特許 6872756 抗Ｍｙｌ９抗体

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6872756

(24)【登録日】2021年4月22日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】抗Ｍｙｌ９抗体

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/18 20060101AFI20210510BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 1/04 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 37/08 20060101ALI20210510BHJP

   C12P 21/08 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   C07K16/18ZNA

   C12N15/13

   A61K39/395 N

   A61P1/04

   A61P11/00

   A61P35/00

   A61P37/08

   !C12P21/08

【請求項の数】21

【全頁数】50

(21)【出願番号】特願2017-561129(P2017-561129)

(86)(22)【出願日】2017年1月11日

(86)【国際出願番号】JP2017000605

(87)【国際公開番号】WO2017122666

(87)【国際公開日】20170720

【審査請求日】2019年12月25日

(31)【優先権主張番号】特願2016-3429(P2016-3429)

(32)【優先日】2016年1月12日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】304021831

【氏名又は名称】国立大学法人千葉大学

(73)【特許権者】

【識別番号】506137147

【氏名又は名称】エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100088155

【弁理士】

【氏名又は名称】長谷川 芳樹

(74)【代理人】

【識別番号】100128381

【弁理士】

【氏名又は名称】清水 義憲

(74)【代理人】

【識別番号】100126653

【弁理士】

【氏名又は名称】木元 克輔

(72)【発明者】

【氏名】中山 俊憲

(72)【発明者】

【氏名】木村 元子

(72)【発明者】

【氏名】林崎 浩史

(72)【発明者】

【氏名】平山 俊文

(72)【発明者】

【氏名】角太 淳吾

(72)【発明者】

【氏名】坂本 佳正

(72)【発明者】

【氏名】源島 龍

(72)【発明者】

【氏名】時田 大輔

(72)【発明者】

【氏名】村本 賢三

(72)【発明者】

【氏名】今井 俊夫

【審査官】 宮岡 真衣

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１９２９１５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１５／１９０５３８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１０／１２３０１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１４／２０５５０１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／１０５０５８（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 LUO Xue-Gang et al.，Cancer Letters，344 (2014)，p.129-137

【文献】 ISHIHARA S. et al.，FEBS Letters，587 (2013)，p.732-736

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ １５／１３

Ａ６１Ｋ ３９／３９５

Ａ６１Ｐ １／０４

Ａ６１Ｐ １１／００

Ａ６１Ｐ ３５／００

Ａ６１Ｐ ３７／０８

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＣｉＮｉｉ

ＧｅｎｅＣａｒｄｓ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド（Ｍｙｌ）９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記抗体は、以下の抗体からなる群から選択される、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片：
（１）配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２）配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（３）配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（４）配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（５）配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（６）配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（７）配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（８）配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（９）配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１０）配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１１）配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１２）配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１３）配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１４）配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１５）配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１６）配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１７）配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１８）配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１９）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２０）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２１）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；および
（２２）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。

【請求項2】

抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド（Ｍｙｌ）９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記抗体は、以下の抗体からなる群から選択される、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片：
（１）配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２）配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（３）配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（４）配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（５）配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（６）配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（７）配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（８）配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（９）配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１０）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１１）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１２）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；および
（１３）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。

【請求項3】

請求項１又は２に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖の定常領域がＩｇＧである、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【請求項4】

請求項３に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記重鎖の定常領域がヒトＩｇＧ２の定常領域である、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【請求項5】

請求項４に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ２の定常領域が、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａの変異を有する、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【請求項6】

請求項４または５に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記定常領域は、Ｃ末端のリシン残基を欠失している、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【請求項7】

請求項３に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記軽鎖の定常領域がヒトＩｇκの定常領域を含む、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記抗体またはそのＭｙｌ９結合断片が、Ｍｙｌ１２aまたはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との相互作用を阻害することを特徴とする、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【請求項9】

請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片をコードする単離された核酸。

【請求項10】

請求項９に記載の核酸を含むベクター。

【請求項11】

請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。

【請求項12】

請求項１１に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片の作製方法。

【請求項13】

請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体またはそのＭｙｌ９結合断片、および薬学的に許容可能な担体または添加物を含有する医薬組成物。

【請求項14】

請求項１３に記載の医薬組成物であって、
アレルギー性気道炎症または炎症性腸疾患の治療用の、
医薬組成物。

【請求項15】

請求項１４に記載の医薬組成物であって、
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎またはクローン病である、
医薬組成物。

【請求項16】

請求項１３に記載の医薬組成物であって、
免疫チェックポイント阻害剤と併用投与されるように用いられることを特徴とする、腫瘍の治療用の、
医薬組成物。

【請求項17】

請求項１６に記載の医薬組成物であって、
免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１阻害剤である、
医薬組成物。

【請求項18】

請求項１７に記載の医薬組成物であって、
ＰＤ−１阻害剤が抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、
医薬組成物。

【請求項19】

請求項１７に記載の医薬組成物であって、
ＰＤ−１阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、
医薬組成物。

【請求項20】

請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物であって、
腫瘍が大腸がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん、肝細胞がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、小細胞肺がん、中皮腫および子宮体がんからなる群から選択される、
医薬組成物。

【請求項21】

請求項２０に記載の医薬組成物であって、
腫瘍が大腸がんである、
医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ミオシン調節軽鎖ポリペプチド（Ｍｙｌ）９に結合する抗体またはそのＭｙｌ９結合断片、および当該抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む医薬組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

ＣＤ６９は、Ｃタイプレクチンファミリーに属するＩＩ型の膜貫通型タンパク質である。ＣＤ６９は、リンパ球活性化の指標として広く用いられており（非特許文献１）、これまでに、局所炎症、関節炎、アレルギー性気道炎症などの炎症性疾患への関与が報告されている（非特許文献２および３）。

【0003】

近年、ＣＤ６９が、ミオシンを構成するサブユニットの１つであるミオシン調節軽鎖ポリペプチド（Ｍｙｌ）９と相互作用することが報告され、これに伴い、Ｍｙｌ９を標的とした、炎症疾患の治療戦略が考察されている（特許文献１）。
また、免疫チェックポイント阻害剤は、近年登場した抗がん剤の一群で、がん細胞やリンパ球（Ｔ細胞）に発現している、免疫チェックポイントと呼ばれる、免疫にブレーキをかけるタンパク質を阻害する。免疫チェックポイントとして働く分子としては、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＰＤ−１）、ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−ｌｉｇａｎｄ １（ＰＤ−Ｌ１）およびｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ−４（ＣＴＬＡ−４）などが知られている。免疫チェックポイント阻害剤のうちの幾つかは医薬品として承認されており、その適応症には、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部がんおよび尿路上皮がんを含む。さらには、大腸がん、乳がん、肝細胞がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、小細胞肺がん、中皮腫、子宮体がんなどの癌種に対しても、免疫チェックポイント阻害剤単独または他の抗がん剤との併用による治療が有効である臨床試験結果が報告されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】ＷＯ２０１４／１９２９１５

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Ｔｅｓｔｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １５：４７９−４８３，１９９４．

【非特許文献2】Ｍｕｒａｔａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．：ＣＤ６９−ｎｕｌｌ ｍｉｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ａｎｔｉ−ｔｙｐｅ ＩＩ ｃｏｌｌａｇｅｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：９８７−９９２，２００３

【非特許文献3】Ｍｉｋｉ−Ｈｏｓｏｋａｗａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：ＣＤ６９ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｌｌｅｒｇｉｃ ａｉｒｗａｙ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８３；８２０３−８２１５，２００９

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

抗体および抗原結合断片は、それらの持つ結合特異性から、望ましい治療薬となりうる。抗体および抗原結合断片は、特定の細胞または組織のみを標的とすることにより、潜在的な副作用を最小にするために用い得る。Ｍｙｌ９の標的化に有用な抗体を同定し、かつ医薬として使用されるヒト化抗体が必要とされている。

【0007】

したがって、本発明は、ヒトにおいて、Ｍｙｌ９に結合し、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害できる抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片、およびこれらを含む医薬組成物を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ヒトおよびマウスＭｙｌ９に結合し、ＣＤ６９との相互作用を阻害し得る、マウス抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体を取得することに成功した。そして、本発明者らは、当該マウス抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ：ＣＤＲ、（「超可変領域」ということもある））のアミノ酸配列を特定することにより、重鎖および軽鎖の可変領域に、前記マウス抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体のＣＤＲ配列を含むヒト化抗体またはキメラ抗体を取得した。

【0009】

すなわち、本発明は、以下の特徴を包含する。
[１] 抗ミオシン調節軽鎖ポリペプチド（Ｍｙｌ）９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
（ａ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる軽鎖ＣＤＲ３；
を含む、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0010】

[２] [１]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記抗体は、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0011】

[３] [１]または[２]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記Ｍｙｌ９は、ヒトＭｙｌ９である、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0012】

[４] [１]〜[３]のいずれかに記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記抗体は、重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖の可変領域は、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、または６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含み、
前記軽鎖の可変領域は、配列番号６５、６６、６７または６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含み、
Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害する、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0013】

[５] [１]〜[４]のいずれかに記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記抗体は、以下の抗体からなる群から選択される、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片：
（１）配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２）配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（３）配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（４）配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（５）配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（６）配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（７）配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（８）配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（９）配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１０）配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１１）配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１２）配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１３）配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１４）配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１５）配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１６）配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１７）配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１８）配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１９）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２０）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２１）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；および
（２２）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。

【0014】

[６] [１]〜[５]のいずれかに記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖の定常領域がＩｇＧである、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0015】

[７] [６]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記重鎖の定常領域がヒトＩｇＧ２の定常領域である、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0016】

[８] [７]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ２の定常領域が、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａの変異を有する、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0017】

[９] [７]または[８]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記定常領域は、Ｃ末端のリシン残基を欠失している、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0018】

[１０] [６]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記軽鎖の定常領域がヒトＩｇκの定常領域を含む、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0019】

[１１] [１]〜[１０]のいずれかに記載の抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記抗体またはそのＭｙｌ９結合断片が、Ｍｙｌ１２aまたはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との相互作用を阻害することを特徴とする、
抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0020】

[１２] [１]〜[１１]のいずれかに記載の抗体またはそのＭｙｌ９結合断片、および薬学的に許容可能な担体または添加物を含有する医薬組成物。

【0021】

[１３] [１２]に記載の医薬組成物であって、
アレルギー性気道炎症または炎症性腸疾患の治療用の、
医薬組成物。

【0022】

[１４] [１３]に記載の医薬組成物であって、
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎またはクローン病である、
医薬組成物。

【0023】

[１５] [１２]に記載の医薬組成物であって、
免疫チェックポイント阻害剤と併用投与されるように用いられることを特徴とする、腫瘍の治療用の、
医薬組成物。

【0024】

[１６] [１５]に記載の医薬組成物であって、
免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１阻害剤である、
医薬組成物。

【0025】

[１７] [１６]に記載の医薬組成物であって、
ＰＤ−１阻害剤が抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、
医薬組成物。
[１８] [１６]に記載の医薬組成物であって、
ＰＤ−１阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、
医薬組成物。

【0026】

[１９] [１５]〜[１８]のいずれかに記載の医薬組成物であって、
腫瘍が大腸がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん、肝細胞がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、小細胞肺がん、中皮腫および子宮体がんからなる群から選択される、
医薬組成物。
[２０] [１９]に記載の医薬組成物であって、
腫瘍が大腸がんである、
医薬組成物。

【0027】

また、本発明は、以下の特徴を包含する。
[１’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0028】

[２’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0029】

[３’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0030】

[４’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0031】

[５’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0032】

[６’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0033】

[７’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0034】

[８’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0035】

[９’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0036】

[１０’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0037】

[１１’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0038】

[１２’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0039】

[１３’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0040】

[１４’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0041】

[１５’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0042】

[１６’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0043】

[１７’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0044】

[１８’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0045】

[１９’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0046】

[２０’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0047】

[２１’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0048】

[２２’] 抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0049】

[２３’] [１’]〜[２２’]のいずれかに記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害する、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0050】

[２４’] [１’]〜[２３’]のいずれかに記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
重鎖および軽鎖を含み、
前記重鎖の定常領域がＩｇＧである、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0051】

[２５’] [２４’]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記重鎖の定常領域がヒトＩｇＧ２の定常領域である、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0052】

[２６’] [２５’]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記ヒトＩｇＧ２の定常領域が、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａの変異を有する、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0053】

[２７’] [２５’]または[２６’]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記定常領域は、Ｃ末端のリシン残基を欠失している、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0054】

[２８’] [２４’]に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記軽鎖の定常領域がヒトＩｇκの定常領域を含む、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。
[２９’] [１’]〜[２８’]のいずれか１項に記載の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片であって、
前記抗体またはそのＭｙｌ９結合断片が、Ｍｙｌ１２aまたはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との相互作用を阻害することを特徴とする、
抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片。

【0055】

[３０’] [１’]〜[２９’]のいずれかに記載の抗体またはそのＭｙｌ９結合断片、および薬学的に許容可能な担体または添加物を含有する医薬組成物。

【0056】

[３１’] [３０’]に記載の医薬組成物であって、
アレルギー性気道炎症または炎症性腸疾患の治療用の、
医薬組成物。

【0057】

[３２’] [３１’]に記載の医薬組成物であって、
炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎またはクローン病である、
医薬組成物。

【0058】

[３３’] [３２’]に記載の医薬組成物であって、
免疫チェックポイント阻害剤と併用投与されるように用いられることを特徴とする、腫瘍の治療用の、
医薬組成物。

【0059】

[３４’] [３３’]に記載の医薬組成物であって、
免疫チェックポイント阻害剤がＰＤ−１阻害剤である、
医薬組成物。

【0060】

[３５’] [３４’]に記載の医薬組成物であって、
ＰＤ−１阻害剤が抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である、
医薬組成物。
[３６’] [３４’]に記載の医薬組成物であって、
ＰＤ−１阻害剤が抗ＰＤ−１抗体である、
医薬組成物。

【0061】

[３７’] [３３’]〜[３６’]のいずれかに記載の医薬組成物であって、
腫瘍が大腸がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん、肝細胞がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、小細胞肺がん、中皮腫および子宮体がんからなる群から選択される、
医薬組成物。
[３８’] [３７’]に記載の医薬組成物であって、
腫瘍が大腸がんである、
医薬組成物。

【0062】

上記に挙げた本発明の態様の一または複数を任意に組み合わせた発明も、本発明の範囲に含まれる。

【発明の効果】

【0063】

本発明によれば、Ｍｙｌ９に結合し、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害し得る、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片、およびこれらを含む医薬組成物が提供される。

【図面の簡単な説明】

【0064】

【図1-1】図１−１は、マウスＭｙｌ９とヒトＭｙｌ９のアミノ酸配列の比較（Ａ）、およびマウスＭｙｌ３とヒトＭｙｌ３のアミノ酸配列の比較（Ｂ）をそれぞれ示す。＊：一致するアミノ酸。−：ギャップ。下線：抗体Ａの作製においてマウスの免疫に用いたペプチドのアミノ酸配列。

【図1-2】図１−２は、マウスＭｙｌ３とマウスＭｙｌ９のアミノ酸配列の比較（Ｃ）、ヒトＭｙｌ３とヒトＭｙｌ９のアミノ酸配列の比較（Ｄ）をそれぞれ示す。＊：一致するアミノ酸。−：ギャップ。

【図2】図２は、抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体（抗体Ａ）の、マウスＭｙｌ９およびヒトＭｙｌ９、ならびにマウスＭｙｌ３およびヒトＭｙｌ３に対する結合能を示す結果である。

【図3】図３は、糖鎖を有する（Ａ）または有しない（Ｂ）マウスＣＤ６９の、マウスＭｙｌ９に対する濃度依存的な結合と、前記結合が、抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体（抗体Ａ）によって有意に阻害されたことを示す（Ｃ）。

【図4-1】図４−１は、気道炎症時に誘導される気管支周囲への細胞浸潤に対する、抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体（抗体Ａ）の投与による抑制効果を示す。図４Ａは、気道炎症が誘導されたマウスへの抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体（抗体Ａ）投与後のヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）、およびＰＡＳ染色の結果を示す。図４Ｂは、気道炎症が誘導されたマウスへの抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体（抗体Ａ）投与後の肺胞洗浄液中に見られる浸潤細胞数と、浸潤細胞種を示す。図４Ｃは、気道炎症が誘導されたマウスへの抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体（抗体Ａ）投与後の、サイトカインの産生量を示す。

【図4-2】図４−２は、気道炎症誘発後１７日目におけるメサコリン誘導性の気道抵抗値について、抗体Ａ投与群（Ｄ）、抗Ｍｙｌ９／１２ポリクローナル抗体投与群(Ｅ)、並びにコントロール抗体投与群（Ｄ、Ｅ）の間の比較を示す。

【図5】図５は、ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ強陽性（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉｇｈ）Ｔリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける、抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体（抗体Ａ）による、体重減少（上図）、および疾患活動性指数［ＤＡＩ（Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）］（下図）の結果を示す。

【図6-1】図６−１は、抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体のヒトＭｙｌ９に対する結合能を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図6-2】図６−２は、抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体のヒトＭｙｌ９に対する結合能を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図6-3】図６−３は、抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体のヒトＭｙｌ９に対する結合能を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図7】図７は、マウスＭｙｌ９、マウスＭｙｌ１２ａおよびマウスＭｙｌ１２ｂのアミノ酸配列の比較（Ａ）、およびヒトＭｙｌ９、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂのアミノ酸配列の比較（Ｂ）をそれぞれ示す。＊：一致するアミノ酸。−：ギャップ。下線：抗体Ａの作製においてマウスの免疫に用いたＭｙｌ９のペプチドのアミノ酸配列。

【図8】図８は、抗体ＡのマウスＭｙｌ９、マウスＭｙｌ１２ａおよびマウスＭｙｌ１２ｂに対する結合能（Ａ）、およびヒトＭｙｌ９、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂに対する結合能（Ｂ）を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図9A】図９Ａは、抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体のヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質に対する結合能を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図9B】図９Ｂ、抗体Ａから作製したヒト化抗体のヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質に対する結合能を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図9C】図９Ｃは、抗体Ａから作製したヒト化抗体のヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質に対する結合能を評価したＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図10】図１０は、ヒトとマウスのＣＤ６９タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列の比較を示す。

【図11】図１１は、ヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質の、ヒトＭｙｌ９、およびヒトＭｙｌ９と相同性の高いＭｙｌ１２ａ、１２ｂへの濃度依存的な結合を示す。

【図12】図１２は、抗体Ａが、ヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質とヒトＭｙｌ９タンパク質（Ａ）、ヒトＭｙｌ１２ａタンパク質（Ｂ）およびヒトＭｙｌ１２ｂタンパク質（Ｃ）との結合を濃度依存的に阻害した結果を示す。

【図13-1】図１３は、抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体が、ヒトＭｙｌ９とヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合を濃度依存的に阻害した結果を示す。

【図13-2】図１３−１の続き。

【図13-3】図１３−２の続き。

【図13-4】図１３−３の続き。

【図13-5】図１３−４の続き。

【図14-1】図１４は、抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体が、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合を濃度依存的に阻害した結果を示す。

【図14-2】図１４−１の続き。

【図14-3】図１４−２の続き。

【図14-4】図１４−３の続き。

【図15】図１５は、マウス大腸がん細胞株ＣＴ２６.ＷＴの皮下腫瘍組織における、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂの発現量を解析した結果を示す。

【図16】図１６は、マウス大腸がん細胞株ＣＴ２６.ＷＴ皮下移植モデルにおける、コントロール群（Ａ）、抗体Ａ単独投与群（Ｂ）、抗ＰＤ−１抗体単独投与群（Ｃ）、および抗体Ａと抗ＰＤ−１抗体併用投与群（Ｄ）での腫瘍増殖抑制を示す。

【発明を実施するための形態】

【0065】

本発明は、ミオシン調節軽鎖ポリペプチド（以下、Ｍｙｌと記載する）９に結合する抗Ｍｙｌ９抗体に関する。

【0066】

本発明で使用される抗Ｍｙｌ９抗体は、Ｍｙｌ９を認識して結合することができる抗体であり、以下に述べるように、該抗体は、ｉｎｔａｃｔ抗体であってもよい。あるいは、本発明で使用される抗Ｍｙｌ９抗体は、Ｍｙｌ９との結合親和性を有する限り、組換え抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体など）や化学合成抗体、その抗原結合断片であってもよい。本発明において、Ｍｙｌ９は、ヒトまたはマウス由来のＭｙｌ９を指すものと理解できる。ヒトまたはマウス由来のＭｙｌ９のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センターが提供するＧｅｎｂａｎｋなど、遺伝子およびアミノ酸の配列情報が登録された公共のデータベースから入手できるほか、近縁関係にある動物種のＭｙｌ９の塩基配列情報を元にプライマーを設計し、所望の動物種から抽出したＲＮＡからクローニングすることで、Ｍｙｌ９遺伝子の配列情報を入手し、その配列情報からアミノ酸配列を決定することが可能である。例えば、ヒトおよびマウスのＭｙｌ９のアミノ酸配列情報は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００６０８８．２（配列番号２）、Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿７４２１１６．１（配列番号１）としてデータベース上に登録されている。

【0067】

本発明の一態様において、Ｍｙｌ９は、配列番号１記載のアミノ酸配列によって示されるペプチド、または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換・付加・欠失したアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む。本発明において、Ｍｙｌ９に関して使用される「複数個」は、その元となるアミノ酸配列によって示されるペプチドと同等の機能特性を保持する限り限定されないが、２個〜２０個、例えば２個〜１５個、２個〜１０個、２個〜９個、２個〜８個、２個〜７個、２個〜６個、または２個〜５個である。本発明の別の態様において、Ｍｙｌ９は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む。

【0068】

本発明において、アミノ酸配列の「相同性」とは、以下のパラメーター設定の下に、ＣＬＵＳＴＡＬＷアルゴリズムを用いて２配列間比較（Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を行った場合の相同性を意味する。
Ｋ−ｔｕｐｌｅ（ｗｏｒｄ）ｓｉｚｅ：１
Ｗｉｎｄｏｗ ｓｉｚｅ：５
Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ：３
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｔｏｐ Ｄｉａｇｏｎａｌｓ：５
Ｓｃｏｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄ：ＰＥＲＣＥＮＴ

【0069】

本発明の一態様において、Ｍｙｌ９は、配列番号２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチド、または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換・付加・欠失したアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む。本発明において、Ｍｙｌ９に関して使用される「複数個」は、その元となるアミノ酸配列によって示されるペプチドと同等の機能特性を保持する限り限定されないが、２個〜２０個、例えば２個〜１５個、２個〜１０個、２個〜９個、２個〜８個、２個〜７個、２個〜６個、または２個〜５個である。本発明の別の態様において、Ｍｙｌ９は、配列番号２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む。

【0070】

本発明の一態様において、Ｍｙｌ９は、配列番号３記載のアミノ酸配列によって示されるペプチド、または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換・付加・欠失したアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む。本発明において、Ｍｙｌ９に関して使用される「複数個」は、その元となるアミノ酸配列によって示されるペプチドと同等の機能特性を保持する限り限定されないが、２個〜２０個、例えば２個〜１５個、２個〜１０個、２個〜９個、２個〜８個、２個〜７個、２個〜６個、または２個〜５個である。本発明の別の態様において、Ｍｙｌ９は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む。

【0071】

本発明の一態様において、マウスＭｙｌ９とマウスＭｙｌ１２ａ、およびマウスＭｙｌ９とマウスＭｙｌ１２ｂは、アミノ酸配列において、それぞれ９４．２％および９３．６％の相同性を有し、マウスＭｙｌ１２ａとマウスＭｙｌ１２ｂは、９７．７％の相同性を有する。また、ヒトＭｙｌ９とヒトＭｙｌ１２ａ、およびヒトＭｙｌ９とヒトＭｙｌ１２ｂは、アミノ酸配列において、それぞれ９１．８％および９３．０％の相同性を有し、ヒトＭｙｌ１２ａとヒトＭｙｌ１２ｂは、９６．５％の相同性を有する。そのため、Ｍｙｌ９を認識する抗体が、Ｍｙｌ１２ａを認識することがある。また、Ｍｙｌ９を認識する抗体が、Ｍｙｌ１２ｂを認識することがある。したがって、本発明の一実施形態では、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂをさらに認識することができる。

【0072】

本発明の一態様において、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、Ｍｙｌ９とＣＤ６９の細胞外領域との結合を阻害する抗体である。例えば、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、配列番号４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチド、または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換・付加・欠失したアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む、ＣＤ６９細胞外領域のいずれかの部位と、Ｍｙｌ９との結合を阻害する抗体または抗原結合断片であってもよい。本発明において、ＣＤ６９の細胞外領域に関して使用される「複数個」は、これに限定されるものではないが、２個〜１５個、例えば２個〜１４個、２個〜１３個、２個〜１２個、２個〜１１個、２個〜１０個、２個〜９個、２個〜８個、２個〜７個、２個〜６個、または２個〜５個である。本発明の別の態様において、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、配列番号４に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む、ＣＤ６９細胞外領域のいずれかの部位と、Ｍｙｌ９との結合を阻害する抗体または抗原結合断片であってもよい。

【0073】

本発明の別の態様において、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９の細胞外領域との結合をさらに阻害する抗体である。例えば、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、配列番号９７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチド、または当該アミノ酸配列において１個または複数個のアミノ酸が置換・付加・欠失したアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む、ＣＤ６９細胞外領域のいずれかの部位と、Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとの結合を阻害する抗体または抗原結合断片であってもよい。本発明の別の態様において、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、配列番号９７に記載のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む、ＣＤ６９細胞外領域のいずれかの部位と、Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとの結合を阻害する抗体または抗原結合断片であってもよい。

【0074】

本発明の一態様において、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒト等）のＭｙｌ９に結合し、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害することができ、好ましくは、ヒトＭｙｌ９に結合し、ヒトＭｙｌ９とヒトＣＤ６９との相互作用を阻害することができる。本発明において、「Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害する」とは、Ｍｙｌ９とＣＤ６９の相互作用の消失または低減を意味する。Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用は、Ｍｙｌ９とＣＤ６９とが共存下で作用した結果生じるＣＤ６９の機能の変化（例えば、ＣＤ６９の機能の発現または亢進、あるいはＭｙｌ９の作用によるＣＤ６９の機能変化によって生じる生理機能）やＣＤ６９を発現したＣＤ４Ｔ細胞の骨髄への移行を測定することによって評価することができる。

【0075】

本発明の別の態様において、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒト等）のＭｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂにさらに結合し、Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとの相互作用を阻害することができ、好ましくは、ヒトＭｙｌ１２ａおよび／またはヒトＭｙｌ１２ｂにさらに結合し、ヒトＭｙｌ１２ａおよび／またはヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９との相互作用を阻害することができる。本発明において、「Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との相互作用を阻害する」とは、Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９の相互作用の消失または低減を意味する。Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との相互作用は、Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９とが共存下で作用した結果生じるＣＤ６９の機能の変化（例えば、ＣＤ６９の機能の発現または亢進、あるいはＭｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂの作用によるＣＤ６９の機能変化によって生じる生理機能）やＣＤ６９を発現したＣＤ４Ｔ細胞の骨髄への移行を測定することによって評価することができる。

【0076】

抗体またはその抗原結合断片の、抗原への結合特性（例えば、結合親和性および種交差反応性）を測定する方法は、当該技術分野において当業者に公知の方法を用いてよい。例えば、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＫｉｎＥｘＡバイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ免疫測定法（ＩＧＥＮ社）、フローサイトメトリー、蛍光消光、蛍光転移、酵母ディスプレイ、または免疫染色等を使用して測定してよいが、これらに限定されない。抗体またはその抗原結合断片の、Ｍｙｌ９とＣＤ６９の結合に対する中和活性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）バイオセンサー、ＥＬＩＳＡ、またはフローサイトメトリー等を使用して測定してよいが、これらに限定されない。

【0077】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、Ｍｙｌ９またはＭｙｌ９上の前記抗体の結合領域のアミノ酸配列を有する他のペプチド分子と結合する、好ましくは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、またはそのＭｙｌ９結合断片のいずれであってもよい。

【0078】

本発明において、モノクローナル抗体は、実質的に均一な抗体のポピュレーションから得られる抗体を意味してよい。すなわち、そのポピュレーションに含まれる個々の抗体は、若干存在し得る可能性のある天然の突然変異体を除いて同一である。モノクローナル抗体は、単一抗原部位に対するものである。さらに、異なる抗原や異なるエピトープを標的とする典型的なポリクローナル抗体とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一のエピトープを標的とするものである。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体ポピュレーションから得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とするものとして限定的に解されるべきではない。

【0079】

本発明において、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇＭ（またはそれらのサブクラス）等の任意のクラスであってよく、特定のクラスに限定されない。重鎖（Ｈ鎖と呼ぶこともある）の定常領域の抗体アミノ酸配列により、免疫グロブリンは、異なるクラスに分類される。５つの主な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらの幾つかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２というサブクラス（アイソタイプ）にさらに細分化され得る。異なるクラスの免疫グロブリンの対応する重鎖の定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。また、抗体の軽鎖（Ｌ鎖と呼ぶこともある）の種類にはλ鎖およびκ鎖が存在する。

【0080】

一態様において、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、ＩｇＧ抗体であってよく、例えば、ＩｇＧ１抗体またはＩｇＧ２抗体等であってよい。また、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、単量体、二量体または多量体の形態であってもよい。

【0081】

本明細書において、Ｍｙｌ９結合断片は、抗Ｍｙｌ９抗体の機能的、構造的断片であって、Ｍｙｌ９に対する結合性を保持しているものであれば特に限定されない。そのようなＭｙｌ９結合断片の例としては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、１本鎖（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、抗体部分を含む融合タンパク質または融合ペプチド、およびＭｙｌ９認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の修飾構造体等を挙げることができる。

【0082】

抗Ｍｙｌ９抗体のＭｙｌ９結合断片は、例えばパパイン、ペプシン等のプロテアーゼによる、完全な抗体のタンパク質消化を介して得ることができ、または組換え宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、または、大腸菌等の原核生物）により直接産生させてもよい。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収し、化学的に結合させることによってＦ（ａｂ’）_２断片を形成させてもよい。また、Ｆ（ａｂ’）_２は、Ｆ（ａｂ’）_２分子の組み立てを促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成させてもよい。また、ｓｃＦｖを化学合成技術で生産する場合には、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖを遺伝子組換え技術で生産する場合には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを、適切な宿主細胞（例えば、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞もしくは哺乳動物細胞等の真核生物、または、大腸菌等の原核生物）に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーション等の周知の操作により作製してもよい。その結果生じるｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技術を使用して単離してもよい。

【0083】

本発明において、抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域、抗体重鎖の可変領域、またはその両方を意味する。また本発明において、抗体の定常領域は、抗体軽鎖の定常領域、抗体重鎖の定常領域、またはその両方を意味する。重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３つのＣＤＲにより連結される４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲにより、近傍に保持されており、他方の鎖におけるＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための技術としては、限定はされないが、例えば、（１）異種間配列可変性に基づくアプローチ（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， １９９１， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）；および（２）抗原−抗体複合体の結晶構造学的研究に基づくアプローチ（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２７３：９２７−９４８）を挙げることができる。これらのアプローチや、他のアプローチを組合せて用いてもよい。

【0084】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、組換え抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体など）や化学合成抗体、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類、サル、ウシ、ウマ、ヤギ等）の抗体、または、それらのＭｙｌ９結合断片である。本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり、好ましくはヒト化抗体である。キメラ抗体は、例えば、非ヒト（例えば、マウスまたはラット）抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に導入した抗体であり、例えば、可変領域は非ヒト抗体由来、定常領域はヒト抗体由来となっている抗体を指す。ヒト化抗体は、例えば、非ヒト抗体の超可変領域をヒト抗体に導入した抗体であり、例えば、ＣＤＲは非ヒト抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体を指す。ただし、本発明において、キメラ抗体とヒト化抗体の境界は必ずしも明確である必要はなく、キメラ抗体ともヒト化抗体とも呼びうるような状態であってもよい。本発明において好ましいヒト化抗体の態様としては、ＣＤＲはげっ歯類抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体であり、特に好ましくは、ＣＤＲはマウス抗体由来、それ以外の抗体領域はヒト抗体由来となっている抗体である。ヒト化は、ＣＤＲ移植法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ（２００１） ａｎｄ Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６９−８３（２００５））を参照）を用いて、げっ歯類等の抗体由来のＣＤＲ配列を、ヒト抗体の対応する部位に導入することによっても行うことができる。ヒト化抗体は、場合によってはＦＲのいくつかのアミノ酸残基が非ヒト抗体の類似した部位由来のアミノ酸残基によって置換されたヒト化抗体であってもよい。

【0085】

抗原性を減少させるためには、ヒト化抗体の作製において、軽鎖および重鎖の両方でヒト可変領域の使用を選択することが重要であり得る。既知のヒトＦＲ配列の全ライブラリーに対して、マウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類抗体の可変領域のアミノ酸配列がスクリーニングされる。次に、げっ歯類抗体の配列に最も近いヒト抗体のアミノ酸配列が、ヒト化抗体のヒトＦＲとして受け入れられる。例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ｊｏｎｅｓ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｌａｂ Ｍａｎｕａｌ）， ５６７−５９０を参照することができる。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群の、全てのヒト抗体の共通配列に由来する特定のフレームワークが用いられる。いくつかの異なるヒト化抗体に対して、同じフレームワークが用いられ得る。例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｅｔ ＵＳＡ ８９：４２８５−４２８９（１９９２） ａｎｄ Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１ ：２６２３−２６３２（１９９３）を参照することができる。

【0086】

さらに、ヒト化抗体は一般に、抗原に対する高い結合親和性およびその他の好ましい生物学的性質を保持されることが望ましい。この目標を達成するため、一方法によれば、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いた、親配列および様々な概念的ヒト化産物の分析工程によって調製される。一般に三次元の免疫グロブリンモデルが利用可能であり、当業者に知られている。選択された候補である免疫グロブリン配列の有望な三次元立体構造を模式化し、これを表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの模式化された三次元立体構造を検討することにより、候補である免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼすアミノ酸残基の分析が可能となる。この方法により、単数または複数の標的抗原（例えばＭｙｌ９またはその断片）に対する結合親和性の保持のような、望ましい抗体の特性が達成されるように、ＦＲ残基を設計することができる。

【0087】

上記に例示したキメラ抗体またはヒト化抗体を、当該抗体の機能を保持させたまま（あるいは、当該抗体の機能を付加、向上させるために）適宜改変（例えば、抗体の修飾、または、抗体のアミノ酸配列の部分的な置換、付加、欠失）した抗体も、本発明の抗体に含まれる。具体的には、抗体産生細胞により産生される抗体の不均一性を減少させるため、重鎖のカルボキシ末端（Ｃ末端）に位置するリシン（Ｌｙｓ）を遺伝子改変等の人為的方法によって欠失させた抗体も、本発明の範囲に含まれる。他の部分的な置換の例としては、これに限定されるものではないが、重鎖の２３４番目のアミノ酸残基をバリン（Ｖ）からアラニン（Ａ）に変異させた抗体、重鎖の２３７番目のアミノ酸残基をグリシン（Ｇ）からアラニン（Ａ）に変異させた抗体およびこれらの組合せなどを挙げることができる。なお、前記変異は、本明細書中、それぞれＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａと記載される。

【0088】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、所望により、修飾してもよい。本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片の修飾は、（ａ）例えばシートまたはヘリックスコンホメーション等の、修飾領域におけるアミノ酸配列の三次元的な構造；（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性の状態；または、（ｃ）側鎖の容積の維持に対する修飾の効果、を変化させる修飾であってもよく、あるいはこれらの変化が明白に観察されないような修飾をほどこすことができる。

【0089】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片の修飾は、例えば、構成するアミノ酸残基の置換、欠失、付加等によって達成することができる。

【0090】

本明細書において、アミノ酸とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸、例えばセリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）のみならず、アミノ酸変異体および誘導体といった、非天然アミノ酸も含まれる。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えばＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸；アミノ酸変異体、アミノ酸誘導体等の化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等、生体内でタンパク質の構成材料とならないアミノ酸；および当業者に公知のアミノ酸の特性を有する、化学的に合成された化合物等を挙げることができる。非天然アミノ酸の例としては、α−メチルアミノ酸（α−メチルアラニン等）、Ｄ−アミノ酸（Ｄ−アスパラギン酸、Ｄ−グルタミン酸等）、ヒスチジン様アミノ酸（２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン、α−メチル−ヒスチジン等）、側鎖に余分なメチレンを有するアミノ酸（ホモアミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸等）等を挙げることができる。

【0091】

天然に存在するアミノ酸残基は、例えば、一般的な側鎖特性に基づいて、次のグループに分類され得る：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0092】

抗体またはその抗原結合断片を構成するアミノ酸配列の非保存的置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を他のグループに属するアミノ酸と交換することにより行ってもよい。より保存的な置換は、これらのグループの１つに属するアミノ酸を同一グループの他のアミノ酸と交換することにより行ってもよい。同様に、アミノ酸配列の欠失または置換を適宜行ってもよい。

【0093】

抗体またはその抗原結合断片を構成するアミノ酸の修飾としては、例えば、糖によるグリコシル化、アセチル化またはリン酸化等の翻訳後修飾であってもよい。抗体は、その定常領域における保存された位置でグリコシル化され得る。抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合型またはＯ−結合型のいずれかである。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖に対する糖質部分の結合を意味する。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−スレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖に対する糖質部分を酵素的に付加するための認識配列である。これらのトリペプチド配列のいずれかが抗体またはその抗原結合断片に存在することにより、潜在的なグリコシル化部位が存在する。Ｏ−結合型グリコシル化は、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのいずれかの、ヒドロキシアミノ酸（例えば、セリンまたはスレオニン）への結合であってよく、場合によっては、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンへの結合であってもよい。グリコシル化の条件（グリコシル化を、生物学的手法を用いて行う場合には、例えば、宿主細胞や細胞培地の種類、ｐＨ等）を、当業者は目的に応じて適宜、選択することができる。

【0094】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、さらに当業者に公知の技術常識に基づいて、その他の修飾方法により、単独または組み合わせて、修飾されてよい。

【0095】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、当業者に周知の方法によって産生されてよい。例えば、本発明のＭｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を産生するハイブリドーマを用いて抗体を産生させてよく、もしくは、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、当該発現ベクターを、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等に導入することによって抗体を産生させてもよい。本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片をコードする遺伝子は、シグナル配列をコードするＤＮＡを有すことが好ましく、重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、および軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの５´末端にシグナル配列をコードするＤＮＡを有することがより好ましい。シグナル配列は、分泌タンパク質や膜内在性タンパク質が、リボソーム上で合成された後に、脂質２重層を通り抜けるのに必要なタンパク質のＮ末端に存在するアミノ酸残基である。本発明においては、この機能を有する配列であれば特に限定されない。本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片が含み得るシグナル配列としては、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギ、ウマ、トリ、イヌ、ネコ、酵母等に由来するシグナル配列を挙げることができる。シグナル配列の具体的な一態様としては、重鎖に関するシグナル配列としては、配列番号１２で表されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられ、軽鎖に関するシグナル配列としては、配列番号１４で表されるアミノ酸配列を含むペプチドを挙げることができる。また、機能的に同等であれば、配列番号１２で表されるアミノ酸配列、または配列番号１４で表されるアミノ酸配列において、１または複数個（例えば２、３、４または５個）のアミノ酸の置換・付加・欠失を有していてもよい。

【0096】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、当業者に公知の方法に従って、単離または精製されたものであってよい。ここで、「単離された」または「精製された」は、自然の状態から、人為的に単離されたか、精製されたことを意味する。分子または組成物が自然に発生したものである場合、それが変化したか、もしくは本来の環境から除去されたか、またはその両方であるとき、それは「単離された」か、または「精製された」ことを意味する。単離または精製の方法の例としては、電気泳動的、分子生物学的、免疫学的またはクロマトグラフィー的手法等を挙げることができる。具体的には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、または、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー、あるいは、等電点電気泳動等を挙げることができるがこれらに限定されない。

【0097】

本発明において、「免疫チェックポイント阻害剤」とは、Ｔ細胞の活性を抑制するシステムである免疫チェックポイント機構を構成する免疫チェックポイント分子に対する阻害剤のことを意味し、ＰＤ−１阻害剤およびＣＴＬＡ−４阻害剤がこれに含まれる。「免疫チェックポイント分子」という語には、免疫チェックポイントとして機能する受容体とリガンドの両者が包含される。

【0098】

本発明において、「免疫チェックポイント阻害剤と併用投与されるように用いられる」とは、治療レジメンの一部として、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片、および薬学的に許容可能な担体または添加物を含有する医薬組成物が免疫チェックポイント阻害剤とともに同時期に腫瘍患者に投与されることをいう。前記医薬組成物と免疫チェックポイント阻害剤は、併用で用いられる場合のそれぞれの有効量を腫瘍患者に、同時に、別々に、連続して、または間隔をあけて投与されて良く、さらに別の抗がん剤が治療レジメンに含まれてもよい。前記医薬組成物と免疫チェックポイント阻害剤は、別々の投与サイクルで腫瘍患者に投与されてもよい。また、前記医薬組成物と免疫チェックポイント阻害剤が同時に腫瘍患者に投与される場合、それらを単一の製剤中に含有する配合剤として投与されてもよい。

【0099】

本発明において、「ＰＤ−１阻害剤」とは、ＰＤ−１に直接的または間接的に作用することより、ＰＤ−１の有するＴ細胞抑制作用を阻害する物質を意味する。ＰＤ−１阻害剤には、ＰＤ−１に結合しそのＴ細胞抑制作用を阻害する低分子化合物、ペプヂドおよび抗ＰＤ−１抗体、ならびにＰＤ−Ｌ１に結合しそのＰＤ−１結合活性を阻害することにより、ＰＤ−１のＴ細胞抑制作用を阻害する低分子化合物、ペプヂドおよび抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む。抗ＰＤ−１抗体には、ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ、ｎｉｖｏｌｕｍａｂおよびＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４）を含むが、これらに限定されない。抗ＰＤ−Ｌ１抗体には、ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、ｄｕｒｖａｌｕｍａｂおよびａｖｅｌｕｍａｂを含むが、これらに限定されない。

【0100】

本発明において、「ＣＴＬＡ−４阻害剤」とは、ＣＴＬＡ−４に作用することより、ＣＴＬＡ−４の有するＴ細胞抑制作用を阻害する物質を意味する。ＣＴＬＡ−４阻害剤には、ＣＴＬＡ−４に結合しそのＴ細胞抑制作用を阻害する低分子化合物、ペプヂドおよび抗ＣＴＬＡ−４抗体を含む。抗ＣＴＬＡ−４抗体には、ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂおよびｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂを含むが、これらに限定されない。

【0101】

本発明において、「悪性リンパ腫」とは、リンパ系組織から発生する血液の悪性腫瘍の一群を意味する。悪性リンパ腫にはホジキンリンパ腫と非ホジキンリンパ腫があり、後者にはびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫などが含まれる。

【0102】

本発明において、「頭頸部がん」とは、顔面から頸部までの領域に発生した悪性腫瘍の総称を意味し、その一部は、頭頸部扁平上皮癌である。

【0103】

本発明において、「尿路上皮がん」とは、尿路上皮細胞から発生する上皮性悪性腫瘍のことを意味し、その下位概念として、腎盂がん、尿管がんおよび膀胱がんを含む。

【0104】

本発明において、「乳がん」とは、乳房組織に発生する癌腫のことを意味する。乳がんの一部は、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体およびヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ−２）のいずれも発現していないトリプルネガティブ乳がんである。

【0105】

本発明の別の好ましい実施形態において、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、以下のＣＤＲを有している：
（ａ）配列番号２８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる重鎖ＣＤＲ１；
（ｂ）配列番号３０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる重鎖ＣＤＲ２；
（ｃ）配列番号３２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる重鎖ＣＤＲ３；
（ｄ）配列番号３３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる軽鎖ＣＤＲ１；
（ｅ）配列番号３４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる軽鎖ＣＤＲ２；および
（ｆ）配列番号３５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドからなる軽鎖ＣＤＲ３。

【0106】

本発明の別の好ましい実施形態において、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、重鎖および軽鎖を含んでおり、前記重鎖の可変領域は、配列番号５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、または６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含み、前記軽鎖の可変領域は、配列番号６５、６６、６７または６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含んでいる。

【0107】

前記重鎖または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、当該配列において、１個または複数個のアミノ酸の置換・付加・欠失を含んでいてもよい。ここで使用される「複数個」は、Ｍｙｌ９に対する結合親和性を保持し、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害する限り限定されないが、２個〜１５個、より好ましくは２個〜１０個、例えば、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個または２個である。または、前記重鎖または軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、当該配列と少なくとも９０％、例えば９１％、９２％、９３％、９４％、または９５％の相同性を有するアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む。

【0108】

本発明の別の好ましい実施形態において、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、以下の組み合わせからなる重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む抗体である。
（１）配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２）配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（３）配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（４）配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（５）配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（６）配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（７）配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（８）配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（９）配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１０）配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１１）配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１２）配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１３）配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１４）配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１５）配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１６）配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１７）配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１８）配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（１９）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６５に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２０）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６７に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；
（２１）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体；および
（２２）配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む重鎖可変領域と、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって示されるペプチドを含む軽鎖可変領域とを含む抗体。

【0109】

本発明は、一態様において、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む、医薬組成物に関する。

【0110】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む医薬組成物は、水性または乾燥製剤の形において、さらに、製薬学的に許容される担体、賦形剤、および／また、安定剤を含んでよい。許容される担体、賦形剤、または安定剤には、例えば、生理食塩水；リン酸、クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；アミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン類を含む、単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール類；ナトリウムのような塩を形成する対イオン；またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはＰＥＧのような非イオン性界面活性剤が含まれる。

【0111】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む医薬組成物は、例えば、マイクロカプセル内、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、またはナノカプセル）内、またはマクロエマルション内に封入されてよい。抗体の投与を必要とするいずれの疾患にも適した放出特性を有する製剤において、抗体の持続放出投与が望まれる場合には、抗体のマイクロカプセル化が意図され得る。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル［例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリ乳酸類、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩との共重合体、非分解性のエチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）のような分解性の乳酸−グリコール酸共重合体（乳酸−グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。

【0112】

上記のとおり、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害することができる。よって、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む医薬組成物は、Ｍｙｌ９とＣＤ６９の相互作用に起因する疾患、例えば喘息、慢性アレルギー性鼻炎または一部の副鼻腔炎などのアレルギー性気道炎症、およびアレルギー性気道炎症に含まれない副鼻腔炎などの気道炎症疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病および好酸球性消化管障害などの炎症性腸疾患の治療に有用であり得る。すなわち、本発明は、他の態様において、治療上有効量の本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を対象に投与する工程を含む、気道炎症疾患または炎症性腸疾患の治療方法を包含する。さらに、本発明は、他の態様において、気道炎症疾患または炎症性腸疾患の治療薬を製造するための、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片の使用を包含する。本発明は、他の態様において、気道炎症疾患または炎症性腸疾患の治療する方法において使用するための抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を包含する。また、本発明は、他の態様において、気道炎症疾患または炎症性腸疾患の治療する医薬を製造するための抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を包含する。

【0113】

さらに、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と併用した場合、大腸がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん、肝細胞がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、小細胞肺がん、中皮腫および子宮体がんなどの腫瘍の治療に有用であり得る。すなわち、本発明は、他の態様において、治療上有効量の本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を対象に投与する工程を含む、腫瘍の治療方法であって、前記抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、免疫チェックポイント阻害剤と併用され前記対象に投与される前記方法を包含する。さらに、本発明は、他の態様において、免疫チェックポイント阻害剤と併用投与されるように用いられることを特徴とする腫瘍の治療薬を製造するための、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片の使用を包含する。本発明は、他の態様において、免疫チェックポイント阻害剤と併用投与されることを特徴とする腫瘍を治療する方法において使用するための抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を包含する。また、本発明は、他の態様において、免疫チェックポイント阻害剤と併用投与されるように用いられることを特徴とする腫瘍を治療する医薬を製造するための抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を包含する。

【0114】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む医薬組成物を、免疫チェックポイント阻害剤と併用して、腫瘍の治療を行う場合、前記抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、Ｍｙｌ１２ａおよび／またはＭｙｌ１２ｂとＣＤ６９との相互作用をさらに阻害する抗体またはその結合断片であることが好ましい。

【0115】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、治療法において単独か、またはその他の薬剤または組成物と併用して用いることができる（ただし、腫瘍の治療法においては、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、免疫チェックポイント阻害剤と併用投与される。）。例えば、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片は、別の薬剤と同時または異時に投与されてよい。このような併用療法には、併用投与（同じかまたは別々の製剤に２以上の薬剤が含まれる）および分離投与（例えば、同時にまたは連続的に）が含まれる。２以上の薬剤を別々に投与する場合、本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片の投与は、付随する治療法に先立つか、または続いて行われてよい。

【0116】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む医薬組成物を投与する対象は限定されず、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物（マウス、ラット、ウサギ等のげっ歯類、サル、ウシ、ウマ、ヤギ等）に本発明が用いられる。

【0117】

本発明の抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片を含む医薬組成物の対象への投与方法（投与経路、投与量、１日の投与回数、投与のタイミング、等）は限定されず、対象の健康状態、疾患の程度、併用する薬剤の種類等に応じて、当業者（例えば、医師）が適宜決定することができる。

【0118】

技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、あらゆる態様の任意の一または複数を、適宜組み合わせて、本発明を実施することができる。さらに、技術的に矛盾しない限り、本明細書に記載の、好ましいまたは有利なあらゆる態様を、適宜組み合わせて、本発明を実施することが好ましいであろう。

【0119】

本明細書中に引用される文献は、参照により、それらのすべての開示が、明確に本明細書に援用されているとみなされるべきであって、当業者は、本明細書の文脈に従って、本発明の範囲を逸脱することなく、それらの文献における関連する開示内容を、本明細書の一部として援用できる。

【0120】

本明細書中に引用される文献は、本出願の出願日前の関連技術の開示のみを目的として提供され、本発明者らが、先行発明または任意の他の理由によって、かかる開示に先行する権利を持たないことを自認するものとして解釈されてはならない。これらの文献のすべての記述は、本出願人が入手可能であった情報に基づいており、これらの記述内容が正確であるという自認を何ら構成しない。

【0121】

本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図はない。

【0122】

本明細書において用いられる「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記載された事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素または数字等）が存在することを排除しない。「かならる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」および／または「実質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載される態様を包含する。

【0123】

本明細書において用いられる「中和活性」という用語は、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との結合を阻害する活性、および／または、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用によりヒト生体内で誘導する、シグナル伝達や、細胞の分子発現応答もしくは機能性変化を低減する活性を意味する。

【0124】

異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。

【0125】

第１の、第２の等の用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はこれらの用語自身によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第１の要素を第２の要素と記し、同様に、第２の要素は第１の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。

【0126】

本明細書において、成分含有量や数値範囲等を示すのに用いられる数値は、特に明示がない限り、用語「約」で修飾されているものと理解されるべきである。例えば、「４℃」とは、特に明示がない限り、「約４℃」を意味するものと理解され、その程度を、当業者は技術常識と本明細書の文意に従って、合理的に理解できることは当然である。

【0127】

文脈上明白に他の意味を示す場合を除き、本明細書および請求の範囲で使用される場合、単数形で表される各態様は、技術的に矛盾しない限り、複数形であってもよいことが理解され、逆もまた真である。

【0128】

以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。関連技術分野の当業者は、本発明の範囲を変更させることなく、様々な改変、付加、欠失、置換等を伴って本発明を実施できる。

【実施例】

【0129】

実施例１：抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体の作製
マウス抗マウス／ヒトＭｙｌ９モノクローナル抗体の作製
マウスＭｙｌ９（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿７４２１１６．１、配列番号１）とヒトＭｙｌ９（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００６０８８．２、配列番号２）に対するモノクローナル抗体を作製するため、マウスＭｙｌ９とヒトＭｙｌ９に共通するＮ末端の配列（１〜２７位）のＣ末端にシステイン（Ｃｙｓ）を付加したもの（以下、マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチドという）（配列番号３）にスカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）を融合したタンパク質（以下、「マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド−ＫＬＨ」という）を以下の工程により調製した。マウスＭｙｌ９とヒトＭｙｌ９の配列の比較を図１−１Ａに示す。

【0130】

まず、マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド（配列番号３）を株式会社東レリサーチセンターに依頼して合成し、Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｍｃＫＬＨ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド−ＫＬＨを作製した。

【0131】

１０μｇのマウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド−ＫＬＨを、同量のＧＥＲＢＵアジュバント（ＧＥＲＢＵ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ）と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの足蹠へ皮下注射した。その後、３、７、および１０日目に同様にマウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド−ＫＬＨを投与した。このとき、ＧＥＲＢＵアジュバント（ＧＥＲＢＵ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ ＧｍｂＨ）は３および１０日目に使用した。１３日目にマウスを屠殺し（ｓａｃｒｉｆｉｃｅｄ）、末梢リンパ節を回収してリンパ節細胞を調製した。ＧｅｎｏｍｅＯＮＥ−ＣＦ（Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｓａｎｇｙｏ Ｋａｉｓｈａ，Ｌｔｄ．）の存在下で、調製したリンパ節細胞とＰ３Ｕ１ミエローマ細胞（京都大学、清水淳先生より分与）とを５：１の割合で融合した。前記融合細胞は、９６ウェルプラスチックプレートで培養した。７日間のインキュベーション（５％ＣＯ_２、３７°Ｃ）の後、培養上清を回収した。

【0132】

得られた培養上清を用いて、マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチドに対する反応性、ならびに、マウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質とマウスＭｙｌ９との結合に対する阻害活性を有するウェルをピックアップした。

【0133】

マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチドに対する反応性は、マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド（配列番号３）に対して、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を融合したタンパク質（以下、マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド−ＢＳＡ）を用い、ＥＬＩＳＡにて評価した。

【0134】

マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド（配列番号３）を株式会社東レリサーチセンターに依頼して合成し、Ｉｍｊｅｃｔ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ＢＳＡ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド−ＢＳＡを作製した。

【0135】

ＦｌａｇタグをＮ末端に付加したマウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質（６２〜１９９位）（配列番号４）（以下、３ｘＦｌａｇ−マウスＣＤ６９ＥＣ）をコードするプラスミドは千葉大学より分与され、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｇｉｂｃｏ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ形質移入した。４日間のインキュベーション（８％ＣＯ２、３７°Ｃ）の後、培養上清を回収した。回収した培養上清より、３ｘＦｌａｇ−マウスＣＤ６９ＥＣを、Ａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ）を用いて精製した。精製後、ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて糖鎖切断処理を行った。

【0136】

グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｈｉｓ−マウスＭｙｌ９（以下ＧＳＴ−ＨｉｓマウスＭｙｌ９）は、千葉大学より分与されたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に発現させ、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製を行った。

【0137】

マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド−ＢＳＡを用いたＥＬＩＳＡは、以下の工程に従って行った。マウス／ヒトＭｙｌ９ペプチド−ＢＳＡを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルに前記融合細胞の培養上清を添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0138】

マウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質とマウスＭｙｌ９との結合に対する阻害活性の評価は、以下の工程に従って行った。ＧＳＴ−Ｈｉｓ−マウスＭｙｌ９を、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、ウェルに前記融合細胞の培養上清を添加した。室温にて１時間インキュベートした。ウェルに糖鎖切断処理を行った３ｘＦｌａｇ−マウスＣＤ６９ＥＣを添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗Ｆｌａｇ抗体（ＳＩＧＭＡ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0139】

上記工程を経てピックアップしたウェルより限界希釈法にてハイブリドーマをクローニングし、最終的にマウス／ヒトＭｙｌ９ペプチドに対する反応活性を有し、かつ、マウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質とマウスＭｙｌ９との結合に対する阻害活性を有するマウス抗マウス／ヒトＭｙｌ９抗体を発現するハイブリドーマクローンを得た。

【0140】

得られたハイブリドーマクローンを培養し、培養上清からＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて抗マウス／ヒトＭｙｌ９抗体（「抗体Ａ」（「ｍＡｂ Ａ」と記載することもある。））を精製した。抗体Ａのアイソタイプは、モノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓｅｒｏｔｅｃ）にて決定し、ＩｇＧ２ｃ、κであった。

【0141】

抗体Ａのマウス／ヒトＭｙｌ９タンパク質に対する結合能の解析
抗体Ａのマウス、ヒトＭｙｌ９に対する結合能をＥＬＩＳＡにて評価した。以下の工程に従って、マウスＭｙｌ３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０３４９８９．１、配列番号５）、マウスＭｙｌ９、ヒトＭｙｌ３（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０００２４９．１、配列番号６）、ヒトＭｙｌ９の各Ｃ末端にヒスチジンタグを結合したタンパク質（以下、それぞれマウスＭｙｌ３−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓという）を作製した。マウスＭｙｌ３とヒトＭｙｌ３（図１−１Ｂ）、マウスＭｙｌ３とマウスＭｙｌ９（図１−２Ｃ）、ヒトＭｙｌ３とヒトＭｙｌ９（図１−２Ｄ）のアミノ酸配列の比較を示す。

【0142】

マウスＭｙｌ３とマウスＭｙｌ９タンパク質をコードする遺伝子は千葉大学より分与された。ヒトＭｙｌ３、ヒトＭｙｌ９タンパク質をコードする遺伝子は、ヒトの心臓のｃＤＮＡよりＰＣＲにて増幅した。これらの遺伝子を、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の切断配列をコードする遺伝子を挿入したｐＥＴ４２ｂベクター（Ｍｅｒｃｋ）のＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入した。作製したベクターを大腸菌株ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換し、ＧＳＴタグのついたマウスＭｙｌ３−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓを発現させた。発現させたタンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製し、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ＰｒｏｔｅａｓｅにてＧＳＴタグを切断し、ＴＡＬＯＮ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にてマウスＭｙｌ３−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓを精製した。

【0143】

マウス／ヒトＭｙｌ９に対する結合能は以下の工程に従ってＥＬＩＳＡにて評価した。マウスＭｙｌ３−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、抗体Ａを１０μｇ／ｍＬの濃度から４倍ずつ１０段階希釈して、ウェルに添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0144】

抗体ＡはマウスおよびヒトＭｙｌ９への濃度依存的な結合を示し、マウスおよびヒトＭｙｌ９とは相同性の低いマウスおよびヒトＭｙｌ３には結合しなかった（図２）。

【0145】

抗体ＡのマウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質とマウスＭｙｌ９との結合に対する阻害活性の評価
抗体ＡのマウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質とマウスＭｙｌ９との結合に対する阻害活性の評価を競合ＥＬＩＳＡにて行った。まず、マウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質とマウスＭｙｌ９タンパク質の作製を行った。

【0146】

具体的には、骨髄、心筋組織のｃＤＮＡよりマウスＭｙｌ３、Ｍｙｌ９各々をクローニングし、ｐＥＴ４２ｂベクター（メルク社）のマルチクローニングサイトへ挿入した。作成した発現ベクターをＲｏｓｅｔｔａコンピテントセル（メルク社）にトランスフォーメーションし、発現ベクターを有するクローンを選抜した。カナマイシン含む５００ｍＬのＬＢ溶液に事前培養を行った各クローン培養液を加え、３７℃の浸透器で培養した。ＯＤ６００＝０．４で終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ（ナカライ社）を加え３時間３７℃でマウスＭｙｌ３、Ｍｙｌ９タンパク質の発現誘導を行った。３時間後に遠心により集菌し、溶解バッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ］で溶解後、氷上で冷やしながらソニケーターにより破砕した。遠心により不溶性画分を取り除き、０．４５μｍのフィルター（コーニング社）に通した後、Ｎｉ−ＮＴＡビーズ（ＱＩＡＧＥＮ）を充填したカラムで精製を行った。洗浄バッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］でビーズを洗浄後、溶出バッファー［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で結合タンパクの溶出を行った。得られたＧＳＴ−Ｈｉｓ−マウスＭｙｌ３、ＧＳＴ−Ｈｉｓ−マウスＭｙｌ９タンパク質はＰＤ１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＰＢＳに溶液置換した。精製タンパク質の濃度測定にはＢｒａｄｆｏｒｄ溶液（ＢＩＯ―ＲＡＤ）を用いた。

【0147】

次に、マウスＭｙｌ９とマウスＣＤ６９の会合の有無を解析する為に、ＥＬＩＳＡを行った（図３Ａ、３Ｂ）。具体的には、ＧＳＴ−Ｈｉｓ−マウスＭｙｌ３タンパク質、およびＧＳＴ−Ｈｉｓ−マウスＭｙｌ９タンパク質を５μｇ／ｍＬの濃度で加え、４℃で一晩培養することによりＥＬＩＳＡプレートに固相化した。翌日にＢｌｏｃｋ Ａｃｅ（大日本住友製薬）を用いて室温１時間でブロッキングした後、洗浄バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ６．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。３ｘＦｌａｇ マウスＣＤ６９ＥＣタンパク質の濃度をふって各ウェルに加え、室温で１時間３０分反応させた。図３ＢではＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ）を用いてＮ型糖鎖を切断した３ｘＦｌａｇ マウスＣＤ６９ＥＣタンパク質を用いた。Ｎ型糖鎖切断処理は、４μｇの３ｘＦｌａｇ マウスＣＤ６９ＥＣタンパク質に対し、１，０００ＵのＰＮＧａｓｅ Ｆを用いて行った。洗浄バッファーで３回洗浄した後、ＨＲＰ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温で１時間反応させた後、洗浄バッファーで５回洗浄した。発色基質は、ＴＭＢ溶液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用し、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を止めた。ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｐａｒａｄｉｇｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍの値を計測した。

【0148】

図３Ａ、３Ｂで示したように、マウスＣＤ６９のマウスＭｙｌ９に対する濃度依存的な結合が有意に検出された。

【0149】

抗体ＡのマウスＣＤ６９細胞外領域タンパク質とマウスＭｙｌ９との結合に対する阻害活性の評価のため、競合ＥＬＩＳＡを行った。具体的には、グルタチオンコートプレート（Ｔｈｅｒｍｏ）に、ＧＳＴタンパク質（Ａｂｃａｍ）、ＧＳＴ−Ｈｉｓ−マウスＭｙｌ９タンパク質を加えることで固相化した。Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅで各ウェルを室温１時間でブロッキングした後、洗浄バッファー（ＰＢＳ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。抗体Ａ、抗Ｍｙｌ９／１２ポリクローナル抗体を図３Ｃに記載されている濃度で加え、室温で１時間反応させた。ＰＮＧａｓｅ Ｆ処理した３ｘＦｌａｇ マウスＣＤ６９ＥＣタンパク質を加え、４℃で一晩反応させ、洗浄バッファーで３回洗浄した。ＨＲＰ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温で１時間反応させた後、洗浄バッファーで５回洗浄した。発色基質は、ＴＭＢ溶液（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を使用し、１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を用いて反応を止めた。ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｐａｒａｄｉｇｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ）を用いて４５０ｎｍの値を計測した。

【0150】

図３Ｃで示したように、マウスＣＤ６９とマウスＭｙｌ９との結合は、抗体Ａの存在下において、濃度依存的に有意に阻害された。この阻害活性は、抗Ｍｙｌ９／１２ポリクローナル抗体よりも高い傾向にあった。

【0151】

抗体Ａの配列解析
抗体Ａの重鎖および軽鎖のシグナル配列、および可変領域をコードするＤＮＡ配列を、５’−ＲＡＣＥ（５’−ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄｓ）法によって増幅した。前記ハイブリドーマから、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ，ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｓｅｔ）で処理した。ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、前記全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを調製した。オリゴＤＮＡ ａｄ２９Ｓ（ACATCACTCCGT）（配列番号７）およびオリゴＤＮＡ ａｄ２９ＡＳ（ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGCGTTGATACTTCAGCGTAGCT）（配列番号８）のアニーリングによって得られた５’アダプターを前記ｃＤＮＡに付加した。得られたｃＤＮＡを、５’フォワードプライマー（５’−ＰＣＲ４ ｐｒｉｍｅｒ，AGCTACGCTGAAGTATCAACGCAGAG) （配列番号９）および３’リバースプライマー（マウスＩｇＧ重鎖の増幅にはGCCAGTGGATAGACTGATGG（配列番号１０）を用い、マウスＩｇκ軽鎖の増幅にはGATGGATACAGTTGGTGCAGC（配列番号１１）を用いた）によって増幅した。増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に挿入した。抗体Ａの遺伝子配列を、ＡＢＩ３１３０ＸＬを用いて解析した（配列番号１２〜１９）。

【0152】

抗体Ａの重鎖および軽鎖の全長配列は、以下の工程により取得した。前記ハイブリドーマから、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを調製し、ＤＮａｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ， ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ ｓｅｔ）で処理した。ｃＤＮＡ合成キット（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて、前記全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製した。得られたｃＤＮＡを鋳型に用い、抗体Ａの重鎖および軽鎖をコードする遺伝子配列を５‘フォワードプライマー（重鎖の増幅にはGCGAAGCTTGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTCTTTC（配列番号２０）を使用し、軽鎖の増幅にはGCGAAGCTTGCCGCCACCATGAAGTTGCCTGTTAGGCTG（配列番号２１）を使用した）と３’リバースプライマー（重鎖の増幅にはGCGGAATTCATCATTTACCCAGAGACCGGGAGATGG（配列番号２２）を使用し、軽鎖の増幅にはGCGGAATTCACTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGAC（配列番号２３）を使用した）を用いて、ＰＣＲにて増幅し、ｐＥＥ６．４、およびｐＥＥ１２．４ベクター（Ｌｏｎｚａ）にそれぞれクローニングした。遺伝子配列を、ＡＢＩ３１３０ＸＬを用いて解析した（配列番号１２〜１９、２４〜２７）。

【0153】

抗体ＡのＣＤＲは、抗体Ａのアミノ酸配列をＫａｂａｔの番号付システム（Ｋａｂａｔ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）に従い、Ａｂｙｓｉｓソフトフェア（ＵＣＬからのライセンス）を用いて番号付けし、この番号を基に、ＣＤＲの同定のためのＫａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）、または、ＡｂＭの定義法（ＡｂＭ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）に従って決定した（配列番号２８〜４３）。

【0154】

実施例２：抗体ＡのＯＶＡ誘導性のマウス気道炎症モデルでの薬効評価
アレルギー性気道炎症に対する、精製マウス抗マウス／ヒトＭｙｌ９抗体（抗体Ａ）のｉｎ ｖｉｖｏ投与における効果を、ＯＶＡ誘導性の気道炎症モデルを用いて検証した。

【0155】

まず、気道炎症時に誘導される気管支周囲への細胞浸潤に対する、抗体Ａ投与による抑制効果について検討した。具体的には、野生型のＢＡＬＢ／ｃマウスに、卵白アルブミン（ＯＶＡ）１００μｇ／マウス（ＳＩＧＭＡ）をアラム４ｍｇ／マウス（Ｔｈｅｒｍｏ）と共に腹腔内投与して免疫した。一回目の投与日を０日目とし、二回目の投与は７日目に行った。１４日目と、１６日目に、１％ＯＶＡ溶液（１０ｍｇ／ｍＬ 生理食塩水）を、超音波式ネブライザー（Ｏｍｒｏｎ）を用いて３０分間噴霧吸引させることで、気道炎症を誘導した（ＯＶＡ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）。コントロール群として、ＯＶＡを吸引させないものを用意した（Ｎｏ ｉｎｈａｌａｔｉｏｎ）。抗体Ａ、もしくはコントロールのマウスＩｇＧ２ａ，κ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）は、１３日目と１５日目にそれぞれ１００μｇを腹腔内投与した。１８日目にマウス肺を摘出し、１０％ホルマリン溶液で固定後、パラフィン包埋し、組織切片を作成し、ヘマトキシリン・エオジン染色(Ｈ＆Ｅ染色)、並びにＰＡＳ（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ Ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ)染色を行った（図４−１Ａ）。

【0156】

図４−１Ａに示すように、ＯＶＡを吸引したコントロール抗体投与群では、気管支周囲に激しい細胞の浸潤が見られるが、ＯＶＡを吸引した抗体Ａ投与群では、細胞浸潤が顕著に抑制された（図４−１Ａ上段）。また、ＯＶＡを吸引したコントロール抗体投与群では、気管支内部にＰＡＳ染色陽性粘液の産生が見られるが、ＯＶＡを吸引した抗体Ａ投与群では、粘液産生も顕著に抑制された（図４−１Ａ下段）。

【0157】

次に、気道炎症を誘発後１７日目に肺胞洗浄を行い、肺胞洗浄液 (Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ：ＢＡＬＦ）中に見られる浸潤細胞数と、浸潤細胞種について、抗体Ａ投与群、コントロール抗体投与群の間で比較した。肺胞洗浄は、マウスにペントバルタールＮａ（７０−９０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内投与して麻酔した後、気道を切開してカニューレ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を挿管し、生理食塩水（大塚製薬）を肺に注入して細胞を回収することにより行った。回収した細胞は細胞数を計測した（全細胞）。またウシ胎仔血清（ＦＣＳ）で懸濁し、サイトスピン３（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドガラスに貼り付けた。メイ グリュンワルド ギムザ (Ｍａｙ−Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ)（ＭＥＲＣＫ）試薬を用いて染色を行い、細胞を形態学的基準によって好酸球、好中球、リンパ球、マクロファージに識別した。

【0158】

図４−１Ｂに示すように、抗体Ａ投与群では、コントロール抗体投与群に比較して、全浸潤細胞数は有意に減少し、好酸球、好中球、リンパ球、マクロファージの各種細胞数も有意に減少していた。

【0159】

次に、回収した肺胞洗浄液中に含まれる各種サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＲＡＮＴＥＳ）について、抗体Ａ投与群、コントロール抗体投与群の間で比較した。測定には、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。

【0160】

図４−１Ｃに示すように、抗体Ａ投与群では、コントロール抗体投与群に比較して、いずれのサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＲＡＮＴＥＳ）産生も低下していた。

【0161】

次に、気道炎症誘発後１７日目におけるメサコリン誘導性の気道抵抗値について、抗体Ａ投与群（図４−２Ｄ）、抗Ｍｙｌ９／１２ポリクローナル抗体投与群(図４−２Ｅ)、並びにコントロール抗体投与群の間で比較した。

【0162】

図４−２Ｄに示すように、コントロール抗体投与群では、メサコリン濃度依存的に気道抵抗値が上昇したのに対し、抗体Ａ投与群では、その上昇が有意に抑制された。また図４−２Ｅに示すように、抗Ｍｙｌ９／１２ポリクローナル抗体投与群では、メサコリン濃度依存的な気道抵抗値の上昇抑制は見られるものの、その効果に有意差は認められなかった。抗体Ａは、抗Ｍｙｌ９／１２ポリクローナル抗体よりも、強い抗気道炎症作用があることが示唆された。

【0163】

実施例３：抗体Ａのマウス大腸炎モデルでの薬効評価
ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ強陽性（ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉｇｈ）Ｔリンパ球移入炎症性腸疾患モデルの作製についてはＰｏｗｒｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５，１４６１−１４７１，１９９３を参考にした。雌性、８−１０週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（日本チャールズ・リバー）の脾臓を摘出し、スリガラスですり潰し脾臓細胞を分離した。分離した脾臓細胞は、脾臓一個あたり５ｍＬの１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウム、８０μＭ ＥＤＴＡ−４Ｎａ蒸留水を加え５分室温に放置し赤血球を溶解した。脾臓細胞溶液にＰＢＳを２倍容量加え、１５００ｒｐｍで５分遠心して沈殿を回収した。分離した脾臓細胞からＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ミルテニー社製）によりＣＤ４ Ｔリンパ球を精製した。ＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ強陽性Ｔリンパ球を分離するために、精製したＣＤ４ Ｔリンパ球に対して、フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ４抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識抗ＣＤ４５ＲＢ抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用い二重染色を行った。二重染色の後、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ベクトンディッキンソン社製）を用いＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ強陽性細胞をソーティングし目的の細胞を回収した。回収された細胞はＰＢＳで洗浄後、２ｘ１０^６細胞／ｍＬの細胞濃度にＰＢＳにて懸濁した。雌性、８週齢のＳＣＩＤマウス（日本クレア）の腹腔に、上記で調製したＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ強陽性細胞を２５０μＬずつ、すなわち５ｘ１０^５細胞／マウスで移入を行った。各群８匹のＣＤ４陽性ＣＤ４５ＲＢ強陽性細胞を移入したＳＣＩＤマウスに、５００μｇのコントロール抗体（マウスＩｇＧ）、５００μｇの抗体Ａ（抗体はＰＢＳ溶液）を、細胞移入後１１日目より、週２回投与した。なお投与は尾静脈から行った。また陰性対照群として、ＣＤ４ Ｔ ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ミルテニー社製）により精製し、ＣＤ４５ＲＢの発現強度による分離をしていないマウスＣＤ４ Ｔリンパ球（全ＣＤ４陽性細胞）を５ｘ１０^５／マウスで移入した。細胞移入２７日後に剖検を行い体重減少、大腸内便性状をスコア化し評価を行った。便性状のスコアはデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎で用いられている便性状のスコア（Ｃｏｏｐｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ６９， ２３８−２４９， １９９３）を使用した。

【0164】

コントロール抗体投与群と比較して、抗体Ａ投与群では有意に疾患活動性指数［ＤＡＩ（Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ）］が低下した（図５）。

【0165】

実施例４：抗体Ａからのキメラ抗体とヒト化抗体の作製
キメラ抗体およびヒト化抗体の調製
まず、キメラ抗体の発現ベクターを構築した。重鎖として、抗体Ａの重鎖のシグナル配列をコードする遺伝子配列（配列番号１６）と可変領域をコードする遺伝子配列（配列番号１７）を、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端のリシン残基を欠失したヒトＩｇＧ２の定常領域（配列番号４４）をコードする遺伝子配列（配列番号４５）を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）に挿入し、軽鎖として、抗体Ａの軽鎖のシグナル配列をコードする遺伝子配列（配列番号１８）と可変領域をコードする遺伝子配列（配列番号１９）を、ヒトＩｇκの定常領域（配列番号４６）をコードする遺伝子配列（配列番号４７）を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）に挿入し、キメラ抗体の発現ベクターを構築した。キメラ抗体を産生するため、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、前記発現ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）へ形質移入した。上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ここでいう、「Ｖ２３４Ａ」とは、２３４位のバリンがアラニンに置換された変異を、「Ｇ２３７Ａ」とは、２３７位のグリシンがアラニンに置換された変異を表す。

【0166】

次にヒト化抗体の可変領域を設計した。抗体Ａのフレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ：ＦＲ）に対する高い相同性を基に、ヒト抗体のＦＲ；軽鎖についてＩＧＫＶ２−２８＊０１（配列番号４８）またはＩＧＫＶ２−２４＊０１（配列番号４９）、およびＪＫ４（配列番号５０）、重鎖についてＩＧＨＶ１−６９＊０２（配列番号５１）、ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号５２）またはＩＧＨＶ７−４−１＊０２（配列番号５３）およびＪＨ４（配列番号５４）を、ヒト化抗体のＦＲとして選択した。その後、マウス抗体Ａの３Ｄ構造予測モデルを用いて、ＣＤＲのアミノ酸と相互作用するＦＲのアミノ酸を予測し、ＣＤＲ（配列番号２８−３５）とともに移植した。Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端リシン残基を欠失したヒトＩｇＧ２の定常領域（配列番号４４）、および、ヒトＩｇκの定常領域（配列番号４６）を、それぞれ重鎖および軽鎖の定常領域として用いた。ＨＫ１−４（配列番号５５）、ＨＫ１−５（配列番号５６）、ＨＫ１−６（配列番号５７）、ＨＫ１−Ａ（配列番号５８）、ＨＫ２−５（配列番号５９）、ＨＫ２−６（配列番号６０）、ＨＫ２−９（配列番号６１）、およびＨＫ３−２（配列番号６２）は、Ｋａｂａｔの定義方法によって決定されたＣＤＲ（配列番号２８、３０、３２）を移植したヒト化抗体の重鎖可変領域として設計され、ＨＡ１−４（配列番号６３）およびＨＡ１−６（配列番号６４）は、ＡｂＭの定義方法によって決定されたＣＤＲ（配列番号２９、３１、３２）を移植されたヒト化抗体の重鎖可変領域として設計され、ＨＫ１−４、ＨＫ１−５、ＨＫ１−６、ＨＫ１−Ａ、ＨＡ１−４、およびＨＡ１−６は、ＩＧＨＶ１−６９＊０２およびＪＨ４を用いるヒト化抗体の重鎖可変領域として設計され、ＨＫ２−５、ＨＫ２−６、およびＨＫ２−９は、ＩＧＨＶ１−４６＊０１およびＪＨ４を用いるヒト化抗体の重鎖可変領域として設計され、ＨＫ３−２は、ＩＧＨＶ７−４−１＊０２およびＪＨ４を用いるヒト化抗体の重鎖可変領域として設計され、Ｌ１−４（配列番号６５）、Ｌ１−５（配列番号６６）、およびＬ１−Ａ（配列番号６７）は、ＩＧＫＶ２−２８＊０１およびＪＫ４を用いるヒト化抗体の軽鎖可変領域として設計され、Ｌ４−２（配列番号６８）は、ＩＧＫＶ２−２４＊０１およびＪＫ４を用いるヒト化抗体の軽鎖可変領域として設計された。

【0167】

ＨＫ１−４、ＨＫ１−５、ＨＫ１−６のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＩＧＨＶ１−６９＊０２（配列番号５１）およびＪＨ４（配列番号５４）に抗体Ａの重鎖ＣＤＲ（配列番号２８、３０、３２）を移植し、シグナル配列（配列番号６９）をＮ末端に付加したアミノ酸配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成し、ＰＣＲにて変異を導入して作製した（ＨＫ１−４：配列番号７０、ＨＫ１−５：配列番号７１、ＨＫ１−６：配列番号７２、シグナル配列：配列番号７３）。ＨＫ１−Ａのアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＨＫ１−ＡのＮ末端にシグナル配列（配列番号６９）を付加したアミノ酸配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成した（ＨＫ１−Ａ：配列番号７４、シグナル配列：配列番号７５）。ＨＫ２−５、ＨＫ２−６、ＨＫ２−９のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＩＧＨＶ１−４６＊０１（配列番号５２）およびＪＨ４（配列番号５４）に抗体Ａの重鎖ＣＤＲ（配列番号２８、３０、３２）を移植し、シグナル配列（配列番号６９）をＮ末端に付加したアミノ酸配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成し、ＰＣＲにて変異を導入して作製した（ＨＫ２−５：配列番号７６、ＨＫ２−６：配列番号７７、ＨＫ２−９：配列番号７８、シグナル配列：配列番号７９）。ＨＫ３−２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＨＫ３−２のＮ末端にシグナル配列（配列番号６９）を付加したアミノ酸配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成した（ＨＫ３−２：配列番号８０、シグナル配列：配列番号８１）。ＨＡ１−４、ＨＡ１−６のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＩＧＨＶ１−６９＊０２（配列番号５１）およびＪＨ４（配列番号５４）に抗体Ａの重鎖ＣＤＲ（配列番号２９、３１、３２）を移植し、シグナル配列（配列番号６９）をＮ末端に付加したアミノ酸配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成し、ＰＣＲにて変異を導入して作製した（ＨＡ１−４：配列番号８２、ＨＡ１−６：配列番号８３、シグナル配列：配列番号８４）。Ｌ１−４、Ｌ１−５のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、ＩＧＫＶ２−２８＊０１（配列番号４８）およびＪＫ４（配列番号５０）に抗体Ａの軽鎖ＣＤＲ（配列番号３３−３５）を移植し、シグナル配列（配列番号８５）をＮ末端に付加したアミノ酸配列を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成し、ＰＣＲにて変異を導入して作製した（Ｌ１−４：配列番号８６、Ｌ１−５：配列番号８７、シグナル配列：配列番号８８）。Ｌ１−Ａ、およびＬ４−２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は、Ｌ１−Ａ、およびＬ４−２のＮ末端にシグナル配列（配列番号８５）を付加したアミノ酸配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．によって遺伝子配列に変換して合成した（Ｌ１−Ａ：配列番号８９、Ｌ１−Ａのシグナル配列：配列番号９０、Ｌ４−２：配列番号９１、Ｌ４−２のシグナル配列：配列番号９２）。これらのヒト化重鎖可変領域とシグナル配列をコードする遺伝子は、Ｖ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ変異を有し、Ｃ末端のリシン残基を欠失したヒトＩｇＧ２の定常領域（配列番号４４）をコードする遺伝子配列（配列番号４５）を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）に挿入した。これらのヒト化軽鎖可変領域とシグナル配列をコードする遺伝子はヒトＩｇκの定常領域（配列番号４６）をコードする遺伝子配列（配列番号４７）を含む発現ベクター（ｐｃＤＮＡ３．４）に挿入した。ここでいう、「Ｖ２３４Ａ」とは、２３４位のバリンがアラニンに置換された変異を、「Ｇ２３７Ａ」とは、２３７位のグリシンがアラニンに置換された変異を表す。抗体を産生するため、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、前記発現ベクターを表１の組み合わせでＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｇｉｂｃｏ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）へ形質移入した。上清を回収し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。

【0168】

【表1】

【0169】

抗体Ａから作製したキメラ抗体とヒト化抗体のヒトＭｙｌ９タンパク質に対する結合能の解析
抗体Ａから作製したキメラ抗体とヒト化抗体のヒトＭｙｌ９に対する結合能をＥＬＩＳＡにて評価した。ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓタンパク質は実施例１に記載の方法により調製した。

【0170】

ヒトＭｙｌ９に対する結合能は以下の工程に従ってＥＬＩＳＡにて評価した。ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、キメラ抗体とヒト化抗体を１０μｇ／ｍＬの濃度から６倍ずつ７段階希釈して、ウェルに添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0171】

表１のすべてのヒト化抗体は、キメラ抗体と同程度にヒトＭｙｌ９に対して、濃度依存的に結合し、ヒトＭｙｌ３には結合しなかった（図６−１〜６−３）。

【0172】

実施例５：抗体Ａとそのキメラ抗体およびヒト化抗体のマウス／ヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質に対する結合能
マウス／ヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質の調製
以下の工程に従って、マウスＭｙｌ１２ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０８０３４０．２、配列番号９３）、マウスＭｙｌ１２ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿０７５８９１．１、配列番号９４）、ヒトＭｙｌ１２ａ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１２８９９７６．１、配列番号９５）、ヒトＭｙｌ１２ｂ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１１３８４１６．１、配列番号９６）の各Ｃ末端にヒスチジンタグを結合したタンパク質（以下、それぞれマウスＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓという）を作製した。マウスＭｙｌ９、１２ａ、１２ｂ（図７Ａ）、ヒトＭｙｌ９、１２ａ、１２ｂ（図７Ｂ）のアミノ酸配列の比較を示す。

【0173】

マウスＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質をコードする遺伝子は千葉大学より分与された。ヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質をコードする遺伝子は、ヒトの心臓、または小腸のｃＤＮＡよりＰＣＲにて増幅した。これらの遺伝子を、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の切断配列をコードする核酸配列を挿入したｐＥＴ４２ｂベクター（Ｍｅｒｃｋ）のＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入した。作製したベクターを大腸菌株ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）ｐＬｙｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換し、ＧＳＴタグのついたマウスＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを発現させた。発現させたタンパク質をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にて精製し、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ＰｒｏｔｅａｓｅにてＧＳＴタグを切断し、ＴＡＬＯＮ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅｓｉｎ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にてマウスＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを精製した。

【0174】

マウスＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓ、および、実施例１にて精製したマウスＭｙｌ３−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓは、最終濃度が５０ｍＭになるようにジチオトレイトール（Ｗａｋｏ）を加え、４℃で１時間反応を行い、モノマーにした。反応後、ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）にて透析を行った。

【0175】

抗体Ａのマウス／ヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質に対する結合能の解析
マウス、ヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂに対する抗体Ａの結合能は以下の工程に従ってＥＬＩＳＡにて評価した。マウスＭｙｌ３−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ９−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、マウスＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、抗体Ａを１０μｇ／ｍＬの濃度から４倍ずつ１１段階希釈して、ウェルに添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0176】

抗体ＡはマウスおよびヒトＭｙｌ９と相同性の高いＭｙｌ１２ａ、１２ｂへの濃度依存的な結合を示し、マウスおよびヒトＭｙｌ９とは相同性の低いマウスおよびヒトＭｙｌ３には結合しなかった（図８Ａ、Ｂ）。

【0177】

抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体のヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂタンパク質に対する結合能の解析
抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体のヒトＭｙｌ１２ａ、１２ｂに対する結合能は以下の工程に従ってＥＬＩＳＡにて評価した。ヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−ＨｉｓおよびヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを、それぞれ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、キメラ抗体およびヒト化抗体をそれぞれ０．０１、０．１、１μｇ／ｍＬの濃度に希釈して、ウェルに添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0178】

キメラ抗体およびヒト化抗体は、ヒトＭｙｌ９と相同性の高いＭｙｌ１２ａ、１２ｂへの濃度依存的な結合を示し、ヒトＭｙｌ９とは相同性の低いヒトＭｙｌ３には結合しなかった（図９Ａ−Ｃ）。

【0179】

実施例６：ヒトＭｙｌ９、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合能に対する、抗体Ａとそのキメラ抗体およびヒト化抗体の阻害効果
ヒトＭｙｌ９、１２ａ、１２ｂタンパク質とヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合
ヒトＭｙｌ９、１２ａ、１２ｂタンパク質とヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合をＥＬＩＳＡにて評価した。以下の工程に従って、ヒトＣＤ６９タンパク質の細胞外領域（６４−１９９位、配列番号９７）のＮ末端にＦｌａｇタグを付加したタンパク質（以下、３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質）を作製した。ヒトとマウスのＣＤ６９タンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列の比較を示す（図１０）。

【0180】

３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質をコードする遺伝子を含む発現プラスミドは千葉大学より分与され、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ ２９３ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｇｉｂｃｏ）を用いてＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）へ形質移入した。４日間のインキュベーション（８％ＣＯ２、３７°Ｃ）の後、培養上清を回収した。回収した培養上清より、３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質をａｎｔｉ−Ｆｌａｇ Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（ＳＩＧＭＡ）を用いて精製したのち、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００またはＳｕｐｅｒｄｅｘ７５を用いてダイマー化したタンパク質を分取した。

【0181】

ヒトＭｙｌ９、１２ａ、１２ｂタンパク質とヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合をＥＬＩＳＡにて評価した。実施例５に従って作製したヒトＭｙｌ３−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを、それぞれ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質を１０μｇ／ｍＬから３倍希釈で６段階の濃度になるように、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で希釈して、ウェルに添加した。室温にて１．５時間インキュベートして３回、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0182】

ヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質は、ヒトＭｙｌ９、およびヒトＭｙｌ９と相同性の高いＭｙｌ１２ａ、１２ｂへの濃度依存的な結合を示し、ヒトＭｙｌ９とは相同性の低いヒトＭｙｌ３には結合しなかった（図１１）。

【0183】

ヒトＭｙｌ９、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合能に対する、抗体Ａの阻害活性の評価
ヒトＭｙｌ９、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合能に対する、抗体Ａの阻害活性は、以下の工程によりＥＬＩＳＡにて評価した。実施例５に従って作製したヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−Ｈｉｓ、およびヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを、それぞれ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、抗体Ａまたはコントロール抗体（抗ジニトロフェノール抗体、マウスＩｇＧ２ｃ、κ）を３０μｇ／ｍＬから３倍希釈で７段階に５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で希釈し、ウェルに添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄し、３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質を１０μｇ／ｍＬの濃度になるように、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で希釈して、ウェルに添加した。室温にて１．５時間インキュベートして３回、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0184】

抗体Ａは、ヒトＭｙｌ９、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合を濃度依存的に阻害した（図１２Ａ−Ｃ）。コントロール抗体は阻害活性を示さなかった。図中のバックグラウンドは、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓ、ヒトＭｙｌ１２ａ−ＨｉｓまたはヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを固相化していないウェル上での３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）による発色を示す。

【0185】

ヒトＭｙｌ９とヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合能に対する、抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体の阻害活性の評価
抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体の、ヒトＭｙｌ９とヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合能に対する阻害活性は、以下の工程によりＥＬＩＳＡにて評価した。実施例５に従って作製したヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓを、９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、抗体Ａ、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはコントロール抗体（ヒトＩｇＧ２、κ、Ｓｉｇｍａ）を３０μｇ／ｍＬから３倍希釈で７段階に５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で希釈し、ウェルに添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄し、３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質を１０μｇ／ｍＬの濃度になるように、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で希釈して、ウェルに添加した。室温にて１．５時間インキュベートして３回、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0186】

抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体は、ヒトＭｙｌ９とヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合を濃度依存的に阻害した（図１３−１〜１３−５）。コントロール抗体は阻害活性を示さなかった。図中のバックグラウンドは、ヒトＭｙｌ９−Ｈｉｓを固相化していないウェル上での３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）による発色を示す。

【0187】

ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合能に対する、抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体の阻害活性の評価
抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体の、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合能に対する阻害活性は、以下の工程によりＥＬＩＳＡにて評価した。実施例５に従って作製したヒトＭｙｌ１２ａ−ＨｉｓおよびヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを、それぞれ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）のウェル上にコートした。４℃にて一晩インキュベートした後、１ｘブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）により、ウェルを室温にて１時間ブロッキングした。０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄した後、抗体Ａ、キメラ抗体、ヒト化抗体またはコントロール抗体（ヒトＩｇＧ２、κ、Ｓｉｇｍａ）を０．１、１、１０μｇ／ｍＬの濃度になるように５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で希釈し、ウェルに添加した。室温にて１時間インキュベートして３回洗浄し、３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質を１０μｇ／ｍＬの濃度になるように、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で希釈して、ウェルに添加した。室温にて１．５時間インキュベートして３回、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）／１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）を加え、室温にて１時間インキュベートした。５回洗浄した後、ウェルにＴＭＢＺ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）溶液を加え、５〜２０分、室温にてインキュベートした。ウェルに等量の反応停止溶液（２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４）を加え、マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により４５０ｎｍの吸光度を読み取った。

【0188】

抗体Ａから作製したキメラ抗体およびヒト化抗体は、ヒトＭｙｌ１２ａおよびヒトＭｙｌ１２ｂとヒトＣＤ６９細胞外領域タンパク質との結合を濃度依存的に阻害した（図１４−１〜１４−４）。コントロール抗体は阻害活性を示さなかった。図中のバックグラウンドは、ヒトＭｙｌ１２ａ−ＨｉｓまたはヒトＭｙｌ１２ｂ−Ｈｉｓを固相化していないウェル上での３ｘＦｌａｇ−ヒトＣＤ６９ＥＣタンパク質、ならびに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識の抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）抗体（Ｓｉｇｍａ）による発色を示す。

【0189】

実施例７：抗体Ａおよび抗ＰＤ−１抗体の併用投与による抗腫瘍効果
１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培養液で培養したマウス大腸がん細胞株ＣＴ２６.ＷＴ（ＡＴＣＣ ｎｕｍｂｅｒ ＣＲＴ−２６３８）をリン酸緩衝生理食塩水にて１．０ × １０^７ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度の細胞懸濁液を調製し、６週齢のマウス（Ｂａｌｂ／ｃ、雌、日本チャールズリバー）の右背部皮下に０．１ｍＬの用量で移植した。移植から６日後に電子デジタルノギス（デジマチックＴＭキャリパ、株式会社ミツトヨ）を用いて腫瘍の短径、長径を計測し、以下の計算式で腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積（ｍｍ^３）＝長径（ｍｍ）× 短径（ｍｍ）× 短径（ｍｍ）／２
マウス大腸がん細胞株ＣＴ２６.ＷＴの皮下腫瘍組織を遺伝子発現解析した結果を図１５に示す。ＣＴ２６細胞由来腫瘍組織から、ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて核酸を抽出した後、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを調製した。全ＲＮＡから、ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡライブラリー調製試薬（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＲＮＡＳｅｑ解析用のＬｉｂｒａｒｙを作製し、ＨｉＳｅｑ４０００（ｉｌｌｕｍｉｎｅ）にてシーケンシングを行った。シーケンスにより得られたＦａｓｔｑファイルからＴＰＭ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ）の方法によりノーマライズを行い、Ｍｙｌ９、Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂの発現量を測定した。腫瘍組織ではＭｙｌ９の発現量は低いが、Ｍｙｌ１２ａおよびＭｙｌ１２ｂの発現量は高いことが示された。
投与初日の腫瘍体積をもとに、各群の腫瘍体積の平均値がほぼ等しくなるように群分けを行った。抗体Ａおよび抗ＰＤ−１抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、Ｃａｔａｌｏｇ＃：ＢＥ０１４６）はリン酸緩衝生理食塩水にて２ｍｇ／ｍＬに調製し、０．１ｍＬ／マウスの投与量で７日に２回の頻度で計４回（がん細胞移植後６、９、１３、１６日目）腹腔内に投与した。コントロール群にはリン酸緩衝生理食塩水を０．２ｍＬ／マウスの投与量で７日に２回の頻度で計４回（がん細胞移植後６、９、１３、１６日目）腹腔内に投与した。実験は１群７−８匹で行った。
試験最終日（３０日目）までのコントロール群（Ａ）、抗体Ａ投与群（Ｂ）、抗ＰＤ−１投与群（Ｃ）、抗体Ａと抗ＰＤ−１抗体併用投与群（Ｄ）それぞれの腫瘍体積を計算し経日的な変化の推移を図１６に示す。図１６Ｂに示すように、抗体Ａ単独では腫瘍の増殖をほとんど抑制しなかった。一方、抗ＰＤ−１抗体単独ではコントロール群と比較して若干の腫瘍増殖抑制（図１６Ｃ）が見られた。一方、抗体Ａと抗ＰＤ−１抗体を併用投与すると、顕著な腫瘍増殖抑制が見られ、腫瘍が消失する個体（２匹／１０匹）も見られた（図１６Ｄ）。以上の結果から、抗体Ａと抗ＰＤ−１抗体の併用投与による相乗効果が強く示唆された。

【産業上の利用可能性】

【0190】

Ｍｙｌ９に結合し、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用を阻害し得る、抗Ｍｙｌ９抗体またはそのＭｙｌ９結合断片、およびこれらを含む医薬組成物を提供し得る。本発明に係る抗体または医薬組成物は、Ｍｙｌ９とＣＤ６９との相互作用に起因する疾患、例えば喘息、慢性アレルギー性鼻炎もしくは一部の副鼻腔炎などのアレルギー性気道炎症、およびアレルギー性気道炎症に含まれない副鼻腔炎などの気道炎症疾患、並びに潰瘍性大腸炎、クローン病、ベーチェット病および好酸球性消化管障害などの炎症性腸疾患の治療に有用であり得る。また、本発明に係る抗体は、さらに、Ｍｙｌ１２とＣＤ６９との相互作用を阻害し得る。したがって、本発明に係る抗体または医薬組成物は、免疫チェックポイント阻害剤と併用された場合、Ｍｙｌ９および／またはＭｙｌ１２とＣＤ６９との相互作用に起因する疾患、例えば、大腸がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞がん、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、頭頸部がん、尿路上皮がん、乳がん、肝細胞がん、胃がん、食道がん、卵巣がん、小細胞肺がん、中皮腫および子宮体などの腫瘍の治療に有用であり得る。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5】

【図6-1】

【図6-2】

【図6-3】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13-1】

【図13-2】

【図13-3】

【図13-4】

【図13-5】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図14-4】

【図15】

【図16】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]