ａｒｅｃａｃｅａｅ）、キク科（Ａｓｔｅｒａｃｅａｅ）、メギ科（Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ）、ベニノキ科（Ｂｉｘａｃｅａｅ）、アブラナ科（Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ）、パイナップル科（Ｂｒｏｍｅｌｉａｃｅａｅ）、アサ科（Ｃａｎｎａｂａｃｅａｅ）、ナデシコ科（Ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌａｃｅａｅ）、イヌガヤ科（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘａｃｅａｅ）、アカザ科（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、イヌサフラン科（Ｃｏｌｃｈｉｃａｃｅａｅ）、ウリ科（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ）、ヤマノイモ科（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａｃｅａｅ）、マオウ科（Ｅｐｈｅｄｒａｃｅａｅ）、ユカノキ科（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌａｃｅａｅ）、トウダイグサ科（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃｅａｅ）、マメ科（Ｆａｂａｃｅａｅ）、シソ科（Ｌａｍｉａｃｅａｅ）、アマ科（Ｌｉｎａｃｅａｅ）、ヒカゲノカズラ科（Ｌｙｃｏｐｏｄｉａｃｅａｅ）、アオイ科（Ｍａｌｖａｃｅａｅ）、メランチウム科（Ｍｅｌａｎｔｈｉａｃｅａｅ）、バショウ科（Ｍｕｓａｃｅａｅ）、フトモモ科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）、ヌマミズキ科（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）、ケシ科（Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ）、マツ科（Ｐｉｎａｃｅａｅ）、オオバコ科（Ｐｌａｎｔａｇｉｎａｃｅａｅ）、イネ科（Ｐｏａｃｅａｅ）、バラ科（Ｒｏｓａｃｅａｅ）、アカネ科（Ｒｕｂｉａｃｅａｅ）、ヤナギ科（Ｓａｌｉｃａｃｅａｅ）、ムクロジ科（Ｓａｐｉｎｄａｃｅａｅ）、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）、イチイ科（Ｔａｘａｃｅａｅ）、ツバキ科（Ｔｈｅａｃｅａｅ）およびブドウ科（Ｖｉｔａｃｅａｅ）由来であり得る。

【0095】

本開示の方法で使用される外植体が由来し得る好適な種としては、トロロアオイ属（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）、コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）、ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ）、ユリズイセン属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）、パイナップル属（Ａｎａｎａｓ）、アンドログラフィス属（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ）、ウシクサ属（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ）、ヨモギ属（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ）、ダンチク属（Ａｒｕｎｄｏ）、アトローパ属（Ａｔｒｏｐａ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）、フダンソウ属（Ｂｅｔａ）、ベニノキ属（Ｂｉｘａ）、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、キンセンカ属（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ）、ツバキ属（Ｃａｍｅｌｌｉａ）、カンレンボク属（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ）、アサ属（Ｃａｎｎａｂｉｓ）、トウガラシ属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、ベニバナ属（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ）、ニチニチソウ属（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ）、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）、キク属（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ）、キナ属（Ｃｉｎｃｈｏｎａ）、スイカ属（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）、イヌサフラン属（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ）、コリウス属（Ｃｏｌｅｕｓ）、キュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、カボチャ属（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ギョウギシバ属（Ｃｙｎｏｄｏｎ）、チョウセンアサガオ属（Ｄａｔｕｒａ）、ニンジン属（Ｄａｕｃｕｓ）、ナデシコ属（Ｄｉａｎｔｈｕｓ）、ジギタリス属（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）、アブラヤシ属（Ｅｌａｅｉｓ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）、エリスロキシルム属（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）、ウシノケグサ属（Ｆｅｓｔｕｃａ）、オランダイチゴ属（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ガランサス属（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ）、ダイズ属（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ワタ属（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヒマワリ属（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）、オオムギ属（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ナンヨウアブラギリ属（Ｊａｔｒｏｐｈａ）、クルミ属（Ｊｕｇｌａｎｓ）、アキノノゲシ属（Ｌａｃｔｕｃａ）、ラベンダー属（Ｌａｖｅｎｄｕｌａ）、ヤマ属（Ｌｉｎｕｍ）、ドクムギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）、ルピナス属（Ｌｕｐｉｎｕｓ）、トマト属（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）、イモノキ属（Ｍａｎｉｈｏｔ）、ウマゴヤシ属（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、メンタ属（Ｍｅｎｔｈａ）、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）、ワサビノキ属（Ｍｏｒｉｎｇａ）、バショウ属（Ｍｕｓａ）、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、イネ属（Ｏｒｙｚａ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）、ケシ属（Ｐａｐａｖｅｒ）、ヨモギキク属（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、チカラシバ属（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）、クサヨシ属（Ｐｈａｌａｒｉｓ）、アワガエリ属（Ｐｈｌｅｕｍ）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）、ポア属（Ｐｏａ）、ポインセチア属（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ）、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）ラウオルフィア属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）、トウゴマ属（Ｒｉｃｉｎｕｓ）、バラ属（Ｒｏｓａ）、ローズマリー属（Ｒｏｓｍａｒｉｎｕｓ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）、サングイナリア属（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）、ライムギ属（Ｓｅｃａｌｅ）、ナス属（Ｓｏｌａｎｕｍ）、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、スパルティナ属（Ｓｐａｒｔｉｎａ）、ホウレンソウ属（Ｓｐｉｎａｃｅａ）、ヨモギギク属（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ）、イチイ属（Ｔａｘｕｓ）、カカオ属（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）、コムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ウニオラ属（Ｕｎｉｏｌａ）、シュロソウ属（Ｖｅｒａｔｒｕｍ）、ビンカ属（Ｖｉｎｃａ）、ブドウ属（Ｖｉｔｉｓ）およびトウモロコシ属（Ｚｅａ）に属するものが挙げられる。

【0096】

さらなる態様において、本開示の方法に使用される外植体は、農業、園芸、液体燃料分子および他の化学物質の製造するためのバイオマス、ならびに／または林業にとって重要な、または興味深い植物由来であり得る。非限定的な例として、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（トウモロコシ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）（コムギ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ）（ワタ）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）（イネ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）（トウジンビエ）、キビ属（Ｐａｎｉｃｕｍ）種、モロコシ属（Ｓｏｒｇｈｕｍ）種、ススキ属（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ）種、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種、エリアンサス属（Ｅｒｉａｎｔｈｕｓ）種、ポプラ属（Ｐｏｐｕｌｕｓ）種、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（ヒロハノウシノケグサ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）、タケ、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）（トマト）、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ）（レタス）、バナナ（Ｍｕｓａ ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）（バナナ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）（ジャガイモ）、ヤセイカンラン（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ）（ブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ）、チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）（チャ）、オランダイチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ）（イチゴ）、カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ）（ココア）、アラビカコーヒーノキ（Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ）（コーヒー）、ヨーロッパブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）（ブドウ）、パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ）（パイナップル）、トウガラシ（Ｃａｐｓｉｃｕｍ ａｎｎｕｍ）（トウガラシ）、タマネギ（Ａｌｌｉｕｍ ｃｅｐａ）（タマネギ）、メロン（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｍｅｌｏ）（メロン）、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ ｓａｔｉｖｕｓ）（キュウリ）、セイヨウカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍａｘｉｍａ）（カボチャ）、ニホンカボチャ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ ｍｏｓｃｈａｔａ）（カボチャ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｅａ ｏｌｅｒａｃｅａ）（ホウレンソウ）、スイカ（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓ）（スイカ）、オクラ（Ａｂｅｌｍｏｓｃｈｕｓ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｓ）（オクラ）、ナス（Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）（ナス）、ケシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）（ケシ）、オニゲシ（Ｐａｐａｖｅｒ ｏｒｉｅｎｔａｌｅ）、ヨーロッパイチゴ（Ｔａｘｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、タイヘイヨウイチイ（Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）、クソニンジン（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）、アサ（Ｃａｎｎａｂｉｓ ｓａｔｉｖａ）、カンレンボク（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔｅ）、ニチニチソウ（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ ｒｏｓｅｕｓ）、ツルニチニチソウ（Ｖｉｎｃａ ｒｏｓｅａ）、キナノキ（Ｃｉｎｃｈｏｎａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、イヌサフラン（Ｃｏｌｃｈｉｃｕｍ ａｕｔｕｍｎａｌｅ）、ベラトラム・カリフォルニカ（Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）、ケジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｌａｎａｔａ）、ジギタリス・プルプレア（Ｄｉｇｉｔａｌｉｓ ｐｕｒｐｕｒｅａ）、ヤマノイモ属（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ）種、センシンレン（Ａｎｄｒｏｇｒａｐｈｉｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、ベラドンナ（Ａｔｒｏｐａ ｂｅｌｌａｄｏｎｎａ）、シロバナヨウシュシュチョウセンアサガオ（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｏｍｏｎｉｕｍ）、メギ属（Ｂｅｒｂｅｒｉｓ）種、イヌガヤ属（Ｃｅｐｈａｌｏｔａｘｕｓ）種、シナマオウ（Ｅｐｈｅｄｒａ ｓｉｎｉｃａ）、マオウ属（Ｅｐｈｅｄｒａ）種、コカ（Ｅｒｙｔｈｒｏｘｙｌｕｍ ｃｏｃａ）、マツユキソウ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ ｗｏｒｎｏｒｉｉ）、ハシリドコロ属（Ｓｃｏｐｏｌｉａ）種、ホソバノトウゲシバ（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ ｓｅｒｒａｔｕｍ）（＝トウゲシバ（Ｈｕｐｅｒｚｉａ ｓｅｒｒａｔａ））、ヒカゲノカズラ属（Ｌｙｃｏｐｏｄｉｕｍ）種、インドジャボク（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ ｓｅｒｐｅｎｔｉｎａ）、インドジャボク属（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）種、アカネグサ（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ）、ヒヨス属（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）種、キンセンカ（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ナツシロギク（Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、コレウス・フォルスコリ（Ｃｏｌｅｕｓ ｆｏｒｓｋｏｈｌｉｉ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ）、グアユールゴムノキ（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）（グアユール）、パラゴムノキ属（Ｈｅｖｅａ）種（ゴム）、スペアミント（Ｍｅｎｔｈａ ｓｐｉｃａｔａ）（ミント）、ペパーミント（Ｍｅｎｔｈａ ｐｉｐｅｒｉｔａ）（ミント）、ベニノキ（Ｂｉｘａ ｏｒｅｌｌａｎａ）、アルストロメリア属（Ａｌｓｔｒｏｅｍｅｒｉａ）種、バラ属（Ｒｏｓａ）種（バラ）、カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）（カーネーション）、ペチュニア属（Ｐｅｔｕｎｉａ）種（ペチュニア）、ポインセチア（Ｐｏｉｎｓｅｔｔｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）（ポインセチア）、タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ）（タバコ）、ルピナス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）（ルピン）、ウニオラ・パニクラータ（Ｕｎｉｏｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）（カラスムギ）、ベントグラス（コヌカグサ属（Ａｇｒｏｓｔｉｓ）種）、ヤマナラシ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｅｍｕｌｏｉｄｅｓ）（アスペン）、マツ属（Ｐｉｎｕｓ）種（マツ）、モミ属（Ａｂｉｅｓ）種（モミ）、カエデ属（Ａｃｅｒ）種（カエデ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ）（バーリー）、ナガハグサ（Ｐｏａ ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）（ブルーグラス）、ドクミギ属（Ｌｏｌｉｕｍ）種（ライグラス）、オオアワガエリ（Ｐｈｌｅｕｍ ｐｒａｔｅｎｓｅ）（ティモシー）、および球果植物が挙げられる。興味深いのは、エネルギー生成のために生育する植物、いわゆるエネルギー作物であり、例えば、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ（トールフェスク）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）およびタケ（Ｂａｍｂｏｏ）などのセルロース系エネルギー作物、ならびにトウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（トウモロコシ）およびキャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）などのデンプン系エネルギー作物、ならびにサトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、およびテンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）などの糖系エネルギー作物、ならびにダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）およびカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）などのバイオディーゼル生成エネルギー作物である。

【0097】

本明細書で使用する場合、「バイオマス再生可能エネルギー源植物」または「液体燃料分子および他の化学物質を生成するためのバイオマス」は、電気エネルギーに変換し得る貯蔵太陽エネルギーを含む（生、もしくは処理されている）材料、液体燃料および他の有用な化学物質を有するか、または生成する植物を意味する。一般的には、そのような植物は、専用エネルギー作物、ならびに農作植物および木本植物を含む。バイオマス再生可能エネルギー源植物の例としては、スイッチグラス（Ｐａｎｉｃｕｍ ｖｉｒｇａｔｕｍ）（スイッチグラス）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）（ソルガム、スーダングラス）、ジャイアントミスカンサス（Ｍｉｓｃａｎｔｈｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ）（ススキ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、バルサムポプラ（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｂａｌｓａｍｉｆｅｒａ）（ポプラ）、ビッグブルーステム（Ａｎｄｒｏｐｏｇｏｎ ｇｅｒａｒｄｉｉ）（ビッグブルーステム）、ナピアグラス（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｐｕｒｐｕｒｅｕｍ）（エレファントグラス）、クサヨシ（Ｐｈａｌａｒｉｓ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（リードカナリーグラス）、ギョウギシバ（Ｃｙｎｏｄｏｎ ｄａｃｔｙｌｏｎ）（バミューダグラス）、オニウシノケグサ（Ｆｅｓｔｕｃａ ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）（ヒロハノウシノケグサ）、スパルティナ・ペクチナータ（Ｓｐａｒｔｉｎａ ｐｅｃｔｉｎａｔａ）（プレーリーコードグラス）、ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ）（アルファルファ）、ダンチク（Ａｒｕｎｄｏ ｄｏｎａｘ）（ダンチク）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ）（ライムギ）、ヤナギ属（Ｓａｌｉｘ）種（ヤナギ）、ユーカリ属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）種（ユーカリ）、ライコムギ属（Ｔｒｉｔｉｃｏｓｅｃａｌｅ）種（ライコムギ−コムギ×ライムギ）、タケ（Ｂａｍｂｏｏ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）（トウモロコシ）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）（キャッサバ）、サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種（サトウキビ）、テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（テンサイ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅｍａｘ）（ダイズ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａｎａｐｕｓ）（キャノーラ）、ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ）（ヒマワリ）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ）（ベニバナ）、ナンヨウアブラギリ（Ｊａｔｒｏｐｈａ ｃｕｒｃａｓ）（ナンヨウアブラギリ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）（トウゴマ）、ギニアアブラヤシ（Ｅｌａｅｉｓ ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ）（ヤシ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）（アマ）およびカラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ）が挙げられる。

【0098】

形質転換された細胞は、従来の方法で植物体に成長させることができる。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ５：８１−８４を参照されたい。これらの植物体は、その後、成長させ、同じ形質転換株または異なる株と受粉させることができ、得られる子孫は、所望の特定の表現型特質の構成的発現を持つことができる。所望の表現型特質の発現が安定して維持され、受け継がれるのを確実にするため、２世代以上生育させ、その後、所望の表現型特質の発現が達成されたことを確実にするため、種子を収穫することができる。このようにして、本明細書の記載の組成物および方法においては、本開示のベクターを使用して植物に導入され、そのゲノムに安定に組み込まれたポリヌクレオチドを含む形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも呼ばれる）が提供される。

【0099】

したがって、本開示の方法および組成物は、限定はされないが、単子葉植物および双子葉植物などの、あらゆる植物種の形質転換に、またあらゆる種のトランスジェニック植物の開発に使用することができる。目的とする植物種の例としては、限定はされないが、トウモロコシ（トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ））、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種（例えば、セイヨウアブラナ（Ｂ．ｎａｐｕｓ）、ブラッシカ・ラパ（Ｂ．ｒａｐａ）、カラシナ（Ｂ．ｊｕｎｃｅａ））、特に、種子油源として有用なアブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）種、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））、イネ（イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））、ライムギ（ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ ｃｅｒｅａｌｅ））、ソルガム（モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｉｃｏｌｏｒ）、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ））、キビ（例えば、トウジンビエ（トウジンビエ（Ｐｅｎｎｉｓｅｔｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ））、キビ（キビ（Ｐａｎｉｃｕｍ ｍｉｌｉａｃｅｕｍ））、アワ（アワ（Ｓｅｔａｒｉａ ｉｔａｌｉｃａ））、シコクビエ（シコクビエ（Ｅｌｅｕｓｉｎｅ ｃｏｒａｃａｎａ）））、ヒマワリ（ヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ））、ベニバナ（ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ））、コムギ（パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ））、ダイズ（ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ））、タバコ（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ））、ジャガイモ（ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ））、ラッカセイ（ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ））、ワタ（海島綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｂａｒｂａｄｅｎｓｅ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ））、サツマイモ（サツマイモ（Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔｕｓ））、キャッサバ（キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ））、コーヒー（コーヒーノキ属（Ｃｏｆｆｅａ）種）、ココナッツ（ココヤシ（Ｃｏｃｏｓ ｎｕｃｉｆｅｒａ））、パイナップル（パイナップル（Ａｎａｎａｓ ｃｏｍｏｓｕｓ））、カンキツ樹（ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）種）、ココア（カカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ ｃａｃａｏ））、チャ（チャノキ（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ））、バナナ（バショウ属（Ｍｕｓａ）種）、アボカド（アボカド（Ｐｅｒｓｅａ ａｍｅｒｉｃａｎａ））、イチジク（イチジク（Ｆｉｃｕｓ ｃａｓｉｃａ））、グアバ（グアバ（Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ））、マンゴー（マンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ ｉｎｄｉｃａ））、オリーブ（オリーブ（Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ））、パパイア（パパイア（Ｃａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ））、カシュー（カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ））、マカダミア（マカダミア（Ｍａｃａｄａｍｉａ ｉｎｔｅｇｒｉｆｏｌｉａ））、アーモンド（アーモンド（Ｐｒｕｎｕｓ ａｍｙｇｄａｌｕｓ））、テンサイ（テンサイ（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、サトウキビ（サトウキビ属（Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）種）、カラスムギ、オオムギ、野菜類、観賞植物および球果植物が挙げられる。

【0100】

野菜類としては、トマト（トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ））、レタス（例えば、レタス（Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ））、サヤマメ（インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ））、ライマメ（ライマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｌｉｍｅｎｓｉｓ））、エンドウマメ（レンリソウ属（Ｌａｔｈｙｒｕｓ）種）、ならびに、キュウリ（キュウリ（Ｃ．ｓａｔｉｖｕｓ））、カンタロープ（ククミス・カンタルペンシス（Ｃ．ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ））、およびマスクメロン（メロンＣ．ｍｅｌｏ））などのキュウリ属（Ｃｕｃｕｍｉｓ）に属するものが挙げられる。観賞植物としては、アザレア（ツツジ属（Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ）種）、アジサイ（アジサイ（Ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ｈｙｄｒａｎｇｅａ）、ハイビスカス（ブッソウゲ（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓａｎｅｎｓｉｓ））、バラ（バラ属（Ｒｏｓａ）種）、チューリップ（チューリップ属（Ｔｕｌｉｐａ）種）、ラッパズイセン（スイセン属（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）種）、ペチュニア（ツクバネアサガオ（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ））、カーネーション（カーネーション（Ｄｉａｎｔｈｕｓ ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ））、ポインセチア（ポインセチア（Ｅｕｐｈｏｒｂｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ））、およびキクが挙げられる。

【0101】

本開示を実施するにあたり使用可能な球果植物としては、例えば、テーダマツ（テーダマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ））、スラッシュパイン（スラッシュパイン（Ｐｉｎｕｓ ｅｌｌｉｏｔｉｉ））、ポンデローサマツ（ポンデローサマツ（Ｐｉｎｕｓ ｐｏｎｄｅｒｏｓａ））、ロッジポールパイン（コントルタマツ（Ｐｉｎｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔａ））、およびモントレーパイン（ラジアータパイン（Ｐｉｎｕｓ ｒａｄｉａｔａ））などのマツ；ダクラスファー（ベイマツ（Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ ｍｅｎｚｉｅｓｉｉ））；カナダツガ（カナダツガ（Ｔｓｕｇａ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ））；アメリカツガ（アメリカツガ（Ｔｓｕｇａ ｈｅｔｅｒｏｐｈｙｌｌａ））；マウンテンヘムロック（マウンテンヘムロック（Ｔｓｕｇａ ｍｅｒｔｅｎｓｉａｎａ））；アメリカカラマツまたはカラマツ（ラリックス・オキシデンタリス（Ｌａｒｉｘ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ））；ベイトウヒ（カナダトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ））；セコイア（セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ））；ヨーロッパモミ（アビエス・アマビリス（Ａｂｉｅｓ ａｍａｂｉｌｉｓ））およびバルサムモミ（バルサムモミ（Ａｂｉｅｓ ｂａｌｓａｍｅａ））などのトゥルーモミ；ならびにベイスギ（ベイスギ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ））およびイエローシーダー（イエローシーダー（Ｃｈａｍａｅｃｙｐａｒｉｓ ｎｏｏｔｋａｔｅｎｓｉｓ））などのシーダーが挙げられる。ユーカリ種、例えば、ユーカリプツス・グランディス（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）（および、その交配種「ウロガンディス（ｕｒｏｇｒａｎｄｉｓ）」）、ユーカリ・グロブルス（Ｅ．ｇｌｏｂｕｌｕｓ）、ユーカリ・カマルドレンシス（Ｅ．ｃａｍａｌｄｕｌｅｎｓｉｓ）、ユーカリ・テレチコルニス（Ｅ．ｔｅｒｅｔｉｃｏｒｎｉｓ）、ユーカリ・ビミナリス（Ｅ．ｖｉｍｉｎａｌｉｓ）、ユーカリ・ニテンス（Ｅ．ｎｉｔｅｎｓ）、ユーカリ・サリグナ（Ｅ．ｓａｌｉｇｎａ）およびユーカリ・ウロフィラ（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）を、本開示の実施において使用することができる。本開示の植物は、好ましくは、作物（例えば、トウモロコシ、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ダイズ、ワタ、ベニバナ、ラッカセイ、ソルガム、コムギ、キビ、タバコなど）であり、より好ましくは、トウモロコシ植物およびダイズ植物であり、より一層好ましくは、トウモロコシ植物である。

【0102】

特に目的とする植物としては、目的とする種子を提供する穀物植物、油糧種子植物およびマメ科植物が挙げられる。目的とする種子としては、限定はされないが、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ソルガムおよびライムギなどの穀物の種子が挙げられる。油糧種子植物としては、限定はされないが、ワタ、ダイズ、ベニバナ、アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、トウモロコシ、アルファルファ、パームおよびココナッツが挙げられ、マメ科植物としては、限定はされないが、マメおよびエンドウマメが挙げられる。マメとしては、グアー、イナゴマメ、コロハ、ダイズ、インゲンマメ、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメが挙げられる。

【0103】

ＩＩＩ．植物の形質および特性を向上させる方法
本開示は、高効率で形質転換された産生するための新規な組成物および方法を提供する。本か時の方法および組成物は、さらに、良好な形質および特性を与えるポリヌクレオチドを含む。したがって、本開示はさらに、植物を形質転換する方法であって、（ａ）植物由来の組織を、（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１もしくはｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２もしくはｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２もしくはｒ−ｖｉｒＤ１−Ｄ２、およびｖｉｒＧもしくはｒ−ｖｉｒＧ、またはそれらの多様体および誘導体を含む第１のベクターであって、ビルレンス遺伝子ｒ−ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｒ−ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｒ−ｖｉｒＤ１〜Ｄ２、およびｒ−ｖｉｒＧを含むベクターはさらにｒ−ｇａｌｌｓビルレンス遺伝子またはその多様体および誘導体を含むベクターと、Ｔ−ＤＮＡ境界配列、および植物に導入する目的ポリヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を提供する。

【0104】

本明細書で使用する場合、「形質」は、植物、または特定の植物材料もしくは植物細胞の生理学的、形態学的、生化学的または物理的特性を指す。いくつかの例において、この特性は、種子または植物体の大きさなど、ヒトの目で視ることができ、あるいは、種子もしくは葉に含まれるタンパク質、デンプンもしくは油の量を検出するなどの生化学的手法により、例えば、二酸化炭素の取り込み量を測定することによって、代謝もしくは生理的プロセスを観察することにより、例えば、ノーザン解析、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ遺伝子発現アッセイ、もしくはレポーター遺伝子発現システムを使用して、遺伝子もしくは遺伝子群の発現レベルを観察することにより、または、ストレス耐性、収量、病原体耐性などの農学的観察により測定することができる。本開示の態様の記載の中で使用する「形質の強化」には、は、例えば、水使用効率もしくは耐乾性の改善もしくは強化、浸透圧ストレス耐性、高塩分ストレス耐性、熱ストレス耐性、低温発芽耐性などの耐寒性の増大、収穫量の増大、窒素利用効率の強化、植物の早い成長および発達、植物の遅い成長および発達、種子タンパク質の増大、ならびに種子油の生産性の増大が含まれる。

【0105】

本開示の方法には任意の目的ポリヌクレオチドを使用することができる。目的とする表現型の様々な変化としては、限定はされないが、植物中の脂肪酸組成の変更、植物のアミノ酸含有量、デンプン含有量または炭水化物含有量の改変、植物の病原体防御機構の改変、実サイズの変更、スクロースの付加などが挙げられる。目的遺伝子はまた、栄養の取り込みの調節、およびフィチン酸塩遺伝子の発現の調節、特に、種子中のフィチン酸塩濃度を低下させるような調節に関与していてもよい。これらの結果は、植物において異種産物を発現させることにより、または内因性産物の発現を増大させることにより得ることができる。あるいは、これらの結果は、１種以上の内因性産物、特に、植物中の酵素または補因子の発現を低減させることにより得ることができる。これらの変化は、形質転換植物の表現型の変化をもたらす。

【0106】

目的遺伝子は、商業市場、および作物の開発に従事している者の関心を反映している。目的とする作物や市場が変わり、国の発展が世界市場を切り開くにつれ、新しい作物や技術もまた出現してくるであろう。さらに、収量や雑種強勢などの農学上の形質や特性に対する理解が深まるにつれ、形質転換のための遺伝子の選択もそれに応じて変化するであろう。目的遺伝子の一般的なカテゴリーとしては、例えば、ジンクフィンガーなどの情報に関与する遺伝子、キナーゼなどの伝達に関与する遺伝子、および熱ショックタンパク質などのハウスキーピングに関与する遺伝子が挙げられる。導入遺伝子のより具体的なカテゴリーとしては、例えば、農学、虫害抵抗性、病気抵抗性、除草剤抵抗性、不稔性、穀類特性および商業生産に重要な形質をコードする遺伝子が挙げられる。目的遺伝子としては、一般に、油、デンプン、炭水化物、または栄養の代謝に関与するもの、ならびに、実サイズ、スクロース量に影響するものが挙げられる。

【0107】

本開示の方法および組成物により標的組織に導入されたポリヌクレオチドは、適切なプロモーターに作動可能に連結することができる。標的組織としては、限定はされないが、体細胞胚、成熟種子、葉外植体、種子、懸濁培養物、胚、分裂組織部位、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、小胞子、および他の外植体が挙げられる。「プロモーター」は、転写開始点の上流のＤＮＡ領域を意味し、ＲＮＡポリメラーゼ、および転写を開始する他のタンパク質の認識および結合に関与している。「植物プロモーター」は、それが植物細胞由来であるか否かに関わりなく、植物細胞において転写を開始することができるプロモーターである。植物プロモーターの例としては、限定はされないが、植物、植物ウイルス、ならびにアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）またはリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）などの植物細胞で発現する遺伝子を含む細菌から得られるものが挙げられる。発生制御下のプロモーターの例としては、葉、根または種子などの特定の組織で優先的に転写を開始するプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは「組織優先的」を呼ばれる。特定の組織でのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」と呼ばれる。「細胞型」特異的プロモーターは、１種以上の器官の特定の細胞型、例えば根または葉の血管細胞における発現を主に駆動する。「誘導性」または「抑制性」プロモーターは、環境制御または外的制御下にあるプロモーターであり得る。誘導性プロモーターによる転写に影響し得る環境条件の例としては、嫌気的条件、特定の化学物質、または光の存在が挙げられる。あるいは、誘導性または抑制性のプロモーターの外的制御は、標的ポリペプチドとの相互作用によって、プロモーターを誘導または抑制する、適切な化学物質または他の薬剤を与えることによって影響され得る。組織特異的プロモーター、組織優先的プロモーター、細胞型特異的プロモーター、および誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーター類を構成する。「構成的」プロモーターは、ほとんどの条件下で活性を有するプロモーターである。本明細書で使用する場合、「アンチセンス配向」は、アンチセンス鎖が転写される方向で、プロモーターに作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列を指す。アンチセンス鎖は、内因性転写産物に十分に相補的であり、そのため内因性転写産物の翻訳は多くの場合抑制される。「作動可能に連結している」とは、単一の核酸断片上の２つ以上の核酸断片が、１つの断片の機能が他の断片に影響されるような関係にあることを指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）とき、そのプロモーターはコード配列に作動可能に連結している。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結することができる。

【0108】

油、デンプンおよびタンパク質の含有量などの農学的に重要な形質は、従来の育種方法に加え、遺伝子的に改変することができる。変更には、オレイン酸、飽和油および不飽和油の含有量の増加、リシンおよび硫黄濃度の上昇、必須アミノ酸の提供、またデンプンの変更が含まれる。ホルドチオニンタンパク質は、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第、５，８８５，８０２号明細書および同第５，９９０，３８９号明細書に記載されており、これらの文献は参照により本明細書に組み込まれる。他の例としては、米国特許第５，８５０，０１６号明細書に記載のダイズ２Ｓアルブミンによりコードされるリシンおよび／または硫黄リッチ種子タンパク質、ならびにＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６５：９９−１０６に記載の、オオムギ由来のキモトリプシン阻害剤がある（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。

【0109】

コード配列の誘導体は、予め選択したアミノ酸の、コードされたポリペプチドにおける濃度を高めるため、部位特異的変異誘発法によって作ることができる。例えば、ヒマワリの種子（Ｌｉｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｎ Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｆｏｏｄｓ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｆｅｅｄｓｔｕｆｆｓ，ｅｄ．Ａｐｐｌｅｗｈｉｔｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｏｉｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｃｈａｍｐａｉｇｎ，Ｉｌｌ．）、ｐｐ．４９７−５０２；この文献は参照により本明細書に組み込まれる）；トウモロコシ（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６２７９；Ｋｉｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ ７１：３５９；これらの両文献は参照により本明細書に組み込まれる）；およびイネ（Ｍｕｓｕｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：１２３、この文献は参照により本明細書に組み込まれる）などからのメチオニンリッチ植物タンパク質を使用することができよう。他の農学的に重要な遺伝子は、ラテックス、Ｆｌｏｕｒｙ ２、成長因子、種子貯蔵因子および転写因子をコードする。

【0110】

虫害抵抗性遺伝子は、穀粒収穫量の低下（ｙｉｅｌｄ ｄｒａｇ）をもたらす重大な作物被害を引き起こす根切り虫、ヨトウムシ、ヨーロッパアワノメイガなどの害虫に対する耐性を付与することができる。このような遺伝子としては、例えば、バチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）毒性タンパク質遺伝子（米国特許第５，３６６，８９２号明細書、同第５，７４７，４５０号明細書、同第５，７３６，５１４号明細書、同第５，７２３，７５６号明細書、同第５，５９３，８８１、およびＧｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ ４８：１０９）などが挙げられる。

【0111】

病気抵抗性形質をコードする遺伝子としては、解毒遺伝子、例えばフモニシンに対する解毒遺伝子（米国特許第５，７９２，９３１号明細書）；非病原性（ａｖｒ）および病気抵抗性（Ｒ）遺伝子（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７８９；Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１４３２；およびＭｉｎｄｒｉｎｏｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７８：１０８９）などが挙げられる。

【0112】

除草剤抵抗性形質としては、アセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）の働きを阻害するように作用する除草剤、特に、スルホニル尿素系除草剤に対する抵抗性をコードする遺伝子（例えば、そのような抵抗性に導く変異、特にＳ４および／またはＨｒａ変異を含むアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）遺伝子）、グルタミン合成酵素の働きを阻害するように作用する除草剤、例えば、ホスフィノスリシンもしくはバスタ（例えば、ｂａｒ遺伝子）、またはグリホサート（例えば、ＥＰＳＰＳ遺伝子およびＧＡＴ遺伝子；例えば、米国特許出願公開第２００４／００８２７７０号明細書および国際公開第０３／０９２３６０号パンフレットを参照）に対する抵抗性をコードする遺伝子、あるいは当該技術分野で知られる他のそのような遺伝子を挙げることができる。ｂａｒ遺伝子は除草剤ｂａｓｔａに対する耐性をコードし、ｎｐｔＩＩ遺伝子は抗生物質カナマイシンおよびｇｅｎｅｔｉｃｉｎに対する耐性をコードし、ＡＬＳ遺伝子変異体は除草剤クロロスルフロンに対する耐性をコードする。

【0113】

不稔性遺伝子はまた、発現カセットにおいてコードされ、物理的な雄穂除去に代わる方法として提供され得る。そのような方法に使用される遺伝子の例としては、雄性組織優先性遺伝子、および米国特許第５，５８３，２１０号明細書に記載されているＱＭなどの雄性不稔性表現型を有する遺伝子が挙げられる。他の遺伝子としては、キナーゼ、および雄性または雌性の配偶体の成長に有害な化合物をコードするものが挙げられる。

【0114】

穀類の品質は、油の濃度や種類、飽和および不飽和、必須アミノ酸の質および量、ならびにセルロースの濃度などの形質に反映される。トウモロコシでは、改変ホルドチオニンタンパク質が、米国特許第５，７０３，０４９号明細書、同第５，８８５，８０１号明細書、同第５，８８５，８０２号明細書および同第５，９９０，３８９号明細書に記載されている。

【0115】

商業的形質もまた、例えばエタノール産生用デンプンなどの形質組成物の改善、またはタンパク質発現の増強のための遺伝子もしくは遺伝子群でコードされ得る。形質転換植物の他の重要な商業利用は、米国特許第５，６０２，３２１号明細書に記載されているようなポリマーおよびバイオプラスチックの生成である。β−ケトチオラーゼ、ＰＨＢ酵素（ポリヒドロキシ酪酸合成酵素）、およびアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素（Ｓｃｈｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０：５８３７−５８４７を参照）などの遺伝子は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）の発現を促進する。

【0116】

外因性産物としては、植物酵素および植物性産物、ならびに、原核生物および他の真核生物などの、他のソースからのものが挙げられる。そのような産物としては、酵素、補因子、ホルモンなどが挙げられる。タンパク質の濃度、特に、アミノ酸分布を改善して植物の栄養価を高めた改変タンパク質の濃度を上昇させることができる。これは、アミノ酸含有量を増大させたそのようなタンパク質の発現によって達成される。

【0117】

一態様において、標的組織に高効率かつ高速で導入することができるさらなる目的農業形質は、収穫量の増大などの形質、または植物価値を高めるその他の形質、例えば種子の品質の向上などである。特に興味深い形質は、水使用効率もしくは耐乾性の改善もしくは強化、収穫量の増大、窒素利用効率の強化、植物の早い成長および発達、植物の遅い成長および発達、種子タンパク質の増大、ならびに種子油の生産性の増大である。

【0118】

多くの農業形質、「収穫」、例えば、限定はされないが、植物の高さ、莢の数、植物体における莢の位置、節間部の数、莢の破損の発生率、穀粒の大きさ、根粒形成効率および窒素固定効率、栄養の消化効率、生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する耐性、炭素同化、植物構造、耐倒伏性、種子の発芽率、苗の成長力、ならびに幼植物の形質が、「収穫」に影響を及ぼし得る。収穫に影響を及ぼし得る他の形質としては、発芽効率（たとえば、ストレス条件下での発芽効率）、成長速度（例えば、ストレス条件下での成長速度）、穂の数、穂１個当たりの種子数、種子の大きさ、種子の組成（デンプン、油、タンパク質）、登塾特性が挙げられる。全植物の収穫量を増大させるか否かはわからないが、所望の表現型特性を示すトランスジェニック植物の世代もまた目的とされる。そのような特性としては、植物形態学的増強、植物生理学的増強、またはトランスジェニック植物から得られる成熟種子の成分の改善が挙げられる。

【0119】

本開示のトランスジェニック植物の「収穫量の増大」は、多くの方法、例えば、重量の測定、１植物体当たりの種子数、種子重量、単位面積当たりの種子数（すなわち、１エーカー当たりの種子、もしくは種子重量）、１エーカー当たりのブッシェル数、１エーカー当たりのトン数、および１へクタールあたりのキロ数で評価し測定することができる。例えば、トウモロコシの収穫量は、例えば、１エーカー当たりのブッシェル数または１へクタール当たりのメートルトン数を単位とした、生産面積１単位当たりの、皮を剥いたトウモロコシ粒の産生量として測定することができ、それは、多くの場合、水分調節ベースで、例えば、水分１５．５％で報告される。収穫量の増大は、キーとなる生化学化合物、例えば、窒素、リンおよび炭水化物などの利用の改善、または、環境ストレス、例えば、寒さ、熱、乾燥、塩分、および害虫もしくは病原体などに対する耐性の向上によりもたらされ得る。形質強化組み換えＤＮＡはまた、植物成長調節物質の発現の改変、または細胞周期もしくは光合成経路の変更の結果として、成長調節物質成長および発達が改善され、ひいては収穫量が増大するトランスジェニック植物を提供するために使用することができる。

【0120】

多くの農業形質、例えば、限定はされないが、植物の高さ、莢の数、植物体における莢の位置、節間部の数、莢の破損の発生率、穀粒サイズ、根粒形成効率および窒素固定効率、栄養の消化効率、生物的ストレスおよび非生物的ストレスに対する耐性、炭素同化、植物構造、耐倒伏性、種子の発芽率、苗の成長力、ならびに幼植物の形質が、「収穫」に影響を及ぼし得る。収穫に影響を及ぼし得る他の形質としては、限定はされないが、発芽効率（たとえば、ストレス条件下での発芽効率）、成長速度（例えば、ストレス条件下での成長速度）、穂の数、穂１個当たりの種子数、種子の大きさ、種子の組成（デンプン、油、タンパク質）、登塾特性が挙げられる。全植物の収穫量を増大させるか否かはわからないが、所望の表現型特性を示すトランスジェニック植物の世代もまた目的とされる。そのような特性としては、限定はされないが、植物形態学的増強、植物生理学的増強、またはトランスジェニック植物から得られる成熟種子の成分の改善が挙げられる。

【0121】

ＩＶ．遺伝子の抑制方法
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物細胞由来の植物中の標的遺伝子の抑制に有用なポリヌクレオチドをその植物細胞に導入するために使用することができる。植物における遺伝子操作のいくつかの態様では、特定の遺伝子の活性低下（遺伝子サイレンシングまたは遺伝子抑制としても知られる）が望まれる。多くの遺伝子サイレンシング技術が当業者に知られており、例えば、限定はされないが、アンチセンス技術（例えば、Ｓｈｅｅｈｙ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８８０５−８８０９、ならびに米国特許第５，１０７，０６５号明細書、同第５，４５３，５６６号明細書および同第５，７５９，８２９号明細書を参照）；コサプレッション（例えば、Ｔａｙｌｏｒ（１９９７）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９：１２４５、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．８（１２）：３４０−３４４、Ｆｌａｖｅｌｌ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３４９０−３４９６、Ｆｉｎｎｅｇａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８８３−８８８およびＮｅｕｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４４：２３０−２４１）；ＲＮＡ干渉（Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９、米国特許第５，０３４，３２３号明細書；Ｓｈａｒｐ（１９９９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３：１３９−１４１、Ｚａｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｅｌｌ １０１：２５−３３、Ｊａｖｉｅｒ（２００３）Ｎａｔｕｒｅ ４２５：２５７−２６３、およびＭｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１５５０２−１５５０７）；ウイルス誘導遺伝子サイレンシング（Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １２：６９１−７０５、およびＢａｕｌｃｏｍｂｅ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏ．２：１０９−１１３）；標的ＲＮＡ特異的リボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１）；ヘアピン構造（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０７：３１９−３２０、国際公開第ＷＯ９９／５３０５０号パンフレット、同第０２／００９０４号パンフレットおよび同第９８／５３０８３号パンフレット）；リボザイム（Ｓｔｅｉｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：１５２５、米国特許第４，９８７，０７１号明細書、およびＰｅｒｒｉｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．３：２５３）；オリゴヌクレオチド媒介標的改変（例えば、国際公開第０３／０７６５７４号パンフレットおよび同第９９／２５８５３号パンフレット）；Ｚｎフィンガー標的分子（例えば、国際公開第０１／５２６２０号パンフレット、同第０３／０４８３４５号パンフレットおよび同第００／４２２１９号パンフレット）；人工マイクロＲＮＡ（ＵＳ８１０６１８０、Ｓｃｈｗａｂ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １８：１１２１−１１３３）；および当業者に知られる他の方法、または上記方法の組み合わせが挙げられる。

【0122】

Ｖ．ゲノム編集技術を植物へ導入する方法
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物細胞由来の植物体のゲノムの改変に特異的な部位を標的とするのに有用なポリヌクレオチドをその植物細胞に導入するために使用することができる。本開示の方法および組成物によって導入することができる部位特異的改変としては、部位特異的改変を導入する任意の方法によるもの、例えば、限定はされないが、遺伝子修復オリゴヌクレオチドの使用（例えば、米国特許出願公開第２０１３／００１９３４９号明細書）、または、ＴＡＬＥＮ、マガヌクレオチド、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓなどの二本鎖切断技術によるものが挙げられる。例えば、植物細胞もしくは植物細胞由来の植物のゲノム中の標的配列の改変のために、植物を選択するために、塩基または配列を欠失させるために、遺伝子編集のために、そして目的ポリヌクレオチドを植物細胞由来の植物のゲノムに挿入するために、本開示の方法および組成物を使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを植物細胞へ導入することができる。したがって、本開示の方法および組成物は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムと共に使用して、植物体、植物細胞または種子のゲノム中の標的部位および目的ヌクレオチドを変更または改変するのに提供することができる。

【0123】

一態様において、本開示は、形質転換のための方法および組成物であって、（ａ）植物細胞を、（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ遺伝子を含む第１のベクターと；ガイドヌクレオチドを発現することができる第２のベクターと；Ｃａｓエンドヌクレアーゼを発現することができる第３のコンストラクトとを含み、ガイドヌクレオチドおよびＣａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼの標的部位における二本鎖切断を可能にする複合体を形成することができるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含む方法を含む。

【0124】

一態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼであり、その植物最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、植物ゲノムのゲノム標的配列に結合し、二本鎖を作ることができる。

【0125】

Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドにガイドされ、植物細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、植物体、植物細胞または種子のゲノム中の標的部位の改変に有効なシステムを提供する。さらに、細胞のゲノム中の標的部位の改変、細胞のゲノム中のヌクレオチドの編集に有効なガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステムを用いる方法および組成物を提供する。ゲノム標的部位が特定されたなら、様々な方法を用いて、様々な目的ポリヌクレオチドを含むように標的部位をさらに改変することができる。本発明の組成物および方法を使用して、細胞のゲノム中のヌクレオチド配列の編集を行うＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを導入することができる。編集されるべきヌクレオチド配列（目的ヌクレオチド配列）は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって認識される標的部位中にあっても標的部位外にあってもよい。

【0126】

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座（クラスター化等間隔短鎖回文リピート）（ＳＰＩＤＲ―スペーサー散在型ダイレクトリピートとしても知られる）は、最近記載されたＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、短く、かつ高度に保存されたＤＮＡリピート（通常２４〜４０ｂｐ、１〜１４０回の繰り返し―ＣＲＩＳＰＲリピートとも呼ばれる）から構成され、部分的に回文を形成している。反復配列（通常、種に固有である）間は一定の長さの可変配列（通常、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に依り２０〜５８ｂｐ）がスペーサーとして存在している（国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット、２００７年３月１日公開）。

【0127】

ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は最初にエシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉにおいて見出された（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１６９：５４２９−５４３３；Ｎａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１７１：３５５３−３５５６を参照）。同様の間隔短配列リピートが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）で特定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１０：１０５７−１０６５、Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：２５４−２６３、Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１３０７：２６−３０、Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７：８５−９３）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座はリピート配列の構造により他のＳＳＲと異なり、短等間隔リピート（ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔ）（ＳＲＳＲ）と呼ばれていた（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００２）ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．６：２３−３３、Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４−２４６）。リピートは、クラスターの形態で生じる短い要素であり、常に一定の長さの可変配列により等しい間隔をおいて存在している（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：２４４−２４６）。

【0128】

Ｃａｓ遺伝子としては、フランキングするＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に結合して、関連して、または近接もしくは隣接して存在する。用語「Ｃａｓ遺伝子」および「ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子」は、本明細書では互換的に使用される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの包括的レビューは、Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ １（６）：ｅ６０．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｃｂｉ．００１００６０に記載されている。

【0129】

４つの当初記載された遺伝子ファミリーに加え、さらに４１のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子ファミリーが、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットに示されており、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。この文献には、ＣＲＩＳＰＲシステムが、異なるリピート配列パターン、遺伝子群および種の範囲を有する異なる分類に属することが示されている。所与のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座におけるＣａｓ遺伝子の数は、種によって変わり得る。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ遺伝子によってコードされるＣａｓタンパク質と関連しており、Ｃａｓタンパク質は、ＤＮＡ標的配列へ二本鎖切断を導入することができる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ガイドヌクレオチドにガイドされ、細胞のゲノムの特定の標的部位を認識し、場合により二本鎖切断を導入する。本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド／Ｃａｓエンドヌクレアーゼシステム」には、ＤＮＡ標的部位に二本鎖切断を導入することができる、Ｃａｓエンドヌクレアーゼとガイドポリヌクレオチドとの複合体が含まれる。Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、ゲノム標的部位に近接したＤＮＡ二本鎖をほどき、標的配列を認識すると同時に、正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が標的配列の３’末端に位置している限り、２本のＤＮＡ鎖をガイドヌクレオチドによって切断する（２０１５年２月２６日公開の国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットの図２Ａおよび図２Ｂを参照）。

【0130】

一態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、限定されないが、２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット（この文献は参照によって本明細書に組み込まれる）に挙げられ開示されているＣａｓ９遺伝子である。他の態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、植物、トウモロコシまたはダイズ最適化Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えば、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットに開示されたものである。他の態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、Ｃａｓコドン領域上流のＳＶ４０核標的シグナル、およびＣａｓコドン領域下流の二分核定位シグナル（Ｔｉｎｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７４４２−６）に作動可能に結合している。

【0131】

一態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、国際公開第２０１５／０２６８８３号パンフレットに開示されている、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ遺伝子、またはその機能的断片もしくは多様体である。
用語「機能的断片」、「機能的に等価である断片」および「機能的に等価な断片」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの一部またはサブ配列を指す。

【0132】

用語「機能的多様体」、「機能的に等価である多様体」および「機能的に等価な多様体」は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、二本鎖切断を起こす能力が保持されている、本開示のＣａｓエンドヌクレアーゼの多様体を指す。断片および多様体および誘導体は、部位特異的変異誘発法および合成構築などの方法によって得ることができる。

【0133】

一態様において、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ遺伝子は、標的とし得るＮ（１２−３０）ＮＧＧ型の任意のゲノム配列を認識することができる、植物コドン最適化ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子である。

【0134】

エンドヌクレアーゼは、ポリヌクレオチド鎖のリン酸ジエステル結合を切断する酵素であり、塩基を損傷することなく特定の部位でＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼを含む。制限エンドヌクレアーゼは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型およびＩＶ型エンドヌクレアーゼを含み、これらはさらに亜型を含む。Ｉ型およびＩＩＩ型系においては、メチラーゼ活性および制限活性の両活性が単一複合体内に含まれる。エンドヌクレアーゼはまた、ホーミングヌクレアーゼ（ＨＥ酵素）としても知られるメガヌクレアーゼを含み、この酵素は、制限エンドヌクレアーゼのように、特定の認識部位に結合し切断するが、メガヌクレアーゼの認識部位は通常長く、約１８ｂｐ以上である。（２０１２年３月２２日出願の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／３００６１）。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、それらのファミリーは、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、Ｈ−Ｎ−ＨおよびＨｉｓ−Ｃｙｓボックスのファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位およびリン酸ジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、その長い認識部位と、そのＤＮＡ基質の配列多型性を許容していることで知られている。メガヌクレアーゼの命名規則は、他の制限エンドヌクレアーゼの規則と類似している。メガヌクレアーゼはまた、それぞれ独立ＯＲＦ、イントロンおよびインテインによってコードされる酵素に対して付される接頭辞のＦ−、Ｉ−またはＰＩ−で特徴付けられる。遺伝子組み換えプロセスの１つの工程は、認識部位またはその近傍でのポリヌクレオチドの切断を含む。この切断活性は、二本鎖の切断に使用され得る。部位特異的リコンビナーゼおよびその認識部位のレビューには、Ｓａｕｅｒ（１９９４）Ｃｕｒｒ Ｏｐ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ５：５２１−７、およびＳａｄｏｗｓｋｉ（１９９３）ＦＡＳＥＢ ７：７６０−７を参照されたい。いくつかの例では、リコンビナーゼは、インテグラーゼファミリーまたはリゾルバーゼファミリーからのものである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、植物または他の有機体のゲノム中の特定の標的配列での二本鎖切断に使用することができる配列特異的ヌクレアーゼの新しい分類である。（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２９：１４３−１４８）．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび二本鎖切断誘発物質ドメインからなる人工の二本鎖切断誘発物質である。認識部位特異性は、ジンクフィンガードメインによって与えられ、このジンクフィンガードメインは、通常、例えば、Ｃ２Ｈ２構造を有する、２、３または４つのジンクフィンガーを含むが、しかしながら他のジンクフィンガー構造も知られており、作られてきている。ジンクフィンガードメインは、選択されたポリヌクレオチド認識配列に特異的に結合するポリペプチドの設計に適している。ＺＦＮとしては、非特異的エンドヌクレアーゼドメインに結合した人工ＤＮＡ結合ジンクフィンガードメイン、例えば、ＦｏｋｌなどのＭｓ型エンドヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインが挙げられる。さらなる機能性は、ジンクフィンガー結合ドメイン、例えば、転写活性因子ドメイン、転写抑制因子ドメインおよびメチラーゼに融合することができる。いくつかの例では、切断活性にヌクレアーゼドメインの二量体化が要求される。核ジンクフィンガーは、標的ＤＮＡの３つの連続する塩基対を認識する。例えば、３フィンガードメインは、二量体化の際に結合する９個の連続するヌクレオチドからなる配列を認識し、２組のジンクフィンガートリプレットが、１８個のヌクレオチドからなる認識配列に結合するために使用される。

【0135】

細菌および古細菌は、短鎖ＲＮＡを使用して外来核酸を分解する、クラスター化等間隔短鎖回文リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）システムと呼ばれる適応免疫防御を進化させた（２００７年３月１日公開の国際公開第２００７／０２５０９７号パンフレット）。細菌由来のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣａｓエンドヌクレアーゼをＤＮＡ標的へガイドするのにｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを使用する。ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）は、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に相補的な領域と、ＣａｓエンドヌクレアーゼにＤＮＡ標的を切断させるＲＮＡ二本鎖を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を有する塩基対とを含む。

【0136】

本明細書で使用する場合、用語「ガイドヌクレオチド」は、２つのＲＮＡ分子、可変標的領域を含むｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）およびｔｒａｃｒＲＮＡの合成的融合に関する。一態様において、ガイドヌクレオチドは、１２〜３０ヌクレオチド配列からなる可変標的ドメインと、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと相互作用し得るＲＮＡ断片とを含む。

【0137】

本明細書で使用する場合、用語「ガイドポリヌクレオチド」は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成し、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位を認識し、場合により切断することを可能にするポリヌクレオチド配列に関連している。このガイドポリヌクレオチドは一本鎖分子であっても二本鎖分子であってもよい。ガイドポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはこれらの組み合わせ（ＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列）であってよい。任意選択で、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１個のヌクレオチド、ホスホジエステル結合または連結修飾を含むことができ、この連結修飾として、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣ、２，６−ジアミノプリン、２’−フルオロＡ、２’−フルオロＵ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８（ヘキサエチレングリコール鎖）分子への連結、または環化をもたらす５’から３’への共有結合的連結が挙げられるがこれらに限定されない。リボ核酸のみを含むガイドポリヌクレオチドもまた、「ガイドヌクレオチド」と称される。

【0138】

ガイドポリヌクレオチドは、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変ターゲティングドメインまたはＶＴドメインとも呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインとも呼ばれる）とを含む二本鎖分子（二本鎖ガイドポリヌクレオチドとも呼ばれる）であってよい。この二本鎖分子ガイドポリヌクレオチドのＣＥＲドメインは、相補領域に沿ってハイブリダイズされる２個の個別の分子を含む。この２個の個別の分子は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であってよい。一態様においては、ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第１の分子は、「ｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、「ｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、または「ｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。ｃｒヌクレオチドは、細菌中および古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片を含むことができる。一態様においては、本明細書で開示するｃｒヌクレオチド中に存在する細菌中および古細菌中に天然に存在するｃＲＮＡの断片のサイズは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個またはそれ以上のヌクレオチドから変動することができるがこれらに限定されない。

【0139】

一態様においては、ＣＥＲドメインを含む二本鎖ガイドポリヌクレオチドの第２の分子は、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、「ｔｒａｃｒＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）「ｔｒａｃｒＤＮＡ」、または「ｔｒａｃｒＤＮＡ−ＲＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドとＲＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称される。一態様においては、ＲＮＡ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。

【0140】

ガイドポリヌクレオチドはまた、標的ＤＮＡのヌクレオチド配列に相補的な第１のヌクレオチド配列ドメイン（可変標的ドメインまたはＶＴドメインと呼ばれる）と、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用する第２のヌクレオチド配列ドメイン（Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメインまたはＣＥＲドメインと呼ばれる）とを含む一本鎖分子であってもよい。「ドメイン」は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列および／またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列であり得るヌクレオチドの連続区間を意味する。一本鎖ガイドポリヌクレオチドのＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインは、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一態様においては、一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインを含む）に連結されているｃｒヌクレオチド（ＣＥＲドメインに連結されているＶＴドメインを含む）を含み、この連結は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むヌクレオチド配列である。ｃｒヌクレオチド由来の配列およびｔｒａｃｒヌクレオチド由来の配列で構成されている一本鎖ガイドポリヌクレオチドは、「一本鎖ガイドヌクレオチド」（ＲＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、「一本鎖ガイドＤＮＡ」（ＤＮＡヌクレオチドの連続区間で構成されている場合）、または「一本鎖ガイドヌクレオチド−ＤＮＡ」（ＲＮＡヌクレオチドとＤＮＡヌクレオチドとの組み合わせで構成されている場合）と称することができる。本開示の一態様においては、一本鎖ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡまたはｃＲＮＡ断片、およびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ断片を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。二本鎖ガイドポリヌクレオチドと対比して一本鎖ガイドポリヌクレオチドを使用する一態様は、一本鎖ガイドポリヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。

【0141】

用語「可変標的ドメイン」または「ＶＴドメイン」は本明細書において互換的に使用され、二本鎖ＤＮＡ標的部位の一方の鎖（ヌクレオチド配列）に相補的であるヌクレオチド配列を含む。第１のヌクレオチド配列ドメイン（ＶＴドメイン）と標的配列との間の％相補性は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６３％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％であり得る。可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり得る。一態様においては、可変ターゲティングドメインは１２〜３０ヌクレオチドからなる連続区間を含む。可変標的ドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。

【0142】

ガイドポリヌクレオチドの用語「Ｃａｓエンドヌクレアーゼ認識ドメイン」または「ＣＥＲドメイン」は本明細書において互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼポリペプチドと相互作用するヌクレオチド配列（例えば、ガイドポリヌクレオチドの第２のヌクレオチド配列ドメイン）を含む。ＣＥＲドメインは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、改変ＤＮＡ配列、改変ＲＮＡ配列（例えば、本明細書に記載する改変を参照されたい）、またはこれらの任意の組み合わせで構成され得る。

【0143】

一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ−ＤＮＡ組み合わせ配列を含むことができる。一態様においては、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列の長さは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００個のヌクレオチドであり得る。他の態様では、一本鎖ガイドポリヌクレオチドのｃｒヌクレオチドとｔｒａｃｒヌクレオチドとを連結するヌクレオチド配列は、限定はされないが、ＧＡＡＡテトラループ配列などのテトラループ配列を含み得る。

【0144】

ガイドポリヌクレオチド、ＶＴドメインおよび／またはＣＥＲドメインのヌクレオチド配列改変は、５’キャップ、３’ポリアデニル化テイル、リボスイッチ配列、安定した制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成する配列、ガイドポリヌクレオチドの標的を細胞内位置に設定する改変または配列、トラッキングが生じる改変または配列、タンパク質用の結合部位が生じる改変または配列、ロックド核酸（ＬＮＡ）、５−メチルｄＣヌクレオチド、２，６−ジアミノプリンヌクレオチド、２’−フルオロＡヌクレオチド、２’−フルオロＵヌクレオチド；２’−Ｏ−メチルＲＮＡヌクレオチド、ホスホロチオエート結合、コレステロール分子への連結、ポリエチレングリコール分子への連結、スペーサー１８分子への連結、５’から３’への共有結合的連結、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択することができるが、これらに限定されない。これらの改変により、少なくとも１種の追加の有利な特徴をもたらすことができ、この追加の有利な特徴は、安定性の変更または調節、細胞内ターゲティング、トラッキング、蛍光標識、タンパク質用またはタンパク質複合体用の結合部位、相補的な標的配列に対する結合親和性の変更、細胞分解に対する耐性の変更、および細胞透過性の増大の群から選択される。

【0145】

種々の態様において、ガイドヌクレオチドとＣａｓエンドヌクレアーゼとは、ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＮＡ標的部位で二本鎖切断を導入するのを可能にする複合体を形成することができる。

【0146】

種々の態様において、可変標的ドメインの長さは、少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０ヌクレオチドであり得る。

【0147】

種々の態様において、ガイドヌクレオチドは、ＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼと複合体を形成することができるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのｃＲＮＡ（またはｃＲＮＡ断片）およびｔｒａｃｒＲＮＡ（またはｔｒａｃｒＲＮＡ断片）を含み、このガイドヌクレオチドＣａｓエンドヌクレアーゼ複合体は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを植物ゲノム標的部位へと誘導することができ、Ｃａｓエンドヌクレアーゼがこのゲノム標的部位に二本鎖切断を導入することを可能にする。一態様において、ガイドヌクレオチドは、当該技術分野で知られた任意の方法、例えば、限定はされないが、粒子衝撃法または局所的適用法により植物体または植物細胞に導入することができる。

【0148】

種々の態様において、ガイドヌクレオチドは、植物細胞中でガイドヌクレオチド転写することができる、植物特異的プロモーターに作動可能に結合した、対応するガイドＤＮＡ配列を含む組み換えＤＮＡ分子を導入することによって、間接的に導入することができる。用語「対応するガイドＤＮＡ」は、ＲＮＡ分子の各「Ｕ」が「Ｔ」に置き替えられている以外はＲＮＡ分子と同じＤＮＡ分子を含む。

【0149】

種々の態様において、ガイドヌクレオチドは、粒子衝撃法により、または、植物Ｕ６ポリメラーゼＩＩＩプロモーターに作動可能に結合した、対応するガイドＤＮＡを含む組み換えＤＮＡコンストラクトをアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）により形質転換するための方法および組成物によって導入される。

【0150】

種々の態様において、ＲＮＡ Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ複合体をガイドするＲＮＡは、二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二本鎖ＲＮＡである。二本鎖ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡに対してガイドヌクレオチドを使用する利点の１つは、融合ガイドヌクレオチドを発現させるために作製する必要がある発現カセットが１種のみであるということである。

【0151】

用語「標的部位」、「標的配列」、「標的ＤＮＡ」、「標的遺伝子座」、「ゲノム標的部位」、「ゲノム標的配列」および「ゲノム標的遺伝子座」は、本明細書では互換的に使用され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼによって植物細胞ゲノムで二本鎖切断が誘発される、植物細胞ゲノム中のポリヌクレオチド配列（葉緑体ＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡを含む）を指す。標的部位は植物ゲノム中の内在性部位であり得、あるいは、標的部位は植物体に対して異種であり得、そのためゲノム中に天然には存在していない、あるいは標的部位は天然で生じる場所と比較して異種のゲノム位置で見出すことができる。

【0152】

本明細書で使用する場合、用語「内在性標的配列」および「天然標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物ゲノムに対して内在性または天然性のものであり、かつ植物ゲノム中の標的配列の内在性または天然の位置に存在する標的配列を指す。一態様において、標的部位は、ＤＮＡ認識部位、または特異的に認識し、かつ／または、ＬＩＧ３−４エンドヌクレアーゼ（２００９年５月２１日公開の米国特許出願公開第２００９／０１３３１５２Ａ１号明細書）、もしくはＭＳ２６＋＋メガヌクレアーゼ（２０１２年６月１９日出願の米国特許出願第１３／５２６９１２号明細書）などの二本鎖切断誘発物質によって結合する標的部位に類似する部位であり得る。

【0153】

「人工標的部位」または「人工標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、植物のゲノム中に導入された標的配列を指す。そのような人工標的配列は、植物ゲノム中の内在性標的配列または天然標的配列と配列が同じであり得、しかし、植物ゲノム中の異なる場所（すなわち、非内在性または非天然の場所）に存在し得る。

【0154】

「改変標的部位」、「改変標的配列」、「変更標的部位」および「変更標的配列」は、本明細書では互換的に使用され、非改変標的配列を比較したとき、少なくとも１つの改変を含む本明細書に開示の標的部位を指す。そのような「改変」としては、例えば、（ｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの置換、（ｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、（ｉｉｉ）少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、または（ｉｖ）（ｉ）〜（ｉｉｉ）の任意の組み合わせが挙げられる。

【0155】

ＶＩ．部位特異的組み込みのためのヌクレオチドの導入法
一態様において、本開示の方法および組成物は、植物細胞由来の植物体へのヌクレオチド配列の標的組み込みに有用なポリヌクレオチドを、高効率かつ高速に植物細胞へ導入するために使用することができる。例えば、本開示の方法および組成物は、標的部位を含む植物体を形質転換するために、非同一組み換え部位が隣接する目的ヌクレオチド配列を含むトランスファーカセットを導入するのに使用することができる。一態様では、標的部位は、トランスファーカセット上のそれに対応した、非同一組み換え部位を少なくとも１セット含む。組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列の置換は、リコンビナーゼにより影響を受ける。このように、本開示の方法および組成物は、ヌクレオチド配列の標的組み込みのためのトランスファーカセットの導入に使用することができ、非同一組み換え部位が隣接するトランスファーカセットは、非同一組み換え部位を認識し、非同一組み換え部位で組み換えを行うリコンビナーゼにより認識される。したがって、本開示の方法および組成物は、植物細胞由来の、非同一組み換え部位を含有する植物体の生長の効率および速度の改善に使用することができる。

【0156】

一態様では、本開示はさらに、植物の形質転換方法であって、植物細胞のゲノム中の標的部位へ目的ポリヌクレオチドを導入することを含み、（ａ）植物体からの外植体を、（ｉ）エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種において増殖し、かつ安定に保持されるための複製起点；（ｉｉｉ）選択マーカー遺伝子；ならびに（ｉｖ）アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ビルレンス遺伝子ｖｉｒＢ１〜Ｂ１１、ｖｉｒＣ１〜Ｃ２、ｖｉｒＤ１〜Ｄ２およびｖｉｒＧ遺伝子を含む第１のベクターと；非同一組み換え部位が隣接した目的ポリヌクレオチドを含むトランスファーカセットを含む第２のベクターとを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と接触させる工程と；（ｂ）組織をアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と共培養する工程と；（ｃ）目的ポリヌクレオチド配列を発現する組織から形質転換された植物体を再生する工程とを含み、その外植体が、トランスファーカセットの隣接部位に対応する、非同一組み換え部位が隣接した標的部位を含むゲノムを有する植物体に由来するものである方法を提供する。この方法はさらに、非同一組み換え部位を認識し、非同一組み換え部位で組み換えを行うリコンビナーゼを提供する工程を含むことができ、このリコンビナーゼは植物外植体、体細胞胚由来の小植物、または植物細胞由来の小植物から得られた植物体に提供される。

【0157】

このように、本開示の方法および組成物は、外因性ヌクレオチドの形質転換植物への、方向性を有する標的組み込みを行うための組成物および方法をさらに含むことができる。一態様では、本開示の方法は、目的の遺伝子およびヌクレオチド配列の、以前に標的植物ゲノムに導入した対応する組み換え部位への、方向性を有するターゲティングを促進する遺伝子ターゲティングシステムにおいて、新規の組み換え部位を使用する。

【0158】

一態様では、２つの非同一組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列が、目的ヌクレオチド配列の挿入のために標的部位が設けられた、標的生物のゲノム由来の外植体の１つ以上の細胞に導入される。安定な植物体または培養組織が確立されたなら、標的部位に隣接している組み換え部位に対応する部位が隣接した第２のコンストラクト、すなわち目的ヌクレオチド配列が、リコンビナーゼタンパク質の存在下に、安定に形質転換された植物体または組織に導入される。このプロセスで、標的部位の非同一組み換え部位とトランスファーカセットの間でヌクレオチド配列の置換が起こる。

【0159】

この方法で調製された形質転換植物体は、複数の標的部位、すなわち、非同一組み換え部位のセットを含み得ると認められる。この方法では、形質転換植物体の標的部位に対して複数の操作を行うことができる。形質転換植物体の標的部位とは、形質転換植物体のゲノムに挿入された、非同一組み換え部位を含むＤＮＡ配列を意味する。

【0160】

本開示の方法で使用する組み換え部位の例は当該技術分野で知られており、例えば、ＦＲＴ部位（例えば、Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１２７４６−１２７５１；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９：４４３−４４８；Ｐａｕｌ Ｄ．Ｓａｄｏｗｓｋｉ（１９９５）Ｉｎ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．５１，ｐｐ．５３−９１；Ｍｉｃｈａｅｌ Ｍ．Ｃｏｘ（１９８９）Ｉｎ Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ，Ｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈｏｗｅ（ｅｄｓ）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ｐｐ．１１６−６７０；Ｄｉｘｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）１８：４４９−４５８；Ｕｍｌａｕｆ ａｎｄ Ｃｏｘ（１９８８）Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ７：１８４５−１８５２；Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４：３１１８−３１１９；Ｋｉｌｂｙ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．９：４１３−４２１：Ｒｏｓｓａｎｔ ａｎｄ Ｇｅａｇｙ（１９９５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：５９２−５９４；Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：６４９−６５９：Ｂａｙｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３５３−３６１；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２３：３６９−３７８；およびＤａｌｅ ａｎｄ Ｏｗ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０５５８−１０５６２０を参照されたい；これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）；Ｌｏｘ（Ａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：６４９−６５９；Ｑｕｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１７０６−１７１０；Ｓｔｕｕｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：９０１−９１３；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｖｅｔ．２２３：３６９−３７８；Ｄａｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：７９−８５；およびＢａｙｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：３５３−３６１）が挙げられる。大部分の天然に存在するサッカロミケス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株に見出される２ミクロンのプラスミドは、２つの反転反復配列間のＤＮＡの反転を促進する、部位特異的リコンビナーゼをコードする。この反転はプラスミドのコピー数増幅に中心的な役割を果たす。

【0161】

タンパク質、指定されたＦＬＰタンパク質は、部位特異的組み換えイベントを触媒する。最小の組み換え部位（ＦＲＴ）が定義されており、非対称８ｂｐスペーサーを挟んだ、２つの反転１３塩基対（ｂｐ）の反復配列を含有する。ＦＬＰタンパク質は、繰り返し配列とスペーサーとの接合部で部位を切断し、３’末端リン酸エステルにより共有結合でＤＮＡに結合する。ＦＬＰのような部位特異的リコンビナーゼは、特定の標的配列でＤＮＡを切断し、再ライゲーションして、２つの同一部位間で正確に定義された組み換えをもたらす。機能させるには、システムは組み換え部位とリコンビナーゼを必要とする。補助的因子は必要でない。このようにして、システム全体を植物細胞に挿入し、機能させることができる。酵母のＦＬＰ￥ＦＲＴ部位特異的組み換えシステムが植物で機能することが示されている。今日では、このシステムは不要なＤＮＡの切除に利用されている。Ｌｙｚｎｉｋ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２１： ９６９−９７５を参照されたい。
対照的に、本開示は、植物ゲノムにおけるヌクレオチド配列の置換、ターゲティング、配置、挿入および発現の制御に、非同一ＦＲＴを使用する。

【0162】

一態様では、ゲノムに組み込まれた標的部位を含有する、植物体の外植体などの目的の形質転換生物を必要とする。標的部位は、非同一組み換え部位が隣接するという特徴を有する。形質転換生物の標的部位に含まれる部位に対応する非同一組み換え部位が隣接するヌクレオチド配列を含むターゲティングカセットがさらに要求される。非同一組み換え部位を認識し、部位特異的組み換えを触媒するリコンビナーゼが要求される。

【0163】

リコンビナーゼは当該技術分野で知られている任意の手段で提供できると認められる。すなわち、それは、生物中でリコンビナーゼを発現することができる発現カセットで生物を形質転換することにより、一過性発現により、またはリコンビナーゼもしくはリコンビナーゼタンパク質のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を提供することにより、生物または植物細胞中に提供され得る。

【0164】

「非同一組み換え部位」とは、隣接する組み換え部位の配列が同一でなく、組み換えが生じないか、または部位間の組み換えが最少になるであろうことを意味する。すなわち、１つの隣接する組み換え部位がＦＲＴ部位で、第２の組み換え部位が変異したＦＲＴ部位であり得る。本開示の方法で使用される非同一組み換え部位は、２つの隣接する組み換え部位間の組み換え、およびそこに含まれるヌクレオチド配列の切除を妨げるか、または大きく抑制する。したがって、本開示においては、ＦＲＴおよび変異ＦＲＴ部位、ＦＲＴおよびｌｏｘ部位、ｌｏｘおよび変異ｌｏｘ部位、ならびに当該技術分野で知られている他の組み換え部位を含む、任意の適切な非同一組み換え部位を使用し得ると認められる。

【0165】

適切な非同一組み換え部位とは、活性なリコンビナーゼの存在下に、２つの非同一組み換え部位間の配列の削除がなされるとしても、植物ゲノムへのヌクレオチド配列の組み換えによる標的配置の置換よりもかなり低い効率で生じることを意味する。このように、本開示で使用される適切な非同一部位には、部位間の組み換え効率が低い部位、例えば、効率が約３０〜約５０％未満、好ましくは約１０〜約３０％未満、より好ましくは約５〜約１０％未満の部位が含まれる。

【0166】

上述のように、ターゲティングカセットの組み換え部位は、形質転換した植物体の標的サイトのそれに対応する。すなわち、形質転換植物体の標的部位が、ＦＲＴおよび変異ＦＲＴという隣接する非同一組み換え部位を含有するならば、ターゲティングカセットは同じＦＲＴおよび変異ＦＲＴの非同一組み換え部位を含有するであろう。

【0167】

さらに、本開示の方法で使用するリコンビナーゼは、形質転換植物体およびターゲティングカセットの標的部位の組み換え部位により変わってくると認められる。すなわち、ＦＲＴ部位が使用されるのであれば、ＦＬＰリコンビナーゼが必要になるであろう。同様に、ｌｏｘ部位が使用されるのであれば、Ｃｒｅリコンビナーゼが必要になる。非同一組み換え部位がＦＲＴおよびｌｏｘ部位の両者を含むのであれば、植物細胞中にＦＬＰおよびＣｒｅの両リコンビナーゼが必要となろう。

【0168】

ＦＬＰリコンビナーゼは、ＤＮＡ複製時に、サッカロミケス・セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２ミクロンプラスミドのコピー数の増幅に関与する、部位特異的反応を触媒するタンパク質である。ＦＬＰタンパク質はクローン化され、発現されてきた。例えば、Ｃｏｘ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：４２２３−４２２７を参照されたい。本開示の標的組み込み法で使用するＦＬＰリコンビナーゼはサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から得ることができる。目的植物体での最適な発現のために、植物体に望ましいコドンを使用してリコンビナーゼを合成することが好ましいであろう。例えば、１９９７年１１月１８日出願の、発明の名称が「Ｎｏｖｅｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＦＬＰ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ」である米国特許出願第０８／９７２，２５８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0169】

バクテリオファージリコンビナーゼＣｒｅは、２つのｌｏｘ部位間の部位特異的組み換えを触媒する。Ｃｒｅリコンビナーゼは当該技術分野で知られている。例えば、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９：４０−４６；Ａｂｒｅｍｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１５０９−１５１４；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４７７−４８８；およびＳｈａｉｋｈ ｅｔ ａｌ．（１９７７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：５６９５−５７０２（これらは全て参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。そのようなＣｒｅ配列はまた、植物体に望ましいコドンを使用して合成することができる。

【0170】

適切な場合には、植物ゲノムに挿入すべきヌクレオチド配列は、形質転換植物における発現を増加させるために最適化することができる。本開示において哺乳動物、酵母または細菌の遺伝子が使用される場合、発現改善のために、植物体に望ましいコドンを使用してそれらを合成することができる。単子葉植物における発現では、単子葉植物に望ましいコドンを使用して双子葉植物の遺伝子も合成できると認められる。植物に望ましい遺伝子を合成するために、当該技術分野における各種方法が利用できる。例えば、米国特許第５，３８０，８３１号明細書、同第５，４３６，３９１号明細書およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物に望ましいコドンは、目的植物で発現するタンパク質において、より頻繁に使用されるコドンから決定され得る。単子葉植物または双子葉植物に望ましい配列は、特定の植物種にとってその植物に望ましい配列と同様に構築できると認められる。例えば、欧州特許出願公開第Ａ−０３５９４７２号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０３８５９６２号明細書、国際公開第９１／１６４３２号パンフレット、Ｐｅｒｌａｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：３３２４−３３２８；およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：４７７−４９８．米国特許第５，３８０，８３１号明細書、米国特許第５，４３６，３９１号明細書など（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。さらに、遺伝子配列の全てまたは任意の部分が最適化されてもよく、また合成されてもよいと認められる。すなわち、完全に最適化されるか、または部分的に最適化された配列もまた使用することができる。

【0171】

配列のさらなる改変が、細胞宿主中で遺伝子発現を促進することが知られており、本開示で使用することができる。これらには、遺伝子発現に有害であり得る、疑似ポリアデニル化シグナルをコードする配列、エクソン−イントロンスプライス部位シグナルをコードする配列、トランスポゾン様反復配列、および他のそのような特徴を有する配列の削除が含まれる。配列のＧ−Ｃ含有量は、宿主細胞中で発現する既知の遺伝子を参照することによって算出される、所与の細胞宿主の平均的なレベルに調節することができる。可能であれば、配列は、予測されるヘアピン二次的ＭＡＲＮＡ構造を避けるよう改変する。

【0172】

本開示はまた、新規なＦＬＰ組み換え標的部位（ＦＲＴ）を包含する。ＦＲＴは、次のような、８塩基スペーサーで分けられた、２つの１３塩基対からなる反復配列を含む最小配列として特定されている：５’−ＧＡＡＧＴＴＣＣＴＡＴＴＣ［ＴＣＴＡＧＡＡＡ］ＧＴＡＴＡＧＧＡＡＣＴＴＣ３’（ここで、カッコ内のヌクレオチドはスペーサー領域を示す）。２つの１３塩基反復配列が８ヌクレオチドで分離されている限り、スペーサー領域のヌクレオチドは、ヌクレオチドの組み合わせで置換することができる。スペーサー領域のヌクレオチドのいくつかの置換は、他より良好に機能し、どの置換が当業者の技能の範囲内であるかを決定するのに役立つ。８塩基対のスペーサーは、鎖置換時のＤＮＡ−ＤＮＡの対合に関与する。この領域の非対称性は、組み換えイベントの部位アライメントの方向を決定し、これは、その後、逆方向になるか、または切除されるかに繋がる。上述のように、スペーサーの大部分は機能を失わずに変異することができる。例えば、Ｓｃｈｌａｋｅ ａｎｄ Ｂｏｄｅ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１２７４６−１２７５１（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。

【0173】

新規のＦＲＴ変異体部位は、本開示の方法の実施で使用することができる。そのような変異体部位はＰＣＲをベースとした変異誘発により構築することができる。変異ＦＲＴ部位は知られている（例えば、１９９９年５月２７日に公開された国際公開第１９９９／０２５８２１号パンフレットを参照されたい）が、本開示の実施には別の変異ＦＲＴ部位を使用できると認められる。種々の態様において、本開示の方法および組成物は、植物ゲノムにおけるヌクレオチド配列の標的挿入および発現に、非同一組み換え部位またはＦＲＴ部位を使用することができる。

【0174】

上で論じたように、リコンビナーゼの存在下に、非同一組み換え部位を有する標的部位を含むゲノムＤＮＡを、対応する非同一組み換え部位を有するトランスファーカセットを含むベクターと一緒にすると、組み換えが起こる。隣接する組み換え部位の間に位置するトランスファーカセットのヌクレオチド配列は、隣接する組み換え部位の間に位置する標的部位のヌクレオチド配列と置換される。このようにして、目的ヌクレオチド配列を、宿主のゲノムに正確に組み込むことができる。

【0175】

本開示の多くの変形を実施することができると認められる。例えば、複数の非同一組み換え部位を有する標的部位を構築することができる。このように、複数の遺伝子またはヌクレオチド配列を、植物ゲノムの正確な位置に積み重ねるか、またはオーダーすることができる。同様に、ゲノム内に標的部位が確立されたならば、トランスファーカセットのヌクレオチド配列内に追加の組み換え部位を組み込み、その部位を標的配列に移入することにより、追加の組み換え部位を導入することができる。このように、標的部位が確立されたならば、その後、組み換えにより部位を追加したり、部位を変更したりすることが可能である。

【0176】

別の変形として、生物の標的部位に作動可能に結合したプロモーターまたは転写開始領域を提供することが挙げられる。プロモーターは最初の組み換え部位の５’末端側にあることが好ましい。コード領域を含むトランスファーカセットで生物を形質転換することにより、コード領域の発現は、トランスファーカセットが標的部位に組み込まれたときに起こるであろう。この態様は、コード配列として選択マーカー配列を提供することにより、形質転換された細胞、特に植物細胞を選択する方法を提供する。

【0177】

本システムの別の利点として、上で論じたトランスファーカセットを使用することによる、導入遺伝子または導入ＤＮＡを生物に組み込むことの複雑さを軽減する能力、および単純な組み込みパターンによる生物の選択が挙げられる。同様に、数種の形質転換イベントを比較することにより、ゲノム内の好ましい部位を特定することができる。ゲノム内の好ましい部位としては、必須配列の発現を妨害せず、かつ導入遺伝子配列を十分に発現させるものが挙げられる。

【0178】

本開示の方法はまた、ゲノム内の１ヵ所に複数のカセットを結合させる手段を提供する。ゲノム内の標的部位で、組み換え部位を追加または切除することができる。

【0179】

本開示においては、本システムの３つの成分を一緒にする、当該技術分野で知られた手段を使用することができる。例えば、植物を安定に形質転換し、そのゲノム内に標的部位を宿させることができる。リコンビナーゼを一時的に発現させるか、または提供することができる。あるいは、リコンビナーゼを発現することができるヌクレオチド配列を植物ゲノムに安定的に組み込むことができる。対応する非同一組み換え部位が隣接するトランスファーカセットは、対応する標的部位とリコンビナーゼの存在下に、形質転換植物のゲノムに挿入される。

【0180】

あるいは、形質転換植物を有性交雑させることにより、本システムの成分を一緒にすることができる。この態様では、ゲノムに組み込まれた標的部位を含有する形質転換植物、すなわち第１の親は、第２の植物、すなわち第１の親に対応する隣接する非同一組み換え部位を含有するトランスファーカセットで遺伝子的に形質転換されている第２の親と有性交雑することができる。第１の植物または第２の植物は、そのゲノム内にリコンビナーゼを発現するヌクレオチド配列を含有する。リコンビナーゼを構成的または誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。

【0181】

誘導性プロモーターとしては、本明細書で先述したもの、ならびに熱誘導性プロモーター、エストラジオール応答性プロモーター、化学誘導性プロモーターなどが挙げられる。病原体誘導性プロモーターとしては、病原体の感染後に誘導される感染特異的タンパク質（ＰＲタンパク質）、例えば、ＰＲタンパク質、ＳＡＲタンパク質、ベータ−１，３−グルカナーゼ、キチナーゼなどからのものが挙げられ。例えば、Ｒｅｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌ．８９：２４５−２５４；Ｕｋｎｅｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：６４５−６５６；およびＶａｎ Ｌｏｏｎ（１９８５）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｖｉｒｏｌ．４：１１１−１１６を参照されたい。このようにして、リコンビナーゼの発現およびその後の組み換え部位の活性を制御することができる。

【0182】

植物の遺伝子発現に使用する構成的プロモーターは、当該技術分野で知られている。そうしたプロモーターとして、限定はされないが、カリフラワーのモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：５６１−５７３；Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２），ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９），ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｆｒｏｍ ｇｅｎｅｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｒｉｂｕｌｏｓｅ ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８：７８−９８），ａｃｔｉｎ（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２：１６３−１７１），ｈｉｓｔｏｎｅ，ＤｎａＪ（Ｂａｓｚｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ ４２：１８９−２０１）などが挙げられる。

【0183】

本開示の組成物および方法は、導入されるヌクレオチド配列を特定の染色体部位へ組み込むターゲティングに有用である。ヌクレオチド配列は任意の目的ヌクレオチド配列をコードすることができる。目的とする特定の遺伝子としては、宿主細胞および／または生物に容易に分析可能な機能的特徴を提供するもの、例えば、マーカー遺伝子や、受容細胞の表現型を変える他の遺伝子などが挙げられる。このように、本開示では、植物の生長、高さ、病気に対する感受性、昆虫、栄養価などに影響する遺伝子を使用することができる。ヌクレオチド配列はまた、遺伝子の発現を停止または改変させる「アンチセンス」配列をコードすることができる。

【0184】

ヌクレオチド配列は、機能性発現ユニットまたはカセットで使用できると認められる。機能性発現ユニットまたはカセットとは、機能性プロモーターおよび殆どの場合に終止領域を有する目的ヌクレオチド配列を意味する。本開示の実施の中で機能性発現ユニットを実現させるには各種の方法がある。本開示の一態様では、目的核酸は機能性発現ユニットとしてゲノムに導入または挿入される。

【0185】

あるいは、ヌクレオチド配列はゲノム内のプロモーター領域の３’末端側の部位へ挿入することができる。この後者の場合、プロモーター領域の３’末端側へのコード配列の挿入が、組み込み時に機能性発現ユニットを実現させるものである。植物における発現では、便宜のために、標的部位をコードする核酸および目的ヌクレオチド配列を含むトランスファーカセットを発現カセットに含ませることができる。発現カセットは、目的ペプチドをコードする核酸に作動可能に連結した転写開始領域、すなわちプロモーターを含むであろう。そのような発現カセットは、調節領域の転写調節下とする、目的遺伝子または遺伝子群を挿入するための複数の制限部位を備えている。

【0186】

転写開始領域、すなわちプロモーターは、宿主にネイティブ、すなわち同種であっても、外来、すなわち異種であってもよく、あるいは、天然配列または合成配列とすることができよう。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主に、転写開始領域が存在しないことを意味する。目的のコード配列に関し、ネイティブプロモーターまたは異種プロモーターを使用することができる。

【0187】

転写カセットは、転写の５’−３’方向に、植物内で機能する、転写および翻訳開始領域、目的ＤＮＡ配列、ならびに転写および翻訳終止領域を含み得る。終止領域は、転写開始領域と共にネイティブであっても、目的ＤＮＡ配列と共にネイティブであっても、または他のソース由来であってもよい。使いやすい終止領域は、ジャガイモプロテイナーゼ阻害剤（ＰｉｎＩＩ）遺伝子から、またはノパリンシンターゼ、オクトピンシンターゼおよびオパリンシンターゼ終止領域などの、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドの配列から得ることができる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；Ｊｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。

【0188】

発現カセットは、発現カセットコンストラクト中に５’末端リーダー配列をさらに含有することができる。そのようなリーダー配列は翻訳を促進するよう作用し得る。翻訳リーダーは当該技術分野で知られており、ピコルナウイルスリーダー、例えば、ＥＭＣＶリーダー（脳心筋炎５’末端非コード領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ，Ｏ．，Ｆｕｅｒｓｔ，Ｔ．Ｒ．，ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９８９）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，８６：６１２６−６１３０）；ポティウイルスリーダー、例えば、ＴＥＶリーダー（タバコ・エッチ・ウイルス（Ｔｏｂａｃｃｏ Ｅｔｃｈ Ｖｉｒｕｓ））（Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６））；ＭＤＭＶリーダー（トウモロコシ萎縮モザイクウイルス）（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１５４：９−２０）、およびヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）（Ｍａｃｅｊａｋ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ Ｐ．Ｓａｒｎｏｗ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５３：９０−９４）；アルファルファモザイクウイルスの外皮タンパク質ＭＡＲＮＡの非翻訳リーダー（ＡＭＶ ＲＮＡ ４）（Ｊｏｂｌｉｎｇ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ Ｇｅｈｒｋｅ，Ｌ．，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：６２２−６２５；タバコモザイクウイルスリーダー（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ，ｐａｇｅｓ ２３７−２５６，Ｇａｌｌｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：３２５７−３２７３）；トウモロコシ退緑斑紋ウイルスリーダー（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｒｎｍｅｌ、Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８１：３８２−３８５）が挙げられる。Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，８４：９６５−９６８も参照されたい；そして内因性トウモロコシ５’末端非翻訳配列。翻訳を促進することで知られている他の方法、例えば、イントロンなども使用することができる。

【0189】

発現カセットは、形質転換植物に導入され発現する、１つ以上の遺伝子または核酸配列を含有することができる。したがって、各核酸配列は５’末端および３’末端の調節配列に作動可能に連結するであろう。あるいは、複数の発現カセットが提供され得る。

【実施例】

【0190】

実施例１：改善された特徴を有するｖｉｒプラスミド
一連の改良スーパーバイナリーベクターを調製した。本明細書に記載の配列番号（配列番号）を表２３に示す。ベクターｐＰＨＰ７０２９８、ｐＰＨＰ７１５３９およびｐＰＨＰ７９７６１は、プラスミドマップとして、それぞれ図２、３および４に示されており、それぞれ配列番号３４、３５、および３６に記載の配列を有する（表２３を参照）。比較のために、ｖｉｒ遺伝子プラスミドｐＳＢ１（Ｋｏｍａｒｉ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．（１９９０），９：３０３−３０６）のプラスミドマップを図１に示す。ｐＰＨＰ７０２９８（配列番号３４）、ｐＰＨＰ７１５３９（配列番号３５）およびｐＰＨＰ７９７６１配列番号３６）に対する改善の中には、大きく不安定な複製起点（ＲＫ２）に代えて、より小さく、より安定な複製起点ｐＶＳ１を存在させたことがある。さらに、Ｔ−ＤＮＡ導入の改善のために、オーバードライブ結合タンパク質をコードする、ｖｉｒＣ１〜２オペロンのフレームシフトが修復される。フレームシフトが、ジシストロニックなｍＲＮＡ中の第２の遺伝子としてｖｉｒＣ１〜２の翻訳を減少させることは可能である。ｖｉｒＤ１およびｖｉｒＤ２を導入する（ｐＰＨＰ７０２９８）か；完全なｖｉｒＤオペロン（すなわち、ｖｉｒＤ１〜Ｄ５）をｖｉｒＥ１〜３およびｖｉｒＧ遺伝子と共に導入する（ｐＰＨＰ７１５３９）か；または完全なｖｉｒＤオペロン（すなわち、ｖｉｒＤ１〜Ｄ５）をｖｉｒＥ１〜３、ｖｉｒＡ、ｖｉｒＧ、およびｖｉｒＪ遺伝子と共に導入する（ｐＰＨＰ７１５３９）ことにより、ビルレンス遺伝子の機能もまた改善された。ベクターｐＰＨＰ７０２９８およびｐＰＨＰ７１５３９中のｖｉｒ遺伝子の配置（図２および３を参照）は、ｐＴｉＢｏ５４２親プラスミド（図４を参照）に存在しているときのように、連続した断片である。しかしながら、ｐＰＨＰ７９７６１では、ｖｉｒＡおよびｖｉｒＪ遺伝子の配置は連続的に配置されているが（図４を参照）、これらの遺伝子は、ｐＴｉＢｏ５４２親プラスミドでは連続的でない（図４を参照）。特に、ｐＰＨＰ７９７６１中のｖｉｒＡおよびｖｉｒＪ遺伝子の配置は、反復配列および４つの潜在的コード配列が隣接する推定転移性ＤＮＡ因子（ＩＳ２９２）を削除する（ＧｅｎＢａｎｋ登録ＮＣ０１０９２９のＣＤＳ５１〜５４を参照）。これらのコンストラクトは、より多数のビルレンス遺伝子を有しているにもかかわらず、ｐＳＢ１より小さい。

【0191】

ｐＳＢ１と比較すると、必須でないＤＮＡおよび反復因子は除かれている。例えば、ベクターｐＰＨＰ７０２９８、ｐＰＨＰ７１５３９、およびｐＰＨＰ７９７６１は、ｐＳＢ１に存在する１６．２ｋｂ ＲＫ２複製起点に含まれる７．０ｋｂｐの短縮ｔｒａおよびｔｒｂオペロンまたは隣接する遺伝子を含まない（図１を参照）。ベクターｐＰＨＰ７０２９８、ｐＰＨＰ７１５３９、およびｐＰＨＰ７９７６１で除かれた２つのさらなる配列がｐＳＢ１に見い出された（図１を参照）：（ａ）３２ｂｐパリンドローム配列（配列番号６１）；および（ｂ）１４６ｂｐ逆向き反復配列（配列番号６２）。ベクター主鎖内のこれらの要素は、プラスミド全体の安定性を低下させると考えられており、したがって、本ベクターからそれらを除去することにより、プラスミド全体の安定性は増大するはずである。

【0192】

ベクターｐＰＨＰ７０２９８、ｐＰＨＰ７１５３９、およびｐＰＨＰ７９７６１はまた、複製起点、ベータラクタマーゼをコードする配列および不安定な１８ｂｐポリ−Ｇ隣接ラムダＣＯＳ部位を含むｐＳＢ１中に存在する２．７ｋｂｐのｐＢＲ３２２断片を欠いている。代わりに、ベクターｐＰＨＰ７０２９８、ｐＰＨＰ７１５３９、およびｐＰＨＰ７９７６１は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）における安定な保持を付与する、１．２ｋｂｐのＣｏｌＥ１複製起点を使用する。

【0193】

選択マーカーは、プラスミドの安定性を高め、かつアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を速めるゲンタマイシンカセットである。ｐＳＢ１中のテトラサイクリン耐性遺伝子ｔｅｔＡＲは、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｃ５８株における遅い増殖もしくはプラスミドを含まないコロニー、またはテトラサイクリン耐性を有する変異アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）コロニーをもたらすことがしばしばである（Ｃ５８、およびＡＧＬ０、ＡＧＬ１などのその誘導体は、自然発生のｔｅｔ耐性変異を高頻度で引き起こすことが報告されている；Ｌｕｏ，Ｚ．Ｋ．ａｎｄ Ｆａｒｒａｎｄ，Ｓ．Ｋ．（１９９９）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：６１８−６２６を参照）。ゲンタマイシンカセットとして、ゲンタマイシン耐性を付与するＧｍＲ合成ａａｃＣ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ５３０４２１に基づく；配列番号１）を使用したが、これは、このプラスミドを有する組み換えアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株における増殖を遅らせることも、病原性を低下させることもない。

【0194】

簡単に言えば、これらのベクターを類似の方法で構築した。ｐＰＨＰ７０２９８およびｐＰＨＰ７１５３９の構築に用いた方法の一例として、ｐＰＨＰ７９７６１の構築を本明細書で説明する。ビルレンス遺伝子は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミド、ｐＴｉＢｏ５４２（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０１０９２９．１；図５を参照）から得た。当業者は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｒ_ｉプラスミドのｖｉｒ遺伝子もまた、本明細書で開示したベクターに有用であることを理解できよう。

【0195】

アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＡＧＬ１のゲノムＤＮＡ調製物からのｖｉｒＡ、ｖｉｒＪおよびｖｉｒＢ１〜ｖｉｒＥ３のコード領域および調節領域を増幅するよう、ＰＣＲプライマーを設計した。ＰＣＲを促進するために、２４ｋｂのｖｉｒＢ１〜Ｅ３配列を５つに分割して増幅した。シームレスクローニング法を促進するために、断片／誘導体を、４０ｂｐのオーバーラッピング末端を有するよう設計した。図４に示すように、機能要素間に固有の制限酵素部位を含め、他の機能的に同等の要素との置換を促進させた。ｐＴｉＢｏ５４２ ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ中でＩＳ２９２の標識が付され、ｖｉｒＡとｖｉｒＪ遺伝子の間に存在する可動遺伝要素は、サイズおよび植物への導入の可能性を低減する目的でｐＰＨＰ７９７６１に含めなかった。細菌宿主にゲンタマイシン耐性を付与するために、隣接制限部位を用いてゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ５３０４２１に基づく）を合成した。エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での安定な複製のために、ｐＢＲ３２２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０１７４９）の塩基対２３４８〜３２４７に対応するＣｏｌＥ１の複製起点を含めた。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）中での安定な維持のために、ｐＶＳ１の複製起点をコードする２．６ｋｂの断片（Ｓｔａｎｉｓｉｃｈ，Ｖ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１２９：１２２７−１２３３を参照）を含めた（図６を参照）。

【0196】

実施例２：ｐＰＨＰ７０２９８ヘルパーを使用したアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）によるトランスジェニックトウモロコシのイベント
２つの異なるトウモロコシの品種、ＰＨＲ０３およびＰＨ１８４Ｃにおいて、本明細書で後述するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介による未成熟胚の形質転換を使用し、トウモロコシの形質転換のためのヘルパーベクターとして、ベクターｐＰＨＰ７０２９８を試験した。発現カセットＺｍＵｂｉ：ＰＭＩ：ＰＩＮＩＩおよびＺｍＵｂｉ：ＺｓＹｅｌｌｏｗ：ＰＩＮＩＩ（ｐＰＨＰ４５９８１；Ｔ−ＤＮＡ；配列番号２８）を含有するターナリーベクターを宿した、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−を試験した。トウモロコシの形質転換に及ぼすこれらの２つのベクター、ｐＳＢ１とｐＰＨＰ７０２９８の影響を比較するために、ｐＳＢ１とＰＨＰ４５９８１、およびｐＰＨＰ７０２９８とｐＰＨＰ４５９８１による比較実験を行った。２つのベクターの形質転換を、カルス形質転換頻度（カルスＴｘ％）、Ｔ０植物形質転換頻度（Ｔ０ Ｔｘ％）、クオリティイベント頻度（ＱＥ）（目的遺伝子の全てが単一コピーであり、ベクターの主鎖ＤＮＡを有しないイベントのパーセントと定義される−ＱＥ％）、および使用可能なイベントの品質（ＵＥ））（感染した１００個の胚当たり回収されたＱＥイベントの数と定義されるＵＥ％）に関して評価した。最少でも６００個の胚を用いて形質転換実験を行い、遺伝子型ＰＨＲ０３およびＰＨ１８４Ｃの形質転換データをそれぞれ表２および３に要約する。表のデータは、ベクターｐＰＨＰ７０２９８が、試験したトウモロコシの両品種において、カルスおよびＴ０植物全体の形質転換頻度に有意な改善をもたらしたことを示している。

【0197】

【表3】

【0198】

【表4】

【0199】

固形培地におけるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の培養：５ｍＬのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地（７００培地；表２１を参照）および５μＬの１００ｍＭ ３’−５’−ジメトキシ−４’−ヒドロキシアセトフェノン（アセトシリンゴン）を、フードの中で１４ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに加えた。チューブ内に、白金耳に約３杯のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を懸濁させ、その後、チューブをボルテックスして均質な懸濁液とした。１ｍＬの懸濁液を分光光度計のチューブに移し、懸濁液のＯＤを５５０ｎｍで０．３５に調節した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の濃度は約０．５×１０^９ｃｆｕ／ｍＬであった。最終のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を２ｍＬの微量遠心機のチューブに分取し、各チューブに１ｍＬの懸濁液を含有させた。その後、できるだけ速やかに懸濁液を使用した。

【0200】

アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の液体培地における培養：感染させる１日前に、１２５ｍｌのフラスコに３０μＬのスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）および３０μＬのアセトシリンゴン（２０ｍｇ／ｍＬ）を含む３０ｍＬの５５７Ａ（表２１を参照）を調製した。白金耳の半分量のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）をフラスコ内に懸濁させ、２００ｒｐｍの振盪機により２８℃で終夜振盪した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の培養物を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を除去し、アセトシリンゴン溶液を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の感染培地（７００培地；表２１を参照）を加えた。ボルテックスして細菌を再懸濁させ、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液のＯＤを５５０ｎｍで０．３５に調節した。

【0201】

トウモロコシの形質転換：Ｔｗｅｅｎ２０を１滴加えた２０％（ｖ／ｖ）漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ソーダ）中で、トウモロコシ（トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．））の品種、ＰＨＲ０３またはＰＨ１８４Ｃの穂表面を１５〜２０分間滅菌し、続いて滅菌水で３回洗浄した。穂から未成熟胚（ＩＥ）を単離し、アセトシリンゴン溶液を含む、２ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地（７００培地；表２１を参照）中に置いた。胚の最適サイズは、ＰＨＲ０３でそれぞれ１．５〜１．８ｍｍであった。溶液を抜き取り、１ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を胚に加え、チューブを５〜１０秒間ボルテックスした。微量遠心管をフード内で５分間静置させた。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の懸濁液と胚を、共培養培地（７１０Ｉ；表２１を参照）に注いだ。滅菌したスパチュラで、チューブに残った胚をプレートに移した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を抜き取り、胚を軸側を下にして培地上に置いた。Ｐａｒａｆｉｌｍ（商標）フィルム（耐湿性の柔軟なプラスチック、Ｂｅｍｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．，１ Ｎｅｅｎａｈ Ｃｅｎｔｅｒ ４^ｔｈｆｌｏｏｒ，ＰＯ Ｂｏｘ ６６９，Ｎｅｅｎａｈ，ＷＩ ５４９５７より入手可能）でプレートを密封し、１〜３日間の共培養のために暗所において２１℃でインキュベートした。

【0202】

胚を、選択せずに、安静培地（６０５Ｗ；表２１を参照）に移した。３〜７日後、マンノース（１２．５ｇ／Ｌ）または他の選択剤（Ｇ４１８、１５０ｍｇ／Ｌ）を補った、選択培地１３１５２Ｔまたは１３１５２Ｚ（表２１を参照）にそれらを移した。選択の第１ラウンドから３週間後から、３〜４週間隔で、選択剤を含む新しい１３１５２Ｔまたは１３１５２Ｚ（表２１を参照）に培養物を移した。形質転換されたなら、適切な選択剤を補った成熟培地（２８９Ｑまたは２８９Ｍ；表２１を参照）に組織を移した。

【0203】

実施例３：トウモロコシの形質転換における、ｐＰＨＰ７０２９８およびｐＰＨＰ７１５３９のプラスミドｐＳＢ１との比較
アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介未成熟胚形質転換を使用した、トウモロコシ遺伝子型ＰＨ１８４Ｃのトウモロコシ形質転換でのｐＰＨＰ７０２９８およびｐＰＨＰ７１５３９の効果を測定した。この研究では、植物体の選択のために、マーカー遺伝子、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｏＰＡＴ）に作動可能に連結した、少なくとも１つ以上の目的遺伝子（ＧＯＩ）をＴ−ＤＮＡ中に持つターナーリープロダクションベクターを使用した。形質転換データを表４に示すが、これらのデータは、ｐＰＨＰ７０２９８およびｐＰＨＰ７１５３９を使用した、ＰＨ１８４ＣのカルスおよびＴ０の植物レベルにおける実験で、ｐＳＢ１と比べて形質転換頻度が少なくとも１．５〜２倍高いことを示している。クオリティイベント（ＱＥ）頻度（目的遺伝子の全てが単一コピーであり、ベクターの主鎖ＤＮＡを有しないイベントのパーセントと定義される）は、３つのプラスミドｐＳＢ１、ｐＰＨＰ７０２９８およびｐＰＨＰ７１５３９の間で有意な違いはないが、使用可能なイベント（ＵＥ）頻度（感染した胚１００個当たり回収したＱＥイベントの数と定義される）は、３種の独立したプロダクションベクターのうち、ｐＰＨＰ７０２９８およびｐＰＨＰ７１５３９の両者で高かった。３種のプロダクションベクターの平均形質転換頻度、ＱＥ％およびＵＥを表４に要約する。

【0204】

【表5】

【0205】

実施例４：ｐＰＨＰ７１５３９による形質転換の改善
アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介未成熟胚形質転換により、トウモロコシの形質転換に対するｐＰＨＰ７１５３９の効果を、別のトウモロコシ品種ＰＨＲ０３でさらに試験した。この研究では、植物体の選択のために、マーカー遺伝子、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）およびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｍｏＰＡＴ）に作動可能に連結した、少なくとも１つ以上の目的遺伝子（ＧＯＩ）をＴ−ＤＮＡ中に持つプロダクションベクターを使用した。表５に示すように、ｐＰＨＰ７１５３９は、クオリティイベント頻度に悪影響を及ぼさずに、形質転換頻度を顕著に改善し、ｐＳＢ１と比べると、遺伝子型ＰＨＲ０３の使用可能イベントの回収を相当に高める結果となった。これらのデータは、複数の遺伝子型のトウモロコシの形質転換に対する、開示したプラスミドによる改善をさらに立証するものである。

【0206】

【表6】

【0207】

当業者は、ヘルパープラスミドｐＶＩＲ１０（配列番号３６；表２３を参照）を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）菌が、複数のトウモロコシ近交系で、形質転換頻度、クオリティイベントおよび使用可能クオリティイベントの回収を有意に改善できることを認識するであろう。

【0208】

実施例５：植物における一過性ＤＮＡ送達および遺伝子発現の改善
葉の外植体における一過性Ｔ−ＤＮＡ送達について、アグロインフェクション法を用いてプラスミドｐＰＨＰ７１５３９を試験した。アグロインフェクションでは、若葉の外植体に、プロダクションカセット（すなわち、植物保護ＧＯＩ）を持つアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株をバキュームインフィルトレーとさせ、その２〜３日後にタンパク質の測定のために葉を収穫した。タンパク質の測定は、複製試料を使用し、標準ＥＬＩＳＡで２回繰り返して行った。トウモロコシの葉における一過性ＤＮＡ送達に関するデータを表６に示す。ｐＰＨＰ７１５３９をインフィルトレートさせた葉で測定したタンパク質の量は、ｐＳＢ１を有する同じ遺伝子発現カセットをインフィルトレートさせた葉に見られるタンパク質の量より有意に多かった。このことは、ｐＰＨＰ７１５３９がＴ−ＤＮＡの送達を促進させ、トウモロコシにおける一過性タンパク質の発現を高めることを示している。

【0209】

【表7】

【0210】

当業者は、ヘルパープラスミドｐＶＩＲ７、ｐＶＩＲ９またはｐＶＩＲ１０を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）菌が、複数のトウモロコシ近交系の異なる植物外植体で、一過性タンパク質の発現を大きく改善することを認識するであろう。

【0211】

実施例６：ｐＰＨＰ７０２９８を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の使用によるソルガム形質転換の改善
他の単子葉植物の植物形質転換を改善するための、開示したベクターの機能の改善を示すために、ソルガムの変種ＴＸ４３０の未成熟胚を用いて、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介ソルガム形質転換の形質転換頻度を試験した。最初の実験では、発現カセットＺｍＵｂｉ：ＰＭＩ：ＰＩＮＩＩおよびＺｍＵｂｉ：ＺｓＹｅｌｌｏｗ：ＰＩＮＩＩ（配列番号２８）を含有するターナリーベクターｐＰＨＰ４５９８１を宿すアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−を使用した。ｐＰＨＰ４５９８１とｐＳＢ１、およびｐＰＨＰ４５９８１とｐＰＨＰ７０２９８を用いて平行実験を行い、カルスの形質転換頻度（カルスＴｘ％）、Ｔ０植物形質転換頻度（Ｔ０ Ｔｘ％）、クオリティイベント頻度（ＱＥ％）および使用可能なイベントのクオリティ（ＵＥ）を測定した。最少でも３００個の未成熟胚を用いた２つの独立した実験から得た形質転換データを表７に要約する。プラスミドｐＰＨＰ４５９８１およびｐＰＨＰ７０２９８を宿すＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−株では、ソルガム形質転換のすべての段階で、カルス形質転換、Ｔ０植物形質転換、クオリティイベントおよび全体の使用可能クオリティイベントを含む能力が改善することが示された。少なくとも１種の形質スタック、およびｐＰＨＰ７１５３９を加えたＰＭＩ発現カセットを含有するコンストラクトを用いて、追加の試験を行った。ｐＰＨＰ７１５３９を用いた平均形質転換頻度（表８）は、ｐＳＢ１を含有するターナリーベクターで観察された通常の形質転換頻度（表７）より高かった。

【0212】

【表8】

【0213】

【表9】

【0214】

当業者は、ヘルパープラスミドｐＶＩＲ７（配列番号３４）、ｐＶＩＲ９（配列番号３５）またはｐＶＩＲ１０（配列番号３６）を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）菌が、異なるソルガム系統で、形質転換頻度、クオリティイベントおよび使用可能クオリティイベントの回収を有意に改善できることを認識するであろう。

【0215】

実施例７：ｐＰＨＰ７１５３９の使用による部位特異的組込みの改善
米国特許第６，１８７，９９４号明細書および米国仮特許出願第６２／２９６６３９号明細書（両者は参照により全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、トウモロコシの品種ＰＨＲ０３において作られた標的遺伝子座を持つ標的系統で、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介部位特異的組込み（「ＳＳＩ」）に対するｐＰＨＰ７１５３９の評価を行った。標的イベントの同定およびＳＳＩイベントの同定を容易にするために、プロモータートラップに作動可能に連結した標的部位を使用した。プロモータートラップ標的部位を含む系統を、ｐＰＨＰ６４４８４ ＺｍＰｒｏＵｂｉ−ＦＲＴ１−ＮｐｔＩＩ：：ＰｉｎＩＩ＋ＺｍＵｂｉＰｒｏ：：ＡｍＣｙａｎ：：ＰｉｎＩＩ−ＦＲＴ８７（配列番号２９）を含むコンストラクトを用いた形質転換により作製した。プロモータートラップ選択マーカーに構成的プロモーター（ＺｍＵｂｉＰｒｏ；配列番号３０）であって、ドナーと呼ばれるＴ−ＤＮＡ内で、同一でないＦＲＴ組み換え部位のペア（例えば、ＦＲＴ１／ＦＲＴ８７（配列番号３２および３３）が隣接するレポーター遺伝子（ＤｓＲｅｄ（配列番号３１）を駆動する構成的プロモーターをプラスしてバイナリーベクターを作製した。ＳＳＩイベントの回収および使用可能なＳＳＩ頻度（正確なＳＳＩイベント）に対するｐＰＨＰ７１５３９の影響を評価するために、バイナリーベクターをｐＰＨＰ７１５３９と共に、または単独でアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１へ可動させた。標的遺伝子（ＮｐｔＩＩ）の切除、ドナー遺伝子の組込み（ＰＭＩおよびＤｓＲＥＤ）、ＦＬＰ遺伝子の不在（Ｔ−ＤＮＡのランダムな組込み）およびＦＲＴのペア接合部（１／８７）の存在を判定するために、ｑＰＣＲ／ＰＣＲアッセイを使用して、推定イベントの分子的キャラクタリゼーションを実施した。ベクターの主鎖を分析するために、多重ＰＣＲを行った。以下の基準を満たすものを正確なＳＳＩイベント（使用可能なＳＳＩイベント）としてキャラクタライズした：（１）ドナー遺伝子（ＰＭＩおよびＤｓＲｅｄ）の単一無傷コピー；（２）標的遺伝子（ＮｐｔＩＩ）、ＦＬＰ、ＯＤＰ／ＭｏＣｒｅの不在；（３）ＦＲＴ１およびＦＲＴ８７両者の接合部の存在；ならびに、（４）ベクター主鎖の挿入の不在。表９に、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１中のコンストラクトｐＰＨＰ７１５１８を、ヘルパープラスミドｐＰＨＰ７１５３９と共にまたは単独で使用して得た、トウモロコシ品種ＰＨＲ０３の形質転換頻度および正確なＳＳＩ頻度を要約する。ｐＰＨＰ７１５３９およびｐＰＨＰ７１５１８を含有するアグロ株では、ｐＰＨＰ７１５１８を単独で含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と比較して、推定ＳＳＩイベントの回収およびＳＳＩ Ｔ０の正確なイベントの回収にかなりの改善が認められた。

【0216】

【表10】

【0217】

当業者は、ヘルパープラスミド、ｐＶＩＲ７またはｐＶＩＲ１０を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）菌が、複数トウモロコシ近交系で、Ｔ０形質転換頻度および正確なＳＳＩ頻度を有意に改善することを認識するであろう。

【0218】

実施例８：ＰＶＩＲプラスミドの使用によるコムギの形質転換の改善（コムギの高効率形質転換および迅速なＴ０植物の生産
Ａ．コムギの形質転換法
目的ベクターを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４ ＴＨＹ−のアリコートを−８０℃で貯蔵容器から取り出し、選択剤スペクチノマイシンを含有する固体ＬＢ培地（１２Ｖ）上にストリークした。１２Ｖ上、２１℃の暗所で、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を２〜３日間培養し、プレートから単一コロニーを選択し、選択剤を含有する８１０Ｄ培地にストリークし、その後、２８℃の暗所で終夜インキュベートした。滅菌したスパチュラで２〜３のアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）コロニーを採取し、４００μＭのアセトシリンゴン（ＡＳ）を含む約５ｍＬのコムギ感染培地（ＷＩ４）（ＷＩ４、表１０を参照）に懸濁した。懸濁液の光学密度（６００ｎｍ）を同じ培地を使用して約０．１〜０．７に調節した。

【0219】

未成熟の種子を含有する４〜５本の穂（１．４〜２．３ｍｍの胚を有する）を採取し、未成熟の種子から未成熟胚を単離した。Ｔｗｅｅｎ２０の１滴を加えた２０％（ｖ／ｖ）漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）中で１５分間、コムギの穀粒を表面殺菌し、続いて滅菌水中で２〜３回洗浄した。滅菌後、未成熟胚（ＩＥ）をコムギの穀粒から分離し、１．５ｍｌのＷＩ４培地中に置いた。未成熟胚を１ｍＬのＷＩ４培地を加えた０．２５ｍＬの滅菌砂を含有する２ｍＬの微量遠心管に移し、その後、１０，０００ＲＰＭで３０秒間遠心分離を行った。最初の遠心分離の後、「中」の設定で１０秒間、微量遠心管をボルテックスし、再度１０，０００ＲＰＭで３０秒間、２回目の遠心分離を行った。胚をこの懸濁液中で２０分間放置した。

【0220】

次の工程で、ＷＩ４培地をデカンテーションし、１．０ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を加えることによって、未成熟胚の感染を開始させた。感染した胚を２０分間放置した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびＩＥの懸濁液をコムギ共培養培地＃１０（表１１を参照）に注いだ。滅菌したスパチュラを使用し、軸側を下方の培地に向けて胚をプレートに注ぎ入れ、胚を確実に溶液に浸漬した。プレートをＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）テープフィルム（耐湿性の柔軟なプラスチック、Ｂｅｍｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，１ Ｎｅｅｎａｈ Ｃｅｎｔｅｒ ４^ｔｈｆｌｏｏｒ，ＰＯ Ｂｏｘ ６６９，Ｎｅｅｎａｈ，ＷＩ ５４９５７から入手可能）で密封し、３日間の共培養のために２１℃の暗所でインキュベートした。表１０〜１５に、液体のコムギ感染培地（ＷＩ４）、コムギ共培養培地（ＷＣ＃１０）、１回目のＤＢＣ４培地、２回目のＤＢＣ６培地、再生ＭＳＡ培地および再生ＭＳＢ培地を記載する。

【0221】

【表11】

【0222】

【表12】

【0223】

【表13】

【0224】

【表14】

【0225】

【表15】

【0226】

【表16】

【0227】

Ｂ．コムギ胚の選択
選択せずに、ＤＢＣ４緑色組織（表１２を参照）（１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含むＧＴ培地（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂ．，Ｓｈａｗｎｅｅ Ｍｉｓｓｉｏｎ，ＫＳ）誘導培地に、胚の軸が培地に接触するような向きにして未成熟胚を移す。薄暗い所にて、２６〜２８℃で２週間、この培地上で胚をインキュベートし、その後、１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含有するＤＢＣ６培地（表１３を参照）上にさらに２週間置く。この時点で、蛍光顕微鏡下に、蛍光タンパク質を発現する全ての組織を非形質転換組織から分離し、組織を増殖させるために１００ｍｇ／Ｌのセフォタキシムを含有するＤＢＣ６ ＧＴ誘導培地（表１３を参照）上に置く。

【0228】

Ｃ．小植物体の再生および温室への移動
蛍光組織をＭＳＡ再生培地（表１４を参照）に移し、２６〜２８℃の明るい光の中で２〜４週間インキュベートする。この時点で、トランスジェニック小植物体の蛍光マーカー遺伝子の均一な発現、および健康な根に関して組織をチェックする。小植物体を温室内のポットの土壌に移す。

【0229】

Ｄ．スーパーバイナリープラスミドｐＰＨＰ７１５３９およびｐＰＨＰ７０２９８の、植物発現カセットを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌への導入は、コムギの一過性Ｔ−ＤＮＡ送達を改善およびトランスジェニックＴ０イベント回収の改善をもたらした

【0230】

未成熟胚をコムギの品種ＨＣ０４５６Ｄから収穫し、以下の成分を有するＴ−ＤＮＡバイナリープラスミドを含有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４ ＴＨＹ−ｐＰＨＰ７１５３９およびＡＧＬ１を感染させた− ＲＢ−ＵＢＩ−ＺＭＰＲＯ：ＭＯ−ＰＡＴ：ＰＲＯＴＥＩＮ ＬＩＮＫＥＲ：ＤＳ−ＲＥＤ：ＰＩＮＩＩ−ＬＢ（配列番号６８。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４ ＴＨＹ−は、比較的弱い株であり、弱い一過性Ｔ−ＤＮＡ送達に終わることが以前に示され、コムギの形質転換には不十分な株であると他で報告されており、このため、研究には使われてこなかった。一過性Ｔ−ＤＮＡ発現のために、この品種の２０〜３０個の胚を感染させ、感染後、７日目および１５日目にＤＳ−ＲＥＤの発現を観察した。実験では、２種の異なるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１およびＬＢＡ４４０４Ｔｈｙ−ｐＰＨＰ７１５３９を試験し、コムギの安定な形質転換（１５ＤＰＩ）に対するｐＶＩＲ９の影響を特徴付けた（図７）。天然のＡＧＬ１株は、ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−ｐＰＨＰ７１５３９株と比べると、７ＤＰＩで数分の一の一過性ＤｓＲｅｄ発現を示し、１５ＤＰＩでは、より少ないＤｓＲｅｄ発現セクターを引き続き示し（図７）、感染胚中での安定なＴ−ＤＮＡ発現を示した。

【0231】

別の実験では、ｐＶＩＲヘルパープラスミドを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、コムギの複数の品種で、形質転換の安定性を改善し、かつＴ０イベントの回収を増加させた。この目的のために、異なる２品種のコムギ（ＦｉｅｌｄｅｒおよびＨＣ０４５６Ｄ）で、ｐＶＩＲヘルパーｐＰＨＰ７０２９８を含有するか、または含有しないアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１によるコムギの形質転換の比較実験を行った。２品種のコムギ（ＦｉｅｌｄｅｒおよびＨＣ０４５６Ｄ）から未成熟胚を収穫し、Ｔ０植物の形質転換頻度を得るために、次の発現カセット；ＲＢ−ＵＢＩ−ＺＭＰＲＯ：ＭＯ−ＰＡＴ：ＰＲＯＴＥＩＮ ＬＩＮＫＥＲ：ＤＳ−ＲＥＤ：ＰＩＮＩＩ−ＬＢ（配列番号６８）を含有する２種の異なるバイナリープラスミド（ＡおよびＢ）を含有する、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＡＧＬ１と、ｐＰＨＰ７０２９８をプラスしたＡＧＬ１を感染させた。形質転換のデータを表１６に要約する。

【0232】

【表17】

【0233】

ｐＰＨＰ７０２９８をプラスしたＡＧＬ１で形質転換したコムギの未成熟胚は、カルス形質転換およびＴ０植物形質転換を含むコムギの形質転換のあらゆる段階で顕著な改善を示した。ｐＶＩＲ７プラスミドを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌によるＴ０植物形質転換頻度は、ｐＶＩＲ７ヘルパープラスミドを含まない野生型株のＡＧＬ１よりはるかに高いことが測定された。ｐＶＩＲ７、ｐＶＩＲ９またはｐＶＩＲ１０プラスミドを含有するオクロバクテリウム（Ｏｃｈｒｏｂａｃｔｒｕｍ）属は、米国仮特許出願第６２／２１１２６７号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているように、植物の形質転換に成功裡に使用されてきた（データは示さず）。

【0234】

当業者は、ヘルパープラスミドｐＶＩＲ９（配列番号３５、表２３を参照）またはｐＶＩＲ１０を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌が、複数のトウモロコシ系統で、形質転換頻度、クオリティイベントおよび使用可能クオリティイベントの回収を有意に改善できることを認識するであろう。

【0235】

実施例９：ＰＶＩＲ９プラスミドはトウモロコシの形質転換を改善した
米国仮特許出願第６２／２４８５７８号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載のように、トウモロコシの遺伝子型ＰＨ１８４Ｃを形質転換するターナリーベクターシステムを使用して、ｐＶＩＲ９プラスミドのトウモロコシ形質転換を試験した。スーパーバイナリープラスミドｐＰＨＰ７１５３９の、植物発現カセットを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌への導入は、トウモロコシの一過性Ｔ−ＤＮＡ送達の改善、体細胞胚表現型およびトランスジェニックＴ０イベント回収の改善をもたらした。

【0236】

簡潔に述べれば、受粉から約１１日後に、Ｐｉｏｎｅｅｒトウモロコシ近交系ＰＨ１８４Ｃ）から未成熟胚（長さ２〜２．５ｍｍ）を収穫し、以下の組成を有するＴ−ＤＮＡプラスミド１）ｐＰＨＰ８０５６１または２）ｐＰＨＰ８０５５９を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４ ＴＨＹ−を感染させた；ｐＰＨＰ８０５６１− ＲＢ＋ＬＯＸ Ｐ−ＺＭ−ＡＸＩＧ１ １ＸＯＰ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１ ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８ ＴＥＲＭ＋ＰＩＮＩＩ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ ＴＥＲＭ＋ＯＬＥ ＰＲＯ：ＭＯ−ＣＲＥ ＥＸＯＮ１：ＳＴ−ＬＳ１ ＩＮＴＲＯＮ２：ＭＯ−ＣＲＥ ＥＸＯＮ２−ＰＩＮＩＩ ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＵＢＩ ＰＲＯ：ＳＢ−ＵＢＩ ＩＮＴＲＯＮ１：ＵＢＩ ＰＲＯ：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ：ＯＳ−ＵＢＩ ＴＥＲＭ＋ＬＯＸＰ＋ＳＢ−ＡＬＳ ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＰＩＮＩＩ ＴＥＲＭ＋ＬＢ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６９）およびｐＰＨＰ８０５５９− ＲＢ＋ＬＯＸ Ｐ−ＺＭ−ＡＸＩＧ１ １ＸＯＰ−ＷＵＳ２：：ＩＮ２−１ ＴＥＲＭ＋ＺＭ−ＰＬＴＰ ＰＲＯ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＯＳ−Ｔ２８ ＴＥＲＭ＋ＰＩＮＩＩ＋ＧＺ−Ｗ６４Ａ ＴＥＲＭ＋ＬＴＰ２ ＰＲＯ：ＭＯ−ＣＲＥ ＥＸＯＮ１：ＳＴ−ＬＳ１ ＩＮＴＲＯＮ２：ＭＯ−ＣＲＥ ＥＸＯＮ２−ＰＩＮＩＩ ＴＥＲＭ＋ＳＢ−ＵＢＩ ＰＲＯ：ＳＢ−ＵＢＩ ＩＮＴＲＯＮ１：ＵＢＩ ＰＲＯ：ＺＳ−ＧＲＥＥＮ：ＯＳ−ＵＢＩ ＴＥＲＭ＋ＬＯＸＰ＋ＳＢ−ＡＬＳ ＰＲＯ：：ＨＲＡ：：ＰＩＮＩＩ ＴＥＲＭ＋ＬＢ（配列番号７０）。これらのプラスミドを、２種の異なるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−ｐＳＢ１およびＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−ｐＶＩＲ９（ｐＰＨＰ７１５３９）へ可動させた。このプラスミドを含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌を、光学密度が０．５（５２０ｎｍで）になるまで液体培地で培養し、未成熟胚（約６００超の胚、スプリットイヤー法、３つの複製物）をこのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液中で５分間インキュベートした後、液体から取り出して７１０Ｉ固体培地上に置いた。２４時間後、胚を６０５Ｔ培地（表２１を参照）に移し、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を除去する選択を開始した。６日後、処理した未成熟胚の表面に多くの小さな体細胞胚が観察された。アグロ感染から７日後、胚を成熟培地（０．１ｍｇ／ｌイマザピル含有の２８９Ｑ培地）に移し、イマダゾリノン系除草剤を使用して、トランスジェニック胚を選択した。成熟培地に１４日間置いた後、成熟胚を発根培地（１３１５８Ｈ培地；１３１５８培地＋２５ｍｇ／ｌセフォタキシム）に移し、ＰＣＲ分析用に葉片をサンプリングした。ＴＸ頻度、切除ＱＥ頻度およびＵＥ頻度に関するデータを表１７に示す。

【0237】

【表18】

【0238】

ｐＰＨＰ７１５３９（ｐＶＩＲ９）プラスミドを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌で形質転換した未成熟胚は、ｐＳＢ１プラスミドで形質転換したアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌と比べて、多数のＴ０植物を生み出し、かつより高頻度のＴ０形質転換をもたらした。ヘルパープラスミドｐＶＩＲ９を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌はまた、プラスミドｐＳＢ１を感染させた未成熟胚と比べて、有意により高頻度の使用可能クオリティイベントをもたらした。

【0239】

当業者は、ｐＶＩＲ９に代えてヘルパープラスミドｐＶＩＲ７またはｐＶＩＲ１０を含むアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌が、トウモロコシの形質転換、クオリティイベントおよび使用可能なクオリティイベントを相当に改善できることを認識するであろう。

【0240】

実施例１０：異なる複製起点を有する植物形質転換用ＰＶＩＲプラスミド
複製起点の違いがトウモロコシの形質転換用ヘルパープラスミドに及ぼす影響を特徴付けるために、ターナリーベクターシステムを使用して、トウモロコシの遺伝子型ＨＣ６９を形質転換した。上記実施例９に記載のようなトウモロコシの形質転換法（米国仮特許出願第６２／２４８５７８号明細書、参照により全体が本明細書に組み込まれる）を使用して、異なる細菌性複製起点、すなわち、ｐＶＳ１、ｐＳａｐａｒＤＥおよびＲＫ２ｐａｒＤＥ（表１８）を含有する４種のｐＶＩＲプラスミドを試験した。トウモロコシ近交系（ＨＣ６９）から未成熟胚を収穫し、以下のＴ−ＤＮＡ組成を有するｐＰＨＰ７９０６６（配列番号７１）と、異なる細菌性複製起点（「ｏｒｉ」）すなわち次のｐＶＳ１（ｐＶＩＲ１０；ｐＰＨＰ７９７６１）、ｐＳａｐａｒＤＥ（ｐＶＩＲ１０；ｐＰＨＰ８０３９９）、ＲＫ２ｐａｒＤＥ（ｐＶＩＲ１０；ｐＰＨＰ８０５６６）およびコントロール（ｐＶＩＲ９；ｐＰＨＰ７１５３９）とを含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−株）（表１８に詳述）を感染させた。形質転換頻度を決定するために、スプリットイヤー法を使用して、各コンストラクトに対し、近交系ＨＣ６９の１５０個の胚を形質転換した。すべてのコンストラクトが高頻度でトウモロコシを形質転換し、ｐＶＩＲプラスミド中でこれらの異なるｏｒｉの組み合わせが機能することを示した。近交系ＨＣ６９での形質転換データを表１９に示す。

【0241】

【表19】

【0242】

【表20】

【0243】

異なるｏｒｉを有するｐＶＩＲプラスミドがトウモロコシを形質転換し、Ｔ０イベントを再生した。Ｔ０の形質転換頻度は、試験した全ての異なるｏｒｉで同等であった。

【0244】

実施例１１：トウモロコシにおけるＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９試薬の送達システムおよびＰＶＩＲプラスミドによる遺伝子変異の改善
ＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓ９の送達および異なるヘルパープラスミドから回収される変異体の割合に対するヘルパープラスミドの影響を特徴付けるために、ターナリーベクターシステムを使用して、トウモロコシの遺伝子型ＰＨ２ＨＴを形質転換した。ランダム形質転換プロトコールを使用して、標的遺伝子ＺＭ−ＡＲＧＯＳ８およびＺＭ−ＧＣＮ２における脱落欠失の発生に特異的な２種のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列をそれぞれ含む、２種の異なるコンストラクトｐＰＨＰ７８１４７（配列番号７２）およびｐＰＨＰ７８１４８（配列番号７３）を形質転換した。ガイドＲＮＡ配列および発現カセットの配列をそれぞれ配列番号７２、および配列番号７３に記載する。トウモロコシ近交系ＰＨ１８４Ｃから未成熟胚を収穫し、Ｔ−ＤＮＡ発現カセットｐＰＨＰ７８１４７またはｐＰＨＰ７８１４８を含有する、ヘルパープラスミドｐＰＳＢ１またはｐＶＩＲ９を含有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−株）を感染させた。形質転換頻度、変異の割合、単一脱落欠失および両アレルの脱落欠失割合を決定するために、スプリットイヤー法を使用して、各コンストラクトに対し、近交系ＰＨ２ＲＴの約２８０個の胚を形質転換した。変異の割合を決定するために、Ｔ０植物のディープシーケンシング分析を行い、分子イベントクオリティは、前述したように、標的遺伝子についてＰＣＲおよびｑＰＣＲ分析を行うことによって決定した。形質転換データおよびＰＨ２ＲＴの各コンストラクトから得られる遺伝子編集の種類を表２０に示す。

【0245】

【表21】

【0246】

新規ｐＶＩＲスーパーバイナリーベクターから回収された形質転換頻度および変異の割合は、ｐＳＢ１で観察されたものをはるかに上回った。形質転換頻度はｇＲＮＡ配列および欠失の種類により変化した。より大きな脱落欠失が標的（６１９ｂｐ）とされたＡＲＧＯＳ８では、観察された形質転換頻度は、ｐＳＢ１での約６１．８％と比較して、ｐＶＩＲ９では約８０．３％であった。ＡＲＧＯＳ８コンストラクトで回収された単一アレルの脱落頻度は、ｐＳＢ１（２．３％）と比較してｐＶＩＲ９（７．７％）でより高かった。ＺＭ−ＧＣＮ２（５２ｂｐ）のより小さい脱落欠失を標的とする第２のコンストラクトで、ヘルパープラスミドｐＶＩＲ９を含有するアルゴで形質転換した胚は、ｐＳＢ１ヘルパーを含むアルゴから回収したイベントと比較して、Ｔ０イベントの発生および変異体イベント（単一アレルおよび両アレルの変異）の回収はより高かった（表２０）。

【0247】

当業者は、ヘルパープラスミドｐＶＩＲ７またはｐＶＩＲ１０を有するアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌が、複数のトウモロコシ近交系で、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたは関連ヌクレアーゼの送達を促進し、ゲノムの編集およびゲノムの改変を改善できることを認識するであろう。

【0248】

実施例１２：スーパーバイナリープラスミドを宿すアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−における部位特異的組込み（ＳＳＩ）イベントの回収の改善
正確なＳＳＩイベントの回収に対するスーパーバイナリーベクター（ｐＶＩＲ９；ｐＰＨＰ７１５３９）の効果を決定するために、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−中のｐＶＩＲ９ヘルパープラスミドを可動化した。ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−株では、正確なＳＳＩイベントの回収が低いことが示されている（米国仮特許出願第６２／２９６６３９号明細書、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。アグロ株ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−中のｐＶＩＲ９がＳＳＩイベントの回収を改善するかどうかを試験するために、以下の発現カセットを有するドナーカセット、すなわちＲＢ−ＯＳ−ＡＣＴＩＮ ＰＲＯ：ＯＳ−ＡＣＴＩＮ ＩＮＴＲＯＮ：：ＺＭ−ＷＵＳ２：：ＰＩＮＩＩ＋ＵＢＩ ＰＲＯ：：ＵＢＩ１ＺＭ ＩＮＴＲＯＮ：：ＺＭ−ＯＤＰ２：：ＰＩＮＩＩ ＴＥＲＭ：：ＵＢＩ ＰＲＯ：ＵＢＩ１ＺＭ ＩＮＴＲＯＮ：：ＭＯ−ＦＬＰ：：ＰＩＮＩＩ ＴＥＲＭ：：ＣａＭＶ３５Ｓ ＴＥＲＭ＋ＦＲＴ１：ＰＭＩ：：ＰＩＮＩＩ ＴＥＲＭ＋ＴＲＡＩＴ ＧＥＮＥ＋ＦＲＴ８７−ＬＢを含有するバイナリーベクターを、２種の異なるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株ＡＧＬ１およびＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−ｐＰＨＰ７１５３９へ可動させた（ｐＰＨＰ７９３６６；配列番号７４）。後述するように、アグロ媒介形質転換によりドナーカセットを、遺伝子型ＰＨ１８４ＣのＦＲＴ１−８７ランディング部位を有する複数の標的部位に送達した。

【0249】

簡潔に言えば、ＦＲＴ１〜ＦＲＴ８７ランディング部位を有する標的系統へのアグロ媒介形質転換を以下のように行った。Ｔｗｅｅｎ２０を１滴加えた２０％（ｖ／ｖ）漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ソーダ）中で、トウモロコシ（トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ．））の品種、ＰＨ１８４Ｃの穂表面を１５〜２０分間滅菌し、続いて滅菌水で３回洗浄した。通常１．５〜１．８ｍｍの未成熟胚（ＩＥ）を穂から単離し、アセトシリンゴン溶液を含む、２ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）感染培地中に置いた。溶液を抜き取り、１ｍｌのアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を胚に加え、５〜１０秒間ボルテックスし、その後、室温で５分間インキュベートした。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の懸濁液と胚を、７１０Ｉ共培養培地（表２１を参照）に注いだ。滅菌したスパチュラで、チューブに残った胚をプレートに移した。アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）懸濁液を抜き取り、胚は軸側を下にして培地上に置いた。Ｐａｒａｆｉｌｍ（商標）テープ（耐湿性の柔軟なプラスチック、Ｂｅｍｉｓ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｉｎｃ．，１ Ｎｅｅｎａｈ Ｃｅｎｔｅｒ ４^ｔｈｆｌｏｏｒ，ＰＯ Ｂｏｘ ６６９，Ｎｅｅｎａｈ，ＷＩ ５４９５７より入手可能）でプレートを密封し、１〜３日間の共培養のために２１℃の暗所でインキュベートした。

【0250】

胚を、選択せずに、安静培地１３２６５Ａ（表２１を参照）に移した。３〜７日後、マンノースまたは他の適切な選択剤を補った、選択培地１３１５２Ｚ（表２１を参照）にそれらを移した。選択の第１ラウンドから３週間後から、３〜４週間隔で、選択剤を含有する１３１５２Ｚ（表２１を参照）に培養物を移した。形質転換されたなら、トランスジェニック緑色組織を選択し、基本的に米国特許第７１０２０５６号明細書、米国特許第８４０４９３０号明細書および米国特許出願公開第２０１３／００５５４７２号明細書に記載されているように培養した。

【0251】

【表22】

【0252】

【表23】

【0253】

【表24】

【0254】

【表25】

【0255】

【表26】

【0256】

【表27】

【0257】

【表28】

【0258】

【表29】

【0259】

【表30】

【0260】

多重ＰＣＲ法を使用してＳＳＩイベントを同定し、ランダムなアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のＴ−ＤＮＡの存在／不在を検出し、ベクター主鎖分析およびｑＰＣＲにより標的遺伝子の切除、ＦＬＰの挿入（ランダムＴ−ＤＮＡの組込み）およびＦＲＴペア接合部（１／８７）を決定した。データを表２２に要約する。主鎖の挿入がない標的およびＦＬＰを除き、無傷ＦＲＴ接合部（１／８７）を有するドナー遺伝子の単一コピーを選択することにより、正確なＳＳＩイベントを同定した。ＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−株におけるヘルパープラスミド（ｐＶＩＲ９）の使用は、ヘルパープラスミドを含まないＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−株を使用した標準的なＳＳＩ回収と比較して、この株からのＳＳＩイベントの回収を改善した。ヘルパープラスミド（ｐＶＩＲ９）の非存在下では、２種のＴ−ＤＮＡ発現カセット、すなわち、ＺｍＵｂｉＰｒｏ：：ＦＬＰ：：ＰＩＮＩＩ＋ＦＲＴ１−ＰＭＩ：：ＰＩＮＩＩ＋ＺｍＵｂｉＰｒｏ：：ＤｓＲＥＤ：：ＰＩＮＩＩ−ＦＲＴ８７（ｐＰＨＰ６０５７７；配列番号７５）からなる第１のＴ−ＤＮＡ、およびｌｏｘＰ−Ｒａｂ１７Ｐｒｏ：：Ｃｒｅ＋ＮｏｓＰｒｏ：：ＷＵＳ：：ＰＩＮＩＩ＋ＺｍＵｂｉＰｒｏ：：ＢＢＭ：：ＰＩＮＩＩ−ｌｏｘＰ（ｐＰＨＰ４４５４２；配列番号７６）から構成される第２のＴ−ＤＮＡを含むターナリーベクターを宿すＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−株は、アグロＳＳＩが困難な近交系ＰＨ１８４Ｃでの多重ＲＴＬで観察されるＬＢＡ４４０４ＴＨＹ−７１５３９株でのＳＳＩ頻度（０．４〜０．５％）と比較すると、遺伝子型ＰＨＲ０３では非常に低いＳＳＩ頻度（０．１％）を与えるにとどまった（米国仮特許出願第６２／２９６６３９号明細書、参照により全体を本明細書に組み込まれる）。

【0261】

【表31】

【0262】

当業者は、異なるアグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株へのヘルパープラスミドｐＶＩＲ７（配列番号３４）またはｐＶＩＲ１０（配列番号３６）の組込みが、複数のトウモロコシ近交系において、アグロ株の病原性を高め、ＳＳＩ頻度を改善できることを認識するであろう。

【0263】

実施例１３：異なる複製起点を有するドナーカセットおよび／またはヘルパープラスミドを使用したアルゴＳＳＩの改善
アグロＳＳＩを改善する他の方法は、プラスミドコピー数に違い（高、中間、低；例えば、ＲｅｐＡＢＣ、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ＲＫ２など）がある、異なる細菌性複製起点（Ｏｒｉ）を有するドナーカセットを構築し、植物細胞に送達されるドナーＤＮＡ分子の量の設定（高〜低）を可能にすることである。あるいは、異なるＯｒｉを宿すドナーカセットは、他のさらなるビルレンス遺伝子を有するヘルパープラスミドと組み合わせることができる。これらのプラスミドは、そのコピー数に違いがある、異なる細菌性複製起点（ＲｅｐＡＢＣ、ｐＲｉ、ｐＶＳ１、ＲＫ２）を有していてもよい。この方法は、ＳＳＩのイベントおよび回収を改善し得る。

【0264】

実施例１４：配列番号（配列番号）

【0265】

【表32】

【0266】

【表33】

【0267】

【表34】

【0268】

【表35】

【0269】

【表36】

【0270】

本明細書では、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は別途文脈が明確に指示しない限り複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、そのような細胞を複数種含み、「タンパク質」への言及は、１つ以上のタンパク質および当業者に知られたその同等物などを含む。別途明確な指示がない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同一の意味を有する。

【0271】

本明細書で言及した全ての特許、刊行物および特許出願は、本開示が属する技術分野の当業者の水準を示すものである。全ての特許、刊行物および特許出願は、あたかも個々の特許、刊行物または特許出願が、明確にかつ個々に参照により全体的に組み込まれるよう指示されているのと同程度に、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0272】

以上の開示は、理解を明確にする目的で、図面および実施例を使ってある程度の詳しく説明してきたが、添付の請求項の範囲内で一定の変更および修正を行うことができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]