特許 6871969 突然変異クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に関する組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6871969

(24)【登録日】2021年4月20日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】突然変異クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に関する組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/00 20060101AFI20210510BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20210510BHJP

   C07K 14/33 20060101ALI20210510BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20210510BHJP

   C12R 1/145 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12N1/00 FZNA

   C12N1/00 A

   C12N1/21

   C12N1/20 A

   C07K14/33

   C12P21/02 A

   C12P21/02 C

   !C12N15/31

   C12R1:145

【請求項の数】5

【全頁数】174

(21)【出願番号】特願2019-90728(P2019-90728)

(22)【出願日】2019年5月13日

(62)【分割の表示】特願2013-216224(P2013-216224)の分割

【原出願日】2013年10月17日

(65)【公開番号】特開2019-150045(P2019-150045A)

(43)【公開日】2019年9月12日

【審査請求日】2019年6月10日

(31)【優先権主張番号】61/716,605

(32)【優先日】2012年10月21日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】593141953

【氏名又は名称】ファイザー・インク

(74)【代理人】

【識別番号】100133927

【弁理士】

【氏名又は名称】四本 能尚

(74)【代理人】

【識別番号】100137040

【弁理士】

【氏名又は名称】宮澤 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100147186

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 眞紀

(74)【代理人】

【識別番号】100174447

【弁理士】

【氏名又は名称】龍田 美幸

(74)【代理人】

【識別番号】100185960

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 理愛

(72)【発明者】

【氏名】キャサリン ウテ ジャンセン

(72)【発明者】

【氏名】アンナリーサ シビル アンダーソン

(72)【発明者】

【氏名】ロバート ジー．ケイ． ドナルド

(72)【発明者】

【氏名】マイケル ジェームズ フリント

(72)【発明者】

【氏名】ナレンダー クマール カリアン

(72)【発明者】

【氏名】ジェイソン アーノルド ロトヴィン

(72)【発明者】

【氏名】マニンンダー ケイ． シドゥー

(72)【発明者】

【氏名】ジャスティン キース モラン

(72)【発明者】

【氏名】マーク エドワード ラッペン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイキアング サン

【審査官】 太田 雄三

(56)【参考文献】

【文献】 特開昭６０−２０７０６０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2009), 106, [32], p.13225-13229

【文献】 J. Clin. Immunol., (1998), 36, [1], p.184-190

【文献】 J. Microbiol. Methods, (2010), 80, [1], p.49-55

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｐ ２１／０２０

Ｃ１２Ｎ １／００

Ｃ０７Ｋ １４／００

Ｃ１２Ｎ １５／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＷＰＩＤＳ／ＷＰＩＸ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を培養するための、ダイズ加水分解物、酵母抽出物、およびグルコースを含む培養培地であって、組換えクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１３５１（ＡＴＣＣ４３５９３（商標））を含み、細菌が毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠いており、細菌が配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む、培養培地。

【請求項2】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を培養するための、ダイズ加水分解物、酵母抽出物、およびグルコースを含む培養培地であって、組換えクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）３２３２（ＡＴＣＣ
ＢＡＡ−１８０１（商標））を含み、細菌が毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠いており、細菌が配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む、培養培地。

【請求項3】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を培養するための、ダイズ加水分解物、酵母抽出物、およびグルコースを含む培養培地であって、組換えクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７３２２（ＡＴＣＣ
４３６０１（商標））を含み、細菌が毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠いており、細菌が配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む、培養培地。

【請求項4】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を培養するための、ダイズ加水分解物、酵母抽出物、およびグルコースを含む培養培地であって、組換えクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）５０３６（ＡＴＣＣ
４３６０３（商標））を含み、細菌が毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠いており、細菌が配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む、培養培地。

【請求項5】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を培養するための、ダイズ加水分解物、酵母抽出物、およびグルコースを含む培養培地であって、組換えクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）４８１１（ＡＴＣＣ
４３６０２（商標））を含み、細菌が毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠いており、細菌が配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む、培養培地。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により組み込まれている２０１２年１０月２１日出願の米国仮特許出願第６１／７１６，６０５号の利益を主張するものである。

【0002】

本発明は、突然変異クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に関する組成物および方法を対象とする。

【背景技術】

【0003】

クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ））とは、ヒトにおける胃腸管系の疾患に関連しているグラム陽性の嫌気性細菌である。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のコロニー形成は、通常は、抗生物質を用いた処置によって天然の腸管内菌叢が消失した場合に結腸内で起こる。感染は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の主な病原性因子であるグルコシル化毒素、毒素Ａおよび毒素Ｂ（それぞれ３０８および２７０ｋＤａ）の分泌を介して、抗生物質関連の下痢および場合によっては偽膜性大腸炎をもたらす場合がある。

【0004】

毒素Ａおよび毒素Ｂは、それぞれ遺伝子ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢによって１９ｋｂの病原性座位（ＰａＬｏｃ）内にコードされている。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の非病原性株は、この座位が別の１１５個の塩基対の配列によって置き換えられている。

【0005】

毒素Ａおよび毒素Ｂはどちらも強力な細胞毒素である。これらのタンパク質は、Ｒｈｏ／Ｒａｃ／Ｒａｓファミリーの低分子量ＧＴＰａｓｅを失活させる相同的グルコシルトランスフェラーゼである。その結果生じるシグナル伝達の破壊は細胞間結合の損失、アクチン細胞骨格の調節不全、および／またはアポトーシスを引き起こし、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症（ＣＤＩ）に関連している重度の分泌性下痢をもたらす。

【0006】

この１０年間の間で、病院、養護施設、および他の長期介護施設におけるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）集団発生の数および重症度は劇的に増加している。この増大の主な要因には、超毒性の病原性株の出現、抗生物質の使用の増加、検出方法の改善、および医療施設における空中胞子への曝露の増加が含まれる。

【0007】

メトロニダゾールおよびバンコマイシンがシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患（ＣＤＡＤ）の抗生物質処置の現在受け入れられている標準治療を代表する。しかし、そのような処置を受けている患者の約２０％がＣＤＩの最初の発症後に感染症の再発を経験し、それらの患者のうちの約５０％までがさらなる再発を患う。再発の処置は非常に大きな課題を表し、再発の大多数は、通常、先行する発症の一カ月以内に起こる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】２０１２年１０月２１日出願の米国仮特許出願第６１／７１６，６０５号

【特許文献2】米国特許出願公開第２０１００１３７６２号、段落［０２０１］〜［０２３０］

【特許文献3】Ｍｉｎｔｏｎら、ＷＯ２００７／１４８０９１号、題名「ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、ページ３３〜６６

【特許文献4】米国公開ＵＳ ２０１１０１２４１０９ Ａ１号、段落［００１３７］〜［０２２７］

【特許文献5】米国特許第５，５８５，０８９号（たとえば１２〜１６段）

【特許文献6】ＧＢ２２２０２１１号

【特許文献7】ＷＯ１９９８／０４０１００号

【特許文献8】ＷＯ２０１０／０６７２６２号

【特許文献9】ＷＯ００／０６２８００号

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｋｕｅｈｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０ Ｏｃｔ ７；４６７（７３１６）：７１１〜３

【非特許文献2】Ｂｕｓｃｈら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８ Ｊｕｌ ３１；２７３（３１）：１９５６６〜７２

【非特許文献3】Ｄｏｅｒｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２ Ａｕｇ；３０（８）：２０４２〜６

【非特許文献4】Ｈｅａｐら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０ Ｊａｎ；８０（１）：４９〜５５

【非特許文献5】Ｈｅａｐら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７ Ｓｅｐｔ；７０（３）：４５２〜４６４

【非特許文献6】Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００９ Ｄｅｃ；１９１（２３）：７２９６〜３０５

【非特許文献7】Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ出版第９１−３２４２、１９９１

【非特許文献8】Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７、１９８７

【非特許文献9】Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６、１９８９

【非特許文献10】Ｂｉｒｄら、（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６

【非特許文献11】Ｈｕｓｔｏｎら、（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３

【非特許文献12】ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７

【非特許文献13】Ｂｒａｕｎら、Ｇｅｎｅ．１９９６ Ｎｏｖ２８；１８１（１〜２）：２９〜３８

【非特許文献14】Ｈｅａｐら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｊｕｌ；７８（１）：７９〜８５

【非特許文献15】Ｌｏｗｙら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊａｎ２１；３６２（３）：１９７〜２０５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

したがって、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）に向けられた免疫原性および／または治療的組成物ならびにその方法の必要性が存在する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

これらおよび他の目的を、本発明によって本明細書中に提供する。

【0012】

一態様では、本発明は、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａに関する。突然変異毒素Ａには、野生型毒素Ａと比較して残基位置２８５、２８７、７００、９７２、および９７８に突然変異が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素Ａには配列番号１８３が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素Ａは対応する野生型毒素Ａよりも細胞毒性が低い。一実施形態では、突然変異毒素Ａには、少なくとも１つの化学修飾されたアミノ酸残基が含まれる。一態様では、本発明は、配列番号１８３が含まれる単離ポリペプチドに関する。

【0013】

別の態様では、本発明は、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂに関する。突然変異毒素Ｂには、野生型毒素Ｂと比較して残基２８６、２８８、６９８、９７０、および９７６に突然変異が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素Ｂには配列番号１８４が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素Ｂは対応する野生型毒素Ｂよりも細胞毒性が低い。一実施形態では、突然変異毒素Ｂには、少なくとも１つの化学修飾されたアミノ酸残基が含まれる。一態様では、本発明は、配列番号１８４が含まれる単離ポリペプチドに関する。

【0014】

本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の培養およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の産生において使用するための組成物および方法にさらに関する。一態様では、本発明は、植物加水分解物およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる培養培地に関する。好ましい実施形態では、加水分解物はダイズ加水分解物である。より好ましくは、ダイズ加水分解物はダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫである。

【0015】

別の態様では、本発明は、窒素源およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる培養培地に関する。一実施形態では、窒素源は酵母抽出物である。好ましくは、酵母抽出物はＨＹ ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。

【0016】

さらなる一態様では、本発明は、植物加水分解物、酵母抽出物、およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる培養培地に関する。一実施形態では、培地は炭素源を含有しない。

【0017】

好ましい実施形態では、培地には炭素源がさらに含まれる。本発明者らは、少なくとも１つの炭素源が含まれる培養培地中でのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の発酵は、炭素源を用いない発酵と比較して高いＯＤ_６００値および高い毒素産生収率をもたらしたことを発見した。一実施形態では、炭素源はグルコース、マンニトール、フルクトース、および／またはマンノースである。

【0018】

一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞は遺伝子改変されていない。別の実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞は組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞である。一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞は、毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠く。別の実施形態では、細胞には構成的プロモーターが含まれる。好ましい実施形態では、プロモーターはクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシン（ｆｄｘ）プロモーターである。さらなる実施形態では、細胞にはネイティブの調節性の染色体プロモーターが含まれない。

【0019】

別の態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を培養する方法に関する。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を培地中で培養することが含まれる。一実施形態では、培地にはダイズ加水分解物および／または酵母抽出物が含まれる。好ましい実施形態では、培地には炭素源がさらに含まれる。好ましくは、炭素源はグルコースである。

【0020】

一実施形態では、培養ステップを嫌気性条件下で実施する。

【0021】

一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を種培養として成長させる。一実施形態では、種培養は、培地中で成長させた保存培養からの接種によって開始する。

【0022】

一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を発酵培養として成長させる。一実施形態では、発酵培養は培地中で成長させた種培養から接種した。代替の一態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を培養する方法に関する。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞をモノクローナル抗体培地中で培養することが含まれる。

【0023】

一態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を産生させる方法に関する。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を培地中で培養することが含まれる。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を前記培地から単離することがさらに含まれる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A-H】ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント、初期設定パラメータを使用した、株６３０、ＶＰＩ１０４６３、Ｒ２０２９１、ＣＤ１９６からの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ、および配列番号４を有する突然変異毒素Ａの配列アラインメントを示す図である。

【図2A-F】ＣＬＵＳＴＡＬＷアラインメント、初期設定パラメータを使用した、株６３０、ＶＰＩ１０４６３、Ｒ２０２９１、ＣＤ１９６からの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ、および配列番号６を有する突然変異毒素Ｂの配列アラインメントを示す図である。

【図3】野生型毒素陰性のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の同定を示すグラフである。１３個のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の培養培地をＥＬＩＳＡによって毒素Ａについて試験した。例示したように、７個の株が毒素Ａを発現し、６個の株が発現しなかった（株１３５１、３２３２、７３２２、５０３６、４８１１およびＶＰＩ１１１８６）。

【図4A-B】ＵＤＰ−^１４Ｃ−グルコースを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏグルコシル化アッセイにおいて、三重突然変異体Ａ（配列番号４）、二重突然変異体Ｂ（配列番号５）、および三重突然変異体Ｂ（配列番号６）はＲａｃ１またはＲｈｏＡ ＧＴＰａｓｅをグルコシル化しない一方で、１０μｇ〜１ｎｇの野生型毒素ＢはＲａｃ１をグルコシル化することを例示するＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。

【図5】野生型毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号１および２）の切断断片の観察と比較した、突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）におけるシステインプロテアーゼ活性の抑止を示すウエスタンブロットである。実施例１３を参照されたい。

【図6】三重突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）が、ＩＭＲ−９０細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイによって高濃度（たとえば約１００μｇ／ｍｌ）で試験した場合に残留細胞毒性を示すことを示すグラフである。

【図7】三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）および七重突然変異毒素Ｂ（配列番号８）でＥＣ_５０値が類似していることを示すグラフである。

【図8】ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）を漸増濃度の三重突然変異体ＴｃｄＡ（配列番号４）（上部パネル）および三重突然変異体ＴｃｄＢ（配列番号６）（下部パネル）に対してプロットした、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験の結果を表すグラフである。突然変異毒素ＡおよびＢの残留細胞毒性は、突然変異毒素Ａ（上部パネル−ｐＡｂ ＡおよびｍＡｂ Ａ３−２５＋Ａ６０−２２）ならびに突然変異毒素Ｂ（下部パネル−ｐＡｂ Ｂ）に特異的な中和抗体を用いた完全に抑止することができる。

【図9】処理の７２時間後のＩＭＲ−９０細胞形態の画像を示す図である。パネルＡは偽処理した対照細胞を示す。パネルＢは、ホルマリンで失活させた突然変異体ＴｃｄＢ（配列番号６）を用いた処理後の細胞形態を示す。パネルＣは、ＥＤＣで失活させた突然変異体ＴｃｄＢ（配列番号６）を用いた処理後の細胞形態を示す。パネルＤは、野生型毒素Ｂ（配列番号２）を用いた処理後の細胞形態を示す。パネルＥは、三重突然変異体ＴｃｄＢ（配列番号６）を用いた処理後の細胞形態を示す。ＴｃｄＡの処理で同様の結果が観察された。

【図10】実施例２５に記載する、中和抗体の力価を示すグラフである（研究ｍｕＣｄｉｆｆ２０１０−０６）。

【図11A-B】実施例２６に記載する、中和抗体の力価を示すグラフである（研究ｍｕＣｄｉｆｆ２０１０−０７）。

【図12】実施例２７に記載する、４回の免疫化後のハムスターにおける毒素ＡおよびＢに対する中和抗体応答を示すグラフである（研究 ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２）

【図13A-B】実施例２７に記載する、化学的に失活させた遺伝的突然変異毒素およびＬｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌトキソイドを用いたワクチン接種後のハムスターにおける中和抗体応答を示すグラフである（研究 ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２）。

【図14】実施例２８に記載する、免疫化していない対照と比較した、３つの免疫化したハムスター群の生存曲線を示す図である（研究 ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２、継続中）。

【図15】実施例２９に記載する、ハムスターにおけるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素の様々な配合に対する相対的中和抗体応答を示すグラフである（研究 ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０３）。

【図16A-B】実施例３０に記載する、カニクイザルマカク（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）における化学的に失活させた遺伝的突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）に対する強力な相対的中和抗体応答を示すグラフである。

【図17】Ａ３−２５ ｍＡｂ ＩｇＥの軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＨＬ）の可変領域のアミノ酸配列を示す図である。シグナルペプチドをハイライトで示し、ＣＤＲを斜体および下線で示し、定常領域を太字および下線で示した（完全な配列は示さず）。

【図18】ＡＴＰレベル（相対光量−ＲＬＵによって定量）を細胞生存度の指標として使用した、毒素中和アッセイにおける個々の毒素Ａモノクローナル抗体の滴定を示すグラフである。毒素（４×ＥＣ_５０）対照と比較して、ｍＡｂ Ａ８０−２９、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２およびＡ３−２５は、濃度に伴って毒素Ａに対して増加した中和効果を有していたが、陽性ウサギ抗毒素Ａ対照のレベルと比較しては増加していなかった。ｍＡｂ Ａ５０−１０、Ａ５６−３３、およびＡ５８−４６は毒素Ａを中和しなかった。細胞のみの対照は１〜１．５×１０^６ＲＬＵであった。

【図19】ＢｉａＣｏｒｅによる毒素Ｂ ｍＡｂの８個のエピトープ群のマッピングを示す図である。

【図20A-C】毒素Ａ ｍＡｂの組合せの相乗的な中和活性：様々な希釈率の中和抗体Ａ６０−２２、Ａ６５−３３、およびＡ８０−２９を漸増濃度のＡ３−２５ ｍＡｂに加えることで、希釈率にかかわらず毒素Ａの中和が相乗的に増加した。図２０Ｂおよび図２０Ｃに示すグラフに示すように、毒素Ａのみ（４×ＥＣ_５０）の対照のＲＬＵを例示し（＜０．３×１０^６）、細胞のみの対照は２〜２．５×１０^６ＲＬＵであった。

【図21】毒素Ｂ ｍＡｂの相乗的な中和活性：ｍＡｂ Ｂ８−２６、Ｂ６０−２およびＢ５９−３による毒素Ｂの中和を図２１Ａに例示する。Ｂ８−２６をＢ５９−３の希釈液と組み合わせた後に、毒素Ｂの中和は相乗的に増加する（図２１Ｂ）

【図22】Ｒａｃ１ ＧＴＰａｓｅの発現が２４〜９６時間からの遺伝的突然変異毒素Ｂ（配列番号６）の抽出物では低下しているが、野生型毒素Ｂ（配列番号２）で処理した抽出物では低下していないことを示すウエスタンブロットである。また、このブロットは、Ｒａｃ１が毒素Ｂで処理した抽出物中ではグルコシル化されているが、遺伝的突然変異毒素Ｂで処理した抽出物中ではされていないことも示す。

【図23A-K】ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）を、漸増濃度のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養培地とハムスター血清プール（■）、それぞれの株からの粗毒素（培養収集物）とハムスター血清プール（●）、精製毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手した市販の毒素）とハムスター血清プール（▲）、粗毒素（▼）対照、および精製毒素（◆）対照に対してプロットした、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験の結果を表すグラフである。それぞれの株からの毒素は４×ＥＣ_５０値で細胞に加えた。図２３は、たとえば本明細書中に記載の実施例２９、表１５による突然変異毒素をＥＤＣで失活させた突然変異体ＴｃｄＡ（配列番号４）および突然変異体ＴｃｄＢ（配列番号６）が含まれる免疫原性組成物が、それぞれの毒素のみの対照と比較して、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の少なくとも以下の１６個の異なるＣＤＣ株からの毒素に対する中和活性を示す中和抗体を誘導したことを示す：２００７８８６（図２３Ａ）、２００６０１７（図２３Ｂ）、２００７０７０（図２３Ｃ）、２００７３０２（図２３Ｄ）、２００７８３８（図２３Ｅ）、２００７８８６（図２３Ｆ）、２００９２９２（図２３Ｇ）、２００４０１３（図２３Ｈ）、２００９１４１（図２３Ｉ）、２００５０２２（図２３Ｊ）、２００６３７６（図２３Ｋ）。

【図24】少なくとも３種類の可能な修飾、すなわち、架橋結合、グリシン付加物、およびベータアラニン付加物をもたらす、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の例示的なＥＤＣ／ＮＨＳ失活の図解である。パネルＡは架橋結合を例示する。三重突然変異毒素のカルボン酸残基がＥＤＣおよびＮＨＳの付加によって活性化される。活性化エステルは第一級アミンと反応して安定なアミド結合を形成し、分子内および分子間の架橋結合をもたらす。パネルＢは、グリシン付加物の形成を例示する。失活後、残留活性化エステルはグリシンの付加によって反応停止されて、安定なアミド結合を形成する。パネルＣはベータアラニン付加物の形成を例示する。３モルのＮＨＳが１モルのＥＤＣと反応して、活性化ベータアラニンを形成することができる。その後、これが第一級アミンと反応して安定なアミド結合を形成する。

【図25】以下の修飾の種類、すなわち、（Ａ）架橋結合、（Ｂ）グリシン付加物、および（Ｃ）ベータアラニン付加物のうちの少なくとも１つをもたらす、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の例示的なＥＤＣ／ＮＨＳ失活の図解である。

【図26】ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）（７２時間ＡＴＰ）を、漸増濃度のＬｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入した野生型ＴｃｄＢ（□）、三重突然変異体ＴｃｄＢ（配列番号８６）（●）、および五重突然変異体ＴｃｄＢ（配列番号１８４）（■）に対してプロットした、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイからの結果を表すグラフである。ＩＭＲ−９０細胞（＊）を対照として使用した。

【図27】ＩＭＲ−９０細胞における、五重突然変異毒素Ｂ（配列番号１８４）による三重突然変異毒素Ｂ（配列番号８６）媒介性細胞毒性の競合的阻害を示すグラフである（７２時間ＡＴＰアッセイ）。−●−は五重突然変異毒素Ｂ（配列番号１８４）（「ＰＭ−Ｂ」）を表し、−▲−は２００ｎｇ／ｍＬの三重突然変異体（ＴＭ）を表す。

【図28】灌流発酵（ＣＤＦ−５１２６）後の最終ＯＤおよび三重突然変異毒素Ｂの力価（ｍｇ／ｌ）を示すグラフである。−●−はＯＤ_{６００ｎｍ}を表し、−▲−は灌流速（発酵槽体積／２．０時間）を表し、−■−はグルコース（ｇ／Ｌ）を表し、−●−はトキソイドＢ（三重突然変異体、配列番号８６）を表す。

【図29】別の灌流培養（ＣＤＦ−５１２７）からの最終ＯＤおよび三重突然変異毒素Ｂの力価（ｍｇ／ｌ）の結果を示すグラフである。−●−はＯＤ_{６００ｎｍ}を表し、−▲−は灌流速（発酵槽体積／２．０時間）を表し、−■−はグルコース（ｇ／Ｌ）を表し、−●−はトキソイドＢ（三重突然変異体、配列番号８６）を表す。

【発明を実施するための形態】

【0025】

配列の簡単な説明
配列番号１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素Ａ（ＴｃｄＡ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）のアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、配列番号１と比較して位置２８５および２８７に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、配列番号１と比較して位置２８５、２８７、および７００に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、配列番号２と比較して位置２８６および２８８に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、配列番号２と比較して位置２８６、２８８、および６９８に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、配列番号１と比較して位置２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、および７００に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、配列番号２と比較して位置２７０、２７３、２８６、２８８、４６１、４６３、および６９８に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素Ａ（ＴｃｄＡ）をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号１０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号１１は、配列番号３をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号１２は、配列番号４をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号１３は、配列番号５をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号１４は、配列番号６をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号１５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｒ２０２９１ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６は、配列番号１５をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号１７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＣＤ１９６ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８は、配列番号１７をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号１９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３ ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号２０は、配列番号１９をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号２１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｒ２０２９１ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２は、配列番号２１をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号２３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＣＤ１９６ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４は、配列番号２３をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号２５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３ ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６は、配列番号２５をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号２７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３の病原性座位のＤＮＡ配列を示す。
配列番号２８は、配列番号１の残基１０１〜２９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、配列番号１の残基１〜５４２のアミノ酸配列を示す。
配列番号３０は、配列番号２の残基１０１〜２９３のアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、配列番号２の残基１〜５４３のアミノ酸配列を示す。
配列番号３２は、配列番号１の残基５４３〜８０９のアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、配列番号２の残基５４４〜７６７のアミノ酸配列を示す。
配列番号３４は、残基１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、６５５、および７００が任意のアミノ酸であり得る、突然変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、１０２、２７０、２７３、２８６、２８８、３８４、４６１、４６３、５２０、５４３、５４４、５８７、６００、６５３、６９８、および７５１が任意のアミノ酸であり得る、突然変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号３６は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号３７は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号３８は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３９は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号４０は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号４１は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号４２は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号４３は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの中和抗体（Ａ３−２５ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号４４は、配列番号３をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号４５は、配列番号４をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号４６は、配列番号５をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号４７は、配列番号６をコードしているＤＮＡ配列を示す。
配列番号４８は、免疫賦活オリゴヌクレオチドＯＤＮ ＣｐＧ２４５５５のヌクレオチド配列を示す。
配列番号４９は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号５０は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５１は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５２は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号５３は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号５４は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号５５は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号５６は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号５７は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５８は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号５９は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号６０は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号６１は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号６２は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号６３は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号６４は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号６５は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号６６は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号６７は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号６８は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号６９は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号７０は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号７１は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号７２は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７３は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号７４は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号７５は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号７６は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖の定常領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号７７は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を示す。
配列番号７８は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のシグナルペプチドのアミノ酸配列を示す。
配列番号７９は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ１のアミノ酸配列を示す。
配列番号８０は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ２のアミノ酸配列を示す。
配列番号８１は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のＣＤＲ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号８２は、位置１０２、２７０、２７３、２８６、２８８、３８４、４６１、４６３、５２０、５４３、５４４、５８７、６００、６５３、６９８、および７５１の残基が任意のアミノ酸であり得る、突然変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号８３は、位置１のメチオニンが存在しない、配列番号１と比較して位置２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、および７００に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号８４は、位置１のメチオニンが存在しない、配列番号１と比較して位置２８５、２８７、および７００に突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号８５は、位置１のメチオニンが存在しない、配列番号２と比較して位置２７０、２７３、２８６、２８８、４６１、４６３、および６９８に突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号８６は、位置１のメチオニンが存在しない、配列番号２と比較して位置２８６、２８８、および６９８に突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号８７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４０１３ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号８８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４１１１ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号８９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４１１８ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４２０５ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４２０６ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５０２２ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５０８８ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５２８３ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５３２５ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５３５９ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００６０１７ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７０７０ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号９９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７２１７ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１００は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７３０２ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８１６ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８３８ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８５８ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８８６ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００８２２２ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９０７８ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９０８７ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９１４１ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９２９２ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４０１３ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４１１１ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４１１８ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４２０５ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００４２０６ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５０２２ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５０８８ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５２８３ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５３２５ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００５３５９ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００６０１７ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００６３７６ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７０７０ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７２１７ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７３０２ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８１６ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８３８ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８５８ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００７８８６ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００８２２２ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９０７８ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９０８７ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９１４１ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２００９２９２ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１４ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１５ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２０ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２３ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２７ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２９ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０４６ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１４ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１５ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２０ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２３ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２７ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０２９ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０４６ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００１ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００２ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００３ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００４ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７０ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７５ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７７ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０８１ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１１７ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１３１ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００１ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００２ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００３ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）００４ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７０ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７５ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７７ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０８１ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１１７ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１３１ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０５３ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１６９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７８ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０８７ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０９５ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１２６ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７３は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０５３ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７４は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０７８ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７５は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０８７ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７６は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０９５ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７７は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１２６ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７８は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０５９ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１７９は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０５９ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８０は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１０６ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８１は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１０６ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８２は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）０１７ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８３は、配列番号１と比較して位置２８５、２８７、７００、９７２、および９７８に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＡのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８４は、配列番号２と比較して位置２８６、２８８、６９８、９７０、および９７６に突然変異を有する突然変異体ＴｃｄＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号１８５から配列番号１９５はそれぞれ、例示的な突然変異毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９６から配列番号２１２はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１３から配列番号２２２はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号２２３から配列番号２３６はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２３７から配列番号２４３はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４４から配列番号２４５はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２４６から配列番号２４９はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５０から配列番号２５３はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５４は、例示的な突然変異毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号２５５から配列番号２６３はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号２６４から配列番号２６９はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号２７０から配列番号２７５はそれぞれ、例示的な突然変異毒素のアミノ酸配列を示す。
配列番号２７６から配列番号３２３はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号３２４から配列番号３７３はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号３７４から配列番号４２１はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号４２２から配列番号４７１はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号４７２から配列番号５１９はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号５６８から配列番号６１５はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号５２０から配列番号５６７はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号６１６から配列番号６６３はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。
配列番号６６４から配列番号７１１はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ａのアミノ酸配列を示す。
配列番号７１２から配列番号７６１はそれぞれ、例示的な突然変異毒素Ｂのアミノ酸配列を示す。

【0026】

本発明者らは、驚くべきことに、とりわけ、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂ、ならびにその方法を発見した。突然変異体は、部分的に、免疫原性であること、およびそれぞれの毒素の野生型と比較して低下した細胞毒性を示すことによって特徴づけられている。また、本発明は、その免疫原性部分、その生物学的均等物、および前述のいずれかをコードしている核酸配列が含まれる単離ポリヌクレオチドにも関する。

【0027】

本明細書中に記載の免疫原性組成物は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対する新規中和抗体を誘発する能力を予想外に実証し、これらはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）免疫誘発に対する能動的および／または受動的保護を与える能力を有し得る。新規抗体は毒素Ａおよび毒素Ｂの様々なエピトープに向けられている。本発明者らは、中和モノクローナル抗体のうちの少なくとも２つの組合せが、毒素Ａおよび毒素Ｂのそれぞれのｉｎ ｖｉｔｒｏ中和において予想外に相乗的な効果を示すことができることをさらに発見した。

【0028】

本明細書中に記載の本発明の組成物は、哺乳動物において、組成物を投与しなかった哺乳動物と比較してシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患（ＣＤＡＤ）、その症候群、状態、症状、および／または合併症を処置する、予防する、その危険性を減少させる、その発生率を減少させる、その重症度を減少させる、および／またはその始まりを遅延させるために使用し得る。

【0029】

さらに、本発明者らは、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂを安定して発現することができる組換え無芽胞シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞、ならびにそれを産生させる新規方法を発見した。

【0030】

免疫原性組成物
一態様では、本発明は、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素が含まれる免疫原性組成物に関する。突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素には、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較してグルコシルトランスフェラーゼドメイン中に少なくとも１つの突然変異およびシステインプロテアーゼドメイン中に少なくとも１つの突然変異を有するアミノ酸配列が含まれる。

【0031】

本明細書中で使用する用語「野生型」とは、自然で見つかる形態をいう。たとえば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列とは、天然源から単離することができ、人間の操作によって意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。また、本発明は、前述のいずれかをコードしている核酸配列が含まれる単離ポリヌクレオチドにも関する。さらに、本発明は、組成物を投与しない哺乳動物と比較して、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を処置する、予防する、その危険性を減少させる、その重症度を減少させる、その発生率を減少させる、および／またはその始まりを遅延させるための、前述の組成物のいずれかの使用、ならびに前記組成物を調製する方法に関する。

【0032】

本明細書中で使用する「免疫原性組成物」または「免疫原」とは、組成物を投与する哺乳動物において免疫応答を誘発する組成物をいう。

【0033】

「免疫応答」とは、レシピエント患者中のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に向けられた、有益な液性（抗体媒介性）および／または細胞性（抗原に特異的なＴ細胞もしくはその分泌産物によって媒介される）の応答の発生をいう。免疫応答は液性、細胞性、または両方であり得る。

【0034】

免疫応答は、免疫原性組成物、すなわち免疫原の投与によって誘導された能動的応答であることができる。あるいは、抗体または初回刺激したＴ細胞の投与によって誘導された受動的応答であることができる。

【0035】

液性（抗体媒介性）免疫応答の存在は、たとえば、中和抗体アッセイ、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で知られている細胞に基づくアッセイによって決定することができる。

【0036】

細胞性免疫応答は、典型的には、クラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子と会合したポリペプチドエピトープを提示することで抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞および／またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞を活性化することによって誘発される。また、応答は単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、好塩基球、樹状細胞、星細胞、ミクログリア細胞、好酸球または自然免疫の他の構成要素の活性化も含み得る。細胞媒介性免疫学的応答の存在は、当技術分野で知られている増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞毒性Ｔリンパ球）アッセイによって決定することができる。

【0037】

一実施形態では、免疫原性組成物はワクチン組成物である。本明細書中で使用する「ワクチン組成物」とは、組成物を投与する哺乳動物において免疫応答を誘発する組成物である。ワクチン組成物は、免疫化した哺乳動物を、続く免疫剤または免疫学的交差反応性薬剤による免疫誘発に対して保護し得る。保護は、同じ条件下のワクチン接種していない哺乳動物と比較した症状または感染症の低下に関して完全または部分的であることができる。

【0038】

本明細書中に記載の免疫原性組成物は交差反応性であり、これは、組成物が由来する株とは異なる別のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株によって産生された毒素に対する有効な免疫応答（たとえば液性免疫応答）を誘発することができる特徴を有することをいう。たとえば、本明細書中に記載の免疫原性組成物（たとえばシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０に由来するもの）は、複数のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株によって産生された毒素（たとえばシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｒ２０２９１およびＶＰＩ１０４６３によって産生された毒素）と結合することができる交差反応性抗体を誘発し得る。たとえば実施例３７を参照されたい。交差反応性は細菌性免疫原の交差保護の潜在性の指標であり、その逆もそうである。

【0039】

本明細書中で使用する用語「交差保護」とは、同じ属の異なる細菌株または種による感染症を予防または減弱化する、免疫原性組成物によって誘導された免疫応答の能力をいう。たとえば、本明細書中に記載の免疫原性組成物（たとえばシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０に由来するもの）は、哺乳動物において有効な免疫応答を誘導して、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を減弱化し得るおよび／または６３０以外の株（たとえばシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｒ２０２９１）によって引き起こされたシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患を減弱化し得る。

【0040】

免疫原性組成物または免疫原が免疫応答を誘発する例示的な哺乳動物には、たとえば、マウス、ハムスター、霊長類、およびヒトなどの任意の哺乳動物が含まれる。好ましい実施形態では、免疫原性組成物または免疫原は、組成物を投与するヒトにおいて免疫応答を誘発する。

【0041】

上述のように、毒素Ａ（ＴｃｄＡ）および毒素Ｂ（ＴｃｄＢ）は、Ｒｈｏ／Ｒａｃ／Ｒａｓファミリーの低分子量ＧＴＰａｓｅを失活させる相同的グルコシルトランスフェラーゼである。哺乳動物標的細胞に対するＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの作用は、受容体媒介性エンドサイトーシス、膜転位、自己タンパク質分解プロセス、およびＧＴＰａｓｅのモノグルコシル化の多工程機構に依存する。これらの機能的活性の多くは毒素の一次配列内の別個の領域に帰されており、毒素はイメージングされてこれらの分子の構造が類似していることが示されている。

【0042】

ＴｃｄＡの野生型遺伝子は、約２７１０個のアミノ酸を有する推定分子量約３０８ｋＤａのタンパク質をコードしている約８１３０個のヌクレオチドを有する。本明細書中で使用する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡには、任意の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡが含まれる。野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡには、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって初期設定のギャップ重みづけを使用して最適アラインメントした場合に、配列番号１（完全長）と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡアミノ酸配列が含まれ得る。

【0043】

好ましい実施形態では、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡには配列番号１に記載のアミノ酸配列が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株６３０からのＴｃｄＡの野生型アミノ酸配列を説明している（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００１０８７１３７．１および／またはＣＡＪ６７４９４．１中にも開示）。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株６３０は、ＰＣＲ−リボタイプ０１２株であるとして当技術分野で知られている。配列番号９はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株６３０からのＴｃｄＡの野生型遺伝子を説明しており、これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００９０８９．１中にも開示されている。

【0044】

野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの別の例には配列番号１５に記載のアミノ酸配列が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡの野生型アミノ酸配列を説明している（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００３２１７０８８．１中にも開示）。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株Ｒ２０２９１は、超毒性株であり、ＰＣＲ−リボタイプ０２７株であるとして当技術分野で知られている。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡのアミノ酸配列は、配列番号１と約９８％の同一性を有する。配列番号１６はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡの野生型遺伝子を説明しており、これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１３３１６．１中にも開示されている。

【0045】

野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡのさらなる例には配列番号１７に記載のアミノ酸配列が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＣＤ１９６からのＴｃｄＡの野生型アミノ酸配列を説明している（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＢＡ６１１５６．１中にも開示）。ＣＤ１９６は最近のカナダでの集団発生からの株であり、ＰＣＲ−リボタイプ０２７株であるとして当技術分野で知られている。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＣＤ１９６からのＴｃｄＡのアミノ酸配列は、配列番号１と約９８％の同一性を有し、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＡと約１００％の同一性を有する。配列番号１８はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＣＤ１９６からのＴｃｄＡの野生型遺伝子を説明しており、これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＦＮ５３８９７０．１中にも開示されている。

【0046】

野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡのアミノ酸配列のさらなる例には配列番号１９が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡの野生型アミノ酸配列を説明している（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＡＡ６３５６４．１中にも開示）。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡのアミノ酸配列は、配列番号１と約１００％（９９．８％）の同一性を有する。配列番号２０はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＡの野生型遺伝子を説明しており、これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ９２９８２．１中にも開示されている。

【0047】

野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡのさらなる例には、疾病予防管理センター（ＣＤＣ、ジョージア州、Ａｔｌａｎｔａ）から入手可能な野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＡが含まれる。本発明者らは、ＣＤＣから入手可能な野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＡのアミノ酸配列には、最適アラインメントした場合に配列番号１のアミノ酸残基１〜８２１（シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０からのＴｃｄＡ）と少なくとも約９９．３％〜１００％の同一性が含まれることを発見した。表１を参照されたい。

【0048】

また、本発明者らは、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＡのアミノ酸配列には、最適アラインメントした場合（たとえば完全長の配列を最適アラインメントした場合）に配列番号１と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％から約１００％までの同一性が含まれ得ることも発見した。

【0049】

表１：ＣＤＣから入手した野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、および最適アラインメントした場合に配列番号１のアミノ酸残基１〜８２１に対するそれぞれの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＡのアミノ酸残基１〜８２１のパーセント同一性。

【0050】

【表1】

【0051】

したがって、一実施形態では、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡアミノ酸配列には少なくとも約５００、６００、７００、または８００個の連続的な残基の配列が含まれ、これは、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって初期設定のギャップ重みづけを使用して最適アラインメントした場合に、配列番号１の残基１〜９００の等しい長さの配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％、または最も好ましくは約１００％の同一性を有する。例には上述の株（たとえば、Ｒ２０２９１、ＣＤ１９６など）および表１に記載したものが含まれる。

【0052】

別の実施形態では、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡアミノ酸配列には、最適アラインメントした場合に配列番号８７〜１０９から選択された任意の配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有する配列が含まれる。表１−ａを参照されたい。

【0053】

【表2-1】

【0054】

【表2-2】

【0055】

ＴｃｄＢの野生型遺伝子は、約２３６６個のアミノ酸を有する推定分子量約２７０ｋＤａのタンパク質をコードしている約７０９８個のヌクレオチドを有する。本明細書中で使用する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢには、任意の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢが含まれる。野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢには、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって初期設定のギャップ重みづけを使用して最適アラインメントした場合に、配列番号２と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有する野生型アミノ酸配列が含まれ得る。好ましい実施形態では、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢには配列番号２に記載のアミノ酸配列が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株６３０からのＴｃｄＢの野生型アミノ酸配列を説明している（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００１０８７１３５．１および／またはＣＡＪ６７４９２中にも開示）。配列番号１０はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株６３０からのＴｃｄＢの野生型遺伝子を説明しており、これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００９０８９．１中にも開示されている。

【0056】

野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの別の例には配列番号２１に記載のアミノ酸配列が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＢの野生型アミノ酸配列を説明している（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００３２１７０８６．１および／またはＣＢＥ０２４７９．１中にも開示）。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＢのアミノ酸配列は、配列番号２と約９２％の同一性を有する。配列番号２２はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株Ｒ２０２９１からのＴｃｄＢの野生型遺伝子を説明しており、これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１３３１６．１中にも開示されている。

【0057】

野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢのさらなる例には配列番号２３に記載のアミノ酸配列が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢの野生型アミノ酸配列を説明している（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿００３２１３６３９．１および／またはＣＢＡ６１１５３．１中にも開示）。配列番号２４はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢの野生型遺伝子を説明しており、これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０１３３１５．１中にも開示されている。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＣＤ１９６からのＴｃｄＢのアミノ酸配列は、配列番号２と約９２％の同一性を有する。

【0058】

野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢのアミノ酸配列のさらなる例には配列番号２５が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＢの野生型アミノ酸配列を説明している（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１８１７７および／またはＣＡＡ３７２９８中にも開示）。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＢのアミノ酸配列は、配列番号２と１００％の同一性を有する。配列番号２６はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株ＶＰＩ１０４６３からのＴｃｄＢの野生型遺伝子を説明しており、これはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５３１３８．１中にも開示されている。

【0059】

野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢのさらなる例には、疾病予防管理センター（ＣＤＣ、ジョージア州、Ａｔｌａｎｔａ）から入手可能な野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＢが含まれる。本発明者らは、ＣＤＣから入手可能な野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＢのアミノ酸配列には、最適アラインメントした場合に配列番号２のアミノ酸残基１〜８２１（シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０からのＴｃｄＢ）と少なくとも約９６％〜１００％の同一性が含まれることを発見した。表２を参照されたい。

【0060】

表２：ＣＤＣから入手した野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、および最適アラインメントした場合に配列番号２のアミノ酸残基１〜８２１に対するそれぞれの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＢのアミノ酸残基１〜８２１の％の同一性。

【0061】

【表3】

【0062】

したがって、一実施形態では、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢアミノ酸配列には少なくとも約５００、６００、７００、または８００個の連続的な残基の配列が含まれ、これは、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって初期設定のギャップ重みづけを使用して最適アラインメントした場合に、配列番号２の残基１〜９００の等しい長さの配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有する。例には上述の株（たとえば、Ｒ２０２９１、ＣＤ１９６など）および表２に記載したものが含まれる。

【0063】

別の実施形態では、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢアミノ酸配列には、最適アラインメントした場合に配列番号１１０〜１３３から選択された任意の配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは約９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有する配列が含まれる。表２−ａを参照されたい。

【0064】

【表4-1】

【0065】

【表4-2】

【0066】

毒素ＡおよびＢの遺伝子（ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ）は、３つの追加の小さなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ｔｃｄＤ、ｔｃｄＥ、およびｔｃｄＣが含まれる１９．６ｋｂの遺伝子座位（病原性座位、ＰａＬｏｃ）の一部であり、毒性に有用であるとみなし得る。ＰａＬｏｃは毒素産生性株中で安定かつ保存的であることが知られている。これは、現在までに分析されているすべての毒素産生性株中で同じ染色体組込み部位に存在する。非毒素産生性株では、病原性座位（ＰａＬｏｃ）は存在しない。したがって、本明細書中に記載の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の特徴は、病原性座位の存在である。本明細書中に記載の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の別の好ましい特徴は、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方の産生である。

【0067】

一実施形態では、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株とは、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０またはＶＰＩ１０４６３と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％同一である病原性座位を有する株である。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１０４６３の全病原性座位配列はＥＭＢＬデータベースに配列受託番号Ｘ９２９８２として登録されており、配列番号２６中にも示す。ＰａＬｏｃが参照株ＶＰＩ１０４６３と同一である株は毒素型０と呼ばれる。毒素型Ｉ〜ＶＩＩ、ＩＸ、ＸＩＩ〜ＸＶ、およびＸＶＩＩＩ〜ＸＸＩＶの株は、その毒素遺伝子の変動にもかかわらずＴｃｄＡおよびＴｃｄＢをどちらも産生する。

【0068】

毒素のＮ末端にグルコシルトランスフェラーゼドメインが位置する。毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性は毒素の細胞毒性機能に関連している。機構または理論に束縛されずに、両毒素中のグルコシルトランスフェラーゼ活性は、Ｒｈｏ／Ｒａｃ／Ｒａｓスーパーファミリー内の小さなＧＴＰ結合タンパク質のモノグルコシル化を触媒すると考えられている。これらのＧＴＰ結合タンパク質のグルコシル化後、細胞生理学は劇的に改変され、毒素によって感染した宿主細胞の構造的完全性の損失および重要なシグナル伝達経路の破壊がもたらされる。マンガン、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、およびグルコース結合に関与しているＡｓｐ−Ｘａａ−Ａｓｐ（ＤＸＤ）モチーフは、グルコシルトランスフェラーゼドメインの典型的な特徴である。機構または理論に束縛されずに、ＤＸＤモチーフなどの触媒活性に重要な残基は、６３０などの既知の「歴史的」株からのＴｃｄＢとＲ２０２９１などの超毒性株からのＴｃｄＢとの間で変動しないと考えられている。ＤＸＤモチーフは、配列番号１の付番に従って野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの残基２８５〜２８７、および配列番号２の付番に従って野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの残基２８６〜２８８に位置している。

【0069】

グローバルアラインメントアルゴリズム（たとえば配列解析プログラム）は当技術分野で知られており、２つ以上のアミノ酸毒素配列を最適にアラインメントして、毒素に特定のシグネチャモチーフ（たとえば、以下に記載のグルコシルトランスフェラーゼドメイン中のＤＸＤ、システインプロテアーゼドメイン中のＤＨＣなど）が含まれるかどうかを決定するために使用し得る。最適にアラインメントされた配列（複数可）をそれぞれの参照配列（たとえば、ＴｃｄＡには配列番号１またはＴｃｄＢには配列番号２）と比較して、シグネチャモチーフの存在を決定する。「最適アラインメント」とは、最も高いパーセント同一性のスコアを与えるアラインメントをいう。そのようなアラインメントは既知の配列解析プログラムを使用して行うことができる。一実施形態では、初期設定パラメータ下のＣＬＵＳＴＡＬアラインメント（ＣＬＵＳＴＡＬＷなど）を使用して、クエリ配列を参照配列に対して比較することによって適切な野生型毒素を同定する。保存的アミノ酸残基の相対的付番は、アラインメントした配列内の小さな挿入または欠失（たとえば５個以下のアミノ酸）を説明するために参照アミノ酸配列の残基の付番に基づいている。

【0070】

本明細書中で使用する用語「の付番に従って」とは、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチドの配列を参照配列と比較する場合に、参照配列の残基の付番をいう。言い換えれば、所定のポリマーの数字または残基位置は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチドの配列内の残基の実際の数値的位置によってではなく、参照配列に関連して指定する。

【0071】

たとえば、必要に応じて２つの配列間の残基の一致を最適化するためにギャップを導入することによって、超毒性野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株のものなどの所定のアミノ酸配列を、参照配列（たとえば歴史的野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株、たとえば６３０のものなど）とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップが存在するが、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチドの配列中の残基の付番は、それをアラインメントした参照配列に関連して行う。本明細書中で使用する「参照配列」とは、配列比較の基礎として使用する定義された配列をいう。

【0072】

別段に記述しない限りは、本明細書中におけるＴｃｄＡのアミノ酸位置へのすべての言及は、配列番号１の付番をいう。別段に記述しない限りは、本明細書中におけるＴｃｄＢのアミノ酸位置へのすべての言及は、配列番号２の付番をいう。

【0073】

本明細書中で使用するＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインは、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡ、たとえば配列番号１の例示的な残基１、１０１、または１０２から始まってよく、例示的な残基５４２、５１６、または２９３で終わってよい。ＤＸＤモチーフ領域が含まれる限りは、ＴｃｄＡの残基１から５４２の間で任意の最小残基位置を最大残基位置と組み合わせて、グルコシルトランスフェラーゼドメインの配列を定義し得る。たとえば、一実施形態では、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、配列番号１の残基１０１〜２９３と同一である配列番号２７が含まれ、これにはＤＸＤモチーフ領域が含まれる。別の実施形態では、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、配列番号１の残基１〜５４２と同一である配列番号２８が含まれる。

【0074】

本明細書中で使用するＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインは、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ、たとえば配列番号２の例示的な残基１、１０１、または１０２から始まってよく、例示的な残基５４３、５１６、または２９３で終わってよい。ＤＸＤモチーフ領域が含まれる限りは、ＴｃｄＢの残基１から５４３の間で任意の最小残基位置を最大残基位置と組み合わせて、グルコシルトランスフェラーゼドメインの配列を定義し得る。たとえば、一実施形態では、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、配列番号２の残基１０１〜２９３と同一である配列番号２９が含まれ、これにはＤＸＤモチーフ領域が含まれる。別の実施形態では、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、配列番号２の残基１〜５４３と同一である配列番号３０が含まれる。

【0075】

理論または機構に束縛されずに、ＴｃｄＡおよび／またはＴｃｄＢのＮ末端が自己タンパク質分解プロセスによって切断されることでグルコシルトランスフェラーゼドメインが転位して宿主細胞サイトゾル内に放出され、ここでこれはＲａｃ／Ｒａｓ／Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅと相互作用することができると考えられている。野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡはＬ５４２とＳ５４３の間で切断されることが示されている。野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢはＬ５４３とＧ５４４の間で切断されることが示されている。

【0076】

システインプロテアーゼドメインは毒素の自己触媒的なタンパク質分解活性に関連している。システインプロテアーゼドメインはグルコシルトランスフェラーゼドメインの下流に位置しており、触媒的三つ組のアスパラギン酸、ヒスチジン、およびシステイン（ＤＨＣ）、たとえば、野生型ＴｃｄＡのＤ５８９、Ｈ６５５、およびＣ７００、ならびに野生型ＴｃｄＢのＤ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８によって特徴づけられ得る。機構または理論に束縛されずに、触媒的三つ組は、６３０などの「歴史的」株からの毒素とＲ２０２９１などの超毒性株からのＴｃｄＢとの間で保存的であると考えられている。

【0077】

本明細書中で使用するＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメインは、野生型ＴｃｄＡ、たとえば配列番号１の例示的な残基５４３から始まってよく、例示的な残基８０９、７６９、７６８、または７６７で終わってよい。触媒的三つ組ＤＨＣモチーフ領域が含まれる限りは、野生型ＴｃｄＡの５４３から８０９の間で任意の最小残基位置を最大残基位置と組み合わせて、システインプロテアーゼドメインの配列を定義し得る。たとえば、一実施形態では、ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメインには、配列番号１の付番に従ってそれぞれ野生型ＴｃｄＡのＤ５８９、Ｈ６５５、およびＣ７００に対応する配列番号３２の残基４７、１１３、および１５８に位置するＤＨＣモチーフ領域を有する、配列番号３２が含まれる。配列番号３２は、配列番号１、ＴｃｄＡの残基５４３〜８０９と同一である。

【0078】

本明細書中で使用するＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインは、野生型ＴｃｄＢ、たとえば配列番号２の例示的な残基５４４から始まってよく、例示的な残基８０１、７６７、７５５、または７００で終わってよい。触媒的三つ組ＤＨＣモチーフ領域が含まれる限りは、野生型ＴｃｄＢの５４４から８０１の間で任意の最小残基位置を最大残基位置と組み合わせて、システインプロテアーゼドメインの配列を定義し得る。たとえば、一実施形態では、ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインには、配列番号２の付番に従ってそれぞれ野生型ＴｃｄＢのＤ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８に対応する配列番号３３の残基４４、１１０、および１１５に位置するＤＨＣモチーフ領域が含まれる、配列番号３３が含まれる。配列番号３３は、配列番号２、ＴｃｄＢの残基５４４〜７６７と同一である。別の実施形態では、ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインには、配列番号２、ＴｃｄＢの残基５４４〜８０１が含まれる。

【0079】

突然変異毒素
本発明では、免疫原性組成物には突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素が含まれる。本明細書中で使用する用語「突然変異体」とは、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって初期設定のギャップ重みづけを使用して最適アラインメントした場合に、たとえば、対応する野生型構造と比較して架橋結合を有するおよび／または対応する野生型配列と比較して少なくとも１つの突然変異を有することによって、対応する野生型の構造または配列とは異なる構造または配列を示す分子をいう。本明細書中で使用する用語「突然変異体」には、対応する野生型分子とは異なる機能的特性（たとえば抑止されたグルコシルトランスフェラーゼおよび／または抑止されたシステインプロテアーゼ活性）を示す分子がさらに含まれる。

【0080】

上述の野生型株のいずれかからのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を産生させる供給源として使用し得る。好ましくは、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０が突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を産生させる供給源である。

【0081】

突然変異は、その位置に通常位置する野生型アミノ酸残基の置換、欠失、切断または修飾を含み得る。好ましくは、突然変異は非保存的アミノ酸置換である。また、本発明は、本明細書中に記載の突然変異毒素のいずれかをコードしている核酸配列が含まれる単離ポリヌクレオチドも企図する。

【0082】

本明細書中で使用する「非保存的」アミノ酸置換とは、以下の表３に従って、１つのクラスからのアミノ酸を別のクラスからのアミノ酸で交換することをいう。

【0083】

【表5】

【0084】

非保存的アミノ酸置換の例には、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ、Ｄ）をアラニン残基（Ａｌａ、Ａ）によって置き換える置換が含まれる。他の例には、アスパラギン酸残基（Ａｓｐ、Ｄ）をアスパラギン残基（Ａｓｎ、Ｎ）で置き換えること、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、および／またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）残基をアラニン残基（Ａｌａ、Ａ）で置き換えることが含まれる。

【0085】

保存的置換とは、たとえば表３に従って、同じクラスからのアミノ酸間を交換することをいう。

【0086】

本発明の突然変異毒素は、たとえば部位特異的突然変異誘発、突然変異原（たとえばＵＶ光）を使用した突然変異誘発などの、突然変異を調製するための当技術分野で知られている技法によって調製し得る。好ましくは、部位特異的突然変異誘発を使用する。あるいは、目的の配列を有する核酸分子を直接合成し得る。そのような化学合成方法は当技術分野で知られている。

【0087】

本発明では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素には、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較してグルコシルトランスフェラーゼドメイン中に少なくとも１つの突然変異が含まれる。一実施形態では、グルコシルトランスフェラーゼドメインには少なくとも２つの突然変異が含まれる。好ましくは、突然変異は、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素のグルコシルトランスフェラーゼ酵素活性と比較して、毒素のグルコシルトランスフェラーゼ酵素活性を減少させるまたは抑止する。

【0088】

突然変異を受け得るＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の例示的なアミノ酸残基には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、配列番号１の付番に従って、Ｗ１０１、Ｄ２６９、Ｒ２７２、Ｄ２８５、Ｄ２８７、Ｅ４６０、Ｒ４６２、Ｓ５４１、およびＬ５４２のうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。突然変異を受け得るさらなる例示的なアミノ酸残基には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、配列番号１の付番に従って、Ｅ５１４、Ｓ５１７、およびＷ５１９が含まれる。

【0089】

ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の例示的な突然変異には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａ、Ｓ５４１Ａ、およびＬ５４２Ｇのうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。好ましい実施形態では、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較してＬ５４２Ｇ突然変異が含まれる。別の好ましい実施形態では、ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、Ｄ２８５ＡおよびＤ２８７Ａの突然変異が含まれる。

【0090】

突然変異を受け得るＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の例示的なアミノ酸残基には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂと比較して、配列番号２の付番に従って、Ｗ１０２、Ｄ２７０、Ｒ２７３、Ｄ２８６、Ｄ２８８、Ｎ３８４、Ｄ４６１、Ｋ４６３、Ｗ５２０、およびＬ５４３のうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。突然変異を受け得るさらなる例示的なアミノ酸残基には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂと比較して、配列番号２の付番に従って、Ｅ５１５、Ｓ５１８、およびＷ５２０が含まれる。

【0091】

ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の例示的な突然変異には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｎ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｎ３８４Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｄ４６１Ｒ、Ｋ４６３Ａ、Ｋ４６３Ｅ、Ｗ５２０Ａ、およびＬ５４３Ａのうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。好ましい実施形態では、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較してＬ５４３Ａが含まれる。別の好ましい実施形態では、ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメインには、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、Ｄ２８６ＡおよびＤ２８８Ａの突然変異が含まれる。

【0092】

本明細書中で上述した突然変異のいずれかを、システインプロテアーゼドメイン中の突然変異と組み合わせ得る。本発明では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素には、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較してシステインプロテアーゼドメイン中に少なくとも１つの突然変異が含まれる。好ましくは、突然変異は、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素のシステインプロテアーゼ活性と比較して、毒素のシステインプロテアーゼ活性を減少させるまたは抑止する。

【0093】

突然変異を受け得るＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメイン中の例示的なアミノ酸残基には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、配列番号１の付番に従って、Ｓ５４３、Ｄ５８９、Ｈ６５５、およびＣ７００のうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。ＴｃｄＡのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の例示的な突然変異には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、Ｓ５４３Ａ、Ｄ５８９Ａ、Ｄ５８９Ｎ、Ｈ６５５Ａ、Ｃ７００Ａのうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。好ましい実施形態では、ＴｃｄＡのシステインプロテアーゼドメインには、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較してＣ７００Ａ突然変異が含まれる。

【0094】

突然変異を受け得るＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメイン中の例示的なアミノ酸残基には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、配列番号２の付番に従って、Ｇ５４４、Ｄ５８７、Ｈ６５３、およびＣ６９８のうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。ＴｃｄＢのグルコシルトランスフェラーゼドメイン中の例示的な突然変異には、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、Ｇ５４４Ａ、Ｄ５８７Ａ、Ｄ５８７Ｎ、Ｈ６５３Ａ、Ｃ６９８Ａのうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。好ましい実施形態では、ＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメインには、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較してＣ６９８Ａ突然変異が含まれる。突然変異を受け得るＴｃｄＢのシステインプロテアーゼドメイン中のさらなるアミノ酸残基には、野生型ＴｃｄＢと比較して、Ｋ６００および／またはＲ７５１が含まれる。例示的な突然変異には、Ｋ６００Ｅおよび／またはＲ７５１Ｅが含まれる。

【0095】

したがって、本発明の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素には、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較して、突然変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび突然変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。一実施形態では、突然変異毒素には、グルコシルトランスフェラーゼドメイン中の少なくとも１つの突然変異およびシステインプロテアーゼドメイン中の少なくとも１つの突然変異が含まれる。好ましい実施形態では、突然変異毒素Ａには、少なくともＤ２８５、Ｄ２８７、およびＣ７００の突然変異が含まれる。好ましい実施形態では、突然変異毒素Ｂには、少なくともＤ２８６、Ｄ２８８、およびＣ６９８の突然変異が含まれる。突然変異毒素には、本明細書中に記載の任意のさらなる突然変異が、個々にまたは組み合わせて含まれ得る。

【0096】

例示的な突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡには、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａと比較して、位置２８５および２８７にアミノ酸置換を有する配列番号２９が含まれるグルコシルトランスフェラーゼドメイン、ならびに位置１５８にアミノ酸置換を有する配列番号３２を含むシステインプロテアーゼドメインが含まれる。たとえば、そのような突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡには配列番号４に記載のアミノ酸配列が含まれ、最初のメチオニンは存在しなくてもよい。別の実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａには配列番号８４に記載のアミノ酸配列が含まれる。

【0097】

突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａのさらなる例には、配列番号１と比較してＤ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ４６０Ａ、Ｒ４６２Ａ、およびＣ７００Ａの突然変異を有する、配列番号７に記載のアミノ酸配列が含まれ、最初のメチオニンは存在しなくてもよい。別の実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａには配列番号８３に記載のアミノ酸配列が含まれる。

【0098】

別の例示的な突然変異体ＴｃｄＡには、位置１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、６５５、および７００の残基が任意のアミノ酸であり得る配列番号３４が含まれる。

【0099】

一部の実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較して減少したまたは抑止された自己タンパク質分解プロセスを示す。たとえば、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡには、以下の残基、すなわち、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、Ｓ５４１、Ｌ５４２および／またはＳ５４３のうちの１つでの突然変異、またはその任意の組合せが含まれ得る。好ましくは、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡには、以下の突然変異、すなわち、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、Ｓ５４１Ａ、Ｌ５４２Ｇ、およびＳ５４３Ａのうちの少なくとも１つ、またはその任意の組合せが含まれる。

【0100】

別の例示的な突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡには、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡと比較して、Ｓ５４１Ａ、Ｌ５４２、Ｓ５４３およびＣ７００の突然変異が含まれる。

【0101】

例示的な突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂには、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂと比較して、位置２８６および２８８にアミノ酸置換を有する配列番号３１を含むグルコシルトランスフェラーゼドメイン、ならびに位置１５５にアミノ酸置換を有する配列番号３３を含むシステインプロテアーゼドメインが含まれる。たとえば、そのような突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢには配列番号６に記載のアミノ酸配列が含まれ、最初のメチオニンは存在しなくてもよい。別の実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂには配列番号８６に記載のアミノ酸配列が含まれる。

【0102】

突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢのさらなる例には、配列番号２と比較してＤ２７０Ａ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｋ４６３Ａ、およびＣ６９８Ａの突然変異を有する、配列番号８に記載のアミノ酸配列が含まれ、最初のメチオニンは存在しなくてもよい。別の実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂには配列番号８５に記載のアミノ酸配列が含まれる。

【0103】

別の例示的な突然変異体ＴｃｄＢには、位置１０１、２６９、２７２、２８５、２８７、４６０、４６２、５４１、５４２、５４３、５８９、６５５、および７００の残基が任意のアミノ酸であり得る配列番号３５が含まれる。

【0104】

別の例として、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢには、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、位置５４３および／または５４４での突然変異が含まれ得る。好ましくは、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢには、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、Ｌ５４３および／またはＧ５４４の突然変異が含まれる。より好ましくは、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢには、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、Ｌ５４３Ｇおよび／またはＧ５４４Ａの突然変異が含まれる。

【0105】

別の例示的な突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢには、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して、Ｌ５４３Ｇ、Ｇ５４４ＡおよびＣ６９８の突然変異が含まれる。

【0106】

一態様では、本発明は、配列番号２の付番に従ってアミノ酸残基１から１５００の任意の位置に突然変異を有して、例示的な突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを定義する単離ポリペプチドに関する。たとえば、一実施形態では、単離ポリペプチドには、配列番号２のアミノ酸残基８３０から９９０の間に突然変異が含まれる。突然変異の例示的な位置には、配列番号２の付番に従って位置９７０および９７６が含まれる。好ましくは、残基８３０から９９０の間の突然変異は置換である。一実施形態では、突然変異は非保存的置換であり、Ａｓｐ（Ｄ）および／またはＧｌｕ（Ｅ）アミノ酸残基は、酸性化した際に中和されないアミノ酸残基、たとえばリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈ）などによって置き換えられている。例示的な突然変異には、配列番号２のＥ９７０Ｋ、Ｅ９７０Ｒ、Ｅ９７０Ｈ、Ｅ９７６Ｋ、Ｅ９７６Ｒ、Ｅ９７６Ｈが含まれて、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂを定義する。

【0107】

一実施形態では、単離ポリペプチドには、以下の置換、Ｄ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ／Ｃ６９８Ａ／Ｅ９７０Ｋ／Ｅ９７６Ｋ（配列番号１８４）が含まれる。Ｅ９７０およびＥ９７６は、リボタイプ０７８およびリボタイプ１２６株を除いて（表３５および表３７を参照）観察したすべてのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からの毒素Ｂ中で保存的である（表２−ａ、配列番号１１０〜１３３を参照）。リボタイプ０７８およびリボタイプ１２６株からの毒素Ｂでは、グルタミン酸−９７０の代わりにグリシン−９７０（Ｇ９７０）が存在する。したがって、一実施形態では、単離ポリペプチドには、Ｇ９７０およびＥ９７６での突然変異、たとえばＧ９７０ＫおよびＥ９７６Ｋなどが含まれる。上述したおよびここに記載の突然変異毒素は、対応する野生型毒素と比較して低下した細胞毒性を示し得る。実施例８および１５を参照されたい。

【0108】

別の態様では、本発明は、配列番号１の付番に従ってアミノ酸残基１から１５００の任意の位置に突然変異を有して、例示的な突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａを定義する単離ポリペプチドに関する。たとえば、一実施形態では、単離ポリペプチドには、配列番号１のアミノ酸残基８３２から９９２の間に突然変異が含まれる。突然変異の例示的な位置には、配列番号１の付番に従って位置９７２および９７８が含まれる。好ましくは、残基８３２から９９２の間の突然変異は置換である。一実施形態では、突然変異は非保存的置換であり、Ａｓｐ（Ｄ）および／またはＧｌｕ（Ｅ）アミノ酸残基は、酸性化した際に中和されないアミノ酸残基、たとえばリシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、およびヒスチジン（Ｈ）などによって置き換えられている。例示的な突然変異には、配列番号１のＤ９７２Ｋ、Ｄ９７２Ｒ、Ｄ９７２Ｈ、Ｄ９７８Ｋ、Ｄ９７８Ｒ、Ｄ９７８Ｈが含まれて、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａを定義する。

【0109】

一実施形態では、単離ポリペプチドには、以下の置換、Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ／Ｃ７００Ａ／Ｄ９７２Ｋ／Ｄ９７８Ｋ（配列番号１８３）が含まれる。Ｄ９７２およびＤ９７８の残基は、評価したすべてのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からの毒素Ａ中で保存的である（表１−ａ、配列番号８７〜１０９を参照）。上述したおよびここに記載の突然変異毒素は、対応する野生型毒素と比較して低下した細胞毒性を示し得る。

【0110】

以下にさらなる例示的な突然変異毒素を記載する。一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、（ｉ）配列番号１８５、（ｉｉ）配列番号１８５と少なくとも９０％、９２％、９３％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する、配列番号１８５のポリペプチド、または（ｉｉｉ）配列番号１８５の少なくとも２５０、２８０もしくは３００個のアミノ酸の断片が含まれる。別の実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、（ｉｖ）配列番号１８６、（ｖ）配列番号１８６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する、配列番号１８６のポリペプチド、または（ｖｉ）配列番号１８６の少なくとも２５０、２８０もしくは３００個のアミノ酸の断片が含まれる。

【0111】

一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡは、６００、６７５、６５０、６２５、６００、５７５、５５０、５２５、５００、４７５、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、または２２５個未満のアミノ酸からなる。一実施形態では、突然変異毒素は、８００、７７５、７５０、７２５、７００、６７５、６５０、６２５、６００、５７５、５５０、または５２５個未満のアミノ酸からなる。一実施形態では、突然変異毒素には、配列番号１８５の少なくとも２００、２２５、２５０、２７０、２８０、３００もしくは３１０個のアミノ酸、または配列番号１８５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するポリペプチドの少なくとも２００、２２５、２５０、２７０、２８０、３００もしくは３１０個のアミノ酸が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素には、配列番号１８６の少なくとも４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００もしくは６１０個のアミノ酸、または配列番号１８６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、９９％、もしくは１００％の同一性を有するポリペプチドの少なくとも４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００もしくは６１０個のアミノ酸が含まれる。

【0112】

一実施形態では、突然変異毒素には、Ａ）（ｉ）配列番号１８５、（ｉｉ）配列番号１８５と少なくとも９０％、９２％、９３％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する、配列番号１８５のポリペプチド、または（ｉｉｉ）配列番号１８５の少なくとも２５０、２８０もしくは３００個のアミノ酸の断片と、Ｂ）（ｉｖ）配列番号１８６、（ｖ）配列番号１８６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９５％、９８％、９９％もしくは１００％の同一性を有する、配列番号１８６のポリペプチド、または（ｖｉ）配列番号１８６の少なくとも２５０、２８０もしくは３００個のアミノ酸の断片との融合が含まれる、融合タンパク質が含まれる。さらなる実施形態では、配列番号１８５のＮ末端は配列番号１８６のＣ末端に隣接している。さらなる実施形態では、配列番号１８５のＮ末端は配列番号１８６のＮ末端に隣接している。さらなる実施形態では、配列番号１８５のＣ末端は配列番号１８６のＣ末端に隣接している。突然変異毒素のさらなる例には、以下のアミノ酸配列、すなわち、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、および配列番号１９５のいずれかを有するポリペプチドが含まれる。

【0113】

別の実施形態では、突然変異毒素には、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、配列番号２３６、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、および配列番号２４３のいずれかから選択されるアミノ酸配列の任意の組合せが含まれる融合および／またはハイブリッドポリペプチドが含まれる。たとえば、一実施形態では、突然変異毒素には、配列番号２５４、配列番号２７０、配列番号２７１、配列番号２７２、配列番号２７３、配列番号２７４、または配列番号２７５のいずれかに記載のアミノ酸配列が含まれる。

【0114】

突然変異毒素の別の例には、野生型毒素の断片が含まれる。本明細書中で使用する「断片」突然変異毒素ＴｃｄＡとは、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＴｃｄＡ配列よりも少ない連続したアミノ酸の合計を有するペプチド配列、たとえば、合計２７１０個未満の連続したアミノ酸が含まれる配列をいう。断片突然変異毒素ＴｃｄＡには、本明細書中に記載のアミノ酸残基の突然変異がさらに含まれ得る。本明細書中で使用する「断片」突然変異毒素ＴｃｄＢとは、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ＴｃｄＢ配列よりも少ない連続したアミノ酸の合計を有するペプチド配列、たとえば、合計２３６６個未満の連続したアミノ酸が含まれる配列をいう。断片突然変異毒素ＴｃｄＢには、本明細書中に記載のアミノ酸残基の突然変異がさらに含まれ得る。そのような例示的な突然変異毒素配列には、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、本明細書中に記載の野生型突然変異毒素Ａ、たとえば配列番号１の少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００個の連続したアミノ酸が含まれる。別の実施形態では、突然変異毒素には、本明細書中に記載の遺伝的突然変異させた毒素Ａの断片が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、本明細書中に記載の野生型突然変異毒素Ｂ、たとえば配列番号２の少なくとも２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、または２０００個の連続したアミノ酸が含まれる。別の実施形態では、突然変異毒素には、本明細書中に記載の遺伝的突然変異させた毒素Ｂの断片が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素には、最大で３０００、２７１０、２５００、２４００、２３６６、２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、または３００個の連続したアミノ酸が含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義し得る。別の実施形態では、ハイブリッド分子の生成がもたらされるような様式で、突然変異毒素を少なくとも１つの他のペプチドまたは少なくとも１つの他の突然変異毒素と融合させる。

【0115】

さらなる例示的な断片突然変異毒素ＴｃｄＡには、配列番号３７４から配列番号４２１のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。さらなる例示的な断片突然変異毒素ＴｃｄＡには、配列番号４７２から配列番号５１９のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。さらなる例示的な突然変異毒素ＴｃｄＢには、配列番号４２２から配列番号４７１のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。さらなる例示的な断片突然変異毒素ＴｃｄＢには、配列番号５６８から配列番号６１５のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。

【0116】

以下にさらなる例示的な突然変異毒素を記載する。一実施形態では、突然変異毒素には、たとえば配列番号１の付番に従って、Ｗ１０１、Ｄ２８７、Ｅ５１４、Ｄ２８５、Ｓ５１７、Ｗ５１９、およびＣ７００からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５個の突然変異が含まれる、またはそれからなるＴｃｄＡが含まれる。さらなる実施形態では、ＴｃｄＡ突然変異体には、Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｄ２８５Ａ、Ｓ５１７Ａ、Ｗ５１９Ａ、およびＣ７００Ａの置換ならびにＷ１０１の欠失からなる群から選択される少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５個の突然変異が含まれる、またはそれからなる。

【0117】

別の例示的な突然変異毒素ＴｃｄＡには、たとえば配列番号１の付番に従って、アミノ酸置換Ｗ１０１、Ｄ２８７Ａ、およびＥ５１４Ｑが含まれる。さらなる一実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、およびＷ５１９Ａが含まれる、またはそれからなるＴｃｄＡタンパク質を提供する。本発明の別の具体的な実施形態は、アミノ酸置換Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４Ｑ、Ｗ５１９Ａ、およびＣ７００Ａが含まれる、またはそれからなるＴｃｄＡタンパク質である。

【0118】

別の実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、たとえば配列番号１の付番に従って、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＤ２８５Ａが含まれる。別の実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、突然変異Ｗ１０１Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｅ５１４ＱおよびＳ５１７Ａが含まれる。

【0119】

別の実施形態では、さらなる突然変異、たとえばＣ７００Ａ突然変異を突然変異体ＴｃｄＡに加え得る。さらなる実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個までのさらなる突然変異を、本明細書中に記載の突然変異毒素ＴｃｄＡの実施形態のうちの任意のものに加え得る。

【0120】

突然変異毒素ＴｃｄＡのさらなる例には、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、または配列番号２１１に記載のアミノ酸配列が含まれる。別の実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、配列番号２１０のアミノ酸配列が含まれる。さらに別の実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、位置Ｗ１０１、Ｄ２８７、Ｅ５１４、Ｗ５１９およびＣ７００での突然変異が含まれ、配列番号２１２に記載のように、Ｗ１０１はトリプトファン以外の任意のアミノ酸で置き換えられ、Ｄ２８７はアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸で置き換えられ、Ｅ５１４はグルタミン酸以外の任意のアミノ酸で置き換えられ、Ｗ５１９はトリプトファン以外の任意のアミノ酸で置き換えられ、Ｃ７００はシステイン以外の任意のアミノ酸で置き換えられる。

【0121】

突然変異毒素ＴｃｄＡのさらなる例には、元の参照配列（たとえば、配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１もしくは配列番号２１２または配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５もしくは配列番号８６）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。

【0122】

さらなる実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、たとえば配列番号２０３、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０８、配列番号２０９、配列番号２１０、配列番号２１１および配列番号２１２または配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５もしくは配列番号８６と比較して、最大で１２個のアミノ酸残基、最大で１１個のアミノ酸残基、最大で１０個のアミノ酸残基、最大で９個のアミノ酸残基、最大で８個のアミノ酸残基、最大で７個のアミノ酸残基、最大で６個のアミノ酸残基、最大で５個のアミノ酸残基、最大で４個のアミノ酸残基、最大で３個のアミノ酸残基、最大で２個のアミノ酸残基、または１個のアミノ酸残基での突然変異が含まれる。

【0123】

以下にさらなる例示的な突然変異毒素を記載する。一実施形態では、突然変異毒素は、配列番号２の付番に従って、Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ５１５、Ｄ２８６、Ｓ５１８、Ｗ５２０、およびＣ６９８からなる群から選択されるアミノ酸残基での少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５個の突然変異が含まれる突然変異体ＴｃｄＢである。別の実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、Ｗ１０２Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｅ５１５Ｑ、Ｄ２８６Ａ、Ｓ５１８Ａ、Ｗ５２０Ａ、およびＣ６９８Ａの置換ならびにＷ１０２の欠失からなる群から選択される少なくとも３、少なくとも４、または少なくとも５個の突然変異が含まれる。一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、または配列番号２２１に記載のアミノ酸配列が含まれる。さらに別の実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、位置Ｗ１０２、Ｄ２８８、Ｅ５１５、Ｗ５２０およびＣ６９８での突然変異が含まれ、配列番号２２２に記載のように、Ｗ１０２はトリプトファン以外の任意のアミノ酸で置き換えられ、Ｄ２８８はアスパラギン酸以外の任意のアミノ酸で置き換えられ、Ｅ５１５はグルタミン酸以外の任意のアミノ酸で置き換えられ、Ｗ５２０はトリプトファン以外の任意のアミノ酸で置き換えられ、Ｃ６９８はシステイン以外の任意のアミノ酸で置き換えられる。

【0124】

突然変異毒素ＴｃｄＢのさらなる例には、元の参照配列、すなわち、配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、または配列番号２２２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。

【0125】

さらなる実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、たとえば配列番号２１３、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１７、配列番号２１８、配列番号２１９、配列番号２２０、配列番号２２１、および／または配列番号２２２と比較して、最大で１２個のアミノ酸残基、最大で１１個のアミノ酸残基、最大で１０個のアミノ酸残基、最大で９個のアミノ酸残基、最大で８個のアミノ酸残基、最大で７個のアミノ酸残基、最大で６個のアミノ酸残基、最大で５個のアミノ酸残基、最大で４個のアミノ酸残基、最大で３個のアミノ酸残基、最大で２個のアミノ酸残基、または１個のアミノ酸残基での突然変異が含まれる。

【0126】

さらなる例示的な突然変異毒素ＴｃｄＡには、配列番号２７６から配列番号３２３のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。さらなる例示的な突然変異毒素ＴｃｄＢには、配列番号３２４から配列番号３７３のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。

【0127】

以下にさらなる例示的な突然変異毒素を記載する。一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、（ａ）配列番号２２４または配列番号２４５と５０％以上（たとえば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、または１００％）の同一性を有するアミノ酸配列、ならびに／あるいは、（ｂ）配列番号２２４もしくは配列番号２４５の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片［ただし、「ｎ」は７以上である（たとえば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、３００、４００、５００、５４０、もしくはそれより大きい）］、または配列番号２２４もしくは配列番号２４５と８０％以上の同一性を有し、かつ配列番号２２４および／もしくは配列番号２４５のエピトープを含むポリペプチドの断片であるアミノ酸配列が含まれる。

【0128】

一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、配列番号２２３、配列番号２２４、配列番号２２５、配列番号２２６、配列番号２２７、配列番号２２８、配列番号２２９、配列番号２３０、配列番号２３１、配列番号２３２、配列番号２３３、配列番号２３４、配列番号２３５、または配列番号２３６に記載のアミノ酸配列が含まれる。突然変異毒素ＴｃｄＡのさらなる例示的な実施形態には、配列番号２４４、配列番号２４５、配列番号２５０、配列番号２５１、配列番号２５２、配列番号２５３、配列番号２５４、配列番号２５５、配列番号２５６、配列番号２５７、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２６１、配列番号２６２、および／または配列番号２６３のいずれかに記載のアミノ酸配列が含まれる。

【0129】

一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、（ａ）配列番号２３８または配列番号２４７と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、および／あるいは（ｂ）配列番号２３８もしくは配列番号２４７の少なくとも７個の連続したアミノ酸の断片、または配列番号２３８もしくは配列番号２４７と８０％以上の同一性を有し、かつ配列番号２３８もしくは配列番号２４７のエピトープを含むポリペプチドの断片であるアミノ酸配列が含まれる。

【0130】

一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、（ａ）配列番号２３８または配列番号２４７と５０％以上の（たとえば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９８．５％、９９％、９９．５％、９９．８％、９９．９％、またはそれより高い）同一性を有するアミノ酸配列、および／あるいは（ｂ）配列番号２３８もしくは配列番号２４７の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片、または配列番号２３８もしくは配列番号２４７と５０％以上の同一性を有するポリペプチドの断片［ただし、「ｎ」は７以上である（たとえば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２５０、３００、４００、５００、５４０、もしくはそれより大きい）］であるアミノ酸配列が含まれる。

【0131】

一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＢには、配列番号２３７、配列番号２３８、配列番号２３９、配列番号２４０、配列番号２４１、配列番号２４２、または配列番号２４３に記載のアミノ酸配列が含まれる。突然変異毒素ＴｃｄＢのさらなる例示的な実施形態には、配列番号２４６、配列番号２４７、配列番号２４８、配列番号２４９、配列番号２６４、配列番号２６５、配列番号２６６、配列番号２６７、配列番号２６８、および／または配列番号２６９のいずれかに記載のアミノ酸配列が含まれる。

【0132】

さらなる例示的な突然変異毒素ＴｃｄＡには、配列番号５２０から配列番号５６７のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。さらなる例示的な突然変異毒素ＴｃｄＢには、配列番号６１６から配列番号６６３のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。

【0133】

以下にさらなる例示的な突然変異毒素を記載する。一実施形態では、突然変異毒素ＴｃｄＡには、配列番号６６４から配列番号７１１のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。さらなる例示的な突然変異毒素ＴｃｄＢには、配列番号７１２から配列番号７６１のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドが含まれる。

【0134】

本発明のポリペプチドには、場合によっては宿主細胞媒介性プロセスの結果として、最初のメチオニン残基が含まれ得る。たとえば組換え産生手順で使用する宿主細胞および／または宿主細胞の発酵もしくは成長条件に応じて、翻訳開始コドンによってコードされているＮ末端メチオニンを細胞内での翻訳後にポリペプチドから除去してもよい、またはＮ末端メチオニンは単離ポリペプチド中に存在したままでもよいことが当技術分野で知られている。

【0135】

したがって、一態様では、本発明は、配列番号４に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドに関し、最初のメチオニン（位置１）は存在しなくてもよい。一実施形態では、配列番号４の最初のメチオニンは存在しない。一態様では、本発明は、最初のメチオニンが存在しないこと以外は配列番号４と同一である、配列番号８４に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドに関する。

【0136】

別の態様では、単離ポリペプチドには配列番号６に記載のアミノ酸配列が含まれ、最初のメチオニン（位置１）は存在しなくてもよい。一実施形態では、配列番号６最初のメチオニンは存在しない。一態様では、本発明は、最初のメチオニンが存在しないこと以外は配列番号６と同一である、配列番号８６に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドに関する。

【0137】

さらなる一態様では、単離ポリペプチドには配列番号７に記載のアミノ酸配列が含まれ、最初のメチオニン（位置１）は存在しなくてもよい。一実施形態では、本発明は、最初のメチオニンが存在しないこと以外は配列番号７と同一である、配列番号８３に記載のアミノ酸配列が含まれる単離ポリペプチドに関する。さらに別の態様では、単離ポリペプチドには配列番号８に記載のアミノ酸配列が含まれ、最初のメチオニン（位置１）は存在しなくてもよい。一実施形態では、単離ポリペプチドには、最初のメチオニンが存在しないこと以外は配列番号８と同一である、配列番号８５に記載のアミノ酸配列が含まれる。

【0138】

一態様では、本発明は、配列番号４が含まれる免疫原性組成物に関し、最初のメチオニン（位置１）は存在しなくてもよい。別の態様では、本発明は、配列番号６が含まれる免疫原性組成物に関し、最初のメチオニン（位置１）は存在しなくてもよい。さらなる一態様では、本発明は、配列番号７が含まれる免疫原性組成物に関し、最初のメチオニン（位置１）は存在しなくてもよい。さらに別の態様では、本発明は、配列番号８が含まれる免疫原性組成物に関し、最初のメチオニン（位置１）は存在しなくてもよい。

【0139】

別の態様では、本発明は、配列番号８３が含まれる免疫原性組成物に関する。一態様では、本発明は、配列番号８４が含まれる免疫原性組成物に関する。一態様では、本発明は、配列番号８５が含まれる免疫原性組成物に関する。別の態様では、本発明は、配列番号８６が含まれる免疫原性組成物に関する。

【0140】

細胞毒性
また、哺乳動物において免疫応答を生じることに加えて、本明細書中に記載の免疫原性組成物は対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較して低下した細胞毒性も有する。好ましくは、免疫原性組成物は哺乳動物への投与において安全であり、対応するそれぞれの野生型毒素の細胞毒性と比較して最小限の細胞毒性を有する（たとえば約６〜８ｌｏｇ_１０の低下）〜細胞毒性なしである。

【0141】

本明細書中で使用する用語、細胞毒性とは、当技術分野において理解される用語であり、アポトーシス細胞死および／または細胞毒性剤が存在しない以外は同一条件下の同一細胞と比較して細胞の１つもしくは複数の通常の生化学的もしくは生物学的機能が異常に損なわれている状態をいう。毒性は、たとえば、細胞もしくは哺乳動物中で５０％の細胞死を誘導するために必要な薬剤の量（すなわちそれぞれＥＣ_５０もしくはＥＤ_５０）で、または当技術分野で知られている他の方法によって定量することができる。

【0142】

細胞円形化アッセイなどの細胞毒性を示すためのアッセイは当技術分野で知られている（たとえばＫｕｅｈｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１０ Ｏｃｔ ７；４６７（７３１６）：７１１〜３を参照）。ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの作用は、細胞が円形化（たとえば形態を失う）して死滅することを引き起こし、そのような現象は光学顕微鏡観察によって目で見ることができる。たとえば図９を参照されたい。

【0143】

当技術分野で知られているさらなる例示的な細胞毒性アッセイには、［^１４Ｃ］グルコースで標識したＲａｓのリン光イメージングのアッセイに関するグルコシル化アッセイ（Ｂｕｓｃｈら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９８ Ｊｕｌ ３１；２７３（３１）：１９５６６〜７２に記載）、および好ましくは以下の実施例に記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイが含まれ、ＥＣ_５０とは、細胞、好ましくはヒト二倍体線維芽細胞（たとえばＩＭＲ９０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８６（商標））において、毒素が存在しない同一条件下の同一細胞と比較して細胞変性効果（ＣＰＥ）の少なくとも約５０％を示す免疫原性組成物の濃度をいい得る。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイは、細胞、好ましくはヒト二倍体線維芽細胞（たとえばＩＭＲ９０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８６（商標））において、毒素が存在しない同一条件下の同一細胞と比較して野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に誘導される細胞変性効果（ＣＰＥ）の少なくとも約５０％を阻害する組成物の濃度を評価するためにも使用し得る。さらなる例示的な細胞毒性アッセイには、Ｄｏｅｒｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９２ Ａｕｇ；３０（８）：２０４２〜６に記載のものが含まれる。また、細胞毒性は、毒素で処理した細胞中のＡＴＰレベルを測定することによっても決定することができる。たとえば、相対光量（ＲＬＵ）として測定されるルミネセンスを放射する、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲＧＬＯ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）などのルシフェラーゼに基づく基質を使用し得る。そのようなアッセイでは、細胞生存度は細胞中のＡＴＰの量またはＲＬＵ値に直接比例し得る。

【0144】

一実施形態では、免疫原性組成物の細胞毒性は、対応する野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較して、少なくとも約１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００倍、１４０００倍、１５０００倍、またはそれより多く低減される。たとえば表２０を参照されたい。

【0145】

別の実施形態では、免疫原性組成物の細胞毒性は、同一条件下の対応する野生型毒素と比較して、少なくとも約２ｌｏｇ_１０、より好ましくは約３ｌｏｇ_１０、最も好ましくは約４ｌｏｇ_１０またはそれより多く低下する。たとえば、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢは、標準の細胞変性効果アッセイ（ＣＰＥ）で測定して、少なくとも約１０^−１２ｇ／ｍｌのＥＣ_５０値を有し得る例示的な野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと比較して約１０^−９ｇ／ｍｌのＥＣ_５０値を有し得る。たとえば、以下の実施例セクション中の表７Ａ、７Ｂ、８Ａおよび８Ｂを参照されたい。

【0146】

さらに別の実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性は、たとえば本明細書中に記載したものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイによって測定して、少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌまたはそれより高いＥＣ_５０を有する。したがって、好ましい実施形態では、免疫原性組成物および突然変異毒素は、哺乳動物に投与するために生物学的に安全である。

【0147】

機構または理論に束縛されずに、野生型ＴｃｄＡと比較してＤ２８５およびＤ２８７の突然変異を有するＴｃｄＡ、ならびに野生型ＴｃｄＢと比較してＤ２８６およびＤ２８８の突然変異を有するＴｃｄＢは、グルコシルトランスフェラーゼ活性に欠損があり、したがって細胞変性効果の誘導に欠損があると予想された。さらに、ＤＨＣモチーフ中に突然変異を有する毒素は、自己触媒プロセスに欠損があり、したがって細胞毒性効果をまったく持たないと予想された。

【0148】

しかし、本発明者らは、驚くべきことに、とりわけ、配列番号４を有する例示的な突然変異体ＴｃｄＡおよび配列番号６を有する例示的な突然変異体ＴｃｄＢが、機能不全のグルコシルトランスフェラーゼ活性および機能不全のシステインプロテアーゼ活性を示したにもかかわらず、予想外に細胞毒性を示した（ただし野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０毒素からは顕著に低下している）ことを発見した。機構または理論に束縛されずに、突然変異毒素は新規機構によって細胞毒性を達成すると考えられている。それにもかかわらず、配列番号４を有する例示的な突然変異体ＴｃｄＡおよび配列番号６を有する例示的な突然変異体ＴｃｄＢは驚くべきことに免疫原性であった。以下の実施例を参照されたい。

【0149】

架橋結合
野生型毒素の化学的架橋結合は毒素の失活に失敗する潜在性を有するが、本発明者らは、突然変異毒素の少なくとも１つのアミノ酸を化学的に架橋結合させることで、化学的架橋結合を欠く同一の突然変異毒素と比較して、および対応する野生型毒素と比較して、突然変異毒素の細胞毒性がさらに低下したことをさらに発見した。好ましくは、突然変異毒素は、化学的架橋剤と接触させる前に精製する。

【0150】

さらに、化学的架橋剤が有用なエピトープを変更する潜在性にもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、少なくとも１つのアミノ酸を化学的に架橋結合させた遺伝子改変した突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、複数の中和抗体またはその結合断片を誘発した免疫原性組成物をもたらしたことを発見した。したがって、中和抗体分子と会合したエピトープが化学的架橋結合後に予想外に保たれた。

【0151】

架橋結合（本明細書中で「化学的失活」または「失活」とも呼ばれる）とは、２つ以上の分子を共有結合によって化学的に一緒にするプロセスである。用語「架橋結合試薬」、「架橋剤」、および「架橋結合剤」とは、ペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質上の特定の官能基（第一級アミン、スルヒドリル、カルボキシル、カルボニルなど）と反応するおよび／または化学的に付着することができる分子をいう。一実施形態では、分子は、ペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質上の特定の官能基（第一級アミン、スルヒドリル、カルボキシル、カルボニルなど）と反応するおよび／または化学的に付着することができる２つ以上の反応性末端を含有し得る。好ましくは、化学的架橋剤は水溶性である。別の好ましい実施形態では、化学的架橋剤はヘテロ二官能性架橋結合剤である。別の実施形態では、化学的架橋剤は二官能性架橋結合剤ではない。化学的架橋剤は当技術分野で知られている。

【0152】

好ましい実施形態では、架橋剤は長さゼロの架橋剤である。「長さゼロ」の架橋結合剤とは、２つの分子の官能基間の直接架橋結合を媒介または生成する架橋剤をいう。たとえば、２つのポリペプチドの架橋結合において、長さゼロの架橋結合剤は、外因性物質を組み込まずに、１つのポリペプチドのアミノ酸側鎖からのカルボキシル基と別のポリペプチドのアミノ基との間の橋または架橋結合の形成をもたらす。長さゼロの架橋剤は、たとえば、ヒドロキシル部分とカルボキシル部分との間のエステル結合の形成、および／またはカルボキシル部分と第一級アミノ部分との間のアミド結合の形成を触媒することができる。

【0153】

例示的な適切な化学的架橋剤には、ホルムアルデヒド、ホルマリン、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＭＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、およびその誘導体を含めた水溶性カルボジイミド（ＲＮ＝Ｃ＝ＮＲ’）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、フェニルグリオキサール、ならびに／またはＵＤＰ−ジアルデヒドが含まれる。

【0154】

好ましくは、架橋剤はＥＤＣである。突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドがＥＤＣによって化学修飾する場合（たとえばポリペプチドをＥＤＣと接触させることによる）、一実施形態では、ポリペプチドには（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。一実施形態では、ポリペプチドには（ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。一実施形態では、ポリペプチドには（ｃ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基とポリペプチドのＮ末端のアミノ基との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。一実施形態では、ポリペプチドには（ｄ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。一実施形態では、ポリペプチドには（ｅ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖と第２の単離ポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。一実施形態では、ポリペプチドには（ｆ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖と第２の単離ポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。一実施形態では、ポリペプチドには（ｇ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と第２の単離ポリペプチドのＮ末端のアミノ基との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。一実施形態では、ポリペプチドには（ｈ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と第２の単離ポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。たとえば図２４および図２５を参照されたい。

【0155】

「第２の単離ポリペプチド」とは、ＥＤＣとの反応中に存在する任意の単離ポリペプチドをいう。一実施形態では、第２の単離ポリペプチドは、第１の単離ポリペプチドと同一の配列を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドである。別の実施形態では、第２の単離ポリペプチドは、第１の単離ポリペプチドとは異なる配列を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドである。

【0156】

一実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）〜（ｄ）の修飾から選択される少なくとも２つの修飾が含まれる。例示的な一実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合、および（ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。さらなる実施形態では、ポリペプチドには、（ａ）〜（ｄ）の修飾から選択される少なくとも３つの修飾が含まれる。さらなる一実施形態では、ポリペプチドには（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）の修飾が含まれる。

【0157】

ＥＤＣによる化学修飾中に複数の突然変異ポリペプチドが存在する場合、一実施形態では、生じる組成物には、（ａ）〜（ｈ）の修飾のいずれかの少なくとも１つが含まれる。一実施形態では、組成物には、（ａ）〜（ｈ）の修飾から選択される少なくとも２つの修飾が含まれる。さらなる実施形態では、組成物には、（ａ）〜（ｈ）の修飾から選択される少なくとも３つの修飾が含まれる。さらなる一実施形態では、組成物には、（ａ）〜（ｈ）の修飾から選択される少なくとも４つの修飾が含まれる。別の実施形態では、組成物には、（ａ）〜（ｈ）の修飾のそれぞれが少なくとも１つずつ含まれる。

【0158】

例示的な一実施形態では、生じる組成物には、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合、および（ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。一実施形態では、組成物には、（ｃ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基とポリペプチドのＮ末端のアミノ基との間の少なくとも１つの架橋結合、および（ｄ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基とポリペプチドのリシン残基との間の少なくとも１つの架橋結合の側鎖がさらに含まれる。

【0159】

別の例示的な実施形態では、生じる組成物には、（ｅ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖と第２の単離ポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合、（ｆ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖と第２の単離ポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合、（ｇ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と第２の単離ポリペプチドのＮ末端のアミノ基との間の少なくとも１つの架橋結合、および（ｈ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と第２の単離ポリペプチドのリシン残基との間の少なくとも１つの架橋結合の側鎖が含まれる。

【0160】

さらなる例示的な一実施形態では、生じる組成物には、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合、（ｂ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合、（ｅ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖と第２の単離ポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合、および（ｆ）ポリペプチドのグルタミン酸残基の側鎖と第２の単離ポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合が含まれる。

【0161】

好ましい実施形態では、化学的架橋剤には、ホルムアルデヒド、より好ましくは、リシンの非存在下でホルムアルデヒドが含まれる薬剤が含まれる。グリシンまたは第一級アミンを有する他の適切な化合物を、架橋結合反応において反応停止剤として使用することができる。したがって、別の好ましい実施形態では、化学的薬剤には、ホルムアルデヒド、およびグリシンの使用が含まれる。

【0162】

さらに別の好ましい実施形態では、化学的架橋剤にはＥＤＣおよびＮＨＳが含まれる。当技術分野で知られているように、ＮＨＳをＥＤＣカップリングプロトコルに含め得る。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、対応する野生型毒素と比較して、遺伝的突然変異させた毒素と比較して、かつＥＤＣによって化学的に架橋結合させた遺伝的突然変異させた毒素と比較して、ＮＨＳが突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性をさらに減少させることを容易にし得ることを発見した。たとえば実施例２２を参照されたい。したがって、機構または理論に束縛されずに、ポリペプチドの少なくとも１つのリシン残基の側鎖と連結されたベータアラニン部分（たとえば、突然変異毒素ポリペプチド、ＥＤＣ、およびＮＨＳの反応から生じたもの）を有する突然変異毒素ポリペプチドは、たとえばベータアラニン部分が存在しないシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（野生型または突然変異体）と比較して、突然変異毒素の細胞毒性をさらに減少させることを容易にし得る。

【0163】

また、ＥＤＣおよび／またはＮＨＳの使用には、反応停止剤としてのグリシンまたは第一級アミンを有する他の適切な化合物の使用も含まれ得る。たとえばグリシンメチルエステルおよびアラニンなどの、第一級アミンを有する任意の化合物を反応停止剤として使用し得る。好ましい実施形態では、反応停止化合物は非ポリマー性の親水性第一級アミンである。非ポリマー性の親水性第一級アミンの例には、たとえば、アミノ糖、アミノアルコール、およびアミノポリオールが含まれる。非ポリマー性の親水性第一級アミンの具体的な例には、グリシン、エタノールアミン、グルカミン、アミン官能化ポリエチレングリコール、およびアミン官能化エチレングリコールオリゴマーが含まれる。

【0164】

一態様では、本発明は、少なくとも１つのアミノ酸側鎖がＥＤＣおよび非ポリマー性の親水性第一級アミン、好ましくはグリシンによって化学修飾された、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドに関する。生じるグリシン付加物（たとえば、ＥＤＣ、ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素の反応、グリシンで反応停止したもの）は、対応する野生型毒素と比較して、突然変異毒素の細胞毒性を減少させることを容易にし得る。

【0165】

一実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドをＥＤＣおよびグリシンによって化学修飾させる場合、ポリペプチドをＥＤＣによって修飾させる場合の少なくとも１つの修飾がポリペプチドに含まれ（たとえば、上述の（ａ）〜（ｈ）の修飾のいずれか少なくとも１つ）、かつ以下のうちの少なくとも１つの例示的な修飾が含まれる：（ｉ）ポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基と連結されたグリシン部分、（ｊ）ポリペプチドの少なくとも１つのアスパラギン酸残基の側鎖と連結されたグリシン部分、および（ｋ）ポリペプチドの少なくとも１つのグルタミン酸残基の側鎖と連結されたグリシン部分。たとえば図２４および図２５を参照されたい。

【0166】

一実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの少なくとも１つのアミノ酸が化学的に架橋結合されている、および／または突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの少なくとも１つのアミノ酸が化学的に架橋結合されている。本明細書中に記載の突然変異毒素のいずれかを化学的に架橋結合させ得る。別の実施形態では、配列番号４、配列番号６、配列番号７、および／または配列番号８のうちの少なくとも１つのアミノ酸が化学的に架橋結合されている。一実施形態では、配列番号１から配列番号７６１のうちの任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基が架橋結合されている。別の実施形態では、配列番号１８３から配列番号７６１のうちの任意のアミノ酸配列を有するポリペプチドの少なくとも１つのアミノ酸残基には、上述の修飾、たとえば、（ａ）ポリペプチドのアスパラギン酸残基の側鎖とポリペプチドのリシン残基の側鎖との間の少なくとも１つの架橋結合などの、（ａ）〜（ｋ）の修飾のいずれかが含まれる。

【0167】

たとえば、少なくとも１つのアミノ酸は、ＥＤＣなどのカルボジイミドが含まれる薬剤によって化学的に架橋結合させ得る。カルボジイミドは、遊離カルボキシル（たとえばアスパラギン酸および／またはグルタミン酸の側鎖からのもの）とアミノ基（たとえばリシン残基の側鎖中のもの）との間に共有結合を形成して、安定なアミド結合を形成し得る。

【0168】

別の例として、少なくとも１つのアミノ酸は、ＮＨＳが含まれる薬剤によって化学的に架橋結合させ得る。ＮＨＳエステル活性化架橋結合剤は、第一級アミン（たとえば、それぞれのポリペプチド鎖のＮ末端および／またはリシン残基の側鎖中のもの）と反応して、アミド結合を与え得る。

【0169】

別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸は、ＥＤＣおよびＮＨＳが含まれる薬剤によって化学的に架橋結合させ得る。たとえば、一実施形態では、本発明は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドに関し、位置１のメチオニン残基は存在しなくてもよく、ポリペプチドには、ＥＤＣおよびＮＨＳによって化学修飾された少なくとも１つのアミノ酸側鎖が含まれる。別の実施形態では、本発明は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドに関し、位置１のメチオニン残基は存在しなくてもよく、ポリペプチドには、ＥＤＣおよびＮＨＳによって化学修飾された少なくとも１つのアミノ酸側鎖が含まれる。さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８３、配列番号８５、配列番号７、または配列番号８に記載のアミノ酸配列を有する単離ポリペプチドに関する。ポリペプチドは、ポリペプチドをＥＤＣおよびＮＨＳと接触させることによって修飾させる。たとえば図２４および図２５を参照されたい。

【0170】

突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドをＥＤＣおよびＮＨＳによって（たとえば接触させることによって）化学修飾させる場合、一実施形態では、ポリペプチドをＥＤＣによって修飾させる場合の少なくとも１つの修飾がポリペプチドに含まれ（たとえば、上述の（ａ）〜（ｈ）の修飾のうちの任意の少なくとも１つ）、かつ（ｌ）ポリペプチドの少なくとも１つのリシン残基の側鎖と連結されたベータアラニン部分が含まれる。

【0171】

別の態様では、本発明は、ＥＤＣ、ＮＨＳ、および非ポリマー性の親水性第一級アミン、好ましくはグリシンによって化学修飾された少なくとも１つのアミノ酸側鎖が含まれる突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドに関する。一実施形態では、ポリペプチドには、ポリペプチドをＥＤＣによって修飾させる場合の少なくとも１つの修飾（たとえば、上述の（ａ）〜（ｈ）の修飾のうちの任意の少なくとも１つ）、ポリペプチドをグリシンによって修飾させる場合の少なくとも１つの修飾（たとえば、上述の（ｉ）〜（ｋ）の修飾のうちの任意の少なくとも１つ）、および（ｌ）ポリペプチドの少なくとも１つのリシン残基の側鎖と連結されたベータアラニン部分が含まれる。たとえば図２４および図２５を参照されたい。

【0172】

一態様では、本発明は、ポリペプチドの少なくとも１つのリシン残基の側鎖がベータアラニン部分と連結されている突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドに関する。一実施形態では、ポリペプチドの第２のリシン残基の側鎖は、アスパラギン酸残基の側鎖および／またはグルタミン酸残基の側鎖と連結されている。ポリペプチドの「第２の」リシン残基には、ベータアラニン部分と連結されていない、ポリペプチドのリシン残基が含まれる。第２のリシン残基が連結されているアスパラギン酸の側鎖および／またはグルタミン酸の側鎖は、ポリペプチドのものであり分子内架橋結合を形成するか、または第２のポリペプチドのものであり分子間架橋結合を形成し得る。別の実施形態では、ポリペプチドの少なくとも１つのアスパラギン酸残基の側鎖および／または少なくとも１つのグルタミン酸残基の側鎖は、グリシン部分と連結されている。グリシン部分と連結されているアスパラギン酸残基および／またはグルタミン酸残基は、同時にリシン残基とは連結されていない。

【0173】

別の態様では、本発明は、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の少なくとも１つのアミノ酸側鎖が化学修飾されている突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に関する。一実施形態では、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａの少なくとも１つのアミノ酸側鎖および／または野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂの少なくとも１つのアミノ酸側鎖はＥＤＣによって化学修飾されている。たとえば、一実施形態では、ＴｃｄＡ（配列番号１）および／またはＴｃｄＢ（配列番号２）はＥＤＣによって化学修飾されている。別の実施形態では、野生型毒素はＥＤＣおよびＮＨＳによって化学修飾されている。一実施形態では、突然変異毒素には化学修飾した野生型毒素Ａが含まれ、野生型毒素Ａは表１−ａに記載したものの任意の１つである。別の実施形態では、突然変異毒素には化学修飾した野生型毒素Ｂが含まれ、野生型毒素Ｂは表２−ａに記載したものの任意の１つである。

【0174】

化学的に架橋結合させた突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドのさらに別の例として、少なくとも１つのアミノ酸は、ホルムアルデヒドが含まれる薬剤によって化学的に架橋結合させ得る。ホルムアルデヒドは、Ｎ末端アミノ酸残基のアミノ基ならびにアルギニン、システイン、ヒスチジン、およびリシンの側鎖と反応し得る。ホルムアルデヒドおよびグリシンはシッフ塩基付加物を形成する場合があり、これは、第一級Ｎ末端アミノ基、アルギニン、およびチロシン残基に付着する場合があり、より低い度合でアスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、およびトリプトファン残基に付着する場合がある。

【0175】

化学的架橋剤は、たとえばｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイまたは動物毒性によって測定して、処理した毒素が同一条件下の未処理の毒素よりも少ない毒性（たとえば、約１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、５０％、２５％、または１０％少ない毒性）を有する場合に、毒素の細胞毒性を低下させるといわれる。

【0176】

好ましくは、化学的架橋剤は、化学的架橋剤が存在しない以外は同一条件下の突然変異毒素と比較して、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性を少なくとも約２ｌｏｇ_１０の低下、より好ましくは約３ｌｏｇ_１０の低下、最も好ましくは約４ｌｏｇ_１０またはそれより多く低下させる。野生型毒素と比較して、化学的架橋剤は、好ましくは、突然変異毒素の細胞毒性を少なくとも約５ｌｏｇ_１０の低下、約６ｌｏｇ_１０の低下、約７ｌｏｇ_１０の低下、約８ｌｏｇ_１０の低下またはそれより多く低下させる。

【0177】

別の好ましい実施形態では、化学的に失活させた突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、たとえば本明細書中に記載のものなどのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイによって測定して、約５０μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約５０μｇ／ｍｌ、約１００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約１００μｇ／ｍｌ、約２００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約２００μｇ／ｍｌ、約３００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約３００μｇ／ｍｌ、約４００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約４００μｇ／ｍｌ、約５００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約５００μｇ／ｍｌ、約６００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約６００μｇ／ｍｌ、約７００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約７００μｇ／ｍｌ、約８００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約８００μｇ／ｍｌ、約９００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約９００μｇ／ｍｌ、約１０００μｇ／ｍｌ超もしくは少なくとも約１０００μｇ／ｍｌ、またはそれより高いＥＣ_５０値を示す。

【0178】

突然変異毒素を化学的架橋剤と接触させるための反応条件は当業者の技術範囲内にあり、条件は使用する薬剤に応じて変動し得る。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、機能的エピトープを保持し、対応する野生型毒素と比較して突然変異毒素の細胞毒性を減少させつつ、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素ポリペプチドを化学的架橋剤と接触させるための最適な反応条件を発見した。

【0179】

好ましくは、突然変異毒素を架橋剤と接触させるための反応条件を選択し、突然変異毒素は、約０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０ｍｇ／ｍｌの最小濃度から最大で約３．０、２．５、２．０、１．５、または１．２５ｍｇ／ｍｌを有する。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、反応のための突然変異毒素の適切な濃度の範囲を定義し得る。最も好ましくは、突然変異毒素は反応のために約１．０〜１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0180】

一実施形態では、反応で使用する薬剤は、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、または５０ｍＭの最小濃度、および約１００ｍＭ、９０ｍＭ、８０ｍＭ、７０ｍＭ、６０ｍＭ、または５０ｍＭの最大濃度を有する。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、反応のための化学的薬剤の適切な濃度の範囲を定義し得る。

【0181】

薬剤にホルムアルデヒドが含まれる好ましい実施形態では、使用する濃度は、好ましくは約２ｍＭ〜８０ｍＭ、最も好ましくは約４０ｍＭの任意の濃度である。薬剤にＥＤＣが含まれる別の好ましい実施形態では、使用する濃度は、好ましくは約１．３ｍＭ〜約１３ｍＭ、より好ましくは約２ｍＭ〜３ｍＭ、最も好ましくは約２．６ｍＭの任意の濃度である。一実施形態では、ＥＤＣの濃度は、全反応体積に基づいて最大で５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、０．５ｇ／Ｌ、好ましくは最大で１ｇ／Ｌ、より好ましくは最大で０．５ｇ／Ｌである。

【0182】

突然変異毒素を化学的架橋剤と接触させる例示的な反応時間には、最小で約０．５、１、２、３、４、５、６、１２、２４、３６、４８、または６０時間、および最大で約１４日間、１２日間、１０日間、７日間、５日間、３日間、２日間、１日間、または１２時間、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１時間が含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な反応時間の範囲を定義し得る。

【0183】

好ましい実施形態では、突然変異毒素を化学的架橋剤と接触させるステップは、標準のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイにおいて適切なヒト細胞、たとえばＩＭＲ−９０細胞中で、架橋剤が存在しない同一の突然変異毒素と比較して突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性を少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値まで低下させるために十分な期間の間起こる。より好ましくは、反応ステップは、適切なヒト細胞中で突然変異毒素の細胞毒性を少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値まで低下させるために十分な期間よりも少なくとも２倍長い、最も好ましくは少なくとも３倍長い、またはそれより長い時間の間実施する。一実施形態では、反応時間は約１６８時間（すなわち７日間）を超えない。

【0184】

たとえば、薬剤にホルムアルデヒドが含まれる一実施形態では、好ましくは、標準のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイにおいて適切なヒト細胞、たとえばＩＭＲ−９０細胞中で、架橋剤が存在しない同一の突然変異毒素と比較して突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性を少なくとも約１０００μｇ／ｍｌのＥＣ_５０値まで低下させるために十分な例示的な期間であると示された約１２時間の間、突然変異毒素を薬剤と接触させる。より好ましい一実施形態では、十分な反応期間よりも少なくとも約３倍長い約４８時間の間、反応を実施する。そのような実施形態では、反応時間は好ましくは約７２時間を超えない。

【0185】

薬剤にＥＤＣが含まれる別の実施形態では、好ましくは、約０．５時間、より好ましくは少なくとも約１時間、または最も好ましくは約２時間の間、突然変異毒素を薬剤と接触させる。一実施形態では、最大で約５時間、好ましくは最大で約３時間、より好ましくは最大で約２時間の間、突然変異毒素をＥＤＣと接触させる。そのような実施形態では、反応時間は好ましくは約６時間を超えない。

【0186】

突然変異毒素を化学的架橋剤と接触させる例示的なｐＨには、最小で約ｐＨ５．５、６．０、６．５、７．０、または７．５、および最大で約ｐＨ８．５、８．０、７．５、７．０、または６．５が含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切なｐＨの範囲を定義し得る。好ましくは、反応はｐＨ６．５〜７．５、好ましくはｐＨ７．０で起こる。

【0187】

突然変異毒素を化学的架橋剤と接触させる例示的な温度には、最小で約２℃、４℃、１０℃、２０℃、２５℃、または３７℃、および約４０℃、３７℃、３０℃、２７℃、２５℃、または２０℃の最大温度が含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な反応温度の範囲を定義し得る。好ましくは、反応は約２０℃〜３０℃、最も好ましくは約２５℃で起こる。

【0188】

上述の免疫原性組成物には１つの突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（ＡまたはＢ）が含まれ得る。したがって、免疫原性組成物は、調製物またはキット中で別々のバイアル（たとえば、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａが含まれる組成物のための別個のバイアルおよび突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂが含まれる組成物のための別個のバイアル）を占有することができる。免疫原性組成物は、同時、順次、または別々の使用を意図し得る。

【0189】

別の実施形態では、上述の免疫原性組成物には、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（ＡおよびＢ）がどちらも含まれ得る。記載した突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂの任意の組合せを、免疫原性組成物のために組み合わせ得る。したがって、免疫原性組成物を、単一のバイアル（たとえば、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡが含まれる組成物および突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢが含まれる組成物をどちらも含有する単一のバイアル）中で組み合わせることができる。好ましくは、免疫原性組成物には突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡおよび突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢが含まれる。

【0190】

たとえば、一実施形態では、免疫原性組成物には配列番号４および配列番号６が含まれ、配列番号４および配列番号６のそれぞれの少なくとも１つのアミノ酸が化学的に架橋結合されている。別の実施形態では、免疫原性組成物には、配列番号４または配列番号７が含まれる突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ、および配列番号６または配列番号８を含む突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂが含まれ、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素のそれぞれの少なくとも１つのアミノ酸が化学的に架橋結合されている。

【0191】

別の実施形態では、免疫原性組成物には、配列番号４、配列番号８４、および配列番号８３から選択される任意の配列、および配列番号６、配列番号８６、および配列番号８５から選択される任意の配列が含まれる。別の実施形態では、免疫原性組成物には、配列番号８４および配列番号８６が含まれる免疫原性組成物が含まれる。別の実施形態では、免疫原性組成物には、配列番号８３および配列番号８５が含まれる免疫原性組成物が含まれる。別の実施形態では、免疫原性組成物には、配列番号８４、配列番号８３、配列番号８６、および配列番号８５が含まれる。

【0192】

別の実施形態では、免疫原性組成物には、配列番号１〜配列番号７６１から選択される任意の１つの配列を有するポリペプチド、および配列番号１〜配列番号７６１から選択される任意の１つの配列を有する第２のポリペプチドが含まれる。

【0193】

本発明の組成物のいずれか、たとえば突然変異毒素Ａおよび／または突然変異毒素Ｂが含まれる免疫原性組成物は、治療効果のために様々な比または量で組み合わせることができることを理解されたい。たとえば、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡおよび突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢは、０．１：１０〜１０：０．１のＡ：Ｂの範囲の比で免疫原性組成物中に存在することができる。別の実施形態では、たとえば、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢおよび突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡは、０．１：１０〜１０：０．１のＢ：Ａの範囲の比で免疫原性組成物中に存在することができる。好ましい一実施形態では、比は、組成物中に突然変異体ＴｃｄＡの総量よりも突然変異体ＴｃｄＢの総量の方が多く含まれるようなものである。

【0194】

一態様では、免疫原性組成物は中和抗体またはその結合断片と結合することができる。好ましくは、中和抗体またはその結合断片は、本明細書中以下に記載したものである。例示的な一実施形態では、免疫原性組成物は抗毒素Ａ抗体またはその結合断片と結合することができ、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片には、配列番号３６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖および配列番号３７のアミノ酸配列を有する可変重鎖が含まれる。たとえば、免疫原性組成物には、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡ、配列番号４、または配列番号７が含まれ得る。別の例として、免疫原性組成物には配列番号８４または配列番号８３が含まれ得る。

【0195】

別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物は抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片と結合することができ、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片には、Ｂ８−２６の可変軽鎖およびＢ８−２６の可変重鎖が含まれる。たとえば、免疫原性組成物には、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ、配列番号６、または配列番号８が含まれ得る。別の例として、免疫原性組成物には配列番号８６または配列番号８５が含まれ得る。

【0196】

組換え細胞
別の態様では、本発明は、組換え細胞またはその子孫に関する。一実施形態では、細胞またはその子孫には、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡおよび／または突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢをコードしているポリヌクレオチドが含まれる。

【0197】

別の実施形態では、組換え細胞またはその子孫には、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって初期設定のギャップ重みづけを使用して最適アラインメントした場合に、配列番号４、配列番号６、配列番号７、または配列番号８のいずれかと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有するポリペプチドをコードしている核酸配列が含まれる。一実施形態では、組換え細胞またはその子孫には、配列番号１から配列番号７６１のいずれかと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有するポリペプチドをコードしている核酸配列が含まれる。

【0198】

別の実施形態では、組換え細胞またはその子孫には、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって初期設定のギャップ重みづけを使用して最適アラインメントした場合に、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８３、または配列番号８５のいずれかと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有するポリペプチドをコードしている核酸配列が含まれる。

【0199】

さらなる一実施形態では、組換え細胞またはその子孫には、プログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって初期設定のギャップ重みづけを使用して最適アラインメントした場合に、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７のいずれかと少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性を有する核酸配列が含まれる。組換え細胞は、本発明のポリペプチドの組換え産生において有用な任意の細胞、たとえば原核生物または真核生物に由来し得る。好ましくは、組換え細胞は、約５０００を超える、６０００、好ましくは約７０００、またはより好ましくは約８０００個以上のヌクレオチドの異種核酸配列を発現させるために適した任意の細胞に由来する。原核宿主細胞は任意のグラム陰性またはグラム陽性細菌であり得る。例示的な実施形態では、原核宿主細胞は、毒素および／または胞子をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠く。

【0200】

グラム陰性細菌には、それだけには限定されないが、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、およびウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｏｋａｓｍａ）が含まれる。たとえば、本明細書に参照により組み込まれている米国特許出願公開第２０１００１３７６２号、段落［０２０１］〜［０２３０］に記載する、組換え細胞は蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）細胞に由来し得る。

【0201】

グラム陽性細菌には、それだけには限定されないが、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバチルス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。好ましくは、細胞はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞に由来する。

【0202】

本発明者らは、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠く野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の株を同定した。内在性の毒素ＡおよびＢの遺伝子を欠く株には以下の株が含まれ、これらはＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手可能である：シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１３５１（ＡＴＣＣ ４３５９３（商標））、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）３２３２（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８０１（商標））、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７３２２（ＡＴＣＣ ４３６０１（商標））、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）５０３６（ＡＴＣＣ ４３６０３（商標））、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）４８１１（ＡＴＣＣ ４３６０２（商標））、およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１１１８６（ＡＴＣＣ ７０００５７（商標））。

【0203】

したがって、一実施形態では、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞は本明細書中に記載の株に由来する。好ましくは、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞またはその子孫は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１３５１、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）５０３６、およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１１１８６からなる群に由来する。より好ましくは、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞またはその子孫はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１１１８６細胞に由来する。

【0204】

好ましい実施形態では、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞またはその子孫の胞子形成遺伝子は失活している。胞子は、感染性であり、耐性が高く、宿主外の好気性環境中でシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の持続を促進する場合がある。また、胞子は、抗微生物治療中に宿主内でのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の生存にも寄与し得る。したがって、胞子形成遺伝子を欠くシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が、哺乳動物に投与するために安全な免疫原性組成物を生成するために有用である。さらに、そのような細胞の使用は、製造中の安全性、たとえば、施設、将来の製品、およびスタッフを保護するための安全性を容易にする。

【0205】

標的失活させる胞子形成遺伝子の例には、とりわけ、ｓｐｏ０Ａ、ｓｐｏＩＩＥ、σ^Ｅ、σ^Ｇ、およびσ^Ｋが含まれる。好ましくは、ｓｐｏ０Ａ遺伝子が失活されている。

【0206】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子形成遺伝子を失活させる方法は当技術分野で知られている。たとえば、胞子形成遺伝子は、抗生物質耐性マーカーなどの選択マーカーを標的挿入することによって失活させ得る。たとえば、Ｈｅａｐら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１０ Ｊａｎ；８０（１）：４９〜５５、Ｈｅａｐら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００７ Ｓｅｐｔ；７０（３）：４５２〜４６４、およびＵｎｄｅｒｗｏｏｄら、Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００９ Ｄｅｃ；１９１（２３）：７２９６〜３０５を参照されたい。また、たとえば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＭｉｎｔｏｎら、ＷＯ２００７／１４８０９１号、題名「ＤＮＡ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、ページ３３〜６６、または対応する米国公開ＵＳ ２０１１０１２４１０９ Ａ１号、段落［００１３７］〜［０２２７］も参照されたい。

【0207】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞の培養に関する組成物
本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の培養およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の産生において使用するための組成物および方法にさらに関する。一態様では、本発明は、窒素源およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を含む培養培地に関する。

【0208】

適切な培養培地窒素源には、ＨＹ−ＳＯＹ（Ｑｕｅｓｔ）、ＡＭＩ−ＳＯＹ（Ｑｕｅｓｔ）、ＮＺ−ＳＯＹ（Ｑｕｅｓｔ）、ＮＺ−ＳＯＹ ＢＬ４（Ｑｕｅｓｔ）、ＮＺ−ＳＯＹ ＢＬ７（Ｑｕｅｓｔ）、ＳＨＥＦＴＯＮＥ Ｄ（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ）、ＳＥ５０Ｍ（ＤＭＶ）、ＳＥ５０（ＤＭＶ）、ＳＥ％）ＭＫ（ＤＭＶ）、ＳＯＹ ＰＥＰＴＯＮＥ（Ｇｉｂｃｏ）、ＢＡＣＴＯ−ＳＯＹＴＯＮ（Ｄｉｆｃｏ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ ２２０７（ＡＤＭ）、ＢＡＫＥＳ ＮＵＴＲＩＳＯＹ（ＡＤＭ）、ＮＵＴＲＩＳＯＹ ＦＬＯＵＲ、ダイズ粉末、ＢＡＣＴＯ−ＹＥＡＳＴ ＥＸＴＲＡＣＴ（Ｄｉｆｃｏ）、ＹＥＡＳＴ ＥＸＴＲＡＣＴ（Ｇｉｂｃｏ）、ＨＹ−ＹＥＳＴ ４１２酵母抽出物（Ｑｕｅｓｔ）、ＨＹ−ＹＥＳＴ ４４１酵母抽出物（Ｑｕｅｓｔ）、ＨＹ−ＹＥＳＴ ４４４酵母抽出物（Ｑｕｅｓｔ）、ＨＹ−ＹＥＳＴ ４５５酵母抽出物（Ｑｕｅｓｔ）、ＢＡＣＴＯ−ＭＡＬＴ ＥＸＴＲＡＣＴ（Ｄｉｆｃｏ）、コーンスティープ、およびＰＲＯＦＬＯ（Ｔｒａｄｅｒｓ）が含まれる。

【0209】

一態様では、本発明は、植物加水分解物およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる培養培地に関する。任意の植物加水分解物が適切であり得る。適切な植物加水分解物の例は、綿実加水分解物、エンドウマメ加水分解物、およびダイズ加水分解物である。

【0210】

好ましい実施形態では、植物加水分解物はダイズ加水分解物である。好ましくは、ダイズ加水分解物はＳＥ５０ＭＫ（Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ−Ｃａｍｐａｉｇｎａ）である。本発明において使用し得るダイズ製品およびその供給源の他の例には、Ｔｅｋｎｉｓｃｉｅｎｃｅ：ダイズペプトンＡ１、ダイズペプトンＡ２、ダイズペプトンＡ３、植物ペプトンＥ１、植物ペプトンＥＴ１、およびコムギペプトンＥ１、Ｑｕｅｓｔ：ＨＹ−Ｓｏｙ、ＨＹ−Ｓｏｙ Ｔ、ＡＭＩ−Ｓｏｙ、ＮＺ−Ｓｏｙ、ＮＺ−Ｓｏｙ ＢＬＡ、およびＮＺ−Ｓｏｙ ＢＬ７、ＤＭＶ：ＳＥ５０Ｍ、ＳＥ７０Ｍ、ＳＥ５０ＭＫ、ＳＥ５０ＭＫ−ＮＫ（Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ−Ｃａｍｐａｉｇｎａ）、ＷＧＥ８０ＢＴ、ＷＧＥ８０Ｍ、ＣＮＥ５０Ｍ、およびＳＥ７０ＢＴ、Ｍａｒｃｏｒ：ダイズペプトンタイプＡＢ、ダイズペプトンタイプＡＣ、ダイズペプトンタイプＳＬ、ダイズペプトンタイプＩＩ、およびダイズペプトンタイプＦ、Ｏｘｏｉｄ：植物ペプトンおよび植物ペプトンＮｏ．１、Ｇｉｂｃｏ：ダイズペプトン、ならびにＤｉｆｃｏ：Ｂａｃｓｏｙｔｏｎｅが含まれる。

【0211】

培養培地中の植物加水分解物の濃度は、たとえば、５、１０、２０、３０、４０、または５０ｇ／Ｌの最小値から２００、１５０、１００、または７５ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の植物加水分解物の濃度は、１０〜５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは約３０ｇ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中の植物加水分解物の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0212】

別の態様では、本発明は、酵母抽出物（たとえば窒素源として）およびクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる培養培地に関する。最も好ましくは、酵母抽出物はＨＹ ＹＥＳＴ４１２（Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）である。

【0213】

培養培地中の酵母抽出物の濃度は、たとえば、５、１０、２０、３０、４０、または５０ｇ／Ｌの最小値から２００、１５０、１００、または７５ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の酵母抽出物の濃度は、１０〜５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは約２０ｇ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中の酵母抽出物の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0214】

本発明者らは、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の成長は、植物加水分解物が含まれ酵母抽出物が含まれない培養培地、および酵母抽出物が含まれ植物加水分解物が含まれない培養培地中で支持できることを発見した。しかし、植物加水分解物および酵母抽出物がどちらも含まれる培養培地からもたらされる細胞の培養および／または毒素の産生は、植物加水分解物が含まれ酵母抽出物が存在しない培養培地からもたらされる収率よりも高く、かつ酵母抽出物が含まれ植物加水分解物が存在しない培養培地からもたらされる収率よりも高いことが観察された。

【0215】

したがって、本発明者らは、植物加水分解物および酵母抽出物の組合せが最大限のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の成長および／または毒素の産生の支持を助けることを発見した。一態様では、本発明は、植物加水分解物、酵母抽出物、およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる培養培地に関する。植物加水分解物は、上述の当技術分野で知られている任意の適切な植物加水分解物であることができる。好ましくは、加水分解物はダイズ加水分解物である。より好ましくは、ダイズ加水分解物はＳＥ５０ＭＫ（Ｆｒｉｅｓｌａｎｄ−Ｃａｍｐａｉｇｎａ）である。好ましい実施形態では、酵母抽出物はＨＹ ＹＥＳＴ４１２である。

【0216】

一実施形態では、培地には炭素源が含まれない。本発明者らは、ダイズ加水分解物／酵母抽出物が含まれ、炭素源が存在しない培養培地は２〜３のＯＤ_６００値および１０〜１５ｍｇ／Ｌの毒素産生収率を達成することを観察した。

【0217】

しかし、驚くべきことに、炭素源が含まれる培養培地は、炭素源が存在しない培地と比較して、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞の培養および毒素の産生を増加させることが観察された。さらに、本発明者らは、驚くべきことに、突然変異毒素の産生は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を嫌気性条件下で、炭素源を含めて、ダイズ加水分解物が含まれる培地の存在下で培養することによって著しく阻害されないことを発見した。したがって、好ましい実施形態では、培地には炭素源がさらに含まれる。より好ましくは、一実施形態では、培養培地には炭素源が含まれ、培地には組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞がさらに含まれる。さらにより好ましくは、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞には構成的プロモーターが含まれる。好ましい実施形態では、プロモーターはクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシン（ｆｄｘ）プロモーターである。別の好ましい実施形態では、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞には、たとえばグルコース抑制によって負に調節され得る調節性の染色体プロモーターが含まれない。最も好ましい実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｌｅ）細胞は上述の組換え細胞またはその子孫である。任意の炭素源を培養培地中で使用し得る。適切な炭素源には、グルコース、デキストロース、マンニトール、フルクトース、および／またはマンノースが含まれる。好ましくは、培養培地中の炭素源はグルコースである。好ましい実施形態では、培養培地にはアラビノース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、グリセロール、ラムノース、および／またはガラクトースが含まれない。

【0218】

培養培地中の炭素源（たとえば、グルコース、マンニトール、フルクトース、および／またはマンノース）の濃度は、たとえば、１、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、または６０ｇ／Ｌの最小値から１５０、１００、９０、８０、７５、７０、５０、４０、または３０ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の炭素源の濃度は５〜７０ｇ／Ｌである。一実施形態では、培養培地中の炭素源の濃度は約１０ｇ／Ｌである。別の実施形態では、培養培地中の炭素源の濃度は１０ｇ／Ｌより高い。別の実施形態では、培養培地中の炭素源（たとえばグルコース）の濃度は４５〜７５ｇ／Ｌ、好ましくは５５〜６５ｇ／Ｌ、より好ましくは５５〜６５ｇ／Ｌである。別の実施形態では、培養培地中の炭素源の濃度は約６０ｇ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中の炭素源の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0219】

一実施形態では、培養培地にはクロラムフェニコール誘導体がさらに含まれる。例示的なクロラムフェニコール誘導体には、チアムフェニコール、フロルフェニコール、コハク酸クロラムフェニコール、およびフロラムフェニコール（ｆｌｕｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）のうちの任意の１つが含まれる。好ましくは、培養培地にはチアムフェニコールが含まれる。機構または理論に束縛されずに、クロラムフェニコール誘導体は、クロラムフェニコール誘導体が存在しない培養培地と比較して、発酵中にプラスミド損失を予防することならびに細胞および／または毒素の産生を増加させることを助けると考えられている。

【0220】

培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、たとえば、５、１０、１５、２０、または３０ｍｇ／Ｌの最小値から１００、７５、５０、または４０ｍｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。別の実施形態では、培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、たとえば、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、または５ｇ／Ｌの最小値から１０ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、５〜２０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは約１５ｍｇ／Ｌである。別の好ましい実施形態では、培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、最も好ましくは約３ｇ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0221】

一実施形態では、培養培地には、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはプルロニックポリオールなどの細胞保護剤がさらに含まれる。一実施形態では、培養培地には、ポリエチレングリコール２０００（ＰＰＧ２０００）などのポリエチレングリコールが含まれる。

【0222】

培養培地中のポリエチレングリコールなどの細胞保護剤の濃度は、たとえば、０．０１、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、または１ｍｌ／Ｌの最小値から２、１、０．９０、０．８０、０．７０、０．６０、０．５０、０．４０、０．３０、０．２０ｍｌ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中のポリエチレングリコールなどの細胞保護剤の濃度は、０．０１ｍｌ／Ｌ〜０．０．５０、最も好ましくは約０．２５ｍｌ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中の細胞保護剤の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0223】

好ましい実施形態では、培養培地には植物加水分解物、酵母抽出物、および炭素源が含まれ、植物加水分解物はダイズ加水分解物であり、酵母抽出物はＨＹ ＹＥＳＴ ４１２（Ｋｅｒｒｙ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であり、炭素源はグルコース、マンニトール、フルクトース、および／またはマンノースである。最も好ましい実施形態では、培養培地には、ダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫ、ＨＹ ＹＥＳＴ４１２酵母抽出物、グルコース、およびチアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。

【0224】

好ましい一実施形態では、培養培地には、３０ｇ／Ｌのダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫ、２０ｇ／ＬのＨＹ ＹＥＳＴ４１２酵母抽出物、１０ｇ／Ｌのグルコース、および１５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。好ましい一実施形態では、培養培地には、約３０ｇ／Ｌのダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫ、約２０ｇ／ＬのＨＹ ＹＥＳＴ４１２酵母抽出物、約１０ｇ／Ｌのグルコース、および約１５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。培養培地には、約０．２５ｍｌ／ＬのＰＰＧ２０００がさらに含まれ得る。別の実施形態では、培養培地にはデキストロースがさらに含まれ得る。

【0225】

別の好ましい実施形態では、培養培地には、３０ｇ／Ｌのダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫ、２０ｇ／ＬのＨＹ ＹＥＳＴ４１２酵母抽出物、６０ｇ／Ｌのグルコース、および１５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。別の好ましい実施形態では、培養培地には、約３０ｇ／Ｌのダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫ、約２０ｇ／ＬのＨＹ ＹＥＳＴ４１２酵母抽出物、約６０ｇ／Ｌのグルコース、および約１５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。培養培地には、約０．２５ｍｌ／ＬのＰＰＧ２０００がさらに含まれ得る。別の実施形態では、培養培地にはデキストロースがさらに含まれ得る。

【0226】

一実施形態では、培養培地にはポリプロピレングリコール２０００（ＰＰＧ２０００）がさらに含まれる。培養培地には、約０．０５ｍＬのＰＰＧ２０００〜約１ｍｌのＰＰＧ２０００／Ｌの培地が含まれていてよく、好ましくは、培養培地には、約０．２５ｍｌ／ＬのＰＰＧ２０００／Ｌの培地が含まれる。

【0227】

本明細書中に記載の培養培地は、任意のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞の培養に適切であり得る。一実施形態では、細胞は遺伝子改変されていない。別の実施形態では、細胞は、上述の組換え細胞またはその子孫（ｐｒｏｇｒｅｎｙ）などのように、遺伝子改変されている。一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞は、毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠く。好ましい実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞はＶＰＩ１１１８６に由来する。

【0228】

別の実施形態では、細胞には構成的プロモーターが含まれる。好ましい実施形態では、プロモーターはクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシン（ｆｄｘ）プロモーターである。別の好ましい実施形態では、細胞には、たとえばグルコース抑制によって負に調節され得る調節性の染色体プロモーターが含まれない。最も好ましい実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞は上述の組換え細胞またはその子孫である。

【0229】

また、本発明者らは、モノクローナル抗体培地がシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の成長を支持することも発見した。したがって、一態様では、本発明は、モノクローナル抗体培地が含まれる培養培地に関する。一実施形態では、培地はＳＦＭ４ＭＡｂ（商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。培地は約１０のＯＤ_６００値を与えることを示し、毒素産生収率は約４０ｍｇ／Ｌであった。

【0230】

一実施形態では、培養培地のｐＨは、たとえば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０の最小値から８．０、７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、または７．１の最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地のｐＨは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５である。最も好ましくは、ｐＨは７．０である。

【0231】

適切なｐＨ滴定剤は当技術分野で知られており、たとえば、ＮＨ_４ＯＨ、Ｎａ_２ＣＯ_３、およびＮａＯＨが含まれる。好ましくは、ｐＨ滴定剤はＮａＯＨである。

【0232】

培養培地には、Ｎａ_２ＨＰＯ_４、ＫＨ_２ＰＯ_４などのリン酸含有成分が含まれ得る。しかし、好ましい実施形態では、培養培地にはリン酸含有成分が含まれない。

【0233】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞の培養に関する方法
別の態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を培養する方法に関する。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を上述の培地中で培養することが含まれる。

【0234】

一実施形態では、本発明の方法によるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の成長は、少なくとも２つの段階、すなわち種の成長および発酵で進行する。種培養は、保存培養、たとえば作業細胞バンクからの接種によって最初に成長させる。種は、第２の種培養に接種するためまたは比較的大きな発酵培養に接種するためのどちらかに使用する。当技術分野で理解されているように、使用する種培養の数は、たとえば発酵ステップの大きさおよび体積に依存し得る。

【0235】

したがって、一態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を培養する方法に関する。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を第１の培養培地中、細胞の成長を容易にする条件下で培養することと、前記第１の培養の後に、第２の培養培地に前記第１の培地のすべてまたは一部分を接種することと、前記接種した第２の培地を、細胞の成長を容易にする条件下で培養することとが含まれる。方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を前記第２の培地から単離することがさらに含まれ得る。一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を、種培養と呼ばれる第１の培養培地中で成長させる。一実施形態では、種培養には、上述の培養培地と培地中で成長させた保存培養からの接種とが含まれる。

【0236】

種増殖期（または段階）は、一般に、発酵段階の接種材料として使用できるように微生物の量を保存培養からスケールアップさせるために実施する。また、種増殖期は、保存培養中の比較的休眠状態の微生物を活性化させ、活発に成長する培養物とすることを可能にするためにも実施することができる。

【0237】

発酵培養に接種するために使用する生細胞の体積および量は、保存培養から採取した場合よりも活発に成長する培養物（たとえば種培養）から採取した場合に、より正確に制御することができる。

【0238】

さらに、複数（たとえば２つまたは３つ）の種増殖期を使用して、発酵培地に接種するためのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の量をスケールアップすることができる。あるいは、所望する場合は、発酵段階中のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の成長は、保存培養から直接接種によって直接進行させることができる。

【0239】

第１の培養培地には、上述の培養培地が含まれる。たとえば、一実施形態では、第１の培養培地には、植物加水分解物およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる。好ましくは、植物加水分解物はダイズ加水分解物、最も好ましくはダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫである。別の実施形態では、第１の培養培地には、酵母抽出物およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる。好ましくは、酵母抽出物はＨＹ ＹＥＳＴ４１２である。さらなる実施形態では、第１の培養培地には、植物加水分解物および酵母抽出物が含まれる。さらなる一実施形態では、第１の培養培地には、炭素源がさらに含まれる。好ましくは、炭素源はグルコースである。一実施形態では、培養培地には、炭素源が含まれる場合は組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれ、組換え細胞には構成的プロモーターが含まれる。別の実施形態では、第１の培養培地には、クロラムフェニコール誘導体がさらに含まれる。好ましくは、培養培地にはチアムフェニコールが含まれる。

【0240】

第１の培養培地（たとえば種培養培地）中の植物加水分解物の濃度は、たとえば、５、１０、２０、３０、４０、または５０ｇ／Ｌの最小値から２００、１５０、１００、または７５ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の植物加水分解物の濃度は１０〜５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは約３０ｇ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中の植物加水分解物の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0241】

第１の培養培地（たとえば種培養培地）中の酵母抽出物の濃度は、たとえば、５、１０、２０、３０、４０、または５０ｇ／Ｌの最小値から２００、１５０、１００、または７５ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の酵母抽出物の濃度は１０〜５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは約２０ｇ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中の酵母抽出物の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0242】

第１の培養培地（たとえば種培養培地）中の炭素源の濃度は、たとえば、１、５、１０、１５、または２０ｇ／Ｌの最小値から１００、７５、５０、４０、または３０ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の炭素源の濃度は５〜２０ｇ／Ｌ、最も好ましくは約１０ｇ／Ｌである。

【0243】

一実施形態では、培養培地には、チアムフェニコール、フロルフェニコール、コハク酸クロラムフェニコール、およびフロラムフェニコールからなる群から選択されるクロラムフェニコール誘導体がさらに含まれる。好ましくは、培養培地にはチアムフェニコールが含まれる。第１の培養培地（たとえば種培養培地）中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、たとえば、５、１０、１５、２０、または３０ｍｇ／Ｌの最小値から１００、７５、５０、または４０ｍｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は５〜２０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは約１５ｍｇ／Ｌである。

【0244】

一実施形態では、第１の培養培地のｐＨは、たとえば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０の最小値から８．０、７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、または７．１の最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、第１の培養培地のｐＨは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５である。最も好ましくは、ｐＨは７．０である。

【0245】

好ましい実施形態では、第１の培養培地には、ダイズ加水分解物、酵母抽出物ＨＹ ＹＥＳＴ４１２、グルコース、チアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。より好ましくは、培養培地には、３０ｇ／Ｌのダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫ、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物ＨＹ ＹＥＳＴ４１２、１０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。

【0246】

発酵段階を開始させるために、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含有する種培養の一部または全部を使用して発酵培養培地に接種し得る。発酵培地に接種するために使用する種培養の適切な濃度は当業者によって決定することができ、たとえば０．１〜１０％の範囲であることができる。具体的な例として、０．５、１、５、５．５、６、６．２５、６．５、７、８、９、１０％の濃度を使用することができる。

【0247】

発酵を使用して、大スケールの嫌気性環境下で最大量の細胞を産生させ得る。一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を発酵培養として成長させる。一実施形態では、発酵培養は培地中で成長させた種培養から接種した。

【0248】

第２の培養培地には、上述の培養培地が含まれる。たとえば、一実施形態では、第２の培養培地には、植物加水分解物およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる。好ましくは、植物加水分解物はダイズ加水分解物、最も好ましくはダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫである。別の実施形態では、第２の培養培地には、酵母抽出物およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれる。好ましくは、酵母抽出物はＨＹ ＹＥＳＴ４１２である。さらなる実施形態では、第２の培養培地には、植物加水分解物および酵母抽出物が含まれる。さらなる一実施形態では、第２の培養培地には、炭素源がさらに含まれる。好ましくは、炭素源はグルコースである。一実施形態では、培養培地には、炭素源が含まれる場合は組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞が含まれ、組換え細胞には構成的プロモーターが含まれる。別の実施形態では、第２の培養培地には、クロラムフェニコール誘導体がさらに含まれる。好ましくは、培養培地にはチアムフェニコールが含まれる。

【0249】

第２の培養培地中の植物加水分解物の濃度は、たとえば、５、１０、２０、３０、４０、または５０ｇ／Ｌの最小値から２００、１５０、１００、または７５ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の植物加水分解物の濃度は、１０〜５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは約３０ｇ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中の植物加水分解物の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0250】

第２の培養培地中の酵母抽出物の濃度は、たとえば、５、１０、２０、３０、４０、または５０ｇ／Ｌの最小値から２００、１５０、１００、または７５ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の酵母抽出物の濃度は、１０〜５０ｇ／Ｌ、最も好ましくは約２０ｇ／Ｌである。

【0251】

第２の培養培地中の炭素源の濃度は、たとえば、１０、２０、３０、４０、５０、または６０ｇ／Ｌの最小値から１５０、１００、９０、８０、または７０ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中の炭素源の濃度は、５０〜７０ｇ／Ｌ、最も好ましくは約６０ｇ／Ｌである。一実施形態では、第２の培養培地中の炭素源の濃度は、第１の培養培地中の炭素源の濃度よりも高い。本明細書中に記載の培養培地中の炭素源の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0252】

一実施形態では、培養培地には、チアムフェニコール、フロルフェニコール、コハク酸クロラムフェニコール、およびフロラムフェニコールからなる群から選択されるクロラムフェニコール誘導体がさらに含まれる。好ましくは、培養培地にはチアムフェニコールが含まれる。第２の培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、たとえば、５、１０、１５、２０、または３０ｍｇ／Ｌの最小値から１００、７５、５０、または４０ｍｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。別の実施形態では、培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、たとえば、０．５ｇ／Ｌ、１ｇ／Ｌ、１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、または５ｇ／Ｌの最小値から１０ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、５〜２０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは約１５ｍｇ／Ｌである。別の好ましい実施形態では、培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は、１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは１ｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ、最も好ましくは約３ｇ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中のクロラムフェニコール誘導体の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0253】

一実施形態では、培養培地には、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはプルロニックポリオールなどの細胞保護剤がさらに含まれる。一実施形態では、培養培地には、ポリエチレングリコール２０００（ＰＰＧ２０００）などのポリエチレングリコールが含まれる。

【0254】

培養培地中のポリエチレングリコールなどの細胞保護剤の濃度は、たとえば、０．０１、０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、または１ｍｌ／Ｌの最小値から２、１、０．９０、０．８０、０．７０、０．６０、０．５０、０．４０、０．３０、０．２０ｍｌ／Ｌの最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、培養培地中のポリエチレングリコールなどの細胞保護剤の濃度は、０．０１ｍｌ／Ｌ〜０．０．５０、最も好ましくは約０．２５ｍｌ／Ｌである。本明細書中に記載の培養培地中の細胞保護剤の濃度は培養培地の全体積に基づき得る。

【0255】

一実施形態では、第２の培養培地のｐＨは、たとえば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０の最小値から８．０、７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、または７．１の最大値の間の範囲であることができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、第２の培養培地のｐＨは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５である。最も好ましくは、ｐＨは７．０である。

【0256】

好ましい実施形態では、第２の培養培地には、ダイズ加水分解物、酵母抽出物ＨＹ ＹＥＳＴ４１２、グルコース、チアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。より好ましくは、培養培地には、３０ｇ／Ｌのダイズ加水分解物、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物ＨＹ ＹＥＳＴ４１２、６０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコール、ｐＨ７が含まれる。

【0257】

一実施形態では、培養を嫌気性条件下で実施する。一実施形態では、本発明の方法の培養ステップ（種および発酵の両方）を嫌気性条件下で実施するが、これらの段階はいずれも好気性条件を使用してもよい。

【0258】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）などの細菌の嫌気性培養の手法は当技術分野で知られており、たとえば、窒素ガスまたは窒素と水素ガスとの混合物を用いることができる。ガスは、発酵中に泡として培地に通す（たとえばスパージング）か、または培養チャンバ内の液体の上部の領域（たとえばチャンバのヘッドスペース）を通し得る。

【0259】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞の培養は、嫌気性チャンバ内で、約３０±１℃、３１±１℃、３２±１℃、３３±１℃、３４±１℃、３５±１℃、３６±１℃、３７±１℃、３８±１℃、または３９±１℃、好ましくは約３７±１℃で実施することができる。培養は、たとえば、１、２、３、４、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４時間の最小値から９日間、８日間、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、４８時間、もしくは３６時間、または２４時間の間の最大値の範囲の時間で実施することができる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。好ましい実施形態では、細胞の培養は１１〜４８時間、最も好ましくは約２４時間起こる。別の実施形態では、細胞の培養は５〜２５時間、１０〜２０時間、好ましくは約１５時間起こる。成長は培地の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を測定することによって監視することができる。

【0260】

一実施形態では、この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を前記培地から単離することがさらに含まれる。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素は、既知のタンパク質精製方法を使用して培養物から単離および／または精製することができる。その後、精製毒素をたとえば化学的失活処理によって失活させることができる。

【0261】

代替の一態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を培養する方法に関する。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞をモノクローナル抗体培地中で培養することが含まれる。

【0262】

別の態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を産生させる方法に関する。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を上述の培地中、毒素の産生を可能にする条件下で培養することが含まれる。この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を培地から単離することがさらに含まれる。

【0263】

一実施形態では、この方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を第１の培地中、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の成長を容易にする条件下で培養することと、前記培養の後に、第２の培地に、前記第１の培地のすべてまたは一部分を接種することと、前記接種した第２の培地を、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の成長および毒素産生を容易にする条件下で培養することと、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を前記第２の培地から単離することとが含まれる。一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が含まれる第１または第２の培地の培養は、嫌気性条件下で実施する。

【0264】

一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を連続培養系中で培養する。別の実施形態では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を灌流培養中で培養する方法に関する。驚くべきことに、本発明者らは、突然変異毒素を発現する組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞の培養は嫌気性連続培養中および嫌気性灌流培養中で成功し得ることを発見した。連続系および／または灌流系の一利点は、新鮮な培地を連続的に加え得ることである。さらに、系内の細胞生存度を維持しながら、産生からの毒素副産物を産生から除去し得る。

【0265】

連続培養系には、消費された培地および細胞をバイオリアクターから除去すると同時に新鮮な培地を細胞に提供することが含まれ得る。連続培養には灌流培養が含まれていてよく、流出液体は、細胞を実質的に含まないまたはバイオリアクターよりも実質的に低い細胞濃度が含まれる培養培地を含有する。灌流培養では、細胞は、たとえば、濾過、超音波濾過、遠心分離、または沈降によって保持することができる。

【0266】

一実施形態では、消費された培地を除去および濾過し、これは細胞がバイオリアクターから除去されることを防止する。フィルターは直交流フィルターおよび／または接線流フィルターであり得る。一実施形態では、前記濾過系は中空繊維フィルターを含む。別の実施形態では、遠心分離ステップによって、細胞がバイオリアクターから除去されることを防止する。別の実施形態では、超音波濾過ステップによって、細胞がバイオリアクターから除去されることを防止する。別の実施形態では、沈降系によって、細胞がバイオリアクターから除去されることを防止する。別の実施形態では、前記濾過系は平板カセットを含む。

【0267】

さらに別の実施形態では、灌流系は、細胞を保持するが所望の産物は保持しない中空繊維フィルターを含む。細胞は再循環してバイオリアクター内に戻され、所望の産物を含有する消費された培地を所望の分子量カットオフのフィルターに通す。フィルターは所望の産物を保持する。フィルターによって保持されない廃棄物は廃棄または再循環させることができる。

【0268】

突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を産生させる方法
一態様では、本発明は、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を産生させる方法に関する。一実施形態では、方法には、上述の任意の組換え細胞またはその子孫を、ポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で培養することが含まれる。この方法には、毒素を培地から単離するステップがさらに含まれる。

【0269】

別の実施形態では、方法には、組換え細胞またはその子孫を、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドを発現させるのに適切な条件下で培養することが含まれ、細胞には突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドが含まれ、突然変異体には、対応する野生型クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と比較して少なくとも１つの突然変異を有するグルコシルトランスフェラーゼドメインおよび少なくとも１つの突然変異を有するシステインプロテアーゼドメインが含まれる。一実施形態では、細胞は毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠く。

【0270】

さらなる実施形態では、方法には、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞またはその子孫を、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドを発現させるのに適切な条件下で培養することが含まれ、細胞には突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドが含まれ、細胞はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠く。

【0271】

別の態様では、本発明は、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を産生させる方法に関する。方法には、（ａ）シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を組換え大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞と接触させるステップであって、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞がシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠き、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞には突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドが含まれるステップと、（ｂ）シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞にポリヌクレオチドを導入するのに適切な条件下で培養するステップと、（ｃ）突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドを含むシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を選択するステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を、ポリヌクレオチドを発現させるのに適切な条件下で培養するステップと、（ｅ）突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を単離するステップとが含まれる。

【0272】

本発明の方法では、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞には、本明細書中に記載の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしている異種ポリヌクレオチドが含まれる。ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。例示的な一実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコドン使用頻度にコドン最適化されている。ポリヌクレオチドのコドン最適化を行う方法は当技術分野で知られている。

【0273】

一実施形態では、ポリヌクレオチドには、上述の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡをコードしているポリヌクレオチドと少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列が含まれる。一実施形態では、ポリヌクレオチドには、配列番号１〜配列番号７６１から選択される任意の１つの配列を有するポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列が含まれる。突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａをコードしている例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４４、および配列番号４５が含まれる。

【0274】

別の実施形態では、ポリヌクレオチドには、上述の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢをコードしているポリヌクレオチドと少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列が含まれる。突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂをコードしている例示的なポリヌクレオチドには、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４６、および配列番号４７が含まれる。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、または配列番号８６をコードしている。

【0275】

一実施形態では、異種ポリヌクレオチドが含まれる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしている異種ポリヌクレオチドの安定的な宿主となる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。例示的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞には、ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）Ｓｔｂｌ２（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｓｔｂｌ３（商標）化学的コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）Ｓｔｂｌ４（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＡ４３４ からなる群から選択される細胞が含まれる。好ましい実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニング宿主細胞はＤＨ５αではない。より好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニング宿主細胞はＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）Ｓｔｂｌ２（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）コンピテント細胞である。

【0276】

本発明の方法には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞にポリヌクレオチドを導入するのに適切な条件下で培養して、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞をもたらすステップがさらに含まれる。好ましい実施形態では、培養条件は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ドナー細胞）からシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞（レシピエント細胞）内にポリヌクレオチドを導入するのに適切であり、遺伝的に安定した遺伝をもたらす。

【0277】

最も好ましくは、培養条件は当技術分野で知られている細菌接合に適切である。「接合」とは、ポリヌクレオチドの一方向的な導入（たとえば細菌プラスミドからのもの）が１つの細菌細胞（すなわち「ドナー」）から別の細菌細胞（すなわち「レシピエント」）へと起こる、ポリヌクレオチドを導入する特定のプロセスをいう。接合プロセスは、ドナー細胞からレシピエント細胞への接触を含む。好ましくは、ドナー大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣＡ４３４細胞である。

【0278】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞にポリヌクレオチドを導入するのに適切な例示的な（接合）条件には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の液体培養を脳心臓浸出物ブロス（ＢＨＩ、Ｏｘｏｉｄ）またはＳｃｈａｅｄｌｅｒｓ嫌気性ブロス（ＳＡＢ、Ｏｘｏｉｄ）中で成長させることが含まれる。別の実施形態では、固体シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養を新鮮な血液寒天（ＦＢＡ）またはＢＨＩ寒天上で成長させ得る。好ましくは、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を３７℃で、嫌気性環境（たとえば、８０％のＮ_２、１０％のＣＯ_２、および１０％のＨ_２［体積／体積］）中で成長させる。一実施形態では、適切な条件には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を好気的にＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス中またはＬＢ寒天上で、３７℃で成長させることが含まれる。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）への接合伝達では、例示的な適切な条件には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を嫌気的にＦＢＡ上で成長させることが含まれる。当技術分野で知られているように抗生物質を液体および固体培地中に含め得る。そのような抗生物質の例には、シクロセリン（２５０μｇ／ｍｌ）、セフォキシチン（８μｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（１２．５μｇ／ｍｌ）、チアムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）、およびエリスロマイシン（５μｇ／ｍｌ）が含まれる。

【0279】

本発明の方法には、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドが含まれる、生じる組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を選択するステップがさらに含まれる。例示的な一実施形態では、組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞は、接合を介した、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞からの突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドのレシピエントである。

【0280】

本発明の方法には、組換え細胞またはその子孫を、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドを発現させるのに適切な条件下で培養して、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の産生をもたらすステップが含まれる。組換え細胞がポリヌクレオチドを発現するのに適切な条件には、当技術分野で知られている、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を成長させるのに適切な培養条件が含まれる。たとえば、適切な条件には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）形質転換体を脳心臓浸出物ブロス（ＢＨＩ、Ｏｘｏｉｄ）またはＳｃｈａｅｄｌｅｒｓ嫌気性ブロス（ＳＡＢ、Ｏｘｏｉｄ）中で培養することが含まれ得る。別の実施形態では、固体シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養をＦＢＡまたはＢＨＩ寒天上で成長させ得る。好ましくは、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を３７℃、嫌気性環境（たとえば、８０％のＮ_２、１０％のＣＯ_２、および１０％のＨ_２［体積／体積］）で成長させる。

【0281】

一実施形態では、本発明の方法には、生じる突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を単離するステップが含まれる。タンパク質をシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）から単離する方法は当技術分野で知られている。

【0282】

別の実施形態では、方法には、生じる突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を精製するステップが含まれる。クロマトグラフィーなどのポリペプチドを精製する方法は当技術分野で知られている。

【0283】

例示的な一実施形態では、この方法には、単離した突然変異クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を上述の化学的架橋剤と接触させるステップがさらに含まれる。好ましくは、薬剤には、ホルムアルデヒド、エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、またはＥＤＣとＮＨＳとの組合せが含まれる。例示的な反応条件は上記および以下の実施例セクション中に記載されている。

【0284】

別の態様では、本発明は、任意の方法、好ましくは上述の方法のいずれかによって産生させた、本明細書中に記載の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素が含まれる免疫原性組成物に関する。

【0285】

抗体
驚くべきことに、上述の本発明の免疫原性組成物はｉｎ ｖｉｖｏで新規抗体を誘発し、これは、免疫原性組成物にはそれぞれの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の保存されているネイティブ構造（たとえば保存されている抗原エピトープ）が含まれ、免疫原性組成物にはエピトープが含まれることを示唆している。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の１つの株からの毒素に対して産生させた抗体は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の別の株によって産生された対応する毒素と結合することができ得る。すなわち、抗体およびその結合断片は、複数のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株から産生された毒素上の類似した抗原部位と反応する能力をいう、「交差反応性」であり得る。また、交差反応性には、その産生を刺激しなかった抗原と反応または結合する抗体の能力、すなわち、異なるが類似する抗原に対して生じた、抗原と抗体との間の反応も含まれる。

【0286】

一態様では、本発明者らは、驚くべきことに、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対して中和効果を有するモノクローナル抗体、およびそれを産生させる方法を発見した。本発明の抗体は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の細胞毒性をｉｎ ｖｉｔｒｏで中和することができ、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素と哺乳動物細胞との結合を阻害し、かつ／またはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の腸内毒性をｉｎ ｖｉｖｏで中和することができる。また、本発明は、前述のいずれかをコードしている核酸配列が含まれる単離ポリヌクレオチドにも関する。さらに、本発明は、組成物を投与しない哺乳動物と比較して、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を処置する、予防する、その危険性を減少させる、その重症度を減少させる、その発生率を減少させる、および／またはその始まりを遅延させるための、前述の組成物のいずれかの使用、ならびに前記組成物を調製する方法に関する。

【0287】

本発明者らは、中和モノクローナル抗体のうちの少なくとも２つの組合せが、ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢのそれぞれの中和において予想外に相乗的な効果を示すことができることをさらに発見した。抗毒素抗体またはその結合断片はシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の阻害において有用な場合がある。

【0288】

「抗体」とは、少なくとも１本または２本の重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略記）、および少なくとも１本または２本の軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書中でＶＬと略記）が含まれるタンパク質である。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が散在する、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細区分することができる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、米国保健社会福祉省、ＮＩＨ出版第９１−３２４２、１９９１およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１〜９１７、１９８７を参照）。用語「抗体」には、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（およびその亜型）のインタクトな免疫グロブリンが含まれ、免疫グロブリンの軽鎖はカッパまたはラムダ型のものであり得る。

【0289】

抗体分子は完全長であることができる（たとえばＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体）。抗体は、ＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥを含めて、様々なアイソタイプのものであることができる。好ましい一実施形態では、抗体はＩｇＧアイソタイプ、たとえばＩｇＧ１である。別の好ましい実施形態では、抗体はＩｇＥ抗体である。

【0290】

別の実施形態では、抗体分子には、本明細書中で使用する「抗原結合断片」または「結合断片」が含まれ、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の毒素（たとえば毒素Ａ）と特異的に結合する抗体の一部分をいう。結合断片は、たとえば、１つまたは複数の免疫グロブリン鎖が完全長でないが、毒素と特異的に結合する分子である。

【0291】

用語、抗体の「結合断片」内に包含される結合部分の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、すなわち、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６、１９８９）、ならびに（ｖｉ）たとえば可変領域の抗原結合部分と特異的に結合するために十分なフレームワークを有する、単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。

【0292】

軽鎖可変領域の結合断片および重鎖可変領域の結合断片、たとえばＦｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られ、たとえば、Ｂｉｒｄら、（１９８８）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６およびＨｕｓｔｏｎら、（１９８８）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３を参照されたい）として作製されることを可能にする合成リンカーによって、結合することができる。そのような単鎖抗体もまた、用語、抗体の「結合断片」内に包含される。これらの抗体部分は当技術分野で知られている技法を使用して得られ、これらの部分をインタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングする。

【0293】

本明細書中で使用する、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープと「特異的に結合する」またはそれに「特異的」な抗体とは、任意の他のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープと実質的に結合せずにその特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープと結合する抗体である。たとえば、標的と「特異的に結合する」生体分子（たとえば、タンパク質、核酸、抗体など）に言及する場合、生体分子は、指定した条件（たとえば、抗体の場合は免疫アッセイ条件）下で測定した場合に、その標的分子と結合し、標的が含まれる分子の異種集団中の他の分子とは有意な量で結合しない。抗体とその標的との間の結合反応は、分子の異種集団中の標的の存在の決定因である。たとえば、「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、抗体またはその結合断片の、非特異的な抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性でシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の野生型および／または突然変異毒素と結合する能力をいう。

【0294】

例示的な一実施形態では、抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は当技術分野で知られている組換えＤＮＡ技法によって産生することができる。たとえば、マウス（または他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードしている遺伝子を制限酵素で消化してマウスＦｃをコードしている領域を除去し、ヒトＦｃ定常領域をコードしている遺伝子の同等部分を置換することができる。また、キメラ抗体は、マウス可変領域をコードしているＤＮＡを、ヒト定常領域をコードしているＤＮＡとライゲーションさせることができる組換えＤＮＡ技法によっても作製することができる。

【0295】

別の例示的な実施形態では、抗体またはその結合断片は、当技術分野で知られている方法によってヒト化する。たとえば、マウス抗体を得た後、抗体のＣＤＲをヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置き換え得る。また、ヒト化抗体は、抗原結合に直接関与していないマウスＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域からの同等配列で置き換えることによっても作製することができる。ヒト化抗体を作製するための一般方法は当技術分野で知られている。

【0296】

また、たとえば、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡまたはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢに向けられたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技法（たとえばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７を参照）などの標準の技法によっても産生させることができる。手短に述べると、不死化細胞系をシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡ、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ、または本明細書中に記載の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素で免疫化した哺乳動物からのリンパ球と融合させ、生じるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡまたはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。典型的には、不死化細胞系はリンパ球と同じ哺乳動物種に由来する。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ＥＬＩＳＡなどのアッセイを使用して、ハイブリドーマ培養上清をシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡまたはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢと結合する抗体についてスクリーニングすることによって検出する。ヒトハイブリドーマを同様の方法で調製することができる。

【0297】

また、免疫化および選択によって抗体を産生させる代替方法として、本発明の抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリをシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡ、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ、または本明細書中に記載の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素でスクリーニングすることによっても同定し得る。組換え抗体ライブラリは、たとえばｓｃＦｖライブラリまたはＦａｂライブラリであり得る。さらに、本明細書中に記載の本発明の抗体は、追加の抗ＴｃｄＡまたは抗ＴｃｄＢ抗体およびその結合断片を同定するための競合的結合研究において使用し得る。たとえば、追加の抗ＴｃｄＡまたは抗ＴｃｄＢ抗体およびその結合断片は、ヒト抗体ライブラリをスクリーニングし、競合的結合アッセイにおいて本明細書中に記載の本発明の抗体と競合する、ライブラリ内の分子を同定することによって同定し得る。

【0298】

さらに、本発明によって包含される抗体には、当技術分野で知られているファージディスプレイ方法を使用して作製し得る組換え抗体が含まれる。ファージディスプレイ方法では、ファージを使用して、レパートリーまたは抗体ライブラリ（たとえば、ヒトまたはマウス）から発現される抗原結合ドメインを表示させることができる。本明細書中に記載の免疫原（たとえば突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素）と結合する抗原結合ドメインを発現するファージを、抗原、たとえば標識した抗原を使用して選択または同定することができる。

【0299】

また、特定のアミノ酸が置換、欠失、または付加された抗体およびその結合断片も本発明の範囲内にある。具体的には、好ましい抗体は、抗原との結合を改善させるなどのために、フレームワーク領域中にアミノ酸置換を有する。たとえば、免疫グロブリン鎖の選択された少数のアクセプターフレームワーク残基を対応するドナーアミノ酸によって置き換えることができる。置換の好ましい位置には、ＣＤＲに隣接するアミノ酸残基、またはＣＤＲと相互作用することができるアミノ酸残基が含まれる。ドナーからアミノ酸を選択する基準は、米国特許第５，５８５，０８９号（たとえば１２〜１６段）に記載されている。アクセプターフレームワークは、成熟ヒト抗体のフレームワーク配列またはコンセンサス配列であることができる。

【0300】

本明細書中で使用する「中和抗体またはその結合断片」とは、中和抗体またはその結合断片が存在しない同一条件下での病原体と比較して、哺乳動物および／または細胞培養物中で病原体（たとえばシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢ）と結合して病原体の感染力および／または活性を低下させる（たとえば細胞毒性を低下させる）、それぞれの抗体またはその結合断片をいう。一実施形態では、中和抗体またはその結合断片は、中和抗体またはその結合断片が存在しない同一条件下での病原体の生物活性と比較して、病原体の生物活性の少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはそれより高くを中和することができる。

【0301】

本明細書中で使用する用語「抗毒素抗体またはその結合断片」とは、それぞれのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（たとえばシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａまたは毒素Ｂ）と結合する抗体またはその結合断片をいう。たとえば、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片とは、ＴｃｄＡと結合する抗体またはその結合断片をいう。

【0302】

本明細書中に記載の抗体またはその結合断片は、野生型および／またはトランスジェニックの、たとえば、マウス、ヒト、ウサギ、およびヤギを含めた任意の哺乳動物中で産生させ得る。

【0303】

上述の免疫原性組成物が、ワクチン接種などのために集団に以前に投与されたものである場合は、対象において生じた抗体の応答を使用して、同じ株および抗体の産生を刺激しなかった株からの毒素を中和することができる。たとえば、免疫原性組成物によって生じる、６３０株と様々な野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からの毒素との間の交差反応性に関する研究を示す実施例３７を参照されたい。

【0304】

一態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡに特異的な抗体またはその結合断片に関する。ＴｃｄＡと特異的に結合するモノクローナル抗体には、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２、Ａ８０−２９、および／または好ましくはＡ３−２５が含まれる。

【0305】

一態様では、本発明は、上述のものなどの任意の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＡ、たとえば配列番号１に特異的な抗体またはその結合断片に関する。別の態様では、本発明は、上述の免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。たとえば、一実施形態では、抗体またはその結合断片は、配列番号４または配列番号７が含まれる免疫原性組成物に特異的である。別の実施形態では、抗体またはその結合断片は、配列番号４または配列番号７が含まれる免疫原性組成物に特異的であり、配列番号４または配列番号７の少なくとも１つのアミノ酸は、ホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣとＮＨＳとの組合せによって架橋結合されている。別の実施形態では、抗体またはその結合断片は、配列番号８４または配列番号８３が含まれる免疫原性組成物に特異的である。

【0306】

Ａ６５−３３、Ａ６０−２２、Ａ８０−２９、および／または好ましくはＡ３−２５の可変重鎖および軽鎖領域と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性である可変重鎖および可変軽鎖領域を有する抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＡとも結合することができる。

【0307】

一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号３７に記載のＡ３−２５の可変重鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

【0308】

別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号３６に記載のＡ３−２５の可変軽鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

【0309】

さらなる一態様では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号３７に記載の可変重鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域、および配列番号３６に記載の可変軽鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

【0310】

別の実施形態では、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２、Ａ８０−２９、および／または好ましくはＡ３−２５の可変重鎖および／または可変軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＡとも結合することができる。Ａ３−２５の可変重鎖領域のＣＤＲを以下の表４に示す。

【0311】

【表6】

【0312】

Ａ３−２５の可変軽鎖領域のＣＤＲを以下の表５に示す。

【0313】

【表7】

【0314】

一実施形態では、抗体またはその結合断片には、配列番号４１（ＣＤＲ Ｈ１）、４２（ＣＤＲ Ｈ２）および４３（ＣＤＲ Ｈ３）に示す重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに／または配列番号３８（ＣＤＲ Ｌ１）、３９（ＣＤＲ Ｌ２）および４０（ＣＤＲ Ｌ３）に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

【0315】

例示的な一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａに特異的な抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＡのＮ末端領域内のエピトープ、たとえば、配列番号１の付番に従ってＴｃｄＡのアミノ酸１〜１２５６のエピトープと特異的に結合する。

【0316】

好ましい実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａに特異的な抗体またはその結合断片は、毒素ＡのＣ末端領域内のエピトープ、たとえば、配列番号１の付番に従ってＴｃｄＡのアミノ酸１８３２〜２７１０のエピトープと特異的に結合する。例にはＡ３−２５、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２、Ａ８０−２９が含まれる。

【0317】

さらに別の実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａに特異的な抗体またはその結合断片は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａの「転位」領域内のエピトープ、たとえば、配列番号１の付番に従ってＴｃｄＡのアミノ酸６５９〜１８３２のエピトープなどの、配列番号１の付番に従ってＴｃｄＡの残基９５６〜１１２８が好ましくは含まれるエピトープと特異的に結合する。

【0318】

別の態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢに特異的な抗体またはその結合断片に関する。たとえば、抗体またはその結合断片は、上述のものなどの任意の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からのＴｃｄＢ、たとえば配列番号２に特異的であり得る。別の態様では、本発明は、上述の免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。たとえば、一実施形態では、抗体またはその結合断片は、配列番号６または配列番号８が含まれる免疫原性組成物に特異的である。

【0319】

別の実施形態では、抗体またはその結合断片は、配列番号６または配列番号８が含まれる免疫原性組成物に特異的であり、配列番号６または配列番号８の少なくとも１つのアミノ酸は、ホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣとＮＨＳとの組合せによって架橋結合されている。別の実施形態では、抗体またはその結合断片は、配列番号８６または配列番号８５が含まれる免疫原性組成物に特異的である。

【0320】

ＴｃｄＢと特異的に結合するモノクローナル抗体には、本明細書中に記載のＢ２−３１、Ｂ５−４０、Ｂ７０−２、Ｂ６−３０、Ｂ９−３０、Ｂ５９−３、Ｂ６０−２、Ｂ５６−６、および／または好ましくはＢ８−２６クローンによって産生された抗体が含まれる。

【0321】

ＴｃｄＢとも結合することができる抗体またはその結合断片には、Ｂ２−３１、Ｂ５−４０、Ｂ７０−２、Ｂ６−３０、Ｂ９−３０、Ｂ５９−３、Ｂ６０−２、Ｂ５６−６、好ましくはＢ８−２６、Ｂ５９−３、および／またはＢ９−３０の可変重鎖および軽鎖領域と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性である可変重鎖および可変軽鎖領域を有するものが含まれる。

【0322】

一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号４９に記載のＡ３−２５の可変重鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

【0323】

一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号６０に記載のＡ３−２５の可変重鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

【0324】

一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号７１に記載のＡ３−２５の可変重鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

【0325】

別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号５５に記載のＡ３−２５の可変軽鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

【0326】

別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号６６に記載のＡ３−２５の可変軽鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

【0327】

別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、配列番号７７に記載のＡ３−２５の可変軽鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

【0328】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を配列番号４９に示す。表２５−ａを参照されたい。

【0329】

【表8】

【0330】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ８−２６ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を配列番号５５に示す。表２５−ｂを参照されたい。

【0331】

【表9】

【0332】

一実施形態では、抗体またはその結合断片には、配列番号５１（ＣＤＲ Ｈ１）、５２（ＣＤＲ Ｈ２）および５３（ＣＤＲ Ｈ３）に示す重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、ならびに／または配列番号５７（ＣＤＲ Ｌ１）、５８（ＣＤＲ Ｌ２）および５９（ＣＤＲ Ｌ３）に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

【0333】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を配列番号６０に示す。表２６−ａを参照されたい。

【0334】

【表10】

【0335】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ５９−３ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を配列番号６６に示す。表２６−ｂを参照されたい。

【0336】

【表11】

【0337】

一実施形態では、抗体またはその結合断片には、配列番号６２（ＣＤＲ Ｈ１）、６３（ＣＤＲ Ｈ２）および６４（ＣＤＲ Ｈ３）に示す重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、ならびに／または配列番号６８（ＣＤＲ Ｌ１）、６９（ＣＤＲ Ｌ２）および７０（ＣＤＲ Ｌ３）に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

【0338】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変重鎖のアミノ酸配列を配列番号７１に示す。表２７−ａを参照されたい。

【0339】

【表12】

【0340】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの中和抗体（Ｂ９−３０ ｍＡｂ）の可変軽鎖のアミノ酸配列を配列番号７７に示す。表２７−ｂを参照されたい。

【0341】

【表13】

【0342】

一実施形態では、抗体またはその結合断片には、配列番号７３（ＣＤＲ Ｈ１）、７４（ＣＤＲ Ｈ２）および７５（ＣＤＲ Ｈ３）に示す重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列、ならびに／または配列番号７９（ＣＤＲ Ｌ１）、８０（ＣＤＲ Ｌ２）および８１（ＣＤＲ Ｌ３）に示す軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

【0343】

一態様では、本発明は、上述のものなどの任意のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢ、たとえば配列番号２に特異的な抗体またはその結合断片に関する。別の態様では、本発明は、上述の免疫原性組成物に特異的な抗体またはその結合断片に関する。たとえば、一実施形態では、抗体またはその結合断片は、配列番号６または配列番号８が含まれる免疫原性組成物に特異的である。別の実施形態では、抗体またはその結合断片は、配列番号６または配列番号８が含まれる免疫原性組成物に特異的であり、配列番号６または配列番号８の少なくとも１つのアミノ酸は、ホルムアルデヒド、ＥＤＣ、ＮＨＳ、またはＥＤＣとＮＨＳとの組合せによって架橋結合されている。

【0344】

Ｂ２−３１、Ｂ５−４０、Ｂ７０−２、Ｂ６−３０、Ｂ９−３０、Ｂ５９−３、Ｂ６０−２、Ｂ５６−６、および／または好ましくはＢ８−２６の可変重鎖および軽鎖領域と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、好ましくは約９８％、より好ましくは約９９％または最も好ましくは約１００％の同一性である可変重鎖および可変軽鎖領域を有する抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＢとも結合することができる。

【0345】

一実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６の可変重鎖領域アミノ酸配列（配列番号４９）と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域が含まれる。

【0346】

別の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６の可変軽鎖領域アミノ酸配列（配列番号５５）と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

【0347】

さらなる一態様では、抗体またはその抗原結合断片には、Ｂ８−２６（配列番号４９）の可変重鎖領域アミノ酸配列と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変重鎖領域、およびＢ８−２６の可変軽鎖領域アミノ酸配列（配列番号５５）と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列が含まれる可変軽鎖領域が含まれる。

【0348】

別の実施形態では、Ｂ２−３１、Ｂ５−４０、Ｂ７０−２、Ｂ６−３０、Ｂ９−３０、Ｂ５９−３、Ｂ６０−２、Ｂ５６−６、および／または好ましくはＢ８−２６の可変重鎖および／または可変軽鎖のＣＤＲを有する抗体またはその結合断片は、ＴｃｄＢとも結合することができる。

【0349】

一実施形態では、抗体またはその結合断片には、Ｂ８−２６の重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列および／またはＢ８−２６の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列が含まれる。

【0350】

好ましい実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片は、毒素ＢのＮ末端領域内のエピトープ、たとえば、配列番号２の付番に従ってＴｃｄＢのアミノ酸１〜１２５６のエピトープと特異的に結合する。例にはＢ２−３１、Ｂ５−４０、Ｂ８−２６、Ｂ７０−２、Ｂ６−３０、およびＢ９−３０が含まれる。

【0351】

例示的な一実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片は、毒素ＢのＣ末端領域内のエピトープ、たとえば、配列番号２の付番に従ってＴｃｄＢのアミノ酸１８３２〜２７１０のエピトープと特異的に結合する。

【0352】

さらに別の実施形態では、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂに特異的な抗体またはその結合断片は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂの「転位」領域内のエピトープ、たとえば、ＴｃｄＢのアミノ酸６５９〜１８３２のエピトープなどの、配列番号２の付番に従ってＴｃｄＢの残基９５６〜１１２８が好ましくは含まれるエピトープと特異的に結合する。例にはＢ５９−３、Ｂ６０−２、およびＢ５６−６が含まれる。

【0353】

抗体の組合せ
抗毒素抗体またはその結合断片は、他の抗シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素抗体（たとえば、他のモノクローナル抗体、ポリクローナルガンマ−グロブリン）またはその結合断片と組み合わせて投与することができる。使用することができる組合せには、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片および抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる。

【0354】

別の実施形態では、組合せには、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片と別の抗毒素Ａ抗体またはその結合断片とが含まれる。好ましくは、組合せには、中和抗毒素Ａモノクローナル抗体またはその結合断片および別の中和抗毒素Ａモノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。驚くべきことに、本発明者らは、そのような組合せが毒素Ａの細胞毒性の中和において相乗効果をもたらしたことを発見した。たとえば、組合せには、以下の中和抗毒素Ａモノクローナル抗体、すなわち、Ａ３−２５、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２、およびＡ８０−２９のうちの少なくとも２つの組合せが含まれる。より好ましくは、組合せには、Ａ３−２５抗体と、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２、およびＡ８０−２９のうちの少なくとも１つの中和抗毒素Ａモノクローナル抗体とが含まれる。最も好ましくは、組合せには、４つすべての抗体、すなわち、Ａ３−２５、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２、およびＡ８０−２９が含まれる。

【0355】

さらなる実施形態では、組合せには、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片と別の抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片とが含まれる。好ましくは、組合せには、中和抗毒素Ｂモノクローナル抗体またはその結合断片と別の中和抗毒素Ｂモノクローナル抗体またはその結合断片が含まれる。驚くべきことに、本発明者らは、そのような組合せが毒素Ｂの細胞毒性の中和において相乗効果をもたらしたことを発見した。より好ましくは、組合せには、以下の中和抗毒素Ｂモノクローナル抗体、すなわち、Ｂ８−２６、Ｂ９−３０およびＢ５９−３のうちの少なくとも２つの組合せが含まれる。最も好ましくは、組合せには、３つすべての抗体、すなわち、Ｂ８−２６、Ｂ９−３０およびＢ５９−３が含まれる。

【0356】

さらに別の実施形態では、組合せには、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片と別の抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片とが含まれる。既に記述したように、本発明者らは、中和モノクローナル抗体のうちの少なくとも２つの組合せが、毒素Ａおよび毒素Ｂのそれぞれの中和において予想外に相乗的な効果を示すことができることを発見した。

【0357】

別の実施形態では、本発明の薬剤を混合物として配合する、または当技術分野で認識されている技法を使用して化学的もしくは遺伝子的に連結させることによって、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂの結合特性をどちらも有する共有結合した抗体（または共有結合した抗体断片）をもたらすことができる。合わせた配合物は、単独または別の薬剤と組み合わせた、薬剤の親和性、結合力、または生物学的有効性などの１つまたは複数のパラメータの決定によって導き得る。

【0358】

そのような組合せ療法は、その治療活性、たとえば、シー・ディフィシル関連の疾患または障害の阻害、予防（たとえば再発の予防）、および／または処置において、好ましくは相加的および／または相乗的である。そのような組合せ療法の投与により、所望の効果を達成するために必要な治療剤（たとえば、抗体もしくは抗体断片の混合物、または架橋結合もしくは遺伝子融合させた二重特異性抗体もしくは抗体断片）の用量を減少させることができる。

【0359】

本発明の組成物のいずれか、たとえば抗毒素Ａおよび／もしくは抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片は、治療効果のために様々な比または量で組み合わせることができることを理解されたい。たとえば、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体またはそのそれぞれの結合断片は、０．１：１０〜１０：０．１のＡ：Ｂの範囲の比で組成物中に存在することができる。別の実施形態では、抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ抗体またはそのそれぞれの結合断片は、０．１：１０〜１０：０．１のＢ：Ａの範囲の比で組成物中に存在することができる。

【0360】

別の態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡに対する中和抗体を産生させる方法に関する。方法には、上述の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することと、抗体を哺乳動物から回収することとが含まれる。好ましい実施形態では、免疫原性組成物には配列番号４を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡが含まれ、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡの少なくとも１つのアミノ酸は、好ましくはホルムアルデヒドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドによって化学的に架橋結合されている。産生させ得る例示的なＴｃｄＡに対する中和抗体には、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２、Ａ８０−２９、および／またはＡ３−２５が含まれる。

【0361】

さらに別の態様では、本発明は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢに対する中和抗体を産生させる方法に関する。方法には、上述の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することと、抗体を哺乳動物から回収することとが含まれる。好ましい実施形態では、免疫原性組成物には配列番号６を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢが含まれ、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢの少なくとも１つのアミノ酸は、好ましくはホルムアルデヒドまたは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドによって化学的に架橋結合されている。産生させ得る例示的なＴｃｄＢに対する中和抗体には、Ｂ２−３１、Ｂ５−４０、Ｂ７０−２、Ｂ６−３０、Ｂ９−３０、Ｂ５９−３、Ｂ６０−２、Ｂ５６−６、および／またはＢ８−２６が含まれる。

【0362】

配合物
本発明の組成物（たとえば、本明細書中に記載の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、免疫原性組成物、抗体および／またはその抗体結合断片が含まれる組成物など）は様々な形態であり得る。これらには、たとえば、半固体および固体の剤形、坐薬、液体の液剤（たとえば注射用および輸液用の液剤）、分散剤もしくは懸濁剤などの液体形態、リポソーム、ならびに／またはたとえば凍結乾燥粉末形態、凍結乾燥形態、噴霧乾燥形態、および／もしくは泡沫乾燥形態などの乾燥形態が含まれる。坐薬では、結合剤および担体にはたとえばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ、そのような坐薬は本発明の組成物を含有する混合物から形成することができる。例示的な一実施形態では、組成物は、注射前に液体ビヒクル中の液剤または懸濁剤とするために適した形態である。別の例示的な実施形態では、組成物を乳化する、あるいはリポソームまたはポリ乳酸、ポリグリコリド、もしくはコポリマーなどの微粒子中にカプセル封入する。

【0363】

好ましい実施形態では、組成物を凍結乾燥し、使用前に即席で再構成する。

【0364】

一態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体と一緒に配合した、本明細書中に記載の組成物のいずれか（たとえば、本明細書中に記載の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素、免疫原性組成物、抗体および／またはその抗体結合断片が含まれる組成物など）が含まれる医薬組成物に関する。「薬学的に許容できる担体」には、生理的に適切な任意の溶媒、分散媒、安定化剤、希釈剤、および／またはバッファーが含まれる。

【0365】

例示的な安定化剤には、ソルビトール、マンニトール、デンプン、デキストラン、スクロース、トレハロース、ラクトース、および／もしくはグルコースなどの炭水化物、アルブミンおよび／もしくはカゼインなどの不活性タンパク質、ならびに／または、キトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（ラテックス官能化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）アガロース、アガロース、セルロースなど）などの多糖、アミノ酸、重合アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（油滴もしくはリポソームなど）等の、他の大きなゆっくりと代謝される巨大分子が含まれる。さらに、これらの担体は免疫刺激剤（すなわちアジュバント）として機能し得る。

【0366】

好ましくは、組成物にはトレハロースが含まれる。トレハロースの好ましい量（重量％）には、最小で約１％、２％、３％、または４％から最大で約１０％、９％、８％、７％、６％、または５％が含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。一実施形態では、組成物には、たとえば０．５ｍＬの用量あたり約３％から６％のトレハロース、最も好ましくは４．５％のトレハロースが含まれる。

【0367】

適切な希釈剤の例には、蒸留水、生理食塩水、生理的リン酸緩衝溶液、グリセロール、アルコール（エタノールなど）、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス平衡塩類溶液、および／または凍結乾燥賦形剤が含まれる。

【0368】

例示的なバッファーには、リン酸バッファー（リン酸カリウム、リン酸ナトリウムなど）、酢酸バッファー（酢酸ナトリウムなど）、コハク酸バッファー（コハク酸ナトリウムなど）、グリシンバッファー、ヒスチジンバッファー、炭酸バッファー、トリスバッファー（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、および／または炭酸水素バッファー（炭酸水素アンモニウム）が含まれる。好ましくは、組成物にはトリスバッファーが含まれる。トリスバッファーの好ましい量には、最小で約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭから最大で約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ、１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、または１１ｍＭが含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。一実施形態では、組成物には、たとえば０．５ｍＬの用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭのトリスバッファー、最も好ましくは１０ｍＭのトリスバッファーが含まれる。

【0369】

別の好ましい実施形態では、組成物にはヒスチジンバッファーが含まれる。ヒスチジンバッファーの好ましい量には、最小で約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭから最大で約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ、１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、または１１ｍＭが含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。一実施形態では、組成物には、たとえば０．５ｍＬの用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭのヒスチジンバッファー、最も好ましくは１０ｍＭのヒスチジンバッファーが含まれる。

【0370】

さらに別の好ましい実施形態では、組成物にはリン酸バッファーが含まれる。リン酸バッファーの好ましい量には、最小で約１ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭから最大で約１００ｍＭ、５０ｍＭ、２０ｍＭ、１９ｍＭ、１８ｍＭ、１７ｍＭ、１６ｍＭ、１５ｍＭ、１４ｍＭ、１３ｍＭ、１２ｍＭ、または１１ｍＭが含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。一実施形態では、組成物には、たとえば０．５ｍＬの用量あたり約８ｍＭ〜１２ｍＭのリン酸バッファー、最も好ましくは１０ｍＭのリン酸バッファーが含まれる。

【0371】

バッファーのｐＨは一般に、選択された活性物質を安定化させるように選択され、当業者が既知の方法によって確定することができる。好ましくは、バッファーのｐＨは生理的ｐＨの範囲内となる。したがって、好ましいｐＨ範囲は約３〜約８、より好ましくは約６．０〜約８．０、さらにより好ましくは約６．５〜約７．５、最も好ましくは約７．０〜約７．２である。

【0372】

一部の実施形態では、医薬組成物には界面活性剤が含まれ得る。両性、非イオン性、陽イオン性または陰イオン性であるかにかかわらず、任意の界面活性剤が適切である。例示的な界面活性剤には、ポリソルベート２０および／またはポリソルベート８０などのポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（たとえばＴＷＥＥＮ（登録商標））、トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）などのラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪酸エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として知られる）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００、すなわちｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、また、トリオレイン酸ソルビタン（Ｓｐａｎ８５）およびモノラウリン酸ソルビタンなどのソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして知られる）、ならびにその組合せが含まれる。好ましい界面活性剤にはポリソルベート８０（モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン）が含まれる。

【0373】

ポリソルベート８０の好ましい量（重量％）には、最小で約０．００１％、０．００５％、または０．０１％から最大で約０．０１０％、０．０１５％、０．０２５％、または１．０％が含まれる。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。一実施形態では、組成物には約０．００５％〜０．０１５％のポリソルベート８０、最も好ましくは０．０１％のポリソルベート８０が含まれる。

【0374】

例示的な一実施形態では、免疫原性組成物にはトレハロースおよびポリソルベート８０が含まれる。別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物には、トリスバッファーおよびポリソルベート８０が含まれる。別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物には、ヒスチジンバッファーおよびポリソルベート８０が含まれる。さらに別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物にはリン酸バッファーおよびポリソルベート８０が含まれる。

【0375】

例示的な一実施形態では、免疫原性組成物にはトレハロース、トリスバッファーおよびポリソルベート８０が含まれる。別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物にはトレハロース、ヒスチジンバッファーおよびポリソルベート８０が含まれる。さらに別の例示的な実施形態では、免疫原性組成物にはトレハロース、リン酸バッファーおよびポリソルベート８０が含まれる。

【0376】

本明細書中に記載の組成物には、石油、動物、植物、または合成起源の構成要素、たとえば、ピーナッツ油、ダイズ油、および／または鉱物油がさらに含まれ得る。例にはプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれる。

【0377】

一部の実施形態では、医薬組成物にはホルムアルデヒドがさらに含まれる。たとえば、好ましい実施形態では、ホルムアルデヒドがさらに含まれる医薬組成物は免疫原性組成物を有しており、免疫原性組成物の突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素はホルムアルデヒドが含まれる化学的架橋剤と接触させられている。医薬組成物中に存在するホルムアルデヒドの量は、最小で約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１０％、０．０１３％、または０．０１５％から最大で約０．０２０％、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、０．０１３％、０．０１２％、０．０１１％または０．０１０％で変動し得る。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。一実施形態では、医薬組成物には約０．０１０％のホルムアルデヒドが含まれる。

【0378】

一部の代替実施形態では、本明細書中に記載の医薬組成物にはホルムアルデヒドが含まれない。たとえば、好ましい実施形態では、ホルムアルデヒドが含まれない医薬組成物は免疫原性組成物を有しており、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素の少なくとも１つのアミノ酸はＥＤＣが含まれる薬剤によって化学的に架橋結合されている。より好ましくは、そのような実施形態では、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素はホルムアルデヒドが含まれる化学的架橋剤と接触させられていない。別の例示的な実施形態として、凍結乾燥形態の医薬組成物にはホルムアルデヒドが含まれない。

【0379】

別の実施形態では、本明細書中に記載の組成物には以下に記載のアジュバントが含まれ得る。好ましいアジュバントは、免疫応答の定性的形態に影響を与え得る免疫原のコンホメーション変化を引き起こさずに、免疫原の内因性の免疫応答を増強させる。

【0380】

例示的なアジュバントには、３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ（商標））（ＧＢ２２２０２１１号を参照（ＧＳＫ））、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（商標）（Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、デンマーク）などの水酸化アルミニウムゲル、ＭＰＬまたは３−ＤＭＰ、ＱＳ−２１、ポリグルタミン酸もしくはポリリシンなどの重合もしくは単量体のアミノ酸等の免疫刺激剤を用いてまたは用いずに使用し得るアルミニウム塩（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなど）が含まれる。

【0381】

さらに別の例示的なアジュバントは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活オリゴヌクレオチド（たとえば、ＷＯ１９９８／０４０１００号、ＷＯ２０１０／０６７２６２号を参照）、またはサポニンおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活オリゴヌクレオチド（たとえばＷＯ００／０６２８００号を参照）である。好ましい実施形態では、アジュバントはＣｐＧオリゴヌクレオチド、最も好ましくはＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ ＯＤＮ）である。好ましいＣｐＧ ＯＤＮは、Ｂ細胞を優先的に活性化させるＢクラスのものである。本発明の態様では、ＣｐＧ ＯＤＮは核酸配列５’Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｃ^＊Ｇ^＊Ｇ^＊Ｔ^＊Ｇ^＊Ｃ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ^＊Ｔ３’（配列番号４８）を有しており、^＊はホスホロチオエート結合を示す。この配列のＣｐＧ ＯＤＮはＣｐＧ２４５５５として知られており、ＷＯ２０１０／０６７２６２号に記載されている。好ましい実施形態では、ＣｐＧ２４５５５をＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌなどの水酸化アルミニウム塩と一緒に使用する。

【0382】

例示的なアジュバントのさらなるクラスには、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）（トリテルペングリコシドまたはサポニンであるＱＳ−２１、Ａｑｕｉｌａ、マサチューセッツ州、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）などのサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）およびＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントなどのそれから作製された粒子が含まれる。したがって、本発明の組成物は、ＩＳＣＯＭ、ＣＴＢを含有するＩＳＣＯＭ、リポソームの形態、またはアクリレートもしくはポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコシド）などの化合物中にカプセル封入して吸着に適した大きさのミクロスフェアを形成した形態で送達し得る。典型的には、用語「ＩＳＣＯＭ」とは、トリテルペノイドサポニン（特にＱｕｉｌ Ａ）などのグリコシドと疎水性領域を含有する抗原との間で形成された免疫原性複合体をいう。好ましい実施形態では、アジュバントはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントである。

【0383】

他の例示的なアジュバントには、ＲＣ−５２９、ＧＭ−ＣＳＦならびに完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が含まれる。

【0384】

例示的なアジュバントのさらに別のクラスは、そのそれぞれが糖残基中でアミノ酸によって置換されているＮ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシル尿素およびＮ−グリコシルカルバメートを含めた糖脂質類似体である。

【0385】

医薬組成物には、２つ以上の異なるアジュバントが含まれていてもよい。アジュバントの好ましい組合せには、たとえば、以下のアジュバント、すなわち、ミョウバン、ＭＰＬ、ＱＳ−２１、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＣｐＧ、およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌのうちの少なくとも２つを含めたアジュバントの任意の組合せが含まれる。アジュバントの例示的な組合せには、ＣｐＧとＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとの組合せが含まれる。

【0386】

あるいは、一実施形態では、アジュバントの非存在下で組成物を哺乳動物に投与する。

【0387】

本明細書中に記載の組成物は、予防的および／または治療的な応用のための、たとえば、非経口、局所的、静脈内、粘膜の、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内、皮内、輸液、直腸、および／または経皮の経路などの任意の投与経路によって投与することができる。好ましい実施形態では、組成物の投与経路は非経口、より好ましくは筋肉内の投与である。典型的な筋肉内投与は腕または脚の筋肉内に行う。

【0388】

本明細書中に記載の組成物は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の予防および／または処置において少なくとも部分的に有効である治療と組み合わせて投与することができる。たとえば、本発明の組成物は、生物療法、プロバイオティック療法、便移植、免疫療法（静脈内免疫グロブリンなど）、ならびに／またはメトロニダゾールおよび／もしくはバンコマイシンなどのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患（ＣＤＡＤ）の抗生物質処置のための受け入れられている標準治療の前、それと同時に、またはその後に投与し得る。

【0389】

毒素Ａおよび毒素Ｂに関連する本発明の組成物は、任意の組合せで哺乳動物に投与し得る。たとえば、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡが含まれる免疫原性組成物は、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢが含まれる免疫原性組成物の投与の前、それと同時に、またはその後に哺乳動物に投与し得る。逆に、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢが含まれる免疫原性組成物は、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡが含まれる免疫原性組成物の投与の前、それと同時に、またはその後に哺乳動物に投与し得る。

【0390】

別の実施形態では、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片が含まれる組成物は、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる組成物の投与の前、それと同時に、またはその後に哺乳動物に投与し得る。逆に、抗毒素Ｂ抗体またはその結合断片が含まれる組成物は、抗毒素Ａ抗体またはその結合断片が含まれる組成物の投与の前、それと同時に、またはその後に哺乳動物に投与し得る。

【0391】

さらなる実施形態では、本発明の組成物は、薬学的に許容できる担体の投与の前、それと同時に、またはその後に哺乳動物に投与し得る。たとえば、アジュバントを、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素が含まれる組成物の投与の前、それと同時に、またはその後に投与し得る。したがって、本発明の組成物および薬学的に許容できる担体を同じバイアルに梱包することができるか、またはこれらを別々のバイアルに梱包して使用前に混合することができる。組成物を単一用量の投与および／または複数用量の投与用に配合することができる。

【0392】

哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症を保護および／または処置する方法
一態様では、本発明は、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対する免疫応答を誘導する方法に関する。方法には、有効量の本明細書中に記載の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。たとえば、方法には、哺乳動物においてそれぞれのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素に対する免疫応答を生じさせるために有効な量を投与することが含まれ得る。

【0393】

例示的な一実施形態では、本発明は、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡに対する免疫応答を誘導する方法に関する。方法には、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡが含まれる有効量の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。別の例示的な実施形態では、本発明は、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢに対する免疫応答を誘導する方法に関する。方法には、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢが含まれる有効量の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。

【0394】

さらなる実施形態では、方法には、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡが含まれる有効量の免疫原性組成物と突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢが含まれる有効量の免疫原性組成物とを哺乳動物に投与することが含まれる。さらなる態様では、本明細書中に記載の組成物は、組成物を投与しない哺乳動物と比較して、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を処置する、予防する、その危険性を減少させる、その重症度を減少させる、その発生率を減少させる、および／またはその始まりを遅延させるために使用し得る。方法には、有効量の組成物を哺乳動物に投与することが含まれる。

【0395】

感染症の重症度に基づいて、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症によって引き起こされる３つの臨床症候群が認識されている。最も重度の形態は偽膜性大腸炎（ＰＭＣ）であり、これは、おびただしい下痢、腹痛、疾病の全身兆候、および結腸の特有の内視鏡像によって特徴づけられている。

【0396】

また、抗生物質関連の大腸炎（ＡＡＣ）もおびただしい下痢、腹痛および腹部圧痛、全身兆候（たとえば発熱）、ならびに白血球増加によって特徴づけられている。ＡＡＣにおける腸管障害はＰＭＣよりも重症度が低く、ＰＭＣにおける結腸の特徴的な内視鏡像は存在せず、死亡率は低い。

【0397】

最後に、抗生物質関連の下痢（ＡＡＤ、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連の下痢（ＣＤＡＤ）としても知られる）は比較的穏やかな症候群であり、大腸炎（たとえば腹痛および腹部圧痛によって特徴づけられるもの）ならびに感染症の全身兆候（たとえば発熱）をどちらも欠く軽度から中等度の下痢によって特徴づけられている。

【0398】

これら３つの特徴的な症候群は、典型的には起こる頻度の昇順である。すなわち、ＰＭＣは典型的にはＡＡＣよりも低い頻度で起こり、ＡＡＤが典型的にはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患の最も頻繁な臨床提示である。

【0399】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の頻繁な合併症は再発または回帰する疾患であり、これはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）疾患から回復するすべての対象の２０％までで起こる。再発は、臨床的にＡＡＤ、ＡＡＣ、またはＰＭＣとして特徴づけ得る。一度再発する患者は再び再発する可能性が高い。

【0400】

本明細書中で使用するシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の状態には、たとえば、軽度、軽度から中等度、中等度、および重度のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症が含まれる。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の状態は感染症の症状の存在および／または重症度に応じて変動し得る。

【0401】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の症状には、たとえば、下痢、大腸炎、激しい腹痛（ｃｒａｍｐｓ）、発熱、便中白血球、および結腸生検での炎症を伴った大腸炎、偽膜性大腸炎、低アルブミン血症、全身浮腫、白血球増加、敗血症、腹痛、無症候性保菌、ならびに／または合併症および感染症の発生中に存在する中間病理学的表現型、また、その組合せなどの、生理的、生化学的、組織学的および／または行動的な症状が含まれ得る。したがって、たとえば、有効量の本明細書中に記載の組成物の投与は、たとえば、組成物を投与しなかった哺乳動物と比較して、下痢、腹痛、激しい腹痛、発熱、結腸生検での炎症、低アルブミン血症、全身浮腫、白血球増加、敗血症、および／または無症候性保菌などを処置する、予防する、その危険性を減少させる、その重症度を減少させる、その発生率を減少させる、および／またはその始まりを遅延させ得る。

【0402】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の危険因子には、たとえば、抗微生物剤（嫌気性細菌に対する抗菌スペクトルおよび／または活性を有する任意の抗微生物剤が包含され、たとえば正常な結腸微生物叢の破壊を引き起こす抗生物質、たとえば、クリンダマイシン、セファロスポリン、メトロニダゾール、バンコマイシン、フルオロキノロン（レボフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、およびシプロフロキサシンが含まれる）、リネゾリドなどが含まれる）の現在または近い将来の使用、処方されたメトロニダゾールまたはバンコマイシンの現在または近い将来の退薬、医療施設（病院、長期介護施設など）への現在または近い将来の入院および医療従事者、プロトンポンプ阻害剤、Ｈ２拮抗剤、および／もしくはメトトレキサート、またはその組合せを用いた現在または近い将来の処置、現在の炎症性腸疾患などの胃腸管系の疾患またはその危険性、哺乳動物に対する過去、現在、または近い将来の胃腸管系手術または胃腸管系処置、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および／またはＣＤＡＤの過去または現在の再発、たとえばシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および／またはＣＤＡＤに１回または複数回罹患した患者、ならびに少なくとも約６５歳以上のヒトが含まれ得る。

【0403】

本明細書中に記載の方法では、哺乳動物は、たとえばマウス、ハムスター、霊長類、およびヒトなどの任意の哺乳動物であり得る。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。本発明によれば、ヒトには、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を示していた個体、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を現在示している個体、ならびにシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症の危険性にある個体が含まれ得る。

【0404】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の症状を示していた個体の例には、上述の症状を示していたまたは示している個体、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および／またはシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患（ＣＤＡＤ）に罹患していたまたは罹患している個体、ならびにシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および／またはＣＤＡＤを再発していた個体が含まれる。

【0405】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の危険性にある患者の例には、計画された抗微生物剤の使用の恐れがあるまたは現在それを経験している個体、処方されたメトロニダゾールまたはバンコマイシンの退薬の恐れがあるまたは現在それを経験している個体、医療施設（病院、長期介護施設など）への計画された入院の恐れがあるまたは現在それを経験している個体および医療従事者、ならびに／あるいはプロトンポンプ阻害剤、Ｈ２拮抗剤、および／もしくはメトトレキサート、またはその組合せを用いた計画された処置の恐れがあるまたは現在それを経験している個体、炎症性腸疾患などの胃腸管系の疾患に罹患していたまたはそれを現在経験している個体、胃腸管系手術または胃腸管系処置を受けていたまたは現在受けている個体、ならびにシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および／またはＣＤＡＤを再発していたまたは現在再発している個体、たとえばシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および／またはＣＤＡＤに１回または複数回罹患した患者、約６５歳以上である個体が含まれる。そのような危険性にある患者は、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の症状を現在示していても示していなくてもよい。

【0406】

無症候患者では、予防および／または処置を任意の年齢（たとえば、約１０、２０、または３０歳）で開始することができる。しかし、一実施形態では、患者が少なくとも約４５、５５、６５、７５、または８５歳に達するまで処置を開始する必要はない。たとえば、本明細書中に記載の組成物を５０〜８５歳の無症候性のヒトに投与し得る。

【0407】

一実施形態では、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を予防する、その危険性を減少させる、その重症度を減少させる、その発生率を減少させる、および／またはその始まりを遅延させる方法には、有効量の本明細書中に記載の組成物を、それを必要としている哺乳動物、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の危険性にある哺乳動物および／またはそれに罹りやすい哺乳動物に投与することが含まれる。有効量には、たとえば、組成物を投与しない哺乳動物と比較して、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を予防する、その危険性を減少させる、その重症度を減少させる、その発生率を減少させる、および／またはその始まりを遅延させるために十分な量が含まれる。有効量の本明細書中に記載の組成物の投与は、たとえば、組成物を投与しなかった哺乳動物と比較して、下痢、腹痛、激しい腹痛、発熱、結腸生検での炎症、低アルブミン血症、全身浮腫、白血球増加、敗血症、および／または無症候性保菌などを予防する、その危険性を減少させる、その重症度を減少させる、その発生率を減少させる、および／またはその始まりを遅延させ得る。好ましい実施形態では、方法には、有効量の本明細書中に記載の免疫原性組成物を、それを必要としている哺乳動物、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の危険性にある哺乳動物および／またはそれに罹りやすい哺乳動物に投与することが含まれる。

【0408】

さらなる一実施形態では、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を処置する、その重症度を減少させる、および／またはその始まりを遅延させる方法には、有効量の本明細書中に記載の組成物を、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症が疑われる、または現在それを患っている哺乳動物に投与することが含まれる。有効量には、たとえば、組成物を投与しない哺乳動物と比較して、哺乳動物においてシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）関連疾患、その症候群、状態、症状、および／または合併症を処置する、その重症度を減少させる、および／またはその始まりを遅延させるために十分な量が含まれる。

【0409】

有効量の組成物の投与は、対象において、以下に記載のものなどのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の少なくとも１つの兆候または症状を改善させ得る。有効量の本明細書中に記載の組成物の投与は、たとえば、組成物を投与しなかった哺乳動物と比較して、下痢の重症度を減少させ得るおよび／または発生率を減少させ、腹痛、激しい腹痛、発熱、結腸生検での炎症、低アルブミン血症、全身浮腫、白血球増加、敗血症、および／または無症候性保菌などの重症度を減少させるおよび／または発生率を減少させ得る。感染症の症状、兆候、および／または危険因子の存在は処置を開始する前に決定されてもよい。好ましい実施形態では、方法には、有効量の本明細書中に記載の抗体および／またはその結合断片を、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症が疑われる、または現在それを患っている哺乳動物に投与することが含まれる。

【0410】

したがって、有効量の組成物とは、本発明の方法において所望の効果（たとえば予防的および／または治療的な効果）を達成するために十分な量をいう。たとえば、投与するための免疫原の量は、１回の注射あたり最小で約１μｇ、５μｇ、２５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、２００μｇ、５００μｇ、または１ｍｇから最大で約２ｍｇ、１ｍｇ、５００μｇ、２００μｇで変動し得る。任意の最小値を任意の最大値と組み合わせて、適切な範囲を定義することができる。典型的には、それぞれのヒト注射に１つの免疫源あたり約１０、２０、５０または１００μｇを使用する。

【0411】

対象に投与する本発明の組成物の量は、感染症の種類および重症度ならびに／また全体的な健康、年齢、性別、体重および薬物耐性などの個体の特徴に依存し得る。また、これは疾患の度合、重症度、および種類にも依存し得る。また、有効量は、投与経路、標的部位、患者の生理的状態、患者の年齢、患者がヒトであるか動物であるか、投与した他の治療、および処置が予防的であるか治療的であるかなどの要因に応じても変動し得る。当業者はこれらおよび他の要因に応じて適切な量を決定できるであろう。

【0412】

本明細書中の方法において使用するために、有効量には、１回の有効用量または複数回の有効用量（たとえば、２、３、４回の用量またはそれより多く）が含まれ得る。有効な用量は安全性および有効性を最適化するために滴定する必要があり得る。

【0413】

予防的および／または治療的な使用を達成するために十分な用量の量および頻度の組合せは、予防上または治療上有効なレジメンと定義される。予防的および／または治療的なレジメンでは、組成物は、典型的には、十分な免疫応答が達成されるまで複数の用量で投与する。典型的には、免疫応答を監視し、免疫応答が衰退し始めた場合は繰返し用量を与える。

【0414】

組成物は一定期間にわたって複数用量で投与し得る。処置は、治療剤（たとえば突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素が含まれる免疫原性組成物）に対する抗体または活性Ｔ細胞もしくはＢ細胞の応答を経時的にアッセイすることによって監視することができる。応答が低下した場合はブースター用量が指示される。

【実施例1】

【0415】

毒素陰性のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の同定
毒素（ＡおよびＢ）遺伝子および毒素発現を欠くシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株を同定するために、１３個のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株を試験した。１３個のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株の培養培地をＥＬＩＳＡによって毒素Ａについて試験した。７個の株が毒素Ａを発現した：シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１４７９７−２、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）６３０、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＢＤＭＳ、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）Ｗ１１９４、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）８７０、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１２５３、およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）２１４９。図３を参照されたい。

【0416】

６個の株が毒素Ａを発現せず、病原性座位の全体を欠いていた：シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）１３５１（ＡＴＣＣ４３５９３（商標））、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）３２３２（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８０１（商標））、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）７３２２（ＡＴＣＣ４３６０１（商標））、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）５０３６（ＡＴＣＣ４３６０３（商標））、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）４８１１（４ＡＴＣＣ３６０２（商標））、およびシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１１１８６（ＡＴＣＣ７０００５７（商標））。プラスミドＤＮＡを接合によって取り込むその有効性に基づいて、ＶＰＩ１１１８６を選択した。

【0417】

同じ１３個の株を、病原性座位（ＰａＬｏｃ、Ｂｒａｕｎら、Ｇｅｎｅ．１９９６ Ｎｏｖ２８；１８１（１〜２）：２９〜３８）外のプライマーを使用した多重ＰＣＲアッセイで試験した。ＰＣＲ結果により、６個の毒素Ａ陰性株からのＤＮＡでは、ＥＬＩＳＡによってＰａＬｏｃからのどの遺伝子も増幅されなかったことが実証された（ｔｃｄＡ〜ｔｃｄＥ）。ＰａＬｏｃ隣接配列（ｃｄｄ３およびｃｄｕ２）は存在していた（データ示さず）。

【実施例2】

【0418】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＶＰＩ１１１８６における胞子形成経路の失活
シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）産生株の胞子形成機能のノックアウトは、安全な製造環境での大スケール発酵を容易にする。ＣｌｏｓＴｒｏｎシステムを使用して無芽胞シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株を作製した。Ｈｅａｐら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｊｕｌ；７８（１）：７９〜８５を参照されたい。ＣｌｏｓＴｒｏｎシステムは、ｓｐｏ０Ａ１クロストリジウム遺伝子の部位特異的挿入失活のための、ＩＩ群イントロンを用いた標的化遺伝子失活を可能にする。毒素陰性（ｍｉｎｕｓ）産生株ＶＰＩ１１１８６をＣｌｏｓＴｒｏｎ技術による胞子形成失活に供した。エリスロマイシン耐性突然変異体を選択し、挿入カセットの存在をＰＣＲによって確認した（示さず）。２つの独立したクローンが胞子を形成できないことが確認された。

【実施例3】

【0419】

細胞毒性機能を失活させるための毒素ＡおよびＢ遺伝子の遺伝子修飾
株６３０Δゲノム配列に基づく完全長の突然変異毒素ＡおよびＢのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈでカスタム合成するために設計した。たとえば配列番号９〜１４を参照されたい。細胞毒性の原因であるグルコシルトランスフェラーゼ活性の活性部位を、２つの対立遺伝子置換、すなわち、毒素ＡにはＤ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ（配列番号３を参照）、毒素ＢにはＤ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ（配列番号５を参照）によって変更した。２個のヌクレオチドをそれぞれのアスパラギン酸（Ｄ）コドンで突然変異させて、アラニン（Ａ）のコドンを作製した。たとえば配列番号９〜１４を参照されたい。さらに、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈでのカスタム合成に従って、システイン残基を欠く突然変異毒素を発現する一対のベクターを構築した。突然変異毒素Ａからの７個のシステイン残基および突然変異毒素Ｂからの９個のシステイン残基をアラニンで置き換えた。置換には、ＡおよびＢ毒素の自己触媒的プロテアーゼの触媒的システインが含まれる。また、ベクターの構築に使用した制限酵素部位を排除するために必要な場合はサイレント突然変異を導入した。

【実施例4】

【0420】

ｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ発現ベクター
シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素抗原の発現に使用したプラスミドシャトルベクターは、Ｍｉｎｔｏｎ ｌａｂによって開発されたｐＭＴＬ８０００シリーズのモジュラーシステムから選択した（Ｈｅａｐら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９ Ｊｕｌ；７８（１）：７９〜８５を参照）。選択されたベクターｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘは、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）プラスミドｐＣＤ６グラム＋レプリコン、ｃａｔＰ（クロラムフェニコール／チアムフェニコール）選択マーカー、ｐ１５ａグラム−レプリコンおよびｔｒａ機能、ならびにスポロゲネス菌（Ｃ．ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシンプロモーター（ｆｄｘ）および遠位の多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。経験的データにより、低コピー数のｐ１５ａレプリコンが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＣｏｌＥ１代替物よりも高い安定性を与えたことが示唆された。ｆｄｘプロモーターは、ＣＡＴレポーター構築体を用いた実験において試験した他のプロモーター（たとえば、ｔｃｄＡ、ｔｃｄＢ、または異種のｔｅｔＲもしくはｘｙｌＲ）よりも高い発現をもたらしたため選択した（データ示さず）。

【実施例5】

【0421】

修飾した毒素ＯＲＦをｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ内にクローニング
株６３０Δゲノム配列に基づく完全長の突然変異毒素ＡおよびＢのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、ｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘベクター多重クローニングＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩ部位を使用して、標準の分子生物学的技法を使用してサブクローニングした。クローニングを容易にするために、ＯＲＦは開始コドンを含有する近位のＮｄｅＩ部位およびストップコドンのすぐ下流のＢｇｌＩＩ部位に隣接していた。

【実施例6】

【0422】

三重突然変異体を作製するためのＴｃｄＡの部位特異的突然変異誘発
配列番号３および５、すなわち「二重突然変異体」のそれぞれにおいて、自己触媒的プロテアーゼドメインの触媒的システイン残基を置換した（すなわち、ＴｃｄＡではＣ７００ＡおよびＴｃｄＢではＣ６９８Ａ）。突然変異毒素Ａの突然変異誘発では、ＴｃｄＡ Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ発現プラスミドからの２．４８ｋｂのＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＵＣ１９（同じように切断）内にサブクローニングし、部位特異的突然変異誘発をこの鋳型に対して行った。新しい対立遺伝子がＤＮＡ配列解析によって確認された後、修飾されたＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を発現ベクターｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ内に再導入して、「三重突然変異体」、すなわち配列番号４および配列番号６を作製した。

【実施例7】

【0423】

三重突然変異体を作製するためのＴｃｄＢ部位特異的突然変異誘発
突然変異毒素Ｂの突然変異誘発には、突然変異毒素Ｂプラスミドからの３．２９ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＮＩ断片を修飾し、再導入した。ＥｃｏＮＩ部位は利用可能なクローニングベクター中に存在しないため、わずかに大きい３．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＶ断片をｐＵＣ１９（ＮｄｅＩ−ＳｍａＩで準備）内にサブクローニングした。突然変異誘発後、修飾された内部３．３ｋｂのＮｄｅＩ−ＥｃｏＮＩ断片を切り出し、対応する突然変異毒素Ｂ発現ベクターｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘ断片を置き換えるために使用した。この定方向戦略のクローニング効率は非常に低いことが見出されたため、１．５ｋｂのＤｒａＩＩＩの置き換えを含む、Ｃ６９８Ａ対立遺伝子を導入するための代替戦略が並行して試みられた。どちらの戦略も独立して所望の組換えをもたらした。

【実施例8】

【0424】

部位特異的突然変異誘発による追加の突然変異毒素変異体の作製
少なくとも１２個の異なるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素変異体を構築した。部位特異的突然変異誘発によって対立遺伝子置換をＮ末端突然変異毒素遺伝子断片内に導入した（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）キット）。また、このプラスミドに基づくシステムの、野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株から精製したネイティブ毒素と生物活性が定量的に同等であるタンパク質を作製する能力を評価するために、組換え毒素も参照対照として操作した。この場合、元のグルコシルトランスフェラーゼ置換に復帰させるために対立遺伝子置換を導入した。さらに、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈでのカスタム合成に従って一対の無システイン突然変異毒素ベクターを構築した。

【0425】

１２個の毒素変異体には、（１）Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（配列番号３）、（２）Ｄ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（配列番号５）、（３）Ｄ２８５Ａ／Ｄ２８７Ａ Ｃ７００Ａ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（配列番号４）、（４）Ｄ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ Ｃ６９８Ａ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（配列番号６）、（５）配列番号１を有する組換え毒素Ａ、（６）配列番号２を有する組換え毒素Ｂ、（７）Ｃ７００Ａ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ、（８）Ｃ６９８Ａ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ、（９）Ｃ７００Ａ Ｃ５９７Ｓ、Ｃ１１６９Ｓ、Ｃ１４０７Ｓ、Ｃ１６２３Ｓ、Ｃ２０２３Ｓ、およびＣ２２３６Ｓ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ、（１０）Ｃ６９８Ａ Ｃ３９５Ｓ、Ｃ５９５Ｓ、Ｃ８２４Ｓ、Ｃ８７０Ｓ、Ｃ１１６７Ｓ、Ｃ１６２５Ｓ、Ｃ１６８７Ｓ、およびＣ２２３２Ｓ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ、（１１）Ｄ２８５Ａ、Ｄ２８７Ａ、Ｃ７００Ａ、Ｄ２６９Ａ、Ｒ２７２Ａ、Ｅ４６０Ａ、およびＲ４６２Ａ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ（配列番号７）、ならびに（１２）Ｄ２７０Ａ、Ｒ２７３Ａ、Ｄ２８６Ａ、Ｄ２８８Ａ、Ｄ４６１Ａ、Ｋ４６３Ａ、およびＣ６９８Ａ突然変異を有する突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（配列番号８）が含まれる。

【0426】

また、部位特異的突然変異誘発によって、かつ上記、たとえば実施例１〜７に記載のしたものと同じ材料および方法を使用することによって、五重突然変異毒素も構築した。毒素Ｂの五重突然変異体には以下の置換、すなわちＤ２８６Ａ／Ｄ２８８Ａ Ｃ６９８Ａ／Ｅ９７０Ｋ／Ｅ９７６Ｋが含まれていた（配列番号１８４）。五重突然変異毒素Ｂは、上述のようにＶＰＩ１１１８６ ｓｐｏ０Ａ陰性細胞中で発現させた。毒素ＢのＮ末端エピトープに特異的なｍＡｂ＃Ｂ８−２６（配列番号４９）を使用したウエスタンブロットを行って五重突然変異毒素Ｂの発現を確認した。左から２、３、および４番目のレーンでは、それぞれ５０ｎｇ、３０ｎｇ、および１０ｎｇの精製した三重突然変異体Ｂ（配列番号８６）を参照タンパク質として使用した。左から５および６番目のレーンでは、それぞれ１：１００の希釈率および１：１０００の希釈率の五重突然変異毒素Ｂ細胞溶解濃縮液を評価した。五重突然変異毒素Ｂ濃度中のタンパク質の推定量は約１０００ｕｇ／ｍＬである。ブロット上で示すように、五重突然変異毒素Ｂ（濃縮）は、約２７０ｋＤで予想された大きさのタンパク質バンドを示す。

【実施例9】

【0427】

形質転換体の安定性
再編成されたプラスミドは、一般的に使用されているＤＨ５α大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）実験室株を用いて得た。対照的に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｔｂｌ２（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主を使用した形質転換は、３０℃、ＬＢクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）プレート上で３日間の成長の後に成長の遅い完全長の突然変異毒素組換え体をもたらした。関連のＳｔｂｌ３（商標）およびＳｔｂｌ４（商標）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ではより低いクローニング効率が得られたが、これらの細胞系はプラスミド維持のために安定であることが見出された。続いて形質転換体を寒天または液体培養中、クロラムフェニコール選択下、３０℃で繁殖させた。また、無動物トリプトン−ダイズに基づく培地と比較して、ＬＢ（ミラー）培地の使用も形質転換体の回収および成長を改善させることが見出された。

【実施例10】

【0428】

野生型または遺伝的突然変異毒素の遺伝子をコードしているｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘを用いたシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の形質転換
Ｈｅａｐら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００９．７８（１）：ｐ．７９〜８５に本質的に記載されているように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）接合伝達によるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の形質転換を行った。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＣＡ４３４を野生型または変異体突然変異毒素の遺伝子をコードしているｐＭＴＬ８４１２１ｆｄｘで形質転換させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主ＣＡ４３４は、発現プラスミドをシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）産生株ＶＰＩ１１１８６ ｓｐｏ０Ａ１内に動員するための中間体である。ＣＡ４３４は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＢ１０１の誘導体である。この株は、Ｋｍ、Ｔｃ、Ｓｕ、Ｓｍ／Ｓｐｅ、およびＨｇに対する耐性を与える（Ｔｎ１８３１による）Ｔｒａ＋Ｍｏｂ＋Ｒ７０２接合性プラスミドを宿している。化学的コンピテントまたは電気的コンピテントなＣＡ４３４細胞を調製し、発現ベクター形質転換体をミラーＬＢ ＣＡＭプレート上、３０℃で選択した。３日間後に出現する成長の遅いコロニーを拾い、３ｍＬのＬＢクロラムフェニコール培養中で対数期中間（約２４時間、２２５ｒｐｍ、オービタルシェーカー、３０℃）まで増幅した。線毛の破壊を避けるために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物を低速（５，０００ｇ）遠心分離によって収集し、広口径のホールピペットを用いて細胞ペレットを１ｍＬのＰＢＳに穏やかに再懸濁させた。細胞を低速遠心分離によって濃縮した。ほとんどのＰＢＳを反転によって除去し、排水したペレットを嫌気性チャンバ内に移し、０．２ｍＬのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養で再懸濁させ、ＢＨＩＳ寒天プレート上にスポットし、８時間または終夜成長させた。突然変異毒素Ａ形質転換体の場合は、終夜の接合でより良好な結果が得られた。細胞パッチを０．５ｍＬのＰＢＳ内に掻爬し、０．１ｍＬを、１５μｇ／ｍＬのチアムフェニコール（クロラムフェニコールのより強力な類似体）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ドナー細胞を死滅させるためのＤ−シクロセリン／セフォキシチンを添加したＢＨＩＳ選択培地上にプレートした。１６〜２４時間後に出現する形質転換体を、新しいＢＨＩＳ（および添加物）のプレート上に再画線することによって精製し、その後の培養物を組換え毒素または突然変異毒素の発現について試験した。グリセロール永久体および種ストックは良好な発現を示すクローンから調製した。また、プラスミドのミニプレップも、細胞をリゾチームで前処理した、改変したＱｉａｇｅｎキットの手順を使用した２ｍＬの培養物から調製した（必須ではない）。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ミニプレップＤＮＡはクローンの完全性を確認するためのＰＣＲ配列決定の鋳型として使用した。あるいは、プラスミドのマキシプレップＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｓｔｂｌ２（商標）形質転換体から調製し、配列決定した。

【実施例11】

【0429】

毒素ＡおよびＢ三重突然変異体（それぞれ配列番号４および６）ならびにヘプタＢ突然変異体（配列番号８）のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）発現分析
形質転換体を２ｍＬの培養（ルーチン分析用）または空気抜きキャップ付フラスコ（時間経過実験用）のいずれかで成長させた。試料（２ｍＬ）を簡単に遠心分離して（１０，０００ｒｐｍ、３０秒間）細胞を濃縮した。上清をデカントし、１０×濃縮した（Ａｍｉｃｏｎ−ｕｌｔｒａ３０ｋ）。ペレットを排水し、−８０℃で凍結した。細胞ペレットを氷上で解凍し、１ｍＬの溶解バッファー（トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５％のグリセロール）中に再懸濁させ、超音波処理した（マイクロチップを用いて１×２０秒間のバースト）。溶解物を４℃で遠心分離し、上清を５倍に濃縮した。上清および溶解物の試料を試料バッファーと合わせ、熱処理した（１０分間、８０℃）後、２つ組の３〜８％のトリス−アセテートＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。１つのゲルをクマシーで染色し、２つ目のゲルをウエスタン分析のために電気ブロッティングした。毒素Ａ特異的および毒素Ｂ特異的なウサギ抗血清（Ｆｉｔｇｅｒａｌｄ、Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）を使用して突然変異毒素ＡおよびＢ変異体を検出した。また、七重突然変異毒素Ｂ（配列番号８）の発現もウエスタンブロットハイブリダイゼーションによって確認された。

【実施例12】

【0430】

突然変異毒素のグルコシルトランスフェラーゼ活性の抑止
遺伝的二重突然変異体（ＤＭ）毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号３および５）ならびに三重突然変異体（ＴＭ）毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）は、ＵＤＰ−^１４Ｃ−グルコース［３０μＭ］、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２、１００ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ_２、２ｍＭのＭｎＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、および０．１μｇ／μＬのＢＳＡの存在下におけるｉｎ ｖｉｔｒｏグルコシル化アッセイにおいて、^１４Ｃ−グルコースを１０μｇのＲｈｏＡ、Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２ ＧＴＰａｓｅへと移行させなかった。しかし、野生型ＡおよびＢ毒素対照（それぞれ配列番号１および２を有する）は、それぞれ１０および１ｎｇの低い用量（およびさらに低い用量−データ示さず）で^１４Ｃ−グルコースをＧＴＰａｓｅに効率的に移行させた（図４Ａおよび４Ｂ）。このことは１００μｇの突然変異毒素の存在下にも当てはまり（図４Ｂ）、これはそれぞれの野生型毒素と比較して少なくとも１００，０００倍の低下を示す。同様の結果がＣｄｃ４２ ＧＴＰａｓｅでも検出された（データ示さず）。

【0431】

具体的には、図４Ｂでは、野生型毒素Ａおよび毒素Ｂ（１ｎｇ）または三重突然変異毒素Ａおよび三重突然変異毒素Ｂ（１００μｇ）を、ＲｈｏＡ ＧＴＰａｓｅと共に、ＵＤＰ−^１４Ｃ−グルコースの存在下で２時間、３０℃でインキュベーションした。例示したように、１ｎｇの野生型ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢは^１４Ｃ−グルコースをＲｈｏＡへと移行させたが、１００μｇの三重突然変異毒素Ａおよび三重突然変異毒素Ｂは移行させなかった。１ｎｇの野生型ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢをそれぞれの１００μｇの三重突然変異毒素Ａまたは三重突然変異毒素Ｂと共に反応内に添加した場合はＲｈｏＡのグルコシル化が検出され、これはグルコシル化阻害剤の欠如を示す。グルコシル化活性の検出の感度は、１００μｇの突然変異毒素のバックグラウンド中に１ｎｇの野生型毒素であると確立された（１：１００，０００の比）。結果は、三重突然変異毒素Ａおよび三重突然変異毒素Ｂ中のグルコシルトランスフェラーゼの活性部位中の突然変異がすべての測定可能な（それぞれの野生型毒素の活性と比較して１００，０００倍未満低い活性）グルコシルトランスフェラーゼ活性を低下させたことを示している。また、グルコシル化ＧＴＰａｓｅのＴＣＡ沈降によってグルコシルトランスフェラーゼ活性を定量する同様のアッセイも開発された。

【実施例13】

【0432】

自己触媒的システインプロテアーゼ活性の抑止
システインプロテアーゼ切断部位を突然変異させた場合に、三重遺伝的突然変異体ＡおよびＢ（ＴＭ）（それぞれ配列番号４および６）において自己触媒的切断の機能が抑止された。図５に例示したように、野生型（ｗｔ）毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号３および５）はイノシトール−６−リン酸の存在下で切断される。また、野生型と同様に、二重突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号３および５）もイノシトール−６−リン酸の存在下で切断される（データ示さず）。毒素Ａ（配列番号３）は切断されて３０８ｋＤａから２４５および６０ｋＤａの２つの断片となる。毒素Ｂ（配列番号５）は切断されて２７０ｋＤａから２０７および６３ｋＤａの２つの断片となる。三重遺伝的突然変異体ＡおよびＢ（ＴＭ）（それぞれ配列番号４および６）は、イノシトール−６−リン酸の存在下でさえもそれぞれ３０８および２７０ｋＤａで影響を受けずに保たれる。図５を参照されたい。したがって、システインプロテアーゼ活性が遺伝子修飾によって失活された。

【0433】

より具体的には、図５では、１μｇの三重突然変異体Ａおよび三重突然変異体Ｂを、９０分間、室温（２１±５℃）で、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓからの野生型ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢと並行してインキュベーションした。切断反応を２０μＬの体積で、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭのＤＴＴ中、イノシトール−６−リン酸の存在または非存在下（ＴｃｄＡには１０ｍＭおよびＴｃｄＢには０．１ｍＭ）で行った。その後、反応体積の全体を３〜８％のＳＤＳ／ＰＡＧＥにローディングし、タンパク質バンドを銀染色によって可視化した。例示したように、ｗｔ ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢはイノシトール−６−リン酸の存在下でそれぞれ２４５ｋＤおよび６０ｋＤならびに２０７ｋＤおよび６３ｋＤの２つのタンパク質バンドへと切断された。三重突然変異毒素Ａおよび三重突然変異毒素Ｂは切断されず、したがって、三重突然変異毒素Ａ中のＣ７００Ａ突然変異および三重突然変異毒素Ｂ中のＣ６９８Ａ突然変異が切断を遮断したことが確認された。

【実施例14】

【0434】

三重突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）の残留細胞毒性
遺伝的突然変異毒素をその細胞毒性についてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイによってヒト二倍体肺線維芽細胞系であるＩＭＲ９０細胞において評価した。これらの細胞は毒素ＡおよびＢのどちらにも感受性がある。代替の好ましい一実施形態として、毒素ＡおよびＢに対して合理的な感受性を有することが観察されているため、ミドリザル（Ｃｅｒｃｏｐｉｔｈｅｃｕｓ ａｅｔｈｉｏｐｓ）からのＶｅｒｏ正常腎細胞を細胞毒性アッセイに使用し得る。好ましくは、ＶｅｒｏおよびＩＭＲ９０細胞系と比較して毒素に対する感受性が有意に減少しているため、ＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞は細胞毒性アッセイに使用しない。たとえば以下の表６を参照されたい。

【0435】

【表14】

【0436】

段階希釈した遺伝的突然変異毒素またはｗｔ毒素試料を、９６ウェル組織培養プレート中で成長させた細胞単層に加えた。３７℃で７２時間インキュベーションした後、相対発光量（ＲＬＵ）として表すルミネセンスを生じるルシフェラーゼに基づくＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ）を加えることによって細胞ＡＴＰレベルを測定することによって、プレートを代謝活性細胞について評価した。高いＲＬＵは細胞が生存していることを示し、低いＲＬＵは細胞が代謝的に活性でなく死滅しつつあることを示す。ＥＣ_５０として表す細胞毒性のレベルは、細胞培養対照におけるレベルと比較して５０％のＲＬＵの低下を誘発するｗｔ毒素または遺伝的突然変異毒素の量として定義される（このアッセイの詳細は以下に提供する）。図６、表７Ａ、および表８Ａに示したように、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのＥＣ_５０値はそれぞれ約０．９２ｎｇ／ｍＬおよび０．００９ｎｇ／ｍＬであった。三重突然変異毒素Ａおよび三重突然変異毒素ＢのＥＣ_５０値はそれぞれ約８６００ｎｇ／ｍＬおよび７４ｎｇ／ｍＬであった。ｗｔ毒素と比較して約１０，０００倍の細胞毒性の低下にもかかわらず、どちらの遺伝的突然変異毒素も残留レベルの細胞毒性を依然として実証した。この残留細胞毒性は中和抗毒素モノクローナル抗体によって遮断することができ、このことは、これが三重突然変異毒素に特異的であったが、ｗｔ毒素の既知の酵素活性（グルコシル化または自己タンパク質分解）とは関連している可能性が低いことを示している。

【0437】

どちらのｗｔ毒素も強力なｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を示し、少量の毒素が細胞円形化（細胞変性効果すなわちＣＰＥ）および代謝活性の欠如（ＡＴＰレベルによって測定）などの哺乳動物細胞に対して様々な効果を引き起こすために十分であった。その結果、突然変異毒素原薬中に残留細胞毒性がまったく残らないことを確認するために、２つのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ（ＣＰＥすなわち細胞円形化アッセイおよびＡＴＰアッセイ）を開発した。結果は、１）細胞の５０％におけるＣＰＥの発生または２）相対光量で測定したＡＴＰレベルの５０％の低下を引き起こす毒素または突然変異毒素の量であるＥＣ_５０として表す。

【0438】

ＣＰＥアッセイでは、原薬の試料を段階希釈し、ＩＭＲ９０細胞と共にインキュベーションし、これを潜在的な細胞変性効果について観察する。ＣＰＥアッセイは０（正常細胞）から４（約１００％の細胞円形化）のスケールでスコアづけし、スコア２（約５０％の細胞円形化）が試験試料のＥＣ_５０値として定義される。この方法は、マトリックス干渉なしにこのアッセイで試験することができる最大耐用濃度である１０００μｇ／ｍＬの濃度で突然変異毒素原薬を試験するために使用する。その結果、ＥＣ_５０＞１０００μｇ／ｍｌとして報告される検出可能な細胞毒性は存在しない。

【0439】

ＡＴＰアッセイはＡＴＰから生じるルミネセンスシグナルの量の測定に基づいており、これは代謝活性細胞の数に比例する。アッセイ干渉なしにこのアッセイで試験することができる最大耐用濃度は約２００μｇ／ｍＬである。したがって、このアッセイにおいてＥＣ_５０＞２００μｇ／ｍＬとして報告される検出可能な細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｔｙ）は存在しない。

【0440】

毒素対照と並行して様々な濃度の突然変異毒素ＡおよびＢを細胞に加えた。アッセイのエンドポイントは、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞ＡＴＰレベルによって決定される細胞生存度であった。ルミネセンスの度合はＡＴＰレベルまたは生細胞数に比例する。

【0441】

野生型（ｗｔ）毒素Ａのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性（ＥＣ_５０）は９２０ｐｇ／ｍＬであり、毒素Ｂでは９ｐｇ／ｍＬであった。突然変異毒素Ａ（配列番号４）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性（ＥＣ_５０）は８６００ｎｇ／ｍＬであり、突然変異毒素Ｂ（配列番号６）では７４ｎｇ／ｍＬであった。これらの値はそれぞれ９３４８および８２２２倍の低下を表すが、残留細胞毒性はどちらの突然変異毒素でも検出された。

【0442】

言い換えれば、三重突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）の細胞毒性は、ｗｔ毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号１および２）の細胞毒性と比較して、ＩＭＲ−９０細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイにおいて有意に低下していた。図６に例示したように、どちらの三重突然変異毒素もｗｔ毒素と比較して細胞毒性の有意な低下を示したが（１０^４倍）、どちらの三重突然変異毒素でも残留細胞毒性がより濃度で観察された。

【0443】

さらに、それぞれの三重突然変異毒素の残留細胞毒性は毒素特異的抗体によって完全に中和することができる（たとえば、野生型毒素の毒性と比較して少なくとも６〜８ｌｏｇ_１０の毒性の低下）。以下の実施例１６を参照されたい。

【0444】

細胞培養アッセイは細胞毒性の検出においてｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルよりも感受性が高い。マウス致死的免疫誘発モデルにおいて腹腔内または静脈内経路のどちらかで送達した場合、ｗｔ ＴｃｄＡは約５０ｎｇ／マウスのＬＤ_５０を有する一方で、ｗｔ ＴｃｄＢは約５ｎｇ／マウスのＬＤ_５０を有しており、より強力である。対照的に、上述の細胞培養に基づくｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、ｗｔ ＴｃｄＡでは１００ｐｇ／ウェルおよびｗｔ ＴｃｄＢでは２ｐｇ／ウェルのＥＣ_５０値を有する。

【実施例15】

【0445】

遺伝的七重突然変異毒素Ｂ（配列番号８）の残留細胞毒性および五重突然変異毒素Ｂ（配列番号１８４）の細胞毒性
図７に例示したように、三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）（２０．７８ｎｇ／ｍＬ）および七重突然変異毒素Ｂ（配列番号８）（３５．９ｎｇ／ｍＬ）の突然変異体ではＥＣ_５０値が類似しており、これは、グルコシルトランスフェラーゼ活性部位およびＧＴＰａｓｅ基質結合部位をさらに修飾するための４つの追加の突然変異が遺伝的突然変異毒素の細胞毒性をさらに低下させなかったことを示す。ＥＣ_５０値は三重および七重突然変異毒素と同様に二重突然変異毒素Ｂ（配列番号５）についても類似していた（データ示さず）。この観察は、突然変異毒素の細胞毒性の機構が驚くべきことにグルコシルトランスフェラーゼおよび基質認識の機構とは独立していることを示唆している。

【0446】

五重突然変異毒素Ｂ（配列番号１８４）をその細胞毒性について上述のようにＩＭＲ９０細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏ ＡＴＰ細胞毒性アッセイによって評価した。たとえば実施例１４を参照されたい。図２６に示したように、五重突然変異毒素Ｂの細胞毒性は、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから購入した野生型毒素Ｂ（たとえば配列番号２）と比較して、かつ三重突然変異毒素Ｂ（配列番号８６）と比較して大いに低下していた。「細胞のみ」の対照はＩＭＲ−９０細胞に関する。それぞれのＥＣ_５０値を示す以下の表６２を参照されたい。

【0447】

【表15】

【0448】

さらに、ＩＭＲ−９０細胞において、五重突然変異毒素Ｂ（「ＰＭ−Ｂ」）（配列番号１８４）を三重突然変異毒素Ｂ（配列番号８６）によって媒介される細胞毒性の競合的阻害について評価した。図２７を参照されたい。試料を調製するために、三重突然変異毒素Ｂ（ＴＭ Ｂ）（配列番号８６）をすべてのウェルで２００ｎｇ／ｍＬ（１０×ＥＣ_５０）の一定濃度に保った。５μｇ／ｍＬから開始して２倍段階希釈した五重突然変異毒素Ｂを、三重突然変異毒素Ｂを含有するウェルに加えた。その後、ＩＭＲ−９０細胞を含有する９６ウェルプレートに試料を移し、その後、７２時間インキュベーションした。ＡＴＰアッセイを上述のように、たとえば実施例１４のように完了した。図２７に示すことができるように、五重突然変異毒素Ｂは三重突然変異毒素Ｂの細胞毒性を競合的に阻害した。

【実施例16】

【0449】

三重突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）の残留細胞毒性
残留細胞毒性の性質をさらに評価するために、突然変異毒素（配列番号４および６）を混合し、そのそれぞれの中和抗体と共にインキュベーションした後、混合物をＩＭＲ９０細胞単層に加えた。

【0450】

結果（図８）により、突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）の残留細胞毒性は、突然変異毒素Ａ（上部パネル、図８）および突然変異毒素Ｂ（下部パネル、図８）に特異的な中和抗体を用いて完全に抑止することができることが示された。漸増濃度の突然変異毒素Ａ（上部パネル）およびＢ（下部パネル）をウサギ抗毒素ポリクローナル（ｐＡｂ、１：１０の希釈率）またはマウスモノクローナル抗体（３．０ｍｇのＩｇＧ／ｍＬを含有するストックから１：５０の希釈率）と共にインキュベーションした後、ＩＭＲ９０細胞に加えた。ＩＭＲ９０細胞と共に３７℃で７２時間の処理インキュベーションの後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）基質を加え、相対光量（ＲＬＵ）を分光光度計でルミネセンスプログラムを用いて測定して、ＡＴＰレベルを測定した。ＡＴＰレベルが低ければ低いほど毒性が高い。対照には、その対応するＥＣ_５０値の４倍で加えたＴｃｄＡおよびＴｃｄＢが含まれていた。

【0451】

公開されている報告は、毒素のグルコシルトランスフェラーゼまたは自己触媒的プロテアーゼドメイン中の突然変異は毒性の完全な失活をもたらすことを示唆している。しかし、本発明者らのデータはこれらの公開されている報告と一致せず、これは、公開されている報告における粗培養溶解物に対して本発明者らの研究において試験した高度に精製された突然変異毒素のより高い濃度、１２時間未満で行った観察に対して突然変異毒素で処理した細胞の細胞円形化が観察されたより長い時点（たとえば、２４時間、４８時間、７２時間、もしくは９６時間）、公開されている報告中に開示されている細胞毒性アッセイにおけるＨＴ−２９ヒト結腸直腸腺癌細胞とは対照的に、本発明の細胞毒性アッセイにおける毒素に対して顕著により高い感受性を示す細胞系の使用、および／または突然変異毒素の残留毒性を駆動している可能性のあるグルコシル化以外の未知の活性もしくはプロセスに帰因させることができる。

【実施例17】

【0452】

遺伝的突然変異毒素の細胞毒性の新規機構
遺伝的突然変異毒素の残留細胞毒性の機構を調査するために、ＩＭＲ−９０細胞をｗｔ毒素Ｂ（配列番号２）または遺伝的突然変異毒素Ｂ（配列番号６）で処理し、Ｒａｃ１ ＧＴＰａｓｅのグルコシル化を処理の時間と共に研究した。試料を２４〜９６時間から採取し、細胞抽出物を調製した。Ｒａｃ１に対する２つの抗体を用いたウエスタンブロットによってグルコシル化Ｒａｃ１を非グルコシル化Ｒａｃ１から区別する。一方の抗体はＲａｃ１の両方の形態を認識し（２３Ａ８）、他方（１０２）は非グルコシル化Ｒａｃ１のみを認識する。図２２に例示したように、毒素Ｂでは、全Ｒａｃ１レベルは時間と共に変化せずに留まり、大多数のＲａｃ１がグルコシル化された。他方では、遺伝的突然変異毒素Ｂ（配列番号６）を用いた処理は全Ｒａｃ１の顕著な低下をもたらしたが、Ｒａｃ１はすべての時点でグルコシル化されていなかった。このことは、Ｒａｃ１レベルは遺伝的突然変異毒素を用いた処理によって負の影響を受けたが、ｗｔ毒素によっては受けなかったことを示す。図２２に例示したように、アクチンのレベルは毒素および遺伝的突然変異毒素Ｂで処理した細胞で類似しており、示した時点において偽処理した細胞と類似していた。これにより、遺伝的突然変異毒素が野生型毒素に駆動されるグルコシル化経路とは異なる機構によって細胞毒性を発揮したことが示された。

【実施例18】

【0453】

遺伝的突然変異毒素の化学的処理
４ｌｏｇの細胞毒性活性の低下を示す遺伝子改変した突然変異毒素が好ましいが、細胞毒性活性のさらなる低下（２〜４ｌｏｇ）が検討された。２つの化学的失活戦略が評価されている。

【0454】

第１の方法では、突然変異毒素を失活させるためにホルムアルデヒドおよびグリシンを使用する。ホルムアルデヒド失活は、ホルムアルデヒドとタンパク質上の第一級アミンとの間でシッフ塩基（イミン）を形成することによって起こる。その後、シッフ塩基はいくつかのアミノ酸残基（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ）と反応して分子内または分子間のどちらかの架橋結合を形成することができる。この架橋結合がタンパク質の構造を固定して、それを失活させる。さらに、ホルムアルデヒドはグリシンと反応してシッフ塩基を形成することができる。その後、グリシルシッフ塩基はアミノ酸残基と反応して分子間タンパク質−グリシン架橋結合を形成することができる。ホルムアルデヒドは遺伝的突然変異毒素の細胞毒性活性を検出可能な限界未満まで低下させた（三重突然変異体Ｂ（配列番号６）では＞８ｌｏｇ_１０および三重突然変異体Ａ（配列番号４）では＞６ｌｏｇ_１０の細胞毒性の低下）。しかし、ホルムアルデヒド失活（ＦＩ）の三重突然変異毒素を２５℃でインキュベーションした場合は、復帰変異が経時的に観察された。細胞毒性の復帰変異は、ＦＩ−三重突然変異毒素貯蔵溶液に少量のホルムアルデヒド（０．０１〜０．０２％）を加えることによって防止することができる。実施例２３を参照されたい。

【0455】

別の方法では、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）処理を使用して失活させた突然変異毒素を作製する。この方法では、ＥＤＣ／ＮＨＳがタンパク質上のカルボキシル基と反応して活性化エステルを形成する。その後、活性化エステルはタンパク質上の第一級アミンと反応して安定なアミド結合を形成することができる。ホルムアルデヒド反応と同様、この反応は分子内および分子間の架橋結合をもたらす。ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた処理によって形成されたアミド結合は、ホルマリン失活によって形成された不安定なイミン結合よりも安定かつ不可逆的である。活性化エステルとポリペプチド上の第一級アミンとの反応によって形成された架橋結合に加えて、グリシンおよびベータアラニン付加物がどちらも形成される場合がある。機構または理論に束縛されずに、未反応の活性化エステルを反応停止させるためにグリシンを加えた際にグリシン付加物が生じる。グリシンのアミンはポリペプチド上の活性化エステルと反応して安定なアミド結合を形成する。機構または理論に束縛されずに、活性化ベータアラニンとポリペプチド上の第一級アミンとの反応によってベータアラニン付加物が形成される。この反応は安定なアミド結合をもたらす。活性化ベータアラニンは３モルのＮＨＳと１モルのＥＤＣとの反応によって生成される。

【0456】

遺伝子改変した突然変異毒素（ネイティブ毒素と比較して６〜８ｌｏｇ）と比較して２〜４ｌｏｇの細胞毒性活性の低下を達成するために、化学的に失活させた突然変異毒素は≧１０００μｇ／ｍＬのＥＣ_５０値を有しているべきである。細胞毒性活性の低下に加えて、ドットブロット分析によって決定された主要なエピトープを保持することが有利であろう。現在までに、細胞毒性低下およびエピトープ認識の基準をどちらも満たすいくつかの反応条件が同定されている。失活させた突然変異毒素のいくつかのバッチが動物研究用に調製されており、いくつかの代表的なバッチからの分析データが表７Ａおよび７Ｂ、表８Ａおよび８Ｂに示されている。

【0457】

【表16】

【0458】

【表17】

【0459】

【表18】

【0460】

【表19】

【実施例19】

【0461】

発酵および精製
発酵は、上述のｆｄｘプロモーターが含まれる組換えクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の凍結供給源から開始した。凍結ストックはＯＤ_６００＝２．０とした細胞懸濁液および２０％のグリセロールであった。開始培養は、０．２ｍＬの培養ストックを５００ｍＬのＳＨＹＧ１０培地（３０ｇ／Ｌのダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫ、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物ＨＹ ＹＥＳＴ４１２、１０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコール、ｐＨ７）内に接種した。培地を５００ｍＬの通気式のボトルに含有させた。接種を慣用の生物学的安全性キャビネット内で行い、ボトルに窒素をフラッシュし、その後、ボトルを約１６〜１８時間、３７℃、慣用のインキュベーター内で静的に（通気口を閉じて）インキュベーションした。

【0462】

８ＬのＳＨＹＧ６０培地（３０ｇ／Ｌのダイズ加水分解物ＳＥ５０ＭＫ、２０ｇ／Ｌの酵母抽出物ＨＹ ＹＥＳＴ４１２、６０ｇ／Ｌのグルコース、１５ｍｇ／Ｌのチアムフェニコール、ｐＨ７）を含有する１０リットルのバイオリアクターを発酵段階に使用した。接種材料ボトルの５００ｍＬの内容物を発酵槽に接種し、これを３７℃、４００ｒｐｍ（１．４７ｍ／秒）、０．１ｖｖｍの窒素スパージを用いて稼働した。５ＮのＮａＯＨの自動添加によってｐＨを７．０に制御した。発酵は典型的には約２４時間実行して、ピーク効力に達成させた。発酵の経過中の成長はＯＤ_６００の読取りによって監視した。突然変異毒素の定量用に採取した試料を約５０００×ｇで遠心し、生じたペレットを−７０℃で凍結した。その後、細胞ペレットを解凍し、２０ｍＭのトリス、３ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．５からなるバッファーに再懸濁させ、４０の振幅で２０秒間超音波処理した。生じた細胞溶解液を５，０００×ｇで１０分間遠心した。上清をローディングバッファーおよび還元剤と合わせ、３．８％のトリス−アセテートＰＡＧＥゲル上を１５０ボルトで５０〜５５分間、信頼のおける毒素標準に対して流した。ゲルを終夜染色し、その後、脱染色し、走査型濃度計で定量した。典型的には、約１０〜１２のＯＤ_６００値が観察され、毒素値は８０〜１２０ｍｇ／Ｌであった。

【0463】

以下の表は突然変異毒素Ａの発酵データの一例である。

【0464】

【表20】

【0465】

突然変異毒素Ｂの発酵データの一例を以下の表に表す。

【0466】

【表21】

【0467】

組換えシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細胞を培養するためおよび／または突然変異毒素を産生させるための組成物および方法の改変が試験されており、本発明の範囲内にある。たとえば、ＳＥ５０ＭＫ（および別種としてＳＥ５０ＭＫ−ＮＫ、どちらもＦｒｉｅｓｌａｎｄ−Ｃａｍｐａｉｇｎａから供給）が窒素源の好ましい選択肢であったが、プロセスにおいて良好に作動した、他の製造者からの様々な他のダイズ加水分解物が同定された。酵母抽出物の非存在下でダイズ加水分解物が含まれる培養培地は予想された収率の３０〜４０％をもたらした。

【0468】

別の製造者からの酵母抽出物が同等の収率を支持することが示された。ダイズ加水分解物の非存在下で酵母抽出物が含まれる培養培地は予想された収率の６０〜７０％をもたらした。

【0469】

炭素源の非存在下におけるダイズ加水分解物／酵母抽出物に基づく培養培地の使用は約２〜３のＯＤ_６００および約１０〜１５ｍｇ／Ｌの毒素をもたらした。グルコースが培養の好ましい炭素源であるが、マンニトールで同等の結果が得られた。ボトル内の炭素源のスクリーニングにより、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）が、やはり炭素源の非存在下における培養培地と比較して高いＯＤ／収率を支持すると予想されるであろうフルクトースおよびマンノースも利用し得ることが示された。以下の炭素源、すなわちアラビノース、キシロース、スクロース、ラクトース、マルトース、グリセロール、ラムノースおよびガラクトースは、最適な成長を支持するようには考えられなかった。

【0470】

さらに、発酵時間を４８時間まで延長することは（追加のグルコースの添加を必要とする）、収率を実質的に改善させるようには考えられなかった。

【0471】

さらに、ｐＨ６．５および７．５での発酵は８０〜１２０ｍｇ／Ｌの予想範囲内の収量をもたらした。より極端なｐＨ（ｐＨ６．０または８．０）での発酵は、依然として予想されたＯＤ_６００値を与えたが、毒素の収量を低下させた（４０〜６０ｍｇ／Ｌ）。

【0472】

チアムフェニコールが存在しない培養培地を使用した発酵は、プラスミドの損失、たとえば、突然変異毒素Ｂをコードしているプラスミドでは約１０〜２０％および突然変異毒素Ａをコードしているプラスミドでは約３０〜４０％をもたらした。したがって、クロラムフェニコール誘導体が存在しない培養培地を発酵することは実行可能であった。

【0473】

また、発酵を稼働する代替の機序も試験し、本発明の範囲内にある。たとえば、発酵を４００ｒｐｍ以下で実行してもよく、また窒素オーバーレイを使用してもよい。これらの技法をどちらも試し、使用に成功した。

【0474】

さらに、モノクローナル抗体培地ＳＦＭ４ＭＡｂを試験し、約１０の細胞のＯＤ_６００および約４０ｍｇ／Ｌの突然変異毒素を与えることが示された。

【0475】

最後に、リン酸含有成分を発酵に加えることで、リン酸含有成分が存在しない培養培地と比較して毒素の産生が低下するように考えられる。

【0476】

発酵の終わりに発酵槽を冷却する。連続的な遠心分離によって細胞スラリーを回収し、適切なバッファーに再懸濁させる。細胞懸濁液の溶解は高圧ホモジナイズによって達成する。突然変異毒素Ａでは、ホモジネートを凝結させ、凝結させた溶液は連続的な遠心分離を受ける。この溶液を濾過し、その後、下流の処理のために移す。突然変異毒素Ｂでは、連続的な遠心分離によってホモジネートを清澄にし、その後、下流の処理のために移す。

【0477】

２つのクロマトグラフィーステップを使用して突然変異毒素Ａ（配列番号４）を精製し、続いて最終バッファー交換を行う。清澄にした溶解物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム上にローディングし、クエン酸ナトリウム勾配を使用して結合した突然変異毒素を溶出させる。その後、ＨＩＣカラムからの生成物プールを陽イオン交換（ＣＥＸ）カラム上にローディングし、塩化ナトリウム勾配を使用して結合した突然変異毒素Ａを溶出させる。精製した突然変異毒素Ａを含有するＣＥＸプールを、ダイアフィルトレーションによって最終バッファー中へと交換する。精製した突然変異毒素Ａを、ダイアフィルトレーションによって最終原薬中間体バッファー中へと交換する。ダイアフィルトレーション後、濃縮水を０．２ミクロンのフィルターを通して濾過した後に、化学的に失活させて最終原薬とする。タンパク質濃度は１〜３ｍｇ／ｍＬと目標とする。

【0478】

２つのクロマトグラフィーステップを使用して突然変異毒素Ｂ（配列番号６）を精製し、続いて最終バッファー交換を行う。清澄にした溶解物を陰イオン交換（ＡＥＸ）カラム上にローディングし、塩化ナトリウム勾配を使用して結合した突然変異毒素を溶出させる。クエン酸ナトリウムをＡＥＸカラムからの生成物プールに加え、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラム上にローディングする。クエン酸ナトリウム勾配を使用して結合した突然変異毒素を溶出させる。精製した突然変異毒素ポリペプチド（配列番号６）を含有するＨＩＣプールを、ダイアフィルトレーションによって最終バッファー中へと交換する。精製した突然変異毒素Ｂを、ダイアフィルトレーションによって最終原薬中間体バッファー中へと交換する。ダイアフィルトレーション後、濃縮水を０．２ミクロンのフィルターを通して濾過した後に、化学的に失活させて最終原薬とする。タンパク質濃度は１〜３ｍｇ／ｍＬを目標とする。

【実施例20】

【0479】

ホルムアルデヒド／グリシン失活
精製後、遺伝的突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）を４８時間、２５℃で、４０ｍＭ（１．２ｍｇ／ｍｌ）のホルムアルデヒドを使用して失活させる。失活はｐＨ７．０±０．５で、４０ｍＭ（３ｍｇ／ｍｌ）のグリシンを含有する１０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウムバッファー中で実施する。失活期間は、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ_５０が１０００ｕｇ／ｍＬを超えるまで低下するために必要な期間の３倍を超えるように設定する。４８時間後、生物活性はネイティブ毒素と比較して７〜８ｌｏｇ_１０低下している。４８時間のインキュベーション後、失活させた突然変異毒素を、ダイアフィルトレーションによって最終原薬バッファー中へと交換する。たとえば１００ｋＤの再生酢酸セルロース限外濾過カセットを使用して、失活させた毒素を１〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、バッファー交換する。

【実施例21】

【0480】

Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）失活
精製後、遺伝的突然変異毒素（配列番号４および配列番号６）を２時間、２５℃で、１ｍｇの精製した遺伝的突然変異毒素ＡおよびＢあたり０．５ｍｇのＥＤＣおよび０．５ｍｇのＮＨＳ（それぞれ約２．６ｍＭおよび４．４ｍＭ）を使用して失活させる。グリシンを１００ｍＭの最終濃度まで添加することによって反応を停止させ、反応をさらに２時間、２５℃でインキュベーションする。失活はｐＨ７．０±０．５で、１０ｍＭのリン酸塩、１５０ｍＭの塩化ナトリウムバッファー中で実施する。失活期間は、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ_５０が１０００ｕｇ／ｍＬを超えるまで低下するために必要な期間の３倍を超えるように設定する。２時間後、生物活性はネイティブ毒素と比較して７〜８ｌｏｇ_１０低下している。４時間のインキュベーション後、失活させた突然変異毒素を、ダイアフィルトレーションによって最終原薬バッファー中へと交換する。たとえば１００ｋＤの再生酢酸セルロース限外濾過カセットを使用して、失活させた毒素を１〜２ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、バッファー交換する。

【0481】

別段に記述しない限りは、実施例セクション中で使用する以下の用語は、実施例２１中の本説明に従って生成された組成物をいう：「ＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素」、「ＥＤＣで失活させた突然変異毒素」、「突然変異毒素［Ａ／Ｂ］原薬」、「ＥＩ−突然変異毒素」、「ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重突然変異毒素」。たとえば以下の用語は同義である：「ＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素Ａ」、「ＥＤＣで失活させた突然変異毒素Ａ」、「突然変異毒素Ａ原薬」、「ＥＩ−突然変異毒素Ａ」、「ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重突然変異毒素Ａ」。別の例として、以下の用語は同義である：「ＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素Ｂ」、「ＥＤＣで失活させた突然変異毒素Ｂ」、「突然変異毒素Ｂ原薬」、「ＥＩ−突然変異毒素Ｂ」、「ＥＤＣ／ＮＨＳ−三重突然変異毒素Ｂ」。

【0482】

突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬は、（１）それぞれの遺伝的三重突然変異毒素ポリペプチドをコードしているプラスミドを含有する毒素陰性シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株（ＶＰＩ１１１８６）を発酵することと（ダイズ加水分解物、酵母抽出物ＨＹ ＹＥＳＴ（商標）４１２（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、グルコース、およびチアムフェニコールが含まれる培地中）、（２）イオン交換および疎水性相互作用クロマトグラフィー手順を使用して遺伝的突然変異毒素（「原薬中間体」）を無細胞溶解物から少なくとも９５％より高い純度まで精製することと、（３）ＥＤＣ／ＮＨＳを用いて処理し、続いてグリシンを用いて反応停止／キャッピングすることによって化学的に失活させることと、（４）最終バッファーマトリックス中へと交換することとが含まれるバッチプロセスを使用してそれぞれ製造される。

【実施例22】

【0483】

失活および配合の条件を支持する研究
遺伝的突然変異毒素の化学的失活を最適化するために統計的実験設計（ＤＯＥ）を行った。ＤＯＥにおいて調査した要因には、温度、ホルムアルデヒド／グリシンの濃度、ＥＤＣ／ＮＨＳの濃度および時間が含まれていた（表９および１０）。生物活性の損失を監視するために、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ_５０値を決定した。さらに、処理後の様々な時点でのＩＭＲ−９０細胞の細胞形態も観察した。処理の７２時間後の形態を示す図９を参照されたい。タンパク質構造に対する効果を決定するために、毒素の様々なドメインに対して産生させたモノクローナル抗体のパネルを使用したドットブロット分析を使用して、エピトープ認識を監視した。

【0484】

【表22】

【0485】

【表23】

【0486】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素のホルムアルデヒド／グリシン失活では、最終反応条件は、エピトープ認識が最大限となる一方で所望の細胞毒性活性の低下のレベル（７〜８ｌｏｇ_１０）が達成されるように選択した。上記実施例２０を参照されたい。

【0487】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素のＥＤＣ／ＮＨＳ失活では、最終反応条件は、エピトープ認識が最大限となる一方で所望の細胞毒性活性の低下のレベル（７〜８ｌｏｇ_１０）が達成されるように選択した。上記実施例２１を参照されたい。

【0488】

代替実施形態では、アラニンを加えることによってＥＤＣ−ＮＨＳ反応を反応停止させ、これは反応を十分に停止させた。アラニンの使用は、反応をグリシンによって停止させる場合の修飾と同様の、突然変異毒素タンパク質上の修飾をもたらし得る。たとえば、アラニンを加えることによる反応停止は、突然変異毒素のグルタミン酸および／またはアスパラギン酸残基の側鎖上のアラニン部分をもたらし得る。別の代替実施形態では、グリシンメチルエステルを加えることによってＥＤＣ−ＮＨＳ反応を反応停止させ、これは反応を十分に停止させた。

【0489】

最適化した条件下での、化学的に失活させた三重突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび毒素Ｂの産生は、毒素特異的中和抗体に対するその反応性によって測定して抗原性を保持したままで、残留細胞毒性が検出不可能なレベルまでさらに低下することをもたらした（＞１０００μｇ／ｍＬ−ＣＰＥアッセイによって試験した最も高い濃度）。表２８に示した結果は、ｗｔ毒素からＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素までの段階的な細胞毒性の低下を実証する。免疫蛍光標識により、三重突然変異毒素（配列番号４および６）ならびに突然変異毒素原薬がＩＭＲ−９０細胞に対する匹敵する結合を示したことが確認され、これは、細胞毒性の損失は細胞との結合の低下が原因でないことを示唆している（データ示さず）。突然変異毒素Ａ原薬と比較して、突然変異毒素Ｂ原薬の方が高い細胞毒性の低下の倍数を達成し、これはＴｃｄＡと比較してＴｃｄＢで観察された約６００倍高い効力と一貫している。

【0490】

【表24】

【0491】

また、ＥＤＣ単独またはＥＤＣおよびスルホＮＨＳによって修飾された突然変異毒素Ｂの細胞毒性アッセイの結果も評価した。表２９を参照されたい。

【0492】

【表25】

【0493】

条件：三重突然変異毒素Ｂ（「ＴＭ ＴｃｄＢ」）（配列番号６）は突然変異毒素Ｂ：ＥＤＣ：スルホＮＨＳ＝１：０．５：０．９４の重量比で修飾した。この比は、実施例２１に記載の標準のＥＤＣ／ＮＨＳ反応に対するモル当量（スルホＮＨＳのより高い分子量について補正）である。スルホＮＨＳの影響を決定するために、スルホＮＨＳの比を標準の比の０．５×〜２×で変動させた。２つ組の反応を１×ＰＢＳ、ｐＨ７．０中、２５℃で行い、ＥＤＣ溶液を加えることによって開始させた。２時間後、１Ｍのグリシン、ｐＨ７．０（０．１Ｍの最終濃度）を加えることによって反応を停止させ、さらに２時間インキュベーションした。反応停止した反応を脱塩し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０装置を使用して突然変異毒素Ｂ原薬（「ＴＭ ＴｃｄＢ−ＥＤＣ」）を濃縮した、無菌的なバイアル内へと滅菌濾過し、細胞毒性アッセイにおける評価に供した。

【0494】

同じモル比で、スルホＮＨＳは、ＮＨＳの＞１０００ｕｇ／ｍＬと比較してＥＣ_５０を約２５０ｕｇ／ｍＬまで低下させた。２倍のモル比でさえも、スルホＮＨＳは細胞毒性を減少させることにおいてＮＨＳほど有効でないと考えられる。表３０を参照されたい。

【0495】

【表26】

【0496】

修飾の数および種類を決定するために、ＥＤＣ／ＮＨＳおよびＥＤＣ／スルホＮＨＳで失活させた三重突然変異毒素Ｂ試料の両方でペプチドマッピングを行った。同様の量のグリシン付加物、架橋結合およびデヒドロアラニン修飾がどちらの試料でも観察された。しかし、スルホＮＨＳ試料ではベータアラニンはまったく観察されなかった。

【0497】

標準のプロトコル（実施例２１を参照）を使用して野生型毒素Ｂ（配列番号２）を失活させた：毒素Ｂ：ＥＤＣ：ＮＨＳを１：０．５：０．５、２５℃で２時間、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．０中、その後、１Ｍのグリシン（０．１Ｍの最終濃度）を用いた反応停止およびさらに２時間のインキュベーション。試料を脱塩し、濃縮し、細胞毒性アッセイに供した。この試料のＥＣ_５０は＜２４４ｎｇ／ｍＬであった。

【実施例23】

【0498】

復帰変異研究
ホルムアルデヒド／グリシンまたはＥＤＣ／ＮＨＳで失活させたシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素のいずれかで復帰変異が起こるかどうかを決定するために、失活させた突然変異毒素の試料（１ｍｇ／ｍＬ）を２５℃で５〜６週間インキュベーションした。アリコートを毎週取り出し、ＩＭＲ９０細胞におけるＥＣ_５０値を決定した。１つのホルムアルデヒド／グリシンで失活させた試料はホルムアルデヒドを含有せず、１つの試料は０．０１％のホルムアルデヒドを含有していた。ＥＣ_５０はＣＰＥアッセイによって測定した。

【0499】

【表27】

【0500】

２５℃、残留ホルムアルデヒドの非存在下では、部分的な復帰変異が観察される（表１１）。５週間後に細胞毒性活性は約３倍増加した。細胞毒性活性は増加したが、５週間後にネイティブ毒素と比較して依然として７ｌｏｇ_１０の低下の低下が存在していた。復帰変異は、ホルマリンを０．０１０％の濃度で含めることによって完全に予防された。ＥＤＣ／ＮＨＳで失活させた試料では復帰変異は観察されなかった。６週間のインキュベーションの全体にわたって、ＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素Ａ（配列番号４）およびＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）の両方の４つのロットすべてにおいて、ＥＣ_５０値は＞１０００μｇ／ｍＬの開始レベルに保たれた。対照的に、ＦＩで処理した三重突然変異毒素Ａ（配列番号４）およびＦＩで処理した三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）のＥＣ_５０値は安定しておらず、許容されないほど低いＥＣ_５０値まで低下し、これは細胞毒性の増加または失活の復帰変異を示している。表１１を参照されたい。

【0501】

細胞毒性を検出不可能なレベルまで安定に低下させることに加えて（＞１０００μｇ／ｍＬ、ＣＰＥアッセイによって測定）、ＥＤＣ／ＮＨＳを使用して失活させた突然変異毒素は毒素中和ｍＡｂの標的である重要なエピトープを保持していた。表３１を参照されたい。ＦＩ突然変異毒素は同じ抗原決定基の損失を示した。

【0502】

【表28】

【実施例24】

【0503】

前臨床免疫原性研究
主要な前臨床目的には、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素ＡおよびＢが含まれる組成物を小動物および非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において試験することが含まれる。マウスおよびハムスターを免疫化して、とりわけ、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）組成物が突然変異毒素ＡおよびＢに対する中和抗体を誘発できるかどうかを決定した。マウス、ハムスター、およびカニクイザルマカクにおける一連の免疫化の後に、抗原を血清中和抗体応答の誘導について試験した。一部の実施形態では、遺伝的および／または化学的に失活させた突然変異毒素を、中性バッファー、リン酸アルミニウムバッファー、またはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸをアジュバントとして含有するバッファーのいずれか中で配合した。中和抗体応答は一般にそれぞれのブーストまたは最終用量の約２〜４週間後に試験した。

【0504】

毒素中和アッセイは、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＡまたはＴｃｄＢによって媒介される細胞毒性効果を中和する抗血清の能力を実証し、したがって試料中に存在する抗体の機能的活性を測定することができる。毒素中和アッセイを、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢのどちらにも感受性があるヒト肺線維芽細胞系、ＩＭＲ−９０に対して行った。手短に述べると、９６ウェルマイクロタイタープレートに、毒素媒介性細胞毒性の標的として役割を果たすＩＭＲ−９０細胞を播種した。それぞれの試験血清試料を、ＴｃｄＡおよびＴｃｄＢを中和する能力について別々に分析した。適切な段階希釈の試験抗血清を固定濃度のＴｃｄＡまたはＴｃｄＢと混合し、３７℃で９０分間、加湿インキュベーター内（３７℃／５％のＣＯ_２）でインキュベーションして、毒素の中和を行わせた。品質管理のために、すべてのプレートに参照標準および既知の力価の抗毒素抗体が含まれる対照を含めた。９０分後、毒素−抗血清の混合物をＩＭＲ−９０細胞単層に加え、プレートをさらに７２時間インキュベーションした。続いて、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）基質をアッセイプレートに加えて代謝活性細胞中に存在するアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）レベルを決定し、相対発光量（ＲＬＵ）として測定した。高いＡＴＰレベルは高い細胞生存度を示し、レベルは試料中に存在する抗体による毒素の中和の量に正比例する。前臨床データのために、ＲＬＵデータを試験抗血清試料の希釈率の値に対してプロットして、４パラメータロジスティック（４−ＰＬ）回帰応答当てはめ曲線を作成した。中和力価は、５０％の細胞毒性の低下を示した試料希釈率の値として表した。

【実施例25】

【0505】

マウス免疫原性研究：ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０６
この研究の目的は、それぞれ異なる方法によって化学的に失活させた突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂ（配列番号６）の２つの形態の免疫原性を評価することであった。この研究では、未処理の突然変異毒素Ｂ（配列番号６）（遺伝的に失活させたが化学的に失活させていない）を、アジュバントを用いてまたは用いずに対照として使用した。

【0506】

１０匹のマウスの群を、１０μｇの表１２による免疫原を用いて筋肉内で免疫化した。

【0507】

【表29】

【0508】

結果：マウスにおいてワクチン候補のそれぞれの投与後に有害事象は存在しなかった。図１０に例示したように、それぞれの群のマウスは、それぞれの突然変異毒素を用いた３回目の用量後に顕著な頑強な抗毒素Ｂ中和抗体を発生した。

【0509】

１２週目の力価に基づいて、マウスにおいてＥＤＣで失活させた突然変異毒素Ｂ（第２群）およびホルマリンで失活させた突然変異毒素（第１群）は強力な中和応答を生じたと考えられる。

【0510】

化学的失活が存在しない場合には、遺伝的突然変異毒素Ｂ（配列番号６）が２回の用量後に中和応答を生じ（第３〜４群、８週目）、これらを３回目の用量後にブーストした（第３〜４群、１２週目）。

【実施例26】

【0511】

マウス免疫原性研究：ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０７：
この研究の目的は、化学的に失活させたシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）の単独または組合せのどちらかの免疫原性を評価することであった。すべての群の免疫原はリン酸アルミニウムをアジュバントとして用いて配合した。

【0512】

５匹のマウスの群、１０μｇの表１３による免疫原を用いて筋肉内で免疫化した。

【0513】

【表30】

【0514】

結果：マウスにおいてワクチン候補のそれぞれの投与後に有害事象は存在しなかった。図１１に例示したように、化学的に失活させた遺伝的突然変異毒素の２回の用量後に、抗毒素Ａ中和抗体（第３〜５群）は３〜４ｌｏｇ_１０の力価までブーストされた一方で、抗毒素Ｂ中和抗体（第１〜２、５群）は低い〜検出不可能に保たれ、これは上述のマウス研究からのデータと一貫している（図１０）。抗毒素Ｂ中和抗体は第１、２、および５群において３回目の用量後に２〜３ｌｏｇ_１０までブーストされており（１２週目の力価）、４回目の用量の２週間後にそのピークに達した（１４週目の力価）。第３〜５群の抗毒素Ａ中和抗体の力価は、３回目（１２週目の力価）および４回目の免疫化（１４週目の力価）後にわずかに増加した。

【実施例27】

【0515】

ハムスター免疫原性研究：ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０２：
この研究の目的は、シリアンゴールデンハムスターモデルにおけるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）三重突然変異体ならびに化学的に失活させた突然変異毒素ＡおよびＢの免疫原性および保護潜在性を評価することであった。シリアンゴールデンハムスターモデルは、ヒトＣＤＡＤを刺激するための最良の利用可能な免疫誘発モデルを表す。マウス研究ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０７で使用したものと同じバッチの突然変異毒素ＡおよびＢをこの研究で使用した。対照として、１つの群にはアルミニウム含有アジュバントなしで突然変異毒素を与えた。

【0516】

５匹のシリアンゴールデンハムスターの群を、１０μｇの表１４による免疫原を用いて筋肉内で免疫化した。

【0517】

【表31】

【0518】

結果：突然変異毒素を用いた免疫化後に有害事象は観察されなかった。図１２に例示したように、単一用量の突然変異毒素の後、抗毒素Ａ中和応答はホルマリンで失活させた突然変異毒素（第１〜２群）では２〜３ｌｏｇ_１０であり、ＥＤＣで失活させた突然変異毒素（第３群）では３〜４ｌｏｇ_１０であった。第２の用量後、抗毒素Ａ抗体は３つの群すべてでブーストされていた。３つの群すべての抗毒素Ａ抗体は、３回目の用量後に増加したようには考えられなかった。４回目の免疫化後に同様の結果が観察され、アルミニウムアジュバントを含有しなかったホルマリン失活の群（第２群）において力価の増加が観察された。

【0519】

抗毒素Ｂ中和応答はホルマリンで失活させた突然変異毒素の群（第１〜２群）において検出不可能であり、ＥＤＣで失活させた突然変異毒素（第３群）では単一用量後に２ｌｏｇ_１０をわずかに上回っていた。第２の用量後、２つのホルマリン失活の群（第１〜２群）における抗毒素Ｂ中和抗体の力価は３〜４ｌｏｇ_１０まで増加した一方で、ＥＤＣ失活の群（第３群）におけるものは４〜５ｌｏｇ_１０まで増加した。３つの群すべてにおいて、３回目および／または４回目の用量後に抗毒素Ｂ中和抗体の力価の増加が観察され、すべての群で１６週目にピーク力価に達した（最後の用量の後）。図１２を参照されたい。

【0520】

図１３では、化学的に失活させた遺伝的突然変異毒素に対する中和抗体応答のレベル（図１２）を、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州、Ｃａｍｐｂｅｌｌ）（本明細書中で「Ｌｉｓｔ Ｂｉｏ」または「Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ」とも呼ぶ）トキソイド（すなわち、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入したトキソイドは野生型毒素のホルマリン失活によって調製し、対照試薬を使用してハムスター免疫誘発モデルを確立した）によって誘発させたものと比較した。

【0521】

本明細書中で使用する図および表中の「ＦＩ」とは、別段に記述しない限りは２日間、２５℃での毒素のホルマリン／グリシン処理をいう。本明細書中で使用する図および表中の「ＥＩ」とは、別段に記述しない限りは４時間、３０℃でのＥＤＣ／ＮＨＳ処理をいう。図１３では、５匹のハムスター動物をそれぞれの突然変異毒素組成物で処置した一方で、１１匹のハムスター動物をＬｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入したトキソイドで処置した。

【0522】

図１３のデータは、表１４に従って投与したハムスターでは、ＥＤＣで失活させた突然変異毒素が含まれる免疫原性組成物によって誘導された毒素Ａ（図１３Ａ）および毒素Ｂ（図１３Ｂ）に対するそれぞれの中和抗体の力価は、２回の用量後に、Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓトキソイドによって誘発されたそれぞれの中和抗体の力価よりも高い。

【実施例28】

【0523】

ハムスター免疫原性研究：シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ｈａｍ２０１０−０２（継続中）
突然変異毒素の保護効率を評価するために、免疫化したハムスターおよび免疫化していない動物の１つの対照群に、正常な腸管内菌叢を乱すために経口量のクリンダマイシン抗生物質（３０ｍｇ／ｋｇ）を最初に与えた。５日後、経口量の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子（６３０株、１００ｃｆｕ／動物）を用いてハムスターを免疫誘発した。動物を免疫誘発後の１１日間、ハムスターでは濡れた尾部として知られるＣＤＡＤの兆候について毎日監視した。いくつかの異なるパラメータを臨床的にスコアづけするシステムを使用して、重度のＣＤＡＤを有すると決定された動物を安楽死させた。パラメータには、刺激後の活動、脱水、排泄物、温度、および重量などが含まれており、これらは当技術分野で知られている。

【0524】

１１日目に研究を終了し、すべての生存している動物を安楽死させた。図１４は、免疫化していない対照と比較した３つの免疫化した群（第１〜３群、表１４に従う）のそれぞれの生存曲線を示す。図からも明らかなように、免疫化していない動物はすべて重度のＣＤＡＤを発生し、免疫誘発後１〜３日目に安楽死を必要とした（０％の生存）。ホルマリンで失活させた突然変異毒素を投与したどちらの群も６０％の生存曲線を有しており、動物は３日目（第１群）または４日目（第２群）まで安楽死を必要としなかった。ＥＤＣで失活させた突然変異毒素を投与した群は８０％の生存曲線を有しており、（５匹のうち）１匹の動物が７日目に安楽死を必要とした。したがって、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子でハムスターは致死的免疫誘発から保護された。

【実施例29】

【0525】

ハムスター免疫原性研究：ｈａｍＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０３：遺伝的および化学的に失活させたシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素の免疫原性
この研究の目的は、シリアンゴールデンハムスターモデルにおけるアジュバントなしのシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）三重突然変異体ならびに化学的に失活させた突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）の免疫原性を評価することであった。マウス研究ｍｕＣ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ２０１０−０７で使用したものと同じバッチの突然変異毒素ＡおよびＢ（それぞれ配列番号４および６）をこの研究で使用した。対照として、１つの群（第１群）にはリン酸緩衝溶液をプラセボとして与えた。

【0526】

５または１０匹のシリアンゴールデンハムスターの群を、表１５による免疫原を用いて免疫化した。動物に３回の用量を与えた。さらに、動物を２週間ごとに投薬した。

【0527】

【表32】

【0528】

結果：図１５を参照されたい。プラセボ対照群では抗毒素ＡまたはＢ抗体は観察されなかった。１回の用量の後、ホルマリンで失活させた群（第２群）および遺伝的突然変異毒素の群（第４群）では抗毒素Ａ中和抗体が２〜３ｌｏｇ_１０で観察され、ＥＤＣ失活の群（第３群）では３〜４ｌｏｇ_１０で観察された。抗毒素Ａ中和抗体は、これらの群のそれぞれ（２〜４）において関連する突然変異毒素を用いた第２の免疫化後に増加した（図１５の２週目から３週目での力価を比較）。突然変異毒素の３回目の用量の後（４週目に与えた）、第２〜４群における抗毒素Ａ中和抗体の力価はその４週目の力価と比較して増加した。

【0529】

抗毒素Ｂ中和抗体は第２の用量後に検出可能であり、ホルマリンで失活させた（第２群）およびＥＤＣで失活させた（第３群）抗毒素Ｂ中和抗体は３〜４ｌｏｇ_１０まで増加し、遺伝的三重突然変異体（第４群）は２〜３ｌｏｇ_１０まで増加した。３回目の免疫化の後（４週目）、抗毒素Ｂ中和抗体の力価は、ホルマリンで失活させた突然変異毒素（第２群）および遺伝的突然変異毒素（第４群）では３〜４ｌｏｇ_１０までブーストされ、ＥＤＣで失活させた突然変異毒素（第３群）では４〜５ｌｏｇ_１０までブーストされた。

【0530】

抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ中和抗体のどちらでも、ワクチン接種したすべての群（第２〜４群）においてピーク力価は６週目（用量３後）に観察された。

【0531】

Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸをアジュバントとした免疫原性組成物の評価
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧ２４５５５（Ａｌｈ／ＣｐＧ）を用いて配合した、化学的に失活させた突然変異毒素が含まれる免疫原性組成物で免疫化したハムスターは、頑強な中和抗毒素抗血清を生じた。Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ中で配合した突然変異毒素で免疫化した群は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを単独で用いて配合したワクチンと比較して、ピーク抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ応答が２〜３倍高く、統計的に有意であったことが観察された。５０％の中和力価を示す表３２を参照されたい。１００μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、または２００μｇのＣｐＧ２４５５５＋１００μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ、または１０ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸを用いて配合したそれぞれ１０μｇの突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬を用いて、ハムスター（ｎ＝１０匹／群）を０、２、および４週間目にＩＭで免疫化した。血清をそれぞれの時点で採取し、機能的抗毒素活性の毒素中和アッセイで分析した。相乗平均力価を表３２に提供する。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ群の力価と比較した場合のアスタリスク（^＊）は統計的有意性を示す（ｐ＜０．０５）。

【0532】

【表33】

【0533】

これらのアジュバントを用いて配合した突然変異毒素原薬が含まれる免疫原性組成物の保護効率を試験した。ハムスターを免疫化し、５週目に経口クリンダマイシン（３０ｍｇ／ｋｇ）を与え、上述の方法に従って免疫誘発した。免疫化していないハムスターの１つの群（ｎ＝５匹）を対照として含めた。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ単独と比較して（７０％の生存）、Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのいずれかをアジュバントとした突然変異毒素原薬で免疫化したハムスターにおいて有効性の増加が観察された（１００％の生存）。したがって、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子でハムスターは致死的免疫誘発から保護された。

【実施例30】

【0534】

カニクイザルマカクにおけるクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）のワクチン接種
この研究の目的は、カニクイザルマカクにおいて低および高用量のＥＤＣで失活させたおよびホルマリンで失活させたシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）突然変異毒素の免疫原性を試験することであった。すべての突然変異毒素は、アジュバントなし対照として役割を果たした１つの群（第５群）以外は、アジュバントとしてＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）中で配合した。

【0535】

【表34】

【0536】

結果：図１６は、これらの動物における０、２、３、４、６、８、および１２週目での抗毒素中和抗体応答を示す。抗毒素Ａの力価は５つの群すべてで単一用量後に（２週目の力価）２〜３ｌｏｇ_１０であった。これらの力価は、それぞれの群においてそれぞれの続く用量後にブーストされた。これらの動物では、３および４週目の間で力価の低下はなかった。すべての群でピーク力価は４〜５ｌｏｇ_１０であった。すべての時点で、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸアジュバントを含まない群（第５群）が最も低い力価を有しており、これは、免疫応答をブーストすることにおけるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸの有用性を示している。アジュバントなしの対照群（第５群）は１２週目にピーク力価に達し、高用量のＥＤＣで失活させた突然変異毒素で免疫化した群（第４群）も同様であった。すべての他の群は、最後の用量の２週間後である６週目にピーク力価に達した。すべての群の力価は第２の用量後（３週目の時点）にブーストされた。抗毒素Ａ応答と同様、抗毒素Ｂ応答は３週目から４週目で減少しなかった。３回目の用量後（６週目の時点）、すべての群の抗毒素Ｂ中和抗体の力価は、どちらも４ｌｏｇ_１０をわずかに上回る力価を有していた低用量のホルマリン失活の群（第１群）および高用量のＥＤＣ失活の群（第４群）以外は３〜４ｌｏｇ_１０であった。ピーク力価は、８週目にピーク力価を有していた低用量のＥＤＣ失活の群（第３群）以外は、すべての群で１２週目に観察された。すべての群はピーク力価＞４ｌｏｇ_１０を有していた。

【実施例31】

【0537】

モノクローナル抗体の産生
毒素ＡおよびＢは多くの構造的相同性を共有しているが、抗体の中和活性は毒素特異的であることが見出された。本発明では、個々の毒素に特異的であり、様々なエピトープおよび機能的ドメインに向けられており、ネイティブ毒素に対して高い親和性および強力な中和活性を有するいくつかの抗体を同定した。市販のホルマリンで失活させた（ＦＩ）突然変異毒素または組換えホロ突然変異毒素（配列番号４および６）のいずれかで免疫化したマウスから単離した抗体は、それぞれ毒素ＡおよびＢ ｍＡｂを産生するためのその触媒部位中に特定の突然変異を導入することによって、無毒性となった。抗体のエピトープマッピングにより、毒素Ａに対するｍＡｂの圧倒的大多数（５２個のうちの４９）が毒素の非触媒的Ｃ末端ドメインに向けられていたことが示された。

【0538】

毒素Ｂに対するモノクローナルはタンパク質の３つのドメインを標的としていた。合計１７個の毒素Ｂ特異的ｍＡｂのうち、６個はＮ末端（たとえば６３０などの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢのアミノ酸１〜５４３）に特異的であり、６個はＣ末端（たとえば６３０などの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢのアミノ酸１８３４〜２３６６）に特異的であり、５個は中間転位ドメイン（たとえば６３０などの野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＴｃｄＢのアミノ酸７９９〜１８３３）に特異的であった。したがって、突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素（たとえば配列番号４および６）を免疫化抗原として使用する手法は、突然変異毒素の抗原構造に有害な影響を与える傾向があるホルマリン失活プロセスと比較して、全部でなくてもほとんどの抗原エピトープを提示する主要な利点を提供する。

【実施例32】

【0539】

配列番号３６のアミノ酸配列を有する可変軽鎖および配列番号３７のアミノ酸配列を有する可変重鎖が含まれる毒素Ａ ｍＡｂ、Ａ３−２５の特徴づけ。
ｍＡｂ Ａ３−２５抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡの一般的に入手可能なアイソタイプ決定キットを使用してその免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプ決定を定義するすべての試みを許容しなかったため、特に興味深いものであった。Ｉｇ Ｈ鎖に特異的な抗血清を用いたウエスタンブロットによるさらなる分析により、Ａ３−２５は、ｍＡｂ産生において稀な事象であるＩｇＥアイソタイプのものであることが示された。このことは、Ａ３−２５ハイブリドーマ細胞から単離したｍＲＮＡのヌクレオチド配列決定によってさらに確認された。Ａ３−２５のＨおよびＬ鎖の可変領域のヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配列を図１７に示す。

【0540】

シー・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症および疾患の動物モデルにおいてＡ３−２５ ｍＡｂをさらに評価するために、公開されている方法に従ってεＨ鎖の可変領域をマウスγ重鎖上に分子移植することによって、そのＩｇアイソタイプをマウスＩｇＧ１へと変化させた。

【実施例33】

【0541】

毒素特異的抗体の中和能力およびエピトープマッピング
さらに、機能的／中和抗体を同定する試みとして、すべてのモノクローナルを、標準の細胞変性効果（ＣＰＥ）アッセイまたは細胞生存度の指示薬としてＡＴＰの測定に基づくよりストリンジェントかつ定量的なアッセイにおいて、野生型毒素を中和する能力について評価した。

【0542】

合計５２個の毒素Ａ特異的抗体のうち、４個のｍＡｂ（Ａ３−２５、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２およびＡ８０−２９（表１７および図１８））は様々なレベルの中和活性を示した。抗体エピトープをマッピングするためにＢｉａＣｏｒｅ競合的結合アッセイおよび血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイを行った。結果により、これらの抗体は毒素Ａタンパク質の様々なエピトープを標的とし得ることが示された（表１７）。タンパク質上の結合部位の位置をさらに同定するために、抗体を既知の配列の毒素断片を使用したウエスタンブロットまたはドットブロットアッセイにおいて個々に評価した。４つすべての中和ｍＡｂが毒素のＣ末端領域に向けられていることが見出された。

【0543】

合計１７個の毒素Ｂ特異的抗体のうち、９個が中和性であることが見出された。この９個の中和ｍＡｂのうち、６個がＢ毒素のＮ末端に向けられており、他の３個が転位ドメインに向けられていた（表１８）。Ｂｉａｃｏｒｅ競合的結合アッセイに基づいて、この９個の中和モノクローナル抗体は、図１９に示したように４つのエピトープ群に分類し得る。

【0544】

【表35】

【0545】

【表36】

【実施例34】

【0546】

有意に増強した中和活性を有する新規毒素Ａ抗体の組合せの同定：
４個の毒素Ａ ｍＡｂ（Ａ３−２５、Ａ６５−３３、Ａ６０−２２およびＡ８０−２９）は、ＡＴＰに基づく中和アッセイにおいて個々に試験した場合に不完全または部分的な毒素Ａの中和を示した。ｍＡｂ Ａ３−２５が最も強力な抗体であり、他の３つは中和性がより低く、Ａ８０−２９はバックグラウンドをかろうじて上回っていた（図１８）。しかし、図２０Ａ〜Ｃに示したように、Ａ３−２５を他の３つのｍＡｂのいずれか１つと組み合わせた場合、３つすべての組合せにおいて個々の抗体の中和の総合計よりもはるかに高い中和の相乗効果が観察された。さらに、３つすべての組合せが抗毒素Ａポリクローナル抗体で通常観察される完全な中和能力を示した。

【実施例35】

【0547】

有意に増強した中和活性を示す新規毒素Ｂ抗体の組合せの同定：
また、本発明者らは、ＢｉａＣｏｒｅ分析によって同定された異なるエピトープ群からの毒素Ｂ ｍＡｂでも相乗的な中和を観察した。第１群の最も優性なｍＡｂである毒素Ｂ ｍＡｂ Ｂ８−２６を第３群からの複数のｍＡｂと組み合わせた。組合せを毒素Ｂ特異的中和アッセイにおいて評価し、結果を図２１および表１９に示す。

【0548】

【表37】

【0549】

Ｂ８−２６をエピトープ群３のｍＡｂと組み合わせた場合に相乗的な中和効果が観察されたが（図２１Ｂ）、その他のｍＡｂでは観察されなかった（データ示さず）。

【実施例36】

【0550】

安全かつ有効な突然変異毒素組成物のためのｍＡｂによるｉｎ ｖｉｔｒｏスクリーニング：
遺伝子操作によって作製したシー・ディフィシル（Ｃ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の遺伝的突然変異毒素ＡおよびＢ（たとえば配列番号４および６）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを使用して残留細胞毒性を示した。本発明者らはそれぞれの突然変異毒素、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素について約４ｌｏｇの細胞毒性の低下を達成したが（表２０）、ホルマリン処理などの突然変異毒素のさらなる化学的失活が好ましいものであった。しかし、化学的失活処理は粗暴な場合があり、これらの毒素または突然変異毒素の主要な抗原エピトープに有害な影響を与える場合がある。

【0551】

【表38】

【0552】

バイオプロセスの最適化のために、ホルマリンおよびＥＤＣ／ＮＨＳ処理を使用した三重突然変異体ＴｃｄＡおよびＢ（１ｍｇ／ｍＬ）の化学的失活の統計的実験設計（ＤＯＥ）を行った。三重突然変異体ＴｃｄＡのホルマリン失活を最適化するために、本発明者らはホルマリン／グリシンの濃度（２０〜４０ｍＭ）、ｐＨ（６．５〜７．５）、および温度（２５〜４０℃）を変動させた。三重突然変異体ＴｃｄＢでは、ホルマリン／グリシン濃度を２〜８０ｍＭで変動させ、温度およびｐＨはそれぞれ２５℃および７．０であった。すべてのホルマリン処理のインキュベーション時間は２４時間であった。ホルマリン失活では、表２１および２３中の「４０／４０」は反応中で使用したホルマリンおよびグリシンの濃度を表す。ＥＤＣ／ＮＨＳ処理では、本発明者らはＥＤＣ／ＮＨＳの濃度を三重突然変異体ＴｃｄＡの０．２５〜２．５ｍｇ／ｍｇおよび三重突然変異体ＴｃｄＢの０．１２５〜２．５ｍｇ／ｍｇで変動させ、４時間、２５℃でインキュベーションした。反応の終わりに、すべての試料を１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ７．０中で脱塩した。精製後、処理したＴｃｄを残留細胞毒性およびドットブロット分析によってエピトープのｍＡｂ認識について分析した。目標は、中和ｍＡｂのパネルによって認識されるエピトープに負の影響を与えずに（＋＋＋＋または＋＋＋）細胞毒性を所望のレベルまで低下させる（ＥＣ_５０＞１０００μｇ／ｍＬ）処理条件を同定することであった。処理条件（表２１〜２４中にチェックマーク「∨」で印した）が、それぞれの野生型毒素の細胞毒性と比較して６〜８ｌｏｇ_１０の細胞毒性の低下を示しつつ少なくとも４つの中和ｍＡｂに対する反応性を保持した、潜在的に安全かつ有効な免疫原性組成物を与えた。選択した結果を表２１〜２４に例示する。三重突然変異毒素に対する処理条件を変動させることからのさらなるデータならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性および毒素中和アッセイからのデータを表３３および表３４に示す。また、たとえば、突然変異毒素の好ましい架橋結合処理条件に関するさらなる詳細を提供する上記実施例２０および２１も参照されたい。

【0553】

【表39】

【0554】

【表40】

【0555】

【表41】

【0556】

【表42】

【0557】

【表43-1】

【0558】

【表43-2】

【0559】

表３３で参照した三重突然変異毒素Ａ（配列番号４）の試料の化学的架橋結合反応条件
試料１〜４はＥＤＣ／ＮＨＳで修飾した。条件：３０℃、２０ｍＭのＭＥＳ／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５。反応はＥＤＣの添加によって開始させた。２時間の反応後、試料Ａ、Ｂ、およびＣに１Ｍのグリシンを５０ｍＭのグリシンの最終濃度まで加えた。試料Ｄにはグリシンを加えなかった。反応は、以下に示すように突然変異毒素Ａ（配列番号４）：ＥＤＣ：ＮＨＳの様々な重量比で設定した。
１ Ｌ４４１６６−１５７Ａ、１：０．２５：０．２５、ｗ：ｗ：ｗ
２ Ｌ４４１６６−１５７Ｂ、１：１．２５：１．２５
３ Ｌ４４１６６−１５７Ｃ、１：２．５：２．５
４ Ｌ４４１６６−１５７Ｄ、１：２．５：２．５

【0560】

試料５ Ｌ４４９０５−１６０Ａ、８０ｍＭのＨＣＨＯ、８０ｍＭのグリシン、８０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬの突然変異毒素Ａ（配列番号４）タンパク質、４８時間の反応、２５℃。

【0561】

試料６ Ｌ４４１６６−１６６、突然変異毒素Ａ（配列番号４）のＥＤＣ／ＮＨＳ修飾、２５℃、２０ｍＭのＭＥＳ／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５。突然変異毒素Ａ（配列番号４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：０．５：０．５。反応はＥＤＣの添加によって開始させた。２時間の反応後、１Ｍのグリシンを０．１Ｍのグリシンの最終濃度まで加え、さらに２時間インキュベーションした。この時点で、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５上で反応バッファーを１×ＰＢＳへと交換した。

【0562】

試料７ Ｌ４４９０５−１７０Ａ、８０ｍＭのＨＣＨＯ、８０ｍＭのグリシン、８０ｍＭのＮａＰＯ_４、ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬの突然変異毒素Ａ（配列番号４）タンパク質、４８時間の反応、３５℃。このホルマリン反応は、抗原結合が大幅に消失されるように過剰の架橋結合を生成することに向けられていた。

【0563】

試料８ Ｌ４４８９７−６１、３２ｍＭのＨＣＨＯ／８０ｍＭのグリシン、７２時間の反応、２５℃。

【0564】

試料９ Ｌ４４８９７−６３、８０ｍＭのＨＣＨＯ／８０ｍＭのグリシン、７２時間の反応、２５℃。

【0565】

以下の反応はすべて２４時間の反応時間であった。
試料１０ Ｌ４４８９７−７２、チューブ＃１、２５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＨＣＨＯ／２０ｍＭのグリシン
試料１１ Ｌ４４８９７−７２、チューブ＃２、２５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．５、４０ｍＭのＨＣＨＯ／４０ｍＭのグリシン
試料１２ Ｌ４４８９７−７２、チューブ＃３、３２．５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、３０ｍＭのＨＣＨＯ／３０ｍＭのグリシン
試料１３ Ｌ４４８９７−７２、チューブ＃４、３２．５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、３０ｍＭのＨＣＨＯ／３０ｍＭのグリシン
試料１４ Ｌ４４８９７−７２、チューブ＃５、３２．５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、３０ｍＭのＨＣＨＯ／３０ｍＭのグリシン
試料１５ Ｌ４４８９７−７５、チューブ＃６、２５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのＨＣＨＯ／２０ｍＭのグリシン
試料１６ Ｌ４４８９７−７５、チューブ＃７、２５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．５、４０ｍＭのＨＣＨＯ／４０ｍＭのグリシン
試料１７ Ｌ４４８９７−７５、チューブ＃８、４０℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．５、２０ｍＭのＨＣＨＯ／２０ｍＭのグリシン
試料１８ Ｌ４４８９７−７５、チューブ＃９、４０℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６．５、４０ｍＭのＨＣＨＯ／４０ｍＭのグリシン
試料１９ Ｌ４４８９７−７５、チューブ＃１０、４０℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのＨＣＨＯ／２０ｍＭのグリシン
試料２０ Ｌ４４８９７−７５、チューブ＃１１、４０℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．５、４０ｍＭのＨＣＨＯ／４０ｍＭのグリシン

【0566】

以下の８個の試料は、２５℃で示した時間の間、７８ｍＭのＨＣＨＯおよび７６ｍＭのグリシンを含有する８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０中で反応させた。
試料２１ Ｌ４４８９７−１０１（修飾前）、ＴｘＡ対照、時間０の対照試料、修飾されてもＨＣＨＯ／グリシンに曝露してもいない
試料２２ Ｌ４４８９７−１０１、２時間
試料２３ Ｌ４４８９７−１０１、４時間
試料２４ Ｌ４４８９７−１０１、６時間
試料２５ Ｌ４４８９７ １０２、２４時間
試料２６ Ｌ４４８９７−１０３、５１時間
試料２７ Ｌ４４８９７−１０４、７４時間
試料２８ Ｌ４４８９７−１０５、１２０時間

【0567】

試料２９（Ｌ４４９８０−００４）はＥＤＣ／ＮＨＳで修飾した突然変異毒素Ａ（配列番号４）であった（三重突然変異毒素Ａ（配列番号４）−ＥＤＣ）。反応条件：２５℃、バッファーは２０ｍＭのＭＥＳ／１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．６であった。三重突然変異毒素Ａ（配列番号４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：０．５：０．５、ｗ：ｗ：ｗ。反応はＥＤＣの添加によって開始させた。２時間の反応後、グリシンを０．１Ｍの最終濃度まで加え、さらに２時間、２５℃で反応させた。反応はＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５上で脱塩することによって終了させた。

【0568】

以下の１２個の試料および２つの対照は、試料を２５℃および３７℃でインキュベーションした復帰変異実験であった。
反応１＝２５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、４０ｍＭのＨＣＨＯのみ（グリシンなし）、２４時間の反応。
反応２＝２５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、４０ｍＭのＨＣＨＯ／４０ｍＭのグリシン、２４時間の反応
試料 反応
３０ 反応＃１、０週目、２５℃
３１ 反応＃１、１週目、２５℃
３２ 反応＃１、２週目、２５℃
３３ 反応＃１、３週目、２５℃
３４ 反応＃１、４週目、２５℃
３５ 反応＃１、３週目、３７℃
３６ 反応＃２、０週目、２５℃
３７ 反応＃２、１週目、２５℃
３８ 反応＃２、２週目、２５℃
３９ 反応＃２、３週目、２５℃
４０ 反応＃２、４週目、２５℃
４１ 反応＃２、３週目、３７℃
４２ ＴｘＡ対照、３週目、２５℃
４３ ＴｘＡ対照、３週目、３７℃

【0569】

次の４個の試料は、示した時間の２５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、４０ｍＭのＨＣＨＯ／４０ｍＭのグリシン中での反応によって作製した。
４４ Ｌ４４８９７−１１６−６、２９．５時間
４５ Ｌ４４８９７−１１６−７、５７．５時間
４６ Ｌ４４８９７−１１６−８、７９．５時間
４７ Ｌ４４８９７−１１６−９、１２３．５時間

【0570】

試料４８ Ｌ４４８９７−１３９、４８時間の反応、２５℃、８０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７．０、４０ｍＭのＨＣＨＯ／４０ｍＭのグリシン。

【0571】

試料４９ Ｌ４４１６６−２０４、突然変異毒素Ａ（配列番号４）のＥＤＣ／ＮＨＳ修飾。２５℃、バッファー１×ＰＢＳ、ｐＨ７．０。突然変異毒素Ａ（配列番号４）：ＥＤＣ：ＮＨＳ＝１：０．５：０．５、ｗ：ｗ：ｗ。ＥＤＣ／ＮＨＳを用いた２時間の反応、その後、１Ｍのグリシンを０．１Ｍの最終濃度まで添加、さらに２時間の反応。バッファーをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５上で２０ｍＭのＬ−ヒスチジン／１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５へと交換した。

【0572】

【表44-1】

【0573】

【表44-2】

【0574】

【表44-3】

【0575】

【表44-4】

【0576】

表３４で参照した突然変異毒素Ｂの試料の化学的架橋結合反応条件
三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）を以下の反応条件に従って化学的に架橋結合させ、試験した。Ｌ４４９０５−８６試料を３つのホルマリン反応のバリエーションおよび２つのインキュベーション温度を含む実験で試験した。毎日６つの試料を採取して合計１８個の試料とした。リストの最初の試料は未処理の対照である（これにより合計１９個の試料となる）。未処理の対照には未処理の三重突然変異毒素Ｂポリペプチド（配列番号６）が含まれていた。
反応１（「Ｒｘｎ１」）＝８０ｍＭのＨＣＨＯ、８０ｍＭのグリシン、８０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬの三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）タンパク質
反応２（「Ｒｘｎ２」）＝８０ｍＭのＨＣＨＯ、グリシンなし、８０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬの三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）タンパク質
反応３（「Ｒｘｎ３」）＝８０ｍＭのＨＣＨＯ、グリシンなし、８０ｍＭのＮａＰＯ４、ｐＨ７、１ｍｇ／ｍＬの三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）タンパク質＋シアノ水素化ホウ素キャッピング。シアノ水素化ホウ素キャッピングは、脱塩した最終反応に８０ｍＭのＣＮＢｒＨ_４を加え、２４時間、３６℃でインキュベーションすることを含んでいた。

【0577】

試料Ｌ３４３４６−３０Ａでは、１ｇの三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）あたり０．５ｇのＥＤＣおよびＮＨＳ、４時間、３０℃、２０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５。

【0578】

試料Ｌ３４３４６−３０Ｂでは、１ｇの三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）あたり０．５ｇのＥＤＣおよびＮＨＳ、２時間、３０℃、次いでグリシン（ｇ／Ｌの最終濃度）の添加、さらに２時間、３０℃、２０ｍＭのＭＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．５中でインキュベーション。Ｌ３４３４６−３０ＡおよびＬ３４３４６−３０Ｂの２つの反応の唯一の差異は、反応Ｌ３４３４６−３０Ｂにグリシンを加えることである。

【実施例37】

【0579】

免疫原性組成物によって誘導された抗体は様々なシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からの毒素を中和する能力を有する
突然変異毒素原薬が含まれる免疫原性組成物によって誘導された抗体が広範囲の多様な毒素配列を中和することができるかどうかを評価するために、多様なリボタイプおよび毒素型を表す株を配列決定して、突然変異毒素原薬と比較した、様々な株間の遺伝的多様性の程度を同定した。その後、様々な株からの分泌された毒素を含有する培養上清を、免疫化したハムスターからの血清を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて試験して、免疫原性組成物のカバレッジを決定し、流布している臨床株からの多様な毒素に対して保護する免疫原性組成物の能力を決定した。

【0580】

ＨＴ−２９細胞（結腸癌細胞系）およびＩＭＲ−９０細胞をどちらも使用して、ＣＤＣ株から発現された毒素の中和を試験した。ＨＴ−２９細胞はＴｃｄＡに対して感受性がより高く、これらの細胞における精製したＴｃｄＡのＥＣ_５０は１００ｐｇ／ｍＬであり、それと比較してＴｃｄＢでは３．３ｎｇ／ｍＬである。他方では、ＩＭＲ−９０細胞はＴｃｄＢに対して感受性がより高く、これらの細胞における精製したＴｃｄＢのＥＣ_５０は９〜３０ｐｇ／ｍＬの範囲であり、それと比較してＴｃｄＡでは０．９２〜１．５ｎｇ／ｍＬである。これらの細胞系におけるＴｃｄＡおよびＴｃｄＢの両方のアッセイ特異性は、ポリクローナルおよびモノクローナル毒素特異的抗体の両方を使用することによって確認した。アッセイの正規化のために、２４個のＣＤＣ単離体の培養濾液をそのそれぞれのＥＣ_５０値の４倍の濃度で試験した。株のうちの３つは、中和アッセイで試験するには低すぎる毒素レベルを有していた。

【0581】

米国およびカナダにおいて流布しているシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の株の９５％より高くをカバーする多様なリボタイプ／毒素型を表す２４個の株をＣＤＣから得た。これらの単離体のうちには、米国、カナダおよび英国におけるＣＤＡＤの３つの流行性株であるリボタイプ０２７、００１および０７８を表す株もあった。株２００４０１３および２００４１１８はリボタイプ０２７を表し、株２００４１１１はリボタイプ００１を表し、株２００５０８８、２００５３２５および２００７８１６はリボタイプ０７８を表していた。疾患を引き起こす臨床的な単離体と６３０株との間の遺伝的多様性の程度を同定するために、これらの臨床株からの毒素遺伝子（ｔｃｄＡおよびｔｃｄＢ）を配列決定した。表３５を参照されたい。Ｍｅｇａｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標））中のＣｌｕｓｔａｌＷを使用して毒素のアミノ酸配列をアラインメントし、配列同一性について分析した。ｔｃｄＡでは、ゲノムアラインメント分析によりすべての臨床的単離体と株６３０とが全体的な約９８〜１００％のアミノ酸配列同一性を共有することが示された。ｔｃｄＡ遺伝子のＣ末端部分は相違がわずかにより高かった。同じ分析をｔｃｄＢ遺伝子で行い、これはより高い配列の相違を示した。特に、株２００７８３８／ＮＡＰ７／１２６および２００７８５８／ＮＡＰ１／ｕｎｋ５がＮ末端（７９〜１００％）およびＣ末端ドメイン（８８〜１００％、データ示さず）において６３０株から最も相違したパターンを示した。

【0582】

ハムスター血清プール（ＨＳ）を、たとえば上述の実施例２９、表１５による突然変異毒素をＥＤＣで失活させた突然変異体ＴｃｄＡ（配列番号４）および突然変異体ＴｃｄＢ（配列番号６）が含まれ、リン酸アルミニウムを用いて配合した免疫源で免疫化したシリアンゴールデンハムスターから採取した。表３５中の結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて、それぞれの培養上清からの少なくとも毒素Ｂが免疫化したハムスターからの血清によって中和されたことを示す。

【0583】

【表45】

【0584】

図２３は、様々なシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株からの毒素調製物を使用した、ＩＭＲ−９０細胞に対する中和アッセイの結果を示す。データは、ハムスター抗血清中のＴｃｄＢ中和抗体が、超毒性株およびＴｃｄＡ陰性、ＴｃｄＢ陽性の株を含めた、試験した２１個すべての単離体からの毒素を中和する能力を有することを示す。シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の少なくとも１６個の異なる株をＣＤＣ（ジョージア州、Ａｔｌａｎｔａ）（以前に記載）から入手し、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養培地中で、当技術分野で知られており上述した適切な条件下で培養した。分泌された毒素を含有する培養上清を分析してＩＭＲ−９０単層に対するその細胞毒性（ＥＣ_５０）を決定し、続いて、標準のｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいてＥＣ_５０の４倍で、リン酸アルミニウムを用いて配合した突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬で免疫化したハムスターからの血清の様々な希釈率を使用して試験した。それぞれの株の培養上清から得た粗毒素および精製毒素（Ｌｉｓｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓから入手した市販の毒素）（それぞれの上清から精製していない）を、上述のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイを使用してＩＭＲ−９０細胞に対する細胞毒性について試験した。

【0585】

図２３Ａ〜Ｋでは、グラフは、ＡＴＰレベル（ＲＬＵ）を、漸増濃度の、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）培養培地とハムスター血清プール（■）、粗毒素とハムスター血清プール（●）、精製毒素とハムスター血清プール（▲）、粗毒素（▼）対照、および精製毒素（◆）対照に対してプロットした、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験の結果（以前に記載）を示す。それぞれの株からの毒素は４×ＥＣ_５０値で細胞に加えた。

【0586】

図２３Ａ〜Ｋに示したように、記載した免疫原を受けたハムスターは、驚くべきことに、それぞれの毒素のみの対照と比較して、シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の少なくとも以下の１６個の異なるＣＤＣ株からの毒素に対する中和活性を示す中和抗体を発生した：２００７８８６（図２３Ａ）、２００６０１７（図２３Ｂ）、２００７０７０（図２３Ｃ）、２００７３０２（図２３Ｄ）、２００７８３８（図２３Ｅ）、２００７８８６（図２３Ｆ）、２００９２９２（図２３Ｇ）、２００４０１３（図２３Ｈ）、２００９１４１（図２３Ｉ）、２００５０２２（図２３Ｊ）、２００６３７６（図２３Ｋ）。また、毒素を試験し、リン酸アルミニウム中で配合した突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬が含まれる免疫原性組成物によって中和されたさらなるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株にも、表３５を参照されたい。

【0587】

別の研究では、様々なシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）株（ＣＤＣおよびリーズ（Ｌｅｅｄｓ）病院、英国から入手）からの分泌された毒素を含有する培養上清を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ中和アッセイにおいて、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを用いて配合した突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬を投与したハムスターからの血清を使用して試験した。実験設計には表３６を参照されたい。結果を表３７および表３８に示す。

【0588】

【表46】

【0589】

【表47】

【0590】

【表48】

【実施例38】

【0591】

ＥＤＣ／ＮＨＳ三重突然変異毒素のペプチドマッピング
ＥＤＣ／ＮＨＳで失活させた三重突然変異毒素を特徴づけるために、４ロットのＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素Ａ（配列番号４）および４ロットのＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異体Ｂ（配列番号６）に対してペプチドマッピング実験を行った。突然変異毒素をトリプシンで消化した後、逆相ＨＰＬＣを使用して生じたペプチド断片を分離した。質量スペクトル分析を使用して失活プロセスの結果として起こる修飾を同定した。突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬のどちらにおいても、理論上のトリプシンペプチドの９５％より多くが同定された。架橋結合およびグリシン付加物（グリシンをキャッピング剤として使用した）を同定した。突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬のどちらにおいても、ベータアラニン付加物も観察された。機構または理論に束縛されずに、ベータアラニン付加物は、ＮＨＳ活性化ベータアラニンを形成する３モルのＮＨＳと１モルのＥＤＣとの反応から生じると考えられる。その後、この分子がリシン基と反応してベータアラニン付加物（＋７０Ｄａ）を形成することができる。ＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素Ｂの試料では、低レベル（０．０７モル／１モルのタンパク質）のデヒドロアラニン（−３４Ｄａ）も観察された。デヒドロアラニンはシステイン残基の脱スルホン化の結果である。同じ種類および度合の修飾がそれぞれの突然変異毒素の４つすべてのバッチで観察され、このプロセスが一貫した生成物を生じることを示している。ペプチドマッピング（９５％より高い配列カバレッジ）により修飾が存在することが確認される。修飾の要約を表３９に示す。また図２４〜２５も参照されたい。さらに、三重突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素Ｂ原薬の大きさおよび荷電の不均一性は、化学的失活が存在しない場合のそれぞれの三重突然変異毒素Ａおよび三重突然変異毒素Ｂの大きさおよび荷電の不均一性と比較して増加した。その結果、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）プロフィールは比較的幅広いピークを有していた（データ示さず）。

【0592】

【表49】

【実施例39】

【0593】

薬物製品の生成
シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）免疫原性組成物（薬物製品）は２つの活性薬学的成分（突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬）を含有する。例示的な薬物製品は、突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬のそれぞれが含まれる、１０ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ７．４、４．５％（ｗ／ｗ）のトレハロース二水和物、および０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０を含有する凍結乾燥した配合物である。表４０を参照されたい。免疫原性組成物は、凍結乾燥したワクチンを希釈剤またはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有する希釈剤のどちらかに再懸濁させることによって、注射用に調製する。プラセボには無菌的な注射用生理食塩水（０．９％の塩化ナトリウム）が含まれる。

【0594】

【表50】

【0595】

バッファーの調製
注射用水（ＷＦＩ）を配合用容器に加える。混合しながら賦形剤を加え、溶液となるまで溶かす。ｐＨを測定する。必要な場合は、ｐＨをＨＣｌで７．４±０．１に調節する。溶液をＷＦＩで最終重量まで希釈し、その後、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ ＸＬ１５０フィルターを使用して濾過する。濾過前の汚染微生物数低下試料を濾過前に採取する。濾過したバッファーを重量モル浸透圧濃度およびｐＨのためにサンプリングする。

【0596】

配合物の調製
解凍した突然変異毒素原薬を以下の操作順序で事前に計算した量に基づいて配合容器中にプールする：０．６ｍｇ／ｍＬを達成するための標的希釈率のバッファー体積の５０％を最初に容器に加え、次いで突然変異毒素Ａ原薬を加え、５分間、１００ｒｐｍで混合する。その後、突然変異毒素Ｂ原薬を容器に加え、溶液を０．６ｍｇ／ｍＬの希釈点までさらに希釈し、その後、さらに５分間、１００ｒｐｍで混合する。試料を取り出し、全突然変異毒素濃度について試験する。溶液をプロセス内の突然変異毒素濃度値に基づいて１００パーセント体積まで希釈し、その後、１５分間、１００ｒｐｍで混合する。配合された薬物製品をｐＨおよび濾過前の汚染微生物数についてサンプリングする。その後、配合された薬物製品をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ ＸＬ１５０を使用して濾過し、終夜貯蔵するか、または滅菌濾過のために標線（ｆｉｌｌｉｎｇ ｌｉｎｅ）まで充填する。

【0597】

配合されたバルクを充填領域に移動し、汚染微生物数についてサンプリングし、その後、２つの直列のＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ ＸＬ１５０フィルターで滅菌濾過する。配合されたバルクを０．７３ｍＬの標的充填体積で発熱物質除去したガラスバイアル内に充填する。満たしたバイアルに部分的に栓をし、その後、凍結乾燥機にローディングする。凍結乾燥サイクルは表４１に示したように実行する。サイクルの完了時に、凍結乾燥チャンバを窒素で０．８ａｔｍまで埋め戻し、その後、栓を完全にはめ込む。チャンバからバイアルを出し、フリップオフシールを使用してバイアルにキャップをする。

【0598】

【表51】

【0599】

薬物製品の安定性データを表４２に要約する。データは、薬物製品が２〜８℃で少なくとも３カ月または２５°もしくは４０℃で少なくとも１カ月の貯蔵中に物理的および化学的に安定であることを示唆している。どちらの貯蔵条件下でも、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって検出された不純物のレベルは変化せず、試験した最新時点までの間にｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原性の変化も存在しなかった。

【0600】

【表52】

【実施例40】

【0601】

ワクチン希釈剤
再構成時に等張な溶液を確実にするために、生理食塩水には、アジュバントをまったく用いない６０ｍＭのＮａＣｌを凍結乾燥薬物製品の希釈剤として使用する。

【0602】

Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ：Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ「８５」２％（Ｂｒｅｎｎｔａｇ）は、水酸化アルミニウムの八面体の結晶性シートから構成される市販の適正製造基準（ＧＭＰ）グレードの製品である。例示的なＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ希釈剤配合物を表４３に示す。例示的な配合物は上述の薬物製品と組み合わせて使用し得る。

【0603】

【表53】

【0604】

Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントを用いた研究は、ｐＨ６．０〜７．５で突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬と１ｍｇのＡｌ／ｍＬのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとの１００％の結合を示す。両方の原薬の最大結合が試験した最大のタンパク質濃度（それぞれ３００μｇ／ｍＬ）で見られた。

【0605】

また、タンパク質とＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとの結合も、２００μｇ／ｍＬのそれぞれの原薬および０．２５〜１．５ｍｇ／ｍｌの範囲のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有する凍結乾燥薬物製品配合物を用いて試験した。薬物製品を様々な濃度のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含有する希釈剤で再構成し、結合したそれぞれの突然変異毒素のパーセントを測定した。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌのすべての試験した濃度で抗原の１００％の結合が実証された。

【0606】

また、標的用量の突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬（それぞれ２００μｇ／ｍＬ）でのタンパク質とＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌとの結合動力学も評価した。結果は、２４時間のＲＴの時間経過の間全体にわたって、突然変異毒素原薬の１００％がＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌと結合していたことを示す。

【0607】

ＣｐＧ２４５５５およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ：ＣｐＧ２４５５５は、配列５−ＴＣＧ ＴＣＧ ＴＴＴＴＴＣ ＧＧＴ ＧＣＴ ＴＴＴ−３（配列番号４８）を有する合成２１量体オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）である。ＣｐＧ２４５５５とＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ希釈剤との組合せの例示的な配合物を表４４に示す。例示的な配合物は上述の薬物製品と組み合わせて使用し得る。

【0608】

【表54】

【0609】

ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）：ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバントは、当技術分野で知られているサポニンに基づくアジュバントである。ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（登録商標）アジュバント配合物の例示的な配合物を表４５に示す。例示的な配合物は上述の薬物製品と組み合わせて使用し得る。

【0610】

【表55】

【実施例41】

【0611】

ＮＨＰモデルにおけるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌをアジュバントとした突然変異毒素原薬組成物の免疫原性および前臨床概念証明
ＮＨＰ、具体的にはカニクイザルマカクにおけるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌをアジュバントとした突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬組成物の免疫原性を評価した。２週間間隔で（０、２、４週目）、それぞれ１０μｇの突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬組成物（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを用いて配合）／用量を用いて免疫化したＮＨＰは、頑強な中和抗毒素応答を発生した。表４６を参照されたい。抗毒素Ａおよび抗毒素Ｂ中和応答はどちらも３回目の免疫化後に保護範囲に達し、少なくとも３３週目まで（研究した最後の時点）保護範囲内またはそれより高く保たれた。

【0612】

２５０μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ中で配合したそれぞれ１０μｇの突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬を用いて、カニクイザルマカク（ｎ＝８匹）を０、２および４週目にＩＭで免疫化した。血清をそれぞれの時点で採取し、機能的抗毒素活性の毒素中和アッセイにおいて分析した。ＧＭＴを表４６に提供する。表中に提供する保護力価の範囲は、Ｍｅｒｃｋモノクローナル抗体治療治験におけるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の再発の有意な低下に相関する中和抗体の力価の範囲を示す。

【0613】

【表56】

【0614】

ＮＨＰにおける、Ｍｅｒｃｋ ｍＡｂ治療治験からのヒト保護抗体力価とＰｆｉｚｅｒのワクチン候補によって誘導された力価との相関
Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ ｍＡｂを用いた第ＩＩ相有効性研究（Ｌｏｗｙら、Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１０ Ｊａｎ２１；３６２（３）：１９７〜２０５）は、血清中の中和抗毒素ｍＡｂのレベルとＣＤＡＤの再発の予防との間の相関を実証していると考えられる。毒素特異的ｍＡｂをヒトに投与した後、ヒトレシピエントにおける１０〜１００μｇ／ｍＬの範囲内の血清抗体レベルが再発に対して保護すると考えられる（ＣＤＡＤの再発の７０％の低下）。

【0615】

免疫原性組成物がヒトにおいて潜在的に有効な中和抗体応答を誘導することができるかどうかを測るために、Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘの第ＩＩ相研究の公開データを、ＮＨＰモデルにおいて免疫原性組成物によって誘導された抗体のレベルと比較することによって、突然変異毒素原薬が含まれる免疫原性組成物を試験した。これは、Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ ｍＡｂの以前に公開されている特徴を利用して再発の兆候を示さなかった対象から得たこれらのｍＡｂの範囲（１０〜１００μｇ／ｍＬ）を５０％の中和力価へと変換し、これらの力価（「保護力価の範囲」）を本明細書中に記載の前臨床モデルで観察された力価と比較することによって達成した。表４６に示したように、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌをアジュバントとした突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬が含まれる免疫原性組成物は、ＮＨＰにおいて３回目の用量後に「保護範囲」に達し、３３週目までこの範囲内またはそれより高く保たれた免疫応答を生じた。ＮＨＰにおいて本発明のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）免疫原性組成物によって誘導された毒素中和抗体のレベルは、ＣＤＡＤの再発から保護されていたと考えられるＭｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ治験対象における血清抗体レベルに匹敵する。

【実施例42】

【0616】

ＮＨＰモデルにおけるＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸまたはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ／ＣｐＧ２４５５５（Ａｌｈ／ＣｐＧ）をアジュバントとした突然変異毒素原薬組成物の免疫原性
ＮＨＰでは、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸおよびＡｌｈ／ＣｐＧはどちらも、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを単独で用いて投与したワクチンと比較して、抗毒素ＡおよびＢの中和力価を統計的に有意に増強した（表４７）。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ単独と比較して（４〜６週目）、Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸのいずれかを用いて投与したワクチン（２〜４週目）によって、より早い時点でバックグラウンドを超える抗毒素応答が誘発され、これはヒトにおけるＣＤＡＤの再発の保護に対して重要な効果を有し得る。Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと比較して、Ａｌｈ／ＣｐＧまたはＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸをアジュバントとした免疫原性組成物は、より迅速に保護範囲に達し（実施例４１も参照）、３３週目までこの範囲内またはそれより高く保たれた抗毒素中和力価を生じた。

【0617】

表４７に示したように、２５０μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｎ＝８匹）、または５００μｇのＣｐＧ＋２５０μｇのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（ｎ＝１０匹）、または４５ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（ｎ＝１０匹）中で配合したそれぞれ１０μｇの突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬を用いて、カニクイザルマカクを０、２、および４週目にＩＭで免疫化した。血清をそれぞれの時点で採取し、上述の機能的抗毒素活性の毒素中和アッセイで分析した。ＧＭＴを表に記載する。アスタリスク（^＊）は、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ群における力価と比較した場合の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す。保護力価の範囲は、Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ ｍＡｂ治療治験によるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の再発の有意な低下に相関する中和抗体の力価の範囲を表す。

【0618】

【表57】

【0619】

また、ＮＨＰにおいて生じた中和抗毒素抗体価に対する、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸまたはＡｌｈ／ＣｐＧアジュバントの存在下での投与した突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬の用量も評価した。１つの研究では、低（１０μｇ）または高（１００μｇ）用量のＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ中で配合したそれぞれの突然変異毒素原薬をＮＨＰに投与した。応答を免疫化後のそれぞれの時点で比較した。表４８に示したように、抗毒素中和力価はどちらの処置群でも頑強であった。抗毒素Ａの力価はほとんどの時点において低用量および高用量の群の間でほぼ同等であった一方で、抗毒素Ｂの力価は高用量の群でより高い傾向があった。

【0620】

【表58】

【0621】

表４８に示したように、それぞれ１０μｇまたは１００μｇの４５ＵのＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸを用いて配合した突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬を用いて、カニクイザルマカク（ｎ＝５匹）を０、２、および４週目にＩＭで免疫化した。血清をそれぞれの時点で採取し、機能的抗毒素活性の毒素中和アッセイで分析した。ＧＭＴを表に記載する。保護力価の範囲は、Ｍｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ ｍＡｂ治療治験におけるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の再発の有意な低下に相関する中和抗体の力価の範囲を表す。

【0622】

抗毒素Ｂ応答の動力学を増強させる試みとして、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸまたはＡｌｈ／ＣｐＧアジュバントの存在下で漸増用量の突然変異毒素Ｂ原薬（１０、５０、または１００μｇ）と混合した一定用量の突然変異毒素Ａ原薬（１０μｇ）を用いてＮＨＰを免疫化した。アジュバントにかかわらず、１０μｇ用量の突然変異毒素Ｂ薬物と比較して、より高い用量の突然変異毒素Ｂ原薬（５０または１００μｇのどちらか）を受けた群がより高い抗毒素Ｂ中和応答を誘導する傾向が存在した（表５０、統計的に有意な増加を示すために^＊によって印した）。この傾向は最終免疫化後のほとんどの時点で観察された。しかし、一部の事例では、突然変異毒素Ｂの量が増加した場合に抗毒素Ａ中和応答が統計的に有意な減少を示した（表４９中に∧によって印した）。

【0623】

表４９および表５０に示したように、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（４５Ｕ／用量）またはＡｌｈ／ＣｐＧ／（２５０μｇ／５００μｇ／用量）を用いて配合した様々な比の突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬（１０μｇの突然変異毒素Ａ原薬＋１０、５０、または１００μｇのいずれかの突然変異毒素Ｂ原薬、表４９および表５０中でそれぞれ１０Ａ：１０Ｂ、１０Ａ：５０Ｂおよび１０Ａ：１００Ｂと命名）を用いて、ＮＨＰ（１０匹／群）を０、２、および４週目にＩＭで免疫化した。表４９は抗毒素Ａの力価を示す。表５０は抗毒素Ｂの力価を示す。ＧＭＴを表に記載する。保護力価の範囲は、Ｍｅｒｃｋ ｍＡｂ治療治験におけるシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症の再発の有意な低下に相関する中和抗体の力価の範囲を表す。記号∧は、１０Ａ：１０Ｂ群と比較した中和力価の統計的に有意な減少を表す（ｐ＜０．０５）。アスタリスク記号^＊は、１０Ａ：１０Ｂ群と比較した中和力価の統計的に有意な増加を表す（ｐ＜０．０５）。

【0624】

【表59】

【0625】

【表60】

【実施例43】

【0626】

カニクイザルにおける免疫原性組成物を用いた５週間の繰返し用量のＩＭ毒性研究、４週間の回復期間を伴う
カニクイザルにおけるＰＦ−０６４２５０９５（アジュバント水酸化アルミニウムおよびＣｐＧ２４５５５と組み合わせた三重突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素Ｂ原薬が含まれる免疫原性組成物）を用いた５週間のＩＭ繰返し用量の毒性研究を実施して、アジュバント水酸化アルミニウムおよびＣｐＧ２４５５５と組み合わせたシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）三重突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素Ｂ原薬（ＰＦ−０６４２５０９５）の潜在的な毒性および免疫原性を評価した。０．２または０．４ｍｇ／用量の三重突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素Ｂ原薬（それぞれ低および高用量の免疫原性組成物の群）、０．５ｍｇのアルミニウム（水酸化アルミニウムとして）、および１ｍｇのＣｐＧ２４５５５のＰＦ−０６４２５０９５、ならびにアジュバントの組合せ単独（水酸化アルミニウム＋ＣｐＧ２４５５５、ＰＦ−０６３７６９１５）を、カニクイザル（６匹／性別／群）に初回刺激用量としてＩＭで投与した、続いて３回のブースター用量（１、８、２２、および３６日目）を投与した。別の動物の群（６匹／性別）は約ｐＨ７．０の０．９％の等張生理食塩水を受けた。免疫原性組成物ビヒクルは１０ｍＭのトリスバッファー、ｐＨ７．４、４．５％のトレハロース二水和物、および０．１％のポリソルベート８０から構成されていた。アジュバント対照ビヒクルは６０ｎＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのヒスチジンバッファー、ｐＨ６．５から構成されていた。合計用量体積は１回の注射あたり０．５ｍＬであった。すべての用量を左および／または右の四頭筋内に投与した。研究の投薬段階中に観察されたいずれかの効果の可逆性を評価するために、選択した動物を４週間の投薬なしの観察期間に供した。

【0627】

この研究では有害な発見は存在しなかった。ＰＦ−０６４２５０９５は良好に耐用され、局所的な炎症性反応しか生じず、全身性毒性の証拠はなかった。投薬段階中、免疫原性組成物で処理した群では、４および３８日目にフィブリノーゲン（２３．１％から２．３×）、４日目（２．１×から２７．５×）および３８日目（２．３×から１０１．５×）にＣ反応性タンパク質、ならびに３６および／または３８日目にグロブリン（１１．１％から２４．１％）の、予備試験からの用量依存的な増加がで見られ、アジュバントを用いた免疫原性組成物の投与に対する予想された炎症反応と一貫していた。

【0628】

４日目に注目されたフィブリノーゲンおよびＣ反応性タンパク質の増加は８日目までに部分的に回復しており、高用量の免疫原性組成物の群のみでフィブリノーゲン（２５．６％から６５．５％）およびＣ反応性タンパク質（４．５×および５．６×）が増加していた。低および高用量の免疫原性組成物の群において、インターロイキン（ＩＬ）−６の増加が１日目、３時間目（１日目、０時間目の個々の値の８．３×から１２７．２×、用量応答性）および３６日目、３時間目（３６日目、０時間目の個々の値の９．４×から３９．５×）に観察された。他のサイトカイン（ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン−誘導タンパク質（ＩＰ−１０））、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）では変化は観察されなかった。これらの急性期タンパク質およびサイトカインの増加は、外来抗原の投与に対する予想された正常な生理的応答の一部であった。回復段階においてこれらの臨床的病理学的パラメータにＰＦ ０６４２５０９５関連またはアジュバント関連の変更は存在しなかった（サイトカインは回復段階中に評価しなかった）。さらに、注射部位に局所的な変化が存在し、これらはアジュバント対照群と低および高用量の免疫原性組成物の群とで同様の発生率および重症度であったため、ＰＦ−０６４２５０９５と直接関連していなかった。投薬段階中、変化には、マクロファージの浸潤による筋線維の分離によって特徴づけられた軽度から中等度の慢性活動性炎症が含まれており、多くの場合これは好塩基球性顆粒物質（アルミニウム含有アジュバントと解釈される）、リンパ球、形質細胞、好中球、好酸球、壊死性細片、および浮腫を含有する。また、好塩基球性顆粒物質は、これら慢性活動性炎症の病巣内にも細胞外で存在していた。回復段階の終了時に軽度から中等度の慢性炎症および単核細胞浸潤ならびに軽度の線維症が存在していた。これらの注射部位での発見はアジュバントに対する局所的炎症反応を表す。他の微視的な変化には、アジュバント対照群ならびに低および高用量の免疫原性組成物の群において投薬段階中に注目された、腸骨（流入領域）リンパ節における軽度から中等度に増加したリンパ球細胞充実度および脾臓の胚中心における軽度に増加した細胞充実度が含まれていた。回復段階の終了時には、これらの微視的な発見の重症度はより低かった。これらの効果は抗原刺激に対する免疫学的応答を表し、アジュバントまたはＰＦ−０６４２５０９５に対する薬理学的応答であった。抗ＤＮＡ抗体に被験物質関連の増加は存在しなかった。

【0629】

有害な発見が存在しないことに基づいて、この研究における無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、２回の０．５ｍＬの注射として４回の用量を投与した高用量の免疫原性組成物の群である（ＰＦ−０６４２５０９５として０．４ｍｇの三重突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素Ｂ原薬／用量）。

【実施例44】

【0630】

ハムスターに受動伝達した血清陽性ＮＨＰ血清の有効性
正常な腸管内菌叢を乱すために５匹のシリアンゴールデンハムスターの群に経口量のクリンダマイシン抗生物質（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。５日後、経口量の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子（６３０株、１００ｃｆｕ／動物）を用いてハムスターを免疫誘発し、表５１に従ってＮＨＰ血清を腹腔内（ＩＰ）投与した。機構または理論に束縛されずに、胞子を用いた免疫誘発後の疾患症状は、典型的には免疫誘発の約３０〜４８時間後から現れ始める。

【0631】

ハムスターに投与したＮＨＰ血清は、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸを用いて配合した突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬（１０：１０、１０：５０、および１０：１００のＡ：Ｂの比）を用いた３回の免疫化後に最も高い力価を示すＮＨＰ血清試料（抗毒素Ａ血清および抗毒素Ｂ血清）からプールした（実施例４２、表４９、および表５０を参照）。実施例４２に記載する、ＮＨＰ血清は５、６、および８週目の時点で採取した（免疫化は０、２、および４週目に起こった）。結果を以下の表５２〜５４に示す。記号「＋」は、非応答者である動物＃３を含めない、（）内に示す相乗平均（ＧＭ）を示す。「^＊ＴＢ」は動物を安楽死させた日の終末時出血を表し、すべての動物で同じではない。

【0632】

【表61】

【0633】

【表62】

【0634】

【表63】

【0635】

【表64】

【0636】

別の研究では、正常な腸管内菌叢を乱すためにシリアンゴールデンハムスターに経口量のクリンダマイシン抗生物質（３０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。５日後、経口量の野生型シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）胞子（６３０株、１００ｃｆｕ／動物）を用いてハムスターを免疫誘発し、表５５に従ってＮＨＰ血清を腹腔内（ＩＰ）投与した。機構または理論に束縛されずに、胞子を用いた免疫誘発後の疾患症状は、典型的には免疫誘発の約３０〜４８時間後から現れ始める。

【0637】

ハムスターに投与したＮＨＰ血清は、ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌおよびＣｐＧ２４５５５を用いて配合した突然変異毒素Ａ原薬および突然変異毒素Ｂ原薬（１０：１０、１０：５０、および１０：１００のＡ：Ｂの比）を用いた３回の免疫化後にＮＨＰから採取した試料からプールした（実施例４２、表４９、および表５０を参照）。実施例４２に記載する、ＮＨＰ血清は５、６、８、および１２週目の時点で採取した（ＮＨＰは０、２、および４週目に免疫化した）。結果を以下の表５６〜５９に示す。ハムスターからの血清をさらに調査して、上述の毒素中和アッセイを使用して阻害濃度（ＩＣ_５０）値を決定した。ハムスターにおいて本発明のシー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）免疫原性組成物によって誘導された毒素中和抗体のレベルは、ＣＤＡＤの再発から保護されていたと考えられるＭｅｒｃｋ／Ｍｅｄａｒｅｘ治験対象における血清抗体レベルに匹敵する。

【0638】

【表65】

【0639】

【表66】

【0640】

【表67】

【0641】

【表68】

【0642】

【表69】

【実施例45】

【0643】

突然変異毒素原薬の特徴づけ
三重突然変異毒素Ａの一次構造を配列番号４に示す。配列番号４の位置１のＮＨ_２末端のＭｅｔ残基は配列番号１２の開始コドンに由来するものであり、単離したタンパク質中には存在しない（たとえば配列番号８４を参照）。したがって、実施例１２〜実施例４５において、「配列番号４」とは最初のメチオニン（位置１）が存在しない配列番号４をいう。精製した三重突然変異毒素Ａ（配列番号４）（原薬中間体−ロットＬ４４９９３−１３２）およびＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素Ａ（配列番号４）（「突然変異毒素Ａ原薬」−ロットＬ４４８９８−０１２）はどちらもＳＬＩＳＫＥＥＬＩＫＬＡＹＳＩ（配列番号４の位置２〜１６）から開始される単一のＮＨ_２末端配列を示した。

【0644】

三重突然変異毒素Ｂの一次構造を配列番号６に示す。配列番号６の位置１のＮＨ_２末端のＭｅｔ残基は開始コドンに由来するものであり、単離したタンパク質中には存在しない（たとえば配列番号８６を参照）。したがって、実施例１２〜実施例４５において、「配列番号６」とは最初のメチオニン（位置１）が存在しない配列番号６をいう。精製した三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）（原薬中間体−ロット０１０）およびＥＤＣ／ＮＨＳで処理した三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）（「突然変異毒素Ｂ原薬」−ロットＬ４４９０６−１５３）はどちらもＳＬＶＮＲＫＱＬＥＫＭＡＮＶＲ（配列番号６の位置２〜１６）から開始される単一のＮＨ_２末端配列を示した。

【0645】

円二色性（ＣＤ）分光分析を使用して三重突然変異体Ａ（配列番号４）および突然変異毒素Ａ原薬の二次および三次構造を評価した。また、ＣＤ分光分析を使用して三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）および突然変異毒素Ｂ原薬の二次および三次構造も評価した。また、ＣＤ分光分析は、構造に対するｐＨの潜在的な効果を評価するためにも使用した。三重突然変異毒素Ａに対するＥＤＣ処理の効果は、突然変異毒素Ａ原薬で得られたＣＤデータを三重突然変異毒素Ａで得られたデータと比較することによって分析した。三重突然変異毒素Ｂ（配列番号６）に対するＥＤＣ処理の効果は、突然変異毒素Ｂ原薬で得られたＣＤデータを三重突然変異毒素Ｂで得られたデータと比較することによって分析した。

【0646】

突然変異毒素Ａ原薬の遠ＵＶ ＣＤデータを様々なｐＨで得た。ｐＨ５．０〜７．０で記録されたスペクトルは二次構造中の高いα−ヘリックスの割合の指標であり、タンパク質のポリペプチド主鎖が、α−ヘリックスが優勢な明確に定義されたコンホメーションを採ることを示唆している。

【0647】

また、突然変異毒素Ａ原薬の近ＵＶ ＣＤスペクトルも得た。２６０〜３００ｎｍの強い負の楕円率は、芳香族側鎖が固有の強固な環境にあること、すなわち突然変異毒素Ａ原薬が三次構造を保有することの指標である。実際、個々の芳香族側鎖の種類から生じる特徴的な特長をスペクトル内で識別することができる：約２９０ｎｍのショルダーおよび約２８３ｎｍの最大の負のピークは、秩序的なトリプトファン側鎖による偏光の吸光度が原因であり、２７６ｎｍの負のピークはチロシン側鎖からのものであり、２６２および２６８ｎｍの小さなショルダーは三次接触に関与しているフェニルアラニン残基の指標である。遠および近ＵＶの結果は、突然変異毒素Ａ原薬が生理的ｐＨでコンパクトに折り畳まれた構造を保つことの証拠を提供する。ｐＨ５．０〜７．０で観察されたほぼ同一の遠および近ＵＶ ＣＤスペクトルは、このｐＨ範囲内で検出可能な構造的変化が起こっていないことを示す。ＰＨ３．０および４．０ではタンパク質がこれらのｐＨ点で不溶性であるため、ＣＤデータを収集することができなかった。突然変異毒素Ａ原薬の遠および近ＵＶ ＣＤスペクトルを三重突然変異毒素Ａのものと比較すると、どちらのタンパク質のスペクトルも研究したすべての実験条件下で本質的に同一であり、これはＥＤＣ処理が三重突然変異毒素Ａの二次および三次構造に対して検出可能な効果を有さないことを示している。この発見は、それぞれストークス半径および沈降／摩擦係数に検出可能な変化を示さないゲル濾過および分析的超遠心分離の結果と一致している。

【0648】

突然変異毒素Ａ原薬（および三重突然変異毒素Ａ）は、一次配列の全体にわたって広がっており、好都合な内因性の蛍光プローブとして役割を果たすことができる２５個のトリプトファン残基を含有する。３００〜４００ｎｍの突然変異毒素Ａ原薬の蛍光発光スペクトルを温度の関数として得た。６．８℃で、突然変異毒素Ａ原薬は、２８０ｎｍで励起した際に特徴的なトリプトファン蛍光発光スペクトルを示す。蛍光発光の最大は約３３５ｎｍで観察され、これは、トリプトファン残基が極性の水性環境ではなくタンパク質内部に典型的な非極性環境にあることを示している。蛍光発光スペクトルの結果が本報告書中に提示するＣＤ実験の結果とあいまって、突然変異毒素Ａ原薬がコンパクトな折り畳まれた構造を保つことが確認される。

【0649】

外因性プローブ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）の蛍光を使用して、ｐＨが変化した際に突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素Ａにおいて可能なコンホメーション変化を特徴づけた。結果から見ることができるように、突然変異毒素Ａ原薬または三重突然変異毒素Ａのいずれかをプローブを用いてｐＨ７．０で滴定した場合にＡＮＳ蛍光強度は本質的に増加せず、これは、これらの条件下ではタンパク質上に疎水性表面が曝露されていないことを示唆している。ｐＨを２．６にシフトさせることで、蛍光量子収率が明らかな飽和に達するまで、プローブの濃度の増加に伴ってＡＮＳ蛍光量子収率の劇的な増加がもたらされる。このＡＮＳ蛍光量子収率の増加は、低ｐＨ（２．６）で突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素ＡがどちらもｐＨに誘導されるコンホメーション変化を受けて、疎水性表面を曝露させることを示す。そのようなコンホメーション変化は、ＥＤＣに誘導された修飾および三重突然変異毒素Ａの失活が突然変異毒素Ａ原薬（ＤＳ）のコンホメーション柔軟性を制限しなかったことを示している。

【0650】

三重突然変異毒素Ａの流体力学的特性に対するＥＤＣ処理の効果を、Ｇ４０００ ＳＷＸＬカラム上のサイズ排除クロマトグラフィーを使用して評価した。突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素ＡをｐＨ７．０、６．０、および５．０で平衡化したＧ４０００ ＳＷＸＬカラム上に注入した。データは、突然変異毒素Ａ原薬および三重突然変異毒素Ａのストークス範囲の差異はサイズ排除クロマトグラフィーを使用して検出することができないことを示している。したがって、ＥＤＣ処理は流体力学的特性、またそれに対応して三重突然変異毒素Ａの全体的な分子形状に劇的な影響を与えていない。

【0651】

多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）技法を使用して三重突然変異毒素Ａおよび突然変異毒素Ａ原薬のさらなる分析を行った。三重突然変異毒素ＡをＥＤＣで処理することで、様々な多量体および単量体の種から構成される異種混合物の作製がもたらされた。そのような不均一性は、タンパク質のカルボキシルと第一級アミンとの間の、ＥＤＣに誘導された多数の分子間および分子内の共有結合の導入を反映する。

【0652】

得られたデータは三重突然変異毒素Ａおよび突然変異毒素Ａ原薬（ＥＤＣで処理した三重突然変異毒素Ａ）の物理的および化学的な特徴を提供しており、その一次、二次、および三次構造の主要な特長を説明している。生成されたデータは、三重突然変異毒素ＡをＥＤＣで処理することでそのポリペプチド鎖の共有的修飾がもたらされたが、タンパク質の二次および三次構造に影響が与えられなかったことを実証している。ＥＤＣを用いた処理は分子内および分子間の架橋結合をもたらす。突然変異毒素Ａ原薬（および三重突然変異毒素Ａ）で得られた生化学的および生物物理学的なパラメータを表６０に提示する。

【0653】

【表70】

【0654】

突然変異毒素Ｂ原薬の遠ＵＶ ＣＤデータを様々なｐＨで得た。ｐＨ５．０〜７．０で記録されたスペクトルは二次構造中の高いα−ヘリックスの割合の指標であり、タンパク質のポリペプチド主鎖が、α−ヘリックスが優勢な明確に定義されたコンホメーションを採ることを示唆している。

【0655】

また、突然変異毒素Ｂ原薬の近ＵＶ ＣＤスペクトルも得た。２６０〜３００ｎｍの強い負の楕円率は、芳香族側鎖が固有の強固な環境にあること、すなわち突然変異毒素Ｂ原薬が三次構造を保有することの指標である。実際、個々の芳香族側鎖の種類から生じる特徴的な特長をスペクトル内で識別することができる：約２９０ｎｍのショルダーおよび約２８３ｎｍの最大の負のピークは、秩序的なトリプトファン側鎖による偏光の吸光度が原因であり、２７６ｎｍの負のピークはチロシン側鎖からのものであり、２６２および２６８ｎｍの小さなショルダーは三次接触に関与しているフェニルアラニン残基の指標である。遠および近ＵＶ ＣＤスペクトルは、突然変異毒素Ｂ原薬が生理的ｐＨでコンパクトに折り畳まれた構造を保つことの証拠を提供する。ｐＨ５．０〜７．０で観察された非常に類似した遠および近ＵＶ ＣＤスペクトルは、このｐＨ範囲内で検出可能な二次または三次の構造的変化が起こっていないことを示す。ＰＨ３．０および４．０ではタンパク質がこれらのｐＨ点で不溶性であるため、ＣＤデータを収集することができなかった。

【0656】

突然変異毒素Ｂ原薬の遠および近ＵＶ ＣＤスペクトルを三重突然変異毒素Ｂのものと比較すると、どちらのタンパク質のスペクトルもｐＨ５．０と７．０との間で非常に類似しており、これはＥＤＣ処理がタンパク質の二次および三次構造に対して検出可能な効果を有さないことを示している。

【0657】

三重突然変異毒素Ｂは、一次配列の全体にわたって広がっており、好都合な内因性の蛍光プローブとして役割を果たすことができる１６個のトリプトファン残基を含有する。３００〜４００ｎｍの突然変異毒素Ｂ原薬の蛍光発光スペクトルを温度の関数として得た。７℃で、突然変異毒素Ｂ原薬は、２８０ｎｍで励起した際に特徴的なトリプトファン蛍光発光スペクトルを示す。蛍光発光の最大は約３３５ｎｍで観察され、これは、トリプトファン残基が極性の水性環境ではなくタンパク質内部に典型的な非極性環境にあることを示している。この結果がＣＤ実験の結果（上記参照）とあいまって、突然変異毒素Ｂ原薬がコンパクトな折り畳まれた構造を保つことが確認される。

【0658】

外因性プローブ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）の蛍光を使用して、ｐＨが変化した際に突然変異毒素Ｂ原薬および三重突然変異毒素Ｂにおいて可能なコンホメーション変化を特徴づけた。結果から見ることができるように、突然変異毒素Ｂ原薬または三重突然変異毒素Ｂのいずれかをプローブを用いてｐＨ７．０で滴定した場合にＡＮＳ蛍光強度は本質的に増加せず、これは、これらの条件下ではタンパク質上に疎水性表面が曝露されていないことを示唆している。ｐＨを２．６にシフトさせることで、蛍光量子収率が明らかな飽和に達するまで、突然変異毒素Ｂ原薬の存在下でプローブの濃度の増加に伴ってＡＮＳ蛍光量子収率の劇的な増加がもたらされる。このＡＮＳ蛍光量子収率の増加は、低ｐＨ（２．６）で突然変異毒素Ｂ原薬がｐＨに誘導されるコンホメーション変化を受けて、疎水性表面を曝露させることを示す。そのようなコンホメーション変化は、ＥＤＣに誘導された修飾および三重突然変異毒素Ｂの失活が突然変異毒素Ｂ原薬（ＤＳ）のコンホメーション柔軟性を制限しなかったことを示している。

【0659】

三重突然変異毒素Ｂの流体力学的特性に対するＥＤＣ処理の効果を、Ｇ４０００ ＳＷＸＬカラム上のサイズ排除クロマトグラフィーを使用して評価した。突然変異毒素Ｂ原薬および三重突然変異毒素ＢをｐＨ７．０、６．０、５．０で平衡化したＧ４０００ ＳＷＸＬカラム上に注入した。データは、突然変異毒素Ｂ原薬および三重突然変異毒素Ｂのストークス範囲の差異はサイズ排除クロマトグラフィーを使用して検出することができず、したがって、ＥＤＣ処理は流体力学的特性、またそれに対応してタンパク質の全体的な分子形状に劇的な影響を与えていないことを示している。

【0660】

多角度レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）技法を使用して三重突然変異毒素Ｂおよび突然変異毒素Ｂ原薬のさらなる分析を行った。三重突然変異毒素ＢをＥＤＣで処理することで、様々な多量体および単量体の種から構成されるより異種の混合物の作製がもたらされた。そのような不均一性は、タンパク質のカルボキシルと第一級アミンとの間の、ＥＤＣに誘導された多数の分子間および分子内の共有結合の導入を反映する。

【0661】

得られたデータは三重突然変異毒素Ｂおよび突然変異毒素Ｂ原薬（ＥＤＣで処理した三重突然変異毒素Ｂ）の物理的および化学的な特徴を提供しており、その一次、二次、および三次構造の主要な特長を説明している。生成されたデータは、三重突然変異毒素ＢをＥＤＣで処理することでそのポリペプチド鎖の共有的修飾がもたらされたが、タンパク質の二次および三次構造に影響が与えられなかったことを実証している。ＥＤＣを用いた処理は分子内および分子間の架橋結合をもたらす。突然変異毒素Ｂ原薬（および三重突然変異毒素Ｂ）で得られた主要な生化学的および生物物理学的なパラメータを表６１に提示する。

【0662】

【表71】

【実施例46】

【0663】

トキソイドＢ（三重突然変異体）の灌流発酵
トキソイドＢ（三重突然変異体）の種培養：４００ｍＬの培地を含有するそれぞれの１Ｌのボトルに１ｍｌの種を接種し、３７℃、静止で終夜（約１５時間）インキュベーションした。最終ＯＤ_６００は３．０〜４．０であるべきである。作業体積：３Ｌ（２．７Ｌの培地＋３００ｍＬの接種材料）。それぞれの発酵槽は１つのＲｕｓｈｔｏｎ羽根車およびチューブスパージャーを備えていた。初期条件：温度：３７℃、Ｎ２流：約０．５ｖｖｍ、スパージ。制御装置：ｐＨは５ＮのＮａＯＨで７．０に制御した。泡沫はＰＰＧ−２０００の自動添加によって制御し、０．２５ｍＬ／Ｌを滅菌前に発酵槽培地に加えた。

【0664】

シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の灌流培養は、積み重ねた２つのＳＡＲＴＯＣＯＮ Ｓｌｉｃｅカセット、０．２μｍの孔径のＨＹＤＲＯＳＡＲＴフィルター材料、０．１平方メートルの表面積／カセットを使用して行った。１０Ｌのガラス発酵槽中で、３Ｌを発酵槽に加えた。図２８、例１では、灌流はＯＤが標的の約４に圧した際に開始し、２時間間隔で０．７５Ｌ／時、１．５Ｌ／時、２．２５Ｌ／時、３Ｌ／時の増加する速度で行った。図２９、例２では、灌流はＯＤが標的の約４に達した際に発酵培地で開始し、２時間間隔で０．７５Ｌ／時、１．５Ｌ／時、３Ｌ／時、および６Ｌ／時の増加する速度で行った。灌流の開始シグナルで、再循環ポンプを１．３Ｌ／分の直交流の所望の速度で開始した。

【0665】

例１、図２８：最終ＯＤ５０およびトキソイドＢの力価２４３ｍｇ／Ｌが得られた。

【0666】

例２、図２９：最終ＯＤ５９およびトキソイドＢの力価３０６ｍｇ／Ｌが得られた。

【0667】

また、本発明は、以下の条項中で定義される以下の実施形態も提供する。
第１項．配列番号１８３を含む単離ポリペプチド。
第２項．配列番号１８４を含む単離ポリペプチド。
第３項．配列番号１８３を含む単離ポリペプチドを含む免疫原性組成物。
第４項．配列番号１８４を含む単離ポリペプチドを含む免疫原性組成物。
第５項．ダイズ加水分解物、酵母抽出物、およびグルコースを含む培養培地であって、培地がＶＰＩ１１１８６に由来するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を含み、細菌が毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠いており、細菌が突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドを含み、細菌がクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシン（ｆｄｘ）プロモーターをさらに含む培養培地。
第６項．シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を培地中で培養することを含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を培養する方法であって、培地がダイズ加水分解物、酵母抽出物、およびグルコースを含み、培地がＶＰＩ１１１８６に由来するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を含み、細菌が毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠いており、細菌が突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドを含み、細菌がクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシン（ｆｄｘ）プロモーターをさらに含む方法。
第７項．シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を培地中、毒素を産生させるのに適切な条件下で培養することと、毒素を培地から単離することとを含む、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素を産生させる方法であって、培地がダイズ加水分解物、酵母抽出物、およびグルコースを含み、培地がＶＰＩ１１１８６に由来するクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）細菌を含み、細菌が毒素をコードしている内在性ポリヌクレオチドを欠いており、細菌が突然変異シー・ディフィシル（Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素をコードしているポリヌクレオチドを含み、細菌がクロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）フェレドキシン（ｆｄｘ）プロモーターをさらに含む方法。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図1-5】

【図1-6】

【図1-7】

【図1-8】

【図2-1】

【図2-2】

【図2-3】

【図2-4】

【図2-5】

【図2-6】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16-1】

【図16-2】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図21-1】

【図21-2】

【図22】

【図23-1】

【図23-2】

【図23-3】

【図23-4】

【図23-5】

【図23-6】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]