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特許6873901ＴＮＦファミリーリガンド三量体を含む抗原結合分子
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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6873901
(24)【登録日】2021年4月23日
(45)【発行日】2021年5月19日
(54)【発明の名称】ＴＮＦファミリーリガンド三量体を含む抗原結合分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20210510BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20210510BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20210510BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20210510BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20210510BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20210510BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20210510BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20210510BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20210510BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20210510BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20210510BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13ZNA
C07K14/705
C07K16/28
C07K19/00
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
A61K39/395 N
A61K39/395 T
A61P35/00
【請求項の数】49
【全頁数】387
(21)【出願番号】特願2017-525959(P2017-525959)
(86)(22)【出願日】2015年11月13日
(65)【公表番号】特表2018-503356(P2018-503356A)
(43)【公表日】2018年2月8日
(86)【国際出願番号】EP2015076528
(87)【国際公開番号】WO2016075278
(87)【国際公開日】20160519
【審査請求日】2018年11月9日
(31)【優先権主張番号】14193260.8
(32)【優先日】2014年11月14日
(33)【優先権主張国】EP
(31)【優先権主張番号】15183736.6
(32)【優先日】2015年9月3日
(33)【優先権主張国】EP
(31)【優先権主張番号】15188142.2
(32)【優先日】2015年10月2日
(33)【優先権主張国】EP
(73)【特許権者】
【識別番号】306021192
【氏名又は名称】エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林特許業務法人
(72)【発明者】
【氏名】アマン， マリア
(72)【発明者】
【氏名】ブルエンカー， ペーター
(72)【発明者】
【氏名】クラウス， クリスティーナ
(72)【発明者】
【氏名】フェッラーラ コラー， クラウディア
(72)【発明者】
【氏名】グラウ−リチャーズ， ザンドラ
(72)【発明者】
【氏名】クライン， クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】レヴィツキー， ヴィクトル
(72)【発明者】
【氏名】メスナー， エッケハルト
(72)【発明者】
【氏名】レーグラ， イェルク トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ウマーニャ， パブロ
【審査官】
小田 浩代
(56)【参考文献】
【文献】
RABU, C. et al.，Production of recombinant human trimeric CD137L (4-1BBL). Cross-linking is essential to its T cell co-stimulation activity，J. Biol. Chem.，２００５年，Vol. 280，pp. 41472-41481
【文献】
WYZGOL, A. et al.，Trimer stabilization, oligomerization, and antibody-mediated cell surface immobilization improve the activity of soluble trimers of CD27L, CD40L, 41BBL, and glucocorticoid-induced TNF receptor ligand，J. Immunol.，２００９年，Vol. 183，pp. 1851-1861
【文献】
MULLER, N. et al.，Activity of soluble OX40 ligand is enhanced by oligomerization and cell surface immobilization，FEBS J.，２００８年，Vol. 275，pp. 2296-2304
【文献】
BREMER, E. et al.，Target cell-restricted and -enhanced apoptosis induction by a scFv:sTRAIL fusion protein with specificity for the pancarcinoma-associated antigen EGP2，Int. J. Cancer，２００４年，Vol. 109，pp. 281-290
【文献】
Zhang, N. et al.，Targeted and untargeted CD137L fusion proteins for the immunotherapy of experimental solid tumors，Clin. Cancer Res.，２００７年，Vol. 13，pp. 2758-2767
【文献】
MACEWAN, D. J.，TNF ligands and receptors - a matter of life and death，Br. J. Pharmacol.，２００２年，Vol. 135，pp. 855-875
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ０７Ｋ １／００−１９／００
ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
ＰｕｂＭｅｄ
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂ分子、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、
抗原結合分子は、第１のポリペプチドが第１の重鎖定常（ＣＨ１）ドメイン又は軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含み、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインをそれぞれ含み、
ここで、第１のポリペプチドが、互いに接続し且つペプチドリンカーによりＣＨ１又はＣＬドメインと接続する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、及び配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含むことと、
第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインとペプチドリンカーにより接続する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインを一つだけ含むこととを特徴とし、
（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
をさらに含む、抗原結合分子。
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であって、
抗原結合分子は、第１のポリペプチドが第１の重鎖定常（ＣＨ１）ドメイン又は軽鎖定常（ＣＬ）ドメインを含み、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインをそれぞれ含み、
ここで、第１のポリペプチドが、互いに接続し且つペプチドリンカーによりＣＨ１又はＣＬドメインと接続する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、及び配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含むことと、
第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインとペプチドリンカーにより接続する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインを一つだけ含むこととを特徴とし、
（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメイン
をさらに含む、抗原結合分子。
【請求項2】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがヒトＴ細胞の活性化を共刺激する、請求項１に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項3】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬである、請求項１又は２に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項4】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号１又は配列番号９６のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項5】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが配列番号９６のアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項6】
（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂ分子、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことと、第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこととを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、
第１のポリペプチドが、配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことと、第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこととを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項7】
標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項8】
標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である、請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項9】
ＦＡＰに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含むか、又は
ＦＡＰに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、（ｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、
請求項１から８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
ＦＡＰに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、（ｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、
請求項１から８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項10】
ＦＡＰに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項11】
ＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項12】
Ｆｃドメインが、２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項13】
標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子をいずれも含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
Ｃ末端で第２のペプチドリンカーにより第２の重鎖又は軽鎖に融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含む第１のペプチド、及び
Ｃ末端で第３のペプチドリンカーによりそれぞれ第２の軽鎖又は重鎖に融合した、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択される前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第２のペプチド
を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
Ｃ末端で第２のペプチドリンカーにより第２の重鎖又は軽鎖に融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含む第１のペプチド、及び
Ｃ末端で第３のペプチドリンカーによりそれぞれ第２の軽鎖又は重鎖に融合した、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択される前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第２のペプチド
を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項14】
第１のペプチドリンカーにより互いに接続する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合しており、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択される前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合している、
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択される前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合している、
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項15】
第１のペプチドリンカーにより互いに接続する、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメインを含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＬドメインに融合しており、
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択される前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合している、
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む４−１ＢＢＬ、又は配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌから選択される前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合している、
請求項１から１３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項16】
４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており、かつ４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、請求項１４または１５のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項17】
（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子をいずれも含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
（ｂ）配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
（ｂ）配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項18】
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項19】
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から１３及び１５のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から１３及び１５のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項20】
ａ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；及び
ｆ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される、請求項１から１３、１５及び１９のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；及び
ｆ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む２つの軽鎖、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖及び配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される、請求項１から１３、１５及び１９のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項21】
配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項１から１３、１５、１９及び２０のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項22】
標的細胞抗原がＣＤ１９である、請求項１から７及び１１から１７のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項23】
ＣＤ１９に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、（ｉ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含むか、または
ＣＤ１９に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、（ｉ）配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、
請求項１から７、１１から１７及び２２のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
ＣＤ１９に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、（ｉ）配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、
請求項１から７、１１から１７及び２２のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項24】
ＣＤ１９に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むか、又はＣＤ１９に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から７、１１から１７、２２及び２３のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項25】
（ｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から７、１１から１７及び２２から２４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から７、１１から１７及び２２から２４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項26】
（ｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から７、１１から１７、及び２２から２４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から７、１１から１７、及び２２から２４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項27】
配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項１から７、１１から１７及び２２から２４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項28】
配列番号３０６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２７９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項１から７、１１から１７及び２２から２４のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項29】
標的細胞抗原がＣＥＡである、請求項１から７及び１１から１７のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項30】
ＣＥＡに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、（ｉ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、請求項１から７、１１から１７及び２９のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項31】
ＣＥＡに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子が、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む、請求項１から７、１１から１７、２９及び３０のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項32】
（ｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から７、１１から１７、及び２９から３１のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から７、１１から１７、及び２９から３１のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項33】
（ｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から７、１１から１７、及び２９から３１のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１から７、１１から１７、及び２９から３１のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項34】
配列番号３３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む、請求項１から７、１１から１７及び２９から３１のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項35】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーが、配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むＯＸ４０Ｌである、請求項１、２及び７から１６のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項36】
ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインが、配列番号５３のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、７から１６及び３５のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項37】
（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つのＦａｂ分子、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、
第１のポリペプチドが配列番号３７１又は配列番号３７２のアミノ酸配列を含むことと、第２のポリペプチドが配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むこととを特徴とする、請求項１、２、７から１６、３５及び３６のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、
第１のポリペプチドが配列番号３７１又は配列番号３７２のアミノ酸配列を含むことと、第２のポリペプチドが配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むこととを特徴とする、請求項１、２、７から１６、３５及び３６のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項38】
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１、２、７から１６及び３５から３７のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３５５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、請求項１、２、７から１６及び３５から３７のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子。
【請求項39】
請求項１から３８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項40】
請求項３９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項41】
請求項３９に記載の単離されたポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項42】
請求項３９に記載の単離されたポリヌクレオチド又は請求項４０に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項43】
（ｉ）請求項４２に記載の宿主細胞を、抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及び
（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程
を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を生成するための方法。
（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程
を含む、請求項１から３８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を生成するための方法。
【請求項44】
請求項１から３８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤とを含む薬学的組成物。
【請求項45】
医薬としての使用のための、請求項１から３８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は請求項４４に記載の薬学的組成物。
【請求項46】
がんの治療における使用のための、請求項１から３８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は請求項４４に記載の薬学的組成物。
【請求項47】
がんの治療のための医薬の製造のための、請求項１から３８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用。
【請求項48】
請求項１から３８のいずれか一項に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的有効量を含む、個体の疾患の治療のための医薬。
【請求項49】
前記疾患ががんである、請求項４８に記載の医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチドを含む新規のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする。本発明はさらに、これら分子の生成方法及び使用法に関する。
【背景技術】
【0002】
ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体スーパーファミリーの分子と相互作用するリガンドは、免疫系の構成及び機能において中心的役割を有する。免疫応答、造血及び形態形成といった通常の機能を制御すると同時に、ＴＮＦファミリーリガンド（サイトカインとも呼ばれる）は、腫瘍形成、移植片拒絶反応、敗血症性ショック、ウィルス複製、骨吸収、関節リウマチ及び糖尿病（Aggarwal, 2003）に関与する。ＴＮＦリガンドファミリーは、保存されたＣ末端ドメインの 「ＴＮＦ相同性ドメイン」（ＴＨＤ）の存在により特徴付けられる、１９のＩＩ型（即ち細胞内Ｎ末端及び細胞外Ｃ末端）膜貫通タンパク質をコードする１８の遺伝子を含む。このドメインは、受容体結合を担い、したがってＴＮＦリガンドファミリーメンバーの生物活性に必須である。ファミリーメンバー間の配列同一性は−２０−３０％である（Bodmer, 2002）。ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、自己構築性の非共有結合三量体としてその生物的機能を発揮する（Banner et al, Cell 1993, 73, 431-445）。したがって、ＴＮＦファミリーリガンドは、ＴＮＦＲスーパーファミリーの対応する受容体に結合してそれを活性化することのできる三量体を形成する。
【0003】
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）はＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、Ｔ細胞活性化によりその発現が誘導される分子として最初に同定された（Kwon and Weissman, 1989）。その後の研究により、Ｔリンパ球及びＢリンパ球（Snell et al., 2011; Zhang et al., 2010）、ＮＫ細胞（Lin et al., 2008）、ＮＫＴ細胞（Kim et al., 2008）、単球（Kienzle and von Kempis, 2000; Schwarz et al., 1995）、好中球（Heinisch et al., 2000）、マスト細胞（Nishimoto et al., 2005）及び樹状細胞、並びに内皮及び平滑筋細胞といった非造血性起源の細胞（Broll et al., 2001; Olofsson et al., 2008）における４−１ＢＢの発現が実証された。異なる細胞型における４−１ＢＢの発現は、多くの場合誘導性であり、様々な刺激性シグナル、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）又はＢ細胞受容体トリガリング、並びに炎症誘発サイトカインの共刺激分子又は受容体を通して誘導されるシグナル伝達により駆動される。（Diehl et al., 2002; von Kempis et al., 1997; Zhang et al., 2010）。
【0004】
４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ又はＣＤ１３７Ｌ）の発現は、もっと制限されたものであり、Ｂ細胞、樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージといったプロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に観察される。４−１ＢＢＬの誘導性の発現は、αβ及びγδ両方のＴ細胞サブセットを含むＴ細胞と内皮細胞に特徴的である（Shao and Schwarz、2011に概説がある）。
【0005】
ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＩＦＮγ分泌及びＮＫ細胞の増殖を刺激し（Buechele et al., 2012; Lin et al., 2008; Melero et al., 1998）、さらにはその生存率の上昇及びサイトカイン分泌能の増大により示されるようにＤＣ活性を促進し、共刺激分子を上方制御することが知られている（Choi et al., 2009; Futagawa et al., 2002; Wilcox et al., 2002）。しかしながら、ＣＤ１３７を最もよく特徴付けるのは、Ｔ細胞のＣＤ４＋及びＣＤ８＋両方のサブセットにおいてＴＣＲ誘導性活性を調節する共刺激分子である。ＴＣＲのトリガリングとの組み合わせで、アゴニスト４−１ＢＢ特異的抗体は、Ｔ細胞の増殖を増強し、リンホカイン分泌を刺激し、活性化により誘導された細胞死に対するＴ−リンパ球の感受性を低下させる（Snell et al., 2011に概説）。
【0006】
Ｔ細胞に対するインビトロでの４−１ＢＢ抗体のこれら共刺激効果と一致して、腫瘍を有するマウスへのその投与は、多くの実験的腫瘍モデルにおいて強力な抗腫瘍効果をもたらす（Melero et al., 1997; Narazaki et al., 2010）。しかしながら、４−１ＢＢは通常、他の免疫調節化合物（Curran et al., 2011; Guo et al., 2013; Morales-Kastresana et al., 2013; Teng et al., 2009; Wei et al., 2013）、化学療法薬剤（Ju et al., 2008; Kim et al., 2009）、腫瘍特異的ワクチン接種（Cuadros et al., 2005; Lee et al., 2011）又は放射線療法（Shi and Siemann, 2006）と組み合わせて投与されたときにのみ抗腫瘍剤としてのその有効性を呈する。インビボでの枯渇実験により、４−１ＢＢ−特性性抗体の抗腫瘍効果においてＣＤ８＋ Ｔ細胞が最も重要な役割を果たすことが実証された。しかしながら、腫瘍モデル又は抗４−１ＢＢを含む併用療法によっては、ＤＣ、ＮＫ細胞又はＣＤ４＋ Ｔ細胞といった他の型の細胞の寄与が報告されている（Melero et al., 1997; Murillo et al., 2009; Narazaki et al., 2010; Stagg et al., 2011）。
【0007】
異なるリンパ球サブセットに対するそれらの直接的な効果に加えて、４−１ＢＢアゴニストは、腫瘍血管内皮上の細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）及び血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）の４−１ＢＢ媒介性上方制御により、腫瘍中における活性化Ｔ細胞の浸潤及び保持を誘導することもできる（Palazon et al., 2011）。
【0008】
４−１ＢＢトリガリングはまた、腫瘍微小環境における又は慢性感染の間の免疫寛容の破壊に寄与しうる可溶型抗原への曝露により誘導されるＴ細胞アネルギーの状態を反転させうる（Wilcox et al., 2004）。
【0009】
４−１ＢＢアゴニスト抗体のインビボでの免疫調節特性は、抗体分子上に野生型Ｆｃ部分の存在を必要とし、これにより、ＴＮＦＲスーパーファミリーの他のアポトーシス誘導又は免疫調節メンバーに特異的なアゴニスト抗体について記載されているように、Ｆｃ受容体結合がこのような試薬の薬理的活性に必要な重要な事象であることが示される（Li and Ravetch, 2011; Teng et al., 2009）。しかしながら、機能的に活性なＦｃドメインを含む４−１ＢＢ特異的アゴニスト抗体の全身投与はまた、肝毒性に関連付けられるＣＤ８＋ Ｔ細胞の拡大を誘導し（Dubrot et al., 2010）、このような拡大は、マウスにおいて、機能的Ｆｃ受容体の非存在下で縮小されるか又は有意に改善される。ヒトの臨床治験では（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ，ＮＣＴ００３０９０２３）、三週に一度１２週間にわたって投与されたＦｃコンピテント４−１ＢＢアゴニスト抗体（ＢＭＳ−６６３５１３）は、メラノーマ、卵巣癌又は腎細胞癌を有する患者において疾患の安定化を誘導した。しかしながら、別の治験（ＮＣＴ００６１２６６４）において投与された同じ抗体は、グレード４の肝炎を引き起こし、これにより治験は終了された（Simeone and Ascierto, 2012）。
【0010】
つまり、前臨床及び臨床データは、有効な４−１ＢＢアゴニストが臨床的に強く求められていることを示している。しかしながら、新世代の薬物候補は、造血細胞及び内皮細胞の表面上において４−１ＢＢに有効に係合するだけでなく、制御不能な副作用を避けるために、Ｆｃ受容体に対する結合以外の機序によりこれを達成することができなければならない。後者は、腫瘍特異的又は腫瘍関連部分に対する優先的結合及びそこでのオリゴマー形成により達成されうる。
【0011】
４−１ＢＢリガンドの一つの細胞外ドメイン及び単鎖抗体断片からなる融合タンパク質（Mueller et al., 2008; Hornig et al., 2012）又は重鎖のＣ末端に融合した単一の４−１ＢＢリガンド（Zhang et al, 2007）が作製された。国際公開第２０１０／０１００５１号には、互いに結合し且つ抗体部分に融合した三つのＴＮＦリガンドエクトドメインからなる融合タンパク質の生成が開示されている。
【0012】
しかしながら、依然として、腫瘍特異的又は腫瘍関連標的に対する優先的結合能を有する部分と同時刺激ＴＮＦリガンド三量体形成能を有する部分とを組み合わせた、薬物学的に有用であるために十分な安定性を有する新規の抗原結合分子に対する需要が存在する。本発明の抗原結合分子は両方を兼ね備え、驚くべきことに、三量体、すなわち生物学的に活性なＴＮＦリガンドを提供するが、三量体形成ＴＮＦリガンドエクトドメインのうちの一つは、分子の他の二つのＴＮＦリガンドエクトドメインとは別のポリペプチド上に位置している。
【発明の概要】
【0013】
一態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチドを含む新規のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする。
【0014】
特定の態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチドを含む新規のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とし、また（ｃ）安定な結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【0015】
さらなる態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインをそれぞれ含み、第２のポリペプチドがＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合し、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むか、又は
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインをそれぞれ含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に結合するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むか、又は
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインをそれぞれ含み、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合し、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドの断片ＶＬ又はＶＨに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む
ことを特徴とする。
【0016】
特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞の活性化を共刺激する。したがって、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチドを含む新規のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とし、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ヒトＴ細胞の活性化を共刺激する。具体的には、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【0017】
一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬである。
【0018】
さらなる態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号９６のアミノ酸配列を含む。
【0019】
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号９６からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号９６のアミノ酸配列を含む。具体的には、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。
【0020】
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0021】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0022】
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが配列番号１８３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0023】
またさらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが配列番号１８４又は配列番号１８５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0024】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、
（ｂ）ＣＨ１又はＣＬドメインを含む第１のポリペプチド及びＣＬ又はＣＨ１ドメインを含む第２のポリペプチド
を含み、第２のポリペプチドはＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする。
【0025】
一態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、
（ｂ）ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチド及びＣＬドメインを含む第２のポリペプチドを含み、第２のポリペプチドはＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１ドメインに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＬドメインに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
【0026】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、
（ｂ）ＣＬドメインを含む第１のポリペプチド及びＣＨ１ドメインを含む第２のポリペプチドを含み、第２のポリペプチドはＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＬドメインに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ１ドメインに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
【0027】
さらなる態様では、本発明は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分が、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0028】
一態様では、本発明は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分が抗体断片である、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0029】
特に、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される。
【0030】
一態様では、本発明は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分が足場抗原結合タンパク質である、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0031】
特定の態様では、本発明は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分が、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子である、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0032】
本発明は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する一つの部分を含む。別の態様では、本発明は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0033】
別の態様において提供される本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原が、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される。
【0034】
特定の態様では、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【0035】
一態様では、本発明は、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分が、（ｉ）配列番号７又は配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９又は配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１又は配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0036】
一態様では、本発明は、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分が、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0037】
特定の態様では、本発明は、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分が、（ｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0038】
一態様において提供される上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【0039】
さらなる態様において提供される本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むペプチドが、そのＣ末端において、第２のペプチドリンカーにより重鎖のＣＨ１又はＣＬドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片が、そのＣ末端において、第３のペプチドリンカーにより軽鎖上のＣＬ又はＣＨ１ドメインに融合している。
【0040】
特定の態様では、本発明は、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２、即ち配列番号１３のペプチドリンカーである、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。一態様では、第１のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２であり、第２のペプチドリンカーはＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）であり、第３のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。別の態様では、第１、第２及び第３のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。
【0041】
本発明はさらに、安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0042】
特に、（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子はさらに、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含み、Ｆａｂ重鎖はＣ末端においてＦｃドメイン内のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合する。
【0043】
さらなる態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。
【0044】
別の態様では、本発明は、（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、このＦｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低減する一又は複数のアミノ酸置換を含む。
【0045】
特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。具体的には、本発明により提供される三量体ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。
【0046】
さらなる態様において本発明により提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
Ｃ末端で第２のペプチドリンカーにより第２の重鎖又は軽鎖に融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第１のペプチド、及び
Ｃ末端で第３のペプチドリンカーにより第２の軽鎖又は重鎖に融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第２のペプチド
を含む。
【0047】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合している。
【0048】
また別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＬドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合している。
【0049】
さらなる態様では、本発明は、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第１のペプチドがそのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＶＨドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドがそのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＶＬドメインに融合している、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0050】
さらには、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており、かつＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【0051】
さらなる態様では、（ａ）共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む第１の重鎖及び第１の軽鎖、
（ｂ）配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、上記に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【0052】
一態様では、本発明は、（ａ）ＦＡＰに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子、及び
（ｂ）配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0053】
特定の態様では、本発明は、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。一態様においては、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１３９及び配列番号１４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４及び配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【0054】
別の態様では、本発明は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸を含む第２の軽鎖
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0055】
また別の態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインをそれぞれ含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
【0056】
特に、このようなＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分を含む。
【0057】
一態様では、本発明は、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する二つの部分を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特に、提供される上記に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２５のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２５のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖
を含む。
【0058】
別の特定の態様では、本発明は、標的細胞抗原がＣＤ１９である、上記に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0059】
一態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分は、（ｉ）配列番号１９５又は配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９６又は配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９７又は配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１９８又は配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９９又は配列番号２５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２００又は配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0060】
さらなる態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分が配列番号２０１のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むか、又はＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分が配列番号３５７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【0061】
特定の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、抗原結合分子は、（ｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0062】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸を含む第２の軽鎖
を含む。
【0063】
一態様では、本発明は、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する二つの部分を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特に、提供されるのは、請求項１から１４、２９、３０及び３２から３４のいずれか一項のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であり、この抗原結合分子は、（ｉ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３１０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２７９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｖ）配列番号３１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２７９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖
を含む。
【0064】
別の特定の態様では、本発明は、標的細胞抗原がＣＥＡである、上記に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0065】
一態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する部分は、（ｉ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0066】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【0067】
一態様において提供される上記に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0068】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0069】
一態様では、本発明は、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する二つの部分を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特に、提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖
を含む。
【0070】
さらなる態様において提供される、上記に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーはＯＸ４０Ｌである。一態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列、特に配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
【0071】
さらなる態様において提供されるのは、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む、請求項１から５、１０から２４、２９、３０、３２から３４、３８から４０、４４及び４５のいずれか一項のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であり、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号３７１又は配列番号３７２のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0072】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分が、（ｉ）配列番号７又は配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９又は配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１又は配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0073】
特に、提供される本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨドメインを含む第１の重鎖、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0074】
本発明の別の態様によれば、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明はさらに、本発明の単離されたポリヌクレオチド含むベクター、特に発現ベクター、及び本発明の単離されたポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様では、宿主細胞は真核細胞、特に哺乳動物の細胞である。
【0075】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を生成するための方法が提供され、この方法は、（ｉ）本発明の宿主細胞を抗原結合分子の発現に適した条件下で培養する工程、及び（ｉｉ）抗原結合分子を回収する工程を含む。本発明は、本発明の方法により生成されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も包含する。
【0076】
本発明はさらに、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子及び少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤を含む薬学的組成物を提供する。
【0077】
本発明は、医薬としての使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物も包含する。一態様においては、それを必要とする個体の疾患の治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。特定の一実施態様では、がんの治療における使用のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又は本発明の薬学的組成物が提供される。
【0078】
さらには、それを必要とする個体における疾患の治療のための医薬の製造のため、特にがんの治療のための医薬の製造のための、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用、並びに、前記個体に対し、薬学的に許容される形態の本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含む組成物の治療的有効量を投与することを含む、個体における疾患の治療方法が提供される。特定の一実施態様において、疾患はがんである。上記実施態様のいずれにおいても、個体は好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
【図面の簡単な説明】
【0079】
【図1】分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドの構築のための構成要素を示している。（１Ａ）は、Ｃ末端でヒトＣＨ１又はＣＬドメイン、或いはＶＬ又はＶＨドメインに融合する二量体リガンドを示し、（１Ｂ）は、ヒトＣＬ又はＣＨ１ドメイン、或いはＶＬ又はＶＨドメインに融合する単量体リガンドを示す。（１Ｃ）は、Ｎ末端でヒトＣＨ３ドメインに融合する二量体リガンドを示し、（１Ｄ）は、Ｎ末端でヒトＣＨ３ドメインに融合する単量体リガンドを示す。
【図2-1】本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子コンストラクト１．１から１．６を示している。これらコンストラクトの調製及び生成は、実施例１に記載される。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＦＡＰ抗体２８Ｈ１のものであり、黒丸はノブ・イントゥ・ホール修飾を表している。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメイン内のアミノ酸修飾を示す（いわゆる荷電残基）。
【図2-2】本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子コンストラクト１．７から１．１０を示している。これらコンストラクトの調製及び生成は、実施例１に記載される。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＦＡＰ抗体２８Ｈ１のものであり、黒丸はノブ・イントゥ・ホール修飾を表している。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメイン内のアミノ酸修飾を示す（いわゆる荷電残基）。
【図3】分裂三量体マウス４−１ＢＢリガンドの構築のための構成要素を示している。（３Ａ）は、Ｃ末端でマウスＣＬドメインに融合する二量体リガンドを示しており、（３Ｂ）は、Ｃ末端でマウスＣＨ１ドメインの融合する単量体リガンドを示している。ＦＡＰ標的化分裂三量体マウス４−１ＢＢリガンドの構築のための構成要素。（３Ｃ）は、構築されたマウス４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子を示しており、この詳細は実施例１．３に記載される。
【図4】本発明の４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子コンストラクト２．１から２．６を示している。これらコンストラクトの調製及び生成は、実施例２に記載される。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＦＡＰ抗体４Ｂ９のものであり、黒丸はノブ・イントゥ・ホール修飾を表している。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメイン内のアミノ酸修飾を示す（いわゆる荷電残基）。
【図5】（５Ａ）及び（５Ｂ）は、抗ＦＡＰ Ｆａｂ分子の代わりにＤＰ４７ Ｆａｂ分子を含むコンストラクト１．１及び１．２の「非標的化」変異体を示している。分子は、それぞれコントロールＡ及びコントロールＢと命名される。調製は実施例１．４に記載される。（５Ｃ）は、実施例３で調製される単量体４−１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの図面である。
【図6-1】ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体、黒丸）又はＤＰ−４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体、白丸）の、休止（ナイーブ）又は活性化ヒトＰＭＢＣに対する結合に関する。具体的には、休止（ナイーブ）又は活性化ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合が（６Ａ）に、休止（ナイーブ）又は活性化ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞に対する結合が（６Ｂ）に示される。図示されるのは、二次的な検出抗体として使用される、大型紅藻フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の、蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーにより測定され、ベースラインはブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことにより修正された。
【図6-2】ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体、黒丸）又はＤＰ−４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体、白丸）の、休止（ナイーブ）又は活性化ヒトＰＭＢＣに対する結合に関する。休止（ナイーブ）又は活性化ヒトＮＫ細胞に対する結合が（６Ｃ）に示される。図示されるのは、二次的な検出抗体として使用される、大型紅藻フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の、蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーにより測定され、ベースラインはブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことにより修正された。
【図7A】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ＰＨＡ−Ｌ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化及び抗ヒトＣＤ３／抗ヒトＣＤ２８再活性化ヒトＰＢＭＣ由来のヒト４−１ＢＢ発現Ｔ細胞に対する結合が示されている。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、実施例１の試験されたコンストラクト１．１から１．１０の濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（ＣＨ−ＣＬ交差及び荷電残基を有する一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた四つの異なるブロットに分けられている。結合は、ＣＤ３＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞についてモニターされた。ＣＤ８ Ｔ細胞上における４−１ＢＢ発現レベルは、通常ＣＤ４Ｔ細胞上より高い。すべてのバージョンが、極めて類似した親和性でヒト４−１ＢＢに結合する。
【図7B】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ＰＨＡ−Ｌ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化及び抗ヒトＣＤ３／抗ヒトＣＤ２８再活性化ヒトＰＢＭＣ由来のヒト４−１ＢＢ発現Ｔ細胞に対する結合が示されている。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、実施例１の試験されたコンストラクト１．１から１．１０の濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（ＣＨ−ＣＬ交差及び荷電残基を有する一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた四つの異なるブロットに分けられている。結合は、ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞についてモニターされた。すべてのバージョンが、極めて類似した親和性でヒト４−１ＢＢに結合する。
【図8A】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、新鮮なＰＢＭＣ由来のＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合が示されている。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験された実施例２のコンストラクト２．１、２．３、２．４、２．５及び２．６と、コントロール分子のコントロールＢ、コントロールＣ、コントロールＥ及びコントロールＦの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト２．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてコントロールＢ（ＣＨ−ＣＬ交差及び荷電残基を有する一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いる二つの異なるブロットに分けられている。結合は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（下部にブロット）及びＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（上部にブロット）についてモニターされた。ＣＤ８ Ｔ細胞上における４−１ＢＢ発現レベルは、通常ＣＤ４Ｔ細胞上より高い。すべてのコンストラクトは、極めて類似した親和性でヒト４−１ＢＢに結合し、これに対し、二価のコンストラクト２．３及びその非標的化コントロールＣはそれよりも低いＭＦＩを示す。これは、４−１ＢＢ−結合の立体障害及び／又はＦｃコンジュゲート分裂４−１ＢＢリガンドにより誘導された第２の検出抗体に起因する検出減少に起因している可能性がある。
【図8B】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ヒト４−１ＢＢ発現ＰＨＡ−Ｌ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化及び抗ヒトＣＤ３／抗ヒトＣＤ２８再活性化ヒトＰＢＭＣに対する結合が示されている。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験された実施例２のコンストラクト２．１、２．３、２．４、２．５及び２．６と、コントロール分子のコントロールＢ、コントロールＣ、コントロールＥ及びコントロールＦの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト２．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてコントロールＢ（ＣＨ−ＣＬ交差及び荷電残基を有する一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いる二つの異なるブロットに分けられている。結合は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（下部にブロット）及びＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（上部にブロット）についてモニターされた。ＣＤ８ Ｔ細胞上における４−１ＢＢ発現レベルは、通常ＣＤ４Ｔ細胞上より高い。すべてのコンストラクトは、極めて類似した親和性でヒト４−１ＢＢに結合し、これに対し、二価のコンストラクト２．３及びその非標的化コントロールＣはそれよりも低いＭＦＩを示す。
【図9】ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体、黒丸）又はＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体；白丸）の、活性化マウス脾細胞に対する結合を示す。具体的には、活性化マウスＣＤ４＋ Ｔ細胞に対する結合が（９Ａ）に、活性化マウスＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合が（９Ｂ）に示されている。抗マウスＣＤ１３７特異的ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ抗体（クローンＬｏｂ１２．３）がポジティブコントロール（三角）として使用された。結合は、二次的検出抗体として使用されるＲ−ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を、試験された分裂４−１ＢＢＬ三量体コンストラクトの濃度（ｎＭ）に対してプロットすることにより特徴付けられる。ＭＦＩはフローサイトメトリーにより測定され、ベースラインはブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことにより修正された。
【図10】４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（黒丸：ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子コンストラクト１．１、白丸：ＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子コントロールＡ）の、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）発現ヒトメラノーマの（１０Ａ）ＭＶ−３細胞株及び（１０Ｂ）ＷＭ−２６６−４細胞株に対する結合を示す。結合は、二次的検出抗体として使用されるＲ−ＰＥ標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を、試験された分裂４−１ＢＢＬ三量体コンストラクトの濃度（ｎＭ）に対してプロットすることにより特徴付けられる。ＭＦＩはフローサイトメトリーにより測定され、ベースラインはブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことにより修正された。
【図11A】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマＭＶ−３細胞に対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素又はフルオレセイン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線を四つのブロットに分け、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を比較曲線として使用している。二価のＦＡＰ標的化コンストラクト（コンストラクト１．５、１．７及び１．８）を除き、すべてのコンストラクトは、類似する親和性でヒトＦＡＰに結合する。これらコンストラクトは、比較的低いＥＣ５０値及び比較的低いメジアン蛍光強度を有する傾向を示した。これは、それらの二価の標的化により説明することができる（より高い結合活性、二つのエピトープの占有に起因して同時に結合できる分子数が減少する結果、ＭＦＩが低下する）。構造の差異も、コンストラクト１．８（完全な二価標的化）とコンストラクト１．５及び１．７（部分的な二価標的化）の間の差異を説明しうる。
【図11B】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９トランスフェクトマウス胚性線維芽細胞細胞に対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素又はフルオレセイン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線を二つのブロット に分け、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を比較曲線として使用している。二価のＦＡＰ標的化コンストラクト（コンストラクト１．５、１．７及び１．８）を除き、すべてのコンストラクトは、類似する親和性でヒトＦＡＰに結合する。これらコンストラクトは、比較的低いＥＣ５０値及び比較的低いメジアン蛍光強度を有する傾向を示した。これは、それらの二価の標的化により説明することができる（より高い結合活性、二つのエピトープの占有に起因して同時に結合できる分子数が減少する結果、ＭＦＩが低下する）。
【図12A】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクト２．１、２．３、２．４、２．５及び２．６の、ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマＭＶ−３細胞に対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線を二つのブロットに分け、コンストラクト２．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を比較曲線として使用している。二価のＦＡＰ標的化コンストラクト２．３を除き、すべてのコンストラクトは類似する親和性でヒトＦＡＰに結合する。これは比較的低いＥＣ５０値及び比較的低いメジアン蛍光強度を示す傾向を有する。これは、その二価の標的化によって説明することができ、その結果比較的高い結合活性がもたらされるが、細胞表面上の占有率低下又はＦＡＰ分子 が得られ、ＭＦＩが低下する。
【図12B】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクト２．１、２．３、２．４、２．５及び２．６の、ＷＭ−２６６−４細胞に対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線を二つのブロットに分け、コンストラクト２．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を比較曲線として使用している。二価のＦＡＰ標的化コンストラクト２．３を除き、すべてのコンストラクトは類似する親和性でヒトＦＡＰに結合する。これは比較的低いＥＣ５０値及び比較的低いメジアン蛍光強度を示す傾向を有する。これは、その二価の標的化によって説明することができ、その結果比較的高い結合活性がもたらされるが、細胞表面上の占有率低下又はＦＡＰ分子 が得られ、ＭＦＩが低下する。
【図13】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体マウス４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、新鮮な脾細胞（１３Ａ）又はマウス４−１ＢＢ発現抗マウスＣＤ３／抗マウスＣＤ２８モノクローナルアゴニスト抗体活性化マウス脾細胞（１３Ｂ）由来のＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合を示している。結合は、ＦＩＴＣ−蛍光色素コンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。結合は、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞（左のブロット）及びＣＤ３＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞（右のブロット）についてモニターされた。ＣＤ８ Ｔ細胞上における４−１ＢＢ発現レベルは、通常ＣＤ４Ｔ細胞上より高い。すべてのコンストラクトが、極めて類似した親和性でマウス４−１ＢＢに結合する。
【図14】異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体マウス４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に対する結合が示されている。結合は、ＦＩＴＣ−蛍光色素コンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。結合は、ＭＶ−３細胞（１４Ａ）及びＷＭ−２６６−４細胞（１４Ｂ）についてモニターされた。ＦＡＰ標的化分裂三量体マウス４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトＭ．１及びＭ．２は、極めて類似した親和性でＦＡＰに結合する。
【図15】レポーター細胞株を用いる実施例６．１に記載のＮＦｋＢ活性化アッセイの一般原則を説明するスキームを示している。図示されているのは、ヒト４−１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞株を用いて設定された活性化アッセイである。レポーター細胞上に発現された４−１ＢＢの架橋は、ＮＦκＢの活性化及びＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現を誘導する。細胞の溶解後、ルシフェラーゼは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化を触媒することができる。この化学反応は、ＮＦκＢ−媒介ルシフェラーゼ発現の強さとポジティブに相関し、発光の強度（放出光の単位）により測定することができる。ＦＡＰ発現腫瘍細胞対レポーター細胞株ＨｅＬａ−ｈｕＣＤ１３７−ＮＦｋＢ−ｌｕｃの比は、５対１であった。
【図16】ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト１．１）によるＮＦｋＢシグナル伝達経路の活性化が、ＦＡＰ発現標的細胞に対するその結合に厳密に依存していることを示している。ヒトＣＤ１３７発現ＮＦｋＢレポーターＨｅＬａ細胞を、異なるレベルの細胞表面ＦＡＰ発現を呈する図示の腫瘍細胞と共に共培養した。ルシフェラーゼ活性を、図示の濃度で６時間にわたり４−１ＢＢＬ含有分子の非存在下又は存在下において培養した後、実施例６．１に記載のようにして評価した。黒丸はコンストラクト１．１を示す。白丸はＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コントロールＡ）を示す。グラフ（Ａ）では細胞株ＮＩＨ／３Ｔ３−ヒトＦＡＰクローン３９が標的細胞として使用された。グラフ（Ｂ）はＭＶ３細株を標的細胞として用いた場合の活性化を、グラフ（Ｃ）はＷＭ−２６６−４細胞株を標的細胞として用いた場合の活性化を示す。活性は、０．５秒間測定された放出光の単位（ＵＲＬ）を、試験された分裂４−１ＢＢＬ三量体コンストラクトの濃度（ｎＭ）に対してブロッティングすることにより特徴付けられる。ＵＲＬは、ルシフェラーゼ媒介性の、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化に起因して発せられる。
【図17A】実施例６．１に記載のアッセイにより測定されたＮＦκＢ−活性化−誘導ルシフェラーゼ発現及び活性を示している。一秒毎の放出光のカウント数（ＣＰＳ）は、０．５秒／ウェル測定され、ＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの使用濃度に対してプロットされている。ヒト４−１ＢＢ−発現ＨｅＬａ−レポーター細胞を、架橋ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３の非存在下で６時間インキュベートした。ＣＰＳを測定し、異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの濃度に対してブロッティングした。細胞比は、五つの腫瘍細胞に対して一つのヒト４−１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞である。よりよい表示のために、活性化曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（ＣＨ−ＣＬ交差及び荷電残基を有する一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた四つの異なる表示ブロットに分けた。架橋ＦＡＰ発現腫瘍細胞がない場合の活性化が示されている。
【図17B】実施例６．１に記載のアッセイにより測定されたＮＦκＢ−活性化−誘導ルシフェラーゼ発現及び活性を示している。一秒毎の放出光のカウント数（ＣＰＳ）は、０．５秒／ウェル測定され、ＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの使用濃度に対してプロットされている。ヒト４−１ＢＢ−発現ＨｅＬａ−レポーター細胞を、架橋ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３の存在下で６時間インキュベートした。ＣＰＳを測定し、異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの濃度に対してブロッティングした。細胞比は、五つの腫瘍細胞に対して一つのヒト４−１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞である。よりよい表示のために、活性化曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（ＣＨ−ＣＬ交差及び荷電残基を有する一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた四つの異なる表示ブロットに分けた。架橋ＦＡＰ発現ＭＶ−３腫瘍細胞の存在下における活性化が示されている。
【図17C】実施例６．１に記載のアッセイにより測定されたＮＦκＢ−活性化−誘導ルシフェラーゼ発現及び活性を示している。一秒毎の放出光のカウント数（ＣＰＳ）は、０．５秒／ウェル測定され、ＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの使用濃度に対してプロットされている。ヒト４−１ＢＢ−発現ＨｅＬａ−レポーター細胞を、ＷＭ−２６６−４の存在下で６時間インキュベートした。ＣＰＳを測定し、異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの濃度に対してブロッティングした。細胞比は、五つの腫瘍細胞に対して一つのヒト４−１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞である。よりよい表示のために、活性化曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（ＣＨ−ＣＬ交差及び荷電残基を有する一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた四つの異なる表示ブロットに分けた。架橋ＦＡＰ発現ＷＭ−２６６−４腫瘍細胞の存在下における活性化を示している。
【図18】実施例２のコンストラクトについて測定されたＮＦκＢ−活性化−誘導ルシフェラーゼ発現及び活性を示している。放出光の単位（ＵＲＬ）は、０．５秒／ウェル測定され、ＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの使用濃度に対してプロットされている。ヒト４−１ＢＢ−発現ＨｅＬａ−レポーター細胞を、架橋ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３又はＷＭ−２６６−４の非存在下又は存在下で、６時間インキュベートした。ＵＲＬを測定し、異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクト２．１、２．３、２．４、２．５及び２．６とコントロールＢ、Ｃ、Ｅ及びＦの濃度に対してブロッティングした。細胞比は、五つの腫瘍細胞に対して一つの４−１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞である。よりよい表示のために、活性化曲線を、コンストラクト２．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いる二つの異なる表示−ブロットに分けた。
【図19】カニクイザル４−１ＢＢ発現Ｔ２９３−ＨＥＫレポーター細胞株を用いて設定された活性化アッセイが示されている。レポーター細胞上に発現されたカニクイザル４−１ＢＢの架橋は、ＮＦκＢの活性化及びＮＦκＢ媒介ルシフェラーゼ発現を誘導する。細胞の溶解後、ルシフェラーゼは、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化を触媒することができる。この化学反応は、ＮＦκＢ−媒介性のルシフェラーゼ発現の強度とポジティブに相関し、発光の強度（放出光の単位）により測定することができる 。
【図20】ＮＦκＢ−活性化−誘導ルシフェラーゼの発現及び活性を示している。放出光の単位（ＵＲＬ）は、０．５秒／ウェル測定され、ＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの使用濃度に対してプロットされている。カニクイザル４−１ＢＢ−発現Ｔ２９３−ＨＥＫ−レポーター細胞を、架橋ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３又はＷＭ−２６６−４の非存在下又は存在下で、６時間インキュベートした。ＵＲＬを測定し、異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの濃度に対してブロッティングした。細胞比は、五つのＭＶ−３又は二つのＷＭ−２６６−４細胞に対して一つのヒト４−１ＢＢ発現Ｔ２９３−ＨＥＫレポーター細胞である。よりよい表示のために、活性化曲線を、比較曲線としてコンストラクト２．１を用いる二つの異なるブロットに分けた。
【図21】このスキームは、実施例６．３に記載されるＴ細胞活性化アッセイの原理を説明している。図示されているのは、異なる滴定濃度のＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下においてＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ−特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる模式的アッセイ活性化の設定である。細胞を２８時間にわたりインキュベートし、最後の４時間はモネシン（ｍｏｎｅｓｉｎ ）含有Ｇｏｌｇｉ−Ｓｔｏｐを存在させた。ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞対ＭＶ−３腫瘍細胞の比は１：８である。
【図22-1】実施例１において調製された異なる滴定濃度の異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下において、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる活性化アッセイに関する。よりよい表示のために、発現曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた複数の異なる表示ブロットに分けられている。結果は、四つの独立した類似の実験において得られ、それにより、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の持続性のＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７発現が、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体（シグナル１）とＦＡＰ標的化ヒト分裂４−１ＢＢＬ（シグナル２）による４−１ＢＢ−トリガリングの認識を介したＴ細胞の同時活性化に厳密に依存していることが示される。４−１ＢＢの上方制御の効果がグラフに示されている。図示されているのはどれも、全体のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団中における陽性細胞の頻度（パーセンテージ）である。すべてのＦＡＰ標的化変異体は、４−１Ｂｂ−上方制御（ポジティブフィードバックループ）として示される、ＮＬＶ−ペプチド活性化ＣＤ８ Ｔ細胞に類似した活性化改善を誘導した。曲線の差異は、正常な偏差内にあり、有意でない。
【図22-2】実施例１において調製された異なる滴定濃度の異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下において、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる活性化アッセイに関する。よりよい表示のために、発現曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた複数の異なる表示ブロットに分けられている。結果は、四つの独立した類似の実験において得られ、それにより、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の持続性のＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７発現が、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体（シグナル１）とＦＡＰ標的化ヒト分裂４−１ＢＢＬ（シグナル２）による４−１ＢＢ−トリガリングの認識を介したＴ細胞の同時活性化に厳密に依存していることが示される。４−１ＢＢの上方制御の効果がグラフに示されている。図示されているのはどれも、全体のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団中における陽性細胞の頻度（パーセンテージ）である。すべてのＦＡＰ標的化変異体は、４−１Ｂｂ−上方制御（ポジティブフィードバックループ）としてとして示される、ＮＬＶ−ペプチド活性化ＣＤ８ Ｔ細胞に類似した活性化改善を誘導した。曲線の差異は、正常な偏差内にあり、有意でない。
【図22-3】実施例１において調製された異なる滴定濃度の異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下において、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる活性化アッセイに関する。よりよい表示のために、発現曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた複数の異なる表示ブロットに分けられている。結果は、四つの独立した類似の実験において得られ、それにより、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の持続性のＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７発現が、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体（シグナル１）とＦＡＰ標的化ヒト分裂４−１ＢＢＬ（シグナル２）による４−１ＢＢ−トリガリングの認識を介したＴ細胞の同時活性化に厳密に依存していることが示される。４−１ＢＢの上方制御の効果がグラフに示されている。図示されているのはどれも、全体のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団中における陽性細胞の頻度（パーセンテージ）である。すべてのＦＡＰ標的化変異体は、４−１Ｂｂ−上方制御（ポジティブフィードバックループ）として示される、ＮＬＶ−ペプチド活性化ＣＤ８ Ｔ細胞に類似した活性化改善を誘導した。曲線の差異は、正常な偏差内にあり、有意でない。
【図23-1】実施例１において調製された異なる滴定濃度の異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下において、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる活性化アッセイに関する。よりよい表示のために、発現曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた複数の異なる表示ブロットに分けられている。結果は、四つの独立した類似の実験において得られ、それにより、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の持続性のＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７発現が、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体（シグナル１）とＦＡＰ標的化ヒト分裂４−１ＢＢＬ（シグナル２）による４−１ＢＢ−トリガリングの認識を介したＴ細胞の同時活性化に厳密に依存していることが示される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＩＮＦγ発現の効果がグラフに示されている。図示されているのはどれも、全体のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団中における陽性細胞の頻度（パーセンテージ）である。すべてのＦＡＰ標的化変異体は、刺激の２４時間後のＩＦＮ発現として示される、ＮＬＶ−ペプチド活性化ＣＤ８ Ｔ細胞に類似した活性化改善を誘導した。曲線の差異は、正常な偏差内にあり、有意でない。
【図23-2】実施例１において調製された異なる滴定濃度の異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下において、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる活性化アッセイに関する。よりよい表示のために、発現曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた複数の異なる表示ブロットに分けられている。結果は、四つの独立した類似の実験において得られ、それにより、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の持続性のＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７発現が、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体（シグナル１）とＦＡＰ標的化ヒト分裂４−１ＢＢＬ（シグナル２）による４−１ＢＢ−トリガリングの認識を介したＴ細胞の同時活性化に厳密に依存していることが示される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＩＮＦγ発現の効果がグラフに示されている。図示されているのはどれも、全体のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団中における陽性細胞の頻度（パーセンテージ）である。すべてのＦＡＰ標的化変異体は、刺激の２４時間後のＩＦＮ発現として示される、ＮＬＶ−ペプチド活性化ＣＤ８ Ｔ細胞に類似した活性化改善を誘導した。曲線の差異は、正常な偏差内にあり、有意でない。
【図23-3】実施例１において調製された異なる滴定濃度の異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下において、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる活性化アッセイに関する。よりよい表示のために、発現曲線は、コンストラクト１．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢ（一価の非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））を用いた複数の異なる表示ブロットに分けられている。結果は、四つの独立した類似の実験において得られ、それにより、ＮＬＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の持続性のＩＦＮγ分泌及びＣＤ１３７発現が、ＮＬＶ−ＨＬＡ−Ａ２複合体（シグナル１）とＦＡＰ標的化ヒト分裂４−１ＢＢＬ（シグナル２）による４−１ＢＢ−トリガリングの認識を介したＴ細胞の同時活性化に厳密に依存していることが示される。ＣＤ８＋ Ｔ細胞のＩＮＦγ発現の効果がグラフに示されている。図示されているのはどれも、全体のＣＤ８＋ Ｔ細胞集団中における陽性細胞の頻度（パーセンテージ）である。すべてのＦＡＰ標的化変異体は、刺激の２４時間後のＩＦＮ発現として示される、ＮＬＶ−ペプチド活性化ＣＤ８ Ｔ細胞に類似した活性化改善を誘導した。曲線の差異は、正常な偏差内にあり、有意でない。
【図24】滴定濃度の、実施例２の異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下において、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる活性化アッセイに関する。よりよい表示のために、発現曲線を、コンストラクト２．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢを用いる二つの異なる表示ブロットに分けた。すべてのＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトは、刺激の２４時間後における４−１Ｂｂ−上方制御（ポジティブフィードバックループ）として示される、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ−ペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の類似した活性化改善を示した。曲線の差異は、正常な偏差内にあり、有意でない。
【図25】滴定濃度の、実施例２の異なるＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの存在下において、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞及びＮＬＶ−パルスＨＬＡ−Ａ２＋ＦＡＰ＋ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３を用いる活性化アッセイに関する。よりよい表示のために、発現曲線を、コンストラクト２．１（一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ））及び比較曲線としてのコントロールＢを用いる二つの異なる表示ブロットに分けた。すべてのＦＡＰ標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトは、刺激の２４時間後におけるＩＮＦγ発現として示される、ＨＬＡ−Ａ２−ＮＬＶ−ペプチド特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の類似した活性化改善を示した。曲線の差異は、正常な偏差内にあり、有意でない。
【図26】このスキームは、実施例６．４に記載される実験を示している。
【図27】ＣＤ８＋ Ｔ細胞増殖の誘導を示している。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する増殖性ＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度である。
【図28A】健常なＮＯＧマウスにおけるコンストラクト１．２及びコントロールＢの単回投与のＰＫ実験に関する。図示されているのは、経時的なコンストラクト濃度の低下である。
【図28B】幹細胞でヒト化された腫瘍保持ＮＯＧマウスにおけるコンストラクト２．１、２．３、コントロールＢ及びコントロールＣの単回投与のＰＫ実験の結果を示している。
【図28C】健常ＮＯＧマウスにおけるコンストラクト２．１及び２．３を比較する単回投与のＰＫ実験に関する。
【図29】分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドの構築のための構成要素を示ししている。（２９Ａ）は、Ｃ末端で突然変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ（荷電残基）を有するヒトＣＬドメインに融合する二量体リガンドを示しており、（２９Ｂ）は、突然変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ（荷電残基）を有するヒトＣＨ１ドメインに融合する単量体４−１ＢＢリガンドを示している。二価のＣＤ１９標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）抗原結合分子（コンストラクト３．３）の構築のための構成要素（コンストラクト３．３）。（２９Ｃ）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合している二量体リガンドを示している。（２９Ｄ）は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合している単量体リガンドを示している。
【図30】本発明のＣＤ１９標的化４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子コンストラクト３．１から３．６を示している。これらコンストラクトの調製及び生成は、実施例３に記載される。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＣＤ１９抗体８Ｂ８−０１８のものであり、黒丸はノブ・イントゥ・ホール修飾を表している。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメイン内のアミノ酸修飾を示す（いわゆる荷電残基）。
【図31A】親クローン８Ｂ８のＣＤＲ領域の無作為化ストラテジーが示されている。図示されているのは、Ｋａｂａｔの番号付けによる親クローン８Ｂ８の可変ドメイン及びＣＤＲ領域（四角で囲まれる）である。（Ｘ）は、無作為化された位置を表している。
【図31B】ライブラリ生成ストラテジーの概略的な記載を示している。図示されているのは、Ａ）軽鎖及び重鎖の無作為化ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域、又はＢ）軽鎖の無作為化ＣＤＲ１及びＣＤＲ３領域及び重鎖のＣＤＲ３領域を用いる８Ｂ８ベースのライブラリの生成に使用されるＰＣＲ増幅及びクローニングストラテジーである。ファージミドへのクローニングに使用されるそれぞれの酵素が示される。
【図32】選択された親和性成熟バインダーによる親抗ＣＤ１９クローン８Ｂ８のアラインメントを示している。図示されているのは、クローン８Ｂ８の配列と、選択されたすべての親和性成熟バインダーである。重鎖及び軽鎖両方のＣＤＲが四角で囲まれている。
【図33】親８Ｂ８クローン及びその親和性成熟変異体のＳＰＲ分析に関する。図示されているのは、ＬＣＤＲ１Ｎ２７ｄ及びＮ２８のホットスポットのないクローン８Ｂ８及びその親和性成熟誘導体のセンサーグラムである。
【図34】ＣＤ１９標的化三量体分裂４−１ＢＢＬのｈｕ４−１ＢＢ及びｈｕＣＤ１９への同時結合を測定するアッセイの設定を示している（実施例８．２）。
【図35】グラフは、ＣＤ１９標的化三量体４−１ＢＢＬ ＦＣ融合抗原結合分子コンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５、３．６及び４．４（被分析物１）の、固定化されているヒト４−１ＢＢ及びヒトＣＤ１９（被分析物２）への同時結合を示している。
【図36A】異なるＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ＰＨＡ−Ｌ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化及び抗ヒトＣＤ３／抗ヒトＣＤ２８再活性化ヒトＰＢＭＣの４−１ＢＢ発現ＣＤ４Ｔ細胞に対する結合が示されている。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト３．４及び比較曲線としてのコントロールＦ（アイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）を用いた三つの異なるブロットに分けられている。結合は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞についてモニターされた。ＣＤ８ Ｔ細胞上における４−１ＢＢ発現レベルは、通常ＣＤ４Ｔ細胞上より高い。すべてのコンストラクトが極めて類似した親和性でヒト４−１ＢＢに結合する。
【図36B】異なるＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ＰＨＡ−Ｌ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化及び抗ヒトＣＤ３／抗ヒトＣＤ２８再活性化ヒトＰＢＭＣの４−１ＢＢ発現ＣＤ８ Ｔ細胞に対する結合が示されている。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト３．４及び比較曲線としてのコントロールＦ（アイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）を用いた三つの異なるブロットに分けられている。結合は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞についてモニターされた。ＣＤ８ Ｔ細胞上における４−１ＢＢ発現レベルは、通常ＣＤ４Ｔ細胞上より高い。すべてのコンストラクトが極めて類似した親和性でヒト４−１ＢＢに結合する。
【図37A】ＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）抗原結合分子の、ヒト−ＣＤ１９発現Ｂ細胞リンパ腫細胞株である、びまん性大型非ホジキンＢ細胞リンパ腫ＳＵ−ＤＨＬ−８に対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト３．４及び比較曲線としてのコントロールＦ（アイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）を用いた三つの異なるブロットに分けられている。すべてのコンストラクトが極めて類似した親和性でヒトＣＤ１９に結合する。
【図37B】ＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）抗原結合分子の、ヒト−ＣＤ１９発現Ｂ細胞リンパ腫細胞株である、急性Ｂ細胞前駆体リンパ性白血病Ｎａｌｍ６に対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト３．４及び比較曲線としてのコントロールＦ（アイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）を用いた三つの異なるブロットに分けられている。すべてのコンストラクトが極めて類似した親和性でヒトＣＤ１９に結合する。
【図37C】ＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）抗原結合分子の、ヒト−ＣＤ１９発現Ｂ細胞リンパ腫細胞株である、びまん性大型細胞リンパ芽球リンパ腫Ｔｏｌｅｄｏに対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト３．４及び比較曲線としてのコントロールＦ（アイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）を用いた三つの異なるブロットに分けられている。すべてのコンストラクトが極めて類似した親和性でヒトＣＤ１９に結合する。
【図37D】ＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）抗原結合分子の、ヒト−ＣＤ１９発現Ｂ細胞リンパ腫細胞株である、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫ＯＣＩ−Ｌｙ１８に対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト３．４及び比較曲線としてのコントロールＦ（アイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）を用いた三つの異なるブロットに分けられている。すべてのコンストラクトが極めて類似した親和性でヒトＣＤ１９に結合する。
【図38】ＮＦκＢ−活性化−誘導ルシフェラーゼ発現及びＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）抗原結合分子の活性に関する。 放出光の単位（ＵＲＬ）を、０．５秒／ウェル測定し、ＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクト３．１及び３．３と、コントロール分子Ｂ及びＣの使用濃度に対してプロットする。ヒト４−１ＢＢ発現ＨｅＬａ−レポーター細胞を、架橋ヒト−ＣＤ１９発現ＳＵ−ＤＨＬ−８又はＰｆｅｉｆｆｅｒ細胞の非存在下／存在下において７．５時間にわたりインキュベートしている。ＵＲＬを測定し、異なるＣＤ１９標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの濃度に対してブロッティングした。細胞比は、２．５又は五つの腫瘍細胞に対して一つの４−１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞である。
【図39】ＣＥＡ発現ヒト胃腺癌細胞に対するＴ８４．６６ ＩｇＧの異なるヒト化変異体の結合を示している。データに基づき、ＣＥＡ標的化三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）抗原結合分子中に含めるためのヒト化変異体１を選択した。
【図40】本発明のＣＥＡ標的化４−１ＢＢＬ三量体含有抗原結合分子コンストラクト５．１から５．６を示している。これらコンストラクトの調製及び生成は、実施例１１に記載される。ＶＨ及びＶＬドメインは、抗ＣＥＡ抗体Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡのものであり、黒丸はノブ・イントゥ・ホール修飾を表している。＊は、ＣＨ１及びＣＬドメイン内のアミノ酸修飾を示す（いわゆる荷電残基）。
【図41】（４１Ａ）は、ヒトＮＡ３Ｂ３Ａ２−ａｖｉ Ｈｉｓ（ＣＥＡ標的化三量体分裂４−１ＢＢＬ Ｆｃ（ｋｉｈ）抗原結合分子の結合を評価するために使用される抗原）を示している。（４１Ｂ）は、ＣＥＡ標的化三量体分裂４−１ＢＢＬのｈｕ４−１ＢＢ及びヒトＮＡ３Ｂ３Ａ２への同時結合を測定するアッセイの設定を示している（実施例１２．１）。
【図42】グラフは、ＣＥＡ標的化三量体４−１ＢＢＬ Ｆｃ融合抗原結合分子コンストラクト５．４、５．６、５．７及び５．８（被分析物１）の、固定化されているヒト４−１ＢＢ及びヒトＮＡ３Ｂ３Ａ２（被分析物２）への同時結合を示している。
【図43】異なるＣＥＡ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ＰＨＡ−Ｌ及びＰｒｏｌｅｕｋｉｎ事前活性化及び抗ヒトＣＤ３／抗ヒトＣＤ２８再活性化ヒトＰＢＭＣの４−１ＢＢ発現ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞に対する結合が示されている。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。よりよい表示のために、結合曲線は、コンストラクト５．４及び比較曲線としてのコントロールＦ（アイソタイプコントロールｈｕＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ）を用いた二つの異なるブロットに分けられている。結合は、ＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（下部にブロット）及びＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞（上部にブロット）についてモニターされた。ＣＤ８ Ｔ細胞上における４−１ＢＢ発現レベルは、通常ＣＤ４Ｔ細胞上より高い。すべてのコンストラクトが極めて類似した親和性でヒト４−１ＢＢに結合する。
【図44】ＣＥＡ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ヒト−ＣＥＡ発現ヒト胃細胞株ＭＫＮ−４５（左）及びヒト結腸直腸腺癌細胞株ＬＳ１８０（右）に対する結合を示している。結合は、Ｒ−フィコエリトリン−蛍光色素コンジュゲート抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて検出された。図示されているのは、試験されたコンストラクトの濃度に対する蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値である。
【図45】ＮＦκＢ−活性化−誘導ルシフェラーゼ発現及びＣＥＡ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）抗原結合分子の活性に関する。放出光の単位（ＵＲＬ）は、０．５秒／ウェル測定され、ＣＥＡ標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクト５．４、５．６、５．７及び５．８とコントロール分子の使用濃度に対してブロットされる。ヒト４−１ＢＢ発現ＨｅＬａ−レポーター細胞を、架橋ヒト−ＣＥＡ発現ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ−４５の非存在下又は存在下で、６時間インキュベートした。細胞比は、三つの腫瘍細胞に対して一つの４−１ＢＢ発現ＨｅＬａレポーター細胞である。
【図46】（４６Ａ）及び（４６Ｂ）に示されているのは、一価のＦＡＰ標的化分裂三量体ヒトＯＸ４０リガンド（コンストラクト６．１）の構築のための構成要素である。（４６Ａ）はヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合した二量体リガンドに関し、（４６Ｂ）はヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合した単量体リガンドに関する。（４６Ｃ）は、ＦＡＰ標的化ＯＸ４０Ｌ三量体含有抗原結合分子コンストラクト６．１を示す。（４６Ｄ）に示されているのは、ＤＰ４７「非標的化」ヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）である。
【図47A】ＦＡＰ標的化分裂三量体ヒトＯｘ４０ＬのＦＡＰ陽性ＷＭ−２６６−４細胞への結合を示している。ＷＭ−２６６−４細胞は、高レベルのヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ｈｕＦＡＰ）を発現する。ＦＡＰ標的化ＯＸ４ＯリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクト（黒四角）のみがＷＭ−２６６−４細胞に結合し、コントロール５（黒菱形）は結合しなかった。図示されるのは、二次的検出抗体として使用される、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値としての結合である。ＭＦＩはフローサイトメトリーにより測定された。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図47B】ＦＡＰ標的化ＯＸ４ＯリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトのヒトＦＡＰヒトＯｘ４０陰性Ａ５４９ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞への結合を示している。ＦＡＰ標的化ＯＸ４ＯリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトは、ＯＸ４０陰性ＦＡＰ陰性Ａ５４９腫瘍細胞への結合を示さなかった。図示されるのは、二次的検出抗体として使用される、ＦＩＴＣ標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値としての結合である。ＭＦＩがフローサイトメトリーにより測定され、ベースラインがブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことにより修正された。
【図48】（４８Ａ）は、ＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌの、休止及び活性化ヒトＣＤ４Ｔ細胞への結合を示している。Ｏｘ４０は、休止ヒトＣＤ４Ｔ細胞（左側）上には発現しない。ヒトＯｘ４０発現細胞の非存在下では、結合は観察されなかった（左のグラフ）。ヒトＰＢＭＣの活性化後に、Ｏｘ４０はＣＤ４＋ Ｔ細胞上で上方制御される（右側）。ＦＡＰ−Ｏｘ４０ＬはＯｘ４０＋活性化ＣＤ４Ｔ細胞に結合した。図示されるのは、二次的検出抗体として使用される、ＦＩＴＣ標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値としての結合である。ＭＦＩがフローサイトメトリーにより測定され、ベースラインがブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことにより修正された。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。（４８Ｂ）は、Ｏｘ４０が休止ヒトＣＤ８ Ｔ細胞上に発現しないことを示している（左側）。ヒトＯｘ４０発現細胞の非存在下では、結合は観察されなかった（左のグラフ）。ヒトＰＢＭＣの活性化後に、Ｏｘ４０はＣＤ８＋ Ｔ細胞上で上方制御される（右側）。ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞上におけるＯｘ４０発現は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞上より低く、ドナー間で及び時点により変動する。Ｏｘ４０の発現は、図示のＣＤ８ Ｔ細胞上では低かった。ＦＡｐ−Ｏｘ４０Ｌは、Ｏｘ４０＋活性化ＣＤ８ Ｔ細胞に結合した。図示されるのは、二次的検出抗体として使用される、ＦＩＴＣ標識された抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片の蛍光強度（ＭＦＩ）のメジアン値としての結合である。ＭＦＩがフローサイトメトリーにより測定され、ベースラインがブランクコントロールのＭＦＩを差し引くことにより修正された。ｘ軸は、抗体コンストラクトの濃度を示す。
【図49】ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞における、ＦＡＰ標的化分裂三量体ヒトＯＸ４０Ｌ抗原結合分子（ＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌ）によるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化が示されている。図示されているのは、二次抗体による架橋がある（右のグラフ）又はない（左のグラフ）場合の活性化である。レポーター細胞を、１：２の比で架橋二次ポリクローナル抗ｈｕＩｇＧ１ Ｆｃγ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ）２断片と共に又はなしで、図示の濃度のＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌの存在下で５時間培養した。ルシフェラーゼ活性を、実施例６．１に記載のように評価した。活性は、０．５秒間測定された放出光の単位（ＵＲＬ）を、試験されたコンストラクトの濃度（ｎＭ）に対してブロッティングすることにより特徴付けられる。ＵＲＬは、ルシフェラーゼ媒介性の、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化に起因して発せられる。
【図50】ＦＡＰ陽性細胞の存在下でのＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞におけるＦＡＰ−ＯＸ４０ＬによるＮＦκＢの活性化が図５０Ａに示されている。図示されているのは、低ＦＡＰ発現ＮＩＨ−３Ｔ３ヒトＦＡＰ細胞の存在下での、レポーター細胞におけるＦＡＰ−ＯＸ４０ＬによるＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化である（比：１つのレポーター細胞に対して３つのＦＡＰ＋腫瘍細胞）。ＮＦκＢ−媒介ルシフェラーゼ活性は、試験された化合物の濃度（ｎＭ）に対し、５秒間測定された放出光の単位（ＵＲＬ）をブロッティングすることにより特徴付けられた。ＵＲＬは、ルシフェラーゼ媒介性の、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化に起因して発せられる。値は、ブランクコントロールのＵＲＬを差し引くことにより修正されたベースラインである。よりよい比較のために、それぞれのブロッティングされた用量−応答曲線の曲線下面積を、各コンストラクトのアゴニスト能に関するマーカーとして定量化した。比較を（５０Ｂ）に示す。面積は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて計算された。値は、ブランクコントロールの値を差し引くことにより修正されたベースラインである。
【図51】最適以下でＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣのＯＸ４０媒介共刺激を示している（実施例１５．５）。本発明のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌのハイパー架橋は、ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞における生存と増殖を強く促進した。図示されているのは、生存ＣＤ４＋（左）及びＣＤ８＋（右）Ｔ細胞の事象数である。試料のベースラインの値は抗ヒトＣＤ３（クローンＶ９、ｈｕＩｇＧ１）のみを含んでおり、休止ヒトＰＢＭＣ及びＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９は差し引かれた。したがって、ＯＸ４０共刺激の効果の増強が図示されており、最適以下の抗ＣＤ３刺激自体は示されていない。下部の図には、休止ヒトＰＢＭＣの細胞表面固定化ＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌの最適以下のＴＣＲ刺激の救出 −増殖が示されている。
【発明を実施するための形態】
【0080】
定義特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野において一般的に使用されるものと同じ意味を有する。本明細書の説明のために、以下の定義を適用し、適切な場合はいつでも、単数形で用いられる用語は複数形も含み、その逆も同じである。
【0081】
本明細書において使用される用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片、及び足場抗原結合タンパク質である。
【0082】
本明細書において使用される用語「標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分」は、抗原決定基に特異的に結合するポリペプチド分子を指す。一態様では、抗原結合部分は、その標的細胞抗原を通してシグナル伝達を活性化することができる。特定の態様では、抗原結合部分は、それが結合するエンティティ（例えばＴＮＦファミリーリガンド三量体）を標的部位へ、例えば特定の型の腫瘍細胞又は抗原決定基を有する腫瘍間質へと方向付けることができる。標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分には、本明細書においてさらに定義される抗体及びその断片が含まれる。加えて、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分には、例えば本明細書においてさらに定義される足場抗原結合タンパク質、設計反復タンパク質又は設計反復ドメインをベースとする結合ドメイン（例えば国際公開第２００２／０２０５６５号参照）が含まれる。
【0083】
抗体又はその断片に関し、用語「標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分」は、抗原の一部又は全部に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む分子の部分を指す。特定の抗原に対する結合能を有する部分は、例えば、一又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）により提供される。特に、特定の抗原に対する結合能を有する部分は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【0084】
用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造を包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性及び多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【0085】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、即ち、例えば、天然に生じる変異を含むか又はモノクローナル抗体調製物の製造時に発生し、一般的に少量で存在している可能性のある変異型抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【0086】
本明細書において使用される用語「単一特異性」抗体は、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する一又は複数の結合部位を有する抗体を意味する。用語「二重特異性」は、抗原結合分子が少なくとも二つの異なる抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。一般的に、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原決定基に特異的な二つの抗原結合部位を含む。特定の実施態様では、二重特異性抗原結合分子は、二つの抗原決定基、特に二つの別個の細胞上に発現した二つの抗原決定基に同時に結合することができる。
【0087】
本出願において使用される用語「価」は、抗原結合分子内における特定数の結合部位の存在を意味する。したがって、用語「二価」、「四価」、及び「六価」は、抗原結合分子内における、二つの結合部位、四つの結合部位、及び六つの結合部位をそれぞれ意味する。
【0088】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有する抗体を指す。「天然型の抗体」は、天然に生じる、様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型のＩｇＧクラスの抗体は、ジスルフィド結合している二つの軽鎖と二つの重鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、各重鎖は可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続いている。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、各軽鎖は可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常領域とも呼ばれる軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が続いている。抗体の重鎖は、五つのタイプのうちの一つ、即ちα（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、又はμ（ＩｇＭ）に割当てられ、それらのいくつかはさらにサブタイプ、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）に分けられる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる二つの種類のうちのいずれかに割り当てることができる。
【0089】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片；直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び単一ドメイン抗体が含まれる。特定の抗体断片の総説については、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 （2003）を参照。ｓｃＦｖ断片の総説については、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., （Springer-Verlag, New York）, pp. 269-315 （1994）を参照；また、国際公開第９３／１６１８５号；及び米国特許第５５７１８９４号及び第５５８７４５８号も参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、且つインビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の議論については、米国特許第５８６９０４６号を参照のこと。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる二つの抗原−結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ４０４０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 （2003）; and Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 （1993）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディもHudson et al., Nat. Med. 9:129-134 （2003）に記載されている。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべて又は一部、又は軽鎖可変ドメインのすべて又は一部を含む抗体断片である。特定の実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ；例えば、米国特許第６２４８５１６Ｂ１号を参照）。抗体断片は様々な技術によって作成することができ、そのような技術には、限定されないが、本明細書に記載するように、インタクトな抗体のタンパク分解、並びに組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌又はファージ）による生産が含まれる。
【0090】
インタクトな抗体のパパイン消化により、二つの同一の抗原結合断片が生成され、これら断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインの各々と、さらには軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とを含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書において使用される用語「Ｆａｂ断片」は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメイン及び定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’断片である。ペプシン処理は、二つの抗原結合部位（二つのＦａｂ断片）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２断片を産む。
【0091】
用語「クロスＦａｂ断片」又は「ｘＦａｂ断片」又は「クロスオーバーＦａｂ断片」は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域が交換されているＦａｂ断片を指す。クロスオーバーＦａｂ分子の二つの異なる鎖組成物が可能であり、本発明の二重特異性抗体に含まれる：一方は、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の可変領域が交換されたものであり、即ちクロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖と、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖とを含む。このようなクロスオーバーＦａｂ分子はＣｒｏｓｓＦａｂ（ＶＬＶＨ）とも呼ばれる。他方、Ｆａｂの重鎖及び軽鎖の定常領域が交換されているとき、クロスオーバーＦａｂ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）からなるペプチド鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域（ＣＨ１）からなるペプチド鎖とを含む。このようなクロスオーバーＦａｂ分子は、ＣｒｏｓｓＦａｂ（ＣＬＣＨ１）とも呼ばれる。
【0092】
「単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーかならるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し；かつ前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２から５０のアミノ酸のポリペプチドである。前記単鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化する。加えて、これら単鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によりさらに安定しうる。
【0093】
「クロスオーバー単鎖Ｆａｂ断片」又は「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の順序：ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１及びｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬのうちの一つを有し；ＶＨとＶＬは一緒に、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは少なくとも３０のアミノ酸のポリペプチドである。加えて、これらｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基（例えばＫａｂａｔ番号付けによる可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成によりさらに安定しうる。
【0094】
「単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０から約２５のアミノ酸からなる短いリンカーペプチドにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖ｓ（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンに、かつ溶解度のためにセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、又はその逆に接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にも関わらず元の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えばHouston, J.S., Methods in Enzymol. 203 （1991） 46-96に記載されている。加えて、抗体断片は、ＶＨドメインの特徴を有し、即ちＶＬドメインと共に機能性抗原結合部位を構築することができるか、又はＶＬドメインの特徴を有し、即ちＶＨドメインと共に機能性抗原結合部位を構築することができる単鎖ポリペプチドを含み、それにより完全長抗体の抗原結合特性を提供する。
【0095】
「足場抗原結合タンパク質」は、当技術分野で既知であり、例えば、フィブロネクチン及びアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）が抗原結合ドメインのための代替的足場として使用されている。例えば、Gebauer and Skerra, Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics. Curr Opin Chem Biol 13:245-255 （2009） and Stumpp et al., Darpins: A new generation of protein therapeutics. Drug Discovery Today 13: 695-701 （2008）参照。本発明の一態様では、足場抗原結合タンパク質は、ＣＴＬＡ−４（Ｅｖｉｂｏｄｙ）、リポカリン（アンチカリン）、プロテインＡにより得られる分子、例えばプロテインＡ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ）のＺ−ドメイン、Ａ−ドメイン（Ａｖｉｍｅｒ／Ｍａｘｉｂｏｄｙ）、血清トランスフェリン（トランスボディ）；アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）、抗体軽鎖又は重鎖の可変ドメイン（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂ）、抗体重鎖の可変ドメイン（ナノボディ、ＶＨ）、ａＶＮＡＲ断片、フィブロネクチン（アドネクチン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）；新規抗原受容体ベータ−ラクタマーゼの可変ドメイン（ＶＮＡＲ断片）、ヒトガンマ−クリスタリン又はユビキチン（Ａｆｆｉｌｉｎ分子）；ヒトプロテアーゼ阻害剤のｋｕｎｉｔｚ型、ミクロボディ、例えばノッチンファミリー由来のタンパク質、ペプチドアプタマー及びフィブロネクチン（アドネクチン）からなる群より選択される。
【0096】
ＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４）は、主にＣＤ４＋ Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８ファミリー受容体である。その細胞外ドメインは可変ドメイン様Ｉｇフォールドを有する。抗体のＣＤＲに対応するループは、異なる結合特性を付与するために、異種配列で置換することができる。異なる結合特異性を有するように操作されたＣＴＬＡ−４分子は、Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓ（例えば米国特許第７１６６６９７号）としても知られる。Ｅｖｉｂｏｄｉｅｓは、抗体（例えばドメイン抗体）の単離された可変領域とほぼ同じ大きさである。さらなる詳細については、Journal of Immunological Methods 248 （1-2）, 31-45 （2001）を参照されたい。
【0097】
リポカリンは、疎水性の小分子、例えばステロイド、ビリン、レチノイド及び脂質を輸送する細胞外タンパク質のファミリーである。リポカリンは、異なる標的抗原に結合するように操作することのできる、円錐構造の開放端に複数のループを有する剛性のベータシート二次構造を有する。アンチカリンは、１６０から１８０のアミノ酸の大きさであり、リポカリンから誘導される。さらなる詳細については、Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 （2000）、米国特許第７２５０２９７号及び米国特許出願公開第２００７０２２４６３３号を参照されたい。
【0098】
アフィボディは、抗原に結合するように操作することのできるブドウ球菌属のプロテインＡから誘導される足場である。ドメインは、約５８のアミノ酸の３ヘリックス束からなる。表面残留物の無作為化によりライブラリが生成された。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 （2004）及びＥＰ１６４１８１８Ａ１を参照されたい。
【0099】
Ａｖｉｍｅｒは、Ａドメイン足場ファミリーから誘導される多ドメインタンパク質である。約３５のアミノ酸の天然ドメインは、規定のジスルフィド結合構造をとる。Ａドメインのファミリーが呈する自然変異のシャフリングにより、多様性が生じる。さらなる詳細については、Nature Biotechnology 23（12）, 1556 - 1561 （2005） 及びExpert Opinion on Investigational Drugs 16（6）, 909-917 （June 2007）を参照されたい。
【0100】
トランスフェリンは単量体血清輸送糖タンパク質である。トランスフェリンは、許容表面ループ内のペプチド配列の挿入により、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。操作されたトランスフェリン足場には、トランスボディが含まれる。さらなる詳細については、J. Biol. Chem 274、24066-24073(1999)を参照されたい。
【0101】
アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎｓ）は、内在性膜タンパク質の細胞骨格への結合を媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンから誘導される。単一のアンキリンリピートは、二つのアルファヘリックスと一つのベータターンからなる３３の残基モチーフである。これらモチーフは、各リピートの１番目のアルファヘリックス及びベータターン内の残基を無作為化することにより、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。これらの結合面は、モジュールの数を増加させることにより増大させることができる（親和性成熟の方法）。さらなる詳細については、J. Mol. Biol. 332, 489-503 （2003）, PNAS 100（4）, 1700-1705 （2003） and J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 （2007）及び米国特許出願公開第２００４０１３２０２８号を参照されたい。
【0102】
単一ドメイン抗体は、単一の単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１の単一ドメインは、ラクダ科（ナノボディ又はＶＨＨ断片）由来の抗体重鎖の可変ドメインから誘導された。さらに、単一ドメイン抗体という用語は、サメ由来の自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）又はＶＮＡＲ断片を含む。
【0103】
フィブロネクチンは、抗原に結合するように操作することのできる足場である。アドネクチンは、ヒトフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦＮ３）の１５の反復単位の１０番目のドメインの天然アミノ酸配列の骨格からなる。ベータサンドイッチの一端の三つのループは、対象の治療的標的をアドネクチンが特異的に認識することを可能にするように操作することができる。さらなる詳細については、Protein Eng. Des. Sel. 18, 435- 444 （2005）、米国特許出願公開第２００８０１３９７９１号、国際公開第２００５０５６７６４号及び米国特許第６８１８４１８号を参照されたい。
【0104】
ペプチドアプタマーは、定常足場タンパク質、典型的には活性部位に挿入された制限可変ペプチドループを含むチオレドキシン（ＴｒｘＡ）からなるコンビナトリアル認識分子である。さらなる詳細については、Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 （2005）を参照されたい。
【0105】
ミクロボディは、３−４システイン架橋を含む、長さ２５〜５０のアミノ酸の天然に存在するマイクロプロテインから誘導される−マイクロプロテインの例には、ＫａｌａｔａＢＩ及びコノトキシン及びノッチンが含まれる。マイクロプロテインは、マイクロプロテインのフォールド全体に影響を与えずに２５までのアミノ酸を含むように操作することのできるループを有する。操作されたノッチンドメインのさらなる詳細については、国際公開第２００８０９８７９６号を参照されたい。
【0106】
参照分子と「同じエピトープに結合する抗原結合分子」は、競合アッセイにおいて、参照分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗原結合分子を指し、逆に参照分子は、競合アッセイにおいて、抗原結合分子のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。
【0107】
用語「抗原結合ドメイン」は、抗原の一部又は全部に結合し、且つ抗原の一部又は全部に相補的な領域を含む抗原結合分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合し、この特定の部分はエピトープと呼ばれる。抗原結合ドメインは、例えば、一又は複数の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）により提供される。好ましくは、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【0108】
本明細書において使用される用語「抗原決定基」は、「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合部分が結合し、抗原結合部分−抗原複合体を形成するポリペプチド巨大分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的広がり又は非連続的アミノ酸の異なる領域から形成される立体配座構造）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面に、ウイルス感染細胞の表面に、他の疾患細胞の表面に、免疫細胞の表面に、血清中に遊離した状態で、及び／又は細胞外基質（ＥＣＭ）に見出すことができる。特に断らない限り、本明細書において抗原として有用なタンパク質は、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス、ラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物源由来のタンパク質の任意の天然型を指す。特定の実施態様では、抗原はヒトタンパク質である。本明細書において特定のタンパク質が言及される場合、その用語は「完全長」の未処理のタンパク質と、細胞内でのプロセシングにより得られる任意の形態のタンパク質とを包含する。その用語はまた、天然に存在するタンパク質の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。
【0109】
「特異的に結合」とは、結合が、抗原について選択的であり、望ましくない相互作用又は非特異的相互作用とは区別可能であることを意味する。抗原結合分子の、特定の抗原への結合能は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られた他の技術、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ計器上での解析）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 （2000））、及び古典的結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 （2002））により測定することができる。一実施態様では、抗原結合分子の無関係なタンパク質への結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合分子の抗原への結合の約１０％未満である。特定の実施態様では、抗原に結合する分子は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、又は≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば１０−８Ｍから１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍから１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。
【0110】
「親和性」又は「抗原親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書で使用する場合、特に断らない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する本質的な結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、通常、解離定数（Ｋｄ）によって表される。この解離定数（ＫＤ）は、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋｏｆｆ及びｋｏｎ）の比である。したがって、等価な親和性は、速度定数の比が同じままである限り、異なる速度定数を含みうる。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当技術分野で既知の一般的な方法により測定することができる。親和性を測定するための特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【0111】
本明細書において使用される「標的細胞抗原」は、標的細胞、例えばがん細胞又は腫瘍間質の細胞といった腫瘍内細胞の表面に提示される抗原決定基を指す。特定の実施態様では、標的細胞抗原は、腫瘍細胞の表面上の抗原である。一実施態様では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される。特に、標的細胞抗原は線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
【0112】
プロリルエンドペプチダーゼＦＡＰ又はセプラーゼ（ＥＣ３．４．２１）としても知られる用語「線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）」は、別途指示がない限り、霊長類（例えばヒト）非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含むいずれかの脊椎動物を供給源とする任意の天然ＦＡＰを指す。この用語は、「完全長」の、プロセシングされていないＦＡＰ並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のＦＡＰを包含する。この用語は、天然に存在するＦＡＰの変異体、例えばスプライスバリアント又は対立遺伝子変異体も包含する。一実施態様では、本発明の抗原結合分子は、ヒト、マウス及び／又はカニクイザルのＦＡＰに対する特異的結合能を有する。ヒトＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）受託番号Ｑ１２８８４（バージョン１４９、配列番号２０）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿００４４５１．２に示されている。ヒトＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位２６から７６０に延びている。Ｈｉｓタグ付きヒトＦＡＰ ＥＣＤのアミノ酸及びヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１５及び１６に示される。マウスＦＡＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ９７３２１（バージョン１２６、配列番号２３）、又はＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０３２０１２．１に示されている。マウスＦＡＰの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、アミノ酸位２６から７６１に延びている。配列番号２４及び２５は、Ｈｉｓタグ付きマウスＦＡＰ ＥＣＤのそれぞれアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。配列番号２６及び２７は、Ｈｉｓタグ付きカニクイザルＦＡＰ ＥＣＤのそれぞれアミノ酸及びヌクレオチド配列を示す。好ましくは、本発明の抗ＦＡＰ結合分子は、ＦＡＰの細胞外ドメインに結合する。例示的抗ＦＡＰ結合分子は、国際公開第２０１２／０２０００６号に記載されている。
【0113】
用語「がん胎児性抗原（ＣＥＡ）」は、がん胎児性抗原関連細胞接着分子５（ＣＥＡＣＡＭ５）としても知られ、別途指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含むいずれかの脊椎動物を供給源とする任意の天然ＣＥＡを指す。ヒトＣＥＡのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０６７３１（バージョン１５１、配列番号２８）に示されている。ＣＥＡは、以前より、腫瘍関連抗原として同定されている（Gold and Freedman, J Exp Med., 121:439-462, 1965; Berinstein N. L., J Clin Oncol., 20:2197-2207, 2002）。ＣＥＡは、最初胎子組織にのみ発現するタンパク質として分類され、現在では複数の正常な成人組織において同定されている。これら組織は主に上皮に由来しており、胃腸、呼吸器、及び尿生殖路の細胞と、結腸、頸部、汗腺、及び前立腺の細胞を含む（Nap et al., Tumour Biol., 9（2-3）:145-53, 1988; Nap et al., Cancer Res., 52（8）:2329-23339, 1992）。上皮由来の腫瘍、並びにその転移は、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを含む。ＣＥＡ自体の存在はがん性細胞への形質転換を示すものではないが、ＣＥＡの分布が示される。正常組織では、ＣＥＡは通常細胞の頂髄膜側に発現され（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9（2）:67-81 （1999））、それが血流中の抗体に到達することを不可能にする。正常組織と対照的に、ＣＥＡは、がん性細胞の表面全体に発現される傾向がある（Hammarstrom S., Semin Cancer Biol. 9（2）:67-81 （1999））。発現パターンのこのような変化により、ＣＥＡは、がん性細胞内に結合する抗体に到達可能となる。加えて、ＣＥＡ発現はがん性細胞において増大する。さらに、増大したＣＥＡ発現は細胞間接着の増大を促し、これは転移に繋がる（Marshall J., Semin Oncol., 30（a Suppl. 8）:30-6, 2003）。様々な腫瘍エンティティにおけるＣＥＡ発現の有病率は、通常極めて高い。公開データと合わせて、組織試料に実施された本発明の分析により、その高い有病率が確認され、有病率は、結腸直腸癌（ＣＲＣ），において約９５％、膵臓がんにおいて９０％、胃がんにおいて８０％、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ、ＨＥＲ３との共発現）において６０％、及び乳がんにおいて４０％であった。低発現が、小細胞肺がん及び膠芽細胞腫に見られた。
【0114】
ＣＥＡは、容易に細胞表面から切断され、直接又はリンパ管を介して腫瘍から血流中へと流れる。この特性により、血清ＣＥＡのレベルは、がんの診断及びがん、特に結腸直腸がんの再発のスクリーニングのための臨床マーカーとして使用されている（Goldenberg D M., The International Journal of Biological Markers, 7:183-188, 1992; Chau I., et al., J Clin Oncol., 22:1420-1429, 2004; Flamini et al., Clin Cancer Res; 12（23）:6985-6988, 2006）。
【0115】
コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）としても知られる用語「メラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）」は、別途指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含むいずれかの脊椎動物を供給源とする任意の天然ＭＣＳＰを指す。ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ６ＵＶＫ１（バージョン１０３、配列番号２９）に示されている。がん原遺伝子ｃ−ＥｒｂＢ−１又は受容体型チロシンタンパク質キナーゼｅｒｂＢ−１の名称も持つ用語「上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）」は、別途指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含むいずれかの脊椎動物を供給源とする任意の天然ＥＧＦＲを指す。ヒトＥＧＦＲのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ００５３３（バージョン２１１、配列番号３０）に示されている。
【0116】
用語「ＣＤ１９」は、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ４又はＴ細胞表面抗原Ｌｅｕ−１２としても知られるＢリンパ球抗原ＣＤ１９を指し、別途指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むいずれかの脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ１９を含む。ヒトＣＤ１９のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ１５３９１（バージョン１６０、配列番号３０）に示されている。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないヒトＣＤ１９、並びに本明細書において報告される抗体が結合する限りにおいて細胞内でのプロセシングから生じるヒトＣＤ１９の任意の形態を包含する。ＣＤ１９は、ヒトＢ細胞の表面上に発現する構造的に異なる細胞表面受容体であり、限定しないが、プレＢ細胞、発生初期のＢ細胞（即ち、未成熟Ｂ細胞）、形質細胞への最終分化を介した成熟Ｂ細胞、及び悪性Ｂ細胞を含む。ＣＤ１９は、多くのプレＢ急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ球性白血病、ヘアリー細胞白血病、一般的な急性リンパ球性白血病、及び一部のＮｕｌｌ急性リンパ芽球性白血病によって発現される。形質細胞上におけるＣＤ１９の発現はさらに、それが多発性骨髄腫といった分化したＢ細胞腫瘍に発現されうることを示唆している。したがって、ＣＤ１９抗原は、非ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病及び／又は急性リンパ芽球性白血病の治療における免疫療法の標的である。
【0117】
用語「ＣＤ２０」は、膜貫通４ドメインファミリーＡメンバー１（ＭＳ４Ａ１）、Ｂリンパ球表面抗原Ｂ１又は白血球表面抗原Ｌｅｕ−１６としても知られるＢリンパ球抗原ＣＤ２０を指し、別途指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むいずれかの脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ２０を含む。ヒトＣＤ２０のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ１１８３６（バージョン１４９、配列番号３２）に示されている。「ＣＤ３３」は、ＳＩＧＬＥＣ３又はｇｐ６７としても知られる骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、別途指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）といった哺乳動物を含むいずれかの脊椎動物源由来の任意の天然ＣＤ３３を含む。ヒトＣＤ３３のアミノ酸配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０１３８（バージョン１５７、配列番号３３）に示されている。
【0118】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原結合分子の抗原への結合に関与する抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。通常、天然型抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、各々が四つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と三つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む類似構造を有する。例えば、Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 （2007）を参照されたい。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分である。
【0119】
本明細書で使用される用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列が超可変である、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、天然型４鎖抗体は、ＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）、計６つのＨＶＲを含む。ＨＶＲは、一般的に超可変ループ由来及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高の配列可変性を有し、及び／又は抗原認識に関与している。例示的な超可変ループはアミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987）。）例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、及びＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基、Ｌ１の２４−３４、Ｌ２の５０−５６、Ｌ３の８９−９７、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−６５、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。）超可変領域（ＨＶＲ）は、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に言及して本明細書では交換可能に使用される。このような特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" （1983） and by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 （1987）に記載されており、その定義には、互いに比較されたときのアミノ酸残基の重複又はサブセットが含まれる。それでも、抗体又はその変異体のＣＤＲに言及していずれかの定義が適用される場合、本明細書において定義及び使用される用語の範囲に含まれることが意図されている。上記文献の各々により定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表Ａに明記される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及び大きさに応じて変化するであろう。当業者であれば、抗体の可変領域のアミノ酸配列を前提に、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかを、常套的に決定することができる。
【0120】
[この文献は図面を表示できません]
１ 表ＡのすべてのＣＤＲの定義の番号付けは、Ｋａｂａｔら（以下参照）によって規定された番号付けの慣習に従っている。２ 表Ａにおいて使用されている小文字の「ｂ」を含む「ＡｂＭ」は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒの「ＡｂＭ」抗体モデル化ソフトウェアによって定義されるＣＤＲを指す。
【0121】
Ｋａｂａｔらは、あらゆる抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者であれば、配列自体を超える実験データに頼らなくとも、この「Ｋａｂａｔ番号付け」のシステムをあらゆる可変領域配列に明確に割り当てることができる。ここで使用される「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" （1983）によって規定された番号付けシステムを指す。特に断らない限り、抗体可変領域内における特定のアミノ酸残基の位置の番号付けへの言及は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従っている。
【0122】
ＶＨのＣＤＲ１を例外として、ＣＤＲは一般的に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」も含む。ＳＤＲは、略称（ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ−）ＣＤＲ、又はａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれている。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２、及びａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、アミノ酸残基、Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８、及びＨ３の９５−１０２に生じる。（Almagro and Fransson, Front. Biosci.13:1619-1633 （2008）参照。）特に断らない限り、可変ドメイン内のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では、上掲のＫａｂａｔらに従って番号付けされる。
【0123】
抗原結合分子（例えば、抗体）の文脈において本明細書で使用される用語「親和性成熟」は、例えば、突然変異により、参照抗原結合分子から誘導され、参照抗体と同じ抗原に結合し、好ましくは同じエピトープに結合し、かつ抗原に対して参照抗原結合分子より高い親和性を有する抗原結合分子を指す。親和性成熟は通常、抗原結合分子の一又は複数のＣＤＲにおける一又は複数のアミノ酸残基の修飾を含む。典型的には、親和性成熟抗原結合分子は、最初の参照抗原結合分子と同じエピトープに結合する。
【0124】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般に四つのＦＲのドメイン、即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４で構成される。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は一般にＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列に現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【0125】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」とは、下記に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られる軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同一のアミノ酸配列を含んでもよく、又はそれはアミノ酸配列の変化を含んでもよい。いくつかの実施態様において、アミノ酸変化の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【0126】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる起源又は種に由来する抗体を指す。
【0127】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体には五つの主要なクラス、即ち ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けられる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0128】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。特定の実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、 非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を遂げている抗体を指す。本発明が包含する「ヒト化抗体」の他の形態は、定常領域が、特にＣ１ｑ結合及び／又はＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合に関して、本発明による特性を産むように元の抗体の定常領域から追加的に修飾又は変更されているものである。
【0129】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体コード化配列を利用する非ヒト起源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外する。
【0130】
本明細書の用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３ドメインを含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びる。一実施態様では、糖（炭水化物）鎖がＣＨ２ドメインに結合している。本明細書のＣＨ２ドメインは、天然配列ＣＨ２ドメイン又は変異型ＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域内においてＣＨ２ドメインに対する残基Ｃ末端のストレッチを含む（即ちＩｇＧの約３４１位のアミノ酸残基から約４４７のアミノ酸残基）。本明細書のＣＨ３領域は、天然配列ＣＨ３ドメイン又は変異型ＣＨ３ドメイン（例えばその一方の鎖に「隆起」（「ノブ」）が導入されて、その他方の鎖に導入された「空洞」（「ホール」）に対応しているＣＨ３ドメイン；米国特許第５８２１３３３号参照（参照により本明細書に明示的に包含する））であってもよい。このような変異型ＣＨ３ドメインは、本明細書に記載される二つの非同一抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用される。一実施態様において、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、存在してなくともよい。本明細書に別途指定のない限り、Ｆｃ領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載のように、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに従う。
【0131】
「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996）及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、この方法では、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することが行われる。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。特定の実施態様では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットのうちの一方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの二つのサブユニットのうちの他方にアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む。さらなる特定の実施態様では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、加えてアミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、加えてアミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニット間にジスルフィド架橋が形成され、したがってさらに二量体を安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 （2001））。番号付けは、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991のＥＵインデックスに従う。
【0132】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、免疫グロブリンのＦｃ領域の天然に存在する対立遺伝子変異体、並びに置換、付加又は欠失を生成するが、免疫グロブリンのエフェクター機能（例えば抗体依存性細胞傷害）媒介能を実質的に低下させることのない改変を有する変異体を含むことを意図している。例えば、一又は複数のアミノ酸は、生物的機能を置実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端又はＣ末端から削除することができる。このような変異体は、活性に対する影響が最小となるように、当技術分野で既知の一般的規則に従って選択することができる（例えば、Bowie, J. U. et al., Science 247:1306-10 （1990）参照）。
【0133】
用語「エフェクター機能」は、抗体のアイソタイプにより変わる、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞の活性化が含まれる。
【0134】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による結合に続いて、エフェクター機能を実行するように受容体保有細胞を刺激するシグナル伝達現象を生じさせるＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体には、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が含まれる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０８６３７、バージョン１４１参照）。
【0135】
用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「ＴＮＦファミリーリガンド」は、炎症誘発サイトカインを指す。一般的なサイトカイン、及び特にＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、免疫系の刺激及び調整に重要な役割を果たす。現在、配列、機能、及び構造の類似性に基づいて、１９のサイトカインがＴＮＦ（腫瘍壊死因子）リガンドスーパーファミリーのメンバーとして同定されている。これらリガンドのすべては、Ｃ末端細胞外ドメイン（エクトドメイン）、Ｎ末端細胞内ドメイン及び単一の膜貫通ドメインを有するＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＴＮＦ相同性ドメイン（ＴＨＤ）として知られるＣ末端細胞外ドメインは、スーパーファミリーメンバー間に２０〜３０％のアミノ酸同一性を有し、受容体に対する結合を担っている。また、ＴＮＦエクトドメインは、ＴＮＦリガンドによる、それらの特異的受容体によって認識される三量体複合体の形成を担っている。
【0136】
ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーは、リンホトキシンα（ＬＴＡ又はＴＮＦＳＦ１としても知られる）、ＴＮＦ（ＴＮＦＳＦ２としても知られる）、ＬＴβ（ＴＮＦＳＦ３としても知られる）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４としても知られる）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４又はＴＮＦＳＦ５としても知られる）、ＦａｓＬ（ＣＤ９５Ｌ、ＣＤ１７８又はＴＮＦＳＦ６としても知られる）、ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０又はＴＮＦＳＦ７としても知られる）、ＣＤ３０Ｌ（ＣＤ１５３又はＴＮＦＳＦ８としても知られる）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９としても知られる）、ＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ２Ｌ、ＣＤ２５３又はＴＮＦＳＦ１０としても知られる）、ＲＡＮＫＬ（ＣＤ２５４又はＴＮＦＳＦ１１としても知られる）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２としても知られる）、ＡＰＲＩＬ（ＣＤ２５６又はＴＮＦＳＦ１３としても知られる）、ＢＡＦＦ（ＣＤ２５７又はＴＮＦＳＦ１３Ｂとしても知られる）、ＬＩＧＨＴ（ＣＤ２５８又はＴＮＦＳＦ１４としても知られる）、ＴＬ１Ａ（ＶＥＧＩ又はＴＮＦＳＦ１５としても知られる）、ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８としても知られる）、ＥＤＡ−Ａ１（エクトジスプラシンＡ１としても知られる）及びＥＤＡ−Ａ２（エクトジスプラシンＡ２としても知られる）からなる群より選択される。この用語は、特に断らない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の天然ＴＮＦファミリーリガンドを指す。本発明の特定の実施態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、ＯＸ４０Ｌ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＴＲＡＩＬ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ及びＧＩＴＲＬからなる群より選択される。特定の実施態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【0137】
さらなる情報、特にＴＮＦリガンドファミリーメンバーの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）といった公に利用可能なデータベースから取得することができる。例えば、ヒトＴＮＦリガンドは、以下のアミノ酸配列：ヒトリンホトキシンα（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１３７４、配列番号３４）、ヒトＴＮＦ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０１３７５、配列番号３５）、ヒトリンホトキシンβ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０６６４３、配列番号３６）、ヒトＯＸ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２３５１０、配列番号３７）、ヒトＣＤ４０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２９９６５、配列番号３８）、ヒトＦａｓＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ４８０２３、配列番号３９）、ヒトＣＤ２７Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３２９７０、配列番号４０）、ヒトＣＤ３０Ｌ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３２９７１、配列番号４１）、４−１ＢＢＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ４１２７３、配列番号４２）、ＴＲＡＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５０５９１、配列番号４３）、ＲＡＮＫＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ１４７８８、配列番号４４）、ＴＷＥＡＫ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ４３５０８、配列番号４５）、ＡＰＲＩＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ７５８８８、配列番号４６）、ＢＡＦＦ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｙ２７５、配列番号４７）、ＬＩＧＨＴ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ４３５５７、配列番号４８）、ＴＬ１Ａ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ９５１５０、配列番号４９）、ＧＩＴＲＬ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＵＮＧ２、配列番号５０）及びエクトジスプラシンＡ（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９２８３８、配列番号５１）を有する。
【0138】
「エクトドメイン」は、細胞外スペース（即ち標的細胞外のスペース）へと延びる膜タンパク質のドメインである。エクトドメインは通常、シグナル伝達に繋がる表面との接触を開始するタンパク質の部分である。したがって、本明細書に定義されるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、細胞外スペース（細胞外ドメイン）中へと延びるＴＮＦリガンドタンパク質の部分を指すが、三量体形成及び対応するＴＮＦ受容体への結合を担うその断片のもっと短い部分も含む。したがって、用語「ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片」は、細胞外ドメインを形成するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの細胞外ドメイン又は依然受容体に結合できるその断片（受容体結合ドメイン）を指す。
【0139】
用語「相補的ＴＮＦリガンドファミリーメンバー」又は「共刺激ＴＮＦファミリーリガンド」は、Ｔ細胞の増殖又はサイトカイン生成を共刺激することのできるＴＮＦリガンドファミリーメンバーのサブグループを指す。これらＴＮＦファミリーリガンドは、それらに対応するＴＮＦ受容体と相互作用するときＴＣＲシグナルを共刺激することができ、それらの受容体との相互作用はＴＮＦＲ関連因子（ＴＲＡＦ）の動員を招き、それによりシグナル伝達カスケードが開始されてＴ細胞が活性化する。共刺激ＴＮＦファミリーリガンドは、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ及びＬＩＧＨＴからなる群より選択され、さらに具体的には共刺激ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択される。
【0140】
先述のように、４−１ＢＢＬはＩＩ型膜貫通タンパク質及びＴＮＦリガンドファミリーの一メンバーである。配列番号４２のアミノ酸配列を有する完全な、即ち完全長の４−１ＢＢＬは、細胞の表面に三量体を形成することが記載されている。三量体の形成は、４−１ＢＢＬのエクトドメインの特定のモーティブによって可能になる。前記モーティブは、本明細書では「三量体化領域」と呼ばれる。ヒト４−１ＢＢＬ配列のアミノ酸５０−２５４（配列番号５２）が４−１ＢＢＬの細胞外ドメインを形成するだけでなく、その断片も三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「４−１ＢＢＬのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２５４）、配列番号１（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２５４）、配列番号３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２５４）及び配列番号２（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２５４）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、又は配列番号９６（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸７１−２４８）、配列番号３７５（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸５２−２４８）、配列番号３７４（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８０−２４８）及び配列番号３７３（ヒト４−１ＢＢＬのアミノ酸８５−２４８）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すが、本明細書では三量体形成能を有するエクトドメインの他の断片も含まれる。
【0141】
先述のように、ＯＸ４０Ｌは別のＩＩ型膜貫通タンパク質及びＴＮＦリガンドファミリーのさらなるメンバーである。完全な、即ち完全長のヒトＯＸ４０Ｌは配列番号３７のアミノ酸配列を有する。ヒトＯＸ４０Ｌ配列のアミノ酸５１−１８３（配列番号５３）がＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを形成するだけでなく、その断片も三量体を形成することができる。本発明の特定の実施態様では、用語「ＯＸ４０Ｌのエクトドメイン又はその断片」は、配列番号５３（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５１−１８３）又は配列番号５４（ヒトＯＸ４０Ｌのアミノ酸５２−１８３）から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指すが、本明細書では三量体形成能を有するエクトドメインの他の断片も含まれる。
【0142】
用語「ペプチドリンカー」は、一又は複数のアミノ酸、典型的には約２から２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは当分野において既知であるか、又は本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（Ｓｇ４）ｎ４）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで「ｎ」は通常１から１０の数、典型的には１から４の数、特に２であり、即ちこのペプチドは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１２８）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５５）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号５６）からなる群より選択されるだけでなく、配列ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号５８）、ＧＳＧＳＧＮＧＳ（配列番号５９）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号６０）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号６１）、ＧＧＳＧ（配列番号６２）、ＧＧＳＧＮＧＳＧ（配列番号６３）、ＧＧＮＧＳＧＳＧ（配列番号６４）及びＧＧＮＧＳＧ（配列番号６５）も含む。特に対象とされるペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）１又はＧＧＧＧＳ（配列番号１２８）、（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）、さらに具体的には（Ｇ４Ｓ）２又はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１３）及びＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）である。
【0143】
本願内で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アラニン（３文字コード：ａｌａ、１文字コード：Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、及びバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の群を意味する。
【0144】
本明細書において使用される「単鎖融合タンパク質」は、エクトドメイン抗原結合部分又はＦｃ部分の一部に融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一又は二のエクトドメインからなる単鎖ポリペプチドを指す。このような融合は、抗原結合部分のＮ又はＣ末端のアミノ酸を、ペプチドリンカーを介して前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインのＣ又はＮ末端のアミノ酸に直接結合することにより生じうる。
【0145】
「融合」した又は「接続」したとは、成分（例えば前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのポリペプチド及びエクトドメイン）がペプチド結合により、直接又は一又は複数のペプチドリンカーを介して結合していることを意味する。
【0146】
参照ポリペプチド（タンパク質）配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大の配列同一性パーセントを得るように配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の、いかなる保存的置換も配列同一性の一部とみなさない、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当分野の技術の範囲内にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＳＡＷＩ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含めた、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書において、アミノ酸配列同一性％の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社によって著作され、ソースコードは米国著作権庁、ワシントンＤ．Ｃ．，２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。また、ＡＬＩＧＮ−２はプログラム、ジェネンテック社（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から公的に入手可能であり、又はそのソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸのＶ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されて変動しない。アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Ａの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（或いは、所与のアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有する又は含む所与のアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２により、ＡとＢのそのプログラムのアラインメントにおいて同一であるとして一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。特に断らない限り、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して、直前の段落で説明したように得られる。
【0147】
特定の実施態様では、本明細書において提供されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体が考慮される。例えば、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましい。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により、調製することができる。このような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。最終コンストラクトが所望の特性、例えば、抗原結合を有していることを条件として、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを、最終構築物に到達させるために行うことができる。置換突然変異の目的の部位は、ＨＶＲ及びフレームワーク（ＦＲ）を含む。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表Ｂに示され、アミノ酸側鎖のクラス（１）から（６）を参照して下記にさらに説明される。アミノ酸置換は、目的の分子に導入することができ、その産物は、所望の活性、例えば、抗原結合の保持／改善、免疫原性の低下、又はＡＤＣＣ又はＣＤＣの改善についてスクリーニングされる。
【0148】
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【0149】
アミノ酸は以下の共通の側鎖特性に従ってグループ化することができる。（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【0150】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの一クラスのメンバーを別のクラスのもと交換することを必要とする。
【0151】
用語「アミノ酸配列変異体」は、親抗原結合分子（例えばヒト化又はヒト抗体）の一又は複数の超可変領域残基にアミノ酸置換が存在する実質的な変異体を含む。一般的には、結果として得られ、さらなる研究のために選択される変異体は、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性（例えば、親和性の向上、免疫原性の低下）に修飾（例えば、改善）を有する、及び／又は親抗体結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換型変異体は、親和性成熟抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて、簡便に生成される。簡潔に言えば、一又は複数のＨＶＲ残基が変異し、変異体抗原結合分子は、ファージ上に表示され、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。特定の実施態様では、置換、挿入又は欠失は、 このような改変が抗原に対する抗原結合分子の結合能を実質的に低下させない限り、一又は複数のＨＶＲ内で生じうる。例えば、実質的に結合親和性を低下させない保存的変更（例えば本明細書において提供される保存的置換）をＨＶＲ内で行うことができる。突然変異誘発のために標的とすることができる抗体の残基又は領域を同定するための有用な方法は、Cunningham and Wells （1989） Science, 244:1081-1085により記載されているように、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基又は標的残基のグループ（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）が同定され、抗原と抗体との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、中性又は負に帯電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置き換えられる。さらなる置換が、最初の置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸の位置に導入されうる。代替的に又は追加的に、抗体と抗原の接点を同定するための抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基及び隣接残基は、置換の候補として標的とされてもよいし、又は排除されてもよい。変異体は、所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされうる。
【0152】
アミノ酸配列挿入物は、 １残基から１００以上の残基を有するポリペプチドの長さに及ぶアミノ及び／又はカルボキシル末端融合体、 並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が含まれる。分子の他の挿入変異体は、ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の血清半減期を延ばすポリペプチドのＮ又はＣ末端への融合を含む。
【0153】
特定の実施態様では、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、抗体がグリコシル化される程度を上昇又は低下させるように改変される。分子のグリコシル化変異体は、一又は複数のグリコシル化部位が創出又は削除されるようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に得ることができる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子がＦｃ領域を含む場合、それに結合する糖（炭水化物）を改変することができる。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ結合により一般に付着した分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH15:26-32 （1997）を参照されたい。オリゴ糖は、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐糖鎖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含む。いくつかの実施態様では、特定の改善された特性を有する変異体を生成するために、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のオリゴ糖の修飾が行われる。一態様では、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）結合するフコースを欠く糖鎖（炭水化物）構造を有するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の変異体が提供される。このようなフコシル化変異体は、ＡＤＣＣ機能を改善したと思われる。例えば米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）又は同第２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ Ｈａｋｋｏ Ｋｏｇｙｏ Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のさらなる変異体には、二分されたオリゴ糖を有するもの、例えば、Ｆｃ領域に結合する二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されているものが含まれる。このような変異体では、フコシル化が低減及び／又はＡＤＣＣ機能が改善した可能性がある。例えば、国際公開第２００３／０１１８７８号（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔら）；米国特許第６６０２６８４号（Ｕｍａｎａら）、及び米国特許出願公開第２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａら）を参照されたい。Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖中に少なくとも一のガラクトース残基を持つ変異体も提供される。このような抗体変異体は、ＣＤＣ機能を改善した可能性があり、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号（Ｐａｔｅｌら）；同第１９９８／５８９６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及び同第１９９９／２２７６４号（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【0154】
特定の実施態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のシステイン改変変異体、例えば、分子の一又は複数の残基がシステイン残基で置換されている「ｔｈｉｏＭＡｂ」を生成することが望ましい。特定の実施態様では、置換される残基は分子の接近可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することによって、反応性チオール基がそれにより抗体の接近可能部位に配置され、抗体を他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬剤部分にコンジュゲートさせ、免疫コンジュゲートを作るために使用することができる。特定の実施態様では、以下の残基のうちのいずれかの一又は複数がシステインで置換される：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔの番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗原結合分子は、例えば、米国特許第７５２１５４１号に記載のように生成されうる。
【0155】
特定の態様では、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、容易に入手可能な当技術分野で既知の追加的非タンパク質様部分を含むようにさらに修飾することができる。抗体の誘導体化に適した部分は、限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストラン又はポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレン（ｐｒｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）オキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、並びにそれらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のために製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に付着するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが付着する場合、それらは同じか又は異なる分子であってよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定しないが、改善されるべき抗体の特定の特性又は機能、二重特異性抗体誘導体が規定された条件下での治療法に使用されるかどうかなどを含む検討事項に基づいて決定することができる。別の態様では、照射への曝露により選択的に加熱することのできる抗体と非タンパク質様部分のコンジュゲートが提供される。一実施態様では、非タンパク質様部分はカーボンナノチューブである（Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 （2005） 11600-11605）。放射線は、任意の波長であってよく、限定されるものではないが、通常の細胞に害を与えないが抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅する温度に非タンパク質部分を加熱する波長を含む。
【0156】
別の態様では、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のイムノコンジュゲートが得られる。「イムノコンジュゲート」とは、細胞傷害性剤を含むがそれに限定されない、一又は複数の異種分子にコンジュゲートした抗体である。
【0157】
用語「ポリヌクレオチド」は、単離された核酸分子又はコンストラクト、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ウイルス由来のＲＮＡ、又はプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、一般的なホスホジエステル結合又は非一般的結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含みうる。用語「核酸分子」は、ポリヌクレオチド中に存在する、任意の一又は複数の核酸セグメント、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ断片を指す。
【0158】
「単離された」核酸分子又はポリヌクレオチドは、その天然環境から除去された目的の核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡである。例えば、ベクターに含有されるポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを、本発明の目的のために単離することが考慮される。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持される組み換えポリヌクレオチド、又は溶液中の精製された（部分的に又は実質的に）ポリヌクレオチドが含まれる。単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド分子を通常含む細胞に含まれるポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。単離されたＲＮＡ分子は、インビボ又はインビトロの本発明のＲＮＡ転写物、並びにポジティブ及びネガティブな鎖形式、及び二重鎖形式を含む。本発明の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、さらに、合成により生成されたそのような分子を含む。加えて、ポリヌクレオチド又は核酸は、プロモーター、リボソーム結合部位、又は転写ターミネーターといった制御要素を含んでも含まなくてもよい。
【0159】
例えば、本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００のヌクレオチドにつき最大５ポイントの変異を含みうる点以外は同一であることを意図している。換言すれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中最大５％のヌクレオチドが削除又は別のヌクレオチドで置換されてよいか、又は参照配列に含まれるすべてのヌクレオチドの最大５％の数のヌクレオチドが参照配列に挿入されてよい。参照配列のこのような変更は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’末端の又はこれら末端の間の位置いずれかで、参照配列に含まれる残基中において個々に又は参照配列内部の一又は複数の連続する群中において散在して、発生してよい。特定の事項として、いずれか特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるかどうかは、ポリペプチドについて上述したもの（例えばＡＬＩＧＮ−２）などの既知のコンピュータプログラムを用いて常套的に決定することができる。
【0160】
用語「発現カセット」は、組み換えにより又は合成により、標的細胞内の特定の核酸の転写を許可する一連の特定の核酸要素を用いて生成されたポリヌクレオチドを指す。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片中に取り込むことができる。典型的には、発現ベクターの組み換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写される核酸配列及びプロモーターが含まれる。特定の実施態様では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む。
【0161】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、「発現コンストラクト」と同義であり、標的細胞内においてそれが作用可能に結合する特定の遺伝子の発現を導入及び方向付けするために使用されるＤＮＡ分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。本発明の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、大量の安定なｍＲＮＡの転写を可能にする。発現ベクターが標的細胞内部に入ると、遺伝子によってコードされるリボ核酸分子又はタンパク質が、細胞転写及び／又は翻訳機械により生成される。一実施態様では、本発明の発現ベクターは、本発明の二重特異性抗原結合分子をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片を含む発現カセットを含む。
【0162】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は、互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、それには、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一でなくともよく、突然変異を含みうる。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が本含まれる。宿主細胞は、本発明の二重特異性抗原結合分子を生成するために使用することができるいずれかの種類の細胞系である。宿主細胞は、培養細胞、例えば、いくつか例を挙げると、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、又はハイブリドーマ細胞といった哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含み、さらには、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、又は培養された植物若しくは動物組織内部に含まれる細胞も含む。
【0163】
「有効量の」薬剤は、それが投与される細胞又は組織中に生理的変化をもたらすために必要な量を指す。
【0164】
薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」は、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的有効量の薬剤は、疾患の有害作用を、例えば、排除する、低下させる、遅延させる、最小化する、又は防止する。
【0165】
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれる。特に、個体又は対象はヒトである。
【0166】
用語「薬学的組成物」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にする形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【0167】
「薬学的に許容される賦形剤」は、対象に非毒性である、有効成分以外の薬学的組成物の成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、限定しないが、バッファー、安定剤又は保存剤を含む。
【0168】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、適応症、用法、用量、投与、併用療法、そのような治療製品の使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【0169】
本明細書で用いられる場合、「治療）」（及び「治療する」又は「治療すること」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施されうる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様において、本発明の分子は、疾患の発症を遅延させるか、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
【0170】
本明細書で使用される用語「がん」は、リンパ腫、カルシノーマ、芽細胞腫、肉腫、白血病、リンパ性白血病、肺がん、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）がん、気管支平滑筋細胞肺がん、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、膵臓がん、乳がん、三種陰性乳がん、子宮がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟組織の肉腫、尿道がん、陰茎がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓又は尿管のがん、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞がん、胆道がん、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、シュワン腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌、下垂体腺腫及びユーイング肉腫、メラノーマ、多発性骨髄腫、Ｂ細胞がん（リンパ腫）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄芽球性白血病といった増殖性疾患を指し、これには上記がんのいずれかの難治型、又は上記がんの一又は複数の組み合わせも含まれる。
【0171】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子本発明は、生産可能性、安定性、結合親和性、生物活性、標的化効率及び毒性低下といった特に有利な特性を有する新規のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0172】
第１の態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む新規のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする。
【0173】
特定の態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とし、また
（ｃ）安定な結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【0174】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とし、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーはヒトＴ細胞の活性化を共刺激する。
【0175】
別の特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とし、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、すべての場合において同一である。
【0176】
さらなる態様において提供されるのは、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含む、請求項１に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子であり、この抗原結合分子は、
（ｉ）第１のポリペプチドがＣＨ１又はＣＬドメインを、第２のポリペプチドがＣＬ又はＣＨ１ドメインをそれぞれ含み、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合し、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むか、又は
（ｉｉ）第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインをそれぞれ含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に結合するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むか、又は
（ｉｉｉ）第１のポリペプチドがＶＨ−ＣＬ又はＶＬ−ＣＨ１ドメインを、第２のポリペプチドがＶＬ−ＣＨ１ドメイン又はＶＨ−ＣＬドメインをそれぞれ含み、第２のポリペプチドが、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合し、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＶＨ又はＶＬに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドの片ＶＬ又はＶＨに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む
ことを特徴とする。
【0177】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、４−１ＢＢＬ及びＯＸ４０Ｌから選択されるヒトＴ細胞の活性化を共刺激するＴＮＦリガンドファミリーメンバーを含む。さらに具体的には、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーは４−１ＢＢＬである。
【0178】
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号９６、配列番号３７３、配列番号３７４及び配列番号３７５からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号９６のアミノ酸配列を含む。一態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号９６からなる群より選択されるアミノ酸配列、特に配列番号１又は配列番号９６のアミノ酸配列を含む。特定の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。
【0179】
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。特定の態様では、第１のポリペプチドは配列番号９７のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドは配列番号９６アミノ酸配列を含む。
【0180】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが配列番号６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0181】
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号５のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが配列番号１８３のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0182】
またさらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが配列番号１８４又は配列番号１８５のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0183】
別の態様では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーはＯＸ４０Ｌである。特定の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメインは、配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列、特に配列番号５３のアミノ酸配列を含む。
【0184】
一態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号３７１又は配列番号３７２のアミノ酸配列を、第２のポリペプチドが配列番号５３又は配列番号５４のアミノ酸配列を、それぞれ含むことを特徴とする。
【0185】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分，
（ｂ）ＣＨ１又はＣＬドメインを含む第１のポリペプチド及びＣＬ又はＣＨ１ドメインを含む第２のポリペプチド
を含み、第２のポリペプチドはＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合しており、
この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１又はＣＬドメインに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＬ又はＣＨ１ドメインに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする。
【0186】
一態様において提供される、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、
（ｂ）ＣＨ１ドメインを含む第１のポリペプチド及びＣＬドメインを含む第２のポリペプチド
を含み、第２のポリペプチドがＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合している
ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ１ドメインに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＬドメインに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
【0187】
別の態様において提供される、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、
（ｂ）ＣＬドメインを含む第１のポリペプチド及びＣＨ１ドメインを含む第２のポリペプチド
を含み、第２のポリペプチドがＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間におけるジスルフィド結合により第１のポリペプチドに結合している
ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＬドメインに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ１ドメインに接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
【0188】
別の態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする。
【0189】
また別の態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する一を超える部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドにペプチドリンカーを介して接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする。
【0190】
一態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とする。
【0191】
特定の態様において提供される、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインをそれぞれ含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。特に、このようなＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分を含む。
【0192】
一態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチドを含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含み、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分が二つの異なる細胞抗原に結合することを特徴とする。
【0193】
さらなる態様では、本発明は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分が、抗体、抗体断片及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0194】
一態様において提供される上記に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、抗体断片、Ｆａｂ分子、クロスオーバーＦａｂ分子、単鎖Ｆａｂ分子、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、単一ドメイン抗体、ａＶＨ及び足場抗原結合タンパク質からなる群より選択される。一態様では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分はＶＨ又は足場抗原結合タンパク質である。一態様では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する足場抗原結合タンパク質である。
【0195】
特に、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する一つ又は二つの部分を含む。
【0196】
特定の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分が、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子又はクロスオーバーＦａｂ分子である。特に、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂである。
【0197】
さらに、提供される本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される。
【0198】
さらなる態様において提供される本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むペプチドが、そのＣ末端において、第２のペプチドリンカーにより重鎖のＣＨ１ドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片が、そのＣ末端において、第３のペプチドリンカーにより軽鎖上のＣＬドメインに融合している。
【0199】
別の態様において提供される本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むペプチドが、そのＣ末端において、第２のペプチドリンカーにより重鎖のＣＬドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片が、そのＣ末端において、第３のペプチドリンカーにより軽鎖上のＣＨ１ドメインに融合している。
【0200】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含むペプチドは、そのＣ末端において、第２のペプチドリンカーにより軽鎖のＣＬドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片は、そのＣ末端において、第３のペプチドリンカーにより重鎖のＣＨ１ドメインに融合している。
【0201】
特定の態様では、本発明は、ペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２である、上記に定義されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。一態様では、第１のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１３）であり、第２のペプチドリンカーはＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ（配列番号５７）であり、第３のペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１３）である。特に、本発明は、第１のペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１３）であり、第２のペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１３）であり、第３のペプチドリンカーが（Ｇ４Ｓ）２（配列番号１３）である、上記に定義されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0202】
別の態様では、本明細書に定義されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【0203】
特に、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子であって、Ｆａｂ重鎖がＣ末端においてＦｃドメイン内のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合するＦａｂ分子と、（ｃ）安定した結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインとを含む。
【0204】
さらなる態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ、特にＩｇＧ１ Ｆｃドメイン又はＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。さらに具体的には、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。
【0205】
Ｆｃ受容体の結合及び／又はエフェクター機能を低減するＦｃドメインの修飾本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは二量体であり、その各サブユニットはＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの二つのサブユニットは、互いに安定に結合することができる。
【0206】
Ｆｃドメインは、本発明の抗原結合分子に好ましい薬物動態特性を付与し、そのような特性には、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期、及び好ましい組織−血液分布比が含まれる。しかしながらそれは同時に、本発明の二重特異性抗体の好ましくないターゲティング、即ち、好ましい抗原保持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞へのターゲティングに繋がる。したがって、特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、天然ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較した場合に、Ｆｃ受容体への結合親和性の低下及び／又はエフェクター機能の低下を呈する。一態様では、ＦｃはＦｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。特定の態様では、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。特定の一態様では、Ｆｃ受容体は活性化ヒトＦｃγ受容体であり、具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、さらに具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様では、Ｆｃドメインはエフェクター機能を誘導しない。エフェクター機能の低下は、限定しないが、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性Ｔ細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞に対する結合の低減、マクロファージに対する結合の低減、単球に対する結合の低減、多形核細胞に対する結合の低減、アポトーシスを誘導する直接的シグナル伝達の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの一又は複数を含むことができる。
【0207】
特定の態様では、一又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃ領域に導入し、それによりＦｃ領域変異体を生成することができる。Ｆｃ領域変異体は、一又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域）を含みうる。
【0208】
特定の態様では、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチドを含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とし、また
（ｃ）Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低減する一又は複数のアミノ酸置換を含む、安定な結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。
【0209】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低下させる一又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、同じ一又は複数のアミノ酸変異がＦｃドメインの二つのサブユニットの各々に存在する。特に、このＦｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＥＵ番号付け）の位置にアミノ酸置換を含む。特に、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ重鎖の２３４位及び２３５位（ＥＵ番号付け）及び／又は３２９位（ＥＵ番号付け）にアミノ酸置換を含む。具体的には、本発明により提供される三量体ＴＮＦファミリーリガンド含有抗原結合分子は、ＩｇＧ重鎖内にアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、ＥＵ番号付け）を有するＦｃドメインを含む。アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５ＡはいわゆるＬＡＬＡ変異を指す。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体結合をほぼ完全に消失させるもので、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載があり、この文献には、このような変異Ｆｃドメインを調製する方法、及びＦｃ受容体結合又はエフェクター機能といったその特性を決定する方法も記載されている。「ＥＵ番号付け」は、Kabat et al , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991のＥＵによる番号付けを指す。
【0210】
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減したＦｃドメインは、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの一又は複数の置換を有するものも含む（米国特許第６７３７０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ突然変異体を含めた、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７のうちの二以上において置換を有するＦｃ突然変異体を含む（米国特許第７３３２５８１号）。
【0211】
別の態様では、ＦｃドメインはＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を呈する。さらに特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｓ２２８（Ｋａｂａｔ番号付け）の位置にアミノ酸置換を、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。さらに具体的な態様では、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３５Ｅ及びＳ２２８Ｐ及びＰ３２９Ｇ（ＥＵ番号付け）を含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメインの突然変異及びそのＦｃγ受容体結合特性も、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
【0212】
変異Ｆｃドメインは、当技術分野で周知の遺伝学的又は化学的方法を用いたアミノ酸の削除、置換、挿入、又は修飾により調製することができる。遺伝学的方法は、コード化ＤＮＡ配列の部位特異的突然変異、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正確なヌクレオチドの変化は、例えば配列決定により検証することができる。
【0213】
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡにより、又はＢＩＡｃｏｒｅ器具（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準の器具類を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定することができ、このようなＦｃ受容体は組み換え発現により得ることができる。このような適切な結合アッセイは本明細書に記載される。代替的に、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む細胞活性化二重特異性抗原結合分子のＦｃ受容体に対する結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を用いて評価してもよい。
【0214】
Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む本発明の二重特異性抗体のエフェクター機能は、当技術分野で既知の方法により測定することができる。ＡＤＣＣを測定するための適切なアッセイは本明細書に記載される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例が、米国特許第５５００３６２号；Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 （1986） and Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 （1985）；米国特許第５８２１３３７号；Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 （1987）に記載されている。或いは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩＴＭ非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ． Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）；及びＣｙｔｏＴｏ×９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。或いは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 （1998）に開示されるように、例えば動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【0215】
いくつかの実施態様では、補体成分に対するＦｃドメインの結合、特にＣ１ｑに対する結合が低減する。したがって、エフェクター機能が低下するようにＦｃドメインが改変されているいくつかの実施態様では、前記エフェクター機能の低下はＣＤＣの低下を含む。本発明の二重特異性抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために、Ｃ１ｑ結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 （1996）; Cragg, et al., Blood 101:1045-1052 （2003）;及びCragg, and Glennie, Blood 103:2738-2743 （2004）を参照）。
【0216】
特定の態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促進する修飾を含む。
【0217】
ヘテロ二量体化を促すＦｃドメインの修飾一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチドを含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチが、ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むこと、及び第２のポリペプチドが前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を一つだけ含むことを特徴とし、また（ｃ）Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低減する一又は複数のアミノ酸置換を含む、安定な結合が可能な第１及び第２のサブユニットからなるＦｃドメインを含む。したがって、このような抗原結合分子は、典型的には二つの非同一のポリペプチド鎖（「重鎖」）に含まれるＦｃドメインの二つのサブユニットの一方又は他方に融合する異なる半分を含む。これらポリペプチドの組み換え同時発現とそれに続く二量体化は、二つのポリペプチドの複数の可能な組み合わせをもたらす。したがって、組み換え生成におけるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の収率及び純度を改善するために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの結合を促す修飾を導入することが有利であろう。
【0218】
したがって、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促す修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの二つのサブユニット間においてタンパク質−タンパク質相互作用が最大である部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、前記修飾は特にＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内で行われる。
【0219】
特定の一態様では、前記修飾はいわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの一方に「ノブ」修飾を、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの他方に「ホール」修飾を、それぞれ含んでいる。したがって、特定の態様では、本発明は、ＩｇＧ分子を含む上記に記載されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関し、この場合、第１の重鎖のＦｃ部分が第１の二量体化モジュールを含み、第２の重鎖のＦｃ部分が第２の二量体化モジュールを含んでＩｇＧ分子の二つの重鎖のヘテロ二量体化を可能にしており、ノブ・イントゥ・ホール技術に従って、第１の二量体化モジュールがノブを含み、第２の二量体化モジュールがホールを含む。
【0220】
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５７３１１６８号；同第７６９５９３６号；Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 （1996） and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 （2001）に記載されている。通常、方法は、隆起がそれに対応する空洞内に位置できるように、第１のポリペプチドの接触面に隆起（「ノブ」）を、及び第２のポリペプチドの接触面に対応する空洞を、それぞれ導入することにより、ヘテロ二量体形成を促進し、且つホモ二量体形成を妨害することを伴う。隆起は、第１のポリペプチドの接触面由来の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることにより構築される。隆起と同じか又は同様のサイズの相補的空洞は、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置き換えることにより、第２のポリペプチドの接触面に作り出される。
【0221】
このように、特定の一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基がそれよりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の空洞内に配置可能な隆起が生成され、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内において、アミノ酸残基がそれよりも小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それにより、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内部の隆起を配置可能な空洞が生成される。
【0222】
隆起と空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を、例えば部位特異的突然変異誘発により、又はペプチド合成により、変化させることにより作り出すことができる。
【0223】
特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基で置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）。具体的には、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３６６位のスレオニン残基がセリン残基で置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）。さらに具体的には、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいてさらに、３５４位のセリン残基がシステイン残基で置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいてさらに、３４９位のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）。これら二つのシステイン残基の導入により、Ｆｃドメインの二つのサブユニットの間にジスルフィド架橋が形成される。このジスルフィド架橋は二量体をさらに安定させる（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 （2001））。
【0224】
代替的な一態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの結合を促す修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されているような静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、ホモ二量体形成が静電的に望ましくなくなり、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるような、荷電アミノ酸残基による二つのＦｃドメインサブユニットの接触面における一又は複数のアミノ酸残基の置き換えを伴う。
【0225】
ＣＨ１／ＣＬドメインの修飾正確な対合をさらに向上させるために、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、異なる荷電アミノ酸置換（いわゆる「荷電残基」）を含むことができる。これら修飾は、交差又は非交差のＣＨ１及びＣＬドメインに導入される。特定の態様では、本発明は、ＣＬドメインの一つにおいて１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のがリジン（Ｋ）によって置換されており、かつＣＨ１ドメインの一つにおいて１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0226】
具体的には、本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており、かつＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0227】
特定のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子別の態様では、本発明は、
共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
Ｃ末端で第２のペプチドリンカーにより第２の重鎖又は軽鎖に融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第１のペプチド、及び
Ｃ末端で第３のペプチドリンカーにより第２の軽鎖又は重鎖に融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメインを含む第２のペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0228】
さらなる態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＬドメインに融合している。
【0229】
また別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＣＬドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端において、第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＣＨ１ドメインに融合している。
【0230】
さらなる態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第１のペプチドが、そのＣ末端で第２のペプチドリンカーにより重鎖の一部であるＶＨドメインに融合しており、前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２のペプチドが、そのＣ末端で第３のペプチドリンカーにより軽鎖の一部であるＶＬドメインに融合している。
【0231】
一態様では、本発明は、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＬドメインにおいて、１２３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置き換えられており、１２４位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており、かつＴＮＦリガンドファミリーメンバーに隣接するＣＨ１ドメインにおいて、１４７位（ＥＵ番号付け）及び２１３位（ＥＵ番号付け）のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されている、請求項２１から２３のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。これら修飾は、例えば誤対合のような望ましくない影響を回避する有利な特性を有するいわゆる家電残基をもたらす。
【0232】
さらに、提供される本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸塩プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３３からなる群より選択される。
【0233】
標的細胞抗原がＦＡＰであるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子特定の態様では、標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）であるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【0234】
一態様では、本発明は、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分が、（ｉ）配列番号７又は配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９又は配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１又は配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0235】
特定の態様において提供される本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、ＦＡＰに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子であり、（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0236】
別の態様において提供される本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、ＦＡＰに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子であり、（ｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0237】
さらなる態様では、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0238】
別の態様では、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0239】
一態様では、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号１６のアミノ酸配列含む可変重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖、又は配列番号１０６のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【0240】
特定の態様では、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の態様では、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の態様では、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号１０６のアミノ酸配列からなるＶＨドメイン及び配列番号１０７のアミノ酸配列からなるＶＬドメインを含む。
【0241】
さらなる態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0242】
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが配列番号９６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0243】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0244】
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが配列番号９６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0245】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む第１の重鎖及び第１の軽鎖、
そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによりＣＨ１ドメインに融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の重鎖、及びそのＣ末端において第３のペプチドリンカーによりＣＬドメインに融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の軽鎖
を含み、かつ
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0246】
さらに特定の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む第１の重鎖及び第１の軽鎖、
そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによりＣＬドメインに融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の重鎖、及びそのＣ末端において第３のペプチドリンカーによりＣＨ１ドメインに融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の軽鎖
を含み、かつ
（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0247】
具体的には、提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む第１の重鎖及び第１の軽鎖であって、第１の重鎖が配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含み、第１の軽鎖が配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、並びに
（ｂ）そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによりＣＬドメインに融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続する、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の重鎖、及びそのＣ末端において第３のペプチドリンカーによりＣＨ１ドメインに融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の軽鎖であって、第２の重鎖が配列番号１１９又は配列番号１７３のアミノ酸配列を含み、第２の軽鎖が配列番号１２０又は配列番号１７４のアミノ酸配列を含む、第２の重鎖及び第２の軽鎖
を含む。特に、第２の重鎖は配列番号１１９のアミノ酸配列を含み、第２の軽鎖は配列番号１２０のアミノ酸配列を含む。
【0248】
さらに、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインをそれぞれ含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
【0249】
特定の態様では、このようなＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分を含む。
【0250】
具体的には、このようなＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２５のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２５のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖
を含む。
【0251】
さらなる態様では、本発明は、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１５のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１３６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１０９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１３９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１４０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号１９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号１２１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１２２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｆ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１０８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｇ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｈ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１４９のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１１のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１２のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；並びに
ｊ）配列番号１８のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子
からなる群より選択される、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0252】
別の態様では、本発明は、ａ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号１２３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１２４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号１２６のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号１２７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0253】
特に、本発明は、配列番号１６４のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１２５のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0254】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーがＯＸ４０Ｌであり、標的細胞抗原が線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）であり、ＦＡＰに対する特異的結合能を有する部分が、（ｉ）配列番号７又は配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号８又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９又は配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１０又は配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１１又は配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号１２又は配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0255】
特定の態様では、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＨドメインを含む第１の重鎖、配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号３５５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び
（ｉｉｉ）配列番号３５６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0256】
標的細胞抗原がＣＤ１９であるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子特定の態様では、標的細胞抗原がＣＤ１９であるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【0257】
一態様では、本発明は、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分が、（ｉ）配列番号１９５又は配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９６又は配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９７又は配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１９８又は配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９９又は配列番号２５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２００又は配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0258】
特定の態様において提供される本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子であり、（ｉ）配列番号１９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0259】
さらなる態様において提供される本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子であり、（ｉ）配列番号２５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号２５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号２５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号２４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号２５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号２５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0260】
別の態様では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分は、配列番号２０１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号２０２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0261】
さらなる態様では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分は、配列番号３５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0262】
一態様では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含むか、又はＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【0263】
特定の態様では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分は、配列番号２０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の特定の態様では、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【0264】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0265】
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが配列番号９６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0266】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0267】
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが配列番号９６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0268】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む第１の重鎖及び第１の軽鎖、
そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによりＣＨ１ドメインに融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の重鎖、及びそのＣ末端において第３のペプチドリンカーによりＣＬドメインに融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の軽鎖
を含み、かつ
（ｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0269】
さらに特定の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む第１の重鎖及び第１の軽鎖、
そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによりＣＬドメインに融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の重鎖、及びそのＣ末端において第３のペプチドリンカーによりＣＨ１ドメインに融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の軽鎖
を含み、かつ
（ｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、又は
配列番号３５７のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３５８のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0270】
さらに、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインをそれぞれ含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
【0271】
特定の態様では、このようなＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分を含む。
【0272】
具体的には、このようなＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉｉ）配列番号３０９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３１０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２７９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｖ）配列番号３１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号２７９のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖
を含む。
【0273】
さらなる態様では、本発明は、ａ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0274】
特に、本発明は、配列番号２０５のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号２０６のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0275】
別の態様では、本発明は、ａ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３５８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号２０９のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３５８のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号２１３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号２１４のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0276】
特に、本発明は、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0277】
標的細胞抗原がＣＥＡであるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子特定の態様では、標的細胞抗原がＣＥＡであるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【0278】
一態様では、本発明は、ＣＤ１９に対する特異的結合能を有する部分が、（ｉ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0279】
特定の態様において提供される本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分は、ＣＥＡに対する特異的結合能を有するＦａｂ分子であり、（ｉ）配列番号３２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号３２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、（ｉｖ）配列番号３２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｖ）配列番号３２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び（ｖｉ）配列番号３２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含む。
【0280】
さらなる態様では、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号３２７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３２８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0281】
一態様では、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【0282】
さらなる態様では、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号３２９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号３３０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。
【0283】
一態様では、ＣＥＡに対する特異的結合能を有する部分は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む可変重鎖及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む可変軽鎖を含む。
【0284】
別の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが、配列番号５、配列番号９７、配列番号９８及び配列番号９９からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むこと、及び第２のポリペプチドが、配列番号１、配列番号９６、配列番号３及び配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0285】
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ａ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含み、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドが配列番号９７のアミノ酸配列を含み、第２のポリペプチドが配列番号９６のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。
【0286】
別の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによりＣＨ１ドメインに融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の重鎖、及びそのＣ末端において第３のペプチドリンカーによりＣＬドメインに融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の軽鎖
を含み、かつ
（ｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１４、配列番号１０８、配列番号１１１及び配列番号１１３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１５、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１２及び配列番号１１４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0287】
さらなる特定の態様において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、共に標的細胞抗原に対する特異的結合能を有するＦａｂ分子を含む、第１の重鎖及び第１の軽鎖、
そのＣ末端において第２のペプチドリンカーによりＣＬドメインに融合した第１のペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の重鎖、及びそのＣ末端において第３のペプチドリンカーによりＣＨ１ドメインに融合した前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含む第２の軽鎖
を含み、かつ
（ｉ）配列番号３２９のアミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む第１の重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む第１の軽鎖、
（ｉｉ）配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９及び配列番号１７３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖、並びに
（ｉｉｉ）配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、及び配列番号１７４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む第２の軽鎖
を含む。
【0288】
さらに、本発明は、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、及び
（ｂ）ジスルフィド結合により互いに結合する第１及び第２のポリペプチド
を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供し、この抗原結合分子は、第１のポリペプチドがＣＨ３ドメインを、第２のポリペプチドがＣＨ３ドメインをそれぞれ含み、第１のポリペプチドが、ペプチドリンカーにより互いに及びＣＨ３ドメインのＣ末端に接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含み、第２のポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記ポリペプチドのＣＨ３ドメインのＣ末端に接続する前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むことを特徴とする。
【0289】
特定の態様では、このようなＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する二つの部分を含む。
【0290】
具体的には、このようなＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、（ｉ）配列番号３３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、又は
（ｉｉ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３４２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖
を含む。
【0291】
さらなる態様では、本発明は、ａ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１５のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１６のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｂ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１７のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１１８のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｃ）配列番号３３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号３３７のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３３８のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子；
ｄ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｅ）配列番号３３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１７３のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１７４のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含む分子；
ｆ）配列番号３３４のアミノ酸配列を含む二つの軽鎖、配列番号３４１のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、及び配列番号３４２のアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む分子
からなる群より選択される、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に関する。
【0292】
特に、本発明は、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号３３４のアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号１１９のアミノ酸配列を含む第２の重鎖、及び配列番号１２０のアミノ酸配列を含む第２の軽鎖を含むＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。
【0293】
ポリヌクレオチド本発明はさらに、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチド又はその断片を提供する。
【0294】
本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドは、抗原結合分子全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数の（例えば、二つ以上の）ポリヌクレオチドとして、発現されうる。共発現されるポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドは、例えばジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能的抗原結合分子を形成することができる。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分とは別個のポリヌクレオチドによりコードされる。共発現されると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと結合して免疫グロブリンを形成する。
【0295】
いくつかの態様では、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子全体をコードする。特に、単離されたポリヌクレオチドは、本明細書に記載される本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子に含まれるポリペプチドをコードする。
【0296】
一態様では、本発明は、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドを目的とし、このポリヌクレオチドは、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続するＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）前記ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの一つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【0297】
別の態様において提供されるのは、４−１ＢＢリガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続する４−１ＢＢＬの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）４−１ＢＢＬの一つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【0298】
さらなる態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号９６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む二つの４−１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドと、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４又は配列番号９６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む一つの４−１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドとを目的とする。
【0299】
さらに、提供されるのは、ＯＸ４０リガンド三量体含有抗原結合分子をコードする単離されたポリヌクレオチドであり、このポリヌクレオチドは、（ａ）標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分をコードする配列、（ｂ）ペプチドリンカーにより互いに接続するＯＸ４０Ｌの二つのエクトドメイン又はその二つの断片を含むポリペプチドをコードする配列、及び（ｃ）ＯＸ４０Ｌの一つのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む。
【0300】
別の態様では、本発明は、配列番号５３又は配列番号５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む二つの４−１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドと、配列番号５３又は配列番号５４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む一つの４−１ＢＢＬ断片を含むポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドとを目的とする。
【0301】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に開示される特定のｃＤＮＡ配列と少なくとも約９０％、９５％、９８％又は１００％同一である配列を含むポリペプチドに関する。特定の態様では、本発明は、本明細書に開示される特定のｃＤＮＡ配列の一つと同一である配列を含むポリヌクレオチドに関する。
【0302】
他の態様では、核酸分子は、配列番号５、６、９７、９８、９９、１８３、１８４又は１８５のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、又は同ヌクレオチド配列からなる。さらなる態様では、核酸分子は、配列番号１４、１５、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５，１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１７３又は１７４のいずれか一つに規定されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、又は同ヌクレオチド配列からなる。
【0303】
さらに他の態様では、核酸分子は、配列番号６６、６７、６８、６９、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３７、１３８、１４１、１４２、１４３、１４４、１４６、１４７、１５０、１５１、１５２、１５３、１６２、１６３、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７５、１７６、１７７、１７８、２０３、２０４、２０７、２０８、２１１、２１２、２１５、２１６、２７３、２７４、２７７、２７８、２８１、２８２、２８５、２８６、２８９、２９０、２９３、２９４、２９７、２９８、３０１、３０２、３０５、３０７、３０８、３１１、３１２、３１５、３１６、３３１、３３２、３３５、３３６、３３９、３４０、３４３、３４４、３４７、３４８、３５３又は３５４からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含むか、又は同ヌクレオチド配列からなる。
【0304】
特定の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の実施態様では、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の、ＲＮＡである。本発明のＲＮＡは一本鎖又は二本鎖である。
【0305】
組み換え法本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、例えば、固体状態のペプチド合成（例えばメリフィールド固体相合成）又は組み換え生成により得られる。組み換え生成のために、例えば上述したように、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内でのさらなるクローニング及び／又は発現のために、一又は複数のベクター中に挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。本発明の一態様では、本発明のポリヌクレオチドの一又は複数を含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子（断片）のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボでの組み換え／遺伝子組み換えを含む。例えば、Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. （1989）; and Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. （1989）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミドの一部、ウイルスとすることができるか、又は核酸断片でよい。発現ベクターは、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片（即ち、コード領域）をコードするポリヌクレオチドが、プロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御エレメントと作動可能に結合するようにクローニングされる発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「終止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合にはコード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクト内に、例えば別の（異なる）ベクター上に存在することができる。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、二つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質中に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片、又はその変異体若しくは誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合又は非融合された異種コード領域をコードしうる。異種コード領域は、限定しないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、ポリペプチドなどの遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下において遺伝子産物の発現を配置するように、一又は複数の制御配列と結合するときである。（ポリペプチドコード領域及びそれに結合するプロモーターのような）二つのＤＮＡ断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、及び二つのＤＮＡ断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきＤＮＡ鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことがでればポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合されるといえる。プロモーターは所定の細胞においてのみＤＮＡの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーター以外に、他の転写制御エレメント、例えばエンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと作動可能に結合することができる。
【0306】
適切なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えばイントロン−Ａと連動した即初期プロモーター）、サルウイルス４０（例えば初期プロモーター）、及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルスなど）が含まれる。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギα−グロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を制御することのできる他の配列に由来するものを含む。さらなる適切な転写制御領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター（例えば、プロモーター誘導性テトラサイクリン）を含む。同様に、種々の翻訳制御エレメントが当業者に知られている。これらには、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終結コドン、及びウイルス系由来の要素（特に、配列内リボソーム進入部位、又はＣＩＴＥ配列とも呼ばれるＩＲＥＳ）が含まれる。発現カセットはまた、例えば、複製起点、及び／又はレトロウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の末端反転型配列（ＩＴＲ）などの染色体組み込み要素といった他の特徴を含んでもよい。
【0307】
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指示する分泌ペプチド又はシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合させることができる。例えば、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするＤＮＡが、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードする核酸の上流に配置される。シグナル仮説によると、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは粗面小胞体上で成長するタンパク質鎖の排出が開始されると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが通常、ポリペプチドの分泌型又は「成熟」型を生成するように翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有することを認識している。特定の実施態様では、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。或いは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
【0308】
その後の精製（例えばヒスチジンタグ）を促進する又は融合タンパク質の標識化を助けるために使用されうる短いタンパク質配列をコードするＤＮＡを、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドの内部又は端部に含めてもよい。
【0309】
本発明のさらなる態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含む宿主細胞が提供される。特定の実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独で又は組み合わせて組み込むことができる。一態様では、宿主細胞は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子（の一部）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む（例えばそのようなベクターで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう改変できるいずれかの種類の細胞系を指す。抗原結合分子の複製及び発現の補助に適切な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は特定の発現ベクターで適切にトランスフェクト又は形質導入することができ、大量のベクター含有細胞を、臨床利用のための十分な量の抗原結合分子を得るために、大規模発酵槽での播種用に増殖させることができる。適切な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要でない場合には、ポリペプチドは細菌中で生成することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され、さらに精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、菌類や酵母菌株を含む、ポリペプチドコード化ベクターの適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、そのグリコシル化経路は「ヒト化」されており、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 （2004）,及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 （2006）を参照。
【0310】
（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物と脊椎動物）から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物及び昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定されており、これらは特にスポドプテラ・フルギペルダ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（トランスジェニック植物における抗体生成に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。脊椎動物細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合されている哺乳動物細胞株は有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７）で形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 （1977）に記載された２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスのセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 （1980）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６）、ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）、マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）、（例えばMather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 （1982）に記載される）ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 （1980））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；及びＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞系の総説については、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 （B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ）, pp. 255-268 （2003）を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えばいくつか挙げると、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、並びにトランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内部に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。これらの系において外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された生成物が重鎖及び軽鎖の両方を有する免疫グロブリンであるように、免疫グロブリン鎖の他方を発現するように改変することができる。
【0311】
一態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の生成方法が提供され、この方法は、本明細書に記載のように、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片の発現に適した条件下において、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子又はそのポリペプチド断片を宿主細胞（又は宿主細胞培地）から回収することを含む。
【0312】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子では、その成分（標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する少なくとも一つの部分、ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片を含む一つのポリペプチド、及び前記ＴＮＦファミリーリガンドファミリーメンバーのエクトドメイン又はその断片を含むポリペプチド）は遺伝的に互いに融合していない。ポリペプチドは、その成分（ＴＮＦリガンドファミリーメンバーの二つのエクトドメイン又はその断片、及びＣＨ又はＣＬといった他の成分）が直接又はリンカー配列を通して互いに融合するように設計される。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験することができる。本発明の抗原結合分子の異なる成分間のリンカー配列の例は、本明細書に提供される配列に見られる。必要に応じて、融合タンパク質の個々の成分を分離するための切断部位を取り込むために、追加的配列、例えばエンドペプチダーゼ認識配列も含めることができる。
【0313】
特定の実施態様では、抗原結合分子の一部を形成する標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分（例えばＦａｂ断片）は、少なくとも、抗原に対する結合能を有する免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域は、天然に又は非天然に存在する抗体及びその断片の一部を形成することができ、且つそのような抗体及び断片から誘導することができる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Harlow and Lane, 「Antibodies, a laboratory manual」, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。非天然に存在する抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組み換え的に生成されるか（例えば米国特許第４１８６５６７号に記載のように）、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含むコンビナトリアルライブラリのスクリーニング（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙの米国特許第５９６９１０８号を参照）によって得ることができる。
【0314】
本発明では、任意の動物種の免疫グロブリンを使用することができる。本発明において有用な非限定的免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものでありうる。融合タンパク質がヒトでの使用を意図する場合、定常領域がヒトに由来する免疫グロブリンのキメラ形態を使用することができる。ヒト化又は完全ヒト形態の免疫グロブリンも、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる（例えばＷｉｎｔｅｒの米国特許第５５６５３３２号を参照）。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、それら方法には、限定されないが、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）のＣＤＲを、重要なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を維持するために重要であるもの）の保持を伴う又は伴わないヒト（例えば、レシピエント抗体）のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ−ＣＤＲ；抗体−抗原相互作用に重要な残基）のみをヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様切片で「覆い隠す」ことが含まれる。ヒト化抗体及びその製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 （2008）に総説があり、さらには、例えばRiechmann et al., Nature 332, 323-329 （1988）; Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 （1989）；米国特許第５８２１３３７号、同第７５２７７９１号、同第６９８２３２１号、及び同第７０８７４０９号；Jones et al., Nature 321, 522-525 （1986）; Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 （1984）; Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 （1988）; Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 （1988）; Padlan, Molec Immun 31（3）, 169-217 （1994）; Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 （2005） （ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）グラフティングについて記載）; Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 （1991）（「リサーフェイシング」について記載）；Dall’Acqua et al., Methods 36, 43-60 （2005）（「ＦＲシャフリング」について記載）；及びOsbourn et al., Methods 36, 61-68 （2005） and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 （2000）（「ＦＲシャフリングに対するガイド選択」を記載）に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンはヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野において既知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 （2001） 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 （2008）に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、且つそのような抗体から誘導することができる（例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 （Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を生成するように修飾されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる（例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 （2005）を参照）。ヒト抗体及びヒト可変領域は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変領域配列を単離することによっても生成することができる（例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 （O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001）;及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 （1991）参照）。ファージは、通常、抗体断片を、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片、又はＦａｂ断片として表示する。
【0315】
特定の態様では、本発明の抗原結合分子に含まれる標的細胞抗原に対する特異的結合能を有する部分（例えばＦａｂ断片）は、国際公開第２０１２／０２０００６号（親和性成熟に関する実施例参照）又は米国特許出願公開第２００４／０１３２０６６号に記載される方法に従って、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明の抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術（Liljeblad,et al.,Glyco.J.17:323-329（2000））及び古典的な結合アッセイ（Heeley,R.P.,Endocr.Res.28:217-229（2002））によって測定することができる。特定の抗原に対する結合について参照抗体と競合する抗原結合分子を同定するために、競合アッセイを使用してもよい。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、参照抗原結合分子により結合される同じエピトープ（例えば直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗原結合分子が結合するエピトープをマッピングするための典型的な方法の詳細が、Morris （1996）“Epitope Mapping Protocols”, in Methods in Molecular Biology vol. 66 （Humana Press, Totowa, NJ）に提供されている。例示的競合アッセイでは、固定化された抗原を、抗原に結合する第１の標識抗原結合分子と、抗原に対する結合について第１の抗原結合分子と競合する能力について試験される第２の非標識抗原結合分子とを含む溶液中においてインキュベートする。第２の抗原結合分子は、ハイブリドーマ上清に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原を、第１の標識抗原結合分子を含むが第２の非標識抗原結合分子は含まない溶液中でインキュベートする。第１の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、余分な未結合抗体を除去し、固定化された抗原に結合した標識の量を測定する。固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第２の抗原結合分子が、抗原への結合について第１の抗原結合分子と競合していることを示している。Harlow and Lane （1988） Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 （Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY）を参照。
【0316】
本明細書に記載のようにして調製される本発明のＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子は、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどによって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性などの要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、ＴＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインＡ又はＧアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、基本的に実施例に記載のようにして抗原結合分子を単離するために使用されうる。ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子又はその断片の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々な周知の分析方法のいずれかによって決定されうる。例えば、実施例に記載のようにして発現されるＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子は、還元及び非還元型ＳＤＳーＰＡＧＥにより実証されるように、インタクトであり、適切に構築されることが示された。
【0317】
アッセイ本明細書で提供される抗原結合分子が、同定され、当技術分野で既知の様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び／又は生物学的活性についてスクリーニングされる、又は特徴付けられる。
【0318】
１．アフィニティーアッセイ対応するＴＮＦ受容体に対する、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の親和性を、実施例に規定される方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、組み換え発現により得られるもののような受容体又は標的タンパク質とを用いて、プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）により決定することができる。また、標的細胞抗原に対するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような標準的器具類と、受容体又は組み換え発現により得られるもののような標的タンパク質とを用いるプラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定することができる。結合親和性を測定するための例示的及び代表的実施態様を、実施例４において説明する。一態様によれば、ＫＤは、２５℃でＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｔ１００マシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる表面プラズモン共鳴により測定される。
【0319】
２．結合アッセイとその他のアッセイ本明細書において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の、対応する受容体発現細胞に対する結合は、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を用いて、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価することができる。一態様では、ＴＮＦ受容体を発現する新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が結合アッセイに使用される。これら細胞は、単離後直接（ナイーブＰＭＢＣ）又は刺激後（活性化ＰＭＢＣ）に使用される。別の態様では、活性化マウス脾細胞（ＴＮＦ受容体分子を発現する）を使用して、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の、対応するＴＮＦ受容体発現細胞に対する結合を実証した。
【0320】
さらなる態様では、標的細胞抗原、例えばＦＡＰを発現するがん細胞株を使用して、抗原結合分子の標的細胞抗原に対する結合を実証した。
【0321】
別の態様では、それぞれ標的又はＴＮＦ受容体に対する結合について特定の抗体又は抗原結合分子と競合する抗原結合分子を同定するために、競合アッセイを用いる。特定の実施態様では、このような競合抗原結合分子は、特定の抗標的抗体又は特定の抗ＴＮＦ受容体抗体により結合される同じエピトープ（例えば、直鎖状又は立体構造エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための代表的な方法が、Morris （1996）“Epitope Mapping Protocols,” in Methods in Molecular Biology vol. 66 （Humana Press, Totowa, NJ）に詳細に示されている。
【0322】
３．活性のアッセイ一態様では、特定の標的細胞抗原及び生物活性を有する特定のＴＮＦ受容体に結合するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を同定するためのアッセイが提供される。生物活性には、例えば、標的細胞抗原を発現する細胞上のＴＮＦ受容体を通したアゴニスティックなシグナル伝達が含まれる。そのような生物活性をインビトロで有するとしてアッセイにより同定されたＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も提供される。
【0323】
特定の態様では、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子がそのような生物活性について試験される。本発明の分子の生物活性を検出するためのアッセイは、実施例６に記載されるものである。さらに、細胞溶解（例えばＬＤＨ放出の測定値により）、誘導されたアポトーシスの動態（例えばカスパーゼ３／７活性の測定値により）、又はアポトーシス（例えばＴＵＮＥＬアッセイを用いて）を検出するためのアッセイは、当技術分野において周知である。加えて、このような複合体の生物活性は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞又はγδＴ細胞などの様々なリンパ球サブセットの生存、増殖、及びリンホカイン分泌に対する複合体の影響を査定すること、又は複合体の、樹状細胞、単球／マクロファージ又はＢ細胞といった抗原提示細胞の表現型及び機能を調節する能力を評価することにより、評価することができる。
【0324】
薬学的組成物、製剤及び投与経路さらなる態様において、本発明は、例えば下記の治療法のいずれかに使用される、本明細書で提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のいずれかを含む薬学的組成物を提供する。一実施態様では、薬学的組成物は、本明細書に提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のいずれかと、少なくとも一つの薬学的に許容される賦形剤とを含む。別の他の実施態様では、薬学的組成物は、本明細書において提供されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子のいずれかと、少なくとも１つの追加的な治療剤を、例えば後述するように含む。
【0325】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される賦形剤に溶解又は分散された、一又は複数のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の治療的有効量を含む。「薬学的に許容される又は薬理学的に許容される」という表現は、用いられる用量及び濃度においてレシピエントに非毒性であり、即ち、例えばヒトなどの動物に必要に応じて投与されたとき、副作用、アレルギー反応、又は他の望ましくない応答を生じさせない分子的実態及び組成物を指す。少なくとも一つのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子と、任意選択的に追加的な活性成分とを含む薬学的組成物の調製物は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.Mack Printing Company, 1990によって例示されているように、本開示内容の見地から当業者には既知であろう（この文献は参照により本明細書に包含される）。特に、組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」には、当業者には既知であるように、任意の及びすべての溶媒、バッファー、分散媒、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば抗細菌剤、抗真菌剤）、等張剤、塩、安定剤及びこれらの組み合わせが含まれる。
【0326】
非経口組成物には、注射による投与、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内又は腹腔内への注射用に考案されたものが含まれる。注射の場合、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩水バッファーといった生理的に適合性のバッファー中において製剤化される。溶液は、懸濁化剤、安定剤、及び／又は分散剤といった製剤関連薬剤を含むことができる。代替的に、融合タンパク質は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌済みのピロゲンを含まない水を用いた組成に適した粉末形態であってもよい。無菌の注射可能な溶液は、必要量の本発明の融合タンパク質を、必要に応じて以下に列挙する他の様々な成分を含む適切な溶媒中に取り込むことにより調製される。滅菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。通常、分散液は、基本的な分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクル中に、滅菌された様々な活性成分を取り込むことにより調製される。無菌の注射可能な溶液、懸濁液、又は乳濁液を調製するための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、直前に滅菌濾過されたその液体媒質から活性成分の粉末と任意の所望の追加的成分とを生む真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒質は、必要であれば適切にバッファーリングされなければならず、十分な食塩水又はグルコースを注射される前に、液体はまず希釈されて等張性にされる。組成物は、製造及び貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌といった微生物の汚染作用から保護されなければならない。エンドトキシンの汚染が安全レベル、例えばタンパク質１ｍｇあたり０．５ｎｇ未満で最小限に保たれなければならない。薬学的に許容される適切な賦形剤には、限定されないが；リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸のようなバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチオルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；マンノサッカライド、ジサッカライド、及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、デキストランなどの懸濁液の粘度を上昇させる化合物が含有されていてよい。任意選択的に、懸濁液は、適切な安定剤、又は化合物の溶解度を上昇させて高濃度の溶液の調製を可能にする薬剤も含むことができる。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製することができる。適切な親油性溶媒又はビヒクルには、ごま油のような脂肪油、又はエチルクリート若しくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステルが含まれる。
【0327】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに、封入することができる。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences（18th Ed. Mack Printing Company, 1990）に開示されている。徐放性調製物が調製される。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリックスが成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の吸収を、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はそれらの組合せといった吸収を遅延させる薬剤を組成物に使用することにより持続させることができる。
【0328】
本明細書における例示的な薬学的に許容可能な賦形剤は、介在性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒｈｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）のようなヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質をさらに含む。特定の典型的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用法は、ｒＨｕＰＨ２０を含み、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８に記載されている。一態様において、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの一又は複数のさらなるグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【0329】
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第６２６７９５８号に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第６１７１５８６号及び国際公開第２００６／０４４９０８号に記載されているものを含み、後者の製剤はヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【0330】
上記の組成物に加えて、融合タンパク質はデポー製剤として製剤化することもできる。このような長時間作用型の製剤は、注入（例えば、皮下若しくは筋肉内）により、又は筋肉内注射により投与することができる。したがって、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー性若しくは疎水性物質（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液としての）又はイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として製剤化することができる。
【0331】
本発明の融合タンパク質を含む薬学的組成物は、一般的な混合、溶解、乳化、カプセル化、封入、又は凍結乾燥方法により製造することができる。薬学的組成物は、一又は複数の生理的に許容される担体、希釈材、賦形剤、又は薬学的に使用可能な調製物へのタンパク質の処理を容易にする補助剤を用いる一般的な方法で製剤化することができる。適当な製剤は、選択される投与経路によって決定する。
【0332】
ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、遊離酸又は遊離塩基の、天然又は塩の形態の組成物に製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。これらには、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基で形成されたもの、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸といった有機酸で形成されたものが含まれる。また、遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基；又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、又はプロカインといった有機塩基から誘導することができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態より、水性及び他のプロトン性溶媒に溶け易い。
【0333】
本明細書中の組成物はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【0334】
インビボ投与に使用される製剤は、一般的に無菌である。無菌状態は、例えば、滅菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
【0335】
治療的方法及び組成物本明細書において提供されるいずれのＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子も、治療法に使用することができる。
【0336】
治療法において使用される場合、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、医学行動の規範に則って製剤化、投薬、及び投与することができる。この観点において考慮すべき要因は、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法、投与日程及び医療従事者に既知の他の要因を含む。
【0337】
一態様では、医薬としての使用のための本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、疾病の治療における使用、特にがんの治療における使用のための本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。特定の態様では、治療の方法における使用のための本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。一態様では、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療に使用される、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、本発明は、融合タンパク質の治療的有効量を個体に投与することを含む、疾患を有する個体の治療法において使用されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を提供する。特定の態様では、治療される疾患はがんである。がんの例には、固体腫瘍、膀胱がん、腎細胞癌、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がん、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病が含まれる。したがって、がんの治療における使用のための本明細書に記載される本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。治療を必要とする被検体、患者、又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
【0338】
別の態様では、感染症の治療における使用のため、特にウイルス性感染の治療のための、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。さらなる態様では、例えば狼瘡疾患といった自己免疫疾患の治療における使用のための、本明細書に記載のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【0339】
一態様では、標的細胞抗原がＦＡＰである、頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん（ＰＡＣ）、胃がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び中皮腫の治療における使用のための、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が提供される。
【0340】
さらなる態様においては、本発明は、それを必要とする個体の疾患の治療のための医薬の製造及び調製における、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。一態様では、本医薬は、疾患を有する個体に対して医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。特定の実施態様では、治療される疾患は増殖性疾患、特にがんである。したがって、一態様では、本発明は、がんの治療のための医薬の製造又は調製における本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。がんの例には、固体腫瘍、膀胱がん、腎細胞癌、脳のがん、頭部及び頸部のがん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頚がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨のがん、及び腎臓がん、メラノーマ、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病、非ホジキンリンパ腫及び急性リンパ芽球性白血病が含まれる。本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を用いて治療することができる他の細胞増殖性疾患には、限定されないが、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部及び頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部、及び泌尿生殖器系に位置する腫瘍が含まれる。前がん性の状態又は病変及びがん転移も含まれる。特定の実施態様では、がんは、腎細胞がん、皮膚がん、肺がん、結腸直腸がん、乳がん、脳のがん、頭部及び頸部のがんからなる群より選択される。当業者は、場合によっては、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は治癒をもたらさず、部分的恩恵を提供するだけであることを認識する。いくつかの態様では、いくつかの恩恵を有する生理的変化も治療的に有益と考えられる。したがって、いくつかの態様では、生理的変化をもたらすＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の量は、「有効量」又は「治療的有効量」と考えられる。
【0341】
さらなる態様においては、本発明は、感染症の治療のため、特にウイルス性感染の治療のため又は自己免疫疾患、例えば狼瘡病の治療のための医薬の製造及び調製における、本明細書に記載されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の使用に関する。
【0342】
さらなる態様では、本発明は個体の疾患の治療法を提供し、この方法は、前記個体に対し、治療的有効量の本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を投与することを含む。一態様では、薬学的に許容される形態の本発明の融合タンパク質を含む組成物が、前記個体に対して投与される。特定の態様では、治療される疾患は増殖性疾患である。特定の一態様では、疾患はがんである。別の態様では、疾患は感染症又は自己免疫性疾患である。特定の態様では、方法はさらに、個体に対して少なくとも一つの追加の治療剤、例えば、治療される疾患ががんであれば抗がん剤の治療的有効量を投与することを含む。上記実施態様のいずれにおいても、「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトとすることができる。
【0343】
疾患の予防又は治療のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の適切な用量は（単独で使用されるか、或いは一又は複数の他の追加的治療剤との組み合わせで使用されるとき）、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質が予防又は治療いずれの目的で投与されるか、直前又は同時に行われる治療的介入、患者の病歴及び融合タンパク質に対する応答、並びに主治医の裁量によって決定される。投与の責任を負う施術者は、いずれにしろ、組成物中の活性成分の濃度及び個別の被験者に適切な用量を決定する。限定されないが、様々な時点にわたる単一又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
【0344】
ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、患者に対して、単回の又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ）のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が患者への投与のための初期候補用量となりうる。一つの典型的な１日用量は、上記の因子に応じて約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲であろう。数日以上にわたる反復投与に関しては、状態に応じて、治療は一般に疾患症状の望まれる抑制が起こるまで持続されるであろう。融合タンパク質の一つの例示的投薬量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであろう。他の実施例では、用量は、一回の投与につき、体重ベースで、約１μｇ／ｋｇ、約５μｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ、約５０μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ、約２００μｇ／ｋｇ、約３５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約３５０ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇ、約１０００ｍｇ／ｋｇ以上及びそこから導かれるあらゆる範囲を含む。本明細書に列挙される数字から導かれる範囲の例では、上記の数字に基づいて、体重ベースで約５ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５μｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇなどが投与されうる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一又は複数の用量（又はこれらのいずれかの組み合わせ）を患者に投与してよい。このような用量は断続的に、例えば毎週又は三週毎（例えば患者が約２から約２０、例えば融合タンパク質の約６用量を受けるように）投与してよい。初期の高負荷用量の後、一以上の低用量を投与してよい。しかしながら、他の用量用法も有用でありうる。この治療法の進行は、従来の技術及びアッセイにより容易にモニターされる。
【0345】
本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、通常、意図された目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子、又はその薬学的組成物は、治療的有効量で投与又は適用される。治療的有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容を踏まえると十分に当業者の能力の範囲内である。
【0346】
全身投与の場合、治療的に有効な用量は、まずは細胞培養アッセイのようなインビトロアッセイに基づいて推定することができる。次いで用量を、細胞培養物において決定されるＩＣ５０を含む循環濃度範囲を達成するために、動物モデルにおいて製剤化することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために使用することができる。
【0347】
初期投与量は、インビボデータ、例えば動物モデルから、当技術分野で周知の技術を用いて推定することもできる。当業者であれば、動物データに基づいて、ヒトへの投与を容易に最適化することができるであろう。
【0348】
投与の量及び間隔は、治療効果を維持するために十分なＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の血漿レベルを提供するために個別に調整されうる。注射による投与のための通常の患者への投与量は、約０．１から５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５から１ｍｇ／ｋｇ／日にわたる。治療的に有効な血漿レベルは、毎日複数の用量を投与することにより達成することができる。血漿中のレベルは、例えばＨＰＬＣにより測定することができる。
【0349】
局所投与又は選択的取り込みの場合、ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の有効な局所濃度は血漿濃度に関連していなくともよい。当業者であれば、過度の実験をしなくとも、治療的に有効な局所投与量を最適化することができるであろう。
【0350】
本明細書に記載されるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の治療的に有効な用量は、通常、実質的な毒性なしで治療的恩恵を提供するであろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物における標準の薬学的手順により決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物の研究は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らしめる用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために使用することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０と表現することができる。大きな治療指数を呈するＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子が好ましい。一実施態様では、本発明によるＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用に適した一定範囲の投与量の製剤化に使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性をほとんど又はまったく伴わないＥＤ５０を含む、一定範囲の循環濃度内にある。投与量は、種々の要因、例えば、用いられる投与形態、使用される投与経路、対象の状態などに応じてこの範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路、及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師により選択されうる（例えば、Fingl et al., 1975, in:ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1参照。この文献は参照により本明細書に包含される）。
【0351】
本発明の融合タンパク質を用いて治療される患者の主治医には、毒性、器官不全などにより、いつ及びどのようにして投与を終了、中断、又は調整するかが分かるであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でなかった場合には（毒性なしで）、治療レベルを上げるように調整することも分かっているであろう。対象となる障害の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重症度、投与経路などによって変動するであろう。例えば、状態の重症度は、部分的には標準の予後評価方法により評価される。さらに、用量及び恐らくは投薬回数も、個々の患者の年齢、体重、及び応答により変動するであろう。
【0352】
その他の薬剤及び治療本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、療法において、一又は複数の他の薬剤との組み合わせで投与されうる。例えば、本発明の融合タンパク質は、少なくとも一つの追加の治療剤と共投与されうる。用語「治療剤」は、症状又は疾患を治療するために、そのような治療を必要とする個体に投与することのできるあらゆる薬剤を包含する。このような追加的な治療剤は、治療されている特定の兆候に適したあらゆる活性成分、好ましくは、互いに打ち消し合うことのない相補的活性を有する活性成分を含む。特定の実施態様では、追加的な治療剤は別の抗がん剤である。
【0353】
このような他の薬剤は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在する。このような他の薬剤の有効量は、用いられる融合タンパク質の量、疾患又は治療の種類、及び上記他の要因によって決まる。ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子は、通常、本明細書に記載されるものと同じ用量及び投与経路において、又は本明細書に記載された用量の１％〜９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路により使用される。
【0354】
上記のこうした併用療法は、併用投与（二つ以上の治療剤が、同一又は別々の組成物に含まれている）、及び本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の投与が、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与の前、投与と同時、及び／又は投与の後に起きうる分離投与を包含する。
【0355】
製造品本発明の別の態様では、上述した障害の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、それ自体で又は又は別の組成物と組み合わせて、状態の治療、予防、及び／又は診断に有効な組成物を収容し、滅菌のアクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも一つの活性な薬剤は、本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子である。
【0356】
ラベル又は添付文書は、組成物が特定の状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造品は、（ａ）本発明のＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子を含む組成物を中に含む第１の容器；及び（ｂ）さらなる細胞障害性又はその他の治療的薬剤を中に含む組成物を中に含む第２の容器を含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の状態を治療するために使用されうることを示す添付文書をさらに含んでもよい。
【0357】
代替的に又は追加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液を含む第２（又は第３）の容器をさらに含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含め、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含んでもよい。
【0358】
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【0359】
ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991）。抗体鎖のアミノ酸は、上記に定義されたように、Kabat （Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD （1991））によるＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされ、そのように呼ばれる。
【実施例】
【0360】
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施されうることが理解される。
【0361】
組み換えＤＮＡ技術標準的な方法を使用して、Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記載されているようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は以下に与えられている：Kabat, E.A. et al., （1991） Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242。
【0362】
ＤＮＡ配列決定ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定により決定された。
【0363】
遺伝子合成所望の遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを用いてＰＣＲによって生成するか、又は自動化された遺伝子合成による合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲ生成物からＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により合成した。正確な遺伝子配列が入手可能でない場合、最も近いホモログ由来の配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、適切な組織を起源とするＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子を単離した。特異な制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準のクローニング／シーケンシングベクター中にクローニングした。形質転換した細菌からプラスミドＤＮＡを精製し、ＵＶ分光法により濃度を決定した。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター中へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計された。すべてのコンストラクトは、真核細胞内の分泌のためにタンパク質を標的とするリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列を含むように設計された。
【0364】
細胞培養技術Current Protocols in Cell Biology(2000)、Bonifacino、J.S.、Dasso、M.、Harford、J.B.、Lippincott-Schwartz、J. and Yamada、K.M.(eds.)、John Wiley & Sons,Inc.に記載されているように、標準的な細胞培養技術を使用した。
【0365】
タンパク質精製タンパク質は、標準プロトコールを参照して、濾過された細胞培養上清から精製された。簡単に説明すると、抗体をプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、ＰＢＳで洗浄した。抗体の溶出をｐＨ２．８で行った後、直ちに試料を中和させた。凝集タンパク質を、ＰＢＳ又は２０ｍＭのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により単量体抗体から分離した。単量体抗体の画分を、プールし、例えばＭＩＬＬＩＰＯＲＥ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ（３０ ＭＷＣＯ）遠心濃縮機を用いて濃縮し（必要に応じて）、冷凍し、−２０℃又は−８０℃で貯蔵した。試料の一部は、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又は質量分析によるその後のタンパク質分析及び分析的特徴付けのために提供された。
【0366】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥＮｕＰＡＧＥ(R) Ｐｒｅ−Ｃａｓｔ ｇｅｌシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、製造元の指示に従って使用した。特に、１０％又は４−１２％のＮｕＰＡＧＥ（登録商標）Ｎｏｖｅｘ（登録商標）ビス−ＴＲＩＳ Ｐｒｅ−Ｃａｓｔゲル（ｐＨ６．４）及びＮｕＰＡＧＥ（登録商標）ＭＥＳ（還元ゲル、ＮｕＰＡＧＥ（登録商標）抗酸化剤ランニングバッファー添加剤）又はＭＯＰＳ（非還元ゲル）ランニングバッファーが使用された。
【0367】
分析的サイズ排除クロマトグラフィー抗体の凝集及びオリゴマー状態の決定のためのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施された。簡単に説明すると、プロテインＡ精製抗体を、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰＬＣ １１００システム上のＴｏｓｏｈ ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムの３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４／Ｋ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）に、又はＤｉｏｎｅ×ＨＰＬＣ−システム上のＳｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の２×ＰＢＳに適用した。溶出されたタンパク質を、ＵＶ吸光度及びピーク面積の積分により定量化した。ＢｉｏＲａｄゲル濾過標準１５１−１９０１が標準となった。
【0368】
質量分析この項は、それらの正確な構築に重点を置いたＶＨ／ＶＬ交換（ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂｓ）による多特異性抗体の特徴付けについて記載する。予想される一次構造を、脱グリコシル化インタクトＣｒｏｓｓＭａｂｓ及び脱グリコシル化／プラスミン消化又は代替的脱グリコシル化／限定ＬｙｓＣ消化ＣｒｏｓｓＭａｂｓのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）により分析した。
【0369】
ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂｓを、タンパク質濃度１ｍｇ／ｍｌにおいて、３７℃のホスフェート又はＴｒｉｓバッファー中において１７時間、Ｎ−グリコシダーゼＦを用いて脱グリコシル化した。プラスミン又は限定ＬｙｓＣ（Ｒｏｃｈｅ）の消化を、それぞれ室温で１２０時間、及び３７℃で４０分間、Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ８）中において１００μｇの脱グリコシル化ＶＨ／ＶＬ ＣｒｏｓｓＭａｂｓを用いて実施した。質量分析に先立ち、試料を、Ｓｅｐｈａｄｅ×Ｇ２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でＨＰＬＣにより脱塩した。総質量を、ＴｒｉＶｅｒｓａ ＮａｎｏＭａｔｅソース（Ａｄｖｉｏｎ）を備えたｍａＸｉｓ ４Ｇ ＵＨＲ−ＱＴＯＦ ＭＳシステム（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｋ）上において、ＥＳＩ−ＭＳにより決定した。
【0370】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（ＢＩＡＣＯＲＥ）を用いた各抗体に対する多特異性抗体の結合及び結合親和性の決定生成された抗体の、各抗原に対する結合が、ＢＩＡＣＯＲＥ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた表面プラズモン共鳴により調査される。簡単に説明すると、親和性測定のために、各抗原に対する抗体を提示するためのアミンカップリングにより、ヤギ−抗ヒトＩｇＧ、ＪＩＲ １０９−００５−０９８抗体がＣＭ５チップ上に固定化される。結合が、ＨＢＳバッファー（ＨＢＳ−Ｐ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％ Ｔｗｅｅｎ ２０（ｐｈ７．４））、２５℃（又は３７℃）中において測定される。抗原（Ｒ＆Ｄシステム又は社内精製品）を、様々な濃度で溶液に加えた。８０秒から３分間の抗原注入により結合を測定し；ＨＢＳバッファーを用いて３〜１０分間チップ表面を洗浄することにより解離を測定し、ラングミュア１：１結合モデルを用いてＫＤ値を推定した。ネガティブコントロールデータ（例えばバッファー曲線）が、システムに固有のベースライン変動の修正のため、及びノイズシグナル低減のために、試料曲線から差し引かれる。対応のＢｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅが、センサーグラムの分析のため、及び親和性データの計算のために使用される。
【0371】
実施例１１．１ 標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製
ヒト４−１ＢＢリガンドのエクトドメイン（アミノ酸７１−２５４、５２−２５４及び８０−２５４）のＤＮＡ配列コード化部分の異なる断片を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ４１２７３配列（配列番号４２）に従って合成した。
【0372】
ＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子の構築のための成分として、（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンドの二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１又はＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図１Ａ（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ１又はＣＬ）に示されるように、又は図１Ｃ（ヒトＣＨ３、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）に示されるように、クローニングした。
【0373】
４−１ＢＢリガンドの一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬ又はＣＨ１ドメインに融合したポリペプチドを、図１Ｂ（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ又はＣＨ１）に記載のように、又は図１Ｄ（ヒトＣＨ３、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）に示されるように、クローニングした。
【0374】
ポリペプチドを、例えばコンストラクト１のために、任意選択的なペプチドリンカーを用いて、ヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングし、ヒトＣＨ１ドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、配列番号１３のリンカー（Ｇ４Ｓ）２又は配列番号５７のリンカー（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Ｍｅｒｃｈａｎｔ、Ｚｈｕら １９９８）。
【0375】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的なバインダー、即ち２８Ｈ１をコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、ホールの定常重鎖（Carter, J. Immunol. Methods （2001）, 248, 7-15）又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖と、インフレームでサブクローニングした。ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号に記載されており、この特許文献は参照により本明細書に包含される。
【0376】
表１に、生成されたコンストラクトの特性をまとめる。コンストラクト１から１０は、その幾何学的形状、ＦＡＰの原子価、４−１ＢＢリガンドエクトドメイン、ＣＨ１及びＣＬドメインのクロスオーバー（ＣｒｏｓｓＭａｂ技術）、ＣＨ１及びＣＬドメインの突然変異、及び４−１ＢＢリガンド（単量体４−１ＢＢＬ鎖）の一つのエクトドメインを含むポリペプチド内の異なるペプチドリンカーにおいて異なっている。
【0377】
表１：生成されたＴＮＦリガンド三量体含有抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体）の特性[この文献は図面を表示できません]
【0378】
誤対合を回避するため、国際公開第２００９／０８０２５３号に記載のようにして、大部分のコンストラクトにおいて一対のＣＨ１及びＣＬドメインを互いに置き換えた（ドメインクロスオーバー）。
【0379】
正確な対合をさらに向上させるため、コンストラクト２から４及び６から１０内の荷電残基として、交差又は非交差ＣＨ１及びＣＬドメインに異なる荷電アミノ酸置換を導入した。ヒトＣＬドメインに突然変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋを導入し、突然変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３ＥをヒトＣＨ１ドメイン中にクローニングした。
【0380】
すべてのコンストラクトについて、ノブ鎖のＣＨ３ドメイン内のＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異及びそれに対応するホール鎖のＣＨ３ドメイン内のＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異による、ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術を用いた（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 （2001））。
【0381】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0382】
例えば、コンストラクト１では、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を第１のＣＨ３ドメインに含むリガンド−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を第２のＣＨ３ドメインに含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖の組み合わせが、構築された三量体ｉｃ ４−１ＢＢリガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図２、グラフ１．１）。
【0383】
表２は、一価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト１．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0384】
表２：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．１の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0385】
表３は、ＣＨ１−ＣＬクロスオーバー及び荷電残基を有する一価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト１．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0386】
表３：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．２の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0387】
表４は、一価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．３（抗ＦＡＰ Ｆａｂ内のＣＨ１−ＣＬクロスオーバー及び４−１ＢＢＬ含有鎖上の荷電残基を有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0388】
表４：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．３の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0389】
表５は、一価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．４（抗ＦＡＰ Ｆａｂ、ＣＨ１−ノブ鎖に融合した単量体４−１ＢＢリガンド及び４−１ＢＢ含有鎖上の荷電残基を有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0390】
表５：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．４の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0391】
表６は、二価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．５（２つの抗ＦＡＰ Ｆａｂ、各重鎖のＣ末端にそれぞれ融合した二量体及び単量体４−１ＢＢリガンドを有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0392】
表６：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．５の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0393】
表７は、一価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．６（抗ＦＡＰ Ｆａｂ、（Ｇ４Ｓ）−リンカーを介してＣＬ＊に融合した単量体４−１ＢＢリガンドを有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0394】
表７：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．６の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0395】
表８は、二価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト７（Ｆｃホール鎖のＮ末端上の二重抗ＦＡＰ及び４−１ＢＢリガンドに融合した交差ＣＨ１及びＣＬ上の荷電残基を有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0396】
表８：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．７の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0397】
表９は、二価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．８（ノブ鎖上の荷電残基と共に、抗ＦＡＰ ＣｒｏｓｓＦａｂに融合した４−１ＢＢリガンドを有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0398】
表９：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．８の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0399】
表１０は、一価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド（５２−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．９（４−１ＢＢＬエクトドメインのアミノ酸５２−２５４及びリガンド鎖上の荷電残基を有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0400】
表１０：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．９の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0401】
表１１は、一価のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド（８０−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１．１０（４−１ＢＢＬエクトドメインのアミノ酸８０−２５４及びリガンド鎖上の荷電残基を有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0402】
表１１：ＦＡＰ標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト１０の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0403】
１．２ ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合コンストラクトの生成標的化ＴＮＦリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子コード化配列を、プラスミドベクター中にクローニングした。これは、ＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を誘導するものであり、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ｐｏｌｙＡ配列を含む。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【0404】
標的化ＴＮＦリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子を、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成した。コンストラクト１、２、３、４、６、７、８、９、１０のために、細胞に、１：１：１：１の比で対応する発現ベクター（例えば「ベクター二量体リガンド−（ＣＨ１又はＣＬ）−ノブ鎖」：「ベクター単量体リガンド 融合−（ＣＬ又はＣＨ１）」：「ベクター抗ＦＡＰ Ｆａｂ−ホール重鎖」：「ベクター抗ＦＡＰ軽鎖」）をトランスフェクトした。二価のコンストラクト５のために、１：１：１の比（「ベクターホール重鎖」：「ベクターノブ重鎖」：「ベクター抗ＦＡＰ軽鎖」）を使用した。
【0405】
５００ｍＬの振盪フラスコ内での生成のために、３億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を１０分間２１０×ｇで遠心分離し、上清を、２０ｍＬの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地により置き換えた。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に混合した。５４０μＬのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰＥＰＳＯＹ及び１．２ｍＭのバルプロ酸を補った１６０ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１２％のＦｅｅｄ ７及びグルコース（最終濃度３ｇ／Ｌ）を加えた。７日間の培養後、上清を、３０〜４０分間４００×ｇで遠心分離することにより収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に維持した。
【0406】
標的化ＴＮＦリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５−１５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの樹脂）に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容積の同じバッファーによる洗浄により除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）による直線勾配（２０ＣＶ）又は段階的溶出（８ＣＶ）を用いて溶出した。直線勾配については、さらに４カラム容積の段階的溶出を適用した。
【0407】
収集された画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより調節した。タンパク質を濃縮した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【0408】
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。標的化ＴＮＦリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の純度及び分子量を、還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｒｅｉｔｏｌ））の存在下及び非存在下で、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅTM ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵＳＡ）で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより又はＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＣＥ−ＳＤＳにより、分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、２５℃の０．０２％（ｗ／ｖ）ＮａＮ３（ｐＨ６．７）ランニングバッファー中において平衡化した、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【0409】
表１２は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0410】
表１２：ＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0411】
１．３ 標的化マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子と同様に、マウスＦＡＰ標的化４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を調製した。
【0412】
マウス４−１ＢＢリガンドのエクトドメイン（アミノ酸１０４−３０９）のＤＮＡ配列コード化部分を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＱ３Ｕ１Ｚ９−１配列（配列番号７０）に従って合成した。コンストラクトＭ．１のために、１３７位、１６０位及び２４６位のシステインを、標準的なＰＣＲ法によりセリンに変異導入し、コンストラクトＭ．２のために、１６０位のシステインをセリンに変異導入した（Ｃ１６０Ｓ）。
【0413】
マウスリガンドを、ヒト４−１ＢＢＬについて記載し且つ図３Ａ及び３Ｂに示したようにして構築した。（Ｇ４Ｓ）２リンカーによって分離された二量体４−１ＢＢＬを、マウスＩｇＧ１−ＣＬドメイン（図３Ａ）に融合させ、単量体４−１ＢＢＬを、マウスＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合させた（図３Ｂ）。マウスＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、マウスＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングし、図３Ｃに示すコンストラクトを構築した。
【0414】
マウスコンストラクトのために、突然変異Ｌｙｓ３９２Ａｓｐ及びＬｙｓ４０９Ａｓｐ（ＤＤ）を、マウス４−１ＢＢＬを含む重鎖に導入し、突然変異Ｇｌｕ３５６Ｌｙｓ及びＡｓｐ３９９Ｌｙｓ（ＫＫ）を、抗ＦＡＰ Ｆａｂを含む重鎖に導入し、非対称分子を得た（Gunasekaran K. et al, J Biol. Chem., 2010, Jun 18;285（25）:19637-46）。
【0415】
突然変異Ａｓｐ２６５Ａｌａ及びＰｒｏ３２９Ｇｌｙ（ＤＡＰＧ）を、重鎖の定常領域に導入し、Ｆｃガンマ受容体に対する結合を抑止した。
【0416】
表１３は、ＦＡＰ標的化マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子コンストラクトＭ．１の、ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列それぞれを示す。
【0417】
表１３：ＦＡＰ標的化マウスコンストラクトＭ．１の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0418】
表１４は、非標的化（ＤＰ４７）マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子コントロールＭ．１のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列それぞれを示す。
【0419】
表１４：非標的化マウスコントロールＭ．１の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0420】
表１５は、ＦＡＰ標的化マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子コンストラクトＭ．２の、ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0421】
表１５：ＦＡＰ標的化マウスコンストラクトＭ．２の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0422】
表１６は、ＤＰ４７非標的化マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子コンストラクトコントロールＭ．２の、ｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0423】
表１６：ＦＡＰ標的化マウスコントロールＭ．２の配列[この文献は図面を表示できません]
【0424】
マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、ヒト４−１ＢＢＬコンストラクトについて前述したように生成及び精製した。
【0425】
表１７は、ＦＡＰ標的化及び非標的化マウス４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0426】
表１７：ＦＡＰ標的化及び非標的化マウス４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生成のまとめ[この文献は図面を表示できません]
【0427】
１．４ 非標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（コントロール分子）の調製及び精製抗ＦＡＰバインダー（ＶＨ−ＶＬ）を生殖系列コントロール（ＤＰ４７と呼ばれる、抗原に結合しない）により置き換えたことを除き、ＦＡＰ標的化コンストラクト１及び２について上述したように、コントロール分子を調製した。コントロールは、非標的化一価分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）（コントロールＡ、図５Ａ）であり、コントロールＢの場合、コンストラクトは、荷電残基を持つＣＨ−ＣＬクロスオーバーも含む（図５Ｂ）。ＦＡＰバインダーの重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域を、生殖系列コントロール（ＤＰ４７）の可変領域で置き換え、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0428】
非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子を、ＦＡＰ標的化コンストラクトについて上述したように生成した。細胞に、１：１：１：１の比で対応する発現ベクター（「ベクター二量体リガンド−ＣＨ１又はＣＬ＊−ノブ鎖」：「ベクター単量体リガンド融合−ＣＬ又はＣＨ１＊」：「ベクターＤＰ４７ Ｆａｂ−ホール鎖」：「ベクターＤＰ４７軽鎖」）をトランスフェクトした。
【0429】
表１８は、ＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子コントロールＡのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列それぞれを示す。
【0430】
表１８：ＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体）コントロールＡの配列[この文献は図面を表示できません]
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【0431】
表１９は、４−１ＢＢリガンド含有アームにＣＨ１−ＣＬクロスオーバー及び荷電残基を有するＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す（コントロールＢ）。
【0432】
表１９：ＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体）コントロールＢの配列[この文献は図面を表示できません]
【0433】
表２０は、ＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0434】
表２０：ＤＰ４７非標的化４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コントロール分子）の生成特性[この文献は図面を表示できません]
【0435】
実施例２２．１ ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製
ヒト４−１ＢＢリガンドのエクトドメイン（アミノ酸７１−２５４、及び７１−２４８）のＤＮＡ配列コード化部分の異なる断片を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ４１２７３配列（配列番号４２）に従って合成した。
【0436】
２．１．１ 荷電残基を持つ交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．１）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図１Ａに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。
【0437】
４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合したポリペプチドを、図１Ｂに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0438】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、リンカー（Ｇ４Ｓ）２、又は代替的に、（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。
【0439】
正確な対合を向上させるために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬに導入された。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンド内に、突然変異Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋを導入した。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンド内において、突然変異Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３ＥをヒトＣＨ１ドメイン中にクローニングした。
【0440】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン４Ｂ９） を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0441】
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号に記載されており、この特許文献は参照により本明細書に包含される。
【0442】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0443】
すべてのコンストラクトについて、ノブ鎖のＳ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異及びそれに対応するホール鎖内のＹ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異による、ノブ・イントゥ・ホールヘテロ二量体化技術を用いた。
【0444】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４、コンストラクト２．１）。
【0445】
表２１は、ＣＨ１−ＣＬクロスオーバー及び荷電残基を含む一価のＦＡＰ（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0446】
表２１：一価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト２．１の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0447】
２．１．２ 荷電残基を持たない交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．２）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図１Ａに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。
【0448】
４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合したポリペプチドを、図１Ｂに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ１）クローニングした。
【0449】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、リンカー（Ｇ４Ｓ）２又は代替的に、（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。
【0450】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン４Ｂ９）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0451】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された（国際公開第２０１２／１３０８３１号）。
【0452】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４、コンストラクト２．２）。
【0453】
表２２は、荷電残基を持たないＣＨ１−ＣＬクロスオーバーを含む一価のＦＡＰ（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0454】
表２２：一価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト２．２の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0455】
２．１．３ 各重鎖のＣ末端に融合した二量体及び単量体４−１ＢＢリガンドを含む二価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．３）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図１Ｃに示すように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させた。図１Ｄに記載のように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したポリペプチド。
【0456】
二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、（Ｇ４Ｓ）２コネクターを用いて、ホール上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＣ末端にインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。単量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、（Ｇ４Ｓ）２コネクターを用いて、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＣ末端にインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。
【0457】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン４Ｂ９）を、ヒトＩｇＧ１の定常軽鎖、ノブ、又はホールの定常重鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0458】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0459】
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４、コンストラクト２．３）。
【0460】
表２３は、二価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト２．３（２つの抗ＦＡＰ Ｆａｂ、各重鎖のＣ末端にそれぞれ融合した二量体及び単量体４−１ＢＢリガンドを有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0461】
表２３：二価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト２．３の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0462】
２．１．４ 荷電残基を持つ交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．４）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図１Ａに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合したポリペプチドを、図１Ｂに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0463】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、リンカー（Ｇ４Ｓ）２又は、代替的に（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。正確な対合を向上させるために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬに導入された。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【0464】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン４Ｂ９）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0465】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0466】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４、コンストラクト２．４）。
【0467】
表２４は、荷電残基を持つＣＨ１−ＣＬクロスオーバーを含む一価のＦＡＰ（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0468】
表２４：一価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト２．４の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0469】
２．１．５ 荷電残基を持たない交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．５）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図１Ａに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合したポリペプチドを、図１Ｂに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0470】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、リンカー（Ｇ４Ｓ）２又は、代替的に（ＧＳＰＧＳＳＳＳＧＳ）を用いて、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。
【0471】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン４Ｂ９）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0472】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0473】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４、コンストラクト２．５）。
【0474】
表２５は、荷電残基を持たないＣＨ１−ＣＬクロスオーバーを含む一価のＦＡＰ（４Ｂ９）−ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．５）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0475】
表２５：一価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト２．５の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0476】
２．１．６ 各重鎖のＣ末端に融合した二量体及び単量体４−１ＢＢリガンドを含む二価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト２．６）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図１Ｃに示すように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させた。図１Ｄに記載のように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したポリペプチド。
【0477】
二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、（Ｇ４Ｓ）２コネクターを用いて、ホール上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＣ末端にインフレームでサブクローニングした（Ｍｅｒｃｈａｎｔ、Ｚｈｕら １９９８）。単量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、（Ｇ４Ｓ）２コネクターを用いて、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインのＣ末端にインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。
【0478】
線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン４Ｂ９）を、ヒトＩｇＧ１の定常軽鎖、ノブ、又はホールの定常重鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0479】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0480】
Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗ＦＡＰ ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４、コンストラクト２．６）。
【0481】
表２６は、二価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト２．６（２つの抗ＦＡＰ Ｆａｂ、各重鎖のＣ末端にそれぞれ融合した二量体及び単量体４−１ＢＢリガンドを有するＦＡＰ分裂三量体）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0482】
表２６：二価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コンストラクト２．６の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0483】
２．２ 非標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（コントロール分子）の調製コントロールＡ及びＢのために、さらなるコントロール分子を、上記実施例１．４に記載のように調製した。二価の変異体コントロールＣを、二価のコンストラクト２．３及び２．６と同様に調製し、一価の変異体コントロールＥを、コンストラクト２．５（４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体を含有）と同様に調製し、但し唯一の相違点として抗ＦＡＰバインダー（ＶＨ−ＶＬ）を生殖系列コントロール（ＤＰ４７と呼ぶ、抗原に結合しない）により置き換えた。
【0484】
表２７は、二価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コントロールＣのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。表２８は、一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コントロールＥのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0485】
表２７：二価のＤＰ４７非標的化ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コントロールＣの配列[この文献は図面を表示できません]
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【0486】
表２８：一価の非標的化ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子コントロールＥの配列[この文献は図面を表示できません]
【0487】
２．３ コントロールＦとしての非標的化ヒトＩｇＧ１の調製アッセイに使用された追加のコントロール分子は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載された方法に従ってＦｃガンマ受容体に対する結合を抑止するためにＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含む、非標的化ＤＰ４７、生殖系列コントロール、ヒトＩｇＧ１であった。
【0488】
表２９は、非標的化ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0489】
表２９：非標的化ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１（コントロールＦ）の配列[この文献は図面を表示できません]
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【0490】
２．４ 一価及び二価のＦＡＰ（４Ｂ９）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合コンストラクト及びコントロール分子の生成標的化及び非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合コード化配列を、プラスミドベクター中にクローニングした。これは、ＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を誘導するものであり、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ｐｏｌｙＡ配列を含む。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【0491】
分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体を、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成した。細胞には、対応する発現ベクターがトランスフェクトされた。コンストラクト２．１、２．２．、２．４及び２．５、並びに対応するコントロール分子のために、１：１：１：１の比（例えば「ベクター二量体リガンド−ＣＬ−ノブ鎖」：「ベクター単量体リガンド融合−ＣＨ１」：「ベクター抗ＦＡＰ Ｆａｂ−ホール鎖」：「ベクター抗ＦＡＰ軽鎖」）を使用した。コンストラクト２．３及び２．６、並びにそのコントロール分子のために、１：１：１の比（「ベクターｈｕＩｇＧ１ Ｆｃホール二量体リガンド鎖」：「ベクターｈｕＩｇＧ１ Ｆｃノブ単量体リガンド鎖」：「ベクター抗ＦＡＰ軽鎖」）を用いた。アッセイにおいてコントロールとして用いたヒトＩｇＧは、二重特異性コンストラクトのためとして生成された（トランスフェクションのためにのみ、軽鎖のベクター及び重鎖のベクターを使用した）。
【0492】
５００ｍＬの振盪フラスコ内での生成のために、３億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を１０分間２１０×ｇで遠心分離し、上清を、２０ｍＬの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地により置き換えた。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に混合した。５４０μＬのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰＥＰＳＯＹ及び１．２ｍＭのバルプロ酸を補った１６０ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１２％のＦｅｅｄ ７及びグルコース（最終濃度３ｇ／Ｌ）を加えた。７日間の培養後、上清を、３０〜４０分間少なくとも４００×ｇで遠心分離することにより収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に維持した。
【0493】
標的化及び非標的化ＴＮＦリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子及びヒトＩｇＧ１を、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５−１５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの樹脂）に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容積の同じバッファーによる洗浄により除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）による直線勾配（２０ＣＶ）又は段階的溶出（８ＣＶ）を用いて溶出した。直線勾配については、さらに４カラム容積の段階的溶出を適用した。
【0494】
収集された画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより調節した。タンパク質を濃縮した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【0495】
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。標的化三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の純度及び分子量を、還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下で、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵＳＡ）で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより又はＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＣＥ−ＳＤＳにより、分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３（ｐＨ６．７、２５℃）のランニングバッファー中において平衡化した、ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【0496】
表３０は、ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子及びコントロール分子の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0497】
表３０ ＦＡＰ（４Ｂ９）標的化及び非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子及びコントロール分子の生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0498】
実施例３４−１Ｂｂの調製、精製及び特徴付け
ヒト、マウス又はカニクイザル４−１ＢＢ（表３１）のエクトドメインをコードするＤＮＡ配列を、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Merchant et al., 1998）。ＡｃＴＥＶプロテアーゼ切断部位を、ヒトＩｇＧ１のＦｃと抗原エクトドメインの間に導入した。目的とするビオチン化のためのＡｖｉタグを、抗原−ＦｃノブのＣ末端に導入した。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含むＦｃホール鎖の組み合わせが、４−１ＢＢ エクトドメイン含有鎖の単一コピーを含むヘテロ二量体の生成を可能にし、したがってＦｃ結合抗原のモノマー形態を生成する（図５Ｃ）。表３２は、抗原Ｆｃ融合コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示している。
【0499】
表３１：抗原エクトドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸番号付け及びその起源[この文献は図面を表示できません]
【0500】
表３２：単量体抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
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【0501】
すべての４−１ＢＢ−Ｆｃ融合分子コード化配列を、プラスミドベクター中にクローニングした。これは、ＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を誘導するものであり、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ｐｏｌｙＡシグナル配列を含む。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【0502】
ビオチン化単量体抗原／Ｆｃ融合分子の調製のために、指数関数的に増殖するサスペンジョンＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞に、融合タンパク質の二つの成分（ノブ及びホール鎖）と、ＢｉｒＡ（ビオチン化反応に必要な酵素）をコードする三つのベクターをコトランスフェクトした。対応するベクターを、２：１：０．０５の比（「抗原ＥＣＤ−ＡｃＴＥＶ−Ｆｃノブ」：「Ｆｃホール」：「ＢｉｒＡ」）で使用した。
【0503】
５００ｍｌの振盪フラスコ内でのタンパク質生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を５分間２１０ｇで遠心分離し、上清を、予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地により置き換えた。発現ベクターを、２００μｇのベクターＤＮＡを含む２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に再懸濁した。５４０μＬのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。生成培地に５μＭのキフネンシンを補った。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及びサプリメントを含む７％のＦｅｅｄ １を培養物に加えた。７日間の培養後、細胞上清を、１５分間２１０ｇで細胞を遠心分離することにより収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるまでアジ化ナトリウムを補い、４℃に維持した。
【0504】
分泌タンパク質を、細胞培養物上清から、プロテインＡを用いたアフィニティークロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、４０ｍＬ ２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（ＣＶ＝５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。結合していないタンパク質を、少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５ Ｍの塩化ナトリウム含有バッファー（ｐＨ７．５）で洗浄することにより除去した。結合タンパク質を、２０カラム容積の、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）で生成された塩化ナトリウム（０から５００ｍＭ）の線形ｐＨ勾配を用いて溶出した。次いでカラムを、１０カラム容積の、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０（ｐＨ３．０）で洗浄した。
【0505】
収集された画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることにより調節した。タンパク質を濃縮及び濾過した後、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％（ｖ／ｖ）のアジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【0506】
また、ヒト受容体に対する親和性の決定のために、ヒト４−１ＢＢのエクトドメインを、ａｖｉ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）及びヘキサヒスチジンタグと、インフレームでサブクローニングした。
【0507】
タンパク質生成を、Ｆｃ融合タンパク質について上記したように実施した。分泌タンパク質を、細胞培養物の上清から、キレートクロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。第１のクロマトグラフィ工程を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｎＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化したＮｉＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）上で実施した。溶出は、１２カラム容積で５％から４５％の溶出バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｎＭの塩化ナトリウム、５００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４））の勾配を適用することにより実施された。タンパク質を濃縮及び濾過した後、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した（表３３）。
【0508】
表３３：単量体ヒト４−１ＢＢ Ｈｉｓ分子の配列[この文献は図面を表示できません]
【0509】
実施例４表面プラズモン共鳴によるＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生化学的特徴付け
組み換え４−１ＢＢに対するＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。すべてのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ１００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で実施した。
【0510】
ＦＡＰ標的化又は非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子と組み換え４−１ＢＢ（ヒト、カニクイザル、及びマウス）の間の相互作用の結合活性を、以下のように決定した。データは、標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子及び非標的化ＤＰ４７ ４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の両方が、同等の結合活性でヒト及びカニクイザル４−１ＢＢに結合するが、マウスホモログには結合しないことを実証した。
【0511】
組み換えビオチン化ヒト、カニクイザル及びマウス４−１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子を、標準的なカップリング指示を用いてＳＡチップ上に直接結合させた（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）。固定化レベルは約３０ＲＵであった。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子、又はＤＰ４７非標的化コントロールを、０．３９から２００ｎＭの濃度範囲で、３０μＬ／分のフローで、フローセルに１２０秒間通過させた。解離を１８０秒間モニターした。バルク屈折率の差異を、標準の空のフローセルで取得される応答を差し引くことにより修正した。
【0512】
親和性の測定のために、抗ヒトＦｃ特異的抗体の約７２００共鳴単位（ＲＵ）の直接結合を、ｐＨ５．０のＣＭ５チップ上において、標準的アミンカップリングキットを用いて実施した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。５０ｎＭのＦＡＰ標的化又は非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子を、３０μｌ／分の流速で６０秒間フローセル２上において捕獲した。ヒト４−１ＢＢ−ａｖｉ−Ｈｉｓの希釈系列（１．９５から１０００ｎＭ）を、３０μｌ／分で１８０秒間両方のフローセル上に通過させ、結合相を記録した。解離相を１８０秒間モニターし、試料溶液からＨＢＳ−ＥＰへと切り替えることによりトリガーした。チップ表面を、６０秒間１０ｍＭのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．１）の二重注入を用いて、各サイクル後に再生成した。バルク屈折率の差異を、基準フローセル１で取得される応答を差し引くことにより修正した。４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子とｈｕ４−１ＢＢ ａｖｉ Ｈｉｓの間の相互作用のために、Ｂｉａｅｖａｌ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて１：１ラングミュア結合曲線にフィッティングすることにより親和定数を速度定数から誘導した。
【0513】
表３４：１：１ラングミュア結合へのフィッティング及び親和定数[この文献は図面を表示できません]
【0514】
実施例５標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の機能的特徴付け
５．１．ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子のナイーブヒトＰＭＢＣと活性化ヒトＰＭＢＣに対する結合の比較
バフィーコートをチューリッヒ献血センターから取得した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容積のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１４１９０ ３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を供給し、希釈したバフィーコート溶液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７の上に重ねた。管を３０分間４００×ｇで遠心分離した。次いでＰＢＭＣを、接触面から収集し、ＤＰＢＳで三度洗浄し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６０００−０４４、Ｌｏｔ９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、５６℃で３５分間熱失活）、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５０５０ ０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｍ７１４５）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ，Ｍ３１４８）を供給したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４２４０１−０４２）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
【0515】
ＰＢＭＣは、単離後直接用いるか、又は、４日間、６ウェル組織培養プレート内において、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｈｗｅｉｚ ＡＧ，ＣＨＣＬＢ−Ｐ−４７６−７００−１０３４０）及び２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（ＳＩＧＭＡ Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｌ２７６９）を補ったＴ細胞培地で、次いで１日間、１０ｕｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３１７３１５）及び２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．：３０２９２８）でコーティングした６ウェル組織培養プレートにおいて、Ｔ細胞培地で３７℃及び５％のＣＯ２で培養することにより刺激して、Ｔ及びＮＫ細胞の細胞表面に４−１ＢＢ発現を誘導した。
【0516】
ヒトＰＢＭＣに対する４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の結合を決定するために、０．１ｘ１０６ナイーブ又は活性化ＰＢＭＣを、丸底サスペンジョン細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５０１８５）．の各ウェルに加えた。プレートを、４分間４００×ｇ及び４℃で遠心分離した。上清は捨てた。その後、細胞を、１：１０００に希釈した、ＵＶ励起のためのＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ ＢｌｕｅＤｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌ−２３１０５）又はＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ６５−０８６４−１８）又はＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｇｒｅｅｎ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｌ−２３１０１）を含む１００μＬ／ウェルのＤＰＢＳ中において、暗所で３０分間４℃で染色した。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｔｈ染色としてＤＡＰＩを使用した場合、この染色工程は省いた。細胞を２００μＬの冷たいＦＡＣＳバッファー（２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１７７）及び７．５ｍＭのアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）で一度洗浄した。
【0517】
次に、異なる滴定濃度の４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファーを加え、細胞を、１２０分間４℃でインキュベートし、２００μＬ／ウェルの４℃のＦＡＣＳバッファーで四度洗浄し、再懸濁した。さらに細胞を、０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローンＵＣＨＴ１、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３００４３０）又は０．１６μＬの抗ヒトＣＤ３−ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＳＰ３４−２、マウスＩｇＧ１κ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５５７７４９、Ｌｏｔ３３３２４５９７）、０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４５−ＡＦ４８８（クローンＨＩ３０、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０４０１７）又は０．１２μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ５６−ＦＩＴＣ（クローンＮＣＡＭ１６．２、マウスＩｇＧ２ｂκ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３４５８１１）又は１μＬの抗ヒトＣＤ５６−ＡＰＣ（クローンＢ１５９、マウスＩｇＧ１ κ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５５５５１８、Ｌｏｔ３０９８８９４）、０．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３００５３２）又は０．２３μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ４−ＢＶ４２１（クローンＯＫＴ４、マウスＩｇＧ２ｂκ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３１７４３４）、０．２５μＬの抗ヒトＣＤ８ａ−ＡＰＣ（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５５５３６９）又は０．６７μＬの抗ヒトＣＤ８ａ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０１０１６）又は０．８３ｎｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８ａ−ＢＶ７１１（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０１０４４）及び５μｇ／ｍＬのＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９ １１６ ０９８ ｏｒ １０９ １１６ １７０）を含む、５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファーで染色した。細胞をＦＡＣＳバッファーで二度洗浄した。定着可能な生存能力染料で染色する場合、細胞は、１％のホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ、ＨＴ５０１３２０−９．５Ｌ）で固定した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、翌日又は同日に、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又は３レーザーＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＦｌｏｗ Ｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ Ｘ １０．０．７）を用いて獲得した。ＤＡＰＩ染色を使用して死細胞を検出する場合、細胞は、０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓｃ−３５９８）を含む８０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて獲得した。
【0518】
図６に示すように、ＦＡＰ標的化又は非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子はいずれも、休止ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合せず、休止ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＮＫ細胞に対する検出可能な結合を示さなかった。対照的に、両方のコンストラクトは、活性化ＮＫ、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔ細胞に強力に結合したが、ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＮＫ細胞と比較した場合、その約１０分の一に相当する低い特異的蛍光を示し、ＣＤ８＋ Ｔ細胞と比較した場合、特異的蛍光の強度はその２０分の一に低下した。
【0519】
図７Ａ及び７Ｂは、実施例１で調製されたコンストラクト１．１から１．１０の、４−１ＢＢ発現活性化ヒトＣＤ３＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞及び４−１ＢＢ発現活性化ヒトＣＤ３＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞に対する結合をそれぞれ示している。表３５は、コンストラクト１．１から１．１０について測定されたＥＣ５０値を示している。
【0520】
表３５：活性化ヒトＣＤ３＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ３＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0521】
図８Ａ及び８Ｂは、実施例２で調製されたコンストラクト２．１、２．３、２．４、２．５及び２．６の、新鮮なヒト血液由来のＣＤ４＋及びＣＤ８＋、及び活性化４−１ＢＢ発現ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合をそれぞれ示している。生存ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ４＋又はＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞にゲートを設定し、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ 抗ヒトＩｇＧ ＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片のＭＦＩを、標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合変異体の滴定濃度に対してブロッティングした。表３６は、コンストラクト２．１、２．３、２．４、２．５及び２．６について測定されたＥＣ５０値を示している。
【0522】
表３６：活性化４−１ＢＢ発現ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0523】
５．２ 活性化マウス脾細胞に対するＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の結合マウスの脾臓を３ｍＬのＰＢＳ中に収集し、単一細胞の懸濁液を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｃａｔ．−Ｎｏ．１３０−０９６−３３４）及びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて生成した。その後、脾細胞を、３０μｍのＰｒｅ−Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｃａｔ．−Ｎｏ．１３０−０４１−４０７）を通して濾過し、７分間３５０×ｇ及び４℃で遠心分離した。上清を吸出し、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭの非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノール及び１０％のＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｐ４３３３）を供給したＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。１０６個の細胞／ｍＬを、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３ε Ａｒｍｅｎｉａｎ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００３３１）及び２μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８ Ｓｙｒｉａｎ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ（クローン３７．５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０２１０２）でコーティングした６ウェル組織培養プレートにおいて２日間培養した。
【0524】
活性化マウス脾細胞を、採取し、ＤＰＢＳ中で洗浄し、数え、０．１ｘ１０６個の細胞を、９６Ｕ字底型非組織培養物処理ウェルプレートの各ウェルに移した。上清を取り除き、細胞を、１：５０００に希釈されたＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦ６６０（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ−Ｎｏ．６５−０８６４−１８）を含む１００ｕＬ／ウェルのＤＰＢＳ中において３０分間４℃で染色した。細胞を、ＰＢＳで洗浄し、異なる濃度のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体）、非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体）又は抗マウスＣＤ１３７ ヒトＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ｍＡｂ（クローンＬｏｂ．１２．３、ＢｉｏＸｃｅｌｌ Ｃａｔａｌｏｇ＃：ＢＥ０１６９）を含む５０ｕＬのＦＡＣＳバッファー中において染色した。細胞を、１２０分間４℃でインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳバッファーで四度洗浄し、１０μｇ／ｍＬの精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ラットＩｇＧ−Ｆｃ−Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５５３１４２ クローン２．４Ｇ２）、５μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ８ｂラットＩｇＧ２ｂκ−ＦＩＴＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１２６６０６、クローンＹＴＳ１５６．７．７）、０．６７μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３ラットＩｇＧ２ｂκ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００２２２、クローン１７Ａ２）、０．６７μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ４ラットＩｇＧ２ｂκ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００４２２、クローンＧＫ１．５）、２μｇ／ｍＬの抗マウスＮＫ１．１マウス（Ｃ３Ｈ×ＢＡＬＢ／ｃ）ＩｇＧ２ａκ−ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０８７２８、クローンＰＫ１３６）及び１０μｇ／ｍＬのＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅポリクローナルＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異性で、ウシ、マウス及びウサギ血清タンパク質に対して最小交差反応性）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０９−１１６−１７０）を含む５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファー中において３０分間４℃で染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルの冷たいＦＡＣＳバッファーで二度洗浄した。細胞を、１％のホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定した。細胞を、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、翌日５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて獲得した。
【0525】
図９に示すように、ＦＡＰ標的化ｈｕ４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂ｈｕ４−１ＢＢＬ三量体）及び非標的化ｈｕ４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂ｈｕ４−１ＢＢＬ三量体）は、マウス４−１ＢＢに結合しない。したがって、免疫担当マウスで活性化を試験することはできない。インビボモードの行動研究のためには、図３に示すように、免疫能力のないマウスにおけるヒト化マウスモデル又はマウス４−１ＢＢＬ三量体を含むサロゲートが使用されなければならない。
【0526】
５．３ ＦＡＰ発現腫瘍細胞に対する結合ＦＡＰ発現細胞の結合アッセイのために、ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３（Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991, 48（1）, 85-91参照）、ＷＭ−２６６−４（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−１６７６）又はＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞株を使用した。後者の細胞株を生成するために、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞にヒトＦＡＰ（ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９）をトランスフェクトした。細胞は、ＣＭＶプロモーターの下、マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）への発現ｐＥＴＲ４９２１プラスミドコード化ヒトＦＡＰのトランスフェクションにより生成した。細胞を、１．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．：抗ｐｒ−５）の存在下に維持した。０．１ｘ１０６個のＦＡＰ発現腫瘍細胞を、丸底サスペンジョン細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５０１８５）の各ウェルに加えた。細胞を、２００μＬのＤＰＢＳで一度洗浄し、ペレットを再懸濁した。１：５０００に希釈されたＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ｅＦｌｕｏｒ ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５−０８６３−１８）又はＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ ｅＦｌｕｏｒ ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５−０８６４−１８）を含む、１００μＬ／ウェルの４℃の冷たいＤＰＢＳバッファーを加え、ププレートを、３０分間４℃でインキュベートした。細胞を、２００μＬの４℃の冷たいＤＰＢＳバッファーで一度洗浄し、異なる濃度の滴定された４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を含む、５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファー（２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｅ１７７）、及び７．５ｍＭのアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ２００２）を補ったＤＰＢＳ） に再懸濁し、その後１時間にわたる４℃でのインキュベーションを行った。２００μＬ／ウェルで四度の洗浄後、細胞を、３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０９−０９６−０９８）又は５μｇ／ｍＬのＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｇγ−断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９−１１６−０９８又は１０９−１１６−１７０）を含む５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファーで３０分間４℃で染色した。細胞を、２００μＬの４℃のＦＡＣＳバッファーで二度洗浄し、次いで１％のホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳに再懸濁した。同日又は翌日、細胞を１００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又は３レーザーＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＦｌｏｗ Ｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ Ｘ １０．０．７）を用いて獲得した。
【0527】
図１０に示すように、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体）コンストラクト１．１は、非標的化ＤＰ４７−Ｆａｂ含有コンストラクト（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体）コントロールＡとは異なり、効率的にヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）発現メラノーマ（１０Ａ）ＭＶ−３細胞又は（１０Ｂ）ＷＭ−２６６−４細胞に結合した。
【0528】
図１１Ａは、実施例１で調製されたコンストラクト１．１から１．１０の、ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマＭＶ−３細胞に対する結合を示し、図１１Ｂには、コンストラクト１．１．、１．２、１．３及び１．５の、ヒトＦＡＰ発現ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９トランスフェクトマウス胚性線維芽細胞に対する結合を提示する。表３７は、コンストラクト１．１から１．１０について測定されたＥＣ５０値を示す。
【0529】
表３７：ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0530】
図１２は、異なるＦＡＰ（４Ｂ９）標的化又は非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトの、ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマＭＶ−３細胞（図１２Ａ）及びＷＭ−２６６−４細胞（図１２Ｂ）に対する結合を示している。コンストラクト２．１、２．３、２．４、２．５及び２．６は、実施例２に記載のように調製され、コントロールは、上述のように調製された。ゲートを生存腫瘍細胞上に設定し、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片のＭＦＩを、標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合コンストラクトの滴定濃度に対してブロッティングした。表３８は、測定されたＥＣ５０値を示す。
【0531】
表３８：ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0532】
５．４ マウス標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の機能的特徴付け５．４．１ 活性化マウス脾細胞に対する結合
マウスの脾臓を３ｍＬのＰＢＳ中に収集し、単一細胞の懸濁液を、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳチューブ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｃａｔ．−Ｎｏ．１３０−０９６−３３４）及びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ Ｏｃｔｏ Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて生成した。その後、脾細胞を、３０μｍのＰｒｅ−Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｃａｔ．−Ｎｏ．１３０−０４１−４０７）を通して濾過し、７分間３５０×ｇ及び４℃で遠心分離した。上清を吸出し、細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸、５０μＭのβ−メルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ １６４０培地に再懸濁した。
【0533】
新鮮なマウス脾細胞上における結合を直接用いた。Ｔ細胞上にマウス４−１ＢＢ発現を誘導するために、マウス脾細胞を以下のように活性化した。１０６個の細胞／ｍＬを、１０μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３ε Ａｒｍｅｎｉａｎ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００３３１）及び２μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ２８ Ｓｙｒｉａｎ Ｈａｍｓｔｅｒ ＩｇＧ（クローン３７．５１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０２１０２）でコーティングした６ウェル組織培養プレートにおいて２日間培養した。
【0534】
新鮮なマウス脾細胞又は活性化マウス脾細胞を収集し、ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１４１９０−１３６）中において洗浄し、数え、０．１ｘ１０６個の細胞を９６Ｕ字底型非組織培養処理ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ，ｃｅｌｌ ｓｔａｒ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５０１８５）の各ウェルに移した。上清を取り除き、細胞を、１：１０００に希釈されたＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌ３４９５７）を含む、１００ｕＬ／ウェルの４℃の冷たいＤＰＢＳ中において、３０分間４℃で染色した。細胞を、冷たいＤＰＢＳで洗浄し、異なる濃度のマウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子又はマウスＩｇＧ１ κアイソタイプコントロール（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．４００１５３、クローンＭＯＰＣ−２１）を含む、５０ｕＬ／ウェルの冷たいＦＡＣＳバッファー（２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１７７）及び７．５ｍＭ アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）中で染色した。細胞を、１２０分間４℃でインキュベートし、冷たいＤＰＢＳで四度洗浄し、３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃ−ガンマ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１１５−０９６−０７１）を含む５０μＬ／ウェルの冷たいＦＡＣＳバッファー中で３０分間４℃で染色した。その後、細胞を、冷たいＤＰＢＳで二度洗浄し、１０μｇ／ｍＬの精製抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２ラットＩｇＧ−Ｆｃ−Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５５３１４２クローン２．４Ｇ２）、０．６７μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ８ａ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００７１４、クローン５３−６．７）、０．６７μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３ε−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００３２８、クローン１４５−２Ｃ１１）、０．６７μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ４ラットＩｇＧ２ｂκ−ＰＥ−Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００４２２、クローンＧＫ１．５）を供給した５０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで３０分間４℃で染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルの冷たいＤＰＢＳで二度洗浄し、１％のホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。細胞を、３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＦｌｏｗ Ｊｏ ｖ１０．０．７（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて獲得した。ゲートを、ＣＤ３＋ ＣＤ８＋又はＣＤ３＋ ＣＤ４＋ Ｔ細胞上に設定し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃ−ガンマ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を分析し、ブランクコントロール（マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子を付加しない）のＭＦＩを差し引くことにより正規化した。ＭＦＩを、使用したマウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の濃度に対してブロッティングし、マウス４−１ＢＢ細胞結合分子に対する結合を示した。
【0535】
図１３に示すように、マウス４−１ＢＢＬコンストラクトＭ．１及びＭ．２、並びに対応するコントロール分子のコントロールＭ．１及びコントロールＭ．２は、極めて類似した親和性でマウス４−１ＢＢに結合する。表３９は、コンストラクトＭ．１及びＭ．２と、コントロール分子について測定されたＥＣ５０値を示す。
【0536】
表３９：活性化４−１ＢＢ発現ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0537】
５．４．２ ＦＡＰ発現腫瘍細胞に対する結合ＦＡＰ発現細胞の結合アッセイのために、ヒトメラノーマ細胞株ＭＶ−３（Ruiter et al., Int. J. Cancer 1991, 48（1）, 85-91参照）、及びＷＭ−２６６−４（ＡＴＴＣ ＣＲＬ−１６７６）を使用した（抗ＦＡＰ特異的クローン２８Ｈ１はマウス／ヒト交差反応性である）。０．１ｘ１０６個のＦＡＰ発現腫瘍細胞を、丸底サスペンジョン細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５０１８５）の各ウェルに加えた。細胞を、２００μＬの冷たいＤＰＢＳで一度洗浄し、１：１０００に希釈されたＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌ３４９５７）を含む、１００μＬ／ウェルの４℃の冷たいＤＰＢＳバッファーに再懸濁し、３０分間４℃でインキュベートした。細胞を、２００μＬの冷たいＤＰＢＳバッファーで一度洗浄し、一連の濃度でマウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子を含む５０μＬ／ウェルの冷たいＦＡＣＳバッファー（２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８）（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ１７７）及び７．５ｍＭのアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）に再懸濁した後、１時間４℃でインキュベートした。１ウェル当たり２００μＬのＤＰＢＳで四度洗浄した後、細胞を、３０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃ−ガンマ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１１５−０９６−０７１）を含む、５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファーで３０分間４℃で染色した。細胞を、２００μＬ／ウェルの冷たいＤＰＢＳバッファーで二度洗浄し、１％のホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳで固定し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁した。細胞を、３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＦｌｏｗ Ｊｏ ｖ１０．０．７（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて獲得した。ゲートを生存細胞上に設定し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇＧ Ｆｃ−ガンマ特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を分析し、ブランクコントロール（マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子を付加しない）のＭＦＩを差し引くことにより正規化した。ＭＦＩを、使用したマウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の濃度に対してブロッティングし、マウス４−１ＢＢ細胞結合分子に対する結合を示した。予想されるように、マウス４−１ＢＢＬコンストラクトＭ．１及びＭ．２は、極めて類似した親和性でＦＡＰに結合し、一方コントロール分子は結合しない。
【0538】
図１４は、ＦＡＰ標的化又は非標的化分裂三量体マウス４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）コンストラクトＭ．１及びＭ．２の、ヒト−ＦＡＰ発現ヒトメラノーマＭＶ−３細胞（図１４Ａ）及びＷＭ−２６６−４細胞（図１４Ｂ）に対する結合を示す。表４０は、測定されたＥＣ５０値を示す。
【0539】
表４０：ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0540】
実施例６標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生物活性
６．１．ヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化
ヒト４−１ＢＢ及びＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞の生成
頸部癌細胞株であるＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）に、発現ベクターｐＥＴＲ１０８２９に基づくプラスミドを形質導入した。これは、ＣＭＶ−プロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子の制御下にあるヒト４−１ＢＢ（Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ０７０１１）の配列を含む。細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ及び３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補ったＤＭＥＭ培地で培養した。
【0541】
４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、４−１ＢＢの発現についてフローサイトメトリーにより試験した。０．２ｘ１０６個の生存細胞を、０．１μｇのＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲート抗ヒト４−１ＢＢマウスＩｇＧ１κクローン４Ｂ４−１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０９８１４）又はそのアイソタイプコントロール（ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５コンジュゲートマウスＩｇＧ１κアイソタイプコントロール抗体クローンＭＯＰＣ−２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ Ｃａｔ．−Ｎｏ．４００１５０）を含む１００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、３０分間４℃でインキュベートした。細胞を、ＦＡＣＳバッファーで二度洗浄し、０．０６μｇのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓｃ−３５９８）を含む３００μＬのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＩＶＡソフトウェア）を用いて獲得した。限界希釈を実施して、記載のように単一クローンを生成した：ヒト−４−１ＢＢ形質導入ＨｅＬａ細胞を、１０、５及び２．５個の細胞／ｍＬの濃度となるまで培地に再懸濁し、２００μｌの細胞懸濁液を丸底組織培養処理９６ウェルプレート ６のプレート／細胞の濃度、ＴＰＰ Ｃａｔ．−Ｎｏ．９２６９７）に移した。上述のように、単一のクローンを採取し、拡大し、４−１ＢＢ発現について試験した。４−１ＢＢの発現が最高であったクローン（クローン５）を、その後のＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ発現−ベクター５４９５ｐ Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ ＨｙｇＢのトランスフェクションのために選択した。ベクターは、トランスフェクトされた細胞に、ＮＦ−ｋＢ−応答要素（ＨｙＢ耐性が導入されたバックボーンベクターＰａｎｏｍｉｃｓ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．ＬＲ００５１）の制御下において、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂに対する耐性と、ルシフェラーゼ発現能の両方を付与する。ヒト−４−１ＢＢ ＨｅＬａクローン５細胞を、７０％コンフルエントになるまで培養した。５０μｇ（４０μＬ）の直線化された（制限酵素ＡｓｅＩ及びＳａｌＩ）５４９５ｐ Ｔｒａｎｌｕｃｅｎｔ ＨｙｇＢ発現ベクターを、滅菌された０．４ｃｍのＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ／ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒ Ｃｕｖｅｔｔｅ（Ｂｉｏｒａｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ，１６５−２０８１）に加えた。４００μｌのサプリメントフリーＤＭＥＭ培地中、２．５ｘ１０６個のヒト−４−１ＢＢ ＨｅＬａクローン５細胞を加え、プラスミド溶液と注意深く混合した。細胞のトランスフェクションを、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ Ｘｃｅｌｌトータルシステム（Ｂｉｏｒａｄ，Ｃａｔ−Ｎｏ．１６５−２６６０）を用いて、以下の設定、即ち、指数形パルス、キャパシタンス５００μＦ、電圧１６０Ｖ、抵抗∞下において実施した。パルスの直後に、トランスフェクトされた細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給した、１５ｍＬの３７℃の温かいＤＭＥＭ培地を有する７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（ＴＰＰ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．９００７５）に移した。翌日、３μｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ及び２００μｇ／ｍＬのＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ（Ｒｏｃｈｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０８４３５５５００１）を含む培地を加えた。生存細胞を拡大し、上述のように限界希釈を実施して、単一クローンを生成した。
【0542】
クローンを、４−１ＢＢ発現について上述のように試験し、ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼ活性について以下のように試験した。クローンを、選択培地において採取し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｖｉ−ｃｅｌｌ ｘｒ ２．０３（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．７３１０５０）を用いて数えた。細胞を、０．３３ｘ１０６個の細胞／ｍＬの細胞密度に設定し、１５０μＬのこの細胞懸濁液を、蓋付きの滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５５０８３）の各ウェルに、及びコントロールとして正規の９６ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰ Ｃａｔ．−Ｎｏ．９２０９６）の各ウェルにそれぞれ移し、生存及び細胞密度を翌日試験した。細胞を、３７℃及び５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる濃度の組み換えヒト腫瘍壊死因子アルファ（ｒｈＴＮＦ−α、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３００−０１Ａ）を含む５０μＬの培地を、９６ウェルプレートの各ウェルに加え、ｒｈＴＮＦ−αの最終濃度を１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び０ｎｇ／ウェルとした。細胞を、６時間３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートし、次いで２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで二度洗浄した。Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ−Ｎｏ：Ｅ３９７１）を、各ウェルに加え（４０μｌ）、プレートを一晩−２０℃で貯蔵した。翌日、凍結した細胞プレート及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ １０００ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｅ４５５０）を、室温に温めた。１００ｕＬ の検出バッファーを各ウェルに加え、プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａ×Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及びＳｏｆｔＭａ×Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて可能な限り迅速に測定した。コントロール（ｒｈＴＮＦ−αなし）を上回る５００ｍｓ／ウェル（ＵＲＬ）の放出光の測定された単位を、ルシフェラーゼ活性とした。最も高いルシフェラーゼ活性及び有意なレベルの４−１ＢＢ−発現を呈したＮＦ−κＢ−ｌｕｃ−４−１ＢＢ−ＨｅＬａクローン２６を、さらなる使用のために選択した。
【0543】
ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養されたヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼヒト−４−１ＢＢ ＨｅＬａ細胞を採取し、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に、０．２ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度となるように再懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌ（２ｘ１０４個の細胞）を、蓋付き滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定濃度のＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体）又はＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体）を含む５０μＬの培地を加えた。ＦＡＰ発現腫瘍細胞（ＭＶ３、ＷＭ−２６６−４又はＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９）を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に、細胞２ｘ１０６個／ｍＬの濃度となるように再懸濁した。
【0544】
ＦＡＰ発現腫瘍細胞（５０μｌ、最終比１：５）の懸濁液又は培地のみを各ウェルに加え、プレートを６時間３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで二度洗浄した。４０μｌの新しく調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ−Ｎｏ：Ｅ３９７１）を各ウェルに加え、プレートを一晩−２０℃で貯蔵した。翌日、凍結した細胞プレート及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ １０００ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｅ４５５０）を、室温で温めた。１００μＬの検出バッファーを各ウェルに加え、ルシフェラーゼ活性を、ＳｐｅｃｔｒａＭａ×Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダーと、発光をＵＲＬ（０．５秒／ウェルの放出光の単位）でカウントするＳｏｆｔＭａ×Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）、又はＶｉｃｔｏｒ３ １４２０ マルチラベルカウンタープレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）と、カウント毎秒（ＣＰＳ）として発光をカウントするＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２０３０ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄを用いて測定し、試験したコンストラクトの濃度に対してブロッティングした。
【0545】
ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体）は、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の存在下において、レポーター細胞株内のＮＦκＢシグナル伝達経路の活性化をトリガーした。対照的に、同じ分子の非標的化変異体は、試験された濃度のいずれにおいてもそのような効果をトリガーできなかった（図１６）。ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の存在下においてさえも、ＦＡＰ陰性腫瘍細胞と共にＮＦ−ｋＢレポーター細胞株を培養した場合にＮＦ−ｋＢ活性化は検出できず、このような標的化４−１ＢＢＬの活性は、腫瘍細胞の細胞表面におけるＦＡＰの発現に依存していた。コンストラクト１．１から１．１０について測定された活性を図１７に示し、コンストラクト２．１、２．４及び２．５について測定されたデータを図１８に提示する。
【0546】
６．２．カニクイザル ４−１ＢＢを発現するＨＥＫ Ｔ２９３細胞におけるＮＦκＢ活性化カニクイザル４−１ＢＢ及びＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨＥＫ Ｔ２９３細胞の生成
ウイルス様粒（ＶＬＰ）の生成のために、ヒト胎児性／胚性腎臓（ＨＥＫ）Ｔ２９３／１７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８）に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＬＴＸ ＲｅａｇｅｎｔとＰＬＵＳTM Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１５３３８１００）とを用いてＮＦκＢ−ルシフェラーゼ−ＩＲＩＳ−ＧＦＰレポーター遺伝子カセット（ＮＦκＢ−ｌｕｃ−ＧＦＰ）をコードするベクターｐＥＴＲ１４３７２を、製造者のプロトコールに従ってトランスフェクトした。６時間後、１０％のＦＢＳ培地を供給したＤＭＥＭの交換を実施し、ＶＬＰを４日後に採取した。新鮮なＨＥＫ ２９３Ｔ細胞に、生成されたｐＥＴＲ１４３７２−ＶＬＰ及び４μｇ／ｍＬのポリブレンを、７０〜８０％の培養密度で形質導入した。細胞を、２４時間培養し、培地交換を実施した。形質導入ＨＥＫ Ｔ２９３／１７細胞を採取し、安定な単一クローンについてスクリーニングするために、１個の細胞／ウェルの限界希釈を実施した。培地中において単一クローンを２５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ Ｉｎｃ． Ｃａｔ．−Ｎｏ．３００−０１Ａ）で刺激し、Ｉｎｃｕｙｔｅ Ｚｏｏｍ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて経時的に陽性のＧＦＰシグナルについてスクリーニングした。ＧＦＰシグナル記録細胞を、製造者のプロトコールに従ってＮａｎｏ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎ１１２０）を用いて、ルシフェラーゼ活性について試験した。ルシフェラーゼ活性は、Ｖｉｃｔｏｒ３ １４２０マルチラベルカウンタープレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及びＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２０３０ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて測定された。発光は、１ウェルにつき０．５秒間、カウント毎秒（ＣＰＳ）でカウントされた。クローン６１は、ＴＮＦ−α活性化の後に、ＧＦＰ及びルシフェラーゼの最も高い発現を示し、レポーター細胞株生成のためにさらに使用された。
【0547】
上述のように、新規のＶＬＰを、カニクイザル４−１ＢＢをコードするベクターｐＥＴＲ１４８７９を用いて生成し、ピューロマイシン耐性及びＨＥＫ ２９３Ｔ ＮＦκＢ−ｆｌｕｃ−ＧＦＰ クローン６１細胞株に、生成されたｐＥＴＲ１４８７９−ＶＬＰ及び４μｇ／ｍＬのポリブレンを、７０〜８０％の培養密度で形質導入した。細胞を、２４時間培養し、培地交換を実施した。形質導入の四日後、細胞を、１％のＦＢＳを含むＤＰＢＳ中において、ＰＥコンジュゲート抗ヒトカニクイザル−交差反応性４−１ＢＢ抗体（マウスＩｇＧ１κ、クローンＭＯＰＣ−２１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０９８０４）で染色し、ＦＡＣＳ（ＡＲＩＡ、ＢＤ）によりソートし、１μｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎｅを含む１０％のＦＢＳ培地を供給したＤＭＥＭ中において、５細胞／ウェルで播種した（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．ａｎｔ−ｐｒ）。増殖するクローンを、ＴＮＦ−α刺激後のＧＦＰ及びルシフェラーゼ活性について、並びに高いカニクイザル ４−１ＢＢ発現について記載したように、フローサイトメトリーにより試験した。二重陽性クローンを、一価のＦＡＰ標的化コンストラクト２．１又はコントロールＢ及びＦＡＰ発現ＭＶ−３又はＷＭ−２６６−４細胞の存在下におけるルシフェラーゼ活性のために選択し、試験した。ＨＥＫ Ｔ２９３／１７−ＮＦ−κＢ−ｌｕｃ−ＧＦＰ−ｃｙ４−１ＢＢ発現クローン６１−１３を選択し、さらなる実験に使用した。
【0548】
ＦＡＰ発現腫瘍細胞と共培養されたカニクイザル ４−１ＢＢを発現するＨＥＫ Ｔ２９３／１７レポーター細胞のＮＦκＢ活性化ＨＥＫ Ｔ２９３／１７−ＮＦκＢ−ｌｕｃ−ＧＦＰ−ｃｙ４−１ＢＢ発現クローン６１−１３細胞を採取し、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に、０．２ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度となるように再懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌ（２ｘ１０４個の細胞）を、蓋付き滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、異なる滴定濃度のＦＡＰ標的化又は非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を含む培地５０μＬを加えた。ＦＡＰ発現腫瘍細胞（ＭＶ３及びｂＷＭ−２６６−４）を、２ｘ１０６個の細胞／ｍＬの濃度となるように、培地に再懸濁した。ＦＡＰ発現腫瘍細胞懸濁液（５０μｌ）を各ウェルに加え、プレートを６時間３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。このアッセイの原理を図１９に示す。インキュベーション後、細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで三度洗浄した。４０μｌの新しく調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ−Ｎｏ：Ｅ３９７１）を各ウェルに加え、プレートを一晩−２０℃で貯蔵した。翌日、凍結した細胞プレート及び検出バッファー（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ １０００ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｅ４５５０）を室温に温めた。１００μＬの検出バッファーを各ウェルに加え、ルシフェラーゼ活性を、ＳｐｅｃｔｒａＭａ×Ｍ５／Ｍ５ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）マイクロプレートリーダー（５００ｍｓ積分時間刻み、全波長収集フィルターなし）を用いて可能な限り迅速に測定した。発光を、０．５秒／ウェルで放出光の単位（ＵＲＬ）でカウントし、試験されたＦＡＰ標的化又は非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の濃度に対してブロッティングした。実施例２のコンストラクトの結果を図２０に示す。
【0549】
６．３ 抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞に基づくアッセイ抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の単離及び培養
新鮮な血液を、ＨＬＡ−Ａ２＋ ＣＭＶに感染したボランティアから得た。ＰＢＭＣを、上述のように単離した。ＣＤ８ Ｔ細胞を、製造者の推奨に従ってネガティブ選択ヒトＣＤ８ Ｔ細胞単離キットを用いて（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０−０９４−１５６）、ＰＢＭＣから精製した。一千万個の単離されたＣＤ８ Ｔ細胞を、ＣＭＶから得られたＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｆ００８−２Ｂ）を含む５０μＬのＰＥ標識されたＨＬＡ−Ａ２−五量体と共に１％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを補った１ｍＬの滅菌ＤＰＢＳに再懸濁し、１０分間室温でインキュベートした。細胞を、１％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを供給した３ｍＬの滅菌ＤＰＢＳで二度洗浄した。細胞を、１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８−ＦＩＴＣ（クローンＬＴ８、Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａｂ２８０１０）を含む１％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを供給した１ｍＬの細胞ＤＰＢＳに再懸濁し、３０分間４℃でインキュベートした。細胞を、二度洗浄し、５ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度となるように、１％（ｖ／ｖ）のＦＢＳを供給したＤＰＢＳに再懸濁し、３０μｍの事前分離ナイロンネット細胞ストレーナー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１３０−０４１−４０７）を通して濾過した。ＮＬＶ−ペプチド特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＡＲＩＡセルソーター（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、以下の設定で、ＦＡＣＳソーティングにより単離した：１００μｍノズル及び純度ソートマスク。ソートされた細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ及び４００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給した５ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を含む１５ｍｌのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ，Ｃａｔ．Ｎｏ．９１０１５）に収集した。ソートされた細胞を、７分間３５０×ｇ及び室温で遠心分離し、０．５３ｘ１０６細胞／ｍＬの濃度となるように、同培地に再懸濁した。この細胞懸濁液１００μＬ／ウェルを、事前に調製されたフィーダープレートの各ウェルに加えた。
【0550】
ＰＨＡ−Ｌ活性化照射同種異系フィーダー細胞を、先述のようにＰＢＭＣから調製し（Levitsky et al., 1998）、９６ウェル培養プレートに、１ウェル当たり２ｘ１０５個のフィーダー細胞に分配した。
【0551】
培養の一日後、１００μＬの培地／ウェルを、ソートされたＣＤ８＋ Ｔ細胞を含むウェルから除去し、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ及び４００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを補った新規のＲＰＭＩ １６４０培地により置き換え、これを培養中定期的に繰り返した（２〜４日毎）。細胞は、増殖を開始するとすぐに、２４ウェル平底組織培養プレート（ＴＰＰ、９２０２４）に移した。細胞を、拡大／分裂させ、新規のフィーダー細胞調製物で定期的に再活性化した。
【0552】
抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の活性化アッセイＭＶ３細胞を採取し、ＤＰＢＳで洗浄し、２ｘ１０７個の細胞を、２５０μＬのＰＫＨ−２６ Ｒｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ＣｅｌｌリンカーＫｉｔ（Ｓｉｇｍａ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．ＰＫＨ２６ＧＬ）のＣ希釈剤に再懸濁した。１μＬのＰＫＨ２６−Ｒｅｄ−染色溶液を、２５０μＬのＣ希釈剤で希釈し、ＭＶ３細胞の懸濁液に加え、次いでこれを５分間室温で暗所でインキュベートした。続いてこれに０．５ｍＬのＦＢＳを加え、細胞を１分間インキュベートし、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを補ったＲＰＭＩ １６４０からなるＴ細胞培地で一度洗浄した。１ｘ１０６個のＭＶ３細胞／ｍＬを、Ｔ細胞培地に再懸濁し、三つの管に分けた。合成ＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチド（シンクペプチド（ｔｈｉｎｋｐｅｐｔｉｄｅ）から得た）を、最終濃度が１ｘ１０−９Ｍ又は１ｘ１０−８Ｍとなるように加え、細胞を、９０分間インキュベートした。ＭＶ３細胞を、Ｔ細胞培地で一度洗浄し、密度が０．５ｘ１０６細胞／ｍＬとなるように再懸濁し、９６ウェル丸底細胞懸濁プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５０１８５）に分配し（１００μＬ／ウェル）、一晩３７℃及び５％のＣＯ２でインキュベートした。このアッセイの原理を図２１に示す。
【0553】
翌日、異なる滴定濃度の標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を含むＴ細胞培地５０μＬ／ウェルを加えた。ＮＬＶ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞を採取し、ＣＦＤＡ−ＳＥ（５（６）−カルボキシフルオレセイン二酢酸−Ｎ−スクシンイミジルエステル、ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．２１８８８−２５ＭＧ−Ｆ）を、最終濃度が４０ｎＭとなるように加え、細胞を、回転下で１５分間３７℃でインキュベートした。ＦＢＳを加えることにより標識化を停止し、細胞を、洗浄し、最終濃度が０．１２５ｘ１０６細胞／ｍＬとなるようにＴ細胞培地に再懸濁した。５０μＬのこのＣＦＳＥ−標識ＣＤ８ Ｔ細胞懸濁液を各ウェルに加えた（最終的なＥ：Ｔ比＝１：８）。細胞プレートを２４時間インキュベートし、５０μＬ／ウェルを除去し、２．６４μＬ／ｍＬのＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（Ｍｏｎｅｓｉｎを含むタンパク質輸送阻害剤、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５５４７２４）を含む５０μＬのＴ細胞培地を、各ウェルに加えた（最終濃度 ０．６６μＬ／ｍＬ）。細胞を４時間インキュベートした後、プレートを、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄し、１：５０００に希釈されたＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ−ｅＦ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５−０８６４）を含む１００μＬ／ウェルの４℃のＤＰＢＳで３０分間４℃で染色した。細胞プレートを、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで洗浄した後、蛍光性染料コンジュゲート抗体、即ち、抗ヒトＣＤ１３７−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５（クローン４Ｂ４−１、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０９８１４）、抗ヒトＣＤ８−ＢＶ６０５（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０１０１２）又は０．６７μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ８ａ−ＡＰＣ／Ｃｙ７（クローンＲＰＡ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０１０１６）及び抗ヒトＣＤ２５ ＰＥ／Ｃｙ７（クローンＢＣ９６、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０２６１２）で染色した。３０分間４℃でのインキュベーション後、細胞を、２００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーで二度洗浄し、５０μＬ／ウェルの新しく調製したＦｏｘＰ３ Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃａｔ．−Ｎｏ．００−５１２３及び００−５２２３）に再懸濁し、３０分間４℃でインキュベートした。プレートを、２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍバッファー（２％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｗ／ｖ）のサポニン（Ｓｉｇｍａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓ７９００）及び１％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ２００２）を供給したＤＰＢＳ）で二度洗浄し、０．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩＦＮγ−ＡＰＣ（クローンＢ２７、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５０６５１０）又は０．３３μｇ／ｍＬの抗ヒトＩＦＮγ−ＢＶ５１０（クローン４Ｓ．Ｂ３、マウスＩｇＧ１κ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５０２５４３）を含む５０μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．００−８３３３−５６）で染色した。プレートを、１時間４℃でインキュベートし、２００μＬ／ウェルのＰｅｒｍ−Ｂｕｆｆｅｒで二度洗浄した。固定化のために、１％のホルムアルデヒドを含む５０μＬ／ウェルのＤＰＢＳを加えた。同日又は翌日、細胞を、１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又は３レーザーＭｉｌｔｅｎｙｉ Ｑｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及びＦｌｏｗ Ｊｏ（ＦｌｏｗＪｏ Ｘ １０．０．７）を用いて獲得した。
【0554】
コンストラクト１．１から１．１０について図２２及び２３に、コンストラクト２．１、２．３及び２．４について図２４及び２５に示すように、抗原特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞（非刺激コントロール以外）は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体）の存在下において、表面４−１ＢＢ発現のレベルの上昇を呈した。このような４−１ＢＢＬの効果は、用量依存性であり、非標的化コントロール分子の付加が４−１ＢＢ発現のレベルに影響しなかったことから、ＦＡＰ標的化を必要とした。さらに、比較的高いペプチド濃度で活性化されたＴ細胞（１ｘ１０−８Ｍ）は、ＦＡＰ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂４−１ＢＢＬ三量体）の存在下において、ＩＮＦγの持続性の分泌を示した。つまり、これらデータは、抗原標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子が、表面表現型及び標的化依存性の抗原特異的Ｔ細胞の応答性を調節することを示している。
【0555】
６．４ 細胞標的化及び非標的化マウス４−１ＢＢＬＦｃ融合抗原結合分子の比較標的化及び非標的化マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＦＡＰ分裂マウス４−１ＢＢＬ三量体及びＤＰ４７分裂 マウス４−１ＢＢＬ三量体）を、実施例１．３に記載のように調製した。
【0556】
細胞標的化及び非標的化マウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子のバイオ活性を比較するために、Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｄｙｅ ｅＦｌｏｕｒ６７０標識化（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５−０８４０−９０）又はＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ色素標識化（Ｃｅｌｌ ｔｒａｃｅｒ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｃ３４５５７）新規マウス脾細胞を、３〜４日間、９６ウェル組織培養Ｕ字底型プレート（ＴＴＰ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．９２０９７）において、接着性の５０Ｇｙ照射ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（生成について５．３参照）と共に、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸及び５０μＭのβ−メルカプトエタノールを供給したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．４２４０１−０４２）中で、０．５μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ３ ＳｙｒｉａｎハムスターＩｇＧ（クローン１４５−２Ｃ１１、ＢＤ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５５３０５７）及び一定の濃度範囲で加えられた図示の薬物候補分子の存在下において共培養した（図２６）。三日又は四日後、細胞を、ＦＡＣＳバッファーで洗浄し、抗マウスＣＤ８ラットＩｇＧ２ａ−ＢＶ７１１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００７４７、クローン５３−６．７，）及び抗マウスＣＤ４ラットＩｇＧ２ａ−ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１００５４４、クローンＲＭ４−５）及び０．６７μｇ／ｍＬの抗マウスＣＤ１３７（４−１ＢＢ）ＳｙｒｉａｎハムスターＩｇＧ−ＰＥ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０６１０６、クローン１７Ｂ５）及び抗マウスＣＤ２５−ＰＥｒＣＰ−Ｃｙ５．５ラットＩｇＧ２ｂ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０１９１１２）を含む２５ｕＬのＦＡＣＳバッファー／ウェル中において、３０分間４℃で染色した。細胞を、洗浄し、調製されたＦｉｘ／Ｐｅｒｍ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｉ． ００（−５５２３−００）中において、１時間室温でインキュベートした。細胞を、新しく調製されたＰｅｒｍバッファーで二度洗浄し、細胞傷害性系譜転写因子Ｅｏｍｅｓ、即ち抗マウスＥｏｍｅｓラットＩｇＧ２ａ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．５３４８７５、クローンＤａｎ１１ｍａｇ）に対する蛍光標識化抗体、−ＣＤ１３７が染色されない場合は−細胞傷害性エフェクター分子グランザイムＢ、即ち抗マウスｒａｔＩｇＧ２ａグランザイムＢ−ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１２８８２２，クローン１６Ｇ６）に対する蛍光標識化抗体を含む２５μＬ／ウェルのＰｅｒｍバッファーで、１時間室温で共染色した。次いで細胞を、二度洗浄し、ＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又は３レーザーＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＦｌｏｗ Ｊｏ ｖ１０．０．７（ＦｌｏｗＪｏ ＬＬＣ）を用いて獲得した。ゲートを生存ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞上に設定し、増殖細胞の頻度、並びにＣＤ２５、Ｅｏｍｅｓ及びグランザイムＢ又はＣＤ１３７の発現レベルを決定した。一又は複数の増殖頻度及び活性化マーカーのＭＦＩを、使用したマウス４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子の濃度に対してブロットし、機能活性を示した。図２７に示すように、増殖ＣＤ８＋ Ｔ細胞の増加が、コンストラクトＭ．１及びＭ．２について見られた。
【0557】
６．５ 抗マウス４−１ＢＢ抗体Ｌｏｂ１２．３（ｍｕＩｇＧ１ Ｗｔ）又はコンストラクトＭ．２で治療したマウスにおける肝臓の変化ＭＣ３８−ｍｕＦＡＰ（マウス結腸直腸がんモデル）ｓ．ｃ．を有するＣ５７ＢＬ／６マウスを、週に一度３週間にわたりＦＡＰに標的化されたアゴニスト抗マウス４−１ＢＢ抗体で治療した（効力試験０２０−ＧＡ１４０１：「Ｃ５７Ｂ６マウスＭＣ３８−ｍｕＦＡＰ ｓ．ｃ． モデルにおけるａ−ＰＤ−Ｌ１と組み合わせた４−１ＢＢ標的化療法の有効性を示すための実験」）。使用された抗体は、Ｌｏｂ１２．３ｍｕＩｇＧ１ Ｗｔ（「野生型」Ｆｃを有する、ＢｉｏＸｃｅｌｌ Ｃａｔａｌｏｇ＃：ＢＥ０１６９のクローンＬｏｂ１２．３）又はＤＡＰＧ突然変異（不活性Ｆｃ）を有するコンストラクトＭ．２であった。二つの抗体を、週に一度連続して三週間にわたり投与した。四の動物／群を、最後の治療の７日後に屠殺し、肝臓を顕微鏡により検査した。
【0558】
Ｌｏｂ１２．３ ｍｕＩｇＧ１ Ｗｔを投与した動物においてのみ肝臓の変化が観察され、それは、病巣における、Ｆ４／８０陽性マクロファージ及び血管中心の分布を頻繁に示す炎症細胞（主にリンパ球）の少量の混合集団の蓄積による肝細胞の変性からなっていた。時に、肝細胞の単一細胞壊死、及び門脈空間における血管周囲の単核細胞浸潤が見られた。コンストラクトＭ．２を投与された動物の肝臓に、治療に関連する所見は観察されなかった（表４１）。
【0559】
表４１：病理組織学的所見の発生（ｎ＝４／群）[この文献は図面を表示できません]
【0560】
肝臓内のＦｃγＲによる架橋に起因する肝炎が、Ｕｒｅｌｕｍａｂ ＢＭＳ−６６３５１３で治療された患者（Ascierto P.A. et al. 2010）、及びマウスサロゲートを用いるマウスに観察された。不活性Ｆｃを有する抗体により治療した動物に肝臓の所見がなかったことは、この仮説をサポートする。
【0561】
６．６ ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の薬物動態パラメータの決定本発明のヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子が薬学的使用に適しているかどうかを試験するために、マウスにおける、クリアランス、分布容積又は排出半減期（ｔ１／２）などの薬物動態パラメータ（ＰＫデータ）を決定した。したがって、以下の実験を実施した。
【0562】
実験Ａ：健常なＮＯＧマウスにおけるコンストラクト１．２及びコントロールＢの単回投与のＰＫ実験開始時に平均週齢８〜１０のＮＯＧメスマウス；（Ｔａｃｏｎｉｃ，ＳＯＰＦ施設から購入）を、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体のいない条件下で維持した。実験的な研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された（Ｐ２０１１１２８）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために維持された。継続的な健康モニターが定期的に実施された。
【0563】
コンストラクト１．２及びコントロールＢの曝露を評価するために、単回投与薬物動態試験（ＳＤＰＫ）を実施した。２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与をＮＯＧマウスに投与し、薬物動態評価のための選択された時点において血液試料を採取した。マウス血清試料をＥＬＩＳＡにより分析した。ビオチン化ヒト４−１ＢＢ、試験試料、Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ標識抗ｈｕＣＨ１抗体及び抗Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ検出抗体（ＰＯＤ）を、９６ウェルストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに段階的に加え、各段階後に１時間室温でインキュベートした。プレートを、各段階後に三度洗浄し、結合しなかった物質を除去した。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化した。４０５ｎｍにおいて測光法により決定された反応生成物の強度（４９０ｎｍに基準波長を有する）は、血清試料中の被分析物濃度に比例している。コンストラクトの標準曲線の較正範囲は０．１５６から１０ｎｇ／ｍｌであった。ここで、３ｎｇ／ｍｌが定量化の下限（ＬＬＯＱ）である。図２８Ａは、この実験において観察された経時的濃度の低下を示している。
【0564】
実験Ｂ：幹細胞によりヒト化された腫瘍を有するＮＯＧマウスにおけるコンストラクト２．１、２．３、コントロールＢ及びコントロールＣの単回投与のＰＫコンストラクト２．１、２．３、コントロールＢ及びコントロールＣの曝露を評価するために、単回投与薬物動態試験（ＳＤＰＫ）を実施した。ヒト幹細胞を移植したＮＳＧメスマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓにより送達された。マウスを、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体のいない条件下で維持した。実験的な研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された（ＺＨ１９３−２０１４）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために維持された。継続的な健康モニターが定期的に実施された。
【0565】
ヒトＭＫＮ４５細胞（ヒト胃癌）は、最初ＡＴＣＣから取得され、拡大後にＧｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２の水飽和雰囲気中で３７℃で培養した。生存率９７％において、皮下注射のためにインビトロ継代９を使用した。ヒト線維芽細胞ＮＩＨ−３Ｔ３を、ヒトＦＡＰを発現するようにＲｏｃｈｅ Ｎｕｔｌｅｙにおいて操作した。クローン３９をインビトロ継代番号１２に、生存率９８％で使用した。５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの細胞懸濁液（１ｘ１０６ ＭＫＮ４５細胞＋１ｘ１０６ ３Ｔ３−ｈｕＦＡＰ ）を、麻酔したマウスの側腹部に皮下注射した。腫瘍が平均サイズ１９０ｍｍ３に達したとき、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与を、ヒト化マウスに投与した。血液試料を、薬物動態評価のための選択された時点において採取した。マウス血清試料をＥＬＩＳＡにより分析した。ビオチン化ヒト４−１ＢＢ、試験試料、Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ標識抗ｈｕＣＨ１抗体及び抗Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ検出抗体（ＰＯＤ）を、９６ウェルストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに段階的に加え、各段階後に１時間室温でインキュベートした。プレートを、各段階後に三度洗浄し、結合しなかった物質を除去した。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化する。４０５ｎｍにおいて測光法により決定される反応生成物の強度（４９０ｎｍに基準波長を有する）は、血清試料中の被分析物濃度に比例している。コンストラクトの標準曲線の較正範囲は０．１５６から１０ｎｇ／ｍｌであった。ここで、３ｎｇ／ｍｌが定量化の下限（ＬＬＯＱ）である。図２８Ｂは、この実験において観察された経時的なコンストラクトの濃度の低下を示している。
【0566】
実験Ｃ：健常なＮＯＧマウスにおけるコンストラクト２．１及び２．３の単回投与のＰＫ実験開始時に平均週齢８〜１０のＮＯＧメスマウス；（Ｔａｃｏｎｉｃ、ＳＯＰＦ施設から購入）を、関連するガイドライン（ＧＶ−Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従い、毎日１２時間明所／１２時間暗所のサイクルで、特定の病原体のいない条件下で維持した。実験的な研究プロトコールが審査され、地方自治体により承認された（Ｐ ２０１１１２８）。動物は到着後１週間、新しい環境への馴致及び観察のために維持された。継続的な健康モニターが定期的に実施された。
【0567】
コンストラクト２．１及び２．３の曝露を評価するために、単回投与薬物動態試験（ＳＤＰＫ）を実施した。２．５ｍｇ／ｋｇの静脈内ボーラス投与をＮＯＧマウスに投与し、薬物動態評価のための選択された時点で血液試料を採取した。マウス血清試料をＥＬＩＳＡにより分析した。ビオチン化ヒト４−１ＢＢ、試験試料、Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ標識抗ｈｕＣＨ１抗体及び抗Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ検出抗体（ＰＯＤ）を、９６ウェルストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートに段階的に加え、各段階後に１時間室温でインキュベートした。プレートを、各段階後に三度洗浄し、結合しなかった物質を除去する。最後に、ペルオキシダーゼ結合複合体を、ＡＢＴＳ基質溶液を加えて有色反応生成物を形成することにより可視化する。４０５ｎｍにおいて測光法により決定される反応生成物の強度（４９０ｎｍに基準波長を有する）は、血清試料中の被分析物濃度に比例している。コンストラクトの標準曲線の較正範囲は０．１５６から１０ｎｇ／ｍｌであった。ここで、３ｎｇ／ｍｌが定量化の下限（ＬＬＯＱ）である。図２８Ｃは、観察された経時的な濃度の低下を示している。
【0568】
試験されたコンストラクト２．１及び２．３は、身体中で十分に安定であり、製剤開発に適した範囲にＰＫパラメータを有している。また、結果からは、コンストラクト２．１の方がやや安定であると結論することができる。
【0569】
６．７ ヒト腫瘍におけるＦＡＰ保有率ＦＡＰ標的化コンストラクトの可能な臨床利用に関する理解を得るために、ヒト腫瘍におけるＦＡＰ保有率を、国際公開第２０１４／１６１８４５に記載のように評価した。
【0570】
Ｖｉｔａｔｅｘ（ＭＡＢＳ１００１）からのＲａｔ抗ヒトセプラーゼ抗体（ＩｇＧ２ａ、クローンＤ８）を使用して、Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴにおいて、様々な腫瘍徴候由来の２，５μｍのＦＦＰＥＴ切片を免疫染色した。切片を、標準的なＣＣ１治療に供した後、抗体を、Ｄａｋｏ抗体希釈剤（Ｓ３０２２）中において５μｇ／ｍＬの濃度で６０分間３７℃でインキュベートし、Ｕｌｔｒａｖｉｅｗ ＤＡＢ検出システム（Ｖｅｎｔａｎａ ＃７６０−４４５６）を用いて陽性染色を検出した。Ａｂｃａｍ（ａｂ１８４５０）からの一致するアイソタイプ抗体をネガティブコントロールとして使用した。ＦＡＰ＋間質浸潤は、異なる徴候のヒト腫瘍に存在しており、これには、ＦＡＰ標的化コンストラクトに関して潜在的に興味深い臨床徴候を示す、頭部及び頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、乳がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵臓がん（ＰＡＣ）、胃がん、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び中皮腫が含まれた（表４２）。
【0571】
表４２：ヒト腫瘍におけるＦＡＰ保有率[この文献は図面を表示できません]
【0572】
実施例７７．１ ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製
７．１．１ ファージディスプレイキャンペーンのためのＣＤ１９抗原Ｆｃ融合の調製、精製及び特徴付け
単量体状態のヒト及びカニクイザルＣＤ１９エクトドメインを発現させて精製するために（ヒトＣＤ１９、配列番号３１参照）、対応するＤＮＡ断片を、「ノブ」突然変異（ヒト：配列番号１８６；カニクイザル：配列番号１８８）を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃ遺伝子断片に融合させ、「Ｆｃ−ホール」（配列番号８６）カウンターパートをトランスフェクトした（Merchant et al., 1998）。ＩｇＡ切断部位（ＰＴＰＰＴＰ）を、抗原エクトドメインとＦｃノブ鎖の間に導入した。目的とするビオチン化のためのＡｖｉタグを、抗原−Ｆｃノブ鎖のＣ末端に導入し、突然変異Ｈ４３５Ｒ及びＹ４３６Ｆを、精製目的でＦｃホールに導入した（Jendeberg L. et al, J. Immunological methods, 1997）。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異（ヒト：配列番号１８７；カニクイザル：配列番号１８９）を含む抗原−Ｆｃノブ鎖と、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異（配列番号９０）を含むＦｃホール鎖の組み合わせは、ＣＤ１９エクトドメインの単一コピーを含むヘテロ二量体Ｆｃ融合断片の生成を可能にする（図５Ｃの４−１ＢＢコンストラクトと同様）。表４３は、抗原Ｆｃ融合コンストラクトのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を列挙する。
【0573】
表４３：単量体ヒト及びカニクイザルＣＤ１９抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合分子のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
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【0574】
単量体抗原／Ｆｃ融合分子の生成のために、指数関数的に増殖する懸濁ＣＨＯ細胞に、標準の方法を用いて、融合タンパク質の二つの成分（ノブ及びホール鎖）をコードする二つのプラスミドをコトランスフェクトした。
【0575】
分泌タンパク質を細胞培養物の上清から、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、Ｓｏｄｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（２０ｍＭ）、Ｓｏｄｉｕｍ Ｃｉｔｒａｔｅ（２０ｍＭ）、０．５Ｍの塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム容積（ＣＶ）＝５−１５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの樹脂）に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容積の同じバッファーによる洗浄により除去した。結合したタンパク質を、直線勾配を用いて溶出した；工程１、０から６０％の溶出バッファー（２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ２．５））から１０ＣＶ；工程２、６０から１００％の溶出バッファーから２ＣＶ。直線勾配のために、１００％溶出バッファーによりさらに２カラム容積の段階溶出を適用した。
【0576】
収集された画分のｐＨを、１／４０（ｖ／ｖ）の２ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）を加えることにより調節した。タンパク質を濃縮及び濾過した後、２ｍＭのＭＯＰＳ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０２％（ｖ／ｖ）のアジ化ナトリウム溶液（ｐＨ７．４）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【0577】
表４４は、単量体ヒト及びカニクイザルＣＤ１９抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合タンパク質の収率及び最終的な単量体含有率をまとめたものである。
【0578】
表４４−単量体ヒト及びカニクイザルＣＤ１９抗原Ｆｃ（ｋｉｈ）融合タンパク質の生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0579】
精製された抗原の一部を、製造者の指示に従ってＢｉｒＡビオチン−タンパク質リガーゼ標準反応キット（結合活性、Ｃａｔ．＃ＢｉｒＡ５００）を用いて、インビトロでビオチン化した。ヒトＣＤ１９含有融合のビオチン化の度合いは９４％であり、対応するカニクイザルＣＤ１９コンストラクトの同度合いは１００％であった。次いで、ビオチン化したタンパク質を、脱アミドホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を欠く親和性成熟８Ｂ８由来のクローンの選択、スクリーニング及び特徴付けに使用した。
【0580】
７．１．２ 抗ＣＤ１９クローン８Ｂ８−０１８の生成７．１．２．１ マウス抗ヒトＣＤ１９抗体（ハイブリドーマ）の免疫化及び生成
Ｂａｌｂ／ｃマウスを６度免疫化し、ＣＤ１９トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞（ミーン受容体密度３５０００／細胞）で追加免疫した。免疫応答を、ヒトＣＤ１９トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞上において血清試料をＣＤ１９−細胞−ＥＬＩＳＡで試験することによりモニターした。十分な力価の抗ヒトＣＤ１９抗体を有するマウス由来の脾臓細胞を使用して、マウス骨髄腫細胞株Ｐ３Ｘ６３ Ａｇ８．６５３との融合により不死化した。三度の融合を実施し、ハイブリドーマ上清を、ヒトＣＤ１９トランスフェクトＮＩＨ−３Ｔ３細胞上における細胞−ＥＬＩＳＡと、抗ヒトＣＤ１９特異的抗体のための、Ｄａｕｄｉ（ＣＤ１９＋）及びＣＤ１９細胞を用いたＦＡＣＳ結合アッセイによりスクリーニングした（国際公開第２０１１／１４７８３４号の実施例１参照）。
【0581】
７．１．２．２ 抗ＣＤ１９抗体のハイブリドーマスクリーニング及び細胞生物的機能的評価 ヒトＣＤ１９に対して抗体をスクリーニングするための細胞−ＥＬＩＳＡ
細胞ＥＬＩＳＡを、ハイブリドーマのスクリーニングのため、及びヒト−ＣＤ１９に対して抗体を分泌するそれらのハイブリドーマを同定するために適用した。ヒト−ＣＤ１９をトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を、陽性細胞として使用し；非トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞をネガティブコントロール細胞として使用した。ポジティブハイブリドーマの評価のために、トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞と非トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞のＯＤ比を定量化した。
・培地：ＤＭＥＭ高グルコース（４．５ｍｇ／ｍｌ）、１０％ＦＣＳ、Ｎａ−Ｐｙｒｕｖａｔｅ、ＮＥＡＡ、グルタミン
・抗体ポジティブコントロール：抗ＣＤ１９モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｃａｔ＃５５５４０９ｃ＝１ｍｇ／ｍｌ
・検出抗体：ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰコンジュゲートＢｉｏ−Ｒａｄ Ｃａｔ＃１７０−０６５１６
・希釈物１：１ｘＥＬＩＳＡブロッキング試薬中２０００
・その他の試薬：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃８３８０３９ｃ＝１ｍｇ／ｍｌ
・グルタルジアルデヒド：２５％保存溶液／／Ｇｒａｄｅ Ａｇａｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃Ｒ１０２最終濃度：ＰＢＳ中０．０５％
・ＥＬＩＳＡブロッキング試薬：１０ｘ保存溶液／／Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃１１１２５８９
・ＴＭＢ基質：Ｒｏｃｈｅ Ｃａｔ＃１１４３２５５９
・停止液：１Ｍ Ｈ２ＳＯ４
・ＢｉｏＲａｄ Ｃａｔ＃１７０−６５１６希釈物１：１ｘＥＬＩＳＡブロッキング試薬中２０００
【0582】
１日目：・フィブロネクチンコーティング：ＰＢＳ中５μｇ／ｃｍ2；９６ウェルプレート＝ ３２ｃｍ2；６ｍｌ中１６０μｇ／プレート
・ＰＢＳ、５０μｌ／ウェル
・４５分間ＲＴでインキュベート、コーティング溶液を吸引
・９６ウェルプレートの５０μｌの培地に１．２５ｘ１０４細胞／ウェルで播種
・４０時間３７℃でインキュベート
・プレートの上半分に付加：ＣＤ１９を発現するＮＩＨ３Ｔ３細胞
・プレートの下半分に付加：非トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞
【0583】
３日目：・５０μｌの培地にポジティブコントロール抗体又は試料（上清又はマウス血清）の追加
・２時間４℃でインキュベート
・培地を除去、１００μｌのＧｌｕｔａｒｄｉａｌｄｅｈｙｄｅ（ＰＢＳ中０．０５％）で細胞を固定
・２００μｌのＰＢＳで二度洗浄
・検出抗体の付加１：２０００、５０μｌ／ウェル
・２時間ＲＴでインキュベート
・２００μｌのＰＢＳで三度洗浄
・５０μｌのＴＭＢを付加、３０分間ＲＴでインキュベート
・１ＭのＨ２ＳＯ４を２５μｌ付加することにより停止；４５０ｎｍ／６２０ｎｍにおける死滅の読み取り
・結果の計算：比ＯＤ ＮＩＨ３Ｔ３ ＣＤ１９：ＯＤ ＮＩＨ３Ｔ３非トランスフェクト
【0584】
選択された抗体は、非トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞と比較した場合に、ＣＤ１９トランスフェクトＮＩＨ３Ｔ３細胞に対する特異的結合を示した（国際公開第２０１１／１４７８３４の実施例２）。
【0585】
７．１．２．３ 抗ＣＤ１９抗体のヒト化マウス抗体のＣＤ１９結合特異性をヒトアクセプターフレームワーク上に移し、ヒトの身体が異物として認識するであろう、配列ストレッチから生じうる免疫原性の問題を排除した。これは、マウス（ドナー）抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）全体を、ヒト（アクセプター）抗体フレームワーク上に移植することにより行われたもので、ＣＤＲ移植又は抗体ヒト化と呼ばれる。
【0586】
マウスアミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系抗体Ｖ遺伝子の集合と整列させ、配列同一性及び相同性に従ってソートした。一つの特定のアクセプター配列を選択する前に、ドナー抗体のいわゆる正準ループ構造を決定しなければならない（Morea, V., et al., Methods, Vol 20, Issue 3 （2000） 267-279）。これら正準ループ構造は、いわゆる正準位置に存在する残基の種類により決定される。これら位置は、ＣＤＲ領域の（部分的に）外側にあり、親（ドナー）抗体のＣＤＲコンホメーションを保持するために、最終的なコンストラクト内に機能的に等価に保たれなくてはならない。ヒト生殖細胞系配列ＶＢＡＳＥ＿ＶＨ１＿１を、重鎖のアクセプターとして選択し、配列ＶＢＡＳＥ＿ＶＫ２＿５を、軽鎖のアクセプターとして選択した。
【0587】
７．１．２．４ 脱アミドホットスポットの除去野生型ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体はＨＶＲ−Ｌ１に三つの脱アミドホットスポット：ＮＳＮＧＮＴ（配列番号１９０）を有することが判明した。加えて、ＨＶＲ−Ｈ２には、さらなる脱アミドホットスポット：ＫＦＮＧ（配列番号１９１）が存在することが判明した。ＨＶＲ−Ｈ２中の脱アミドホットスポットに対処するために、６４位（Ｋａｂａｔによる番号付け）にＮ（Ａｓｎ）からＱ（Ｇｌｎ）の点突然変異を導入した。したがって、本明細書に報告される抗体は、アミノ酸配列ＴＥＫＦＱＧＲＶＴＭ（配列番号１９２）を含むＨＶＲ−Ｈ２を有している。
【0588】
軽鎖の脱アミドホットスポットに対処し、改善された脱アミド安定性を有するヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体を得るため、Ｋａｂａｔ位置２７ｄ、２７ｅ、２８及び２９のそれぞれに一つの突然変異と、位置２７ｅ及び２８（Ｋａｂａｔによる番号付け）に二重変異とを導入した。野生型ヒト化抗体（ｖａｒ．０）の合計９の変異体（ｖａｒ．１からｖａｒ．９）が生成された（表４５参照）。
【0589】
表４５：ヒト化野生型ＣＤ１９抗体の変異体[この文献は図面を表示できません]
【0590】
Ｋａｂａｔによる２７ｅ位においてＳ（セリン）からＰ（プロリン）への単一の突然変異により、ＨＶＲ−Ｌ１内のすべての脱アミドホットスポットに対処できることが判明した。これは、脱アミド傾向のＮ（アスパラギン）残基の突然変異ではなく、隣接残基の突然変異である。
【0591】
したがって、本明細書に報告される抗体は、アミノ酸配列ＬＥＮＰＮＧＮＴ（配列番号１９３）を含むＨＶＲ−Ｌ１を有している。一実施態様では、ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体は、アミノ酸配列ＬＥＮＰＳＧＮＴ（配列番号１９４）を有するＨＶＲ−Ｌ１を含む。
【0592】
加えて、これら抗体は、以下の表４６に示すように、カニクイザルＣＤ１９に対する交差反応性を維持している。[この文献は図面を表示できません]
【0593】
野生型ヒト化抗ヒトＣＤ１９抗体（ｖａｒ．０）は、精製後に約７．５％の脱アミドを示す。二週間ｐＨ７．４での貯蔵後、脱アミドされた抗体の量は、約１８．５％まで増加している。Ｓ２７ｅＰ突然変異（ｖａｒ．５）を有する変異型抗体は、精製後に約２％の脱アミド及び２％のスクシンイミド形成を示す。ｐＨ７．４で二週間の貯蔵中には、約７．５％の脱アミド抗体しか存在していない。Ｖａｒ．５は、クローン８Ｂ８−０１８と命名され、ＣＤ１９標的化ＴＮＦファミリーリガンド三量体含有抗原結合分子の調製のために選ばれた。
【0594】
７．１．３ 荷電残基を含む交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．１）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ｂに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0595】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。正確な対合を向上させるために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬに導入された。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【0596】
ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−０１８）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0597】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３０、コンストラクト３．１）。
【0598】
表４７は、交差ＣＨ−ＣＬ及び荷電残基を含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0599】
表４７：荷電残基を含むＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト３．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
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【0600】
７．１．４ 荷電残基のない交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．２）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すものと同様に、但しＣＬドメインにおけるアミノ酸突然変異なしで（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）、クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合したポリペプチドを、図（２９Ｂ）に示すものと同様に、但しＣＨ１ドメインにおけるアミノ酸突然変異なしで（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ１）、クローニングした。
【0601】
ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−０１８）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0602】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３０、コンストラクト３．２）。
【0603】
表４８は、荷電残基のない交差ＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0604】
表４８：荷電残基のないＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト３．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。[この文献は図面を表示できません]
【0605】
７．１．５ 二価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合（コンストラクト３．３）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図２９Ｃに示すように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させた。図２９Ｄに記載のように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したポリペプチド。
【0606】
ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−０１８）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１のノブ又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む抗ＣＤ１９ ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗ＣＤ１９ ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３０、コンストラクト３．３）。
【0607】
表４９は、二価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．３）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0608】
表４９：二価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）ＰＧＬＡＬＡ融合体（コンストラクト３．３）の塩基対配列[この文献は図面を表示できません]
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【0609】
７．１．６ 荷電残基を含む交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．４）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すものと同様に（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ｂに示すものと同様に（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0610】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。正確な対合を向上させるために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬに導入された。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【0611】
ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−０１８）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従ってＦＣガンマ受容体に対する結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａの突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３０、コンストラクト３．４）。
【0612】
表５０は、交差ＣＨ−ＣＬ及び荷電残基を含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0613】
表５０：荷電残基を含むＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト３．４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
【0614】
７．１．７ 荷電残基のない交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．５）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すものと同様に、但しＣＤドメインにおけるアミノ酸突然変異なしで（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合したポリペプチドを、図（２９Ｂ）に示すものと同様に、但しＣＨ１ドメインにおけるアミノ酸突然変異なしで（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ１）クローニングした。
【0615】
ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−０１８）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３０、コンストラクト３．５）。
【0616】
表５１は、荷電残基のない交差ＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．５）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0617】
表５１：荷電残基のないＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト３．５）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。[この文献は図面を表示できません]
【0618】
７．１．８ 二価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合（コンストラクト３．６）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図２９Ｃに示すように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させた。図２９Ｄに記載のように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したポリペプチド。
【0619】
ＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−０１８）を、ヒトＩｇＧ１の定常軽鎖、ノブ又はホールの定常重鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む抗ＣＤ１９ ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗ＣＤ１９ ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図３０、コンストラクト３．６）。
【0620】
表５２は、二価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．６）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0621】
表５２：二価のＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト３．６）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。[この文献は図面を表示できません]
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【0622】
７．２ ＣＤ１９（８Ｂ８由来親和性成熟）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子及び対応するコントロール分子の調製７．２．１ ホットスポットのない８Ｂ８由来親和性成熟抗ＣＤ１９バインダーの生成
７．２．１．１ 親和性成熟ＣＤ１９特異的抗体の選択
ヒト化クローン８Ｂ８の軽鎖のＣＤＲ１に位置する２７ｄ位及び２８位におけるアスパラギン残基の脱アミド化は、生物活性を有意に低下させる。したがって、改善された親和性を有する８Ｂ８変異体について選択するために、ａ）２７ｄ位及び２８位両方のアスパラギン残基が削除され、ｂ）重鎖及び軽鎖の追加のＣＤＲが無作為化された、２つのファージディスプレイライブラリが生成された。
【0623】
７．２．１．２ ＬＣＤＲ１ホットスポットのない８Ｂ８親和性成熟ライブラリの生成ＬＣＤＲ１に位置する、脱アミド部位Ｎ２７ｄ及びＮ２８のない親和性成熟８Ｂ８由来抗体の生成を、標準のプロトコールを用いるファージディスプレイにより実施した（Silacci et al, 2005）。第１の工程において、ヒト化親クローン８Ｂ８のＶＬ及びＶＨ ＤＮＡ配列（配列番号２１５及び配列番号２１６）を、本発明のファージミド中にクローニングし、次いでこれを無作為化のテンプレートとして使用した。次の工程では、ファージディスプレイにより好ましいクローンの選択のために二つのライブラリを生成した。上記ホットスポットの位置を除去するために、２７ｄ位及び２８位にアミノ酸Ｓ Ｔ Ｑ Ｅのみを可能にするＬＣＤＲ１無作為化プライマー（配列番号２１７）を両ライブラリに使用した。突然変異のライブラリ１を、軽鎖及び重鎖両方のＣＤＲ１及び２において無作為化し、突然変異ライブラリ２を、軽鎖のＣＤＲ１及び３及び重鎖のＣＤＲ３において無作為化した。それぞれのＣＤＲ領域における無作為化位置を図３１Ａに示す。軽鎖及び重鎖両方のＣＤＲ１及び２において無作為化された、突然変異ライブラリ１の生成のために、三つの断片を、「重複伸展によるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲにより構築し、ファージベクター中にクローニングした（図３１Ｂ）。以下のプライマーの組み合わせが、ライブラリの断片を生成するために使用された：断片１（ＬＭＢ３（配列番号２２２）及びＣＤ１９Ｌ１リバースランダム（配列番号２１７）、断片２（ＣＤ１９Ｌ２フォワードランダム（表中「順ランダム」）（配列番号２１８）及びＣＤ１９Ｈ１リバースランダム（表中「逆ランダム」）（配列番号２１９）、及び断片３（ＣＤ１９Ｈ２フォワードランダム（配列番号２２０）及びＣＤ１９Ｈ３逆定常（配列番号２２１）（表５３）。十分な量の完全長無作為化断片の構築後、同じ処理を施したアクセプターファージミドベクターと共にＮｃｏＩ／ＮｈｅＩで消化させた。３倍過剰モルのライブラリ挿入物を、１０μｇのファージミドベクターでライゲートした。精製したライゲーションを、２０の形質転換体に使用し、２×１０のｅｘｐ９形質転換体を得た。８Ｂ８親和性成熟ライブラリを示すファージミド粒子を救済し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製し、選択に使用した。
【0624】
軽鎖のＣＤＲ１及び３と重鎖のＣＤＲ３において無作為化された第２のライブラリの生成を、同様に実施した。以下のプライマーの組み合わせが、ライブラリの断片を生成するために使用された：断片１（ＬＭＢ３（配列番号２２２）及びＣＤ１９Ｌ１リバースランダム（配列番号２１７）、断片２（ＣＤ１９Ｌ１順定常（配列番号２２３）及びＣＤ１９Ｌ３リバースランダム（配列番号２２４）、及び断片３（ＣＤ１９Ｌ３順定常（配列番号２２５）及びＣＤ１９Ｈ３リバースランダム（配列番号２２６）（表５４）。十分な量の完全長無作為化断片の構築後、同じ処理を施したアクセプターファージミドベクターと共にＮｃｏＩ／ＫｐｎＩで消化させた。３倍過剰モルのライブラリ挿入物を、２０μｇのファージミドベクターでライゲートした。精製したライゲーションを、４０の形質転換体に使用し、２×１０のｅｘｐ９形質転換体を得た。８Ｂ８親和性成熟ライブラリを示すファージミド粒子を救済し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製により精製し、選択に使用した。
【0625】
表５３：８Ｂ８親和性成熟のプライマー及びホットスポット除去ライブラリＬ１＿Ｌ２／Ｈ１＿Ｈ２[この文献は図面を表示できません]
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【0626】
表５４：８Ｂ８親和性成熟のプライマー及びホットスポット除去ライブラリＬ１＿Ｌ３／Ｈ３[この文献は図面を表示できません]
【0627】
７．２．１．３ ＬＣＤＲ１ホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を持たない親和性成熟８Ｂ８由来クローンの選択ＬＣＤＲ１ホットスポットＮ２７ｄ及びＮ２８を持たない親和性成熟クローンの選択のために、ファージディスプレイによる二つの選択手法を実施した。
【0628】
第１の手法では、選択は、両方のファージディスプレイライブラリを用いてヒトＣＤ１９−Ｆｃ融合タンパク質において実施された。以下のパターンに従って、溶液中においてパニングラウンドを実施した。１．〜１０１２個のファージミド粒子を、３０ｎＭのビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質に、０．５時間１ｍｌの総体積において結合させ、２．ビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質及び特異的に結合したファージ粒子を、５．４×１０７個のストレプトアビジン被覆磁気ビーズを１０分間加えることにより捕捉し、３．ビーズを、５×１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０及び５×１ｍｌのＰＢＳを用いて洗浄し、４．ファージ粒子を、１ｍｌの１００ｍＭ ＴＥＡを加えることにより１０分間溶出し、５００μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を加えることにより中和させ、５．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌を再感染させ、６．ヘルパーファージＶＣＳＭ１３で感染させた後、ファージミド粒子をＰＥＧ／ＮａＣｌ沈降させて次の選択ラウンドに使用する。選択は、抗原濃度を低下させながら（３０ｘ１０−９Ｍ、１０ｘ１０−９Ｍ、及び３ｘ１０−９Ｍ）、３ラウンドにわたって実施した。２及び３ラウンド目では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを用いて抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。ニュートラアビジンプレートを、５×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０及び５×ＰＢＳで洗浄した。ラウンド３では、ファージをプレートから溶出する前に、ニュートラアビジンプレートを一晩２リットルのＰＢＳ中においてインキュベートし、「オフレート」選択した。さらに、交差反応性バインダーを濃縮するために、カニクイザルＣＤ１９−Ｆｃタンパク質をラウンド２に使用した。
【0629】
第２の選択法において、ファージパニングを、細胞表面上にヒト又はカニクイザルＣＤ１９ ＥＣＤを一過性に発現する細胞上で実施した。ＨＥＫ細胞の一過性のトランスフェクションのために、以下のタンパク質部分のＤＮＡ配列（５’から３’末端）を担持する発現プラスミドを生成した：Ｆｌａｇタグ、ＳＮＡＰタグ、ヒト又はカニクイザル起源のＣＤ１９ ＥＣＤ、及び血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）（配列番号２２７及び２２８）の膜貫通領域。細胞表面上における反応性タンパク質（配列番号２２９及び２３０）の発現を、検出用の抗Ｆｌａｇ抗体を用いるフローサイトメトリーにより確認した。両方のライブラリを、第１の選択ラウンドにおいて、ヒト又はカニクイザルＣＤ１９ ＥＣＤ含有タンパク質融合体を発現する細胞に対して曝露した。続くパニングラウンドのために、ＣＤ１９ ＥＣＤの種をそれに応じて交換した。不適切な膜タンパク質で一過性にトランスフェクトされた細胞を、事前クリアリングに使用した。
【0630】
以下のパターンに従ってパニングラウンドを実施した：１．先述の標準手順による、ＣＤ１９ ＥＣＤ又は不適切な膜貫通タンパク質を発現するコンストラクトを用いたＨＥＫ細胞のトランスフェクション、
２．５％ ＣＯ２雰囲気を用いるインキュベーター内での３７℃で合計４８時間にわたる細胞のインキュベーション、３．遠心分離（２５０×ｇで３分）よる細胞の単離、及びＰＢＳ／５％ ＢＳＡ中での、それぞれ１×１０Ｅ７のＣＤ１９ ＥＣＤ陽性細胞及び１×１０Ｅ７の陰性細胞の再懸濁、
３．ゆっくりと回転する管回転装置を用いて１×１０７のＣＤ１９陰性細胞を含むファージライブラリを６０分間４℃でインキュベートすることによる非特異的ファージの事前クリアリング、
４．２５０×ｇで３分間の細胞の遠心分離及び新規管への上清の輸送及び１×１０Ｅ７のＣＤ１９陽性細胞の付加及び管回転装置での低速回転による６０分間４℃でのインキュベーション、
５．１分間２５０×ｇでの遠心分離による細胞の洗浄、上清の吸引、及び１ｍｌのＰＢＳ中への再懸濁（８回）、
６．１００ｍＭのＴＥＡを１ｍｌを用いるファージ溶出、５分間ＲＴでのインキュベーション、及び１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を５００ｕｌ用いる溶出液の中和、
７．指数関数的に増殖する大腸菌ＴＧ１細菌の再感染、並びに
８．ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染及びそれに続く、その後の選択ラウンドに使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。選択は３ラウンドにわたって実施された。
【0631】
両方の選択法のために、特異的バインダーをＥＬＩＳＡにより以下のようにして同定した：１ウェルあたり１００ｕｌの３０ｎＭビオチン化ＣＤ１９−Ｆｃタンパク質を、ニュートラアビジンプレートにコーティングした。Ｆａｂ含有細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を用いて、結合するＦａｂをそれらのＦｌａｇタグにより検出した。
【0632】
組み換えヒトＣＤ１９上においてＥＬＩＳＡ陽性であるクローンを、ヒトＣＤ１９ＥＣＤ含有発現プラスミド（配列番号２２７）が一過性にトランスフェクトされた細胞を用いる細胞ベースＥＬＩＳＡにおいてさらに試験した。この分析は以下のように実施された：トランスフェクションの４８時間後、ＨＥＫ細胞を採取し、２５０ｘｇで５分間遠心分離した。次いで細胞を、氷冷のＰＢＳ ＢＳＡ ２％において４ｘ１０６細胞／ｍｌに再懸濁し、２０分間氷上でインキュベートし、非特異的結合部位をブロックした。１００ｕｌ中、４×０５個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに分配し、２５０ｘｇ及び４℃で３分間遠心分離した。上清を、吸引し、可溶型Ｆａｂ断片を含む５０ｕｌの細菌上清を、５０ｕｌの氷冷ＰＢＳ／ＢＳＡ ２％で希釈し、プレートに加え、細胞と混合して１時間４℃でインキュベートした。その後、細胞を３℃の氷冷ＰＢＳで洗浄してから、１：２０００希釈の抗Ｆａｂ−ＨＲＰ抗体を含む１ウェル当たり１００ｕｌのＰＢＳ ＢＳＡ ２％を加えた。１時間のインキュベーション時間の後、細胞を、再び氷冷のＰＢＳで３度洗浄した。発生のために、１ウェル当たり１００ｕｌの「１工程超ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ」基質を加えた。１０分間のインキュベーション時間の後、上清を、１ウェル当たり４０ｕｌのＨ２ＳＯ４ １Ｍを含む新規の９６ウェルプレートに移し、吸光度を４５０ｎＭで測定した。背景上に有意なシグナルを呈するクローンを、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６を用いるＳＰＲ分析により動態スクリーニング実験に供した。
【0633】
７．２．１．４ ＳＰＲによる親和性成熟８Ｂ８由来変異体の同定さらにＥＬＩＳＡ陽性クローンの特徴を明らかにするために、オフレートを表面プラズモン共鳴により測定し、親ヒト化クローン８Ｂ８と比較した。
【0634】
この実験のために、７０００ＲＵのポリクローナル抗ヒトＦａｂ抗体を、ＧＬＭチップの６チャネルすべてにアミド結合（ＮａＡｃｅｔａｔｅ（ｐＨ４．５）、２５μｌ／分、２４０ｓ）（垂直配向）により固定化した。各抗体含有細菌上清を、濾過し、ＰＢＳで２倍に希釈し、次いで３６０秒間２５μｌ／分で注入し、垂直配向において１００から４００反応単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。単量体ＣＤ１９−Ｆｃの注入：ワンショットの反応速度論的な測定のために、注入方向を水平配向に変更し、三倍の希釈系列の精製された単量体ＣＤ１９−Ｆｃ（１５０から６ｎＭの間で変動する濃度）を、結合時間１８０秒及び解離時間３００秒で、別々のチャネル１−４に５０μｌ／分で同時注入した。ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片（１５０ｎＭ）をチャネル５にネガティブコントロールとして注入し、単量体ＣＤ１９−Ｆｃに特異的に結合させた。バッファー（ＰＢＳＴ）を六番目のチャネルに注入し、参照用の「インライン」ブランクを提供した。３０秒間９０ｕｌ／分（水平配向）で１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）及び５０ｍＭのＮａＯＨの二つのパルスにより再生成を実施した。解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、センサーグラムを同時にフィッティングすることにより、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアで、単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて計算した。最も遅い解離速度定数でＦａｂを発現するクローンを同定した（表５５）。ここで、クローン５Ａ０７及び５Ｂ０８の解離速度定数は、不十分なフィッティングにより決定することができなかった。それでも、得られた結果が極めて遅い解離を示したため、両方のクローンが選択された。対応するファージミドの可変ドメインを配列決定した。重要なのは、ＬＣＤＲ１の両方のアスパラギン残基（２７ｄ位及び２８位）が、セリン又はスレオニンで置き換えられたことであり、これにより両方の脱アミド部位が除去されたことが示された。配列比較を図３２に示す。最良のクローンのＣＤＲを表５６（軽鎖の可変領域）及び表５７（重鎖の可変領域）に示す（クローン５Ｈ０９：（配列番号２３１−２３６）；クローン７Ｈ０７：（配列番号２３７−２４２）；クローン２Ｂ０３：（配列番号２４３−２４８）；クローン２Ｂ１１：（配列番号２４９−２５４）；クローン５Ａ０７：（配列番号２５５−２６０）；クローン５Ｂ０８：（配列番号２６１−２６６）；クローン５Ｄ０８：（配列番号２６７−２７２）。
【0635】
表５５：細菌上清によるふるい分析法において得られた選択されたクローンの解離定数[この文献は図面を表示できません]
【0636】
表５６：選択された８Ｂ８軽鎖のＣＤＲ配列[この文献は図面を表示できません]
【0637】
表５７：選択された８Ｂ８重鎖のＣＤＲ配列[この文献は図面を表示できません]
【0638】
７．２．２ 親和性成熟８Ｂ８由来抗体の特徴付け７．２．２．１ 可変抗体ドメインの発現ベクター中へのクローニング
選択された抗ＣＤ１９バインダーの重鎖及び軽鎖のＤＮＡ配列の可変領域を、ヒトＩｇＧ１の定常重鎖又は定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。重鎖において、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載された方法により、Ｆｃガンマ受容体に対する結合を抑止するためにＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を導入した。
【0639】
抗ＣＤ１９ ＩｇＧのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を、表５８及び表５９にそれぞれ示す。すべての抗体コード化配列を、発現ベクター中にクローニングした。これは、キメラＭＰＳＶプロモーターによる挿入物の転写を誘導するものであり、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ｐｏｌｙＡシグナル配列を含む。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【0640】
表５８：Ｐ３２９ＧＬＡＬＡヒトＩｇＧ１フォーマットにおける抗ＣＤ１９クローン８Ｂ８のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
[この文献は図面を表示できません]
【0641】
表５９：Ｐ３２９ＧＬＡＬＡヒトＩｇＧ１フォーマットにおける親和性成熟抗ＣＤ１９クローンのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
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【0642】
７．２．２．２ ＳＰＲによる選択された抗体の親和性の決定ＳＰＲによる親和性の正確な決定のために、選択された抗ＣＤ１９抗体を、ポリエチレンイミンを用いて、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成した。細胞に、標準の手続きにより、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトした。トランスフェクションの７日後、上清の抗体価を測定し、すべての力価を１０μｇ／ｍｌに平衡化した。
【0643】
親抗体８Ｂ８の親和性（ＫＤ）とその誘導体を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６機器（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて２５℃でＳＰＲにより測定した。７０００ＲＵのポリクローナル抗ヒトＦａｂ抗体を、アミン結合（ＮａＡｃｅｔａｔｅ（ｐＨ４．５）、２５ｕｌ／分、２４０秒）（垂直配向）により、ＧＬＭチップの６チャネルすべてに固定化した。各抗体含有ＨＥＫ上清を、濾過し、ＰＢＳＴ（１０ｍＭのホスフェート、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０）を用いて１０ｕｇ／ｍｌの濃度に希釈し、次いで３６０秒間２５μｌ／分で注入し、垂直配向において５００から８００反応単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。単量体ＣＤ１９−Ｆｃの注入：ワンショットの反応速度論的な測定のために、注入方向を水平配向に変更し、三倍希釈系列の精製された単量体ＣＤ１９−Ｆｃ（１５０から６ｎＭの範囲で変化する濃度）を、結合時間１８０秒、及び解離時間３００秒で、５０μｌ／分で別々のチャネル１−４に同時に注入した。ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片（１５０ｎＭ）を、ネガティブコントロールとしてチャネル５に注入し、単量体ＣＤ１９−Ｆｃに特異的に結合させた。バッファー（ＰＢＳＴ）を、六番目のチャネルに注入し、参照用の「インライン」ブランクを提供した。それぞれのセンサーグラムの概要を図３３に示す。３０秒間９０ｕｌ／分（垂直配向）で１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）及び５０ｍＭのＮａＯＨの二つのパルスにより再生成を実施した。結合速度定数（ｋｏｎ）及び解離速度定数（ｋｏｆｆ）を、ＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ３．１ソフトウェアにおいて単純な１対１ラングミュア結合モデルを用いて、結合及び解離センサーグラムを同時にフィッティングすることにより計算した。平衡解離定数（ＫＤ）はｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。速度論的及び熱力学的データのまとめを表６０に示す。すべての親和性成熟クローンの解離定数が、それらの親クローン８Ｂ８と比較して向上していた。
【0644】
表６０：抗ＣＤ１９ ｈｕＩｇＧ１とヒトＣＤ１９の相互作用に関する速度論的及び熱力学的データのまとめ[この文献は図面を表示できません]
【0645】
７．２．２．３ 抗ＣＤ１９ ＩｇＧ１Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡの調製及び精製選択された抗ＣＤ１９抗体を、ポリエチレンイミンを用いて、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物の発現ベクターをコトランスフェクトすることにより精製した。細胞に、対応する発現ベクターを１：１の比（「ベクター重鎖」：「ベクター軽鎖」）でトランスフェクトした。
【0646】
５００ｍＬの振盪フラスコ内での生成のために、４億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションの前に、細胞を５分間２１０×ｇで遠心分離し、上清を、予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地により置き換えた。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に混合した。５４０μＬのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベート後、１６０ｍｌのＦ１７培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１ｍＭのバルプロ酸及びサプリメントを含む７％のＦｅｅｄを加えた。７日間の培養後、上清を、１５分間２１０×ｇで遠心分離することにより収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に維持した。
【0647】
細胞培養物上清由来の抗体分子の精製を、抗原Ｆｃ融合体の精製について上述したように、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより実施した。タンパク質を濃縮及び濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【0648】
精製された抗体のタンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。抗体の純度及び分子量を、還元剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の存在下及び非存在下において、ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ（Ｃａｌｉｐｅｒ）を用いるＣＥ−ＳＤＳにより分析した。抗体試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７、２５℃のランニングバッファー中において平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【0649】
表６１：抗ＣＤ１９Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ ＩｇＧ１クローンの生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0650】
二重特異性コンストラクトの調製のために、三つの脱アミドホットスポットを欠くという理由でクローン２Ｂ１１が選択された。
【0651】
ヒト４−１ＢＢリガンドのエクトドメイン（アミノ酸７１−２５４、及び７１−２４８）のＤＮＡ配列コード化部分を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ４１２７３配列に従って合成した。
【0652】
７．２．３ 荷電残基を含む交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．１）の調製コンストラクト４．１を、コンストラクト３．１について記載したように（図３０）、但しＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−２Ｂ１１）を用いて調製した。
【0653】
表６２は、交差ＣＨ−ＣＬ及び荷電残基を含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0654】
表６２：荷電残基を含むＣＨ−ＣＬ交差を含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト４．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
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【0655】
７．２．４ 荷電残基のない交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．２）の調製コンストラクト４．２を、コンストラクト３．２について記載したように（図３０）、但しＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−２Ｂ１１）を用いて調製した。
【0656】
表６３は、荷電残基のない交差ＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0657】
表６３：荷電残基のないＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト４．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。[この文献は図面を表示できません]
【0658】
７．２．５ 二価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合（コンストラクト４．３）の調製コンストラクト４．３を、コンストラクト３．３について記載したように（図３０）、但しＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−２Ｂ１１）を用いて調製した。
【0659】
表６４は、二価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．３）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0660】
表６４：二価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）ＰＧＬＡＬＡ融合体（コンストラクト４．３）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
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【0661】
７．２．６ 荷電残基を含む交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．４）の調製コンストラクト４．４を、コンストラクト３．４について記載したように（図３０）、但しＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−２Ｂ１１）を用いて調製した。
【0662】
表６５は、交差ＣＨ−ＣＬ及び荷電残基を含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0663】
表６５：荷電残基を含むＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト４．４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
【0664】
７．２．７ 荷電残基のない交差ＣＨ１−ＣＬドメインを有する一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．５）の調製コンストラクト４．５を、コンストラクト３．５について記載したように（図３０）、但しＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−２Ｂ１１）を用いて調製した。
【0665】
表６６は、荷電残基のない交差ＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト４．５）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0666】
表６６：荷電残基のないＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト４．５）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。[この文献は図面を表示できません]
【0667】
７．２．８ 二価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合（コンストラクト４．６）の調製コンストラクト４．６を、コンストラクト３．６について記載したように（図３０）、但しＣＤ１９に特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン８Ｂ８−２Ｂ１１）を用いて調製した。
【0668】
表６７は、二価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト３．６）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0669】
表６７：二価のＣＤ１９（８Ｂ８−２Ｂ１１）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト４．６）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
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【0670】
７．３ コントロール分子としての非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合体及びヒトＩｇＧの調製７．３．１ 非標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（コントロール分子）の調製
これらコントロール分子は、ＣＤ１９標的化コンストラクト３．１（コントロールＢと呼ぶ）、３．３（コントロールＣと呼ぶ）、３．４（コントロールＤと呼ぶ）及び３．５（コントロールＥと呼ぶ）について上述したように調製し、但し唯一の相違点として、抗ＣＤ１９バインダー（ＶＨ−ＶＬ）を、抗原に結合しない生殖系列コントロール（ＤＰ４７と呼ぶ）により置き換えた（図３０参照）。
【0671】
表６８は、荷電残基のある交差ＣＨ−ＣＬを含む一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＢ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列のそれぞれを示す。
【0672】
表６９は、二価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＣ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列のそれぞれを示す。
【0673】
表７０は、荷電残基のあるＣＨ−ＣＬクロスを含む一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＤ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列のそれぞれを示す。
【0674】
表７１は、ＣＨ−ＣＬクロスに荷電残基のない一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＥ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列のそれぞれを示す。
【0675】
表６８：荷電残基を含みかつＣＨ−ＣＬクロスを含む一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＢ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
【0676】
表６９：二価のＤＰ４７非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＣ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。[この文献は図面を表示できません]
【0677】
表７０：荷電残基を含みかつＣＨ−ＣＬクロスを含む一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＤ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
【0678】
表７１：ＣＨ−ＣＬクロスを含み荷電残基を含まない一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体ヒト４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＥ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。[この文献は図面を表示できません]
【0679】
７．３．２ コントロール分子としての抗体ＰＧＬＡＬＡを含む二つのコントロールヒトＩｇＧ１を調製した。
【0680】
表７２は、抗ＣＤ１９ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（クローン８Ｂ８−０１８）、即ちコントロールＧのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0681】
表７３は、生殖系列コントロールＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0682】
表７２：抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＧ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
[この文献は図面を表示できません]
【0683】
表７３：生殖系列コントロールＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
【0684】
７．４ ＣＤ１９標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子及びそのコントロール分子の調製標的化及び非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子コード化配列を、プラスミドベクター中にクローニングした。これは、ＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を誘導するものであり、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ｐｏｌｙＡ配列を含む。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【0685】
分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子を、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成した。細胞には、対応する発現ベクターがトランスフェクトされた。変異体１，２，４，５及びそのコントロールＢ、Ｄ及びＥのために、１：１：１：１の比（「ベクター二量体リガンド−ＣＬ−ノブ鎖」：「ベクター単量体リガンド融合−ＣＨ１」：「ベクター抗ＣＤ１９ Ｆａｂ−ホール鎖」：「ベクター抗ＣＤ１９軽鎖」）で。 変異体３、６及びそのコントロールＣのために、１：１：１の比（「ベクターｈｕＩｇＧ１ Ｆｃホール二量体リガンド鎖」：「ベクターｈｕＩｇＧ１ Ｆｃノブ単量体リガンド鎖」：「ベクター抗ＣＤ１９軽鎖」）で。 アッセイにおいてコントロールとして用いたヒトＩｇＧは、二重特異性コンストラクトのためとして生成された（トランスフェクションのためだけに、軽鎖のベクター及び重鎖のベクターを１：１の比で使用した）。
【0686】
５００ｍＬの振盪フラスコ内での生成のために、３億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を１０分間２１０×ｇで遠心分離し、上清を、２０ｍＬの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地により置き換えた。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に混合した。５４０μＬのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰＥＰＳＯＹ及び１．２ｍＭのバルプロ酸を補った１６０ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１２％のＦｅｅｄ（アミノ酸及びグルコース）を加えた。７日間の培養後、上清を、３０〜４０分間少なくとも４００×ｇで遠心分離することにより収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に維持した。
【0687】
分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子、並びにＩｇＧを、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５−１５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの樹脂）に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容積の同じバッファーによる洗浄により除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）による直線勾配（２０ＣＶ）又は段階的溶出（８ＣＶ）を用いて溶出した。直線勾配については、さらに４カラム容積の段階的溶出を適用した。
【0688】
収集された画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより調節した。タンパク質を濃縮した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【0689】
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。標的化三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の純度及び分子量を、還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下で、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵＳＡ）で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ３、ｐＨ６．７ ２５℃のランニングバッファー中において平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【0690】
表７４は、ＣＤ１９標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0691】
表７４：ＣＤ１９標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0692】
表７５は、一価（コントロールＢ、Ｄ及びＥ）及び二価（コントロールＣ）両方の、ＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0693】
表７５：ＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0694】
表７６は、抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）及び生殖系列ＤＰ４７ヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0695】
表７６：コントロールヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡの生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0696】
実施例８ＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の機能的特徴付け
８．１．表面プラズモン共鳴（親和性）
組み換え４−１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びＣＤ１９に対するＣＤ１９標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子（コンストラクト３．４及び３．６）の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。すべてのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で実施した。
【0697】
ヒト及びカニクイザル４−１ＢＢとの相互作用抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準のアミン結合キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接結合させた。固定化レベルは約８０００ＲＵであった。ＣＤ１９標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合体を、６０秒間２及び５ｎＭで捕獲した（コントロールＤも注入した）。組み換えヒト又はカニクイザル４−１ＢＢ ａｖｉ Ｈｉｓを、２．７から２０００ｎＭの濃度範囲（３倍希釈）及び３０μＬ／分の流れでフローセルに１２０秒間通過させた。解離を１８０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面に流したが、その上には、抗体ではなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【0698】
ヒトＣＤ１９との相互作用抗ヒトＦａｂ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を、標準のアミン結合キット（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｐＨ５．０でＣＭ５チップ上に直接結合させた。固定化レベルは約８０００ＲＵであった。ＣＤ１９標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合、又はコントロール抗体（抗ＣＤ１９（８Ｂ８−０１８）ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ）を、６０秒間２０ｎＭで捕獲した。組み換えヒトＣＤ１９ Ｆｃ（ｋｉｈ）を、７．８から５００ｎＭの濃度範囲（２倍希釈）及び３０μＬ／分の流れでフローセルに１２０秒間通過させた。解離を１２０／１８００秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。ここで、抗原は、固定化された抗ヒトＦａｂ抗体を有する表面上に流したが、その上には、抗体ではなくＨＢＳ−ＥＰが注入された。
【0699】
速度定数を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｖＡＡ，Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて導出し、数値積分法により、１：１ラングミュア結合の反応速度式に当てはめた。
【0700】
二重特異性コンストラクト３．４、３．６及びコントロールＤは、同様に４−１ＢＢに結合する。表７７は、二つの実験（２ｎＭ又は５ｎＭのコンストラクト捕獲溶液を用いる）の平均を標準偏差（括弧内）と共に示している。二重特異性コンストラクト３．４及び３．６は、ヒトＣＤ１９に対してＩｇＧと同様の親和性で結合する。相互作用の親和定数を、１：１ラングミュア結合に対するフィッティングにより決定した。ｈｕ４−１ＢＢ及びｃｙ４−１ＢＢによる測定について、平均及び標準偏差（括弧内）が示されている（２又は５ｎＭの捕獲溶液を用いた二つの実験）
【0701】
表７７：組み換えヒト（ｈｕ）４−１ＢＢ、カニクイザル（ｃｙ）４−１ＢＢ及びヒト（ｈｕ）ＣＤ１９に対するＣＤ１９標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合体の結合[この文献は図面を表示できません]
【0702】
８．２．表面プラズモン共鳴（同時結合）ヒト４−１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＣＤ１９に対する同時結合能を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。すべてのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で実施した。ビオチン化ヒト４−１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。２５０共鳴単位（ＲＵ）以下の固定化レベルを用いた。
【0703】
ＣＤ１９標的化三量体分裂４−１ＢＢＬコンストラクト（コンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５、３．６、４．４）を、２００ｎＭの濃度範囲及び３０μＬ／分の流れでフローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＣＤ１９を、第２の被分析物として３０μＬ／分の流れでフローセルに９０秒間５００ｎＭの濃度で注入した（図３４Ａ）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差異を、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで得られる応答を差し引くことにより修正した。
【0704】
図３５のグラフに見ることができるように、すべての二重特異性コンストラクトはヒト４−１ＢＢ及びヒトＣＤ１９に同時に結合することができた。
【0705】
実施例９ＣＤ−１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の機能的特徴付け
９．１．ＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の活性化ヒトＰＭＢＣに対する結合
４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子のヒトＰＢＭＣに対する結合を決定するために、異なる滴定濃度のＣＤ１９標的化４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、実施例５．２に記載のようにしてアッセイに用いた。
【0706】
図３６Ａ及び３６Ｂは、実施例７で調製されたコンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５及び３．６の、活性化４−１ＢＢ発現ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合をそれぞれ示している。生存ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ４＋又はＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞上にゲートを設定し、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ ＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片のＭＦＩを、標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合変異体の滴定濃度に対してブロッティングした。表７８は、コンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５及び３．６と、コントロール分子について測定されたＥＣ５０値を示している。
【0707】
表７８：活性化４−１ＢＢ発現ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0708】
９．２ ＣＤ１９発現腫瘍細胞に対する結合ＣＤ１９発現腫瘍細胞に対する結合アッセイのために、以下のヒトＣＤ１９発現リンパ腫細胞株を用いた：びまん性大非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＤＳＭＺ ＡＣＣ５７３）、急性Ｂ細胞前駆体リンパ性白血病細胞株Ｎａｌｍ６（ＤＳＭＺ ＡＣＣ−１２８）、びまん性大細胞リンパ芽球性リンパ腫細胞株Ｔｏｌｅｄｏ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６３１）及びびまん性大Ｂ細胞型リンパ腫細胞株ＯＣＩ−Ｌｙ１８（ＤＳＭＺ ＡＣＣ−６９９）。アッセイを、実施例５．３においてＦＡＰ発現ＭＶ−３及びＷＭ−２６６−４腫瘍細胞株について記載したようにして実施した。
【0709】
ゲートを生存腫瘍細胞上に設定し、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ ＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片のＭＦＩを、標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合コンストラクトの滴定濃度に対してブロッティングした。
【0710】
図３７Ａは、実施例７．１において調製されたコンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５及び３．６の、びまん性大非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−８に対する結合を示し、また図３７Ｂには、コンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５及び３．６の、急性Ｂ細胞前駆体リンパ性白血病細胞株Ｎａｌｍ６に対する結合が提示されている。図３７Ｃは、コンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５及び３．６の、びまん性大細胞リンパ芽球性リンパ腫細胞株Ｔｏｌｅｄｏに対する結合を示しており、図３７Ｄは、コンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５及び３．６の、びまん性大Ｂ細胞型リンパ腫細胞株ＯＣＩ−Ｌｙ１８に対する結合を示している。表７９は、コンストラクト３．１、３．３、３．４、３．５及び３．６とコントロール分子について測定されたＥＣ５０値を示す。
【0711】
表７９：ＣＤ１９発現腫瘍細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0712】
実施例１０ＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生物活性
１０．１．ヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化
ヒト４−１ＢＢ及びＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞を、実施例６．１に記載のようにして生成した。
【0713】
ＣＤ１９発現腫瘍細胞と共培養されたヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼヒト−４−１ＢＢ ＨｅＬａ細胞を採取し、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に、０．２ｘ１０６細胞／１ｍｌの濃度となるように再懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌ（２ｘ１０４個の細胞）を、蓋付き滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定濃度のＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＣＤ１９分裂４−１ＢＢＬ三量体）又はＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体）を含む５０μＬの培地を加えた。ＣＤ１９発現Ｂ細胞リンパ腫細胞株（びまん性大非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）細胞株ＳＵ−ＤＨＬ−８（ＤＳＭＺ ＡＣＣ５７３）及びヒト非ホジキンＢ細胞リンパ腫細胞株Ｐｆｅｉｆｆｅｒ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２６３２））を、２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度となるように１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に再懸濁した。
【0714】
ＣＤ１９発現Ｂ細胞リンパ腫細胞（５０μｌ、最終比１：５）の懸濁液又は培地のみを各ウェルに加え、プレートを６時間３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで二度洗浄した。４０μｌの新しく調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ−Ｎｏ：Ｅ３９７１）を各ウェルに加え、プレートを一晩−２０℃で貯蔵した。翌日、凍結した細胞プレート及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ １０００ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｅ４５５０）を、室温で温めた。１００μＬの検出バッファーを各ウェルに加え、ルシフェラーゼ活性を、ＳｐｅｃｔｒａＭａ×Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及び発光をＵＲＬ（０．５秒／ウェルの放出光の単位）でカウントするＳｏｆｔＭａ×Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）又はＶｉｃｔｏｒ３ １４２０ マルチラベルカウンタープレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及びカウント毎秒（ＣＰＳ）として発光をカウントするＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２０３０ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄを用いて測定し、試験したコンストラクトの濃度に対してブロッティングした。
【0715】
ＣＤ１９標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子コンストラクト３．１及び３．３は、ＣＤ１９発現Ｂ細胞リンパ腫細胞の存在下で、レポーター細胞株内にＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路の活性化をトリガーした。対照的に、非標的化コントロール分子は、試験された濃度のいずれにおいてもそのような効果をトリガーできなかった（図３８）。
【0716】
実施例１１１１．１ ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製
１１．１．１ 抗ＣＥＡクローンＴ８４．６６のヒト化
マウス抗体Ｔ８４．６６の新規ヒト化変異体（Wagener et al., J Immunol 130, 2308 （1983）, Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 （1985））を、ヒト生殖系列フレームワークアクセプター配列上にＣＤＲを移植することにより発生させた。
【0717】
非ヒト起源の抗体のヒト化は、基本的に、ＣＤＲ残基を非ヒト抗体（ドナー）からヒト（アクセプター）抗体のフレームワーク上に移植することからなる。通常、アクセプターフレームワークが、ドナーの配列をアクセプター配列候補の集合に合わせて整列させ、ドナーに対する妥当な相同性を有するか、又は構造及び活性に重要ないくつかの位置に類似のアミノ酸を示す一つを選ぶことにより、選択される。本例の場合、抗体アクセプターフレームワークのサーチは、マウスＴ８４．６６タンパク質（重鎖についてはＮＣＢＩ Ａｃｃ Ｎｏ：ＣＡＡ３６９８０（配列番号３１７）、及び軽鎖についてはＣＡＡ３６９７９（配列番号３１８））配列を、ヒト生殖系列配列の集合に合わせて整列させ、高い配列同一性を示したヒト配列を選ぶことにより実施された。ここでは、ＩＭＧＴデータベースから重鎖フレームワークアクセプター配列（ＩＭＧＴ Ａｃｃ Ｎｏ．Ｚ１４３０９、配列番号３１９）として配列ＩＧＨＶ１−６９＊０８が選ばれ、ＩＧＫＶ３−１１＊０１配列（ＩＭＧＴ Ａｃｃ Ｎｏ．Ｘ０１６６８、配列番号３２０）が軽鎖のフレームワークアクセプターとして選ばれた。これら二つのアクセプターフレームワーク上に、マウス重鎖及び軽鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を移植した。フレームワーク４（ＦＲ４）領域は生殖系列Ｖ遺伝子の可変領域の一部ではないため、その位置のための整列は個々に行われた。重鎖にはＪＨ４配列が、軽鎖にはＪＫ２配列が、それぞれ選ばれた。
【0718】
１１．１．２ 細胞に対するＴ８４．６６ ＩｇＧの異なるヒト化変異体の結合Ｔ８４．６６ ＩｇＧの異なるヒト化変異体の結合を、ＣＥＡ発現ヒト胃腺癌細胞（ＭＫＮ４５、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４０９）上において試験した。
【0719】
細胞を、採取し、カウントし、生存能力をチェックし、ＦＡＣＳバッファー（１００μｌのＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡ）中２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。１００μｌの細胞懸濁液（０．２ｘ１０６個の細胞を含有）を、漸増濃度のＣＥＡ ＩｇＧ（４ｎｇ／ｍｌ−６０μｇ／ｍｌ）と共に丸底９６ウェルプレートで３０分間４℃でインキュベートし、冷たいＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで２度洗浄し、ＰＥ−コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃｇ断片特異的二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ ＰＥ ＃１０９−１１６−１７０）と共にさらに３０分間４℃で再インキュベートし、冷たいＰＢＳ ０．１％ ＢＳＡで２度洗浄し、ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＩＩ（Ｓｏｆｔｗａｒｅ ＦＡＣＳ Ｄｉｖａ）を用いるＦＡＣＳにより直ちに分析した。結合曲線及びＥＣ５０値を得て、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５を用いて計算した。
【0720】
図３９は、ＭＫＮ４５細胞上に発現された、Ｔ８４．６６ ＩｇＧの選択されたヒト化変異体の、ヒトＣＥＡに対する異なる結合パターンを示している。計算されたＥＣ５０結合値（表８０）に基づいて、ヒト化変異体１をさらなる評価のために選択した。
【0721】
表８０：細胞に対するＴ８４．６６ ＩｇＧの異なるヒト化変異体の結合（ＥＣ５０値、図３９に示される結合曲線に基づく、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍにより計算）[この文献は図面を表示できません]
【0722】
ヒト化変異体１は、以下のＴ８４．６６−ＬＣＨＡに命名される。そのＣＤＲとＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、並びに親キメラＴ８４．６６クローンのＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を表８１に示す。
【0723】
表８１：ＣＥＡクローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ及びその親抗体Ｔ８４．６６の可変ドメインのアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
【0724】
１１．２ ＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製ヒト４−１ＢＢリガンドのエクトドメイン（アミノ酸７１−２５４、及び７１−２４８）のＤＮＡ配列コード化部分の異なる断片を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ４１２７３配列（配列番号４２）に従って合成した。
【0725】
１１．２．１ 荷電残基を含む交差ＣＨ１−ＣＬドメインを含む一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．１）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ｂに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0726】
正確な対合を向上させるために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬに導入された。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【0727】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0728】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＥＡ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４０、コンストラクト５．１）。
【0729】
表８２は、交差ＣＨ−ＣＬ及び荷電残基を含む一価のＣＥＡ Ｔ８４．６６（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0730】
表８２：荷電残基を含むＣＨ−ＣＬクロスを含む一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト５．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
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【0731】
１１．２．２ 荷電残基のない交差ＣＨ１−ＣＬドメインを含む一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．２）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すものと同様に、但しＣＤドメインにおけるアミノ酸突然変異（ヒト４−１ＢＢリガンドなしで（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）、クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ｂに示すものと同様に、但しＣＨ１ドメインにおけるアミノ酸突然変異（ヒト４−１ＢＢリガンドなしで（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（ＣＨ１）２コネクター、ヒトＣＬ）、クローニングした。
【0732】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。
【0733】
Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＥＡ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４０、コンストラクト５．２）。
【0734】
表８３は、荷電残基のない交差ＣＨ−ＣＬクロスを含む一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0735】
表８３：荷電残基のないＣＨ−ＣＬクロスを含む一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト５．２）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
【0736】
１１．２．３ 二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合（コンストラクト５．３）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図２９Ｃに示すように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させた。図２９Ｄに記載のように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したポリペプチド。
【0737】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ）を、ヒトＩｇＧ１の定常軽鎖、ノブ又はホールの定常重鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４０、コンストラクト５．３）。
【0738】
表８４は、二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．３）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0739】
表８４：二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）ＰＧＬＡＬＡ融合体（コンストラクト５．３）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
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[この文献は図面を表示できません]
【0740】
１１．２．４ 荷電残基を含む交差ＣＨ１−ＣＬドメインを含む一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．４）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すものと同様に（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ｂに示すものと同様に（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0741】
ヒトＣＬドメインに融合した二量体４−１ＢＢリガンドをコードするポリペプチドを、ノブ上のヒトＩｇＧ１重鎖ＣＨ２及びＣＨ３ドメインとインフレームでサブクローニングした（Merchant, Zhu et al. 1998）。正確な対合を向上させるために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬに導入された。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【0742】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、ＦＣガンマ受容体に対する結合を抑止するために、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａの突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４０、コンストラクト５．４）。
【0743】
表８５は、交差ＣＨ−ＣＬ及び荷電残基を含む、一価のＣＥＡ Ｔ８４．６６（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0744】
表８５：荷電残基を含むＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト５．４）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
【0745】
１１．２．５ 荷電残基のない交差ＣＨ１−ＣＬドメインを含む一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．５）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すものと同様に、但しＣＬドメインにおけるアミノ酸突然変異なしで（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）、クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨ１ドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ｂに示すものと同様に、但しＣＨ１ドメインにおけるアミノ酸突然変異なしで（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（ＣＨ１）２コネクター、ヒトＣＬ）、クローニングした。
【0746】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＥＡ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＤ１９結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４０、コンストラクト５．５）。
【0747】
表８６は、荷電残基のない交差ＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．５）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0748】
表８６：荷電残基のないＣＨ−ＣＬ交差を含む、一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト５．５）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。[この文献は図面を表示できません]
【0749】
１１．２．６ 二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合（コンストラクト５．６）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）の二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図２９Ｃに示すように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させた。図２９Ｄに記載のように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したポリペプチド。
【0750】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローンＴ８４．６６−ＬＣＨＡ）を、ヒトＩｇＧ１の定常軽鎖、ノブ、又はホールの定常重鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４０、コンストラクト５．６）。
【0751】
表８７は、二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．６）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0752】
表８７：二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト５．６）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
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【0753】
１１．２．７ 荷電残基を含む交差ＣＨ１−ＣＬドメインを含む、一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．７）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ａに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合したポリペプチドを、図２９Ｂに示すように（ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0754】
正確な対合を向上させるために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬに導入された。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【0755】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローンＴ８４．６６）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0756】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＣＤ１９−Ｆｃホール鎖、及び抗ＣＤ１９軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及びＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。コンストラクト５．７は、図４０に示すコンストラクト５．１に対応する。
【0757】
表８８は、交差ＣＨ−ＣＬ及び荷電残基を含む一価のＣＥＡ Ｔ８４．６６（Ｔ８４．６６）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．７）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0758】
表８８：荷電残基を含む交差ＣＨ−ＣＬを含む、一価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト５．７）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
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【0759】
１１．２．８ 二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６）標的化４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．８）の調製（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離された４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の二つのエクトドメインを含むポリペプチドを、図２９Ｃに示すように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃホール鎖のＣ末端に融合させた。図２９Ｄに記載のように（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒト４−１ＢＢリガンド）、４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）の一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃノブ鎖のＣ末端に融合したポリペプチド。
【0760】
ＣＥＡに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローンＴ８４．６６）を、ヒトＩｇＧ１の定常軽鎖、ノブ又はホールの定常重鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異をノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ホール二量体リガンド鎖、Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む抗ＣＥＡ ｈｕＩｇＧ１ノブ単量体リガンド鎖、及び抗ＣＥＡ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体４−１ＢＢリガンド及び二つのＣＥＡ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする。コンストラクト５．８は、図４０に示すコンストラクト５．３に対応する。
【0761】
表８９は、二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト５．８）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0762】
表８９：二価のＣＥＡ（Ｔ８４．６６）標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）ＰＧＬＡＬＡ融合体（コンストラクト５．８）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
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【0763】
１１．３ コントロール分子としての非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合分子及びヒトＩｇＧの調製１１．３．１ 非標的化ヒト４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（コントロール分子）の調製
これらコントロール分子は、ＣＥＡ標的化コンストラクト３．１（コントロールＢと呼ぶ）、３．３（コントロールＣと呼ぶ）、３．４（コントロールＤと呼ぶ）及び３．５（コントロールＥと呼ぶ）について上述したように調製し、但し唯一の相違点として抗ＣＤ１９バインダー（ＶＨ−ＶＬ）を、抗原に結合しない生殖系列コントロール（ＤＰ４７と呼ぶ）により置き換えた（図４０参照）。コントロールＢ、即ち荷電残基を含む交差ＣＨ−ＣＬを含む一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列が上記表６８に示されている（実施例７．３．１参照）。表６９は、二価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２５４）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＣ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。表７０は、荷電残基を含むＣＨ−ＣＬクロスを含む一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＤ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。表７１は、ＣＨ−ＣＬクロスに荷電残基のない一価のＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンド（７１−２４８）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合体（コントロールＥ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0764】
１１．３．２ コントロール分子としての抗体アッセイに使用されるさらなるコントロール（コントロールＦと呼ぶ）は、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含む非標的化ＤＰ４７、生殖系列コントロール、ヒトＩｇＧ１であり、Ｆｃガンマ受容体に対する結合を抑止する。コントロールＦのｃＤＮＡ及びアミノ酸配列は、上記表７３に見ることができる。
【0765】
１１．４ ＣＥＡ標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合抗原結合分子及びそのコントロール分子の調製標的化及び非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子コード化配列を、プラスミドベクター中にクローニングした。これは、ＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を誘導するものであり、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ｐｏｌｙＡ配列を含む。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【0766】
分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体を、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成した。細胞には、対応する発現ベクターがトランスフェクトされた。変異体１，２，４，５及びそのコントロールＢ、Ｄ及びＥのために、１：１：１：１の比（「ベクター二量体リガンド−ＣＬ−ノブ鎖」：「ベクター単量体リガンド融合−ＣＨ１」：「ベクター抗ＣＥＡ Ｆａｂ−ホール鎖」：「ベクター抗ＣＥＡ軽鎖」）で。変異体３、６及びそのコントロールＣのために、１：１：１の比（「ベクターｈｕＩｇＧ１ Ｆｃホール二量体リガンド鎖」：「ベクターｈｕＩｇＧ１ Ｆｃノブ単量体リガンド鎖」：「ベクター抗ＣＥＡ軽鎖」）で。アッセイにおいてコントロールとして用いたヒトＩｇＧは、二重特異性コンストラクトのためとして生成された（トランスフェクションのためだけに、軽鎖のベクター及び重鎖のベクターを１：１の比で使用した）。
【0767】
５００ｍＬの振盪フラスコ内での生成のために、３億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を１０分間２１０×ｇで遠心分離し、上清を、２０ｍＬの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地により置き換えた。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に混合した。５４０μＬのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰＥＰＳＯＹ及び１．２ｍＭのバルプロ酸を補った１６０ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１２％のＦｅｅｄ（アミノ酸及びグルコース）を加えた。７日間の培養後、上清を、３０〜４０分間少なくとも４００×ｇで遠心分離することにより収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に維持した。
【0768】
分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体、並びにＩｇＧを、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５−１５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの樹脂）に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容積の同じバッファーによる洗浄により除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）による直線勾配（２０ＣＶ）又は段階的溶出（８ＣＶ）を用いて溶出した。直線勾配については、さらに４カラム容積の段階的溶出を適用した。
【0769】
収集された画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより調節した。タンパク質を濃縮した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【0770】
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。標的化三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の純度及び分子量を、還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下で、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅＴＭ ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵＳＡ）で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより又はノギスＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＣＥ−ＳＤＳにより、分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−アルギニン一塩酸塩、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ、ｐＨ６．７ ２５℃のランニングバッファー中において平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【0771】
表９０は、ＣＥＡ標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0772】
表９０：ＣＥＡ標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の生化学分析。[この文献は図面を表示できません]
【0773】
表９１は、一価（コントロールＢ、Ｄ及びＥ）及び二価（コントロールＣ）両方のＣＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合分子と、生殖系列ＤＰ４７ヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）の、収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0774】
表９１：ＤＰ４７非標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0775】
実施例１２ＣＥＡ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の機能的特徴付け
１２．１ 表面プラズモン共鳴（同時結合）
ＣＥＡ標的化三量体分裂４−１ＢＢＬコンストラクトの抗原としてのｈｕ ＮＡ３Ｂ３Ａ２の生成
ＳＰＲによるＣＥＡへの結合を評価するために使用された抗原は、ＮＡＢＡについて記載されたもの（Durbin H. et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 May 10;91（10）:4313-7）と同様に、ヒトＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ）由来のＡ３及びＢ３ドメインと、ヒトＣＥＡＣＡＭ１（ＢＧＰ１）由来のＮ及びＡ２ドメインからなるハイブリッド分子であった。この抗原は、本明細書でＮＡ３Ｂ３Ａ２と命名され、模式的説明を図４１Ａに見ることができる。
【0776】
表９２は、ｈｕ ＮＡ３Ｂ３Ａ２−ａｖｉ−Ｈｉｓのヌクレオチド及びアミノ酸配列を示している。
【0777】
表９２：ｈｕ ＮＡ３Ｂ３Ａ２−ａｖｉ−Ｈｉｓのヌクレオチド及びアミノ酸配列[この文献は図面を表示できません]
[この文献は図面を表示できません]
【0778】
タンパク質生成を、Ｆｃ融合タンパク質について上記したように実施した（実施例７．１．１）．。分泌タンパク質を、細胞培養物の上清から、キレートクロマトグラフィーと、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。第１のクロマトグラフィ工程を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｎＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）で平衡化したＮｉＮＴＡ Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌ、Ｑｉａｇｅｎ）上で実施した。溶出は、５％から４５％の溶出バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｎＭの塩化ナトリウム、５００ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４））の１２カラム容積での勾配を適用することにより実施された。
【0779】
タンパク質を濃縮及び濾過した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×７５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。表９３は、ヒトＮＡ３Ｂ３Ａ２−ａｖｉ−Ｈｉｓの収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0780】
表９３：ヒトＮＡ３Ｂ３Ａ２−ａｖｉ−Ｈｉｓの生化学分析[この文献は図面を表示できません]
【0781】
ヒト４−１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）及びヒトＮＡ３Ｂ３Ａ２に対する同時結合能を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。すべてのＳＰＲ実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００において、ランニングバッファーとしてＨＢＳ−ＥＰ（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０、Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ／Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２５℃で行われた。ビオチン化ヒト４−１ＢＢ Ｆｃ（ｋｉｈ）を、ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーチップのフローセルに直接結合させた。２５０共鳴単位（ＲＵ）以下の固定化レベルを用いた。
【0782】
ＣＥＡ標的化三量体分裂４−１ＢＢＬコンストラクト（コンストラクト５．４、５．６、５．７及び５．８）を、２００ｎＭの濃度範囲及び３０μＬ／分の流れで、フローセルに９０秒間通過させ、解離をゼロ秒に設定した。ヒトＮＡ３Ｂ３Ａ２を、第２の被分析物として、３０μＬ／分の流れでフローセルを通して９０秒間５００ｎＭの濃度で注入した（図４１Ｂ）。解離を１２０秒間モニターした。バルク屈折率の差異は、タンパク質が固定化されていない基準フローセルで取得される応答を差し引くことにより修正された。
【0783】
図４２のグラフに見ることができるように、すべての二重特異性コンストラクトはヒト４−１ＢＢ及びヒトＮＡ３Ｂ３Ａ２に同時に結合することができた。
【0784】
１２．２．ＣＥＡ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子の活性化ヒトＰＭＢＣに対する結合４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子のヒトＰＢＭＣに対する結合を決定するために、異なる滴定濃度のＣＥＡ標的化４−１ＢＢＬ三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子を、実施例５．２に記載のようにしてアッセイに用いた。
【0785】
図４３は、実施例１１で調製されたコンストラクト５．４、５．６、５．７及び５．８の、活性化４−１ＢＢ発現ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合をそれぞれ示している。ゲートを生存ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ４＋ ｏｒ ＣＤ４５＋ ＣＤ３＋ ＣＤ８＋ Ｔ細胞上に設定し、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ ＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片のＭＦＩを、標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合変異体の滴定濃度に対してブロッティングした。表９４は、コンストラクト５．４、５．６、５．７及び５．８とコントロール分子について測定されたＥＣ５０値を示す。
【0786】
表９４：活性化４−１ＢＢ発現ＣＤ４＋ Ｔ細胞及びＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0787】
１２．２ ＣＥＡ発現腫瘍細胞に対する結合ＣＥＡ発現腫瘍細胞に対する結合アッセイのために、以下のヒトＣＥＡ発現リンパ腫細胞株を用いた：ＣＥＡ発現腫瘍細胞株ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ−４５（ＡＴＣＣ ＴＣＰ−１００８）及びヒト結腸直腸腺癌細胞株ＬＳ１８０（ＡＴＣＣ ＣＬ−１８７）。アッセイを、実施例５．３においてＦＡＰ発現ＭＶ−３及びＷＭ−２６６−４腫瘍細胞株について記載したようにして実施した。
【0788】
ゲートを生存腫瘍細胞上に設定し、ＰＥコンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ ＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＦ（ａｂ’）２断片のＭＦＩを、標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ融合コンストラクトの滴定濃度に対してブロッティングした。
【0789】
図４４は、実施例１１．２．７で調製されたコンストラクト５．７の、ヒト−ＣＥＡ発現ヒト胃細胞株ＭＫＮ−４５（左）及びヒト結腸直腸腺癌細胞株ＬＳ１８０（右）に対する結合を示している。表９５は、ヒト−ＣＥＡ発現ヒト胃細胞株ＭＫＮ−４５に測定されたＥＣ５０値を示している。
【0790】
表９５：ＣＥＡ発現腫瘍細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0791】
実施例１３ＣＥＡ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の生物活性
１３．１．ヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化
ヒト４−１ＢＢ及びＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞を、実施例６．１に記載のようにして生成した。
【0792】
ヒトＣＥＡ発現腫瘍細胞と共培養されたヒト４−１ＢＢを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化ＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼヒト−４−１ＢＢ ＨｅＬａ細胞を採取し、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に、０．２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度となるように再懸濁した。この細胞懸濁液１００μｌ（２ｘ１０４個の細胞）を、蓋付き滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０８３）の各ウェルに移し、プレートを３７℃及び５％のＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、滴定濃度のＣＥＡ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＣＥＡ分裂４−１ＢＢＬ三量体）又はＤＰ４７非標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子（ＤＰ４７分裂４−１ＢＢＬ三量体）を含む５０μＬの培地を加えた。ＣＥＡ発現腫瘍細胞株ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ−４５（ＡＴＣＣ ＴＣＰ−１００８）を、１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ及び１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉを供給したＤＭＥＭ培地に、２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度となるように再懸濁した。
【0793】
ＣＥＡ発現Ｂ細胞リンパ腫細胞（５０μｌ、最終比１：５）の懸濁液又は培地のみを各ウェルに加え、プレートを６時間３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。細胞を、２００μＬ／ウェルのＤＰＢＳで二度洗浄した。４０μｌの新しく調製したＲｅｐｏｒｔｅｒ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ−Ｎｏ：Ｅ３９７１）を各ウェルに加え、プレートを一晩−２０℃で貯蔵した。翌日、凍結した細胞プレート及びＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ １０００ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｅ４５５０）を、室温で温めた。１００μＬの検出バッファーを各ウェルに加え、ルシフェラーゼ活性を、ＳｐｅｃｔｒａＭａ×Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー及び発光をＵＲＬ（０．５秒／ウェルの放出光の単位）でカウントするＳｏｆｔＭａ×Ｐｒｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）又はＶｉｃｔｏｒ３ １４２０ マルチラベルカウンタープレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）及びカウント毎秒（ＣＰＳ）として発光をカウントするＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２０３０ Ｍａｎａｇｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅａｎｄを用いて測定し、試験したコンストラクトの濃度に対してブロッティングした。
【0794】
ＣＥＡ標的化４−１ＢＢリガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子コンストラクト５．７及び５．８は、ヒト胃がん細胞株ＭＫＮ−４５細胞の存在下で、レポーター細胞株内にＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路の活性化をトリガーした。対照的に、非標的化コントロール分子は、試験された濃度のいずれにおいてもそのような効果をトリガーできなかった（図４５）。表９６は、対応するＥＣ５０値を示す。
【0795】
表９６：ＣＥＡ発現腫瘍細胞に対する結合[この文献は図面を表示できません]
【0796】
実施例１４１４．１ ＦＡＰ標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の調製
ヒトＯＸ４０リガンドのエクトドメイン（アミノ酸５１−１８３）のＤＮＡ配列コード化部分を、ＵｎｉｐｒｏｔデータベースのＰ２３５１０配列に従って合成した。グリコシル化によるヒトＯｘ４０リガンドの不均一性を低下させるために、９０位及び１１４位のアスパラギン残基を、部位特異的突然変異誘発によりアスパラギン酸に突然変異させた（Compaan D.M., Hymowitz S.G., Structure （2006） 14（8）, 1321-30に従って）。
【0797】
（Ｇ４Ｓ）２リンカーにより分離されたＯＸ４０リガンドの二つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＬドメインに融合したポリペプチドを、図４６Ａに示すように（ヒトＯＸ４０リガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＯＸ４０リガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＬ）クローニングした。
【0798】
ＯＸ４０リガンドの一つのエクトドメインを含み、ヒトＩｇＧ１−ＣＨドメインに融合したポリペプチドを、図４６Ｂに示すように（ヒトＯＸ４０リガンド、（Ｇ４Ｓ）２コネクター、ヒトＣＨ）クローニングした。
【0799】
正確な対合を向上させるために、以下の突然変異が交差ＣＨ−ＣＬに導入された。ヒトＣＬに融合した二量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｅ１２３Ｒ及びＱ１２４Ｋ。ヒトＣＨ１に融合した単量体４−１ＢＢリガンド内において、Ｋ１４７Ｅ及びＫ２１３Ｅ。
【0800】
ＦＡＰバインダーの生成及び調製は、国際公開第２０１２／０２０００６号に記載されており、この特許文献は参照により本明細書に包含される。
【0801】
ＦＡＰに特異的なバインダーをコードする重鎖及び軽鎖ＤＮＡ配列の可変領域（クローン２８Ｈ１１）を、ホールの定常重鎖又はヒトＩｇＧ１の定常軽鎖とインフレームでサブクローニングした。Ｆｃガンマ受容体への結合を抑止するために、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載される方法に従って、Ｐｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異がノブ及びホール重鎖の定常領域に導入された。
【0802】
Ｓ３５４Ｃ／Ｔ３６６Ｗ突然変異を含む二量体リガンド−Ｆｃノブ鎖、単量体ＣＨ１融合体、Ｙ３４９Ｃ／Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ突然変異を含む標的化抗ＦＡＰ−Ｆｃホール鎖、及び抗ＦＡＰ軽鎖の組み合わせが、構築された三量体ＯＸ４０リガンド及びＦＡＰ結合Ｆａｂを含むヘテロ二量体の生成を可能にする（図４６Ｃ、コンストラクト６．１）。
【0803】
表９７は、交差ＣＨ−ＣＬ及び荷電残基を含む一価のＣＥＡ Ｔ８４．６６（Ｔ８４．６６−ＬＣＨＡ）標的化分裂三量体ＯＸ４０リガンド（５１−１８３）Ｆｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（コンストラクト６．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0804】
表９７：荷電残基を含むＣＨ−ＣＬクロスを含む、一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化分裂三量体ＯＸ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体（コンストラクト６．１）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列。＊荷電残基[この文献は図面を表示できません]
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【0805】
１４．２ コントロールＦとしての非標的化ヒトＩｇＧ１の調製アッセイに使用されたコントロール分子（コントロールＦと呼ぶ（図４６Ｄ））は、国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載された方法に従ってＦｃガンマ受容体に対する結合を抑止するためにＰｒｏ３２９Ｇｌｙ、Ｌｅｕ２３４Ａｌａ及びＬｅｕ２３５Ａｌａ突然変異を含む、非標的化ＤＰ４７、生殖系列コントロール、ヒトＩｇＧ１であった。その調製は実施例２．３に記載されている。表２９は、非標的化ＤＰ４７ ｈｕＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）のｃＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【0806】
１４．３ ＦＡＰ標的化分裂三量体ＯＸ４０リガンドＦｃ融合抗原結合分子及びそのコントロール分子の調製標的化及び非標的化分裂三量体ＯＸ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合コード化配列を、プラスミドベクター中にクローニングした。これは、ＭＰＳＶプロモーターから挿入物の発現を誘導するものであり、ＣＤＳの３’末端に位置する合成ｐｏｌｙＡ配列を含む。加えて、このベクターは、プラスミドのエピソーム維持のためのＥＢＶ ＯｒｉＰ配列を含む。
【0807】
分裂三量体Ｏｘ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体を、ポリエチレンイミンを用いてＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に哺乳動物発現ベクターをコトランスフェクトすることにより生成した。細胞には、対応する発現ベクターがトランスフェクトされた。変異体１，２，４，５及びそのコントロールＢ、Ｄ及びＥのために、１：１：１：１の比（「ベクター二量体リガンド−ＣＬ−ノブ鎖」：「ベクター単量体リガンド融合−ＣＨ１」：「ベクター抗ＦＡＰ Ｆａｂ−ホール鎖」：「ベクター抗ＦＡＰ軽鎖」）で。変異体３、６及びそのコントロールＣのために、１：１：１の比（「ベクターｈｕＩｇＧ１ Ｆｃホール二量体リガンド鎖」：「ベクターｈｕＩｇＧ１ Ｆｃノブ単量体リガンド鎖」：「ベクター抗ＦＡＰ軽鎖」）で。アッセイにおいてコントロールとして用いたヒトＩｇＧは、二重特異性コンストラクトのためとして生成された（トランスフェクションのためにのみ、軽鎖のベクター及び重鎖のベクターを１：１の比で使用した）。
【0808】
５００ｍＬの振盪フラスコ内での生成のために、３億個のＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞をトランスフェクションの２４時間前に播種した。トランスフェクションのために、細胞を１０分間２１０×ｇで遠心分離し、上清を、２０ｍＬの予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地により置き換えた。発現ベクター（２００μｇの全ＤＮＡ）を２０ｍＬのＣＤ ＣＨＯ培地に混合した。５４０μＬのＰＥＩを加えた後、溶液を１５秒間ボルテックスし、室温で１０分間インキュベートした。その後細胞を、ＤＮＡ／ＰＥＩ溶液と混合し、５００ｍｌの振盪フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気のインキュベーター内において３７℃で３時間インキュベートした。インキュベーション後、６ｍＭのＬ−グルタミン、５ｇ／ＬのＰＥＰＳＯＹ及び１．２ｍＭのバルプロ酸を補った１６０ｍＬのＥｘｃｅｌｌ培地を加え、細胞を２４時間培養した。トランスフェクションの一日後、１２％のＦｅｅｄ（アミノ酸及びグルコース）を加えた。７日間の培養後、上清を、３０〜４０分間少なくとも４００×ｇで遠心分離することにより収集した。溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍのフィルター）、最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）となるようにアジ化ナトリウムを補い、４℃に維持した。
【0809】
分裂三量体ＯＸ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子、並びにＩｇＧを、プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーに続いてサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより、細胞培養物上清から精製した。アフィニティークロマトグラフィーのために、上清を、リン酸ナトリウム（２０ｍＭ）、クエン酸ナトリウム（２０ｍＭ）バッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＣＶ＝５−１５ｍＬ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの樹脂）に充填した。未結合のタンパク質を、少なくとも６カラム容積の同じバッファーによる洗浄により除去した。結合したタンパク質を、２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１００ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ３．０）による直線勾配（２０ＣＶ）又は段階的溶出（８ＣＶ）を用いて溶出した。直線勾配については、さらに４カラム容積の段階的溶出を適用した。
【0810】
収集された画分のｐＨを、１／１０（ｖ／ｖ）の０．５Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）を加えることにより調節した。タンパク質を濃縮した後、２０ｍＭのヒスチジン、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、０．０１％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０溶液（ｐＨ６．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅ×２００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。
【0811】
タンパク質濃度を、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）を測定することにより決定した。標的化三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の純度及び分子量を、還元剤（５ｍＭ １，４−ジチオトレイトール）の存在下及び非存在下で、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ＳｉｍｐｌｅＢｌｕｅTM ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＵＳＡ）で染色し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより又はＣａｌｉｐｅｒ ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いるＣＥ−ＳＤＳにより、分析した。試料の凝集物含有量を、２５ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１２５ｍＭのＮａＣｌ、２００ｍＭのＬ−Ａｒｇｉｎｉｎｅ Ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｌｏｒｉｄｅ、０．０２％（ｗ／ｖ）のＮａＮ、ｐＨ６．７ ２５℃のランニングバッファー中において平衡化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ分析的サイズ除外カラム（Ｔｏｓｏｈ）を用いて分析した。
【0812】
表９８は、ＦＡＰ標的化分裂三量体Ｏｘ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子と、生殖系列ＤＰ４７ヒトＩｇＧ１ ＰＧＬＡＬＡ（コントロールＦ）の、収率及び最終的な単量体含有量をまとめたものである。
【0813】
表９８：ＣＥＡ標的化分裂三量体４−１ＢＢリガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合体の生化学分析。[この文献は図面を表示できません]
【0814】
実施例１５標的化ＯＸ４０リガンド三量体含有Ｆｃ融合抗原結合分子の機能的特徴付け
１５．１ ヒトＦＡＰ発現腫瘍細胞に対する結合
細胞表面ＦＡＰに対する結合を、ＷＭ−２６６−４細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６７６）を用いて試験した。０．５ｘ１０５個のＷＭ−２６６−４細胞を、丸底サスペンジョン細胞９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ、ｃｅｌｌｓｔａｒ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５０１８５）の各ウェルに加えた。細胞を、１２０分間４℃で暗所において、滴定された抗Ｏｘ４０抗体コンストラクトを含む、５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファー（ＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１４１９０ ３２６）ｗ／ＢＳＡ（０．１％ ｖ／ｗ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ９４１８）中で染色した。過剰ＦＡＣＳバッファーにより三度洗浄した後、細胞を、４５分間４℃で暗所において、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０９ ０９６ ０９８）を含む、２５μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファー中で染色した。
【0815】
プレートは、最後に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓｃ−３５９８）を含む９０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁され、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて獲得された。
【0816】
図４７Ａに示すように、一価のＦＡＰ（２８Ｈ１）標的化分裂三量体Ｏｘ４０リガンドＦｃ（ｋｉｈ）融合抗原結合分子（ＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌ）はヒトＦＡＰ発現標的細胞に効率よく結合したが、ネガティブコントロールＦは結合しなかった。ＦＡＰ陽性ＷＭ−２６６−４に対する結合のＥＣ５０値は［６．９ｎＭ］であった。
【0817】
１５．２ ＯＸ４０及びＦＡＰ陰性腫瘍細胞に対する結合ＯＸ４０陰性ＦＡＰ陰性腫瘍細胞に対する結合の欠如を、非標識化ヒトＦＡＰ陽性ＷＭ２６６−４細胞からの分離を可能にする、核に限定されたＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ蛍光タンパク質を発現するＡ５４９ ＮｕｃＬｉｇｈｔTM Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４４９１）を用いて試験した。親Ａ５４９（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）に、Ｅｓｓｅｎ ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４４７６；ＥＦ１α、ピューロマイシン）を、標準のＥｓｓｅｎプロトコールに従い、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下において、３（ＴＵ／細胞）のＭＯＩで形質導入した。
【0818】
ＦＡＣＳバッファー中、５ｘ１０４個の非標識化ＷＭ２６６−４細胞と非標識化Ａ５４９ ＮｕｃＬｉｇｈｔTM Ｒｅｄ Ｃｅｌｌｓの混合物を、丸底サスペンジョン細胞９６ウェルプレートの各ウェルに加え、セクション１５．１に記載のようにして結合アッセイを実施した。
【0819】
図４７Ｂに示すように、、ＦＡＰ−ＯＸ４０ＬはＯＸ４０陰性ＦＡＰ陰性ヒト腫瘍細胞に結合しなかった。
【0820】
１５．３ ヒトＯＸ４０発現細胞への結合：ナイーブ及び活性化ヒト末梢単核球白血球（ＰＢＭＣ）バフィーコートをチューリッヒ献血センターから取得した。新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、バフィーコートを同じ容積のＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１４１９０ ３２６）で希釈した。５０ｍＬのポリプロピレン遠心分離管（ＴＰＰ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．９１０５０）に、１５ｍＬのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７（ＳＩＧＭＡ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０７７１、ポリスクロース及びジアトリゾ酸ナトリウム、１．０７７ｇ／ｍＬの密度に調整）を供給し、バフィーコート溶液をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ １０７７の上に重ねた。管を、３０分間４００×ｇ、室温、及び低下速度で、中断なく遠心分離した。その後ＰＢＭＣを、接触面から収集し、ＤＰＢＳで三度洗浄し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１６０００−０４４、Ｌｏｔ９４１２７３、ガンマ線照射、マイコプラズマフリー、５６℃で３５分間熱失活）、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ（ＧＩＢＣＯ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５０５０ ０３８）、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓ８６３６）、１％（ｖ／ｖ）のＭＥＭ非必須アミノ酸（ＳＩＧＭＡ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｍ７１４５）及び５０μＭのβ−メルカプトエタノール（ＳＩＧＭＡ、Ｍ３１４８）を供給した、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ ｂｙ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４２４０１−０４２）からなるＴ細胞培地に再懸濁した。
【0821】
ＰＢＭＣは、単離後直接使用された（休止ヒトＰＢＭＣに結合）か、又はＴ細胞の細胞表面上に強いヒトＯｘ４０の発現を受けるように刺激された（活性化ヒトＰＢＭＣに結合）。したがって、ナイーブＰＢＭＣを、６ウェル組織培養プレートにおいて、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及び２ｕｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌ２７６９−１０）を供給したＴ細胞培地中で四日間、次いで事前コーティングした６ウェル組織培養プレート［４ｕｇ／ｍＬ］抗ヒトＣＤ３（クローンＯＫＴ３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａ．Ｎｏ．１６−００３７−８５）において一晩培養し、［２ｕｇ／ｍＬ］抗ヒトＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ Ｎｏ．１６−０２８９−８５）を、２００Ｕ／ｍＬのＰｒｏｌｅｕｋｉｎを供給したＴ細胞培地において３７℃及び５％ ＣＯ２で培養した。
【0822】
Ｏｘ４０の検出のために、ナイーブヒトＰＢＭＣ及び活性化ヒトＰＢＭＣを混合した。活性化ヒトＰＢＭＣからナイーブを区別するために、ナイーブ細胞を、結合アッセイに先立ってｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖染料（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５−０８４０−８５を用いて標識化した。
【0823】
標識化のために、細胞を、採取し、予め温めた（３７℃）ＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中において細胞密度１ｘ１０７細胞／ｍＬに調整した。ｅＦｌｕｏｒ６７０細胞増殖染料（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．６５−０８４０−８５）を、ＤＰＢＳ中、最終濃度２．５ｍＭ及び最終細胞密度０．５ｘ１０７細胞／ｍＬでナイーブヒトＰＢＭＣの懸濁液に加えた。次いで細胞を、１０分間室温で暗所においてインキュベートした。標識化反応を止めるため、４ｍＬの熱失活したＦＢＳを加え、Ｔ細胞培地で細胞を三度洗浄した。次いで、１ｘ１０５個の休止ｅＦｌｕｏｒ６７０標識化ヒトＰＢＭＣと０．５ｘ１０５個の非標識化活性化ヒトＰＢＭＣの二対一の混合物を、丸底サスペンジョン細胞９６ウェルプレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ，ｃｅｌｌｓｔａｒ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５０１８５）の各ウェルに加えた。
【0824】
細胞を、１２０分間４℃で暗所において、滴定された抗Ｏｘ４０抗体コンストラクトを含む、５０μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファー中で染色した。過剰ＦＡＣＳバッファーで三度洗浄した後、細胞を、４５分間４℃で暗所において、蛍光標識された抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３００５３２）、抗ヒトＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、マウスＩｇＧ１ｋ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０１０４４１）及びフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１０９−０９６−０９８）の混合物を含む、２５μＬ／ウェルの４℃の冷たいＦＡＣＳバッファーで染色した。
【0825】
プレートは、最後に０．２μｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｓｃ−３５９８）を含む９０μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁され、同日に５レーザーＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて獲得された。
【0826】
図４８Ａ及び４８Ｂに示すように、ＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０に陰性である休止ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞又はＣＤ８＋ Ｔ細胞に結合しなかった。対照的に、ＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌは、ＯＸ４０を発現しない活性化ＣＤ８＋又はＣＤ４＋ Ｔ細胞に結合した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞に対する結合は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合よりもはるかに強かった。活性化ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞は、活性化ＣＤ４＋ Ｔ細胞上において検出されるＯＸ４０の一部しか発現しない。ＯＸ４０の発現レベルは、刺激の動力学及び強度に依存しており、本発明の条件は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞上におけるＯＸ４０発現について最適化されたが、ＣＤ８＋ Ｔ細胞については最適化されなかった。したがって、ＯＸ４０発現はＣＤ８ Ｔ細胞上にほとんど誘導されなかった。ＯＸ４０陽性ＣＤ４＋又はＣＤ８＋ Ｔ細胞に対する結合のＥＣ５０値は［０．１５ｎＭ］であった。
【0827】
１５．４ ヒトＯＸ４０及びレポーター遺伝子ＮＦκＢ−ルシフェラーゼを発現するＨｅＬａ細胞におけるＮＦκＢ活性化Ｏｘ４０のそのリガンドに対するアゴニスト結合は、核内因子カッパＢ（ＮＦκＢ）の活性化により下流のシグナル伝達を誘導する（A. D. Weinberg et al., J. Leukoc. Biol. 2004, 75（6）, 962-972）。組み換えレポーター細胞株ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１が、その表面上にヒトＯｘ４０を発現するように生成された。加えて、この細胞株は、ＮＦκＢ−感受性エンハンサーセグメントの制御下において、ルシフェラーゼ遺伝子を含むレポータープラスミドを担持する。Ｏｘ４０のトリガーは、用量依存性のＮＦκＢの活性化を誘導し、ＮＦκＢは核内で位置を変え、そこでレポータープラスミドのＮＦκＢ感受性エンハンサーに結合し、ルシフェラーゼタンパク質の発現を増大させる。ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化を触媒し、その結果発光するオキシルシフェリンを生じる。これは、ルミノメーターにより定量化することができる。したがって、様々な抗Ｏｘ４０分子の、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１レポーター細胞においてＮＦκＢ活性化を誘導する能力が、バイオ活性の評価基準として分析された。
【0828】
接着性のＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１３１５１−０１４）を１０分間３７℃で使用して採取した。細胞を、ＤＰＢＳで一度洗浄し、ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．２２５６１−０２１）、１０％（ｖ／ｖ）の熱失活したＦＢＳ、１ｍＭのＳｏｄｉｕｍ−Ｐｙｒｕｖａｔ及び１％（ｖ／ｖ）の非必須アミノ酸を含むアッセイ培地において細胞密度１．３３ｘ１０５個に調整した。細胞を、蓋付き滅菌白色９６ウェル平底組織培養プレート（ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．６５５０８３）内において１ウェル当たり０．２＊１０５細胞の密度に播種し、インキュベーター（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０）内において一晩３７℃及び５％ ＣＯ２に保持した。
【0829】
翌日、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１を、５時間にわたり、滴定したＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌ又はネガティブコントロールＦを含むアッセイ培地を加えることにより刺激した。抗Ｏｘ４０抗体に対する超架橋の効果を試験するために、二次抗体抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ−断片特異的ヤギＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１０９−００６−０９８）を含む、２５μＬ／ウェルの培地を、１：２の比で加えた（一次抗体の２倍の二次抗体）。インキュベーションの後、上清を吸引し、プレートをＤＰＢＳで二度洗浄した。発光の定量化を、製造者の指示に従ってルシフェラーゼ１００アッセイ系及びレポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｅ４５５０及びＣａｔ−Ｎｏ：Ｅ３９７１の両方）を用いて実施した。簡単に説明すると、細胞を、１０分間にわたり−２０℃で、１ウェル当たり３０ｕＬの１ｘ溶解バッファーを加えることにより溶解した。細胞を、２０分間にわたり３７℃で解凍した後、１ウェル当たり９０ｕＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を加えた。 すべての波長を収集するフィルターなしで５００ｍｓの積分時間刻みを用いるＳｐｅｃｔｒａＭａ×Ｍ５／Ｍ５ｅマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）により発光を直ちに定量化した。放射された発光量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｕｎｉｔｓ（ＵＲＬ））を、ＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞の基礎発光により修正し、Ｐｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて対数的な一次抗体濃度に対してブロットした。曲線は、組み込まれたシグモイド用量応答を用いてフィッティングされた。
【0830】
図４９に示すように、限定された、用量依存性のＮＦｋＢ活性化が、レポーター細胞株にＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌ（左側）を加えることにより既に誘導されていた。抗ヒトＩｇＧ特異的二次抗体によるＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌの超架橋は、濃度依存性にＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を増加させた（右側）。
【0831】
その結果として、ＦＡＰ＋腫瘍細胞株によるコンストラクトの超架橋によるＦＡＰ−Ｏｘ４０ＬのＮＦｋＢ活性化能が試験された。
【0832】
試験した腫瘍細胞株はＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９であった。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９は、マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５８）に、１．５μｇ／ｍＬのＰｕｒｏｍｙｃｉｎ選択の下でｈｕＦＡＰを発現させる発現ベクターｐＥＴＲ４９２１をトランスフェクトすることにより、生成した。ＦＡＰの表面発現を、製造者の指示に従ってＱｕｉｆｉｋｉｔ（Ｄａｋｏ Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｋ００７８）を用いて定量化した。細胞表面のＦＡＰ発現を検出するために使用された一次抗体は、ヒト／マウス交差反応性クローンＦ１１−２４（マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｃａ．Ｎｏ．ＯＰ１８８）であった。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９上での表面発現は、細胞１つ当たりのｈｕＦＡＰが約９００００であった。
【0833】
本明細書に先述のように、接着性のＨｅＬａ＿ｈＯｘ４０＿ＮＦｋＢ＿Ｌｕｃ１細胞を、一晩にわたり、１ウェル当たり細胞０．２＊１０５個の細胞密度で培養し、５時間にわたり、滴定されたＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌを含むアッセイ培地で刺激した。細胞表面ＦＡＰ結合による超架橋の効果を試験するために、ＦＡＰ＋腫瘍細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９を含む、２５μＬ／ウェルの培地を、３対１の比で（１ウェル当たり、レポーター細胞の三倍のＦＡＰ＋腫瘍細胞）共培養した。活性化ＮＦκＢを、ルシフェラーゼ１００アッセイ系及びレポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．Ｅ４５５０及びＣａｔ−Ｎｏ：Ｅ３９７１の両方）を用いて発光を測定することにより定量化した。
【0834】
図５０Ａに示すように、ＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌを加えたとき、ＦＡＰ発現腫瘍細胞の存在はＮＦκＢ媒介性ルシフェラーゼ活性化の誘導を強力に増大させた。それぞれのブロッティングされた用量−応答曲線の曲線下面積を、各コンストラクトのアゴニスト能に関するマーカーとして定量化した。図５０Ａに示すように、細胞表面に提示されるＦＡＰの存在は、より高い架橋を保証し、すなわちＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌのアゴニスト効果を改善するもので、次いでＦｃ特的二次抗体の追加を保証した。
【0835】
１５．５ 最適以下でＴＣＲトリガーされた休止ヒトＰＢＭＣのＯＸ４０媒介性共刺激及び細胞表面ＦＡＰによる超架橋実施例１５．４において、ＦＡＰ＋腫瘍細胞の追加が、ＯＸ４０受容体の強力なオリゴマー形成を提供することにより、ヒトＯｘ４０陽性レポーター細胞株においてＦＡＰ標的化ＯＸ４０Ｌにより誘導されるＮＦｋＢ活性を強力に増大させることができることが示された。同様に、ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞の存在下において、ＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌコンストラクトを、休止ヒトＰＢＭＣ細胞の準最適なＴＣＲ刺激を救済する能力について試験した。
【0836】
ヒトＰＢＭＣ調製物は、（１）休止Ｏｘ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞及び（２）細胞表面、例えばＢ細胞及び単球上に様々なＦｃ−γ受容体分子を有する 抗原提示細胞を含む。ヒトＩｇＧ１アイソタイプの抗ヒトＣＤ３抗体は、そのＦｃ部分で本発明のＦｃ−γ受容体分子に結合し、休止Ｏｘ４０陰性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞上において持続性のＴＣＲ活性化を媒介することができる。次いでこれら細胞は、数時間以内にＯｘ４０を発現し始める。Ｏｘ４０に対する機能的アゴニスト化合物は、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ Ｔ細胞上に存在するＯｘ４０受容体を介してシグナル伝達し、ＴＣＲ媒介性刺激を支持することができる。
【0837】
休止ＣＦＳＥ標識化ヒトＰＢＭＣを、放射されたＦＡＰ＋ ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞及び滴定されたＦＡＰ−Ｏｘ４０Ｌの存在下において、五日間にわたり準最適濃度の抗ＣＤ３抗体で刺激した。Ｔ細胞の生存及び増殖に対する効果を、フローサイトメトリーにより生存細胞中における総細胞数及びＣＦＳＥ希釈をモニターすることにより分析した。
【0838】
マウス胚性線維芽細胞ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞（実施例１５．４参照）を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．１３１５１−０１４）を用いて１０分間３７℃で採取した。細胞を、ＤＰＢＳで一度洗浄した。ＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０）内の滅菌９６ウェル丸底接着組織培養プレート（ＴＰＰ，Ｃａｔ．Ｎｏ．９２０９７）のＴ細胞培地中で一晩３７℃及び５％ ＣＯ２ で、１ウェル当たり ０．２＊１０５細胞の密度で培養した。翌日、それら細胞を、４５００ ＲＡＤの線量を用いるエックス線照射器内で照射して、腫瘍細胞株によりヒトＰＢＭＣが後で過剰増殖することを防止した。
【0839】
ヒトＰＢＭＣを、実施例１５．３に記載したフィコール密度遠心分離により単離した。次いで細胞を、最終濃度［５０ｎＭ］でＣＦＤＡ−ＳＥ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．２１８８）を用いて、１ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞密度のＣＦＳＥにより１０分間３７℃で標識した。その後、細胞を、ＦＢＳ（１０％ ｖ／ｖ）を含む過剰ＤＰＢＳにより二度洗浄した。標識された細胞を、Ｔ細胞培地中において３７℃で３０分間休止させた。その後、非転換ＣＦＤＡ−ＳＥを、ＤＰＢＳによる二度の追加的洗浄工程により除去した。ＣＦＳＥ標識された休止ヒトＰＢＭＣを、１ウェル当たり０．５＊１０５細胞の密度で各ウェルに加えた。最終濃度［２０ｎＭ］の抗ヒトＣＤ３抗体（Rodrigues et al., Int J Suppl 7, 45-50 （1992）及び米国特許第６０５４２９７号に記載されるクローンＶ９、ヒトＩｇＧ１）及びＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌを、示された濃度で加えた。細胞を、インキュベーター（Ｈｅｒａ Ｃｅｌｌ １５０）内において、五日にわたり３７℃及び５％ ＣＯ２で活性化した。次いで細胞を、蛍光性染料コンジュゲート抗体抗ヒトＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３００５３２）及びＣＤ８（クローンＲＰａ−Ｔ８、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．−Ｎｏ．３０１０４４１）を用いて、２０分間４℃で表面染色した。ＦＡＣＳバッファーによる洗浄工程後、細胞を、８５μＬ／ウェルのＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、５レーザーＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＤＩＶＡソフトウェアを有するＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて獲得した。
【0840】
図５１に示すように、本発明のＮＩＨ／３Ｔ３−ｈｕＦＡＰクローン３９細胞によるＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌコンストラクトの超架橋は、ＴＣＲ刺激ヒトＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞において、増殖（上部の「事象」グラフ参照）及び生存（下部の「増殖」グラフ参照）を強力に促進した。ヒトＣＤ８＋ Ｔ細胞上におけるＯＸ４０の低発現と一致して、ＣＤ８＋ Ｔ細胞上におけるＦＡＰ−ＯＸ４０Ｌのアゴニスト効果はＣＤ４＋ Ｔ細胞上よりも弱かった。
【0841】
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【図1】
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【図2-1】
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【図2-2】
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【図3】
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【図4】
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【図5】
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【図6-1】
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【図6-2】
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【図7A】
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【図7B】
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【図8A】
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【図8B】
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【図9】
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【図10】
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【図11A】
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【図11B】
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【図12A】
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【図12B】
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【図13】
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【図14】
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【図15】
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【図16】
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【図17A】
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【図17B】
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【図17C】
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【図18】
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【図19】
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【図20】
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【図21】
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【図22-1】
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【図22-2】
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【図22-3】
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【図23-1】
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【図23-2】
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【図23-3】
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【図24】
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【図25】
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【図26】
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【図27】
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【図28A】
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【図28B】
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【図28C】
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【図29】
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【図30】
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【図31A】
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【図31B】
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【図32】
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【図33】
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【図34】
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【図35】
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【図36A】
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【図36B】
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【図37A】
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【図37B】
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【図37C】
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【図37D】
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【図38】
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【図39】
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【図40】
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【図41】
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【図42】
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【図43】
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【図44】
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【図45】
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【図46】
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【図47A】
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【図47B】
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【図48】
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【図49】
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【図50】
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【図51】
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【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]