特許 6873306 組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの吸着固定化発酵によってリシンを生産する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6873306

(24)【登録日】2021年4月22日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの吸着固定化発酵によってリシンを生産する方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/74 20060101AFI20210510BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210510BHJP

   C12P 13/08 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 11/02 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 11/14 20060101ALI20210510BHJP

   C12R 1/15 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/74 ZZNA

   C12N1/21

   C12P13/08 A

   C12N11/02

   C12N11/14

   C12R1:15

【請求項の数】10

【外国語出願】

【全頁数】38

(21)【出願番号】特願2020-207457(P2020-207457)

(22)【出願日】2020年12月15日

(65)【公開番号】特開2021-40659(P2021-40659A)

(43)【公開日】2021年3月18日

【審査請求日】2020年12月16日

(31)【優先権主張番号】202010176582.4

(32)【優先日】2020年3月13日

(33)【優先権主張国】CN

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】515352674

【氏名又は名称】南京工▲業▼大学

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】▲応▼ ▲漢▼杰

(72)【発明者】

【氏名】柳 ▲東▼

(72)【発明者】

【氏名】▲陳▼ 勇

(72)【発明者】

【氏名】欧▲陽▼ 平▲凱▼

(72)【発明者】

【氏名】▲劉▼ ▲慶▼国

(72)【発明者】

【氏名】牛 ▲歡▼青

(72)【発明者】

【氏名】余 斌

(72)【発明者】

【氏名】彭 西▲偉▼

(72)【発明者】

【氏名】雷 ▲鳴▼

(72)【発明者】

【氏名】曹 幸▲園▼

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０９３３７８５４（ＣＮ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０９２０７４１８（ＣＮ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ １／００−４１／００

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの、リシン発酵生産における使用であって、
前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲが不活性化されると共に、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅの発現が増加されることを特徴とする使用。

【請求項2】

前記細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるものであることを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項3】

前記アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるものであることを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項4】

前記発酵は固定化発酵であることを特徴とする請求項１に記載の使用。

【請求項5】

固形担体を含む培地において前記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを発酵させ、リシン発酵液を得ることを特徴とする請求項４に記載の使用。

【請求項6】

前記固形担体は綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ゼオライト、細菌セルロースフィルム、シルク、サトウキビバガス、トウモロコシの茎、活性炭、プラスチック、及びガラスの中の１つ又は複数の組み合わせであることを特徴とする請求項５に記載の使用。

【請求項7】

発酵培地における固形担体の使用量は１〜１００ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項５に記載の使用。

【請求項8】

培地における各成分の濃度は、グルコース８０〜３００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３０〜５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５〜１．５ｇ／Ｌ、糖蜜１０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１０〜２５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１００〜３００ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４０〜８０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム５〜１５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１５〜１５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．５〜２ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．５〜２ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５〜２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０〜５０ｇ／Ｌであり、溶媒は水であることを特徴とする請求項５に記載の使用。

【請求項9】

バッチの発酵が終了した毎に、得られた発酵液を新しい発酵培地に交換し、糖が全て消耗するまでに培養してリシン発酵液を得ることを特徴とする請求項５に記載の使用。

【請求項10】

前記発酵は、温度２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍ／ｍｉｎの条件で２０〜９０ｈ発酵することであることを特徴とする請求項５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、微生物及び発酵プロセス技術分野に属し、具体的には、組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの吸着固定化発酵によってリシンを生産する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ−リシンは、アスパラギン酸ファミリーに属するアミノ酸であって、人と動物に必要である自身合成できないアミノ酸の１つであり、飼料添加剤、食品強化剤、医薬品などの面に広く適用され、その中、リシン製品の９０％以上は飼料添加剤として用いられている。

【0003】

バイオフィルムは自然界に広く存在し、バイオフィルムの形成過程において、細菌の自身分泌による細胞外ポリマー（ＥＰＳ）はバイオフィルム形成の基質であり、層別散布という特徴を有し、細菌の粘着と会合の面で重要な役割を果たす。

【0004】

今、固定化連続発酵という技術は既に生産に実用化され、その中、バイオフィルムによる固定化連続発酵は有効になった。しかしながら、コリネバクテリウム・グルタミカムでは、バイオフィルムによる固定化連続発酵はあまり開示されない。

【0005】

コリネバクテリウム・グルタミカムは産業において重要な菌株であるが、その成膜力は極めて弱くて連続的発酵が困難であるため、当該菌株の分子修飾を行なってその成膜効果を強化させ、後期の固定化連続発酵を実現しなければならない。

【0006】

ｅＤＮＡによって担体への菌体の最初粘着及び菌体同士の粘着を強化させ、バイオフィルムの後期形成を促進すると共に、バイオフィルムの構造を安定化させることができるという検討があった。最初のバッチの細胞が担体に到達した直後、バイオフィルムの形成は開始し、細胞は初めて分泌してＤＮＡを生成し、ＤＮＡは担体と細胞との間のバインダーとして機能するため、細胞と担体は別れないようになり、そして同じように引き寄せられる。そして、細胞は多糖とタンパクを分泌してＤＮＡによるネット構造を強固させ、バイオフィルムは崩れにくくなる。

【0007】

従来、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを発現したコリネバクテリウム・グルタミカムと、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲをノックアウトしたコリネバクテリウム・グルタミカムを報告する特許があった。この２つの特許に採用された菌株は、いずれもプロリン生産に用いられたものである。プロリンはリシンに比べると、その代謝経路、生産菌株及び発酵条件は大きな差がある。本検討において、リシン生産の菌株発酵過程を検討して大量に試験したところ、１つの遺伝子を取り扱うではリシン産量の向上に限界があるが、２つの遺伝子を同時に取り扱うと、リシン産量が明らかに向上したということを発見した。そのため、リシンの産量を更に向上するために、リシン生産菌株の細胞外ヌクレアーゼ遺伝子ＥｘｅＲをノックアウトすると共に、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅの発現を増加させた。また、このような組換え菌株に好適である固定化バッチ式発酵方法も検討したが、組換え菌の固定化発酵はオリジナル菌のフリー発酵よりも、そのリシン産量が４９．６７％向上し、発酵性能は、単に細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲをノックアウトしたコリネバクテリウム・グルタミカムと、単にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカムよりも遥かに優れるものである。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0008】

本発明は、従来技術の不足に対して、従来技術においてリシン生産菌株の成膜力が弱くて固定化連続発酵に使用できない問題を解決し、リシンを生産する組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを提供し、コリネバクテリウム・グルタミカムの固定化成膜力を向上させた。

【0009】

本発明は更に、コリネバクテリウム・グルタミカムのバッチ毎の発酵周期が長すぎるという問題を解決し、上記組換えコリネバクテリウム・グルタミカムの固定化連続発酵によってリシンを生産する方法を提供し、コリネバクテリウム・グルタミカムのバッチ毎の発酵周期を短縮し、その固定化連続発酵における優位性を更に明らかにした。

【課題を解決するための手段】

【0010】

ｅＤＮＡの量を増加し、更に菌株の固定化成膜力を強化させるために、まず、コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞外ヌクレアーゼ遺伝子ＥｘｅＲをノックアウトし、また、ＥｘｅＲをノックアウトした上に、ＩＶ型分泌システムであるタンパクアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現し、ＤＮＡの分泌を促進して成膜効果を向上した。

【0011】

本発明は、上記した技術問題を解決するために、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲが不活性化されると共に、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅの発現が増加される組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを開示し、当該組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲをノックアウトすると共に、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現することにより構築される。

【0012】

その中、上記した細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲをノックアウトすると共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現するとは、遺伝子ノックアウト又は遺伝子不活性化の技術によってコリネバクテリウム・グルタミカムゲノムにおけるＥｘｅＲ遺伝子を不活性化させ、そして、ＥｘｅＲ遺伝子不活性化コリネバクテリウム・グルタミカムにおいて、遺伝子強化発現の技術によってＡＴＰａｓｅ酵素発現遺伝子を強化させることである。

【0013】

その中、上記のコリネバクテリウム・グルタミカムはＡＴＣＣ３１２６９である。

【0014】

その中、上記の細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１に示されるものである。

【0015】

その中、上記のアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅのヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるものである。

【0016】

上記の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムは、
（１）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに対してＰＣＲを実行して増幅し、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４に示すヌクレオチド配列のＥｘｅＲ遺伝子ノックアウトサイドの上流遺伝子断片ＥｘｅＲ−Ｒと下流遺伝子断片ＥｘｅＲ−Ｌを得る工程と、
（２）ノックアウトプラスミドｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆに対してＰＣＲを実行し、ｃｒＲＮＡ配列を増幅し、具体的には、Primer５とPrimer６を使用して、ＥｘｅＲゲノムノックアウトサイドで選別された２０ｂｐ ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１認識配列によってプラスミドでの元の認識配列を置換し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５に示すヌクレオチド配列のＥｘｅＲ−１を得る工程と、
（３）工程（１）で得られたＥｘｅＲ−Ｒ、ＥｘｅＲ−Ｌと工程（２）で得られたＥｘｅＲ−１ンを、ＡｐａＩ／ＳｗａＩ酵素切断されたｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆプラスミドにクローし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０に示すヌクレオチド配列のノックアウトプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲを得る工程、
（４）工程（３）で得られたノックアウトプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲをコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に導入し、スクリーニングしてＥｘｅＲ遺伝子がノックアウトされたコリネバクテリウム・グルタミカムを得、配列測定によって所望のように遺伝子をノックアウトしたかを検証する工程であって、配列測定サービスは蘇州ＪｉｎＷｅｉＺｈｉ生物科技有限会社により提供され、配列測定によって正しいと検証されたノックアウト菌株を△ＥｘｅＲ菌株と名付け、ＥｘｅＲ遺伝子を成功にノックアウトした後、配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示されるものである工程と、
（５）コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムに対してＰＣＲを実行し、ＡＴＰａｓｅ遺伝子を増幅し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６に示すヌクレオチド配列の、増幅されたＡＴＰａｓｅ遺伝子断片を得る工程と、
（６）工程（５）で得られたＡＴＰａｓｅ遺伝子断片を過剰発現プラスミドｐＸＭＪ１９にクローンし、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１に示すヌクレオチド配列の組換えプラスミドｐＸＭＪ１９＊ＡＴＰを得る工程と、
（７）工程（６）で得られた組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカム△ＥｘｅＲに導入し、スクリーニングし、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲがノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した組換えコリネバクテリウム・グルタミカム△ＥｘｅＲ＋ＡＴＰを得る工程と、
を含む方法によって構築される。

【0017】

工程（１）において、ＥｘｅＲ−Ｒ遺伝子設計を増幅するPrimerの配列として、Primer１のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７に示されるものであり、Primer２のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８に示されるものである。ＥｘｅＲ−Ｌ遺伝子設計を増幅するPrimerの配列として、Primer３のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９に示されるものであり、Primer４のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０に示されるものである。

【0018】

工程（１）において、上記したＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸するというサイクルを３０回繰り返すことによって行われる。

【0019】

工程（２）において、ＥｘｅＲ−１遺伝子設計を増幅するPrimerの配列として、Primer５のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１に示されるものであり、Primer６のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２に示されるものである。

【0020】

工程（２）において、上記したＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１０秒間延伸するというサイクルを３０回繰り返すことによって行われる。

【0021】

工程（５）において、ＡＴＰａｓｅ遺伝子設計を増幅するPrimerの配列として、Primer７のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３に示されるものであり、Primer８のヌクレオチド配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４に示されるものである。

【0022】

工程（５）において、上記したＰＣＲ増幅は、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸するというサイクルを３０回繰り返すことによって行われる。

【0023】

工程（６）において、上記の過剰発現プラスミドはｐＸＭＪ１９である。

【0024】

上記の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムによって発酵してリシンを生産する方法も、本発明の保護範囲内にある。

【0025】

好ましくは、上記発酵は固定化発酵であり、固形担体を含む培地において上記の組換えコリネバクテリウム・グルタミカムを発酵させ、リシン発酵液を得る工程を含む。

【0026】

具体的には、
（ｉ）組換えコリネバクテリウム・グルタミカムをシード培地に接種し、培養してシード液を得る工程と、
（ｉｉ）固定化担体を発酵培地にセットし、発酵培地にシード液を仕込み、バッチで発酵して発酵液を得る工程と、
を含む。

【0027】

その中、バッチの発酵が終了した毎に、得られた発酵液を新しい発酵培地に交換し、糖が全て消耗するまでに培養し、約７０ｈ発酵して終了させ、リシンを得た。その中、上記の糖はグルコース、糖蜜、ショ糖の３種の組み合わせである。

【0028】

工程（ｉ）において、シード培地における各成分の濃度は、ショ糖１５〜３５ｇ／Ｌ、ペプトン５〜１５ｇ／Ｌ、酵母パウダー１〜１０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５〜１０ｇ／Ｌ、七水硫酸マグネシウム０．１〜１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム５〜１５ｇ／Ｌ、尿素１〜５ｇ／Ｌであり、溶媒は水である。上記した培養は、２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍの条件で１０〜１４ｈ培養することである。

【0029】

工程（ｉｉ）において、上記の固定化担体は綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、ゼオライト、細菌セルロースフィルム、ゼオライト、シルク、サトウキビバガス、トウモロコシの茎、活性炭、プラスチック、及びガラスの中のいずれか１つ又は複数の組み合わせである。固定化担体をシート状、繊維状、マッシュ又はマイクロバルーンの形として作製してもよい。

【0030】

好ましくは、シード状の固定化担体を予備処理した。上記の予備処理は、固定化担体を２〜８ｃｍ×２〜８ｃｍの正方形（好ましく５ｃｍ×５ ｃｍ）にカットし、純水で洗浄してオーブンで乾燥した後、エチルアルコールに１ｈ浸漬し、純水で洗浄した後、沸騰水浴で１０〜４０ｍｉｎ（好ましくは２０ｍｉｎ）処理して乾燥することである。固定化担体の使用量は１〜１００ｇ／Ｌ発酵培地である。上記の滅菌は、１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌することである。

【0031】

工程（ｉｉ）において、発酵培地における各成分の濃度は、グルコース８０〜３００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム３０〜５０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．５〜１．５ｇ／Ｌ、糖蜜１０〜２５ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー１０〜２５ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１〜５ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１００〜３００ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００〜２００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド４０〜８０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム５〜１５ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ ５〜１５ｍｇ／Ｌ、硫酸銅０．５〜２ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛０．５〜２ｍｇ／Ｌ、ビオチン０．５〜２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム１０〜５０ｇ／Ｌであり、溶媒は水である。

【0032】

工程（ｉｉ）において、５００ｍＬの振盪フラスコ毎に発酵培地５０ｍＬを加え、１０％〜３０％（ｖ／ｖ）のシード液を播種し、２８〜３４℃、２００〜２５０ｒｐｍ／ｍｉｎの条件で６０〜９０ｈ（好ましくは７２ｈ）発酵した。

【0033】

その中、本願に係るリシンの代謝経路、生産菌株及び発酵条件は、プロリンと大きな差がある。本願における生産菌株はＡＴＣＣ３１２６９であるが、従来技術におけるリシン生産菌株はＡＴＣＣ１３０３２である。また、本願における発酵培地も、従来技術におけるリシンの発酵培地と異なる。なお、グルタミン酸発酵によるプロリン生産は、グルタミン酸を前駆体物質として変換することによって成されるが、発酵によるリシン生産の経路はもっと煩雑であり、また、その前駆体物質はα−ケトグルタル酸とアセチルコエンザイムエーＡである。

【発明の効果】

【0034】

本発明は従来技術に比べると、以下のメリットがある。
１）本発明は、コリネバクテリウム・グルタミカムの固定化発酵によってリシンを生産する方法を開示し、固定化材として繊維（綿繊維織物、不織布、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維、細菌セルロースフィルム、シルク、サトウキビバガス、及びトウモロコシの茎）を使用し、固定された菌体は繰り返して使用できる。

【0035】

２）本発明によると、大規模生産にもまだ実現されない、リシンの連続化（又は反復バッチ発酵による）生産が実現された。

【0036】

３）本発明によると、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲがノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカムを構築し、コリネバクテリウム・グルタミカムのｅＤＮＡ分泌が促進され、コリネバクテリウム・グルタミカムｅＤＮＡの分解が低減されるため、コリネバクテリウム・グルタミカムの固定化連続発酵はフリー発酵のオリジナル菌よりも、その産量が４９．６７％向上し、また、発酵周期が２９．１７％短縮された。小試験規模の産量は３０ｇ／Ｌ程度に達することができる。

【図面の簡単な説明】

【0037】

【図1】ｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲとｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰプラスミドのアガロースゲル電気泳動図である。その中、レーン１はオリジナルプラスミドｐＸＭＪ１９であり、レーン２は組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰであり、レーン３はｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆであり、レーン４はｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲであり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。オリジナルＭＪ１９プラスミドの大きさは６６０１ｂｐであるが、組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰの大きさは７７４１ｂｐである。図から分かるように、ＡＴＰａｓｅ遺伝子断片は、既に発現プラスミドｐＸＭＪ１９に挿入された。Ｍａｒｋｅｒの大きさは１２０００ｂｐである。

【図2】△ＥｘｅＲ菌株とオリジナル菌のゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲアガロースゲル電気泳動図である。その中、レーン１、２は△ＥｘｅＲ菌株ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物であり、レーン３、４はオリジナル菌株ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物であり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。プライマー９とプライマー１０を使用してノックアウト菌株のゲノムに対してＰＣＲを実行し、成功にノックアウトされた後の突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物は１４９４ｂｐであるが、コントロールの野生型菌は２６１９ｂｐである。Ｍａｒｋｅｒの大きさは５０００ｂｐである。

【図3】コリネバクテリウム・グルタミカムのオリジナル菌と組換え菌の電子顕微鏡図である。

【図4】コリネバクテリウム・グルタミカムのオリジナル菌、組換え菌、ＡＴＰ菌株、△ＥｘｅＲ菌株の固定発酵とフリー発酵の周期図である。

【図5】コリネバクテリウム・グルタミカムのオリジナル菌と組換え菌の、クリスタルバイオレット染色法によってバイオフィルム量を半定量的に計測する試験データである。

【図6】コリネバクテリウム・グルタミカムのオリジナル菌、組換え菌、ＡＴＰ菌株、△ＥｘｅＲ菌株の固定発酵とフリー発酵によるリシン産量の比較図である。

【発明を実施するための形態】

【0038】

以下の実施例によれば、本発明を更に明らかに理解できる。しかしながら、当業者にとって理解しやすいように、実施例に記載された内容はただ本発明を説明するためのものであり、請求の範囲に詳細に記述される本発明はこれに制限されるべきではない。
以下の実施例に用いられるプラスミドｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆとｐＸＭＪ１９は、武漢ＭｉａｏＬｉｎｇ生物科技有限会社から購入された。特に説明しない限り、全ての酵素はＴＡＫＡＲＡから購入され、プラスミド抽出・ゲル回収キットはＴＡＫＡＲＡから購入され、一段階クローニングキットは南京ＮｕｏＷｅｉＺａｎ生物科技有限会社から購入された。Ｌ−リシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌株（以下、オリジナル菌と略する）はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ３１２６９であり、アメリカ微生物株保存機関（ＡＴＣＣ）から購入され、寄託番号はＡＴＣＣ３１２６９である。

【0039】

実施例１：細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲノックアウトプラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌の染色体を使用してＰＣＲを実行し、ＥｘｅＲ遺伝子ノックアウトサイドの上下流の２つの遺伝子断片を増幅し、ＥｘｅＲ−Ｒ、ＥｘｅＲ−Ｌと名付けた。具体的には、配列ＥｘｅＲ−Ｒは、以下のプライマー１とプライマー２を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸という反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、１０４８ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３）を増幅した。配列ＥｘｅＲ−Ｌは、以下のプライマー３とプライマー４を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸するという反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、１０３５ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４）を増幅した。

【0040】

ＰＣＲ増幅の反応系は以下の通りであり、全系１００μＬである（特に説明しない限り、全てのＰＣＲ反応は当該系に準ずる。）。
Ｂｕｆｆｅｒ ２０μＬ
ｄＮＴＰ １０μＬ
テンプレート ２μＬ
プライマー１ ２μＬ
プライマー２ ２μＬ
ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ２μＬ
ＤｄＨ_２Ｏ ６２μＬ

【0041】

プラスミドｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆに対してＰＣＲを実行し、ｃｒＲＮＡ配列を増幅した。プライマー５とプライマー６を使用し、ＥｘｅＲゲノムノックアウトサイドで選別された２１ｂｐ ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１認識配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２）、即ち、ＥｘｅＲ遺伝子での２１ｂｐ ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１認識配列によって、交換プラスミドでの元の認識配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３）、即ち、ｃｒｔＹｆ遺伝子での２１ｂｐ ＣＲＩＳＰＲ−ｃｐｆ１認識配列を置換した。置換された配列をＥｘｅＲ−１と名付けた。具体的には、配列ＥｘｅＲ−１は、以下のプライマー５とプライマー６を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１０秒間延伸するという反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、１１０ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５）を増幅した。

【0042】

配列ＥｘｅＲ−Ｒ、ＥｘｅＲ−ＬとＥｘｅＲ−１を、ＡｐａＩ／ＳｗａＩ酵素切断されたｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆプラスミドにクローンし、ノックアウトプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲを得た。アガロースゲル電気泳動を図１に示す。レーン３はオリジナルｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆプラスミドであり、レーン４は構築されたプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲであり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。その中、オリジナルｐＪＹＳ３_ｃｒｔＹｆプラスミドの大きさは１１９８２ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７）であるが、組換えプラスミドｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲの大きさは１１８９５ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２０）である。

【0043】

増幅されたＥｘｅＲ−Ｒ配列は、２０ｂｐの担体相同の配列及び３０ｂｐのＥｘｅＲ−Ｌ相同の配列を含む。なお、プライマー１はＡｐａＩの制限酵素認識サイドを有する。増幅されたＥｘｅＲ−Ｌ配列は、３０ｂｐのＥｘｅＲ−Ｒ相同の配列及び２５ｂｐのＥｘｅＲ−１相同の配列を含む。増幅されたＥｘｅＲ−１配列は、２５ｂｐのＥｘｅＲ−Ｌ相同の配列及び１６ｂｐの担体相同の配列を含む。なお、プライマー６はＳｗａＩの制限酵素認識サイドを有する。制限酵素認識サイドをボールド体で示した。

【0044】

【表1】

【0045】

実施例２：アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅ過剰発現プラスミドの構築
コリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌の染色体を使用してＰＣＲを実行し、ＡＴＰａｓｅ遺伝子を増幅した。

【0046】

具体的には、以下のプライマー７とプライマー８を使用し、９４℃で３０秒間変性し、５５℃で３０秒間アニールし、７２℃で１分間延伸するという反応条件で３０回繰り返してＰＣＲを実行し、１１８６ｂｐの遺伝子断片（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６）を増幅した。

【0047】

増幅された配列はＡＴＰａｓｅコード配列及び２０ｂｐの担体相同の配列を含む。なお、プライマー７はＢａｍＨＩの制限酵素認識サイドを有し、プライマー８はＢａｍＨＩの制限酵素認識サイドを有する。ＢａｍＨＩ制限酵素認識サイドをボールド体で示した。

【0048】

【表2】

【0049】

得られたポリヌクレオチドと制限酵素ＢａｍＨＩで処理されたｐＸＭＪ１９プラスミドを一段階クローンし、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅ遺伝子を過剰発現するための組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰを得た。そのアガロースゲル電気泳動を図１に示す。レーン１はオリジナルｐＸＭＪ１９プラスミドであり、レーン２は構築されたプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰであり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。その中、オリジナルｐＸＭＪ１９プラスミドの大きさは６６０１ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４）であるが、組換えプラスミドｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰの大きさは７７４１ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２１）である。図から分かるように、ＡＴＰａｓｅ遺伝子断片は既に発現プラスミドｐＸＭＪ１９に挿入された。

【0050】

実施例３：細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲ遺伝子が不活性化されたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した菌株の構築
得られたｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲ組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌コンピテントセルに導入し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、コロニーＰＣＲによってゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子が欠失したかを検証した。プライマー９とプライマー１０を使用してノックアウト菌株のゲノムに対してＰＣＲを実行し、成功にノックアウトされた後の突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物は１４９４ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）であるが、コントロールの野生型菌では２６１９ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６）である。アガロースゲル電気泳動を図２に示す。レーン１、２は突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物であり、レーン３、４はコントロールの野生型菌のＰＣＲ生成物であり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。最終に、配列測定によってコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子が成功にノックアウトされたかを検証し、配列測定サービスは蘇州ＪｉｎＷｅｉＺｈｉ生物科技有限会社により提供された。得られた細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲ遺伝子不活性化菌株を△ＥｘｅＲ菌株と名付け、ＥｘｅＲ遺伝子が成功にノックアウトされた後の配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１９に示されるものである。

【0051】

更に、得られたｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰ組換えプラスミドを△ＥｘｅＲ菌株のコンピテントセルに導入し、６．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、コロニーＰＣＲによって検証し、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲ遺伝子がノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した組換え菌株、即ち、本願に係る組換え菌を得、△ＥｘｅＲ＋ＡＴＰ菌株と名付けた。プライマー１１とプライマー１２を使用してＰＣＲを実行し、遺伝子が組換えプラスミドに挿入されたかを検証した。

【0052】

【表3】

【0053】

修飾菌株が成功に構築された後、９６ウェルプレート及びＳＥＭ電子顕微鏡試験を行った。９６ウェルプレートによる試験データを図５に示す。修飾された組換え菌は１２ｈで、そのバイオマスがオリジナル菌よりも５９％向上したが、菌株の持続的成長に伴って、バイオマスの差分はしだいに低減していたと認められた。電子顕微鏡写真を図３に示す。これを一見して分るように、組換え菌のバイオフィルムはオリジナル菌よりも厚く、ブロックとして形成したが、オリジナル菌のバイオフィルムは比較的薄い。成膜効果が向上された後、固定化連続発酵を行った。

【0054】

実施例４：異なる担体での、組換え菌の固定化発酵によるリシン生産
活性化培地成分は、グルコース１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌである。

【0055】

シード培地としては、ショ糖２５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１２ｇ／Ｌ、尿素５ｇ／Ｌである。

【0056】

発酵培地の配合としては、グルコース１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム４０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、糖蜜２０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド５０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／Ｌ、ビオチン２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌである。

【0057】

５０ｍＬ遠心管毎に活性化培地５ｍＬを加え、実施例３で調製された組換え菌を仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で２０ｈ活性化した。

【0058】

活性化終了後、それぞれシード培地５０ｍＬ入り５００ｍＬ振盪フラスコに注ぎ、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１２ｈ培養した。

【0059】

５００ｍＬの振盪フラスコ毎に発酵培地５０ｍＬを注ぎ、表４に示す担体も発酵培地に加えて、一緒に１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌した。担体使用量は、３０ｇ／Ｌが好ましい。

【0060】

発酵培地にシード液５ｍＬを仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で７２ｈ発酵した。

【0061】

固定化連続発酵：発酵過程において、１バッチ目では菌体が既に固定化担体に吸着され、この際に、既に振盪フラスコにより約７２ｈ培養した。２バッチ目では発酵液を除去し、菌体が吸着された固定化担体を残し、新しい発酵培地５０ｍＬを注ぎ、グルコース、糖蜜及びショ糖の３つの組み合わせである糖が全て消耗するまでに約６０ｈ培養し、発酵周期のデータとリシン産量のデータを測定した。後のバッチの固定化連続発酵にはいずれも当該方法を採用し、最後の１０バッチの連続発酵データを表４に示す。

【0062】

【表4】

【0063】

表４から分かるように、固定化連続発酵のため最も好ましくは綿繊維であるため、後の固定化連続発酵全体には綿繊維を固定化担体とした。

【0064】

実施例５：組換え菌リシン発酵試験（綿繊維担体での組換え菌固定）
活性化培地成分は、グルコース１０ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌである。

【0065】

シード培地としては、ショ糖２５ｇ／Ｌ、ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母パウダー５ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・七水和物１ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム５ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１２ｇ／Ｌ、尿素５ｇ／Ｌである。

【0066】

発酵培地の配合としては、グルコース１００ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム４０ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム１ｇ／Ｌ、糖蜜２０ｇ／Ｌ、コーンスティープリカー２０ｇ／Ｌ、リン酸二水素カリウム１ｇ／Ｌ、硫酸第一鉄１５０ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン１００ｍｇ／Ｌ、ニコチンアミド５０ｍｇ／Ｌ、パントテン酸カルシウム１０ｍｇ／Ｌ、ＶＢ１ １０ｍｇ／Ｌ、硫酸銅１ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛１ｍｇ／Ｌ、ビオチン２ｍｇ／Ｌ、炭酸カルシウム４０ｇ／Ｌである。

【0067】

５０ｍＬ遠心管毎に活性化培地５ｍＬを加え、実施例３で調製された組換え菌を仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で２０ｈ活性化した。

【0068】

活性化終了後、それぞれシード培地５０ｍＬ入り５００ｍＬ振盪フラスコに注ぎ、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で１２ｈ培養した。

【0069】

５００ｍＬの振盪フラスコ毎に発酵培地５０ｍＬを注ぎ、予備処理された綿繊維担体も発酵培地に加え、一緒に１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌した。

【0070】

発酵培地にシード液５ｍＬを仕込み、３０℃、２２０ｒｐｍの条件で７２ｈ発酵した。

【0071】

固定化連続発酵：発酵過程において、１バッチ目では菌体が既に固定化担体に吸着され、この際に、既に振盪フラスコによって約７２ｈ培養した。２バッチ目では、発酵液を除去し、菌体が吸着された固定化担体を残し、新しい発酵培地５０ｍＬを注ぎ、グルコース、糖蜜とショ糖の３つの組み合わせである糖が全て消耗するまでに約６０ｈ培養し、発酵周期データを測定し、図４に示す。リシン産量を図６に示す。後の固定化連続発酵にはいずれも当該方法を採用した。

【0072】

綿繊維担体材の予備処理：綿繊維担体を５ｃｍ×５ｃｍの正方形にカットし、純水で洗浄してオーブンで乾燥した後、エチルアルコールで１ｈ浸漬し、純水で２回洗浄した後、沸騰水浴で２０ｍｉｎ処理してオーブンで乾燥し、１．５ｇ秤量し、発酵液入り振盪フラスコに加え、一緒に１１５℃で１５ｍｉｎ滅菌した。

【0073】

比較例１：オリジナル菌の固定化発酵（オリジナル菌）
実施例５に仕込まれた組換え菌をオリジナル菌に変更した以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。

【0074】

比較例２：組換え菌のフリー発酵（組換え菌）
発酵培地に担体を加えない以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。

【0075】

比較例３：オリジナル菌のフリー発酵（オリジナル菌）
実施例５に仕込まれた組換え菌をオリジナル菌に変更し、発酵培地に担体を加えない以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。

【0076】

図４から分かるように、固定化発酵はフリー発酵に比べると、その周期が短縮され、その中、組換え菌の固定化発酵周期はオリジナル菌のフリー発酵周期よりも２９．１７％短縮された。図６から分かるように、固定化発酵はフリー発酵よりも、得られたリシンの産量が向上し、また、組換え菌の固定化産量はオリジナル菌の固定化産量よりも４９．６７％向上した。上記の発酵周期の短縮及びリシン産量の向上は、いずれも固定化発酵と組換え菌を使用してコリネバクテリウム・グルタミカムの成膜力を強化させたからである。

【0077】

比較例４：コリネバクテリウム・グルタミカムにおけるＥｘｅＲ遺伝子不活性化菌株の構築
得られたｐＪＹＳ３_ＥｘｅＲ組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌コンピテントセルに導入し、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、コロニーＰＣＲによってゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子が欠失したかを検証した。プライマー９とプライマー１０を使用してノックアウト菌株のゲノムに対してＰＣＲを実行し、成功にノックアウトされた後の突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物は１４９４ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５）であるが、コントロールの野生型菌では２６１９ｂｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６）である。アガロースゲル電気泳動を図２に示す。レーン１、２は突然変異菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子のＰＣＲ生成物であり、レーン３、４はコントロールの野生型菌のＰＣＲ生成物であり、レーン５はＭａｒｋｅｒである。最終に、配列測定によってコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌ゲノムでのＥｘｅＲ遺伝子が成功にノックアウトされたかを検証し、配列測定サービスは蘇州ＪｉｎＷｅｉＺｈｉ生物科技有限会社により提供された。細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲ遺伝子不活性化菌株を得、△ＥｘｅＲ菌株と名付けた。

【0078】

比較例５：コリネバクテリウム・グルタミカムにおいてアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した菌株の構築
得られたｐＸＭＪ１９／＊ＡＴＰ組換えプラスミドをコリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌コンピテントセルに導入し、６．５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含みＬＢプレートでスクリーニングし、２〜３日間培養して形質転換細胞を抽出し、コロニーＰＣＲによって検証し、アデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅ過剰発現組換え菌株を得、ＡＴＰ菌株と名付けた。

【0079】

比較例６：△ＥｘｅＲ菌株固定化発酵
実施例５に仕込まれた組換え菌を△ＥｘｅＲ菌株（コリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌からＥｘｅＲ遺伝子をノックアウトしたもの）に変更した以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。

【0080】

比較例７：ＡＴＰ菌株固定化発酵
実施例５に仕込まれた組換え菌をＡＴＰ菌株（コリネバクテリウム・グルタミカムオリジナル菌にＡＴＰａｓｅ遺伝子を過剰発現したもの）に変更した以外、実施例５と同じ工程で実行し、得られた発酵周期データを図４に示す。リシン産量を図６に示す。

【0081】

オリジナル菌、組換え菌、△ＥｘｅＲ菌株とＡＴＰ菌株の発酵データの比較から分かるように、単にＥｘｅＲ遺伝子をノックアウトした場合、単にＡＴＰａｓｅ遺伝子を過剰発現した場合は、いずれも発酵産量の向上と発酵周期の短縮が図れ、リシン産量から見れば、単にＥｘｅＲ遺伝子をノックアウトした方は、その効果が単にＡＴＰａｓｅ遺伝子を過剰発現した方よりも良好である。図６から分るように、ＡＴＰ菌株の固定化発酵によるリシン産量は、オリジナル菌の固定化発酵によるリシン産量よりも２．５６％向上し、△ＥｘｅＲ菌株の固定化発酵によるリシン産量は、オリジナル菌の固定化発酵によるリシン産量よりも９．００％向上し、組換え菌の固定化発酵によるリシン産量は、オリジナル菌の固定化発酵によるリシン産量よりも２８．５４％向上した。要するに、リシン産量から見れば、組換え菌の発酵性能は最も好ましい。

【0082】

実施例６：還元糖の測定方法
ＤＮＳ（ジニトロサリチル酸）を使用し、アルカリ条件で還元糖と酸化還元反応し、３−アミノ−５−ニトロサリチル酸を生成した。当該生成物は沸騰条件で赤茶の色を呈し、一定の濃度範囲内には、色の濃淡は還元糖の含有量に比例し、紫外分光光度計（ＯＤ_５４０）で還元糖含有量を測定した。

【0083】

見込み糖含有量を０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬの間にするようにサンプルを適切に希釈した後、希釈後のサンプル０．５ｍＬを１０ｍＬ目盛りチューブに取り、ＤＮＳ ０．５ｍＬを加え、沸騰水で５ｍｉｎ沸騰した直後、５ｍｉｎ冷却し、純水８ｍＬを加えて均一に混合し、また、純水０．５ｍＬとＤＮＳサンプル０．５ｍＬをブランクサンプルとする。予め本試験に用いられるＤＮＳ還元糖含有量の標準曲線を作製しておき、紫外分光光度計によって５４０ｎｍ波長で吸光度を計測し、還元糖含有量の計量とする。

【0084】

実施例７：リシン含有量の測定
発酵液毎に１００μＬサンプリングし、０．１Ｍ塩酸溶液で５０倍希釈し、サンプル毎に希釈液４００μＬを取り、ＰＩＴＣプレカラム誘導体化を実行し、ＲＰ−ＨＰＬＣ法でリシン含有量を計測し、サンプル毎のリシン濃度を算出した。

【0085】

オリジナル菌と本発明に係る構築の組換え菌で固定化連続発酵試験を行い、１０バッチの発酵試験による発酵結果を表５に示す。図６から分かるように、修飾後の菌株の固定化連続発酵によるリシン産量は、フリー発酵のオリジナル菌よりも４９．６７％向上した。図４から分かるように、修飾後の菌株の固定化発酵周期はオリジナル菌よりも２９．１７％短縮された。

【0086】

【表5】

【0087】

実施例８：クリスタルバイオレット染色法によるバイオフィルム量の半定量的な計測
無色９６ウェルプレートに発酵培地２００μＬを加え（固定化担体と炭酸カルシウムを加えない）、そしてオリジナル菌と組換え菌２０μＬをそれぞれ加えて培養し、１２ｈ、２４ｈ、３６ｈ、４８ｈ経過した時点に、クリスタルバイオレット染色法とＥＬＩＳＡリーダーでＯＤ５７０ｎｍを計測した。図５から分かるように、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲがノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現した組換え菌は、その成膜力が明らかに向上した。

【0088】

本発明によると、細胞外ヌクレアーゼＥｘｅＲがノックアウトされたと共にアデノシントリホスファターゼＡＴＰａｓｅを過剰発現したコリネバクテリウム・グルタミカム、その構築方法、及びそのリシン生産における使用の構想及び方法を提供し、具体的には、当該技術手段を実現するための方法とルートは多いが、以上に記載されたのはただ本発明の好ましい実施形態であり、当業者にとって明らかであるように、本発明の原理から離脱しない限り、若干の改良と修飾を加えることができ、これらの改良と修飾も本発明の保護範囲にある。本実施例に明確的でない各組成部分は、いずれも従来技術によって実現できる。

【配列表フリーテキスト】

【0089】

SEQUENCE LISTING

<110> NANJING TECH UNIVERSITY

<120> METHOD FOR PRODUCING LYSINE BY UTILIZINGADSORPTION AND IMMOBILIZED FERMENTATION OF RECOMBINANT CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1
<211> 2751
<212> DNA
<213> Extracellular nuclease (ExeR)

<400> 1
atgtctcgca tttctgcgcg cactctggca atcgcacttg ccggtgcaac cgcggccagc 60
ctggcagttg ttccagcagc aacagctaat cctgccggaa ccgctcctgt catcaacgaa 120
atctacggag gcggtggaaa cagcggatcg ttgttctcca acgacttcat tgagctctac 180
aacccaacct caggggacat ttccctcgac ggttggagcg ttacctacta cgcagccaac 240
ggtaactccg gcggaaccac aaacctgacc ggaaacatcc ctgccaacgg ttactacctc 300
atccagcaac gcgcaggcag caacaacacc ggcgctctgc ctaccccaga cgccaccggt 360
aacttggcaa tgggtgcctc ccaaggatca gttgcactga ccgacaactc tggcctaacc 420
gctgaccttg tcggattcgg tggcacgtcc atgtttgaag gaacagctgc tgcacctgag 480
accagcaaca aattgtctgt tcaacgcaaa gaagttggcg ctgactctga taacaactcc 540
gtagacttcg agactggagc tccaactcca acgtcctcgg gaggatccgc tcctgttgac 600
ccaggcgagc cagaaactcc agtaaaccct ggggaaacag tctccatcgc acaaatccaa 660
ggaaccggtc tcgctacccc actcgagggt cagaccgtca ccaccgaagg tattgtcact 720
gccgtttacg cagaaggtgg cttcaacggt tactacatcc agacacctgg atctggtact 780
gcaccaaagg ttgctggcga cgcatccgac ggcatcttcg tctacgtggg aagcaatggt 840
tcctacccag agctcggcgc atctgtcacc gtcactggca aggccaccga acactacgag 900
atgactcagc taggcaactc ctccttcacc gtttcggaca ccgcattcga gccagtaacc 960
ccactcgaac tggacaccgt tcctactggc gatgacattc gcgaagcata cgaaggcatg 1020
ctgctgaagc caaccggcgc tcacaccgtg accaacaact acgcaaccaa caccttcggt 1080
gaaattgccc tcgccccagg taacgagcct ttgtaccagg ccactcaaat ggtggcaccg 1140
ggagccgaag cgattgcgta cgaggcggaa aacgtcgcaa agcaaattac gctggatgac 1200
ggacgctccg gcaactacac tcgcggcgac tccagcacgc ctatggcatg gcttgtgcag 1260
gacggtggcg agaccatcaa gtccatccgc accggcgacc aggtggaatt ccaggcacca 1320
gtaatcttcg attaccgcta cgacctgtgg aaattccagc caaccacccc tgtcaccggc 1380
aacaccgcaa gctccgacct tcctatcacc tgggatgaca cccgcgcggc tgagctagct 1440
tcaatcaatg acgttgctgg cgaattccac atcgcaagct tcaacgtgct caactacttc 1500
acctctctcg gcgaagatga accaggctgc agcgcataca gggatatcaa caacacccca 1560
gtcaccgcca acaactgtaa cgtccgtggc gcttacaccg aagaagcact cgaagatcag 1620
cagagcaaga tcgtcgaagc aatcaaccgc cttgacgtcg atgttcttgg acttgaagaa 1680
atcgaaaaca ccgcgaccgt caccggcgac gtctcccgtc gcgatgacgc actcaatacc 1740
ctcgtcgcag cactcaacga agcagttgga tccgatcgct gggcggccgt cgaatctcca 1800
gaacaattgg gcaccgatga agactacatc cgcgtcgcct tcatctacga ccaaaccacc 1860
gtcaagcccg tcggcgaatc ccgaatcttc gacgacgcag ccttcaccgg caccgcacgc 1920
cagccactcg cacaggaatt ccagccactc aacgacagcg agaaatcctt cgtcggcgta 1980
gtcaaccact tcaagtccaa gggctctgtc actcgtggag acgccgacac cggcgacggc 2040
caaggcaaca acgccaacgt tcgcgtcgca caggcacagg cactcatcga ccacctggaa 2100
aaccaggacg actgggcatc caagccaatc ttcatcctcg gcgacaccaa ctcctacgcc 2160
aaggaaaccg cgatgaccac cctttacggc gctggctaca ccaacatcgc caccgaattc 2220
gacgctggct acagctacca gttctccggc cgcattggca gcctcgacca cgcactcggc 2280
aacgaagcag ccatgaagca cgtcatcgac gccgaggtct gggacatcaa cgctgacgaa 2340
gcaatcgcat tcgaatactc ccgtcgactc aacaacacct ccgacgtatt cgagaacaac 2400
gtcttccgct cctccgacca cgacccgatc aaggtcggat tcaacctcag cgagaccact 2460
gagcccacca ttccggtaga gcccactgat cctgcagaac ctaccgatcc aactacccca 2520
gttaagccaa ctgatccggt agagaccacg gatccatctg agccaaccga ccctgcagaa 2580
cctactgatc cagctgaacc aactgaccct gaggaaacga agaagccaga ggagccgaag 2640
aaccctggtt cctccaacgg aagctcccaa tacgccacca ttgcagcaat catcgcagca 2700
atcctaggtg ccattgcttt ggccttccag ttcttcccat tcaagttcta a 2751

<210> 2
<211> 1134
<212> DNA
<213> Adenosine triphosphatase (ATPase)

<400> 2
atgactgaca ttgatctggt ggtggaaaac gtccaaagga ttatcgccac caaagagaca 60
ccgccgacct ctgcggaaat agcgagcctg attcgggaac aagcaggcgt gatcagtaac 120
gaggacatcg tgatggtgtt gcgtcgactg cgcagtgatt ctgtgggcgt gggaccgttg 180
gaatctctgc ttgcgcttcc tggcgtgacg gatgtgttgg ttaatgccca tgacagcgtg 240
tggattgatc gcggtcaggg cgtggagaaa gtcgacatgg atctgggctc agaggaggcg 300
gtgcgtcgcc ttgccacccg gttggcgttg acctgtggca gacgcttaga tgatgcgcag 360
cctttcgctg atggccgaat caccagggac gacggcagcg tgttgcgcat tcacgcggtg 420
ttggcaccct tggcggaatc cggcacgtgc atcagtgtgc gagtactgcg tcaagcacgg 480
ctgagccttg atgatcttat ccaaagcggc acggtgcctg aggacatcgc gcctgcgctc 540
cggaacatca tcaatcaacg gcgctcgttc cttgttgtcg gtggcaccgg cacagggaaa 600
accacattgc tgtccgcgat gctcaccgaa gttcccgctg atcaacgaat catctgcatc 660
gaggacaccg cagagcttca tcccggccat ccaagcacca tcaacttggt gtctcgccaa 720
gcaaacgtcg agggcgccgg cgccgtgagc atggcggatt tgttgaaaca atcgctgcgc 780
atgaggcctg accggattgt cgtcggagag attcgcggtg cggaagtcgt ggatcttttg 840
gctgcgatga ataccggaca cgacggcggt gctggcacca ttcacgcgaa ctccatctct 900
gaagttcccg cgcgcatgga agctcttgcg gcgaccggcg gattggaccg catggcattg 960
cattctcaac tcgcggccgc agtggacatt gtgctggtca tgaaacacac cccttttggc 1020
cgcaggctag ctcaactcgg ggtgctccgc ggaaatcctg tgaccacgca ggtggtgtgg 1080
gatttggacc acggcatgca cgaagggagc gaagaggcat ggtttatgcc ctag 1134

<210> 3
<211> 1048
<212> DNA
<213> ExeR-R

<400> 3
aagtagaaca actgttcacc gggcccacgg aatcatctac ctcaagctcg aagcgctttc 60
cctgacggac atcggaaacg ccagaaactc cgatacgtcc gagggcgcgg tgtaccgcct 120
gcccctgggg atccagaatc tcagccttag gcatgacatt gacaactaca cgggccacgg 180
tattttccct tactcaagaa atggggagga caatgtttta cgagcacaag tgtaactgtt 240
gccactggtc aaacctagcc agcccttaga tagggagatt ctcctcgatt gcttccacta 300
cctcagctgc agatggttcc gtccgaggag caaagcgctt aatcgtatta ccttctgcat 360
ctaccaggaa tttctcaaaa ttccactcga tttcgctacc atcagttgcc tctttgagca 420
ccttgtacag ggggtgggca ccctccccat tcacctcggt tttgctcaag agcgggaagg 480
tgacgtcgta ctgattttgc gcgaaagcac acacctcagc gtcggttcca ggttcctggc 540
cgttgaattg attgcagggc acgccaatga caaagaagcc tcgatcttgg tattcctcat 600
acagtttttg aagcccttca tactgtggcg tgagtccgca cttggatgcc acgttcacga 660
tgagcaaaag gtggcccgcc caatccgcca tggtggtttc tgtgccgtcg ttgagagtta 720
cgctgatgtc atgaatagaa gtcataatcg caaccctagt tgagggggag gatttagtgc 780
atcatctaaa taaaggtcag ctaataggtg aactttggtg agaccaaagg tgaactgcca 840
ggtcgaccaa attgctcgcc aagcagactc cgaaaaacac gggtaattca tatggcttgt 900
atctaatcca tactgaacag aggacctctc ctatgtctcg catttctgcg cgcactctgg 960
caatcgcact tgccggtgca accgcggcca gcctggcagt tgttccagca gcaacagcta 1020
atcctgccgg aaccgactcc agcacgcc 1048

<210> 4
<211> 1035
<212> DNA
<213> ExeR-L

<400> 4
taatcctgcc ggaaccgact ccagcacgcc tatggcatgg cttgtgcagg acggtggcga 60
gaccatcaag tccatccgca ccggcgacca ggtggaattc caggcaccag taatcttcga 120
ttaccgctac gacctgtgga aattccagcc aaccacccct gtcaccggca acaccgcaag 180
ctccgacctt cctatcacct gggatgacac ccgcgcggct gagctagctt caatcaatga 240
cgttgctggc gaattccaca tcgcaagctt caacgtgctc aactacttca cctctctcgg 300
cgaagatgaa ccaggctgca gcgcatacag ggatatcaac aacaccccag tcaccgccaa 360
caactgtaac gtccgtggcg cttacaccga agaagcactc gaagatcagc agagcaagat 420
cgtcgaagca atcaaccgcc ttgacgtcga tgttcttgga cttgaagaaa tcgaaaacac 480
cgcgaccgtc accggcgacg tctcccgtcg cgatgacgca ctcaataccc tcgtcgcagc 540
actcaacgaa gcagttggat ccgatcgctg ggcggccgtc gaatctccag aacaattggg 600
caccgatgaa gactacatcc gcgtcgcctt catctacgac caaaccaccg tcaagcccgt 660
cggcgaatcc cgaatcttcg acgacgcagc cttcaccggc accgcacgcc agccactcgc 720
acaggaattc cagccactca acgacagcga gaaatccttc gtcggcgtag tcaaccactt 780
caagtccaag ggctctgtca ctcgtggaga cgccgacacc ggcgacggcc aaggcaacaa 840
cgccaacgtt cgcgtcgcac aggcacaggc actcatcgac cacctggaaa accaggacga 900
ctgggcatcc aagccaatct tcatcctcgg cgacaccaac tcctacgcca aggaaaccgc 960
gatgaccacc ctttacggcg ctggctacac caacatcgcc accgaattcg acgctctaga 1020
ttgacagcta gctca 1035

<210> 5
<211> 110
<212> DNA
<213> ExeR-1

<400> 5
acgctctaga ttgacagcta gctcagtcct aggtataatg gatccgaatt tctactgttg 60
tagatcctcg acggttggag cgttacattt aaataaaacg aaaggctcag 110

<210> 6
<211> 1186
<212> DNA
<213> ATPase

<400> 6
gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga ctgacattga tctggtggtg gaaaacgtcc 60
aaaggattat cgccaccaaa gagacaccgc cgacctctgc ggaaatagcg agcctgattc 120
gggaacaagc aggcgtgatc agtaacgagg acatcgtgat ggtgttgcgt cgactgcgca 180
gtgattctgt gggcgtggga ccgttggaat ctctgcttgc gcttcctggc gtgacggatg 240
tgttggttaa tgcccatgac agcgtgtgga ttgatcgcgg tcagggcgtg gagaaagtcg 300
acatggatct gggctcagag gaggcggtgc gtcgccttgc cacccggttg gcgttgacct 360
gtggcagacg cttagatgat gcgcagcctt tcgctgatgg ccgaatcacc agggacgacg 420
gcagcgtgtt gcgcattcac gcggtgttgg cacccttggc ggaatccggc acgtgcatca 480
gtgtgcgagt actgcgtcaa gcacggctga gccttgatga tcttatccaa agcggcacgg 540
tgcctgagga catcgcgcct gcgctccgga acatcatcaa tcaacggcgc tcgttccttg 600
ttgtcggtgg caccggcaca gggaaaacca cattgctgtc cgcgatgctc accgaagttc 660
ccgctgatca acgaatcatc tgcatcgagg acaccgcaga gcttcatccc ggccatccaa 720
gcaccatcaa cttggtgtct cgccaagcaa acgtcgaggg cgccggcgcc gtgagcatgg 780
cggatttgtt gaaacaatcg ctgcgcatga ggcctgaccg gattgtcgtc ggagagattc 840
gcggtgcgga agtcgtggat cttttggctg cgatgaatac cggacacgac ggcggtgctg 900
gcaccattca cgcgaactcc atctctgaag ttcccgcgcg catggaagct cttgcggcga 960
ccggcggatt ggaccgcatg gcattgcatt ctcaactcgc ggccgcagtg gacattgtgc 1020
tggtcatgaa acacacccct tttggccgca ggctagctca actcggggtg ctccgcggaa 1080
atcctgtgac cacgcaggtg gtgtgggatt tggaccacgg catgcacgaa gggagcgaag 1140
aggcatggtt tatgccctag ggatccccgg gtaccgagct cgaatt 1186

<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> Primer 1

<400> 7
aagtagaaca actgttcacc gggcccacgg aatcatctac c 41

<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Primer 2

<400> 8
ggcgtgctgg agtcggttcc ggcaggatta 30

<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> Primer 3

<400> 9
taatcctgcc ggaaccgact ccagcacgcc 30

<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> Primer 4

<400> 10
tgagctagct gtcaatctag agcgtcgaat tcggt 35

<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Primer 5

<400> 11
acgctctaga ttgacagcta gctca 25

<210> 12
<211> 60
<212> DNA
<213> Primer 6

<400> 12
ctgagccttt cgttttattt aaatgtaacg ctccaaccgt cgaggatcta caacagtaga 60

<210> 13
<211> 46
<212> DNA
<213> Primer 7

<400> 13
gcctgcaggt cgactctaga ggatccatga ctgacattga tctggt 46

<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> Primer 8

<400> 14
aattcgagct cggtacccgg ggatccctag ggcataaacc atgcct 46

<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer 9

<400> 15
gtgagaccaa aggtgaactg 20

<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer 10

<400> 16
gtaggttctg caggatcagt 20

<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer 11

<400> 17
ggaattgtga gcggataaca 20

<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Primer 12

<400> 18
gtatcaggct gaaaatcttc 20

<210> 19
<211> 1626
<212> DNA
<213> Artificial sequence (Artificial)

<400> 19
atgtctcgca tttctgcgcg cactctggca atcgcacttg ccggtgcaac cgcggccagc 60
ctggcagttg ttccagcagc aacagctaat cctgccggaa ccgactccag cacgcctatg 120
gcatggcttg tgcaggacgg tggcgagacc atcaagtcca tccgcaccgg cgaccaggtg 180
gaattccagg caccagtaat cttcgattac cgctacgacc tgtggaaatt ccagccaacc 240
acccctgtca ccggcaacac cgcaagctcc gaccttccta tcacctggga tgacacccgc 300
gcggctgagc tagcttcaat caatgacgtt gctggcgaat tccacatcgc aagcttcaac 360
gtgctcaact acttcacctc tctcggcgaa gatgaaccag gctgcagcgc atacagggat 420
atcaacaaca ccccagtcac cgccaacaac tgtaacgtcc gtggcgctta caccgaagaa 480
gcactcgaag atcagcagag caagatcgtc gaagcaatca accgccttga cgtcgatgtt 540
cttggacttg aagaaatcga aaacaccgcg accgtcaccg gcgacgtctc ccgtcgcgat 600
gacgcactca ataccctcgt cgcagcactc aacgaagcag ttggatccga tcgctgggcg 660
gccgtcgaat ctccagaaca attgggcacc gatgaagact acatccgcgt cgccttcatc 720
tacgaccaaa ccaccgtcaa gcccgtcggc gaatcccgaa tcttcgacga cgcagccttc 780
accggcaccg cacgccagcc actcgcacag gaattccagc cactcaacga cagcgagaaa 840
tccttcgtcg gcgtagtcaa ccacttcaag tccaagggct ctgtcactcg tggagacgcc 900
gacaccggcg acggccaagg caacaacgcc aacgttcgcg tcgcacaggc acaggcactc 960
atcgaccacc tggaaaacca ggacgactgg gcatccaagc caatcttcat cctcggcgac 1020
accaactcct acgccaagga aaccgcgatg accacccttt acggcgctgg ctacaccaac 1080
atcgccaccg aattcgacgc tggctacagc taccagttct ccggccgcat tggcagcctc 1140
gaccacgcac tcggcaacga agcagccatg aagcacgtca tcgacgccga ggtctgggac 1200
atcaacgctg acgaagcaat cgcattcgaa tactcccgtc gactcaacaa cacctccgac 1260
gtattcgaga acaacgtctt ccgctcctcc gaccacgacc cgatcaaggt cggattcaac 1320
ctcagcgaga ccactgagcc caccattccg gtagagccca ctgatcctgc agaacctacc 1380
gatccaacta ccccagttaa gccaactgat ccggtagaga ccacggatcc atctgagcca 1440
accgaccctg cagaacctac tgatccagct gaaccaactg accctgagga aacgaagaag 1500
ccagaggagc cgaagaaccc tggttcctcc aacggaagct cccaatacgc caccattgca 1560
gcaatcatcg cagcaatcct aggtgccatt gctttggcct tccagttctt cccattcaag 1620
ttctaa 1626

<210> 20
<211> 11895
<212> DNA
<213> Knockout plasmid (pJYS3_ExeR)

<400> 20
taattatcat tgactagccc atctcaattg gtatagtgat taaaatcacc tagaccaatt 60
gagatgtatg tctgaattag ttgttttcaa agcaaatgaa ctagcgatta gtcgctatga 120
cttaacggag catgaaacca agctaatttt atgctgtgtg gcactactca accccacgat 180
tgaaaaccct acaaggaaag aacggacggt atcgttcact tataaccaat acgctcagat 240
gatgaacatc agtagggaaa atgcttatgg tgtattagct aaagcaacca gagagctgat 300
gacgagaact gtggaaatca ggaatccttt ggttaaaggc tttgagattt tccagtggac 360
aaactatgcc aagttctcaa gcgaaaaatt agaattagtt tttagtgaag agatattgcc 420
ttatcttttc cagttaaaaa aattcataaa atataatctg gaacatgtta agtcttttga 480
aaacaaatac tctatgagga tttatgagtg gttattaaaa gaactaacac aaaagaaaac 540
tcacaaggca aatatagaga ttagccttga tgaatttaag ttcatgttaa tgcttgaaaa 600
taactaccat gagtttaaaa ggcttaacca atgggttttg aaaccaataa gtaaagattt 660
aaacacttac agcaatatga aattggtggt tgataagcga ggccgcccga ctgatacgtt 720
gattttccaa gttgaactag atagacaaat ggatctcgta accgaacttg agaacaacca 780
gataaaaatg aatggtgaca aaataccaac aaccattaca tcagattcct acctacataa 840
cggactaaga aaaacactac acgatgcttt aactgcaaaa attcagctca ccagttttga 900
ggcaaaattt ttgagtgaca tgcaaagtaa gcatgatctc aatggttcgt tctcatggct 960
cacgcaaaaa caacgaacca cactagagaa catactggct aaatacggaa ggatctgagg 1020
ttcttatggc tcttgtatct atcagtgaag catcaagact aacaaacaaa agtagaacaa 1080
ctgttcaccg ggcccacgga atcatctacc tcaagctcga agcgctttcc ctgacggaca 1140
tcggaaacgc cagaaactcc gatacgtccg agggcgcggt gtaccgcctg cccctgggga 1200
tccagaatct cagccttagg catgacattg acaactacac gggccacggt attttccctt 1260
actcaagaaa tggggaggac aatgttttac gagcacaagt gtaactgttg ccactggtca 1320
aacctagcca gcccttagat agggagattc tcctcgattg cttccactac ctcagctgca 1380
gatggttccg tccgaggagc aaagcgctta atcgtattac cttctgcatc taccaggaat 1440
ttctcaaaat tccactcgat ttcgctacca tcagttgcct ctttgagcac cttgtacagg 1500
gggtgggcac cctccccatt cacctcggtt ttgctcaaga gcgggaaggt gacgtcgtac 1560
tgattttgcg cgaaagcaca cacctcagcg tcggttccag gttcctggcc gttgaattga 1620
ttgcagggca cgccaatgac aaagaagcct cgatcttggt attcctcata cagtttttga 1680
agcccttcat actgtggcgt gagtccgcac ttggatgcca cgttcacgat gagcaaaagg 1740
tggcccgccc aatccgccat ggtggtttct gtgccgtcgt tgagagttac gctgatgtca 1800
tgaatagaag tcataatcgc aaccctagtt gagggggagg atttagtgca tcatctaaat 1860
aaaggtcagc taataggtga actttggtga gaccaaaggt gaactgccag gtcgaccaaa 1920
ttgctcgcca agcagactcc gaaaaacacg ggtaattcat atggcttgta tctaatccat 1980
actgaacaga ggacctctcc tatgtctcgc atttctgcgc gcactctggc aatcgcactt 2040
gccggtgcaa ccgcggccag cctggcagtt gttccagcag caacagctaa tcctgccgga 2100
accgactcca gcacgcctat ggcatggctt gtgcaggacg gtggcgagac catcaagtcc 2160
atccgcaccg gcgaccaggt ggaattccag gcaccagtaa tcttcgatta ccgctacgac 2220
ctgtggaaat tccagccaac cacccctgtc accggcaaca ccgcaagctc cgaccttcct 2280
atcacctggg atgacacccg cgcggctgag ctagcttcaa tcaatgacgt tgctggcgaa 2340
ttccacatcg caagcttcaa cgtgctcaac tacttcacct ctctcggcga agatgaacca 2400
ggctgcagcg catacaggga tatcaacaac accccagtca ccgccaacaa ctgtaacgtc 2460
cgtggcgctt acaccgaaga agcactcgaa gatcagcaga gcaagatcgt cgaagcaatc 2520
aaccgccttg acgtcgatgt tcttggactt gaagaaatcg aaaacaccgc gaccgtcacc 2580
ggcgacgtct cccgtcgcga tgacgcactc aataccctcg tcgcagcact caacgaagca 2640
gttggatccg atcgctgggc ggccgtcgaa tctccagaac aattgggcac cgatgaagac 2700
tacatccgcg tcgccttcat ctacgaccaa accaccgtca agcccgtcgg cgaatcccga 2760
atcttcgacg acgcagcctt caccggcacc gcacgccagc cactcgcaca ggaattccag 2820
ccactcaacg acagcgagaa atccttcgtc ggcgtagtca accacttcaa gtccaagggc 2880
tctgtcactc gtggagacgc cgacaccggc gacggccaag gcaacaacgc caacgttcgc 2940
gtcgcacagg cacaggcact catcgaccac ctggaaaacc aggacgactg ggcatccaag 3000
ccaatcttca tcctcggcga caccaactcc tacgccaagg aaaccgcgat gaccaccctt 3060
tacggcgctg gctacaccaa catcgccacc gaattcgacg ctctagattg acagctagct 3120
cagtcctagg tataatggat ccgaatttct actgttgtag atcctcgacg gttggagcgt 3180
tacatttaaa taaaacgaaa ggctcagtcg aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt 3240
ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca aatccgccgg gagcggattt gaacgttgcg 3300
aagcaacggc ccggagggtg gcgggcagga cgcccgccat aaactgccag gcatcaaatt 3360
aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacaaactct taagcttgca 3420
tgcctgcagg tcgacttagt tattgcggtt ctggacaaat tcaaagtatt cttcgttctt 3480
aatgacgaga ttcagcttct tgccttcctg gttgttcttg atgcgaccca ggagcatgag 3540
acccttcaga ccgatgtggt aggcgccgtt tgcatcagcg tcctgtggca tgttctttgg 3600
agcctggcgg gaatcgaaga agttgccgtt gacgtcggcc actggggaga tgaggtaatc 3660
cagctcggtg ccggtcttgg agttgcgcat ctgcaggatg gtgttgagca cagaggtcag 3720
ctttgcgaag aacttcttgt cggattcgcc gcagattgca gccttgatgc actcgccgtg 3780
gccgtattcg atggagtaat ccttcaggag cttctccagt tccttggttg ggtacacttc 3840
gcgggtatcc cagttgtggt tcttgtcgga gttgcggaag ttgatgaggc gggagccgaa 3900
ggatgcgatg gtccacttgc ccttggctgc cttatcgccg aagttcttgt agtcgaagga 3960
gaattcgaag tagcccttat ccaggttgta gcagatcttg tcgaacttgg agaagaactc 4020
ctgggacttg gagacggatt cgtactttgg gtagagctgg ttgacgaagc cggtcactgg 4080
gcagatctta gaggtgaagc cagctggcac gtagtagatg atgccggtct gcttgcccat 4140
cttcttgaag gtctcgaatg gggcggtcag ctggtatgca cggaggacgc cgccggtctt 4200
atcgaattcg ttgtccttga acacgaggta gttcagcttc tcgatgagca tcttttccag 4260
cttctggtag acctgcttct ccaccttgaa gcggccgcgc ttgaagccga agttcaggtc 4320
ttcgaagacc acgattgcgt tgtactcgat caccagctta gcgatttcgt ggaccacctg 4380
ggagaggtag ccttccttca tttccttgat gttgttgatc ttcttccaat ccttgcgagc 4440
ggaatcgcgg tccttctcga tagcggccag cttgtcgtgg tagttggtct tcatgcgatc 4500
gttgccgatg atgttgaagg tgtcctgctt gatgatgttg cccttgccgt cgaccagggt 4560
gtagtaggcg aggtggcgtt cgccgcgatc gatggacagg atgtgcacgt cgttagcctt 4620
ctccttcagg agcaggttga tttcatcgtt gaacttgttg gcgccggagg acttgaagtt 4680
gatggtgatt gggcagtgga agaagaactt gtcctcggtg aagcgcttat ccttgatcag 4740
gtcgtactcg aacacggatt ccttctttgg gttatccttg ttcttgttgg cgattgcttc 4800
cttggctggg tgggtgatct tctttgggat ggactgcttg cggtagaaca gctctgcttc 4860
gccgttgagc ttgtagacca catcctgcag gttgcgttcg tcgaagagtg ccttccagta 4920
gagggtgtgc aggtttgggc ggcccttgga gtaagcggag aagtccttgt tgtagatctg 4980
gaagaggtac agcttgccct ggttgaccac ggaatcgatg taggactcgg agatgttttc 5040
gaaggtcagc ttgtagccct ggttctccac ttcgcggtag aattcatcga tggagttgta 5100
gcgctgggta tcggagaagc ggaagccgaa gtccttccac tctgggtgct tggagatgga 5160
ctgcttgtag aaatcgatga acttgcggca gtcttcgatg ttgaactcga acttttcgta 5220
gcccttctgt ggggagccgt tcttggtgtg ggtggagtgg ttgcggatgc gcaggatatc 5280
ttcggatggg ttgtagaact tgatggactt tgcggagaag aagacctttg ggagcatctt 5340
gttagcgcct gggagcagct tgtacacgat cttcttgtag ccctcgccct tgttttcctt 5400
gatggcctta tcgtcgaaga tcttgttgtt cttcttgttc atcacgccca ggtagtactt 5460
atcgtccttg atgaagagga tggcggtgtt atctggttcc ttgttcttgt cccagccgtt 5520
tgccagggtg gagttctcga agttgagctt gaacttttca tcggagtatg gcttctgggt 5580
gatgtagttg cggatcttgt tgtacagtgg gacgatgtta gcgagttcga agtagcactc 5640
ttcgaacacc aggtagaagt gctcatcctt gtcgaggatg ttggccttgt cttcggactg 5700
ggagatgtgg aagatcttca gcttgtggag caggttgttg gtctgatcga gcaggtcctt 5760
gattgccttc acatcgtcct cagcggaggc ctggagcaga tccttcttgc cctggttctg 5820
gtacttgatg gagatctggg ccaggttatc cttgttctgt gcgatttcgt cgaagatcat 5880
tgggattgca gcgaagtttg cgaggatctc ttcgaagcgg cactgcttat cgatgtcgcg 5940
gtgcttgttg aactcttcga gagccagctt gatggtctcg agggacaggt acttagcctt 6000
ttcggtcttc ttggcgatca gctcctgttc cttcttggat gggttatcga ggttctttgg 6060
ggcgatctgc tgggtgatgt attccaggac tgcggtgccg atcacggagt aatcgtcgaa 6120
gacctgctgg gagagatcgg tcagggactt gtcgttcttg aagtagatct tggagagatc 6180
cagcttctga gccttcagat cgtcgaagag cagggagagg gtctccttga tggacttctc 6240
ttccacggtc ttgaaggctg cgatctgttc gtagaaggac tgcatggtgg tgaccacatc 6300
ggaatcgtcc tccagcttgt cgatgacgaa ggacttggat tcggtgtcgg acaggatctg 6360
cttgaagagc acggacatct tgtacttctt cagggtctta tcgttgatct gctgggagta 6420
gaggttgatg tactcgttga tgcccttgcg cttggtgttt tcgccgttga cgaacttgcc 6480
gccgatgatg gtgttgaact tggtgatgcc ggactggttc aggtagttgt tgaagttggc 6540
gatctcgaac acttcatcga gggagaagac gcgctggttc acttcagagg tcttgtaatc 6600
gatgtcgaag gtgagctctt cggccaggtc cttcttgatc tgctcgtagt tgatagcttc 6660
tggggcctta tccttcaggg actcgtactt tgccttgttt tcgaggaact ttggcaggtt 6720
atcgtcgacg atgcggtaga tgatagaggt tgggatatcg ttggaggagt acacgttctt 6780
gcggttttcg tggaagccct tgaagtaggt ggtccagccc ttgaaggact tgatgatctc 6840
cagagcttca tcgatgtcgg tgatgtcgga gttggccttg aagagctcga tgccgttatc 6900
cttggactgc ttgagccaca ggatgagatc ggattcctgg cccttctttg cgtcgatcag 6960
gttctggttg aagaggttct tgaacttctc ggaatccttg atgtattcgg agatctgctt 7020
cttgatggta tccttagcgg acttgaagtc cttctgcagg ttatcgtcat cggacttctt 7080
gagcttgaag tagacatcgg agtagttctg gagcaggtcc tcggagatgc acacggagga 7140
caggatctct tcgatgaaga actggtggta cttgtcgatg atctgctttg ccttcttgta 7200
atccttagcg cgcttttcgt catccaggat gaggccgcgt gccttgatgt tttcgagggt 7260
cttgccttgg gggatcagct caaaacggag ggtcttggac agggagtatt tattcacaaa 7320
ctcttggtag atggacatcg ttcaagtcct ttccaattcc acacatggta ccacacgatg 7380
attaattgta aacagctcag gtcatgattc cgcgaacccc agagtcccgc tcagaagaac 7440
tcgtcaagaa ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc 7500
acgaggaagc ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac 7560
gctatgtcct gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag 7620
cggccatttt ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc 7680
tcgccgtcgg gcatccgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga 7740
tgctcttcgt ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc 7800
tcgatgcgat gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc 7860
cgccgcattg catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg 7920
agatcctgcc ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg 7980
tcgagcacag ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg 8040
tcttggagtt cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc 8100
tgcgctgaca gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca 8160
tagccgaata gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca 8220
atcatgcgaa acgatcctca tcctgtctct tgatcagatc ttgatcccct gcgccatcag 8280
atccttggcg gcaagaaagc catccagttt actttgcagg gcttcccaac cttaccagag 8340
ggcgccccag ctggcaattc cggttcgctt gctgtccata aaaccgccca gtctagctat 8400
cgccatgtaa gcccactgca agctacctgc tttctctttg cgcttgcgtt ttcccttgtc 8460
cagatagccc agtagctgac attcatccgg ggtcagcacc gtttctgcgg actggctttc 8520
tacgtgttcc gcttccggtg accgcctcga tgatcgccgg gtgggcgtgg cccaaggagg 8580
atcatccagc cattcggggt cgttcactgg ttcccctttc tgatttctgg catagaagaa 8640
cccccgtgaa ctgtgtggtt ccgggggttg ctgatttttg cgagacttct cgcgcaattc 8700
cctagcttag gtgaaaacac catgaaacac tagggaaaca cccatgaaac acccattagg 8760
gcagtagggc ggcttcttcg tctagggctt gcatttgggc ggtgatctgg tctttagcgt 8820
gtgaaagtgt gtcgtaggtg gcgtgctcaa tgcactcgaa cgtcacgtca tttaccgggt 8880
cacggtgggc aaagagaact agtgggttag acattgtttt cctcgttgtc ggtggtggtg 8940
agcttttcta gccgctcggt aaacgcggcg atcatgaact cttggaggtt ttcaccgttc 9000
tgcatgcctg cgcgcttcat gtcctcacgt agtgccaaag gaacgcgtgc ggtgaccacg 9060
acgggcttag cctttgcctg cgcttctagt gcttcgatgg tggcttgtgc ctgcgcttgc 9120
tgcgcctgta gtgcctgttg agcttcttgt agttgctgtt ctagctgtgc cttggttgcc 9180
atgctttaag actctagtag ctttcctgcg atatgtcatg cgcatgcgta gcaaacattg 9240
tcctgcaact cattcattat gtgcagtgct cctgttacta gtcgtacata ctcatattta 9300
cctagtctgc atgcagtgca tgcacatgca gtcatgtcgt gctaatgtgt aaaacatgta 9360
catgcagatt gctgggggtg cagggggcgg agccaccctg tccatgcggg gtgtggggct 9420
tgccccgccg gtacagacag tgagcaccgg ggcacctagt cgcggatacc ccccctaggt 9480
atcggacacg taaccctccc atgtcgatgc aaatctttaa cattgagtac gggtaagctg 9540
gcacgcatag ccaagctagg cggccaccaa acaccactaa aaattaatag tccctagaca 9600
agacaaaccc ccgtgcgagc taccaactca tatgcacggg ggccacataa cccgaagggg 9660
tttcaattga caaccatagc actagctaag acaacgggca caacacccgc acaaactcgc 9720
actgcgcaac cccgcacaac atcgggtcta ggtaacactg aaatagaagt gaacacctct 9780
aaggaaccgc aggtcaatga gggttctaag gtcactcgcg ctagggcgtg gcgtaggcaa 9840
aacgtcatgt acaagatcac caatagtaag gctctggcgg ggtgccatag gtggcgcagg 9900
gacgaagctg ttgcggtgtc ctggtcgtct aacggtgctt cgcagtttga gggtctgcaa 9960
aactctcact ctcgctgggg gtcatctctg gctgaattgg aagtcatggg cgaacgccgc 10020
attgagctgg ctattgctac taagaatcac ttggcggcgg gtggcgcgct catgatgttt 10080
gtgggcactg ttcgacacaa ccgctcacag tcatttgcgc aggttgaagc gggtattaag 10140
actgcgtact cttcgatggt gaaaacatct cagtggaaga aagaacgtgc acggtacggg 10200
gtggagcaca cctatagtga ctatgaggtc acagactctt gggcgaacgg ttggcacttg 10260
caccgcaaca tgctgttgtt cttggatcgt ccactgtctg acgatgaact caaggcgttt 10320
gaggattcca tgttttcccg ctggtctgct ggtgtggtta aggccggtat ggacgcgcca 10380
ctgcgtgagc acggggtcaa acttgatcag gtgtctacct ggggtggaga cgctgcgaaa 10440
atggcaacct acctcgctaa gggcatgtct caggaactga ctggctccgc tactaaaacc 10500
gcgtctaagg ggtcgtacac gccgtttcag atgttggata tgttggccga tcaaagcgac 10560
gccggcgagg atatggacgc tgttttggtg gctcggtggc gtgagtatga ggttggttct 10620
aaaaacctgc gttcgtcctg gtcacgtggg gctaagcgtg ctttgggcat tgattacata 10680
gacgctgatg tacgtcgtga aatggaagaa gaactgtaca agctcgccgg tctggaagca 10740
ccggaacggg tcgaatcaac ccgcgttgct gttgctttgg tgaagcccga tgattggaaa 10800
ctgattcagt ctgatttcgc ggttaggcag tacgttctcg attgcgtgga taaggctaag 10860
gacgtggccg ctgcgcaacg tgtcgctaat gaggtgctgg caagtctggg tgtggattcc 10920
accccgtgca tgatcgttat ggatgatgtg gacttggacg cggttctgcc tactcatggg 10980
gacgctacta agcgtgatct gaatgcggcg gtgttcgcgg gtaatgagca gactattctt 11040
cgcacccact aaaagcggca taaaccccgt tcgatatttt gtgcgatgaa tttatggtca 11100
atgtcgcggg ggcaaactat gatgggtctt gttgttggcg tcccggagcg taaaggatct 11160
aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc 11220
actgagcgtc agaccttgat gataccgctg ccttactggg tgcattagcc agtctgaatg 11280
acctgtcacg ggataatccg aagtggtcag actggaaaat cagagggcag gaactgctga 11340
acagcaaaaa gtcagatagc accacatagc agacccgcca taaaacgccc tgagaagccc 11400
gtgacgggct tttcttgtat tatgggtagt ttccttgcat gaatccataa aaggcgcctg 11460
tagtgccatt tacccccatt cactgccaga gccgtgagcg cagcgaactg aatgtcacga 11520
aaaagacagc gactcaggtg cctgatggtc ggagacaaaa ggaatattca gcgatttgcc 11580
cgagcttgcg agggtgctac ttaagccttt agggttttaa ggtctgtttt gtagaggagc 11640
aaacagcgtt tgcgacatcc ttttgtaata ctgcggaact gactaaagta gtgagttata 11700
cacagggctg ggatctattc tttttatctt tttttattct ttctttattc tataaattat 11760
aaccacttga atataaacaa aaaaaacaca caaaggtcta gcggaattta cagagggtct 11820
agcagaattt acaagttttc cagcaaaggt ctagcagaat ttacagatac ccacaactca 11880
aaggaaaagg actag 11895

<210> 21
<211> 7741
<212> DNA
<213> Recombinant plasmid (pXMJ19*ATP)

<400> 21
aattaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc atgactgaca ttgatctggt 60
ggtggaaaac gtccaaagga ttatcgccac caaagagaca ccgccgacct ctgcggaaat 120
agcgagcctg attcgggaac aagcaggcgt gatcagtaac gaggacatcg tgatggtgtt 180
gcgtcgactg cgcagtgatt ctgtgggcgt gggaccgttg gaatctctgc ttgcgcttcc 240
tggcgtgacg gatgtgttgg ttaatgccca tgacagcgtg tggattgatc gcggtcaggg 300
cgtggagaaa gtcgacatgg atctgggctc agaggaggcg gtgcgtcgcc ttgccacccg 360
gttggcgttg acctgtggca gacgcttaga tgatgcgcag cctttcgctg atggccgaat 420
caccagggac gacggcagcg tgttgcgcat tcacgcggtg ttggcaccct tggcggaatc 480
cggcacgtgc atcagtgtgc gagtactgcg tcaagcacgg ctgagccttg atgatcttat 540
ccaaagcggc acggtgcctg aggacatcgc gcctgcgctc cggaacatca tcaatcaacg 600
gcgctcgttc cttgttgtcg gtggcaccgg cacagggaaa accacattgc tgtccgcgat 660
gctcaccgaa gttcccgctg atcaacgaat catctgcatc gaggacaccg cagagcttca 720
tcccggccat ccaagcacca tcaacttggt gtctcgccaa gcaaacgtcg agggcgccgg 780
cgccgtgagc atggcggatt tgttgaaaca atcgctgcgc atgaggcctg accggattgt 840
cgtcggagag attcgcggtg cggaagtcgt ggatcttttg gctgcgatga ataccggaca 900
cgacggcggt gctggcacca ttcacgcgaa ctccatctct gaagttcccg cgcgcatgga 960
agctcttgcg gcgaccggcg gattggaccg catggcattg cattctcaac tcgcggccgc 1020
agtggacatt gtgctggtca tgaaacacac cccttttggc cgcaggctag ctcaactcgg 1080
ggtgctccgc ggaaatcctg tgaccacgca ggtggtgtgg gatttggacc acggcatgca 1140
cgaagggagc gaagaggcat ggtttatgcc ctagggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 1200
cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 1260
cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 1320
gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 1380
catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 1440
ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 1500
gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 1560
ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 1620
tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 1680
aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 1740
tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 1800
aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 1860
aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 1920
tgatgagcac ttttgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 1980
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 2040
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 2100
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 2160
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 2220
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 2280
cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 2340
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 2400
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 2460
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 2520
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 2580
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 2640
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 2700
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 2760
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gggtgggcga 2820
agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccattcggg gtcgttcact 2880
ggttcccctt tctgatttct ggcatagaag aacccccgtg aactgtgtgg ttccgggggt 2940
tgctgatttt tgcgagactt ctcgcgcaat tccctagctt aggtgaaaac accatgaaac 3000
actagggaaa cacccatgaa acacccatta gggcagtagg gcggcttctt cgtctagggc 3060
ttgcatttgg gcggtgatct ggtctttagc gtgtgaaagt gtgtcgtagg tggcgtgctc 3120
aatgcactcg aacgtcacgt catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt 3180
agacattgtt ttcctcgttg tcggtggtgg tgagcttttc tagccgctcg gtaaacgcgg 3240
cgatcatgaa ctcttggagg ttttcaccgt tctgcatgcc tgcgcgcttc atgtcctcac 3300
gtagtgccaa aggaacgcgt gcggtgacca cgacgggctt agcctttgcc tgcgcttcta 3360
gtgcttcgat ggtggcttgt gcctgcgctt gctgcgcctg tagtgcctgt tgagcttctt 3420
gtagttgctg ttctagctgt gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg 3480
cgatatgtca tgcgcatgcg tagcaaacat tgtcctgcaa ctcattcatt atgtgcagtg 3540
ctcctgttac tagtcgtaca tactcatatt tacctagtct gcatgcagtg catgcacatg 3600
cagtcatgtc gtgctaatgt gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc 3660
ggagccaccc tgtccatgcg gggtgtgggg cttgccccgc cggtacagac agtgagcacc 3720
ggggcaccta gtcgcggata ccccccctag gtatcggaca cgtaaccctc ccatgtcgat 3780
gcaaatcttt aacattgagt acgggtaagc tggcacgcat agccaagcta ggcggccacc 3840
aaacaccact aaaaattaat agtccctaga caagacaaac ccccgtgcga gctaccaact 3900
catatgcacg ggggccacat aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta 3960
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taggtaacac tgagtaacac tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat 4080
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accaatagta aggctctggc ggggtgccat aggtggcgca gggacgaagc tgttgcggtg 4200
tcctggtcgt ctaacggtgc ttcgcagttt gagggtctgc aaaactctca ctctcgctgg 4260
gggtcacctc tggctgaatt ggaagtcatg ggcgaacgcc gcattgagct ggctattgct 4320
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cgctggtctg ctggtgtggt taaggccggt atggacgcgc cactgcgtga gcacggggtc 4680
aaacttgatc aggtgtctac ctggggtgga gacgctgcga aaatggcaac ctacctcgct 4740
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gctgttttgg tggctcggtg gcgtgagtat gaggttggtt ctaaaaacct gcgttcgtcc 4920
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tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 5940
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tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 6060
ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 6120
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gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc 6240
gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg 6300
tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg 6360
atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 6420
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gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 6540
cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 6600
ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 6660
tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 6720
ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 6780
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gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 7080
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gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 7260
ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 7320
cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 7380
tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 7440
cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 7500
cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 7560
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 7620
ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 7680
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 7740
t 7741

<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> Recognition sequence on ExeR gene

<400> 22
cctcgacggt tggagcgtta c 21

<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Recognition sequence on crtYf gene

<400> 23
caggcaacca tagggcagga a 21

<210> 24
<211> 6601
<212> DNA
<213> Plasmid (pXMJ19)

<400> 24
aattaagctt gcatgcctgc aggtcgactc tagaggatcc ccgggtaccg agctcgaatt 60
cagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa 120
cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct 180
gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc 240
catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg 300
ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc ctgagtagga caaatccgcc 360
gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg tggcgggcag gacgcccgcc 420
ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt 480
tctacaaact cttttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac 540
aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt 600
tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag 660
aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg 720
aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa 780
tgatgagcac ttttgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 840
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 900
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 960
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 1020
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1080
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 1140
cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 1200
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 1260
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 1320
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 1380
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 1440
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 1500
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 1560
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1620
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatccttttg gggtgggcga 1680
agaactccag catgagatcc ccgcgctgga ggatcatcca gccattcggg gtcgttcact 1740
ggttcccctt tctgatttct ggcatagaag aacccccgtg aactgtgtgg ttccgggggt 1800
tgctgatttt tgcgagactt ctcgcgcaat tccctagctt aggtgaaaac accatgaaac 1860
actagggaaa cacccatgaa acacccatta gggcagtagg gcggcttctt cgtctagggc 1920
ttgcatttgg gcggtgatct ggtctttagc gtgtgaaagt gtgtcgtagg tggcgtgctc 1980
aatgcactcg aacgtcacgt catttaccgg gtcacggtgg gcaaagagaa ctagtgggtt 2040
agacattgtt ttcctcgttg tcggtggtgg tgagcttttc tagccgctcg gtaaacgcgg 2100
cgatcatgaa ctcttggagg ttttcaccgt tctgcatgcc tgcgcgcttc atgtcctcac 2160
gtagtgccaa aggaacgcgt gcggtgacca cgacgggctt agcctttgcc tgcgcttcta 2220
gtgcttcgat ggtggcttgt gcctgcgctt gctgcgcctg tagtgcctgt tgagcttctt 2280
gtagttgctg ttctagctgt gccttggttg ccatgcttta agactctagt agctttcctg 2340
cgatatgtca tgcgcatgcg tagcaaacat tgtcctgcaa ctcattcatt atgtgcagtg 2400
ctcctgttac tagtcgtaca tactcatatt tacctagtct gcatgcagtg catgcacatg 2460
cagtcatgtc gtgctaatgt gtaaaacatg tacatgcaga ttgctggggg tgcagggggc 2520
ggagccaccc tgtccatgcg gggtgtgggg cttgccccgc cggtacagac agtgagcacc 2580
ggggcaccta gtcgcggata ccccccctag gtatcggaca cgtaaccctc ccatgtcgat 2640
gcaaatcttt aacattgagt acgggtaagc tggcacgcat agccaagcta ggcggccacc 2700
aaacaccact aaaaattaat agtccctaga caagacaaac ccccgtgcga gctaccaact 2760
catatgcacg ggggccacat aacccgaagg ggtttcaatt gacaaccata gcactagcta 2820
agacaacggg cacaacaccc gcacaaactc gcactgcgca accccgcaca acatcgggtc 2880
taggtaacac tgagtaacac tgaaatagaa gtgaacacct ctaaggaacc gcaggtcaat 2940
gagggttcta aggtcactcg cgctagggcg tggcgtaggc aaaacgtcat gtacaagatc 3000
accaatagta aggctctggc ggggtgccat aggtggcgca gggacgaagc tgttgcggtg 3060
tcctggtcgt ctaacggtgc ttcgcagttt gagggtctgc aaaactctca ctctcgctgg 3120
gggtcacctc tggctgaatt ggaagtcatg ggcgaacgcc gcattgagct ggctattgct 3180
actaagaatc acttggcggc gggtggcgcg ctcatgatgt ttgtgggcac tgttcgacac 3240
aaccgctcac agtcatttgc gcaggttgaa gcgggtatta agactgcgta ctcttcgatg 3300
gtgaaaacat ctcagtggaa gaaagaacgt gcacggtacg gggtggagca cacctatagt 3360
gactatgagg tcacagactc ttgggcgaac ggttggcact tgcaccgcaa catgctgttg 3420
ttcttggatc gtccactgtc tgacgatgaa ctcaaggcgt ttgaggattc catgttttcc 3480
cgctggtctg ctggtgtggt taaggccggt atggacgcgc cactgcgtga gcacggggtc 3540
aaacttgatc aggtgtctac ctggggtgga gacgctgcga aaatggcaac ctacctcgct 3600
aagggcatgt ctcaggaact gactggctcc gctactaaaa ccgcgtctaa ggggtcgtac 3660
acgccgtttc agatgttgga tatgttggcc gatcaaagcg acgccggcga ggatatggac 3720
gctgttttgg tggctcggtg gcgtgagtat gaggttggtt ctaaaaacct gcgttcgtcc 3780
tggtcacgtg gggctaagcg tgctttgggc attgattaca tagacgctga tgtacgtcgt 3840
gaaatggaag aagaactgta caagctcgcc ggtctggaag caccggaacg ggtcgaatca 3900
acccgcgttg ctgttgcttt ggtgaagccc gatgattgga aactgattca gtctgatttc 3960
gcggttaggc agtacgttct cgattgcgtg gataaggcta aggacgtggc cgctgcgcaa 4020
cgtgtcgcta atgaggtgct ggcaagtctg ggtgtggatt ccaccccgtg catgatcgtt 4080
atggatgatg tggacttgga cgcggttctg cctactcatg gggacgctac taagcgtgat 4140
ctgaatgcgg cggtgttcgc gggtaatgag cagactattc ttcgcaccca ctaaaagcgg 4200
cataaacccc gttcgatatt ttgtgcgatg aatttatggt caatgtcgcg ggggcaaact 4260
atgatgggtc ttgttgttgg cgtcccggaa aacgattccg aagcccaacc tttcatagaa 4320
ggcggcggtg gaatcgaaat ctcgtgatgg caggttgggc gtcgcttggt cggtcatttc 4380
gaagggcacc aataactgcc ttaaaaaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 4440
tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacagacggc atgatgaacc 4500
tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 4560
acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 4620
cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 4680
ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 4740
tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 4800
gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg gaactccgga 4860
tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 4920
ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 4980
tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 5040
gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgtc 5100
gaagctcggc ggatttgtcc tactcaagct gatccgacaa aatccacaca ttatcccagg 5160
tgtccggatc ggtcaaatac gctgccagct catagaccgt atccaaagca tccggggctg 5220
atccccggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 5280
ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgtggtttgc cccagcaggc 5340
gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 5400
cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 5460
ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 5520
tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 5580
ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 5640
ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 5700
gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 5760
tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 5820
tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 5880
gattgtgcac cgccgcttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 5940
cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 6000
gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 6060
gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 6120
ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 6180
cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac 6240
tctcttccgg gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg atggtgtcaa 6300
cgtaaatgcc gcttcgcctt cgcgcgcgaa ttgcaagctg atccgggctt atcgactgca 6360
cggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag ctgtggtatg gctgtgcagg 6420
tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact cccgttctgg ataatgtttt 6480
ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa tgagctgttg acaattaatc 6540
atcggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagaat 6600
t 6601

<210> 25
<211> 1494
<212> DNA
<213> ExeR gene PCR after being knocked out (DNA)

<400> 25
gtgagaccaa aggtgaactg ccaggtcgac caaattgctc gccaagcaga ctccgaaaaa 60
cacgggtaat tcatatggct tgtatctaat ccatactgaa cagaggacct ctcctatgtc 120
tcgcatttct gcgcgcactc tggcaatcgc acttgccggt gcaaccgcgg ccagcctggc 180
agttgttcca gcagcaacag ctaatcctgc cggaaccgac tccagcacgc ctatggcatg 240
gcttgtgcag gacggtggcg agaccatcaa gtccatccgc accggcgacc aggtggaatt 300
ccaggcacca gtaatcttcg attaccgcta cgacctgtgg aaattccagc caaccacccc 360
tgtcaccggc aacaccgcaa gctccgacct tcctatcacc tgggatgaca cccgcgcggc 420
tgagctagct tcaatcaatg acgttgctgg cgaattccac atcgcaagct tcaacgtgct 480
caactacttc acctctctcg gcgaagatga accaggctgc agcgcataca gggatatcaa 540
caacacccca gtcaccgcca acaactgtaa cgtccgtggc gcttacaccg aagaagcact 600
cgaagatcag cagagcaaga tcgtcgaagc aatcaaccgc cttgacgtcg atgttcttgg 660
acttgaagaa atcgaaaaca ccgcgaccgt caccggcgac gtctcccgtc gcgatgacgc 720
actcaatacc ctcgtcgcag cactcaacga agcagttgga tccgatcgct gggcggccgt 780
cgaatctcca gaacaattgg gcaccgatga agactacatc cgcgtcgcct tcatctacga 840
ccaaaccacc gtcaagcccg tcggcgaatc ccgaatcttc gacgacgcag ccttcaccgg 900
caccgcacgc cagccactcg cacaggaatt ccagccactc aacgacagcg agaaatcctt 960
cgtcggcgta gtcaaccact tcaagtccaa gggctctgtc actcgtggag acgccgacac 1020
cggcgacggc caaggcaaca acgccaacgt tcgcgtcgca caggcacagg cactcatcga 1080
ccacctggaa aaccaggacg actgggcatc caagccaatc ttcatcctcg gcgacaccaa 1140
ctcctacgcc aaggaaaccg cgatgaccac cctttacggc gctggctaca ccaacatcgc 1200
caccgaattc gacgctggct acagctacca gttctccggc cgcattggca gcctcgacca 1260
cgcactcggc aacgaagcag ccatgaagca cgtcatcgac gccgaggtct gggacatcaa 1320
cgctgacgaa gcaatcgcat tcgaatactc ccgtcgactc aacaacacct ccgacgtatt 1380
cgagaacaac gtcttccgct cctccgacca cgacccgatc aaggtcggat tcaacctcag 1440
cgagaccact gagcccacca ttccggtaga gcccactgat cctgcagaac ctac 1494

<210> 26
<211> 2619
<212> DNA
<213> ExeR gene PCR not knocked out (DNA)

<400> 26
gtgagaccaa aggtgaactg ccaggtcgac caaattgctc gccaagcaga ctccgaaaaa 60
cacgggtaat tcatatggct tgtatctaat ccatactgaa cagaggacct ctcctatgtc 120
tcgcatttct gcgcgcactc tggcaatcgc acttgccggt gcaaccgcgg ccagcctggc 180
agttgttcca gcagcaacag ctaatcctgc cggaaccgct cctgtcatca acgaaatcta 240
cggaggcggt ggaaacagcg gatcgttgtt ctccaacgac ttcattgagc tctacaaccc 300
aacctcaggg gacatttccc tcgacggttg gagcgttacc tactacgcag ccaacggtaa 360
ctccggcgga accacaaacc tgaccggaaa catccctgcc aacggttact acctcatcca 420
gcaacgcgca ggcagcaaca acaccggcgc tctgcctacc ccagacgcca ccggtaactt 480
ggcaatgggt gcctcccaag gatcagttgc actgaccgac aactctggcc taaccgctga 540
ccttgtcgga ttcggtggca cgtccatgtt tgaaggaaca gctgctgcac ctgagaccag 600
caacaaattg tctgttcaac gcaaagaagt tggcgctgac tctgataaca actccgtaga 660
cttcgagact ggagctccaa ctccaacgtc ctcgggagga tccgctcctg ttgacccagg 720
cgagccagaa actccagtaa accctgggga aacagtctcc atcgcacaaa tccaaggaac 780
cggtctcgct accccactcg agggtcagac cgtcaccacc gaaggtattg tcactgccgt 840
ttacgcagaa ggtggcttca acggttacta catccagaca cctggatctg gtactgcacc 900
aaaggttgct ggcgacgcat ccgacggcat cttcgtctac gtgggaagca atggttccta 960
cccagagctc ggcgcatctg tcaccgtcac tggcaaggcc accgaacact acgagatgac 1020
tcagctaggc aactcctcct tcaccgtttc ggacaccgca ttcgagccag taaccccact 1080
cgaactggac accgttccta ctggcgatga cattcgcgaa gcatacgaag gcatgctgct 1140
gaagccaacc ggcgctcaca ccgtgaccaa caactacgca accaacacct tcggtgaaat 1200
tgccctcgcc ccaggtaacg agcctttgta ccaggccact caaatggtgg caccgggagc 1260
cgaagcgatt gcgtacgagg cggaaaacgt cgcaaagcaa attacgctgg atgacggacg 1320
ctccggcaac tacactcgcg gcgactccag cacgcctatg gcatggcttg tgcaggacgg 1380
tggcgagacc atcaagtcca tccgcaccgg cgaccaggtg gaattccagg caccagtaat 1440
cttcgattac cgctacgacc tgtggaaatt ccagccaacc acccctgtca ccggcaacac 1500
cgcaagctcc gaccttccta tcacctggga tgacacccgc gcggctgagc tagcttcaat 1560
caatgacgtt gctggcgaat tccacatcgc aagcttcaac gtgctcaact acttcacctc 1620
tctcggcgaa gatgaaccag gctgcagcgc atacagggat atcaacaaca ccccagtcac 1680
cgccaacaac tgtaacgtcc gtggcgctta caccgaagaa gcactcgaag atcagcagag 1740
caagatcgtc gaagcaatca accgccttga cgtcgatgtt cttggacttg aagaaatcga 1800
aaacaccgcg accgtcaccg gcgacgtctc ccgtcgcgat gacgcactca ataccctcgt 1860
cgcagcactc aacgaagcag ttggatccga tcgctgggcg gccgtcgaat ctccagaaca 1920
attgggcacc gatgaagact acatccgcgt cgccttcatc tacgaccaaa ccaccgtcaa 1980
gcccgtcggc gaatcccgaa tcttcgacga cgcagccttc accggcaccg cacgccagcc 2040
actcgcacag gaattccagc cactcaacga cagcgagaaa tccttcgtcg gcgtagtcaa 2100
ccacttcaag tccaagggct ctgtcactcg tggagacgcc gacaccggcg acggccaagg 2160
caacaacgcc aacgttcgcg tcgcacaggc acaggcactc atcgaccacc tggaaaacca 2220
ggacgactgg gcatccaagc caatcttcat cctcggcgac accaactcct acgccaagga 2280
aaccgcgatg accacccttt acggcgctgg ctacaccaac atcgccaccg aattcgacgc 2340
tggctacagc taccagttct ccggccgcat tggcagcctc gaccacgcac tcggcaacga 2400
agcagccatg aagcacgtca tcgacgccga ggtctgggac atcaacgctg acgaagcaat 2460
cgcattcgaa tactcccgtc gactcaacaa cacctccgac gtattcgaga acaacgtctt 2520
ccgctcctcc gaccacgacc cgatcaaggt cggattcaac ctcagcgaga ccactgagcc 2580
caccattccg gtagagccca ctgatcctgc agaacctac 2619

<210> 27
<211> 11982
<212> DNA
<213> Plasmid (pJYS3_crtYf)

<400> 27
taattatcat tgactagccc atctcaattg gtatagtgat taaaatcacc tagaccaatt 60
gagatgtatg tctgaattag ttgttttcaa agcaaatgaa ctagcgatta gtcgctatga 120
cttaacggag catgaaacca agctaatttt atgctgtgtg gcactactca accccacgat 180
tgaaaaccct acaaggaaag aacggacggt atcgttcact tataaccaat acgctcagat 240
gatgaacatc agtagggaaa atgcttatgg tgtattagct aaagcaacca gagagctgat 300
gacgagaact gtggaaatca ggaatccttt ggttaaaggc tttgagattt tccagtggac 360
aaactatgcc aagttctcaa gcgaaaaatt agaattagtt tttagtgaag agatattgcc 420
ttatcttttc cagttaaaaa aattcataaa atataatctg gaacatgtta agtcttttga 480
aaacaaatac tctatgagga tttatgagtg gttattaaaa gaactaacac aaaagaaaac 540
tcacaaggca aatatagaga ttagccttga tgaatttaag ttcatgttaa tgcttgaaaa 600
taactaccat gagtttaaaa ggcttaacca atgggttttg aaaccaataa gtaaagattt 660
aaacacttac agcaatatga aattggtggt tgataagcga ggccgcccga ctgatacgtt 720
gattttccaa gttgaactag atagacaaat ggatctcgta accgaacttg agaacaacca 780
gataaaaatg aatggtgaca aaataccaac aaccattaca tcagattcct acctacataa 840
cggactaaga aaaacactac acgatgcttt aactgcaaaa attcagctca ccagttttga 900
ggcaaaattt ttgagtgaca tgcaaagtaa gcatgatctc aatggttcgt tctcatggct 960
cacgcaaaaa caacgaacca cactagagaa catactggct aaatacggaa ggatctgagg 1020
ttcttatggc tcttgtatct atcagtgaag catcaagact aacaaacaaa agtagaacaa 1080
ctgttcaccg ggcccgtggg tggctaggca agttacagaa ctgatcggat aaaagcagag 1140
ttatatctga tgaattgcta ttagcagtat cgttatcaca gcaccaacaa agtagttcag 1200
ccacaggaaa actttccaac tgcgattagc ctgttcacaa ctggcatctg taatgttcca 1260
aaatcgtgcg gcattaaata cgtaagttag aatcgcaatc ccgatgatcc acgccggatt 1320
aggcaaagta gtgactaaca cagcagctag taaataaagt actactgaaa gccgaatggc 1380
tccacgcgcc ccaattacag tggcaattga gctcagatta gcttcccggt ctgcattaac 1440
atcctgtact gctccaagga tctgactggc catgccccac aagaaaaagg atcccagtgc 1500
tatccacatc gctgctgaag gagatgttcc agtgatcgtt gcaccgatta atgcaggtga 1560
agtgaagtga gtagaagatg ttagagcatc gataaagggg cgttctttaa aacgcaattt 1620
cggtgctgaa taagcaatca ctgctagcac tgagagtgtc agccataaag acgacatcca 1680
ggtgccaaat atgaaaagaa taactaggaa aggaattgtt gagatagccg aggcccataa 1740
cagtgtgctg tgggaacttt tcggtagcac ggccccctcg acgccgcctt tgcggggatt 1800
acgcatatca gattcgtaat caaaaacatc gttgatacca tacatggcga tgttatacgg 1860
gataagaaaa aatacgatgc ctagccaaaa cagccagtca atctctcctg catttaatag 1920
gtaggccaga ccaaaggggt aggcggtatt gatccagcta atggggcgag atgacaatag 1980
aattagtctt attttttcca tcatgactac ggcttttctg gctcagattg cgtggtggtg 2040
gatcgcaccc aatgagaact aggagagtac ctagataaat aaaggccata aaaatatcgc 2100
tatcttgctc attttgtgaa atatcgatga tagggatcaa aatttaatga tcgtatgagg 2160
tcttttgaga tggtgtcgtt ttaggcggca atggttcggg cagtggtcct gcactggtat 2220
cggcatgtaa acgcttaata atattctcgg cagaaattaa acacatgggt attcctacac 2280
ccgggacggt ggtggcaccg gaatagaaga ggttattgac cttgcgggag ctattgcgcc 2340
ctcttaagaa agcggactgt ctgagggtat gtgctggacc cagcgcactg cctacccatg 2400
aatggtagcg gtgctcaaaa tccgcagggc caatggtgcg tttgaccaca attcggtcag 2460
tgaggtcagg gatgccggct tgcgtagcaa tttgattgat tgcatgtgac gcgattgttt 2520
ccacggatgc tgaagccgac tgcatatacg catcaccgtg gccgatgctg ctagaggcct 2580
tggtcggaat taaaacaaaa aggttttcgt atccagcagg tgcaacgccg tcttcggacg 2640
ttgaaggctt ggagacataa atggaatttg atgcattgtg ggggcgggta agttgaggcc 2700
cgtcgaaaac tacagcaaaa tcatctgtcc aatcttcact gaagaaaagg ttgtgatggt 2760
cgagctgggg taactctcct tttacgccca ggaggattaa taccgctcca attccaggat 2820
tgcgattgga ccaatatcgt tcgggatagg ttcgaagttc ccggggaagc agattatttt 2880
ctgtatggtg taggtcgcct gctgaaacca caagatccgc atctagattt tgcacttttc 2940
tgttgtgaag caagctcaca cctgtggcgc ttgtgttgcc cctcgatgaa gcagtgttga 3000
tggaaatgac ctcagaatcg agttgaaact caaccccgtt ttccagcgct aactgatgca 3060
gagcgttaac cactgcagta aaaccaccta tagggtattt cactccctgc accaaatcgg 3120
tatgactcat caagtggtac atcgatgggg tagtagtggg tcgggaagac aggaagactg 3180
ctggataggc tagattgaca gctagctcag tcctaggtat aatggatccg aatttctact 3240
gttgtagatc aggcaaccat agggcaggaa atttaaataa aacgaaaggc tcagtcgaaa 3300
gactgggcct ttcgttttat ctgttgtttg tcggtgaacg ctctcctgag taggacaaat 3360
ccgccgggag cggatttgaa cgttgcgaag caacggcccg gagggtggcg ggcaggacgc 3420
ccgccataaa ctgccaggca tcaaattaag cagaaggcca tcctgacgga tggccttttt 3480
gcgtttctac aaactcttaa gcttgcatgc ctgcaggtcg acttagttat tgcggttctg 3540
gacaaattca aagtattctt cgttcttaat gacgagattc agcttcttgc cttcctggtt 3600
gttcttgatg cgacccagga gcatgagacc cttcagaccg atgtggtagg cgccgtttgc 3660
atcagcgtcc tgtggcatgt tctttggagc ctggcgggaa tcgaagaagt tgccgttgac 3720
gtcggccact ggggagatga ggtaatccag ctcggtgccg gtcttggagt tgcgcatctg 3780
caggatggtg ttgagcacag aggtcagctt tgcgaagaac ttcttgtcgg attcgccgca 3840
gattgcagcc ttgatgcact cgccgtggcc gtattcgatg gagtaatcct tcaggagctt 3900
ctccagttcc ttggttgggt acacttcgcg ggtatcccag ttgtggttct tgtcggagtt 3960
gcggaagttg atgaggcggg agccgaagga tgcgatggtc cacttgccct tggctgcctt 4020
atcgccgaag ttcttgtagt cgaaggagaa ttcgaagtag cccttatcca ggttgtagca 4080
gatcttgtcg aacttggaga agaactcctg ggacttggag acggattcgt actttgggta 4140
gagctggttg acgaagccgg tcactgggca gatcttagag gtgaagccag ctggcacgta 4200
gtagatgatg ccggtctgct tgcccatctt cttgaaggtc tcgaatgggg cggtcagctg 4260
gtatgcacgg aggacgccgc cggtcttatc gaattcgttg tccttgaaca cgaggtagtt 4320
cagcttctcg atgagcatct tttccagctt ctggtagacc tgcttctcca ccttgaagcg 4380
gccgcgcttg aagccgaagt tcaggtcttc gaagaccacg attgcgttgt actcgatcac 4440
cagcttagcg atttcgtgga ccacctggga gaggtagcct tccttcattt ccttgatgtt 4500
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gtcgtggtag ttggtcttca tgcgatcgtt gccgatgatg ttgaaggtgt cctgcttgat 4620
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ggacaggatg tgcacgtcgt tagccttctc cttcaggagc aggttgattt catcgttgaa 4740
cttgttggcg ccggaggact tgaagttgat ggtgattggg cagtggaaga agaacttgtc 4800
ctcggtgaag cgcttatcct tgatcaggtc gtactcgaac acggattcct tctttgggtt 4860
atccttgttc ttgttggcga ttgcttcctt ggctgggtgg gtgatcttct ttgggatgga 4920
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gcgttcgtcg aagagtgcct tccagtagag ggtgtgcagg tttgggcggc ccttggagta 5040
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atcgatgtag gactcggaga tgttttcgaa ggtcagcttg tagccctggt tctccacttc 5160
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ttcgatgttg aactcgaact tttcgtagcc cttctgtggg gagccgttct tggtgtgggt 5340
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ggtgccgatc acggagtaat cgtcgaagac ctgctgggag agatcggtca gggacttgtc 6240
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ctggttcagg tagttgttga agttggcgat ctcgaacact tcatcgaggg agaagacgcg 6660
ctggttcact tcagaggtct tgtaatcgat gtcgaaggtg agctcttcgg ccaggtcctt 6720
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gaaccccaga gtcccgctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 7560
gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 7620
tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 7680
cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 7740
gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tccgcgcctt gagcctggcg 7800
aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 7860
ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 7920
caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 7980
tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 8040
cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 8100
gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtct tggagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 8160
gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 8220
cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 8280
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tcagatcttg atcccctgcg ccatcagatc cttggcggca agaaagccat ccagtttact 8400
ttgcagggct tcccaacctt accagagggc gccccagctg gcaattccgg ttcgcttgct 8460
gtccataaaa ccgcccagtc tagctatcgc catgtaagcc cactgcaagc tacctgcttt 8520
ctctttgcgc ttgcgttttc ccttgtccag atagcccagt agctgacatt catccggggt 8580
cagcaccgtt tctgcggact ggctttctac gtgttccgct tccggtgacc gcctcgatga 8640
tcgccgggtg ggcgtggccc aaggaggatc atccagccat tcggggtcgt tcactggttc 8700
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atttttgcga gacttctcgc gcaattccct agcttaggtg aaaacaccat gaaacactag 8820
ggaaacaccc atgaaacacc cattagggca gtagggcggc ttcttcgtct agggcttgca 8880
tttgggcggt gatctggtct ttagcgtgtg aaagtgtgtc gtaggtggcg tgctcaatgc 8940
actcgaacgt cacgtcattt accgggtcac ggtgggcaaa gagaactagt gggttagaca 9000
ttgttttcct cgttgtcggt ggtggtgagc ttttctagcc gctcggtaaa cgcggcgatc 9060
atgaactctt ggaggttttc accgttctgc atgcctgcgc gcttcatgtc ctcacgtagt 9120
gccaaaggaa cgcgtgcggt gaccacgacg ggcttagcct ttgcctgcgc ttctagtgct 9180
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tgctgttcta gctgtgcctt ggttgccatg ctttaagact ctagtagctt tcctgcgata 9300
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atgtcgtgct aatgtgtaaa acatgtacat gcagattgct gggggtgcag ggggcggagc 9480
caccctgtcc atgcggggtg tggggcttgc cccgccggta cagacagtga gcaccggggc 9540
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ccactaaaaa ttaatagtcc ctagacaaga caaacccccg tgcgagctac caactcatat 9720
gcacgggggc cacataaccc gaaggggttt caattgacaa ccatagcact agctaagaca 9780
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ctggcggggt gccataggtg gcgcagggac gaagctgttg cggtgtcctg gtcgtctaac 10020
ggtgcttcgc agtttgaggg tctgcaaaac tctcactctc gctgggggtc atctctggct 10080
gaattggaag tcatgggcga acgccgcatt gagctggcta ttgctactaa gaatcacttg 10140
gcggcgggtg gcgcgctcat gatgtttgtg ggcactgttc gacacaaccg ctcacagtca 10200
tttgcgcagg ttgaagcggg tattaagact gcgtactctt cgatggtgaa aacatctcag 10260
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ctgtctgacg atgaactcaa ggcgtttgag gattccatgt tttcccgctg gtctgctggt 10440
gtggttaagg ccggtatgga cgcgccactg cgtgagcacg gggtcaaact tgatcaggtg 10500
tctacctggg gtggagacgc tgcgaaaatg gcaacctacc tcgctaaggg catgtctcag 10560
gaactgactg gctccgctac taaaaccgcg tctaaggggt cgtacacgcc gtttcagatg 10620
ttggatatgt tggccgatca aagcgacgcc ggcgaggata tggacgctgt tttggtggct 10680
cggtggcgtg agtatgaggt tggttctaaa aacctgcgtt cgtcctggtc acgtggggct 10740
aagcgtgctt tgggcattga ttacatagac gctgatgtac gtcgtgaaat ggaagaagaa 10800
ctgtacaagc tcgccggtct ggaagcaccg gaacgggtcg aatcaacccg cgttgctgtt 10860
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gttctcgatt gcgtggataa ggctaaggac gtggccgctg cgcaacgtgt cgctaatgag 10980
gtgctggcaa gtctgggtgt ggattccacc ccgtgcatga tcgttatgga tgatgtggac 11040
ttggacgcgg ttctgcctac tcatggggac gctactaagc gtgatctgaa tgcggcggtg 11100
ttcgcgggta atgagcagac tattcttcgc acccactaaa agcggcataa accccgttcg 11160
atattttgtg cgatgaattt atggtcaatg tcgcgggggc aaactatgat gggtcttgtt 11220
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tactgggtgc attagccagt ctgaatgacc tgtcacggga taatccgaag tggtcagact 11400
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gtgagcgcag cgaactgaat gtcacgaaaa agacagcgac tcaggtgcct gatggtcgga 11640
gacaaaagga atattcagcg atttgcccga gcttgcgagg gtgctactta agcctttagg 11700
gttttaaggt ctgttttgta gaggagcaaa cagcgtttgc gacatccttt tgtaatactg 11760
cggaactgac taaagtagtg agttatacac agggctggga tctattcttt ttatcttttt 11820
ttattctttc tttattctat aaattataac cacttgaata taaacaaaaa aaacacacaa 11880
aggtctagcg gaatttacag agggtctagc agaatttaca agttttccag caaaggtcta 11940
gcagaattta cagataccca caactcaaag gaaaaggact ag 11982

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]