特許 6871858 抗体薬物コンジュゲート

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6871858

(24)【登録日】2021年4月20日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】抗体薬物コンジュゲート

(51)【国際特許分類】

   C07K 5/062 20060101AFI20210510BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20210510BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20210510BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210510BHJP

【ＦＩ】

   C07K5/062

   C07K16/00

   C07K19/00

   A61K47/68

   A61K38/05

   A61K39/395 L

   A61K39/395 Y

   A61P35/00

   A61P43/00 111

【請求項の数】9

【全頁数】25

(21)【出願番号】特願2017-540224(P2017-540224)

(86)(22)【出願日】2016年1月28日

(65)【公表番号】特表2018-512376(P2018-512376A)

(43)【公表日】2018年5月17日

(86)【国際出願番号】US2016015482

(87)【国際公開番号】WO2016123412

(87)【国際公開日】20160804

【審査請求日】2019年1月25日

(31)【優先権主張番号】62/108,894

(32)【優先日】2015年1月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】514291864

【氏名又は名称】ソレント・セラピューティクス・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｓｏｒｒｅｎｔｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】ジェンウェイ・ミャオ

(72)【発明者】

【氏名】ガン・チェン

(72)【発明者】

【氏名】トン・ジュウ

(72)【発明者】

【氏名】アリシャー・ビー・ハサノフ

(72)【発明者】

【氏名】ディラン・デン

(72)【発明者】

【氏名】ホン・ジャン

【審査官】 松浦 安紀子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１７３３９１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／１０７０２４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２００７−５１４６５２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００６−５００３３３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／１７３３９２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１７３３９３（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ ５／０６２

Ａ６１Ｋ ３８／０５

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４７／６８

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ４３／００

Ｃ０７Ｋ １６／００

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

式IV：

【化1】

〔式中、
ＹはＯＨまたはＮＨ_２であり、
Ｒ_４はＯＨ、ＮＨ_２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＩまたはＯＲ_５であり、ここで、Ｒ_５はＣ１〜Ｃ４アルキルである；または
Ｒ_４は存在しない〕
を含む化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項2】

式Ｉ：

【化2】

〔式中、
Ａｂはモノクローナル抗体であり、
Ｌ^１はコネクターであり、
Ｌ^１−Ｌ^２は、

【化3】

から選択され；
Ｌ^２はアミノ酸、ペプチド、−（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−、−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）−、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ_２−、

【化4】

およびそれらの組合せから選択されるリンカーであり；
Ｄは式II：

【化5】

（式中、
ＹはＯまたはＮＨであり、
ＸはＣＨ_２Ｎ_３である）
の構造を有する活性物質であり、
ｎは１〜８の整数である〕
を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩。

【請求項3】

下記：

【化6】

【化7】

およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群より選択される抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。

【請求項4】

ＹがＯＨである、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項5】

ＹがＮＨ_２である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項6】

式Ｉ：

【化2A】

〔式中、
Ａｂはモノクローナル抗体であり、
Ｌ^１はコネクターであり、
Ｌ^１−Ｌ^２は、

【化3A】

から選択され；
Ｌ^２が、
−（Ｃ＝Ｏ）−、−ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−、Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）、−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｌａ−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−、−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２−、−Ｃｉｔ−Ｖａｌ−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ−、−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−、

【化8】

から選択され；
Ｄは式II：

【化5A】

（式中、
ＹはＯまたはＮＨであり、
ＸはＣＨ_２Ｎ_３である）
の構造を有する活性物質であり、
ｎは１〜８の整数である〕
を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩。

【請求項7】

ＹがＮＨである、請求項２に記載の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩。

【請求項8】

ＹがＯである、請求項２に記載の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩。

【請求項9】

式Ｉ：

【化2B】

〔式中、
Ａｂはモノクローナル抗体であり、
Ａｂと一体となった−Ｌ^１−Ｌ^２が、

【化9】

から選択され；
Ｌ^２はアミノ酸、ペプチド、−（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）、−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−、−Ｖａｌ−Ａｌａ−、−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−、−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２（Ｃ＝Ｏ）−、−（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）−、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ−、−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ_２−、

【化4B】

およびそれらの組合せから選択されるリンカーであり；
Ｄは式II：

【化5B】

（式中、
ＹはＯまたはＮＨであり、
ＸはＣＨ_２Ｎ_３である）
の構造を有する活性物質であり、
ｎは１〜８の整数である〕
を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはその薬学的に許容される塩。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は薬物成分として式IIのドラスタチン誘導体部分を含む抗体薬物コンジュゲート（式Ｉ）を提供する。

【背景技術】

【0002】

天然物であるドラスタチン１０、ならびにその合成誘導体であるモノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびモノメチルオーリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）のようなドラスタチン類は、強力な抗腫瘍特性およびチューブリン阻害特性を示す製品である。治療薬としてのドラスタチン類の直接的な使用は、それらの高い毒性のため有効ではなかった。その代わりに、それらはがん細胞を死滅させるための標的送達のために、抗体に接合された。

【化1】

【発明の概要】

【0003】

本発明は、式IV：

【化2】

〔式中、
ＹはＯＨまたはＮＨ_２であり、
Ｒ_４はＯＨ、ＮＨ_２、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ_５であり、ここで、Ｒ_５はＣ１〜Ｃ４アルキルである〕
のドラスタチン誘導体部分を含む化合物を提供する。

【0004】

本発明はさらに式Ｉ：

【化3】

〔式中、
Ａｂはモノクローナル抗体であり、
Ｌ^１はコネクターであり、
Ｌ^２はリンカーであり、
Ｄは式II

【化4】

（式中、
ＹはＯまたはＮＨであり、波線は結合点を示し、
Ｘは−ＣＨ_２Ｎ_３または

【化5】

であり、ここで、ＲはＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ６環状アルキル、アリールまたはヘテロアリールである）
の構造を有する活性物質であり、
ｎは１〜８の整数である〕
の構造を有する抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を提供する。

【0005】

好ましくは、Ｌ^２はアミノ酸、ペプチド、−（ＣＨ_２）_ｎ−、−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−、ｐ−アミノベンジル（ＰＡＢ）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（シトルリン）−ＰＡＢ、Ｖａｌ−Ａｌａ−ＰＡＢ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ−ＰＡＢまたはそれらの組合せから成る群から選択される。好ましくは、−Ｌ^１−Ｌ^２は

【化6】

から成る群から選択される。好ましくは、Ａｂ−Ｌ^１−Ｌ^２は

【化7】

から成る群から選択される。

【0006】

本発明はさらに、式Ｉ：

【化8】

〔式中、
Ａｂはモノクローナル抗体であり、
Ｌ^１はコネクターであり、
Ｌ^２はリンカーであり、
Ｄは式II：

【化9】

（式中、
ＹはＯまたはＮＨであり、波線は結合点を示し、
Ｘは−ＣＨ_２Ｎ_３または

【化10】

であり、ここで、ＲはＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ３〜Ｃ６環状アルキル、アリールまたはヘテロアリールである）
の構造を有する活性物質であり、
ｎは１〜８の整数である〕
の構造を有する抗体薬物コンジュゲートまたはその薬学的に許容される塩を合成する方法であって、抗体上のＬｙｓと式III

【化11】

〔式中、
Ｇは−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｎ_３、−ＯＲ、ＳＲ、−ＯＮＲＲ、ＲＣ（＝Ｏ）Ｏ−およびＲＳＯ_２−Ｏ−から成る群から選択され；そして
Ｒは場合により置換されていてよいアルキルまたは場合により置換されていてよいアリールであり、
ｍ＝０または１である〕
を反応させることを含む、方法を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】図１は静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝８）に投与されたコンジュゲート１６の単回投与を示す。

【図2】図２は静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝８）に投与されたコンジュゲート１６の単回投与を示す。

【図3】図３は処置後３５日のマウスの写真を示す。

【図4A】図４Ａは腫瘍細胞株群におけるＡＤＣ−２３（抗Ｈｅｒ２抗体）のインビトロ内活性を示す。

【図4B】図４Ｂは腫瘍細胞株群におけるＡＤＣ−１６（抗Ｈｅｒ２抗体）のインビトロ活性を示す。

【図5】図５は種々の異種移植腫瘍モデルにおけるＡＤＣ−６５、ＡＤＣ−２３およびＡＤＣ−１９のインビボ有効性を示す。

【図6A-6B】図６Ａおよび６Ｂは、静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（ｎ＝８）に投与されたコンジュゲート１６および１９の単回投与を示す。

【発明を実施するための形態】

【0008】

詳細な説明
本発明は、ペプチドに基づくリンカー部分が、そのＣ末端に、制御された様式で抗体上のＣｙｓまたはＬｙｓのいずれか一方と反応する結合点を有する、ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲート）のような化合物およびコンジュゲートを提供する。Ｌｙｓ接合については、例えば、ＤＡＲ（薬物抗体比）は２である。Ｃｙｓ上で接合が起こるとき、大部分のコンジュゲートのＤＡＲ（薬物抗体比）は４である。

【0009】

【表1】

【0010】

【表2】

【0011】

【表3-1】

【表3-2】

【0012】

定義
略語は以下のように定義する。

【表4】

【表5】

【0013】

一般的合成方法−酸からの活性エステル（例えばＮＨＳ）の形成
酸をＤＣＭ（塩化メチレン）に溶解し、必要ならば、溶解を助けるためにＤＭＦ（Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド）を添加した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１．５当量）を添加し、その後ＥＤＣ．ＨＣｌ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）（１．５当量）を添加した。酸の大部分が消費されるまで、反応混合物を室温で１時間撹拌した。反応の進行をＲＰ−ＨＰＬＣにより観察した。混合物をその後ＤＣＭで希釈し、クエン酸（１０％水溶液）および飽和食塩水で順次洗浄した。有機層を乾燥させ、濃縮乾固した。粗生成物を任意に、ＲＰ−ＨＰＬＣまたはシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。

【実施例1】

【0014】

化合物１の調製

【化12】

粗製の化合物４７（０．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）溶液に、ピペリジン４−カルボン酸（６０ｍｇ）の飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１ｍＬ）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、その後１Ｎ ＨＣｌ水溶液でｐＨ＝４〜５まで酸性化した。反応混合物を濃縮し、残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後、化合物１（６８ｍｇ）を白色粉末として得た。ＭＳ ｍ／ｚ １０２０．７（Ｍ＋Ｈ）。

【実施例2】

【0015】

化合物２の調製

【化13】

化合物５２（１８５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＤＭＦ（５／１、ｖ／ｖ、５ｍＬ）に溶解した。ＥＤＣ．ＨＣｌ（０．５ｍｍｏｌ）およびＨＯＳｕ（０．３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。全ての化合物５２が消費されたことをＨＰＬＣ分析で確認した。反応物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和食塩水で洗浄した。有機層を１ｍＬまで濃縮し、アセトニトリル／水（６／４、ｖ／ｖ、３ｍＬ）で希釈した。ピロリジン３−カルボン酸（６０ｍｇ）の飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１ｍＬ）を添加し、混合物を室温で１０分間撹拌した。反応液をＨＯＡｃで酸性化し、濃縮した。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、化合物２（１３８ｍｇ、６８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １０２６．６（Ｍ＋Ｈ）。

【実施例3】

【0016】

化合物４の調製

【化14】

化合物３８の調製：
化合物３７（２６１ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（２１７ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（３６２μＬ、２．０８ｍｍｏｌ）およびアミン３６（２１３ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後ピペリジン４００μＬを添加し、１０分間撹拌した。混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物３８（１７１ｍｇ、６０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ５４８．３（Ｍ＋Ｈ）。

【0017】

化合物４０の調製：
化合物３９（３７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（５９ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１０８μＬ、０．６ｍｍｏｌ）およびアミン３８（１０２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後蒸発乾固させた。残渣を２ｍＬのＤＣＭに溶解させ、その後１ｍＬのＴＦＡを添加し、１０分間撹拌した。混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物４０（９４ｍｇ、７８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６７３．４（Ｍ＋Ｈ）。

【0018】

化合物４の調製：
化合物４１（８５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（４８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８３μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）およびアミン４０（９４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後ＮａＯＨ（９０ｍｇ）の水溶液（１ｍＬ）を添加し、３０分間撹拌した。混合物をＨＰＬＣにより精製し、化合物４（８６ｍｇ、５８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １２３９．７（Ｍ＋Ｈ）。

【実施例4】

【0019】

化合物６の調製

【化15】

化合物４６の調製：
化合物４１（１０００ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（６４０ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８７０μＬ、５．００ｍｍｏｌ）およびアミン４５（５３５ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物４６（１１４０ｍｇ、７０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ８６５．５（Ｍ＋Ｈ）。

【0020】

化合物４７の調製：
化合物４６（５００ｍｇ、０．５７ｍｍｏｌ）のＤＭＡ（１０ｍＬ）溶液に、ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート（２１０ｍｇ、０．６９ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３５μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１８時間撹拌し、その後１００ｍＬのエーテルを添加し、析出物をろ過により回収し、化合物４７（５００ｍｇ、８５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １０３０．６（Ｍ＋Ｈ）。

【0021】

化合物４９の調製：
化合物４７（１２５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液に、ＨＯＢｔ（７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（２１μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）およびアミン４８（４０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１６時間撹拌し、その後２００μＬのピペリジンを添加し、１０分間撹拌した。混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物４９（７２ｍｇ、６０％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １００５．６（Ｍ＋Ｈ）。

【0022】

化合物６の調製：
化合物４９（３０ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＥＡ（１５μＬ、０．０８６ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（５０μＬ、０．２８８ｍｍｏｌ）および無水物５０（１９ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物６（３２ｍｇ、８８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １３４７．５（Ｍ＋Ｈ）。

【実施例5】

【0023】

化合物７の調製。

【化16】

化合物６の合成について記載したように、化合物７は化合物４９（０．１ｍｍｏｌ）と無水物６３（０．１ｍｍｏｌ）から合成した。収率７９％。ＭＳ ｍ／ｚ １２９６．８（Ｍ＋Ｈ）。

【実施例6】

【0024】

化合物８の調製。

【化17】

化合物４７（０．１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（３ｍＬ）溶液に、化合物６４（０．１５ｍｍｏｌ、６７ｍｇ）のアセトニトリル／水（１／１、ｖ／ｖ、１ｍＬ）溶液を添加し、その後ＤＩＥＡ（５０μＬ）を添加した。３０分後、反応物を酸性化および濃縮した。残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製し、化合物８（８７ｍｇ）を白色固体として得た。ＭＳ ｍ／ｚ １２４３．６［Ｍ＋Ｈ］^＋。

【実施例7】

【0025】

化合物９の調製。

【化18】

化合物５２の調製：
化合物４６（１２０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、Ｋ_２ＣＯ_３（１１８ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）およびブロモアセテート５１（３５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１６時間撹拌し、その後蒸発させた。残渣を２ｍＬのＤＣＭに溶解させ、ろ過し、２ｍＬのＴＦＡを添加した。２０分後、混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物５２（９２ｍｇ、８３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ９２３．５（Ｍ＋Ｈ）。

【0026】

化合物５３の調製：
化合物５２（９２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（３８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７０μＬ、０．４ｍｍｏｌ）およびｂｏｃ−ヒドラジン（１５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後蒸発乾固させた。残渣を２ｍＬのＤＣＭに溶解し、１ｍＬのＴＦＡを添加し、１０分間撹拌した。混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物５３（８２ｍｇ、７８％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ９３７．５（Ｍ＋Ｈ）。

【0027】

化合物９の調製：
化合物５４（５３ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（２ｍＬ）溶液に、ＤＩＣ（１０ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）を添加し、１０分間撹拌した。その後ＤＩＥＡ（５４μＬ、０．３１２ｍｍｏｌ）およびアミン５３（８２ｍｇ、０．０７８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１５分間撹拌した。混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物９（６２ｍｇ、６３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １２６０．５（Ｍ＋Ｈ）。

【実施例8】

【0028】

化合物１３の調製

【化19】

化合物３７（１３０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３ｍＬ）溶液に、ＨＡＴＵ（１１０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（１７５μＬ、１ｍｍｏｌ）およびアミン３６（１１０ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後濃縮乾固した。残渣をその後ＴＦＡ／ＤＣＭ（１／４、ｖ／ｖ、５ｍＬ）で３０分間撹拌した。混合物を蒸発させ、ＨＰＬＣにより精製し、化合物６６（１０８ｍｇ、６５％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ ６７０．５（Ｍ＋Ｈ）。

【0029】

化合物４１（８５ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液にＨＡＴＵ（４８ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（８３μＬ、０．４８ｍｍｏｌ）およびアミン６６（９４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０分間撹拌し、その後ピペリジン（０．２ｍＬ）を添加し、３０分間撹拌した。混合物を濃縮し、ＨＰＬＣにより精製し、化合物６７（８７ｍｇ、６３％）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １０２８．７（Ｍ＋Ｈ）。

【0030】

化合物６７（５７ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌ）および酸６８（２２ｍｇ）のＤＣＭ／ＤＭＦ（３／１、ｖ／ｖ、４ｍＬ）溶液に、ＰｙＢｒＯＰ（０．０５５ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（３５μＬ）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、その後約２ｍＬまで濃縮した。残渣を逆相ＨＰＬＣにより精製し、化合物１３（４１ｍｇ）を得た。ＭＳ ｍ／ｚ １４２５．７（Ｍ＋Ｈ）。

【実施例9】

【0031】

本実施例は特定の細胞においてインビトロで測定した、指定した薬物接合抗体のＥＣ５０アッセイの結果を提供する。

【表6】

【実施例10】

【0032】

本実施例は、Ｎ８７皮下異種移植モデルにおけるＡＤＣ１６（抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲート）のインビボ有効性を示す。図１は静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに投与されたコンジュゲート１６の単回投与を示す。各群にマウスが８匹存在し、合計６群のマウスを試験した：３群は種々の用量でＴ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲート）を注射され；２群は種々の用量でＡＤＣ１６コンジュゲートを注射され；そして１群は溶媒対照群であった。全ての薬物は同一の方法（単回投与）で投与した。ＡＤＣ−１６静脈注射の単回投与は、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇで、それぞれ３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇでのＴ−ＤＭ１より優れた。３ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ−１６は１００日まで腫瘍増殖を完全に阻害した。

【実施例11】

【0033】

本実施例は、Ｎ８７皮下異種移植モデルにおけるＡＤＣ１６（抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲート）のインビボ安全性を示す。図２は静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに投与されたコンジュゲート１６の単回投与を示す。各群にマウスが８匹存在し、合計７群のマウスを試験した：３群は種々の用量でＴ−ＤＭ１（トラスツズマブ−ＤＭ１コンジュゲート）を注射され；３群は種々の用量でＡＤＣ１６コンジュゲートを注射され；そして１群は溶媒対照群であった。全ての薬物は同一の方法（単回投与）で投与した。ＡＤＣ−１６静脈注射の単回投与は、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇで体重増加を遅らせなかった。Ｔ−ＤＭ１群とＡＤＣ−１６群の体重差は、腫瘍重量の違いによるものであった。図３は処置後３５日のマウスの写真を示す。

【実施例12】

【0034】

本実施例（図４Ａ）は、ＡＤＣ−２３が乳がん細胞株において、ＭＭＡＥコンジュゲートと比較して、同等またはより強い抗増殖活性を誘導することを示す。これらの試験において、細胞を全てＡＤＣ−２３またはＭＭＡＥのいずれか一方で３日間処理した。ＩＣ５０を細胞増殖の５０％阻害を示す濃度として決定する。

【実施例13】

【0035】

本実施例（図４Ｂ）は、ＡＤＣ−１６が乳がん細胞株において、ＭＭＡＥコンジュゲートと比較して、同等またはより強い抗増殖活性を誘導することを示す。上記試験において、細胞を全てＡＤＣ−１６またはＭＭＡＥのいずれか一方で３日間処理した。ＩＣ５０を細胞増殖の５０％阻害を示す濃度として決定する。

【実施例14】

【0036】

本実施例（図５）はＬｏＶｏ（結腸）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（乳房）、ＢｘＰＣ−３（膵臓）、ＰＡ−１（卵巣）およびＨ１９７５ ＮＳＣＬＣ異種移植ヌードマウスにおけるＡＤＣ−６５、ＡＤＣ−２３およびＡＤＣ−１９のインビボ有効性を示す。全てのＡＤＣは示した濃度で静脈注射により単回投与で与えた。試験されたＡＤＣはほとんどの場合同一量でのＭＭＡＦより優れ、かつ単回投与により完全に腫瘍増殖を阻害した。

【実施例15】

【0037】

本実施例は、Ｎ８７皮下異種移植モデルにおけるＡＤＣ１９（抗Ｈｅｒ２抗体コンジュゲート）のインビボ安全性および有効性を示す。図６Ａおよび６Ｂは静脈内投与によりＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに投与されたコンジュゲート１９の単回投与を示す。各群にマウスが８匹存在し、合計３群のマウスを試験した：１群のマウスはＡＤＣ１６を注射され；１群のマウスはＡＤＣ１９を注射され；そして１群は溶媒対照群であった。全ての薬物は同一の方法（単回投与）で投与した。２ｍｇ／ｋｇでのＡＤＣ−１９静脈注射の単回投与は、同用量でのＡＤＣ−１６の単回投与と同等であり、４９日まで腫瘍増殖を完全に阻害し、かつＡＤＣ−１６と同等に体重増加を遅らせなかった。

【実施例16】

【0038】

本実施例は、抗体薬物コンジュゲート１６、１７、１９および６４を合成するための一般的な接合方法を示す。有機溶媒を０〜３０％含むｐＨ６．０〜９．０の緩衝液中の０．５〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体溶液に、０．１〜１０当量の活性化薬物リンカーコンジュゲート（１、または２、または３、または４、または５、または６２）を少しずつまたは連続流の方法で添加した。反応を０〜４０℃で０．５〜５０時間、穏やかに撹拌または振盪しながら実施し、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより観察した。得られた粗ＡＤＣ生成物は最先端の方法を使用して、必要な脱塩、緩衝液の交換／配合、および任意に、精製の下流工程に付した。ＡＤＣ生成物はＨＩＣ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、および任意にＬＣ−ＭＳにより特徴付けた。

【実施例17】

【0039】

本実施例は、抗体薬物コンジュゲート２１、２２、２３、２４、２８および６５を合成するための一般的な接合方法を示す。ＰＢＳのようなｐＨ５．０〜９．０のある緩衝液中の０．５〜５０ｍｇ／ｍＬの抗体溶液に、０．５〜１００当量のＴＣＥＰおよびＤＴＴのような還元剤を添加した。還元を０〜４０℃で０．５〜４０時間、穏やかに撹拌または振盪しながら実施し、その後還元剤をカラムまたは限外ろ過によって除去した。ＤＭＡのような有機共溶媒を０〜３０％含む、ＰＢＳのようなｐＨ５．０〜９．０の、ある緩衝液中の０．５〜５０ｍｇ／ｍＬの還元された抗体に、０．５〜１０当量の（化合物６〜１５、または６３から選択される）薬物−リンカー反応剤を添加した。反応を０〜４０℃で０．５〜４０時間、穏やかに撹拌または振盪しながら実施し、ＨＩＣ−ＨＰＬＣにより観察した。得られた粗ＡＤＣ生成物は最先端の方法を使用して、必要な脱塩、緩衝液の交換／配合、および任意に、精製の下流工程に付した。最終ＡＤＣ生成物はＨＩＣ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣ、および任意にＬＣ−ＭＳにより特徴付けた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】