特許 6872482 ＨＥＲ２を標的とする二重特異性抗原結合性構築物の使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6872482

(24)【登録日】2021年4月21日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】ＨＥＲ２を標的とする二重特異性抗原結合性構築物の使用方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/395 20060101AFI20210510BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20210510BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/395 T

   A61P35/00

   A61K47/68

   !C07K16/30ZNA

【請求項の数】31

【全頁数】175

(21)【出願番号】特願2017-528442(P2017-528442)

(86)(22)【出願日】2015年11月26日

(65)【公表番号】特表2018-501211(P2018-501211A)

(43)【公表日】2018年1月18日

(86)【国際出願番号】CA2015051238

(87)【国際公開番号】WO2016082044

(87)【国際公開日】20160602

【審査請求日】2018年11月26日

(31)【優先権主張番号】PCT/CA2014/051140

(32)【優先日】2014年11月27日

(33)【優先権主張国】CA

(31)【優先権主張番号】62/166,844

(32)【優先日】2015年5月27日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】510214045

【氏名又は名称】ザイムワークス，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名 雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部 俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上 隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺 秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関 雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐 義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本 和弥

(72)【発明者】

【氏名】ウィックマン グラント レイモンド

(72)【発明者】

【氏名】エング ゴードン イウ コン

(72)【発明者】

【氏名】ウェイサー ニーナ イー．

【審査官】 山村 祥子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１４−５１７８２３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１３／０５５９５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１３−５２３１０４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／１３１５５５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Cancer Genomics Proteomics，２０１３年 ２月，Vol. 10，p. 1-18

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｋ ４７／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ｃ０７Ｋ １６／３０ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

対象において、腫瘍の増殖を阻害するための、有効量の抗原結合性構築物を含む医薬組成物であって、
前記抗原結合性構築物が、
第一の重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）及び第一の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を含み、かつＨＥＲ２発現細胞上のＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）ＥＣＤ２（細胞外ドメイン２）領域と一価で特異的に結合する、第一の抗原結合性ポリペプチド構築物であって、
第一の重鎖可変ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３の３つの第一の重鎖ＣＤＲを含み、第一の軽鎖可変ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３の３つの第一の軽鎖ＣＤＲを含む、
第一の抗原結合性ポリペプチド構築物、ならびに
第二の重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）及び第二の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）を含み、かつＨＥＲ２発現細胞上のＨＥＲ２ ＥＣＤ４（細胞外ドメイン４）領域と一価で特異的に結合する、第二の抗原結合性ポリペプチド構築物であって、
第二の重鎖可変ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０７に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１１に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０９に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３の３つの第二の重鎖ＣＤＲを含み、第二の軽鎖可変ドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９９に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０３に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０１に記載の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３の３つの第二の軽鎖ＣＤＲを含む、
第二の抗原結合性ポリペプチド構築物
を含み；
前記第一の抗原結合性ポリペプチド構築物がＦａｂであり、前記第二の抗原結合性ポリペプチド構築物がｓｃＦｖであり；かつ
前記抗原結合性構築物の複数の用量が対象に投与されるように用いられることを特徴とし、前記複数の用量の少なくとも１つの量が、少なくとも０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは３０ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物であり、かつ／または、前記複数の用量のそれぞれの量が、少なくとも０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは３０ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物である、
前記医薬組成物。

【請求項2】

第一の重鎖可変ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９に記載の配列を含み、第一の軽鎖可変ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１に記載の配列を含み、第二の重鎖可変ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０５に記載の配列を含み、かつ第二の軽鎖可変ドメインがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９７に記載の配列を含む、請求項１に記載の医薬組成物。

【請求項3】

抗原結合性構築物が、第一及び第二のリンカーポリペプチドをさらに含み、前記第一のリンカーポリペプチドが前記第一の抗原結合性ポリペプチド構築物に機能的に連結されており、かつ前記第二のリンカーポリペプチドが前記第二の抗原結合性ポリペプチド構築物に機能的に連結されており、かつ前記第一及び第二のリンカーポリペプチドがＦｃに機能的に連結されている、請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項4】

前記第一及び第二のリンカーポリペプチドがそれぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒンジ領域から選択される免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項5】

前記抗原結合性構築物が、２つのＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃを含み、前記２つのＣＨ３配列の少なくとも１つが、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進する１つまたは複数の修飾を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項6】

前記抗原結合性構築物が、野生型ホモ二量体Ｆｃと比較して、ＥＵナンバリングに従って、
ｉ．修飾Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを第二のポリペプチド中に有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ；
ｉｉ．修飾Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ；
ｉｉｉ．修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ；
ｉｖ．修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ；
ｖ．修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ；
ｖｉ．修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ；または
ｖｉｉ．修飾Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０５Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有する、ヘテロ二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ
を含む、
請求項５に記載の医薬組成物。

【請求項7】

前記抗原結合性構築物が、少なくとも１つのＣＨ２ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項8】

第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７に記載の配列を含む第一の重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に記載の配列を含む第一の軽鎖を含み、かつ
第二の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９５に記載の配列を含む、
請求項１または２に記載の医薬組成物。

【請求項9】

第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７に記載の配列からなる第一の重鎖およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９に記載の配列からなる第一の軽鎖を含み、かつ
第二の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９５に記載の配列からなる、
請求項１、２、または８に記載の医薬組成物。

【請求項10】

抗原結合性構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９５に記載のｖ１００００の全長配列からなる、請求項１、２、８、または９に記載の医薬組成物。

【請求項11】

各用量が、少なくとも毎日、毎週、または毎月投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項12】

各用量が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日毎に投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項13】

追加の薬剤と併用されることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記追加の薬剤が、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、ｎａｂ−パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エルロチニブ、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、トポテカン、ビノレルビン、カペシタビン、ナベルビン、またはパクリタキセルのうちの１つまたは複数である、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記対象が、ＨＥＲ２−低、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）；ＨＥＲ２−低、頭頸部扁平上皮癌；ＨＥＲ２ １＋、ＥＲ＋乳癌；ＨＥＲ２陰性膵臓癌；またはＨＥＲ２ ３＋胃癌を有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

前記対象がＨＥＲ２−低、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有し、前記抗原結合性構築物が、１５ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物の用量で１回投与された後、１０ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物の用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項17】

前記対象がＨＥＲ２−低、頭頸部扁平上皮癌を有し、前記抗原結合性構築物が、１５ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物の用量で１回投与された後、１０ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物の用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項18】

シスプラチンと併用されることを特徴とする、請求項１７に記載の医薬組成物。

【請求項19】

前記対象がＨＥＲ２ １＋、ＥＲ＋乳癌を有し、前記抗原結合性構築物が、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇまたは３０ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物の用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項20】

前記対象がＨＥＲ２陰性膵臓癌を有し、前記抗原結合性構築物が、３０ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物の用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項21】

ｎａｂ−パクリタキセルと併用されることを特徴とする、請求項２０に記載の医薬組成物。

【請求項22】

前記対象がＨＥＲ２ ３＋胃癌を有し、前記抗原結合性構築物が、３０ｍｇ／ｋｇの抗原結合性構築物の用量で投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項23】

処置期間が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１日間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０週間；または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０カ月である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項24】

注射または注入により投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項25】

静脈内投与されるように用いられることを特徴とする、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項26】

前記抗原結合性構築物が薬物にコンジュゲートしている、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項27】

前記薬物がマイタンシン（ＤＭ１）である、請求項２６に記載の医薬組成物。

【請求項28】

薬学的担体をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項29】

前記対象が抗ＨＥＲ２抗体を用いて以前に処置されていない、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項30】

前記対象が、ペルツズマブ、トラスツズマブおよび／もしくはＴＤＭ１を用いて以前に処置されており、かつ／または前記腫瘍が、ペルツズマブ、トラスツズマブおよび／もしくはＴＤＭ１に耐性または不応性である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項31】

前記対象がヒト対象である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年１１月２７日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５１１４０、及び２０１５年５月２７日に出願された６２／１６６，８４４号の利益を主張し；このそれぞれは、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出されるだろう配列表を含有し、この配列表は全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１５年１１月２４日に作製され、名称は３２５６５ＰＣＴ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔであり、サイズは２７５，０９１バイトである。

【背景技術】

【0003】

現在市販されている抗体治療薬の大部分は、２つの抗原結合性ドメインによって付与される高い親和性結合及び結合活性について最適化及び選択された二価単一特異性抗体である。突然変異誘発によるＦｃｇＲ結合のアフコシル化または増強を用いて、抗体Ｆｃ依存性細胞傷害性機構を介して抗体をより有効にしている。アフコシル化抗体、またはＦｃｇＲ結合を増強された抗体は、依然として治験において不完全な治療有効性に甘んじており、薬物を市販する状況は、これらの抗体のいずれについても、まだ達成されていない。毒素にコンジュゲートされた典型的な二価抗体（抗体薬物コンジュゲート）はさらに有効であるが、より広い臨床的有用性は、用量制限毒性により限定される。

【0004】

治療用抗体は、理想的には、対象患者への投与後の標的特異性、生体内安定性、バイオアベイラビリティ、及び生体内分布を含むある特定の最小限の特性、ならびに抗体依存性治療効果を最大化するために十分な標的結合親和性及び高い標的占有率を有するであろう。典型的には、治療用抗体は単一特異性である。しかしながら、単一特異的に標的とすることは、シグナル伝達及び病因に関連する可能性がある他の標的エピトープに対処せず、薬物耐性及び逃避機構を許してしまう。現行の治療パラダイムのいくつかは、同じ標的抗原の２つの異なるエピトープを標的とする２種の治療用単一特異性抗体の組み合わせの使用を必要とする。一例は、いくつかの癌細胞の表面上にあるＨＥＲ２受容体タンパク質を両方とも標的とするトラスツズマブ及びペルツズマブの併用であるが、比較的低いＨＥＲ２受容体レベル（Ｈｅｒｃｅｐｔ検査でＨＥＲ２＜３＋）を有する他の癌細胞は治療利益を示さず、患者の疾患は依然として進行する。ＨＥＲ２を標的とする治療用抗体は、ＧｅｎＭａｂに付与されたＷＯ２０１２／１４３５２３（特許文献１）及びＧｅｎｅｎｔｅｃｈに付与されたＷＯ２００９／１５４６５１（特許文献２）において開示されている。抗体は、ＷＯ２００９／０６８６２５（特許文献３）及びＷＯ２００９／０６８６３１（特許文献４）においても記載されている。

【0005】

共有特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５１１４０（特許文献５）は、ＨＥＲ２抗体を記載する。共有特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７４０１（ＷＯ２０１４／１８２９７０）（特許文献６）は、ＨＥＲ２抗体を記載する。共有特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０３５８（ＷＯ２０１３／１６６６０４）（特許文献７）は、シングルアーム一価抗体を記載する。２０１１年１１月４日に出願された共有特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８（特許文献８）、２０１２年１１月２日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０（特許文献９）、２０１３年５月１０日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１３／００４７１（特許文献１０）、及び２０１３年５月８日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０３５８（特許文献７）は、治療用抗体を記載する。それぞれ、その全体がすべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】ＷＯ２０１２／１４３５２３

【特許文献2】ＷＯ２００９／１５４６５１

【特許文献3】ＷＯ２００９／０６８６２５

【特許文献4】ＷＯ２００９／０６８６３１

【特許文献5】ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５１１４０

【特許文献6】ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３７４０１（ＷＯ２０１４／１８２９７０）

【特許文献7】ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／０５０３５８（ＷＯ２０１３／１６６６０４）

【特許文献8】ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８

【特許文献9】ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０

【特許文献10】ＰＣＴ／ＣＡ２０１３／００４７１

【発明の概要】

【0007】

例えば、胃、膵臓、乳房、肺、または頭頸部腫瘍などの、対象における腫瘍を処置するために１つまたは複数の抗原結合性構築物を使用する方法を本明細書に記載する。１つまたは複数の抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２発現細胞上のＨＥＲ２（ヒト上皮成長因子受容体２）ＥＣＤ２（細胞外ドメイン２）抗原と一価で特異的に結合する第一の抗原結合性ポリペプチド構築物及びＨＥＲ２発現細胞上のＨＥＲ２ ＥＣＤ４（細胞外ドメイン４）抗原と一価で特異的に結合する第二の抗原結合性ポリペプチド構築物、第一及び第二のリンカーポリペプチドを含むことができ、ここで、第一のリンカーポリペプチドは第一の抗原結合性ポリペプチド構築物に機能的に連結し、第二のリンカーポリペプチドは第二の抗原結合性ポリペプチド構築物に機能的に連結し；リンカーポリペプチドは相互に共有結合を形成することができ、ＥＣＤ２結合性ポリペプチド構築物またはＥＣＤ４結合性ポリペプチド構築物の少なくとも一方はｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ＥＣＤ２結合性ポリペプチド構築物はｓｃＦｖであり、ＥＣＤ２結合性ポリペプチド構築物はＦａｂである。ある特定の実施形態では、ＥＣＤ２結合性ポリペプチド構築物はＦａｂであり、ＥＣＤ４結合性ポリペプチド構築物はｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、ＥＣＤ２結合性ポリペプチド構築物及びＥＣＤ４結合性ポリペプチド構築物は両方ともｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、ＣＨ３配列を含む二量体Ｆｃを有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ＣＨ３配列において、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進する１つまたは複数の修飾を有するヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体ＣＨ３配列は、６８℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する。
[本発明1001]
腫瘍を有する対象を処置する；ＨＥＲ2シグナル伝達を阻害する、減少させるもしくは遮断する；またはＨＥＲ2発現腫瘍細胞を殺傷するもしくは増殖を阻害する方法であって、
ＨＥＲ2発現細胞上のＨＥＲ2（ヒト上皮成長因子受容体2）ＥＣＤ2（細胞外ドメイン2）抗原と一価で特異的に結合する第一の抗原結合性ポリペプチド構築物；
ＨＥＲ2発現細胞上のＨＥＲ2 ＥＣＤ4（細胞外ドメイン4）抗原と一価で特異的に結合する第二の抗原結合性ポリペプチド構築物；
第一及び第二のリンカーポリペプチド
を含む抗原結合性構築物の有効量を投与することを含み、
第一のリンカーポリペプチドは第一の抗原結合性ポリペプチド構築物に機能的に連結されており、第二のリンカーポリペプチドは第二の抗原結合性ポリペプチド構築物に機能的に連結されており；
前記リンカーポリペプチドは相互に共有結合を形成することができ、
第一もしくは第二の抗原結合性ポリペプチド構築物の一方または両方がｓｃＦｖであり、
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された前記抗原結合性構築物のマウスＨＥＲ2細胞外ドメインに対する解離定数（Ｋ_Ｄ）が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された単一特異性抗ＨＥＲ2 ＥＣＤ4抗体（ｖ506；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：317）のマウスＨＥＲ2細胞外ドメインに対する解離定数と等しいかまたはそれより低く、かつ、
腫瘍増殖が、対応量の非特異的対照抗体を受けている対照と比較して、対応量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ／トラスツズマブを受けている対照と比較して、または処置を受けていない対照と比較して、低減する、
前記方法。
[本発明1002]
前記抗原結合性構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：97、295、及び69の完全長配列（ｖ10000）を含み、任意選択で、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された前記構築物のマウスＨＥＲ2細胞外ドメインに対する解離定数（Ｋ_Ｄ）が、おおよそ0．6ｎＭである、本発明1001の方法。
[本発明1003]
腫瘍を有する対象を処置する；ＨＥＲ2シグナル伝達を阻害する、減少させるもしくは遮断する；またはＨＥＲ2発現腫瘍細胞を殺傷するもしくは増殖を阻害する方法であって、
ＨＥＲ2発現細胞上のＨＥＲ2（ヒト上皮成長因子受容体2）ＥＣＤ2（細胞外ドメイン2）抗原と一価で特異的に結合し、第一の可変軽鎖（ＶＬ1）ドメイン及び第一の可変重鎖（ＶＨ1）ドメインを含み、ｖ7091のＶＨ1及びＶＬ1 ＣＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：223、225、227、37、39、及び41）に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％同一であるＶＨ1及びＶＬ1 ＣＤＲ配列を含む、第一の抗原結合性ポリペプチド構築物であって、前記ＶＬ1ドメインは1、2、3、4、または5個のアミノ酸置換を含み、かつ／または前記ＶＨ1ドメインは1、2、3、4、または5個のアミノ酸置換を含む、第一の抗原結合性ポリペプチド構築物；
ＨＥＲ2発現細胞上のＨＥＲ2 ＥＣＤ4（細胞外ドメイン4）抗原と一価で特異的に結合する第二の抗原結合性ポリペプチド構築物；
第一及び第二のリンカーポリペプチド
を含む抗原結合性構築物の有効量を投与することを含み、
第一のリンカーポリペプチドは第一の抗原結合性ポリペプチド構築物に機能的に連結されており、第二のリンカーポリペプチドは第二の抗原結合性ポリペプチド構築物に機能的に連結されており；
第一もしくは第二の抗原結合性ポリペプチド構築物の一方または両方がｓｃＦｖであり、
前記リンカーポリペプチドは相互に共有結合を形成することができ、かつ、
腫瘍増殖が、対応量の非特異的対照抗体を受けている対照と比較して、対応量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ／トラスツズマブを受けている対照と比較して、または処置を受けていない対照と比較して、低減する、
前記方法。
[本発明1004]
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された前記抗原結合性構築物のマウスＨＥＲ2細胞外ドメインに対する結合親和性が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定されたｖ7091（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：33、219、及び295）のマウスＨＥＲ2細胞外ドメインに対する結合親和性より大きく、任意選択で前記抗原結合性構築物とｖ7091が同じエピトープと結合し、任意選択で前記抗原結合性構築物がペルツズマブと同じエピトープと結合し、任意選択で前記抗原結合性構築物がｖ7091より大きいＢｍａｘを有し、かつ、任意選択で前記抗原結合性構築物が細胞表面結合の際にｖ7091よりも大きい程度に内部移行する、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1005]
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された前記抗原結合性構築物のマウスＨＥＲ2細胞外ドメインに対する結合親和性が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定された単一特異性抗ＨＥＲ2 ＥＣＤ4抗体（ｖ506；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：1及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：317）のマウスＨＥＲ2細胞外ドメインに対する結合親和性と等しいかまたはそれより大きい、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1006]
第一の抗原結合性ポリペプチド構築物がｖ7091のＶＨ1及びＶＬ1 ＣＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：223、225、227、37、39、及び41）を含み、前記ＶＬ1ドメインが1、2、3、4、または5個のアミノ酸置換を含み、かつ／または前記ＶＨ1ドメインが1、2、3、4、または5個のアミノ酸置換を含み、任意選択で第一の抗原結合性ポリペプチド構築物は前記ＶＬ1ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35）中のＹ96での置換を含み、任意選択で第一の抗原結合性ポリペプチド構築物は前記ＶＬ1ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35）中にＹ96Ａ置換を含み、任意選択で第一の抗原結合性ポリペプチド構築物は前記ＶＨ1ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：221）中のＴ30、Ａ49、および／またはＬ69での置換を含み、任意選択で第一の抗原結合性ポリペプチド構築物は前記ＶＨ1ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：221）中にＴ30Ａ、Ａ49Ｇ、および／またはＬ69Ｆ置換（複数可）を含み、かつ、任意選択で第一の抗原結合性ポリペプチド構築物は前記ＶＨ1ドメイン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：221）中にＴ30Ａ、Ａ49Ｇ、及びＬ69Ｆ置換（複数可）を含む、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1007]
第二の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ｖ10000のＶＨ2及びＶＬ2 ＣＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：299、301、303、307、309、及び311）に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％同一であるＶＨ2及びＶＬ2 ＣＤＲ配列を含み、任意選択で第二の抗原結合性ポリペプチド構築物がｖ10000のＶＨ2及びＶＬ2 ＣＤＲ配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：299、301、303、307、309、及び311）を含む、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記抗原結合性構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：71および／もしくは99に記載の可変ドメイン配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：297および／もしくは305に記載の可変ドメイン配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：71、99、297、及び305に記載の可変ドメイン配列を含む、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1009]
前記抗原結合性構築物が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：97に記載の完全長配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：295に記載の完全長配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：69に記載の完全長配列、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：97、295、及び69に記載の完全長配列（ｖ10000）を含む、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1010]
第一及び第二のリンカーポリペプチドがそれぞれ、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2またはＩｇＧ4ヒンジ領域から選択される免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドを含む、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1011]
第一及び第二のリンカーポリペプチドが、スカフォールド、任意選択でＦｃ、に機能的に連結されている、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1012]
第一及び第二のリンカーポリペプチドが、ＣＨ3配列をそれぞれ含む第一及び第二のＦｃポリペプチドを含む二量体Ｆｃに機能的に連結されており、第一のＦｃポリペプチドは第一のリンカーポリペプチドに機能的に連結されており、かつ、第二のＦｃポリペプチドは第二のリンカーポリペプチドに機能的に連結されている、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1013]
（ｉ）第一の抗原結合性ポリペプチド構築物がｓｃＦｖであり、かつ第二の抗原結合性ポリペプチド構築物がＦａｂである；または（ｉｉ）第一の抗原結合性ポリペプチド構築物がＦａｂであり、第二の抗原結合性ポリペプチド構築物がｓｃＦｖである；または（ｉｉｉ）第一の抗原結合性ポリペプチド構築物及び第二の抗原結合性ポリペプチド構築物の両方がｓｃＦｖである、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1014]
ｉ．第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、Ｆａｂであり、
ａ．ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のペルツズマブ群のＶＨ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：221、149、221、259、及び99）を含む第一の重鎖可変ポリペプチドＶＨ1、ならびに
ｂ．ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のペルツズマブ群のＶＬ（ｖ5019、ｖ7091、及びｖ10000に対してそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35、35、及び71）を含む第一の可変軽鎖ポリペプチドＶＬ1
を含み；かつ、
第二の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ｓｃＦｖであり、
（ａ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のトラスツズマブ群のＶＨ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：171、205、297、171、及び297）を含む第二の可変重鎖ポリペプチドＶＨ2、ならびに
（ｂ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のトラスツズマブ（ｔｒａｓｔｚｕｍａｂ）群のＶＬ（ｖ5020に対してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35）を含む第二の可変軽鎖ポリペプチドＶＬ2
を含み；または
ｉｉ．第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ｓｃＦｖであり、
（ａ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のペルツズマブ群のＶＨ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：221、149、221、259、及び99）を含む第一の可変重鎖ポリペプチドＶＨ1、ならびに
（ｂ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のペルツズマブ群のＶＬ（ｖ5019、ｖ7091、及びｖ10000に対してそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35、35、及び71）を含む第一の可変軽鎖ポリペプチドＶＬ1
を含み、かつ、
第二の抗原結合性ポリペプチド構築物が、Ｆａｂであり、
（ａ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のトラスツズマブ群のＶＨ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：171、205、297、171、及び297）を含む第二の重鎖可変ポリペプチドＶＨ2、ならびに
（ｂ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のトラスツズマブ群のＶＬ（ｖ5020に対してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35）を含む第二の可変軽鎖ポリペプチドＶＬ2
を含む；または
ｉｉｉ．第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ｓｃＦｖであり、
（ａ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のペルツズマブ群のＶＨ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：221、149、221、259、及び99）を含む第一の重鎖可変ポリペプチドＶＨ1、ならびに
（ｂ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のペルツズマブ群のＶＬ（ｖ5019、ｖ7091、及びｖ10000に対してそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35、35、及び71）を含む第一の可変軽鎖ポリペプチドＶＬ1
を含み、
第二の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ｓｃＦｖであり、
（ａ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のトラスツズマブ群のＶＨ（それぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：171、205、297、171、及び297）を含む第二の重鎖可変ポリペプチドＶＨ2、ならびに
（ｂ）ｖ5019、ｖ5020 ｖ7091、ｖ6717もしくはｖ10000のトラスツズマブ群のＶＬ（ｖ5020に対してＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：35）を含む第二の可変軽鎖ポリペプチドＶＬ2
を含む、
上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1015]
第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、
ｉ．アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：335、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：337、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：335、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：348を含む3つのＶＨ ＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；
ｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：335、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：337、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：335、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336、及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：348の3つのＶＨ ＣＤＲ配列に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含む3つのＶＨ ＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；
ｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：338、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：339及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：340、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：338、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：347及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：340の3つのＶＬ ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を含む3つのＶＬ ＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；
ｉｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：338、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：339及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：340、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：338、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：347及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：340に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99％同一である3つのＶＬ ＣＤＲ配列のアミノ酸配列に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99％同一である3つのＶＬ ＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；
ｖ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：335、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：337、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：338、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：339及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：340；もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：335、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：348、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：338、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：347及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：340の6つのＣＤＲ配列のアミノ酸配列を含む6つのＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；または
ｖｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：335、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：337、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：338、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：339及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：340；もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：335、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：336、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：348、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：338、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：347及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：340の6つのＣＤＲ配列に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含む6つのＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物
から選択され、かつ、
第二の抗原結合性ポリペプチドが、
ｖｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：341、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：342及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：343の3つのＶＨ ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を含む3つのＶＨ ＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；
ｖｉｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：341、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：342及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：343の3つのＶＨ ＣＤＲ配列に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含む3つのＶＨ ＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；
ｉｘ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：344、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：345及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：346の3つのＶＬ ＣＤＲ配列のアミノ酸配列を含む3つのＶＬ ＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；
ｘ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：344、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：345及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：346の3つのＶＬ ＣＤＲ配列のアミノ酸配列に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99％同一である3つのＶＬ ＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；
ｘｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：341、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：342、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：343、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：344、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：345及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：346の6つのＣＤＲ配列のアミノ酸配列を含む6つのＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物；または
ｘｉｉ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：341、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：342、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：343、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：344、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：345及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：346の6つのＣＤＲ配列に少なくとも90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99％同一であるアミノ酸配列を含む6つのＣＤＲ配列を含むポリペプチド構築物
から選択される、
上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1016]
第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、（ｉ）ＥＣＤ2へのペルツズマブの結合を50％以上遮断する、かつ／または（ｉｉ）第二の抗原結合性ポリペプチドが、ＥＣＤ4へのトラスツズマブの結合を50％以上遮断する、上記本発明のいずれかの方法。
[本発明1017]
第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ＨＥＲ2 ＥＣＤ2に特異的なｖ5019、ｖ10000、ｖ7091、ｖ5020またはｖ6717抗原結合性ポリペプチド構築物のうちの1つを含み、第二の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ＨＥＲ2 ＥＣＤ4に特異的なｖ5019、ｖ10000、ｖ7091、ｖ5020またはｖ6717抗原結合性ポリペプチド構築物のうちの1つを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1018]
第一の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ＨＥＲ2 ＥＣＤ2に特異的なｖ5019、ｖ10000、ｖ7091、ｖ5020またはｖ6717抗原結合性ポリペプチド構築物に少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含み、第二の抗原結合性ポリペプチド構築物が、ＨＥＲ2 ＥＣＤ4に特異的なｖ5019、ｖ10000、ｖ7091、ｖ5020またはｖ6717抗原結合性ポリペプチド構築物に少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％、または99％同一であるアミノ酸配列を含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1019]
ｖ5019、ｖ10000、ｖ7091、ｖ5020及びｖ6717から選択される、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1020]
第一の抗原結合性ポリペプチド構築物がＦａｂであり、第二の抗原結合性ポリペプチド構築物がｓｃＦｖであり、前記抗原結合性構築物が、2つのＦａｂを有する基準二重パラトピック抗原結合性構築物と比較して、
（ｉ）ＨＥＲ2 3＋細胞において受容体内部移行の増加を誘導する、かつ／または
（ｉｉ）ＨＥＲ2 1＋細胞に対するＡＤＣＣ（抗体指向性細胞傷害）アッセイにてより高い効力を示す、かつ／または
（ｉｉｉ）実施例、表、及び図の1つまたは複数において記載した特性の1つまたは複数を含む、
先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1021]
第一及び第二の抗原結合性ポリペプチド構築物がｓｃＦｖであり、前記抗原結合性構築物が、2つのＦａｂを有する基準抗原結合性構築物と比較して、ＨＥＲ2 1＋、2＋及び3＋細胞において受容体内部移行の増加を誘導する、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1022]
前記抗原結合性構築物がＦｃを含み、任意選択で前記Ｆｃがヘテロ二量体Ｆｃである、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1023]
前記抗原結合性構築物がヘテロ二量体Ｆｃを含み、二量体化ＣＨ3配列が、約68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77．5、78、79、80、81、82、83、84、または85℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1024]
前記抗原結合性構築物が、発現するときに、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％超の純度で形成されるヘテロ二量体Ｆｃを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1025]
前記抗原結合性構築物が、単一の細胞を介して発現するときに、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％超の純度で形成されるヘテロ二量体Ｆｃを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1026]
前記抗原結合性構築物が、前記ＣＨ3配列の少なくとも1つにおいて1つまたは複数の修飾を含むヘテロ二量体Ｆｃを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1027]
前記抗原結合性構築物が、前記ＣＨ3配列の少なくとも1つにおいて、野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進する1つまたは複数の修飾を含むヘテロ二量体Ｆｃを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1028]
前記抗原結合性構築物が、野生型ホモ二量体Ｆｃと比較して、ＥＵナンバリングに従って、
ｉ．修飾Ｌ351Ｙ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ366Ｌ＿Ｋ392Ｍ＿Ｔ394Ｗを第二のポリペプチド中に有するヘテロ二量体ＩｇＧ1 Ｆｃ；
ｉｉ．修飾Ｌ351Ｙ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ366Ｌ＿Ｋ392Ｌ＿Ｔ394Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有するヘテロ二量体ＩｇＧ1 Ｆｃ；
ｉｉｉ．修飾Ｔ350Ｖ＿Ｌ351Ｙ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ350Ｖ＿Ｔ366Ｌ＿Ｋ392Ｌ＿Ｔ394Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有するヘテロ二量体ＩｇＧ1 Ｆｃ；
ｉｖ．修飾Ｔ350Ｖ＿Ｌ351Ｙ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ350Ｖ＿Ｔ366Ｌ＿Ｋ392Ｍ＿Ｔ394Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有するヘテロ二量体ＩｇＧ1 Ｆｃ；
ｖ．修飾Ｔ350Ｖ＿Ｌ351Ｙ＿Ｓ400Ｅ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ350Ｖ＿Ｔ366Ｌ＿Ｎ390Ｒ＿Ｋ392Ｍ＿Ｔ394Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有するヘテロ二量体ＩｇＧ1 Ｆｃ、
ｖｉ．修飾Ｔ350Ｖ＿Ｌ351Ｙ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ407Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ366Ｉ＿Ｎ390Ｒ＿Ｋ392Ｍ＿Ｔ394Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有するヘテロ二量体ＩｇＧ1 Ｆｃ；または
ｖｉｉ．修飾Ｌ351Ｙ＿Ｓ400Ｅ＿Ｆ405Ａ＿Ｙ405Ｖを第一のＦｃポリペプチド中に、及び修飾Ｔ350Ｖ＿Ｔ366Ｌ＿Ｋ392Ｌ＿Ｔ394Ｗを第二のＦｃポリペプチド中に有するヘテロ二量体ＩｇＧ1 Ｆｃ
を含む、
先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1029]
前記抗原結合性構築物が、少なくとも1つのＣＨ2ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1030]
前記ヘテロ二量体Ｆｃの前記ＣＨ2ドメイン（複数可）が1つまたは複数の修飾を含む、本発明1029の方法。
[本発明1031]
前記抗原結合性構築物が、Ｆｃ−ガンマ受容体の選択的結合を促進する1つまたは複数の修飾を含むヘテロ二量体Ｆｃを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1032]
前記抗原結合性構築物が少なくとも1つの修飾を含み、該修飾がアフコシル化である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1033]
前記抗原結合性構築物が薬物にコンジュゲートしている、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1034]
前記薬物がマイタンシン（ＤＭ1）である、本発明1033の方法。
[本発明1035]
前記構築物が、ＳＭＣＣリンカーを通してＤＭ1にコンジュゲートされている、本発明1034の方法。
[本発明1036]
前記抗原結合性構築物が、薬学的担体と共に医薬組成物に製剤化される、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1037]
前記薬学的担体が、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート化剤、安定剤、または賦形剤を含む、本発明1036の方法。
[本発明1038]
前記処置の結果が、前記腫瘍の縮小、前記腫瘍の増殖の阻害、前記腫瘍の無増悪期間の増加、前記対象の無病生存期間の延長、転移の低減、前記対象の無増悪生存期間の増加、または前記対象の全生存期間の増加である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1039]
前記腫瘍が、腫瘍細胞1個あたり平均で10，000以上のＨＥＲ2のコピーを発現する細胞を含み、任意選択で前記腫瘍はＨＥＲ2遺伝子増幅されている、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記腫瘍が、免疫組織化学（ＩＨＣ）により決定して、ＨＥＲ2 1＋、ＨＥＲ2 2＋またはＨＥＲ2 3＋である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記腫瘍が、ＩＨＣにより決定して2＋以下のレベルでＨＥＲ2を発現する、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記ＨＥＲ2＋腫瘍が、免疫組織化学（ＩＨＣ）により決定して2＋レベル以下でＨＥＲ2を発現する乳癌である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記腫瘍が肺腫瘍であり、任意選択で前記腫瘍はＨＥＲ2低（ＨＥＲ2−ｌｏｗ）で非ＨＥＲ2遺伝子増幅の非扁平上皮非小細胞肺腫瘍である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1044]
前記腫瘍がＨＥＲ3＋である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記腫瘍がＥＧＦＲ低（ＥＧＦＲ ｌｏｗ）である、本発明1043または1044の方法。
[本発明1046]
前記腫瘍が、ＭＴＤでシスプラチンに対して中程度に感受性である、本発明1043、1044または1045の方法。
[本発明1047]
前記腫瘍が頭頸部腫瘍であり、任意選択で前記腫瘍はＨＥＲ2低で非ＨＥＲ2遺伝子増幅の頭頸部の扁平上皮腫瘍である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記腫瘍がＨＥＲ3＋低（ＨＥＲ3＋ ｌｏｗ）である、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記腫瘍がＥＧＦＲ＋である、本発明1047または1048の方法。
[本発明1050]
前記腫瘍が、ＭＴＤでシスプラチンに対して高感受性である、本発明1047、1048または1049の方法。
[本発明1051]
前記腫瘍が乳房腫瘍であり、任意選択で前記腫瘍はルミナルＢ分子分類を伴うＥＲ＋／ＰＲ−乳癌である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1052]
前記腫瘍が膵臓腫瘍であり、任意選択で前記膵臓腫瘍はＩＨＣにより決定してＨＥＲ2陰性である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記腫瘍が胃腫瘍であり、任意選択で前記胃腫瘍はＨＥＲ2 3＋である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記対象が抗ＨＥＲ2抗体を用いて以前に処置されていない、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記腫瘍が、ペルツズマブ、トラスツズマブおよび／またはＴＤＭ1に対して耐性であるまたは不応性である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1056]
前記対象が、ペルツズマブ、トラスツズマブおよび／またはＴＤＭ1を用いて以前に処置されている、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記腫瘍が、（ｉ）ＨＥＲ2 3＋エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰＲ−）、トラスツズマブ耐性、化学療法耐性の浸潤性乳管癌、（ｉｉ）ＨＥＲ2 3＋ＥＲ−、ＰＲ−、トラスツズマブ耐性の炎症性乳癌、（ｉｉｉ）ＨＥＲ2 3＋、ＥＲ−、ＰＲ−、浸潤性乳管癌、または（ｉｖ）ＨＥＲ2 2＋ＨＥＲ2遺伝子増幅トラスツズマブ及びペルツズマブ耐性の乳癌である、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1058]
前記腫瘍細胞が、ＨＥＲ2 1＋もしくは2＋ヒト膵臓癌腫細胞、ＨＥＲ2 3＋ヒト肺癌腫細胞、ＨＥＲ2 2＋ヒト白色人種細気管支肺胞上皮（ｂｒｏｎｃｈｉｏａｖｅｏｌａｒ）癌細胞、ヒト咽頭癌腫細胞、ＨＥＲ2 2＋ヒト舌扁平上皮癌細胞、咽頭のＨＥＲ2 2＋舌扁平上皮癌、ＨＥＲ2 1＋または2＋ヒト結腸直腸癌腫細胞、ＨＥＲ2 3＋ヒト胃癌腫細胞、ＨＥＲ2 1＋ヒト乳管ＥＲ＋（エストロゲン受容体陽性）癌腫細胞、ＨＥＲ2 2＋／3＋ヒトＥＲ＋、ＨＥＲ2増幅乳癌腫細胞、ＨＥＲ2 0＋／1＋ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞、ＨＥＲ2 2＋ヒト類内膜癌細胞、ＨＥＲ2 1＋肺転移性悪性メラノーマ細胞、ＨＥＲ2 1＋ヒト子宮頸癌腫細胞、Ｈｅｒ2 1＋ヒト腎細胞癌腫細胞、またはＨＥＲ2 1＋ヒト卵巣癌腫細胞である、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記腫瘍細胞が、ＨＥＲ2 1＋もしくは2＋もしくは3＋ヒト膵臓癌腫細胞、ＨＥＲ2 2＋転移性膵臓癌腫細胞、ＨＥＲ2 0＋／1＋、＋3＋ヒト肺癌腫細胞、ＨＥＲ2 2＋ヒト白色人種細気管支肺胞上皮（ｂｒｏｎｃｈｉｏａｖｅｏｌａｒ）癌細胞、ＨＥＲ2 0＋未分化肺癌腫、ヒト非小細胞肺癌細胞、ヒト咽頭癌腫細胞、ＨＥＲ2 2＋ヒト舌扁平上皮癌細胞、咽頭のＨＥＲ2 2＋扁平上皮癌、ＨＥＲ2 1＋もしくは2＋ヒト結腸直腸癌腫細胞、ＨＥＲ2 0＋、1＋もしくは3＋ヒト胃癌腫細胞、ＨＥＲ2 1＋ヒト乳管ＥＲ＋（エストロゲン受容体陽性）癌腫細胞、ＨＥＲ2 2＋／3＋ヒトＥＲ＋、ＨＥＲ2増幅乳癌腫細胞、ＨＥＲ2 0＋／1＋ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞、ＨＥＲ2 0＋ヒト乳管癌腫（基底Ｂ、間葉様トリプルネガティブ）細胞、ＨＥＲ2 2＋ＥＲ＋乳癌腫、ＨＥＲ2 0＋ヒト転移性乳癌腫細胞（ＥＲ−、ＨＥＲ2増幅、ルミナルＡ、ＴＮ）、ヒト子宮中胚葉性腫瘍（混合型グレードＩＩＩ）細胞、2＋ヒト類内膜癌細胞、ＨＥＲ2 1＋ヒト皮膚類表皮癌細胞、ＨＥＲ2 1＋肺転移性悪性メラノーマ細胞、ＨＥＲ2 1＋悪性メラノーマ細胞、ヒト子宮頸部類表皮癌ｖ細胞、ＨＥＲ2 1＋ヒト膀胱癌腫細胞、ＨＥＲ2 1＋ヒト子宮頸癌腫細胞、Ｈｅｒ2 1＋ヒト腎細胞癌腫細胞、またはＨＥＲ2 1＋、2＋もしくは3＋ヒト卵巣癌腫細胞であり、前記抗原結合性構築物がマイタンシン（ＤＭ1）にコンジュゲートしている、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1060]
前記腫瘍細胞が、ＨＥＲ2 2／3＋、遺伝子増幅卵巣癌細胞、ＨＥＲ2 0＋／1＋トリプルネガティブ乳癌細胞；ＥＲ＋、ＨＥＲ2 1＋乳癌細胞；トラスツズマブ耐性ＨＥＲ2 2＋乳癌細胞；ＥＲ＋、ＨＥＲ2＋乳癌細胞；またはＨＥＲ2 3＋乳癌細胞から選択される、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1061]
前記構築物が、ｖ5019、ｖ10000、ｖ7091、ｖ5020またはｖ6717から選択される、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1062]
投与が注射または注入によりなされ、任意選択で前記投与は静脈内である、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記対象に追加の薬剤、任意選択で化学療法剤、を投与することをさらに含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1064]
前記追加の薬剤が、ブレオマイシン、カルボプラチン、シスプラチン、ｎａｂ−パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エルロチニブ、フルオロウラシル、ゲムシタビン、メトトレキサート、ペメトレキセド、トポテカン、ビノレルビン、カペシタビン、ナベルビン、またはパクリタキセルのうちの1つまたは複数である、本発明1063の方法。
[本発明1065]
ｉ．前記腫瘍が非小細胞肺癌であり、前記追加の薬剤が、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチン、カペシタビン、ナベルビンもしくはペメトレキセドのうちの1つもしくは複数である；または
ｉｉ．前記腫瘍が頭頚部癌であり、前記追加の薬剤が、パクリタキセル、カルボプラチン、ドキソルビシンもしくはシスプラチンのうちの1つもしくは複数である；または
ｉｉｉ．前記腫瘍がエストロゲンおよび／もしくはプロゲステロン陽性乳癌であり、前記追加の薬剤が、ドキソルビシン、エピルビシン、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ドセタキセル、フルオロウラシル、シクロホスファミド、カルボプラチン、レトロゾール、ミフェプリストン、カペシタビン、ゲムシタビン、ビノレルビンもしくはタモキシフェンのうちの1つもしくは複数である；または
ｉｖ．前記腫瘍が膵臓腫瘍であり、前記追加の薬剤が、ｎａｂ−パクリタキセル、カペシタビン、ゲムシタビン、ナベルビンもしくはパクリタキセルである、
本発明1063の方法。
[本発明1066]
前記対象がヒトである、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1067]
ＨＥＲ2シグナル伝達を阻害する、減少させるまたは遮断することを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1068]
ＨＥＲ2発現腫瘍細胞を殺傷するまたは増殖を阻害することを含む、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記対象が、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20用量を投与される、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1070]
前記複数の用量の少なくとも1つの量が、少なくとも0．3、0．5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ｍｇ／ｋｇである、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記複数の用量のそれぞれの量が、少なくとも0．3、0．5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20ｍｇ／ｋｇである、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1072]
各用量が、少なくとも毎日、毎週、または毎月投与される、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1073]
各用量が、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20日毎に投与される、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1074]
処置が、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、もしくは31日間；少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20週間；または少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20カ月継続する、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1075]
少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20用量を受けた後の前記対象の平均腫瘍体積が、対応量のトラスツズマブを受けている対照対象の平均腫瘍体積より少ない、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1076]
前記対象の全生存期間が、対応量の非特異的対照抗体を受けている対照対象と比較して、もしくは処置を受けていない対照対象と比較して、有意に増加する；または腫瘍の増殖が、対応量の非特異的対照抗体を受けている対照対象と比較して、対応量のＨｅｒｃｅｐｔｉｎを受けている対照対象と比較して、もしくは処置を受けていない対照対象と比較して、有意に低減する、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1077]
有意性がログランク検定により測定される、本発明1076の方法。
[本発明1078]
ｐ値が、0．5、0．01、または0．001未満である、本発明1076の方法。
[本発明1079]
前記対象の全生存期間が、対応量のトラスツズマブを受けている対照対象と比較してより有意に増加する、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1080]
抗原結合性構築物ｐ値が0．001未満であり、トラスツズマブｐ値が0．001より大きい、本発明1079の方法。
[本発明1081]
対応量の非特異的対照抗体を受けている前記対照対象に対する増加の有意性のｐ値が、対応量の非特異的対照抗体を受けている前記対照対象と比較して対応量のトラスツズマブを受けている第二の対照の生存期間における増加のｐ値より低い、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1082]
抗原結合性構築物ｐ値が0．001未満であり、トラスツズマブｐ値が、0．001より大きい、本発明1081の方法。
[本発明1083]
前記抗原結合性構築物及び追加の薬剤の組み合わせを受けた後の前記対象の全生存期間が、対応量のトラスツズマブ単独を受けている対照対象と比較して有意に増加する、先行本発明のいずれかの方法。
[本発明1084]
前記対象の全生存期間が、より少ない量のトラスツズマブを受けている対照対象と比較して有意に増加する、先行本発明のいずれかの方法。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１Ａは、Ｆａｂ−Ｆａｂ形式の二重パラトピック抗体の構造を示す。図１Ｂ〜１Ｅは、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ形式の二重パラトピック抗体の生じ得るバージョンの構造を示す。図１Ｂでは、抗原結合性ドメイン１はｓｃＦｖであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン２はＦａｂであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｃでは、抗原結合性ドメイン１はＦａｂであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン２はｓｃＦｖであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｄでは、抗原結合性ドメイン２はＦａｂであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン１はｓｃＦｖであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｅでは、抗原結合性ドメイン２はｓｃＦｖであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン１はＦａｂであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｆでは、両方の抗原結合性ドメインはｓｃＦｖである。

【図2A】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の発現及び精製の特性決定を示す。図２Ａは、プロテインＡ精製抗体のＳＥＣクロマトグラフを示す。

【図2B】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の発現及び精製の特性決定を示す。図２Ｂは、ｖ５０１９の１０Ｌ発現及び精製の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

【図2C】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の発現及び精製の特性決定を示す。図２Ｃは、ｖ１００００の２５Ｌ発現及び精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。

【図3A】プロテインＡ及びＳＥＣによって精製された例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析の結果を示す。図３Ａは、ｖ５０１９についての結果を示し、上のパネルは精製の結果を示し、下のパネルは、ｙ軸に関してスケールを拡大した同じ結果を示す。得られたデータの概要を、ＵＰＬＣ−ＳＥＣの結果の下に提示する。

【図3B】プロテインＡ及びＳＥＣによって精製された例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析の結果を示す。図３Ｂは、ｖ１００００についての結果を示す。

【図4A】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のヘテロ二量体純度のＬＣＭＳ分析を示す。図４Ａは、ｖ５０１９のプールしたＳＥＣ画分のＬＣ−ＭＳ分析からの結果を示す。

【図4B】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のヘテロ二量体純度のＬＣＭＳ分析を示す。図４Ｂは、ｖ１００００のプールしたプロテインＡ画分のＬＣ−ＭＳ分析からの結果を示す。

【図5A】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の２５Ｌ規模調製物の分析を示す。図５Ａは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ ＦＦ精製後の例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピックのＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。

【図5B】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の２５Ｌ規模調製物の分析を示す。図５Ｂは、精製抗体のＬＣＭＳ分析を示す。

【図6A】ＦＡＣＳによって測定したときの、対照抗体と比較して異なるＨＥＲ２受容体密度を提示するＨＥＲ２＋全細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を比較する。図６Ａは、ＳＫＯＶ３細胞への結合を示す。

【図6B】ＦＡＣＳによって測定したときの、対照抗体と比較して異なるＨＥＲ２受容体密度を提示するＨＥＲ２＋全細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を比較する。図６Ｂは、ＪＩＭＴ１細胞への結合を示す。

【図6C】ＦＡＣＳによって測定したときの、対照抗体と比較して異なるＨＥＲ２受容体密度を提示するＨＥＲ２＋全細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を比較する。図６Ｃは、ＭＣＦ７細胞への結合を示す。

【図6D】ＦＡＣＳによって測定したときの、対照抗体と比較して異なるＨＥＲ２受容体密度を提示するＨＥＲ２＋全細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を比較する。図６Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への結合を示す。

【図6E】ＦＡＣＳによって測定したときの、対照抗体と比較して異なるＨＥＲ２受容体密度を提示するＨＥＲ２＋全細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を比較する。図６Ｅは、ＳＫＯＶ３細胞への結合を示す。

【図6F】ＦＡＣＳによって測定したときの、対照抗体と比較して異なるＨＥＲ２受容体密度を提示するＨＥＲ２＋全細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を比較する。図６Ｆは、ＭＣＦ７細胞への結合を示す。

【図6G】ＦＡＣＳによって測定したときの、対照抗体と比較して異なるＨＥＲ２受容体密度を提示するＨＥＲ２＋全細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を比較する。図６Ｇは、ＷＩ−３８細胞への結合を示す。

【図7A】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図７Ａは、ＳＫＯＶ３細胞における増殖阻害を示す。

【図7B】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図７Ｂは、ＢＴ−４７４細胞における増殖阻害を示す。

【図7C】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図７Ｃは、ＳＫＢＲ３細胞における増殖阻害を示す。

【図7D】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図７Ｄは、ＳＫＯＶ３細胞における増殖阻害を示す。

【図7E】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図７Ｅは、ＪＩＭＴ−１細胞における増殖阻害を示す。

【図8】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のパラトープに関するＳＰＲ結合データを示す。図８Ａは、固定化Ｈｅｒ２ ＥＣＤまたは二量体Ｈｅｒ２−Ｆｃへの結合についての一価抗Ｈｅｒ２抗体（ｖ１０４０；例示的な抗Ｈｅｒ２二重パラトピック抗体のＣＨ−Ｂ上の抗原結合性ドメインを表す）のＫ_Ｄ値（ｎＭ）を示す。図８Ｂは、固定化Ｈｅｒ２ ＥＣＤまたは二量体Ｈｅｒ２−Ｆｃへの結合についての一価抗Ｈｅｒ２抗体（ｖ４１８２；例示的な抗Ｈｅｒ２二重パラトピック抗体のＣＨ−Ａ上の抗原結合性ドメインを表す）のＫ_Ｄ値（ｎＭ）を示す。

【図9】ＨＥＲ２＋細胞に内部移行する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図９Ａは、ＢＴ−４７４細胞における内部移行を示し、図９ｂは、ＪＩＭＴ−１細胞における内部移行を示す。

【図10A】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の表面結合及び内部移行を示す。図１０Ａ（ｖ５０１９）は、ＢＴ−４７４細胞における結果を示す。

【図10B】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の表面結合及び内部移行を示す。図１０Ｂ（ｖ５０１９）は、ＪＩＭＴ１細胞おける結果を示す。

【図10C】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の表面結合及び内部移行を示す。図１０Ｃ（ｖ５０１９）は、ＳＫＯＶ３細胞おける結果を示す。

【図10D】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の表面結合及び内部移行を示す。図１０Ｄ（ｖ５０１９）は、ＭＣＦ７細胞おける結果を示す。

【図10E】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の表面結合及び内部移行を示す。図１０Ｅ（ｖ５０１９及びｖ１００００）は、ＳＫＯＶ３細胞おける結果を示す。

【図10F】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の表面結合及び内部移行を示す。図１０Ｆ（ｖ５０１９及びｖ１００００）は、ＪＩＭＴ１細胞おける結果を示す。

【図11】ＳＫＯＶ３細胞におけるＡＤＣＣを媒介する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図１１Ａでは、アッセイを、５：１のエフェクター対標的細胞比を使用して実行し；図１１Ｂでは、アッセイを、３：１のエフェクター対標的細胞比を使用して実行し；図１１Ｃでは、アッセイを、１：１のエフェクター対標的細胞比を使用して実行した。

【図12】組換えヒトＨＥＲ２に対する一価抗ＨＥＲ２（ｖ６３０及びｖ４１８２）及び例示的な二重パラトピック抗Ｈｅｒ２抗体（ｖ５０１９）の親和性及び結合反応速度の特性決定を示す。図１２Ａは、ｋａ（１／Ｍｓ）の測定値を示す。図１２Ｂは、ｋｄ（１／ｓ）の測定値を示す。図１２Ｃは、Ｋ_Ｄ（Ｍ）の測定値を示す

【図13】抗体捕捉レベルの範囲にわたる、組換えヒトＨＥＲ２に対する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の親和性及び結合特性を示す。図１３Ａは、例示的な二重パラトピック抗Ｈｅｒ２抗体（ｖ５０１９）について抗体捕捉レベルの範囲にわたって決定されたＨＥＲ２ ＥＣＤに対するｋｄ（１／ｓ）の測定値を示す。図１３Ｂは、一価抗Ｈｅｒ２抗体（ｖ４１８２）について抗体捕捉レベルの範囲にわたって決定されたＨＥＲ２ ＥＣＤに対するｋｄ（１／ｓ）の測定値を示す。図１３Ｃは、一価抗Ｈｅｒ２抗体（ｖ６３０）について抗体捕捉レベルの範囲にわたって決定されたＨＥＲ２ ＥＣＤに対するｋｄ（１／ｓ）の測定値を示す。

【図14】単一特異性抗ＥＣＤ４ ＨＥＲ２抗体（左側）及びＦａｂ−ｓｃＦｖ二重パラトピック抗ＥＣＤ２×ＥＣＤ４ ＨＥＲ２抗体（右側）の結合機構の比較を示す。単一特異性抗ＥＣＤ４ ＨＥＲ２抗体は、１つの抗体分子を２つのＨＥＲ２分子に結合させることができる；ところが、二重パラトピック抗ＥＣＤ２×ＥＣＤ４ ＨＥＲ２抗体は、１つの抗体を２つのＨＥＲ２分子に、ならびに、２つの抗体を１つのＨＥＲ２分子に、またその組み合わせで結合させることができ、ＨＥＲ２受容体架橋及び格子形成、続いて、矢印によって示す内部移行および／または増殖阻害などの下流生物学的効果をもたらす。ＩＥＣは、「免疫エフェクター細胞」を表す。ＨＥＲ２の４つの細胞外ドメインは、１、２、３、または４と付番され、１＝ＥＣＤ１、２＝ＥＣＤ２、３＝ＥＣＤ３、及び４＝ＥＣＤ４である。

【図15】ＢＴ−４７４細胞におけるＡＫＴリン酸化に与える例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の効果を示す。

【図16】心筋細胞生存力に与える例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の効果を示す。図１６Ａは、心筋細胞生存力に与えるｖ５０１９及び対応するＡＤＣであるｖ６３６３の効果を示す；図１６Ｂは、心筋細胞生存力に与えるｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００、ならびに対応するＡＤＣ ｖ６３６３、７１４８、１０５５３の効果を示し、図１６Ｃは、ドキソルビシンで事前処置した心筋細胞の生存力に与えるｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００、ならびに対応するＡＤＣ ｖ６３６３、７１４８、１０５５３の効果を示す。

【図17A】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲートの能力を示す。図１７Ａは、ＪＩＭＴ１細胞の増殖を阻害するＡＤＣｖ ６３６３の能力を示す。

【図17B】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲートの能力を示す。図１７Ｂは、ＳＫＯＶ３細胞の増殖を阻害するＡＤＣｖ ６３６３の能力を示す。

【図17C】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲートの能力を示す。図１７Ｃは、ＭＣＦ７細胞の増殖を阻害するＡＤＣｖ ６３６３の能力を示す。

【図17D】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲートの能力を示す。図１７Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の増殖を阻害するＡＤＣｖ ６３６３の能力を示す。

【図17E】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲートの能力を示す。図１７Ｅは、ＳＫＯＶ３細胞の増殖を阻害するＡＤＣｖ ６３６３、ｖ１０５５３、及びｖ１７４８の能力を示す。

【図17F】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲートの能力を示す。図１７Ｆは、ＪＩＭＴ−１細胞の増殖を阻害するＡＤＣｖ ６３６３、ｖ１０５５３、及びｖ１７４８の能力を示す。

【図17G】ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲートの能力を示す。図１７Ｇは、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞の増殖を阻害するＡＤＣｖ ６３６３、ｖ１０５５３、及びｖ１７４８の能力を示す。

【図18A】ヒト卵巣癌系異種移植モデル（ＳＫＯＶ３）における二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の効果を示す。図１８Ａは、平均腫瘍体積に与える抗体の効果を示す。

【図18B】ヒト卵巣癌系異種移植モデル（ＳＫＯＶ３）における二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の効果を示す。図１８Ｂは、動物の生存率（％）に与える抗体の効果を示す。

【図19A】ヒト卵巣癌系異種移植モデル（ＳＫＯＶ３）における二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果を示す。図１９Ａは、平均腫瘍体積に与える抗体の効果を示す。

【図19B】ヒト卵巣癌系異種移植モデル（ＳＫＯＶ３）における二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果を示す。図１９Ｂは、動物の生存率（％）に与える抗体の効果を示す。

【図20】ヒト乳房初代細胞異種移植モデル（ＨＢＣｘ−１３ｂ）における平均腫瘍体積に与える二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果を示す。

【図21】ヒト乳房初代細胞異種移植モデル（Ｔ２２６）における平均腫瘍体積に与える二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果を示す。

【図22】ヒト乳房初代細胞異種移植モデル（ＨＢＣｘ−５）における平均腫瘍体積に与える二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果を示す。

【図23】ヒト細胞系異種移植モデル（ＳＫＯＶ３）における抗ＨＥＲ２処置耐性腫瘍に与える二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果を示す。

【図24】ヒト初代細胞異種移植モデル（ＨＢＣｘ−１３ｂ）における抗ＨＥＲ２処置耐性腫瘍に与える二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果を示す。

【図25】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の熱安定性を示す。図２５Ａは、ｖ５０１９の熱安定性を示す。図２５Ｂは、ｖ１００００の熱安定性を示す。図２５Ｃは、ｖ７０９１の熱安定性を示す。

【図26】例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲートの熱安定性を示す。図２６Ａは、ｖ６３６３の熱安定性を示す。図２６Ｂは、ｖ１０５５３の熱安定性を示す。図２６Ｃは、ｖ７１４８の熱安定性を示す。

【図27A】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図２７Ｃにおいて示される凡例は、図２７Ａにも適用される。図２７Ａは、ＳＫＢＲ３細胞におけるこの能力を示す。

【図27B】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図２７Ｃにおいて示される凡例は、図２７Ｂにも適用される。図２７Ｂは、ＪＩＭＴ−１細胞におけるこの能力を示す。

【図27C】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図２７Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるこの能力を示す。

【図27D】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図２７Ｄは、ＷＩ−３８細胞におけるこの能力を示す。

【図28A】ＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力に与えるアフコシル化の効果を示す。図２８Ｂにおいて示す凡例は、図２８Ａにも適用される。図２８Ａは、ＳＫＯＶ３細胞において、ＡＤＣＣを媒介するｖ５０１９のアフコシル化版の能力をＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）の能力と比較する。

【図28B】ＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力に与えるアフコシル化の効果を示す。図２８Ｂは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において、ＡＤＣＣを媒介するｖ５０１９のアフコシル化版の能力をＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）の能力と比較する。

【図28C】ＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力に与えるアフコシル化の効果を示す。図２８Ｃは、ＺＲ−７５−１細胞において、ＡＤＣＣを媒介するｖ１００００及びｖ１００００のアフコシル化版の能力をＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）の能力に対して比較する。

【図29】増殖刺激リガンドの存在下または不在下でＢＴ−４７４細胞の増殖を阻害するｖ５０１９の能力を示す。

【図30】ヒト乳癌異種移植モデル（ＨＢＣｘ１３Ｂ）における腫瘍体積に与えるｖ５０１９のアフコシル化版（ｖ７１８７）の効果を示す。

【図31A】ＨＥＲ２＋腫瘍細胞に結合する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの能力を示す。図３１Ａは、ＳＫＯＶ３細胞において、ｖ６３６３の結合をＴ−ＤＭ１類似体であるｖ６２４６と比較する。

【図31B】ＨＥＲ２＋腫瘍細胞に結合する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの能力を示す。図３１Ｂは、ＪＩＭＴ−１細胞において、ｖ６３６３の結合をＴ−ＤＭ１類似体であるｖ６２４６と比較する。

【図31C】ＨＥＲ２＋腫瘍細胞に結合する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの能力を示す。図３１Ｃは、ＳＫＯＶ３細胞において、数種の例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの結合を対照と比較する。

【図31D】ＨＥＲ２＋腫瘍細胞に結合する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの能力を示す。図３１Ｄは、ＪＩＭＴ−１細胞において、数種の例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの結合を対照と比較する。

【図32】ＨＥＲ２ ３＋（ＥＲ−ＰＲ陰性）患者由来の異種移植モデル（ＨＢＣｘ１３ｂ）における、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの用量依存性腫瘍増殖阻害を示す。図３２Ａは、腫瘍体積に与えるｖ６３６３の効果を示し、図３２Ｂは、生存率（％）に与える効果を示す。

【図33】トラスツズマブ耐性ＰＤＸ ＨＢＣｘ−１３ｂ異種移植モデルにおいて、標準治療の組み合わせと比較した二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣｖ ６３６３の効果を示す。図３３Ａは、腫瘍体積に与える処置の効果を示し、図３３Ｂは、生存に与える処置の効果を示す。

【図34】ＨＥＲ２＋トラスツズマブ耐性乳癌細胞由来の腫瘍異種移植モデル（ＪＩＭＴ−１）における二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣの有効性を示す。

【図35】トラスツズマブ感受性卵巣癌細胞由来の腫瘍異種移植モデル（ＳＫＯＶ３）におけるｉｎ ｖｉｖｏでの例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の有効性を示す。図３５Ａは、腫瘍体積に与える処置の効果を示し、図３５Ｂは、生存に与える処置の効果を示す。

【図36】トラスツズマブ感受性卵巣癌細胞由来の腫瘍異種移植モデル（ＳＫＯＶ３）におけるｉｎ ｖｉｖｏでの例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の用量依存性有効性を示す。

【図37】ＨＥＲ２ならびにＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３を３＋、２＋、または１＋レベルで発現する細胞系の増殖を阻害する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの能力を示す。図３７Ａは、選択された細胞系の増殖を阻害するｖ１００００の能力を示す。図３７Ｂは、選択された細胞系の増殖を阻害するｖ１０５５３の能力を示す。

【図38】細胞系の一団において増殖を阻害するｖ１００００及びｖ１０５５３の能力の概要を示す。ハイフンで区切った値（例えば、１／２）は、文献において報告されたものと相違するｅｒｂｂ受容体レベルを示し；Ｅｒｂｂ ＩＨＣ値は、内部で、または文献から得た。値が報告されていない場合、その受容体量は不明である、および／または報告されていない。^＊ＩＨＣレベルは、ｅｒＢｂ２遺伝子発現データ（Ｃｒｏｗｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）に基づき推定されている。付番された参考文献は、以下に記載する。

【図39A】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介するｖ１００００の能力を示す。図３９Ａは、ＦａＤｕ細胞における結果を示す。

【図39B】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介するｖ１００００の能力を示す。図３９Ｂは、Ａ５４９細胞における結果を示す。

【図39C】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介するｖ１００００の能力を示す。図３９Ｃは、ＢｘＰＣ３細胞における結果を示す。

【図39D】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介するｖ１００００の能力を示す。図３９Ｄは、ＭｉａＰａｃａ２細胞における結果を示す。

【図40】ＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を示す。図４０Ａは、Ａ５４９細胞における結果を示す。図４０Ｂは、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞における結果を示す。図４０Ｃは、ＨＣＴ−１１６細胞における結果を示す。

【図41A】ＨＥＲ２＋細胞との結合に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４１Ａは、ＢＴ−４７４細胞への結合に与える形式の効果を示す。

【図41B】ＨＥＲ２＋細胞との結合に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４１Ｂは、ＪＩＭＴ−１細胞への結合に与える形式の効果を示す。

【図41C】ＨＥＲ２＋細胞との結合に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４１Ｃは、ＭＣＦ７細胞への結合に与える形式の効果を示す。

【図41D】ＨＥＲ２＋細胞との結合に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４１Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への結合に与える形式の効果を示す。

【図42】ＨＥＲ２＋細胞において、抗体の内部移行に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４２Ａは、ＢＴ−４７４細胞における内部移行に与える効果を示す。図４２Ｂは、ＪＩＭＴ−１細胞における内部移行に与える効果を示す。図４２Ｃは、ＭＣＦ７細胞における内部移行に与える効果を示す。

【図43A】ＨＥＲ２＋細胞において、ＡＤＣＣを媒介する能力に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４３Ａは、ＪＩＭＴ−１細胞における効果を示す。

【図43B】ＨＥＲ２＋細胞において、ＡＤＣＣを媒介する能力に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４３Ｂは、ＭＣＦ７細胞における効果を示す。

【図43C】ＨＥＲ２＋細胞において、ＡＤＣＣを媒介する能力に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４３Ｃは、ＨＥＲ２ ０／１＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞における効果を示す。

【図44】増殖刺激リガンドの存在下または不在下で、ＢＴ−４７４細胞においてＨＥＲ２＋腫瘍細胞増殖を阻害する抗体の能力に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。

【図45】ＳＫＢＲ３細胞の増殖を阻害する抗体の能力に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。

【図46A】ＨＥＲ２＋腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体の能力に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４６Ａは、ＳＫＯＶ３細胞における増殖阻害を示す。

【図46B】ＨＥＲ２＋腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体の能力に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４６Ｂは、ＪＩＭＴ−１細胞における増殖阻害を示す。

【図46C】ＨＥＲ２＋腫瘍細胞の増殖を阻害する抗体の能力に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を示す。図４６Ｃは、ＭＣＦ７細胞における増殖阻害を示す。

【図47】ＳＰＲによって測定した、異なる形式の抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の結合特性の比較を示す。図４７Ａは、ｖ６９０３及びｖ７０９１を用いて、異なる抗体捕捉レベルでのｋｄ（１／ｓ）のプロット及び線形回帰分析を示す。図４７Ｂは、ｖ６９０３及びｖ７０９１を用いて、異なる抗体捕捉レベルでのＫＤ（Ｍ）のプロット及び線形回帰分析を示す。

【0009】

図３８に見いだされる参考文献は以下の通りである：１．Ｌａｂｏｕｒｅｔ ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ １４：１２１−１３０；２．Ｇｈａｓｅｍｉ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｏｎｃｓｉｓ．２０１４．３１；３．Ｇａｂｏｒｉｔ ｅｔ ａｌ．２０１１ Ｊ Ｂｉｏ Ｃｈｅｍ，２８６：１１３３−１１３４５；４．Ｋｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；１２：４９２５−４９３２；５．Ｋｏｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｃａｎｃ Ｓｃｉ；１０１：４６８−４７３；６．Ｃｒｅｔｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ １３：１４３−１５５；７．Ｂｕｎｎ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；７：３２３９−３２５０；８．Ｌｅｗｉｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０：４５６−４６８；９．ＭｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ．２０１２，１１：５８２−５９３；１０．Ｃｏｌｄｒｅｎ ｅｔ ａｌ．２００６，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ：５２１−５２８；１１．Ｃａｖａｚｚｏｎｉ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ，１１：９１−１１５；１２．Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１４，Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５８／１５４１−７７８６．ＭＣＲ−１３−０３９６；１３．Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７３：７６４７−７６５３；１４．Ｋｕｗａｄａ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０９：２９１−３０１；１５．Ｆｕｊｉｍｏｔｏ−Ｏｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，５９：７９５−８０５；１６．Ｃｈａｖｅｚ−Ｂｌａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．２００４，ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ，４：５９；１７．Ｃａｍｐｉｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．２００４，Ｊ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．１９８：２５９−２６８；１８．Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１２１：２７５０−２７６７；１９．Ｃｏｌｌｉｎｓ ｅｔ ａｌ．２０１１，Ａｎｎａｌｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２３：１７８８−１７９５；２０．Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．２００５，Ｃａｎｃｅｒ，１０４：２７０１−２７０８；２１．Ｒｕｓｎａｃｋ ｅｔ ａｌ．２００７，Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆ，４０：５８０−５９４；２２．Ｍａ ｅｔ ａｌ．２０１３，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，８：ｅ７３２６１−ｅ７３２６１；２３．Ｍｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．２００９，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ，１０１：７８２−７９１；２４．Ｈａｙａｓｈｉ ＭＰ２８−１４ ｐｏｓｔｅｒ；２５．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｊ Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ Ｍｅｄ Ｓｃｉ．２５：３２６−８；２６．Ｍａｋｈｊａ ｅｔ ａｌ．２０１０．Ｊ Ｃｌｉｎｃ Ｏｎｃｏｌｏ ２８：１２１５−１２２３。

【図48】図４８Ａ〜Ｂは、ＨＥＲ２−低、非小細胞肺癌の異種移植モデルにおける二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の効果を示す。図４８Ａは、腫瘍体積に与える抗体の効果を示す。図４８Ｂは、動物の生存率（％）に与える抗体の効果を示す。

【図49】図４９Ａ〜Ｂは、ＨＥＲ２−低、頭頸部扁平上皮癌の異種移植モデルにおける二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の効果を示す。図４９Ａは、腫瘍体積に与える抗体の効果を示す。図４９Ｂは、動物の生存率（％）に与える抗体の効果を示す。

【図50】図５０Ａ〜Ｂは、ＨＥＲ２−低、ＥＲ＋乳癌の異種移植モデルにおける二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の効果を示す。図５０Ａは、腫瘍体積に与える抗体の効果を示す。図５０Ｂは、動物の生存率（％）に与える抗体の効果を示す。

【図51】図５１Ａ〜Ｂは、膵臓癌の異種移植モデルにおける腫瘍体積及び生存を示す。

【図52】胃癌の異種移植モデルにおける腫瘍体積を示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

ＨＥＲ２と結合する二重特異性抗原結合性構築物を使用する方法を本明細書に記載する。

【0011】

抗原結合性構築物
ＨＥＲ２と結合する抗原結合性構築物、例えば、抗体を本明細書に提供する。抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２ ＥＣＤ２抗原と結合する少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、第二の抗原、例えば、ＨＥＲ２ ＥＣＤ４抗原またはＨＥＲ２ ＥＣＤ２抗原と結合する第二の抗原結合性ポリペプチド構築物を含む。以下により詳述するように、抗原結合性ポリペプチド構築物は、タンパク質構築物、例えば、Ｆａｂ（断片抗原結合性）、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）及びｓｄａｂ（単一ドメイン抗体）であることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、スカフォールド、例えば、Ｆｃを含む。

【0012】

「抗原結合性構築物」という用語は、抗原に結合することができる任意の作用物質、例えば、ポリペプチドまたはポリペプチド複合体を指す。いくつかの態様では、抗原結合性構築物は、目的の抗原に特異的に結合するポリペプチドである。抗原結合性構築物は、単量体、二量体、多量体、タンパク質、ペプチド、またはタンパク質もしくはペプチド複合体；抗体、抗体断片、またはその抗原結合性断片；ｓｃＦｖ等であることができる。抗原結合性構築物は、単一特異性、二重特異性、または多重特異性であることができる。いくつかの態様では、抗原結合性構築物は、例えば、１つまたは複数のＦｃに連結した１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド構築物（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）を含むことができる。抗原結合性構築物のさらなる例を以下に記載し、実施例において提供する。

【0013】

いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、単一特異性である。単一特異性抗原結合性構築物は、１つの結合特異性を伴う抗原結合性構築物を指す。言い換えると、抗原結合性ポリペプチド構築物は、同じ抗原上の同じエピトープに結合する。単一特異性抗原結合性構築物の例には、トラスツズマブ及びペルツズマブが含まれる。

【0014】

二重特異性抗原結合性構築物は、固有の結合特異性をそれぞれ伴う２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を有する。例えば、第一の抗原結合性ポリペプチド構築物は、第一の抗原上のエピトープに結合し、第二の抗原結合性ポリペプチド構築物は、第二の抗原上のエピトープに結合する。「二重パラトピック」という用語は、本明細書で用いるとき、二重特異性抗体を指し、ここで第一の抗原結合性部分及び第二の抗原結合性部分は、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。

【0015】

抗原結合性構築物は、抗体またはその抗原結合性部分であることができる。本明細書で用いるとき、「抗体」または「免疫グロブリン」は、１つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチド、またはその断片を指し、これは分析物（例えば、抗原）と特異的に結合し、これを認識する。認識された免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパまたはラムダのいずれかとして分類される。抗体または免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ_２へとさらに分割され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。

【0016】

例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２対のポリペプチド鎖から構成されており、それぞれの対が、１本の「軽鎖」（約２５ｋＤ）及び１本の「重鎖」（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端ドメインが、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖及び重鎖ドメインを指す。ＩｇＧ１重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へとそれぞれＶＨ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される。軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へとＶＬ及びＣＬドメインから構成される。ＩｇＧ１重鎖は、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとの間にヒンジを含む。

【0017】

「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で用いるとき、配列中で超可変的である、および／または構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般に、天然の４本鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループから、および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含み、後者は、最高配列可変性を有する、および／または抗原認識に関与する。ＶＨのＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも称され、これらの用語は本明細書において、抗原結合性領域を形成する可変領域の部分に言及する際には互換的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１−９１７（１９８７）において記載されており、その定義は、相互に比較するときに、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲに言及するためのいずれの定義の適用も、本明細書において定義及び使用するとおりの用語の範囲内であることが意図される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変化するだろう。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列を考慮して、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。

【0018】

非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域からの残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの例では、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらには、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見いだされない残基を含んでよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに洗練するためになされる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み得、このドメイン内では、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのものに対応しており、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択で、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含むだろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。

【0019】

ヒト化ＨＥＲ２抗体は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３７号の表３に記載されている、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−１、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−２、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−３、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−４、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−５、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−６、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−７及びｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８またはトラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））；ヒト化５２０Ｃ９（ＷＯ９３／２１３１９）及び米国特許公開第２００６／００１８８９９号に記載されているヒト化２Ｃ４抗体を含む。

【0020】

抗原結合性ポリペプチド構築物
本明細書に記載の抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２ ＥＣＤ２抗原にそれぞれ結合する少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、例えば、ＨＥＲ２ ＥＣＤ２抗原またはＨＥＲ２ ＥＣＤ４抗原に結合する第二の抗原結合性ポリペプチド構築物を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチド構築物は、以下の実施例に開示される配列、例えば、ｖ５０１９、ｖ５０２０、ｖ７０９１、ｖ１００００、またはｖ６７１７のＶＨまたはＶＬまたはＣＤＲを含む。

【0021】

抗原結合性ポリペプチド構築物は、典型的には一価である、すなわち、１つのエピトープにのみ結合することができる。いくつかの実施形態では、しかしながら、抗原結合性ポリペプチド構築物は、二価（２つのエピトープに結合する）または多価であることができる。

【0022】

いずれの抗原結合性ポリペプチド構築物も、用途に応じて、例えば、Ｆａｂ、またはｓｃＦｖであることができる。いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を含む。抗原結合性構築物の形式は、Ｆａｂ−Ｆａｂ、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、またはＦａｂ−ｓｃＦｖもしくはｓｃＦｖ−Ｆａｂ（それぞれ、第一の抗原結合性ポリペプチド構築物−第二の抗原結合性ポリペプチド）であってよい。

【0023】

Ｆａｂ（抗原結合性断片とも称される）は、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を、それぞれ軽鎖及び重鎖上の可変ドメインＶＬ及びＶＨと共に含有する。可変ドメインは、抗原結合に関与する相補性決定ループ（ＣＤＲ、超可変領域とも称される）を含む。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での、数個の残基が付加していることによってＦａｂ断片とは異なり、これには、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含む。

【0024】

「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨとＶＬドメインとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合に所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。ＨＥＲ２抗体ｓｃＦｖ断片は、ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；及び米国特許第５，５８７，４５８号に記載されている。

【0025】

「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」形式は、個別の免疫グロブリンドメインである。ＳｄＡｂは、非常に安定しており、抗体のＦｃ鎖との融合パートナーとして発現が容易である（Ｈａｒｍｓｅｎ ＭＭ，Ｄｅ Ｈａａｒｄ ＨＪ（２００７）．“Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃａｍｅｌｉｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７７（１）：１３−２２）。

【0026】

いくつかの実施形態では、抗原結合性ポリペプチド構築物は、抗体、フィブロネクチン、アフィボディ、アンチカリン、システインノットタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ、アビマー、クニッツドメインまたはその変異体もしくは誘導体から誘導される。

【0027】

本明細書に記載の抗原結合性ポリペプチド構築物は、異なる形式に変換することができる。例えば、ＦａｂはｓｃＦｖに変換されることができ、またはｓｃＦｖはＦａｂに変換されることができる。抗原結合性ドメインの型間で変換する方法は、当該分野で公知である（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ（２０１２）Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ １１：１１６７−１４７６で記載されている、例えば、ｓｃＦｖをＦａｂ形式に変換するための方法を参照されたい。そこに記載の方法は、参照により組み込まれる）。

【0028】

本明細書に記載の抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２と特異的に結合する。「特異的に結合する」、「特異的結合」または「選択的結合」は、結合が、抗原に対して選択的であり、望ましくないまたは非特異的相互作用とは区別され得ることを意味する。特定の抗原決定基に結合する抗原結合性構築物の能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または当業者が熟知する他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３−３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７−２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。

【0029】

一実施形態では、抗原結合性部分の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えば、ＳＰＲにより測定されて、抗原結合性構築物の抗原への結合の約１０％未満である。

【0030】

ＨＥＲ２
本明細書に記載の抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２のＥＣＤ２に結合する抗原結合性ポリペプチド構築物を含む。

【0031】

「ＥｒｂＢ２」及び「ＨＥＲ２」という表現は、本明細書で互換可能に使用され、例えば、Ｓｅｍｂａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８２：６４９７−６５０１（１９８５）及びＹａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ３１９：２３０−２３４（１９８６）（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０３３６３）に記載のヒトＨＥＲ２タンパク質を指す。「ｅｒｂＢ２」及び「ｎｅｕ」という用語は、ヒトＥｒｂＢ２タンパク質をコードする遺伝子を指す。ｐ１８５またはｐ１８５ｎｅｕは、ｎｅｕ遺伝子のタンパク質生成物を指す。

【0032】

ＨＥＲ２は、ＨＥＲ受容体である。「ＨＥＲ受容体」は、受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ）ファミリーに属し、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３及びＨＥＲ４受容体を含む。ＨＥＲ受容体は、一般的に、ＨＥＲリガンドと結合し得る細胞外ドメイン；親油性膜貫通ドメイン；保存細胞内チロシンキナーゼドメイン；及びリン酸化され得るいくつかのチロシン残基を収容するカルボキシル末端シグナル伝達ドメインを含むだろう。「ＨＥＲリガンド」は、ＨＥＲ受容体に結合するおよび／またはこれを活性化するポリペプチドを意味する。

【0033】

ＨＥＲ２の細胞外（ｅｃｔｏ）ドメインは、４つのドメイン、ドメインＩ（ＥＣＤ１、約１〜１９５のアミノ酸残基）、ドメインＩＩ（ＥＣＤ２、約１９６〜３１９のアミノ酸残基）、ドメインＩＩＩ（ＥＣＤ３、約３２０〜４８８のアミノ酸残基）、及びドメインＩＶ（ＥＣＤ４、約４８９〜６３０のアミノ酸残基）（シグナルペプチドを伴わない残基ナンバリング）を含む。Ｇａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．１１：４９５−５０５（２００３）、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２１：７５６−７６０（２００３）、Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４）、Ｔｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．２０１２ Ａｐｒ；３８（２）：１３３−４２（２０１２）、またはＰｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９０：１７４６−１７５０（１９９３）を参照されたい。

【0034】

ＨＥＲ２の配列は以下の通りである；ＥＣＤ範囲は、ドメインＩ：１〜１６５；ドメインＩＩ：１６６〜３２２；ドメインＩＩＩ：３２３〜４８８；ドメインＩＶ：４８９〜６０７。

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【0035】

「エピトープ２Ｃ４」は、抗体２Ｃ４が結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインの領域である。エピトープ２Ｃ４は、ＨＥＲ２の細胞外ドメインのドメインＩＩからの残基を含む。２Ｃ４及びペルツズマブは、ＨＥＲ２の細胞外ドメインにドメインＩ、ＩＩ及びＩＩＩの接続部で結合する。Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４）。２Ｃ４エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）において記載されているアッセイなどの通常のクロスブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、当該分野で公知の方法を使用して抗体がＨＥＲ２の２Ｃ４エピトープに結合するかどうかを評価するためにエピトープマッピングを行うことができ、かつ／またはＨＥＲ２のどのドメイン（複数可）が抗体と結合するかを調べるために抗体−ＨＥＲ２構造を研究することができる（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ５：３１７−３２８（２００４））。

【0036】

「エピトープ４Ｄ５」は、抗体４Ｄ５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０４６３）及びトラスツズマブが結合するＨＥＲ２の細胞外ドメインにおける領域である。このエピトープは、ＨＥＲ２の膜貫通ドメインに近接し、ＨＥＲ２のドメインＩＶ内である。４Ｄ５エピトープに結合する抗体についてスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）において記載されているアッセイなどの通常のクロスブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、抗体がＨＥＲ２の４Ｄ５エピトープ（例えば、両端を含む約残基５２９から約残基６２５の領域における任意の１つまたは複数の残基、米国特許公開第２００６／００１８８９９号の図１を参照されたい）に結合するかどうかを評価するためにエピトープマッピングを行うことができる。

【0037】

例示的な抗ＨＥＲ２抗原結合性構築物
例示的な抗ＨＥＲ２抗体（または抗原結合性構築物）及び対照を本明細書に提供する。例示的な二重パラトピック形式の代表を図１に示す。図１に示す形式のすべてにおいて、ヘテロ二量体Ｆｃを、一方の鎖（鎖Ａ）を黒色で示し、他方（鎖Ｂ）を灰色で示し、一方の抗原結合性ドメイン（１）は斜線をかけて示し、他方の抗原結合性ドメイン（２）を白色で示して、図示する。

【0038】

図１Ａは、Ｆａｂ−Ｆａｂ形式の二重パラトピック抗体の構造を示す。図１Ｂ〜１Ｅは、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ形式の二重パラトピック抗体の生じ得るバージョンの構造を示す。図１Ｂでは、抗原結合性ドメイン１はｓｃＦｖであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン２はＦａｂであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｃでは、抗原結合性ドメイン１はＦａｂであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン２はｓｃＦｖであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｄでは、抗原結合性ドメイン２はＦａｂであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン１はｓｃＦｖであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｅでは、抗原結合性ドメイン２はｓｃＦｖであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン１はＦａｂであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｆでは、両方の抗原結合性ドメインはｓｃＦｖである。

【0039】

以下の変異体の配列を実施例の後にある配列の表において提供する。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ法の組み合わせを使用して同定した。領域は、同定のために使用される方法に基づいて多少変動してよい。

【0040】

例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体
例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体を表１に示す。
（表１）例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体

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注釈
・ＥＵ抗体のナンバリングを参照するＫａｂａｔでのＥＵインデックスに従うＣＨ３ナンバリング（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５）；
・Ｋａｂａｔに従うＦａｂまたは可変ドメインナンバリング（Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ−ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎ°９１−３２４２，ｐ６４７（１９９１））
・「エピトープを含有するドメイン」＝抗原結合性部分が結合するＨＥＲ２のドメイン；
・「抗体名」＝抗原結合性部分が由来する抗体であり、存在するときには野生型と比較して置換を含む；
・「Ｆａｂ置換」＝正確な軽鎖対合を促進するＦａｂにおける置換；
・「ＣＨ３配列置換」＝ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する、ＣＨ３ドメインにおける置換

【0041】

例示的な抗ＨＥＲ２一価対照抗体
ｖ１０４０：一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上のトラスツズマブから誘導されたＦａｂであり、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域は、突然変異Ｃ２２６Ｓを有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。

【0042】

ｖ６３０−一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上のトラスツズマブから誘導されたｓｃＦｖであり、Ｆｃ領域は、突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり；ヒンジ領域は、両方の鎖に突然変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵナンバリング）を有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。

【0043】

ｖ４１８２：一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上のペルツズマブから誘導されたＦａｂであり、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域は、突然変異Ｃ２２６Ｓを有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン２に結合する。

【0044】

例示的な抗ＨＥＲ２単一特異性二価抗体対照（フルサイズ抗体、ＦＳＡ）
ｖ５０６は、対照として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において自家産生された野生型抗ＨＥＲ２である。両方のＨＥＲ２結合性ドメインは、Ｆａｂ形式でトラスツズマブから誘導され、Ｆｃは、野生型ホモ二量体であり；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。この抗体は、トラスツズマブ類似体とも称される。

【0045】

ｖ７９２は、ＩｇＧ１ヒンジを伴う野生型トラスツズマブであり、ここで両方のＨＥＲ２結合性ドメインは、Ｆａｂ形式でトラスツズマブから誘導され、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。この抗体は、トラスツズマブ類似体とも称される。

【0046】

ｖ４１８４は、二価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここで両方のＨＥＲ２結合性ドメインは、Ｆａｂ形式でペルツズマブから誘導され、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体である。抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン２に結合する。この抗体は、ペルツズマブ類似体とも称される。

【0047】

例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
以下に、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲート（抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ）を示す。変異体５０１９、７０９１、１００００及び５０６のＡＤＣは以下のように同定される：
ｖ６３６３（ＤＭ１にコンジュゲートしたｖ５０１９）
ｖ７１４８（ＤＭ１にコンジュゲートしたｖ７０９１）
ｖ１０５５３（ＤＭ１にコンジュゲートしたｖ１００００）
ｖ６２４６（ＤＭ１にコンジュゲートしたｖ５０６、Ｔ−ＤＭ１、トラスツズマブ−エムタンシンに対する類似体）
ｖ６２４９（ＤＭ１にコンジュゲートしたヒトＩｇＧ）

【0048】

抗原結合性構築物のＦｃ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、Ｆｃ、例えば、二量体Ｆｃを含む。二量体Ｆｃは、ホモ二量体またはヘテロ二量体であることができる。

【0049】

「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書で、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。本明細書で別段の指定がない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステムに従い、これはＥＵインデックスとも呼ばれ、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１において記載されているとおりである。二量体Ｆｃの「Ｆｃポリペプチド」は、本明細書で用いるとき、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドの一方、すなわち、安定した自己会合が可能である、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、二量体ＩｇＧ ＦｃのＦｃポリペプチドは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメイン配列を含む。

【0050】

Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはＣＨ３及びＣＨ２ドメインのいずれかを含む。ＣＨ３ドメインは、２つのＣＨ３配列を含み、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドのそれぞれから１つである。ＣＨ２ドメインは、２つのＣＨ２配列を含み、二量体Ｆｃの２つのＦｃポリペプチドのそれぞれから１つである。

【0051】

いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つのまたは２つのＣＨ３配列を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、１つまたは複数のリンカーを用いてまたは用いずに、第一の抗原結合性構築物および／または第二の抗原結合性構築物にカップリングする。いくつかの態様では、Ｆｃは、ヒトＦｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧまたはＩｇＧ１ Ｆｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは、ヘテロ二量体Ｆｃである。いくつかの態様では、Ｆｃは、少なくとも１つのまたは２つのＣＨ２配列を含む。

【0052】

いくつかの態様では、Ｆｃは、１つまたは複数の修飾をＣＨ３配列の少なくとも１つにおいて含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、１つまたは複数の修飾をＣＨ２配列の少なくとも１つにおいて含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、単一のポリペプチドである。いくつかの態様では、Ｆｃは、複数のペプチド、例えば、２つのポリペプチドである。

【0053】

いくつかの態様では、Ｆｃは、２０１１年１１月４日に出願された特許出願ＰＣＴ／ＣＡ２０１１／００１２３８、または２０１２年１１月２日に出願されたＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０７８０に記載のＦｃであり、このそれぞれの全開示はその全体がすべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。

【0054】

修飾ＣＨ３ドメイン
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、非対称に修飾されている修飾ＣＨ３ドメインを含むヘテロ二量体Ｆｃを含む。ヘテロ二量体Ｆｃは、２つの重鎖定常ドメインポリペプチド：第一のＦｃポリペプチド及び第二のＦｃポリペプチドを含むことができ、これは、Ｆｃが１つの第一のＦｃポリペプチド及び１つの第二のＦｃポリペプチドを含む限り、互換可能に使用することができる。一般に、第一のＦｃポリペプチドは第一のＣＨ３配列を含み、第二のＦｃポリペプチドは第二のＣＨ３配列を含む。

【0055】

非対称様式で導入された１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む２つのＣＨ３配列は、通常、２つのＣＨ３配列が二量体化するとき、ホモ二量体ではなく、ヘテロ二量体Ｆｃをもたらす。本明細書で用いるとき、「非対称アミノ酸修飾」は、第一のＣＨ３配列上の特定の位置のアミノ酸が、同じ位置で第二のＣＨ３配列上のアミノ酸と異なる任意の修飾を指し、第一及び第二のＣＨ３配列は、優先的に対合して、ホモ二量体ではなくヘテロ二量体を形成する。このヘテロ二量体化は、各配列上の同じそれぞれのアミノ酸位置での２つのアミノ酸のうちの一方のみの修飾；または第一及び第二のＣＨ３配列のそれぞれの上の同じそれぞれの位置での各配列上の両方のアミノ酸の修飾の結果であることができる。ヘテロ二量体Ｆｃの第一及び第二のＣＨ３配列は、１つ以上の非対称アミノ酸修飾を含むことができる。

【0056】

表Ａは、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に対応する、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ配列のアミノ酸配列を提供する。ＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸３４１〜４４７を含む。

【0057】

典型的には、Ｆｃは、二量体化することができる２つの連続した重鎖配列（Ａ及びＢ）を含むことができる。いくつかの態様では、Ｆｃの一方または両方の配列は、１つまたは複数の突然変異または修飾を以下の位置で含む：ＥＵナンバリングを使用して、Ｌ３５１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｔ３６６、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｔ３５０、Ｓ４００、および／またはＮ３９０。いくつかの態様では、Ｆｃは、表Ｘに示す突然変異配列を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体１Ａ−Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体２Ａ−Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体３Ａ−Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体４Ａ−Ｂの突然変異を含む。いくつかの態様では、Ｆｃは、変異体５Ａ−Ｂの突然変異を含む。
（表Ａ）ＩｇＧ１ Ｆｃ配列

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【0058】

第一及び第二のＣＨ３配列は、完全長ヒトＩｇＧ１重鎖のアミノ酸２３１〜４４７に関して、本明細書に記載のようなアミノ酸突然変異を含むことができる。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、第一のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｆ４０５及びＹ４０７で有し、第二のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｔ３９４で有する、修飾ＣＨ３ドメインを含む。一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、第一のＣＨ３配列がＬ３５１Ｙ、Ｆ４０５Ａ、及びＹ４０７Ｖから選択された１つまたは複数のアミノ酸修飾を有し、第二のＣＨ３配列がＴ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｉ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、及びＴ３９４Ｗから選択された１つまたは複数のアミノ酸修飾を有する、修飾ＣＨ３ドメインを含む。

【0059】

一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、第一のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７で有し、第二のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４で有し、第一または第二のＣＨ３配列の一方がアミノ酸修飾を位置Ｑ３４７でさらに含み、他方のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｋ３６０でさらに含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、第一のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７で有し、第二のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４で有し、第一または第二のＣＨ３配列の一方がアミノ酸修飾を位置Ｑ３４７でさらに含み、他方のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｋ３６０でさらに含み、前記ＣＨ３配列の一方または両方がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。

【0060】

一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、第一のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７で有し、第二のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４で有し、前記第一及び第二のＣＨ３配列の一方がＤ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾をさらに含み、他方のＣＨ３配列がＴ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうちの１つまたは複数を含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、第一のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７で有し、第二のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４で有し、前記第一及び第二のＣＨ３配列の一方がＤ３９９ＲまたはＤ３９９Ｋのアミノ酸修飾をさらに含み、他方のＣＨ３配列がＴ４１１Ｅ、Ｔ４１１Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ３９２Ｅ及びＫ３９２Ｄのうちの１つまたは複数を含み、前記ＣＨ３配列の一方または両方がアミノ酸修飾Ｔ３５０Ｖをさらに含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。

【0061】

一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、第一のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｌ３５１、Ｆ４０５及びＹ４０７で有し、第二のＣＨ３配列がアミノ酸修飾を位置Ｔ３６６、Ｋ３９２、及びＴ３９４で有し、ここで前記ＣＨ３配列の一方または両方がＴ３５０Ｖのアミノ酸修飾をさらに含む、修飾ＣＨ３ドメインを含む。

【0062】

一実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、以下のアミノ酸修飾を含む修飾ＣＨ３ドメインを含み、ここで「Ａ」は第一のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表し、「Ｂ」は第二のＣＨ３配列に対するアミノ酸修飾を表す。

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【0063】

１つまたは複数の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体ＣＨ３ドメインが野生型ホモ二量体ＣＨ３ドメインに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進することができる。一実施形態では、１つまたは複数の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが野生型ホモ二量体Ｆｃドメインに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する。一実施形態では、１つまたは複数の非対称アミノ酸修飾は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインが示差走査熱量測定試験において融解温度（Ｔｍ）を介して観察される安定性を有し、ここでその融解温度が、対応する対称な野生型ホモ二量体Ｆｃドメインについて観察された融解温度の４℃以内である、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を促進する。いくつかの態様では、Ｆｃは、１つまたは複数の修飾をＣ_Ｈ３配列の少なくとも１つに含み、これは野生型ホモ二量体Ｆｃに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する。

【0064】

一実施形態では、ＣＨ３ドメインの安定性は、例えば示差走査熱量測定（ＤＳＣ）により、ＣＨ３ドメインの融解温度を測定することにより評価することができる。ゆえに、さらなる実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約６８℃またはより高い融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７０℃またはより高い融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７２℃またはより高い融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７３℃またはより高い融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７５℃またはより高い融解温度を有する。別の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、約７８℃またはより高い融解温度を有する。いくつかの態様では、二量体化ＣＨ３配列は、約６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７７．５、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または８５℃またはより高い融解温度（Ｔｍ）を有する。

【0065】

いくつかの実施形態では、修飾ＣＨ３配列を含むヘテロ二量体Ｆｃは、発現産物において、ホモ二量体Ｆｃと比較して、少なくとも約７５％の純度で形成されることができる。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８０％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約８５％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９０％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９５％超の純度で形成される。別の実施形態では、ヘテロ二量体Ｆｃは、約９７％超の純度で形成される。いくつかの態様では、Ｆｃは、発現されるときに、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％超の純度で形成されるヘテロ二量体である。いくつかの態様では、Ｆｃは、単一の細胞を介して発現されるときに、約７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％超の純度で形成されるヘテロ二量体である。

【0066】

ヘテロ二量体Ｆｃ形成を促進するために単量体Ｆｃポリペプチドを修飾するための追加の方法は、国際特許公開番号ＷＯ９６／０２７０１１（ｋｎｏｂｓ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ）、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ ｅｔ ａｌ．（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８５，１９６３７−４６，ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｄａｖｉｓ，ＪＨ．ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ；２３（４）：１９５−２０２，ｓｔｒａｎｄ ｅｘｃｈａｎｇｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｄｏｍａｉｎ（ＳＥＥＤ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、及びＬａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ［Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ１ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｆａｂ−ａｒｍ ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｌａｂｒｉｊｎ ＡＦ，Ｍｅｅｓｔｅｒｓ ＪＩ，ｄｅ Ｇｏｅｉｊ ＢＥ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｅｍｅｒ ＥＴ，Ｎｅｉｊｓｓｅｎ Ｊ，ｖａｎ Ｋａｍｐｅｎ ＭＤ，Ｓｔｒｕｍａｎｅ Ｋ，Ｖｅｒｐｌｏｅｇｅｎ Ｓ，Ｋｕｎｄｕ Ａ，Ｇｒａｍｅｒ ＭＪ，ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ＰＨ，ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ ＪＧ，Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ Ｊ，Ｐａｒｒｅｎ ＰＷ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ｍａｒ ２６；１１０（１３）：５１４５−５０において記載されている。

【0067】

ＣＨ２ドメイン
いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物のＦｃは、ＣＨ２ドメインを含む。ＦｃのＣＨ２ドメインの一例は、表Ａに示す配列のアミノ酸２３１〜３４０である。いくつかのエフェクター機能が、抗体のＦｃに結合するＦｃ受容体（ＦｃＲ）により媒介される。

【0068】

「Ｆｃ受容体」及び「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために使用される。例えば、ＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲであることができる。一般に、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体と結合するもの（ガンマ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異型及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性受容体」）を含み、これらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。他のアイソタイプの免疫グロブリンも、ある特定のＦｃＲと結合することができる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ：ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｄｉｓｅａｓｅ，（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，ＮＹ）（４ｔｈ ｅｄ．，１９９９）を参照されたい）。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン系抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）において概説されている）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；及びｄｅ Ｈａａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において概説されている。将来同定されるものを含む他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語は、胎児への母親ＩｇＧの移行を担う新生児受容体であるＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）；及びＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。

【0069】

ＣＨ２ドメインにおける修飾は、ＦｃへのＦｃＲの結合に影響を及ぼし得る。Ｆｃ領域におけるいくつかのアミノ酸修飾が、異なるＦｃガンマ受容体に対するＦｃの親和性を選択的に変更することについて当該分野で公知である。いくつかの態様では、Ｆｃは、Ｆｃ−ガンマ受容体の選択的結合を促進するために１つまたは複数の修飾を含む。

【0070】

Ｆｃに対するＦｃＲの結合を変更する例示的な突然変異を以下に挙げる：

【0071】

Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ／Ｋ３２６Ａ（Ｌｕ Ｙ，Ｖｅｒｎｅｓ ＪＭ，Ｃｈｉａｎｇ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１１ Ｆｅｂ ２８；３６５（１−２）：１３２−４１）；

【0072】

Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ、Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｌ２３５Ｖ／Ｐ３９６Ｌ（Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ ＪＢ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ，Ｔｕａｉｌｌｏｎ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７ Ｓｅｐ １５；６７（１８）：８８８２−９０；Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ ＪＬ，Ｇｏｒｌａｔｏｖ Ｓ，Ｚｈａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１ Ｎｏｖ ３０；１３（６）：Ｒ１２３）；

【0073】

Ｆ２４３Ｌ（Ｓｔｅｗａｒｔ Ｒ，Ｔｈｏｍ Ｇ，Ｌｅｖｅｎｓ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１１ Ｓｅｐ；２４（９）：６７１−８．）、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ（Ｓｈｉｅｌｄｓ ＲＬ，Ｎａｍｅｎｕｋ ＡＫ，Ｈｏｎｇ Ｋ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００１ Ｍａｒ ２；２７６（９）：６５９１−６０４）；

【0074】

Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｌａｚａｒ ＧＡ，Ｄａｎｇ Ｗ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６ Ｍａｒ １４；１０３（１１）：４００５−１０）；

【0075】

Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２６７Ｅ、Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（Ｃｈｕ ＳＹ，Ｖｏｓｔｉａｒ Ｉ，Ｋａｒｋｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８ Ｓｅｐ；４５（１５）：３９２６−３３）；

【0076】

Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｓ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２９８Ａ／Ｋ３２６Ａ／Ａ３２７Ｈ、Ｇ２３７Ｆ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｋ３２６Ｅ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ／Ｓ２９８Ａ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２７０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｄ、Ｌ２３４Ｆ／Ｓ２６７Ｅ／Ｎ３２５Ｌ、Ｇ２３７Ｆ／Ｖ２６６Ｌ／Ｓ２６７Ｄならびに参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１１／１２０１３４及びＷＯ２０１１／１２０１３５に挙げられる他の突然変異。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｒ．Ｓｔｒｏｈｌ ａｎｄ ＬｉｌａＭ．Ｓｔｒｏｈｌ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ｓｅｒｉｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｎｏ １１，ＩＳＢＮ １ ９０７５６８ ３７ ９，Ｏｃｔ ２０１２）は、２８３頁にて突然変異を挙げている。

【0077】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、抗原と結合する抗原結合性ポリペプチド構築物；及び二量体Ｆｃであって、同じ二量体Ｆｃを含まない抗原結合性構築物と比較して安定性及び製造の容易性などの優れた生物物理学的特性を有する前記二量体Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、１つまたは複数の非対称アミノ酸修飾を含む。例示的な非対称突然変異は、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＣＡ２０１４／０５０５０７に記載されている。

【0078】

エフェクター機能を改善するための追加の修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、エフェクター機能を媒介するその能力を改善するための修飾を含む。かかる修飾は、当該分野で公知であり、アフコシル化、または活性化受容体、主にＡＤＣＣのためのＦＣＧＲ３ａに向けた、及びＣＤＣのためのＣ１ｑに向けたＦｃの親和性の操作が含まれる。以下の表Ｂは、エフェクター機能操作に関して文献において報告された様々な設計をまとめる。

【0079】

アミノ酸配列を変更することなく、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ ２９７、ＥＵナンバリング）上にフコースをほとんどまたは全く有さない抗原結合性構築物を産生する方法は、当該分野で周知である。ＧｌｙｍａＸ（登録商標）技術（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ ＡＧ）は、フコース生合成の細胞経路を偏向させる酵素のための遺伝子を、抗原結合性構築物産生のために使用される細胞内に導入することに基づく。これは、抗原結合性構築物産生細胞によるＮ連結抗体炭水化物部分への糖「フコース」の付加を防ぐ（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｄｅｃ；２０（１２）：１６０７−１８。フコシル化のレベルが低い抗原結合性構築物を得るための別の手法は、米国特許第８，４０９，５７２号において見いだすことができ、これは、抗原結合性構築物上でより低いレベルのフコシル化をもたらすそれらの能力について、抗原結合性構築物産生のための細胞系を選択することを教示している。抗原結合性構築物は、完全にアフコシル化（検出可能なフコースを含有しないことを意味する）されることができるか、または部分的にアフコシル化されることができる、つまり、単離された抗体が哺乳類発現系によって産生された同様の抗体で通常検出されるフコースの量の９５％未満、８５％未満、７５％未満、６５％未満、５５％未満、４５％未満、３５％未満、２５％未満、１５％未満、または５％未満を含有することを意味する。

【0080】

ゆえに、一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、エフェクター機能の改善をもたらす表Ｂに記載するような１つまたは複数のアミノ酸修飾を含む二量体Ｆｃを含むことができる。別の実施形態では、抗原結合性構築物は、エフェクター機能を改善するためにアフコシル化することができる。
（表Ｂ）ＣＨ２ドメイン及びエフェクター機能操作

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【0081】

ＦｃγＲおよび／または補体結合および／またはエフェクター機能を低下させるＦｃ修飾が、当該分野で公知である。最近の刊行物は、エフェクター活性が低下したまたはサイレンシングされた抗体を操作するために使用されている方略を記載している（Ｓｔｒｏｈｌ，ＷＲ（２００９），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０：６８５−６９１、及びＳｔｒｏｈｌ，ＷＲ ａｎｄ Ｓｔｒｏｈｌ ＬＭ，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ”Ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ：Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０１２），ｐｐ２２５−２４９を参照されたい）。これらの方略には、グリコシル化の修飾を通したエフェクター機能の低下、ＩｇＧ２／ＩｇＧ４スカフォールドの使用、またはＦｃのヒンジもしくはＣＨ２領域での突然変異の導入が含まれる。例えば、米国特許公開第２０１１／０２１２０８７号（Ｓｔｒｏｈｌ）、国際特許公開番号ＷＯ２００６／１０５３３８（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２２５０５８号（Ｘｅｎｃｏｒ）、米国特許公開第２０１２／０２５１５３１号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、及びＳｔｒｏｐ ｅｔ ａｌ（（２０１２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２０：２０４−２１９）は、Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体結合を低下させるための具体的な修飾を記載している。

【0082】

Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体結合を低下させるための公知のアミノ酸修飾の具体的で非限定的な例には、以下の表に同定されているものが含まれる：
（表Ｃ）Ｆｃに対するＦｃγＲまたは補体結合を低下させるための修飾

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【0083】

一実施形態では、Ｆｃは、上記の表において同定される少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、またはＤ２６５のうちの少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、Ｌ２３４、Ｌ２３５、及びＤ２６５でアミノ酸修飾を含む。別の実施形態では、Ｆｃは、アミノ酸修飾Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ｓを含む。

【0084】

リンカー及びリンカーポリペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を含む。これらの実施形態では、抗原結合性ポリペプチド構築物はそれぞれ、リンカーポリペプチドに機能的に連結し、ここでリンカーポリペプチドは、相互に複合体または境界面を形成することができる。いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドは、相互に共有結合を形成することができる。リンカーポリペプチドを伴う第一及び第二の抗原結合性ポリペプチド構築物を含む抗原結合性構築物の空間的コンフォメーションは、たとえ２つの抗原結合性ポリペプチド構築物を伴う抗原結合性構築物の文脈においても、パパイン消化により生成されるＦ（ａｂ’）２断片のパラトープの相対的空間的コンフォメーションに類似している。

【0085】

いくつかの実施形態では、リンカーポリペプチドがＦ（ａｂ’）断片のパラトープの相対的な空間的コンフォメーションを維持し、ＩｇＧのコアヒンジにおいてジスルフィド結合に相当する共有結合を形成することができるように、リンカーポリペプチドは選択される。好適なリンカーポリペプチドは、ＩｇＧヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４からのものを含む。これらの例示的なリンカーの修飾したものも使用することができる。例えば、ＩｇＧ４ヒンジの安定性を改善するための修飾は、当該分野で公知である（例えば、Ｌａｂｒｉｊｎ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７，７６７−７７１を参照されたい）。

【0086】

一実施形態では、リンカーポリペプチドは、本明細書に記載のようなスカフォールド、例えばＦｃに機能的に連結する。いくつかの態様では、Ｆｃは、１つまたは複数の抗原結合性ポリペプチド構築物に、１つまたは複数のリンカーでカップリングする。いくつかの態様では、Ｆｃは、リンカーにより各抗原結合性ポリペプチドの重鎖にカップリングする。

【0087】

他の実施形態では、リンカーポリペプチドは、Ｆｃ以外のスカフォールドに機能的に連結する。多くの代替タンパク質または分子ドメインが当該分野で公知であり、２つの異なる抗原結合性ポリペプチドの選択的な対を形成するために使用することができる。一例は、Ｆｏｓ及びＪｕｎなどのロイシンジッパードメインであり、これらは１つに選択的に対合する［Ｓ Ａ Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｍ Ｓ Ｃｏｌｅ，ａｎｄ Ｊ Ｙ Ｔｓｏ．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｙ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｌｅｕｃｉｎｅ ｚｉｐｐｅｒｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２ １４８：１５４７−５３；Ｂｅｒｎｄ Ｊ．Ｗｒａｎｉｋ，Ｅｒｉｎ Ｌ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｇａｂｒｉｅｌｅ Ｓｃｈａｅｆｅｒ，Ｊａｎｅｔ Ｋ．Ｊａｃｋｍａｎ，Ａｎｄｒｅｗ Ｃ．Ｖｅｎｄｅｌ，ａｎｄ Ｄａｎ Ｅａｔｏｎ．ＬＵＺ−Ｙ，ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ ＩｇＧ−ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１２ ２８７：４３３３１−４３３３９］。あるいは、他の選択的に対合する分子対、例えば、バルナーゼバルスター対［Ｄｅｙｅｖ，Ｓ．Ｍ．，Ｗａｉｂｅｌ，Ｒ．，Ｌｅｂｅｄｅｎｋｏ，Ｅ．Ｎ．，Ｓｃｈｕｂｉｇｅｒ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００３）．Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｂａｒｎａｓｅ^＊ｂａｒｓｔａｒ ｍｏｄｕｌｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２１，１４８６−１４９２］、ＤＮＡ鎖対［Ｚａｈｉｄａ Ｎ．Ｃｈａｕｄｒｉ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂａｒｔｌｅｔ−Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｏｒｇｅ Ｐａｎａｙｏｔｏｕ，Ｔｈｏｍａｓ Ｋｌｏｎｉｓｃｈ，Ｉｖａｎ Ｍ．Ｒｏｉｔｔ，Ｔｏｒｂｅｎ Ｌｕｎｄ，Ｐｅｔｅｒ Ｊ．Ｄｅｌｖｅｓ，Ｄｕａｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｒｉｄｇｅ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ４５０，Ｉｓｓｕｅｓ １−２，３０ Ａｐｒｉｌ １９９９，Ｐａｇｅｓ ２３−２６］、スプリット蛍光タンパク質対［Ｕｌｒｉｃｈ Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｈａａｓ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｔｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｕｓｅ，ＷＯ２０１１１３５０４０Ａ１］も使用することができる。

【0088】

親和性
いくつかの実施形態では、親和性は、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）および／またはＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）により決定される。いくつかの実施形態では、親和性は、下記のようにＳＰＲおよび／またはＦＡＣＳにより決定される。

【0089】

解離定数（Ｋ_Ｄ）及び最大結合（Ｂｍａｘ）
いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、解離定数及び最大結合を含むがこれらに限定されない機能的特性により記載される。

【0090】

「解離定数（Ｋ_Ｄ）」という用語は、本明細書で用いるとき、特定のリガンド−タンパク質相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。本明細書で用いるとき、リガンド−タンパク質相互作用は、限定されないが、タンパク質間相互作用または抗体−抗原相互作用を指す。Ｋ_Ｄは、より小さない構成要素（Ａ＋Ｂ）へと可逆的に解離する２つのタンパク質（例えば、ＡＢ）の性向を測定するものであり、「オフ速度（ｋ_ｏｆｆ）」とも呼ばれる解離速度の、会合速度、すなわち「オン速度（ｋ_ｏｎ）」に対する比率として定義される。ゆえに、Ｋ_Ｄは、ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎに等しく、モル濃度（Ｍ）として表される。Ｋ_Ｄが小さいほど、結合の親和性は強いということになる。それゆえ、１ｍＭのＫ_Ｄは、１ｎＭのＫ_Ｄと比較して弱い結合親和性を示す。抗原結合性構築物のＫ_Ｄ値は、当該分野で十分に確立されている方法を使用して決定することができる。抗原結合性構築物のＫ_Ｄを決定するための一方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用する、典型的には、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、決定するために使用することができる別の方法である。

【0091】

抗原結合性構築物の結合特性は、様々な技術により決定することができる。そのうちの１つは、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、蛍光活性化細胞選別）による、抗原を発現する標的細胞への結合の測定である。典型的には、そのような実験では、目的の抗原を発現する標的細胞を、異なる濃度で抗原結合性構築物と共にインキュベートし、洗浄し、抗原結合性構築物を検出するための二次薬剤と共にインキュベートし、洗浄し、フローサイトメーターにおいて分析して、細胞上の検出シグナルの強度を表す蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を測定する。これが、細胞に結合した抗原結合性構築物の数に関連する。次いで、抗原結合性構築物濃度対ＭＦＩデータを飽和結合方程式に当てはめて、２つの重要な結合パラメータである、Ｂｍａｘ及び見かけのＫ_Ｄを得る。

【0092】

見かけのＫ_Ｄ、すなわち見かけの平衡解離定数は、最大半量の細胞結合が観察される抗原結合性構築物濃度を表す。明らかに、Ｋ_Ｄ値が小さいほど、最大細胞結合に達するためにより低い抗原結合性構築物濃度が必要とされ、ゆえに、その抗原結合性構築物の親和性は高くなる。見かけのＫ_Ｄは、細胞上で発現される異なる受容体レベル及びインキュベーション条件などの細胞結合実験の条件に依存しており、ゆえに、見かけのＫ_Ｄは一般に、ＳＰＲ及びＩＴＣなどの細胞不含分子実験から決定されたＫ_Ｄ値とは異なる。しかしながら、それらの異なる方法の間にも、概して良好な一致が存在する。

【0093】

「Ｂｍａｘ」という用語、すなわち最大結合は、抗原結合性構築物の飽和濃度での、細胞上の最大抗原結合性構築物結合レベルを指す。このパラメータは、相対比較のための任意単位ＭＦＩで報告されるか、または標準曲線を使用して細胞に結合した抗原結合性構築物の数に対応する絶対値に変換することができる。

【0094】

抗原結合性構築物の検査：ＨＥＲ２結合性
本明細書に記載の抗原結合性構築物または医薬組成物をｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで、所望の治療活性または予防活性について検査してから、ヒトにおいて使用した。例えば、化合物または医薬組成物の治療有用性または予防有用性を実証するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイには、細胞系または患者組織試料に与える化合物の効果が含まれる。細胞系および／または組織試料に与える化合物または組成物の効果は、当業者に公知の技術を活用して決定することができ、それには、ロゼット形成アッセイ及び細胞溶解アッセイが含まれるが、これらに限定されない。本発明に従って、特定の抗原結合性構築物の投与が示されるかどうかを決定するために使用することができるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイには、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイ、または患者組織試料を培養において増殖させ、抗原結合性構築物に曝露するか、または別の方法でこれを投与し、組織試料に与えるかかる抗原結合性構築物の効果を観察するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイが含まれる。

【0095】

候補となる抗原結合性構築物は、ＨＥＲ２を発現する細胞、例えば、乳癌細胞系を使用してアッセイすることができる。以下の表Ｄは、いくつかの代表的な癌細胞系におけるＨＥＲ２の発現レベルを記載する。
（表Ｄ）目的の細胞系におけるＨＥＲ２の相対的発現レベル

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【0096】

ＭｃＤｏｎａｇｈ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｍａｒ；１１（３）：５８２−９３；Ｓｕｂｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：４；３５−４１；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ，１９９４：８９；４２８５−４２８９；Ｙａｒｄｅｎ ２０００，ＨＥＲ２：Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ；Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ ２０１３；１２：１８１６−２８。

【0097】

当該分野で公知のように、本明細書に記載の方法における使用に好適な抗原結合性構築物を同定するために、いくつかのアッセイを使用してよい。これらのアッセイは、ＨＥＲ２を発現する癌細胞において実施することができる。好適な癌細胞の例を、表Ａ５において同定する。実施してよいアッセイの例を以下に記載する。

【0098】

例えば、ＨＥＲ２と結合する増殖阻害性の抗原結合性構築物候補を同定するために、ＨＥＲ２を発現する癌細胞の増殖を阻害する抗体についてスクリーニングしてよい。一実施形態では、選択された抗原結合性構築物候補は、細胞培養物中の癌細胞の増殖を、対照抗原結合性構築物と比較して約２０〜１００％、好ましくは約５０〜１００％阻害することができる。

【0099】

細胞死を誘導する抗原結合性構築物候補を選択するために、例えば、ＰＩ（ホスファチジルイノシトール）、トリパンブルー、または７ＡＡＤ取り込みによって示されるような膜完全性の喪失を、対照に対して評価してよい。

【0100】

アポトーシスを誘導する抗原結合性構築物候補を選択するために、アネキシン結合アッセイを使用してよい。アネキシン結合アッセイに加えて、ＤＮＡ染色アッセイも使用してよい。

【0101】

一実施形態では、目的の抗原結合性構築物候補は、免疫共沈降実験において決定されるように、モノクローナル抗体４Ｄ５よりも実質的に有効に、好ましくはモノクローナル抗体７Ｆ３よりも実質的に有効に、ＭＣＦ７及びＳＫ−ＢＲ−３細胞の両方において、ＥｒｂＢ２とＥｒｂＢ３とのヘレグリン依存性会合を遮断し得る。

【0102】

目的の抗体が結合するＥｒｂＢ２上のエピトープに結合する抗原結合性構築物をスクリーニングするために、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（１９８８）に記載されているものなどの通常のクロスブロッキングアッセイを行うことができる。あるいは、または加えて、当該分野で公知の方法により、エピトープマッピングを行うことができる。

【0103】

抗原結合性構築物間の競合は、検査中の抗原結合性構築物が、共通の抗原への基準抗原結合性構築物の特異的な結合を阻害また遮断するアッセイによって決定することができる（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５０：１４９５，１９９０；Ｆｅｎｄｌｙ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：１５５０−１５５８；米国特許第６，９４９，２４５号を参照されたい）。競合結合アッセイにおいて測定されて、過剰な被験抗原結合性構築物（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、または１００倍）が、基準抗原結合性構築物の結合を例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％阻害または遮断する場合に、被験抗原結合性構築物は、基準抗原結合性構築物と競合する。競合アッセイによって同定される抗原結合性構築物（競合する抗原結合性構築物）には、基準抗原結合性構築物と同じエピトープに結合する抗原結合性構築物、及び基準抗原結合性構築物が結合するエピトープに、立体障害が生じるほど十分に近接して隣接するエピトープに結合する抗原結合性構築物が含まれる。例えば、ＨＥＲ２への結合について、本明細書に記載の第一の抗原結合性構築物と競合する第二の競合性抗原結合性構築物を同定することができる。ある特定の例では、第二の構築物は、競合結合アッセイにおいて測定した場合に、第一の構築物の結合を例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％遮断または阻害することができる。ある特定の例では、第二の構築物は、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％超で、第一の構築物を置き換えることができる。

【0104】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物を、ｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、動物モデルにおける、機能についてアッセイする。いくつかの実施形態では、動物モデルは、表Ｅに記載の動物モデルである。いくつかの実施例では、動物モデルは、実施例に記載の動物モデルである。いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、基準抗原結合性構築物と比較して、動物モデルでの処置の有効性の増加を示す。
（表Ｅ）ＨＥＲ２結合性抗原結合性構築物を検査するための動物モデル

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【0105】

基準抗原結合性構築物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物の機能的特性を、基準抗原結合性構築物のものと比較する。基準抗原結合性構築物が何であるかは、測定される機能的特性または成される識別に依存する。例えば、本明細書に記載の抗原結合性構築物の機能的特性を比較するとき、基準抗原結合性構築物は、トラスツズマブ（例えばｖ６３３６）、もしくはその類似体であってよいか、または対照ＩｇＧ、例えば、非特異的ポリクローナルヒト抗体であってよい。

【0106】

抗原結合性構築物及び抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
ある特定の実施形態では抗原結合性構築物を、薬物、例えば、毒素、化学療法剤、免疫調節剤、または放射性同位体にコンジュゲートさせる。ＡＤＣ（抗体薬物コンジュゲートまたは抗原結合性構築物薬物コンジュゲート）を調製するいくつかの方法が、当該分野で公知であり、以下に記載する。

【0107】

いくつかの実施形態では、薬物は、マイタンシン、オーリスタチン、カリケアマイシン、またはその誘導体から選択される。他の実施形態では、薬物は、ＤＭ１及びＤＭ４から選択されたマイタンシンである。さらなる例を以下に記載する。

【0108】

いくつかの実施形態では、薬物を、ＳＭＣＣリンカー（ＤＭ１）またはＳＰＤＢリンカー（ＤＭ４）を用いて単離された抗原結合性構築物にコンジュゲートさせる。追加の例を以下に記載する。薬物−対−抗原結合性タンパク質の比率（ＤＡＲ）は、例えば、１．０〜６．０または３．０〜５．０、または３．５〜４．２であることができる。

【0109】

いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物を、細胞毒性薬剤にコンジュゲートさせる。「細胞毒性薬剤」という用語は、本明細書で用いるとき、細胞の機能を阻害もしくは防ぐ、および／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、及びＬｕ１７７）、化学療法剤、ならびに毒素、例えば、細菌、真菌、植物、または動物起源の小分子毒素または酵素活性な毒素、その断片および／または変異体を含む、を含むと意図される。さらなる例を以下に記載する。

【0110】

薬物
ＡＤＣの様々な実施形態において使用される薬物またはペイロードの非限定的な例には、ＤＭ１（マイタンシン、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン）、ｍｃ−ＭＭＡＤ（６−マレイミドカプロイル−モノメチルオーリスタチン−ＤまたはＮ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−２−メトキシ−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−［［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（２−チアゾリル）エチル］アミノ］プロピル］−１−ピロリジニル］−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−（９Ｃｌ）−Ｌ−バリンアミド）、ｍｃ−ＭＭＡＦ（マレイミドカプロイル−モノメチルオーリスタチンＦまたはＮ−［６−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｌ−バリル−（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−５−メチル−４−（メチルアミノ）ヘプタノイル−（αＲ，βＲ，２Ｓ）−β−メトキシ−α−メチル−２−ピロリジンプロパノイル−Ｌ−フェニルアラニン）及びｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ−ＭＭＡＥ（６−マレイミドカプロイル−ＶａｌｃＣｉｔ−（ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル）−モノメチルオーリスタチンＥまたはＮ−［［［４−［［Ｎ−［６−（２，５−ジヒドロ−２，５−ジオキソ−１Ｈ−ピロール−１−イル）−１−オキソヘキシル］−Ｌ−バリル−Ｎ５−（アミノカルボニル）−Ｌ−オルニチル］アミノ］フェニル］メトキシ］カルボニル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−Ｎ−［（１Ｓ，２Ｒ）−４−［（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−［［（１Ｒ，２Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチル−２−フェニルエチル］アミノ］−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］−１−ピロリジニル］−２−メトキシ−１−［（１Ｓ）−１−メチルプロピル］−４−オキソブチル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）が含まれる。ＤＭ１は、チューブリン阻害剤マイタンシンの誘導体であり、ＭＭＡＤ、ＭＭＡＥ、及びＭＭＡＦは、オーリスタチン誘導体である。

【0111】

マイタンシノイド薬物部分
上述のように、いくつかの実施形態では、薬物はマイタンシノイドである。例示的なマイタンシノイドには、ＤＭ１、ＤＭ３（Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）マイタンシン）、及びＤＭ４（Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）メチルマイタンシン）が含まれる（ＵＳ２００９０２０２５３６を参照されたい）。

【0112】

マイタンシン化合物上の多くの位置が、連結の種類に応じて、連結位置として有用であるとして公知である。例えば、エステル連結を形成するためには、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ−１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位がすべて好適である。

【0113】

マイタンシノイド薬物部分のすべての立体異性体、すなわち、Ｄのキラル炭素でのＲ及びＳ立体配置のあらゆる組み合わせが、本明細書に記載のＡＤＣについて企図される。

【0114】

オーリスタチン
いくつかの実施形態では、薬物は、オーリスタチン、例えば、オーリスタチンＥ（ドラスタチン−１０の誘導体としても当該分野で公知）またはその誘導体である。オーリスタチンは、例えば、オーリスタチンＥとケト酸との間で形成されるエステルであることができる。例えば、オーリスタチンＥを、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれＡＥＢ及びＡＥＶＢを産生することができる。他の典型的なオーリスタチンには、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、及びＭＭＡＥが含まれる。例示的なオーリスタチンの合成及び構造は、米国特許第６，８８４，８６９号、同第７，０９８，３０８号、同第７，２５６，２５７号、同第７，４２３，１１６号、同第７，４９８，２９８号、及び同第７，７４５，３９４号に記載されており、このそれぞれは、その全体がすべての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる。

【0115】

化学療法剤
いくつかの実施形態では抗原結合性構築物を、化学療法剤にコンジュゲートさせる。例には、シスプランチン（Ｃｉｓｐｌａｎｔｉｎ）及びラパチニブが含まれるが、これらに限定されない。「化学療法剤」は、癌の処置に有用な化学化合物である。

【0116】

化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロスホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））；アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、イムプロスルファン及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、及びウレドーパ；エチレンイミン及びメチルアメラミン、例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチルオロメラミン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬剤、例えば、メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビスアントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルホルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ７；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２′，２′＝−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ニュージャージー州プリンストン）及びドキセタキセル（ｄｏｘｅｔａｘｅｌ）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ、フランス、アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害薬ＲＦＳ ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸、または誘導体が含まれる。この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば、例として、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン；ならびに、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリンなどの抗アンドロゲン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。

【0117】

コンジュゲートリンカー
いくつかの実施形態では、薬物は、リンカーにより、抗原結合性構築物、例えば、抗体に連結される。抗体へのリンカーの付着は、表面リジンを通して、酸化炭水化物への還元カップリング、鎖間ジスルフィド結合を還元することで遊離されるシステイン残基を通してなど様々な方法で達成することができる。ヒドラゾン、ジスルフィド、及びペプチドをベースとする連結を含む様々なＡＤＣ連結系が、当該分野で公知である。

【0118】

好適なリンカーには、例えば、切断可能及び切断不可能なリンカーが含まれる。切断可能なリンカーは典型的には、細胞内条件下で切断を受けやすい。好適な切断可能リンカーには、例えば、リソソームプロテアーゼまたはエンドソームプロテアーゼなどの細胞内プロテアーゼによって切断可能であるペプチドリンカーが含まれる。例示的な実施形態では、リンカーは、ジペプチドリンカー、例えば、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）、フェニルアラニン−リジン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロン酸−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｍｃ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＡ）リンカーであることができる。別のリンカーは、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）である。スルホ−ｓｍｃｃコンジュゲーションは、スルフヒドリル（チオール、−ＳＨ）と反応するマレイミド基を介して生じ、そのスルホ−ＮＨＳエステルは、第一級アミン（リジン及びタンパク質またはペプチドＮ末端に見いだされる）に対して反応性である。また別のリンカーは、マレイミドカプロイル（ＭＣ）である。他の好適なリンカーには、ヒドラゾンリンカーなどの、特定のｐＨまたはｐＨ範囲で加水分解し得るリンカーが含まれる。追加の好適な切断可能リンカーには、ジスルフィドリンカーが含まれる。リンカーは、薬物を放出するために抗体が細胞内で必ず分解される程度に抗体に共有結合され得る。例えば、ＭＣリンカー等である。

【0119】

ＡＤＣの調製
ＡＤＣは、当業者に知られている有機化学の反応、条件、及び試薬を使用して、いくつかの経路によって調製されてよく、それには、（１）共有結合を介して抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成するための抗体の求核性基または求電子性基と二価リンカー試薬との反応、その後の活性化薬物部分Ｄとの反応；及び（２）共有結合を介して薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成するための、薬物部分の求核性基または求電子性基とリンカー試薬との反応、その後の抗体の求核性基または求電子性基との反応を含む。コンジュゲーション方法（１）及び（２）を、様々な抗体、薬物部分、及びリンカーで使用して、本明細書に記載の抗体−薬物コンジュゲートを調製してよい。

【0120】

ＡＤＣを調製する方法のいくつかの具体的な例は、当該分野で公知であり、米国特許第８，６２４，００３号（ポット方法）、同第８，１６３，８８８号（１ステップ）、及び同第５，２０８，０２０号（２ステップ方法）に記載されている。

【0121】

抗原結合性構築物の調製方法
本明細書に記載の抗原結合性構築物は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を使用して産生してよい。

【0122】

一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードする単離核酸を提供する。かかる核酸は、抗原結合性構築物のＶＬを含むアミノ酸配列および／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗原結合性構築物の軽鎖および／または重鎖）をコードし得る。さらなる実施形態では、かかる核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）を提供する。一実施形態では、核酸を、マルチシストロン性ベクターにて提供する。さらなる実施形態では、かかる核酸を含む宿主細胞を提供する。かかる一実施形態では、宿主細胞は、（１）抗原結合性構築物のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗原結合性ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗原結合性ポリペプチド構築物のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター、及び抗原結合性ポリペプチド構築物のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、これで形質転換されている）。一実施形態では、宿主細胞は、真核、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞、またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。一実施形態では、抗原結合性構築物を作製する方法であって、抗原結合性構築物の発現に適した条件下で、上で提示したように抗原結合性構築物をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、及び任意選択で、宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から抗原結合性構築物を回収することを含む、前記方法を提供する。

【0123】

抗原結合性構築物の組換え産生については、例えば、上記のような、抗原結合性構築物をコードする核酸を単離し、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために１つまたは複数のベクターに挿入する。かかる核酸は、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定され得る（例えば、抗原結合性構築物の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）。

【0124】

「実質的に精製された」という用語は、その天然に存在する環境、すなわち天然細胞、または組換え産生されたヘテロ多量体の場合は宿主細胞において見いだされるようなタンパク質と通常付随するかまたは相互作用する成分を実質的にまたは本質的に含まないであろう、本明細書に記載の構築物、またはその変異体を指し、ある特定の実施形態では、細胞材料を実質的に含まず、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満（乾燥重量で）の混入タンパク質を有するタンパク質の調製物を含む。ヘテロ多量体またはその変異体が、宿主細胞により組み換え産生されるとき、タンパク質は、ある特定の実施形態では、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％以下で存在する。ヘテロ多量体またはその変異体が、宿主細胞により組み換え産生されるとき、タンパク質は、ある特定の実施形態では、培養培地中に、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌ以下で存在する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法により産生された「実質的に精製された」ヘテロ多量体は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％の純度レベル、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％の純度レベル、より具体的には、少なくとも約９０％の純度レベル、少なくとも約９５％の純度レベル、少なくとも約９９％以上の純度レベルを有し、これはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法により決定される。

【0125】

抗原結合性構築物をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、本明細書に記載の原核または真核細胞が含まれる。

【0126】

「組換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、挿入のために使用する方法にかかわらず、外因性ポリヌクレオチドを含む細胞を指し、この方法は、例えば、直接的取り込み、形質導入、ｆ−メーティング、または組換え宿主細胞を作製するために当該分野で公知の他の方法である。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えば、プラスミドとして維持してよいか、またあるいは、宿主ゲノムに組み込んでよい。

【0127】

本明細書で用いるとき、「真核生物」という用語は、動物（哺乳類、昆虫類、爬虫類、鳥類等を含むが、これらに限定されない）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類等を含むが、これらに限定されない）、真菌類、酵母、鞭毛虫、微胞子虫、原生生物等の、系統発生ドメインで真核生物に属する生体を指す。

【0128】

本明細書で用いるとき、「原核生物」という用語は、原核生体を指す。例えば、非真核生体は、真性細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ等を含むが、これらに限定されない）系統発生ドメイン、または古細菌（限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｖｏｌｃａｎｉｉ及びハロバクテリウム種ＮＲＣ−１などのハロバクテリウム、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘを含む）系統発生的ドメインに属し得る。

【0129】

例えば、抗原結合性構築物は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされないときに、細菌にて産生されてよい。細菌における抗原結合性構築物断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号，同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい。（Ｅ． ｃｏｌｉ．における抗体断片の発現を記載している、Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３），ｐｐ．２４５−２５４も参照されたい）。発現の後に、抗原結合性構築物を、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離し、さらに精製することができる。

【0130】

原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物は、抗原結合性構築物をコードするベクターに好適なクローニングまたは発現宿主であり、これには、そのグリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを伴う抗原結合性構築物の産生をもたらす真菌及び酵母株を含む。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。

【0131】

グリコシル化抗原結合性構築物の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）からも誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と併せて、特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために使用され得る多数のバキュロウイルス株が同定されている。

【0132】

植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物において抗原結合性構築物を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい。

【0133】

脊椎動物細胞も宿主として使用してよい。例えば、懸濁液中で増殖するように適合させた哺乳動物細胞系が有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞系の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児由来腎臓系（２９３または例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）において記載されているような２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）において記載されているようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌腫細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝臓由来細胞（ＢＲＬ ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）において記載されているようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞系には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、これはＤＨＦＲ⁻ＣＨＯ細胞を含む（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：４２１６（１９８０））；ならびにＹ０、ＮＳ０、及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞系が含まれる。抗原結合性構築物産生に好適なある特定の哺乳動物宿主細胞系の概説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。

【0134】

一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、安定した哺乳類細胞において、少なくとも１つの安定した哺乳類細胞に抗原結合性構築物をコードする核酸を、所定の比率でトランスフェクトすること；及び少なくとも１つの哺乳類細胞において核酸を発現させることを含む方法により、産生される。いくつかの実施形態では、核酸の所定の比率は、最も高い割合（％）の抗原結合性構築物を発現産物においてもたらすインプット核酸の相対比を決定するための一過的なトランスフェクション実験において決定される。

【0135】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように安定した哺乳動物細胞において抗原結合性構築物を産生する方法であって、少なくとも１つの安定した哺乳動物細胞の発現産物が、単量体重鎖もしくは軽鎖ポリペプチド、または他の抗体と比較して、より高い割合（％）の所望のグリコシル化抗原結合性構築物を含む、前記方法である。

【0136】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のように安定した哺乳動物細胞においてグリコシル化抗原結合性構築物を産生する方法であって、所望のグリコシル化抗原結合性構築物を同定及び精製することを含む、前記方法である。いくつかの実施形態では、前記同定は、液体クロマトグラフィー及び質量分析法の一方または両方による同定である。

【0137】

必要な場合には、抗原結合性構築物を、発現の後に精製または単離することができる。タンパク質は、当業者に公知である様々な方法で単離または精製されてよい。標準的な精製方法には、ＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどのシステムを使用して常圧または高圧で実施する、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイジングまたはゲル濾過、及び逆相を含むクロマトグラフィー技術が含まれる。精製方法には、電気泳動、免疫学的、沈殿、透析、及びクロマトフォーカシング技術も含まれる。タンパク質濃縮と併せた限外濾過及び透析濾過技術も有用である。当該分野で周知のように、様々な天然タンパク質が、Ｆｃ及び抗体と結合し、これらのタンパク質を、抗原結合性構築物の精製のために本発明において使用することができる。例えば、細菌プロテインＡ及びＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌プロテインＬは、いくつかの抗体のＦａｂ領域に結合する。精製はしばしば、特定の融合パートナーによって可能になり得る。例えば、ＧＳＴ融合を使用する場合には、グルタチオン樹脂を、Ｈｉｓタグを使用する場合には、Ｎｉ^＋２アフィニティークロマトグラフィーを、またはフラッグタグを使用する場合には、固定化抗フラッグ抗体を使用して、抗体を精製し得る。好適な精製技術における一般的なガイダンスについては、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれるＰｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３^ｒｄＥｄ．，Ｓｃｏｐｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。必要とされる精製の程度は、抗原結合性構築物の用途に応じて変動するだろう。場合によっては、精製は必要ない。

【0138】

ある特定の実施形態では、抗原結合性構築物を、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ポロスＨＱ、ポロスＤＥＡＦ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＤＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ及びＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｑ、及びＤＥＡＥカラムでのクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されないアニオン交換クロマトグラフィーを使用して精製する。

【0139】

特定の実施形態では、本明細書に記載のタンパク質を、ＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ポロスＨＳ、ポロスＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ及びＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ及びＣＭカラム、ならびにそれらと同等及び相当するものを含むが、これらに限定されないカチオン交換クロマトグラフィーを使用して精製する。

【0140】

加えて、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、当該分野で公知の技術を使用して化学的に合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照されたい）。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチドシンセサイザーの使用により合成することができる。さらに、所望の場合には、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、ポリペプチド配列内への置換または付加として導入することができる。非古典的アミノ酸には、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、□−アラニン、フルオロ−アミノ酸、□−メチルアミノ酸、Ｃ□−メチルアミノ酸、Ｎ□−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、及びアミノ酸類似体が一般に含まれるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であることができる。

【0141】

翻訳後修飾：
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、翻訳の間、またはその後に差次的に修飾される。

【0142】

「修飾された」という用語は、本明細書で用いるとき、所与のポリペプチドに対して成される任意の変化、例えば、ポリペプチドの長さ、ポリペプチドのアミノ酸配列、化学構造、同時翻訳修飾、または翻訳後修飾に対する変化を指す。「（修飾）」という形態の用語は、議論されているポリペプチドが任意選択で修飾される、すなわち、議論中のポリペプチドが修飾されても修飾されなくてもよいことを意味する。

【0143】

「翻訳後修飾」という用語は、ポリペプチド鎖に組み込まれた後にかかるアミノ酸に生じる天然または非天然アミノ酸の任意の修飾を指す。この用語は、例にすぎないが、同時翻訳ｉｎ ｖｉｖｏ修飾、同時翻訳ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾（細胞不含翻訳系においてなど）、翻訳後ｉｎ ｖｉｖｏ修飾、及び翻訳後ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾を包含する。

【0144】

いくつかの実施形態では、修飾は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解性開裂、及び抗体分子または抗原結合性構築物または他の細胞リガンドへの連結のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物は、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ_４による特異的化学開裂；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；及びツニカマイシンの存在下での代謝合成を含むが、これらに限定されない公知の技術によって化学的に修飾される。

【0145】

本明細書に記載の抗原結合性構築物の追加の翻訳後修飾には、例えば、Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）、アミノ酸主鎖への化学部分の付着、Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物鎖の化学的修飾、及び原核宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が含まれる。本明細書に記載の抗原結合性構築物は、タンパク質の検出及び単離を可能にする、酵素、蛍光、同位体、または親和性標識などの検出可能な標識で修飾される。ある特定の実施形態では、好適な酵素標識の例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが含まれ；好適な補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ；好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、またはフィコエリトリンが含まれ；発光物質の例には、ルミノールが含まれ；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ；好適な放射性物質の例には、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が含まれる。

【0146】

特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、放射性金属イオンと会合する大環状キレート剤に付着する。

【0147】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、または当該分野で周知の化学的修飾技術によってのいずれかで修飾される。ある特定の実施形態では、同じ種類の修飾が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同じ程度または様々な程度で存在し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物からのポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝しており、いくつかの実施形態では、分枝を伴うかまたは伴わない環式である。環式、分枝、及び分枝環式ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスからの結果であるか、または合成方法によって作成される。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫化、タンパク質への転移ＲＮＡ媒介アミノ酸付加、例えばアルギニル化、及びユビキチン化が含まれる（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。

【0148】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、固体支持体に付着し、それは、本明細書に記載のタンパク質が結合するか、これに結合するか、またはれと会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製のために特に有用である。かかる固体支持体には、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンが含まれるが、これらに限定されない。

【0149】

医薬組成物
本明細書に記載の抗原結合性構築物を含む医薬組成物も本明細書に提供する。医薬組成物は、構築物及び薬学的に許容され得る担体を含む。

【0150】

「薬学的に許容され得る」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって認可されているか、または米国薬局方もしくは、動物、より具体的にはヒトにおける使用に関する他の一般に認められている薬局方において挙げられていることを意味する。「担体」という用語は、治療薬と共に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、またはビヒクルを指す。かかる薬学的担体は、滅菌液、例えば、水及び油であることができ、これには、石油、動物、植物または合成起源の油、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等が含まれる。いくつかの態様では、担体は、自然界には存在しない人工担体である。医薬組成物を静脈投与するときには、水を担体として使用することができる。食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液も、特に注射用液剤のための液体担体として使用することができる。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、イネ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が含まれる。組成物は、所望の場合には、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有することができる。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤等の形態をとることができる。組成物は、従来の結合剤及び担体、例えばトリグリセリドを伴う坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の標準的な担体を含むことができる。好適な薬学的担体の例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”においてＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎにより記載されている。かかる組成物は、患者に適正に投与するための形態が得られるように、治療有効量の化合物を好ましくは精製形態で、好適な量の担体と一緒に含有するだろう。製剤は、投与様式に適合すべきである。

【0151】

ある特定の実施形態では、構築物を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、通常の手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液である。必要な場合には、組成物は、注射部位での疼痛を緩和するために、可溶化剤及び局所麻酔薬、例えばリグノカインも含んでよい。一般に、成分を、別々に、または一緒に混合して、単位剤形で、例えば、無水凍結乾燥散剤または無水濃縮物として、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの気密密封容器に入れて供給する。組成物が注入によって投与される場合、これを、滅菌された医薬グレードの水または食塩水を含有する注入ボトルに分配することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように滅菌注射用水または食塩水のアンプルを提供することができる。

【0152】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、中性または塩の形態で製剤化される。薬学的に許容され得る塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどのアニオンと共に形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどのカチオンと共に形成されるものが含まれる。

【0153】

処置方法
ある特定の実施形態では、疾患または障害を処置する方法であって、かかる処置、予防または回復が望まれる対象に、本明細書に記載の抗原結合性構築物を、疾患または障害を処置、予防または回復させるのに有効な量で、投与することを含む、前記方法を提供する。

【0154】

「障害」は、本明細書に記載の抗原結合性構築物または方法を用いる処置から利益を得るだろう任意の状態を指す。これは、該当する障害に哺乳動物が罹患しやすくなる病的状態を含む慢性及び急性障害または疾患を含む。いくつかの実施形態では、障害は、以下により詳述するような癌である。

【0155】

「対象」という用語は、処置、観察または実験の対象である、動物、いくつかの実施形態では、哺乳類を指す。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）、または実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモット等）であってよい。

【0156】

「哺乳動物」という用語は、本明細書で用いるとき、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、及びブタを含むが、これらに限定されない。

【0157】

「処置」は、処置を受ける個体または細胞の自然の経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防のためまたは臨床病理の経過中のいずれかに行うことができる。処置の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患のいずれもの直接的または間接的病理学的帰結の減弱、転移の予防、疾患進行の減速、病態の回復または緩和、及び寛解または予後の改善が含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物を、疾患または障害の発症を遅延させるために使用する。一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物及び方法は、腫瘍退縮に影響する。一実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物及び方法は、腫瘍／癌増殖の阻害に影響する。

【0158】

処置の望ましい効果には、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患のいずれもの直接的または間接的病理学的帰結の減弱、転移の予防、疾患進行の減速、病態の回復または緩和、生存の改善、及び寛解または予後の改善が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物を、疾患の発症を遅延させるか、または疾患の進行を遅らせるために使用する。

【0159】

「有効量」という用語は、本明細書で用いるとき、列挙された方法の目標を達成するだろう、例えば、処置されている疾患、状態、または障害の症状の１つまたは複数をある程度軽減するだろう、投与される構築物の量を指す。治療用タンパク質の異常な発現および／または活性に伴う疾患または障害の処置、阻害、及び予防において有効であるだろう本明細書に記載の組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、任意選択で最適な投与量範囲の同定を助けるために使用することができる。製剤において使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患または障害の重篤性にも依存し得、担当医の判断及び各患者の状況に従って決断されるべきである。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験システムから誘導される用量反応曲線から外挿される。

【0160】

抗原結合性構築物は、対象に投与される。様々な送達系が公知であり、これを使用して、本明細書に記載の抗原結合性構築物を投与することができ、例えば、リポソーム、マイクロ粒子、マイクロカプセルへの封入、化合物を発現できる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照されたい）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築等である。導入方法には、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路が含まれるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の好都合な経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸管粘膜等）を通る吸収によって投与されてよく、他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与されてよい。投与は、全身でも局所でも可能である。加えて、ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物組成物を、脳室内及び髄腔内注射を含む任意の好適な経路によって中枢神経系へと導入することが望ましく；脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａレザバーなどのレザバーに取り付けられた脳室内カテーテルによって容易になり得る。例えば、吸入器または噴霧器の使用、及びエアロゾル化剤を伴う製剤によって、肺投与も使用することができる。

【0161】

特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物または組成物を、処置を必要とする領域に局所投与することが望ましく；これは、例であって限定ではないが、外科手術中の局所注入、例えば外科手術後の創傷の包帯と併せての局所塗布によって、注射によって、カテーテルの使用によって、坐剤の使用によって、またはインプラントの使用によって達成することができ、前記インプラントは、多孔性、非多孔性、またはゼラチン材料からなり、シアラスティック（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜などの膜または繊維を含む。好ましくは、本明細書に記載の抗原結合性構築物を含むタンパク質を投与するとき、タンパク質が吸収しない材料を使用するように配慮する必要がある。

【0162】

別の実施形態では、抗原結合性構築物または組成物を、小胞、具体的には、リポソームで送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）にて；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ．３１７−３２７を参照されたい；一般には同書を参照されたい）。

【0163】

また別の実施形態では、抗原結合性構築物または組成物を、制御放出系で送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用してよい（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照されたい；また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照されたい）。また別の実施形態では、制御放出系を、治療標的、例えば、脳の近傍に設置して、ほんの少しの全身用量のみを必要とすることができる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）にてを参照されたい）。

【0164】

本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードする核酸を含む特定の実施形態では、核酸をｉｎ ｖｉｖｏに投与して、そのコードされるタンパク質の発現を促進することができ、これは、好適な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、または直接注射によって、またはマイクロ粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子ガン；Ｂｉｏｂｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤でのコーティングによって、または核に入ることが公知のホメオボックス様ペプチドと連結して投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照されたい）等によって細胞内になるようにそれを投与することによる。あるいは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。

【0165】

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物を、結合標的エピトープが重複しない抗原結合性構築物との組み合わせとして投与する。

【0166】

疾患または障害の処置、阻害、及び予防において有効であるだろう抗原結合性構築物の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、任意選択で、最適な投与量範囲の同定を助けるために使用することができる。製剤において使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患または障害の重篤性にも依存し得、担当医の判断及び各患者の状況に従って決断されるべきである。有効な用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験システムから誘導される用量反応曲線から外挿される。

【0167】

本明細書に記載の抗原結合性構築物を、単独で、または他の種類の処置（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法、及び抗腫瘍薬）と組み合わせて投与してよい。一般に、患者の種と同じ種である種起源または（抗体の場合）種反応性の生成物の投与が好ましい。ゆえに、一実施形態では、ヒト抗原結合性構築物、断片誘導体、類似体、または核酸を、治療または予防のためにヒト患者に投与する。

【0168】

癌を処置する方法
本明細書に記載の抗原結合性構築物を使用して、対象においてＨＥＲ２＋癌または腫瘍を処置する方法、及びＨＥＲ２＋腫瘍細胞の増殖を阻害するまたはＨＥＲ２＋腫瘍細胞を死滅させる方法を本明細書に記載する。

【0169】

ＨＥＲ２＋癌とは、本明細書に記載の抗原結合性構築物がその癌に結合することができるようなＨＥＲ２を発現する癌を意味する。当該分野で公知のように、ＨＥＲ２＋癌は、ＨＥＲ２を様々なレベルで発現する。癌におけるＥｒｂＢ、例えば、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）発現を決定するために、様々な診断／予後アッセイが利用可能である。一実施形態では、ＥｒｂＢ２過剰発現を、ＩＨＣによって、例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＥＳＴ（登録商標）（Ｄａｋｏ）を使用して分析してよい。腫瘍生検からのパラフィン包埋組織切片をＩＨＣアッセイに供し、以下のＥｒｂＢ２タンパク質染色強度基準に従う：

【0170】

スコア０
染色が観察されないか、または膜染色が腫瘍細胞の１０％未満において観察される。

【0171】

スコア１＋
かすかに／かろうじて認知可能な膜染色が、腫瘍細胞の１０％超で検出される。細胞は、それらの膜の一部においてのみ染色される。

【0172】

スコア２＋
弱から中程度の膜全体の染色が、腫瘍細胞の１０％超において観察される。

【0173】

スコア３＋
中から強度の膜全体の染色が、腫瘍細胞の１０％超において観察される。

【0174】

ＥｒｂＢ２過剰発現評価について０または１＋のスコアを示す腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現していないと特性決定され得るが、２＋または３＋のスコアを示す腫瘍は、ＥｒｂＢ２を過剰発現していると特性決定され得る。

【0175】

あるいは、または加えて、ＩＮＦＯＲＭ（商標）（Ｖｅｎｔａｎａ，Ａｒｉｚ．により販売）またはＰＡＴＨＶＩＳＩＯＮ（商標）（Ｖｙｓｉｓ，Ｉｌｌ．）などの蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）アッセイを、ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍組織において、腫瘍におけるＥｒｂＢ２過剰発現の程度（もしあるならば）を決定するために実行してよい。ＩＨＣアッセイと比較して、ＨＥＲ２遺伝子増幅を測定するＦＩＳＨアッセイは、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）を用いる処置に対する患者の応答とより良好に相関しているようであり、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）処置から利益を受ける可能性が高い患者を同定するために好ましいアッセイであると現在考えられている。

【0176】

表Ｄに、いくつかの代表的な乳癌及び他の癌細胞系でのＨＥＲ２の発現レベルを記載する（Ｓｕｂｉｋ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ：Ｂａｓｉｃ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：４；３５−４１；Ｐｒａｎｇ ｅｔ ａ．（２００５）Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ：９２；３４２−３４９）。表に示すように、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、低ＨＥＲ２発現細胞であると考えられる；ＪＩＭＴ−１及びＺＲ−７５−１細胞は、中程度ＨＥＲ２発現細胞であると考えられ、ＳＫＢＲ３及びＢＴ−４７４細胞は、高ＨＥＲ２発現細胞であると考えられる。ＳＫＯＶ３（卵巣癌）細胞は、中程度ＨＥＲ２発現細胞であると考えられる。

【0177】

ＨＥＲ２＋癌または腫瘍を有する対象を処置する方法であって、対象に、本明細書に記載の抗原結合性構築物を含む有効量の医薬組成物を提供することを含む、前記方法を本明細書に記載する。

【0178】

癌または腫瘍を処置するための医薬品を製造するための、本明細書に記載のＨＥＲ２抗原結合性構築物の使用も本明細書に記載する。癌または腫瘍の処置において使用するためのＨＥＲ２抗原結合性構築物も本明細書に記載する。

【0179】

いくつかの実施形態では、処置される対象は、膵臓癌、頭頚部癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、腎臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、脳癌、子宮内膜癌、膀胱癌、非小細胞肺癌または上皮由来癌を有する。いくつかの実施形態では、腫瘍は、転移性である。

【0180】

一般に、処置される対象における腫瘍は、腫瘍細胞１個当たり平均で１０，０００以上のＨＥＲ２のコピーを発現する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、ＩＨＣによって決定されて、ＨＥＲ２ ０〜１＋、１＋、ＨＥＲ２ ２＋、またはＨＥＲ２ ３＋である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、ＨＥＲ２ ２＋以下、またはＨＥＲ２ １＋以下である。いくつかの実施形態では、腫瘍は、増幅ＨＥＲ２遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２遺伝子は、増幅されていない。

【0181】

いくつかの実施形態では、抗原結合性構築物を用いて処置される対象の腫瘍は、乳癌である。いくつかの実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２を３＋レベルで発現する。いくつかの実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２を３＋レベル未満で発現する。特定の実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２を２＋レベル以下で発現する。特定の実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２を１＋レベル以下で発現する。いくつかの実施形態では、乳癌は、エストロゲン受容体（ＥＲ＋）および／またはプロゲステロン受容体（ＰＲ＋）を発現する。いくつかの実施形態では、乳癌は、ＥＲ−及びまたはＰＲ−である。いくつかの実施形態では、乳癌は、増幅ＨＥＲ２遺伝子を有する。いくつかの実施形態では、ＨＥＲ２遺伝子は、増幅されていない。いくつかの実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２ ３＋エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、プロゲステロン受容体陰性（ＰＲ−）、トラスツズマブ耐性、化学療法耐性の浸潤性乳管癌である。別の実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２ ３＋ＥＲ−、ＰＲ−、トラスツズマブ耐性の炎症性の乳癌である。別の実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２ ３＋、ＥＲ−、ＰＲ−、浸潤性乳管癌である。別の実施形態では、乳癌は、ＨＥＲ２ ２＋ＨＥＲ２遺伝子増幅トラスツズマブ及びペルツズマブ耐性乳癌である。いくつかの実施形態では、乳癌は、トリプルネガティブ（ＥＲ−、ＰＲ−及び低ＨＥＲ２発現）である。いくつかの実施形態では、乳癌は、トラスツズマブ、ペルツズマブおよび／またはＤＭ１にコンジュゲートしたトラスツズマブ（ａｄｏ−トラスツズマブエムタンシンまたはＴ−ＤＭ１）に対して耐性であるまたは不応性である。

【0182】

一実施形態では、腫瘍は、増幅ＨＥＲ２遺伝子を有するＨＥＲ２ ２／３＋卵巣上皮性腺癌である。

【0183】

他の標準治療法に対して耐性であるまたは耐性になりつつあるＨＥＲ２＋腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、対象に、本明細書に記載の抗原結合性構築物を含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法を本明細書に提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、現行の治療に応答しない対象に、任意選択で１つまたは複数の現行の抗ＨＥＲ２療法と組み合わせて提供される。いくつかの実施形態では、現行の抗ＨＥＲ２療法には、抗ＨＥＲ２または抗ＨＥＲ３単一特異性二価抗体、トラスツズマブ、ペルツズマブ、Ｔ−ＤＭ１、二重特異性ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ ｓｃＦｖ、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、癌は、タキサンなどの様々な化学療法剤に対して耐性である。いくつかの実施形態では、癌は、トラスツズマブに対して耐性である。いくつかの実施形態では、癌は、ペルツズマブに対して耐性である。一実施形態では、癌は、ＴＤＭ１（ＤＭ１にコンジュゲートしたトラスツズマブ）に対して耐性であるかまたは不応性である。いくつかの実施形態では、対象は、トラスツズマブ、ペルツズマブまたはＤＭ１などの抗ＨＥＲ２抗体を用いて以前に処置されている。いくつかの実施形態では、対象は、抗ＨＥＲ２抗体を用いて以前に処置されていない。一実施形態では、抗原結合性構築物は、対象に、患者が以前の抗ＨＥＲ２療法で進行しているときに、転移性癌の処置のために提供される。

【0184】

ＨＥＲ２＋腫瘍を有する対象を処置する方法であって、本明細書に記載の抗原結合性構築物を含む有効量の医薬組成物を、追加の抗腫瘍薬と併せて与えることを含む、前記方法を本明細書に提供する。追加の抗腫瘍薬は、上述のような治療用抗体、または化学療法剤であってよい。本発明の抗原結合性構築物との併用に有用な化学療法剤には、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチン、ペメトレキセド、５−フルオロウラシル（フォリン酸を含むか、または含まない）、カペシタビン、カルボプラチン、エピルビシン、オキサリプラチン、フォルフィリノックス、アブラキサン、ナベルビン及びシクロホスファミド、カペシタビン、ゲムシタビン、ナベルビン、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセルが含まれる。

【0185】

いくつかの実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺癌であり、追加の薬剤は、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、カペシタビン、ナベルビン、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチンまたはペメトレキセドのうちの１つまたは複数である。実施形態では、腫瘍は、胃癌または胃部の癌であり、追加の薬剤は、５−フルオロウラシル（フォリン酸を含むか、または含まない）、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、エピルビシン、イリノテカン、オキサリプラチン、ｎａｂ−パクリタキセルまたはパクリタキセルのうちの１つまたは複数である。他の実施形態では、腫瘍は、膵臓癌であり、追加の薬剤は、ｎａｂ−パクリタキセル、カペシタビン、ナベルビン、ゲムシタビン、フォルフィリノックス、アブラキサン、または５−フルオロウラシルのうちの１つまたは複数である。他の実施形態では、腫瘍は、エストロゲンおよび／またはプロゲステロン陽性乳癌であり、追加の薬剤は、パクリタキセル、カペシタビン、ナベルビン、ゲムシタビン、パクリタキセルまたはｎａｂ−パクリタキセルまたは（ａ）ドキソルビシン及びエピルビシンの組み合わせ、（ｂ）パクリタキセル及びドセタキセルの組み合わせ、または（ｃ）５−フルオロウラシル、シクロホスファミド及びカルボプラチンの組み合わせのうちの１つまたは複数である。他の実施形態では、腫瘍は、頭頚部癌であり、追加の薬剤は、パクリタキセル、カペシタビン、ナベルビン、ゲムシタビンまたはｎａｂ−パクリタキセルカルボプラチン、ドキソルビシンまたはシスプラチンのうちの１つまたは複数である。他の実施形態では、腫瘍は、卵巣癌であり、追加の薬剤は、カペシタビン、ナベルビン、ゲムシタビン、ｎａｂ−パクリタキセル、シスプラチン、カルボプラチン、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルなどのタキサンのうちの１つまたは複数であってよい。

【0186】

追加の薬剤を、処置を受けている対象に、抗原結合性構築物と同時に、または連続して投与してよい。

【0187】

抗原結合性構築物を用いた処置を受ける対象は、ヒト、非ヒト霊長類、またはマウスなどの他の哺乳動物であってよい。

【0188】

いくつかの実施形態では、有効量の抗原結合性構築物を、腫瘍を有する対象に提供することの結果は、腫瘍の縮小、腫瘍の増殖の阻害、腫瘍の無増悪期間の増加、対象の無病生存期間の延長、転移の低減、対象の無増悪生存期間の増加、または対象の全生存期間の増加もしくは処置を受けている対象の群の全生存期間の増加である。

【0189】

ＨＥＲ２発現腫瘍細胞を殺傷するまたはその増殖を阻害する方法であって、細胞を、本明細書に提供する抗原結合性構築物と接触させることを含む、前記方法も本明細書に記載する。

【0190】

様々な実施形態では、腫瘍細胞は、ＨＥＲ２ １＋または２＋ヒト膵臓癌腫細胞、ＨＥＲ２ ３＋ヒト肺癌腫細胞、ＨＥＲ２ ２＋ヒト白色人種細気管支肺胞上皮（ｂｒｏｎｃｈｉｏａｖｅｏｌａｒ）癌細胞、ヒト咽頭癌腫細胞、ＨＥＲ２ ２＋ヒト舌扁平上皮癌細胞、咽頭のＨＥＲ２ ２＋舌扁平上皮癌、ＨＥＲ２ １＋または２＋ヒト結腸直腸癌腫細胞、ＨＥＲ２ ３＋ヒト胃癌腫細胞、ＨＥＲ２ １＋ヒト乳管ＥＲ＋（エストロゲン受容体陽性）癌腫細胞、ＨＥＲ２ ２＋／３＋ヒトＥＲ＋、ＨＥＲ２増幅乳癌腫細胞、ＨＥＲ２ ０＋／１＋ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞、ＨＥＲ２ ２＋ヒト類内膜癌細胞、ＨＥＲ２ １＋肺転移性悪性メラノーマ細胞、ＨＥＲ２ １＋ヒト子宮頸癌腫細胞、Ｈｅｒ２ １＋ヒト腎細胞癌腫細胞、またはＨＥＲ２ １＋ヒト卵巣癌腫細胞であってよい。

【0191】

抗原結合性構築物がＤＭ１にコンジュゲートしている実施形態では、腫瘍細胞は、ＨＥＲ２ １＋または２＋または３＋ヒト膵臓癌腫細胞、ＨＥＲ２ ２＋転移性膵臓癌腫細胞、ＨＥＲ２ ０＋／１＋、＋３＋ヒト肺癌腫細胞、ＨＥＲ２ ２＋ヒト白色人種細気管支肺胞上皮（ｂｒｏｎｃｈｉｏａｖｅｏｌａｒ）癌細胞、ＨＥＲ２ ０＋未分化肺癌腫、ヒト非小細胞肺癌細胞、ヒト咽頭癌腫細胞、ＨＥＲ２ ２＋ヒト舌扁平上皮癌細胞、咽頭のＨＥＲ２ ２＋舌扁平上皮癌、ＨＥＲ２ １＋または２＋ヒト結腸直腸癌腫細胞、ＨＥＲ２ ０＋、１＋または３＋ヒト胃癌腫細胞、ＨＥＲ２ １＋ヒト乳管ＥＲ＋（エストロゲン受容体陽性）癌腫細胞、ＨＥＲ２ ２＋／３＋ヒトＥＲ＋、ＨＥＲ２増幅乳癌腫細胞、ＨＥＲ２ ０＋／１＋ヒトトリプルネガティブ乳癌細胞、ＨＥＲ２ ０＋ヒト乳管癌腫（基底Ｂ、間葉様トリプルネガティブ）細胞、ＨＥＲ２ ２＋ＥＲ＋乳癌腫、ＨＥＲ２ ０＋ヒト転移性乳癌腫細胞（ＥＲ−、ＨＥＲ２増幅、ルミナルＡ、ＴＮ）、ヒト子宮中胚葉性腫瘍（混合型グレードＩＩＩ）細胞、２＋ヒト類内膜癌細胞、ＨＥＲ２ １＋ヒト皮膚類表皮癌細胞、ＨＥＲ２ １＋肺転移性悪性メラノーマ細胞、ＨＥＲ２ １＋悪性メラノーマ細胞、ヒト子宮頸部類表皮癌ｖ細胞、ＨＥＲ２ １＋ヒト膀胱癌腫細胞、ＨＥＲ２ １＋ヒト子宮頸癌腫細胞、ＨｅｒＲ２ １＋ヒト腎細胞癌腫細胞、またはＨＥＲ２ １＋、２＋または３＋ヒト卵巣癌腫細胞であってよい。

【0192】

いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、以下の細胞系の１つまたは複数であってよい：膵臓腫瘍細胞系のＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ−１、ＭｉａＰａｃａ２；肺腫瘍細胞系のＣａｌｕ−３、ＮＣＩ−Ｈ３２２；頭頚部腫瘍細胞系のＤｅｔｒｏｉｔ ５６２、ＳＣＣ−２５、ＦａＤｕ；結腸直腸腫瘍細胞系のＨＴ２９、ＳＮＵ−Ｃ２Ｂ；胃腫瘍細胞系のＮＣＩ−Ｎ８７；乳房腫瘍細胞系のＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＢＴ−２０、ＪＩＭＴ−１、ＳｋＢｒ３、ＢＴ−４７４；子宮腫瘍細胞系のＴＯＶ−１１２Ｄ；皮膚腫瘍細胞系のＭａｌｍｅ−３Ｍ；子宮頸部腫瘍細胞系のＣａｓｋｉ、ＭＳ７５１；膀胱腫瘍細胞系のＴ２４、卵巣腫瘍細胞系のＣａＯＶ３及びＳＫＯＶ３。

【0193】

抗原結合性構築物がＤＭ１にコンジュゲートしているいくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、以下の細胞系の１つまたは複数であってよい：膵臓腫瘍細胞系のＢｘＰＣ３、Ｃａｐａｎ−１、ＭｉａＰａｃａ２、ＳＷ １９９０、Ｐａｎｃ１；肺腫瘍細胞系のＡ５４９、Ｃａｌｕ−３、Ｃａｌｕ−６、ＮＣＩ−Ｈ２１２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２；頭頚部腫瘍細胞系のＤｅｔｒｏｉｔ ５６２、ＳＣＣ−１５、ＳＣＣ−２５、ＦａＤｕ；結腸直腸腫瘍細胞系のＣｏｌｏ２０１、ＤＬＤ−１、ＨＣＴ１１６、ＨＴ２９、ＳＮＵ−Ｃ２Ｂ；胃腫瘍細胞系のＳＮＵ−１、ＳＮＵ−１６、ＮＣＩ−Ｎ８７；乳房腫瘍細胞系のＳｋＢｒ３、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ―ＭＢ−１７５、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１、ＢＴ−２０、ＢＴ５４９、ＢＴ−４７４、ＣＡＭＡ−１、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＪＩＭＴ−１、Ｔ４７Ｄ；子宮腫瘍細胞系のＳＫ−ＵＴ−１、ＴＯＶ−１１２Ｄ；皮膚腫瘍細胞系のＡ４３１、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ、ＳＫＥＭＥＬ２８；子宮頸部腫瘍細胞系のＣａｓｋｉ、ＭＳ７５１；膀胱腫瘍細胞系のＴ２４、腎臓腫瘍細胞系のＡＣＨＮ；卵巣腫瘍細胞系のＣａＯＶ３、Ｏｖａｒ−３、及びＳＫＯＶ３。

【0194】

ＨＥＲ２＋肺、頭頸部、または乳房腫瘍などのＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２＋）腫瘍を有する対象を、本明細書に開示の抗原結合性構築物を投与することにより処置する方法も本明細書に記載する。いくつかの態様では、少なくとも７用量の抗原結合性構築物を受けた後の対象の腫瘍体積は、対応量のトラスツズマブを受けている対照対象の腫瘍体積より小さい。いくつかの態様では、抗原結合性構築物を受けている対象の生存期間は、対応量の非特異的対照抗体を受けている対照対象と比較して、または処置を受けていない対照対象と比較して、増加する。

【0195】

いくつかの態様では、腫瘍は、肺腫瘍であり、任意選択で腫瘍は、ＨＥＲ２低、非ＨＥＲ２遺伝子増幅である、非扁平上皮非小細胞肺腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍は、ＨＥＲ３＋である。いくつかの態様では、腫瘍は、ＥＧＦＲ低である。いくつかの態様では、腫瘍は、ＭＴＤでシスプラチンに対して中程度に感受性である。

【0196】

いくつかの態様では、腫瘍は、頭頸部腫瘍であり、任意選択で腫瘍は、ＨＥＲ２低、非ＨＥＲ２遺伝子増幅である、頭頸部の扁平上皮腫瘍である。いくつかの態様では、腫瘍は、ＨＥＲ３＋低である。いくつかの態様では、腫瘍は、ＥＧＦＲ＋である。いくつかの態様では、腫瘍は、ＭＴＤでシスプラチンに対して高感受性である。

【0197】

いくつかの態様では、腫瘍は、乳房腫瘍であり、任意選択で腫瘍は、ルミナルＢ分子分類を伴うＥＲ＋／ＰＲ−乳癌である。

【0198】

いくつかの態様では、対象は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０用量を投与される。いくつかの態様では、複数の用量の少なくとも１つの量は、少なくとも０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、複数の用量のそれぞれの量は、少なくとも０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ｍｇ／ｋｇである。いくつかの態様では、各用量は、少なくとも毎日、毎週、または毎月投与される。いくつかの態様では、各用量は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与される。いくつかの態様では、処置は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、もしくは３１日間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０週間；または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０カ月継続する。

【0199】

いくつかの態様では、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０用量を受けた後の対象の平均腫瘍体積は、対応量のトラスツズマブを受けている対照対象の平均腫瘍体積より少ない。

【0200】

いくつかの態様では、対象の全生存期間は、対応量の非特異的対照抗体を受けている対照対象と比較して、または処置を受けていない対照対象と比較して、有意に増加する。いくつかの態様では、有意性は、ログランク検定により測定される。いくつかの態様では、ｐ値は、０．５、０．０１、または０．００１未満である。

【0201】

いくつかの態様では、対象の全生存期間は、対応量のトラスツズマブを受けている対照対象と比較してより有意に増加する。いくつかの態様では、抗原結合性構築物ｐ値は、０．００１未満であり、トラスツズマブｐ値は、０．００１より大きい。

【0202】

いくつかの態様では、対応量の非特異的対照抗体を受けている対照対象に対する増加の有意性のｐ値は、対応量の非特異的対照抗体を受けている対照対象と比較して対応量のトラスツズマブを受けている第二の対照の生存期間における増加のｐ値より低い。いくつかの態様では、抗原結合性構築物ｐ値は、０．００１未満であり、トラスツズマブｐ値は、０．００１より大きい。

【0203】

いくつかの態様では、抗原結合性構築物及び追加の薬剤の組み合わせを受けた後の対象の全生存期間は、対応量のトラスツズマブ単独を受けている対照対象と比較して、有意に増加する。

【0204】

いくつかの態様では、対象の全生存期間は、より少ない量のトラスツズマブを受けている対照対象と比較して、有意に増加する。

【0205】

キット及び製品
本明細書に記載の１つまたは複数の抗原結合性構築物を含むキットも本明細書に記載する。キットの個々の構成要素は、別々の容器に包装され得、かかる容器に、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって指示された形態での注意書が付随してよく、その注意書は、製造、使用、または販売の該機関による認可を反映する。キットは、任意選択で、抗原結合性構築物の使用方法または投与レジメンを概説する説明書または指示書を含有してよい。

【0206】

キットの１つまたは複数の構成要素を、溶液、例えば、水溶液または滅菌水溶液として提供するとき、容器手段はそれ自体が、溶液をそこから対象に投与し得るか、キットの他の構成要素に適用される及びそれと混合され得る、吸入装置、シリンジ、ピペット、点眼装置、または他のかかる同様の装置であってよい。

【0207】

キットの構成要素は、乾燥形態または凍結乾燥形態で提供してもよく、キットは、凍結乾燥された構成要素の再構成に好適な溶媒を追加で含有することができる。容器の数または種類に関係なく、本明細書に記載のキットは、患者への組成物の投与を補助するための器具も含んでよい。かかる器具は、吸入装置、経鼻噴霧デバイス、シリンジ、ピペット、ピンセット、測定用スプーン、点眼装置、または同様の医学的に認められた送達ビヒクルであってよい。

【0208】

本明細書に記載の別の態様では、上記の障害の処置、予防、および／または診断に有用な材料を含有する製品を提供する。製品は、容器、及びその容器の上かまたはそれに付随するラベルまたは添付文書を含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグ等が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成されていてよい。容器は、組成物を単独で、または状態の処置、予防、および／もしくは診断に有効な別の組成物と組み合わせて保持し、滅菌アクセスポートを有してよい（例えば、容器は、皮下注射針を刺し通すことができるストッパーを有するＩＶ溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載のＴ細胞活性化抗原結合性構築物である。ラベルまたは添付文書は、組成物が、選択した状態の処置のために使用されることを示す。さらに、製品は、（ａ）その中に組成物を含有し、該組成物が本明細書に記載の抗原結合性構築物を含む、第一の容器；及び（ｂ）その中に、組成物を含有し、該組成物がさらなる細胞毒性薬剤または別の治療剤を含む、第二の容器を含んでよい。本明細書に記載のこの実施形態における製品は、組成物が特定の状態を処置するために使用することができることを示す添付文書をさらに含んでよい。あるいは、または加えて、製品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース液などの薬学的に許容され得る緩衝液を含む第二（または第三）の容器をさらに含んでよい。これは、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的立場及び使用者の立場から望ましい他の材料をさらに含んでよい。

【0209】

ポリペプチド及びポリヌクレオチド
本明細書に記載の抗原結合性構築物は、少なくとも１つのポリペプチドを含む。本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載する。抗原結合性構築物は典型的には、単離されている。

【0210】

本明細書で用いるとき、「単離された」とは、その天然細胞培養環境の構成要素から同定及び分離および／または回収されている作用物質（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を意味する。その天然環境の混入構成要素は、抗原結合性構築物の診断または治療用途に干渉するだろう物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質または非タンパク質溶質が含まれ得る。単離された、は、例えば、ヒトの介入によって合成して産生されている薬剤も指す。

【0211】

「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。すなわち、ポリペプチドを対象とする記載は、ペプチドの記載及びタンパク質の記載に等しく当てはまり、逆も同様である。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、ならびに、１個または複数個のアミノ酸残基が天然にはコードされないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で用いるとき、この用語は、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結する。

【0212】

「アミノ酸」という用語は、天然に存在する、及び天然に存在しないアミノ酸、ならびに、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされるアミノ酸は、２０種の共通アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリン）、ならびにピロリシン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち水素に結合しているａ炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基を有する化合物を指し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。かかる類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸に対する言及には、例えば、天然に存在するタンパク質構成Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、アミノ酸変異体及び誘導体などの化学的に修飾されたアミノ酸；β−アラニン、オルニチン等の天然に存在する非タンパク質構成アミノ酸；ならびにアミノ酸の特徴であると当該分野で公知の特性を有する化学的に合成された化合物が含まれる。天然に存在しないアミノ酸の例には、α−メチルアミノ酸（例えば、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖に追加のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置き換えられているアミノ酸（例えば、システイン酸）が含まれるが、これらに限定されない。本発明のタンパク質内に、非天然アミノ酸、例えば、合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、または１つもしくは複数のＤ−アミノ酸を組み込むことは、いくつかの異なる方法において有利であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ−アミノ酸含有対応物と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増加した安定性を呈する。ゆえに、Ｄ−アミノ酸を組み込むペプチド等の構築は、より大きな細胞内安定性が望まれるかまたは必要であるときに、特に有用であり得る。より具体的には、Ｄ−ペプチド等は、内因性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性があり、それにより、かかる特性が望ましいときには、ｉｎ ｖｉｖｏでの分子の改善したバイオアベイラビリティ及び寿命の長期化をもたらす。加えて、Ｄ−ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞に対する主要組織適合性複合体クラスＩＩ制限提示について効率的にプロセシングされ得ず、したがって、生体全体における体液性免疫応答を誘導する可能性が低い。

【0213】

アミノ酸は、本明細書において、それらの一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号によって言及されてよい。同様に、ヌクレオチドは、それらの一般に認められている１文字コードによって言及されてよい。

【0214】

抗原結合性構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。「ポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続するストレッチを示すことが意図されている。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、もしくは合成起源、またはそれらの任意の組み合わせであってよい。

【0215】

「核酸」という用語は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、及びそれらのポリマーを指す。具体的に限定しない限り、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。他に具体的に限定しない限り、この用語は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含むオリゴヌクレオチド類似体、つまりアンチセンス技術において使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）も指す。別段に示さない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体（限定されないが、縮重コドン置換を含む）及び相補的配列、ならびに、明示されている配列も暗に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。

【0216】

「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異体」は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指すか、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列を指す。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、及びＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。ゆえに、アラニンがコドンによって特定されているいずれの位置においても、コードされるポリペプチドを変更することなく、そのコドンを、記載されている対応するコドンのいずれかに変更することができる。かかる核酸変異は、「サイレント変異」であり、これは、保存的に修飾された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書の核酸配列はいずれも、核酸の生じ得るあらゆるサイレント変異も記載する。当業者であれば、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、及び通常、トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識するだろう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異が、それぞれ記載の配列において暗に示されている。

【0217】

アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列中の単一のアミノ酸またはアミノ酸の低いパーセンテージを変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、その変更がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似するアミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす場合に、「保存的に修飾された変異体」であることを認識するだろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に公知である。かかる保存的に修飾された変異体は、本明細書に記載の多型変異体、種間相同体、及び対立遺伝子に加えられ、それらを排除しない。

【0218】

機能的に類似するアミノ酸を提供する保存置換表は、当業者に公知である。次の８つの群はそれぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照されたい）。

【0219】

２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」または「同一」性（％）という用語は、同じである２つ以上の配列またはサブ配列を指す。配列は、以下の配列比較アルゴリズム（または当業者が利用可能な他のアルゴリズム）の１つを使用して、または手動の整列及び目視検査によって測定して、比較ウィンドウまたは指定の領域にわたって最大一致について比較及び整列したときに、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの割合（％）を有する（すなわち、特定の領域にわたって約６０％同一、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％同一である）場合に、「実質的に同一」である。この定義は、被験配列の補体も指す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって、または７５〜１００アミノ酸もしくはヌクレオチド長である領域にわたって、または特定されない場合には、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの配列全体を通して存在することができる。ヒト以外の種からの相同体を含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ライブラリを、本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはその断片を有する標識プローブでスクリーニングするステップ、及び前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡ及びゲノムクローンを単離するステップを含むプロセスによって獲得され得る。かかるハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知である。

【0220】

配列比較については、典型的に、１つの配列が基準配列として機能し、それに対して、被験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用するときには、被験及び基準配列をコンピューターに入力し、サブ配列座標を指定し、必要な場合には、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用することができ、または代替パラメータを指定することもできる。次いで、配列比較アルゴリズムが、そのプログラムパラメータに基づき、基準配列に対する被験配列の配列同一性（％）を算出する。

【0221】

「比較ウィンドウ」は、本明細書で用いるとき、２つの配列を最適に整列させた後、ある配列を、同数の連続した位置の基準配列と比較し得る２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群より選択されるいくつかの連続した位置のいずれか１つのセグメントに対する言及を含む。比較のための配列の整列方法は、当業者に公知である。比較のための最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピューター制御実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、または手動アラインメント及び目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５補遺）を参照されたい）を含むが、これらに限定されないものより実施することができる。

【0222】

配列同一性（％）及び配列類似性を決定するために好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通じて公に入手可能であり、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。（ヌクレオチド配列についての）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期設定値として、文字列長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両ストランドの比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定値として、文字列長３、期待値（Ｅ）１０、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両ストランドの比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的には、「低複雑性」フィルターをオフにして行う。

【0223】

ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計学的分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に生じ得る確率を示す。例えば、核酸は、被験核酸と基準核酸との比較において最小合計確率が約０．２未満、または約０．０１未満、または約０．００１未満である場合に、基準配列と類似しているとみなされる。

【0224】

「に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、その配列が複合混合物（総細胞またはライブラリＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない）中に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列にのみ分子が結合、二重鎖化、またはハイブリダイズすることを指す。

【0225】

「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語句は、当該分野で公知のとおりの低いイオン強度及び高温の条件下でのＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは他の核酸、またはそれらの組み合わせの配列のハイブリダイゼーションを指す。典型的には、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（総細胞またはライブラリＤＮＡまたはＲＮＡを含むがこれらに限定されない）中のその標的サブ配列にハイブリダイズし得るが、その複合混合物中の他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は配列依存性であり、状況により異なるだろう。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）において見いだされる。

【0226】

本明細書で用いるとき、「操作する、操作された、操作すること」という用語は、天然に存在するまたは組換えのポリペプチドまたはその断片のペプチド主鎖の任意の操作または翻訳後修飾を含むと考えられる。操作には、アミノ酸配列の、グリコシル化パターンの、または個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、ならびに、これらの手法の組み合わせが含まれる。操作されたタンパク質は、標準的な分子生物学の技術により発現及び産生される。

【0227】

「単離された核酸分子またはポリヌクレオチド」は、その天然環境から取り出されている核酸分子、ＤＮＡ、またはＲＮＡを意図する。例えば、ベクター中に含有されるポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは、単離されているとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種の宿主細胞中で維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶液中の（部分的に、または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドには、ポリヌクレオチド分子を通常含有する細胞中に含有されるポリヌクレオチド分子が含まれるが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子には、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのＲＮＡ転写物、さらには、ポジティブ及びネガティブ鎖形態、ならびに二本鎖形態が含まれる。本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは核酸にはさらに、合成して、例えば、ＰＣＲまたは化学合成を介して、産生されたかかる分子が含まれる。加えて、ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸には、プロモーター、リボソーム結合部位、または転写ターミネーターなどの調節エレメントが含まれる。

【0228】

「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は一般に、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏで所望のヌクレオチド配列を増幅するための方法を指す。一般に、ＰＣＲ方法は、鋳型核酸に優先的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプライマーを使用する、プライマー伸長合成の反復サイクルを必然的に含む。

【0229】

本発明の基準ヌクレオチド配列に少なくとも、例えば、９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチド配列が、基準ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドあたり５つまでの点突然変異を含み得ることを除いて、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が基準配列と同一であることが意図される。言い換えると、基準ヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、基準配列内のヌクレオチドの５％までが欠失してよいもしくは別のヌクレオチドで置換されてよく、または基準配列内の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが、基準配列内に挿入されてよい。基準配列のこれらの変更は、基準ヌクレオチド配列の５’もしくは３’末端位で、またはこれらの末端位の間のどこかで、基準配列の残基間で個々に散在するか、または基準配列内で１つもしくは複数の連続する基で生じてよい。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上記で検討したものなどの公知のコンピュータープログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）を使用して従来どおり決定することができる。

【0230】

ポリペプチドの誘導体または変異体は、その誘導体または変異体のアミノ酸配列が元のペプチドからの１００アミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する場合に、そのペプチドと「相同性」を共有しているまたは「相同」であるとされる。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかと少なくとも７５％同じである。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかと少なくとも８５％同じである。ある特定の実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、その誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも９０％同じである。いくつかの実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、その誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも９５％同じである。ある特定の実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のいずれかと少なくとも９９％同じである。

【0231】

「修飾された」という用語は、本明細書で用いるとき、所与のポリペプチドに対して成される任意の変化、例えば、ポリペプチドの長さ、ポリペプチドのアミノ酸配列、化学構造、同時翻訳修飾、または翻訳後修飾に対する変化を指す。「（修飾）」という形態の用語は、議論されているポリペプチドが任意選択で修飾される、すなわち、議論中のポリペプチドが修飾されても修飾されなくてもよいことを意味する。

【0232】

いくつかの態様では、抗原結合性構築物は、本明細書に開示の表（複数可）またはアクセッション番号（複数可）において記載する関連のあるアミノ酸配列またはその断片に少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、単離された抗原結合性構築物は、本明細書に開示の表（複数可）またはアクセッション番号（複数可）において記載する関連のあるヌクレオチド配列またはその断片に少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一であるポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む。

【0233】

本発明が、本明細書に記載の特定のプロトコル；細胞系、構築物、及び試薬に限定されず、したがって変動し得ることが理解されたい。本明細書において使用する専門用語は、具体的な実施形態を記載することのみを目的とするもので、本発明の範囲を限定することを意図しないことも理解されたい。

【0234】

本明細書において言及する刊行物及び特許はすべて、例えば、本明細書に記載の発明と関連して使用され得る、これらの刊行物において記載されている構築物及び方法を記載及び開示することを目的として、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において考察する刊行物は、本出願の出願日前にそれらを開示するためのみに提供される。本明細書に記載のいずれも、先行発明によるか、または他の何らかの理由によって、本発明者らがかかる開示に先行する権利を有さないことを承認するものと解釈されない。

【実施例】

【0235】

以下は、本発明を実行するための具体的な実施形態の例である。実施例は、例示目的のためにのみ提供され、いずれにおいても本発明の範囲を限定することを意図しない。使用される数値（例えば、量、温度、等）に関して精度が確保されるよう努めているが、多少の実験誤差及び偏差は、当然許容されるべきである。

【0236】

本発明の実践では、別段に示さない限り、当該分野内の、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を使用するだろう。かかる技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３^ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。

【0237】

実施例１：例示的な抗ＨＥＲ２二重特異性抗体及び対照の調製
いくつかの例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（または抗原結合性構築物）及び対照を下記のように調製した。抗体及び対照は、異なる形式にて調製しており、例示的な二重パラトピック形式の代表を図１に示す。図１に示す形式のすべてにおいて、ヘテロ二量体Ｆｃを、一方の鎖（鎖Ａ）を黒色で示し、他方（鎖Ｂ）を灰色で示し、一方の抗原結合性ドメイン（１）は斜線をかけて示し、他方の抗原結合性ドメイン（２）を白色で示して、図示する。

【0238】

図１Ａは、Ｆａｂ−Ｆａｂ形式の二重パラトピック抗体の構造を示す。図１Ｂ〜１Ｅは、ｓｃＦｖ−Ｆａｂ形式の二重パラトピック抗体の生じ得るバージョンの構造を示す。図１Ｂでは、抗原結合性ドメイン１はｓｃＦｖであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン２はＦａｂであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｃでは、抗原結合性ドメイン１はＦａｂであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン２はｓｃＦｖであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｄでは、抗原結合性ドメイン２はＦａｂであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン１はｓｃＦｖであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｅでは、抗原結合性ドメイン２はｓｃＦｖであり、鎖Ａに融合し、一方で抗原結合性ドメイン１はＦａｂであり、鎖Ｂに融合している。図１Ｆでは、両方の抗原結合性ドメインはｓｃＦｖである。

【0239】

以下の変異体の配列を実施例の後にある配列の表において提供する。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａ法の組み合わせを使用して同定した。領域は、同定のために使用される方法に基づいて多少変動してよい。

【0240】

例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体
例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体を、表１に示すように調製した。
（表１）例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体

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注釈
・ＥＵ抗体のナンバリングを参照するＫａｂａｔでのＥＵインデックスに従うＣＨ３ナンバリング（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９６９，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６３：７８−８５）；
・Ｋａｂａｔに従うＦａｂまたは可変ドメインナンバリング（Ｋａｂａｔ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ−ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎ°９１−３２４２，ｐ６４７（１９９１））
・「エピトープを含有するドメイン」＝抗原結合性部分が結合するＨＥＲ２のドメイン；
・「抗体名」＝抗原結合性部分が由来する抗体であり、存在するときには野生型と比較して置換を含む；
・「Ｆａｂ置換」＝正確な軽鎖対合を促進するＦａｂにおける置換；
・「ＣＨ３配列置換」＝ヘテロ二量体Ｆｃの形成を促進する、ＣＨ３ドメインにおける置換

【0241】

例示的な抗ＨＥＲ２一価対照抗体
ｖ１０４０：一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上のトラスツズマブから誘導されたＦａｂであり、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域は、突然変異Ｃ２２６Ｓを有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。

【0242】

ｖ６３０−一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上のトラスツズマブから誘導されたｓｃＦｖであり、Ｆｃ領域は、突然変異Ｌ３５１Ｙ＿Ｓ４００Ｅ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３６６Ｉ＿Ｎ３９０Ｒ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり；ヒンジ領域は、両方の鎖に突然変異Ｃ２２６Ｓ（ＥＵナンバリング）を有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。

【0243】

ｖ４１８２：一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上のペルツズマブから誘導されたＦａｂであり、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域は、突然変異Ｃ２２６Ｓを有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン２に結合する。

【0244】

例示的な抗ＨＥＲ２単一特異性二価抗体対照（フルサイズ抗体、ＦＳＡ）
ｖ５０６は、対照として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において自家産生された野生型抗ＨＥＲ２である。両方のＨＥＲ２結合性ドメインは、Ｆａｂ形式でトラスツズマブから誘導され、Ｆｃは、野生型ホモ二量体であり；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。この抗体は、トラスツズマブ類似体とも称される。

【0245】

ｖ７９２は、ＩｇＧ１ヒンジを伴う野生型トラスツズマブであり、ここで両方のＨＥＲ２結合性ドメインは、Ｆａｂ形式でトラスツズマブから誘導され、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。この抗体は、トラスツズマブ類似体とも称される。

【0246】

ｖ４１８４は、二価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここで両方のＨＥＲ２結合性ドメインは、Ｆａｂ形式でペルツズマブから誘導され、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖを鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを鎖Ｂに有するヘテロ二量体である。抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン２に結合する。この抗体は、ペルツズマブ類似体とも称される。

【0247】

ｈＩｇＧは、市販の非特異的ポリクローナル抗体対照である（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃００９−０００−００３）。

【0248】

これらの抗体及び対照（ヒトＩｇＧ以外）を以下のようにクローニングし発現させた。抗体重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を、ヒト／哺乳類発現に最適化されたコドンを使用する遺伝子合成を介して構築した。トラスツズマブＦａｂ配列は、公知のＨＥＲ２／ｎｅｕドメイン４結合性抗体から生成した（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ ｐ１８５ ＨＥＲ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８９，４２８５）。Ｆｃは、ＩｇＧ１アイソタイプであった。ｓｃＦｖ配列は、グリシン−セリンリンカーを使用してトラスツズマブのＶＨ及びＶＬドメインから生成した（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｎｔｉ ｐ１８５ ｈｅｒ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８９，４２８５）。ペルツズマブＦａｂ配列は、公知のＨＥＲ２／ｎｅｕドメイン２結合性抗体から生成した（Ａｄａｍｓ ＣＷ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｈｅｒ ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００６；５５（６）：７１７−２７）。

【0249】

最終遺伝子産物を、哺乳類発現ベクターＰＴＴ５（ＮＲＣ−ＢＲＩ、カナダ）へとサブクローニングし、ＣＨＯ細胞にて発現させた（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ，Ｙ．，Ｐｅｒｒｅｔ，Ｓ．＆ Ｋａｍｅｎ，Ａ．Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ−ｇｒｏｗｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０，ｅ９（２００２））。

【0250】

ＣＨＯ細胞を、指数増殖期（１．５〜２百万個の細胞／ｍｌ）において、２．５：１のＰＥＩ：ＤＮＡ比で１ｍｇ／ｍｌ ２５ｋＤａポリエチレンイミン水溶液（ＰＥＩ、ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）でトランスフェクトした（Ｒａｙｍｏｎｄ Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．５５（１）：４４−５１（２０１１））。ヘテロ二量体の形成に最適な濃度範囲を決定するために、ＤＮＡを、ヘテロ二量体形成を可能にする重鎖（ＨＣ−Ａ）、軽鎖（ＬＣ）、及び重鎖Ｂ（ＨＣ−Ｂ）の最適なＤＮＡ比にてトランスフェクトした（例えば、ＨＣ−Ａ／ＨＣ−Ｂ／ＬＣ比＝３０：３０：４０（ｖ５０１９）。トランスフェクトした細胞を５〜６日後に回収し、培養培地は４０００ｒｐｍで遠心分離した後に収集し、０．４５μｍフィルターを使用して清澄化した。

【0251】

清澄化した培養培地を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテイン−Ａカラムにロードし、１０カラム体積のｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。抗体を、１０カラム体積のｐＨ３．６のクエン酸塩緩衝液で溶出し、抗体を含有するプールした画分をｐＨ１１のＴＲＩＳで中和した。

【0252】

プロテイン−Ａ抗体溶出液を、ゲルろ過（ＳＥＣ）によりさらに精製した。ゲルろ過については、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、１ｍＬ／分の流速でＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣを介してロードした。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を、１ｍＬ／分の流速で使用した。精製抗体に対応する画分を収集し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。

【0253】

異なる分子形式（例えば、ｖ６７１７、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ ＩｇＧ１；ｖ６９０３及びｖ６９０２ Ｆａｂ−Ｆａｂ ＩｇＧ１；ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ ＩｇＧ１）を有する例示的な抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２×ＥＣＤ４二重パラトピック抗体を上記のようにクローニングし、発現させ、精製した。

【0254】

抗体純度を定量し、標的ヘテロ二量体タンパク質ならびに生じ得るホモ二量体および／または半抗体および／または誤対合した軽鎖混入物の量を決定するために、ＬＣ−ＭＳインタクト質量分析を行った。ＬＣ−ＭＳインタクト質量分析は、ＡＤＣ分子のために使用されるＤＡＲ分析計算を除いて、実施例２に記載のように行った。

【0255】

データを表２に示す。表２は、これらの二重パラトピック抗体の発現及び精製が、ｖ６７１７では所望の生成物の１００％を、ｖ６９０３では所望のヘテロ二量体生成物の９１％を、そしてｖ６９０２では所望の生成物の６２％をもたらしたことを示す。括弧内の数字は、メインピークと＋８１Ｄａのサイドピークの合計量を示す。このサイドピークは、典型的には、Ｃ末端ＨＡタグを含有する変異体（ｖ６９０３及びｖ６９０２など）で検出される。メイン及びサイドピークを加えることで、ｖ６９０３及びｖ６９０３でおおよそ９８％及び６７％のヘテロ二量体純度が得られる。高いヘテロ二量体純度に基づき、ｖ６９０３を、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−ｓｃＦｖ形式に対する直接比較のための代表的なＦａｂ−Ｆａｂ抗ＨＥＲ２二重パラトピック変異体と同定した。ｖ６９０３を、すべての形式比較アッセイに含んだ。
（表２）抗体の発現及び精製

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【0256】

実施例２：例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の調製
以下の抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体薬物コンジュゲート（抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ）を調製した。変異体５０１９、７０９１、１００００及び５０６のＡＤＣを調製した。これらのＡＤＣは以下のように同定される：
ｖ６３６３（ＤＭ１にコンジュゲートしたｖ５０１９）
ｖ７１４８（ＤＭ１にコンジュゲートしたｖ７０９１）
ｖ１０５５３（ＤＭ１にコンジュゲートしたｖ１００００）
ｖ６２４６（ＤＭ１にコンジュゲートしたｖ５０６、Ｔ−ＤＭ１、トラスツズマブ−エムタンシンに対する類似体）
ｖ６２４９（ＤＭ１にコンジュゲートしたヒトＩｇＧ）

【0257】

ＡＤＣを、マイタンシンへの直接カップリングを介して調製した。実施例１に記載のように、プロテインＡ及びＳＥＣにより精製した抗体（９５％を超える純度）を、ＡＤＣ分子の調製において使用した。ＡＤＣを、Ｋｏｖｔｕｎ ＹＶ，Ａｕｄｅｔｔｅ ＣＡ，Ｙｅ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｅｒａｄｉｃａｔｅ ｔｕｍｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎｄ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｇｅｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００６；６６：３２１４−２１に記載の方法に従ってコンジュゲートした。ＡＤＣは、ＬＣ／ＭＳに決定される及び以下に記載のように、抗体あたり３．０マイタンシノイド分子の平均モル比を有した。

【0258】

ＡＤＣコンジュゲーション反応において使用される試薬の詳細は以下のとおりである：コンジュゲーション緩衝液１：５０ｍＭリン酸カリウム／５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．５、２ｍＭ ＥＤＴＡ。コンジュゲーション緩衝液２：５０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．０。ＡＤＣ製剤緩衝液：２０ｍＭコハク酸ナトリウム、６％（ｗ／ｖ）トレハロース、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ５．０。ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）；１０ｍＭ ＳＭＣＣを含むＤＭＡ（コンジュゲーション前に調製）、１０ｍＭ ＤＭ１−ＳＨを含むＤＭＡ（コンジュゲーション前に調製）、１ｍＭ ＤＴＮＢを含むＰＢＳ、１ｍＭシステインを含む緩衝液、２０ｍＭコハク酸ナトリウム、ｐＨ５．０。ＵＶ−ＶＩＳ分光光度計（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ １００）、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。

【0259】

ＡＤＣは、以下のように調製した。出発抗体溶液を、ＰＤ−１０カラムにロードしたが、これは予め２５ｍＬのコンジュゲーション緩衝液１で平衡化し、その後０．５ｍｌコンジュゲーション緩衝液１をロードした。抗体溶出液を収集し、濃度をＡ_２８０で測定し、濃度を２０ｍｇ／ｍＬに調節した。１０ｍＭ ＳＭＣＣ−ＤＭ１溶液を含むＤＭＡを調製した。抗体に対して７．５モル当量のＳＭＣＣ−ＤＭ１を、抗体溶液に加え、ＤＭＡを１０％ｖ／ｖの最終ＤＭＡ体積まで加えた。反応物を短時間混合し、室温にて２時間インキュベートした。第二のＰＤ−１０カラムを２５ｍｌのコンジュゲーション緩衝液１で平衡化し、抗体−ＭＣＣ−ＤＭ１溶液、その後０．５ｍｌの緩衝液１をカラムに加えた。抗体−ＭＣＣ−ＤＭ１溶出液を収集し、抗体溶液のＡ_２５２及びＡ_２８０を測定した。抗体−ＭＣＣ−ＤＭ１濃度を算出した（□＝１．４５ｍｇ^−１ｃｍ^−１、または２１７５００Ｍ^−１ｃｍ^−１）。ＡＤＣを、高分子量分析のためにＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムで分析した（ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム ＴＯＳＯＨ、Ｇ３０００−ＳＷＸＬ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ、緩衝液、１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０、流速：１ｍｌ／分）。

【0260】

ＡＤＣ薬物対抗体比（ＤＡＲ）を、ＨＩＣ−ＨＰＬＣによりＴｏｓｏｈ ＴＳＫ ｇｅｌ Ｂｕｔｙｌ−ＮＰＲカラム（４．６ｍｍ×３．５ｍｍ×２．５ｍｍ）を使用して分析した。溶出は、１ｍｌ／分で行い、これには、２５分間にわたり１０〜９０％緩衝液Ｂ、その後４分間１００％緩衝液Ｂの勾配を使用した。緩衝液Ａは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０を含む。緩衝液Ｂは、２０ｍＭリン酸ナトリウム、２５％ｖ／ｖイソプロパノール、ｐＨ７．０を含む。

【0261】

ＡＤＣ薬物対抗体比（ＤＡＲ）を、ＬＣ−ＭＳにより以下の方法により決定した。抗体を、ＰＮＧａｓｅ Ｆで脱グリコシル化してからＬＣ−ＭＳにロードした。液体クロマトグラフィーをＡｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズＨＰＬＣで以下の条件下で実行した：

【0262】

流速：１ｍＬ／分をポストカラムでＭＳのために１００ｕＬ／分に分流。溶媒：Ａ＝０．１％ギ酸を含むｄｄＨ２Ｏ、Ｂ＝６５％アセトニトリル、２５％ＴＨＦ、９．９％ｄｄＨ２０、０．１％ギ酸。カラム：２．１×３０ｍｍ ＰｏｒｏｓＲ２。カラム温度：８０℃；溶媒も予め加熱。勾配：２０％Ｂ（０〜３分）、２０〜９０％Ｂ（３〜６分）、９０〜２０％Ｂ（６〜７分）、２０％Ｂ（７〜９分）。

【0263】

続けて、質量分析（ＭＳ）をＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析計で以下の条件下で実行した：イオンマックスエレクトロスプレーを使用するイオン化方法。較正及び調整方法：２ｍｇ／ｍＬ溶液のＣｓＩを１０μＬ／分の流速で注入する。Ｏｒｂｉｔｒａｐをｍ／ｚ ２２１１に調整し、これには自動チューニング機能を使用した（観察された全ＣｓＩイオン範囲：１６９０〜２８００）。コーン電圧：４０Ｖ；チューブレンズ：１１５Ｖ；ＦＴ分解能：７，５００；走査範囲ｍ／ｚ４００−４０００；走査遅延：１．５分。データの分子量プロファイルを、ＴｈｅｒｍｏのＰｒｏｍａｓｓ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎソフトウェアを用いて生成した。試料の平均ＤＡＲを、各画分ピークで観察されたＤＡＲの関数として決定した（計算式：Σ（ＤＡＲ×画分ピーク強度）を使用）。

【0264】

表３は、ＡＤＣ分子の平均ＤＡＲをまとめる。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び対照の平均ＤＡＲは、おおよそ３であった。
（表３）ＡＤＣの平均ＤＡＲ

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【0265】

実施例３：抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の発現及びベンチスケール精製
実施例１に記載の抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００）を、１０および／または２５Ｌ体積にて発現させ、以下のようにプロテインＡ及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。

【0266】

清澄化した培養培地を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテイン−Ａカラムにロードし、１０カラム体積のｐＨ７．２のＰＢＳ緩衝液で洗浄した。抗体を１０カラム体積のｐＨ３．６のクエン酸塩緩衝液で溶出し、抗体を含有するプールした画分を、ｐＨ１１のトリスで中和した。

【0267】

プロテイン−Ａ抗体溶出液を、ゲルろ過（ＳＥＣ）によりさらに精製した。ゲルろ過については、３．５ｍｇの抗体混合物を１．５ｍＬに濃縮し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ ２００ ＨｉＬｏａｄ １６／６００ ２００ｐｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、ＡＫＴＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＦＰＬＣを介して１ｍＬ／分の流速でロードした。ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液を１ｍＬ／分の流速で使用した。精製抗体に対応する画分を収集し、約１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。精製タンパク質を、実施例２に記載のようにＬＣ−ＭＳによって分析した。

【0268】

１０Ｌ発現ならびにベンチスケールでのプロテインＡ及びＳＥＣ精製の結果を図２Ａ及び２Ｂに示す。図２Ａは、プロテインＡ精製ｖ５０１９のＳＥＣクロマトグラフを示し、図２Ｂは、プロテインＡプールした画分、さらにはＳＥＣ画分１５及び１９ならびにプールしたＳＥＣ画分１６〜１８の相対純度を比較する非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。これらの結果は、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が発現されたこと、及びプロテインＡ及びＳＥＣによる精製が純粋なタンパク質試料をもたらしたことを示す。さらなる定量を、ＵＰＬＣ−ＳＥＣ及びＬＣ−ＭＳ分析により行い、実施例４に記載する。

【0269】

２５Ｌ発現及びベンチスケールでのプロテインＡ精製の結果を、図２Ｃに示す。図２Ｃは、プロテインＡ精製ｖ１００００の相対純度を比較するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーンＭは、タンパク質マーカーを含有し；レーン１は、還元条件下のｖ１００００を含有し；レーン２は、非還元条件下のｖ１００００を含有する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ｖ１００００が純粋であり、非還元条件下でおおよそ１２５ｋＤａの補正予測分子量で泳動することを示す。還元条件下では、ＣＨ−Ａ重鎖（おおよそ４９ｋＤａ）及びＣＨ−Ｂ重鎖（おおよそ５２．５ｋＤａ）に相当する２つの重鎖バンドが可視であり；ＣＨ−Ａ軽鎖は可視であり、これは、おおよそ２３．５ｋＤａの補正予測質量で泳動する。これらの結果は、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が発現されること、及びプロテインＡによる１ステップ精製が純粋なタンパク質試料をもたらすことを示す。さらなる定量は、ＵＰＬＣ−ＳＥＣ及びＬＣ−ＭＳ分析により行い、実施例４に記載する。

【0270】

実施例４：ＵＰＬＣ−ＳＥＣ及びＬＣ−ＭＳによる二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体純度の分析
例示的なプロテインＡ及びＳＥＣ精製二重パラトピック抗ＨＥＲ２ヘテロ多量体の純度及び凝集率（％）を、記載の方法によりＵＰＬＣ−ＳＥＣにより決定した。

【0271】

ＵＰＬＣ−ＳＥＣ分析を、３０℃に設定したＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラム（２．５ｍＬ、４．６×１５０ｍｍ、ステンレス鋼、１．７μｍ粒子）を使用して０．４ｍｌ／分で行った。泳動時間は７分で、注射１回当たりの総体積は２．８ｍＬであり、これは２５ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ７．１；及び１５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．４〜７．１の泳動緩衝液を伴う。吸光度による検出は１９０〜４００ｎｍで促進され、蛍光による検出は２８０ｎｍで励起し、発光を３００〜３６０ｎｍで収集した。ピーク積分をＥｍｐｏｗｅｒ ３ソフトウェアによって分析した。

【0272】

プールしたｖ５０１９ ＳＥＣ画分のＵＰＬＣ−ＳＥＣ結果を図３Ａに示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、プロテインＡ及びＳＥＣクロマトグラフィーによって１％未満の高分子量種を伴って９９％を超える純度まで精製されたことを示す。

【0273】

ｖ１００００のプールしたプロテインＡ画分のＵＰＬＣ−ＳＥＣ結果を図３Ｂに示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、プロテインＡクロマトグラフィーによって１％未満の高分子量種を伴って９６％を超える純度まで精製されたことを示す。

【0274】

例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の純度を、実施例２に記載する方法によって、標準的な条件下でＬＣ−ＭＳを使用して決定した。ｖ５０１９のプールしたＳＥＣ画分のＬＣ−ＭＳ分析からの結果を図４Ａに示す。このデータは、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２ヘテロ二量体が１００％のヘテロ二量体純度を有することを示す。ｖ１００００のプールしたプロテインＡ画分のＬＣ−ＭＳ分析からの結果を図４Ｂに示す。このデータは、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２ヘテロ二量体が、１ステッププロテインＡ精製後に、９８％のヘテロ二量体純度を有することを示す。

【0275】

プロテインＡクロマトグラフィーならびに／またはプロテインＡ及びＳＥＣによって精製された抗体を、以下の実施例に記載のアッセイのために使用した。

【0276】

実施例５．プロテインＡ及びＣＥＸクロマトグラフィーによって精製された二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の大規模発現及び製造可能性の評価
実施例１に記載の例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体ｖ５０１９を２５Ｌ規模で発現させ、以下のように精製した。

【0277】

抗体を上清から獲得し、その後、記載のプロトコルによるプロテインＡ精製（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）樹脂；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続く、カチオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ ＦＦ樹脂；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からなる２ステップ精製方法を行った。

【0278】

ＣＨＯ−３Ｅ７細胞を、オービタルシェーカー（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ペンシルベニア州チェスター）上、３７℃、５％ＣＯ２で三角フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃ．，マサチューセッツ州アクトン）中、無血清Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ＣＨＯ発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、カリフォルニア州カールスバッド）中にて、維持した。トランスフェクションの２日前に、細胞を適切な密度で、５０Ｌ ＣｅｌｌＢａｇ内に２５Ｌの体積で播種し、これにはＷａｖｅ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ ２０／５０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ）を使用した。トランスフェクションの当日に、ＤＮＡ及びＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ、エッペルハイム）を、最適な比率で混合し、実施例１に記載の方法を使用して細胞に加えた。６日目に収集した細胞上清をさらなる精製のために使用した。

【0279】

細胞培養ブロスを遠心し、濾過してから、１０．０ｍＬ／分で、ＸＫ２６／２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン、ウプサラ）に充填された３０ｍＬ Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ（商標）樹脂上にロードした。適切な緩衝液で洗浄及び溶出した後に、画分を収集し、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）で中和した。標的タンパク質を、ＸＫ１６／２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン、ウプサラ）に充填された２０ｍＬ ＳＰ ＦＦ樹脂を介してさらに精製した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）精製試料を、２０ｍＭ ＮａＡＣ、ｐＨ５．５で希釈して、伝導性を５ｍｓ／ｃｍ未満に調節し、５０ｍＭクエン酸（ｐＨ３．０）を加え、試料ｐＨ値を５．５に調節した。試料を、１ｍＬ／分でＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ ＦＦ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードし、２０ｍＭ ＮａＡＣで洗浄した。タンパク質を、１ｍＬ／分で、０〜１００％の２０ｍＭ ＮａＡＣ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５、１０ＣＶの勾配溶出を使用して溶出した。

【0280】

精製タンパク質を、実施例１に記載のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び実施例４に記載の方法によるヘテロ二量体純度に関するＬＣ−ＭＳによって分析した。結果を、図５Ａ及び５Ｂに示す。図５Ａは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ ＦＦ精製後のｖ５０１９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示し：レーンＭはタンパク質マーカーを含有する；レーン１：還元条件下でのｖ５０１９（３μｇ）；レーン２：非還元条件下のｖ５０１９（２．５μｇ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、ｖ５０１９が、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ ＦＦ精製後に相対的に純粋であり、非還元条件下で、おおよそ１２５ｋＤａの補正予測分子量で泳動することを示す。還元条件下では、ＣＨ−Ａ重鎖（おおよそ４９ｋＤａ）及びＣＨ−Ｂ重鎖（おおよそ５２．５ｋＤａ）に対応する２つの重鎖バンドが可視であり；ＣＨ−Ａ軽鎖は可視であり、これは、おおよそ２３．５ｋＤａの補正予測質量で泳動する。

【0281】

ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ ＦＦ精製したｖ５０１９のＬＣ−ＭＳ分析を行って、実施例４に記載の方法を使用してヘテロ二量体純度を決定した。ＬＣ−ＭＳ分析からの結果を、図５Ｂに示す。これらの結果は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）及びＨｉＴｒａｐ（商標）ＳＰ ＦＦを使用するｖ５０１９精製が、９９％超のヘテロ二量体純度及び少量（１％未満）または検出不可能なホモ二量体または半抗体混入を伴うタンパク質をもたらすことを示す。

【0282】

実施例６：低レベルから高レベルのＨＥＲ２を発現する細胞系における、対照のＢｍａｘに対する二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体のＢｍａｘの比較
以下の実験を、対照との比較において、様々なレベルのＨＥＲ２を発現する細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を測定するために行った。使用した細胞系は、ＳＫＯＶ３（ＨＥＲ２ ２＋／３＋）、ＪＩＭＴ−１（ＨＥＲ２ ２＋）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＨＥＲ２ ０／１＋）、及びＭＣＦ７（ＨＥＲ２ １＋）であった。検査した二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体には、ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００が含まれる。ＨＥＲ２発現（ＨＥＲ２＋）細胞に結合する二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力は、下記のように決定され、Ｂ_ｍａｘ及び見かけのＫ_Ｄ（平衡解離定数）の具体的な測定を伴った。

【0283】

ＨＥＲ２＋細胞の表面への被験抗体の結合をフローサイトメトリーにより決定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１×１０^５細胞／１００μｌでＤＭＥＭに再懸濁した。細胞懸濁液１００μｌを、各微量遠心管内に加え、続いて、１０μｌ／管の抗体変異体を加えた。これらの管を、回転器上、４℃で２時間インキュベートした。微量遠心管を、２分間２０００ＲＰＭで室温にて遠心し、細胞ペレットを５００μｌ培地で洗浄した。各細胞ペレットを再懸濁し、１００μｌのフルオロクロム標識された二次抗体を培地中に２μｇ／試料まで希釈した。試料を、次いで、１時間４℃にて回転器上でインキュベートした。インキュベーション後に、細胞を２分間２０００ｒｐｍで遠心分離し、培地にて洗浄した。細胞を５００μｌ培地に再懸濁し、５μｌヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する管に濾過し、製造元指示書に従ってＢＤ ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーターで分析した。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２ヘテロ二量体抗体及び対照抗体のＫ_Ｄを、データ分析及び曲線フィッティングをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにて行ってＦＡＣＳにより評価した。

【0284】

結果を図６Ａ〜６Ｇに示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較しておおよそ１．５倍高いＢｍａｘで、ＨＥＲ２＋細胞に結合することができることを実証する。図６Ａ〜６Ｇにおける結果は、二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）が、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較して同様のＢｍａｘで、ＨＥＲ２＋細胞に結合することができることも示す。

【0285】

ＨＥＲ２＋ＳＫＯＶ３細胞（ＨＥＲ２ ２／３＋）での結合結果を、図６Ａ、６Ｅ、ならびに表４及び表５に示す。図６Ａ及び表４における結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、２種の異なる抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６またはｖ４１８４）と比較して、ＳＫＯＶ３細胞への結合においておおよそ１．５倍高いＢｍａｘを表すことを示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較して同等のＢｍａｘを表すことも示す。ＳＫＯＶ３への結合についてのｖ５０１９の見かけのＫ_Ｄは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ単独（ｖ５０６またはｖ４１８４）、または２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）のいずれかと比較しておおよそ２〜４倍高かった。
（表４）ＳＫＯＶ３細胞への結合

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【0286】

図６Ｅ及び表５における結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、７０９１、及びｖ１００００）が、２種の異なる抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６またはｖ４１８４）と比較して、ＳＫＯＶ３細胞への結合においておおよそ１．５〜１．６倍高いＢｍａｘを表すことを示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、７０９１、及びｖ１００００）が、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較して同等のＢｍａｘを表すことも示す。ＳＫＯＶ３への結合についてのｖ５０１９、ｖ７０９１、ｖ１００００、及び２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）の見かけのＫ_Ｄは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ単独（ｖ５０６またはｖ４１８４）のいずれかと比較しておおよそ２〜３倍高かった。
（表５）ＳＫＯＶ３への結合

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【0287】

ＪＩＭＴ−１細胞系（ＨＥＲ２ ２＋）における結合曲線を図６Ｂ及び表６に示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較して、ＪＩＭＴ−１細胞への結合においておおよそ１．５倍高いＢｍａｘを表すことを示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較して同等のＢｍａｘを表すことも示す。ＪＩＭＴ−１への結合についてのｖ５０１９の見かけのＫ_Ｄは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較しておおよそ２倍高く、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較して同様であった（おおよそ１．２倍高い）。
（表６）ＪＩＭＴ−１細胞への結合

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【0288】

ＭＣＦ７細胞系（ＨＥＲ２ １＋）における結合曲線を、図６Ｃ、６Ｆ、ならびに表７及び８に示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、７０９１、及びｖ１００００）が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較して、ＭＣＦ７細胞への結合においておおよそ１．５倍高いＢｍａｘを表すことを示す。図６Ｃにおける結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較して同等のＢｍａｘを表すことも示す。ＭＣＦ７への結合についてのｖ５０１９の見かけのＫ_Ｄは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）及び２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と同様であった。
（表７）ＭＣＦ７細胞への結合

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図６Ｆ及び表８における結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）が、ＦＳＡ単一特異性ｖ５０６と比較しておおよそ１．６〜１．７倍大きいＢｍａｘを表すことを示す。ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００の見かけのＫ_Ｄは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と同様であった。
（表８）ＭＣＦ７細胞への結合

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【0289】

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系（ＨＥＲ２ ０／１＋）における結合曲線を、図６Ｄ及び表９に示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への結合においておおよそ１．５倍高いＢｍａｘを表すことを示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較して同等のＢｍａｘを表すことも示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１への結合についてのｖ５０１９の見かけのＫ_Ｄは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較しておおよそ２．４倍低く、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較しておおよそ１．７倍高かった。
（表９）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞への結合

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【0290】

ＷＩ−３８肺繊維芽細胞細胞系における結合曲線を、図６Ｇ及び表１０に示す。ＷＩ−３８細胞系は、基底レベルのＨＥＲ２（ＨＥＲ２ ０＋、約１０，０００受容体／細胞）を発現する正常な肺上皮である（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９２，ＰＮＡＳ，８９：４２８５−４２８９；Ｙａｒｄｅｎ ２０００，ＨＥＲ２：Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ）。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、ｖ１００００）が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較して、ＷＩ−３８細胞への結合において同等の細胞表面装飾（Ｂｍａｘ）を呈することを示す；しかしながら、ｖ５０６への結合が、飽和に達するようには見えず、ゆえにＫＤを決定することができなかったことに留意されたい。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体間での見かけのＫ_Ｄは同等であった。
（表１０）ＷＩ−３８細胞への結合

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【0291】

これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲ２ １＋、２＋、及び３＋腫瘍細胞に、抗ＨＥＲ２単一特異性ＦＳＡよりもおおよそ１．５〜１．６倍高いレベルで結合することができること、及び例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲ２ １＋、２＋、及び３＋腫瘍細胞に、異なるエピトープ特異性を有する２種の固有の単一特異性抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせと比較して同等のレベルで結合することができることを示す。これらの結果は、二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体がおおよそ１０，０００以下のＨＥＲ２受容体／細胞を発現する基底ＨＥＲ２発現細胞への結合の増加（すなわち、単一特異性抗ＨＥＲ２抗体、ｖ５０６と比較して）を示さないこと、及びＨＥＲ２受容体レベルがおおよそ１０，０００受容体／細胞を超えるときに、二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体への細胞表面結合の増加に関して閾値が生じることを示す。このデータに基づき、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体は、ＨＥＲ２ ３＋、２＋、及び１＋腫瘍細胞への細胞表面結合を増加させ得るが、おおよそ１０，０００受容体以下でＨＥＲ２受容体の基底レベルを発現する非腫瘍細胞への細胞表面結合は増加させないであろうことが予測されるだろう。

【0292】

実施例７：ＨＥＲ２＋細胞の増殖を阻害する二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力
３＋及び２＋レベルでＨＥＲ２を発現する細胞の増殖を阻害する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を測定した。実験を、ＨＥＲ２ ３＋細胞系のＢＴ−４７４、ＳＫＢｒ３、ＳＫＯＶ３、及びＨＥＲ２ ２＋ＪＩＭＴ−１で実施した。二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体のｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００を検査した。ＢＴ−４７４細胞（２００ｎＭ抗体）；ＳＫＯＶ３、ＳＫＢｒ３、及びＪＩＭＴ−１細胞（３００ｎＭ抗体）の増殖を阻害する二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を下記のように測定した。

【0293】

被験抗体を培地中に希釈し、細胞に１０μｌ／ウェルで、三重で添加した。プレートを３日間３７℃でインキュベートした。細胞生存力を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ＃ ｄａｌ１１００）またはＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）のいずれかを使用して測定し、製造元の指示書に従って吸光度を読み取った。データを未処置対照に対して正規化し、分析をＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍにて行った。

【0294】

増殖阻害結果を図７Ａ〜Ｅに示す。結果の概要を表１１Ａ及び１１Ｂに提示する。結果の図７Ａ〜Ｂ及び表１１Ａは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック（ｖ５０１９）が、ＨＥＲ２＋ＳＫＯＶ３及びＢＴ−４７４細胞系の増殖阻害が可能であることを示す。図１０Ａは、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較したときに、及び２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ抗体の組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較したときに、ＳＫＯＶ３の最大増殖阻害を媒介したことを示す。
（表１１Ａ）ＨＥＲ２ ３＋癌細胞の増殖阻害

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【0295】

図７Ｃ〜Ｅ及び表１１Ｂの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）がＨＥＲ２ ３＋ＳＫＢＲ３、ＨＥＲ２ ２＋／３＋ＳＫＯＶ３、及びＨＥＲ２ ２＋ＪＩＭＴ−１腫瘍細胞系の増殖を阻害することができることを示す。図７Ｃは、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体ｖ７０９１及びｖ１００００が、ＨＥＲ２ ３＋ＳＫＢｒ３乳房腫瘍細胞の最大増殖阻害を媒介したことを示す。図７Ｄは、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ７０９１及びｖ１００００）が、ＨＥＲ２ ３＋ＳＫＯＶ３卵巣腫瘍細胞の最大増殖阻害を媒介したことを示す。図７Ｅは、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ７０９１及びｖ１００００）が、ＨＥＲ２ ２＋Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ耐性ＪＩＭＴ−１腫瘍細胞の最大増殖阻害を媒介したことを示す。検査したすべての細胞系において、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ７０９１及びｖ１００００）は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ単一特異性抗体（ｖ５０６）と比較して高い増殖阻害を媒介した。
（表１１Ｂ）ＨＥＲ２ ３＋癌細胞の増殖阻害

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【0296】

これらの結果は、二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の例示的な飽和濃度が、ＨＥＲ２ ３＋及び２＋乳房及び卵巣腫瘍細胞、ならびにＨＥＲ２ ２＋トラスツズマブ耐性腫瘍細胞を、ＦＳＡ抗ＨＥＲ２単一特異性抗体よりもおおよそ２０％高く増殖阻害することができることを示す。

【0297】

実施例８：ＨＥＲ２ ＥＣＤと比較した、二量体ＨＥＲ２への二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体のパラトープの優先的結合
この実験は、膜結合ＨＥＲ２（ＨＥＲ２−Ｆｃ）及びｓｈｅｄ ＨＥＲ２ ＥＣＤの間の結合差異の代理としての二量体ＨＥＲ２及びＨＥＲ２ ＥＣＤに結合する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の個々のパラトープの能力を決定するために行った。実験は、以下のように実施した。

【0298】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析：ＨＥＲ２細胞外ドメイン（ｓＨＥＲ−２、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＢＭＳ３６２、＿完全長タンパク質のアミノ酸２３〜６５２をコードする）及びＨＥＲ２−Ｆｃ（細胞外ドメインのアミノ酸１〜６５２をコードする二量体ＨＥＲ２−Ｆｃ融合体；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．，１０００４−Ｈ０２Ｈ）への結合に関する一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ１０４０またはｖ４１８２）の親和性をＳＰＲによりＢｉａｃｏｒｅからのＴ２００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して測定した。ＨＥＲ２ ＥＣＤへの結合は、以下の方法により決定した。１０ｍｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ６．８中のＨＥＲ２ ＥＣＤを、４４ＲＵ（応答単位）のレベルまでアミンカップリングを通してＣＭ５チップ上に固定化した。一価抗ＨＥＲ２抗体を、０．７６〜６０ｎＭの範囲の濃度でＨＥＲ２固定化チップの表面上を通過させた。ＨＥＲ２−Ｆｃへの結合は、以下の方法により決定した。１０ｍｍ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ６．８中のＨＥＲ２−Ｆｃを、４３ＲＵのレベルまでアミンカップリングを通してＣＭ５チップ上に固定化した。一価抗ＨＥＲ２抗体を、０．７６〜６０ｎＭの範囲の濃度でＨＥＲ２固定化チップの表面上を通過させた。抗体濃度を、三重で結合について分析した。平衡解離結合定数（Ｋ_Ｄ）及び反応速度（ｋａ及びｋｄ）を、単一サイクル反応速度法を使用して決定した。センソグラム（ｓｅｎｓｏｇｒａｍ）を、１：１のラングミュア結合モデルに全体的に当てはめた。すべての実験は、室温にて実施した。

【0299】

結果は、図８Ａ、図８Ｂ、表１１Ｃ及び表１１Ｄに示す。図８Ａ及び表１１Ｃの結果は、一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ１０４０；例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のＣＨ−Ｂ上の抗原結合性ドメインを表す）のＳＰＲ結合データを示す。図８Ａは、固定化ＨＥＲ２ ＥＣＤまたはＨＥＲ２−Ｆｃへのｖ１０４０結合のＫ_Ｄ値（ｎＭ）を図示しており、一価抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲ２−Ｆｃに対する結合について、ＨＥＲ２ ＥＣＤと比較して低いＫ_Ｄを有することを示す。表１１Ｃは、ＨＥＲ２ ＥＣＤ及びＨＥＲ２−ＦＣ（「ＨＥＲ２ ｍｅｍ」）への結合における、フルサイズ抗ＨＥＲ２抗体（ＦＳＡ）と比較した一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ）のｋａ（１／Ｍｓ）及びｋｄ（１／ｓ）値を示す。このデータは、ＨＥＲ２ ＥＣＤ及びＨＥＲ２−ＦＣへの結合について、ＯＡ及びＦＳＡのオン（ｋａ）及びオフ（ｋｄ）速度での比較を示す。
（表１１Ｃ）ＨＥＲ２ ＥＣＤ及びＨＥＲ２−ＦＣ（「ＨＥＲ２ ｍｅｍ」への結合における、フルサイズ抗ＨＥＲ２抗体（ＦＳＡ）と比較した一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ）のｋａ（１／Ｍｓ）及びｋｄ（１／ｓ）値

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【0300】

図８Ｂ及び表１１Ｄにおける結果は、一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ４１８２；例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のＣＨ−Ａ上の抗原結合性ドメインを表す）のＳＰＲ結合データを示す。図８Ｂは、固定化ＨＥＲ２ ＥＣＤまたはＨＥＲ２−Ｆｃへのｖ４１８２結合のＫ_Ｄ値（ｎＭ）を図示しており、一価抗ＨＥＲ２抗体が、ＨＥＲ２−Ｆｃへの結合について、ＨＥＲ２ ＥＣＤと比較して低いＫ_Ｄを有することを示す。表１１Ｄは、ＨＥＲ２ ＥＣＤ及びＨＥＲ２−ＦＣ（「ＨＥＲ２ ｍｅｍ」）への結合における、フルサイズ抗ＨＥＲ２抗体（ＦＳＡ）と比較した一価抗ＨＥＲ２抗体（ＯＡ）のｋａ（１／Ｍｓ）及びｋｄ（１／ｓ）値を示す。このデータは、ＨＥＲ２ ＥＣＤ及びＨＥＲ２−ＦＣへの結合について、ＯＡ及びＦＳＡのオン（ｋａ）及びオフ（ｋｄ）速度での比較を示す。
（表１１Ｄ）

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【0301】

これらのデータは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のパラトープのそれぞれが、膜結合ＨＥＲ２の代表である二量体ＨＥＲ２抗原への結合について、ＨＥＲ２ ＥＣＤと比較して低いＫ_Ｄ値を有することを示す。このデータに基づき、例示的な抗ＨＥＲ２抗体が、罹患患者の血清中に存在し、治療用抗体のためのシンクとして作用し得るｓｈｅｄ ＨＥＲ２ ＥＣＤと比較して、膜結合ＨＥＲ２抗原に対してより高い結合親和性を有し得ると予測されるだろう（Ｂｒｏｄｏｗｉｃｚ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｓｏｌｕｂｌｅ ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ ｂｉｏｌｏｇｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉ−ＨＥＲ−２／ｎｅｕ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１９９７；７３：８７５−８７９）。例えば、ベースラインのＨＥＲ２ ＥＣＤレベルが１５ｎｇ／ｍＬ以下であるのに対して、進行性疾患を有する患者の有するＨＥＲ２ ＥＣＤレベルは３８ｎｇ／ｍＬ以上である。

【0302】

実施例９：ＨＥＲ２＋細胞における二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の全細胞負荷及び内部移行
この実験を、ＨＥＲ２ ２＋細胞へ内部移行する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を評価するために行った。直接的な内部移行方法は、Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ａｎｔｉ−ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｂｉｖａｌｅｎｃｙ，ａｎｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ（２００８）５７：１８７９−１８９０において詳述されているプロトコルに従った。具体的には、抗体を、製造元の指示書に従ってＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ１０２３５）を使用して直接的に標識した。

【0303】

内部移行アッセイについては、１２ウェルプレートに１×１０^５細胞／ウェルを播種し、一晩３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。翌日、標識抗体をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中２００ｎＭで加え、２４時間、３７℃＋５％ＣＯ２でインキュベートした。暗条件下で、培地を吸引し、ウェルを２×５００μＬ ＰＢＳで洗浄した。細胞を回収するために、細胞解離緩衝液（２５０μＬ）を３７℃にて加えた。細胞をペレット化し、１００μＬ ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中に、抗Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ウサギＩｇＧ画分（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ａ１１０９４）を５０μｇ／ｍＬで伴ってまたは伴わずに再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。分析前に、３００μＬ ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ、ろ過試料、４μｌヨウ化プロピジウムを加えた。試料を、ＬＳＲＩＩフローサイトメーターを使用して分析した。

【0304】

ＨＥＲ２＋細胞に内部移行する例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を、図９Ａ及び図９Ｂに示す。図９Ａは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と共に２４時間インキュベートした後のＢＴ−４７４細胞において検出可能な表面及び内部抗体の結果を示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）とのインキュベーションが、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と比較しておおよそ２倍多い内部移行抗体をＢＴ−４７４細胞においてもたらすことを示す。図９Ｂは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と共に２４時間インキュベートした後のＪＩＭＴ−１細胞において検出可能な表面及び内部抗体の結果を示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）とのインキュベーションが、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と比較しておおよそ２倍多い内部移行抗体をＪＩＭＴ−１細胞においてもたらすことを示す。２４時間後の表面染色の量は、ＢＴ−４７４及びＪＩＭＴ−１細胞の両方において、二重パラトピック抗ＨＥＲ２及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの間で同等であった。

【0305】

図１０Ａ〜Ｆの結果は、３７℃にて２４時間後の内部移行抗体の量に加えて；３７℃にて２４時間インキュベーションした後に、表面に結合した抗体と比べた、４℃にて２時間後に全細胞の表面に結合した検出可能抗体の比較を示す。図１０Ａは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と共にインキュベートした後のＢＴ−４７４細胞における結果を示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体とＢＴ−４７４細胞の２４時間にわたるインキュベーションが、全細胞の表面上で検出される抗体をおおよそ１５％減少させることを示す。図１０Ａは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）とのインキュベーションが、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と比較してＢＴ−４７４細胞においておおよそ２倍多い内部移行抗体をもたらすことも示す。

【0306】

図１０Ｂは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と共にインキュベートした後のＪＩＭＴ−１細胞における結果を示す。図１０Ｂは、４℃にて２時間後に表面染色を加えた、図９Ｂに示した実験の反復である。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体とＪＩＭＴ−１細胞の２４時間にわたるインキュベーションが、全細胞の表面上で検出される抗体をおおよそ５７％減少させることを示す。図１０Ｂは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）とのインキュベーションが、３７℃にて２４インキュベーション後に、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と比較してＢＴ−４７４細胞においてより多くの内部移行抗体をもたらすことも示す。

【0307】

図１０Ｃは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体と共にインキュベートした後のＳＫＯＶ３細胞における結果を示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体とＳＫＯＶ３細胞の２４時間にわたるインキュベーションが、全細胞の表面上で検出される抗体をおおよそ３２％減少させることを示す。

【0308】

図１０Ｄは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体と共にインキュベートした後のＭＣＦ７細胞における結果を示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体とＭＣＦ７細胞の２４時間にわたるインキュベーションが、全細胞の表面上で検出される抗体をおおよそ４５％減少させることを示す。

【0309】

図１０Ｅは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体である、ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００と共にインキュベートした後のＳＫＯＶ３細胞における結果を示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のインキュベーションが、ＳＫＯＶ３細胞で、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と比較して１．５〜１．８倍多い内部移行抗体をもたらすことを示す。抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照との２４時間にわたるインキュベーションは、全細胞の表面上で検出される抗体を最も減少させた（約７７％）。

【0310】

図１０Ｆは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体である、ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００と共にインキュベートした後のＪＩＭＴ−１細胞における結果を示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のインキュベーションが、ＪＩＭＴ−１細胞で、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ対照と比較して１．４〜１．８倍多い内部移行抗体をもたらすことを示す。抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９及びｖ１００００）との２４時間にわたるインキュベーションは、全細胞の表面上で検出される抗体を最も減少させた（約６４％）。

【0311】

これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、単一特異性抗ＨＥＲ２ ＦＳＡと比較して優れた内部移行特性をＨＥＲ２＋細胞において有することを示す。３７℃での２４時間のインキュベーション後の検出される表面抗体の減少は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、ＨＥＲ２＋細胞におけるインキュベーション後に細胞表面ＨＥＲ２受容体の量を減少させることができること及びインキュベーション後の表面ＨＥＲ２減少がＨＥＲ２ ２＋腫瘍細胞において最大であることを示す。

【0312】

実施例１０：１、３及び１６時間での、ＨＥＲ２＋細胞とインキュベートした後の抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の細胞染色及び位置
この実験は、異なる時点でのＨＥＲ２＋ＪＩＭＴ−１細胞における例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の内部移行を分析するため、及び全細胞負荷及び内部移行を分析するために実施例９において提示した方法に直交する方法として行った。

【0313】

ＪＩＭＴ−１細胞を、３７℃＋５％ＣＯ_２で１時間、３時間、及び１６時間にわたって無血清ＤＭＥＭ中２００ｎＭの抗体（ｖ５０６、ｖ４１８４、ｖ５０１９、またはｖ５０６及びｖ４１８４の組み合わせ）とインキュベートした。細胞を、加温した滅菌ＰＢＳ（５００ｍｌ／ウェル）で穏やかに２回洗浄した。細胞を、２５０ｍｌの１０％ホルマリン／ＰＢＳ溶液で１０分間室温にて固定した。固定した細胞をＰＢＳ（５００μｌ／ウェル）で３回洗浄し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで５分間透過処理し、５００μｌ／ウェルＰＢＳで３回洗浄した。細胞を、５００μｌ／ウェルのＰＢＳ＋５％ヤギ血清で１時間室温にてブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去し、３００μｌ／ウェル二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８とコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆａｂ断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒｉｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；１０９−５４７−００３）を１時間室温にてインキュベートした。細胞を５００μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄し、固定した細胞を含有するカバーガラスを、次いで、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ ｇｏｌｄ退色防止剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；＃Ｐ３６９３１）を使用してスライド上に載せた。６０倍の単一画像を、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＦＶ１０００共焦点顕微鏡を使用して獲得した。

【0314】

結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）がＪＩＭＴ−１細胞内に３時間で内部移行し、主に核の近くに局在化したことを示した。３時間のインキュベーションでの比較画像は、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）と比較して、及び個々の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６またはｖ４１８４）と比較して、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体に関連する内部染色をより多く示した。抗体染色の細胞位置における差異が、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）の結果を抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ４１８４）と比較するときに見られ；ここで抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ４１８４）は、１、３及び１６時間の時点で明白な原形質膜染色を示した。検出可能な抗体の量は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）、２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体処置について、１６時間で減少した（データは示さず）。

【0315】

これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体ｖ５０１９がＨＥＲ２＋細胞に内部移行し、内部移行抗体が３時間のインキュベーション後に検出可能であったことを示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡと比較してＨＥＲ２＋細胞により多くの量まで内部移行することができることを示す実施例９に提示した結果と一致する。

【0316】

実施例１１：対照と比較して、二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体により媒介されるＨＥＲ２＋細胞のＡＤＣＣ
この実験は、ＳＫＯＶ３細胞（卵巣癌、ＨＥＲ２ ２＋／３＋）においてＡＤＣＣを媒介する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力を測定するために行った。

【0317】

標的細胞を、被験抗体（４５μｇ／ｍｌから１０分の１漸減濃度）と３０分間予めインキュベートし、その後、エフェクター細胞を５：１のエフェクター／標的細胞比で加え、インキュベーションを６時間３７℃＋５％ＣＯ_２にて継続した。試料を、４５μｇ／ｍｌから１０分の１漸減していく８つの濃度で検査した。ＬＤＨ放出を、ＬＤＨアッセイキットを使用して測定した。

【0318】

用量反応試験を、５：１．３：１、及び１：１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で、様々な濃度の試料を用いて行った。５０％効果濃度（ＥＣ_５０）値を、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍを使用してシグモイド用量反応非線形回帰フィットを用いて分析した。

【0319】

細胞を、マッコイ５ａ完全培地中、３７℃／５％ＣＯ_２で維持し、ＡＴＣＣからのプロトコルに従って、１０％ＦＢＳを補充した好適な培地で定期的にサブ培養した。ｐ１０未満の継代数の細胞をこのアッセイで使用した。試料は、１％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したフェノールレッド非含有ＤＭＥＭ培地で、０．３〜３００ｎＭの間の濃度に希釈してからアッセイにて使用した。

【0320】

５：１のエフェクター対標的細胞比でのＨＥＲ２＋ＳＫＯＶ３細胞におけるＡＤＣＣ結果を図１１Ａ及び表１２に示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ７９２）及び２種の異なる抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ７９２＋ｖ４１８４）と比較したときに、ＡＤＣＣによる最大標的細胞溶解の最大割合（％）を媒介したことを示す。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体によって媒介される最大細胞溶解における差異は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡと比較しておおよそ１．６倍大きく、２種の異なる抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ７９２＋ｖ４１８４）と比較しておおよそ１．２倍大きかった。
（表１２）

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【0321】

３：１のエフェクター対標的細胞比でのＨＥＲ２＋ＳＫＯＶ３細胞におけるＡＤＣＣ結果を図１１Ｂ及び表１３に示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ７９２）及び２種の異なる抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ７９２＋ｖ４１８４）と比較したときに、ＡＤＣＣによる最大標的細胞溶解の最大割合（％）を媒介したことを示す。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体によって媒介される最大細胞溶解における差異は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡと比較しておおよそ１．３倍大きく、２種の異なる抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ７９２＋ｖ４１８４）と比較しておおよそ１．８倍大きかった。
（表１３）

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【0322】

１：１のエフェクター対標的細胞比でのＨＥＲ２＋ＳＫＯＶ３細胞におけるＡＤＣＣ結果を図１１Ｃ及び表１４に示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ７９２）及び２種の異なる抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ７９２＋ｖ４１８４）と比較したときに、ＡＤＣＣによる最大標的細胞溶解の最大割合（％）を媒介したことを示す。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体によって媒介される最大細胞溶解における差異は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡと比較しておおよそ１．８倍大きく、２種の異なる抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ７９２＋ｖ４１８４）と比較しておおよそ１．１３倍大きかった。
（表１４）

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【0323】

図１１及び表１２〜１４における結果は、例示的な二重パラトピックＨＥＲ２抗体が、異なるＥ：Ｔ比率で、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ及び２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせと比較したときに、ＳＫＯＶ３細胞の最大ＡＤＣＣを媒介することを示す。抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体によって媒介されるＡＤＣＣの増加の観察が、化学療法後に循環エフェクター細胞の変動および／または減少を表すＨＥＲ２＋罹患患者において予測されるであろう（Ｓｕｚｕｋｉ Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００７；１３：１８７５−１８８２）。図１１における観察は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体への細胞結合において、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡと比較しておおよそ１．５倍の増加を示す、実施例６において提示した細胞全体結合Ｂｍａｘデータと一致する。

【0324】

実施例１２：ＨＥＲ２ ＥＣＤに結合する例示的な抗ＨＥＲ２抗体の能力
ＳＰＲアッセイを、それにより例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体がＨＥＲ２ ＥＣＤに結合する機構を評価するために；具体的には、１つの二重パラトピック抗体分子のパラトープの両方が、１つのＨＥＲ２ ＥＣＤに結合し得る（シス結合；抗体対ＨＥＲ２分子が１：１）か、または１つの二重パラトピック抗体の各パラトープが２つの異なるＨＥＲ２ ＥＣＤに結合し得る（トランス結合；抗体対ＨＥＲ２分子が１：２）かを理解するために、使用した。シス対トランス結合の代表例を図１４に図示する。オフ速度の低下（遅延）と抗体捕捉レベル（表面密度）の増加の間の相関が、トランス結合（すなわち、１つの抗体分子が２つのＨＥＲ２分子に結合すること）の指標である。

【0325】

組換えヒトＨＥＲ２に対する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）の親和性及び結合反応速度を測定し、一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ６３０またはｖ４１８２；ｖ５０１９の個々のパラトープを含む）のそれと比較したが、これは、ＢｉａｃｏｒｅからのＴ２００システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＳＰＲにより測定した。５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で注射した２０００〜４０００ＲＵの間の抗ヒトＦｃを、標準的なアミンカップリングを使用してＣＭ５チップ上に固定化した。一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ６３０またはｖ４１８２）及び例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）を、３５０〜１５ＲＵの範囲の応答レベルで、抗ヒトＦｃ（ＰＢＳＴ中０．０８〜８μｇ／ｍｌの範囲の濃度で注射、１０ｕｌ／分で１分）上で捕捉した。組換えヒトＨＥＲ２をＰＢＳＴ中に希釈し、１２０ｎＭ、２００ｎＭ、または３００ｎＭのいずれかの出発濃度にて３倍希釈で注射し、５０μｌ／分の流速で３分間注射し、その後、最後の注射の終了時にさらに３０分間解離させた。ＨＥＲ２希釈液を二重で分析した。センソグラムを、１：１のラングミュア結合モデルに全体的に当てはめた。すべての実験は、２５℃で実施した。

【0326】

結果を図１２及び図１３に示す。

【0327】

図１２Ａにおける結果は、チップの表面上の、ある範囲の注射抗体濃度及び捕捉抗体濃度にわたる、組換えヒトＨＥＲ２への結合についての一価抗ＨＥＲ２（ｖ６３０及びｖ４１８２）及び例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）のｋａ（１／Ｍｓ）を示す。これらの結果は、異なる抗体捕捉レベルで、ｖ６３０、ｖ４１８２、及びｖ５０１９について、ｋａが変化しないことを示す。

【0328】

図１２Ｂにおける結果は、チップの表面上の、ある範囲の注射抗体濃度及び捕捉抗体濃度にわたる、組換えヒトＨＥＲ２への結合についての一価抗ＨＥＲ２（ｖ６３０及びｖ４１８２）及び例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）のｋｄ（１／ｓ）を示す。これらの結果は、増加する抗体捕捉レベルで、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）についてのみ、ｋｄが低減したことを示す。

【0329】

図１２Ｃにおける結果は、チップの表面上の、ある範囲の注射抗体濃度及び捕捉抗体濃度にわたる、組換えヒトＨＥＲ２への結合についての一価抗ＨＥＲ２（ｖ６３０及びｖ４１８２）及び例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）のＫ_Ｄ（Ｍ）を示す。これらの結果は、増加する抗体捕捉レベルで、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）についてのみ、Ｋ_Ｄが低下したことを示す。この結果は、図１５Ｂに示すｋｄ値の低減と相関する。

【0330】

図１３Ａにおける結果は、ある範囲の抗体捕捉レベルにわたる、組換えヒトＨＥＲ２への結合についての例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）のｋｄ（１／ｓ）を示す。これらの結果は、ｋｄ値が、チップの表面上に捕捉される抗体のＲＵの上昇と逆比例する（すなわち、抗体捕捉レベルが高いほど、オフ速度は遅くなる）ことを示す。この結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、２つの別々のＨＥＲ２分子上のＨＥＲ２ ＥＣＤ２及びＨＥＲ２ ＥＣＤ４に結合（すなわち、トランス結合）し得ることを示し、これはより高い抗体捕捉レベルで、オフ速度が低下することをエビデンスとする。このデータは、図４７において提示され、実施例４３において考察されている同様の実験により支持され、ここで、二価単一特異性抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）は、シス結合（抗体対ＨＥＲ２が１：１）を実証し、ｋｄ（１／ｓ）及びＫ_Ｄ（Ｍ）値は増加する抗体捕捉レベルで一定のままであったが、これはこの分子で予測されたとおりである。

【0331】

図１３Ｂにおける結果は、ある範囲の抗体捕捉レベルにわたる、組換えヒトＨＥＲ２への結合についての一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ４１８２）のｋｄ（１／ｓ）を示す。これらの結果は、チップの表面上に捕捉される異なる抗体ＲＵの範囲にわたって、ｋｄ値が変化しないことを示す。これらの結果は、一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ４１８２）が、一価で、１：１で結合（シス結合）することを示す。

【0332】

図１３Ｃにおける結果は、ある範囲の抗体捕捉レベルにわたる、組換えヒトＨＥＲ２への結合についての一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ６３０）のｋｄ（１／ｓ）を示す。これらの結果は、チップの表面上に捕捉される異なる抗体ＲＵの範囲にわたって、ｋｄ値が変化しないことを示す。これらの結果は、一価抗ＨＥＲ２抗体（ｖ６３０）が、一価で、１：１で結合（シス結合）することを示す。このデータは、図４７において提示され、実施例４３Ｘにおいて考察されている実験によって支持され、ここで、二価単一特異性抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）は、ｋｄ（１／ｓ）において変化を示さなかった。

【0333】

［００９８］図１２及び図１３における結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）が、トランスで、２つのＨＥＲ２分子に同時に結合することができること（抗体対ＨＥＲ２比率は１：２）を示す。ＳＰＲにより検出される結合のトランス機構は、実施例９及び１０において提示される内部移行データと合わせて、実施例６に提示される、より高い細胞表面飽和結合データ（Ｂｍａｘ）と一致する。

【0334】

実施例１３：ＢＴ−４７４細胞におけるＡＫＴリン酸化に与える例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体インキュベーションの効果
ＢＴ−４７４細胞においてｐＡＫＴシグナル伝達を減少させる例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を、ＡＫＴ Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ Ｉｎ−Ｃｅｌｌ ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｉｃ；カタログ番号６２２１５）を使用して、製造元の指示書に従い、以下の改変を伴って検査した。細胞を５×１０^３／ウェルで播種し、２４時間３７℃＋５％ＣＯ_２でインキュベートした。細胞を１００ｎＭ抗体と３０分間インキュベートし、その後、ｒｈＨＲＧ−β１と１５分間インキュベートした。細胞を、指示書に従って、洗浄し、固定し、透過処理した。二次抗体（１：５０００；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅａｓｅａｒｃｈ、ＨＲＰ−ロバ抗マウスＩｇＧ、ＪＩＲ、カタログ番号７１５−０３６−１５０、ＨＲＰ−ロバ抗ウサギＩｇＧ、ＪＩＲ、カタログ番号７１１−０３６−４５２）を加え、アッセイを製造元の指示書に従って処理した。

【0335】

図１５の結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体とのインキュベーションが、ＨＲＧβ１の存在下でｐ−Ａｋｔレベルにおいて、ヒトＩｇＧ対照（ＣＴＬ）に対しておおよそ１．２分の１に低下して媒介したことを示す。２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）は、ＨＲＧβ１存在下でｐ−Ａｋｔレベルにおいて最大の減少を媒介し、これはヒトＩｇＧ対照と比較しておおよそ約１．５分の１であった。リガンド（ＨＲＧβ１）の不在下では、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体で、ヒトＩｇＧ対照抗体と比較して、ｐ−Ａｋｔのわずかな低下が検出された。

【0336】

これらのデータは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、ＨＥＲ２＋細胞においてリガンド活性化シグナル伝達を遮断することができることを示す。

【0337】

実施例１４：心筋細胞生存力に与える二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の効果
心筋細胞生存力に与える例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体及びＡＤＣの効果を、潜在的な心臓毒性作用の予兆を得るために測定した。

【0338】

基底レベルのＨＥＲ２受容体を発現するｉＣｅｌｌ心筋細胞（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、ＣＭＣ−１００−０１０）を、製造元の指示書に従って増殖させ、抗体処置後の心筋細胞の健康状態を評価するための標的細胞として使用した。アッセイは、以下のように行った。細胞を９６ウェルプレートに播種（１５，０００細胞／ウェル）し、４８時間維持した。細胞培地を維持培地と置き換え、細胞を７２時間維持した。抗体誘発性心臓毒性の作用にアクセスするために、細胞を７２時間、１０及び１００ｎＭの変異体単独または組み合わせを用いて処置した。（単独、または例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体と組み合わせた）アントラサイクリン誘発性心臓毒性の作用にアクセスするために、細胞を、３ｕＭ（約ＩＣ_２０）のドキソルビシンで１時間処置し、その後、７２時間１０及び１００ｎＭの抗体変異体単独または組み合わせを用いて処置した。細胞生存力を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光性細胞生存力アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７０）および／またはスルフォローダミン（Ｓｕｌｐｈｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ）（Ｓｉｇｍａ ２３０１６２−５Ｇ）を製造元の指示書に従って用いて細胞ＡＴＰレベルを定量化することによって、評価した。

【0339】

結果を、図１６Ａ〜Ｃに示す。図１６Ａにおける結果は、心筋細胞と治療的に関連する濃度の例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）及び例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３）のインキュベーションが、未処置対照（「モック」）と比較して、心筋細胞生存力に影響を及ぼさなかったことを示す。

【0340】

図１６Ｂにおける結果は、心筋細胞と治療的に関連する濃度の例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）、及び例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８、及びｖ１０５５３）のインキュベーションが、未処置対照（「モック」）と比較して、心筋細胞生存力に対して効果を有さなかったことを示す。図１６Ａ及び１６Ｂにおける結果に基づき、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、他の抗ＨＥＲ２標的抗体で報告されているような（Ｇｒａｚｅｔｔｅ Ｌ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＥｒｂＢ２ Ｃａｕｓｅｓ Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ；Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ：２００４；４４：１１）、例えば、ミトコンドリア機能障害を通した心筋症を誘発しないだろうと予測される。

【0341】

図１６Ｃにおける結果は、ドキソルビシンを用いた心筋細胞の前処置、その後の、治療的に関連する濃度の例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）及び例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８、及びｖ１０５５３）とのインキュベーションが、未処置対照＋ドキソルビシン（「モック＋ドキソルビシン」）と比較して、心筋細胞生存力に対して効果を有さなかったことを示す。図１６Ｃにおける結果に基づき、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、同時にアントラサイクリン処置を受けている患者において心臓機能障害のリスクの上昇をもたらさないだろうと予測される（Ｓｅｉｄｍａｎ Ａ，Ｈｕｄｉｓ Ｃ，Ｐｉｅｒｒｉ ＭＫ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｄｉａｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ（２００２）２０：１２１５−１２２１）。

【0342】

図１６Ａ〜Ｃは、心筋細胞と抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及びＡＤＣのインキュベーションが、単一特異性抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ抗体（ｖ５０６）、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）、及びＡＤＣ（ｖ６２４６）と比較して、単独で、またはドキソルビシンと組み合わせてのいずれかで処置したときに、同等の効果を有したことを示す。これらの結果に基づき、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及びＡＤＣが、抗単一特異性抗ＨＥＲ２ ＦＳＡであるトラスツズマブ、またはＡＤＣであるＴ−ＤＭ１と比較してより大きな心臓毒性作用を有することはないだろうと予測される。

【0343】

実施例１５：ＨＥＲ２＋細胞における例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣの細胞毒性
ＨＥＲ２＋細胞において細胞の細胞毒性を媒介する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ抗体（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）の能力を測定した。ＤＭ１にコンジュゲートしたヒトＩｇＧ（ｖ６２４９）をいくつかの場合において対照として使用した。実験は、ＨＥＲ２＋乳房腫瘍細胞系のＪＩＭＴ−１、ＭＣＦ７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＥＲ２＋卵巣腫瘍細胞系のＳＫＯＶ３、及びＨＥＲ２＋胃細胞系のＮＣＩ−Ｎ８７において実施した。ＨＥＲ２＋細胞における例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ抗体の細胞毒性を評価し、単一特異性抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）及び抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ＋抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ対照（ｖ６２４６＋ｖ４１８４）と比較した。この方法は、以下の改変を伴って実施例７に記載のように実施した。抗ＨＥＲ２ ＡＤＣを、標的ＳＫＯＶ３及びＪＩＭＴ−１（図１７Ａ及びＢ）細胞と２４時間インキュベートし、細胞を洗浄し、培地を置き換え、細胞生存を３７℃での５日間のインキュベーション後に評価した。抗ＨＥＲ２ ＡＤＣを、標的ＭＣＦ７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１標的細胞と６時間（図１７Ｃ及びＤ）インキュベートし、細胞を洗浄し、培地を置き換え、細胞生存を３７℃での５日間のインキュベーション後に評価した。図１７Ｅ〜Ｇでは、抗ＨＥＲ２ ＡＤＣを、標的ＳＫＯＶ３、ＪＩＭＴ−１、ＮＣＩ−Ｎ８７細胞と継続して５日間インキュベートした。細胞生存力は、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（図１７Ａ〜Ｄ）またはＣｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（図１７Ｅ〜Ｇ）のいずれかを使用して実施例７に記載のように測定した。

【0344】

結果を、図１７Ａ〜Ｇに示し、データを表１５及び１６にまとめた。

【0345】

図１７Ａならびに表１５及び１６の結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３）が、ＪＩＭＴ−１において抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）及び抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ＋抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ６２４６＋ｖ４１８４）の組み合わせと比較してより細胞毒性であることを示す。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、より優れたＥＣ_５０を有し、それは抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ対照と比較しておおよそ１３分の１であった。

【0346】

図１７Ｂ及び表１５の結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３）が、ＳＫＯＶ３において抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）及び抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ＋抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ６２４６＋ｖ４１８４）の組み合わせと比較してより細胞毒性であることを示す。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、より優れたＥＣ_５０を有し、それは抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ対照と比較しておおよそ５分の１であった。

【0347】

図１７Ｃ及び表１５の結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３）が、ＭＣＦ７において抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）及び抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ＋抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ６２４６＋ｖ４１８４）の組み合わせと比較してより細胞毒性であることを示す。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、より優れたＥＣ_５０を有し、それは抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ対照と比較しておおよそ２分の１であった。

【0348】

図１７Ｄ及び表１５の結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３）が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１において抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）及び抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ＋抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ６２４６＋ｖ４１８４）の組み合わせと比較してより細胞毒性であることを示す。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、より優れたＥＣ_５０を有し、それは抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ対照と比較しておおよそ２分の１であった。
（表１５）

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【0349】

図１７Ｅ及び表１６の結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）が、ＳＫＯＶ３卵巣腫瘍細胞において抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）と比較してより細胞毒性であることを示す。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、より優れたＥＣ_５０値を有し、それは抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ対照と比較しておおよそ２〜７分の１であった。

【0350】

図１７Ｆ及び表１６の結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）が、ＪＩＭＴ−１乳房腫瘍細胞において抗ＨＥＲ２−ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）と比較してより細胞毒性であることを示す。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、より優れたＥＣ_５０値を有し、それは抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ対照と比較しておおよそ６〜９分の１であった。

【0351】

図１７Ｇ及び表１６の結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）が、ＮＣＩ−Ｎ８７胃腫瘍細胞において細胞毒性であることを示す。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ対照と比較して、おおよそ同等のＥＣ_５０値を有した（ｈａｄ ｈａｓ）。
（表１６）

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これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）が、ＨＥＲ２ ３＋、２＋、及び１＋乳房腫瘍細胞において抗ＨＥＲ−ＦＳＡ−ＡＤＣ対照と比較してより細胞毒性であることを示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）がＨＥＲ２ ２／３＋胃腫瘍細胞において細胞毒性であることも示す。これらの結果は、実施例９において提示した内部移行結果と一致する。

【0352】

実施例１６：ヒト卵巣癌細胞異種移植モデルにおける二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の効果
樹立したヒト卵巣癌細胞由来の異種移植モデルＳＫＯＶ３を使用して、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の抗腫瘍有効性を評価した。

【0353】

雌無胸腺ヌードマウスに、１ｍｍ^３腫瘍断片の皮下挿入を介して、腫瘍を接種した。腫瘍を、それらが２２０ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし；次いで、動物を３つの処置群：ＩｇＧ対照、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）、及び二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９）へと無作為化した。

【0354】

１５匹の動物を各群に含んだ。各群での投薬は以下の通りである。

【0355】

Ａ）ＩｇＧ対照を、試験１日目に３０ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで試験３９日目まで週２回の２０ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0356】

Ｂ）抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）を、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで試験１８日目まで週２回の１０ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。２２日目から３９日目までは、５ｍｇ／ｋｇの抗ＨＥＲ２ ＦＳＡを週２回静脈内投薬した。抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ４１８４）を、同時に５ｍｇ／ｋｇで週２回腹腔内投薬した。

【0357】

Ｃ）二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体を、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで試験３９日目まで週２回の１０ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0358】

腫瘍体積を、試験期間を通して週２回測定し、応答者数及び生存中央値を２２日目に評価した。結果を図１８及び表１７に示す。

【0359】

二重パラトピック抗ＨＥＲ２及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡは、ＩｇＧ対照と比較してより優れた腫瘍増殖阻害を実証した。二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ組み合わせと比較してより優れた腫瘍増殖阻害を誘発した（図１８Ａ）。二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体は、２２日目で、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ ｖ５０６と比較して応答腫瘍の数における増加を伴った（それぞれ、１１及び５）（表１７）。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡは、ＩｇＧ対照と比較してより優れた生存を実証した。二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（３６日間）と比較して、より優れた生存中央値（６１日間）を有した（図１８Ｂ及び表１７）。試験２２日目に、第二の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ４１８４）を抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と組み合わせて加えた。２種の抗ＨＥＲ２ ＦＳＡの組み合わせは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）単独と比較してさらなる腫瘍増殖阻害を誘発した。
（表１７）

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【0360】

実施例１７：ヒト卵巣癌細胞系異種移植モデルにおける二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果
樹立したヒト卵巣癌細胞由来の異種移植モデルＳＫＯＶ３を使用して、ＤＭ１にコンジュゲートした例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ６３６３）の抗腫瘍有効性を評価した。

【0361】

雌無胸腺ヌードマウスに、１ｍｍ^３腫瘍断片の皮下挿入を介して、腫瘍を接種した。腫瘍を、それらが２２０ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし；次いで、動物を３つの処置群：ＩｇＧ対照、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ、及び二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣへと無作為化した。

【0362】

１５匹の動物を各群に含んだ。各群での投薬は以下の通りである。

【0363】

Ａ）ＩｇＧ対照を、試験１日目に３０ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで試験３９日目まで週２回の２０ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0364】

Ｂ）抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）を、試験１日目に１０ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで試験１５日目及び２９日目に５ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0365】

Ｃ）二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体−ＡＤＣ（ｖ６３６３）を、試験１日目に１０ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで１５日目及び２９日目に５ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0366】

腫瘍体積を、試験全体を通して測定し、応答者数及び生存中央値を２２日目に評価した。結果を、図１９に示す。結果の概要を、表１８に示す。

【0367】

二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣは、ＩｇＧ対照より良好に腫瘍増殖を阻害した（図１９Ａ及び表１８）。二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣが阻害したよりも大きい程度に腫瘍増殖を阻害した。二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ群は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣと比較して応答腫瘍の数における増加を伴った（それぞれ、１１及び９）。二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ群は、ＩｇＧ対照と比較してより優れた生存を実証した（図１９Ｂ及び表１８）。二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体群は、６１日間の生存中央値を実証し、それに対し、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣは、３６日間の生存中央値を有した（図１９Ｂ及び表１８）。
（表１８）

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【0368】

実施例１８：ヒト初代細胞異種移植モデル（ＨＢＣｘ−１３ｂ）における二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果
トラスツズマブ耐性の、患者由来の、ヒト乳癌からの異種移植モデルである、ＨＢＣｘ−１３Ｂを使用して、ＤＭ１にコンジュゲートした例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の抗腫瘍有効性を評価した。

【0369】

雌無胸腺ヌードマウスに、２０ｍｍ^３腫瘍断片の皮下挿入を介して、腫瘍を接種した。腫瘍を、それらが１００ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし；次いで、動物を３つの処置群：抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６）、及び二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ（ｖ６３６３）へと無作為化した。７匹の動物が各群に含まれた。各群についての投薬は以下の通りである：

【0370】

Ａ）抗ＨＥＲ２ ＦＳＡを、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで試験４、８、１１、１５、１８、２２、及び２５日目に１０ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0371】

Ｂ）抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣを、試験１日目に１０ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで２２日目に５ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0372】

Ｃ）二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体−ＡＤＣを、試験１日目に１０ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで２２日目に５ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0373】

腫瘍体積を、試験全体を通して測定し、平均腫瘍体積、完全奏功、及びゼロ残存疾患パラメータを５０日目に評価した。結果を、図２０に示す。結果の概要を、表１９に示す。

【0374】

二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）と比較してより大きな腫瘍増殖阻害を実証した。二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣより良好に腫瘍増殖を阻害した。二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ群は、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ群と比較して、完全奏功（ベースラインから１０％超の低減）、それぞれ７及び４を示し、ゼロ残存疾患、それぞれ５及び２を示す腫瘍の数における増加を伴った。
（表１９）

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【0375】

実施例１９：ヒト初代細胞異種移植モデル（Ｔ２２６）における二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果
患者由来の、トラスツズマブ耐性の、ヒト乳癌からの異種移植モデルである、Ｔ２２６を使用して、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を評価した。

【0376】

雌無胸腺ヌードマウスに、２０ｍｍ^３腫瘍断片の皮下挿入を介して、腫瘍を接種した。腫瘍を、それらが１００ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし；次いで、動物を４つの処置群：ＩｇＧ対照（ｎ＝１５）、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６；ｎ＝１５）、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６；ｎ＝１６）、及び二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣコンジュゲート（ｖ６３６３；ｎ＝１６）へと無作為化した。各群についての投薬は以下の通りである。

【0377】

Ａ）ＩｇＧ対照を、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇの初回用量で、次いで試験４、８、１１、１５、１８、２２、及び２５日目に１０ｍｇ／ｋｇの維持用量で静脈内投薬した。

【0378】

Ｂ）抗ＨＥＲ２ ＦＳＡを、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇの初回用量で静脈内投薬し、１０ｍｇ／ｋｇの維持用量を試験４、８、１１、１５、１８、２２、及び２５日目に投与した。

【0379】

Ｃ）抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣを、試験１日目及び１５日目に５ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬した。

【0380】

Ｄ）二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣコンジュゲートを、試験１日目及び１５日目に５ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬した。

【0381】

腫瘍体積を、試験期間を通して測定し、平均腫瘍体積及び完全奏功パラメータを３１日目に評価した。結果を、図２１に示す。結果の概要を、表２０に示す。

【0382】

二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）及びＩｇＧ対照と比較してより良好な腫瘍増殖阻害を実証した。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣは、このモデルにおいて、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣと比較して、同等の腫瘍増殖阻害及び完全なベースライン退縮を誘発した（図２１及び表２０）。
（表２０）

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【0383】

実施例２０：ヒト初代細胞異種移植モデル（ＨＢＣｘ−５）における二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果
患者由来の、トラスツズマブ耐性の、ヒト乳癌からの異種移植モデルである、ＨＢＣｘ−５（浸潤性乳管癌、ルミナルＢ）を使用して、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を評価した。

【0384】

雌無胸腺ヌードマウスに、２０ｍｍ^３腫瘍断片の皮下挿入を介して、腫瘍を接種した。腫瘍を、それらが１００ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし；次いで、動物を４つの処置群：ＩｇＧ対照（ｎ＝１５）、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６；ｎ＝１５）、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣ（ｖ６２４６；ｎ＝１６）、及び二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ（ｖ６３６３；ｎ＝１６）へと無作為化した。各群についての投薬は以下の通りである。

【0385】

Ａ）ＩｇＧ対照を、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇの初回用量で静脈内投薬し、１０ｍｇ／ｋｇの維持用量を試験４、８、１１、１５、１８、２２、及び２５日目に投与した。

【0386】

Ｂ）抗ＨＥＲ２ ＦＳＡを、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇの初回用量で静脈内投薬し、１０ｍｇ／ｋｇの維持用量を試験４、８、１１、１５、１８、２２、及び２５日目に投与した。

【0387】

Ｃ）抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣを、試験１及び１５、２２、２９、３６日目に１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬した。

【0388】

Ｄ）二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣを、試験１及び１５、２２、２９、３６日目に１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬した。

【0389】

腫瘍体積を、試験期間を通して測定し、平均腫瘍体積、Ｔ／Ｃ比率、応答者数、完全奏功、及びゼロ残存疾患パラメータを４３日目に評価した。結果を、図２２に示す。結果の概要を、表２１に示す。

【0390】

二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ及び抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣは、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）及びＩｇＧ対照と比較してより良好な腫瘍増殖阻害を実証した。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣは、トラスツズマブ耐性ＨＢＣｘ−５ヒト乳癌異種移植モデルにおいて、抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ−ＡＤＣと比較して、同等の腫瘍増殖阻害を誘発し、増加した応答者の数を有した（図２２及び表２１）。
（表２１）

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【0391】

実施例２１：ヒト細胞系異種移植モデル（ＳＫＯＶ３）における抗ＨＥＲ２処置耐性腫瘍に対する二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果
実施例１７に記載した、樹立したヒト卵巣癌細胞由来の異種移植モデルＳＫＯＶ３を使用して、抗ＨＥＲ２処置耐性腫瘍における例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣの抗腫瘍有効性を評価した。

【0392】

方法は、実施例１７に記載のように行ったが、以下の改変を伴った。動物コホートに、抗ＨＥＲ２抗体を、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇで、４、８、１５日目に１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬した；しかしながら、この処置は、このモデルでは、１５日目までに有効な応答を実証することに失敗した。そのため、この処置群を、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ｖ６３６３）を用いた処置に変換し、これを試験１９及び２７日目に５ｍｇ／ｋｇで、試験３４、４１、及び４８日目に１５ｍｇ／ｋｇで投薬した。

【0393】

腫瘍体積を、実験期間を通して週２回測定した。

【0394】

結果を、図２３に示し、これは、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ（ｖ６３６３）を用いて処置された群が、２２０ｍｍ^３の当初平均開始体積未満の平均腫瘍体積への腫瘍退縮を示したことを示す。

【0395】

実施例２２：ヒト初代細胞異種移植モデル（ＨＢＣｘ−１３ｂ）における抗ＨＥＲ２処置耐性腫瘍に与える二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の効果
トラスツズマブ耐性の、患者由来の、ヒト乳癌からの異種移植モデルである、ＨＢＣｘ−１３Ｂを使用して、ＤＭ１にコンジュゲートした例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の抗腫瘍有効性を評価した。

【0396】

方法は、実施例１８に記載のように行ったが、以下の改変を伴った。動物コホートに、二重特異性抗ＥｒｂＢファミリーを標的とする抗体を、試験１日目に１５ｍｇ／ｋｇで、４、８、１５、１８、２２、及び２５日目に１０ｍｇ／ｋｇで静脈内投薬した；しかしながら、この処置は、有効な応答を実証することに失敗した。そのため、この処置群を、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体薬物コンジュゲート（ｖ６３６３）を用いた処置に変換し、これを３１、５２日目に１０ｍｇ／ｋｇで、４５日目に５ｍｇ／ｋｇで投薬した。腫瘍体積を、試験期間を通して測定した。

【0397】

結果を、図２４に示す。これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ（ｖ６３６３）が、腫瘍の進行を防いだことを示す。最初の投薬から５７日目までで、ｖ６３６３処置群の腫瘍体積は２％未満増加したが、一方で同じ期間において、ｖ５０６処置群は、１１０％超増殖した。

【0398】

実施例２３：例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体のフコース含有率の分析
グリコペプチド分析を、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）のＮ−連結グリカンのフコース含有率を定量化するために行った。

【0399】

グリコペプチド分析を、以下のように行った。抗体試料を、５６℃で１時間１０ｍＭ ＤＴＴで還元し、室温にて１時間５５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化し、一晩３７℃で、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム中トリプシンで溶液中にて消化した。トリプシン消化物を、ＱＴｏｆ−ＵｌｔｉｍａでナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。ＮＣＢＩデータベースをＭａｓｃｏｔで検索して、タンパク質配列を同定した。ＭａｘＥｎｔ３（ＭａｓｓＬｙｎｘ）を使用して、グリコペプチドイオンをデコンボリューションし、異なる糖型を定量化した。

【0400】

グリコペプチド分析結果の概要を、表２２に示す。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）のＮ−連結グリカンは、おおよそ９０％フコシル化されている（フコースを伴わないＮ−連結グリカンは１０％）。単一特異性抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）のＮ−連結グリカンは、おおよそ９６％フコシル化されており（フコースを伴わないＮ−連結グリカンは４％）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）は、約８７％フコシル化されている（フコースを伴わないＮ−連結グリカンは４％）。
（表２２）Ｆｃ Ｎ−連結グリコペプチド分析

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【0401】

これらの結果は、ＣＨＯ細胞において一過性に発現させた二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ヘテロ二量体Ｆｃを伴う）が、市販のＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と比較して、Ｎ−グリカンにておおよそ３％高いフコース含有率を有することを示す。ＣＨＯ細胞において一過性に発現させたホモ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）は、おおよそ９６％の最も高いフコース含有率を有する。

【0402】

実施例２４：例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の熱安定性
例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００）及びＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５３３）の熱安定性を、下記のようにＤＳＣにより測定した。

【0403】

ＤＳＣを、ＰＢＳ中で約０．３ｍｇ／ｍｌに調節した精製タンパク質試料（抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣ）を使用して、ＭｉｃｒｏＣａｌ（商標）ＶＰ−キャピラリーＤＳＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて行った。試料を６０℃／時の速度で２０℃から１００℃まで走査し、低フィードバック、８秒フィルター、５分間のｐｒｅＴｓｔａｔ、及び７０ｐｓｉの窒素圧を用いた。結果得られたサーモグラムを、Ｏｒｉｇｉｎ ７ソフトウェアを使用して分析した。

【0404】

例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）の熱安定性結果を図２５Ａ〜Ｃに示す。図２５Ａは、ｖ５０１９でのサーモグラムを示し；５０１９のそれぞれのＦｃ及び鎖Ａ Ｆａｂは、７５℃のＴ_ｍを有し、鎖Ｂ ｓｃＦｖは、６９℃のＴ_ｍを有する。図２５Ｂは、ｖ１００００でのサーモグラムを示し；Ｆｃ ＣＨ３ドメインは、８２℃のＴ_ｍを有し、Ｆａｂ鎖Ａは、７６．５℃のＴ_ｍを有し、鎖Ｂ ｓｃＦｖは、６９．５℃のＴ_ｍを有する。図２５Ｃは、ｖ７０９１でのサーモグラムを示し；Ｆｃ ＣＨ３ドメインは、８２℃のＴ_ｍを有し、Ｆａｂ鎖Ａは、７６．７℃のＴ_ｍを有し、鎖Ｂ ｓｃＦｖは、６９．５℃のＴ_ｍを有する。

【0405】

例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８、及びｖ１０５３３）の熱安定性結果を図２６Ａ〜Ｃに示す。図２６Ａは、ｖ６３６３でのサーモグラムを示し；Ｆｃは、７５℃のＴ_ｍを有し、鎖Ａ Ｆａｂ及びＦｃ ＣＨ３ドメインは、７５℃のＴ_ｍを有する。６３６３の鎖Ｂ ｓｃＦｖは、６９℃のＴ_ｍを有する。図２６Ｂは、ｖ１０５５３でのサーモグラムを示し；Ｆｃ ＣＨ３ドメインは、８３℃のＴ_ｍを有し、鎖Ａ Ｆａｂは、７５．７℃のＴ_ｍを有し、鎖Ｂ ｓｃＦｖは、６６．２℃のＴ_ｍを有する。図２６Ｃは、ｖ７１４８でのサーモグラムを示し；Ｆｃ ＣＨ３ドメインは、８２．６℃のＴ_ｍを有し、鎖Ａ Ｆａｂは、７４．８℃のＴ_ｍを有し、鎖Ｂ ｓｃＦｖは、６６．６℃のＴ_ｍを有する。

【0406】

例示的な二重パラトピック抗体及びＡＤＣは、野生型ＩｇＧに匹敵する熱安定性を有する。

【0407】

実施例２５：様々なレベルのＨＥＲ２を発現する乳房腫瘍細胞のＡＤＣＣを引き出す例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力
ＨＥＲ２陽性３＋、２＋、及び０／１＋ＨＥＲ２発現（トリプルネガティブ）乳癌細胞系の用量依存性ＡＤＣＣを引き出す例示的な二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）の能力を調査した。ＡＤＣＣ実験を、ＮＫエフェクター細胞対標的細胞比を５：１で一定のままにすること以外は、実施例１１に記載するように行った。

【0408】

ＡＤＣＣ結果を、図２７及び表２３に示す。図２７Ａ〜Ｃにおける結果は、例示的な二重パラトピック抗体（ｖ５０１９）が、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と比較しておおよそ１．２〜１．３倍大きい、ＨＥＲ２陽性３＋、２＋、及び０／１＋ＨＥＲ２発現乳癌細胞の最大細胞溶解を引き出すことを示す。結果は、ｖ５０１９（９０％のＮ−グリカンがフコースを有する）が、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（８６％のＮ−グリカンがフコースを有する；実施例２３）と比較して、Ｎ−グリカンにおいておおよそ４％高いフコース含有率を有する（ＮＫ細胞上のＣＤ１６への結合親和性が低くなる）にもかかわらず、より有効にＨＥＲ２陽性３＋、２＋、及び０／１＋ＨＥＲ２発現乳癌のＡＤＣＣを媒介することも示す。ｖ５０１９により引き出される、より高い標的細胞殺傷は、実施例６に記載するような腫瘍細胞装飾の増加に起因すると推定される。
（表２３）ＨＥＲ２ ３＋、２＋及び０／１＋ＨＥＲ２発現乳癌細胞のＡＤＣＣ

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【0409】

図２７ＤにおけるＡＤＣＣ結果は、例示的な二重パラトピック抗体（ｖ７０９１及びｖ１００００）が、基底ＨＥＲ２発現ＷＩ−３８細胞系において、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）と比較して同様の最大細胞溶解を引き出すことを示す。ＡＤＣＣ結果は、ＨＥＲ２受容体レベルが１０，０００のＨＥＲ２／細胞よりも大きいときに、結合及びＡＤＣＣの増加に関して閾値が生じることを示した細胞結合データ（実施例６）を支持する。このデータに基づいて、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体では、ＨＥＲ２ ３＋、２＋及び１＋腫瘍細胞の細胞表面結合及びＡＤＣＣが増加するだろうが、おおよそ１０，０００受容体またはそれ以下の基底レベルのＨＥＲ２受容体を発現する非腫瘍細胞の細胞表面結合及びＡＤＣＣは増加しないだろうと予期されるだろう。

【0410】

実施例２６：ＡＤＣＣに与える抗体アフコシル化の効果
ＨＥＲ２陽性２／３＋、２＋及び０／１＋ＨＥＲ２発現（トリプルネガティブ）乳癌細胞系の用量依存性ＡＤＣＣを引き出すアフコシル化された例示的な二重パラトピック抗体（アフコシル化ｖ５０１９、アフコシル化１００００）の能力を検査した。ＡＤＣＣ実験は、５：１の一定のＮＫエフェクター細胞またはＰＢＭＣエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比率を使用したことを除いて、実施例１１に記載のように、ＳＫＯＶ３細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞及びＺＲ７５−１細胞において行った。アフコシル化された例示的な二重パラトピック抗体を、ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１０ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０：１６０７−１６１８に記載のように一過的に発現されたＲＭＤ酵素を使用して、実施例１に記載のようにＣＨＯ細胞において一過的に産生した。アフコシル化ｖ５０１９及びアフコシル化１００００のフコース含有率は、実施例２３に記載のように測定し、２％未満と少なくフコシル化されていると決定された（データは示さず）。ＮＫエフェクター細胞を使用したデータを図２８Ａ〜Ｂに示し、ＰＢＭＣを使用したデータを図２８Ｃに示す。

【0411】

図２８Ａ、図２８Ｂ及び表２４は、アフコシル化されたｖ５０１９（アフコシル化ｖ５０１９）がＨＥＲ ２／３＋及び０／１＋ＨＥＲ２発現乳癌細胞のＡＤＣＣを、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）よりもおおよそ１．５〜１．７倍高い最大細胞溶解を伴って引き出すことを示す。
（表２４）ＨＥＲ２ ２／３＋及び基底ＨＥＲ２発現（トリプルネガティブ）乳癌細胞のＡＤＣＣ

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【0412】

図２８Ｃ及び表２５における結果は、ｖ１００００がＨＥＲ２ ２＋ＺＲ−７５−１乳癌細胞のＡＤＣＣを、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）よりもおおよそ１．３倍大きい最高細胞溶解を伴って引き出し、アフコシル化ｖ１００００がＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）よりもおおよそ１．５倍大きい最高細胞溶解を引き出すことを示す。
（表２５）ＨＥＲ２ ２／３＋乳癌細胞のＡＤＣＣ

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【0413】

ＡＤＣＣ結果は、例示的なアフコシル化二重パラトピック抗体（アフコシル化ｖ５０１９、アフコシル化ｖ１００００）が、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）をベンチマークとして使用したときに、フコシル化抗体（ｖ５０１９ 実施例２５、ｖ１００００）と比較して、およそ１５〜２５％大きい最大細胞溶解を引き出すことを示す。これらの結果は、Ｆｃ Ｎ−グリカンのフコース含有率を減少させることが、ＡＤＣＣによる最高細胞溶解の増加をもたらすことを示す。

【0414】

実施例２７：外因性増殖刺激リガンド（ＥＧＦ及びＨＲＧ）の存在下でＨＥＲ２ ３＋乳癌細胞の増殖を阻害する例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の能力
外因性増殖刺激リガンド（ＥＧＦ及びＨＲＧ）の存在下でＨＥＲ２ ３＋乳癌細胞の増殖を阻害する５０１９の能力を検査した。

【0415】

被験抗体及び外因性リガンド（１０ｎｇ／ｍＬ ＨＲＧまたは５０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ）を、三重で標的ＢＴ−４７４ ＨＥＲ２ ３＋細胞に加え、５日間３７℃でインキュベートした。細胞生存力を、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）（３７℃で２時間）使用して測定し、吸光度を５３０／５８０ｎｍで読み取った。データを未処置対照に対して正規化し、分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して行った。

【0416】

結果を、図２９及び表２６に示す。結果は、例示的な二重パラトピック抗体ｖ５０１９が、増殖刺激リガンドの不在下（７０％阻害）、ならびにＥＧＦ（４０％阻害）またはＨＲＧ（約１０％阻害）の存在下で、ＨＥＲ２ ３＋乳癌細胞の増殖を阻害することを示す。抗ＨＥＲ２単一特異性ＦＳＡ（ｖ５０６）は、他のｅｒｂＢ受容体ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３を介するＥＧＦまたはＨＲＧ誘発性腫瘍細胞増殖を遮断しない。ｖ５０１９は、ＨＥＲ２及びリガンド依存性二量体化ならびに他のコンパニオンｅｒｂＢ受容体を介する増殖の阻害においてｖ５０６より優れている。
（表２６）ＨＥＲ２ ３＋癌細胞の増殖阻害

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【0417】

これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗体が、ＨＥＲ２＋細胞のリガンド依存性増殖を減少させることができることを示し、これはおそらく抗ＥＣＤ２鎖Ａ Ｆａｂアームの結合及びリガンド刺激性受容体ホモ及びヘテロ二量体化、ならびにｅｒｂＢシグナル伝達の続く遮断のためである。

【0418】

実施例２８：浸潤性乳管癌のトラスツズマブ耐性及び化学療法耐性ＨＥＲ２ ３＋患者由来（ＰＤＸ）の転移性乳癌異種移植モデルにおける二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体の効果
ＨＥＲ２ ３＋（ＥＲ−ＰＲ陰性）患者由来の、ヒト浸潤性乳管癌からの異種移植モデルである、ＨＢＣｘ−１３Ｂを使用して、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体である、ｖ７１８７の抗腫瘍有効性を評価した。ｖ７１８７は、ｖ５０１９をアフコシル化したものである。このモデルは、単剤トラスツズマブ、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせ（実施例３１を参照）、カペシタビン、ドセタキセル、及びアドリアマイシン／シクロホスファミドに対して耐性である。

【0419】

雌無胸腺ヌードマウスに、２０ｍｍ^３腫瘍断片を皮下接種した。次いで、腫瘍を１４０ｍｍ３の平均体積に達するまでモニターした。次いで、動物を２つの処置群：ビヒクル対照及びｖ７１８７へと無作為化し、各群は８匹の動物を有した。静脈内投薬は以下の通りとした。ビヒクル対照を、５ｍｌ／ｋｇの製剤緩衝液と週２回試験４３日目まで静脈内投薬した。ｖ７１８７を、１０ｍｇ／ｋｇで週２回試験４３日目まで静脈内投薬した。腫瘍体積は、試験全体を通して測定し、他のパラメータは４３日目に表２７に示すように評価した。

【0420】

結果を、図３０及び表２７に示す。結果は、ビヒクル対照を用いて処置した腫瘍が、進行の継続を示し、試験４３日目までに１６００ｍｍ^３を超えたことを示す。ｖ７１８７を用いて処置したマウスは、有意に大きな腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ−０．４４）を示し、４３日目に７４０ｍｍ^３の平均腫瘍体積を有した。ｖ７１８７は、５／８の腫瘍において応答を誘発し、試験４３日目にゼロ残存疾患で完全退縮を示す腫瘍が１つあった。ｖ７１８７を用いて処置した動物は、より優れた奏効率を有し、ビヒクル対照を用いて処置したマウスの０／８と比較して、５／８腫瘍が治療に応答した。加えて、ｖ７１８７を用いた処置は、ビヒクル対照と比較して腫瘍進行を有意に遅らせ、それぞれ倍加時間は１９及び１１日であった。
（表２７）

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【0421】

これらのデータは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック（ｖ７１８７）が、トラスツズマブ＋ペルツズマブ耐性ＨＥＲ２ ３＋転移性乳癌腫瘍異種移植モデルにおいて有効であることを示す。Ｖ７１８７処置は、高い奏効率を有し、標準治療に対して耐性であるＨＥＲ２ ３＋乳癌の腫瘍進行を有意に減速させることができる。

【0422】

実施例２９：ＨＥＲ２＋腫瘍細胞系に結合する二重パラトピック抗ＨＥＲ２ ＡＤＣの評価
ＨＥＲ２陽性３＋、２＋、乳房及び卵巣腫瘍細胞系に結合し、それらを飽和させる例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２ ＡＤＣの能力を、実施例６に記載のようにＦＡＣＳにより分析した。

【0423】

データを図３１に示す。図３１Ａは、ｖ６３６３が、飽和濃度で、Ｔ−ＤＭ１（ｖ６２４６）よりもおおよそ２．０倍大きなＢｍａｘ（ＭＦＩ）で、ＳＫＯＶ３腫瘍細胞系に結合することを示す。図３１Ｂは、ｖ６３６３が、飽和濃度で、Ｔ−ＤＭ１（ｖ６２４６）よりもおおよそ１．６倍大きなＢｍａｘ（ＭＦＩ）で、ＪＩＭＴ−１腫瘍細胞系に結合することを示す。これらのデータは、ｖ６３６３（ＡＤＣ）が、コンジュゲートされていない親のｖ５０１９抗体（実施例６）と比較して、増加した細胞表面結合の同様の腫瘍細胞結合特性を有することを示す。ＳＭＣＣ−ＤＭ１とｖ５０１９のコンジュゲーション（ｖ６３６３）は、抗体の抗原結合性特性を変えるものではない。

【0424】

ＦＡＣＳ結合アッセイを繰り返して、例示的な二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００）及びＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）の直接比較を含んだ。データを、図３１Ｃ及び図３１Ｄに示す。例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）は、未標識二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００）と比較して同等の細胞表面飽和（Ｂｍａｘ）を有した。

【0425】

これらのデータは、例示的な二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００）とＳＭＣＣ−ＤＭ１のコンジュゲーションが、結合特性を変えないことを示す。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）は、単一特異性抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ（ｖ６２４６、Ｔ−ＤＭ１）と比較しておおよそ１．５倍（またはより大きい）増加した細胞表面結合を有する。

【0426】

実施例３０：ＨＥＲ２ ３＋（ＥＲ−ＰＲ陰性）患者由来の異種移植モデルにおける例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの用量依存性腫瘍増殖阻害
ＨＥＲ２ ３＋（ＥＲ−ＰＲ陰性）患者由来の、ヒト浸潤性乳管癌からの異種移植モデルである、ＨＢＣｘ−１３Ｂを使用して、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２ ＡＤＣである、ｖ６３６３の抗腫瘍有効性を評価した。このモデルは、単剤トラスツズマブ、トラスツズマブ及びペルツズマブの組み合わせ（実施例３１を参照）、カペシタビン、ドセタキセル、及びアドリアマイシン／シクロホスファミドに対して耐性である。

【0427】

雌無胸腺ヌードマウスに、２０ｍｍ^３腫瘍断片の皮下挿入を介して、腫瘍を接種した。腫瘍を、それらが１６０ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし；次いで、動物を５つの処置群：非特異的ヒトＩｇＧ対照、及び４つの漸増用量のｖ６３６３へと無作為化した。８〜１０匹の動物を各群に含んだ。各群についての投薬は以下の通りである。ＩｇＧ対照を、１０ｍｇ／ｋｇで週２回試験２９日目まで静脈内投薬した。ｖ６３６３を、０．３、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇで試験１、１５、及び２９日目に静脈内投薬した。腫瘍体積は、試験全体を通して測定し、パラメータを表２９に示すように評価した。

【0428】

結果を、図３２及び表２８に示す。これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピックＡＤＣ（ｖ６３６３）が、トラスツズマブ耐性ＨＢＣｘ−１３ｂ ＰＤＸモデルにおいて用量依存性腫瘍増殖阻害を媒介したことを示す（図３２Ａ）。加えて、ｖ６３６３は、用量依存的様式で全生存期間を改善し、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ用量では６３日間を超える生存時間中央値を伴い、それに比べてＩｇＧ対照では４３日間であった（図３２Ｂ及び表２８）。３ｍｇ／ｋｇ用量は、対照（０／８）と比較して増加した奏効率（５／１０）を伴った。１０ｍｇ／ｋｇ用量のｖ６３６３を用いて処置されたすべてのマウスは、治療に応答した（９／９）のみでなく、腫瘍進行の防止も示した。さらには、腫瘍の大半が客観的な部分奏功（７／９）を有し、試験の終了時には、多くがゼロ残存疾患を有した（６／９）。ｖ６３６３は、すべての用量に十分に忍容性を示し、有害事象は観察されず、体重減少も観察されなかった。
（表２８）

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【0429】

これらのデータは、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピックＡＤＣ（ｖ６３６３）が、トラスツズマブ＋ペルツズマブ耐性ＨＥＲ２ ３＋転移性乳癌腫瘍異種移植モデルにおいて有効であることを示す。ｖ６３６３処置は、標準治療に対して耐性であるＨＥＲ２ ３＋乳癌において、高い奏効率を伴い、腫瘍進行を有意に減速させ、生存期間を延長させる。

【0430】

実施例３１：トラスツズマブ耐性ＰＤＸ ＨＢＣｘ−１３ｂにおける標準治療の組み合わせと比較した二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣ
ＨＥＲ２ ３＋、ＥＲ−ＰＲ陰性トラスツズマブ耐性の、患者由来の、乳癌異種移植モデル（ＨＢＣｘ−１３ｂ）におけるｖ６３６３の有効性を評価し、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）＋Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）；及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）＋ドセタキセルの組み合わせと比較した。

【0431】

雌無胸腺ヌードマウスに、２０ｍｍ３腫瘍断片の皮下挿入を介して、腫瘍を接種した。腫瘍を、それらが１００ｍｍ３の平均体積に達するまでモニターし；次いで、動物を４つの処置群（８〜１０動物／群）：非特異的ヒトＩｇＧ対照、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）＋ドセタキセル、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）＋Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）、及びｖ６３６３へと無作為化した。各群についての投薬は以下の通りである。ＩｇＧ対照を、１０ｍｇ／ｋｇで週２回試験２９日目まで静脈内投薬した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）＋ドセタキセル併用では、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）を、１０ｍｇ／ｋｇで週２回試験２９日目まで静脈内投薬し、ドセタキセルを、２０ｍｇ／ｋｇで試験１及び２２日目に腹腔内投薬した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）＋Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）併用では、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎを５ｍｇ／ｋｇで週２回試験２９日目まで静脈内投薬し、Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）を５ｍｇ／ｋｇで週２回試験２９日目まで静脈内投薬した。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）及びＰｅｒｊｅｔａ（商標）の投薬は同時とした。ｖ６３６３を、１０ｍｇ／ｋｇで試験１、１５、及び２９日目に静脈内投薬した。

【0432】

結果を、図３３及び表２９に示す。図３３Ａは、経時的な腫瘍体積を示し、図３３Ｂは、生存プロットを示す。これらの結果は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）＋Ｐｅｒｊｅｔａ（商標）の併用が、対照ＩｇＧと比較していずれの腫瘍増殖阻害も生じず、３９日目に１８００ｍｍ^３を超えたことを示す。Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）＋ドセタキセルの併用は、腫瘍増殖を有意に減少させなかったが、生存中央値を５３日間まで延長し、それに比べてＩｇＧ対照では４３日間であった。ｖ６３６３は、有意な腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ−０．０４）を生じ、ここで、すべての腫瘍は、治療に応答し、７／１０腫瘍は、完全な退縮（ゼロ残存疾患）を経験した。ｖ６３６３は、両方の併用療法と比較して、生存を有意に延長した。コホート全体にわたって、体重は処置により有意に影響されなかった。
（表２９）

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【0433】

これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピックＡＤＣ（ｖ６３６３）が、この異種移植モデルにおいて検査されたすべてのパラメータに関して、標準治療の組み合わせよりも優れていることを示す。

【0434】

実施例３２：ＨＥＲ２＋トラスツズマブ耐性乳癌細胞由来の腫瘍異種移植モデルにおける二重パラトピック抗ＨＥＲ２−ＡＤＣの有効性
ＨＥＲ２ ３＋トラスツズマブ耐性乳癌細胞由来の（ＪＩＭＴ−１、ＨＥＲ２ ２＋）異種移植モデルにおけるｖ６３６３の有効性を評価した（Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２００４．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ３：１５８５−１５９２）。

【0435】

雌ＲＡＧ２マウスに、腫瘍を皮下接種した。腫瘍を、それらが１１５ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし；次いで、動物を２つの処置群：トラスツズマブ（ｎ＝１０）及びｖ６３６３へと無作為化した。各群での投薬は以下の通りである。トラスツズマブを、１５ｍｇ／ｋｇで試験１日目に、１０ｍｇ／ｋｇで週２回試験２６日目まで静脈内投薬した。ｖ６３６３を、５ｍｇ／ｋｇで試験１及び１５日目に、１０ｍｇ／ｋｇで２３及び３０日目に、９ｍｇ／ｋｇで３７及び４４日目に静脈内投薬した。

【0436】

結果を、図３４及び表３０に示す。これらの結果は、ｖ６３６３が、試験３６日目に、トラスツズマブと比較して腫瘍増殖を有意に阻害した（Ｔ／Ｃ−０．７４）ことを示す。ｖ６３６３及びトラスツズマブ処置は、体重を有意に変化させなかった。ｖ６３６３血清曝露は、初回の１０ｍｇ／ｋｇ用量から７日後に、１７．９μｇ／ｍｌであった。
（表３０）

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【0437】

これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピックＡＤＣ（ｖ６３６３）が、トラスツズマブ耐性乳癌において有効であること、及び現行の標準治療に対して耐性である乳癌の処置において潜在的な有用性を有することを示す。

【0438】

実施例３３：抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣのヘテロ二量体ＦｃへのＦｃγＲ結合
ヘテロ二量体Ｆｃを有する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０１９ ｖ１００００）及びＡＤＣ（ｖ６３６３、ｖ７１４８及びｖ１０５５３）の、ヒトＦｃγＲへの結合を評価し、ホモ二量体Ｆｃを有する抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）及びＡＤＣ（ｖ６２４６）と比較した。

【0439】

抗体Ｆｃ領域に対するＦｃγＲの親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用してＳＰＲにより測定した。ＨＥＲ２を、標準的なアミンカップリングによってＣＭ５チップ上に固定化した（３０００ＲＵ）。抗体は、ＨＥＲ２表面上で抗原捕捉された。精製したＦｃγＲを、様々な濃度（２０〜３０μｌ／分）で２分間注射し、続いて、４分間解離させた。センソグラムを、１：１のラングミュア結合モデルに全体的に当てはめた。実験は２５℃で実施した。

【0440】

結果を、表３１に示す。例示的なヘテロ二量体抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及びＡＤＣは、同等の親和性でＣＤ１６ａＦ、ＣＤ１６ａＶ１５８、ＣＤ３２ａＨ、ＣＤ３２ａＲ１３１、ＣＤ３２ｂＹ１６３及びＣＤ６４Ａに結合した。抗体とＳＭＣＣ−ＤＭ１のコンジュゲーションは、ＦｃγＲ結合に負の影響を及ぼさない。ヘテロ二量体抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体は、ホモ二量体抗ＨＥＲ２ ＦＳＡ（ｖ５０６）及びＡＤＣ（ｖ６２４６）と比較して、ＣＤ１６ａＦ、ＣＤ３２ａＲ１３１、ＣＤ３２ａＨに対しておおよそ１．３〜２倍高い親和性を有する。これらの結果は、ヘテロ二量体抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及びＡＤＣが、野生型ホモ二量体ＩｇＧ１と同様か、またはそれよりも高い親和性で、免疫エフェクター細胞上のＦｃγＲの異なる多形形態と結合することを示す。
（表３１）ＳＰＲによるヒトＦｃγＲ結合

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【0441】

実施例３４：トラスツズマブ感受性卵巣癌細胞由来の腫瘍異種移植モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の有効性
実施例１７に記載した、樹立したヒト卵巣癌細胞由来の異種移植モデルＳＫＯＶ３を使用して、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体、ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００の抗腫瘍有効性を評価した。

【0442】

雌無胸腺ヌードマウスに、ＨＢＳＳ中３２５，０００細胞の腫瘍懸濁液を左側腹部で皮下接種した。腫瘍を、それらが１９０ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし、無作為化及び交互様式で４つの処置群：非特異的ヒトＩｇＧ対照、ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００に登録した。各群での投薬は以下の通りとした。非特異的ヒトＩｇＧを、１０ｍｇ／ｋｇで試験１日目に開始して、週２回試験２６日目まで静脈内投薬した。Ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００を、３ｍｇ／ｋｇで試験１日目に開始して、週２回試験２６日目まで静脈内投薬した。腫瘍体積を、試験全体を通して測定し、表３２に挙げるパラメータを２９日目に測定した。

【0443】

データを図３５Ａ（腫瘍増殖）、図３５Ｂ（生存プロット）、及び表３２に提示し、これらは、ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００を用いた処置が、ＩｇＧ対照と比較して匹敵する腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ：０．５３〜０．７１）、応答腫瘍数、無増悪期間、及び生存を試験２９日目でもたらしたことを示す。ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００の血清曝露は、試験７日目で、同様であった（３１〜４１μｇ／ｍｌ）。
（表３２）

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【0444】

これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体、ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）が、中程度トラスツズマブ感受性ＨＥＲ２過剰発現卵巣癌の処置において、潜在的な有用性を有することを示す。

【0445】

実施例３５：例示的な二重パラトピック抗ｈｅｒ２抗体は、トラスツズマブ感受性卵巣癌細胞由来の腫瘍異種移植片において、腫瘍増殖を用量依存的に阻害する
樹立したヒト卵巣癌細胞由来の異種移植モデルＳＫＯＶ３は、実施例１７に記載されており、これを使用して、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体である、ｖ１００００の用量依存性有効性を評価した。

【0446】

雌無胸腺ヌードマウスに、ＨＢＳＳ中３２５，０００細胞の腫瘍懸濁液を左側腹部で皮下接種した。腫瘍を、それらが１９０ｍｍ^３の平均体積に達するまでモニターし、無作為化及び交互様式で６つの処置群：非特異的ヒトＩｇＧ対照及び５つの漸増用量のｖ１００００に登録した。９〜１３匹の動物を各群に含んだ。各群での投薬は以下の通りとした。ＩｇＧ対照を、１０ｍｇ／ｋｇで週２回試験２６日目まで静脈内投薬した。Ｖ１００００を、０．１、０．３、１、３、または１０ｍｇ／ｋｇで週２回静脈内投薬した。

【0447】

データを、図３６及び表３３に提示し、これらは、ｖ１００００を用いた処置が、対照ＩｇＧと比較して、腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ：０．２８〜０．７３）を用量依存的に誘発することを示す。加えて、ｖ１００００は、試験２９日目で、応答腫瘍を用量依存的に伴い（１０ｍｇ／ｋｇで７／９、及び０．１ｍｇ／ｋｇで３／１１）、無増悪期間を増加させた（１０ｍｇ／ｋｇで２４日間、及び０．１ｍｇ／ｋｇで１２日間）。７日目でのｖ１００００の血清曝露は、用量依存的であり、０．１ｍｇ／ｋｇ用量での０．４６μｇ／ｍｌから、１０ｍｇ／ｋｇ用量での７９．３μｇ／ｍｌまで増加した。
（表３３）

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【0448】

これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体であるｖ１００００が、用量依存性様式で腫瘍進行を阻害することを示す。

【0449】

実施例３６：ＨＥＲ２、ならびにＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３を３＋、２＋、または１＋レベルで発現する細胞系の増殖を阻害する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体及び抗ＨＥＲ２二重パラトピック−ＡＤＣの能力
以下の実験を、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体（ｖ１００００）及び対応する二重パラトピック抗ＨＥＲ２ ＡＤＣ（ｖ１０５５３）の、ＩＨＣによって定義されているように、３＋、２＋、１＋、または０＋レベルでＨＥＲ２、ならびにＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３を発現する乳房、結腸直腸、胃、肺、皮膚、卵巣、腎臓、膵臓、頭頚部、子宮、及び膀胱腫瘍細胞系の選択物の増殖を阻害する能力を測定するために行った。

【0450】

実験を以下のように実施した。各細胞系について最適な播種密度を独自に決定して、７２時間のアッセイ後に、おおよそ６０〜９０％の集密度をもたらす播種密度を同定した。各細胞系を、最適な播種密度で、細胞系ごとに適切な増殖培地中、９６ウェルプレートに播種し、２４℃にて３６℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。抗体を、陽性対照及びビヒクル対照のほかに、３つの濃度で（ｖ１００００は、３００、３０、及び０．３ｎＭで；ｖ１０５５３は、３００、１、０．１ｎＭで）加えた。陽性対照である化学カクテル（ｃｈｅｍｏｃｏｃｋｔａｉｌ）薬物組み合わせは、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、パクリタキセル、シスプラチン、エトポシド（２５μＭ）、ビヒクル対照は、ＰＢＳからなるものとした。抗体処置物及び対照を、細胞と７２時間、細胞培養インキュベーター中、３６℃及び５％ＣＯ_２でインキュベートした。プレートを１２００ＲＰＭで１０分間遠心し、培養培地を吸引によって完全に除去した。ＲＰＭＩ ＳＦＭ培地（２００μＬ）及びＭＴＳ（２０μＬ）を各ウェルに加え、３６℃及び５％ＣＯ_２で３時間インキュベートした。光学密度を４９０ｎＭで読取り、増殖阻害率（％）を、ビヒクル対照に対して決定した。

【0451】

結果を図３７に示し、すべての試験結果の概要を図３８に示す。図３７Ａは、ｖ１００００の増殖阻害結果を示す。これらの結果は、ｖ１００００が、ＨＥＲ２ならびに共発現ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３を３＋、２＋、１＋、または０＋レベルで発現する乳房、結腸直腸、胃、肺、皮膚、卵巣、腎臓、膵臓、頭頚部、子宮、及び子宮内膜腫瘍細胞系の増殖を阻害することができることを示す。３００ｎＭでのｖ１００００及びｖ１０５５３の活性を図３８にまとめ、ここで、「＋」は、３００ｎＭで、ビヒクル対照の５％超である細胞生存力の低下を示した細胞系を示し、「−」は、ビヒクル対照の５％以内の生存力を示す。

【0452】

図３７Ｂは、ｖ１０５５３の増殖阻害結果を示す。これらの結果は、ｖ１０５５３が、ＨＥＲ２ならびに共発現ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３を３＋、２＋、１＋、または０＋レベルで発現する乳房、結腸直腸、胃、肺、皮膚、卵巣、腎臓、膵臓、頭頚部、子宮、及び膀胱腫瘍細胞系の増殖を阻害することができることを示す（図３８も参照されたい）。図３７Ｂにおいてプロットした結果は、３００及び１ｎＭで最小の用量依存性増殖阻害を示した細胞系によって既定されており、ここで、１ｎＭでの増殖阻害は、５％以上である（図３７Ｂ）。

【0453】

これらの結果は、例示的な二重パラトピック抗体ｖ１００００及びＡＤＣのｖ１０５５３が、ＨＥＲ２を３＋、２／３＋、２＋、１＋、及び０／１＋レベルで発現し、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３を２＋、１＋レベルで共発現する乳房、結腸直腸、胃、肺、皮膚、卵巣、腎臓、膵臓、頭頚部、子宮、及び膀胱組織から生じる腫瘍細胞の増殖を阻害することができることを示す。

【0454】

実施例３７：ＨＥＲ２ ２＋、１＋、及び０／１＋癌細胞のＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力
以下の実験を、ＨＥＲ２を２＋、１＋および／または０／１＋レベルで発現し、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ３を２＋または１＋レベルで共発現する腫瘍細胞のＡＤＣＣを媒介する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の能力を決定するために実施した。検査した抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体は、５０１９、１００００、及び１０１５４（ｖ１００００をアフコシル化したもの）であり、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）及びｖ５０６を対照とした。

【0455】

ＡＤＣＣ実験を、ＮＫ−９２エフェクター細胞を用いて５：１のＥ／Ｔで実施例１１及び実施例２５に記載するように（図３９）、及びＰＢＭＣエフェクター細胞を用いて３０：１のＥ／Ｔで実施例２６に記載するように行った。

【0456】

結果を、図３９（ＮＫ−９２エフェクター細胞）及び図４０（ＰＢＭＣエフェクター細胞）に示す。図３９Ａは、ＨＥＲ２ ２＋頭頚部腫瘍細胞系（下咽頭癌腫）であるＦａＤｕのＡＤＣＣ結果を示し、ここで、抗ＨＥＲ２二重パラトピックは、おおよそ１５％の最高細胞溶解を引き出す。図３９Ｃは、ＨＥＲ２ １＋ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍細胞系のＡＤＣＣ結果を示し、図３９Ｄは、ＨＥＲ２ ２＋ＭｉａＰａｃａ２膵臓腫瘍細胞系の結果を示す。図３９Ｂは、ＨＥＲ２ ０／１＋Ａ５４９ ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）腫瘍細胞系のＡＤＣＣ結果を示す。ＢｘＰＣ３、ＭｉａＰａｃａ２、及びＡ５４９腫瘍細胞系において、ｖ１００００は、おおよそ５％の最高腫瘍細胞溶解を媒介した。

【0457】

図４０は、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｎ８７、及びＨＣＴ−１１６細胞におけるＡＤＣＣ結果を示し、ここで、ＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。図４０Ａは、ＨＥＲ２ ０／１＋Ａ５４９ ＮＳＣＬＣ腫瘍細胞系のＡＤＣＣ結果を示し、ここで、ｖ１００００は、約２８％の最大細胞溶解を引き出し、これは、Ｎ−連結グリカンにおいて同等レベルのフコース含有率を有するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）に匹敵した。例示的な１００％アフコシル化（フコース０％）二重パラトピックｖ１０１５４は、Ｎ−連結グリカンにおいておおよそ８８％のフコースを有するｖ１００００及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎと比較して、最大細胞溶解の増加（４０％の最大細胞溶解）及び効力の増加を示す。

【0458】

図４０Ｂは、ＨＥＲ２ ３＋胃腫瘍細胞系である、ＮＣＩ−Ｎ８７のＡＤＣＣ結果を示す。図４０Ｂは、例示的な二重パラトピックｖ５０１９（おおよそ８８％フコシル化）がおおよそ２３％の最高細胞溶解を媒介し、トラスツズマブｖ５０６（おおよそ９８％フコシル化）と比較して低いＥＣ５０を有することを示す。

【0459】

図４０Ｃは、ＨＥＲ２ １＋ＨＣＴ−１１６結腸直腸腫瘍細胞系のＡＤＣＣ結果を示す。図４０Ｃは、例示的な二重パラトピックｖ５０１９（おおよそ８８％フコシル化）がおおよそ２５％の最高細胞溶解を媒介し、トラスツズマブｖ５０６（おおよそ９８％フコシル化）と比較してより効力があることを示す。

【0460】

これらの結果は、例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、頭頚部、胃、ＮＳＣＬＣ、及び膵臓腫瘍組織学から生じるＨＥＲ２ ０１／＋、２＋、及び３＋腫瘍細胞のＡＤＣＣを引き出すことができることを示す。エフェクター細胞としてＮＫ−９２細胞の存在下でのＡＤＣＣは、比較的高い（５％超）割合（％）の最大細胞溶解を示すためには、明らかなＨＥＲ２ ２＋受容体レベル（すなわち、２＋以上）を必要とした。しかしながら、ＰＢＭＣ細胞をエフェクター細胞として使用したとき、比較的高いレベルの最大細胞溶解が達成され（それぞれｖ１００００及びｖ１０１５４で、５％超及び最大２８％または４０％）、これらは、０／１＋、１＋、及び３＋のＨＥＲ２受容体密度レベルで５％超のＡＤＣＣが見られたために、ＨＥＲ２受容体密度とは独立していた。

【0461】

実施例３８：ＳＰＲにより測定したＨＥＲ２結合親和性及び反応速度
実施例１に示すように、異なる抗原結合性部分の形式を有する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体を構築し、表１に記載のとおりである。形式には、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式（ｖ６７１７）、Ｆａｂ−Ｆａｂ形式（ｖ６９０２及びｖ６９０３）の他にも、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ形式（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）が含まれた。以下の実験を、これらの例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式のＨＥＲ２結合親和性及び反応速度を比較するために行った。

【0462】

マウスＨＥＲ２ ＥＣＤ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ５０７１４−Ｍ０８Ｈ）への親和性及び結合反応速度を、ＢｉａｃｏｒｅからのＴ２００ ＳＰＲシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて単一サイクル反応速度によって測定した。抗ヒトＦｃの２０００〜４０００ＲＵを、標準的なアミンカップリングを使用してＣＭ５チップ上に固定化した。５０１９は、５０ＲＵで抗ヒトＦｃ表面上に捕捉された。組換えＨＥＲ２ ＥＣＤ（１．８〜１２０ｎＭ）を５０μｌ／分で３分間注射し、最終の注入後に、３０分の解離を続けた。ＨＥＲ２希釈液を二重で分析した。センサーグラムを、１：１のラングミュア結合モデルに全体的にあてはめた。すべての実験を室温の２５℃で実施した。

【0463】

表３４の結果は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ二重パラトピック抗体（ｖ５０１９及びｖ７０９１）、Ｆａｂ−Ｆａｂ変異体（ｖ６９０２及びｖ６９０３）、及びｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ変異体（ｖ６７１７）が同等の結合親和性（１〜４ｎＭ）を有することを示す。Ｆａｂ−ｓｃＦｖ変異体ｖ１００００は、約０．６ｎＭの比較的高い結合親和性（低いＫＤ）を有した。単一特異性抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ４抗体（ｖ５０６）及び抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２抗体（ｖ４１８４）は、対照としてアッセイに含まれた。これらの結果は、ｖ６７１７、ｖ６９０２、ｖ６９０３、ｖ５０１９、および／またはｖ７０９１を含む分子形式が、同等の結合親和性を有することを示し、ゆえに、これらの抗体間での機能の差違は、形式の差異から生じると考えられ得る。
（表３４）

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【0464】

実施例３９：ＨＥＲ２＋腫瘍細胞への結合に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果
以下の実験を、異なる分子形式（例えば、ｖ６７１７、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ ＩｇＧ１；ｖ６９０３及びｖ６９０２ Ｆａｂ−Ｆａｂ ＩｇＧ１；ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ ＩｇＧ１）を有する例示的な抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２×ＥＣＤ４二重パラトピック抗体の全細胞結合特性（Ｂｍａｘ及び見かけのＫ_Ｄ）を比較するために行った。

【0465】

実験を、実施例６に記載するように実施した。結果を、図４１及び表３５〜３８に示す。図４１Ａ及び表３５は、ＢＴ４７４ ＨＥＲ２ ３＋乳房腫瘍細胞系への例示的な二重パラトピック抗体のＦＡＣＳ結合結果を示す。結果は、すべての抗ＨＥＲ２抗体が、単一特異性二価抗ＨＥＲ２抗体ｖ５０６と比較したときに、より高いＢｍａｘ（１．５〜１．７倍高い）を有することを示す。ｖ５０６と比較して、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（ｖ５０１９、ｖ７０９１、及びｖ１００００）及びＦａｂ−Ｆａｂ（ｖ６９０３）形式は、おおよそ１．７倍増加したＢｍａｘを有し、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式（ｖ６７１７）は、１．５倍増加したＢｍａｘを有した。ＦＳＡであるｖ５０６及びｖ４１８４の等モルの組み合わせは、Ｂｍａｘにおいて１．７倍の増加をもたらした。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体の見かけのＫ_Ｄは、単一特異性ｖ５０６と比較しておおよそ２〜３倍高かった。
（表３５）ＦＡＣＳ結合ＢＴ−４７４

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【0466】

図４１Ｂ及び表３６は、ＪＩＭＴ−１ ＨＥＲ２ ２＋乳房腫瘍細胞系へのＦＡＣＳ結合結果を示す。結果は、すべての抗ＨＥＲ２抗体が、単一特異性二価抗ＨＥＲ２抗体ｖ５０６と比較したときに、より高いＢｍａｘ（１．５〜１．８倍高い）を有することを示す。ｖ５０６と比較して、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（ｖ７０９１及びｖ１００００）及びＦａｂ−Ｆａｂ（ｖ６９０３）形式は、おおよそ１．７倍増加したＢｍａｘを有し、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式（ｖ６７１７）は、１．５倍増加したＢｍａｘを有し、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（ｖ５０１９）及びＦＳＡ組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）は、１．８倍増加したＢｍａｘを有した。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピックＦａｂ−ｓｃＦｖ抗体の見かけのＫ_Ｄは、単一特異性ｖ５０６と比較しておおよそ２〜４倍高く；一方で、Ｆａｂ−Ｆａｂ（ｖ６９０３）及びｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（ｖ６７１７）のＫ_Ｄは、ｖ５０６と比較しておおよそ８倍高かった。
（表３６）ＦＡＣＳ結合ＪＩＭＴ−１

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【0467】

図４１Ｃ及び表３７は、ＨＥＲ２ １＋ＭＣＦ７乳房腫瘍細胞系への例示的な二重パラトピック抗体のＦＡＣＳ結合結果を示す。結果は、抗ＨＥＲ２抗体ｖ１００００及びＦＳＡ組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）が、単一特異性二価抗ＨＥＲ２抗体ｖ５０６と比較して１．６倍高いＢｍａｘを有することを示す。ｖ５０６と比較して、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（ｖ５０１９、ｖ７０９１）は、おおよそ１．４倍；ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式（ｖ６７１７）は、１．３倍、そしてＦａｂ−Ｆａｂ形式（ｖ６９０３）は、１．２倍増加したＢｍａｘを有した。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピックＦａｂ−ｓｃＦｖ、Ｆａｂ−Ｆａｂ（ｖ６９０３）及びＦＳＡ組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）の見かけのＫ_Ｄは、ｖ５０６と比較しておおよそ２〜３分の１であったが；一方で、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（ｖ６７１７）のＫ_Ｄは、ｖ５０６と比較しておおよそ３倍高かった。
（表３７）ＦＡＣＳ結合ＭＣＦ７

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【0468】

図４１Ｄ及び表３８は、ＨＥＲ２ ０／１＋ＭＤＡ−ＭＤ−２３１乳房腫瘍細胞系への例示的な二重パラトピック抗体のＦＡＣＳ結合結果を示す。結果は、例示的な二重パラトピック抗ＨＥＲ２抗体が、単一特異性二価抗ＨＥＲ２抗体ｖ５０６と比較しておおよそ１．３〜１．４倍増加したＢｍａｘを有したことを示す。ＦＳＡ組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）は、１．７倍増加したＢｍａｘを有した。例示的な抗ＨＥＲ２二重パラトピックＦａｂ−ｓｃＦｖ抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、ｖ１００００）及びＦＳＡ組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）の見かけのＫ_Ｄは、ｖ５０６と比較してほぼ同等のＫＤを有し；一方で、Ｆａｂ−Ｆａｂ（ｖ６９０３）及びｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（ｖ６７１７）は、ｖ５０６と比較してそれぞれおおよそ４及び１６倍高いＫ_Ｄであった。
（表３８）ＦＡＣＳ結合ＭＤＡ−ＭＢ−２３１

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【0469】

腫瘍細胞結合結果は、異なる分子形式を有する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、ＨＥＲ２ ３＋、２＋、１＋、及び０／１＋腫瘍細胞に対して、二価単一特異性抗ＨＥＲ２抗体と比較して増加したＢｍａｘを有することを示す。異なる抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体のうち、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式が、ｖ５０６と比較して、ＨＥＲ２ ３＋、２＋、１＋、及び０／１＋腫瘍細胞に対して有するＢｍａｘの増加が最も低かった。これらの結果は、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−Ｆａｂ形式が、単一特異性ｖ５０６（３〜１６倍の増加）及び二重パラトピックＦａｂ−ｓｃＦｖ形式（おおよそ２倍以上）と比較して、ＨＥＲ２ ３＋、２＋、１＋、及び０／１＋腫瘍細胞に対して有するＫ_Ｄの増加が最大であったことを示す。Ｋ_Ｄの増加は、積極的な結合の減少の指標であり、異なる二重パラトピック形式が、細胞表面上のＨＥＲ２への結合について固有の機構を有することを示す。

【0470】

実施例４０：ＨＥＲ２＋細胞における内部移行に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果
以下の実験を、異なる分子形式（例えば、ｖ６７１７、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ ＩｇＧ１；ｖ６９０３及びｖ６９０２ Ｆａｂ−Ｆａｂ ＩｇＧ１；ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ ＩｇＧ１）を有する例示的な抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２×ＥＣＤ４二重パラトピック抗体の、様々なレベルでＨＥＲ２を発現するＨＥＲ２＋細胞に内部移行する能力を比較するために実施した。

【0471】

実験を実施例９において詳述したように実施した。結果を図４２及び表３９〜４１に示す。図４２Ａ及び表３９は、ＨＥＲ２ ３＋ＢＴ−４７４における内部移行結果を示す。これらの結果は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ形式（ｖ１００００）及びＦＳＡ組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）が、単一特異性抗ＨＥＲ２ ｖ５０６と比較して、２．２倍多い量の細胞内抗体を有することを示す。ｖ５０６と比較して、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式（ｖ６７１７）は、１．９倍多い；Ｆａｂ−ｓｃＦｖ形式（ｖ５０１９及びｖ７０９１）は、１．５〜１．７倍多い；及びＦａｂ−Ｆａｂ形式（ｖ６９０２及びｖ６９０３）は、１．２〜１．３倍多い量の細胞内抗体蓄積を有した。
（表３９）内部移行ＢＴ−４７４

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【0472】

図４２Ｂ及び表４０は、ＨＥＲ２ ２＋ＪＩＭＴ−１における内部移行結果を示す。これらの結果は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ形式（ｖ１００００）及びＦＳＡ組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）が、単一特異性抗ＨＥＲ２ ｖ５０６と比較して、それぞれ１．８倍及び１．９倍多い量の細胞内抗体を有することを示す。ｖ５０６と比較して、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（ｖ６７１７）及びＦａｂ−ｓｃＦｖ形式（ｖ５０１９）は、１．４倍多い量；Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（ｖ７０９１）及びＦａｂ−Ｆａｂ形式（ｖ６９０２及びｖ６９０３）は、１．２倍多い量の細胞内抗体蓄積を有する。
（表４０）内部移行ＪＩＭＴ−１

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【0473】

図４２Ｃ及び表４１は、ＨＥＲ２ １＋ＭＣＦ７における内部移行結果を示す。これらの結果は、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式及びＦａｂ−ｓｃＦｖ形式が、単一特異性抗ＨＥＲ２ ｖ５０６と比較して、３．０及び２．８倍多い量の細胞内抗体を有することを示す。ｖ５０６と比較して、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ形式（ｖ１００００）及びＦＳＡ組み合わせ（ｖ５０６＋ｖ４１８４）は、おおよそ２．０倍；Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（ｖ７０９１）及びＦａｂ−Ｆａｂ（ｖ６９０３）形式は、１．８倍多い量の細胞内抗体蓄積を有する。
（表４１）内部移行ＭＣＦ７

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【0474】

これらの結果、異なる分子形式を有する抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体が、固有の程度の内部移行をＨＥＲ２ ３＋、２＋及び１＋腫瘍細胞において有することを示し、これは、抗原結合性ドメインの構造及び形式に関して変動する。一般に、ｖ５０６及びｖ４１８４の単一特異性ＦＳＡ組み合わせ、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ（ｖ１００００、ｖ７０９１及びｖ５０１９）ならびにｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ（ｖ６７１７）二重パラトピック形式は、ＨＥＲ２ ３＋、２＋及び１＋腫瘍細胞において比較的高い内部移行値を有した。それに対して、Ｆａｂ−Ｆａｂ二重パラトピック形式（ｖ６９０２及びｖ６９０３）は、ＨＥＲ２ ３＋、２＋、及び１＋腫瘍細胞において、最も低い内部移行値を有した。これらのデータは、抗原結合性ドメインの分子形式及び幾何学的スペーシングが、二重パラトピック抗体の、ＨＥＲ２受容体を架橋し、引き続いて、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞に内部移行する能力に影響を与えることを示す。２つの抗原結合性ドメインの間の距離が最大であるＦａｂ−Ｆａｂ二重パラトピック形式は、最も低い程度の内部移行をもたらしたが、抗原結合性ドメインの間の距離がより短いＦａｂ−ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式は、ＨＥＲ２＋細胞においてより大きい内部移行を有した。これは、Ｊｏｓｔ ｅｔ ａｌ ２０１３，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２１，１９７９−１９９１）に記載されたとおりの効力及び比較的短いリンカー長さの相関と一致する。

【0475】

実施例４１：ＨＥＲ２＋細胞におけるＡＤＣＣに与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果
以下の実験を、異なる分子形式（例えば、ｖ６７１７、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ ＩｇＧ１；ｖ６９０３及びｖ６９０２ Ｆａｂ−Ｆａｂ ＩｇＧ１；ｖ５０１９、ｖ７０９１及びｖ１００００ Ｆａｂ−ｓｃＦｖ ＩｇＧ１）を有する例示的な抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２×ＥＣＤ４二重パラトピック抗体の、ＨＥＲ２を様々なレベルで発現するＨＥＲ２＋細胞においてＡＤＣＣを媒介する能力を比較するために実施した。

【0476】

ＡＤＣＣアッセイを行う前に、グリコペプチド分析を抗体試料で行って、Ｎ−連結グリコペプチドにおけるフコース含有率を定量化した。実施例２３に記載のように方法を行った。結果を表４２に示す；データは、例示的な二重パラトピック変異体ｖ５０１９、ｖ６７１７、ｖ６９０３が、Ｎ−連結グリカンにおいて同等のフコース含有率（９１〜９３％）を有することを示す。Ｎ−グリカンにおいて同等レベルのフコースを有する抗体試料をＡＤＣＣアッセイのために選択して、ＡＤＣＣアッセイ結果を解釈する際にフコース含有率に対して正規化した。
（表４２）ＬＣ−ＭＳトリプシンペプチド分析

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【0477】

ＡＤＣＣ実験を、ＮＫ−９２エフェクター細胞を用いて５：１のＥ／Ｔで実施例１１に記載のように実施した。ＡＤＣＣ結果を、図４３及び表４３〜４５に示す。図４３Ａ及び表４３は、ＨＥＲ２ ２＋ＪＩＭＴ−１乳房腫瘍細胞におけるＡＤＣＣ結果を示す。これらのデータは、ｖ５０１９、ｖ６７１７、及びｖ６９０３が同様のレベルの最大細胞溶解を引き出すこと、及びＨＥＲ２ ２＋腫瘍細胞が標的であるとき、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式（ｖ６７１７）が、ｖ５０１９及びｖ６９０３と比較して効力が低いことを示す。
（表４３）ＪＩＭＴ−１ＡＤＣＣ

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【0478】

図４３Ｂ及び表４４は、ＨＥＲ２ １＋ＭＣＦ７乳房腫瘍細胞におけるＡＤＣＣ結果を示す。これらのデータは、ｖ５０１９及びｖ６７１７が、ｖ６９０３（２４％）と比較してやや高い最大細胞溶解（２７〜３０％）を有することを示す。これらのデータはまた、ｖ６７１７が最も効力が低く、低いＥＣ５０値を有するｖ６９０３及びｖ５０１９が続くことを示す。
（表４４）ＭＣＦ７ ＡＤＣＣ

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【0479】

図４３Ｃ及び表４５は、ＨＥＲ２ ０／１＋ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳房腫瘍細胞におけるＡＤＣＣ結果を示す。これらのデータは、ｖ５０１９がｖ６９０３（６２％）及びｖ６７１７（６３％）と比較してやや高い最大細胞溶解（７７％）を示すことを示す。これらのデータはまた、ｖ６７１７が最も効力が低く、低いＥＣ_５０値を有するｖ６９０３及びｖ５０１９が続くことを示す。
（表４５）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ ＡＤＣＣ

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【0480】

これらのデータは、例示的な抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２×ＥＣＤ４二重パラトピック抗体が、ＨＥＲ２ ２＋及び１＋腫瘍細胞において、ＡＤＣＣによる同様のレベルの最大細胞溶解を引き出すことを示す。最大細胞溶解における類似性にもかかわらず、これらのデータは、異なる分子形式が固有のＡＤＣＣ効力を有することも示す。ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖは、ＨＥＲ２ ２＋及びＨＥＲ２ １＋において効力が最も低かった（最大のＥＣ_５０値）。これらの３つの形式間での効力の差が、ＨＥＲ２ １＋細胞を標的とするＡＤＣＣデータにおいて見られ、ここでＥＣ５０値は、ｖ６７１７＞ｖ６９０３＞ｖ５０１９であった。これらのデータは、実施例４０（ＦＡＣＳ結合）において提示された観察と一致し、ここでＫ_Ｄの増加（親和性の低下）が、Ｆａｂ−Ｆａｂ及びｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ形式で見られた。

【0481】

実施例４２：ＨＥＲ２＋腫瘍細胞の増殖に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果
以下の実験を、基礎増殖またはリガンド刺激されたかのいずれかの、ＨＥＲ２ ３＋、２＋、及び１＋腫瘍細胞の増殖に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の効果を比較するために行った。基礎増殖は、実施例１５に記載したように測定し、リガンド刺激増殖は、実施例２７に記載したように測定した。両方の種類の実験において、増殖を、対照処置に対する生存率（％）として測定した。

【0482】

図４４及び表４６は、外因性増殖刺激リガンド（ＥＧＦ及びＨＲＧ）の存在下でＨＥＲ２ ３＋乳癌細胞（ＢＴ−４７４）の増殖に与える例示的な抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２×ＥＣＤ４二重パラトピック抗体の効果を示す。ＥＧＦまたはＨＲＧの不在下で、抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体は、ＢＴ−４７４細胞の増殖を阻害することができ、ここで各処置群の生存率（％）を以下のように順位付けした：ｖ６９０３＜ｖ５０６＋ｖ４１８４＜５０６＜ｖ７０９１＜ｖ５０１９＜ｖ１００００＜ｖ６７１７。ＨＲＧの存在下では、モック対照に対する増殖阻害は、ｖ５０６＋ｖ４１８４のＦＳＡ組み合わせでのみ達成された。ＥＧＦの存在下では、モック対照に対する増殖阻害が達成され、各処置群の生存率（％）を以下のように順位付けした：ｖ６９０３＜ｖ５０６＋ｖ４１８４＜７０９１＜ｖ１００００＜５０１９。
（表４６）

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【0483】

図４５は、ＳＫＢｒ３ ＨＥＲ２ ３＋細胞系の増殖阻害に与える抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式の用量依存性効果を示す。データは、図４４に提示する結果と一致し、ここで二重パラトピック形式の効力／有効性の順位は、ＨＥＲ２ ３＋腫瘍細胞では、Ｆａｂ−Ｆａｂ＞Ｆａｂ−ｓｃＦｖ＞ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖのとおりである。

【0484】

抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式がＨＥＲ２＋細胞の生存に与える効果を図４６に示し、ここで、図４６Ａは、３００ｎＭでのトラスツズマブ感受性ＳＫＯＶ３ ＨＥＲ２ ２＋／３＋細胞系における結果を示し；図４６Ｂは、３００ｎＭでのＪＩＭＴ−１ ＨＥＲ２ ２＋（トラスツズマブ耐性）細胞における結果を示し、図４６Ｃは、３００ｎＭでのＭＣＦ７ ＨＥＲ２ １＋細胞系における結果を示す。ＳＫＯＶ３細胞系では、増殖阻害の程度において二重パラトピック形式間でほとんど差異は観察されず、ＪＩＭＴ−１及びＭＣＦ７細胞においていずれの被験抗体によっても、増殖阻害は観察されなかった。

【0485】

図４４及び図４５におけるデータは、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ及びＦａｂ−Ｆａｂ形式を有する抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２×ＥＣＤ４二重パラトピック抗体（ｖ５０１９、ｖ７０９１、ｖ１００００、ｖ６９０３）が、ＥＧＦまたはＨＲＧの不在下、及び存在下で、ＨＥＲ２ ３＋腫瘍細胞を増殖阻害することができることを示す。ＨＥＲ２ ３＋細胞系ＢＴ−４７４及びＳＫＢＲ３では、モック対照に対する増殖阻害を、以下のとおりに順位付けした、ｖ５０６＋ｖ４１８４＞ｖ６９０３＞ｖ７０９１＞ｖ１００００＞ｖ５０１９＞ｖ５０６＞ｖ６７１７。抗原結合性ドメイン間の距離（Ｆａｂ−Ｆａｂ＞Ｆａｂ−ｓｃＦｖ＞ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ）は、ＨＥＲ２ ３＋腫瘍細胞における増殖阻害の順位序列と相関する。トラスツズマブ感受性腫瘍細胞であるＢＴ−４７４及びＳＫＢｒ３におけるデータに基づき、形式間の増殖阻害の差違は、ＨＥＲ２ ３＋レベルにおいては有意であるが、ＨＥＲ２ ２＋またはＨＥＲ２ １＋レベルではそれほどではないと予測され得る。

【0486】

実施例４３：様々な抗体捕捉レベルでのＨＥＲ２結合親和性及び反応速度の評価
以下の実験を、ＳＰＲにより様々な表面密度で捕捉されたときの例示的な抗ＨＥＲ２ ＥＣＤ２×ＥＣＤ４二重パラトピック抗体のＨＥＲ２結合反応速度（ｋｄ、オフ速度）を比較するために、実施した。オフ速度の低下（減速）と抗体捕捉レベル（表面密度）の増加との間の相関は、トランス結合（すなわち、実施例１２に記載する、２つのＨＥＲ２分子への１つの抗体分子結合）の指標である。この実験では、Ｆａｂ−Ｆａｂ形式（ｖ６９０３）をＦａｂ−ｓｃＦｖ形式（ｖ７０９１）と比較して、変異体間でのトランス結合における潜在的な差異を決定した。抗原結合性ドメイン間の空間的距離が比較的広いために、Ｆａｂ−Ｆａｂ形式がシス結合することができる可能性がある（１つのＨＥＲ２分子上のＥＣＤ２及び４を係合する）；それに対し、Ｆａｂ−ｓｃＦｖは、その抗原結合性ドメイン間の距離が比較的短いために、シス結合することができないだろうと仮定される。抗ＨＥＲ２単一特異性ｖ５０６を対照として含んだ。

【0487】

実験を、実施例１２に記載するようにＳＰＲにより実施した。データを図４７に示す。図４７Ａは、ｖ６９０３及びｖ７０９１の異なる抗体捕捉レベルでのｋｄ（１／ｓ）のプロット及び線形回帰分析を示す。ｖ７０９１及びｖ６０９３は両方とも、表面捕捉レベルの増加につれてオフ速度が低減する傾向を示す；しかしながら、この相関は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ変異体では有意である（ｖ７０９１；Ｐ値＝０．０２３）が、Ｆａｂ−Ｆａｂ形式では有意でない（ｖ６０９３；Ｐ値＝０．０５３）。オフ速度は、抗ＨＥＲ２単一特異性対照であるｖ５０６では様々な抗体捕捉レベルで、変化しないままであった。

【0488】

図４７Ｂは、ｖ６９０３及びｖ７０９１の異なる抗体捕捉レベルでのＫ_Ｄ（Ｍ）のプロット及び線形回帰分析を示す。オフ速度比較と同様に、ｖ７０９１及びｖ６０９３は両方とも、表面捕捉レベルの増加につれて親和性が増加する（Ｋ_Ｄ値が低くなる）傾向を示す。しかしながら、この相関は、Ｆａｂ−ｓｃＦｖ変異体では有意である（ｖ７０９１；Ｐ値＝０．０４）が、Ｆａｂ−Ｆａｂ形式では有意でない（ｖ６０９３；Ｐ値＝０．５１）。Ｋ_Ｄは、抗ＨＥＲ２単一特異性対照であるｖ５０６では様々な抗体捕捉レベルで、変化しないままであった。図４７のデータは、Ｆａｂ−Ｆａｂ及びＦａｂ−ｓｃＦｖ抗ＨＥＲ２二重パラトピック抗体形式が、抗体表面捕捉レベルの増加につれてオフ速度が低減する傾向を示すことを示し；これらの傾向は、単一特異性抗Ｈｅｒ２抗体と比較して固有である。

【0489】

実施例４４：ペルツズマブＦａｂの親和性及び安定性の操作
表１に示すように、１つの変異体（ｖ１００００）は、突然変異をペルツズマブＦａｂに含有する。このＦａｂは、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでの試みによる親和性及び安定性の操作から誘導され、一価またはワンアーム（Ｏｎｅ−Ａｒｍｅｄ）抗体（ＯＡＡ）として実験的に測定された。

【0490】

変異体９９９６：一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上のペルツズマブから誘導されたＦａｂであり、Ｙ９６ＡをＶＬ領域に、Ｔ３０Ａ／Ａ４９Ｇ／Ｌ６９ＦをＶＨ領域に有し（Ｋａｂａｔナンバリング）、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（ＥＵナンバリング）を鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（ＥＵナンバリング）を鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域は、突然変異Ｃ２２６Ｓを有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。

【0491】

変異体１００１４：一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上のペルツズマブから誘導されたＦａｂであり、Ｙ９６ＡをＶＬ領域に、Ｔ３０ＡをＶＨ領域に有し（Ｋａｂａｔナンバリング）、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（ＥＵナンバリング）を鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（ＥＵナンバリング）を鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域は、突然変異Ｃ２２６Ｓを有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。

【0492】

変異体１００１３：一価抗ＨＥＲ２抗体であり、ここでＨＥＲ２結合性ドメインは、鎖Ａ上の野生型ペルツズマブから誘導されたＦａｂであり、Ｆｃ領域は、突然変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ（ＥＵナンバリング）を鎖Ａに、Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（ＥＵナンバリング）を鎖Ｂに有するヘテロ二量体であり、鎖Ｂのヒンジ領域は、突然変異Ｃ２２６Ｓを有し；抗原結合性ドメインは、ＨＥＲ２のドメイン４に結合する。

【0493】

以下の実験を、遺伝子操作したペルツズマブ変異体のＨＥＲ２結合親和性及び安定性を比較するために実施した。

【0494】

ＯＡＡ変異体をクローニングし、実施例１に記載のように発現させた。

【0495】

ＯＡＡを、実施例１に記載のように、プロテインＡクロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。

【0496】

ヘテロ二量体純度（すなわち、ヘテロ二量体Ｆｃを伴うＯＡＡの量）を、Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃７６０４９９）を使用して非還元型ハイスループットタンパク質発現アッセイにより評価した。手順を、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＬａｂＣｈｉｐ ＵｓｅｒＧｕｉｄｅ ｖｅｒｓｉｏｎ２ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌに従って、ただし、以下の改変を加えて行った。ヘテロ二量体試料を、２μｌまたは５μｌ（濃度範囲は５〜２０００ｎｇ／μｌ）のいずれかで、９６ウェルプレート（ＢｉｏＲａｄ ＃ＨＳＰ９６０１）の別々のウェルに、７μｌのＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃７６０３２８）と共に加えた。次いで、ヘテロ二量体試料を、７０℃で１５分間変性させた。ＬａｂＣｈｉｐ機器を、ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｃｈｉｐ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＃７６０４９９）及びＡｂ−２００アッセイ設定を使用して操作する。使用後に、チップをＭｉｌｌｉＱ水で洗浄し、４℃で保管した。

【0497】

試料の安定性を、実施例２４において示したプロトコルでＤＳＣによって決定して、融解温度、つまりＴｍを測定することにより評価した。ＤＳＣを、ＳＥＣ精製の前後に測定した。

【0498】

試料のＨＥＲ２ ＥＣＤに対する親和性を、実施例１２からのプロトコルに従ってＳＰＲにより測定した。ＳＰＲを、ＳＥＣ精製の前後に測定した。表４７Ａ及び４７Ｂにおいてまとめるように、可変ドメインにおける突然変異は、野生型安定性を維持しつつ、野生型ペルツズマブと比較して、ＦａｂのＨＥＲ２親和性を増加させている。（^１Ｃａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐによって決定された純度；^２ＫＤ（野生型）／ＫＤ（変異体）
（表４７Ａ）

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（表４７Ｂ）

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【0499】

実施例４５：ＨＥＲ２−低、非小細胞肺癌の異種移植モデル（ＮＳＣＬＣ）における生存及び腫瘍増殖に与えるｖ１００００の効果
この実験を、肺癌のＡ５４９異種移植モデルにおける対照ＩｇＧ（ｖ６９０８）と比較したｖ１００００の有効性を評価するために行った。Ａ５４９細胞は、ＨＥＲ２−低、非ＨＥＲ２遺伝子増幅、ＨＥＲ３＋、ＥＧＦＲ−低であり、ＭＴＤ（最大耐量）でシスプラチンに中程度に感受性である、非扁平上皮非小細胞肺癌から誘導される。本試験は、下記のように実行した。

【0500】

腫瘍細胞懸濁液を、無胸腺ヌードマウスへと皮下移植した。腫瘍が１５８ｍｍ^３に達したときに、動物を表Ａ１に示す群に無作為に割り当て、処置を盲検比較試験にて開始した。動物を、１日目にレジメン１に従って処置し、その後、表Ａ１にて示すように後続日にレジメン２に従って処置した。
（表Ａ１）試験設計

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【0501】

腫瘍体積をキャリパーによって週２回測定した。試験期間は６６日間とし、生存を主要エンドポイントとした。追加の腫瘍応答基準を測定し、表Ａ２に示す。マウスは、腫瘍体積が８００ｍｍ^３を超えたときに安楽死させ、生存率（％）対試験日をカプラン・マイヤーでプロットし、ログランク検定を使用して統計学的に評価した。ｖ１００００の血清濃度を、ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡにより試験７日目に決定した。

【0502】

結果を、図４８Ａ（腫瘍体積）及び図４８Ｂ（カプラン・マイヤー生存）に示す。変異体１００００は、ｖ６９０８処置対照と比較して腫瘍増殖を減少させ、ログランク検定により有意に生存を延長した（図４８Ｂ及び表Ａ３）。ｖ１００００を用いて処置された動物は、６６日間を超える生存中央値を有し、一方で、ｖ６９０８を用いて処置された動物は、２５．７８日間の生存中央値を有した（図４８Ｂ及び表Ａ２）。試験３０日目の腫瘍体積は、それぞれｖ１００００及びｖ６９０８処置群で、４６１ｍｍ３及び８１０ｍｍ３であった（図４８Ａ及び表Ａ２）。血清曝露は、試験７日目で１４０．９μｇ／ｍＬであり、これは、予測された血清濃度が達成されたことを示す。

【0503】

これらの結果は、このＨＥＲ２−低、非遺伝子増幅ＮＳＣＬＣモデルにおいて、ｖ１００００を用いた処置が、対照ｈＩｇＧを用いた処置と比較して、腫瘍増殖を減少させ、生存を延長することができることを示す。
（表Ａ２）Ａ５４９腫瘍応答プロファイル

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ＣＲ−完全奏功
ＰＲ−部分奏功
ＰＤ−進行性疾患
ＳＤ−安定疾患
（表Ａ３）ログランク概要

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凡例：ｎｓ＝有意でない、★＝Ｐ＜０．０５．★★＝Ｐ＜０．０１、★★★＝Ｐ＜０．００１

【0504】

実施例４６：ＨＥＲ２−低、頭頸部扁平上皮癌の異種移植モデルにおける生存及び腫瘍増殖に与えるｖ１００００の効果
この実験を、頭頸部癌のＦａＤｕ異種移植モデルにおけるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（ｖ６３３６）及び対照ヒトＩｇＧ（ｖ６９０８）と比較したｖ１００００の有効性を評価するために行った。ＦａＤｕ細胞は、ＨＥＲ２低、非ＨＥＲ２遺伝子増幅、ＨＥＲ３＋、ＥＧＦＲ＋であり、ＭＴＤでシスプラチンに高感受性である、頭頸部の扁平上皮がんから誘導される。本試験は、下記のように実行した。

【0505】

腫瘍細胞懸濁液を、無胸腺ヌードマウスへと皮下移植した。腫瘍が１２１ｍｍ^３に達したとき、動物を表Ａ４に示す群に無作為に割り当て、処置を盲検比較試験にて開始した。シスプラチンを購入し、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ノースカロライナ州モリスビル）による試験のために提供した。動物を、１日目にレジメン１に従って処置し、その後、表Ａ４にて記すように後続日にレジメン２より処置した。
（表Ａ４）試験設計

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【0506】

腫瘍体積をキャリパーによって週２回測定した。試験期間は５９日間とし、生存を主要エンドポイントとした。追加の腫瘍応答基準を測定し、表Ａ５に示す。マウスは、腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたときに安楽死させ、生存率（％）対試験日をカプラン・マイヤーでプロットし、ログランク検定を使用して統計学的に評価した。ｖ１００００及びｖ６３３６の血清濃度を、ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡにより試験７日目に決定した。

【0507】

結果を、図４９Ａ（腫瘍体積）及び図４９Ｂ（カプラン・マイヤー生存）に示す。変異体１００００は、ｖ６９０８処置対照及びｖ６３３６と比較して腫瘍増殖を減少させたのみでなく、ｖ６９０８と比較してログランク検定により有意に生存を延長した（図４８Ｂ及び表Ａ３）。ｖ１００００を用いて処置された動物は、４６日間を超える生存中央値を有し、一方で、ｖ６９０８及びｖ６３３６を用いて処置された動物は、それぞれ２５及び４０日間の生存中央値を有した（図４９Ｂ及び表Ａ５）。試験２５日目の腫瘍体積は、それぞれｖ１００００、ｖ６９０８及びｖ６３３６処置群で、１０２５、１９７９、１２５７ｍｍ^３であった（図４９Ａ及び表Ａ５）。血清曝露は、試験７日目にｖ１００００では１１６．６μｇ／ｍＬ、ｖ６３３６では１１９．９μｇ／ｍＬ、及びｖ１００００＋シスプラチンでは１０７．２μｇ／ｍＬであり、これは、各試験物で、予測された血清濃度が達成されたことを示す。

【0508】

これらの結果は、ＨＥＲ２−低、非遺伝子増幅頭頚部癌のこのモデルにおいて、単独療法としてｖ１００００を用いた処置が、対照ＩｇＧを用いた処置と比較して腫瘍体積を低減させ、生存を延長することができたことを示す。全体的に、ｖ１００００は、ｖ６３３６（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標））と比較して腫瘍体積を低減させる傾向を示した。

【0509】

変異体１００００を、シスプラチンとの組み合わせにおいても検査した。ｖ１００００及びシスプラチンの併用は、ｖ６９０８、ｖ６３３６、及び単剤シスプラチンと比較して生存を有意に延長した（表Ａ５）。ｖ１００００及びシスプラチン併用の生存中央値は、５３日間であり、一方でｖ６９０８、ｖ６３３６、及び単剤シスプラチンの生存中央値は、それぞれ２５、４０、及び４０日間であった。

【0510】

これらの結果は、シスプラチンと組み合わせてｖ１００００を用いた処置が、頭頸部癌のこのモデルにおいて、ｖ６９０８及びｖ６３３６と比較して腫瘍増殖を低減させ、生存を延長することができたことを実証する。
（表Ａ５）ＦａＤｕ腫瘍応答プロファイル

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ＣＲ−完全奏功
ＰＲ−部分奏功
ＰＤ−進行性疾患
ＳＤ−安定疾患
（表Ａ６）ログランク概要

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凡例：ｎｓ＝有意でない、★＝Ｐ＜０．０５．★★＝Ｐ＜０．０１、★★★＝Ｐ＜０．００１

【0511】

実施例４７：ＨＥＲ２ １＋、ＥＲ＋乳癌の異種移植モデルにおける生存及び腫瘍増殖阻害に与えるｖ１００００の効果
この実験を、乳癌のＳＴ１３３７Ｂ異種移植モデルにおける、対照ＩｇＧ（ｖ６９０８）またはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（ｖ６３３６）と比較したｖ１００００の有効性を評価するために行った。ＳＴ１３３７Ｂは、ルミナルＢ分子分類を有するＥＲ＋／ＰＲ−乳癌からのヌードマウスにて樹立された患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）である。ＳＴ１３３７は、ＩＨＣにより測定されて、ＨＥＲ２ １＋である。本試験は、下記のように実行した。

【0512】

腫瘍断片を、無胸腺ヌードマウスへと皮下移植した。腫瘍が１８０ｍｍ^３に達したときに、動物を表Ａ７に示す群に無作為に割り当て、処置を盲検比較試験にて開始した。動物を、表Ａ７に示すようにレジメン１に従って処置した。
（表Ａ７）試験設計

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【0513】

腫瘍体積をキャリパーによって週２回測定した。試験期間は６３日間とし、生存を主要エンドポイントとした。追加の腫瘍応答基準を測定し、表Ａ８に示す。マウスは、腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたときに安楽死させ、生存率（％）対試験日をカプラン・マイヤーでプロットし、ログランク検定を使用して統計学的に評価した。ｖ１００００及びｖ６３３６の血清濃度を、ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡにより試験７日目及び、３２日目の最終用量の４日後である３６日目に決定した。

【0514】

結果を、図５０Ａ（腫瘍体積）及び図５０Ｂ（カプラン・マイヤー生存）に示す。すべての被験用量の変異体１００００を用いた処置は、ｖ６９０８を用いた処置と比較して腫瘍増殖を低下させ、ｖ６９０８と比較してログランク検定により有意に生存を延長させた（図５０Ｂ及び表Ａ９）。加えて、３０ｍｇ／ｋｇのｖ１００００を用いた処置は、１０ｍｇ／ｋｇのｖ６３３６を用いた処置と比較して有意に生存を延長させた（図５０Ｂ及び表Ａ８）。ｖ１００００を用いて処置した動物は、３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇ用量で、それぞれ４９、５９、及び５９日間の生存中央値を有した（図５０Ｂ及び表Ａ８）。３、１０及び３０ｍｇ／ｋｇのｖ１００００を用いた処置の試験２９日目の腫瘍体積は、それぞれ１０１０、１０１６、及び９３１ｍｍ３であった。ｖ６９０８及びｖ６３３６の試験２９日目の腫瘍体積は、それぞれ１８９８及び１２６４ｍｍ３であった（図５０Ａ及び表Ａ８）。ｖ６３３６及びｖ１００００の血清曝露を表Ａ１０に示す。これらの結果により、ｖ１００００の投与量の増加が、ｖ１００００の血清濃度の増加をもたらすこと、及び同様の用量のｖ１００００及びｖ６３３６が抗体の同様の血清濃度をもたらすことが確認された。

【0515】

これらの結果は、ｖ１００００を用いた処置が、ＩｇＧ対照及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）と比較したときに、ＨＥＲ２−低、ＥＲ＋乳癌のこのモデルにおいて、腫瘍体積を低減させ、生存を延長させることができることを示す。
（表Ａ８）ＳＴ１３３７ｂ腫瘍応答プロファイル

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ＣＲ−完全奏功
ＰＲ−部分奏功
ＰＤ−進行性疾患
ＳＤ−安定疾患
（表Ａ９）ログランク概要

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凡例：ｎｓ＝有意でない、★＝Ｐ＜０．０５．★★＝Ｐ＜０．０１、★★★＝Ｐ＜０．００１
（表Ａ１０）血清曝露概要

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【0516】

実施例４８：ＨＥＲ２陰性膵臓癌の異種移植モデルにおける生存及び腫瘍増殖阻害に与えるｖ１００００の効果
この実験を、膵臓癌のＳＴ８０３異種移植モデルにおいて、単剤としての対照ＩｇＧ（ｖ１２４７０）、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（ｖ６３３６）、及びｎａｂ−パクリタキセル、ならびにｎａｂ−パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ（商標）Ｃｅｌｇｅｎｅ）と組み合わせたｖ１００００と比較したｖ１００００の有効性を評価するために行った。ＳＴ８０３は、ＩＨＣにより測定されてＨＥＲ２陰性である膵臓癌の患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）（Ｓｏｕｔｈ Ｔｅｘａｓ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓａｎ Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ７８２２９）である。本試験は、下記のように実行した。

【0517】

腫瘍断片を、無胸腺ヌードマウスへと皮下移植した。腫瘍が１７０ｍｍ^３に達したときに、動物を表Ａ１１に示す群に無作為に割り当て、処置を盲検比較試験にて開始した。動物を、表Ａ１１に示すようにレジメン１及び２に従って処置した。すべての処置は静脈内投与した。
（表Ａ１１）試験設計

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【0518】

腫瘍体積をキャリパーによって週２回測定した。試験期間は７１日間とし、生存を主要エンドポイントとした。追加の腫瘍応答基準を測定し、表Ａ１２に示す。マウスは、腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたときに安楽死させ；生存率（％）対試験日をカプラン・マイヤーでプロットし、ログランク検定を使用して統計学的に評価した。ｖ１００００及びｖ６３３６を投薬された群の血清濃度を、ＨＥＲ２ ＥＬＩＳＡにより試験７日目に決定した。

【0519】

結果を、図５１Ａ（腫瘍体積）及び図５１Ｂ（カプラン・マイヤー生存）に示す。ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせた変異体１００００を用いた処置のみが、対照ＩｇＧ（ｖ１２４７０）を用いた処置と比較して、腫瘍増殖を低下させ、ログランク検定により有意に生存を延長させた（図５１Ｂ及び表Ａ１３）。加えて、ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせたｖ１００００を用いた処置は、ｎａｂ−パクリタキセル＋対照ＩｇＧを用いた処置と比較して生存を有意に延長させた（図５１Ｂ及び表Ａ１３）。ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせたｖ１００００の生存中央値は、７１日間を超え、一方で単剤としてのｖ１２４７０、ｖ６３３６、ｖ１００００、及びｎａｂ−パクリタキセルの生存中央値は、それぞれ５８．８、６５．９、６９．３、及び６０．６日間であった。ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせたｖ１００００を用いた処置での試験５４日目の平均腫瘍体積は、１０７３ｍｍ３であった。試験５４日目の単剤としてのｖ１２４７０、ｖ６３３６、ｖ１００００、及びｎａｂ−パクリタキセルでの腫瘍体積は、それぞれ１６６３、１４９４、１３０５、及び１３６５ｍｍ３であった（図５１Ａ及び表Ａ１２）。１４日目の血清試料からのｖ６３３６及びｖ１００００の血清曝露を表Ａ１４に示す。

【0520】

これらの結果は、ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせたｖ１００００を用いた処置が、ＨＥＲ２陰性膵臓癌のこのモデルにおいて、ＩｇＧ対照、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）、及び単剤ｖ１００００と比較したとき、腫瘍体積を低減させ、生存を延長することができることを示す。
（表Ａ１２）ＳＴ８０３腫瘍応答プロファイル

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ＣＲ−完全奏功
ＰＲ−部分奏功
ＰＤ−進行性疾患
ＳＤ−安定疾患
＊ｎａｂ−パクリタキセル
（表Ａ１３）ログランク概要

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凡例：ｎｓ＝有意でない、★＝Ｐ＜０．０５．★★＝Ｐ＜０．０１、★★★＝Ｐ＜０．００１
＊ｎａｂ−パクリタキセル
（表Ａ１４）血清曝露概要

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【0521】

実施例４９：ＨＥＲ２ ３＋胃癌の異種移植モデルにおける腫瘍増殖阻害に与えるｖ１００００の効果
この実験を、胃癌のＧＸＡ３０５４異種移植モデルにおいて単剤として対照ＩｇＧ（ｖ１２４７０）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）（ｖ６３３６）と比較したｖ１００００の有効性を評価するために行った。ＧＸＡ３０５４は、ＨＥＲ２ ３＋である胃癌の患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）である（Ｏｎｃｏｔｅｓｔ ＧｍｂＨ，Ａｍ Ｆｌｕｇｈａｆｅｎ １２−１４，７９１０８ Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。本試験は、下記のように実行した。

【0522】

腫瘍断片を、無胸腺ヌードマウスへと皮下移植した。腫瘍が１４４ｍｍ^３に達したときに、動物を表Ａ１５に示す群に無作為に割り当て、処置を盲検比較試験にて開始した。動物を、表Ａ１５に示すようにレジメン１に従って処置した。
（表Ａ１５）試験設計

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【0523】

腫瘍体積をキャリパーによって週２回測定した。試験期間は５９日間とし、腫瘍増殖阻害を主要エンドポイントとした。追加の腫瘍応答基準を測定し、表Ａ１６に示す。マウスは、腫瘍体積が２０００ｍｍ^３を超えたときに安楽死させた。

【0524】

結果を、図５２（腫瘍体積）に示す。変異体１００００及びｖ６３３６を用いた処置は、対照ＩｇＧ（ｖ１２４７０）を用いた処置と比較して腫瘍増殖を低下させた（図５２及び表Ａ１６）。加えて、ｖ１００００を用いた処置は、ｖ６３３６を用いた処置と比較して腫瘍増殖を低下させた（図５２及び表Ａ１６）。対照ＩｇＧ、ｖ１００００及びｖ６３３６を用いた処置での試験３５日目の平均腫瘍体積は、それぞれ１３４０、２３６、及び７．８ｍｍ３であった。ｖ１００００及びｖ６３３６での３５日目の腫瘍増殖阻害は、それぞれ１１１及び９２％であった（表Ａ１６）。３５日目に、ｖ１００００を用いて処置された腫瘍は、ｖ６３３６で処置された腫瘍（０／１０完全及び１／１０部分奏功）と比較して、より大きな応答を示した（７／１０完全及び３／１０部分奏功）（表Ａ１６）。試験の完了時、５９日目には、ｖ１００００を用いて処置した腫瘍の９／１０は完全奏功を有し、再発腫瘍のエビデンスは伴わなかったが、ｖ６３３６処置腫瘍では、１／１０腫瘍のみが完全奏功を有した。

【0525】

これらの結果は、ｖ１００００を用いた処置が、ＨＥＲ２ ３＋胃癌のこのモデルにおいて腫瘍を退縮させることができることを示す。ｖ１００００の腫瘍増殖阻害は、ＩｇＧ対照及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）より優れていた。
（表Ａ１６）ＧＸＡ３０５４腫瘍応答プロファイル

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ＣＲ−完全奏功
ＰＲ−部分奏功
ＰＤ−進行性疾患
ＳＤ−安定疾患

【0526】

実施例において使用した試薬は、概して市販されているか、または当技術分野で公知の市販の計器、方法、または試薬を使用して調製することができる。上述の実施例は、本明細書に記載の様々な態様及び本明細書に記載の方法の実施を例示している。これらの実施例は、本発明の多くの異なる実施形態の包括的な記載を提供することを意図したものではない。したがって、前述の発明は、理解を明瞭にすることを目的として実例及び実施例によって多少詳細に記載されているが、当業者は、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、これに多くの変更及び修正を成すことができることを容易に理解するであろう。

【0527】

本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が具体的及び個別に参照により本明細書に組み込まれると示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【0528】

配列の表

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ペルツズマブ変異体ＣＤＲ−Ｌ３：ＱＱＹＹＩＹＰＡＴ
クローン３３８２、変異体１００００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４７）
ペルツズマブ変異体ＣＤＲ−Ｈ１：ＧＦＴＦＡＤＹＴ
クローン６５８６、変異体１００００（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４８）

【図1】

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【図2A】

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【図2B】

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【図2C】

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【図3A】

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【図3B】

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【図4A】

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【図4B】

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【図5A】

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【図5B】

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【図6A】

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【図6B】

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【図6C】

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【図6D】

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【図6E】

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【図6F】

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【図6G】

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【図7A】

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【図7B】

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【図7C】

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【図7D】

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【図7E】

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【図8】

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【図9】

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【図10A】

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【図10B】

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【図10C】

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【図10D】

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【図10E】

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【図10F】

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【図11】

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【図12】

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【図13】

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【図14】

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【図15】

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【図16】

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【図17A】

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【図17B】

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【図17C】

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【図17D】

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【図17E】

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【図17F】

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【図17G】

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【図18A】

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【図18B】

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【図19A】

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【図19B】

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【図20】

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【図21】

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【図22】

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【図23】

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【図24】

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【図25】

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【図26】

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【図27A】

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【図27B】

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【図27C】

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【図27D】

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【図28A】

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【図28B】

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【図28C】

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【図29】

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【図30】

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【図31A】

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【図31B】

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【図31C】

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【図31D】

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【図32】

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【図33】

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【図34】

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【図35】

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【図36】

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【図37】

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【図38】

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【図39A】

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【図39B】

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【図39C】

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【図39D】

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【図40】

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【図41A】

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【図41B】

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【図41C】

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【図41D】

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【図42】

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【図43A】

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【図43B】

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【図43C】

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【図44】

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【図45】

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【図46A】

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【図46B】

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【図46C】

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【図47】

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【図48】

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【図49】

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【図50】

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【図51】

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【図52】

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【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]