特許 6872797 標的結合ペプチドの安定化方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6872797

(24)【登録日】2021年4月22日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】標的結合ペプチドの安定化方法

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20210510BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20210510BHJP

   C40B 40/10 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   C07K19/00

   C07K14/47ZNA

   C40B40/10

   !C12N15/12

【請求項の数】21

【全頁数】33

(21)【出願番号】特願2017-559228(P2017-559228)

(86)(22)【出願日】2016年12月28日

(86)【国際出願番号】JP2016089017

(87)【国際公開番号】WO2017115828

(87)【国際公開日】20170706

【審査請求日】2019年10月24日

(31)【優先権主張番号】特願2015-257646(P2015-257646)

(32)【優先日】2015年12月29日

(33)【優先権主張国】JP

(73)【特許権者】

【識別番号】304021417

【氏名又は名称】国立大学法人東京工業大学

(74)【代理人】

【識別番号】100139594

【弁理士】

【氏名又は名称】山口 健次郎

(74)【代理人】

【識別番号】100090251

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 憲一

(72)【発明者】

【氏名】門之園 哲哉

(72)【発明者】

【氏名】近藤 科江

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１３−５２０４２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１１−５１４１４９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１４／１７５３０５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２００８／０４５２５２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 PLoS One，２０１４年，Vol.9, No.8，e103397, pp.1-11

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

足場タンパク質のループ構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の置換領域を、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である前記足場タンパク質において、前記置換領域を３〜１５のアミノ酸からなる標的結合ペプチドに置換することを特徴とする標的結合ペプチドの安定化方法。

【請求項2】

前記足場タンパク質の鎖長が、２０〜１３０である、請求項１に記載の標的結合ペプチドの安定化方法。

【請求項3】

前記足場タンパク質がドメイン構造を含むタンパク質である、請求項１又は２に記載の標的結合ペプチドの安定化方法。

【請求項4】

前記足場タンパク質が、結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析されたタンパク質である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の標的結合ペプチドの安定化方法。

【請求項5】

前記連続基準ペプチドの長さと、標的結合ペプチドの長さとが同じである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の標的結合ペプチドの安定化方法。

【請求項6】

前記置換領域が３〜１５のアミノ酸鎖長である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の標的結合ペプチドの安定化方法。

【請求項7】

ループ構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の置換領域を有する足場タンパク質候補において、前記置換領域を連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換し、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質を選択する足場タンパク質のスクリーニング方法。

【請求項8】

前記足場タンパク質の鎖長が、２０〜１３０である、請求項７に記載の足場タンパク質のスクリーニング方法。

【請求項9】

前記足場タンパク質がドメイン構造を含むタンパク質である、請求項７又は８に記載の足場タンパク質のスクリーニング方法。

【請求項10】

前記足場タンパク質が、結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析されたタンパク質である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の足場タンパク質のスクリーニング方法。

【請求項11】

前記置換領域が３〜１５のアミノ酸鎖長である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の足場タンパク質のスクリーニング方法。

【請求項12】

置換領域が除去された２０〜１３０残基の鎖長の足場タンパク質であって、
前記置換領域が足場タンパク質のループを含む構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の領域であり、そして前記置換領域を連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、
足場タンパク質（但し、フィブロネクチンＩＩＩ型第１０（^１０Ｆｎ３）ドメイン由来の足場タンパク質、及びＩｇＧのＣＨ２ドメイン由来の足場タンパク質を除く）。

【請求項13】

配列番号８で表されるオメガコノトキシンMVIIAから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号８で表されるアミノ酸配列の第２〜７アミノ酸、又は第９〜１４アミノ酸である、請求項１２に記載の足場タンパク質。

【請求項14】

配列番号９で表されるＲａｌＧＥＦのＲａｓ結合ドメインから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号９で表されるアミノ酸配列の第４１〜４６アミノ酸である、請求項１２に記載の足場タンパク質。

【請求項15】

配列番号１０で表されるsAb軽鎖（３ＰＧＦ）のCLドメインから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１０で表されるアミノ酸配列の第３０〜３５アミノ酸、又は第４４〜４９アミノ酸である、請求項１２に記載の足場タンパク質。

【請求項16】

配列番号１１で表されるValpha24(-) NKT TCRのIgドメインから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１１で表されるアミノ酸配列の第４５〜５０アミノ酸である、請求項１２に記載の足場タンパク質。

【請求項17】

配列番号１２で表されるCXCL4L1から置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１２で表されるアミノ酸配列の第６〜１１アミノ酸である、請求項１２に記載の足場タンパク質。

【請求項18】

配列番号１３で表されるCXCL13から置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１３で表されるアミノ酸配列の第５〜１０アミノ酸である、請求項１２に記載の足場タンパク質。

【請求項19】

配列番号１４で表されるオメガアガトキシンから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１４で表されるアミノ酸配列の第２８〜３３アミノ酸である、請求項１２に記載の足場タンパク質。

【請求項20】

配列番号１５で表されるＭｕ−アガトキシンから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１５で表されるアミノ酸配列の第３〜８アミノ酸である、請求項１２に記載の足場タンパク質。

【請求項21】

請求項１２〜２０に記載の足場タンパク質における除去された置換領域を、３〜１５のアミノ酸からなる標的結合候補ペプチドと置換している、標的結合ペプチドをスクリーニングするためのライブラリー。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、標的結合ペプチドの安定化方法に関する。本発明によれば、標的結合ペプチドの構造を安定させることができる。

【背景技術】

【0002】

最近、バイオテクノロジー技術を利用したペプチド、核酸、又はタンパク質などを用いたバイオ医薬品の開発が進められている。例えば、抗体医薬、又は活性部位を中心に設計されたペプチド医薬などが開発され、それらの活性物質と、標的分子の結合が、種々の分析を駆使して解析されている。
これらのバイオ医薬品の中で、ペプチド医薬品の第一世代は、ヒトの体内で分泌されるホルモンなどの生理活性物質（アミノ酸の縮合体）を医薬品として用いるものであったが、最近は前記のように活性部位を設計したり、またファージディスプレイ法などによりペプチドをスクリーニングしたりすることにより、さらに標的分子に対する結合活性の優れたペプチド医薬品の開発が進められている。このような標的分子に特異的に強く結合する標的結合ペプチド（機能性ペプチド）は疾患治療薬だけでなく、診断薬としても有望であり、優れた標的結合ペプチドの選択が期待されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】特開２０１５−１５１３８６号公報

【特許文献2】特開２０１５−８４６９４号公報

【特許文献3】特開２０１４−２３７５９９号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

本発明者らは、標的分子に結合する標的結合ペプチドについて、研究していたところ、標的結合ペプチドは、３〜１５アミノ酸程度の比較的短鎖のペプチドであるため、単独では、構造がゆらぐことが分かってきた。そして、標的結合ペプチドは、構造がゆらぐために、標的分子との結合が不安定となった。
本発明者らは、ゆらぎを抑制した標的結合ペプチドは、自由に構造変化できるペプチドよりも、標的分子に対する特異性が高く、結合力も強いことを見出した。すなわち、構造のゆらぎを抑制した標的結合ペプチドは、標的分子に対する特異性が高く、そして結合力が強いことから、新たな創薬シーズとなると考えられた。
従って、本発明の目的は、標的結合ペプチドのゆらぎを抑制する方法を提供することである。すなわち、標的結合ペプチドの安定化方法を提供することである。

【課題を解決するための手段】

【0005】

本発明者は、標的結合ペプチドの安定化方法について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、特定の足場タンパク質のループを含む構造領域を標的結合ペプチドに置換することによって、標的結合ペプチドのゆらぎが抑制され、標的結合ペプチドが安定化することを見出した。そして、前記足場タンパク質は、ループを含む構造領域であって、根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である領域を、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質であることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、
［１］足場タンパク質のループ構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の置換領域を、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である前記足場タンパク質において、前記置換領域を３〜１５のアミノ酸からなる標的結合ペプチドに置換することを特徴とする標的結合ペプチドの安定化方法、
［２］前記足場タンパク質の鎖長が、２０〜１３０である、［１］に記載の標的結合ペプチドの安定化方法、
［３］前記足場タンパク質がドメイン構造を含むタンパク質である、［１］又は［２］に記載の標的結合ペプチドの安定化方法、
［４］前記足場タンパク質が、結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析されたタンパク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載の標的結合ペプチドの安定化方法、
［５］前記連続基準ペプチドの長さと、標的結合ペプチドの長さとが同じである、［１］〜［４］のいずれかに記載の標的結合ペプチドの安定化方法、
［６］前記置換領域が３〜１５のアミノ酸鎖長である、［１］〜［５］のいずれかに記載の標的結合ペプチドの安定化方法、
［７］ループ構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の置換領域を有する足場タンパク質候補において、前記置換領域を連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換し、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質を選択する足場タンパク質のスクリーニング方法、
［８］前記足場タンパク質の鎖長が、２０〜１３０である、［７］に記載の足場タンパク質のスクリーニング方法、
［９］前記足場タンパク質がドメイン構造を含むタンパク質である、［７］又は［８］に記載の足場タンパク質のスクリーニング方法、
［１０］前記足場タンパク質が、結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析されたタンパク質である、［７］〜［９］のいずれかに記載の足場タンパク質のスクリーニング方法、
［１１］前記置換領域が３〜１５のアミノ酸鎖長である、［７］〜［１０］のいずれかに記載の足場タンパク質のスクリーニング方法、
［１２］置換領域が除去された２０〜１３０残基の鎖長の足場タンパク質であって、前記置換領域が足場タンパク質のループを含む構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の領域であり、そして前記置換領域を連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である、足場タンパク質、
［１３］配列番号７で表されるフィブロネクチンIII型から置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号７で表されるアミノ酸配列の第２４〜２９アミノ酸、第５１〜５６アミノ酸、又は第２４〜３０アミノ酸配列である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［１４］配列番号８で表されるオメガコノトキシンMVIIAから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号８で表されるアミノ酸配列の第２〜７アミノ酸、又は第９〜１４アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［１５］配列番号９で表されるＲａｌＧＥＦのＲａｓ結合ドメインから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号９で表されるアミノ酸配列の第４１〜４６アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［１６］配列番号１０で表されるsAb軽鎖（３ＰＧＦ）のCLドメインから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１０で表されるアミノ酸配列の第３０〜３５アミノ酸、又は第４４〜４９アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［１７］配列番号１１で表されるValpha24(-) NKT TCRのIgドメインから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１１で表されるアミノ酸配列の第４５〜５０アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［１８］配列番号１２で表されるCXCL4L1から置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１２で表されるアミノ酸配列の第６〜１１アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［１９］配列番号１３で表されるCXCL13から置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１３で表されるアミノ酸配列の第５〜１０アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［２０］配列番号１４で表されるオメガアガトキシンから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１４で表されるアミノ酸配列の第２８〜３３アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［２１］配列番号１５で表されるＭｕ−アガトキシンから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号１５で表されるアミノ酸配列の第３〜８アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、
［２２］配列番号５６で表されるＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインから置換領域が除去された足場タンパク質であって、前記置換領域が配列番号５６で表されるアミノ酸配列の第４６〜５１アミノ酸である、［１２］に記載の足場タンパク質、及び
［２３］［１２］〜［２２］に記載の足場タンパク質における除去された置換領域を、３〜１５のアミノ酸からなる標的結合候補ペプチドと置換している、標的結合ペプチドをスクリーニングするためのライブラリー、
に関する。

【発明の効果】

【0006】

本発明の標的結合ペプチドの安定化方法によれば、標的結合ペプチドのゆらぎを抑制し、安定化することができる。また、標的結合ペプチドは、短鎖であるため、そのままでは、生体内で急速に分解されてしまうが、本発明の標的結合ペプチドの安定化方法により、生体内で分解されにくくなり、治療薬として生体内における半減期を延長させることができる。また、標的結合ペプチドとして抗体の抗原結合部位を用いることにより、抗原結合部位を安定化することができる。従って、安定化された抗原結合部位を有する足場タンパク質は、抗体医薬の抗体代替分子として用いることができる。

【図面の簡単な説明】

【0007】

【図1】本発明の標的結合ペプチドの安定化方法を模式的に示した図である。

【図2】フィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番（配列番号７）の第２４〜２９アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質１（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図3】フィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番（配列番号７）の第５１〜５６アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質２（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図4】オメガコノトキシンＭＶＩＩＡ（１ＴＴＫ）の１〜２５番（配列番号８）の第２〜７アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質３（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図5】オメガコノトキシンＭＶＩＩＡ（１ＴＴＫ）の１〜２５番（配列番号８）の第９〜１４アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質４（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図6】ＲａｌＧＥＦのＲａｓ結合ドメイン（２ＲＧＦ）の１１〜９７番（配列番号９）の第４１〜４６アミノ酸（ＲａｌＧＥＦの第５１〜５６アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質５（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図7】ｓＡｂ軽鎖（３ＰＧＦ）の１１１〜２１３番のアミノ酸であるＣＬドメイン（配列番号１０）の第３０〜３５アミノ酸（ｓＡｂ軽鎖の第１４０〜１４５アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質６（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図8】ｓＡｂ軽鎖（３ＰＧＦ）の１１１〜２１３番のアミノ酸であるＣＬドメイン（配列番号１０）の第４４〜４９アミノ酸（ｓＡｂ軽鎖の第１５４〜１５９アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質７（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図9】ｓＶａｌｐｈａ２４（−）ＮＫＴ ＴＣＲ（４ＥＮ３）の１〜９９番のアミノ酸であるＩｇドメイン（配列番号１１）の第４５〜５０アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質８（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図10】ＣＸＣＬ４Ｌ１（４ＨＳＶ）の９〜５４番のアミノ酸（配列番号１２）の第６〜１１アミノ酸（ＣＸＣＬ４Ｌ１の第１４〜１９アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質９（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図11】ＣＸＣＬ１３（４ＺＡＩ）の１０〜５５番のアミノ酸（配列番号１３）の第５〜１０アミノ酸（ＣＸＣＬ１３の第１４〜１９アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質１０（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図12】フィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の第２４〜３０アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質１１（Ａ）、前記置換領域を７連続アラニンペプチド、７連続グリシンペプチド、７連続プロリンペプチド、及び７連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域を他の７連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図13】オメガアガトキシンＩＶＡ（１ＯＶＡ）の１〜４８番のアミノ酸（配列番号１４）の第２８〜３３アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質１２（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図14】Ｍｕアガトキシン−Ｉ（１ＥＩＴ）の１〜３６番のアミノ酸（配列番号１５）の第３〜８アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質１３（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図15】Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメイン（３ＷＡ４）の５７〜１５２番のアミノ酸（配列番号１６）の第８５〜９０アミノ酸（Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメインの第１４１〜１４６アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質１（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図16】エラフィン（１ＦＬＥ）の１１〜５７番のアミノ酸（配列番号１７）の第１４〜１９アミノ酸（エラフィンの第２４〜２９アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質２（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図17】フィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の第６２〜６７アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質３（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図18】βspectrin由来CHドメイン（１ＢＫＲ）の２〜１０９番のアミノ酸（配列番号１８）の第５０〜５５アミノ酸（βspectrin由来CHドメインの第５１〜５６アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質４（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図19】Ｇｒｂ７タンパク質由来のＲＡドメイン（１ＷＧＲ）の１〜１００番のアミノ酸（配列番号１９）の第４４〜４９アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質５（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図20】ＭＥＫＫ３のＰＢ１ドメイン（２ＰＰＨ）の１〜９３番のアミノ酸（配列番号２０）の第４６〜５１アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質６（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図21】Ephrin type-B receptor 4のSAMドメイン（２ＱＫＱ）の９０８〜９６８番のアミノ酸（配列番号２１）の第２８〜３３アミノ酸（Ephrin type-B receptor 4のSAMドメインの第９３５〜９４０アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質７（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図22】Protein kinase C, deltaのC1ドメイン（２ＹＵＵ）の１〜８３番のアミノ酸（配列番号２２）の第３９〜４４アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質８（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図23】Human intersectin-1タンパク質のEH 1ドメイン（３ＦＩＡ）の６〜１０３番のアミノ酸（配列番号２３）の第２８〜３３アミノ酸（Human intersectin-1タンパク質のEH 1ドメインの第３３〜３８アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質９（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図24】ZO-1 MAGUKタンパク質のPDZドメイン（３ＴＳＶ）の４２０〜５１２番のアミノ酸（配列番号２４）の第３５〜４０アミノ酸（ZO-1 MAGUKタンパク質のPDZドメインの第４５４〜４５９アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質１０（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図25】Fyn SH3ドメイン（３ＵＡ７）の８１〜１４３番のアミノ酸（配列番号２５）の第３３〜３８アミノ酸（Fyn SH3ドメインの第１１３〜１１８アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質１１（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図26】Cytochrome c（３ＺＣＦ）の４〜１０３番のアミノ酸（配列番号２６）の第１８〜２３アミノ酸（Cytochrome cの第２１〜２６アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質１２（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図27】Muscarinic toxin 2（１ＦＦ４）の１〜６５番のアミノ酸（配列番号２７）の第４８〜５３アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質１３（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【図28】IgG1 CH2ドメイン（４ＤＺ８）の２３８〜３４１番のアミノ酸（配列番号５６）の第４６〜５１アミノ酸（IgG1 CH2ドメインの第２８３〜２８８アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質１４（Ａ）、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｂ）、及び前記置換領域をＨＢＰ、ＩＢＰ、及び他の６連続アミノ酸ペプチドに置換した場合の根平均二乗揺らぎ値（Ｃ）を示した図である。

【発明を実施するための形態】

【0008】

［１］標的結合ペプチドの安定化方法
本発明の標的結合ペプチドの安定化方法は、足場タンパク質のループを含む構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の置換領域を、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である前記足場タンパク質において、前記置換領域を３〜１５のアミノ酸からなる標的結合ペプチドに置換することを特徴とする。

【0009】

《足場タンパク質》
足場タンパク質は、ループ構造を有する限りにおいて、限定されるものではない。本発明に用いる足場タンパク質においては、ループを含む構造中の３〜１５のアミノ酸からなる置換領域を、標的結合ペプチドと置換する。すなわち、前記足場タンパク質は、標的結合タンパク質を挿入するために、ループ構造を有するものである。

【0010】

タンパク質は、αへリックス、βシートを有し、ループ構造は、αへリックス及びβシート、αへリックス及びαへリックス、又はβシート及びβシート等をつなぐ部分である。
αへリックスは、１本のポリペプチド主鎖が、規則正しくらせん状の構造を示すものであり、すべてのペプチド結合が水素結合を形成している。従って、エネルギー的に安定な状態の構造である。らせん状構造は右巻きであり、アミノ酸残基の側鎖は、らせん状構造の外側に突き出している。らせん状構造の１ピッチは０．５４ｎｍであり、１ピッチの間に３．６アミノ酸残基が存在する。αへリックスは、多くの球状タンパク質に存在する二次構造である。また、アミノ酸残基には、αへリックスを形成しやすいものと、αへリックスを破壊しやすいものとがある。
βシートは、平行に配置された２本のポリペプチド主鎖が、水素結合によって固定された構造である。２本のポリペプチド主鎖の方向が同じ構造を平行βシートと称し、反対方向の構造を逆平行βシートと称することがある。また、βシートは３本以上のポリペプチド鎖が平行に並んでいてもよい。βシートは、球状タンパク質の骨組みになっている場合が多い。アミノ酸残基には、βシートを形成しやすいものと、βシートを形成しにくいものが存在する。
タンパク質の三次構造においては、前記のαへリックス及びβシートの二つの二次構造が、ひも状のループ構造によって結合されている。ループ構造の長さ及び構造は、特に限定されないが、３〜２０アミノ酸からなるものが多い。また、２〜４アミノ酸残基からなり、ポリペプチド主鎖がＵ字型のループ構造を、ターンと称することがある。
多くのタンパク質では、いくつかのαへリックス及びβシート等が、ループ構造によって連結され、独立した球状のドメイン構造を形成している。ドメイン構造は、通常２０〜３５０のアミノ酸残基の鎖長を有しており、そして前記αへリックス、βシート、及びループ構造の二次構造の組み合わされた三次構造である。そして、２つ以上のドメイン構造が組み合わされて、１つのタンパク質を形成していることが多い。
タンパク質の二次構造であるαへリックス、βシート及びループ構造、並びに三次構造であるドメイン構造は、タンパク質のアミノ酸配列から、ソフトウエアによって予測することもできる。しかしながら、正確にはタンパク質の結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析により、αへリックス、βシート、ループ構造、及びドメイン構造を同定することができる。
従って、前記足場タンパク質は、限定されるものでないが、好ましくは結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析された足場タンパク質である。結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析された足場タンパク質であることにより、ループを含む構造を正確に特定することが可能である。

【0011】

《ドメイン構造》
本発明に用いる足場タンパク質は、限定されるものではないが、好ましくはドメイン構造を含む。例えば、実施例３又は４に記載の足場タンパク質は、ドメイン構造を有するものではないが、充分にペプチドの揺らぎを抑制することができる。しかしながら、足場タンパク質全体の安定性を向上させるために、ドメイン構造を含むものが好ましい。また、足場タンパク質は、ドメイン構造からなるものでもよい。ドメイン構造は、αへリックス、βシート、及びループ構造を含む。ドメイン構造に含まれるαへリックス、βシート、及びループ構造のそれぞれの数は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではない。しかしながら、αへリックスは好ましくは１〜２０であり、さらに好ましくは１〜８である。βシートは、好ましくは１〜２５であり、さらに好ましくは１〜１０である。ループ構造は、好ましくは１〜３０であり、さらに好ましくは１〜１２である。足場タンパク質は、ドメイン構造を含むことにより、ループ構造の置換領域に組み込まれた標的結合ペプチドを効果的に安定化させることができる。

【0012】

《ループ構造》
本発明に用いる足場タンパク質はル−プ構造を含む。足場タンパク質のループ構造は、αへリックス及びβシート等を結合させる構造である。ループ構造のアミノ酸配列の長さは、特に限定されるものではないが、好ましくは３〜２０アミノ酸であり、より好ましくは３〜１５アミノ酸である。ループ構造は、タンパク質のアミノ酸配列から、ソフトウエアによって予測することもできるが、タンパク質の結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析から特定されたループ構造が好ましい。

【0013】

《置換領域》
足場タンパク質のループ構造は、置換領域を含む。置換領域は、標的結合ペプチドと置換される領域である。置換領域は、足場タンパク質の野生型のアミノ酸配列において根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である領域である限りにおいて、その野生型のアミノ酸配列は限定されない。置換領域の野生型のアミノ酸の鎖長は、標的結合ペプチドを安定化できる限りにおいて、特に限定されるものではないが、好ましくは３〜１５アミノ酸であり、より好ましくは３〜１３アミノ酸であり、さらに好ましくは４〜１０アミノ酸であり、さらに好ましくは５〜８アミノ酸であり、最も好ましくは６又は７アミノ酸である。

【0014】

《連続基準ペプチド》
本発明に用いる足場タンパク質は、置換領域を、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換した場合に、それらの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）値が１．５Å以下である。連続基準ペプチドの長さは、特に限定されるものではないが、好ましくは３〜１５アミノ酸であり、好ましくは４〜１２アミノ酸であり、より好ましくは５〜１０アミノ酸であり、更に好ましくは５〜８アミノ酸であり、最も好ましくは６又は７アミノ酸である。例えば、本明細書において、６連続アラニンペプチドとは、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ（Ａ６：配列番号１）である。６連続グリシンペプチドとは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（Ｇ６：配列番号２）である。６連続プロリンペプチドとは、Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（Ｐ６：配列番号３）である。６連続セリンペプチドとは、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（Ｓ６：配列番号４）である。表１に纏めて記載する。

【0015】

【表1】

【0016】

《根平均二乗揺らぎ値》
前記本発明に用いる足場タンパク質は、置換領域が連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドに置換された場合に、それらの連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）値が１．５Å以下である。ＲＭＳＦ値は、分子動力学計算によって求めることができる。具体的には、足場タンパク質の結晶構造あるいはＮＭＲ溶液構造の置換領域を、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、又は連続セリンペプチドに置換した分子モデルを構築し、Amber14プログラムパッケージでそれぞれのペプチドのRMSF値を計算する。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME2.5において10 nsの計算を行う。
これらの４つの連続基準ペプチドのＲＭＳＦ値が１．５Å以下である場合は、標的結合ペプチドを、安定化することができる。連続アミノ酸ペプチドのＲＭＳＦ値は、好ましくは１．４Å以下であり、より好ましくは１．３Å以下であり、さらに好ましくは１．２Å以下であり、最も好ましくは１．１Å以下である。ＲＭＳＦ値が１．５Å以下であることにより、標的結合ペプチドを効果的に安定化させることができる。

【0017】

《標的結合ペプチド》
本発明の標的結合ペプチドは、標的分子と結合することのできるペプチドである限りにおいて、特に限定されるものではない。しかしながら、例えば、ＨＥＲ２結合ペプチド（ＨＢＰ：Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ：配列番号５４）、インテグリン結合ペプチド（ＩＢＰ：Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ：配列番号５５）、アンギオテンシンII（H-Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-OH：配列番号５）、又はオキシトシン（Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly：配列番号６）を挙げることができる。これらの標的結合ペプチドを、足場タンパク質の置換領域と置換することにより、安定化させることができる。
標的結合ペプチドの長さは、例えば３〜１５アミノ酸であり、好ましくは４〜１２アミノ酸であり、より好ましくは５〜１０アミノ酸であり、更に好ましくは５〜８アミノ酸であり、最も好ましくは６又は７アミノ酸である。

【0018】

《連続基準ペプチドと標的結合ペプチドとの長さ》
前記連続基準ペプチドと標的結合ペプチドとの長さの関係は、本発明の効果が得られる限りにおいて、特に限定されるものではない。例えば、６連続基準ペプチドに置換した場合に根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質の置換領域を、７アミノ酸鎖長の標的結合ペプチドに置換しても、標的結合ペプチドを安定化することができる。しかしながら、好ましくは、６連続基準ペプチドに置換した場合に根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質の置換領域を、６アミノ酸鎖長の標的結合ペプチドに置換する。連続基準ペプチドと標的結合ペプチドとの長さが同じであることによって、より効果的に標的結合ペプチドを安定化することができるからである。
すなわち、連続基準ペプチドが３アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは３アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが４アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは４アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが５アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは５アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが６アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは６アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが７アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは７アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが８アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは８アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが９アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは９アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが１０アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは１０アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが１１アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは１１アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが１２アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは１２アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが１３アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは１３アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが１４アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは１４アミノ酸鎖長が好ましい。連続基準ペプチドが１５アミノ酸鎖長の場合は、標的結合ペプチドは１５アミノ酸鎖長が好ましい。

【0019】

《ＮＭＲ》
核磁気共鳴（Nuclear Magnetic Resonance:以下、ＮＭＲと称することがある）は、外部静磁場に置かれた原子核が固有の周波数の電磁波と相互作用する現象であるが、核磁気共鳴によるスペクトルを得る核磁気共鳴分光法（Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy）をＮＭＲと称することもある。ＮＭＲ法により固体試料や溶液試料の化合物の化学構造及び立体構造の解析、分子内の運動性等の解析を行うことができる。
本発明においては、ＮＭＲ法によって、足場タンパク質のαへリックス、βシート、ループ構造、及びドメイン構造を同定することができる。更に、ＮＭＲ法によって、置換された標的結合ペプチドの揺らぎを同定することができる。

【0020】

本発明に用いる足場タンパク質及び置換領域の具体的な例としては、限定されるものではないが、フィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の第２４〜２９アミノ酸の置換領域を挙げることができる。フィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の第５１〜５６アミノ酸の置換領域を挙げることができる。オメガコノトキシンMVIIA（１ＴＴＫ）の１〜２５番のアミノ酸（配列番号８）の第２〜７アミノ酸の置換領域を挙げることができる。オメガコノトキシンMVIIA（１ＴＴＫ）の１〜２５番のアミノ酸（配列番号８）の第９〜１４アミノ酸の置換領域を挙げることができる。RalGEFのRas結合ドメイン（２ＲＧＦ）の１１〜９７番のアミノ酸（配列番号９）の第４１〜４５（ＲａｌＧＥＦの第５１〜５６アミノ酸）の置換領域を挙げることができる。sAb軽鎖（３ＰＧＦ）の１１１〜２１３番のアミノ酸であるCLドメイン（配列番号１０）の第３０〜３５アミノ酸（sAb軽鎖の第１４０〜１４５アミノ酸）の置換領域を挙げることができる。sAb軽鎖（３ＰＧＦ）の１１１〜２１３番のアミノ酸であるCLドメイン（配列番号１０）の第４４〜４９アミノ酸（sAb軽鎖の第１５４〜１５９アミノ酸）の置換領域を挙げることができる。Valpha24(-) NKT TCR（４ＥＮ３）の１〜９９番のアミノ酸であるIgドメイン（配列番号１１）の第４５〜５０アミノ酸の置換領域を挙げることができる。CXCL4L1（４ＨＳＶ）の９〜５４番のアミノ酸（配列番号１２）の第６〜１１アミノ酸（CXCL4L1の第１４〜１９アミノ酸）の置換領域を挙げることができる。CXCL13（４ＺＡＩ）の１０〜５５番のアミノ酸（配列番号１３）の第５〜１０アミノ酸（CXCL13の第１４〜１９アミノ酸）の置換領域を挙げることができる。フィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の第２４〜３０アミノ酸の置換領域を挙げることができる。オメガアガトキシン（１ＯＡＶ）の１〜４８番のアミノ酸（配列番号１４）の第２８〜３３アミノ酸の置換領域を挙げることができる。Ｍｕ−アガトキシン（１ＥＩＴ）の１〜３６番のアミノ酸（配列番号１５）の第３〜８アミノ酸の置換領域を挙げることができる。IgG1 CH2ドメイン（４ＤＺ８）の２３８〜３４１番のアミノ酸（配列番号５６）の第４６〜５１アミノ酸（IgG1 CH2ドメインの第２８３〜２８８アミノ酸）の置換領域を挙げることができる。

【0021】

前記足場タンパク質のループ構造の置換領域候補を、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの基準連続ペプチドに置換することによって、足場タンパク質の標的結合ペプチド固定性を確認することができる。すなわち、置換領域候補を、基準連続ペプチドに置換し、そしてそれらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値を計算する。根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である場合、足場タンパク質の標的結合ペプチドの固定性が良好であることを確認することができる。
従って、本明細書は、足場タンパク質のループを含む構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の置換領域を、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換し、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下であることを確認することによって、標的結合ペプチドを安定化できる足場タンパク質の同定方法を開示する。前記同定方法における足場タンパク質、置換領域、連続基準ペプチド、標的結合ペプチド、及び根平均二乗揺らぎ値等は、上記に記載のものである。

【0022】

本発明の標的結合ペプチドの安定化方法による安定化された標的結合ペプチドを含む足場タンパク質は、ペプチド医薬として、用いることができる。また、本発明の標的結合ペプチドの安定化方法における標的結合ペプチドを標的結合ペプチド候補とすることにより、安定化された標的結合ペプチド候補を含む足場タンパク質は、標的結合ペプチドライブラリーとして用いることができる。

【0023】

［２］足場タンパク質のスクリーニング方法
本発明の足場タンパク質のスクリーニング方法は、ループ構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の置換領域を有する足場タンパク質候補において、前記置換領域を連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換し、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質を選択することを特徴とする。前記連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質は、その置換領域に標的結合ペプチドを組込んだ場合に、標的結合ペプチドを安定化することができる。

【0024】

本発明のスクリーニング方法においてスクリーニングされる足場タンパク質候補の鎖長、置換領域、ドメイン構造、及びループ構造などの特徴は、前記連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値を除いて、前記「［１］標的結合ペプチドの安定化方法」の足場タンパク質と同じであり、前記連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質を本発明のスクリーニング方法によって選択できる。また、根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）値の測定は、前記の方法によって実施することができる。

【0025】

具体的な足場タンパク質のスクリーニング方法は、ループ構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の置換領域を有する足場タンパク質候補を決定し、置換領域を連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換して、ＲＭＳＦ値を計算する。そして、この４つの連続基準ペプチドの全てのＲＭＳＦ値が１．５Å以下である足場タンパク質を選択する。

【0026】

［３］足場タンパク質
本発明の足場タンパク質は、置換領域が除去された２０〜１３０残基の鎖長の足場タンパク質であって、前記置換領域が足場タンパク質のループを含む構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の領域であり、そして前記置換領域を連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である足場タンパク質である。本発明の足場タンパク質は、前記［１］標的結合ペプチドの安定化方法」に記載の足場タンパク質である。本発明の足場タンパク質の置換領域を３〜１５のアミノ酸からなる標的結合ペプチドに置換すると、標的結合タンパク質を得ることができる。

【0027】

１つの足場タンパク質としては、配列番号７で表されるフィブロネクチンIII型から置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号７で表されるアミノ酸配列の第２４〜２９アミノ酸、第５１〜５６アミノ酸、又は第２４〜３０アミノ酸配列である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号８で表されるオメガコノトキシンMVIIAから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号８で表されるアミノ酸配列の第２〜７アミノ酸、又は第９〜１４アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号９で表されるＲａｌＧＥＦのＲａｓ結合ドメインから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号９で表されるアミノ酸配列の第４１〜４６アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号１０で表されるsAb軽鎖（３ＰＧＦ）のCLドメインから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１０で表されるアミノ酸配列の第３０〜３５アミノ酸、又は第４４〜４９アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号１１で表されるValpha24(-) NKT TCRのIgドメインから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１１で表されるアミノ酸配列の第４５〜５０アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号１２で表されるCXCL4L1から置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１２で表されるアミノ酸配列の第６〜１１アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号１３で表されるCXCL13から置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１３で表されるアミノ酸配列の第５〜１０アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号１４で表されるオメガアガトキシンから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１４で表されるアミノ酸配列の第２８〜３３アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号１５で表されるＭｕ−アガトキシンから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１５で表されるアミノ酸配列の第３〜８アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。
また１つの足場タンパク質としては、配列番号５６で表されるIgG1 CH2ドメインから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号５６で表されるアミノ酸配列の第４６〜５１アミノ酸である足場タンパク質を挙げることができる。

【0028】

［４］ライブラリー
本発明のライブラリーは、前記足場タンパク質における除去された置換領域を、３〜１５のアミノ酸からなる標的結合候補ペプチドと置換されたものであり、標的結合ペプチドをスクリーニングするためのライブラリーである。
すなわち、標的結合候補ペプチド及び２０〜１３０残基の鎖長の足場タンパク質を含むタンパク質を含むライブラリーであって、前記標的結合候補ペプチドが３〜１５のアミノ酸からなる標的結合候補ペプチドであり、そして足場タンパク質の置換領域と置換されており、前記置換領域が足場タンパク質のループを含む構造における根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下の領域であり、そして前記置換領域を連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下であるライブラリーである。

【0029】

１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号７で表されるフィブロネクチンIII型から置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号７で表されるアミノ酸配列の第２４〜２９アミノ酸、第５１〜５６アミノ酸、又は第２４〜３０アミノ酸配列であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号８で表されるオメガコノトキシンMVIIAから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号８で表されるアミノ酸配列の第２〜７アミノ酸、又は第９〜１４アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号９で表されるＲａｌＧＥＦのＲａｓ結合ドメインから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号９で表されるアミノ酸配列の第４１〜４６アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号１０で表されるsAb軽鎖（３ＰＧＦ）のCLドメインから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１０で表されるアミノ酸配列の第３０〜３５アミノ酸、又は第４４〜４９アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号１１で表されるValpha24(-) NKT TCRのIgドメインから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１１で表されるアミノ酸配列の第４５〜５０アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号１２で表されるCXCL4L1から置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１２で表されるアミノ酸配列の第６〜１１アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号１３で表されるCXCL13から置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１３で表されるアミノ酸配列の第５〜１０アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号１４で表されるオメガアガトキシンから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１４で表されるアミノ酸配列の第２８〜３３アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号１５で表されるＭｕ−アガトキシンから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号１５で表されるアミノ酸配列の第３〜８アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。
また１つのライブラリーとしては、足場タンパク質が配列番号５６で表されるIgG1 CH2ドメインから置換領域を除去したものであり、前記置換領域が配列番号５６で表されるアミノ酸配列の第４６〜５１アミノ酸であるライブラリーを挙げることができる。

【0030】

標的結合候補ペプチドは、特に限定されるものではなく、薬剤スクリーニングなどに用いるペプチドライブラリーのペプチドなどを用いることができる。

【0031】

（作用）
本発明の標的結合ペプチドの安定化方法において、標的結合ペプチドの揺らぎが抑制される理由は、完全に解明されているわけではないが、以下のように推論することができる。しかしながら、本発明は以下の説明によって限定されるものではない。
図１に示すように、本発明において提示される標的結合ペプチドは、標的分子に結合するタンパク質である。すなわち、足場タンパク質の表面に提示され、標的分子と結合することが好ましい。従って、足場タンパク質の置換領域は、足場タンパク質の表面のループ構造に存在するものであり、換言すれば置換領域はループ構造であるか、ループ構造を含むものである。また、置換領域が表面に存在することは、タンパク質の結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析によって確認することができるため、好ましくは、足場タンパク質は結晶構造解析又はＮＭＲ溶液構造解析が行われたタンパク質である。更に、置換領域は、野生型のペプチドの根平均二乗揺らぎ値（ＲＭＳＦ値）が１．５Å以下の領域を選択することが好ましく、野生型のペプチドの揺らぎが小さい置換領域を選択することにより、標的結合ペプチドの揺らぎを抑制することが可能になると推定される。しかしながら、野生型のペプチドの揺らぎが小さい領域を選択したとしても、揺らぎの小ささが野生型ペプチド自体の配列によることも考えられる。本発明においては、置換領域のペプチドを、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドに置換した場合に、それらのペプチドの根平均二乗揺らぎ値が１．５Å以下である置換領域に標的結合ペプチドを組み込むことにより、確実に標的結合ペプチドの揺らぎを抑制することができると考えられる。このことは、比較例３〜１３に示すように、足場タンパク質の野生型ペプチドのＲＭＳＦ値が１．５Å以下であっても、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドのいずれかのペプチドのＲＭＳＦ値が１．５Åを超えると、すべての組み込みペプチドのＲＭＳＦ値を１．５Å以下に抑制できないことから理解できる。一方、実施例１〜１１に示すように、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドのすべてのＲＭＳＦ値が１．５Å以下であると、すべての組み込みペプチドのＲＭＳＦ値を１．５Å以下に抑制できる。すなわち、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドは、標的結合ペプチドの揺らぎの優れた指標となるものである。

【実施例】

【0032】

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。

【0033】

《実施例１》
本実施例では、ＮＭＲ溶液構造解析されたフィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の平均ＲＭＳＦ値が０．８Åである第２４〜２９アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質１を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２Ａ）。第２４〜２９アミノ酸配列は、ＡＰＡＶＴＶ（配列番号２８）である。
まず、前記置換領域を６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、６連続プロリンペプチド、及び６連続セリンペプチドの連続基準ペプチドに置換して、根平均二乗揺らぎ値を計算した。そこで分子モデルを構築し、Amber14プログラムパッケージでそれぞれのペプチドの根平均二乗揺らぎ値を計算した。Amber ff14SB force field、GB/SA implicit solvent modelを使い、スーパーコンピューターTSUBAME2.5において10 nsの計算を行った。
図２Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。

【0034】

次に、前置置換領域を、ＨＢＰ（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ）、及びＩＢＰ（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）のペプチドに置換し、根平均二乗揺らぎ値を計算した。ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、０．７５Å及び０．７１Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図２Ｃ）。更に、置換領域をシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、トレオニン、バリン、トリプトファン、又はチロシンのそれぞれの６連続アミノ酸ペプチドに置換し、根平均二乗揺らぎ値を計算した。全ての６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図２Ｃ）。

【0035】

《実施例２》
本実施例では、ＮＭＲ溶液構造解析されたフィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の平均ＲＭＳＦ値が０．９１Åである第５１〜５６アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質２を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図３Ａ）。第５１〜５６アミノ酸配列は、ＰＧＳＫＳＴ（配列番号２９）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質２を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図３Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、０．９４Å及び１．４１Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図３Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図３Ｃ）。

【0036】

《実施例３》
本実施例では、ＮＭＲ溶液構造解析されたオメガコノトキシンMVIIA（１ＴＴＫ）の１〜２５番のアミノ酸（配列番号８）の平均ＲＭＳＦ値が０．７３Åである第２〜７アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質３を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図４Ａ）。第２〜７アミノ酸配列は、ＫＧＫＧＡＫ（配列番号３０）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質３を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図４Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、０．９９Å及び０．７５Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図４Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図４Ｃ）。

【0037】

《実施例４》
本実施例では、ＮＭＲ溶液構造解析されたオメガコノトキシンMVIIA（１ＴＴＫ）の１〜２５番のアミノ酸（配列番号８）の平均ＲＭＳＦ値が０．７３Åである第９〜１４アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質４を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図５Ａ）。第９〜１４アミノ酸配列は、ＳＲＬＭＹＤ（配列番号３１）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質４を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図５Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、１．３９Å及び１．３７Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図５Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図５Ｃ）。

【0038】

《実施例５》
本実施例では、ＮＭＲ溶液構造解析されたＲａｌＧＥＦのＲａｓ結合ドメイン（２ＲＧＦ）の１１〜９７番のアミノ酸（配列番号９）の平均ＲＭＳＦ値が１．１０Åである第４１〜４６アミノ酸（ＲａｌＧＥＦの第５１〜５６アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質５を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図６Ａ）。第４１〜４６アミノ酸配列は、ＬＥＥＥＥＰ（配列番号３２）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質５を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図６Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、１．０２Å及び１．０５Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図６Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図６Ｃ）。

【0039】

《実施例６》
本実施例では、結晶構造解析されたsAb軽鎖（３ＰＧＦ）の１１１〜２１３番のアミノ酸であるCLドメイン（配列番号１０）の平均ＲＭＳＦ値が０．８４Åである第３０〜３５（sAb軽鎖の第１４０〜１４５アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質６を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図７Ａ）。第３０〜３５アミノ酸配列は、ＹＰＲＥＡＫ（配列番号３３）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質６を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図７Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、１．１７Å及び１．２７Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図７Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図７Ｃ）。

【0040】

《実施例７》
本実施例では、結晶構造解析されたsAb軽鎖（３ＰＧＦ）の１１１〜２１３番のアミノ酸であるCLドメイン（配列番号１０）の平均ＲＭＳＦ値が０．７５Åである第４４〜４９アミノ酸（sAbの第１５４〜１５９アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質７を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図８Ａ）。第４４〜４９アミノ酸配列は、ＬＱＳＧＮＳ（配列番号３４）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質７を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図８Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、１．１５Å及び０．９０Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図８Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図８Ｃ）。

【0041】

《実施例８》
本実施例では、結晶構造解析されたValpha24(-) NKT TCR（４ＥＮ３）の１〜９９番のアミノ酸であるIgドメイン（配列番号１１）の平均ＲＭＳＦ値が０．５７Åである第４５〜５０アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質８を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図９Ａ）。第４５〜５０アミノ酸配列は、ＲＩＥＫＶＥ（配列番号３５）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質８を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図９Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、０．８４Å及び０．８５Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図９Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図９Ｃ）。

【0042】

《実施例９》
本実施例では、結晶構造解析されたCXCL4L1（４ＨＳＶ）の９〜５４番のアミノ酸（配列番号１２）の平均ＲＭＳＦ値が１．０６Åである第６〜１１アミノ酸（CXCL4L1の第１４〜１９アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質９を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１０Ａ）。第６〜１１アミノ酸配列は、ＫＴＴＳＱＶ（配列番号３６）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質９を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１０Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、１．３５Å及び１．１１Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図１０Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図１０Ｃ）。

【0043】

《実施例１０》
本実施例では、結晶構造解析されたCXCL13（４ＺＡＩ）の１０〜５５番のアミノ酸（配列番号１３）の平均ＲＭＳＦ値が１．４６Åである第５〜１０アミノ酸（CXCL13の第１４〜１９アミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質１０を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１１Ａ）。第第５〜１０アミノ酸配列は、ＶＱＥＳＳＶ（配列番号３７）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質１０を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１１Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、１．２０Å及び１．０５Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図１１Ｃ）。更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図１１Ｃ）。

【0044】

《実施例１１》
本実施例では、ＮＭＲ溶液構造解析されたフィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の平均ＲＭＳＦ値が０．８３Åである第２４〜３０アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質１１を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１２Ａ）。第２４〜３０アミノ酸配列は、ＡＰＡＶＴＶＲ（配列番号３８）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質１１を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１２Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
他の７連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図１３Ｃ）。

【0045】

《実施例１２》
本実施例では、結晶構造解析されたオメガアガトキシン（１ＯＡＶ）の１〜４８番のアミノ酸（配列番号１４）の平均ＲＭＳＦ値が１．２１Åである第２８〜３３アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質１２を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１３Ａ）。第２８〜３３アミノ酸配列は、ＳＩＭＧＴＮ（配列番号３９）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質１２を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１３Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、１．２４Å及び１．０９Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図１３Ｃ）。
更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図１３Ｃ）。

【0046】

《実施例１３》
本実施例では、結晶構造解析されたＭｕ−アガトキシン（１ＥＩＴ）の１〜３６番のアミノ酸（配列番号１５）の平均ＲＭＳＦ値が０．５４Åである第３〜８アミノ酸を置換領域とする足場タンパク質１３を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１４Ａ）。第３〜８アミノ酸配列は、ＶＰＥＮＧＨ（配列番号４０）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質１３を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１４Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。ＨＢＰ及びＩＢＰの平均ＲＭＳＦ値は、０．８６Å及び０．７４Åであり、標的結合ペプチドの構造のゆらぎを抑制することができた（図１４Ｃ）。
更に、他の６連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図１４Ｃ）。

【0047】

《実施例１４》
本実施例では、結晶構造解析されたＩｇＧ１（４ＤＺ８）の２３８〜３４１番のアミノ酸であるＣＨ２ドメイン（配列番号５６）の平均ＲＭＳＦ値が０．９８Åである第４６〜５１アミノ酸（ＩｇＧ１の２８３〜２８８のアミノ酸）を置換領域とする足場タンパク質１４を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２８Ａ）。第４６〜５１アミノ酸配列は、ＥＶＨＮＡＫ（配列番号５７）である。
足場タンパク質１に代えて、足場タンパク質１４を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２８Ｂに示すように４つの連続基準ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Å以下であった。
他の７連続アミノ酸ペプチドの根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以下であり、ゆらぎが抑制されていた（図２８Ｃ）。

【0048】

実施例１〜１４の足場タンパク質の特徴を表２に示す。

【表2】

【0049】

《比較例１》
本比較例では、Ｇｒｂ２ ＳＨ２ドメイン（３ＷＡ４）の５７〜１５２番のアミノ酸（配列番号１６）の平均ＲＭＳＦ値が１．７０Åである第８５〜９０アミノ酸（Ｇｒｂ２の１４１〜１４６番のアミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質１を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１５Ａ）。第８５〜９０アミノ酸配列は、ＳＲＮＱＱＩ（配列番号４１）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質１を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１５Ｂに示すように６連続アラニンペプチド及び６連続セリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、６連続システインペプチドなどの４つのペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図１５Ｃ）。

【0050】

《比較例２》
本比較例では、エラフィン（１ＦＬＥ）の１１〜５７番のアミノ酸（配列番号１７）の平均ＲＭＳＦ値が１．７３Åである第１４〜１９アミノ酸（エラフィンの２４〜２９番のアミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質２を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１６Ａ）。第１４〜１９アミノ酸配列は、ＡＭＬＮＰＰ（配列番号４２）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質２を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１６Ｂに示すように６連続グリシンペプチド及び６連続プロリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、６連続システインペプチドなど１０のペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図１６Ｃ）。

【0051】

比較例１及び２に示すように、ループ含む置換領域の野生型アミノ酸配列の平均ＲＭＳＦ値が１．５Åを超える場合、標的結合ペプチドの構造の揺らぎを抑制することは困難であった。

【0052】

《比較例３》
本比較例では、フィブロネクチンIII型（１ＴＴＧ）の１〜９４番のアミノ酸（配列番号７）の平均ＲＭＳＦ値が１．０２Åである第６２〜６７アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質３を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１７Ａ）。第６２〜６７アミノ酸配列は、ＬＫＰＧＶＤ（配列番号４３）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質３を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１７Ｂに示すように６連続グリシンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、６連続イソロイシンペプチドなど２つのペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図１７Ｃ）。

【0053】

《比較例４》
本比較例では、βspectrin由来CHドメイン（１ＢＫＲ）の２〜１０９番のアミノ酸（配列番号１８）の第５０〜５５アミノ酸（βspectrin由来CHドメインの第５１〜５６アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質４を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１８Ａ）。第５０〜５５アミノ酸配列は、ＦＤＫＬＫＫ（配列番号４４）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質４を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１８Ｂに示すように６連続グリシンペプチド及び６連続セリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。比較足場タンパク質４に６連続グルタミンペプチドおよび標的結合ペプチドＨＢＰを挿入した場合、根平均二乗揺らぎ値は１．５Å以上となり、ゆらぎが抑制できなかった（図１８Ｃ）。

【0054】

《比較例５》
本比較例では、Ｇｒｂ７タンパク質由来のＲＡドメイン（１ＷＧＲ）の１〜１００番のアミノ酸（配列番号１９）の平均ＲＭＳＦ値が１．４４Åである第４４〜４９アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質５を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図１９Ａ）。第４４〜４９アミノ酸配列は、ＨＡＬＳＤＥ（配列番号４５）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質５を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図１９Ｂに示すように６連続セリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、６連続アスパラギン酸ペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図１９Ｃ）。

【0055】

《比較例６》
本比較例では、ＭＥＫＫ３のＰＢ１ドメイン（２ＰＰＨ）の１〜９３番のアミノ酸（配列番号２０）の平均ＲＭＳＦ値が１．０４Åである第４６〜５１アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質６を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２０Ａ）。第４６〜５１アミノ酸配列は、ＮＮＥＬＳＩ（配列番号４６）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質６を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２０Ｂに示すように６連続アラニンペプチド及び６連続プロリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、ＩＢＰなどの４つペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図２０Ｃ）。

【0056】

《比較例７》
本比較例では、Ephrin type-B receptor 4のSAMドメイン（２ＱＫＱ）の９０８〜９６８番のアミノ酸（配列番号２１）の平均ＲＭＳＦ値が１．４６Åである第２８〜３３アミノ酸（Ephrin type-B receptor 4のSAMドメインの第９３５〜９４０アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質７を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２１Ａ）。第２８〜３３アミノ酸配列は、ＳＦＥＬＶＳ（配列番号４７）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質７を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２１Ｂに示すように６連続グリシンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、６連続アスパラギン酸ペプチドなどの３つのペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図２１Ｃ）。

【0057】

《比較例８》
本比較例では、Protein kinase C, deltaのC1ドメイン（２ＹＵＵ）の１〜８３番のアミノ酸（配列番号２２）の平均ＲＭＳＦ値が１．１５Åである第３９〜４４アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質８を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２２Ａ）。第３９〜４４アミノ酸配列は、ＷＧＬＮＫＱ（配列番号４８）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質８を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２２Ｂに示すように６連続プロリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、６連続バリンペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図２２Ｃ）。

【0058】

《比較例９》
本比較例では、Human intersectin-1タンパク質のEH 1ドメイン（３ＦＩＡ）の６〜１０３番のアミノ酸（配列番号２３）の平均ＲＭＳＦ値が１．０７Åである第２８〜３３アミノ酸（Human intersectin-1タンパク質のEH 1ドメインの第３３〜３８アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質９を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２３Ａ）。第２８〜３３アミノ酸配列は、ＫＰＩＳＧＦ（配列番号４９）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質９を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２３Ｂに示すように６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、及び６連続プロリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、ＨＢＰなどの３つのペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図２３Ｃ）。

【0059】

《比較例１０》
本比較例では、ZO-1 MAGUKタンパク質のPDZドメイン（３ＴＳＶ）の４２０〜５１２番のアミノ酸（配列番号２４）の平均ＲＭＳＦ値が０．９８Åである第３５〜４０アミノ酸（ZO-1 MAGUKタンパク質のPDZドメインの第４５４〜４５９アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質１０を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２４Ａ）。第３５〜４０アミノ酸配列は、ＳＰＡＡＫＥ（配列番号５０）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質１０を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２４Ｂに示すように６連続セリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、６連続グルタミン酸ペプチドなどの５つのペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図２４Ｃ）。

【0060】

《比較例１１》
本比較例では、Fyn SH3ドメイン（３ＵＡ７）の８１〜１４３番のアミノ酸（配列番号２５）の平均ＲＭＳＦ値が１．０４Åである第３３〜３８アミノ酸（Fyn SH3ドメインの第１１３〜１１８アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質１１を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２５Ａ）。第３３〜３８アミノ酸配列は、ＮＳＳＥＧＤ（配列番号５１）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質１１を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２５Ｂに示すように６連続グリシンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、６連続アスパラギン酸ペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図２５Ｃ）。

【0061】

《比較例１２》
本比較例では、Cytochrome c（３ＺＣＦ）の４〜１０３番のアミノ酸（配列番号２６）の平均ＲＭＳＦ値が０．８４Åである第１８〜２３アミノ酸（Cytochrome cの第２１〜２６アミノ酸）を置換領域とする比較足場タンパク質１２を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２６Ａ）。第１８〜２３アミノ酸配列は、ＥＫＧＧＫＨ（配列番号５２）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質１２を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２６Ｂに示すように６連続アラニンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、ＩＢＰなど２つのペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図２６Ｃ）。

【0062】

《比較例１３》
本比較例では、Muscarinic toxin 2（１ＦＦ４）の１〜６５番のアミノ酸（配列番号２７）の平均ＲＭＳＦ値が１．３０Åである第４８〜５３アミノ酸を置換領域とする比較足場タンパク質１３を用いて、ペプチドの安定化を実施した（図２７Ａ）。第４８〜５３アミノ酸配列は、ＫＶＤＮＮＤ（配列番号５３）である。
足場タンパク質１に代えて、比較足場タンパク質１３を用いたことを除いては、実施例１の操作を繰り返した。
図２７Ｂに示すように６連続アラニンペプチド、６連続グリシンペプチド、及び６連続セリンペプチドの根平均二乗揺らぎ値は、１．５Åを超えていた。ＨＢＰ、ＩＢＰ及び他の６連続アミノ酸ペプチドのうち、ＨＢＰなど５つのペプチドの平均ＲＭＳＦ値は、１．５Åを超えており、構造のゆらぎを抑制することができなかった（図２７Ｃ）。

【0063】

比較例３〜１３に示すように、ループ含む置換領域の野生型アミノ酸配列の平均ＲＭＳＦ値が１．５Å以下であっても、連続アラニンペプチド、連続グリシンペプチド、連続プロリンペプチド、及び連続セリンペプチドの連続基準ペプチドのいずれかのペプチドの平均ＲＭＳＦ値が１．５Åを超えた場合、標的結合ペプチドの構造の揺らぎを抑制することはできなかった。

【0064】

比較例１〜１３の足場タンパク質の特徴を表３に示す。

【表3】

【産業上の利用可能性】

【0065】

本発明の標的結合ペプチドの安定化方法は、ペプチド医薬に用いる標的結合ペプチドの標的分子への結合を改善することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変法や改良は本発明の範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]