特許 6871876 がんを治療するための組成物と方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6871876

(24)【登録日】2021年4月20日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】がんを治療するための組成物と方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20210510BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 15/11 20060101ALN20210510BHJP

   C12Q 1/6876 20180101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 D

   A61K39/395 N

   A61K39/395 E

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   A61P43/00 111

   !C12N15/11 Z

   !C12Q1/6876 ZZNA

【請求項の数】15

【全頁数】37

(21)【出願番号】特願2017-566608(P2017-566608)

(86)(22)【出願日】2016年3月4日

(65)【公表番号】特表2018-509469(P2018-509469A)

(43)【公表日】2018年4月5日

(86)【国際出願番号】US2016020864

(87)【国際公開番号】WO2016144743

(87)【国際公開日】20160915

【審査請求日】2019年3月4日

(31)【優先権主張番号】62/131,343

(32)【優先日】2015年3月11日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517318218

【氏名又は名称】ラッシュ ユニヴァーシティ メディカル センター

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100088694

【弁理士】

【氏名又は名称】弟子丸 健

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100084663

【弁理士】

【氏名又は名称】箱田 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100093300

【弁理士】

【氏名又は名称】浅井 賢治

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(72)【発明者】

【氏名】パハン カリパダ

【審査官】 渡邉 潤也

(56)【参考文献】

【文献】 Cancer Res.，２００８年１２月 １日，68(23)，p.9754-9762

【文献】 SUBHAJIT DASGUPTA，GENERATION OF FUNCTIONAL BLOCKING MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST MOUSE INTERLEUKIN-12 P40 HOMODIMER AND MONOMER，HYBRIDOMA，２００８年，VOL:27, NR:3，PAGE(S):141 - 151，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1089/hyb.2007.0560

【文献】 Am J Respir Crit Care Med.，２０００年，161，p.110-117

【文献】 MARK C. HECKEL，HUMAN BREAST TUMOR CELLS EXPRESS IL-10 AND IL-12P40 TRANSCRIPTS AND PROTEINS, BUT DO NOT PRODUCE IL-12P70，CELLULAR IMMUNOLOGY，２０１１年，VOL:266, NR:2，PAGE(S):143 - 153，ＵＲＬ，http://dx.doi.org/10.1016/j.cellimm.2010.09.010

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

治療効果のある量のｐ４０モノマーに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片を含み、前記抗体またはそのエピトープ結合断片がＩＬ−１２に結合しない、がんの治療に使用するための組成物。

【請求項2】

前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ＩＬ−１２シグナル伝達の阻害を抑制する、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項3】

前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ＩＦＮ−γの産生を上方制御する、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項4】

前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、モノクロナール抗体またはその免疫学的に活性な断片である、請求項１から３のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項5】

前記ｐ４０モノマーに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ポリクロナール、モノクロナール、ヒト、ヒト化及びキメラ抗体；単鎖抗体；及びエピトープ結合抗体の断片からなる群より選ばれる、請求項１から４のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項6】

前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ｐ４０ホモ二量体の活動を著しく中和しない、請求項１から５のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項7】

前記がんが、前立腺がん、乳がん、肝臓がん、大腸がん、卵巣がん及びすい臓がんからなる群より選ばれる、請求項１から６のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項8】

前記がんが、ｐ４０モノマーの過剰産生を特徴とするがんである、請求項１から７のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項9】

前記組成物が、さらに少なくとも１の薬学的に許容される担体を含む、請求項１から８のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項10】

前記組成物がヒト対象に投与される、請求項１から９のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項11】

前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、少なくともカベオリン媒介経路を通じたＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションを減少させる、請求項１に記載の使用のための組成物。

【請求項12】

前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ヒト化抗体またはその免疫学的に活性な断片である、請求項１から１１のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項13】

前記組成物が経口投与、または、皮下、関節内、皮内、静脈内、腹腔内及び筋肉内経路からなる群より選ばれる経路によって投与される、請求項１から１２のいずれか１に記載の使用のための組成物。

【請求項14】

細胞死の誘導に治療目的で使用するための、ｐ４０モノマーに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片を含み、前記抗体またはそのエピトープ結合断片がＩＬ−１２に結合しない、組成物。

【請求項15】

細胞ががん細胞であり、好ましくは前記がん細胞はｐ４０モノマーの過剰産生を示し、またはがん細胞が、前立腺がん細胞、乳がん細胞、肝臓がん細胞、大腸がん細胞、卵巣がん細胞、及びすい臓がん細胞からなる群より選ばれる、請求項１４に記載の使用のための抗体またはその免疫学的に活性な断片を含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

(関連出願)
本特許出願は、２０１５年３月１１日に出願された米国仮特許出願第62/131,343号の出願日の利益を請求するものであり、参照によりその内容を本明細書に援用する。
（連邦政府の助成による研究開発に関する発明者の権利に関する陳述）
本発明は米国国立衛生研究所がＡＴ６６８１及びＮＳ８３０５４のもとで拠出した政府からの支援によりなされた。連邦政府は、本発明において一定の権利を有する。
（技術分野）
本願発明は一般的にがんを治療する方法に関連する。本発明の一態様は、がんの治療を必要とするヒト及び獣医学の対象に、ｐ４０モノマーに対する抗体を投与することを含むがんを治療する方法を提供する。

【背景技術】

【0002】

（背景）
がんは世界中で毎年何百万人もの命を奪う死に至る病気である。がん細胞が死を免れるメカニズムを理解すること及び関係する治療標的を特定することは、重要な研究分野である。細胞性炎症の抑制(1)が、この死病の持続性と発達の主な理由の一つであると信じられている。しかしながら、この高いレベルで抑制を維持し、腫瘍細胞が死を免れるメカニズムは、ほとんどわかっていない。ＩＬ−１２は細胞性免疫において最も重要なサイトカインであり(2)、この分子はがん治療のため、常にスキャナーの下にある(3、4)。ＩＬ−１２ファミリーのサイトカインには、４つの異なるメンバーがあり、ｐ４０モノマー（ｐ４０）、ｐ４０ホモ二量体（ｐ４０₂）、ＩＬ−１２（ｐ４０：ｐ３５）及びＩＬ−２３（ｐ４０：ｐ１９）である。ヘテロ二量体が優勢であるこの科学の時代において、ＩＬ−２３とＩＬ−１２のみが生物学的機能を有すると考えられていた。その結果、ｐ４０とｐ４０₂はＩＬ−１２ファミリーの中で機能を有しないと考えられていた(5)。しかしながら、我々はｐ４０₂の炎症促進性の性質を証明し(6-8)、ｐ４０₂の生物学的機能はＩＬ−１２及びＩＬ−２３のそれとは異なることを明らかにした(9、10)。さらに、ｐ４０₂マウスとｐ４０マウスのそれぞれに対して別々に機能を阻害するモノクロナールの抗体（ｍＡｂ）とＥＬＩＳＡを起こさせた後(11)、我々は、ｐ４０₂に対するｍＡｂがマウスをＥＡＥから守ることを明らかにした(12)。
ここに我々は、肺がんを除いた様々な形態のがん細胞がｐ４０の特定の上昇と関係していることを証明する。ｍＡｂによるｐ４０の選択的な除去は、様々ながん細胞及びインビボＴＲＡＭＰ腫瘍組織中で細胞死を刺激する。さらにｐ４０は、カベオリンが媒介するＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションと、ｐ４０ｍＡｂによって中和された関係するＩＬ−１２シグナル伝達を抑制した。これらの結果は、がん細胞が細胞死を免れるのを助けるという、ｐ４０の新規な発症に関わる役割を明らかにしている。

【発明の概要】

【0003】

（好ましい実施態様の概要）
一態様において、本発明は、がんの治療を必要とする対象に対して、治療効果のある量のｐ４０モノマーに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。一実施態様において、抗体あるいはその免疫学的に活性な断片は、ＩＬ−１２シグナル伝達の阻害を抑制する。他の実施態様では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、ＩＦＮ−γの産生を上方制御する。他の実施態様では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、少なくともカベオリン媒介経路によるＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションを減少させる。
抗体またはその免疫学的に活性な断片はモノクロナールの抗体またはモノクロナール抗体の免疫学的に活性な断片であってよい。その他の実施態様では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、ポリクロナール、モノクロナール、ヒト、ヒト化及びキメラ抗体；単鎖抗体またはそのような抗体のエピトープ結合抗体断片である。抗体またはその免疫学的に活性な断片はｐ４０ホモ二量体の生物学的作用を著しく中和しなくてもよい。他の実施態様では、抗体またはその免疫学的に活性な断片は、ヒト化抗体またはその免疫学的に活性な断片である。

【0004】

がんは、例えば、前立腺がん、乳がん、または肝臓がんであってよい。他の実態態様では、該がんは、ｐ４０モノマーの過剰産生によって特徴づけられる。
一実施態様では、該組成物はまた、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む。該組成物は経口投与してもよい。その他の実施態様では、該組成物は、皮下、関接内、皮内、静脈内、腹腔内または筋肉内の経路で投与される。またその他の実施態様では、対象はヒト対象である。
他の態様は、細胞にｐ４０モノマーに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片を、細胞死を引き起こすのに十分な量接触させることを含む、細胞中の細胞死を引き起こすための方法を提供する。一実施態様では、該細胞はがん細胞である。がん細胞は、ｐ４０モノマーの過剰産生を示すがん細胞であってよい。その他の実施態様では、がん細胞は、前立腺がん細胞、乳がん細胞、または肝臓がん細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0005】

【図1】図1：様々ながん細胞中のＩＬ−１２ファミリーのサイトカインのレベル。ｐ４０（左の棒）及びｐ４０₂（右の棒）（Ａ）、ＩＬ−１２（Ｂ）及びＩＬ−２３（Ｃ）のレベルを培養マウスの扁平上皮（ＫＬＮ）、前立腺（ＴＲＡＭＰ）、乳がん（４Ｔ１）及び肝臓がん１−６（Ｈｅｐａ）腫瘍細胞の上清中で、ＥＬＩＳＡサンドイッチ法により測定した。結果は３つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^aｐ＜０．００１ vs. ｐ４０。（Ｄ）別々の３つの実験のＴＲＡＭＰ上清を１０ｋＤａカットカラムに通し、次いでネイティブＰＡＧＥ分析とクマシーブルー染色を行った。純粋なｐ４０タンパク質（最左のコラム）との比較により、ｐ４０バンドを検出した。（Ｅ）別々の３つの実験のＴＲＡＭＰ上清中のｐ４０のネイティブＰＡＧＥイムノブロット解析。（Ｆ）培養ＴＲＡＭＰ細胞中のｐ４０及びｐ４０₂の細胞内ＦＡＣＳアッセイ。（Ｅ）３つの独立した実験からのＴＲＡＭＰ細胞中の細胞内ｐ４０及びｐ４０₂のレベルを示すため平均蛍光強度分析をプロットしたもの。^*ｐ＜０．０１ vs. ｐ４０；ＮＳ、非有意。ネイティブタンパク質ゲル解析、次いでクマシーブルー染色を行い、ヒトヘパトーマＨｅｐ３Ｂ（Ｈ）、前立腺ＬｎＣＡＰ（Ｉ）及び乳がん細胞ラインＭＣＦ−７（Ｊ）の濃縮上清中のｐ４０レベルを検出した。異なるがん細胞の濃縮上清中のｐ４０及びその他のＩＬ−１２メンバーのサイトカインのネイティブＰＡＧＥイムノブロット分析（Ｋ）。

【図2】図２: がん細胞の死に際してのｐ４０及びｐ４０₂モノクロナール抗体性特定中和効果。ＫＬＮ（Ａ及びＥ）、ＴＲＡＭＰ（Ｂ及びＦ）、４Ｔ１（Ｃ及びＧ）及びＨｅｐａ（Ｄ及びＨ）細胞を、ｐ４０及びｐ４０₂を中和するｍＡｂｓで、無血清条件下で処置し、次いで細胞死をＬＤＨ放出（Ａ−Ｄ）及びＭＴＴ（Ｅ−Ｈ）でモニタリング。^*ｐ＜０．０１ vs. コントロール。Ｔ型カルシウム流入が、ＫＬＮ（Ｉ）、ＴＲＡＭＰ（Ｊ）、４Ｔ１（Ｋ）及びＨｅｐａ（Ｌ）細胞でそれぞれ起こった。Ｔ型カルシウム流入は１Ｍ塩化カリウムの存在下で測定された。細胞死をモニターするために、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｍ）、フィコエリトリン（ＰＥ）−標識アネキシンＶ染色（Ｎ）をＫＬＮ、ＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａ細胞について行った。ＴＵＮＥＬ−陽性（Ｏ）及びＰＥ−アネキシンＶ陽性（Ｐ）細胞を、１グループにつき１０の異なる画像について計数し、その後コントロールに対する百分率でプロットした。全ての結果は３つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^*ｐ＜０．００１ vs. ＴＵＮＥＬとアネキシンＶアッセイの両方の各コントロール。図Ｏ及びＰについて：コントロール−左の棒；ＩｇＧ−左中央の棒；ｐ４０ｍＡｂ−右中央の棒；ｐ４０₂ｍＡｂ−右の棒。

【図3】図３：マウスのインビボＴＲＡＭＰ腫瘍の退縮にかかるｐ４０中和抗体の効果。（Ａ）８から１０週齢の雄C57BL/6（ｎ＝５／群）の皮下に百万のＴＲＡＭＰ細胞の懸濁液を注射した。約６週間後、腫瘍が０．８から１ｍｍの大きさの時に、マウスにｐ４０ｍＡｂ（中央パネル）及びハムスターＩｇＧ（右パネル）を、１回につき体重１キログラムあたり２ｍｇを週に２回、処置した。２週間後、腫瘍を２ＤＧ Ｄｙｅと結合したアレクサ８００の尾静脈への注射で標識し、その後、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外スキャニングマシンによって画像化した。処置していないコントロール群（左パネル）と結果を比較した。（Ｂ）腫瘍を全ての群のマウスのわき腹から切除した。各群には５匹のマウス（ｎ＝５）が含まれていた。（Ｃ）腫瘍のサイズを一日おきに全ての群のマウスについてモニターし、比較ラインプロットとして示した。結果は、異なる５体のマウスについて、平均±標準誤差で表した。（Ｄ）コントロール、ＩｇＧ及びｐ４０ｍＡｂで処置した腫瘍のＴＵＮＥＬアッセイ（緑、β−アクチン；赤、ＴＵＮＥＬ）。（Ｅ）コントロール及びｐ４０ｍＡｂ処置した群中の１２の異なるアポトーシス性遺伝子のためのカスタムｍＲＮＡアレイをその後ヒートマップエクスプローラーソフトでプロットしたもの。（Ｆ）３つの異なる群中の１２のアポトーシス性遺伝子のリアルタイムｍＲＮＡ解析。結果は、１群５匹のマウスについて平均±標準誤差で表す。^*ｐ＜０．０５ vs. コントロール、^**ｐ＜０．０１ vs. コントロール群。コントロール−左の棒；ｐ４０ｍＡｂ−中央の棒；ＩｇＧ−右の棒。

【図4】図４：ｐ４０ｍＡｂ性ＴＲＡＭＰ細胞の死におけるＩＦＮ−γの役割。（Ａ）コントロール、ＩｇＧ及びｐ４０ｍＡｂ処置したＴＲＡＭＰ細胞のｍＲＮＡ発現についてのリアルタイムＰＣＲ解析。^aｐ＜０．０１ vs. コントロール。（Ｂ）コントロール、ＩｇＧ及びｐ４０ｍＡｂ処置したＴＲＡＭＰ細胞中のＩＦＮ−γのタンパク質発現についてのＥＬＩＳＡ。^aｐ＜０．０１ vs. ４８時間コントロール、^bｐ＜０．００１ vs. ７２時間コントロール。（Ｃ）ＩｇＧ及びｐ４０ｍＡｂ処置したＴＲＡＭＰ細胞上清中のＩＬ−１０のＥＬＩＳＡアッセイ。（Ｄ）コントロール、ｐ４０ｍＡｂ−、ＩｇＧ−、（ｐ４０ｍＡｂ ＋異なる量のＩＦＮ−γ−中和Ａｂ）−、（ｐ４０ｍＡｂ＋ＩｇＧ）−、及びＩＦＮ−γ−Ａｂ−で処置したＴＲＡＭＰ細胞のＴＵＮＥＬアッセイ。ＴＲＡＭＰ細胞中の（Ｅ）ＬＤＨ及び（Ｆ）ＭＴＴアッセイ。結果は三つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^aｐ＜０．００１ vs. コントロール、^bｐ＜０．０１ vs. ｐ４０ｍＡｂ処置細胞。

【図5】図５：ｐ４０のｍＡｂによる中和がＴＲＡＭＰ腫瘍細胞中のＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションを刺激する。細胞はｐ４０（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｐ４０₂（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｐ７０（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｐ４０ｍＡｂ（０．５μｇ／ｍＬ）及びマウスＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ）で２時間、無血清の条件下で処置し、次いでＩＬ−１２Ｒβ１のＦＡＣＳ分析を、コントロール（ｉ）、ｐ４０_-（ｉｉ）、ｐ４０_2-（ｉｉｉ）、ｐ７０_-（ｉｉｉ）、ｐ４０ｍＡｂ−（ｉｖ）、及びＩｇＧ−（ｖ）処置したＴＲＡＭＰ細胞について行った。ｐ４０−、ｐ４０_2-、ｐ７０−、ｐ４０ｍＡｂ−及びＩｇＧ−で処置したＴＲＡＭＰ細胞中の、膜結合ＩＬ−１２Ｒβ１（Ｂ）、カドヘリン全般（ｐＣＡＤ）（Ｃ）及び全ＩＬ−１２Ｒβ１（Ｄ）のイムノブロット解析。ｐ４０サイトカイン−及びｐ４０ｍＡｂ−で処置したＴＲＡＭＰ細胞中の、膜結合ＩＬ−１２Ｒβ１（Ｅ）、ｐＣＡＤ（Ｆ）及び全ＩＬ−１２Ｒβ１（Ｇ）のイムノブロット解析。結果は３つの独立した実験について示す。５μＭのフィリピン（カベオリン活性阻害物質）または２μＭのクロルプロマジン（chloropromazine）（ＣＰＭ：クラスリン活性阻害物質）のいずれかで２時間、無血清条件下で前処理し、ｐ４０ｍＡｂで処置したＴＲＡＭＰ細胞の膜分画中のＩＬ−１２Ｒβ１（Ｈ）のイムノブロット解析。イムノブロット解析の結果はｐＣＡＤイムノブロットで正規化した（下のパネル）。（Ｉ）ｐＣＡＤで正規化したイムノブロット解析の相対密度。結果は３つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^*ｐ＜０．００１ vs. ｐ４０ｍＡｂ。コントロール（Ｊ）、ｐ４０ｍＡｂ（Ｋ）、（ｐ４０ｍＡｂ＋フィリピン）（Ｌ）で処置したＴＲＡＭＰ細胞中の、ＩＬ−１２Ｒβ１（赤）及びカベオリン−１（Ｃａｖ−１；緑）の免疫細胞化学的分析。核はＤＡＰＩで染色した。（Ｍ）ｐ４０の中和がＴＲＡＭＰ細胞中で細胞性免疫を誘発することについての図式的な説明。

【図6】図６：培養ＴＲＡＭＰ細胞中のＩＦＮ−γの発現におけるｐ４０ｍＡｂの効果。コントロール、ＩｇＧ−及びｐ４０ｍＡｂで処置したＴＲＡＭＰ細胞中のＩＦＮ−γ（緑）の免疫細胞化学的分析。核はＤＡＰＩで染色した。

【図7】図７：培養Ｈｅｐａ及び４Ｔ１細胞中のＩＦＮ−γタンパク質の発現におけるｐ４０ｍＡｂの効果。コントロール、ＩｇＧ−及びｐ４０ｍＡｂで処置したＨｅｐａ（Ａ及びＢ）及び４Ｔ１（Ｃ及びＤ）細胞中のＩＦＮ−γの、リアルタイムｍＲＮＡ（Ａ及びＣ）及びＥＬＩＳＡ（Ｂ及びＤ）解析。結果は３つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^*ｐ＜０．０５ vs. コントロール、^**ｐ＜０．００１ vs. コントロール。

【図8】図８：Ｈｅｐａ細胞中のｐ４０ｍＡｂ性の死におけるＩＦＮ−γの役割。ｐ４０ｍＡｂ−（０．５μg/ml）、またはｐ４０ｍＡｂとともに用量を変えて増やしたＩＦＮ−γＡｂ（０．２５、０．５及び１μｇ／ｍＬ）で処置したＨｅｐａ細胞で、（Ａ）ＭＴＴ及び（Ｂ）ＬＤＨアッセイを行った。結果は３つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^*ｐ＜０．００１ vs. コントロール、^**ｐ＜０．００１ vs. ｐ４０ｍＡｂのみ。

【図9】図９：４Ｔ１細胞中のｐ４０ｍＡｂ性の死におけるＩＦＮ−γの役割。ｐ４０ｍＡｂ−（０．５μg/ml）またはｐ４０ｍＡｂとともに用量を変えて増やしたＩＦＮ−γＡｂで処置した４Ｔ１細胞で、（Ａ）ＭＴＴ及び（Ｂ）ＬＤＨアッセイを行った。結果は３つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^*ｐ＜０．００１ vs. コントロール、^**ｐ＜０．００１ vs. ｐ４０ｍＡｂのみ。

【図10】図１０：ＴＲＡＭＰ腫瘍組織中のＩＦＮ−γの発現におけるｐ４０ｍＡｂの効果。（Ａ）コントロール、ｐ４０ｍＡｂ及びＩｇＧ−で処置したＴＲＡＭＰ腫瘍組織中の、ＩＦＮ−γ、ｔ−ｂｅｔ、ＩＬ−１０、ＧＡＴＡ−３及びＦｏｘｐ３のｍＲＮＡの発現をモニターするための半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析。異なる処置を行った群におけるＩＦＮ−γレベルを確認するため（Ｂ）リアルタイムＰＣＲ及び（Ｃ）ＥＬＩＳＡ解析を行った。^aｐ＜０．００１ vs. コントロール。（Ｄ）コントロール、ｐ４０ｍＡｂ−及びＩｇＧ−で処置したＴＲＡＭＰ腫瘍組織中の、ＩＬ−１０、ＧＡＴＡ−３及びＦｏｘｐ３のｍＲＮＡレベルをモニターするための半定量的ＲＴ−ＰＣＲ解析。ＩＬ−１０及びＦｏｘｐ３の、リアルタイムＰＣＲ（Ｅ）及びＩＬ−１０のＥＬＩＳＡ解析（Ｆ）を、異なる処置を行った群における我々の結果を確認するために行った。^*ｐ＜０．００１ vs. コントロール。異なる群の腫瘍組織中の、（Ｇ）ＩＦＮ−γ（緑）と（Ｈ）ｔ−ｂｅｔ（赤）の免疫組織化学的な分析。結果は１群につき５マウスのそれぞれ２セクションの分析を示す。

【図11】図１１：培養ＴＲＡＭＰ細胞及びＴＲＡＭＰ腫瘍組織中のＩＬ−１２の発現におけるｐ４０ｍＡｂの効果。（Ａ）２４時間、無血清条件下で、ｐ４０ｍＡｂ（０．５μｇ／ｍＬ）とマウスＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ）で処置した培養ＴＲＡＭＰ細胞中のＩＬ−１２レベルをモニターするためのＥＬＩＳＡ解析。結果は３つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^*ｐ＜０．００１ vs. コントロール。（Ｂ）同様に、食塩水、ｐ４０ｍＡｂ及びＩｇＧで処置したＴＲＡＭＰ腫瘍組織（ｎ＝３）中のＩＬ−１２レベルをモニターした。結果は、１群３マウスについての平均±平均値の標準誤差で表す。^*ｐ＜０．００１ vs. コントロール。

【図12】図１２：ＴＲＡＭＰ細胞中のｐ４０ｍＡｂ性の死におけるＩＬ−１２の役割。ｐ４０ｍＡｂ−（０．５μg/ml）またはｐ４０ｍＡｂとともに用量を変えて増やしたＩＬ−１２Ａｂで処置したＴＲＡＭＰ細胞で、（Ａ）ＭＴＴ及び（Ｂ）ＬＤＨアッセイを行った。結果は３つの異なる実験についての平均±標準偏差で表す。^*ｐ＜０．００１ vs. コントロール、^**ｐ＜０．００１ vs. ｐ４０ｍＡｂのみ。

【図13】図１３：培養ＴＲＡＭＰ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ２の細胞表面発現における、ｐ４０、ｐ４０₂、ｐ７０、ｐ４０ｍＡｂ及びＩｇＧの効果。（Ａ）２時間、無血清条件下で、ｐ４０（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｐ４０₂（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｐ７０（２０ｎｇ／ｍＬ）、ｐ４０ｍＡｂ（０．５μｇ／ｍＬ）及びマウスＩｇＧ（０．５μｇ／ｍＬ）で処置した培養ＴＲＡＭＰ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ２レベルをモニターするためのＦＡＣＳ解析。結果は３つの異なる実験についてのものを表す。

【図14】図１４：異なるヒトがん細胞株中のｐ４０の発現。標準タンパク質（Ａ）、ヒトヘパトーマＨｅｐ３ｂ（Ｂ）及びヒト前立腺ＬｎＣＡＰ（Ｃ）細胞株中の、Ｐ４０のＥＳＩ−ＭＳ解析。簡単に言うと、異なるがん細胞株の上清を１０ｋＤａ分子カットカラムに通した後、濃縮し、ＥＳＩ−ＭＳ技術でｐ４０を分析した。同様に、ＩＬ−１２標準（Ｄ）、Ｈｅｐ３Ｂ（Ｅ）及びＬｎＣＡＰ（Ｆ）細胞株中のＩＬ−１２レベルを分析した。

【発明を実施するための形態】

【0006】

（好ましい実施態様についての詳細な説明）
（定義）
別途定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。争いが生じる場合は、本文書が、定義を含めて、支配権を有するであろう。好ましい方法及び物質は以下に記載されるが、本明細書に記載されたものと同様または同等の方法及び物質が、実際に、あるいは本発明の試験において、用いられ得る。
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」という用語の使用及び発明を記述する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）における類似の引用は、別途本明細書に示される、あるいは明らかに文脈的に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むものと解釈される。本明細書における値の範囲の列挙は、別途本明細書に示されない限り、単に当該範囲に入るそれぞれ別個の値を個別に参照することの略式の方法として用いることを意図したものであり、それぞれの別個の値は、あたかも個別に本明細書に列挙されたかのように明細書に編入される。本明細書に記述された全ての方法は、別途本明細書に示される、または明確に文脈的に矛盾しない限り、いずれか適切な順番で実施されて良い。本明細書で提供される、いずれかまたはすべての例または例示的な言葉（例えば「などの」、「たとえば」）の使用は、単に本発明をよりよく解明することを意図したものであり、別途請求されていない限り、本発明の対象範囲に限界を付すことを意図したものではない。本明細書の文言は、いかなる請求されていない要素を本発明の実施にとって本質的であることを示していると解釈されるべきでない。

【0007】

「治療効果」という用語は、本明細書で用いられる場合、病理症状、病勢進行、またはヒトまたは動物の患者の病、例えば再狭窄、に倒れることに関係または抵抗する生理的状態について、改善を誘発する、さらに良くする、またはその他の点で引き起こす効果を意味する。「治療効果のある量」という用語は、薬について用いられる場合、ヒトまたは動物の患者に治療効果を与える薬の量を意味する。
「インターナリゼーション」という用語は、本明細書で用いられる場合、例えばタンパク質のような分子が細胞膜に飲み込まれ、細胞に引き込まれる過程を意味する。
「抗体」という用語は、本明細書で用いられる場合、最も広い意味で用いられ、特に、例えば、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、多重特異性抗体、当該断片が望ましい免疫活性を示す限りにおいて抗体断片等を含む。

【0008】

（がんを治療する方法）
本発明の原理にかかる理解を促進するため、ここで実施態様を参照する。実施態様のうちのいくつかについては図を用いて示され、またそれらを説明するために具体的な用語が用いられることもある。しかしながら、それによって本発明の範囲を制限する意図はないことを理解されたい。記載された実施態様のいかなる変更、更なる修正、及び本明細書に記載された本発明の原理のこれ以上の応用も、本発明の属する技術分野の当業者ならば当然するものと考えられる。以下の議論において、数多くの潜在的な特徴、アッセイ方法、分析方法の選択、またはその他の態様が開示される。そのように開示された特徴あるいは特徴の数々は、既に議論された一般的な特徴と組み合わせて、本発明の開示された実施態様を形成するものと理解されるべきである。

【0009】

本発明の一態様は、がん、例えば前立腺がんを治療する方法を提供する。前立腺がんは男性のがんの最も一般的な形態であり、高齢者の前立腺において発達する。高齢者の間ではまた、免疫システムが損なわれていることは大変一般的であるので、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化、炎症性サイトカインの産生、及び抗原提示細胞の活性化を含むいくつかの免疫療法が、この致死的な病気と戦うために可能なアプローチである(19)。
しかしながら、本願の方法は、前立腺がんの治療に限られない。当該方法は他の多くのがんの治療に適用でき、以下に限られるものではないが、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱がん、脳がん、神経系がん、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん腫、腎臓がん、小細胞性肺がん及び非小細胞性肺がんを含む肺がん（lung cancers）、神経芽細胞腫／神経膠芽腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、皮膚がん、肝臓がん、黒色腫、口腔、咽喉（throat）、喉頭及び肺の扁平上皮がん腫、結腸がん、子宮頸がん、子宮頸がん腫、乳がん、上皮がん、腎臓がん、尿生殖器がん、肺がん（pulmonary cancer）、食道がん腫、頭頸部がん腫、大腸がん、造血器がん（hematopoietic cancers）；精巣がん；結腸及び直腸がん、前立腺がん、並びに膵がんが挙げられる。好ましい実施態様では、該方法はｐ４０モノマーの過剰産生に特徴づけられるがんに適用できる。

【0010】

ＩＬ−１２は細胞性免疫反応を起こす最も重要なサイトカインである。ＩＬ−１２は、ジスルフィド結合で共有結合した重鎖（ｐ４０）と軽鎖（ｐ３５）からなり、いわゆる生理活性なヘテロ二量体（ｐ７０）分子となる(5)。主として、Ｔｏｌｌ様受容体の活性化を通じた抗原提示細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との相互作用によって産生される(5、20)。やがては、ｐ４０はｐ１９と対をなして新たに発見されたサイトカインであるＩＬ−２３を形成する(21)。ｐ１９またはｐ３５のいずれかは、多くの細胞タイプにおいて恒常的に発現する。樹状細胞とマクロファージのような、ヘテロ二量体ＩＬ−１２またはＩＬ−２３を分泌することができる細胞は、常にｐ４０をモノマー（ｐ４０）またはホモ二量体（ｐ４０₂）として過剰に産生することが知られている。しかしながら、ｐ４０₂とｐ４０の生物学的な機能は知られていないままである。

【0011】

本明細書で提示される結果は、多くの異なるがんにおいて、がん細胞はｐ４０₂、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３に比較して過剰なｐ４０を産生し、ｐ４０が、がん細胞の生存に関連していることを実証した。この結論は、部分的には、以下の観察に基づく：第１に、ｐ４０のレベルはＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａ細胞中でｐ４０₂、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３に比べてはるかに高かった。この選択的なｐ４０の増加は、特定のＫＬＮ肺がん細胞株では観察されず、この発見の特異性を示している。しかしながら、この選択的なｐ４０増加の欠如は、肺がんの一般的特徴ではないかもしれない。第２に、ｐ４０₂ではなくｐ４０の中和は、ＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａ細胞中でＬＤＨの放出を誘発した。一方で、ｐ４０₂ではなくｐ４０に対するｍＡｂは、ＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａ細胞中のＭＴＴ代謝を減少させた。再び、ｐ４０ｍＡｂはＫＬＮ細胞中のＬＤＨ及びＭＴＴに何ら影響を与えなかった。第３に、がん細胞の成長を支える事象であるＴ型カルシウム流入が、ｐ４０中和抗体で処置された場合、ＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａ細胞で著しく減少したが、ＫＬＮ細胞中では減少しなかった。第４に、ＴＵＮＥＬ及びアネキシンＶ染色実験は、ｐ４０ｍＡｂで処置した後、ＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａではより多くの死を示したが、ＫＬＮではそうではなかった。最後に、ＩｇＧではなく、ｐ４０ｍＡｂの腹腔内注入は、雄C57BL/6マウスのわき腹に成長した前立腺腫瘍のサイズを著しく減少させた。これは、ＩＬ−１２ファミリーの機能しないメンバーといわれたｐ４０モノマーの、がん細胞の生存における生物学的役割を実証する、予期されない結果である。さらに、これらの結果は、様々ながんにおけるｐ４０中和の治療的見通しの可能性を示している。

【0012】

ｐ４０性腫瘍細胞殺傷の背景にあるメカニズムを調査する一方で、発明者は、純ＴＲＡＭＰ細胞中でｐ４０ｍＡｂにより、主要な細胞障害炎症性サイトカイン(22-24)であるＩＦＮ−γの発現が上昇制御されることを観察した。Ｔリンパ球(25)とナチュラルキラー細胞(26)がＩＦＮ−γの一次供給源であると考えられていたことから、この観察は衝撃的である。しかしながら、過去の文献によると、それは、マウスのマクロファージ(27)において上皮細胞(28、29)と同様に産生され得ることが実証されており、発明者はＴＲＡＭＰ上皮細胞中のＩＦＮ−γの産生を調査することとした。ＴＲＡＭＰ細胞は、刺激されない条件下では非常に少ない量のＩＦＮ−γを発現し、ｐ４０ｍＡｂ処置はＩＦＮ−γの産生を何倍にも刺激した。さらに、例えば４Ｔ１のような上皮起源やＨｅｐａのような肝細胞起源のがん細胞はまた、ｐ４０ｍＡｂで処置された場合、著しい量のＩＦＮ−γを発現し、ｐ４０の機能阻害は広い範囲のがん細胞でＩＦＮ−γの産生を刺激し得ることを示唆した。ＩＦＮ−γの細胞障害性の性質と整合的に、この分子の中和はｐ４０ｍＡｂ性ＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａ細胞の死を抑止し、ｐ４０ｍＡｂがＩＦＮ−γを通じてがん細胞の死を誘導することを実証した。

【0013】

様々な細胞中でＩＦＮ−γを誘発するにあたり、ＩＬ−１２シグナルを活性化することは極めて重要な役割を果たす(5)。細胞膜中のＩＬ−１２とその受容体であるＩＬ−１２Ｒの相互作用は、ヤヌスファミリーチロシンキナーゼを活性化するきっかけとなり、シグナル伝達兼転写活性化因子３及び４（ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ４）のチロシン残基をリン酸化する。これらのチロシンリン酸化反応がＳＴＡＴ４／ＳＴＡＴ４ホモ二量体及びＳＴＡＴ３／ＳＴＡＴ４ヘテロ二量体を形成する。これらの二量体はその後核に移動し、ＩＦＮ−γ転写のためＩＦＮ−γプロモーターと結合する(30)。
したがって、ｐ４０ｍＡｂはＴＲＡＭＰ細胞中のＩＬ−１２の産生を刺激し、ｐ４０の欠乏は、これら細胞中におけるＩＬ−１２の正の自己調節効果(31)を活性化するＩＬ−１２とＩＬ−１２Ｒの相互作用にとって望ましい可能性があることを示唆している。ＩＬ−１２とＩＬ−１２Ｒの相互作用の成功は、ダウンストリームシグナルを伝達し、受容体を細胞内に取り込む。一方で、ＩＬ-１２とＩＬ−１２Ｒの相互作用が失敗すると、受容体を膜に捕らわれたままとし、いかなるダウンストリームシグナルの段階的伝達も不可能となる。ｐ４０処置は、細胞膜におけるＩＬ−１２Ｒβ１の局在化を増加し、ｐ４０ｍＡｂは膜中のＩＬ−１２Ｒβ１レベルを減少させた。一方で、ｐ４０またはｐ４０ｍＡｂのいずれも、ＩＬ−１２Ｒβ２のインターナリゼーションには影響を与えなかった。これらの結果は、ｐ４０は膜中のＩＬ−１２Ｒβ１捕捉には関わっているが、ＩＬ−１２Ｒβ２については関わっていないことを実証している。さらにこのメカニズムについて探るため、発明者は、ＴＲＡＭＰ細胞中のｐ４０ｍＡｂが媒介するＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションがクラスリン依存かカベオリン依存かを調べた。本件では、クラスリンではなくカベオリンが、ｐ４０ｍＡｂが媒介するＩＬ−１２Ｒβ１の膜へのインターナリゼーションに関わっていることがわかった。

【0014】

ｐ４０₂は、ＩＬ−１２Ｒβ１との結合においてＩＬ−１２と競合することから、ＩＬ-１２アンタゴニストとして知られている(5)。一方で、報告によれば、ｐ４０はいかなるＩＬ-１２拮抗作用も有さず、ＩＬ−１２Ｒβ１との結合も非常に弱い（ｐ４０₂に比べれば１０から２０倍効果が弱い）とされている(5)。これら報告と対照的に、本明細書で提供されるＴＲＡＭＰ細胞から得られた結果は、ｐ４０₂ではなく、ｐ４０モノマーが、カベオリンが媒介するＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションの抑制を通じてＩＬ−１２シグナル伝達を阻害することを示唆している。したがって、これは知識のパラダイムシフトである。ｐ４０ｍＡｂによるｐ４０の中和によって、ＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションが再度生じ、ＩＬ−１２性ＩＦＮ−γの産生を通じて死を誘導することから、ｐ４０ｍＡｂは、ｐ４０の過剰産生と結びついた前立腺及びその他のがんについて、治療的効能を有する可能性がある。

【0015】

一つの態様では、本発明は、少なくとも１つのｐ４０に対する抗体またはそのような抗体の免疫活性な断片を含む組成物を、治療的効果を有する量投与することを含む、ヒトまたは動物の患者のがんを治療する方法を提供する。様々な実施態様において、該抗体は、例えば、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメントまたは一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントである。その他の実施態様では、抗体または抗体の断片は、その他の分子と結合し、免疫複合体分子を形成する。例えば、抗体または抗体の断片は、場合によってはリンカーを通じて、細胞傷害性薬物と結合し得る。この開示に含まれる抗体または抗体の断片は、いかなるタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であってもよい。

【0016】

（医薬組成物）
本発明のその他の態様は、少なくとも１つのｐ４０モノマー抗体または抗体断片を含む医薬組成物を提供する。例えば、医薬組成物は、１、２、３、４、５あるいはそれ以上のそのような抗体を含んでもよい。抗体または抗体の断片は、他の治療剤と組み合わせて投与してもよいが、必ずしもそうしなければならないわけではない。例えば、細胞障害性の薬や他の抗がん剤と組み合わせてもよい。
医薬組成物は、例えば、錠剤、ピル、糖衣錠、硬及び軟ゲルカプセル、顆粒、ペレット、水性、脂質、油性またはその他の溶液、水中油型乳剤のような乳剤、リポソーム、水性あるいは油性懸濁液、シロップ、エリキシール（alixiers）、固体乳剤、固体分散剤、または分散性パウダーの形状を取り得る。経口投与のための医薬組成物中では、該薬物は、一般的に知られ、使用されているアジュバント及び賦形剤、例えば、アラビアゴム、滑石、デンプン、砂糖（例えば、マンニトース、メチルセルロース、ラクトース）、ゼラチン、界面活性剤、ステアリン酸マグネシウム、水溶性または非水溶性溶媒、パラフィン誘導体、架橋剤、分散剤、乳化剤、潤滑剤、保存料、香味料（例えば、精油）、溶解性向上剤（例えば、ベンジルベンゾエートまたはベンジルアルコール）または生物学的利用能向上剤（例えばＧＥＬＵＣＩＲＥ）と混合してもよい。医薬組成物中で、該薬物はまた、微小粒子、例えばナノ粒子組成物中に分散されてもよい。
非経口投与のため、該薬物または該薬物の医薬組成物は、生理的に許容される希釈剤、例えば、水、バッファー、溶解剤と共に、あるいは抜きの油、界面活性剤、分散剤または乳化剤に溶解しまたは懸濁させることができる。油としては、例えば、以下に限定するものではないが、オリーブオイル、ピーナッツオイル、綿実油、大豆油、ひまし油及びごま油が用いられ得る。より一般的には、非経口投与のため、該薬物または該薬物の医薬組成物は、水性、脂質、油性またはその他の種類の溶液または懸濁液の形状であってもよく、あるいはリポソームまたはナノ懸濁液の形状で投与されてさえよい。

【0017】

（投与方法）
ｐ４０モノマー抗体、抗体断片、または該抗体若しくはその断片を含む医薬組成物は、治療効果のある量の該薬物を対象に送達することを可能とするいかなる方法によって投与されてもよい。投与方法としては、経口、局所、経皮及び非経口経路が、組織への直接注入やカテーテルによる送達と同様に挙げられるが、これらに限られるわけではない。非経口経路としては、皮下、皮内、関節内、静脈内、腹腔内、筋肉内の経路が挙げられるが、これに限られるわけではない。一つの実施態様では、投与経路は局所または経皮投与であり、例えば、ローション、クリーム、パッチ、注射、体内埋め込み装置、移植装置またはその他の制御された放出担体が挙げられる。投与経路には、組成物を大循環に直接送達するいかなる経路（例えば、注射）も、いかなる非経口経路も含め、含まれる。あるいは、投与は、直接患部組織への送達によってもよい。

【0018】

本発明による方法の一つの実施態様は、少なくとも1つのｐ４０モノマー抗体またはその断片を、例えば上述のどの種類のがんでもがんの発達を阻害若しくはその程度を小さくするために十分なだけの用量及び濃度で、また十分な時間投与することを含む。ある一定の実施態様は、ｐ４０モノマー抗体またはその断片を、対象の体重１Ｋｇあたり約０．１μｇと約１００ｍｇの間の量、対象の体重１Ｋｇあたり約０．１μｇと約１０ｍｇの間の量、対象の体重１Ｋｇあたり約０．１μｇと約１ｍｇの間の量、全身的に投与することを含む。該方法を実施するにあたっては、ｐ４０モノマー抗体または該薬物を含有する治療用組成物は、一日１回の用量または一日複数回の用量で投与することができる。この治療方法は、長期間にわたる投与を必要とする場合がある。投与された一回分の服用量または全体の投与量は、医師によって定められ、患者の体重、年齢、患者の一般的健康状態及び組成物に対する患者の耐久力といった要因に依存するであろう。

【実施例】

【0019】

本発明の実施態様は、下記実施例によってさらに説明されるが、特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１−物質と方法：
動物とリージェント：全てのマウスがん細胞株はＡＴＣＣから購入した。雄C57BL/6マウス（Harlan）が本研究に用いられた。マウスｐ４０（cat#554594）及びｐ７０（cat#554592）をＢＤバイオサイエンスから購入した。マウスｐ４０₂（cat#499-ML）をＲ＆Ｄより購入した。ハムスターＩｇＧ（cat#IR-HT-GF）はイノヴァティブリサーチから入手した。マウスＩｇＧ（cat#sc-2025）はサンタクルズバイオテクノロジーから購入した。クロルプロマジン（cat#C8138）、フィリピン（cat#F9765）、ＭＴＴアッセイキット（cat#CGD1）及びＬＤＨアッセイキット（cat#TOX7）はシグマから購入した。ＩＦＮ−γ中和抗体（cat# 16-7311-81）はｅバイオサイエンスから購入した。ＴＵＮＥＬアッセイキット（cat#QIA39）はカルビオケムから、アネキシンＶアッセイキット（cat#K101-25）はバイオビジョンから購入した。

【0020】

サンドイッチ法ＥＬＩＳＡ：サンドイッチ法ＥＬＩＳＡを用いて、我々が記述したように(11、12)マウスｐ４０₂及びｐ４０を定量した。簡単に述べると、ｐ４０₂については、ｍＡｂ ａ３−１ｄ (１．３ｍｇ／ｍＬ) を１：３０００に希釈し、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェル（１００μＬ／ウェル）にコーティングのため加えた。ビオチン化されたｐ４０₂ｍＡｂ ｄ７−１２ｃ（２ｍｇ／ｍＬ）を１：３０００に希釈し、検出抗体として用いた。同様にｐ４０について、ｍＡｂ ａ３−３ａ （１．３ｍｇ／ｍＬ）とビオチン化されたｐ４０ｍＡｂ ａ３−７ｇ（２ｍｇ／ｍＬ） を１：３０００に希釈し、それぞれコーティングと検出抗体として用いた(11)。異なる処置群の無血清上清中のＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２及びＩＬ−１０濃度を、ＥＬＩＳＡ (eBioscience)で製造者の使用説明書に従って測定した。
ＭＴＴ及びＬＤＨアッセイ: これらのアッセイは、Jana. M. 他(32) 及びKhasnavis. S. 他(33)に記載のとおり行われた。

【0021】

腫瘍の発達と測定: 動物の管理及び実験は、米国国立衛生研究所のガイドラインに従い、ラッシュ大学医療センター（イリノイ州シカゴ）動物実験委員会(IACUC#14-019)の承認を得て行った。腫瘍は雄C57BL/6マウスの皮下で発生させた。腫瘍を発生させるため、マウスのわき腹に１×１０６ ＴＲＡＭＰ−Ｃ２細胞を注射した。マウスは我々の温度管理された動物飼育器で適切な食物と水を与えられて管理された。腫瘍の成長はカリパスで測定され、腫瘍の断面積が式によって定められた（ｍｍ² ＝最も長い径×最も短い径)。ｐ４０ｍＡｂによる処置は、腫瘍のサイズが０．８−１ｃｍ²に達したときに開始した。ｐ４０ｍＡｂ ａ３−３ａを週に一回、腹腔内（intraperitonially）に、容量０．１ｍｌの滅菌ＰＢＳ−１％の正常マウス血清中で注入した。その後、腫瘍の発達または退行を判断するために測定した。赤外色素（２ＤＧと結合したＡｌｅｘａ８００色素；Ｌｉｃｏｒ）を、尾静脈を通じて画像解析の前日に注射した。マウスは研究の最後に犠牲にされ、腫瘍組織はウェスタンブロット、ｍＲＮＡ発現及び免疫組織化学的な分析のために収集された。

【0022】

組織標本と免役組織化学：パラフィン包埋された組織切片を調製し、組織切片を５ミクロンのサイズに切った。内在するペルオキシダーゼ活性を除去するため、組織切片を脱パラフィンし、再水和し、３％過酸化水素水とともにメタノール中、室温で１５分間培養した。抗原の回復を、温度９５℃で２０分間、スライドを０．０１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に置くことにより行った。ブロッキングをした後、一次抗体（表１）とともに、室温で２時間、スライドを培養し、その後洗浄して、Ｃｙ２、Ｃｙ３またはＣｙ５(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、ペンシルべニア州ウェストグローブ) 二次抗体とともに室温で１時間培養した。マウスＩｇＧをアイソタイプコントロールとして用いた(34)。
ＴＵＮＥＬアッセイ: ｐ４０またはｐ４０₂に対するｍＡｂ処置の後、ＴＵＮＥＬアッセイをCorbett GT 他(35)に記載のとおり行った。
半定量的ＲＴ−ＰＣＲ：全ＲＮＡを単離し、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、Ｔ−ｂｅｔ、ＧＡＴＡ３、ＦｏｘＰ３及びＧＡＰＤＨについてBrahmachari S 他 (6); Jana M 他 (32)及びCorbett GT 他 (35) に記載のとおり、プライマー（表２）を用いて行った。

【0023】

リアルタイム定量的ＰＣＲ：ｍＲＮＡの定量を、ＡＢＩ−Ｐｒｉｓｍ７７００シーケンス検出システム (Applied Biosystems) 、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ (Applied Biosystems) を用いてBrahmachari S 他 (6); Jana M 他 (32) 及びCorbett GT 他(35)に記載のとおり行った。各遺伝子のｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡのレベルで正規化した。データはＡＢＩシーケンス検出システム１．６ソフトウェアによって解析し、ＡＮＯＶＡによって分析した。
ＦＡＣＳ：ＩＬ−１２Ｒβ１及びＩＬ−１２Ｒβ２の細胞表面発現を、Brahmachari S 他 (6)記載のとおりモニターした。簡単に述べると、処置後、付着細胞を剥離するためＡｃｃｕｔａｓｅ (BD Bioscience)とともに１０分間、細胞を培養した。ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、細胞をＰＥ標識されたＩＬ−１２ＲβとＩＬ−１２Ｒβ２抗体とともに、温度４℃で１時間培養した。細胞内染色のため、ｐ４０及びｐ４０₂ｍＡｂとともに培養する前に、透過処理した。ＡＰＣ−結合した抗ハムスター二次抗体を用いた。洗浄後、細胞をＦＡＣＳ (BD Biosciences、カルフォルニア州サンノゼ)で分析した。細胞は形態的な特徴に基づきゲートをかけられ（gated）た。アポトーシス性及び壊死性の細胞はＦＡＣＳ分析には許容されなかった。
膜分離：処置後、細胞はＰＢＳ中で解体（scrap）され、細胞ペレットを均質化緩衝液（２５０ｍＭ スクロース、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ トリス塩酸溶液（ｐＨ７．２）、プロテアーゼ阻害剤及びホスファターゼ阻害剤)に溶解し、ハンドホモジナイザーで均質化した。細胞片を温度４℃で１０分間５００ｇで遠心分離し、次いで上清を温度４℃で１時間１００，０００ｇで遠心分離して除去した。上清を処分し、膜分画を含むペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液に溶解した。

【0024】

イムノブロット解析：イムノブロット解析をJana M 他 (32) 、Khasnavis S (33) 及びCorbett GT 他(35) に記載のとおり、異なる一次抗体 (表１)を用いて行った。
統計分析: 腫瘍の退行については、定量的なデータが平均±平均誤差として示された。統計的有意性が、スチューデント＝ニューマン＝コイルス事後分析とともに一元配置分散分析を通じてアクセスされた。その他のデータは、３つの独立した実験の平均±標準偏差として示された。平均の間の統計的有意差は、スチューデントのｔ−検定によって計算した。ｐ−値が０．０５未満（ｐ＜０．０５）の場合、統計的有意であるとみなした。

【0025】

実施例２−異なるマウスがん細胞株中のＩＬ−１２ファミリーのサイトカインレベル（ｐ４０、ｐ４０₂、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３）
がんにおけるＩＬ−１２ファミリーのサイトカインの役割を理解するため、まず、我々は、異なるがん細胞株中のこれらサイトカインのレベルをモニターした。特定機能阻害モノクロナール抗体（ｍＡｂ）が入手できなかったことから、どの病気についても発病にかかるｐ４０及びｐ４０₂の役割を検討することはできなかった。したがって、我々はｐ４０及びｐ４０₂それぞれを中和するｍＡｂを発生させ、これらのサイトカインを別々にモニターするためのＥＬＩＳＡを開発した(11)。定量化分析を、扁平上皮（ＫＬＮ）、前立腺（ＴＲＡＭＰ）、乳（４Ｔ１）及び肝臓ヘパトーマ（Ｈｅｐａ）細胞株を含む異なる付着性マウスがん細胞において行った。細胞を無血清条件下で４８時間培養し、その後、サンドイッチ法ＥＬＩＳＡでｐ４０、ｐ４０₂、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３レベルを測定した。一般的に、これらそれぞれの細胞株中のＩＬ−１２及びＩＬ−２３のレベルはｐ４０及びｐ４０₂よりも非常に低かった（図１Ａ−Ｃ）。ＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａ細胞中のｐ４０のレベルはｐ４０₂、ＩＬ−１２及びＩＬ−２３よりもはるかに高かった（図１Ａ−Ｃ）。しかしながら、ＫＬＮ肺がん細胞中では、ｐ４０及びｐ４０₂のレベルはほぼ同じであり（図１Ａ）、当該効果の特異性を示唆していた。がん細胞中のｐ４０の存在を確認するため、我々は異なる技術を採用した。最初に、我々はＴＲＡＭＰ細胞上清中のｐ４０レベルをネイティブＰＡＧＥ分析によってモニターした（図１Ｄ）。クマシー染色のネイティブＰＡＧＥを行い、当該バンドを純モノマーｐ４０タンパク質のバンド（最左レーン）と比較したところ、ＴＲＡＭＰ細胞の主な分泌性分子として４０ｋＤａタンパク質の存在が示された（図１Ｄ）。第２に、我々は、ＴＲＡＭＰ細胞上清のネイティブイムノブロット解析を我々の特定のｐ４０モノマーモノクロナール抗体（ｐ４０ｍＡｂ）ａ３−３ａとともに行い、ＴＲＡＭＰ細胞上清中に、ｐ４０が存在することを発見した（図１Ｅ）。最後に、細胞内ＦＡＣＳ解析をｐ４０ｍＡｂ ａ３−３ａ及びｐ４０₂ ｍＡｂ ａ３−１ｄとともに行ったところ、ＴＲＡＭＰ細胞中でｐ４０のレベルがｐ４０₂よりも著しく高いことが示された（図１Ｆ−Ｇ）。

【0026】

次に我々は、異なるヒトがん細胞株中のｐ４０レベルを測定した。興味深いことに、我々の上清ＥＳＩ−ＭＳ分析(図１４Ａ−Ｃ）は明確に、ヒトヘパトーマＨｅｐ３Ｂ及び前立腺ＬＮＣａＰ細胞が、ＩＬ−１２よりも著しく高いレベルのｐ４０を発現したことを示した（図１４Ｄ−Ｆ）。さらに、クマシー染色した上清とｐ４０標準タンパク質のネイティブＰＡＧＥ分析は、Ｈｅｐ３Ｂ、ＬＮＣａＰ及びヒト乳がんＭＣＦ−７細胞が著しいレベルのｐ４０を産生したことを実証した（図１Ｈ−Ｊ）。異なる上清と抗ヒト全ＩＬ１２ｐ４０／ｐ７０抗体のイムノブロット解析はまた、３つの全てのヒトがん細胞が、他のＩＬ−１２サイトカインに比べて高いレベルのｐ４０を産生したことを示した（図１Ｋ）。同時に、我々の結果は、幅広いがん細胞において、ｐ４０が過剰に産生されたことを示唆した。

【0027】

実施例３：モノクロナール抗体によるｐ４０の選択的中和はがん細胞の死反応を刺激する
ＩＬ-１２ファミリーのメンバー中で、ｐ４０のレベルがほとんどのがん細胞中で最も高いことから、我々は、がん細胞の成長及び生存におけるその役割について検討した。いかなる病気のプロセスにおいても、分子の役割を調べるにあたっては、ノックアウトマウスモデルを考えることが、しばしば非常に容易である。しかしながら、我々はｐ４０（−／−）マウスを使うことが今回はできなかった。何故なら、ｐ４０遺伝子をノックアウトすることは、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ｐ４０₂及びｐ４０をノックダウンすることでもあるからである。したがって、異なるがん細胞の生と死におけるｐ４０₂及びｐ４０の役割を調べるため唯一の実行可能なアプローチは、これら分子を中和するモノクロナール抗体を用いることであった。ｐ４０₂ｍＡｂ ａ３−１ｄではなく、ｐ４０ｍＡｂ ａ３−３ａが、ＴＲＡＭＰ（図２（Ｂ及びＦ））、４Ｔ１（図２（Ｃ及びＧ））及びＨｅｐａ（図２（Ｄ及びＨ））細胞中のＬＤＨの放出を増加させ（図２（Ａ−Ｄ））、ＭＴＴ放出を減少させた（図２（Ｅ−Ｈ））。一方、ｐ４０ｍＡｂは、ＫＬＮ肺がん細胞では、ＬＤＨあるいはＭＴＴの何れにも効果はなく、当該効果の特異性を示していた。腫瘍細胞の死を別の角度からモニターするため、我々はｔ−型カルシウムチャンネルを通じたカルシウム流入を測定した。異なるがん細胞を、ｐ４０₂ではなくｐ４０ｍＡｂで処置したところ、ＴＲＡＭＰ（図２Ｆ）、４Ｔ１（図２Ｇ）及びＨｅｐａ（図４Ｈ）細胞においてｔ−型カルシウム流入の減少が示された。この場合も、ｐ４０ｍＡｂは、ＫＬＮがん細胞中でｔ−型カルシウム流入を調整することはできなかった（図２Ｅ）。続いて、ＴＵＮＥＬ（図２Ｍ）及びアネキシンＶ（図２Ｎ）で標識し、定量分析を行ったところ（図２Ｏ及び２Ｐ）、ｐ４０₂ではなくｐ４０の中和は、ＴＲＡＭＰ、４Ｔ１及びＨｅｐａがん細胞の死を刺激した。しかしながら、ｐ４０ｍＡｂはＫＬＮがん細胞のアポトーシスに何ら影響を与えなかった。同時に、これらの結果は、ｐ４０₂ではなくｐ４０の特異的な除去が、肺がん細胞の生存に影響を与えることなく、前立腺、乳及び肝臓腫瘍細胞中の死反応を刺激することを示唆している。

【0028】

ｐ４０に特定的な中和は、インビボＴＲＡＭＰ腫瘍組織中で、腫瘍の成長の退縮を誘導し、死反応を刺激した。次に我々は、ＴＲＡＭＰ細胞を雄C57BL/6マウスのわき腹で腫瘍として成長させたときに、インビボでの腫瘍サイズ及び腫瘍組織の死に与えるｐ４０ｍＡｂの効果について検討した。腫瘍が０．８から１ｍｍのサイズに至ったら、マウスにｐ４０ ｍＡａ３−３ａを一回に体重あたり２ｍｇ／Ｋｇ、腹腔内に週２回、２週間処置した。ｐ４０ｍＡｂを処置した後、腫瘍のサイズを一日おきに記録した。ＩｇＧを受けた動物をネガティブコントロールとして分析した。コントロールとなる動物は一切の抗体を受けなかった。２週間後、腫瘍は赤外色素８００が２デオキシＤグルコースと結合したもの（ＩＲＤｙｅ８００２ＤＧ）を尾静脈から注入して標識し、Ｌｉｃｏｒ Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外スキャナーで画像化した。興味深いことに、全ての動物の赤外画像（図３Ａ）及び切除された腫瘍の写真（図３Ｂ）から明らかであるように、我々は、ｐ４０ｍＡｂの投与が著しく腫瘍サイズを退縮させたことを観察した。

【0029】

腫瘍の退縮カーブから、ｐ４０ｍＡｂを処置した群の腫瘍サイズが、コントロール群及びＩｇＧ処置群（図３Ｃ）に比較して、着実かつ著しく減少したことは明らかであった。次に我々は、これら腫瘍組織中のアポトーシスをモニターした。我々のＴＵＮＥＬの結果は、ｐ４０ｍＡｂ処置した腫瘍中のＴＵＮＥＬ−陽性死細胞の総数は、コントロールまたはＩｇＧ処置した腫瘍（図３Ｄ）よりも高いことを明確に示し、ｐ４０ｍＡｂによるｐ４０の中和は、腫瘍組織中でアポトーシスを誘導することができることを示唆している。この発見をさらに確認するため、我々は、処置及び未処置腫瘍組織中の異なるアポトーシス関連遺伝子のｍＲＮＡ発現を、カスタム遺伝子アレイを用いてモニターした。遺伝子アレイ（図３Ｅ）に続いて、個別の遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析（図３Ｆ）は、ｐ４０ｍＡｂ処置がアポトーシス関連の異なる遺伝子、例えば、カスパーゼ３、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、ＢＡＤ、ＢＩＤ、シトクロムＣ、ＢＡＫ及びｐ５３の発現を著しく高めたことを明らかに示した。まとめると、これらの結果は、ｐ４０の中和が前立腺腫瘍細胞中インビボでアポトーシスを誘導することを示唆している。

【0030】

実施例４：ｐ４０特定中和が、培養腫瘍細胞及びインビボ腫瘍組織中のＩＦＮ−γの産生を刺激する
次に我々はｐ４０ｍＡｂが、がん細胞の死反応を誘導するメカニズムについて調査した。ＩＦＮ−γの産生を誘導すると、がん細胞中で細胞傷害性を誘導することは、既に証明された治療戦略である(13)。したがって我々は、ｐ４０ｍＡｂ処置がＴＲＡＭＰ腫瘍細胞中のＩＦＮ−γの発現を上方制御することができるかを調べた。我々は、ＩｇＧではなく、ｐ４０ｍＡｂが、培養ＴＲＡＭＰ細胞中でＩＦＮ−γのｍＲＮＡ発現を著しく上方制御することを観察した（図４Ａ）。ＩＦＮ−γはＴｈ１細胞サイトカインであるが、我々のＥＬＩＳＡ（図４Ｂ）及び免疫細胞化学的分析（図６）の結果は、ｐ４０ｍＡｂ処置がＴＲＡＭＰ細胞中のＩＦＮ−γレベルを増加させたことを明確に示した。一方で、ｐ４０ｍＡｂ処置（図４Ｃ）は、がんの成長を助けるとして知られている(14)、抗炎症性サイトカインであるＩＬ−１０のレベルを低減させた。次に我々は、ｐ４０ｍＡｂ処置したＴＲＡＭＰ細胞中のＩＦＮ−γの増加した発現が、実際に細胞死に関わっているのか調査した。このため、我々は、ＴＲＡＭＰ細胞をＩＦＮ−γ中和抗体のみ、あるいはｐ４０ｍＡｂとともに処置した。ＴＵＮＥＬ（図４Ｄ）、ＬＤＨ（図４Ｅ）及びＭＴＴ（図４Ｆ）アッセイは、ＩＦＮ−γ中和抗体が、ＴＲＡＭＰ細胞中のｐ４０ｍＡｂが媒介する細胞死を無効にすることを明らかにした。これらの結果は、ＩｇＧではＴＲＡＭＰ細胞中のｐ４０ｍＡｂが媒介する細胞死から守ることができなかったことから特定性がある（図４Ｄ−Ｆ）。Ｈｅｐａ（図７Ａ−Ｂ）及び４Ｔ１（図Ｓ２Ｃ−Ｄ）を含むその他の腫瘍細胞もまたＩＦＮ−γの発現の上方制御を示した。ＴＲＡＭＰ細胞と同様に、我々のＭＴＴ活性アッセイ（図８Ａ及び図９Ａ）及びＬＤＨ放出アッセイ（図８Ｂ及び図９Ｂ）は、ＩｇＧではなくｐ４０ｍＡｂが、Ｈｅｐａ及び４Ｔ１の両腫瘍細胞中での死を著しく刺激したことを明らかにし、ｐ４０の中和が、異なる腫瘍細胞においても死を誘導するために重大となり得ることを示唆した。

【0031】

腫瘍組織中のＩＦＮ−γレベルを分析したとき、我々は、細胞培養データと同様に、ｐ４０ｍＡｂ処置腫瘍組織が、コントロール及びＩｇＧ処置腫瘍に比べ、ＩＦＮ−γｍＲＮＡ（図１０Ａ−Ｂ）とタンパク質（図１０Ｃ及び図１０Ｇ）をより多く発現したことを観察した。さらに、ＩＦＮ−γ誘導転写因子であるＴ−ｂｅｔの発現が、ｐ４０ｍＡｂ処置マウス腫瘍では上方制御されたことが認められたが、コントロール及びＩｇＧ処置マウス（図１０Ｈ）では認められなかった。ＩＬ−１０の上方制御(15)と制御性Ｔ細胞マーカーＦｏｘｐ３(16)は、がん細胞中の細胞傷害性効果を阻害すると信じられているところ、我々はまた、これらの分子を腫瘍組織中でモニターした。興味深いことに、ＩＬ−１０、ＧＡＴＡ−３及びＦｏｘｐ３の発現は、ｐ４０ｍＡｂ処置腫瘍中で、コントロール及びＩｇＧ処置腫瘍に比べて減少した（図１０Ｄ−Ｆ）。これらの結果は、ｐ４０の中和が細胞性免疫を誘導し、体液性免疫とＴｒｅｇｓを下方制御することが、培養ＴＲＡＭＰ細胞及びインビボＴＲＡＭＰ腫瘍組織中で可能であることを示唆している。

【0032】

実施例５：ｐ４０特定中和がＴＲＡＭＰ腫瘍細胞中のＩＬ−１２産生を誘導する
ＩＦＮ−γの上方制御は、ＩＬ−１２シグナル伝達系の活性化によって達成される(13、17)。ｐ４０ｍＡｂはＩＦＮ−γの産生を増加させ、ＴＲＡＭＰ細胞中の死をＩＦＮ−γを通じて誘導するため、我々は、これらのプロセスにおけるＩＬ−１２の関与を調査した。ＩＬ−１２の産生は、コントロール及びＩｇＧ処置に比べ、ｐ４０ｍＡｂ処置ＴＲＡＭＰ細胞（図１１Ａ）及びインビボ腫瘍組織（図１０Ｂ）で著しく増加し、ＩＬ−１２シグナル伝達系がｐ４０ｍＡｂ性ＩＦＮ−γ産生及び細胞死に関与している可能性があることを示唆した。我々は、機能阻害抗体によるＩＬ−１２の中和が、ＴＲＡＭＰ細胞中のｐ４０ｍＡｂ誘導ＩＦＮ−γの産生を抑制することを発見した（データは示されていない）。さらに、対ＩＬ−１２中和抗体は、ＭＴＴ（図１２Ａ）及びＬＤＨ放出（図１２Ｂ）に示されたように、ｐ４０ｍＡｂ性ＴＲＡＭＰ細胞の死を抑制した。これらの結果は、ｐ４０の中和が、ＩＬ−１２シグナル伝達系を通じて、がん細胞中のＩＦＮ−γと細胞死を誘導することを示唆している。

【0033】

実施例６：ｐ４０の選択的中和がＴＲＡＭＰ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションを誘導する
ＩＬ−１２シグナル伝達系は、ＩＬ−１２と、ＩＬ−１２Ｒβ１及びＩＬ−１２Ｒβ２のヘテロ二量体であるＩＬ−１２受容体との相互作用により開始される。機能性ＩＬ−１２受容体は、そのリガンドＩＬ−１２と成功裏に結合した後取り込まれ(18)、さもなければ膜に捕らわれたままであると報告されている。したがって、われわれはｐ４０モノマーがＩＬ−１２シグナル伝達系を無効にするため、ＴＲＡＭＰ細胞中でＩＬ−１２受容体を捕らえることに関与しているかを検討した。我々のＦＡＣＳ分析は、ｐ４０₂でもｐ７０でもなく、ｐ４０で処置すると、ＴＲＡＭＰ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ１の表面発現が増加することを明らかにした(図５Ａｉ−ｉｖ)。一方で、ｐ４０はＩＬ−１２Ｒβ２の表面発現には何の効果もなかった（図１３）。さらに、ＩｇＧではなくｐ４０ｍＡｂで処置した場合、ＩＬ−１２Ｒβ１の膜レベルが下方制御され（図５Ａｖ及びｖｉ）、膜においてＩＬ−１２Ｒβ１を捕捉するにあたりｐ４０が関与していることが示唆された。更なる確認のため、我々は、ｐ４０、ｐ４０₂またはｐ７０で別々に処置されたＴＲＡＭＰ細胞の膜分画中のＩＬ−１２Ｒβ１についてイムノブロット解析を行った。興味深いことに、我々は、ｐ４０₂でもＩＬ−１２でもなく、ｐ４０で処置した場合に、膜中のＩＬ−１２Ｒβ１の存在が増加したことを発見した（図５Ｂ）。膜分画の純度を確認するため、全カドヘリンについて分析した（図５Ｃ；上部パネル）。驚くべきことに、我々は、ｐ４０₂またはｐ７０で処置したＴＲＡＭＰ細胞の膜分画中のβ−アクチンのレベルが増加したことを認め、ｐ４０₂またはｐ７０で処置することが膜中のエンドサイト小胞の形成の増加と関連している可能性があることが示唆された（図５Ｃ：下部パネル）。対照的に、我々は、ｐ４０で処置したＴＲＡＭＰ細胞中ではβ−アクチンの膜レベルの増加は観察しなかった（図５Ｃ）。これらの結果は、ｐ４０₂でもｐ７０でもなく、ｐ４０が、膜中でＩＬ−１２Ｒβ１を捕捉することに関わっている可能性を示唆している。

【0034】

しかしながら、ＴＲＡＭＰ細胞がこれらのサイトカインで処置されたとき、細胞全体からの抽出物中のＩＬ−１２Ｒβ１には何の違いもなく（図５Ｄ）、ｐ４０モノマーによるＩＬ−１２Ｒβ１レベルの誘導の可能性を打ち消すものであった。これと整合的に、ｐ４０ｍＡｂは、ｐ４０が媒介するＴＲＡＭＰ細胞の膜中のＩＬ−１２Ｒβ１の増加を無効化しており（図５Ｅ）、ｐ４０が実際に、膜におけるＩＬ−１２Ｒβ１の捕捉に関与していることを示唆している。膜分画の純度を確認するため、全カドヘリンについて分析した（図５Ｆ；上方パネル）。β−アクチンのレベルはｐ４０ｍＡｂ処置細胞でより高く、ｐ４０の欠乏がＴＲＡＭＰ細胞中のエンドサイト小胞の形成を誘導する可能性を示唆している。（図５Ｆ；下部パネル）。しかしながら、この場合も、全ＩＬ−１２Ｒβ１レベルについて、(ｐ４０＋ｐ４０ｍＡｂ)処置細胞とｐ４０処置細胞の間に差異はなく、ｐ４０ｍＡｂ処置は、ＴＲＡＭＰ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ１の発現を下方制御するわけではないことが示唆された。これらの結果はともに、ＴＲＡＭＰ細胞が放出する過剰なｐ４０が、ＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションあるいはエンドサイトーシスを抑制することによって、ＩＬ−１２シグナル伝達を阻害することを示唆している。

【0035】

次に我々は、ｐ４０の中和がＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションを誘導するメカニズムを調査した。受容体のインターナリゼーションは、クラスリン依存とカベオリン依存の主として二つのメカニズムを通じて起こる。クラスリンあるいはカベオリンの関与を調べるため、我々は、二つの薬理学的な阻害剤であるフィリピンとクロルプロマジン（ＣＰＭ）を用いた。興味深いことに、ＣＰＭではなく、フィリピンでの前処置は、ｐ４０ｍＡｂ処置ＴＲＡＭＰ細胞中のＩＬ−１２Ｒβ１の、膜におけるインターナリゼーションを著しく阻害し（図５Ｈ及び５Ｉ）、ｐ４０が媒介するＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションが、カベオリンに敏感でクラスリンに非依存性の経路によって起こることを示唆している。免疫蛍光法はさらに、ＴＲＡＭＰ細胞中のｐ４０ｍＡｂが媒介するＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションがカベオリン依存であること（図５Ｊ−Ｌ）を、ｐ４０ｍＡｂでｐ４０を中和すると、フィリピンで前処理されたＴＲＡＭＰ細胞がＩＬ−１２Ｒβ１を取り込むことができないことから確認した（図５Ｌ）。

【0036】

【表1】

【表2】

【0037】

実施例７−ヒト患者におけるｐ４０、ｐ４０₂及びＩＬ−２レベル
表３はＥＬＩＳＡを用いて１１人の前立腺がん患者と１１人のコントロール対象について測定した、ｐ４０、ｐ４０₂及びＩＬ−１２の血清レベルを示している。Hybridoma 27: 141 -151 , 2008; J. Immunol. 182: 5013-5023, 2009記載のサンドイッチ法ＥＬＩＳＡによって、前立腺がん患者と健康なコントロールの血清中のｐ４０及びｐ４０₂濃度について測定した。簡単に述べると、ｐ４０を定量するため、我々はｍＡｂ ａ３−３ａをコーティングのため、ｍＡｂ ａ３−７ｇを検出のために用いた。同様に、ｐ４０₂を測定するため、ｍＡｂ ａ３−１ｄとｍＡｂ ｄ７−１２ｃをそれぞれコーティングと検出のために用いた。血清中のＩＬ−１２レベルはＩＬ−１２ＥＬＩＳＡキット（eBiosicence社、カリフォルニア州サンディエゴ、９２１２１）を用いて測定された。

【0038】

表３に報告されたそれぞれのレベルは３つの測定の平均値である。ｐ４０モノマーの血清レベルはコントロール対象よりも前立腺がん患者でより高かった。この結果は、ｐ４０の過剰が前立腺がんの発病に一役買っており、がん患者をｐ４０モノマーに対するモノクロナール抗体で処置すると前立腺がんの進行を阻害／停止する可能性があることを示唆している。

【表3】

【0039】

（参考文献）

【0040】

本発明はその特定の実施態様を参照して説明及び例証されているが、該発明がそれら実施態様に限られることを意図するものではない。以下特許請求の範囲に規定されている本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、変形や修正を施すことは可能であることを当業者であれば認識するであろう。したがって、添付された請求の範囲の範囲内及びそれと同等なすべてのそのような変形及び修正は、発明に含まれることを意図している。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕がんの治療を必要とする対象に対して、治療効果のある量のｐ４０モノマーに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片を含む組成物を投与することを含む、がんを治療する方法。
〔２〕前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ＩＬ−１２シグナル伝達の阻害を抑制する、前記〔１〕記載の方法。
〔３〕前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ＩＦＮ−γの産生を上方制御する、前記〔１〕記載の方法。
〔４〕前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、モノクロナール抗体またはその免疫学的に活性な断片である、前記〔１〕記載の方法。
〔５〕前記ｐ４０モノマーに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ポリクロナール、モノクロナール、ヒト、ヒト化及びキメラ抗体；単鎖抗体；及びエピトープ結合抗体の断片からなる群より選ばれる、前記〔１〕記載の方法。
〔６〕前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ｐ４０ホモ二量体の活動を著しく中和しない、前記〔１〕記載の方法。
〔７〕前記がんが、前立腺がん、乳がん及び肝臓がんからなる群より選ばれる、前記〔１〕記載の方法。
〔８〕前記がんが、ｐ４０モノマーの過剰産生を特徴とするがんである、前記〔１〕記載の方法。
〔９〕前記組成物が、さらに少なくとも１の薬学的に許容される担体を含む、前記〔１〕記載の方法。
〔１０〕前記対象がヒト対象である、前記〔１〕記載の方法。
〔１１〕前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、少なくともカベオリン媒介経路を通じたＩＬ−１２Ｒβ１のインターナリゼーションを減少させる、前記〔１〕記載の方法。
〔１２〕前記抗体またはその免疫学的に活性な断片が、ヒト化抗体またはその免疫学的に活性な断片である、前記〔１〕記載の方法。
〔１３〕前記組成物が経口投与される、前記〔１〕記載の方法。
〔１４〕前記組成物が、皮下、関節内、皮内、静脈内、腹腔内及び筋肉内経路からなる群より選ばれる経路によって投与される、前記〔１〕記載の方法。
〔１５〕細胞に、ｐ４０モノマーに対する抗体またはその免疫学的に活性な断片を、細胞死を誘導するために十分な量、接触させることを含む、細胞死を誘導する方法。
〔１６〕前記細胞ががん細胞である、前記〔１５〕記載の方法。
〔１７〕前記がん細胞が、ｐ４０モノマーの過剰産生を示す、前記〔１６〕記載の方法。
〔１８〕前記がん細胞が、前立腺がん細胞、乳がん細胞、及び肝臓がん細胞からなる群より選ばれる、前記〔１６〕記載の方法。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図1I】

【図1J】

【図1K】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図2J】

【図2K】

【図2L】

【図2M】

【図2N】

【図2O】

【図2P】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図4E】

【図4F】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図5G】

【図5H】

【図5I】

【図5J】

【図5K】

【図5L】

【図5M】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図10E】

【図10F】

【図10G】

【図10H】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【図14】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]