特許 6872566 細菌のグラムタイプを特定するためのプロセス及びシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6872566

(24)【登録日】2021年4月21日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】細菌のグラムタイプを特定するためのプロセス及びシステム

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20210510BHJP

   G01N 21/27 20060101ALI20210510BHJP

   G01N 21/59 20060101ALI20210510BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/04

   G01N21/27 B

   G01N21/59 Z

   C12M1/34 B

【請求項の数】20

【全頁数】23

(21)【出願番号】特願2018-565828(P2018-565828)

(86)(22)【出願日】2017年6月13日

(65)【公表番号】特表2019-522970(P2019-522970A)

(43)【公表日】2019年8月22日

(86)【国際出願番号】EP2017064454

(87)【国際公開番号】WO2017216190

(87)【国際公開日】20171221

【審査請求日】2020年3月10日

(31)【優先権主張番号】16174717.5

(32)【優先日】2016年6月16日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】304043936

【氏名又は名称】ビオメリュー

【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＭＥＲＩＥＵＸ

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人

(72)【発明者】

【氏名】ルルー， ドゥニ

(72)【発明者】

【氏名】ララム， エリク

(72)【発明者】

【氏名】マエー， ピエール

(72)【発明者】

【氏名】ミダフン， ローニ

(72)【発明者】

【氏名】バルラス， フィリピーヌ

【審査官】 松田 芳子

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−０６８２６６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０２３１７７７７（ＣＮ，Ａ）

【文献】 American Society of Agricultural and Biological Engineers，２０１５年，vol.58, no.1, p.5-16

【文献】 Sensors，２０１６年 ４月，vol.16, no.4, 466

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／０４

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＷＰＩＤＳ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細菌株のグラムタイプの検出であって、
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの波長範囲で、該範囲において自然電磁応答を有する該株の少なくとも１つの細菌を照明すること；
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲で、該照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得すること；及び
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲で取得した光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定すること
を含む、検出。

【請求項2】

前記細菌が、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲における自然電磁応答も有し、かつ、
− 前記細菌の照明もまた７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲で行われ；
− 照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度の取得もまた、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で行われ；かつ
− 細菌株のグラムタイプの決定が、前記４１５ｎｍ〜４４０ｎｍ及び７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で取得した光強度の関数として行われる、
請求項１に記載の細菌株のグラムタイプの検出。

【請求項3】

前記グラムタイプの決定が、
− 取得した光強度の関数として前記照明された細菌の反射率又は吸収係数を計算すること；
− 計算された反射率又は吸収係数の関数としてグラムタイプを決定すること
を含む、請求項１又は２に記載の検出。

【請求項4】

前記グラムタイプの決定が、
− 計算された反射率又は吸収係数の波長における一次導関数を計算すること；
− 計算された一次導関数の関数としてグラムタイプを決定すること
を含む、請求項３に記載の検出。

【請求項5】

前記グラムタイプの決定が、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲の単一波長における光強度の関数として行われる、請求項１から４の何れか一項に記載の検出。

【請求項6】

前記単一波長が４２０ｎｍの単一波長である、請求項５に記載の検出。

【請求項7】

前記グラムタイプの決定が、
− ４２０ｎｍにおける光強度に等しい値、又はそれから計算された値と、第１の所定の閾値及び第２の所定の閾値とを比較して、グラム陰性染色からグラム陽性染色を分離することであって、第１の閾値が第２の閾値よりも大きく；
− 前記値が第１の閾値を下回る場合にグラム陰性と決定し、前記値が第２の閾値を上回る場合にグラム陽性と決定すること
を含む、請求項５又は６に記載の検出。

【請求項8】

前記グラムタイプの決定が、取得した光強度、又はそれから計算された値を関連する、所定の線形予測をグラムタイプに適用し、その後、適用された線形予測の結果を閾値化することを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の検出。

【請求項9】

前記グラムタイプの決定が、取得した光強度、又はそれから計算された値にＳＶＭタイプの２クラス分類を適用することを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の検出。

【請求項10】

前記照明すること及び前記取得することが、細菌株のコロニーと該株が成長した栄養培地とを含むサンプルに対して直接行われる、請求項１から９の何れか一項に記載の検出。

【請求項11】

前記グラムタイプの決定が、前記栄養培地の関数として行われる、請求項１０に記載の検出。

【請求項12】

前記栄養培地が、その表面でコロニーが成長した不透明の基質である、請求項１０又は１１に記載の検出。

【請求項13】

前記基質が１０％以下の反射率ρを有する、請求項１２に記載の検出。

【請求項14】

前記基質が５％以下の反射率ρを有する、請求項１２に記載の検出。

【請求項15】

前記光強度を取得することが、株の細菌のコロニーのハイパースペクトル又はマルチスペクトル画像を取得することを含み、該光強度が、コロニーに対応する前記画像の少なくとも１つのピクセルの関数として決定される、請求項１から１４の何れか一項に記載の検出。

【請求項16】

前記光強度がコロニーに対応する前記画像の平均ピクセルに等しい、請求項１５に記載の検出。

【請求項17】

細菌株のグラムタイプを検出するためのシステムであって、
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの波長範囲で、該株の少なくとも１つの細菌を照明するように構成された照明；
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得するように構成されたセンサ；及び
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲で取得された光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定するように構成されたコンピュータユニット
を含む、システム。

【請求項18】

− 前記照明が、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲で前記細菌を照明するように構成されており；
− 前記センサが、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得するように構成されており；かつ
− 前記コンピュータユニットが、前記４１５ｎｍ〜４４０ｎｍ及び７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で取得した光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定するように構成されている、
請求項１７に記載のシステム。

【請求項19】

前記株の細菌のコロニー及び前記コロニーが成長した栄養培地を含むサンプルを照明し、その画像を取得するように構成されている、請求項１７又は１８に記載のシステム。

【請求項20】

前記サンプルが、ペトリ皿に入れられている、請求項１９に記載のシステム。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物分析の分野に関し、特に、細菌のグラムタイプの特定に関する。

【0002】

有利には、本発明は、非色素原性、非蛍光原性、かつ色素を含まない栄養培地で成長した細菌コロニーのハイパースペクトル又はマルチスペクトル画像の解析に適用される。

【背景技術】

【0003】

細菌株のグラム分類は、例えばそのペプチドグリカンのパーセンテージなど、その壁の特徴づけを可能にし、細菌の分類学に、又は抗生物質に対するそれらの感受性を評価するために、用いられる。このように、２つのタイプの細菌、すなわち、グラム「陽性」細菌及びグラム「陰性」細菌が識別される。細菌株のグラムタイプを知得することによって、該株を特定するため、又は、例えば本出願人が販売するＶｉｔｅｋ（登録商標）２自動装置によって行われる抗生物質感受性試験に適したカードの選択など、抗生物質感受性試験を行うために、適切な試験を選択することが可能になる。

【0004】

歴史的に、細菌株のグラムタイプは、多数の手動による工程（固定、染色、エッチング、洗浄、対比染色等）を含み、したがって実施に時間がかかる、「グラム染色」として知られる手動の技法によって決定されていた。したがって、特に多数のサンプルを処理するために、細菌のグラムタイプの検出を自動化するためのさまざまな技法が開発されている。しかしながら、これらの技法は、ほとんどが、それらのグラムを容易に観察可能にするために細菌又はそれらの培地の電磁応答を修正し続けるものである。

【0005】

例えば、第１のタイプの技法は、顕微鏡カバーガラス上での細菌細胞膜の染色を自動化することからなるが、グラムタイプを決定する最後の工程は、未だに顕微鏡下でカバーガラスを見る技術者によって行われている。したがって、このタイプの技法は完全には自動化されておらず、さらには、自動化が困難である。これは、グラム陽性細菌とグラム陰性細菌との色の差がわずかでありうることを理由とし、実験技術者の関与が依然として必要とされている理由を説明している。
第２のタイプの技法は、細菌細胞膜のペプチドグリカンによって開始される酵素反応によって分解する基質の存在下に細菌を配置することからなる。この反応は、その濃度がグラムの指標となる、発色団又はフルオロフォアを生成する。細菌の発色性又は蛍光性「染色」という用語は、通常使用されている。このタイプの先行技術は、適切なデバイス（例えば分光計／蛍光光度計）を使用して、例えば発色団／フルオロフォアの光強度を測定することによって、及び、その後、コンピュータープログラムを使用して、測定された強度をあらかじめ定義された閾値と比較することによって、自動化することができるが、それでもなお、それらは、高価であることが多い、特定の発色団又は蛍光発生基質の設計を必然的に伴う。

【0006】

加えて、用いられる手法にかかわらず、細菌は、それらの自然な状態に改変を被り（例えば、それらが色素を含む、それらが発色性又は蛍光性の標識と結合している等）、したがって、その後の特性評価試験（例えば抗生物質感受性の決定）には使用できない。

【発明の概要】

【0007】

本発明の目的は、自動化され、かつ、そのグラムを決定するために細菌の標識化又は染色を必要としない、細菌株のグラムタイプを決定する方法を提供することである。

【0008】

この趣旨で、本発明の主題は、
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの波長範囲で、該範囲において自然電磁応答を有する前記株の少なくとも１つの細菌を照明すること；
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得すること；及び
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲で取得された光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定すること
を含む、細菌株のグラムタイプを検出するためのプロセスである。

【0009】

本発明の目的について、表現「自然電磁」応答は、細菌が、少なくとも対象とする波長範囲の照明に対するその電磁応答を改変する要素（色素、色素原（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅ）、蛍光原（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｅ）等）によって改変されていないことを意味することが意図されている。例えば、株のコロニーは、無着色、非色素原性、及び非蛍光性の栄養培地で培養され、照明／取得は、その培地にまだ存在しているコロニーに直接行われる。

【0010】

言い換えれば、本発明者らは、細菌が「自然に」そのグラムタイプの電磁シグネチャ特性を有する波長範囲を発見した。よって、本発明に従う方法は、このシグネチャを測定し、その後、そこからグラムタイプを抽出することからなる。したがって、発色性又は蛍光性の基質又は色素を使用する必要はない。さらには、本発明に従う方法は、照明し、スペクトルを測定し、このスペクトルを処理、特にコンピュータ処理を行うことで構成される限り、速い。

【0011】

一実施態様によれば、該細菌はまた、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲における自然電磁応答も有し、かつ、
− 該細菌の照明もまた７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲で行われ；
− 照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度の取得もまた、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で行われ；かつ
− 細菌株のグラムタイプの決定は、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍ及び７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で取得した光強度の関数として行われる。

【0012】

言い換えれば、細菌は、そのグラムの７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の特性に自然電磁シグネチャも含む。グラムの検出もまた、この範囲で行うことができる。有利には、２つの波長範囲を組み合わせることによって、グラムタイプの決定において、より良好な精度が得られる。

【0013】

一実施態様によれば、グラムタイプの決定は、
− 取得した光強度の関数としての前記照明された細菌の反射率又は吸収係数の計算
− 計算された反射率又は吸収係数の関数としてのグラムタイプの決定
を含む。

【0014】

言い換えれば、反射率又は吸収係数は、これが照明及びセンサのスペクトルの挙動に関して測定された信号を補正することから（例えば対象範囲における照明のスペクトルの白色点、黒色点、不均一性等）、細菌の自然電磁挙動をより忠実に反映し、したがって、より正確な検出が可能になる。

【0015】

特に、グラムタイプの決定は、
− 計算された反射率又は吸収係数の波長での一次導関数の計算；
− 計算された一次導関数の関数としてのグラムタイプの決定
を含む。

【0016】

言い換えれば、本発明者らは、グラムの電磁シグネチャ特性が、光強度又は反射率／吸収係数を導き出すときに、より識別力があり、それによって、より正確な検出が可能となることを指摘している。

【0017】

一実施態様によれば、グラムタイプの決定は、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲の単一波長、特に４２０ｎｍの波長における光強度の関数として行われる。より詳細には、グラムタイプの決定は、
− ４２０ｎｍにおける光強度に等しい値、又はそれから計算された値を、所定の第１の閾値及び所定の第２の閾値と比較し、グラム陰性染色からグラム陽性染色を分離することであって、第１の閾値が第２の閾値よりも大きく；
− 前記値が第１の閾値を上回る場合にグラム陰性と決定し、前記値が第２の閾値を下回る場合にグラム陽性と決定すること
を含む。

【0018】

言い換えれば、特に４２０ｎｍにおいてなど、単一波長を用いてさえも、検出において良好なレベルの精度が得られる。特に、単純閾値化により、８０％の最小精度を有することが可能となる。これは、コンピュータ計算、及び／又は、照明及びセンサを単純化可能にする。決定は、光強度自体に基づいて行うことができ、あるいはその前処理（例えばノイズのフィルタリング、オフセットの除去、一次又は二次導関数への移行等）の後に行うこともできる。

【0019】

一実施態様によれば、グラムタイプの決定は、取得した光強度、又はそれから計算された値を連結する、所定の線形予測をグラムタイプに適用し、その後、適用された線形予測の結果を閾値化することを含む。このような技法は、（未記載）よりも高い精度レベルを達成することを可能にする。

【0020】

変形として、グラムタイプの決定は、取得した光強度、又はそれから計算された値へのＳＶＭタイプの２クラス分類の適用を含む。

【0021】

一実施態様によれば、照明及び取得は、細菌株のコロニー及び該コロニーが成長した栄養培地を含むサンプルに直接行われる。

【0022】

言い換えれば、本発明が、実施するために特定のサンプル調製物の提供を含まないように、本発明は、有利には、例えばペトリ皿上など、通常は微生物のワークフローで、すなわちコロニーの成長において産生されるサンプルに直接適用される。さらには、コロニーは、株の非常に大量の細菌を含む。よって、コロニーが反射する、又はコロニーを透過する強度の測定は、検出の信頼性の程度を自然に増加させることができ、例えば、強度は自然に平均化される。しかしながら、本発明は、細菌の個々の検出に適用され、幾つかの細菌が観察された場合に統計的研究を実施可能であることに留意されたい。同様に、本発明は、当然、例えば細菌が懸濁されている液体培地など、ペトリ皿に通常使用されるもの（通常は寒天）以外の培地にも適用される。

【0023】

特に、グラムタイプの決定は、前記栄養培地の関数として行われる。言い換えれば、栄養培地は、対象とする波長範囲に、それ自体の「電磁シグネチャ」も有しており、したがって、グラムタイプの検出を妨害する可能性がある。栄養培地を考慮に入れることにより、処理中に、又はコロニーの成長に使用する培地の選択中に、より良好な検出精度が得られる。

【0024】

特に、その表面でコロニーが成長する不透明基質は、好ましくは１０％以下、好ましくは５％以下の反射率ρを有する。特に、反射された光強度に基づく検出の文脈では、より良好な精度が得られる。

【0025】

一実施態様によれば、光強度の取得は、株の細菌のコロニーのハイパースペクトル又はマルチスペクトル画像の取得を含み、光強度は、コロニーに対応する画像の少なくとも１つのピクセルの関数として決定される。特に、光強度は、コロニーに対応する画像の平均ピクセルに等しい。

【0026】

言い換えれば、ハイパースペクトル又はマルチスペクトル画像は、単一のセンサによって４１５ｎｍ〜４４０ｎｍ及び７５０ｎｍ〜８００ｎｍの２つの範囲を同時に取得することを可能にし、また、幾つかのピクセルにわたって取得された各波長の空間平均を取得することも可能にし、それによって検出の精度を高める。それ自体知られているように、用語「ハイパースペクトル」は、全体として（サンプリング間隔の範囲内まで）、波長範囲の取得に対応するのに対し、用語「マルチスペクトル」は、概して、異なる範囲での取得のことを指す。

【0027】

本発明の主題はまた、本明細書に記載された方法を実行するためのシステムでもある。特に、本発明の主題は、
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの波長範囲で、株の少なくとも１つの細菌を照明するように構成された照明；
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得するように構成されたセンサ；及び
− ４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲で取得された光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定するように構成されたコンピュータユニット
を含む、細菌株のグラムタイプを検出するためのシステムである。

【0028】

一実施態様によれば：
− 照明は、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲で前記細菌を照明するように構成されており；
− センサは、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲で、前記照明された細菌によって反射される又は該細菌を透過する光強度を取得するように構成されており；かつ
− 前記コンピュータユニットは、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍ及び７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲で取得した光強度の関数として細菌株のグラムタイプを決定するように構成されている。

【0029】

一実施態様によれば、システムは、前記株の細菌のコロニー及び該コロニーが成長した栄養培地、特にペトリ皿を含むサンプルを照明し、それらの画像を取得するように構成されている。

【0030】

本発明は、単なる例として与えられ、かつ、同一の参照が同一又は類似の要素を示す添付の図面に関して提供される、以下の説明を読むことによってより明確に理解されよう。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】本発明に従う、グラムタイプを予測するためのシステムの概略図

【図2】図１のシステムによって行われるグラムタイプを予測するためのプロセスのフローチャート

【図3A】透明培地上で成長した細菌コロニーの反射率のスペクトルを示すプロット

【図3B】図３Ａと同じ

【図4A】不透明培地上で成長した細菌コロニーの反射率のスペクトルを示すプロット

【図4B】図４Ａと同じ

【図5】本発明の一変形に従う、予測に用いられる線形予測モデルを示すプロット

【図6】さまざまな取得波長についてのシングルチャネル線形予測モデルによって得られた相関を示すプロット

【図7】シングルチャネル線形予測モデルによるグラムタイプの予測の結果を示すプロット

【図8】本発明に従う予測に使用できるさまざまな決定変数の表

【図9】マルチチャネル線形予測モデルによるグラムタイプの予測の結果を示すプロット

【図10】取得波長の関数としてのマルチチャネルモデルのパラメータを示すプロット

【図11】取得波長の関数としてのＳＶＭ分類に基づく予測モデルの成分を示すプロット

【図12】取得波長の関数としての「ｆｕｓｅｄ Ｌａｓｓｏ」タイプの学習に基づく予測モデルの成分を示すプロット

【図13A】ＴＳＡ及びＭＨ２培地で成長した細菌コロニーの反射率のスペクトルを示すプロット

【図13B】図１３Ａと同じ

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下の文では、表記Ａ_ｉ，ｊは、行列Ａのｉ番目の行及びｊ番目の列の要素に関連する。

【0033】

図１を参照すると、第１の実施態様に従う細菌株のグラムタイプを検出するためのシステム１０は、
− ハイパースペクトル画像の取得のためのデバイス１２；及び
− デバイス１２を制御するため、かつ、該デバイス１２によって取得された画像を受信し処理するために、デバイス１２に接続（例えば有線又は無線リンクによって）された、データ処理コンピュータユニット１４
を含む。

【0034】

デバイス１２、例えば、米国モンタナ州所在のＲｅｓｏｎｏｎ社の基準「Ｐｉｋａ ＩＩ」のハイパースペクトル画像システムは、
− 波長範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］＝［４００；９００］ナノメートルに感受性のＣＣＤ又はＣＭＯＳタイプのデジタルセンサなどの基本的センサのネットワークを含むデジタルセンサと、光散乱素子又は該センサによって取得される波長を選択するためのスペクトログラフとからなる、「ハイパースペクトル」カメラ１８；
− カメラ１８のデジタルセンサに、そのハイパースペクトル画像を取得することが望ましいペトリ皿２２の光学像を集束させるための対物レンズ２０；
− 例えば、ペトリ皿２２の均一な前面照明を生成するために、範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］で発光可能な、例えば２つ又は４つのランプなど１つ以上のアロジェニックなランプからなる、前面照明２４。例えば、照明は白色ランプである；
− 範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］でペトリ皿２２の均一な背面照明を生成するために、例えば白色ＬＥＤマトリクスからなる、背面照明２６；及び
− ペトリ皿２２を着座させ、走査することによってペトリ皿２２の全体画像を得るために、該ペトリ皿２２が対物レンズ２０の前を通過することを可能にする、キャリッジ２８
を含む。

【0035】

デバイス１２は、例えば、１６０マイクロメートルのサンプリング間隔（空間分解能は３００マイクロメートルと推定される）及び範囲［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］にわたる１．７ナノメートルのスペクトル分解能で、９０ミリメートル×９０ミリメートルの領域の画像を取得するように構成される。

【0036】

よって、デバイス１２は、Ｎ行及びＭ列を有する、ペトリ皿によって反射された光のデジタル画像ＨＳＩを生成し、該ペトリ皿２２は、好ましくは開いている（すなわち、蓋なし）：

【0037】

一般に「光強度」と称される、ピクセルの輝度は、本明細書では、例えばデジタル写真の分野からそれ自体知られているように、露光時間の間にカメラ１８のセンサの対応する基本的な感受性部位の表面に入射する光量に対応する。

【0038】

各ピクセルＲａｄ_ｉ，ｊ（λ）は、さまざまな波長［λ_ｍｉｎ；λ_ｍａｘ］における、ピクセルに対応する皿２２の輝度のデジタルスペクトルで構成されており、該デジタルスペクトルは、次の関係によって表される：

式中、Δλはスペクトル分解能であり、ｐは、

に属する正の整数である。取得波長λ_ｍｉｎ＋ｐ×Δλは、通常、用語「チャネル」で表される。

【0039】

データ処理ユニット１４は、例えば、パーソナルコンピュータ、タブレット、スマートフォン、サーバ、スーパーコンピュータ、若しくは、より一般的には、取得デバイス１２によって生成されたＨＳＩ画像の処理を実行するように構成された、特にＤＳＰ（デジタルシグナルプロセッサ）タイプの、１つ以上のマイクロプロセッサに基づくもの、ＦＰＧＡタイプの回路に基づくもの、これらの技術タイプを混在させる回路に基づくもの等、あらゆるシステムである。ユニット１４は、特に、デバイス１２によって生成された画像を保存するためのすべてのメモリ（ＲＡＭ、ＲＯＭ、キャッシュメモリ、メインメモリ等）、発明に従う方法を実施するための演算命令、この実行および中間計算と最終計算の結果、特に決定されたグラムタイプの保存に使用されるパラメータを有する。ユニット１４は、任意選択的に、グラムタイプの決定の最終結果を視覚化するための表示画面を含む。単一の処理ユニットが記載されているが、本発明は、明らかに、幾つかの処理ユニット（例えば、ＨＳＩ画像の前処理を実行するためにカメラ１８内に取り付けられたユニット、及び残りの処理を実行するためのデバイス１２の外部のユニット）によって実行される処理に適用される。さらには、システムには、例えば、キーボード／マウス、オペレータが利用可能なスクロールダウンメニュー、及びペトリ皿上に存在しかつ培地に関する情報を含むバーコード／ＱＲコードを読み取るバーコード／ＱＲコードリーダー等によって、ユニット１４内に、サンプルに関する、特に予測が培地に依存する場合に使用される培地の種類に関するデータを入力することを可能にするインターフェースを補充することができる。

【0040】

先ほど説明したシステムによって細菌株のグラムタイプを決定するプロセス３０が、図２のフローチャートに関連して詳細に説明される。

【0041】

本プロセスの第１のステップ３２では、細菌株の少なくとも１つのコロニーが、ペトリ皿に入れた栄養培地、又は「培養」培地の表面で培養される。栄養培地の主な目的は、該コロニーを成長させ、任意選択的に、光の乱れを制限することによってグラムタイプの検出の精度を補強することである。好ましくは、反射された光強度の関数としてのグラムタイプの検出に関して、栄養培地は不透明であり、それによって検出の精度を上げる。特に、不透明培地は、１０％以下、及び好ましくは５％以下、さらにより優先的には１％以下の反射率係数ρを有する。例えば、培養培地は、「ＣＰＳＯ」寒天（培地を不透明にするためにＳｉＯ_２を含む、「ＣＰＳ」寒天）、「コロンビア」寒天（又は「ＣＮＡ」寒天）、５％のヒツジ血液を含むコロンビア寒天（又は「ＣＯＳ」寒天）、Ｍａｎ−Ｒｏｇｏｓａ−Ｓｈａｒｐｅ寒天（「ＭＲＳＭ」寒天）、チョコレート寒天（「ＰＶＸ」寒天）等である。

【0042】

このタイプのコロニーの成長は一般的であることから、それについてはこの後でさらに詳細には説明しない。それは、有利には、オペレータが手動で、又は、それ自体知られている方法で播種するための自動化デバイスによって自動的に、実行することができる。有利には、その調製は、それに基づいてグラムタイプの予測が行われるコロニーが、互いに離れるように、かつ、コロニーの表面が、デバイス１２によって取得された画像における複数のピクセルに対応するように行われる。これは、特に、取得された画像におけるその後の識別を容易にすることを可能にする。

【0043】

ひとたびコロニーの成長が終わると、ペトリ皿は開かれ、キャリッジ２８の上に置かれ、照明２４及び２６が点灯され、３４において、取得デバイス１２によってペトリ皿の少なくとも１つのハイパースペクトル画像ＨＳＩが取得され、該取得された画像に基づいて株のグラムタイプを決定するためにコンピュータ処理を行う処理ユニット１４に保存される。

【0044】

ユニット１４は、任意選択的に、３６において、次の処理動作のうちの１つ又はこれらの処理動作の任意の組合せからなる、ノイズの前処理から始まる：
ａ．それ自体知られている方法でのカメラ１８のセンサのノイズ、特にそのオフセット、その空間ノイズ等の補正；
ｂ．例えば、ピクセルが有することができる最大値の例えば３分の２以上（すなわち、８ビットで符号化された、０〜２５５のピクセルの場合には、１７０以上）など、所定の閾値を上回る値を有するピクセルを排除するために行われる閾値化など、寄生、特に鏡面反射性の、ＨＳＩ画像に「過度に明るい点」を形成する反射の処理；
ｃ．細菌のタイプ及び使用される寒天のタイプによって変動しない波長で反射された光強度でＨＳＩ画像を除算することによって、照明の変動などの外部変動によって生じる画像の変動の低減を可能にする、ラジオメトリック処理；
ｄ．幾つかのＨＳＩ画像が取得された場合に、異常なピクセル値を検索及び除去し、及び／又は、取得された画像を平均化すること。

【0045】

処理は、３８において、前処理されたＨＳＩ画像を反射率のハイパースペクトル画像へと変換することを伴って、続行され、これは、ペトリ皿のみで生成された信号を抽出するために、異なる波長の輝度値を保存する。これは、特に、照明源２４、２６の発光スペクトルの変動のフィルタリングを可能にする。例えば、反射率を得るために、「フラットフィールド補正」（ＦＦＣ）タイプの補正が行われ、これはまた、ピクセル間センサ応答のばらつき（暗電流のばらつき、ゲインのばらつき等）を補正するという利点を有する。この変換は、例えば、次の関係に従う補正である：

式中、γ（λ）は反射率の画像であり、Ｗは、照明２４、２６を照射された、高反射率の中性物体、例えば９０％を超える均一な反射率のシート（例えば、「白色」シート又は１０％未満のグレーチャートを有するもの）の、ユニット１４に保存されたハイパースペクトル画像であり、Ｂは、低反射率の中性物体、例えば対物レンズ２０を遮蔽する黒色のカバーの画像の、ユニット１４に保存されたハイパースペクトル画像であり、ｍ（λ_ｍｉｎ＋ｐ×Δλ）＝１であるか、又はマトリクスＷ（λ_ｍｉｎ＋ｐ×Δλ）−Ｂ（λ_ｍｉｎ＋ｐ×Δλ）の平均に等しい。

【0046】

ユニット１４は、４０において、ステップ３８の後に、又は先行するステップと並行して、例えばＨＳＩ（λ）又はγ（λ）画像から細菌のコロニーを特定するアルゴリズムを実行する。任意の従来形状及び物体認識アルゴリズムを使用して、コロニーに対応する「Ｃｏｌ（λ）」と呼ばれる画像のゾーンを抽出することができる。変形として、この選択は、例えば、表示画面及びマウスタイプのポインティング機構の援助を得て、このゾーンを選択するオペレータによって手動で行われる。例として、ゾーンＣｏｌ（λ）は、コロニーに属するピクセル座標のリストからなる。選択されるピクセルゾーンは、ユニット１４によって保存される。

【0047】

プロセスは、４２において、ゾーンＣｏｌ（λ）に含まれる画像γ（λ）のピクセルの関数としての決定変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）の計算を伴って続行され、この変数には、グラムタイプの予測のための規則が適用される。１つの変形では、決定変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）は、画像γ（λ）のみに基づいている。他の変形では、画像γ（λ）は、後により詳細に説明するように、反射率画像γ（λ）の関数として計算された１つ以上の他のタイプのパラメータで補完または置換される。この趣旨で、反射率画像γ（λ）の処理は、したがって、任意選択的に行われる。特に、ユニット１４は、次のパラメータのうちの１つ又は他のものを計算する：
ｉ．例えば、ベール−ランベルト変換（関係（４））又はクベルカ−ムンク変換（関係（５））による、吸光度画像Ａ（λ）。理論に縛られることなく、本発明者らの意見では、グラム陰性細菌は、［４１５〜４４０］ｎｍの範囲の吸収剤であるチトクロームの含量がより高い点でグラム陽性細菌と異なり、吸光度画像への変換を特徴付け可能にする：

ｉｉ．光学効果による変動を低減するために正規化された反射率画像γ（λ）又は正規化された吸光度画像Ａ（λ）。ユニットは、例えば、面積正規化、単位ベクトル正規化、平均正規化、最大正規化、範囲正規化、又はピーク正規化を実行する。これらの正規化は、例えば、文献K. Varmuza and P. Filzmoser, “Introduction to Multivariate Statistical Analysis in Chemometrics”, CRC Press, 2009及び文献A. Rinnan, F. van den Berg and S. Engelsen, “Review of the most common pre-processing techniques for near-infrared spectra”, Trends in Analytical Chemistry, vol. 28, No. 10, 2009に記載されている；
ｉｉｉ．スペクトルの挙動の変化を強調し、かつ、ベースラインを低減するために、正規化又は非正規化された反射率画像γ（λ）若しくは正規化又は非正規化された吸光度画像Ａ（λ）の波長の一次導関数

又は、二次導関数

。好ましくは、多項式局所フィルタリングアルゴリズムは、エラー伝播を低減するために使用され、有利には、文献A. Savitzky and M.J.E. Golay “Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures”, Anal. Chem., vol. 36, pp.1627-1639, 1964に記載されるアルゴリズムである。

【0048】

その後、各コロニーのグラムタイプが、４４において、その変形が以下に記載されるあらかじめ定義された決定規則を提供することによって、変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）の関数としてユニット１４によって予測される。予測されたグラムタイプは、ユニット４４に保存され、及び／又は、画面に表示される。この予測発明は、例えば、その後のコロニーの同定／特徴付けのステップのために、他の微生物分析機器に送達される。

【0049】

Ａ．シングルチャネルアプローチ
第１の変形では、単一変数及びシングルチャネルアプローチがユニット１４で実行される。この手法によれば、決定変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）は、例えば、コロニーの（正規化又は非正規化された）反射率、又はコロニーの（正規化又は非正規化された）吸光度、又はそれらの一次導関数又は二次導関数など、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの波長範囲のあらかじめ定義された波長λ_ｃをとる単一の値になる。

【0050】

反射率に基づく第１の変形では、ユニット１４は、４２において、例えば、次の関係に従うコロニーのピクセルの平均スペクトルなど、コロニーの反射率のスペクトルを計算する：

式中、Ｎ_ｃｏｌは、ゾーンＣｏｌ（λ）のピクセルの数である。よって、決定変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）はγ_ｃｏｌ（λ_ｃ）に等しい。ユニット１４はまた、波長λ_ｃにおけるコロニーの測定の誤差、特に、ピクセルゾーンＣｏｌ（λ）に属するピクセルのすべての値γ_ｉ，ｊ（λ_ｃ）の「ＳＤ」で示される標準偏差も計算する。

【0051】

次に、４４において、ユニット４４は、スペクトル値γ_ｃｏｌ（λ_ｃ）に次の比較規則を適用する：

式中、

及び

は、培養培地に優先的に依存し、ユニット１４に保存される、２つのあらかじめ定義された閾値である。変形として、測定誤差ＳＤとしてゼロを選択することができる。

【0052】

図３Ａは、透明培地（この事例ではＣＰＳＥ）上で成長したコロニー、すなわち１０のグラム陰性（「ＧＮ」）株（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（３株）、エンテロバクター・クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、プロビデンシア・スチュアーティイ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ ｓｔｕａｒｔｉｉ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、モルガネラ−モルガニイ（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ ｍｏｒｇａｎｉｉ）、シトロバクター・フロインディー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ））及び１０のグラム陽性（「ＧＰ」）株（スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、エンテロコッカス・フェカーリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）（２株）、Ｂ群溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（２株）、Ｂ群溶血性連鎖球菌、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、Ｂ群溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ））の平均スペクトルγ_ｃｏｌ（λ）を示している。図３Ｂは、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲のより詳細な図である。図４Ａ及び４Ｂは、同じスペクトルであるが、不透明培地（この事例では、ＳｉＯ_２粒子を含むという点でＣＰＳＥとは異なる、ＣＰＳＯ）上で成長した株についてのスペクトルを示している。これらの例から分かるように、少なくとも４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲では、２つのグラムタイプは、互いに異なっており、その差異は不透明培地でさえも非常に顕著である。特に、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲では、グラム陰性細菌のスペクトルは、グラム陽性細菌のスペクトル未満であることが観察される。

【0053】

第１の変形を、臨床感染症に最も一般的に関与するものの中から、各培養培地で培養した３０の細菌株、すなわち（括弧内の種ごとの株の数）について試験した：
− グラム陰性：大腸菌（１）、クレブシエラ・ニューモニエ（１）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）（１）、プロテウス・ミラビリス（１）、モルガネラ−モルガニイ（１）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）（１）、アシネトバクター・バウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ）（１）、エンテロバクター・クロアカ（１）、セラチア・マルセッセンス（１）、シトロバクター・コセリ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｋｏｓｅｒｉ）（１）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）（１）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）（１）、ハフニア・アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）（１）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（１）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）（１）；
− グラム陽性：コリネバクテリウム・ジェイケイウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｉｋｅｉｕｍ）（１）、コリネバクテリウム・アミコラツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｙｃｏｌａｔｕｍ）（１）、エンテロコッカス・フェカーリス（１）、エンテロコッカス・フェシウム（１）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（１）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（１）、スタフィロコッカス・ヘモリチカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）（１）、スタフィロコッカス・ホミニス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）（１）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（１）、Ｂ群溶血性連鎖球菌（１）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（１）、ストレプトコッカス・アンギノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｎｇｉｎｏｓｕｓ）（１）、ストレプトコッカス・ビリダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ）（１）。

【0054】

４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲の各チャネルλについて、グラム陽性株の値λにおけるスペクトルの最少値

が決定される。同様に、グラム陰性株の値λにおけるスペクトルの最大値

が決定される。よって、培養培地で保持されるチャネルλ_ｃは、範囲

を最大化するものであり、該培地で保持されるあらかじめ定義された閾値は、それぞれ、値

及び

である。ＣＰＳＥ培地では、１０種のグラム陽性株及び９種のグラム陽性株を含む、上に列挙したものと同一の１９の株種のグラムタイプを、９０％に近い成功率で予測した。ＣＰＳＯ培地では、これらの同一の株の成功は１００％である。

【0055】

反射率の一次導関数に基づく第２の変形では、ユニット１４は、４２において、例えば、上述のコロニーのピクセルの平均スペクトルγ_ｃｏｌ（λ）などのコロニーの反射率のスペクトルを計算し、その後、平均スペクトルの一次導関数

を計算する。よって、決定変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）は、

に等しい。４４において、ユニット１４は、例えば、次の関係に従って判別する線形モデルなどの予測モデルを上記変数に適用する：

式中、グラムはスコアであり、パラメータａ及びｂは、ユニット１４に保存され、かつ、培養培地に優先的に依存する、あらかじめ定義された係数である。

【0056】

第２の変形を、臨床感染症に最も一般的に関与するものの中から、２８はグラム陰性であり、２４はグラム陽性である、１９の異なる種に属する５２株、すなわち（括弧内の種ごとの株の数）について試験した：
− グラム陰性：大腸菌（９）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（３）、エンテロバクター・クロアカ（１）、セラチア・マルセッセンス（２）、シトロバクター・フロインディー（２）、プロテウス・ミラビリス（２）、プロビデンシア・スチュアーティイ（１）、モルガネラ−モルガニイ（２）；
− グラム陽性：スタフィロコッカス・サプロフィティカス（９）、Ｂ群溶血性連鎖球菌（７）、エンテロコッカス・フェシウム（３）、エンテロコッカス・フェカーリス（３）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（１）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）（１）。

【0057】

図５は、関係（１０）についての学習モデルを示しており、観察されたグラム陰性には値０が割り当てられ、観察されたグラム陽性には値１が割り当てられている。それ自体知られている方法でパラメータａ及びｂを決定するために、観察されたグラムと予測されたグラムとの線形回帰が行われる。モデルは、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲の各波長で学習し、図６は、透明な培養培地（この事例ではＣＰＳＥ）についての波長の関数としての相関係数を示している。このコレログラムの最大値は、波長λ_ｃに対応し、したがって、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲の際立った特徴が、線形回帰λ_ｃによって自動的に見いだされ、実際には４１５．３ナノメートルに等しいことが観察される。図７は、ＣＰＳＥ培地についての上述の株の既知のグラムの関数としての予測されたグラムを示しており、成功率は８０％を上回る。さらには、不透明培地についての成功率は１００％である。幾つかの決定変数を試験し、図８の表に該変数が列挙されている。非正規化された反射率の一次及び二次導関数は、最高の成功率を生じる変数であるように見えるが、しかしながら、節約の原則に従えば、一次導関数が好ましい。

【0058】

Ｂ．マルチチャネルアプローチ
この手法によれば、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの波長範囲の幾つかのチャネルが、有利には、任意選択的に、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲のチャネルと組み合わせて使用される。決定変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）は、例えば、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲全体にわたる、平均スペクトル反射率（正規化又は非正規化された）、吸光度（正規化又は非正規化された）、一次導関数又は二次導関数である。

【0059】

第１の変形によれば、及び上述の理由から、非正規化された反射率の一次導関数が用いられる。よって、ユニット１４は、４２において、上述したように、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲にわたって、平均スペクトルγ_ｃｏｌ（λ）の一次導関数

を計算し、この導関数は、決定変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）を構成する。４４において、ユニット１４は、例えば、次の関係に従う線形モデルなどの予測モデルを上記変数に適用する：

式中、グラムはスコアであり、パラメータａ_ｐ及びｂは、ユニット１４に保存され、かつ、培養培地に優先的に依存する、あらかじめ定義された係数である。関係（１３）についての予測モデルは、線形回帰によって、上述のものと同様の方式で学習される。図９は、ＣＰＳＥ培地について観察されたグラムの関数としての予測されたグラムを示している。観察されたグラムについては、相関の程度は９５％である。図１０は、係数ａ_ｐを示している。本明細書では、予測モデルは、該予測モデルの２つの原則的な波長範囲、すなわち、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲、より詳細には４２１ｎｍ〜４３６ｎｍの範囲、及び７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲を使用することに留意されたい。よって、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲はまた、細菌のグラムタイプに関する特徴的なスペクトル情報も含むことが観察される。

【0060】

第２の変形によれば、決定変数は、マルチチャネルかつマルチピクセルでもあり、コロニーの各ピクセルのスペクトル情報が用いられ、前述のように平均化されていない。用語「平均」とは対照的に、ピクセルに関連するスペクトル情報は、用語「個々」で表される。特に、決定変数Ｘ_ｃｏｌ（λ）は、ゾーンＣｏｌ（λ）のピクセルの反射率（正規化又は非正規化された）、吸光度（正規化又は非正規化された）、それらの一次導関数、又はそれらの二次導関数の個々のスペクトルのすべてからなる。

【0061】

例えば、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲にわたる、正規化された反射率のスペクトル

を考慮することにより、（例えば、各個別のスペクトルをそのユークリッド・ノルムで除算することにより）、ユニット１４は、４４において、次の関係に従って、２クラス分類に基づいた予測規則（すなわち、例えば陽性の値に割り当てられる、グラム陽性、及び、例えば陰性の値に割り当てられる、グラム陰性）を実行する：

式中、グラムは、４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲のチャネルの数Ｐに等しい次元ベクトルであり、Ｘ_ｃｏｌ（λ）は、この場合、反射率

の正規化個別スペクトルにそれぞれ等しい行列であり、

は、Ｐに等しい、次元のあらかじめ定義された列ベクトルであり、Ｎ_ｐｏｓ（グラム）は、正のグラムベクトルの成分の数であり、Ｎ_ｎｅｇ（グラム）は、負のグラムベクトルの成分の数である。ユニット１４に保存されるパラメータ

及びβ_０は、培養培地に優先的に依存する。予測は、多数決に基づいて、変形として、ベクトル

の平均について行うことができ、この平均が負の場合にグラム陰性が予測され、この平均が正の場合にグラム陽性が予測される。

【0062】

第１の例では、関係（１４）についての予測モデルは、次の関係に従ってＳＶＭ（サポートベクターマシン）タイプの最適化の問題を解決することによって、前述した５２株のピクセルに基づいて習得される：

該式は、次の制約を受ける：

式中、Ｎは反射率の正規化された個別スペクトルの数であり、γｍ（λ）で示され、学習に用いられ、１からＭまで番号が付され、

において、ｍ番目のスペクトルがグラム陽性細菌に関連付けられている場合、ｑ_ｍ＝１であり、ｍ番目のスペクトルがグラム陰性細菌に関連付けられている場合、ｑ_ｍ＝−１であり、Ｃは、あらかじめ定義されたスカラーである。

【0063】

モデルを、１０のグラム陰性株（大腸菌（３つの株）、エンテロバクター・クロアカ、プロテウス・ミラビリス、プロビデンシア・スチュアーティイ、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ・ニューモニエ、モルガネラ−モルガニイ、シトロバクター・フロインディー）及び１０のグラム陽性株（スタフィロコッカス・サプロフィティカス、エンテロコッカス・フェカーリス（２株）、Ｂ群溶血性連鎖球菌、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（２株）、Ｂ群溶血性連鎖球菌、エンテロコッカス・フェシウム、Ｂ群溶血性連鎖球菌）について検証した。不透明培地（例えばＣＰＳＯ）では、成功率は１００％である。透明培地（例えばＣＰＳＥ）では、成功率は、グラム陰性細菌については９４％に近く、グラム陽性細菌については９８％に近い。チャネルの関数としてのベクトル

の成分を示す図１０から分かるように、ＳＶＭ分類に基づく予測は、特定の範囲の波長を出現させない。

【0064】

第２の例では、関係（１４）についての予測モデルは、次の関係：に従う「Ｆｕｓｅｄ Ｌａｓｓｏ」タイプの最適化問題を解くことによって、前述した５２株のピクセルに基づいて学習した：

式中、μ_１及びμ_２は、それぞれ、モデルの節約（すなわち、０ではない、

の成分の数）及びモデルの規則性（すなわち、

の２つの連続成分間のばらつき）を規制する、２つのパラメータである。図１２に見られるように、節約及び規則性が

の学習中に強制される場合（μ_１＝０．０００１及びμ_２＝０．００２５）、自動的に保持される

の非ゼロ成分は、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍ及び７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲のものである。成功率は、不透明培地（例えばＣＰＳＯ）については１００％であり、透明培地（例えばＣＰＳＥ）については、成功率は、グラム陽性では９２％であり、グラム陰性では８４％である。

【0065】

４００ｎｍ〜９００ｎｍの範囲におけるハイパースペクトルカメラによる取得が記述されている。明らかに、本発明は、それぞれ、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍ及び７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲を含む、又は、それらの範囲からなる２つの分離した範囲のスペクトルを取得する、マルチスペクトルカメラで行われる取得にも適用される。同様に、本発明は、それぞれ、これらの範囲を取得するために構成された２つの異なるカメラにも適用される。

【0066】

４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲よりも広い範囲での取得、特に、細菌のグラムタイプを識別するスペクトル情報を含む、７５０ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の取得が記述されている。変形として、該取得は、４００ｎｍ〜５００ｎｍの範囲、より優先的には４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲でのみ行われ、グラムタイプの予測は、この範囲のスペクトル情報の関数としてのみ、行われる。明らかに、本発明は、予測するグラムタイプについて、この範囲のみにわたって行われる処理と組み合わせて、４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲を含む任意の取得範囲に適用される。

【0067】

画像取得、すなわち、空間情報及びスペクトル情報の取得が記述されている。きわめて明らかに、本発明はまた、例えば顕微分光法によって、スペクトル情報のみの取得にも適用される。例えば、コロニーは、標準的な画像システムによって、又はオペレータによって、事前に局所化されてもよく、その後、コロニーによって放射される反射又は透過スペクトルが、顕微分光法によって取得され、グラムタイプを予測するために処理される。

【0068】

２つの培地、ＣＰＳＥ（透明）及びＣＰＳＯ（不透明）が記載されている。他の培地も試験し、類似の結果を得た。例えば、図１３Ａ及び１３Ｂでは、ＴＳＡ（トリプトンカゼイン大豆寒天）及びＭＨ２（ミューラーヒントン２寒天）培地において、少なくとも４１５ｎｍ〜４４０ｎｍの範囲にわたって、グラム陽性とグラム陰性が互いに異なっていることが観察される。前述の通り、不透明培地は、グラムタイプの予測を容易にすることから、好ましい。よって、本発明は、例として、例えばＳｉＯ_２粒子などの乳白剤が添加されている、先行技術のものなど、任意のタイプの透明及び無着色の培養培地に適用される。

【0069】

さまざまな予測が記載されている（閾値化、線形モデル、ＳＶＭ、Ｌａｓｓｏ）。当然ながら、本発明は、例えば、スペクトル比較アルゴリズム（例えばセントロイド法）、ニューラルネットワークに基づく分類、ツリーに基づく分類（例えばＣＡＲＴ、「分類及び回帰ツリー」用、アルゴリズム）等、２つのクラス（グラム陽性及びグラム陰性）の測定を分類可能にする任意のタイプの処理に適用される。このような方法は、例えば、文献Eric Laloum, “Une methode chimiometrique originale d’identification de produits par spectroscopie proche infrarouge” [“An original chemometric method for identifying products by near infrared spectroscopy”], Spectra Analyse, vol. 33, No. 237, 2004に記載されるものである。

【0070】

反射スペクトルに基づいた実施態様が、記載されている。変形として、スペクトルは、グラムタイプ適用の予測について先に記載した処理操作で、送信中に取得される。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13A】

【図13B】