特許 6873418 遺伝子導入された細胞の製造方法及びポリエチレンイミンの置換体ポリマー

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6873418

(24)【登録日】2021年4月23日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】遺伝子導入された細胞の製造方法及びポリエチレンイミンの置換体ポリマー

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/87 20060101AFI20210510BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210510BHJP

   C08G 18/64 20060101ALI20210510BHJP

   C08G 18/60 20060101ALI20210510BHJP

   C08L 79/02 20060101ALI20210510BHJP

   C08L 39/02 20060101ALI20210510BHJP

   C08L 77/04 20060101ALI20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/87 Z

   C12N5/10

   C08G18/64

   C08G18/60

   C08L79/02

   C08L39/02

   C08L77/04

【請求項の数】15

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2016-221047(P2016-221047)

(22)【出願日】2016年11月11日

(65)【公開番号】特開2018-74984(P2018-74984A)

(43)【公開日】2018年5月17日

【審査請求日】2019年11月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】304024430

【氏名又は名称】国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学

(73)【特許権者】

【識別番号】000253019

【氏名又は名称】澁谷工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110002332

【氏名又は名称】特許業務法人綾船国際特許事務所

(74)【代理人】

【識別番号】100127133

【弁理士】

【氏名又は名称】小板橋 浩之

(72)【発明者】

【氏名】松村 和明

(72)【発明者】

【氏名】サナ アハマッド

(72)【発明者】

【氏名】中 俊明

【審査官】 佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１５−１００２８７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 中国特許出願公開第１０２４３２８７７（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特開平１１−１８７８７４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００２−３７０３１０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１１−０３０５５７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２００６−３０４６４４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 The Journal of Gene Medicine (2009), Vol.11, pp.921-932

【文献】 Biomaterials (2009), Vol.30, pp.4187-4194

【文献】 The Journal of Gene Medicine (2010), Vol.12, pp.729-738

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ０８Ｇ

Ｃ０８Ｌ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程、
培地中の複合体と細胞を、凍結する工程、
凍結した細胞を、解凍する工程、
を含む、遺伝子導入された細胞を製造する方法であって、
カチオン性ポリマーが、
アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のＲ^１基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ^２基：
Ｒ^１基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＯＯＨ）Ｒ^１１
（ただし、Ｒ^１１基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
Ｒ^２基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＯＯＨ）Ｒ^２１
（ただし、Ｒ^２１基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ^１１基とは異なる基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーである、方法。

【請求項2】

核酸とカチオン性ポリマーとの複合体が、
核酸と、カチオン性ポリマーとを、溶液中で混合することによって複合体を形成する行程、によって形成された複合体である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

核酸が、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。

【請求項4】

核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程が、
核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を、細胞が分散した培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

ポリエチレンイミンが、直鎖型ポリエチレンイミンまたは分岐型ポリエチレンイミンである、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

培地が、凍結保護剤を含む培地である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

凍結保護剤が、
ＤＭＳＯ、両性電解質高分子化合物、ポリオール類、及び糖類からなる群から選択された凍結保護剤である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

請求項１〜７のいずれかに記載の方法によって製造された遺伝子導入細胞の遺伝子を発現させて、遺伝子産物を製造する方法。

【請求項9】

アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のＲ^１基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ^２基：
Ｒ^１基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＯＯＨ）Ｒ^１１
（ただし、Ｒ^１１基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
Ｒ^２基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ_２−ＣＯＯＨ）Ｒ^２１
（ただし、Ｒ^２１基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ^１１基とは異なる基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマー。

【請求項10】

Ｒ^１１基が、水素、又はＣ１〜Ｃ２のアルキル基であり、Ｒ^２１基が、Ｃ３〜Ｃ５のアルキル基である、請求項９に記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。

【請求項11】

Ｒ^１１基が、水素であり、Ｒ^２１基が、ブチル基である、請求項９に記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。

【請求項12】

ポリエチレンイミン置換体ポリマーにおいて、
置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ^１基のモル数の比率が、５〜２５の範囲にあり、
置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ^２基のモル数の比率が、１０〜３０の範囲にある、請求項９〜１１のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。

【請求項13】

請求項９〜１２のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマーからなる、遺伝子導入剤。

【請求項14】

請求項９〜１２のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマーと、核酸を含む、核酸複合体組成物。

【請求項15】

核酸が、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸である、請求項１４に記載の核酸複合体組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、遺伝子導入された細胞の製造方法、及び遺伝子導入に好適なポリエチレンイミンの置換体ポリマーに関する。

【背景技術】

【0002】

細胞への遺伝子導入技術として、ポリエチレンイミンなどのポリマーをナノキャリアとして使用した技術が知られている。このようなナノキャリアとＤＮＡとの複合体を形成させた後に、細胞へ投与することによって、ＤＮＡ単独で細胞へ投与した場合と比較して、高い効率で遺伝子が導入され発現する。このようなナノキャリアにおいて、遺伝子の導入と発現の効率を上昇させるために、新しいナノキャリアとなる化合物が探索されてきた（特許文献１、特許文献２）。また新しいナノキャリアとなる化合物は、細胞毒性の点においても良好であることが求められている。

【0003】

細胞の凍結保存技術として、凍結保存剤を添加した凍結保存技術が知られている（特許文献３）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２００６−２４６７６６号公開特許公報

【特許文献2】特開２０１２−０６０９９７号公開特許公報

【特許文献3】特開２０１５−１００２８７号公開特許公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

したがって、本発明の目的は、遺伝子の導入と発現の効率に優れた、細胞への遺伝子導入の手段を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者は、細胞への遺伝子導入の手段について、鋭意研究を行ってきたところ、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質と遺伝子との複合体を形成した後に培地へ添加した状態で、細胞を凍結解凍することによって、上記目的を達成できることを見いだして、本発明に到達した。

【0007】

したがって、本発明は次の（１）以下を含む。
（１）
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程、
培地中の複合体と細胞を、凍結する工程、
凍結した細胞を、解凍する工程、
を含む、遺伝子導入された細胞を製造する方法。
（２）
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体が、
核酸と、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質とを、溶液中で混合することによって複合体を形成する工程、によって形成された複合体である、（１）に記載の方法。
（３）
核酸が、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸である、（１）〜（２）のいずれかに記載の方法。
（４）
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程が、
核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、細胞が分散した培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程である、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
カチオン性ポリマーが、
ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアリルアミン、及びこれらの修飾ポリマーからなる群から選択された１種以上のカチオン性ポリマーである、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）
ポリエチレンイミンが、直鎖型ポリエチレンイミンまたは分岐型ポリエチレンイミンである、（５）に記載の方法。
（７）
ポリエチレンイミンの修飾ポリマーが、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ¹基：
Ｒ¹基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）Ｒ¹¹
（ただし、Ｒ¹¹基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーである、（５）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）
ポリエチレンイミンの修飾ポリマーが、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のＲ¹基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ²基：
Ｒ¹基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）Ｒ¹¹
（ただし、Ｒ¹¹基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
Ｒ²基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）Ｒ²¹
（ただし、Ｒ²¹基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ¹¹基とは異なる基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーである、（５）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（９）
培地が、凍結保護剤を含む培地である、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）
凍結保護剤が、ＤＭＳＯ、両性電解質高分子化合物、ポリオール類、及び糖類からなる群から選択された凍結保護剤である、（９）に記載の方法。
（１１）
（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法によって製造された遺伝子導入細胞の遺伝子を発現させて、遺伝子産物を製造する方法。

【0008】

さらに本発明は次の（１２）以下を含む。
（１２）
アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、
アミノ基、アミノ基が置換されてなる次のＲ¹基、及びアミノ基が置換されてなる次のＲ²基：
Ｒ¹基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）Ｒ¹¹
（ただし、Ｒ¹¹基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基である）
Ｒ²基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）Ｒ²¹
（ただし、Ｒ²¹基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基であり、Ｒ¹¹基とは異なる基である）
を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマー。
（１３）
Ｒ¹¹基が、水素、又はＣ１〜Ｃ２のアルキル基であり、Ｒ²¹基が、Ｃ３〜Ｃ５のアルキル基である、（１２）に記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。
（１４）
Ｒ¹¹基が、水素であり、Ｒ²¹基が、ブチル基である、（１２）に記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。
（１５）
ポリエチレンイミン置換体ポリマーにおいて、
置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ¹基のモル数の比率が、５〜２５の範囲にあり、
置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ²基のモル数の比率が、１０〜３０の範囲にある、（１２）〜（１４）のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマー。
（１６）
（１２）〜（１５）のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマーからなる、遺伝子導入剤。
（１７）
（１２）〜（１５）のいずれかに記載のポリエチレンイミン置換体ポリマーと、核酸を含む、核酸複合体組成物。
（１８）
核酸が、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸である、（１７）に記載の核酸複合体組成物。
（１９）
（１７）〜（１８）のいずれかに記載の核酸複合体組成物によって遺伝子導入されてなる、遺伝子導入細胞。
（２０）
（１７）〜（１８）のいずれかに記載の核酸複合体組成物によって遺伝子導入された遺伝子が発現されて産生された、遺伝子産物。

【発明の効果】

【0009】

本発明は、遺伝子の導入と発現の効率に優れた、細胞への遺伝子導入の手段及び遺伝子導入に好適なポリエチレンイミンの置換体ポリマーを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】図１は、ブチル無水コハク酸と無水コハク酸でアミノ基の一定割合を修飾した分岐型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡ）の合成の流れを示す。

【図2】図２は、異なる構造の分岐型ＰＥＩを用いたＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡを合成する流れを示す。

【図3A】図３Ａは、合成したＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡの１Ｈ−ＮＭＲ測定の結果である。

【図3B】図３Ｂは、１Ｈ−ＮＭＲ測定のピーク番号に対応する構造式中の位置を示す

【図4】図４は、合成したＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡ等の細胞毒性試験の結果である。

【図5】図５は、大腸菌(DH5α)によるプラスミドの増幅と形質転換の手順を示す。

【図6】図６は、リポフェクトアミンの構造を示す。

【図7】図７は、凍結濃縮実験系の手順を示す。

【図8】図８は、市販の直鎖型ＰＥＩ（ＪＥＴ ＰＥＩ）による複合体を添加した場合の培養１０時間後のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。

【図9】図９は、市販の分岐型ＰＥＩによる複合体（PEI:DNA 5:1(w/w)）を添加した場合のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。

【図10】図１０は、市販のリポフェクタミン（リポソーム系導入試薬）による複合体を添加した場合のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。

【図11】図１１は、PEI-BSA-SAによる複合体（PEI-BSA(20)-SA(15)-DNA (AcGFP)複合体）を添加した場合の１０時間培養後の細胞のＧＦＰ発現の様子を示す蛍光顕微鏡写真である。

【図12】図１２は、市販のリポフェクタミン、JETPEI、分岐型PEIを用いた場合のルシフェラーゼ活性を、非凍結濃縮系と凍結濃縮系とで対比するグラフである。

【図13】図１３は、PEI-BSA(20)-SA(15)を用いた場合のルシフェラーゼ活性を、PEI-BSA(20)-SA(15)：DNAのそれぞれの比率ごとに、非凍結濃縮系と凍結濃縮系とで対比するグラフである。

【図14】図１４は、PEI-BSA(20)-SA(15)を用いた複合体による凍結濃縮系において、細胞の核をヘキスト３３３４２（Hoechst 33342）で染色し、エンドソームをリソトラッカーグリーン（lysotracker green）でラベルし、プラスミドＤＮＡをレッドシアニン３’（Red cyanine 3’）でラベルした、蛍光顕微鏡写真である。

【図15】図１５は、直鎖型ＰＥＩ(JET PEI)とレッドシアニン３’（Red cyanine 3’）でラベルしたプラスミドＤＮＡ（pAcGFPプラスミド）との複合体を使用して、複合体のプラスミドＤＮＡが細胞に導入される様子を、凍結濃縮系と非凍結濃縮系とで比較した顕微鏡写真である。

【発明を実施するための形態】

【0011】

具体的な実施の形態をあげて、以下に本発明を詳細に説明する。本発明は、以下にあげる具体的な実施の形態に限定されるものではない。

【0012】

［凍結解凍による遺伝子導入］
本発明によれば、核酸とカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質との複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする工程、培地中の複合体と細胞を、凍結する工程、凍結した細胞を、解凍する工程、を含む方法によって、遺伝子導入された細胞を製造することができる。この方法は、細胞へ遺伝子を導入する方法でもある。

【0013】

従来、カチオン性ポリマー等を使用した細胞への遺伝子導入技術の改良は、核酸のキャリアとしてより特性の優れた新規なカチオン性ポリマー等の化合物を開発するというアプローチによって、行われてきた。しかし、本発明者は、カチオン性ポリマー又はカチオン性脂質を核酸のキャリアとして使用して複合体を形成させた後に、これを培地に添加して細胞を凍結することによって、従来から知られているカチオン性ポリマー又はカチオン性脂質であっても、導入と発現の効率が大幅に上昇することを見いだして、本発明に到達した。

【0014】

［核酸］
導入される核酸は、遺伝子導入される遺伝子を含む核酸であり、従来の遺伝子導入技術において使用されている核酸を使用することができる。好適な実施の態様において、核酸として、例えば、DNA、RNA、small interfering RNA(siRNA)、遺伝子導入される遺伝子を含むプラスミドの形態の核酸を使用することができる。

【0015】

［細胞］
遺伝子導入される細胞は、従来の遺伝子導入技術において使用されている細胞を、特に制限なく使用することができる。動物細胞を好適に使用できる。好適な実施の態様において、細胞として、例えば、Chinese Hamster Ovary（CHO）細胞、間葉系幹細胞、がん細胞などをあげることができる。細胞の状態は、核酸とカチオン性ポリマーとの複合体が、培地中で十分に接触可能な状態であれば、特に制限はない。例えば、ディッシュ上で培養された状態の細胞であってもよく、三次元的な組織に包埋された状態の細胞であってもよく、培地中に分散された状態の細胞であってもよい。好適な実施の態様において、培地中に細胞が分散された状態の細胞を使用することができる。

【0016】

［培地］
培地としては、従来の遺伝子導入技術において使用されている細胞の培地を、特に制限なく使用することができる。好適な実施の態様において、培地としては、例えば、無血清ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM培地）、ＲＰＭＩ培地、イーグル培地をあげることができる。

【0017】

［凍結保護剤］
本発明は、凍結の工程によって細胞へ高い効率で遺伝子導入を可能としているが、好適な実施の態様において、細胞の保護のために、培地として、凍結保護剤が添加された培地を使用することができる。このような凍結保護剤として、公知の凍結保護剤を使用することができる。凍結保護剤として、例えば、ＤＭＳＯ、両性電解質高分子化合物、ポリオール類、糖類をあげることができる。両性電解質高分子化合物としては、例えば、カルボキシル基が導入されたε−ポリ−Ｌ−リジン、ポリジメチルアミノエチルメタクリル酸・メタクリル酸共重合体、ポリスルホベタインをあげることができる。ポリオール類としては、例えば、グリセリン、エチレングリコール、ヒドロキシエチルスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロースをあげることができる。糖類としては、例えば、トレハロース、グルコース、スクロースをあげることができる。これらの凍結保護剤は、それぞれ公知の濃度となるように添加して、使用することができる。ＤＭＳＯは、培地中の最終濃度として、例えば１〜２０質量％の濃度となるように使用できる。カルボキシル基が導入されたε−ポリ−Ｌ−リジンは、培地中の最終濃度として、例えば１〜２０質量％の濃度となるように使用できる。カルボキシル基が導入されたε−ポリ−Ｌ−リジンは、特許文献３に記載の方法によって合成することができる。カルボキシル基を導入したε−ポリ−Ｌ−リジンにおいて、アミノ基に対するカルボキシル基の比率（カルボキシル基／アミノ基）が、例えば０．８〜１９の範囲、好ましくは１．５〜１５の範囲とすることができる。ポリジメチルアミノエチルメタクリル酸・メタクリル酸共重合体は、文献「Rajan R, et al., J. Biomater. Sci. Polym. Ed., 24, 1767-1780, 2013」の開示を参照して使用することができる。ポリスルホベタインは、文献「Rajan R, et al., Biomacromolecules, 17, 1882-1893, 2016」の開示を参照して使用することができる。

【0018】

［カチオン性ポリマー］
カチオン性ポリマーとしては、核酸との複合体を形成できるポリマーが使用される。カチオン性ポリマーとして、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリオルニチン、ポリアリルアミンおよびこれらの修飾ポリマーからなる群から選択された１種以上のカチオン性ポリマーをあげることができる。従来から、遺伝子導入剤として使用されてきたカチオン性ポリマーを、本発明の凍結工程において、好適に使用することができる。

【0019】

［カチオン性脂質］
カチオン性脂質としては、核酸との複合体を形成できる脂質が使用される。カチオン性脂質として、例えば、ポリフェクトアミン、1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane chloride、 1,2-dioleyloxy-3-trimethylammonium propane chloride、 1,2-diolyloxy-3-dimethylaminonium propane、 O,O’-ditetradecanoyl-N-(α-trimethylammonioacetyl)diethanolamine chlorideをあげることができる。従来から、遺伝子導入剤として使用されてきたカチオン性脂質を、本発明の凍結工程において、好適に使用することができる。

【0020】

［ポリエチレンイミン］
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）としては、直鎖型ポリエチレンイミン及び分岐型ポリエチレンイミンをあげることができる。これらの構造式を、図１、図２及び後述する実施例において、例示して示す。分岐型のポリエチレンイミンは、単一の繰り返し構造を備えているものではないが、その分岐構造に由来してアミノ基を有している。アミノ基を有するポリエチレンイミンは、そのアミノ基の一部又は全部を置換することによって、修飾ポリマーとして、置換体ポリマーを製造することができる。この置換体を製造するための修飾の流れを、図１、図２に例示して示す。

【0021】

［アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマー］
好適な実施の態様において、カチオン性ポリマーとして、ポリエチレンイミンの修飾ポリマーを使用することができる。特に好適なポリエチレンイミンの修飾ポリマーとして、アミノ基を有するポリエチレンイミンにおいて、アミノ基を置換して調製した置換体ポリマーをあげることができる。

【0022】

［アミノ基及びＲ¹基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマー］
好適な実施の態様において、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーとして、アミノ基と、アミノ基が置換されてなるＲ¹基を有する、ポリエチレンイミンの置換体ポリマーをあげることができる。

【0023】

上記Ｒ¹基は、
Ｒ¹基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）Ｒ¹¹
である。

【0024】

Ｒ¹基において、Ｒ¹¹基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基とすることができ、好ましくは水素、又はＣ１〜Ｃ２のアルキル基であり、特に好ましくは水素である。

【0025】

ポリエチレンイミン置換体ポリマーにおいて、置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ¹基のモル数の比率を、例えば５〜２５の範囲、１０〜２０の範囲とすることができる。

【0026】

［アミノ基、Ｒ¹基及びＲ²基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマー］
好適な実施の態様において、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーとして、アミノ基と、アミノ基が置換されてなるＲ¹基と、アミノ基が置換されてなるＲ²基を有する、ポリエチレンイミンの置換体ポリマーをあげることができる。

【0027】

上記Ｒ¹基は、
Ｒ¹基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）Ｒ¹¹
である。

【0028】

Ｒ¹基において、Ｒ¹¹基は、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基とすることができ、好ましくは水素、又はＣ１〜Ｃ２のアルキル基であり、特に好ましくは水素である。

【0029】

上記Ｒ²基は、
Ｒ²基： −ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ（ＣＨ₂−ＣＯＯＨ）Ｒ²¹
である。

【0030】

Ｒ²基において、Ｒ²¹基は、Ｒ¹¹基とは異なる基であり、水素、又はＣ１〜Ｃ６のアルキル基とすることができ、好ましくはＣ３〜Ｃ５のアルキル基であり、特に好ましくはブチル基である。

【0031】

ポリエチレンイミン置換体ポリマーにおいて、置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ¹基のモル数の比率を、例えば５〜２５の範囲、１０〜２０の範囲とすることができる。置換前のアミノ基のモル数を１００とした場合のＲ²基のモル数の比率を、例えば１０〜３０の範囲、１５〜２５の範囲とすることができる。

【0032】

［核酸とカチオン性ポリマーとの複合体］
核酸とカチオン性ポリマーとの複合体を、培地中へ添加して、培地中で細胞と接触可能にする。好適な実施の態様において、複合体は、核酸と、カチオン性ポリマーとを、溶液中で混合することによって形成することができる。本発明は、この複合体組成物にもある。

【0033】

［凍結］
培地中の複合体と細胞を凍結する工程は、細胞の凍結保存時における凍結の操作と同様の操作によって行うことができる。例えば、フリーザー（例えば、−８０℃）の中に置いて、凍結することができる。凍結された細胞は、適宜保存することもできるが、速やかに解凍して、次の操作に供することもできる。

【0034】

［解凍］
凍結した細胞を解凍する工程は、細胞の凍結保存時における解凍の操作と同様の操作によって行うことができる。例えば、室温下あるいは３７℃で静置して解凍してもよい。適宜、湯浴等の手段を使用してもよい。

【0035】

［遺伝子発現］
凍結によって遺伝子導入された細胞は、解凍されて培養可能な状態となる。培養は、それぞれの細胞に応じた条件によって行うことができ、導入された遺伝子の発現を、それぞれの遺伝子に応じた公知の手段によって確認することができる。

【0036】

［遺伝子導入剤］
核酸と複合体を形成して遺伝子導入を行うことができる遺伝子導入剤として、本発明において、上述のカチオン性ポリマーを使用することができる。好適な実施の態様において、遺伝子導入剤として、ポリエチレンイミンの置換体ポリマーを使用することができ、好ましくはアミノ基及びＲ¹基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマー、及びアミノ基、Ｒ¹基及びＲ²基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーを使用することができる。

【0037】

後述する実施例で示すように、このアミノ基、Ｒ¹基及びＲ²基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーは、凍結工程を備えた本発明の遺伝子導入方法において好適に使用できることに加えて、凍結工程を備えない従来の手法による遺伝子導入方法においても好適に使用することができる。したがって、本発明は、アミノ基を有するポリエチレンイミンの置換体ポリマーであって、アミノ基、アミノ基が置換されてなるＲ¹基、及びアミノ基が置換されてなるＲ²基を有する、ポリエチレンイミン置換体ポリマーにもある。このアミノ基、Ｒ¹基及びＲ²基を有するポリエチレンイミン置換体ポリマーは、従来の遺伝子導入剤であるポリエチレンイミンと比較して、ＩＣ５０の濃度が５倍以上であるという、細胞毒性が著しく低減されたものとなっている。

【実施例】

【0038】

以下に実施例をあげて、本発明を詳細に説明する。本発明は、以下に例示する実施例に限定されるものではない。なお、実施例中、特にことわりのない限り「％」及び「部」はそれぞれ重量％及び重量部を示す。

【0039】

［合成］
0.5gの分岐型ポリエチレンイミン（シグマアルドリッチ製、1級：2級：3級アミン＝１：２：１(モル比)、分子量２５ｋDa）を10mLの0.5MNaCl水溶液に溶解し、pHを塩酸で5.0に調整した。ブチル無水コハク酸（BSA、東京化成）0.266ｇを加えて100℃で2時間反応させ、次に無水コハク酸（SAナカライテスク）を0.170g加えて100℃で2時間反応させた。透析により精製を行い、凍結乾燥により回収した。TNBS法（Haneeb, A. F. Anal. Biochem. 1966, 14, 328-36による）によるアミノ基の定量から、BSAの置換率は約20±0.8モル％、SAの置換率は約15±1.2％であった。PEI-BSA(20)-SA(15)と表記。BSAによる置換を行わず、SAによる置換のみ行ったPEI-SA(15)も併せて毒性試験に供した。

【0040】

上述した、ブチル無水コハク酸と無水コハク酸でアミノ基の一定割合を修飾した分岐型ポリエチレンイミン（ＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡ）の合成の流れを、図１に示す。図１において、出発材料である分岐型ＰＥＩの構造式では、アミノ基を有する繰り返し単位と、アミノ基を有さない繰り返し単位とが、それぞれ繰り返し単位数ｘとｙとで存在していることを示しているが、これは分子全体の繰り返し単位数のなかにあるアミノ基を有する繰り返し単位の数を、まとめて表現するための構造式であって、アミノ基を有する繰り返し単位と有さない繰り返し単位とが、それぞれ連続して存在していることを示すものではない。図１に例示した分岐型ＰＥＩの構造とは異なる構造の分岐型ＰＥＩを例示して、出発材料として使用してＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡを合成する流れを、図２に示す。図２においても例示した繰り返し単位の構造式は、繰り返し単位の構造の多様性を説明するための例示であって、この構造式と完全同一の繰り返し単位によって分子全体が構成されていることを示すものではない。

【0041】

合成したＰＥＩ−ＢＳＡ−ＳＡの特定を１Ｈ−ＮＭＲ測定によって行った。１Ｈ−ＮＭＲ測定によるグラフを図３Ａに示す。図３Ｂに図３Ａの１Ｈ−ＮＭＲ測定のピーク番号に対応する構造式中の位置を示す。

【0042】

［毒性試験］
毒性試験では、HEK293細胞を使用した。96wellプレートに各ウェルあたり1000個の細胞を播種し、72時間後、所定濃度のPEI化合物を添加し、さらに24時間後、細胞の生存率をMTT法で定量化し、化合物無添加系に対する生存率の比を計算した。その割合が50％を切るのに必要な濃度をIC50で表し、毒性の指標とした。市販の分岐型PEIのIC50 ha40μg/mL、PEI-SA(15)のIC50は175μg/ML、PEI-BSA(20)-SA(15)のIC50は220μg/mLという結果であり、PEI-BSA(20)-SA(15)が最も低い毒性を示した。これは、アミノ基がより多くカルボキシル基に変換されていることが原因であると考えられる。この結果のグラフを、図４に示す。図４のグラフのなかで、下向きの矢印は、それぞれのカーブのなかでＩＣ５０にあたる値が、横軸でどの値に相当するかを示した矢印である。

【0043】

［プラスミドの抽出］
プラスミドは、大腸菌(DH5α)を用い、pAcGFP-N2(Clontech, USA)とpGL4.51[luc2/CMV/Neo] (Promega, USA)を増幅させ、Genopure plasmid kit（ロシュ）を用いて純化し、使用した。pAcGFP-N2はGreen Fluorescent Protein (GFP)をエンコードしており、大腸菌中での増幅にカナマイシン抵抗性遺伝子を使用した。pGL4.51[luc2/CMV/Neo]ベクターは、luc2リポーター遺伝子を有しており、大腸菌中での増幅にアンピシリン抵抗性遺伝子を使用した。大腸菌(DH5α)によるプラスミドの増幅と形質転換の手順を図５に示す。

【0044】

［HEK293細胞への遺伝子導入］
遺伝子導入のために、市販のJETPEI（PolyPlus Transfection）、市販のリポフェクタミン3000（Thermo Scientific）、市販の分岐型PEI（シグマアルドリッチ社製、製品名Branched polyethyleneimine、平均分子量25000）、および上記合成したPEI-BSA(20)-SA(15)を用いた。JETPEIは、直鎖型ＰＥＩを用いた導入キットである。リポフェクタミン３０００は、リポフェクトアミンを用いた導入キットである。直鎖型ＰＥＩの構造を以下に示す。リポフェクトアミンの構造を図６に示す。

【化1】

【0045】

JETPEIは、所定のプロトコルにしたがって、生理食塩水５０μＬ中にJETPEI試薬２μL及びプラスミド１μｇを含むように添加して混合し、複合体溶液として調製して、後述のように細胞に投与した。
リポフェクタミンは、所定のプロトコルにしたがって、Opti-MEMバッファー１２５μＬ中にリポフェクタミン溶液７．５μL及びプラスミド１μｇを含むように添加して混合し、複合体溶液として調製して、後述のように細胞に投与した。
市販の分岐型PEIは、リン酸緩衝液（pH7.4）５０μＬ中に、プラスミド1μgに対してポリマー2、5、7、10μg（ポリマー:DNA=2:1、5:1，7:1、10:1）となるように添加して混合し、複合体溶液として調製して、後述のように細胞に投与した。
上記合成したPEI-BSA(20)-SA(15)は、リン酸緩衝液（pH7.4）５０μＬ中に、プラスミド1μgに対してポリマー2、5、7、10μg（ポリマー:DNA=2:1、5:1，7:1、10:1）となるように添加して混合し、複合体溶液として調製して、後述のように細胞に投与した。
上記の直鎖型ＰＥＩ、リポフェクタミン、分岐型ＰＥＩ又はPEI-BSA(20)-SA(15)と、プラスミドとの複合体の溶液を細胞へ投与するにあたっては、後述する通り、凍結濃縮法による実験（凍結濃縮実験系）と、凍結濃縮を利用しない実験（非凍結濃縮実験系）とを行った。

【0046】

［非凍結濃縮系］
上記作成した複合体の細胞への投与にあたって、凍結濃縮を利用しない実験（本発明の比較例）を以下のように行った。
10⁶個の細胞を3.5cmディッシュに播種し、１ｍL の培養液（無血清ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM））中で10時間培養後、それぞれの複合体試薬溶液（いずれの複合体溶液も50μL、ただしリポフェクタミンによる複合体溶液は125μL）を添加後、10時間37℃、インキュベータ中で培養して、後述のように、共焦点レーザー顕微鏡でGFPの発現の観察(pAcGFP-N2の場合)、ルミノメータ（Lumat3、ベルトールド）でルシフェラーゼ活性の測定（pGL4.51の場合）を行い、遺伝子導入を確認した。

【0047】

ルシフェラーゼ活性の測定は、ルシフェラーゼアッセイキット（Promega）を使用してその使用法に則り行った。培養後の細胞を１ｍL のPBSで3回洗浄し、キット付属の細胞溶解液（2mMジチオスレイトール、２ｍM 1,2-diaminocycloheaxane-N,N,N',N'-teraacetic acid、10%グリセリン1% Triton X-100の25mMトリスリン酸バッファーpH7.8溶液）500μLで細胞を溶解させ、全量をマイクロチューブに回収した。その後、13200rpmで遠心分離し、上清を回収した。キット付属のルシフェラーゼアッセイ試薬（ルシフェリンPBS溶液）をあらかじめ100μL添加したチューブに上記細胞溶解液上清を20μL添加し、ルミノメータにて2秒間の発光を測定し、RLU（相対発光量）を算出し、比較した。

【0048】

［凍結濃縮系］
上記調製した複合体の細胞への投与にあたって、凍結濃縮法による実験（本発明の実施例）を以下のように行った。
クライオバイアル中に10⁶個の細胞を懸濁した１ｍL の無血清DMEM培地（10％DMSOおよび複合体試薬溶液（50μL（リポフェクタミンのみ125μL））含有）を添加し、-80℃のフリーザー中で一晩凍結した。37℃の湯浴中で解凍した後、１ｍL のPBSで3回遠心洗浄した後、3.5cmディッシュに細胞を全量播種し、１ｍL の無血清DMEM中を添加して37℃のインキュベータで10時間培養後、共焦点レーザー顕微鏡観察およびルシフェラーゼ活性の測定を行った。この凍結濃縮実験系の手順を図７に示す。

【0049】

［GFP発現］
市販品のJETPEIでは、非凍結濃縮実験系では、GFPの発現による緑の蛍光がほとんど見られなかったが、凍結濃縮実験系では、GFPの発現による緑の蛍光が明瞭に確認された。市販の分岐型PEIでは凍結のあるなしにかかわらず、蛍光はほとんど観察されなかった。リポフェクタミン3000の場合も、凍結しない場合は蛍光が観察されなかったのに対し、凍結により蛍光が確認された。PEI-BSA(20)-SA(15)に関しては、いずれのポリマー：DNAの割合においても凍結後に蛍光が観察された。5:1の場合は、若干凍結無しの系でも蛍光が確認できた。

【0050】

図８〜図１０に、市販のリポフェクタミン、分岐型ＰＥＩ、直鎖型ＰＥＩのGFP発現の様子を示す。図８〜図１０において、上段の図は、非凍結濃縮系によって得られた細胞の顕微鏡写真である。上段の左図は細胞の顕微鏡写真、上段の中央図はＧＦＰ発現を観察する蛍光顕微鏡写真、上段の右図は両視野を重ねた写真である。図８〜図１０のいずれの図においても、下段の図は、凍結濃縮系によって得られた細胞の顕微鏡写真である。下段の左図は細胞の顕微鏡写真、下段の中央図はＧＦＰ発現を観察する蛍光顕微鏡写真、下段の右図は両視野を重ねた写真である。

【0051】

図８は、市販の直鎖型ＰＥＩ（ＪＥＴ ＰＥＩ）による複合体を添加した場合の培養１０時間後のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。

【0052】

図９は、市販の分岐型ＰＥＩによる複合体（PEI:DNA 5:1(w/w)）を添加した場合のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。

【0053】

図１０は、市販のリポフェクタミン（リポソーム系導入試薬）による複合体を添加した場合のＧＦＰ発現の様子を示す顕微鏡写真である。

【0054】

図１１は、PEI-BSA-SAによる複合体（PEI-BSA(20)-SA(15)-DNA (AcGFP)複合体）を添加した場合の１０時間培養後の細胞のＧＦＰ発現の様子を示す蛍光顕微鏡写真である。

【0055】

［ルシフェラーゼアッセイ］
GFP発現の結果から、凍結濃縮が遺伝子導入の効果を向上させていることがわかった。これを定量化をするため、さらにルシフェラーゼアッセイを上述の通りに行った。

【0056】

非凍結濃縮系の場合のルシフェラーゼ活性は、市販のリポフェクタミン、JETPEI、分岐型PEIにおいて、それぞれ150000、420000、160000（relative light unit (RLU)）であるのに対し、凍結濃縮系ではそれぞれ、310000、800000、470000（RLU）に向上した。

【0057】

一方、PEI-BSA(20)-SA(15)に関しては、ポリマー：DNAが2:1、5:1、7:1、10:1において、非凍結濃縮系はそれぞれ280000、420000、120000、200000（RLU）であったのに対し、凍結濃縮系ではそれぞれ、3100000、3200000、1450000、2100000（RLU）と市販のリポフェクタミン、JETPEI、分岐型PEIに比べて4倍から20倍以上の活性を示すことが確認できた。

【0058】

図１２に、市販のリポフェクタミン、JETPEI、分岐型PEIを用いた場合のルシフェラーゼ活性を、非凍結濃縮系と凍結濃縮系とで対比するグラフを示す。

【0059】

図１３に、PEI-BSA(20)-SA(15)を用いた場合のルシフェラーゼ活性を、PEI-BSA(20)-SA(15)：DNAのそれぞれの比率ごとに、非凍結濃縮系と凍結濃縮系とで対比するグラフを示す。

【0060】

［凍結濃縮系におけるエンドソームからのプラスミドＤＮＡのリリース］
PEI-BSA(20)-SA(15)を用いた複合体による凍結濃縮系において、複合体のプラスミドＤＮＡが細胞に導入発現される機構を確認するために、次の実験を行った。細胞の核をヘキスト３３３４２（Hoechst 33342）で染色し、エンドソームをリソトラッカーグリーン（lysotracker green）でラベルし、プラスミドＤＮＡをレッドシアニン３’（Red cyanine 3’）でラベルした、蛍光顕微鏡写真を図１４に示す。図１４の矢印で示す箇所において、赤色染色されたプラスミドＤＮＡが、緑色染色されたエンドソームの外に移行して、青色染色された細胞核の近傍に存在している。このように複合体による凍結濃縮系によって、プラスミドＤＮＡは細胞内に取り込まれた後に、エンドソームから放出されて、核へ移行するという機構が存在することが確認された。

【0061】

［凍結濃縮系におけるプラスミドＤＮＡの細胞への吸着］
凍結濃縮系において、複合体のプラスミドＤＮＡが細胞に導入発現される機構を確認するために、次の実験を行った。複合体は、直鎖型ＰＥＩ(JET PEI)と、レッドシアニン３’（Red cyanine 3’）でラベルしたプラスミドＤＮＡ（pAcGFPプラスミド）との複合体を使用した。凍結濃縮系において、複合体が導入された細胞の顕微鏡写真を図１５に示す。図１５の上段は非凍結濃縮系であり、図１５の下段は凍結濃縮系である。図１５の左図は細胞の顕微鏡写真、図１５の中央の図は蛍光顕微鏡写真、図１５の右図はこれらを同視野で重ねた写真である。非凍結濃縮系と比較して、凍結濃縮系においては、レッドシアニン３’でラベルされたプラスミドＤＮＡは、著しく細胞へ集中していた。

【産業上の利用可能性】

【0062】

本発明は細胞への遺伝子導入技術を提供する。本発明は産業上有用な発明である。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】