特許 6871760 抗ウイルス作用促進用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6871760

(24)【登録日】2021年4月20日

(45)【発行日】2021年5月12日

(54)【発明の名称】抗ウイルス作用促進用組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 38/05 20060101AFI20210426BHJP

   A61P 31/16 20060101ALI20210426BHJP

   A61P 31/22 20060101ALI20210426BHJP

   A61K 36/03 20060101ALI20210426BHJP

【ＦＩ】

   A61K38/05

   A61P31/16

   A61P31/22

   A61K36/03

【請求項の数】2

【全頁数】15

(21)【出願番号】特願2017-40152(P2017-40152)

(22)【出願日】2017年3月3日

(65)【公開番号】特開2018-52910(P2018-52910A)

(43)【公開日】2018年4月5日

【審査請求日】2019年11月6日

(31)【優先権主張番号】特願2016-188318(P2016-188318)

(32)【優先日】2016年9月27日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】390010674

【氏名又は名称】理研ビタミン株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100077012

【弁理士】

【氏名又は名称】岩谷 龍

(72)【発明者】

【氏名】吉永 恵子

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１０−５３９０６９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００３−２４６７９６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 J. Biol. Chem., (1990), 265, [21], p.12178-12183

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３８／００−３８／５８

Ａ６１Ｋ ４１／００−４５／０８

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ２３Ｌ ５／４０−５／４９

Ａ２３Ｌ ３１／００−３３／２９

Ａ６１Ｋ ８／００−８／９９

Ａ６１Ｑ １／００−９０／００

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／０５

Ａ６１Ｋ ３６／０６，３６／０７−３６／９０６８

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バリン−チロシン、イソロイシン−チロシン又はフェニルアラニン−チロシンの配列を有するジペプチド又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗インフルエンザウイルス作用又は抗単純ヘルペスウイルス作用促進用組成物。

【請求項2】

わかめ由来のペプチドを有効成分とし、わかめ由来のペプチドがバリン−チロシン、イソロイシン−チロシン又はフェニルアラニン−チロシンの配列を有するジペプチド又はその薬理学的に許容される塩を含有する、抗インフルエンザウイルス作用又は抗単純ヘルペスウイルス作用促進用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗ウイルス作用促進用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

インフルエンザは、インフルエンザウイルスが気道粘膜の上皮細胞で感染及び増殖し、上気道に炎症を引き起こす結果として発症する。インフルエンザによる年間死亡者数は、世界で約２５〜５０万人と推計されており、その社会的影響は大きく、社会及び/又は経済活動における損失や医療費の増加も無視できない。

【0003】

また、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）は世界的に広く浸透したウイルスで、感染様式はＨＳＶによる皮疹や口唇ヘルペスを発症した患者の唾液との密接な接触、性器ヘルペスからの母子感染あるいは性的感染によると考えられている。ＨＳＶとしては、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）や単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）が挙げられる。ＨＳＶ−１は、主な病態として口唇ヘルペスや角膜ヘルペス、ヘルペス脳炎、ＨＳＶ−２は、陰部ヘルペスや皮膚粘膜病変等を招き、いずれもＱＯＬの低下を招く。

【0004】

このようなウイルス感染症に対し、例えばインフルエンザの治療薬としては、ノイラミニダーゼ阻害薬であるザナミビル、オセルタミビル等が用いられるが、これらは、薬剤耐性株の出現や、副作用、発病後２日以内の投与が望まれる等の問題がある。

【0005】

一方、ワカメから抽出した蛋白質を蛋白質分解酵素等で処理して得られるペプチドは、安全性に優れ、日常的に長期にわたり服用及び/又は摂取が可能なものであるとともに、アンジオテンシン変換酵素阻害作用があることが知られている（特許文献１〜３）。しかし、このワカメ由来のペプチドの抗ウイルス作用については明らかとなっていなかった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２００３−１２８６９４号公報

【特許文献2】特開２００２−１３８１００号公報

【特許文献3】特開２００１−０６４２９９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、安全性に優れ、日常的に長期にわたり服用及び/又は摂取が可能な抗ウイルス作用促進用組成物を提供することを課題とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者は、上記課題に対して鋭意検討を行った結果、特定の配列を有するペプチドの服用又は摂取により、上記課題が解決されることを見出し、この知見に基づいて本発明を成すに至った。

【0009】

すなわち、本発明は、下記の（１）〜（６）からなっている。
（１）チロシンをＣ末端に有するアミノ酸残基数が２〜１０のペプチド若しくはその誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗ウイルス作用促進用組成物。
（２）疎水性アミノ酸−チロシンの配列をＣ末端に有するペプチド若しくはその誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗ウイルス作用促進用組成物。
（３）疎水性アミノ酸−チロシンの配列を有するジペプチド若しくはその誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする抗ウイルス作用促進用組成物。
（４）疎水性アミノ酸がバリン、イソロイシン又はフェニルアラニンである（２）又は（３）に記載の抗ウイルス作用促進用組成物。
（５）わかめ由来のペプチドを有効成分とする抗ウイルス作用促進用組成物。
（６）前記ウイルスが、インフルエンザウイルス又は単純ヘルペスウイルスである前記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗ウイルス作用促進用組成物。

【発明の効果】

【0010】

本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、種々のウイルスに対して抗ウイルス作用を促進する効果を有する。
本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、日常的に長期間にわたり摂取しても安全性に全く問題は無い。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】図１は、ジペプチド（Ｉｌｅ−Ｔｙｒ又はＰｈｅ-Ｔｙｒ）投与群、対照群及びアシクロビル投与群マウスについてＨＳＶ−２接種の日からその１４日後までの症状スコア（ｌｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）の平均値を示すグラフである。

【0012】

【図2】図２は、わかめ由来ペプチド（１ｍｇ／ｄａｙ、５ｍｇ／ｄａｙ又は１０ｍｇ／ｄａｙ）投与群、対照群及びアシクロビル投与群マウスについてＨＳＶ−２接種の日からその１４日後までのｌｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの平均値を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、チロシンをＣ末端に有するアミノ酸残基数が２〜１０（好ましくは２〜５、より好ましくは２〜３、最も好ましくは２）のペプチド若しくはその誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする。

【0014】

また、本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、Ｖａｌ−Ｔｙｒ（バリン−チロシン）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（イソロイシン−チロシン）又はＰｈｅ−Ｔｙｒ（フェニルアラニン−チロシン）等の疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、プロリン（Ｐｒｏ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、バリン（Ｖａｌ）及びアラニン（Ａｌａ）からなる群より選択される１のアミノ酸）−チロシン（Ｔｙｒ）の配列をＣ末端に有するペプチド若しくはその誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とする。該ペプチドのアミノ酸残基数は、通常２以上、好ましくは２〜１０、より好ましくは２〜５、更に好ましくは２〜３、最も好ましくは２である。ペプチドのアミノ酸残基数が２の場合、本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ又はＰｈｅ−Ｔｙｒ等の疎水性アミノ酸−チロシンの配列を有するジペプチド若しくはその誘導体又はその薬理学的に許容される塩を有効成分とするものである。以下、本明細書では、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ又はＰｈｅ−Ｔｙｒ等の上記例示した疎水性アミノ酸−チロシンの配列を有するジペプチドを、単に疎水性アミノ酸−チロシンとも表記する。

【0015】

本発明で用いられるＶａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ又はＰｈｅ−Ｔｙｒ等の疎水性アミノ酸−チロシンの配列をＣ末端に有するペプチドは、化学的に合成したものでもよく、例えば有機化学的な合成方法によりアミノ酸を段階的に導入する方法、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的方法等によって製造することができる。

【0016】

本発明のペプチドの誘導体は、特定のアミノ酸配列で示されるペプチドのＣ末端が、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）のいずれであってもよい。エステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基のほか、ピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。アミド体としては、アミド、Ｃ_１−６アルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、フェニル基で置換されたＣ_１−６のアルキル基の１つまたは２つで置換されたアミド、アミド基の窒素原子を含んで５から７員環のアザシクロアルカンを形成するアミド等が挙げられる。
本発明のペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基またはカルボキシレートを有している場合、それらの基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のペプチドの誘導体に含まれる。

【0017】

本発明のペプチドの誘導体には、Ｎ末端のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているものも含まれる。

【0018】

本発明のペプチドの誘導体を構成するアミノ酸は、側鎖が任意の置換基で修飾されていてもよい。置換基は特に限定されないが、例えば、フッ素原子、塩素原子、シアノ基、水酸基、ニトロ基、アルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基、アミノ基、リン酸基などが挙げられる。また、側鎖の置換基は、保護基で保護されていてもよい。さらに、糖鎖が結合した糖ペプチドも本発明のペプチドの誘導体に含まれる。

【0019】

本発明のペプチドまたはその誘導体は、元のペプチドの特性が保持される限り、Ｄ−アミノ酸を含んでもよく、非天然アミノ酸を含んでもよい。また、本発明のペプチドまたはその誘導体は、元のペプチドの特性が保持される限り、ペプチドに他の物質を連結してもよい。ペプチドに連結可能な他の物質としては、例えば、他のペプチド、脂質、糖または糖鎖、アセチル基、天然または合成のポリマー等が挙げられる。また、本発明のペプチドは、元のペプチドの特性が保持される限り、ペプチドに、糖鎖付加、側鎖酸化、リン酸化等の修飾を行ってもよい。

【0020】

薬理学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、硫酸、燐酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、フマル酸、シュウ酸、リンゴ酸、クエン酸、オレイン酸、パルミチン酸などの酸との塩；ナトリウム、カリウム、カルシウムなどのアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属の、またはアルミニウムの水酸化物または炭酸塩との塩；トリエチルアミン、ベンジルアミン、ジエタノールアミン、ｔ−ブチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、アルギニンなどとの塩などが挙げられる。

【0021】

また、本発明で用いられるＶａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ又はＰｈｅ−Ｔｙｒ等の疎水性アミノ酸−チロシンの配列をＣ末端に有するペプチドは、食品等に由来するものであってもよく、特に、わかめに由来するペプチド（以下、わかめ由来ペプチドという）であってもよい。

【0022】

本発明で言うところのわかめとは、分類学的にはコンブ目チガイソ科ワカメ属に属する海藻類である。わかめの種類としては、ワカメ（Ｕｎｄａｒｉａ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、ヒロメ（Ｕ．ｕｎｄａｒｉｏｉｄｅｓ）、アオワカメ（Ｕ．ｐｅｔｅｒｓｅｎｉａｎａ）があり、本発明ではいずれも好ましく用いられる。また、わかめの部位に特に制限はなく、葉、芽かぶ等のいずれを用いても良い。また、わかめの形態としては、例えば乾燥わかめ（例えば乾燥カットわかめ、素干しわかめ等）、ボイル塩蔵わかめ、塩蔵わかめ、生わかめ等のいずれでもよく、葉の厚さや色あるいは原料産地等も問わない。

【0023】

本発明で用いられるわかめ由来ペプチドは、例えば、わかめから分離した蛋白質を蛋白質分解酵素で処理して得られる処理物から分取すること等により得られる。

【0024】

わかめから蛋白質を分離する方法に特に制限はないが、例えば、わかめをアルギン酸リアーゼで処理し、これを遠心分離処理して上清を廃棄し沈殿物を回収することにより、粘質多糖類を除去し、蛋白質を分離する方法が挙げられる。

【0025】

蛋白質分解酵素による処理では、わかめから分離した蛋白質に蛋白質分解酵素を添加し、蛋白質の分解を行う。蛋白質分解酵素としては、例えば、プロテアーゼ、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン等が挙げられ、中でもプロテアーゼが好ましく用いられる。

【0026】

上記のアルギン酸リアーゼ及び蛋白質分解酵素による酵素使用量、処理の温度及びｐＨは常識的に許容される範囲内の条件であれば良いが、その酵素の至適使用量、至適温度、至適ｐＨで行うことが反応時間の短縮や酵素の安定性上望ましい。

【0027】

蛋白質分解酵素による処理により得られる処理物からペプチドを分取する方法に特に制限はないが、例えば、該処理物を遠心分離し、未分解の蛋白質を除去して上清を得た後、該上清を限外濾過膜で処理し、分子量１万以下のペプチドを得る方法が挙げられる。

【0028】

上記方法により得られるわかめ由来ペプチドは、特開２００３−１２８６９４号公報に記載されるように、特定の複数種類のジペプチドを含有するものであり、少なくともＶａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ及びＰｈｅ−Ｔｙｒ等の疎水性アミノ酸−チロシンを含有するものである。

【0029】

本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、上記ペプチドをそのまま、あるいは製薬学的に許容される添加物、食品素材、食品原料、さらに必要に応じて食品添加物等を適宜混合し、常法に従い、例えば、抗ウイルス作用の促進を目的とする医薬品、医薬部外品、化粧品、生活用品又は飲食品（健康食品、特定保健用食品又は機能性表示食品を含む）として製造される。該医薬品又は医薬部外品としては、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、マイクロカプセル、ソフトカプセル、ハードカプセル、シロップ剤、エリキシル剤、注射剤、点滴等経口的又は非経口的形態の製剤が挙げられる。該化粧品としては、例えば、口紅、乳液、化粧水、保湿パック、美容液、ファンデーション等が挙げられる。該生活用品としては、衛生用品、洗剤、家庭用日用品、オーラルケア用品、トイレタリー用品、家庭用化学製品等であってもよく、例えば、絆創膏、マスク、包帯、医療用テープ、洗濯用洗剤、台所用洗剤、手ぬぐい、タオル、スポンジ、歯磨剤、歯ブラシ、洗口液、口中清涼剤、スキンケアクリーム、アロマ用品、殺虫剤、防虫剤等が挙げられる。該飲食品としては、例えば、固形食品、クリーム状又はジャム様の半固形食品、ゲル状食品、飲料等あらゆる食品形態をとることが可能である。具体的には、例えば、清涼飲料、サプリメント、クッキー、プリン、ゼリー菓子、キャンディ、ドロップ、チューインガム、チョコレート、ヨーグルト、アイスクリーム、マーガリン、ショートニング、マヨネーズ又はドレッシング等が挙げられる。

【0030】

上記医薬品、医薬部外品又は飲食品の製造に用いられる添加物、食品素材、食品原料又は食品添加物としては、例えば、賦形剤（乳糖、デキストリン、コーンスターチ、結晶セルロース等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル等）、崩壊剤（カルボキシメチルセルロースカルシウム、無水リン酸水素カルシウム、炭酸カルシウム等）、結合剤（デンプン糊液、ヒドロキシプロピルセルロース液、アラビアガム液等）、溶解補助剤（アラビアガム、ポリソルベート８０等）、甘味料（砂糖、果糖、ブドウ糖液糖、ハチミツ、アスパルテーム等）、着色料（β−カロテン、食用タール色素、リボフラビン等）、保存料（ソルビン酸、パラオキシ安息香酸メチル、亜硫酸ナトリウム等）、増粘剤（アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム等）、酸化防止剤（ＢＨＴ、ＢＨＡ、アスコルビン酸、トコフェロール等）、香料（ハッカ、ストロベリー香料等）、酸味料（クエン酸、乳糖、ＤＬ−リンゴ酸等）、調味料（ＤＬ−アラニン、５´−イノシン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム等）、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等）、ｐＨ調整剤（クエン酸、クエン酸三ナトリウム等）、ビタミン類、ミネラル類、アミノ酸類等が挙げられる。

【0031】

本発明の抗ウイルス作用促進用組成物を医薬品、医薬部外品、化粧品、生活用品又は飲食品として使用する場合、上記した添加物、食品素材、食品原料又は食品添加物の他に、薬剤学的又は食品衛生学的に許容される他の素材を常法により適宜添加混合してもよい。このようなものとしては特に限定されず、例えば、コーティング剤、吸収促進剤、安定化剤、漢方薬（生薬エキス）等が挙げられる。

【0032】

本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、種々のウイルスに対して抗ウイルス作用（例えば、宿主細胞に感染したウイルスの細胞内における増殖を抑制する作用等）を示す。本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、特にインフルエンザウイルス及び単純ヘルペスウイルス（好ましくは単純ヘルペスウイルス２型）に抗ウイルス作用を示す。

【0033】

本発明の抗ウイルス作用促進用組成物は、ウイルスによって引き起こされる疾患全般に適用可能と考えられ、例えば、感冒、インフルエンザ、咽頭炎、喉頭炎、気管支炎等の呼吸器系ウイルス性疾患、麻疹、耳下腺炎、風疹、突発性発疹、水痘・帯状疱疹、結節等の皮膚疾病、口唇ヘルペス、性器ヘルペス等の粘膜疾病、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等の肝炎、バーキットリンパ腫、肝細胞癌、子宮頸癌、成人T細胞白血病、カポジ肉腫等のウイルス性腫瘍、ヒト免疫不全症候群、風疹ウイルスによる発熱及び皮膚病変等に有効と考えられる。

【0034】

本発明の抗ウイルス作用促進用組成物を経口的に摂取する場合、摂取量は、感染症による症状、摂取する対象の性別、年齢等によって異なるが、例えば、成人１日当たりの用量は、有効成分であるペプチド（例えば、わかめ由来ペプチド）の乾燥物換算量で約０．０１〜５００ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．０５〜１００ｍｇ／体重１ｋｇの範囲である。この用量を、一日のうち１回で摂取しても良いし、又は数回に分けて摂取してもよい。但し、実際の用量は、目的や摂取者の状況（性別、年齢、健康状態等）を考慮して決められるべきである。

【0035】

以下、実施例をもって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【実施例】

【0036】

[実験例１]
[ジペプチドの抗ウイルス活性試験]
（１）供試ジペプチド
１）Ｖａｌ−Ｔｙｒ（商品名：Ｖａｌ−Ｔｙｒ；ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ社製）
２）Ｉｌｅ−Ｔｙｒ（商品名：Ｈ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒ−ＯＨ；ＢＡＣＨＥＭ社製）
３）Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（商品名：Ｈ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−ＯＨ；ＢＡＣＨＥＭ社製）

【0037】

（２）抗インフルエンザウイルス活性試験
インフルエンザウイルス感染マウスを用い、ジペプチドの抗インフルエンザウイルス活性について調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）を１群当たり１０例用い、下記の５群に分けた。各群のマウスにＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＮＷＳ／３３、Ｈ１Ｎ１亜型）を麻酔下で１回の経鼻接種により感染させた。１回の接種量は、２×１０^４ＰＦＵ（プラーク形成単位）／５０μＬ／マウスとした。各試料をウイルス感染の１週間前から感染後１週間までの計１４日間、１日２回（午前９時及び午後６時）経口投与した。尚、タミフルの経口投与は、タミフルを０．０５質量％含む生理食塩水を調製して行った。また、ジペプチドの経口投与は、Ｖａｌ−Ｔｙｒを０．２５質量％含む生理食塩水（第３群）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒを０．２５質量％含む生理食塩水（第４群）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒを０．２５質量％含む生理食塩水（第５群）を各々調製して行った。
第１群：対照（蒸留水） ０．４ｍＬ／マウス／ｄａｙ
第２群：タミフル（リン酸オセルタミビル） ０．２ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第３群：Ｖａｌ−Ｔｙｒ １ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第４群：Ｉｌｅ−Ｔｙｒ １ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第５群：Ｐｈｅ−Ｔｙｒ １ｍｇ／マウス／ｄａｙ

【0038】

各群のマウスのうち、５例は感染後３日目に気道洗浄液（ＢＡＬＦ）及び肺を採取し、ウイルス量をプラークアッセイにより測定した。残り５例について、感染２週間後にＢＡＬＦ及び血清を採取し、ＢＡＬＦ及び血清中の中和抗体価を測定した。中和抗体価は以下の方法で測定した。即ち、血清をＰＢＳで適宜希釈し、その０．１ｍＬとインフルエンザウイルス液（２００ＰＦＵ／０．１ｍＬ）０．１ｍＬを混合し、３７℃で１時間処理した。この混合液０．１ｍＬを３５ｍｍディッシュに培養したＭＤＣＫ細胞に加えて感染させ、２日後に形成されたプラークをクリスタルバイオレット液で染色してプラーク数を測定した。血清の代わりに生理食塩水をウイルス液に加えた対照のプラーク数を１００％として５０％のプラーク数となる血清希釈倍数を求め、中和抗体価とした。

【0039】

表１に、ＢＡＬＦ中及び肺内のウイルス量を示す。表２に、ＢＡＬＦ中及び血清中のウイルスに対する中和抗体価を示す。

【0040】

【表1】

【0041】

表１の結果から、抗ウイルス薬のタミフル群だけでなく、ジペプチド群のＢＡＬＦ中及び肺内のウイルス量は対照群に比べて低い値を示した。

【0042】

【表2】

【0043】

表２の結果は、抗ウイルス薬のタミフル群では何れの指標においても対照群に比べて明らかに低い値であり、インフルエンザウイルスに対する抗体産生量が少ないこと示している。一方、ジペプチド群では何れの指標においても対照群に対し高い値を示した。この結果は、Ｖａｌ−Ｔｙｒ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ又はＰｈｅ−Ｔｙｒ等の疎水性アミノ酸−チロシンを摂取することにより、インフルエンザウイルスに対する抗体が効率よく産生され、体内での当該ウイルスの増殖を抑制したことを示している。また、この結果は、ジペプチドの摂取による抗インフルエンザウイルス活性の効果がタミフルとは異なるメカニズムによるものであることと、最初の感染だけではなく、将来、再びインフルエンザウイルスに暴露されたときにも抗原抗体反応によりその予防効果を発揮できる可能性があることを示している。

【0044】

（３）抗単純ヘルペスウイルス活性試験
性器ヘルペスウイルスである単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の感染マウスを用い、ジペプチドの抗単純ヘルペスウイルス活性について調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）を１群当たり５例用い、下記の５群に分けた。各群のマウスに単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２ ＵＷ２６８株）を１回、局所に接種し、感染させた。１回の接種量は、１×１０^３ＰＦＵ（プラーク形成単位）／２０μＬ／マウスとした。ウイルス接種の６日前及び１日前に、それぞれ、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ １７−ａｃｅｔａｔｅ）（３ｍｇ／マウス）をマウスに皮下注射した。各試料をウイルス感染の１週間前から感染後１週間までの計１４日間、１日２回（午前９時及び午後６時）経口投与した。尚、アシクロビルの経口投与は、アシクロビルを０．２５質量％含む生理食塩水を調製して行った。また、ジペプチドの経口投与は、Ｖａｌ−Ｔｙｒを０．０５質量％含む生理食塩水（第３群）、Ｖａｌ−Ｔｙｒを０．２５質量％含む生理食塩水（第４群）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒを０．０５質量％含む生理食塩水（第５群）、Ｉｌｅ−Ｔｙｒを０．２５質量％含む生理食塩水（第６群）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒを０．０５質量％含む生理食塩水（第７群）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒを０．２５質量％含む生理食塩水（第８群）を各々調製して行った。
第１群：対照（蒸留水） ０．４ｍＬ／マウス／ｄａｙ
第２群：アシクロビル １ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第３群：Ｖａｌ−Ｔｙｒ ０．２ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第４群：Ｖａｌ−Ｔｙｒ １ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第５群：Ｉｌｅ−Ｔｙｒ ０．２ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第６群：Ｉｌｅ−Ｔｙｒ １ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第７群：Ｐｈｅ−Ｔｙｒ ０．２ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第８群：Ｐｈｅ−Ｔｙｒ １ｍｇ／マウス／ｄａｙ

【0045】

ウイルス接種の３日後に、マウスの局所を冷ＰＢＳで洗浄し、その中のウイルス量をプラークアッセイにより測定した。また、ウイルス接種の日から、その１４日後まで、死亡例や性器ヘルペスの発症の程度を下記基準に基づく「１」〜「５」のｌｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅにより記録した。
１：腫脹あり
２：腫脹及び発赤あり
３：液滲出あり
４：後ろ足麻痺
５：死亡

【0046】

表３に、局所洗浄液中のウイルス量を示す。図１に、ｌｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの記録結果を平均値で示す。表４に、第１、２、６、及び８群の感染後１４日目のマウスの生存率を示す。

【0047】

【表3】

【0048】

表３の結果から、抗ウイルス薬のアシクロビル群だけでなく、第５群を除くジペプチド群の局所洗浄液中のウイルス量は対照群に比べて明らかに低い値を示した。

【0049】

【表4】

【0050】

図１及び表４の結果から、抗ウイルス薬のアシクロビル群及びジペプチド群のうち第６群及び第８群では、対照群に比べて、ＨＳＶ−２感染による性器ヘルペスの発症程度が少なく、生存率が高いことが明らかである。

【0051】

[実験例２]
[わかめ由来ペプチドの抗ウイルス活性試験]

【0052】

（１）わかめ由来ペプチドの製造
乾燥わかめ１００ｇに２Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液を加えｐＨを７．０に調整し、これにアルギン酸リアーゼ（商品名：アルギン酸リアーゼＳ；ナガセケムテックス社製）１００Ｕを加えた後、４５℃で３時間処理した。その後、得られた処理物を３０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄し沈殿物を回収し、わかめから分離された蛋白質を含有する組成物を３５ｇ得た。
次に、上記組成物に対し、１５００ｇの蒸留水を加え、ホモジナイズした後、１００００Ｕのプロテアーゼ（商品名：プロテアーゼＳ「アマノ」；天野エンザイム社製）を加え、ｐＨを８．０に調製した後、７２℃にて１８時間処理した。その後３０００×ｇで５分間、遠心分離し上清を回収した。回収した上清は、限外濾過膜（商品名：ＦＢ０２−ＦＣ−ＦＵＳ０１８１；ダイゼン・メンブレン・システムズ社製）で限外濾過し、透過液を回収した後、凍結乾燥機（型式：ＲＬＥ ＩＩ−１０３；共和真空社製）を用いて、−４０℃で２時間予備凍結した後、真空度４Ｐａの条件下、棚温４０℃で約１２時間かけて凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を０．２ｍｍのスクリーンを用いて粉砕し、粉末状のわかめ由来ペプチド１０ｇを得た。

【0053】

（２）抗インフルエンザウイルス活性試験
インフルエンザウイルス感染マウスを用い、わかめ由来ペプチドの抗インフルエンザウイルス活性について調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）を１群当たり１０例用い、下記の５群に分けた。各群のマウスにＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＮＷＳ／３３、Ｈ１Ｎ１亜型）を麻酔下で１回の経鼻接種により感染させた。１回の接種量は、２×１０^４ＰＦＵ（プラーク形成単位）／５０μＬ／マウスとした。各試料をウイルス感染の１週間前から感染後１週間までの計１４日間、１日２回（午前９時及び午後６時）経口投与した。尚、タミフルの経口投与は、タミフルを０．０５質量％含む生理食塩水を調製して行った。また、わかめ由来ペプチドの経口投与は、わかめ由来ペプチドを２．５質量％含む生理食塩水（第３群）、わかめ由来ペプチドを１．２５質量％含む生理食塩水（第４群）、わかめ由来ペプチドを０．２５質量％含む生理食塩水（第５群）を各々調製して行った。
第１群：対照（蒸留水） ０．４ｍＬ／マウス／ｄａｙ
第２群：タミフル（リン酸オセルタミビル） ０．２ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第３群：わかめ由来ペプチド １０ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第４群：わかめ由来ペプチド ５ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第５群：わかめ由来ペプチド １ｍｇ／マウス／ｄａｙ

【0054】

各群のマウスのうち、５例は感染後３日目に気道洗浄液（ＢＡＬＦ）及び肺を採取し、ウイルス量をプラークアッセイにより測定した。残り５例について、感染２週間後にＢＡＬＦ及び血清を採取し、ＢＡＬＦ及び血清中の中和抗体価を測定した。中和抗体価は以下の方法で測定した。即ち、血清をＰＢＳで適宜希釈し、その０．１ｍＬとインフルエンザウイルス液（２００ＰＦＵ／０．１ｍＬ）０．１ｍＬを混合し、３７℃で１時間処理した。この混合液０．１ｍＬを３５ｍｍディッシュに培養したＭＤＣＫ細胞に加えて感染させ、２日後に形成されたプラークをクリスタルバイオレット液で染色してプラーク数を測定した。血清の代わりに生理食塩水をウイルス液に加えた対照のプラーク数を１００％として５０％のプラーク数となる血清希釈倍数を求め、中和抗体価とした。

【0055】

表５に、ＢＡＬＦ中及び肺内のウイルス量を示す。表６に、ＢＡＬＦ中及び血清中のウイルスに対する中和抗体価を示す。

【0056】

【表5】

【0057】

表５の結果から、抗ウイルス薬のタミフル群だけでなく、わかめ由来ペプチド群のＢＡＬＦ中及び肺内のウイルス量は対照群に比べて明らかに低い値を示した。

【0058】

【表6】

【0059】

表６の結果は、抗ウイルス薬のタミフル群では何れの指標においても対照群に比べて明らかに低い値であり、インフルエンザウイルスに対する抗体産生量が少ないこと示している。一方、わかめ由来ペプチド群では何れの指標においても対照群に対し高い値を示した。この結果は、わかめ由来ペプチドを摂取することにより、インフルエンザウイルスに対する抗体が効率よく産生され、体内での当該ウイルスの増殖を抑制したことを示している。また、この結果は、わかめ由来ペプチドの摂取による抗インフルエンザウイルス活性の効果がタミフルとは異なるメカニズムにあることと、最初の感染だけではなく、将来、再びインフルエンザウイルスに暴露されたときにも抗原抗体反応によりその予防効果を発揮できる可能性があることを示している。

【0060】

（３）抗単純ヘルペスウイルス活性試験
性器ヘルペスウイルスである単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の感染マウスを用い、わかめ由来ペプチドの抗単純ヘルペスウイルス活性について調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢、雌）を１群当たり５例用い、下記の５群に分けた。各群のマウスに単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２ ＵＷ２６８株）を１回、局所に接種し、感染させた。１回の接種量は、１×１０^３ＰＦＵ（プラーク形成単位）／２０μＬ／マウスとした。ウイルス接種の６日前及び１日前に、それぞれ、ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ １７−ａｃｅｔａｔｅ（３ｍｇ／マウス）をマウスに皮下注射した。各試料をウイルス感染の１週間前から感染後１週間までの計１４日間、１日２回（午前９時及び午後６時）経口投与した。尚、アシクロビルの経口投与は、アシクロビルを０．２５質量％含む生理食塩水を調製して行った。また、わかめ由来ペプチドの経口投与は、わかめ由来ペプチドを２．５質量％含む生理食塩水（第３群）、わかめ由来ペプチドを１．２５質量％含む生理食塩水（第４群）、わかめ由来ペプチドを０．２５質量％含む生理食塩水（第５群）を各々調製して行った。
第１群：対照（蒸留水） ０．４ｍＬ／マウス／ｄａｙ
第２群：アシクロビル １ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第３群：わかめ由来ペプチド １０ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第４群：わかめ由来ペプチド ５ｍｇ／マウス／ｄａｙ
第５群：わかめ由来ペプチド １ｍｇ／マウス／ｄａｙ

【0061】

ウイルス接種の３日後に、マウスの局所を冷ＰＢＳで洗浄し、その中のウイルス量をプラークアッセイにより測定した。また、ウイルス接種の日から、その１４日後まで、死亡例や性器ヘルペスの発症の程度を下記基準に基づく「１」〜「５」のｌｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅにより記録した。
１：腫脹あり
２：腫脹及び発赤あり
３：液滲出あり
４：後ろ足麻痺
５：死亡

【0062】

表７に、局所洗浄液中のウイルス量を示す。図２に、ｌｅｓｉｏｎ ｓｃｏｒｅの記録結果を平均値で示す。表８に、感染後１４日目のマウスの生存率を示す。

【0063】

【表7】

【0064】

表７の結果から、抗ウイルス薬のアシクロビル群だけでなく、わかめ由来ペプチド群の局所洗浄液中のウイルス量は対照群に比べて明らかに低い値を示した。

【0065】

【表8】

【0066】

図２及び表８の結果から、抗ウイルス薬のアシクロビル群及びわかめ由来ペプチド群では、対照群に比べて、ＨＳＶ−２感染による性器ヘルペスの発症程度が少なく、生存率が高いことが明らかである。

【図1】

【図2】