特許 6872614 低毒性の新規ライコウトウ配糖体、その製造方法及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6872614

(24)【登録日】2021年4月21日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】低毒性の新規ライコウトウ配糖体、その製造方法及びその使用

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/37 20060101AFI20210510BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 37/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 17/06 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 31/7048 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 31/343 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 125/00 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   A61K36/37

   A61P29/00

   A61P29/00 101

   A61P37/08

   A61P1/16

   A61P37/00

   A61P17/06

   A61P17/00

   A61P13/12

   A61P43/00 121

   A61K31/7048

   A61P19/02

   A61K31/343

   A61K125:00

【請求項の数】3

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2019-528662(P2019-528662)

(86)(22)【出願日】2017年8月30日

(65)【公表番号】特表2020-508287(P2020-508287A)

(43)【公表日】2020年3月19日

(86)【国際出願番号】CN2017099589

(87)【国際公開番号】WO2018161507

(87)【国際公開日】20180913

【審査請求日】2019年5月23日

(31)【優先権主張番号】201710142189.1

(32)【優先日】2017年3月10日

(33)【優先権主張国】CN

(73)【特許権者】

【識別番号】518117810

【氏名又は名称】広州中医薬大学第二附属医院

【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＳＥＣＯＮＤ ＡＦＦＩＬＩＡＴＥＤ ＨＯＳＰＩＴＡＬ ＯＦ ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】519186141

【氏名又は名称】広州中医薬大学

【氏名又は名称原語表記】ＧＵＡＮＧＺＨＯＵ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＨＩＮＥＳＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100137338

【弁理士】

【氏名又は名称】辻田 朋子

(74)【代理人】

【識別番号】100196313

【弁理士】

【氏名又は名称】村松 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】100173679

【弁理士】

【氏名又は名称】備後 元晴

(72)【発明者】

【氏名】リィゥ ブォ

(72)【発明者】

【氏名】マオ ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】リィゥ シュシォン

(72)【発明者】

【氏名】シュ ポン

(72)【発明者】

【氏名】ハン シァォドン

(72)【発明者】

【氏名】ヂョウ ウェン

(72)【発明者】

【氏名】シュ ファンファン

(72)【発明者】

【氏名】リィゥ ジンゴン

(72)【発明者】

【氏名】リー ユェンチャオ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン イーチー

(72)【発明者】

【氏名】ドン ジンバオ

(72)【発明者】

【氏名】ウー リーラン

(72)【発明者】

【氏名】ウー ユンシャン

(72)【発明者】

【氏名】チェン ウェイイン

(72)【発明者】

【氏名】ティェン ルイミン

(72)【発明者】

【氏名】ルー ジンジィェン

(72)【発明者】

【氏名】ヂャン ユーチン

【審査官】 渡部 正博

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０１９９１６３３（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３６／００−３６／９０６８

Ａ６１Ｋ ３１／００−３１／８０

Ａ６１Ｐ １／００−４３／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下のステップ（１）及びステップ（２）を含む方法により製造される新規ライコウトウ配糖体であって、
ステップ（１）において、リン酸二水素ナトリウムとリン酸とで調製したｐＨ３．０〜５．０の緩衝溶液中で、ライコウトウ配糖体を９０〜１２０℃の油浴に入れ、加熱還流により加水分解反応を１８〜９６ｈ行い、
反応前後に、それぞれサンプリングしてトリプトリド量を測定し、トリプトリドの減少量を求め、
ステップ（２）において、ステップ（１）の反応生成物にトリプトリオリド−無水エタノール溶液を加え、混合した後、溶媒を蒸発させて除去し、低毒性の新規ライコウトウ配糖体を得、ここで、トリプトリオリドの添加量はトリプトリドの減少量のモル数の０〜２０倍であり、
前記ライコウトウ配糖体は以下の方法により作製され、即ち、
ライコウトウの乾燥根茎を原料として用いて、質量百分率９５％のエタノールによる還流抽出を３〜１２ｈ行った後、抽出液を減圧濃縮し、粗エキスを得、粗エキスを中性アルミナで吸着し、エタノールを蒸発させて除去した後、トリクロロメタンで抽出し、減圧濃縮することでライコウトウ配糖体を得、ここで、エタノールとライコウトウの乾燥根茎との体積質量比は４〜１６：１であることを特徴とする低毒性の新規ライコウトウ配糖体。

【請求項2】

請求項１に記載の低毒性の新規ライコウトウ配糖体の製造方法であって、以下のステップａ）〜ステップｃ）を含み、
ステップａ）において、ライコウトウの乾燥根茎を原料として用いて、質量百分率９５％のエタノールによる還流抽出を３〜１２ｈ行なった後、抽出液を減圧濃縮し、粗エキスを得、粗エキスを中性アルミナで吸着し、エタノールを蒸発させて除去した後、トリクロロメタンで抽出し、減圧濃縮することでライコウトウ配糖体を得、ここで、エタノールとライコウトウの乾燥根茎との体積質量比は４〜１６：１であり、
ステップｂ）において、リン酸二水素ナトリウムとリン酸とで調製したｐＨ３．０〜５．０の緩衝溶液中で、ライコウトウ配糖体を９０〜１２０℃の油浴に入れ、加熱還流により加水分解反応を１８〜９６ｈ行い、
反応前後に、それぞれサンプリングしてトリプトリド量を測定し、トリプトリドの減少量を求め、
ステップｃ）において、ステップｂ）の反応生成物にトリプトリオリド−無水エタノール溶液を加えて混合した後、溶媒を蒸発させて除去し、低毒性の新規ライコウトウ配糖体を得、ここで、トリプトリオリドの添加量はトリプトリドの減少量のモル数の０〜２０倍であることを特徴とする製造方法。

【請求項3】

請求項１に記載の新規ライコウトウ配糖体を有効成分として含む、ネフローゼ症候群、原発性糸球体腎症、紫斑病性腎炎及びループス腎炎、関節リウマチ、エリテマトーデス、亜急性及び慢性重症肝炎、慢性活動性肝炎、アレルギー性皮膚血管炎、皮炎、湿疹、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎の治療剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、医薬分野に関し、具体的には、低毒性の新規ライコウトウ配糖体、該新規ライコウトウ配糖体の製造方法及びその医薬用途に関する。

【背景技術】

【0002】

ライコウトウ配糖体（雷公藤配糖体，Ｔｒｉｐｔｅｒｙｇｉｕｍ ｗｉｌｆｏｒｄｉｉＨｏｏｋ．ｆ．）は、ニシキギ科植物であるライコウトウ（雷公藤）の根、皮、葉から抽出された混合グリコシドであり、その主要な主な化学成分は、ジテルペンラクトン、アルカロイド、トリテルペン等を含む。ライコウトウは、薬理学的研究により、抗炎症、免疫抑制又は免疫調節、抗腫瘍等の作用を有することが証明されており、現在国内外で積極的に研究されている免疫調節薬であり、関節リウマチ、原発性糸球体腎症、ネフローゼ症候群、紫斑病性腎炎及びループス腎炎、エリテマトーデス、亜急性及び慢性重症肝炎、慢性活動性肝炎の治療に適用されると共に、アレルギー性皮膚血管炎、皮膚炎及び湿疹、乾癬性関節炎、ハンセン病、ベーチェット病、再発性アフタ、強直性脊椎炎等の治療に適用できる。

【0003】

ライコウトウ配糖体が臨床的に使用されて以来、血液系、生殖器系、泌尿器系及び消化器系には、関連する副作用が依然として時々発生する。その理由は、ライコウトウ配糖体の主有効成分、例えば、トリプトリド、トリプトニド等のジテルペノイド成分、トリプテリン、トリプトリド（Ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ）等のトリテルペノイド成分、ウィルホルギン、ウィルホリン等のアルカロイド成分は、いずれも比較的強い毒性を有する一方、市販されているライコウトウ配糖体の標準抽出物又は比例抽出物は、トリプトリドを単一の指標として使用することが多く、その結果、様々なライコウトウ配糖体抽出物が混在するためである。

【0004】

１９９１年に馬鵬程らは最初にトリプトリオリド（ｔｒｉｐｔｒｉｏｌｉｄｅ）の構造を単離し、同定した。しかし、クロヅル属植物におけるトリプトリオリドの含有量は極めて低く、２０ｋｇライコウトウから僅かな７２０ｍｇトリプトリオリドしか得られない。同年、鄭家潤らはマウス耳腫脹実験モデルに対するトリプトリオリドの緩和実験及び血清溶血素測定実験を行なった結果、トリプトリオリドは表在性抗炎症活性のみを有し、免疫抑制活性を有しないことが分かった。そのため、トリプトリオリドは医薬分野では広く使用されていない。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、新規な低毒性のライコウトウ配糖体を提供することである。
本発明の別の目的は、上記新規ライコウトウ配糖体の製造方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、上記新規ライコウトウ配糖体の医薬製造における使用を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一態様によれば、本発明は低毒性の新規ライコウトウ配糖体を提供する。該低毒性の新規ライコウトウ配糖体は、以下のステップ（１）及びステップ（２）を含む方法により製造される。
ステップ（１）において、リン酸二水素ナトリウムとリン酸とで調製したｐＨ３．０〜５．０の緩衝溶液中で、ライコウトウ配糖体（トリプトリドの含有量を測定するためにサンプルを保存する）を９０〜１２０℃の油浴に入れ、加熱還流により加水分解反応を１８〜９６ｈ（好ましくは３０ｈ）行う。

【0007】

反応終了後、溶媒を減圧除去し（又は、抽出により除去し）、無水エタノールを加えて再溶解させ、遠心分離して不溶物を取り除き、さらに溶液に無水エタノールを加えて定容した後、サンプリングしてトリプトリドの量を測定し、トリプトリドの減少量を得る。

【0008】

ステップ（２）において、ステップ（１）の反応生成物にトリプトリオリド−無水エタノール溶液を加え、混合した後、溶媒を蒸発させて除去し、低毒性の新規ライコウトウ配糖体を得る。ここでトリプトリオリドの添加量はトリプトリドの減少量のモル（ｍｏｌ）数の０〜２０倍である。

【0009】

ステップ（１）及び（２）における無水エタノールの代わりに、他の毒性のない有機溶媒、例えば、イソプロパノールを用いてもよい。

【0010】

上記ライコウトウ配糖体は、以下の方法により作製される。
ライコウトウの乾燥根茎を原料として用いて、質量百分率９５％のエタノール（エタノールとライコウトウの乾燥根茎との体積質量比は４〜１６：１である）による還流抽出を３〜１２ｈ行った後、抽出液を減圧濃縮し、粗エキスを得る。粗エキスを中性アルミナで吸着し、エタノールを蒸発させて除去した後、トリクロロメタンで抽出し、減圧濃縮することでライコウトウ配糖体を得る。

【0011】

本発明の他の態様によれば、本発明は、上記低毒性の新規ライコウトウ配糖体の製造方法を提供する。該製造方法は、以下のステップａ）〜ｃ）を含むことを特徴とする。

【0012】

ステップａ）において、ライコウトウの乾燥根茎を原料として用いて、質量百分率９５％のエタノール（エタノールとライコウトウの乾燥根茎との体積質量比は４〜１６：１である）による還流抽出を３〜１２ｈ行なった後、抽出液を減圧濃縮し、粗エキスを得る。粗エキスを中性アルミナで吸着し、エタノールを蒸発させて除去した後、トリクロロメタンで抽出し、減圧濃縮することでライコウトウ配糖体を得る。

【0013】

ステップｂ）において、リン酸二水素ナトリウムとリン酸とで調製したｐＨ３．０〜５．０の緩衝溶液中で、ライコウトウ配糖体（トリプトリドの含有量を測定するためにサンプルを保存する）を９０〜１２０℃の油浴に入れ、加熱還流により加水分解反応を１８〜９６ｈ（好ましくは３０ｈ）行う。

【0014】

反応終了後、溶媒を減圧下で除去し（又は、抽出により除去し）、無水エタノールを加えて再溶解させ、遠心分離して不溶物を取り除き、さらに溶液に無水エタノールを加えて定容した後、サンプリングしてトリプトリドの量を算出し、トリプトリドの減少量を得る。

【0015】

ステップｃ）において、ステップｂ）の反応生成物にトリプトリオリド−無水エタノール溶液を加えて混合した後、溶媒を蒸発させて除去し、低毒性の新規ライコウトウ配糖体を得る。ここで、トリプトリオリドの添加量はトリプトリドの減少量のモル（ｍｏｌ）数の０〜２０倍である。

【0016】

ステップ（１）及び（２）における無水エタノールの代わりに、他の毒性のない有機溶媒、例えば、イソプロパノールを用いてもよい。

【0017】

本発明の他の態様によれば、本発明は、ネフローゼ症候群、原発性糸球体腎症、紫斑病性腎炎及びループス腎炎、関節リウマチ、エリテマトーデス、亜急性及び慢性重症肝炎、慢性活動性肝炎、アレルギー性皮膚血管炎、皮炎、湿疹、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎を治療する薬物の治療における上記低毒性の新規ライコウトウ配糖体の使用を提供する。

【0018】

トリプトリド及びトリプトリオリドは共にライコウトウのジテルペノイド成分であり、両者の化学構造は類似しており、特定の条件下で互いに変換することができる。本発明において、リン酸二水素ナトリウムとリン酸とで調製したｐＨ３．０〜５．０の緩衝溶液中で還流反応させることにより、トリプトリドをトリプトリオリドに変換した上で、ライコウトウ配糖体を全体として上記と同じ条件下で化学的炮製を行うことによりライコウトウ配糖体におけるトリプトリドの含有量を低減させることにより、製剤の毒性を低減させる。しかし、毒性が低減されるのに伴い、製剤の薬効も低下することがある。このため、本発明では、一定量の低毒性で有効な（治療域が広い）トリプトリオリドを追加することにより製剤の薬効を増大させる。本発明は、初めてトリプトリドの含有量を低減させ、その分、トリプトリオリドの含有量を増加させることにより、かなりの抗炎症活性が保証されると共に、免疫抑制による毒性が低減されることにより、他の薬物製剤における使用及び臨床疾患の治療のために物質的基礎を提供する。

【0019】

本発明の低毒性の新規ライコウトウ配糖体は、以下の利点を有する。
１、新規ライコウトウ配糖体は、市販されているライコウトウ製剤に比べて毒性が大幅に低減される（ｐ＜０．０５）。
２、新規ライコウトウ配糖体は、ネフローゼ症候群による腎臓の病理学的損傷及びタンパク尿の発生を有効に緩和し、生体の炎症レベルを改善することができると共に、ネフローゼ症候群に対して顕著な治療効果を有し、持続的な効果を有する。
３、免疫関連疾患のメカニズムが類似しているため、本発明が提供する新規ライコウトウ配糖体は、他の免疫関連疾患、特に、炎症誘発性の免疫関連疾患に対しても治療作用及び毒性低減効果を有する。

【図面の簡単な説明】

【0020】

【図1】ライコウトウ配糖体及び新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩのクロマトグラムである。

【図2】図１に対照品を追加した後のクロマトグラムである。

【図3】新規ライコウトウ配糖体の各細胞系における毒性の結果図である。

【図4】正常Ｔ／Ｂリンパ球に対するトリプトリオリドモノマーの増殖抑制の結果図である。

【図5】誘発されたＴ／Ｂリンパ球に対するトリプトリオリドモノマーの増殖抑制の結果図である。

【図6】Ｒａｗ２６４．７細胞炎症性因子に対するトリプトリオリドモノマーの発生抑制の結果図である。

【図7】Ｒａｗ２６４．７細胞炎症性遺伝子に対するトリプトリオリドモノマーの発生抑制の結果図である。

【図8】Ｒａｗ２６４．７細胞ＮＦ−κＢタンパク質に対するトリプトリオリドモノマーの発現抑制の結果図である。

【図9】足細胞のアポトーシスに対するトリプトリオリドモノマーの抑制の結果図である。

【図10】足細胞マーカータンパク質ｐｏｄｏｃｉｎ及びアポトーシスタンパク質Ｂａｘのタンパク質発現の結果図である。

【図11】共焦点レーザー顕微鏡により足細胞マーカータンパク質の発現を観察した結果図である。

【図12】ＮＳラットの尿タンパク質に対する各実験群の影響のトレンドグラフである。

【図13】ＮＳラットのアルブミンに対する各実験群の影響の模式図である。

【図14】ＮＳラットの総コレステロール、トリグリセリドに対する各実験群の影響の模式図である。

【図15】光学顕微鏡による検査結果である。

【発明を実施するための形態】

【0021】

以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明する。

【0022】

以下の製造例で用いられる試薬は全て市販試薬であり、用いられる機器は以下の通りである。
超高速液体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ，米国のＷａｔｅｒｓ社）、
１万分の１天秤（ＡＬ１０４−ＩＣ，スイスのＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ社）、
１０万分の１天秤（ＡＢ１３５−Ｓ，スイスのＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ社）、酸度計（ＰＨＳ−３Ｃ，上海精科儀器有限公司）、
マグネチックスターラー（ＨＳ７，ドイツのＩＫＡ社）、
回転式薄膜蒸発器（ＲＶ １０ ｂａｓｉｃ Ｖ，ドイツのＩＫＡ社）、
卓上型マイクロ遠心分離機（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ１６，米国のＢＡＣＫＭＡＮ社）、
全波長マイクロプレートリーダー（１５１０，サーモフィッシャーサイエンティフィック（中国）有限公司）、
ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃピペット（１−１０μＬ、１０−１００μＬ、１００−１０００μＬ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ．ｉｎｃ）、
タンパク質垂直型電気泳動フィルム転写システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、
自動イムノアッセイ分析装置（Ａｂｂｏｔｔ）、
ライカスライサー（Ｌｅｉｃａ）。

【0023】

１． 新規ライコウトウ配糖体の製造
ライコウトウの乾燥根茎１５００ｇを原料として用いて、１２Ｌ質量百分率９５％のエタノールで１０ｈ還流抽出した後、抽出液を減圧濃縮して粗エキスを得た。粗エキスを中性アルミナで吸着し、エタノールを蒸発させて除去し、さらにトリクロロメタン５Ｌで抽出し、減圧濃縮することでライコウトウ配糖体を得た。

【0024】

得られたライコウトウ配糖体からサンプリングしてトリプトリドの含有量を測定し、その指紋スペクトル及び特徴的成分に基づいて市販されているライコウトウ配糖体と比較した結果、得られたライコウトウ配糖体は、市場の主流製品（上海復旦復華薬業有限公司、湖南千金協力薬業有限公司、華潤三九薬業有限公司のライコウトウ製剤、湖南協力薬業有限公司製のライコウトウ配糖体錠剤）の指紋スペクトルに相当する。

【0025】

リン酸二水素ナトリウムを取り、水を加えて溶解し、室温で体積百分率１％のリン酸溶液を加えてｐＨ４．０に調整することでｐＨ４．０のリン酸二水素ナトリウム／リン酸緩衝溶液を得た。

【0026】

ｐＨ４．０のリン酸二水素ナトリウム／リン酸緩衝溶液中で、得られたライコウトウ配糖体の一部を取り、９０〜１２０℃の油浴に入れ、加熱還流により加水分解反応を３０ｈ行った後、溶媒を減圧下で除去し、無水エタノールを加えて再溶解させ、遠心分離して不溶物を取り除き、無水エタノールを加えて１Ｌに定容した。１０ｍＬサンプリングし、トリプトリドの減少量を算出した。さらに３００ｍＬ取り、そのまま溶媒を蒸発させて除去し、新規ライコウトウ配糖体Ｉを得た。別途に３００ｍＬ取り、トリプトリド減少量の１０倍（ｍｏｌ倍数）のトリプトリオリド−エタノール溶液を加え、溶媒を蒸発させて除去し、新規ライコウトウ配糖体ＩＩを得た。別途に３００ｍＬ取り、トリプトリド減少量の２０倍（ｍｏｌ倍数）のトリプトリオリド−エタノール溶液を加え、溶媒を蒸発させて除去し、新規ライコウトウ配糖体ＩＩＩを得た。得られた新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩを−２０℃の冷蔵庫に保存した。以上の方法により、新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩを得た。

【0027】

具体的な手順を下図に示す。

【0028】

【化1】

【0029】

２． 新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにおけるトリプトリド及びトリプトリオリドの含有量測定
ＨＰＬＣ検出条件は、以下の通りである。
カラム：ＢＥＨ Ｓｈｉｅｌｄ ＲＰ１８（２．１×１００ｍｍ，１．７μｍ）
移動相：アセトニトリル−水系
勾配溶出：溶出手順を表１に示す。
流速：０．３ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：２２０ｎｍ
カラム温度：３５℃
注入体積：３μＬ
結果を図１、図２に示す。

【0030】

表１

【表1】

【0031】

図２には、対照品はトリプトリドとトリプトリオリドとの混合物である。図１及び図２から分かるように、新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにおけるトリプトリドは、いずれもライコウトウ配糖体よりも少ない。新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ライコウトウ配糖体におけるトリプトリオリドの含有量は極めて少ない一方、新規ライコウトウ配糖体ＩＩ、ＩＩＩにおけるトリプトリオリドの含有量は比較的多い。

【0032】

トリプトリド及びトリプトリオリドモノマーを標準品として、ＨＰＬＣにより定量分析することにより、ライコウトウ配糖体及び新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩにおけるトリプトリド及びトリプトリオリドの含有量が得られた。結果を表２に示す。

【0033】

表２ ライコウトウ配糖体及び新規ライコウトウ配糖体におけるトリプトリド及びトリプトリオリドの含有量（ｎ＝３）

【表2】

【0034】

３． 細胞実験
３．１ ＨＫ−２、ＨＬ−７７０２、ＧＣ１、ＧＣ２、ＴＭ４細胞培養及び毒性測定
ＨＫ−２、ＨＬ−７７０２、ＧＣ１、ＧＣ２、ＴＭ４は、いずれもＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から購入された。ＨＫ−２は、３７℃高グルコースＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液である。ＨＬ−７７０２、ＧＣ１、ＧＣ２、ＴＭ４は、いずれも３７℃ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液である。ＨＫ−２、ＨＬ−７７０２、ＧＣ１、ＧＣ２、ＴＭ４を５％ＣＯ_２インキュベーターに入れて培養した。細胞が８０％まで培養容器に接着して増殖したときに、対数増殖期にある細胞を取り、０．２５％トリプシンで消化した後、適宜な細胞密度を調整して９６ウェルプレートに接種し、細胞が単層で容器に接着した後、同期化培地に交換して培養し、１２ｈ同期した。細胞が静止期に入った後、それぞれライコウトウ配糖体（ＬＧＴ ０、１、５、１０、２０、３０、５０、１００μｇ／ｍＬ）、新規ライコウトウ配糖体ＩＩ（ＬＧＴ−２，０、１、５、１０、２０、３０、５０、１００μｇ／ｍＬ）、新規ライコウトウ配糖体ＩＩＩ（ＬＧＴ−４，０、５、１０、２０、３０、５０、７５、１００μｇ／ｍＬ）、ＬＧＴ−５（０、０．１、２．５、５、１０、１５、２５、５０μｇ／ｍＬ）、トリプトリド（０、１、５、１５、２５、４０、８０、１５０ｎｇ／ｍＬ）、トリプトリオリド（０、５０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００μｇ／ｍＬ）、ミックス（トリプトリド：トリプトリオリド＝１：１０，０、２２、８８、１１０、３３０、６６０、９９０、２２００ｎｇ／ｍＬ）を２００μＬ／回で投与して処理した。投与後、引き続き２４ｈ培養した後、ＭＴＴ法により細胞活性を評価し、投与の２４ｈ後のＩＣ_５０値を算出し、結果を図３に示す。

【0035】

図３には、左側はＩＣ_５０値の０−２００での拡大図であり、右側はＩＣ_５０値の０−１での拡大図である（活性差が大きいため、縦軸に２つの倍率を使用する）。図３から分かるように、新規ライコウトウ配糖体群では、各細胞系における毒性は顕著に低下し、各配合比は平均してトリプトリドの毒性よりも約１０００倍低かった。トリプトリオリド：トリプトリドが１０：１（新規ライコウトウ配糖体ＩＩの割合に近い）である場合に、混合モノマー毒性は、約１００倍顕著に低下した。

【0036】

３．２ 免疫抑制活性の測定
マウスを頸椎脱臼により安楽死させた後、７５％のエタノールに浸し、クリーンベンチ内でマウスの脾臓を取り出し、脾臓をＤＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水，Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）中で３回洗浄して十分に湿潤させた。２００メッシュのガーゼを３５ｍｍの皿に置き、１０ｍＬ注射器のピストンを用いて一方向に沿って均一に研磨しながら、ＤＰＢＳで湿潤させ、収集されたリンパ球懸濁液１５００ｒｐｍを３ｍｉｎ遠心分離し、次いで、各脾臓に７ｍＬ赤血球溶解液を加え、室温で３０ｍｉｎ作用した後、１５００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、さらにＤＰＢＳで３回洗浄することで過剰な血清を除去し、４ｍＬの７０％Ｐｅｒｃｏｌｌを１５ｍＬ遠心チューブの底層、４ｍＬの４０％Ｐｅｒｃｏｌｌを１５ｍＬ遠心チューブの上層に加え、横型遠心分離機で８００ｇ、室温で２０ｍｉｎ遠心分離した後、４０％ｐｅｒｃｏｌｌと７０％ｐｅｒｃｏｌｌとの間の細胞を吸い取り、４ｍＬのＤＰＢＳで３回洗浄し、９６ウェル培養プレートに接種し、ブランク対照群（培地のみ）、濃度の異なるトリプトリオリド（５０、１００、１５０、２００ｕｇ／ｍＬ）、Ｔリンパ球特異的増殖誘導剤Ｃｏｎ Ａ（１０ｕｇ／ｍＬ；正常抑制群に対応）及びＢリンパ球特異的増殖誘導剤ＬＰＳ（１０ｕｇ／ｍＬ；正常抑制群に対応）に従ってそれぞれ２００μＬ加えて処理し、３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターで２４ｈ培養した後、ＭＴＴ法により細胞活性及び抑制率を測定した。結果を図４に示す。

【0037】

特異的抑制実験のリンパ球前処理は上記と同様に行なった。リンパ球接を９６ウェル培養プレートに接種した後、ブランク対照群（培地のみ）、Ｔリンパ球特異的増殖誘導剤Ｃｏｎ Ａモデル群（５ｕｇ／ｍＬ；モデル群に対応）、及びＢリンパ球特異的増殖誘導剤ＬＰＳモデル群（５ｕｇ／ｍＬ；モデル群に対応）に従ってそれぞれ２００μＬ加えた。ここで、複数のＣｏｎ Ａ投与群には、まずそれぞれＴリンパ球特異的増殖誘導剤Ｃｏｎ Ａ（１０ｕｇ／ｍＬ；モデル群に対応）を１００μＬ加え、さらにそれぞれ濃度の異なるトリプトリオリド（１００、２００、３００、４００ｕｇ／ｍＬ）を１００μＬ加え；複数のＬＰＳ投与群には、まずそれぞれＢリンパ球特異的増殖誘導剤ＬＰＳ（１０ｕｇ／ｍＬ；モデル群に対応）を１００μＬ加え、さらにそれぞれ濃度の異なるトリプトリオリド（１００、２００、３００、４００ｕｇ／ｍＬ）を１００μＬ加えた。各群を３７℃の５％ＣＯ_２インキュベーターで２４ｈ培養した後、ＭＴＴ法により細胞活性及び抑制率を測定した。結果を図４及び図５に示す。

【0038】

図４から分かるように、トリプトリオリドは、正常Ｔ、Ｂリンパ球の体外増殖に対して抑制作用を有し、且つその抑制作用は用量依存性を示す。各投与群の細胞活性は、対照群及びモデル群よりも顕著に低い（ｐ＜０．０５）。５０ｕｇ／ｍＬトリプトリオリドと２００ｕｇ／ｍＬトリプトリオリドとの、細胞活性に対する抑制程度には有意差がある（ｐ＜０．０５）。

【0039】

Ｔ細胞特異的誘導剤ＣｏｎＡ及びＢ細胞特異的誘導剤Ｌｐｓをそれぞれ加えた後、さらに、濃度の異なるトリプトリオリドで処理した結果を図５に示す。図５から分かるように、投与群の細胞活性は、いずれもブランク対照群よりも高いが、モデル群よりも低い。これは、トリプトリオリドが確かに比較的低い免疫抑制作用を有し、且つＴリンパ球に対する抑制作用は、Ｂ細胞に対する抑制作用よりも顕著に高い（ｐ＜０．０５）ことを示している。単独の細胞抑制は用量依存性を示していない。

【0040】

３．３ 抗炎症活性の測定結果
Ｒａｗ２６４．７ ３７℃、５％ＣＯ_２ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液。最終にはインキュベーターに入れて培養した。細胞が８０％まで培養容器に接着して増殖したときに、対数増殖期にある細胞を取り、０．２５％トリプシンで消化した後、適宜な細胞密度を調整して６ウェルプレートに接種し、細胞が単層で容器に接着した後、同期化培地に交換して培養し、１２ｈ同期した。細胞が静止期に入った後、ブランク対照群以外の各群に対しては、ＬＰＳ（１ｕｇ／ｍＬ）１ｍＬをモデル構築剤として誘導して細胞炎症モデルを構築し、モデル群に１ｍＬ培地、投与群（トリプトリオリド５０、１００、１５０、２００μｇ／ｍＬ用量群）にそれぞれ１ｍＬ対応する濃度の薬液、ブランク対照群にそのまま２ｍＬ培地を加えて処理した。それぞれＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等の方法により異なる処理ぐんの炎症関連タンパク質、遺伝子、サイトカインの発現レベル；ＮＦ−κＢ転写関連因子の発現；及びＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α等の炎症サイトカインの発現を検出した。

【0041】

図６に示すように、体内と体外の研究より、ＴＮＦ−αは、主に炎症性糸球体でのメサンギウム細胞、上皮細胞、又は単核マクロファージから分泌され、メサンギウム細胞の分裂増殖を刺激するだけではなく、メサンギウム細胞が複数種の炎症性サイトカインを分泌するように刺激することができることで、メサンギウム細胞の増殖が促進されるため、サイトカインＴＮＦ−αは重要な炎症誘発作用を有することが証明されている。本課題の研究結果から分かるように、トリプトリオリドは、ＬＰＳ誘発マウスマクロファージ炎症性損傷モデルにおけるサイトカインの分泌を改善する作用を有する。

【0042】

図７、８に示すように、ＮＦ−κＢ Ｐ６５は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０等の炎症性サイトカイン遺伝子の発現を調整することにより生体の炎症反応に影響を与え、Ｔ、Ｂ細胞の増殖、成長及び分化し、体液性免疫及び細胞性免疫において重要な役割を果たす。図から分かるように、トリプトリオリドは、炎症性サイトカインＴＮＦ−α及びＩＬ−１０を有効に減少させる作用を有する。高濃度の場合、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の発現を向上させることができる。これは、本発明の薬物は、炎症性サイトカインの転写を有効に低減できると共に、一定の免疫調節活性を有することを示している。

【0043】

４． トリプトリオリドによる足細胞アポトーシスの阻害実験
マウスの不死化足細胞系ＭＰＣ５は、中国広東省中医院腎臓病科からの贈物であった。ＭＣＰ５を以下のように処理した。それぞれＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＩＦＣ、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等の方法により異なる処理群の炎症関連タンパク質、遺伝子、サイトカインの発現レベルを検出した。ＭＣＰ５は、温度感受性細胞である。３３℃ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液＋１０Ｕ／ｍＬγ−ＩＦＮの条件下で増殖させ、３７℃ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液の培地で１０−１４日分化させて保存した。ＭＣＰ５を以下のように処理した。ブランク対照群以外の各群に対して、ＡＤＭ（０．８μｇ／ｍＬ）１ｍＬをモデル構築剤として誘導して細胞アポトーシスモデルを構築し、モデル群に１ｍＬ培地、投与群（トリプトリオリド５０、１００、１５０、２００μｇ／ｍＬ用量群）にそれぞれ１ｍＬ対応する濃度の薬液、ブランク対照群にそのまま２ｍＬ培地を加えて処理した。それぞれＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ、ＩＦＣ、ｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ等の方法により異なる処理群の炎症関連タンパク質、遺伝子、サイトカインの発現レベルを検出した。スリット膜タンパク質Ｐｏｄｏｃｉｎ及びアポトーシス関連遺伝子Ｂａｘの発現については、ＦＩＴＣが標識されたＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ及びＰｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ（ＰＩ）により細胞を二重染色し、フローサイトメーターによる検出を行うことにより、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞及びアポトーシス細胞を区別した。結果を図９、図１０、図１１に示す。

【0044】

図９−１１に示すように、足細胞が損傷した後、アポトーシス、オートファジー、壊死が発生することで、その数が減少され、最終的にタンパク尿が引き起こされ、腎臓機能に影響を与えることになる。その結果から分かるように、完全に分化した足細胞を０．８μｇ／ｍＬのＡＤＭで処理してアポトーシス細胞モデルを構築した後、トリプトリオリドで処理した結果、細胞のアポトーシス状況が改善された。これは、トリプトリオリドは、足細胞を損傷から保護する作用を有し、臨床足細胞疾患の治療に適用できることを示している。実験結果から分かるように、トリプトリオリドは、足細胞をアポトーシスから保護する作用を有するが、高濃度の場合に上昇傾向がある。

【0045】

５． 動物実験
５．１ アドリアマイシン（ＡＤＲ）によりラットネフローゼ症候群を誘発することによる疾患動物モデルの構築
雄性で健康なＳＤラット１００匹を７日飼育した後、ブランク対照群として８匹をランダムに選択し、残りのラットに非麻酔条件下で尾静脈より５．０ｍｇ／（ｋｇ・匹）でアドリアマイシンを１回注射してアドリアマイシンネフローゼ症候群動物モデルを構築した。

【0046】

グループ化：アドリアマイシン注射３週間後、１００匹のラットに対して２４時間尿タンパク質排泄量を測定した。ブランク群（等量の生理食塩水を注射）との比較によりモデル構築が成功したラットを確定した。２４時間尿タンパク質排泄量が７０−１８０ｍｇのラットを選択し、尿タンパク質排泄量に応じてモデル群、ライコウトウ配糖体群、新規ライコウトウ配糖体Ｉ群、新規ライコウトウ配糖体ＩＩ群、及び新規ライコウトウ配糖体ＩＩＩ群にランダムに平均的に分けた。含有量の配合結果は表２と同様であった。

【0047】

表２ ライコウトウ配糖体及び新規ライコウトウ配糖体におけるトリプトリド及びトリプトリオリドの含有量（ｎ＝３）

【表3】

【0048】

５．２ 投与量の選択
薬物の製造：ライコウトウ配糖体を０．４ｇ取り、まず５ｍＬ無水エタノールを加えて薬物を溶解し、さらに時計回りによく揺動しながら無水エタノール溶液をカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液にゆっくりと滴下して４２３ｍＬに定容し、超音波処理により均一に混合した。新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩの調製方法はライコウトウ配糖体と同様であり、濃度はいずれも０．９５ｇ／Ｌであった。

【0049】

モデル構築成功後の翌日から、各群に対して毎日胃内投与した。具体的には、ブランク群及びモデル群に生理食塩水、ライコウトウ配糖体群にライコウトウ配糖体（０．９５ｇ／Ｌ）、新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ（０．９５ｇ／Ｌ）群にそれぞれ新規ライコウトウ配糖体Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩを、８週間連続的に投与した。各ラットの胃内投与量はいずれも１ｍＬ／１００ｇであった。

【0050】

５．３ 観察指標の測定
動物状況：各群のラットに対して週２回で体重を測り、ラットの精神状態、体毛、浮腫、動き状況等を観察した。

【0051】

尿タンパク質含有量の測定：各群のラットを、それぞれモデル構築前、モデル構築後の３週目、及び投与後の２、４、６、８週目に代謝ケージに個別に収容し、２４時間尿液を収集し、尿量を記録し、クマシーブリリアントブルー法により尿タンパク質の濃度を測定し、２４時間尿タンパク質排泄量を算出した。結果を表３、表４、図１２に示す。

【0052】

【表4】

ブランク群と比較した結果、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１であった。

【0053】

【表5】

ブランク群と比較した結果、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１であった。
モデル群と比較した結果、＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１であった。

【0054】

実験結果（表３、表４、図１２）から分かるように、実験過程において、ブランク群のラットは、精神状態が良好で、体毛が光沢を有し、動き、飲食が正常で、尿量が正常であった。モデル構築の２週間後、モデルラットのいずれにも、飲水減少、尿量減少が発生し、一部のラットには尾の潰爛（かいらん）が発生した。投与後、モデル群のラットは依然として焦燥性興奮であり、体毛が乱れ、尿量が減少し、痩せていたのに対して、投与群では上記状況が改善された。

【0055】

実験結果から分かるように、ＳＰＳＳ ２０．０統計ソフトウェアにより分析したところ、各時点でのデータは正規分布している。モデル構築前に、各群のラットの尿タンパク質排泄量には有意差がなかった。モデル構築後の３週目に、各モデル構築群のラットはブランク群に比べて、尿タンパク質排泄量に有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデル構築が成功したことを示している。治療過程において、各治療群のラットの尿タンパク質排泄量は、いずれもある程度の減少した。投与後に、モデル群に比べて、ライコウトウ配糖体群及び新規ライコウトウ配糖体ＩＩ群の尿タンパク質排泄量は顕著に減少した（Ｐ＜０．０５）。ライコウトウ配糖体群と新規ライコウトウ配糖体ＩＩ群との尿タンパク質排泄量には有意差がなかった。

【0056】

血液生化学指標の検査：実験の８週目が終わったときに、腹部大動脈採血によりラット血清を取り、自動生化学分析装置により血清における総タンパク質、アルブミン、尿素窒素、クレアチニン、総コレステロール、トリグリセリド等の血液生化学指標を測定した。結果を表５、図１３、図１４に示す。

【0057】

【表6】

ブランク群と比較した結果、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１であった。
モデル群と比較した結果、＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１であった。

【0058】

実験結果から分かるように、ＳＰＳＳ ２０．０統計ソフトウェアにより分析したところ、各データは正規分布になっている。実験結果より、以下のことが明らかになった。
１）各群のラットの総タンパク質レベルには有意差がなかった。モデル群のラットのアルブミンレベルは顕著に低下し、ブランク群に比べて有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデル群に比べて新規ライコウトウ配糖体ＩＩ群のアルブミン含有量は顕著に向上し、有意差があった（Ｐ＜０．０１）。
２）各群のラットの血清における尿素窒素、クレアチニンレベルには有意差がなかった。
３）総コレステロールレベルについて、モデル群のラットの総コレステロールレベルは顕著に向上し、ブランク群に比べて有意差があり（Ｐ＜０．０１）、モデル群に比べて新規ライコウトウ配糖体ＩＩ群の総コレステロールレベルは顕著に低下し、有意差があった（Ｐ＜０．０５）。
４）トリグリセリドレベルについて、ブランク群に比べて、モデル群のラットのトリグリセリドレベルは顕著に向上し（Ｐ＜０．０１）、モデル群に比べて、ライコウトウ配糖体群、新規ライコウトウ配糖体ＩＩ、ＩＩＩ群の総コレステロールレベルは、いずれも顕著に低下した（Ｐ＜０．０５又はＰ＜０．０１）。

【0059】

組織病理学的検査：腹部大動脈採血後に、ラットの腎臓を摘出し、１０％のホルマリン溶液で固定し、パラフィンに包埋してスライスし、ＨＥ染色した後、病理学的検査を行なった。結果を図１５に示す。結果から分かるように、光学顕微鏡下で、ブランク群の糸球体、尿細管及び腎間質に明らかな異常は観察されなかった。モデル群は、メサンギウム細胞及び間質過形成、腎間質線維化が観察され、一部の尿細管上皮細胞に粒子変性が観察され、一部の糸球体が萎縮した。各治療群の腎臓の病理学的状況は、モデル群に比べて改善された。

【0060】

以上まとめると、ＮＳラットは、糸球体のバリア機能の損傷により、大量のアルブミンが尿液に漏出して大量のタンパク尿が形成される。従って、ＮＳ疾患の治療においては、ＮＳラットの尿タンパク質排泄量の低減は重要な指標の一つである。糸球体の損傷がひどくなり糸球体硬化が発生するときに、尿タンパク質の排泄量は顕著に減少するため、偽陽性の結果が生じることがある。従って、薬物のＮＳ疾患に対する治療効果を判断するときに、尿タンパク質の排泄量を観察することに加えて、血清クレアチニン、尿素窒素のレベル及び腎臓の病理学的検査結果を考慮して総合的に評価する必要がある。本実験結果から分かるように、新規ライコウトウ配糖体ＩＩはＮＳラットの２４ｈ尿タンパク質排泄量を顕著に減少させることができ、且つ、クレアチニン、尿素窒素レベルに異常がなく、新規ライコウトウ配糖体ＩＩ群のラットの腎臓病理切片にも顕著な糸球体硬化等の病理学的変化が観察されなかった。新規ライコウトウ配糖体ＩＩはＮＳラットに対して顕著な治療作用を有することを示している。薬力学的結果から明らかであるように、ラットに尾静脈より５ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシンを１回注射することによりＮＳ動物モデルを成功に構築することができた。薬物の介入から分かるように、ライコウトウ配糖体及び新規ライコウトウ配糖体ＩＩは、ＮＳラットに対して顕著な治療作用を有し、両者の効果が類似しているが、新規ライコウトウ配糖体ＩＩの方は効果が速く効いた。本実験で得られた新規ライコウトウ配糖体ＩＩは、毒性低減・効果持続プロセス研究における効果持続の目的を達成した。従って、ネフローゼ症候群、原発性糸球体腎症、紫斑病性腎炎及びループス腎炎、関節リウマチ、エリテマトーデス、亜急性及び慢性重症肝炎、慢性活動性肝炎、アレルギー性皮膚血管炎、皮炎、湿疹、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎の治療薬の製造における本発明の新規ライコウトウ配糖体の使用に基盤を提供し、実現可能性を確認した。

【0061】

以上の説明は本発明の一部の実施形態に過ぎない。本発明の創作趣旨から逸脱しない限り、当業者であれば、様々な変形及び改良を行うことができ、これらは本発明の保護範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】