特許 6872768 ｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6872768

(24)【登録日】2021年4月22日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】ｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/655 20060101AFI20210510BHJP

   A61K 31/426 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 45/00 20060101ALN20210510BHJP

   A61K 31/5415 20060101ALN20210510BHJP

   A61K 31/166 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   A61K31/655ZNA

   A61K31/426

   A61P35/00

   A61P37/06

   A61P43/00 105

   A61P43/00 111

   !A61K45/00

   !A61K31/5415

   !A61K31/166

【請求項の数】1

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2016-206578(P2016-206578)

(22)【出願日】2016年10月21日

(65)【公開番号】特開2018-65772(P2018-65772A)

(43)【公開日】2018年4月26日

【審査請求日】2019年9月18日

(73)【特許権者】

【識別番号】304020177

【氏名又は名称】国立大学法人山口大学

(72)【発明者】

【氏名】渋谷 周作

(72)【発明者】

【氏名】岩田 祐之

【審査官】 長谷川 茜

(56)【参考文献】

【文献】 Carcinogenesis，２０１３年，Vol.34, No.9，pp.2080-2089

【文献】 PNAS，２０１５年，Vol.112, No.14，pp.4423-4428

【文献】 生物工学会誌，２０１２年，Vol.90, No.2，p.97

【文献】 Journal of Cellular Biochemistry，２０１６年 ４月，Vol.117，pp.836-843

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４

Ａ６１Ｋ ４５／００

ＷＰＩ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ダイナソア、又はＰｉｔＳｔｏｐ（登録商標）−２を有効成分とするヒト細胞内へのダイナミン依存性エンドサイトーシスによるアミノ酸取り込み抑制剤。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明はダイナミン依存性エンドサイトーシス阻害剤を有効成分とするｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤や、かかるｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤を含む細胞増殖抑制用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

真核細胞はＴＯＲ（target of rapamycin：哺乳類細胞ではｍＴＯＲと呼ばれる）というタンパク質を持つ。ＴＯＲは酵母からヒトまで生物種を超えて広く保存されており、このことから、ＴＯＲが細胞の基本的機能に欠かすことの出来ない重要なタンパク質であることが示唆されている。事実、マウスでｍＴＯＲを欠損させると胚発生初期で発生停止に陥ることが知られている。

【0003】

ｍＴＯＲは２つの異なる機能を持った複合体として存在し、それぞれｍＴＯＲ ｃｏｍｐｌｅｘ １（ｍＴＯＲＣ１）、ｍＴＯＲ ｃｏｍｐｌｅｘ ２（ｍＴＯＲＣ２）と呼ばれる。ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の違いはｍＴＯＲに結合する調節タンパク質の違いによる。ｍＴＯＲＣ２の活性化メカニズムについては未だ不明な点が多いが、ｍＴＯＲＣ１の活性化メカニズムは比較的よく研究されている。

【0004】

ｍＴＯＲＣ１は、細胞外液に含まれるアミノ酸等の栄養素及びインスリン等の成長因子が存在する時に細胞内で活性化されることが報告されている（非特許文献１参照）。活性化されたｍＴＯＲＣ１は、様々なタンパク質をリン酸化することにより、細胞の生存や増殖を助けることが知られている。しかしながら、その活性化メカニズムが明らかになったのは最近のことである。最近の知見によると、ｍＴＯＲＣ１の活性化は、リソソームと呼ばれる、膜小胞の形をした細胞内小器官で起こることが明らかとなった。リソソーム内腔と細胞質内にはアミノ酸センサータンパク質が存在し、それらのセンサータンパク質がアミノ酸を感知すると、ｍＴＯＲＣ１をリソソーム膜上に移動させる。リソソーム膜上にはＲｈｅｂと呼ばれるｍＴＯＲＣ１の活性化分子が局在するため、ｍＴＯＲＣ１が活性化される、というメカニズムがこれまで明らかとなっている（非特許文献２、３参照）。しかし、アミノ酸は極性分子であり、それ自身は生体膜を通り抜けることが出来ない性質を持つため、細胞外液のアミノ酸がどのようにしてリソソーム内腔や細胞質内に効率よく到達できるのか、未だ明らかではない。こうしたなか、ｍＴＯＲの活性に関与するＬ−グルタミン及びＬ−ロイシンの細胞内への取り込みに関しては、ＳＬＣ１Ａ５やＳＬＣ７Ａ５／ＳＬＣ３Ａ２ヘテロダイマーがトランスポーターとして働くことが開示されている（非特許文献４参照）。

【0005】

ｍＴＯＲ阻害剤としてはラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）が知られているが（非特許文献５参照）、ラパマイシンはＦＫＢＰ１２と呼ばれるタンパク質を介してｍＴＯＲ自体をターゲットとしており、長時間作用させるとｍＴＯＲＣ１だけでなくｍＴＯＲＣ２にも作用することが知られている。

【0006】

一方、細胞質と細胞外液の境目である細胞膜では、常時、エンドサイトーシスと呼ばれる現象が起こっている。エンドサイトーシスは、細胞膜の一部が細胞質側に陥没し、ついで、陥没した部分が細胞膜から切り離されることによって、小胞として細胞質側に落ち込むという現象である。このようにして出来た小胞は、内腔に細胞外液を含む。このような小胞はエンドソームと呼ばれる細胞内小器官とまず融合し、最終的にはリソソームと融合することが知られているため、エンドサイトーシスは細胞外液をリソソーム内腔に効率的に運ぶ手段として有力である。エンドサイトーシスとしては、いくつか知られているが、細胞外液に含まれるどの物質が上記のいずれのエンドサイトーシスによって細胞質内にとりこまれているかの詳細は明らかとなっていない。

【0007】

また、エンドサイトーシス阻害剤の用途として、腫瘍に対する免疫応答を増強させるための免疫療法剤（特許文献１参照）や、仮足形成阻害剤若しくは腫瘍の浸潤抑制剤（特許文献２参照）が開示されているが、エンドサイトーシス阻害剤とｍＴＯＲＣ１の活性や、エンドサイトーシス阻害剤と細胞増殖との関係は知られていない。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0008】

【特許文献1】特表２０１５−５３６３２７号公報

【特許文献2】特開２００９−５７３６４号公報

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Hara et al., 1998 J. Biol. Chem., 273:14484-14494

【非特許文献2】Sancak et al., 2008 Science, 320：1496-1501

【非特許文献3】Sancak et al., 2010 Cell, 141：290-303

【非特許文献4】Paul et al., 2009 Cell, 136:521-534

【非特許文献5】Sarbassov et al., Mol Cell. 2006 Apr 21;22(2):159-68

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の課題は、ｍＴＯＲＣ１活性化を抑制する剤や、ｍＴＯＲＣ１活性化を抑制することによる細胞増殖抑制用組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

細胞はエンドサイトーシスにより細胞外液を常時取り込んでいるが、その中に含まれる栄養素がどのように細胞に影響を与えるのかは理解が進んでいない。本発明者らは、エンドサイトーシスによって細胞外液のアミノ酸がリソソーム内腔に効率的に運ばれ、このプロセスがｍＴＯＲＣ１活性の維持に重要なのではないかと考え、研究を行った。その結果、ダイナミン依存性エンドサイトーシスを阻害するとｍＴＯＲＣ１の活性を抑制することや、ダイナミン依存性エンドサイトーシスにより取り込まれるアミノ酸がｍＴＯＲＣ１の活性に関与することを見出し、さらに、ダイナミン依存性エンドサイトーシスによりｍＴＯＲＣ１の活性を抑制することによって細胞増殖が抑制されることを見出し、本発明を完成した。

【0012】

すなわち、本発明は、以下に示すとおりのものである。
（１）ダイナミン依存性エンドサイトーシス阻害剤を有効成分とするｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤。
（２）ダイナミン依存性エンドサイトーシス阻害剤が、ダイナソア、ＰｉｔＳｔｏｐ（登録商標）−２又はクロルプロマジンであることを特徴とする上記（１）記載のｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤。
（３）上記（１）又は（２）記載のｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤を含む細胞増殖抑制用組成物。

【発明の効果】

【0013】

本発明により、ｍＴＯＲＣ１活性化を抑制することが可能となる。また、従来のｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２に共通のサブユニットであるｍＴＯＲを標的にしていることから、ｍＴＯＲＣ１だけではなく、アポトーシス、グルコース代謝、ＮＦ−κＢシグナル、脳神経系機能等に関与するＡＫＴシグナルの上流に位置するｍＴＯＲＣ２も阻害してしまうという問題があった。しかしながら、ダイナソア又はＰｉｔＳｔｏｐ−２を有効成分とするｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤を用いれば、ｍＴＯＲＣ１を特異的に阻害することが可能である。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】実施例１におけるウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。

【図2】実施例２における免疫染色の結果を示す図である。

【図3】実施例３におけるウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。

【図4】実施例４におけるウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。

【図5】実施例５におけるウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。

【図6】実施例６におけるウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。

【図7】実施例７における細胞増殖抑制解析の結果を示す図である。

【図8】Ｄｙｎａｓｏｒｅ又はＰｉｔＳｔｏｐ−２がエンドサイトーシスによるアミノ酸取り込みを阻害し、ｍＴＯＲＣ１の上流を遮断することで、ｍＴＯＲＣ１活性を特異的に阻害することの説明図である。

【図9】エンドサイトーシスによる細胞内アミノ酸の取り込みとｍＴＯＲＣ１活性化との関係についてまとめた図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、ダイナミン依存性エンドサイトーシス阻害剤を有効成分とするｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤であれば特に制限されず、ここで、ダイナミン依存性エンドサイトーシスとは、細胞膜の一部が細胞質側に陥没し、ついで、陥没した部分が細胞膜から切り離されることによって、小胞として細胞質側に落ち込むという現象を意味し、マクロピノサイトーシスは含まれない。かかるダイナミン依存性エンドサイトーシスによって、アミノ酸等を含む細胞外液がリソソーム内腔に運ばれる。

【0016】

ダイナミン依存性エンドサイトーシスとしては、カベオラ依存性エンドサイトーシス（Ｃａｖｅｏｌａｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）、クラスリン依存性エンドサイトーシス（Ｃｌａｔｈｒｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）等のダイナミン依存性エンドサイトーシス阻害剤を挙げることができ、クラスリン依存性エンドサイトーシスをより好適に挙げることができる。

【0017】

本発明におけるダイナミン依存性エンドサイトーシス阻害剤としては、上記ダイナミン依存性エンドサイトーシスを阻害する物質であれば特に制限されず、ダイノール（登録商標）３４−２（Ｄｙｎｏｌｅ３４−２：2-Cyano-N-octyl-3-[1-(3-dimethylaminopropyl)-1H-indol-3-yl]acrylamide）、ダイノール（登録商標）２−２４（Ｄｙｎｏｌｅ２−２４：N-[[1-[3-(Dimethylamino)propyl]-1H-indol-3-yl]methyl]decan-1-amine）、ダイナソア（Ｄｙｎａｓｏｒｅ：3-Hydroxynaphthalene-2-carboxylic acid(3,4-dihydroxybenzylidene)hydrazide）、ディンゴ（登録商標）４ａ（Ｄｙｎｇｏ４ａ：3-Hydroxy-N'-[(2,4,5-trihydroxyphenyl)methylidene]naphthalene-2-carbohydrazide）、ＰｉｔＳｔｏｐ（登録商標）−１（2-(4-Aminobenzyl)-1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-benzo[de]isoquinoline-5-sulfonic acid sodium salt）、ＰｉｔＳｔｏｐ−１−２５（3-Sulfo-N-(benzyl)-1,8-naphthalimide potassium salt）、ＰｉｔＳｔｏｐ−２（N-[5-(4-Bromobenzylidene)-4-oxo-4,5-dihydro-1,3-thiazol-2-yl]naphthalene-1-sulfonamide）、フェノチアジン（ｐｈｅｎｏｈｉａｚｉｎｅ）、プロマジン（Ｐｒｏｍａｚｉｎｅ）、クロルプロマジン（Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ）、トリフルプロマジン（Ｔｒｉｆｌｕｐｒｏｍａｚｉｎｅ）、チオリダジン（Ｔｈｉｏｒｉｄａｚｉｎｅ）、トリフルオペラジン（Ｔｒｉｆｌｕｏｐｅｒａｚｉｎｅ）、ペルフェナジン（Ｐｅｒｐｈｅｎａｚｉｎｅ）、フルフェナジン（Ｆｌｕｐｈｏｎａｚｉｎｅ）、プロクロルペラジン（Ｐｒｏｃｈｌｏｒｐｅｒａｚｉｎｅ）、メチル−β―シクロデキストリン（Ｍｅｔｈｙｌ−β−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ）、フィリピン（Ｆｉｌｉｐｉｎ）、サイトカラシン（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ）、又はラトランクリン（Ｌａｔｒｕｎｃｕｌｉｎ）を挙げることができ、ダイナソア（Ｄｙｎａｓｏｒｅ）、ＰｉｔＳｔｏｐ−２又はクロルプロマジンを好適に挙げることができ、ダイナソア（Ｄｙｎａｓｏｒｅ）又はＰｉｔＳｔｏｐ−２をより好適に挙げることができ、ＰｉｔＳｔｏｐ−２をさらに好適に挙げることができる。

【0018】

上記エンドサイトーシス阻害剤は、市販品を用いることもでき、化学合成品を用いることもできる。なお、上記それぞれのＰｉｔＳｔｏｐは国際公開第２０１３／０１０２１８号パンフレットに記載の方法を参考に合成することが可能である。

【0019】

また、上記ダイナミン依存性エンドサイトーシスを阻害する物質として、ダイナミンドミナントネガティブや、ダイナミンの発現を抑制するｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム等を挙げることができる。ダイナミンドミナントネガティブとしては、ダイナミンを構成するアミノ酸の１つ、２つ、又は３つ、好ましくは１つのアミノ酸が他のアミノ酸に置換したものを挙げることができき、配列番号１に示すアミノ酸配列の４４番目のリジンがアラニンに置換したものを好適に挙げることができる。なお、配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号２に示す。

【0020】

本発明の細胞増殖抑制用組成物としては、上記本発明のｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤を含んでいればよく、さらに、抗がん剤や免疫賦活剤等を含んでいてもよい。

【0021】

本発明のｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤及び細胞増殖抑制用組成物には、溶解剤、増量剤、賦形剤、担体等の薬学的に許容される添加剤と混合して注射剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、貼付剤、軟膏剤、スプレー剤、溶液剤、徐放剤等の製剤とすることができる。溶解剤、増量剤、賦形剤又は担体等の薬学的に許容される添加剤の種類及び組成は投与経路や投与方法によって決めることができる。

【0022】

本発明の医薬の適当な投与経路としては特に限定されず、経口、直腸内、経粘膜、腸内、筋肉内、皮下、骨髄内、鞘内、直接心室内、静脈内、硝子体内、腹腔内、鼻腔内、又は眼内注射を含めてもよい。投与経路は、投与対象の年齢や病状、併用する他の薬剤などを考慮して適宜選択することができる。

【0023】

製剤中におけるエンドサイトーシス阻害剤の含量は製剤により種々異なるが通常０．００１〜１００重量％、好ましくは０．０１〜９８重量％である。例えば注射剤の場合には、通常０．００１〜３０重量％、好ましくは０．０１〜１０重量％の有効成分を含むようにすることがよい。経口剤の場合には、添加剤とともに錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤、ドライシロップ剤等の形態で用いられる。カプセル剤、錠剤、顆粒、散剤は一般に０．１〜１００重量％、好ましくは１〜９８重量％の有効成分を含む。投与量は、投与対象の年齢、体重、症状等により決定されるが、治療量は一般に、非経口投与で０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、経口投与で０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。溶液で用いる場合は、１ｎＭ〜１０００ｍＭ、好ましくは１ｎＭ〜１０００μＭの濃度で用いる。

【0024】

また、本発明のｍＴＯＲＣ１活性化抑制剤及び細胞増殖抑制用組成物は、抗がん剤や免疫賦活剤等と併用して用いることもできる。

【0025】

以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。なお、本発明の実施例においては、以下の抗体及び試薬を用いた。

【実施例1】

【0026】

（Ｄｙｎａｓｏｒｅ及びＰｉｔＳｔｏｐ−２によるｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の活性化抑制）
Ｄｙｎａｓｏｒｅ及びＰｉｔＳｔｏｐ−２を用いてｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の活性化抑制効果、ならびにｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の構成タンパク質であるｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒの発現量を以下に示すウエスタンブロット解析により調べた。また、Ｄｙｎｓｏｓｒｅ及びＰｉｔｓｔｏｐ−２の比較対象としてＴｏｒｉｎ １及びアミノ酸不含培地を用いた。

【0027】

１．細胞
２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞（理研バイオリソースセンターより購入）は、１０％ウシ胎児血清（HyClone社製）及びストレプトマイシン／ペニシリン（和光純薬工業社製）を添加したＤＭＥＭ培地（和光純薬工業社製）を用いて、５％ ＣＯ_２濃度に保ったＣＯ_２インキュベーターの中で維持した。

【0028】

２．ウエスタンブロッティング
２９３Ｔ細胞はコラーゲン（Cellmatrix type I-C: 新田ゼラチン社製）でコートした１２−ｗｅｌｌプレート内に２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種した。培地は１０％ Ｎｕ−ｓｅｒｕｍ（Thermo Fisher Scientific社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。ここで、ウシ胎児血清の代わりにＮｕ−ｓｅｒｕｍを用いた理由としては、Ｄｙｎａｓｏｒｅを使用する際にＮｕ−ｓｅｒｕｍの使用が推奨されているからである(Kirchhausen et al., Methods Enzymol. 438:77-93. doi:10.1016/S0076-6879(07)38006-3.2008)。実際に、Ｄｙｎａｓｏｒｅがウシ胎児血清中のアルブミンによって不活化されることが報告されている(McCluskey et al., Traffic Cph. Den. 14:1272-1289. doi:10.1111/tra.12119.2013)。播種した細胞をＣＯ_２インキュベーター内で１８−２０時間培養した後、細胞の培地をＤｙｎａｓｏｒｅ、ＰｉｔＳｔｏｐ−２（Abcam社製）、又はＴｏｒｉｎ １（Tocris Bioscience社製）を含む１０％ Ｎｕ−ｓｅｒｕｍ（Thermo Fisher Scientific社製）添加ＲＰＭＩ１６４０培地（和光純薬工業社製）、あるいは薬剤を含まないアミノ酸不含ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、薬剤処理又はアミノ酸飢餓を開始した。薬剤処理又はアミノ酸飢餓を開始後、ＣＯ_２インキュベーター内で１５分、１時間、４時間、又は２４時間静置した。続いて、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を１回洗浄し、冷却したＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２．５ｍＭ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１ｍＭ Ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ（ｃＯｍｐｌｅｔｅ：Sigma-Aldrich社製））を加え、細胞を溶解した。細胞溶解液は１４０００ｒｐｍ ４℃で１０分間遠心し、可溶画分である上清をサンプルとして回収した。サンプルはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含むｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒと混合し、５分間煮沸した後、ウエスタンブロッティングによる解析時まで−２０℃で保存した。ウエスタンブロッティングにおいては、サンプル中のタンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分子量ごとに分離後、ＰＶＤＦメンブレンに転写した。メンブレンはブロッキングバッファー（２％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ及び０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含んだトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ））を用いてブロッキングした後、目的のタンパク質に結合する１次抗体（rabbit anti-phospho-p70 S6 kinase (Thr389) (#9234)、rabbit anti-phospho-Akt (Ser473) (#4060)、 rabbit anti-Akt (#4691)、rabbit anti-Dynamin I/II (#2342)、rabbit anti-GAPDH (#5174P)、rabbit anti-mTOR (#2983)、rabbit anti-p70 S6 kinase (#2708)、rabbit anti-Raptor (#2280)、rabbit anti-Rictor (#2114)：Cell Signaling technology社製）、及びｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識２次抗体（goat anti-rabbit IgG (H+L)-HRP：Jackson Immunoresearch社製）で処理し、発光基質ＥｚＷｅｓｔＬｕｍｉ ｐｌｕｓ（Atto社製）を加え、ケミルミネッセンスイメージャー（LAS3000（Fujifilm社製））で検出した。なお、Ｔｏｒｉｎ １はｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の両方を阻害する薬剤である。

【0029】

３．結果
ウエスタンブロッティングの解析結果を図１に示す。ＤｙｎａｓｏｒｅとＰｉｔＳｔｏｐ−２はアミノ酸飢餓と同様に、ｍＴＯＲＣ１活性を抑制するが、ｍＴＯＲＣ２活性は抑制しておらず、ＤｙｎａｓｏｒｅとＰｉｔＳｔｏｐ−２はｍＴＯＲＣ１活性を特異的に抑制することが明らかとなった。Ｔｏｒｉｎ １等の従来のｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２に共通のサブユニットであるｍＴＯＲを標的にしていることから、ｍＴＯＲＣ１だけではなく、アポトーシス、グルコース代謝、ＮＦ−κＢシグナル、脳神経系機能等に関与するＡＫＴシグナルの上流に位置するｍＴＯＲＣ２も阻害してしまうという問題があった。上記のウエスタンブロッティングの解析の結果、ＤｙｎａｓｏｒｅとＰｉｔＳｔｏｐ−２はｍＴＯＲＣ１活性を特異的に抑制することから、ＡＫＴシグナルに影響しないという点で従来のｍＴＯＲ阻害剤と比較して優れているといえる。また、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の構成タンパク質であるｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒについては、Ｄｙｎａｓｏｒｅ及びＰｉｔＳｔｏｐ−２による発現量の顕著な変化は見られなかったことから、これらの発現量の減少がｍＴＯＲＣ１活性の減少の原因ではないことが明らかとなった。

【0030】

なお、上記非特許文献４に記載のとおり、ｍＴＯＲＣ１の活性に関与するアミノ酸の細胞内への取り込みはトランスポーターによって行われると考えられていたが、上記データにより、Ｄｙｎａｓｏｒｅ又はＰｉｔＳｔｏｐ−２を用いれば、トランスポーターを制御することなくｍＴＯＲＣ１活性を抑制することが可能であることが明らかとなった。

【実施例2】

【0031】

（Ｄｙｎａｓｏｒｅ処理によるｍＴＯＲＣ１の局在の変化）
Ｄｙｎａｓｏｒｅ処理により、ｍＴＯＲＣ１の局在がどのようになるかを以下に示す免疫染色によって調べた。

【0032】

１．免疫染色
コラーゲン（Cellmatrix Type I-C：HyClone社製）でコートしたカバースリップの入った６−ｗｅｌｌプレートを用意し、２９３Ｔ細胞を３×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。培地は１０％ Ｎｕ−ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いた。ＣＯ_２インキュベーター内で１８−２０時間培養後、細胞の培地をＤｙｎａｓｏｒｅを含む１０％ Ｎｕ−ｓｅｒｕｍ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、薬剤処理を開始した。ＣＯ_２インキュベーター内で１時間の薬剤処理を行った後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳを加え２０分間室温で処理し、細胞を固定した。その後、０．０５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳに交換し５分間室温で処理することで膜透過処理を行い、０．０２％ ｇｅｌａｔｉｎを含むＰＢＳに交換し３０分間以上室温で処理することでブロッキングを行った。免疫染色を目的タンパク質に対応する１次抗体（mouse anti-Lamp1 (sc-20011)：Santa Cruz Biotechnology社製、rabbit anti-mTOR (#2983)：Cell Signaling technology社製））、及び蛍光標識２次抗体（Goat anti-rabbit IgG (H+L)-Alexa 、goat anti-mouse IgG (H+L)-Alexa 568（Thermo Fisher Scientific社製））を用いて行い、封入剤（Prolong Gold with DAPI（Thermo Fisher Scientific社製））を用いてスライドグラス上に封入後、共焦点蛍光レーザー顕微鏡LSM 710（Zeiss社製）を用いて画像を取得した。

【0033】

２．結果
免疫染色の結果を図２に示す。Ｄｙｎａｓｏｒｅ処置なしの場合には、ｍＴＯＲＣ１はリソソーム（Ｌａｍｐ１）と共局在するのに対し、Ｄｙｎａｓｏｒｅ（８０μＭ）で１時間処理した細胞では、リソソーム（図中の矢印）と共局在しなくなった。したがって、Ｄｙｎａｓｏｒｅは、ｍＴＯＲＣ１のリソソームへの局在化を阻害し、その結果ｍＴＯＲＣ１の活性化が抑制されることが明らかとなった。

【実施例3】

【0034】

（ＤｙｎａｓｏｒｅのｍＴＯＲＣ１の活性化抑制に対するシクロヘキシミドの影響）
Ｄｙｎａｓｏｒｅ処理によるｍＴＯＲＣ１活性阻害は、細胞内アミノ酸の枯渇が原因か否かを確認するため、Ｄｙｎａｓｏｒｅ処理の際にシクロヘキシミド（ＣＨＸ）を用いて実施例１と同様にｍＴＯＲＣ１の活性化抑制を調べた。なお、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）はタンパク質合成阻害剤であり、シクロヘキシミドで処理すると、細胞内のアミノ酸がタンパク質合成に使われるのを阻害され、細胞内アミノ酸濃度が上昇し、その結果ｍＴＯＲＣ１活性が上昇することが知られている。

【0035】

１．ウエスタンブロッティング
Ｄｙｎａｓｏｒｅ８０μＭと共にシクロヘキシミド１０μｇ／ｍｌ（和光純薬工業社製）を加えた以外は実施例１と同様の方法で行った。

【0036】

２．結果
ウエスタンブロッティングの結果を図３に示す。シクロヘキシミド処理により、Ｄｙｎａｓｏｒｅ処理で認められるリン酸化Ｓ６Ｋの減少が打ち消された。このことから、Ｄｙｎａｓｏｒｅ処理によるｍＴＯＲＣ１活性阻害は、細胞内アミノ酸の枯渇が原因であることが示唆された。

【実施例4】

【0037】

（ＣｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅによるｍＴＯＲＣ１の活性化抑制）
Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅを用いてｍＴＯＲＣ１の活性化抑制効果を以下に示すウエスタンブロット解析により調べた。なお、Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅはダイナミンを阻害することが知られている(Daniel et al., Traffic 16: 635-654. doi:10.1111/tra.12272.2015)。
１．ウエスタンブロッティング
２９３Ｔ細胞の代わりにＲａｗ２６４細胞（マウスマクロファージ様細胞）を用い、コラーゲンコートを行わない１２−ｗｅｌｌプレートに３×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞密度で播種し、培地は１０％ ウシ胎児血清（Hyclone社製）を含むＤＭＥＭ培地（和光純薬工業社製）を用いた以外は実施例１と同様に行った。薬剤はＣｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅ（和光純薬工業社製）を用いた。

【0038】

２．結果
ウエスタンブロッティングの結果を図４に示す。Ｄｙｎａｓｏｒｅ、ＰｉｔＳｔｏｐ−２と同様に、Ｃｈｌｏｒｐｒｏｍａｚｉｎｅが顕著にｍＴＯＲＣ１活性を阻害することが明らかとなった。

【実施例5】

【0039】

（様々な細胞株でのｍＴＯＲＣ１の活性化抑制）
実施例１では２９３Ｔ細胞を用いたが、さらに他の細胞でのｍＴＯＲＣ１の活性化抑制効果を調べた。
１．ウエスタンブロッティング
２９３Ｔ細胞の代わりにＲａｊｉ細胞（ヒトＢ細胞バーキットリンパ腫）、Ｊｕｒｋａｔ（ヒト急性Ｔ細胞白血病）、Ｋ５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病）、Ｕ９３７細胞（ヒト組織球性リンパ腫）を用いた以外は実施例１と同様に行った。
２．結果
ウエスタンブロッティングの結果を図５に示す。２９３Ｔ細胞だけでなく、Ｒａｊｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２細胞、Ｕ９３７細胞等の様々な血球系がん細胞株においても、Ｄｙｎａｓｏｒｅが顕著にｍＴＯＲＣ１活性を阻害することが明らかとなった。

【実施例6】

【0040】

（ダイナミンドミナントネガティブ（Ｄｙｎａｍｉｎ−ＤＮ）によるｍＴＯＲＣ１の活性化抑制）
１．Ｄｙｎａｍｉｎ−２ Ｋ４４Ａ発現細胞の作製
２９３Ｔ細胞にＤｙｎａｍｉｎ−２のドミナントネガティブ型（Ｋ４４Ａ）を一過性に遺伝子導入し、２４時間後に細胞サンプルを回収した。具体的には、Dr. Sandra Schmidからの分与を受けたpcDNA3.1/HA-Dynamin-2 K44A又はpcDNA3.1(-)（Thermo Fisher Scientific社製）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Thermo Fisher Scientific社製）を用いて２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。導入した、HA-Dynamin-2 K44Aをコードする塩基配列を配列番号１に示す。次に、ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間静置し、実施例１と同様の方法で細胞サンプルを回収し、ウエスタンブロッティング解析を行った。

【0041】

（結果）
結果を図６に示す。Ｄｙｎａｓｏｒｅの標的分子であるダイナミンをドミナントネガティブ型ダイナミンの過剰発現で阻害したところ、Ｄｙｎａｓｏｒｅを用いた場合と同様にｍＴＯＲＣ１活性化抑制が起こった。したがって、ドミナントネガティブ型ダイナミンを用いてもｍＴＯＲＣ１活性化を抑制することや、ＤｙｎａｓｏｒｅによるｍＴＯＲＣ１阻害が、薬剤の副作用ではなく、Ｄｙｎａｍｉｎ阻害を通したものであることが示された。

【実施例7】

【0042】

（細胞増殖抑制）
ｍＴＯＲＣ１は細胞増殖において主要な役割を担う分子であることから、エンドサイトーシス阻害剤はｍＴＯＲＣ１特異的抑制を通して細胞増殖抑制剤として機能すると考えられる。そこでＤｙｎａｓｏｒｅ及びＰｉｔＳｔｏｐ−２で処理した場合に細胞増殖を抑制するかどうかを、以下に示す生細胞数アッセイによって調べた。

【0043】

Ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（同仁化学社製）を用いて、製品説明書に従い生細胞数を測定した。まず、２９３Ｔ細胞を９６−ｗｅｌｌプレートに５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で播種した。培地は１０％ Ｎｕ−ｓｅｒｕｍを含むＲＰＭＩ１６４０培地を使用した。ＣＯ_２インキュベーター内で１８−２０時間培養後、細胞の培地をＤｙｎａｓｏｒｅ又はＰｉｔＳｔｏｐ−２含む１０％−ｓｅｒｕｍ添加ＲＰＭＩ１６４０培地に交換し、薬剤処理を開始した。各薬剤処理は２ｗｅｌｌずつ行った（ｄｕｐｌｉｃａｔｅアッセイ）。２４時間若しくは４８時間ＣＯ_２インキュベーター内で薬剤処理した後、１０μｌのＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８試薬を各ウェルに加え、ＣＯ_２インキュベーター内で２時間静置して発色させたあと、４５０ｎｍ波長の吸光度をiMark plate reader（Bio-Rad）で測定した。コントロールとして、細胞を含まずに培地と試薬のみを含むウェルを作製し、それぞれのサンプル測定値からコントロール測定値を引いた値を生細胞数の指標とした。

【0044】

結果を図７に示す。Ｄｙｎａｓｏｒｅ又はＰｉｔＳｔｏｐ−２のいずれも濃度依存的に細胞増殖を抑制することが確認された。

【0045】

［上記結果のまとめ］
本発明によって、図８に示すように、Ｄｙｎａｓｏｒｅ又はＰｉｔＳｔｏｐ−２がダイナミン依存性エンドサイトーシスによるアミノ酸取り込みを阻害し、ｍＴＯＲＣ１の上流を遮断することで、ｍＴＯＲＣ１活性を特異的に（ｍＴＯＲＣ２活性に影響を与えずに）阻害し、細胞増殖を抑制するというメカニズムが明らかとなった。また、クロルプロマジンもダイナミン依存性エンドサイトーシスによるアミノ酸取り込みを阻害し、ｍＴＯＲＣ１活性を阻害することが明らかとなった。Ｄｙｎａｓｏｒｅ、ＰｉｔＳｔｏｐ−２、又はクロルプロマジンは細胞増殖に必要なシグナル分子であるｍＴＯＲＣ１を、その上流である「細胞内への栄養取り込み」という根本のプロセスから阻害するため、強力な細胞増殖抑制剤として働き、特に、がん細胞のように栄養要求性の高い細胞種に選択的に作用する可能性がある。

【0046】

ダイナミン依存性エンドサイトーシス阻害剤がｍＴＯＲＣ１を阻害するメカニズムとして、本発明者らは、ダイナミン依存性エンドサイトーシスによるアミノ酸取り込みが阻害されたためだという仮説を立てた。その仮説を支持するように、アミノ酸存在下で起こることが知られているｍＴＯＲのリソソーム局在が、Ｄｙｎａｓｏｒｅ及びＰｉｔＳｔｏｐ−２処理により解消された。また、タンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドで細胞を処理すると、Ｄｙｎａｓｏｒｅ及びＰｉｔＳｔｏｐ−２によるｍＴＯＲＣ１活性の減少が打ち消された。これらの結果から、Ｄｙｎａｓｏｒｅ及びＰｉｔＳｔｏｐ−２のｍＴＯＲＣ１抑制効果は、細胞内アミノ酸の枯渇によるものだと示唆された。

【0047】

また、これまでの知見及び本発明による結果に基づき、ダイナミン依存性エンドサイトーシスによる細胞内アミノ酸の取り込みとｍＴＯＲＣ１活性化との関係についてまとめると以下のように考えられる。ダイナミン依存性エンドサイトーシスによる細胞内アミノ酸の取り込みとｍＴＯＲＣ１活性化との関係の概念図を図９に示す。まず、ダイナミン依存性エンドサイトーシスにより細胞外のアミノ酸が効率よくリソソーム内に運ばれる。リソソーム膜上のＶ−ＡＴＰａｓｅはその内腔部分にアミノ酸センサーを持つことが報告されており(Zoncu et al. 2011, Science, 334, 678-683)、リソソーム内のアミノ酸濃度が上昇すると、Ｖ−ＡＴＰａｓｅがＲａｇｕｌａｔｏｒと呼ばれる複合体を活性型に変換し、ついで活性型ＲａｇｕｌａｔｏｒはｍＴＯＲＣ１をリソソーム上に繋ぎ止める。リソソーム上にはｍＴＯＲＣ１活性化分子であるＲｈｅｂが存在するため、ｍＴＯＲＣ１はリソソーム上において活性化される。なお、成長因子はＡＫＴと呼ばれるタンパク質（図中では省略）の活性化を介して、Ｒｈｅｂを活性化させる。ただし、成長因子の存在下でＲｈｅｂが活性化していたとしても、アミノ酸が無い状態ではｍＴＯＲＣ１は活性化されないため、アミノ酸はｍＴＯＲＣ１活性化の必要条件であると言える。換言すれば、Ｄｙｎａｓｏｒｅ、ＰｉｔＳｔｏｐ−２又はクロルプロマジン等のエンドサイトーシス阻害剤によってアミノ酸の取り込みを抑制することでｍＴＯＲＣ１活性化が抑制される。

【産業上の利用可能性】

【0048】

本発明は、細胞増殖抑制剤や、ｍＴＯＲＣ１を標的とした抗がん剤、免疫抑制剤として産業上利用可能である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]