特許 6873907 遺伝性眼疾患を治療するための方法及び組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6873907

(24)【登録日】2021年4月23日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】遺伝性眼疾患を治療するための方法及び組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 14/075 20060101AFI20210510BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20210510BHJP

   C12N 15/34 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20210510BHJP

   A61K 31/7105 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20210510BHJP

   A61P 27/06 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20210510BHJP

   A61K 35/30 20150101ALI20210510BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   C07K14/075ZNA

   C12N15/11 Z

   C12N15/113 Z

   C12N15/34

   C12N15/63 Z

   C12N15/861 Z

   C12N7/01

   C12N5/10

   A61K35/76

   A61K31/7105

   A61P27/02

   A61P27/06

   A61K48/00

   A61K35/12

   A61K35/30

   !C12Q1/02

【請求項の数】35

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2017-543944(P2017-543944)

(86)(22)【出願日】2016年2月22日

(65)【公表番号】特表2018-506980(P2018-506980A)

(43)【公表日】2018年3月15日

(86)【国際出願番号】US2016018970

(87)【国際公開番号】WO2016134375

(87)【国際公開日】20160825

【審査請求日】2019年2月20日

(31)【優先権主張番号】62/118,934

(32)【優先日】2015年2月20日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】511293663

【氏名又は名称】ユニバーシティー オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション

(73)【特許権者】

【識別番号】511197958

【氏名又は名称】フォンダッツィオーネ・テレソン

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(72)【発明者】

【氏名】デイビッドソン， ビバリー エル．

(72)【発明者】

【氏名】チェン， ヨン ホン

(72)【発明者】

【氏名】アウリッキオ， アルベルト

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／１５９０３６（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１４−５１８６１４（ＪＰ，Ａ）

【文献】 米国特許第０６３９９５７５（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 Molecular Therapy，２００４年，vol. 9, no. 2，p. 198-208

【文献】 Sci. Tranl. Med.，２０１３年，vol. 5, iss. 189，189ra76

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ

Ｃ１２Ｎ

Ａ６１Ｋ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

眼細胞標的化ペプチドを含む改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、前記標的化ペプチドはＡＡＶを眼細胞に標的化し、前記標的化ペプチドは、アミノからカルボキシへの方向で発現されるアミノ酸配列ＧＳＴＰＰＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）またはアミノ酸配列ＭＰＰＰＴＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）を含む前記カプシドタンパク質。

【請求項2】

前記標的化ペプチドが、アミノからカルボキシへの方向で発現される、アミノ酸配列ＧＳＴＰＰＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）またはアミノ酸配列ＭＰＰＰＴＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）からなる請求項１に記載のカプシドタンパク質。

【請求項3】

前記標的化ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の、Ｐ３４−Ａ３５、Ｔ１３８−Ａ１３９、Ａ１３９−Ｐ１４０、Ｇ４５３−Ｔ４５４、Ｎ５８７−Ｒ５８８及び／またはＲ５８８−Ｑ５８９の位置で、ＡＡＶ２カプシド残基の間に挿入される請求項１に記載のカプシドタンパク質。

【請求項4】

前記標的化ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の、Ｄ３８４、Ｇ３８５、Ｉ５６０、Ｔ５６１、Ｎ５６２、Ｅ５６３、Ｅ５６４、Ｅ５６５、Ｎ７０４及び／またはＹ７０５の位置で、ＡＡＶ９カプシド残基の後に挿入される請求項１に記載のカプシドタンパク質。

【請求項5】

前記カプシドタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を含むかまたはそれからなる請求項１に記載のカプシドタンパク質。

【請求項6】

前記標的化ペプチドは罹患した眼細胞を標的とする請求項１に記載のカプシドタンパク質。

【請求項7】

前記標的化ペプチドは、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒの先天性黒内障、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、脊髄小脳失調症タイプ７（ＳＣＡＴ）、色盲、及びムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症、を有する被験体の眼細胞を標的とする、請求項６に記載のカプシドタンパク質。

【請求項8】

前記ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ−Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、ＡＡＶＲｈ１０、またはこれらの血清型の改変カプシドである請求項１〜７のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質。

【請求項9】

前記ＡＡＶがＡＡＶ２カプシドである請求項８に記載のカプシドタンパク質。

【請求項10】

請求項１〜９のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質をコードする核酸。

【請求項11】

核酸配列ＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む請求項１０に記載の核酸。

【請求項12】

請求項１〜９のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質を含有するＡＡＶウイルス。

【請求項13】

請求項１〜９のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質を含有するウイルスベクター。

【請求項14】

前記ウイルスベクターが、さらに、目的の核酸をコードする核酸配列を含む請求項１３に記載のウイルスベクター。

【請求項15】

前記目的の核酸が治療薬である請求項１４に記載のウイルスベクター。

【請求項16】

前記治療薬が酵素またはＲＮＡｉ分子である請求項１５に記載のウイルスベクター。

【請求項17】

前記治療薬が、アタキシン７ ｍｉｒＲＮＡ、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ ６５）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤または可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｉｆ１）、（Ｒａｂエスコートタンパク質−１）ＲＥＰ１、Ｌ−オプシン、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ホスホジエステラーゼ６（３（ＰＤＥ６Ｉ３）、ＡＴＰ結合カセット，サブファミリーＡ，メンバー４（ＡＢＣＡ４）、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、網膜変性，遅い／ペリフェリン（ＲＤＳ／ペリフェリン）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｒ（ＭＥＲＴＫ）、イノシン−５プライムモノホスフェートデヒドロゲナーゼ，Ｉ型（ＩＭＰＤＨＩ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、アリール−炭化水素相互作用タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、網膜色素変性ＧＴＰアーゼレギュレーター相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰＩ）、イノシン−５−プライムモノホスフェートデヒドロゲナーゼ，Ｉ型（ＩＭＰＤＨ１グアニンヌクレオチド結合タンパク質、アルファト形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）、環状ヌクレオチド依存性チャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、レチノサチシン１（Ｒｓ１）、眼球白内障１型（ＯＡ１）、眼皮膚白皮症型１（ＯＣＡ１）チロシナーゼ、Ｐ２１ ＷＡＦ−１／Ｃｉｐｌ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エンドスタチンアンギオスタチン、アリールスルファターゼＢ、または１３−グルクロニダーゼである請求項１５に記載のウイルスベクター。

【請求項18】

請求項１２に記載のＡＡＶウイルスまたは請求項１３〜１７のいずれかに１項に記載のウイルスベクター及び担体を含む組成物。

【請求項19】

請求項１２に記載のＡＡＶウイルスまたは請求項１３〜１７のいずれかに１項に記載のウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。

【請求項20】

請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む細胞。

【請求項21】

前記細胞が哺乳動物細胞である請求項２０に記載の細胞。

【請求項22】

前記細胞がヒト細胞である請求項２１に記載の細胞。

【請求項23】

前記細胞が非ヒト細胞である請求項２１に記載の細胞。

【請求項24】

前記細胞がインビトロであり、任意に前記細胞が眼細胞である請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項25】

前記細胞がインビボであり、任意に前記細胞が眼細胞である請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞。

【請求項26】

哺乳動物の眼疾患を治療するための、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のウイルスベクターまたは請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の細胞を含む組成物。

【請求項27】

前記哺乳動物がヒトである請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記疾患が、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒの先天性黒内障、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、ＳＣＡＴ、色盲、またはＭＰＳ ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症である請求項２６または２７に記載の組成物。

【請求項29】

請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む、被験体の眼への薬剤の送達のための組成物であって、眼細胞は前記組成物を形質導入されることを特徴とし、前記形質導入された眼細胞が前記治療薬を発現し、前記組成物が前記被験体の眼に送達される、組成物。

【請求項30】

前記細胞が形質導入された眼細胞であり、前記形質導入された眼細胞が、網膜外網状層（ＯＰＬ）内にあるか、それを含む請求項２６に記載の組成物。

【請求項31】

医学的処置または診断に使用するための、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む組成物。

【請求項32】

哺乳動物の眼疾患を治療するために有用な医薬を調製するための、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のウイルスベクターの使用。

【請求項33】

医学的処置または診断に使用するための、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞を含む組成物。

【請求項34】

哺乳動物の眼疾患を治療するために有用な医薬を調製するための、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の細胞の使用。

【請求項35】

哺乳動物の眼疾患の予防的または治療的処置に使用するための、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０１５年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／１１８，９３４号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

序論
遺伝子導入は、現在、細胞レベル及び分子レベルの両方で生物学的事象及び疾患プロセスの分析のための強力なツールとして広く認識されている。最近、遺伝性（例えば、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損）または後天性（例えば、癌または感染性疾患）のいずれかのヒト疾患の治療のために遺伝子治療を適用することがかなり注目を集めている。改善された遺伝子導入技術の出現と、欠損遺伝子関連疾患のますます拡大するライブラリーの同定により、遺伝子治療は治療理論から現実の事実に急速に発展した。

【0003】

伝統的に、遺伝子治療は、先天性遺伝子異常を修正するために、患者の細胞に外因性遺伝子を導入する手順として定義されてきた。現在、４５００以上のヒトの疾患が遺伝的に分類されているが、ヒトゲノムの特異的突然変異は、これらの疾患の比較的少ないものとして特定されている。最近まで、これらのまれな遺伝病は、遺伝子治療努力の排他的な標的であった。従って、今日までのＮＩＨ認可の遺伝子療法プロトコールの大部分は、既知の先天性遺伝子異常を有する個体の体細胞に欠損遺伝子の機能的コピーを導入することに向けられている。最近では、ほとんどのヒト癌、ある種の心臓血管疾患、及び多くの変性疾患にも重要な遺伝的要素があり、新規遺伝子治療の設計のためには、それらは「遺伝的障害」とみなされるべきであると研究者や臨床医は認識し始めた。このため、遺伝子治療は、最近では、病変生物に新しい遺伝情報を導入することによる疾患の表現型の修正として広く定義されている。

【0004】

インビボ遺伝子治療において、導入された遺伝子は、インサイチュで、即ちレシピエント内で、レシピエント生物の細胞に導入される。インビボ遺伝子治療は、いくつかの動物モデルにおいて試験されている。いくつかの最近の刊行物では、筋肉、造血幹細胞、動脈壁、神経系及び肺等の臓器及び組織へのインサイチュでの直接遺伝子導入の実現可能性が報告されている。骨格筋、心筋へのＤＮＡの直接注入、及びＤＮＡ−脂質複合体の血管系への注入もまた、インビボで挿入遺伝子産物の検出可能な発現レベルをもたらすことも報告されている。

【0005】

眼の遺伝的疾患、例えば失明を引き起こす疾患のような眼の遺伝による遺伝子疾患の治療は依然として問題である。このような例としては、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障、Ｌｅｂｅｒ遺伝性視神経症、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡＴ）、色盲、及びムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症が挙げられる。従って、眼の遺伝病の治療法を開発する必要がある。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、ウイルスベクター等の薬剤を眼細胞に標的化する機能を有するペプチドを発見した。本開示は、これらの新規なペプチドを利用して、例えば、ウイルスカプシドを目的の細胞タイプに導く方法を記載する。この場合、眼細胞（例えば、網膜細胞）は、特定されたペプチドによって標的化される。このようなペプチドを含むように改変されたカプシドタンパク質を有するベクターを、治療薬を眼に提供するために使用することができる。

【0007】

本明細書で使用されるように、用語「標的」は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）等のウイルスのカプシドタンパク質が、別のタイプの組織（例えば、脳組織）よりも１つのタイプの組織（例えば、網膜細胞） に優先的に結合することを意味する。特定の実施形態において、遺伝子改変（組換え）カプシドタンパク質は、比較可能な非改変カプシドタンパク質よりも１０〜１０００％高いレベルで結合することによって眼細胞を「標的」化し得る。例えば、遺伝子改変カプシドタンパク質を有するＡＡＶは、非改変ＡＡＶウイルスよりも５０〜１００％高いレベルで眼細胞に結合し得る。

【0008】

本発明は、標的化ペプチドが３〜１０個のアミノ酸（即ち、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸）長であり、且つ標的化ペプチドがＡＡＶを眼細胞に標的化させる、改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を提供する。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、３、４、５、６、７、８、９または１０のアミノ酸長である。

【0009】

本発明は、上記のペプチドをコードするよう遺伝子が改変されたカプシドタンパク質を含有するＡＡＶウイルスを提供する。

【0010】

本発明は、上記ウイルスベクターまたは上記の細胞を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における疾患（例えば、眼疾患）を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、哺乳類はヒトである。特定の実施形態において、これらの疾患は、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒの先天性黒内障、Ｌｅｂｅｒの遺伝性視神経症、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、ＳＣＡＴ、色盲、及びＭＰＳ ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症である。

【0011】

特定の実施形態では、疾患はリソソーム蓄積疾患または障害である。特定の実施形態では、この疾患は、ＴＰＰ１（トリペプチジルペプチダーゼＩ）、ＣＬＮ３（Ｂａｔｔｅｎｉｎ）、ＰＰＴ１（パルミトイルタンパク質チオエステラーゼＩ）、ＣＬＮ６（ニューロンセロイドリポフスチン症タンパク質６）またはＣＬＮ８の発現または活性における、欠損または欠陥である。特定の実施形態において、疾患は、幼児ＮＣＬ、晩期乳児ＮＣＬ、若年性ＮＣＬ（バッテン病）及び成人ＮＣＬ等の神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）等の神経変性疾患である。

【0012】

本発明は、上記のウイルスベクターで眼細胞を形質導入して、形質導入された眼細胞が治療薬を発現し、その薬剤を被験体の眼に送達することによって、被験体の眼に薬剤を送達する方法を提供する。特定の実施形態では、薬剤は、Ａｔａｘｉｎ７ｍｉｒＲＮＡである（例えば、ＳＣＡ ７を治療するため）。特定の実施形態において、薬剤は網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ６５）である（例えばＬｅｂｅｒの先天性黒内障を治療するため）。特定の実施形態では、薬剤は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤または可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｉｆ１）（例えば、加齢性黄斑変性症を治療するためのもの）である。特定の実施形態では、薬剤はＲＥＰ１である（例えば、黄体ホルモン症を治療するため）。特定の実施形態では、薬剤はＬ−オプシンである（例えば、色盲を治療するため）。表１は、疾患、標的遺伝子及び対応するコードされたタンパク質の例を示す。

【表1-1】

【表1-2】

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1-1】ペプチド改変ＡＡＶ（ＰＭＡＡＶ）−ＧＳＴの配列。ＡＡＶ２／２（ＡＡＶ２ ＩＴＲ／ＡＡＶ２カプシド）カプシド配列（イタリック体）及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）網膜標的化ペプチド（太字及び下線）である。

【図1-2】ペプチド改変ＡＡＶ（ＰＭＡＡＶ）−ＧＳＴの配列。ＡＡＶ２／２（ＡＡＶ２ ＩＴＲ／ＡＡＶ２カプシド）カプシド配列（イタリック体）及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）網膜標的化ペプチド（太字及び下線）である。

【図1-3】ペプチド改変ＡＡＶ（ＰＭＡＡＶ）−ＧＳＴの配列。ＡＡＶ２／２（ＡＡＶ２ ＩＴＲ／ＡＡＶ２カプシド）カプシド配列（イタリック体）及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）網膜標的化ペプチド（太字及び下線）である。

【図1-4】ペプチド改変ＡＡＶ（ＰＭＡＡＶ）−ＧＳＴの配列。ＡＡＶ２／２（ＡＡＶ２ ＩＴＲ／ＡＡＶ２カプシド）カプシド配列（イタリック体）及びグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）網膜標的化ペプチド（太字及び下線）である。

【図2】生きた動物における蛍光イメージングは、相対的な感染効率を示した。ＡＡＶ２／２注入眼では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）陽性の斑点領域が観察されたが、ＰＭＡＡＶ−ＧＳＴ眼では、広範かつ均一なＧＦＰシグナルが認められた。

【図3】ＰＭＡＡＶ−ＧＳＴ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び外核層（ＯＮＬ）層群、及び神経節細胞層（ＧＣＬ）のいくつかの細胞を標的とした。ＡＡＶ２／２は主にＯＰＬを標的とした。ＣＭＶ−サイトメガロウイルス；ｅＧＦＰ−強化されたＧＦＰ。

【図4】網膜下注射。

【図5】未改変ＡＡＶ２−網膜下注射。

【図6】未改変ＡＡＶ２−網膜下注射。

【図7】２０×画像ＰＭ改変ＡＡＶ２−網膜下注射。

【図8】硝子体内注射。

【図9】ＡＡＶ２硝子体内注射。

【図10】ＡＡＶ２硝子体内注射。

【図11】ＡＡＶ２ ＰＭ ＧＳＴ硝子体内注射。

【図12】ＡＡＶ２ ＰＭ ＧＳＴ硝子体内注射。

【発明を実施するための形態】

【0014】

（発明の詳細な説明）
本開示の特定の実施形態は、改変されたカプシドを含み、且つ改変されたカプシドは、ウイルスベクターを眼細胞に標的化する少なくとも１つのアミノ酸配列を含むウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、眼細胞は網膜細胞である。

【0015】

特定の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。特定の実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ２であるが、指向性は改変されるので、このような改変は任意のＡＡＶの指向性を変化させるであろう。

【0016】

特定の実施形態では、標的化ペプチドは、アミノからカルボキシへの方向、またはカルボキシからアミノへの方向で表される、ＧＳＴＰＰＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）またはアミノ酸配列ＧＥＴＲＡＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）を内部に有する（またはこれらからなる）最大１０のアミノ酸長の配列を含む。配列の方向は重要ではないことに留意すべきである。例えば、ペプチドは、ペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端まで配向してＧＳＴＰＰＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）であるか、またはペプチドのアミノ末端からカルボキシ末端まで配向してＭＰＰＰＴＳＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）であり得る。

【0017】

特定の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｐ３４−Ａ３５、Ｔ１３８−Ａ１３９、Ａ１３９−Ｐ１４０、Ｇ４５３−Ｔ４５４、Ｎ５８７−Ｒ５８８及び／またはＲ５８８−Ｑ５８９の位置で、ＡＡＶ２カプシド残基の間に挿入される。野生型参照ＡＡＶ２カプシドタンパク質配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に提供される。

【0018】

特定の実施形態では、標的化ペプチドは、Ｄ３８４、Ｇ３８５、Ｉ５６０、Ｔ５６１、Ｎ５６２、Ｅ５６３、Ｅ５６４、Ｅ５６５、Ｎ７０４及び／またはＹ７０５の位置で、ＡＡＶ９カプシド残基の後に挿入される。野生型参照ＡＡＶ９カプシドタンパク質配列の例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に提供される。

【0019】

特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を含むかまたはそれからなる。

【0020】

本発明は、上記のカプシドタンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターを提供する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、目的の核酸をコードする核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、目的の核酸は治療薬である。特定の実施形態において、治療薬は、酵素またはＲＮＡｉ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ分子）である。ある態様において、治療薬は、アタキシン７ ｍｉｒＲＮＡ、ＲＰＥ６５、ＶＥＧＦ阻害剤または可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｉｆ１）、ＲＥＰ１、Ｌ−オプシン、Ｒｈｏ、ＰＤＥ６β、ＡＢＣＡ４、ＬＲＡＴ、ＲＤＳ／ペリフェリン、ＭＥＲＴＫ、ＩＭＰＤＨ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＤＳ／ペリフェリン、ＡＩＰＬ１、ＡＢＣＡ４、ＲＰＧＲＩＰ１、ＩＭＰＤＨ１、ＡＩＰＬ１、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＬＲＡＴ、ＭＥＲＴＫ、ＲＰＧＲＩＰ１、ＲＰＥ６５、ＡＢＣＡ４、ＧＮＡＴ２、ＣＮＧＢ３、Ｒｓｌ、ＯＡ１、（ＯＣＡＩ）チロシナーゼ、Ｐ２１ ＷＡＦ−１／Ｃｉｐｌ、ＰＤＧＦ、エンドスタチン、アンギオスタチン（Angiostatin）、アリールスルファターゼＢ、またはβ−グルクロニダーゼである。

【0021】

本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のウイルスベクターをコードする核酸配列を提供する。

【0022】

本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の改変されたカプシドをコードする核酸配列を提供する。本開示の特定の実施形態は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２（ＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＡＴＧ）を含むかまたはそれからなる核酸配列を提供する。本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の核酸配列によってコードされた改変カプシドを提供する。

【0023】

本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のウイルスベクターを含む細胞を提供する。

【0024】

本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のウイルスベクターによって形質導入された細胞を提供する。

【0025】

特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。特定の実施形態では、細胞は非ヒト細胞である。特定の実施形態では、細胞はインビトロである。特定の実施形態では、細胞はインビボである。特定の実施形態では、細胞は眼細胞、例えば網膜細胞である。

【0026】

本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載のウイルスベクターまたは細胞を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の疾患を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、標的化ペプチドは、罹患した眼細胞を標的とする。特定の実施形態では、標的化ペプチドは、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障、Ｌｅｂｅｒ遺伝性視神経症、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、ＳＣＡＴ、色盲、またはＭＰＳ ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症、を有する被験体（対象）の眼細胞を標的とする。

【0027】

特定の実施形態では、被験体は、リソソーム蓄積疾患または障害を有する。特定の実施形態では、この疾患は、ＴＰＰ１（トリペプチジルペプチダーゼＩ）、ＣＬＮ３（Ｂａｔｔｅｎｉｎ）、ＰＰＴ１（パルミトイルタンパク質チオエステラーゼＩ）、ＣＬＮ６（ニューロンセロイドリポフスチン症タンパク質６）またはＣＬＮ８の発現または活性における、欠損または欠陥である。疾患としては、幼児ＮＣＬ、晩期乳児ＮＣＬ、若年性ＮＣＬ（バッテン病）及び成人ＮＣＬ等の神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）等の神経変性疾患が挙げられる。

【0028】

特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。

【0029】

本開示の特定の実施形態は、被験体の眼に薬剤を送達する方法であって、本明細書に記載のウイルスベクターで眼細胞を形質導入して、形質導入された眼細胞が治療薬を発現し、その治療薬を被験体の眼に送達することを含む方法を提供する。

【0030】

特定の実施形態において、ウイルスベクターは、眼細胞を形質導入する。

【0031】

特定の実施形態では、形質導入された眼細胞は、網膜外網状層（ＯＰＬ）内にあるか、これを含む。

【0032】

本開示の特定の実施形態は、医学的処置または診断において使用するための、本明細書に記載のウイルスベクターまたは細胞を提供する。

【0033】

本開示の特定の実施形態は、哺乳動物における眼疾患、例えば、遺伝性眼疾患を治療するために有用な医薬を調製するための、本明細書に記載のウイルスベクターまたは細胞の使用を提供する。

【0034】

本開示の特定の実施形態は、このようなペプチドを同定するためにファージディスプレイバイオパニング（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）を使用することを含む、眼組織を標的とするペプチドを同定するための方法を提供する。

【0035】

ベクターは、酵素、分泌タンパク質、核タンパク質、または細胞質タンパク質をさらに含み得る。本明細書中で使用されるように、用語「分泌タンパク質」は、自然に分泌されるか、分泌され得るようにシグナル配列を含むよう改変されるかの、いずれかの分泌タンパク質を含む。例えば、分泌タンパク質はベータ−グルクロニダーゼであり得る。

【0036】

核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「作動可能に連結され」ている。一般に、「作動可能に連結され」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続していることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続している必要はない。連結は、便宜的制限部位での連結反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが従来の方法に従って使用される。さらに、酵素をコードする核酸の複数のコピーを発現ベクター内で一緒に連結することができる。このような複数の核酸は、リンカーによって分離されていてもよい。

【0037】

ベクターは、ヒト免疫不全ウイルスまたはネコ免疫不全ウイルスに基づく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルス、またはレンチウイルスベクターであり得る。このようなＡＡＶの例は、Ｄａｖｉｄｓｏｎら，ＰＮＡＳ（２０００）９７：３４２８−３４３２に見られる。ＡＡＶ及びレンチウイルスは、持続的な発現を与えることができ、一方アデノウイルスは一過性発現を提供することができる。

【0038】

本開示は、本明細書に記載のベクターを含む哺乳動物細胞も提供する。細胞はヒトであってもよく、目からであってもよい。細胞型は、幹細胞または前駆細胞集団であり得る。

【0039】

本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチド、ポリペプチド、発現ベクターまたは細胞を投与することによって、哺乳類における遺伝的眼疾患または癌等の疾患を治療する方法を提供する。遺伝性眼疾患または癌は、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障、Ｌｅｂｅｒ遺伝性視神経症、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、ＳＣＡＴ、色盲、及びＭＰＳ ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症であり得る。

【0040】

遺伝病は、リソソーム蓄積疾患または障害であり得る。特定の実施形態では、この疾患は、ＴＰＰ１（トリペプチジルペプチダーゼＩ）、ＣＬＮ３（Ｂａｔｔｅｎｉｎ）、ＰＰＴ１（パルミトイルタンパク質チオエステラーゼＩ）、ＣＬＮ６（ニューロンセロイドリポフスチン症タンパク質６）またはＣＬＮ８の発現または活性における、欠損または欠陥である。遺伝病は、幼児ＮＣＬ、晩期乳児ＮＣＬ、若年性ＮＣＬ（バッテン病）及び成人ＮＣＬ等の神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）等の神経変性疾患であり得る。

【0041】

本開示の特定の態様は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクター、及び遺伝子操作された細胞（インビボで改変された）、並びにこれらの使用に関する。特に、本開示は、治療に有効な用量の治療薬の局所送達が可能な遺伝子またはタンパク質療法のための方法に関する。

【0042】

一態様によれば、哺乳動物レシピエントにおいて治療薬を発現させるための細胞発現系が提供される。発現系（本明細書では「遺伝子改変細胞」とも呼ばれる）は、治療薬を発現させるための細胞及び発現ベクターを含む。発現ベクターには、異種の遺伝物質を細胞に送達するための、ウイルス、プラスミド、及び他のビヒクルが含まれるが、これらに限定されない。従って、本明細書で使用される用語「発現ベクター」は、異種の遺伝物質を細胞に送達するためのビヒクルを指す。特に、発現ベクターは、改変アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、或いはレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである。

【0043】

発現ベクターは、さらに、異種遺伝子の転写を制御するプロモーターを含む。プロモーターは、誘導性プロモーター（後述）であってもよい。発現系は、哺乳動物レシピエントへの投与に適している。発現系は、複数の非不死化遺伝子改変細胞を含み得、各々細胞は少なくとも１つの治療薬をコードする少なくとも１つの改変遺伝子を含んでいる。

【0044】

細胞発現系はインビボで形成することができる。さらに別の態様によれば、インビボで哺乳動物レシピエントを治療するための方法が提供される。この方法は、異種遺伝子産物を発現する発現ベクターを、インサイチュ（例、眼内投与等）で患者の細胞に導入することを含む。インビボで発現系を形成するために、治療薬を発現させる発現ベクターをインビボで哺乳動物レシピエントに導入する。

【0045】

さらに別の態様によれば、インビボで哺乳動物レシピエントを治療するための方法が提供される。この方法は、インビボで標的タンパク質を患者に導入することを含む。

【0046】

異種遺伝子を発現させるための発現ベクターは、異種遺伝子産物の転写を制御するための誘導性プロモーターを含むことができる。従って、インサイチュでの治療薬の送達は、異種遺伝子の転写を誘発する条件に細胞をインサイチュで曝露することによって制御される。

【0047】

哺乳動物のレシピエントは、遺伝子置換療法に適した状態を有し得る。本明細書中で使用されるように、「遺伝子置換療法」は、レシピエントに治療薬をコードする外因性遺伝物質を投与し、続いてインサイチュで投与された遺伝物質を発現させることを指す。従って、「遺伝子置換療法に適した状態」という語句は、遺伝的疾患（即ち、１つ以上の遺伝子欠損に起因する疾患状態）、後天的病態（即ち、先天性欠損に起因しない病理学的状態）、癌及び予防プロセス（即ち、疾患または望ましくない医学的状態の予防）等の状態を含む。従って、本明細書で使用されるように、用語「治療薬」は、哺乳動物レシピエントに有益な効果を有する任意の薬剤または物質を指す。従って、「治療薬」は、核酸またはタンパク質成分を有する治療分子及び予防分子の両方を包含する。

【0048】

一実施形態によれば、哺乳動物レシピエントは遺伝的疾患を有し、外因性遺伝物質は疾患を治療するための治療薬をコードする異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態では、哺乳動物レシピエントは獲得病理を有し、外因性遺伝物質は病理を治療するための治療薬をコードする異種遺伝子を含む。別の実施形態によれば、患者は癌を有し、外因性遺伝物質は抗新生物薬をコードする異種遺伝子を含む。さらに別の実施形態において、患者は望ましくない医学的状態を有し、外因性遺伝物質は、状態を治療するための治療薬をコードする異種遺伝子を含む。

【0049】

さらに別の実施形態によれば、医薬組成物が開示される。医薬組成物は、複数の上記の遺伝子改変された細胞またはポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む。この医薬組成物は、遺伝子置換療法に適した状態を治療するためのものであってもよく、外因性遺伝物質は、この状態を治療するための治療薬をコードする異種遺伝子を含む。医薬組成物は、治療有効量の治療薬を患者に送達するのに十分な量の遺伝子改変された細胞またはポリペプチドを含むことができる。遺伝子置換療法に適した条件の例を以下に記載する。

【0050】

別の態様によれば、上記医薬組成物の形成方法が提供される。この方法は、細胞に異種遺伝子産物を発現させるための発現ベクターを導入して遺伝子改変細胞を形成し、遺伝子改変細胞を薬学的に許容される担体に入れることを含む。

【0051】

これらの及び他の態様、並びに様々な利点及び有用性は、詳細な説明及び添付の図面を参照することにより、より明らかになるであろう。

【0052】

本明細書中で使用されるように、用語「酵素」、「分泌タンパク質」、「核タンパク質」または「細胞質タンパク質」には、これらのポリペプチドの変異体または生物学的に活性若しくは不活性なフラグメントが含まれる。ポリペプチドの１つである「変異体」は、天然のタンパク質と完全には同一ではないポリペプチドである。このような変異体タンパク質は、アミノ酸配列を１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換によって改変することにより得ることができる。タンパク質のアミノ酸配列は、例えば置換によって改変され、天然のポリペプチドと比較して実質的に同じまたは改善された性質を有するポリペプチドを作り出す。置換は、保存された置換であってもよい。「保存された置換」とは、アミノ酸と類似の側鎖を有する別のアミノ酸との置換である。保存された置換は、アミノ酸の電荷またはアミノ酸の側鎖のサイズ（あるいは、側鎖内の化学基のサイズ、電荷または種類）において最小の変化が可能なアミノ酸による置換であり、これにより全ペプチドがその空間的コンフォメーションを保持するが、生物学的活性は変化する。例えば、共通の保存された変化は、ＡｓｐからＧｌｕ、ＡｓｎまたはＧｌｎ；ＨｉｓからＬｙｓ、ＡｒｇまたはＰｈｅ；ＡｓｎからＧｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕ；及びＳｅｒからＣｙｓ、ＴｈｒまたはＧｌｙへの置換であり得る。アリン（Ａｌｉｎｅ）は他のアミノ酸の代用として一般的に使用される。２０個の必須アミノ酸は、以下：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及び非極性側鎖を有するメチオニン；グリシン、セリン、スレオニン、シスチン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミン（荷電していない極性側鎖を有する）；酸性側鎖を有するアスパラギン酸塩及びグルタミン酸塩；塩基性側鎖を有するリジン、アルギニン、及びヒスチジンのように分類することができる。

【0053】

アミノ酸の変化は、対応する核酸配列のコドンを変化させることによって達成される。そのようなポリペプチドは、生物活性を改変または改善するために、ポリペプチド構造中の他のアミノ酸を特定のアミノ酸に置換することに基づいて得ることができることが知られている。例えば、代替のアミノ酸の置換により、ポリペプチドに小さな構造変化が与えられ、ポリペプチドの活性の増加がもたらされ得る。あるいは、特定のポリペプチドにおけるアミノ酸置換を使用して残基を提供することができ、その後他の分子に連結して、出発ポリペプチドの十分な特性を保持して他の目的に有用なペプチド−分子結合体を提供することができる。

【0054】

ポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を付与する際に、アミノ酸の疎水性指数を使用することができ、あるアミノ酸は類似の疎水性指数を有する他のアミノ酸に置換されてもなお、同様の生物学的活性を保持することができることがわかる。あるいは、特に、生成されるべきポリペプチドに求められる生物学的機能が免疫学的実施形態での使用を意図されている場合に、類似のアミノ酸の置換を親水性に基づいて行うことができる。隣接するアミノ酸の親水性によって支配される「タンパク質」の最大局所平均親水性は、その免疫原性と相関する。従って、各アミノ酸に割り当てられた親水性に基づいて置換を行うことができることが注目される。

【0055】

各アミノ酸に値を割り当てる数値として、親水性指数または疎水性指数のいずれかを用いる場合、これらの値が±２（±１が特に好ましい）であるアミノ酸の置換を行うことが好ましく、±０．５のアミノ酸が最も好ましい置換である。

【0056】

変異体タンパク質は、対応する天然タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％であって、しかしながら１００％未満である連続したアミノ酸配列相同性または同一性を有する。

【0057】

変異体ポリペプチドのアミノ酸配列は、天然のポリペプチドのアミノ酸配列に実質的に対応する。本明細書で使用する「実質的に対応する」とは、天然のタンパク質によって生成される応答と実質的に同じ生物学的応答を誘発するポリペプチド配列を指す。このような応答は、天然のタンパク質によって生成されるレベルの少なくとも６０％であり得、天然のタンパク質によって生成されるレベルの少なくとも８０％でさえあり得る。

【0058】

変異体は、対応する天然タンパク質に存在しないアミノ酸残基、または対応する天然タンパク質に対して欠失を含み得る。変異体はまた、対応する天然タンパク質と比較して切り取られた「断片」、即ち全長タンパク質の一部のみであってもよい。タンパク質改変体は、少なくとも１つのＤ−アミノ酸を有するペプチドも含む。

【0059】

変異体タンパク質は、変異体タンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列から発現され得る。「組換え体」は、遺伝子工学のプロセスにより産生されたペプチドまたは核酸として定義される。遺伝暗号における冗長性のために、個々のヌクレオチドはコドンにおいて容易に交換され得、それでもなお同一のアミノ酸配列をもたらすことは当該技術分野において周知であることに留意すべきである。用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、本明細書では互換的に使用される。

【0060】

本開示は、発現ベクターを細胞または患者に投与することによって哺乳動物の疾患を治療する方法を提供する。遺伝子治療法に関して、分子生物学及び遺伝子治療の当業者は、過度の実験をすることなく、本開示の新規な方法で使用される発現ベクターの適切な投与量及び投与経路を決定することができるであろう。

【0061】

一実施形態によれば、細胞はインビボで形質転換されるか、そうでなければインビボで遺伝子改変される。哺乳類レシピエント由来の細胞は、治療薬をコードする異種（例えば、組換え）遺伝子を発現させるための外因性遺伝物質を含むベクターによりインビボで形質転換（即ち、形質導入またはトランスフェクト）され、治療薬はインサイチュで送達される。

【0062】

本明細書中で使用される場合、「外因性遺伝物質」とは、細胞内に天然には見出されない天然または合成の核酸またはオリゴヌクレオチドを指し；そうではなく、細胞内に天然に存在する場合、細胞によって生物学的に有意なレベルで転写または発現されない。従って、「外因性遺伝物質」には、例えば、アンチセンスＲＮＡ、並びに「異種遺伝子」（即ち、同じタイプの天然に存在する細胞において、発現されないか、または生物学的に有意でないレベルで発現されるタンパク質をコードする遺伝子）に転写され得る非天然核酸が含まれ得る。

【0063】

特定の実施形態において、哺乳類のレシピエントは、遺伝子置換療法に適した状態を有する。本明細書中で使用されるように、「遺伝子置換療法」は、レシピエントに治療薬をコードする外因性遺伝物質を投与し、続いてインサイチュで投与された遺伝物質を発現させることを指す。従って、語句「遺伝子置換療法に適した状態」は、遺伝的疾患（即ち、１つ以上の遺伝子欠損に起因する疾患状態）、後天的病態（即ち、先天性欠陥に起因しない病理学的状態）、癌及び予防プロセス（即ち、疾患または望ましくない医学的状態の予防）等の状態を含む。従って、本明細書で使用されるように、用語「治療薬」は、哺乳動物レシピエントに有益な効果を有する任意の薬剤または物質を指す。従って、「治療薬」は、核酸（例えば、アンチセンスＲＮＡ）及び／またはタンパク質成分を有する治療分子及び予防分子の両方を包含する。

【0064】

多くの遺伝的眼疾患が知られている。タンパク質／酵素はこれらの疾患に対して不十分であることが知られている時から、これらの疾患に対して有効な治療薬もまた公知である。特定の実施形態では、前記疾患または状態は、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒ先天性黒内障、Ｌｅｂｅｒ遺伝性視神経症、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、ＳＣＡＴ、色盲、及びＭＰＳ ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症である。

【0065】

特定の実施形態では、疾患または状態は、リソソーム蓄積疾患または障害であり得る。特定の実施形態では、この疾患は、ＴＰＰ１（トリペプチジルペプチダーゼＩ）、ＣＬＮ３（Ｂａｔｔｅｎｉｎ）、ＰＰＴ１（パルミトイルタンパク質チオエステラーゼＩ）、ＣＬＮ６（ニューロンセロイドリポフスチン症タンパク質６）またはＣＬＮ８の発現または活性における、欠損または欠陥である。疾患は、幼児ＮＣＬ、晩期乳児ＮＣＬ、若年性ＮＣＬ（バッテン病）及び成人ＮＣＬ等の神経セロイドリポフスチン症（ＮＣＬ）等の神経変性疾患であり得る。

【0066】

本明細書中で使用されるように、「後天的病態」は、異常な生理学的、生化学的、細胞的、構造的、または分子生物学的状態によって明示される疾患または症候群を指す。後天的病態の例を表２に示す。これらの疾患に対して有効な治療薬もまた示される。

【表2】

【0067】

あるいは、遺伝子置換療法に適した状態は、予防的プロセス、即ち、疾患または望ましくない病状を予防するためのプロセスである。従って、本開示は、予防的機能を有する治療薬（即ち、予防剤）を哺乳類レシピエントに送達するための細胞発現系を包含する。

【0068】

要約すると、用語「治療薬」は、上記表に列挙された薬剤、並びにそれらの機能的等価物を含むが、これらに限定されない。本明細書中で使用されるように、用語「機能的等価物」は、機能的等価物であるとみなされる治療薬として、哺乳動物レシピエントに対して同等または改善された有益な効果を有する分子（例えば、ペプチドまたはタンパク質）を指す。当業者には理解されるように、機能的に等価なタンパク質は、組換え技術によって、例えば「機能的に等価なＤＮＡ」を発現させることにより、作製することができる。本明細書で使用されるように、用語「機能的に等価なＤＮＡ」は、天然に存在しないＤＮＡであり、治療薬をコードするものを指す。例えば、表１〜２に開示されている薬剤の多くは、全てではないにしても、天然に存在する核酸によってコードされている既知のアミノ酸配列を有する。しかしながら、遺伝暗号の縮重のため、２以上の核酸が同じ治療薬をコードすることができる。従って、本開示は、天然に存在するＤＮＡによってコードされる治療薬、並びに天然に存在するＤＮＡによってコードされるのと同じタンパク質をコードする天然に存在しないＤＮＡによってコードされる治療薬を包含する。

【0069】

上記で開示した遺伝子置換療法に適した治療薬及び状態は、単なる例示であり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。既知の状態を治療するための適切な治療薬の選択は、過度の実験をすることなく当業者の範囲内であるとみなされる。

【0070】

スクリーニング方法
本開示は、中枢神経系の脈管構造等の特定の領域を標的化（例えば特異的に標的化）するアミノ酸配列をスクリーニングし、同定する方法を提供する。この方法は、特定の疾患状態に特異的である標的配列を同定するために使用することができる。言い換えれば、標的化配列を同定し、特定の疾患の治療に用いることができる。

【0071】

ＡＡＶベクター
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パーキンソン病及び劣性遺伝疾患等のヒト疾患の治療に有用な、小さな（２０ｎｍ）非病原性ウイルスである。ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を有する標的遺伝子に連結されたプロモーターを取り囲む構築物が生成される。

【0072】

一実施形態では、本開示のウイルスベクターはＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターは、アデノ随伴ウイルスを指し、また天然に存在する野生型ウイルスそれ自体またはその誘導体を指すのに使用され得る。この用語は、特段の要求の無い限り、すべてのサブタイプ、血清型及び偽型、並びに天然型及び組換え型の両方にまで及ぶ。本明細書中で使用されるように、用語「血清型」とは、定義された抗血清とのカプシドタンパク質反応性に基づいて他のＡＡＶによって同定され、区別されるＡＡＶを指し、例えば、霊長類ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ−Ｒｈ７４、及びＡＡＶＲｈ１０、及びこれらの血清型の修飾されたカプシド）の多くの公知の血清型がある。例えば、血清型ＡＡＶ−２は、ＡＡＶ−２のｃａｐ遺伝子からコードされるカプシドタンパク質及び同じＡＡＶ−２血清型からの５’及び３’ＩＴＲ配列を含むゲノムを含むＡＡＶを指すのに使用される。偽型ＡＡＶは、１つの血清型由来のカプシドタンパク質及び第２の血清型の５’−３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムを含むＡＡＶを指す。偽型ｒＡＡＶは、カプシド血清型の細胞表面結合特性及びＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性を有することが期待される。偽型ｒＡＡＶは、当技術分野で記載されている標準技術を用いて産生される。本明細書中で使用されるように、例えば、ｒＡＡＶ１は、同じ血清型由来のカプシドタンパク質及び５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用され得るか、またはそれは、血清型１由来のカプシドタンパク質及び異なるＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ血清型２）由来の５’−３’ＩＴＲ を有するＡＡＶを指すために使用され得る。本明細書に例示される各例について、ベクター設計及び産生の記載は、カプシド及び５’−３’ＩＴＲ配列の血清型を説明する。略語「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを指し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる。

【0073】

「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのカプシドタンパク質のすべてによって）及びカプシド形成されたポリヌクレオチドからなるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド（即ち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子等の野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、それは典型的には「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。

【0074】

一実施形態では、ＡＡＶ発現ベクターは、転写開始領域、対象のＤＮＡ及び転写終結領域等の制御エレメントを、少なくとも、転写の方向に機能的に連結された成分として提供するために、既知の技術を用いて構築される。制御エレメントは、哺乳動物細胞において機能するように選択される。作動可能に連結された成分を含む得られた構築物は、機能的ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する（５’及び３’）。

【0075】

「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復」、即ち「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、ＤＮＡ複製の起点及びウイルスのパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能するＡＡＶゲノムの各末端に見出される当該分野で認識された領域を意味する。ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ ｒｅｐコーディング領域と共に、２つの隣接ＩＴＲの間に挿入されたヌクレオチド配列の、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切除、救済、及び哺乳動物細胞ゲノムへの組み込みを提供する。

【0076】

ＡＡＶ ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は公知である。例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３−８０１；Ｂｅｒｎｓ，Ｋ．Ｉ．“Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ” ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第２版（Ｂ．Ｎ． Ｆｉｅｌｄｓ及びＤ．Ｍ． Ｋｎｉｐｅ編）参照。本明細書で使用するように、「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、描かれた野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって変更することができる。さらに、ＡＡＶ ＩＴＲは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ−Ｒｈ７４及びＡＡＶＲｈ１０等のいくつかのＡＡＶ血清型、及びこれらの血清型の改変カプシドのいずれかから誘導され得る。さらに、ＡＡＶベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、それらが意図されたように機能する限り、必ずしも同じＡＡＶ血清型または単離物と同一またはこれら由来である必要はない、即ち、宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列の切除及び救出を可能にし、そしてＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合に、レシピエント細胞ゲノムへの異種配列の組み込みを可能にするために、同一またはこれら由来である必要はない。

【0077】

一実施形態では、限定されないが、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ−Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）及びＡＡＶＲｈ１０等のいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。さらに、ＡＡＶ発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’及び３’ＩＴＲは、それらが意図されたように機能する限り、必ずしも同じＡＡＶ血清型または単離物と同一またはこれら由来である必要はない、すなわち宿主細胞ゲノムまたはベクターから目的の配列の切除及び救出を可能にし、そして、ＡＡＶ Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞内に存在する場合にはレシピエント細胞ゲノムへのＤＮＡ分子の組み込みを可能にするために、同一またはこれら由来である必要はない。

【0078】

一実施形態では、ＡＡＶカプシドは、限定されないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ−Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、及びＡＡＶＲｈ１０等のいくつかのＡＡＶ血清型から誘導することができ、ＡＡＶ ＩＴＲはＡＡＶ血清型２から誘導することができる。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドはＡＡＶ２カプシドである。ＡＡＶベクターでの使用に適したＤＮＡ分子のサイズは、約５キロベース（ｋｂ）未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満であり、当技術分野で公知である。

【0079】

本開示のいくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターで使用されるＤＮＡ分子は、単一のｓｉＲＮＡ配列の１つ以上のコピーを含む。本明細書中で使用されるように、用語「ｓｉＲＮＡ配列の複数コピー」は、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー及び少なくとも１０コピーを意味する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターで使用されるＤＮＡ分子は、複数のｓｉＲＮＡ配列を含む。本明細書で使用されるように、用語「複数のｓｉＲＮＡ配列」は、少なくとも２つのｓｉＲＮＡ配列、少なくとも３つのｓｉＲＮＡ配列、少なくとも４つのｓｉＲＮＡ配列、少なくとも５つのｓｉＲＮＡ配列、少なくとも６つのｓｉＲＮＡ配列、少なくとも７つのｓｉＲＮＡ配列、少なくとも８つのｓｉＲＮＡ配列 、少なくとも９個のｓｉＲＮＡ配列、及び少なくとも１０個のｓｉＲＮＡ配列を意味する。いくつかの実施形態では、本開示の適切なＤＮＡベクターは、本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする配列及びスタッファー断片を含む。本開示の適切なスタッファー断片には、限定されないが、発現されるタンパク質分子をコードしない配列；発現された細胞型に有害な影響を及ぼさない正常細胞タンパク質をコードする配列；及びそれ自体が機能的ｓｉＲＮＡ二本鎖分子をコードしない配列等の当分野で公知の配列が含まれる。

【0080】

一実施形態では、ＡＡＶベクターでの使用に適したＤＮＡ分子は、サイズが約５キロベース（ｋｂ）未満であり、例えば、スタッファー配列及び本開示のｓｉＲＮＡ分子をコードする配列を含む。例えば、ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶゲノム配列のパッケージングを防止するために、ｒｅｐ及びｃａｐ ＤＮＡフラグメントを含むプラスミドは、当該技術分野において知られているスタッファーフラグメントをＡＡＶゲノムに組み入れることによって改変され得る。これにより、ＤＮＡを最適なパッケージングの長さを超えるようにする。従って、ヘルパー断片はＡＡＶビリオンにパッケージングされない。これは、最適なパッケージングサイズを超えない組換えＡＡＶベクターゲノムのみがビリオンにパッケージングされることを確実にする安全機能である。スタッファー配列を組み込んだＡＡＶヘルパー断片は、４．６ｋｂの野生型ゲノム長を超えることができ、野生型の１０５％を超える長さは、一般にパッケージングされない。スタッファー断片は、例えば、Ｌａｃ−Ｚまたはβ-ガラクトシダーゼ遺伝子のような非ウイルス源から誘導することができる。

【0081】

一実施形態では、選択されたヌクレオチド配列は、インビボで被験体においてその転写または発現を指示する制御エレメントに作動可能に連結される。このような制御エレメントは、選択された遺伝子に通常関連する制御配列を含むことができる。あるいは、異種制御配列を用いることができる。有用な異種制御配列は、一般に、哺乳動物またはウイルス遺伝子をコードする配列に由来するものを含む。例としては、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ前初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）等のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ネズミのメタロチオネイン遺伝子等の非ウイルス遺伝子に由来する配列も本明細書中で使用される。そのようなプロモーター配列は、例えばＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。

【0082】

一実施形態では、異種プロモーターと、網膜特異的プロモーター及び誘導性プロモーター、エンハンサー等の他の制御要素との両方が特に有用である。異種プロモーターの例としては、ＣＭＶプロモーターが挙げられる。網膜特異的プロモーターの例としては、ＩＲＢＰ（インターフォトレセプターレチノイド結合タンパク質）プロモーター、ｈＧＲＫ１（ヒトロドプシンキナーゼ）プロモーター、ＩＲＢＰｅ／ＧＮＡＴ２（インターフォトレセプターレチノイド結合タンパク質プロモーター間のエンハンサー要素）及びヒトトランスデューシンアルファサブユニットプロモーターの最小配列が挙げられる。

【0083】

一実施形態では、ＡＡＶ ＩＴＲによって結合した目的のＤＮＡ分子を有するＡＡＶ発現ベクターは、選択された配列（複数可）を、そこから切除される、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（「ＯＲＦ」）を有するＡＡＶゲノムに直接挿入することによって構築することができる。ＡＡＶゲノムの他の部分もまた、複製及びパッケージング機能を可能にするために十分な量のＩＴＲが残っている限り、削除することができる。このような構築物は、当技術分野で周知の技術を用いて設計することができる。

【0084】

あるいは、ＡＡＶ ＩＴＲをウイルスゲノム、またはそれを含むＡＡＶベクターから切り出し、標準的なライゲーション技術を用いて別のベクターに存在する選択された核酸構築物の５’及び３’に融合させることができる。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１０ｍＭ ＤＴＴ、３３ｇｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０ｍＭ−５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び４０μＭ ＡＴＰ、０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを０℃で（「粘着末端」ライゲーション用）または１ｍＭ ＡＴＰ、０．３−０．６（Ｗｅｉｓｓ）ユニットＴ４ ＤＮＡリガーゼを１４℃で（「平滑末端」ライゲーション用）で行われる。分子間「粘着末端」連結は、通常、３０〜１００μｇ／ｍｌの全ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの全末端濃度）で行われる。ＩＴＲを含むＡＡＶベクター。特に、受託番号５３２２２、５３２２３、５３２２４、５３２２５及び５３２２６でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）から入手可能ないくつかのＡＡＶベクターがそこに記載されている。

【0085】

さらに、キメラ遺伝子は合成的に作製することができ、１つ以上の選択された核酸配列の５’及び３’に配置されたＡＡＶ ＩＴＲ配列を含む。完全なキメラ配列は、標準的な方法によって調製された重複オリゴヌクレオチドから組み立てられる。

【0086】

ｒＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶ発現ベクターが、トランスフェクション等の公知の技術を用いて適切な宿主細胞に導入される。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において一般的に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（実験マニュアル），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照。特に適したトランスフェクション法としては、リン酸カルシウム共沈、培養細胞への直接マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介遺伝子導入、脂質媒介形質導入、及び高速マイクロプロジェクタイルを用いる核酸送達が挙げられる。

【0087】

一実施形態では、ｒＡＡＶビリオンを産生するのに適した宿主細胞としては、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用することができ、または使用してきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞及び哺乳動物細胞が挙げられる。この用語は、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。従って、本明細書で使用される「宿主細胞」は、一般に、外因性ＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を指す。本開示の実施には、安定なヒト細胞株２９３（例えば、受託番号ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３でＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎを通じて容易に入手可能）由来の細胞を使用することができる。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換され、アデノウイルスＥ１ａ及びＥ１ｂ遺伝子を発現するヒト胚性腎臓細胞株である。２９３細胞株は容易にトランスフェクトされて、ｒＡＡＶビリオンを産生するための特に便利なプラットフォームを提供する。

【0088】

一実施形態では、上記のＡＡＶ発現ベクターを含む宿主細胞は、ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接配置されたヌクレオチド配列を複製及びカプシド形成してｒＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶヘルパー機能を付与することができるようにされる。ＡＡＶヘルパー機能は、一般に、生産的ＡＡＶ複製のために順にトランスで機能するＡＡＶ遺伝子産物を提供するために発現させることができるＡＡＶ由来のコード配列である。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書では、ＡＡＶ発現ベクターから失われている必要なＡＡＶ機能を補完するために使用される。従って、ＡＡＶヘルパー機能は、主要なＡＡＶ ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の１つまたは両方、即ちｒｅｐ及びｃａｐコード領域、またはその機能的相同体を含む。

【0089】

Ｒｅｐ発現産物は、とりわけ以下のものを含む多くの機能を有することが示されている：それらの中には、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の認識、結合及びニッキング；ＤＮＡヘリカーゼ活性；及びＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節が含まれる。Ｃａｐ発現産物は、必要なパッケージング機能を提供する。ＡＡＶヘルパー機能は、本明細書において、ＡＡＶベクターから失われているトランスのＡＡＶ機能を補完するために使用される。

【0090】

一実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターのトランスフェクションの前または同時に、ＡＡＶヘルパー構築物で宿主細胞をトランスフェクトすることによって、宿主細胞に導入される。用語「ＡＡＶヘルパー構築物」は、一般に、目的のヌクレオチド配列を送達する形質導入ベクターを産生するために使用されるＡＡＶベクターから欠失したＡＡＶ機能を提供するヌクレオチド配列を含む核酸分子を指す。ＡＡＶヘルパー構築物は、溶解性ＡＡＶ複製のために必要な欠損ＡＡＶ機能を補完するために、ＡＡＶ ｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子の一時的発現を提供するために一般に使用される；しかしながら、ヘルパー構築物はＡＡＶ ＩＴＲがなく、複製もパッケージングもできない。ＡＡＶヘルパー構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。Ｒｅｐ及びＣａｐ発現産物の両方をコードする、一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／Ａｄ及びｐＩＭ２９＋４５等の多くのＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。Ｒｅｐ及び／またはＣａｐ発現産物をコードする多くの他のベクターが記載されている。

【0091】

「ＡＡＶ ｒｅｐコーディング領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０をコードするＡＡＶゲノムの当該分野で認識されている領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起源の認識、結合及びニッキング、ＤＮＡヘリカーゼ活性の認識、結合及びニッキング、及びＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写の調節等の多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。ＡＡＶ ｒｅｐコード領域の適切なホモログ（相同体）は、ＡＡＶ−２ ＤＮＡ複製を媒介するとしても知られているヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子を含む。

【0092】

「ＡＡＶキャップコード領域」とは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３、またはその機能的相同体をコードするＡＡＶゲノムの当該分野で認識されている領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするためにまとめて必要とされるパッケージング機能を提供する。特定の実施形態では、Ｐ３４−Ａ３５、Ｔ１３８−Ａ１３９、Ａ１３９−Ｐ１４０、Ｇ４５３−Ｔ４５４、Ｎ５８７−Ｒ５８８及び／またはＲ５８８−Ｑ５８９でＡＡＶ２カプシドタンパク質に挿入等の改変を行う。特定の実施形態では、挿入を、ＡＡＶ９のＤ３８４、Ｇ３８５、Ｉ５６０、Ｔ５６１、Ｎ５６２、Ｅ５６３、Ｅ５６４、Ｅ５６５、Ｎ７０４及び／またはＹ７０５に行う。

【0093】

一実施形態では、ＡＡＶ発現ベクター及びＡＡＶヘルパー構築物の両方を、１つ以上の任意の選択マーカーを含むように構築することができる。適切なマーカーは、細胞が適切な選択培地で増殖された場合に、選択マーカーを含む核酸構築物でトランスフェクトされた細胞の抗原特性に、抗生物質耐性または感受性を付与するか、色を付与するか、またはこの抗原特性を変化させる遺伝子を含む。本開示の実施に有用ないくつかの選択可能なマーカー遺伝子としては、Ｇ４１８（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏから入手可能）に対する耐性を付与することによって哺乳類細胞における選択を可能にするハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（Ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｆｅｒａｓｅ（ＡＰＨ）をコードする）が挙げられる。他の適切なマーカーは、当業者に公知である。

【0094】

一実施形態では、宿主細胞（またはパッケージング細胞）は、ｒＡＡＶビリオンを産生するために、非ＡＡＶ由来の機能または「アクセサリー機能」を提供することができるようにされている。アクセサリー機能は、ＡＡＶがその複製のために依存する非ＡＡＶ由来のウイルス及び／または細胞機能である。従って、アクセサリー機能としては、ＡＡＶ遺伝子転写、ステージ特異的ＡＡＶ ｍＲＮＡスプライシング、ＡＡＶ ＤＮＡ複製、Ｃａｐ発現産物の合成及びＡＡＶカプシドアセンブリの活性化に関与するもの等の、ＡＡＶ複製に必要な非ＡＡＶタンパク質及びＲＮＡを少なくとも挙げることができる。ウイルスに基づくアクセサリー機能は、公知のヘルパーウイルスのいずれかから誘導され得る。

【0095】

一実施形態では、アクセサリー機能は、当業者に公知の方法を用いて宿主細胞に導入され、次いで宿主細胞で発現され得る。通常、アクセサリー機能は、無関係なヘルパーウイルスによる宿主細胞の感染によって提供される。多数の適切なヘルパーウイルスが知られており、アデノウイルス；単純ヘルペスウイルス１型及び２型等のヘルペスウイルス；ワクシニアウイルスを挙げることができる。様々な公知の薬剤のいずれかを用いて、細胞の同期化によって提供されるようなもの等の非ウイルスアクセサリー機能も本明細書中で使用される。

【0096】

一実施形態では、アクセサリー機能は、アクセサリー機能ベクトルを使用して提供される。アクセサリー機能ベクターとしては、１つ以上のアクセサリー機能を提供するヌクレオチド配列を挙げることができる。アクセサリー機能ベクターは、宿主細胞における効率的なＡＡＶビリオン産生をサポートするために当該ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。アクセサリー機能ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾンまたはコスミドの形態であり得る。アクセサリーベクターはまた、適切な制御エレメント及び酵素に関連する場合、宿主細胞において転写または発現されてアクセサリー機能を提供することができる１つ以上の線状化ＤＮＡまたはＲＮＡフラグメントの形態でもあり得る。

【0097】

一実施形態では、アクセサリー機能を提供する核酸配列は、アデノウイルス粒子のゲノムから等の天然供給源から得ることができ、或いは当該分野で公知の組換えまたは合成方法を用いて構築することができる。これに関して、アデノウイルス由来のアクセサリー機能が広く研究されており、アクセサリー機能に関与する多数のアデノウイルス遺伝子が同定され、部分的に特徴付けられている。具体的には、早期アデノウイルス遺伝子領域Ｅ１ａ、Ｅ２ａ、Ｅ４、ＶＡＩ ＲＮＡ及び場合によってはＥ１ｂが、アクセサリープロセスに関与すると考えられる。ヘルペスウイルス由来のアクセサリー機能が記載されている。ワクシニアウイルス由来のアクセサリー機能も記載されている。

【0098】

一実施形態では、宿主細胞にヘルパーウイルスを感染させた結果、または宿主細胞にアクセサリー機能ベクターをトランスフェクションした結果、ＡＡＶヘルパー構築物をトランス活性化してＡＡＶ Ｒｅｐ及び／またはＣａｐタンパク質を産生するアクセサリー機能が発現される。Ｒｅｐ発現産物は、組換えＤＮＡ（目的のＤＮＡを含む）をＡＡＶ発現ベクターから削除する。Ｒｅｐタンパク質はまた、ＡＡＶゲノムを複製する役割も果たす。発現されたＣａｐタンパク質はカプシドになり、組換えＡＡＶゲノムはカプシドにパッケージングされる。従って、生産的ＡＡＶ複製が起こり、ＤＮＡはｒＡＡＶビリオンにパッケージングされる。

【0099】

一実施形態では、組換えＡＡＶ複製の後、ｒＡＡＶビリオンは、ＣｓＣ１勾配等の様々な従来の精製方法を用いて宿主細胞から精製することができる。さらに、感染がアクセサリー機能の発現のために使用される場合、残留ヘルパーウイルスを公知の方法を用いて不活性化することができる。例えば、アデノウイルスは、約６０℃の温度に、例えば２０分間以上、加熱することによって不活性化することができる。この治療は、ヘルパーアデノウイルスが熱に不安定であるが、ＡＡＶは極めて熱安定性であるため、ヘルパーウイルスのみを効果的に不活性化する。次いで、得られたｒＡＡＶビリオンは、被験体の眼へのＤＮＡ送達に使用する準備がされる。

【0100】

ウイルスベクターの送達方法には、眼内、網膜下、及び硝子体内経路が含まれるが、これらに限定されない。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、インビボまたはインビトロの形質導入技術のいずれかを用いて眼の細胞に導入され得る。インビトロで形質導入する場合、所望のレシピエント細胞を被験体から取り出し、ｒＡＡＶビリオンで形質導入し、被験体に再導入する。あるいは、これらの細胞が被験体において不適切な免疫応答を生成しない場合、同系または異種の細胞を使用することができる。

【0101】

被験体への形質導入細胞の送達及び導入に適した方法が記載されている。例えば、組換えＡＡＶビリオンを眼細胞と組み合わせることによりインビトロで細胞を形質導入する（例えば適切な培地中で）ことができ、目的のＤＮＡを含む細胞を、サザンブロット及び／またはＰＣＲ等の従来の技術を用いてスクリーニングするか、或いは選択可能なマーカーを使用してスクリーニングする。形質導入された細胞は、その後、以下により詳しく記載される医薬組成物に調製され、組成物は、接合（ｇｒａｆｔｉｎｇ)、筋肉内、静脈内、皮下及び腹腔内注射等の様々な技術によって対象に導入され得る。

【0102】

一実施形態では、インビボ送達のために、ｒＡＡＶビリオンを医薬組成物に調製し、一般に眼内投与、例えば、網膜下に注射で投与する。

【0103】

一実施形態では、医薬組成物は、治療上有効量の目的の核酸、即ち問題の疾患状態の症状を軽減または改善するのに十分な量の核酸または所望の利益を与えるのに十分な量の核酸を産生するために十分な遺伝物質を含む。医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤も含む。このような賦形剤は、それ自体、組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生を誘導せず、かつ過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の薬剤を含む。薬学的に許容される賦形剤としては、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、及び水、生理食塩水、グリセロール及びエタノール等の液体が挙げられるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の無機酸塩；及び酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩等の有機酸の塩が挙げられる。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質等がそのようなビヒクルに存在してもよい。薬学的に許容される賦形剤の徹底的な議論は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ． １９９１）で利用可能である。

【0104】

本明細書の教示から当業者に明らかであるように、加えなければならないウイルスベクターの有効量は経験的に決定することができる。投与は、１回の用量で、連続して、または断続的に、治療の過程全体にわたって行うことができる。投与の最も有効な手段及び用量を決定する方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、治療の組成、標的細胞及び治療される対象によって変化する。治療医師が選択した用量レベル及びパターンで単回投与及び複数回投与を行うことができる。

【0105】

送達されたウイルスベクターによって２以上の導入遺伝子を発現させることができることを理解するべきである。あるいは、それぞれが１つ以上の異なるトランスジーンを発現する別個のベクターを、本明細書に記載のように眼に送達することもできる。さらに、本開示の方法によって送達されるウイルスベクターは、他の適切な組成物及び療法と組み合わせられることも意図されている。

【0106】

遺伝物質を細胞に導入する方法
外因性遺伝物質（例えば、１つ以上の治療用タンパク質をコードするｃＤＮＡ）は、トランスフェクションまたは形質導入等の遺伝的伝達方法によってエクスビボまたはインビボで細胞に導入され、遺伝子改変された細胞を提供する。様々な発現ベクター（即ち、外因性遺伝子材料の標的細胞への送達を促進するためのビヒクル）は、当業者に公知である。

【0107】

本明細書中で使用されるように、「細胞のトランスフェクション」とは、添加されたＤＮＡの取り込みによる新しい遺伝物質の細胞による獲得を指す。従って、トランスフェクションは、物理的または化学的方法を用いて細胞に核酸を挿入することを指す。いくつかのトランスフェクション技術は、当業者に知られており、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；及びタングステン粒子−促進微粒子衝撃が挙げられる。ストロンチウムホスフェートＤＮＡ共沈殿は、別の可能なトランスフェクション方法である。

【0108】

一方、「細胞の形質導入」は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを用いて核酸を細胞に導入するプロセスを指す。核酸を細胞に導入するためのＲＮＡウイルス（即ち、レトロウイルス）は、本明細書において、形質導入キメラレトロウイルスと称される。レトロウイルス内に含まれる外因性遺伝物質は、形質導入された細胞のゲノムに組み込まれる。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療薬をコードするｃＤＮＡを保有するアデノウイルス）で形質導入された細胞は、そのゲノムに組み込まれた外因性遺伝物質を有さないが、細胞内の染色体外に保持される外因性遺伝物質を発現することができる。

【0109】

典型的には、外因性遺伝物質は、異種遺伝子（通常、治療タンパク質をコードするエキソンを含むｃＤＮＡの形態で）と、新規遺伝子の転写を制御するためのプロモーターとを含む。プロモーターは、転写を開始させるのに必要な特異的ヌクレオチド配列を有することを特徴とする。任意に、外因性遺伝子材料は、さらに、所望の遺伝子転写活性を得るために必要とされるさらなる配列（即ち、エンハンサー）を含む。これを議論するために、「エンハンサー」は、単に、プロモーターによって指示される基本的な転写レベルを変化させるためにコード配列（シスで）と隣接して働く翻訳されていないＤＮＡ配列である。外来性遺伝物質は、プロモーターのすぐ下流の細胞ゲノムに導入され、これによりプロモーター及びコード配列がコード配列の転写が可能になるように作動可能に連結され得る。レトロウイルス発現ベクターは、挿入された外因性遺伝子の転写を制御する外因性プロモーターエレメントを含むことができる。このような外因性プロモーターは、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターの両方を含む。

【0110】

天然に存在する構成的プロモーターは、必須の細胞機能の発現を制御する。その結果、構成的プロモーターの制御下にある遺伝子が、細胞増殖の全ての条件下で発現される。典型的な構成的プロモーターは、特定の構成的または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子のためのプロモーターを含む：ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、アクチンプロモーター、及び当業者に公知の他の構成的プロモーター。さらに、多くのウイルスプロモーターは、真核細胞において構成的に機能する。これらには、ＳＶ４０の初期プロモーター及び後期プロモーター、モロニー白血病ウイルス及び他のレトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）；及び単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターがあり、他にも多数ある。従って、上記言及された構成的プロモーターのいずれかを用いて、異種遺伝子挿入物の転写を制御することができる。

【0111】

誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導剤の存在下でのみ発現されるか、または存在下でより大きな程度で発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下での転写が特定の金属イオンの存在下で大きく増加する）。誘導性プロモーターは、それらの誘導因子が結合した時に転写を刺激する応答性要素（ＲＥ）を含んでいる。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸及びサイクリックＡＭＰのためのＲＥが挙げられる。誘導性応答を得るために特定のＲＥを含むプロモーターを選択することができ、そして場合によってはＲＥ自体を別のプロモーターに結合させ、それによって組換え遺伝子に誘導性を付与することができる。従って、適切なプロモーター（構成性対誘導性；強対弱）を選択することにより、遺伝子改変細胞内の治療薬の発現の存在及び発現レベルの両方を制御することが可能である。治療薬をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの制御下にある場合、インサイチュの治療薬の送達は、遺伝子改変された細胞をインサイチュで治療薬の転写を可能にする条件にさらすことによって、例えば治療薬の転写を制御する誘導性プロモーターの特異的誘導剤の腹腔内注射によって、引き起こされる。例えば、メタロチオネインプロモーターの制御下にある遺伝子によってコードされる治療薬の遺伝子改変された細胞によるインサイチュ発現は、遺伝子改変された細胞をインサイチュで適切な（即ち誘導する）金属イオンを含む溶液と接触させることによって増強される。

【0112】

従って、インサイチュで送達される治療薬の量は、以下の要因：（１）挿入遺伝子の転写を指示するために使用されるプロモーターの性質（即ち、プロモーターが構成的または誘導的であるか、強いか弱いか）；（２）細胞に挿入される外来遺伝子のコピー数；（３）患者に投与（例えば、移植）される形質導入／トランスフェクト細胞の数；（４）移植のサイズ（例えば、接合（ｇｒａｆｔ）またはカプセル化発現系）；（５）移植の数；（６）形質導入／トランスフェクトされた細胞または移植が適所に残っている時間の長さ；（７）遺伝子改変細胞による治療薬の生成速度、で制御することにより調整される。特定の治療薬の治療上有効な用量を送達するためのこれらの因子の選択及び最適化は、上記開示された因子及び患者の臨床的プロファイルを考慮して、過度の実験なしに当業者の範囲内でなされるものであるとみなされる。

【0113】

少なくとも１つのプロモーター、及び治療薬をコードする少なくとも１つの異種核酸に加えて、発現ベクターは、発現ベクターでトランスフェクトまたは形質導入された細胞の選択を容易にするために、選択遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子）を含むことができる。或いは、細胞に、２つ以上の発現ベクター、治療薬（複数可）をコードする遺伝子（複数可）を含む少なくとも１つのベクター、選択遺伝子を含む他のベクターをトランスフェクトする。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子及び／またはシグナル配列（以下に記載する）の選択は、過度の実験なしに当業者の範囲内でなされるものであるとみなされる。

【0114】

治療薬は、細胞外、細胞内または膜の位置への送達を標的とすることができる。遺伝子産物が細胞から分泌されることが望ましい場合、発現ベクターは、細胞から細胞外環境に治療遺伝子産物を分泌するための適切な分泌「シグナル」配列を含むように設計される。遺伝子産物が細胞内に保持されることが望ましい場合、この分泌シグナル配列は省略される。同様にして、発現ベクターは、細胞原形質膜内に治療薬を固定するための「保持」シグナル配列を含むように構築することができる。例えば、全ての膜タンパク質は疎水性膜貫通領域を有し、これは膜中のタンパク質の転位を停止させ、タンパク質を分泌させない。遺伝子産物を特定の位置に標的化するためのシグナル配列を含む発現ベクターの構築は、過度の実験を必要とせずに当業者の範囲内でなされるものであるとみなされる。

【0115】

以下の議論は、本開示の様々な有用性を対象とする。例えば、本開示はインサイチュで細胞内毒素及び／または細胞外毒素を解毒するのに適した発現系としての有用性を有する。毒素を解毒することができる治療薬をコードする遺伝子に適切なシグナル配列を付加するか、または省略することにより、治療薬は、細胞外環境、細胞原形質膜または細胞内位置への送達を標的とすることができる。一実施形態では、細胞内解毒治療薬をコードする遺伝子を含む外因性遺伝物質は、さらに、細胞外毒素の、治療薬によって細胞内解毒され得る細胞への輸送を促進する表面受容体をコードする配列を含む。あるいは、細胞は、活性部分が細胞外環境に広がるように、細胞原形質膜内に固定された解毒治療剤を発現するよう遺伝子改変することができる。膜結合型治療薬の活性部分は、細胞外環境に存在する毒素を解毒する。

【0116】

その一部は細胞内保持を標的とする上記治療剤に加えて、本開示はまた、細胞外膜への送達を意図した薬剤及び／または細胞原形質膜に固定されることを意図した薬剤を包含する。

【0117】

単離された細胞において特定の遺伝子産物を発現するための特定の発現ベクターの選択及び最適化は、潜在的に１つ以上の適切な制御領域（例えば、プロモーター、挿入配列）を有する遺伝子を得ること；遺伝子が挿入されたベクターを含むベクター構築物を調製すること；培養された細胞にインビトロでベクター構築物をトランスフェクトまたは形質導入すること；遺伝子産物が培養細胞中に存在するかどうかを決定することによって達成される。特定の実施形態では、アデノ随伴ウイルスファミリー由来のウイルスが使用される。特定の実施形態では、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４及び／またはＡＡＶ５に基づく遺伝子治療用発現ベクターが使用される。

【0118】

従って、当業者には明らかであるように、様々な適切なウイルス発現ベクターが、外因性の遺伝物質を細胞に導入するために利用可能である。遺伝子置換治療に適した特定の状態のための治療剤を発現するために適切な発現ベクターの選択及び選択された発現ベクターの細胞への挿入のための条件の最適化は、過度の実験を必要とせずに当業者の範囲内でなされるものである。

【0119】

別の実施形態では、発現ベクターは、物理的（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、スクレープローディング、微粒子衝突）な様々な方法の１つによって、或いは 化学複合体（例えば、カルシウムまたはストロンチウム共沈、脂質との複合体化、リガンドとの複合体化）としての細胞摂取によって、標的細胞に導入されるプラスミドの形態である。Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ．）及びＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）（ＰｒｏＭｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）等のいくつかの市販製品がカチオン性リポソーム複合体形成のために利用可能である。しかしながら、これらの方法によるトランスフェクションの効率は、標的細胞の性質に大きく依存し、従って、上記の手順を用いて細胞への核酸の最適なトランスフェクションの条件を最適化しなければならない。このような最適化は、過度の実験を必要とすることなく、当業者の範囲内でなされるものである。

【0120】

本開示はまた、上記の遺伝子改変細胞を作製及び使用するための様々な方法を提供する。本明細書中で使用されるように、用語「単離された」は、それらの天然に生じるインビボ位置から除去された細胞または複数の細胞を意味する。患者から細胞を除去する方法、及び単離された細胞を培養液中で維持する方法は、当業者に公知である。

【0121】

本開示はまた、インビボで哺乳動物レシピエントの細胞を遺伝子改変するための方法を提供する。一実施形態によれば、この方法は、異種遺伝子産物を発現させるための発現ベクターを、インサイチュで哺乳動物レシピエントの細胞に導入する（例えばベクターをレシピエントに注入することによって）ことを含む。

【0122】

一実施形態では、遺伝子改変された細胞の調製物は、治療有効量の治療薬をインサイチュでレシピエントに送達するのに十分な量の細胞を含む。既知の状態のための特定の治療薬の治療上有効な用量の決定は、過度の実験を必要とせずに当業者の範囲内でなされるものである。従って、有効用量の決定では、当業者は、投与される特定の治療薬の臨床研究の結果だけでなく、患者の状態、状態の重篤度を考慮するであろう。

【0123】

遺伝子改変細胞が、薬学的に許容される担体中にまだ存在しない場合、それらは、レシピエントへの投与前にそのような担体中に置かれる。このような薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水及び患者及び治療に適切な他の緩衝液が挙げられる。

【0124】

１つより多い組換え遺伝子を、同じまたは異なるベクター上の各遺伝子改変細胞に導入することができ、これにより単一の細胞による複数の治療薬の発現を可能にする。

【実施例】

【0125】

実施例１
眼細胞を標的とする改変ＡＡＶの調製
本発明者らは、局所送達後に眼細胞を標的化するように改変されたＡＡＶを設計した。眼細胞を標的とするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を作り出すために、本発明者らはまず眼内細胞に優先的に結合するペプチドモチーフを同定するためにインビボでファージディスプレイパニングを使用した。ファージディスプレイライブラリーをマウスの眼に注射し、その後、結合したファージと共に眼細胞を単離した。次いで、単離されたファージを増幅し、再注入し、このようなインビボでのパンニングを５ラウンド行った後、回収されたファージのＤＮＡ配列決定により、最初のファージライブラリーからの別個のペプチドモチーフの濃縮が明らかになった。

【0126】

マウスにおいて、ペプチドモチーフＧＳＴＰＰＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）及びＧＥＴＲＡＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）が同定された。眼細胞に対するこれらのファージの親和性を確認するために、各ファージを個々にマウスに静脈内注射し、視覚化した。パンニング結果と一致して、選択されたファージの各々は、対照で観察されたバックグラウンドレベルを超えて目に蓄積された。

【0127】

ファージディスプレイパニングから同定されたペプチドをＡＡＶ２カプシドに挿入することにより、ペプチド修飾ＡＡＶを生成した。ＶＰ３カプシドタンパク質の５８７位と５８８位の間にペプチドを挿入してクローンを得た。ＡＡＶ−ＷＴ（野生型、挿入なし）は対照ウイルスとしての役割を担った。５８７／５８８部位は、ＡＡＶ２と主要レセプターのヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）との結合に関与するＶＰ３カプシドタンパク質のドメインに位置し、この部位におけるペプチドの挿入は、ウイルスの生存率を損なうことなくＡＡＶの指向性を変えることができる。改変されたカプシドタンパク質は、野生型ウイルスに匹敵するゲノム力価を有するＡＡＶベクターゲノムをパッケージングした。

【化1】

【0128】

ＡＡＶ２野生型カプシドの配列を以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す。

【化2】

【0129】

以下の実施例では、眼細胞を標的とする挿入モチーフ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を有するＡＡＶ２野生型カプシドの配列をイタリック体にし、下線を付したアミノ酸をスペーサーとする。

【化3】

【0130】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４挿入モチーフを有するＡＡＶ２野生型カプシドの配列を以下の配列番号ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に示す。眼細胞を標的とするアミノ酸モチーフはイタリック体であり、下線を付したアミノ酸はスペーサーである。

【化4】

【0131】

ＡＡＶ９野生型カプシドの配列を以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示す。

【化5】

【0132】

材料及び方法：
インビボバイオパニング：１μｌのＰｈ．Ｄ．（商標）７ファージライブラリー（ＮＥＢからの力価２．０×１０^１３ｐｆｕ／ｍｌ）をマウス眼の網膜下腔に注射した。３０分後、注入した眼からの網膜及びＲＰＥを分離し、５ｍｌの冷ＰＢＳで３〜５回洗浄した。網膜及びＲＰＥを５００μｌのＰＢＳ中で均質化した。回収されたファージを滴定し、増幅し、精製し、次回のインビボパンニングのため追加の目に再注入した。全手順を４回繰り返した。この後、５０個のランダムに選択されたクローンを配列決定して、濃縮されたモチーフを決定した。

【0133】

ペプチド改変ＡＡＶ２カプシドの構築：改変カプシドのクローニングのためのプラスミドを、野生型ＡＡＶ２ Ｒｅｐ及びＣａｐを含むｐＸＸ２から開発した。アミノ酸ＡＡＡｓｔｏｐＡと、ＡＡＶ２Ｃａｐのアミノ酸位置５８７と５８８との間に挿入された制限部位ＮｏｔＩ及びＡｓｃＩとをコードするＤＮＡフラグメントを有するプラスミドを、バックボーンプラスミドとして構築した。選択されたペプチドをコードするｄｓＤＮＡインサートを、ペプチド改変ｐＸＸ２としてＮｏｔＩ及びＡｓｃＩ部位にクローニングした。

【0134】

ＡＡＶ２産生及び力価：２９３Ｔ細胞のプレートに、３つのプラスミド：ＡＡＶ２のＲｅｐ及びＣａｐタンパク質を供給したｐＸＸ２またはペプチド改変ｐＸＸ２；アデノウイルスヘルパー機能を含むｐＨｅｌｐｅｒ；及びＡＡＶ２ ＩＴＲ及び対象の導入遺伝子を含むベクタープラスミド、を同時トランスフェクトした。直径１５０ｍｍのプレート２０枚を、プラスミドｐＸＸ２、ｐＨｅｌｐｅｒ及びベクター（１：１：１のモル比）の９０μｇのＤＮＡで同時トランスフェクトした。６０時間インキュベートした後、ウイルスをイオジキサノール勾配で精製し、ムスタングＱ膜を介してさらに精製した。組換えＡＡＶの力価をリアルタイムＰＣＲによって決定した。

【0135】

実施例２
遺伝子療法による遺伝性眼疾患の治療
インビボで遺伝子治療薬の送達を試験するために、ウイルスベクターを眼に投与する２つの方法を試験した。投与方式は、網膜下（図Ａ−Ｄ）及び硝子体内（図Ｅ−Ｉ）にウイルスベクターを注入することによった。

【0136】

この研究で使用されたウイルスはＡＡＶ２／２であった。対照として、野生型ＡＡＶ２／２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰを使用し、試験薬剤はＰＭＡＡＶ−ＧＳＴ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ．であった。ウイルスを５週齢のｃ５７ＢＬ／６雌マウスに注射した。マウスにウイルス（２．２６×１０９ｖｇ／眼）を網膜下注射した。３週間後、マウスを麻酔し、瞳孔を拡張させた。それらを定位プラットフォームに置き、動的蛍光眼底写真を撮った。４週間後、マウスを屠殺し、眼を摘出し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。組織切片を切断して標本にした。ｅＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡下で観察した。

【0137】

野生型ＡＡＶ２／２．ＣＭＶ．ｅＧＦＰ及びＰＭＡＡＶ−ＧＳＴ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰの網膜下注射の３週間後、生きた動物における蛍光イメージングは相対的な感染効率を示した。この実験で用いた標的化ペプチドはＧＳＴＰＰＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）であった。ＡＡＶ２／２注入眼では、ＧＦＰ陽性の斑点領域が観察されたが、ＰＭＡＡＶ−ＧＳＴ眼では、広範かつ均一なＧＦＰシグナルが存在した（図２）。他の実験では、標的化ペプチドはＧＥＴＲＡＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）であった。

【0138】

網膜下注射の４週間後、ＰＭＡＡＶ−ＧＳＴ．ＣＭＶ．ｅＧＦＰは、網膜色素上皮（ＲＰＥ）及び外核層（ＯＮＬ）の層群、及び神経節細胞層（ＧＣＬ）のいくつかの細胞を標的とした。ＡＡＶ２／２は主に外側網状層（ＯＰＬ）を標的とした（図３）。

【0139】

すべての刊行物、特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の説明では、本発明をその特定の好ましい実施形態に関連して説明し、多くの詳細を説明の目的で記載してきたが、本発明は追加の実施形態を受け入れる余地があり、本明細書に記載される詳細のうちのいくつかは、本発明の基本原理から逸脱することがない限り、かなり変更されてもよいことは、当業者には明らかであろう。

【0140】

本発明を説明する文脈における用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示対象の使用は、本明細書中で特段の指示がない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」、「ｈａｖｉｎｇ（有する）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む、挙げられる）」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ（含有する）」との用語は、特段の指示がない限り、制限のない用語（即ち、「含むが、これに限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で特段の指示がない限り、範囲内の各別個の値を個別に指す簡略方法として役立つことを意図しており、各個別値は本明細書に個別に列挙されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で特段の指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供される任意の、すべての例、または例示的な言語（例えば、「等」）の使用は、単に本発明をよりよく表すことを意図しており、特に断らない限り、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中のいかなる言葉も、請求されていない要素を本発明の実施に不可欠であると解釈されるべきではない。

【0141】

本発明を実施するために本発明者らに知られている最良の形態を含む本発明の実施形態が本明細書に記載されている。これらの実施形態の変形は、前述の説明を読むことにより当業者には明らかになるであろう。本発明者らは、当業者がこのような変形を適切に使用することを期待しており、本発明者らは本発明が本明細書に具体的に記載されたものとは別の方法で実施されることを意図する。従って、本発明は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、それらのすべての可能な変形での上述の要素の任意の組合せが本発明に包含される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
眼細胞標的化ペプチドを含む改変アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、前記標的化ペプチドは３〜１０のアミノ酸長であり、且つ前記標的化ペプチドはＡＡＶを眼細胞に標的化する前記カプシドタンパク質。
（項目２）
前記標的化ペプチドが３、４、５、６または７のアミノ酸長である項目１に記載のカプシドタンパク質。
（項目３）
前記標的化ペプチドが、アミノからカルボキシへの方向、またはカルボキシからアミノへの方向で発現される、アミノ酸配列ＧＳＴＰＰＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）またはアミノ酸配列ＧＥＴＲＡＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）を有する１０以下のアミノ酸長の配列を含む項目１に記載のカプシドタンパク質。
（項目４）
前記標的化ペプチドが、アミノからカルボキシへの方向で、またはカルボキシからアミノへの方向で発現される、アミノ酸配列ＧＳＴＰＰＰＭ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）またはアミノ酸配列ＧＥＴＲＡＰＬ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）からなる項目１に記載のカプシドタンパク質。
（項目５）
前記標的化ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８の、Ｐ３４−Ａ３５、Ｔ１３８−Ａ１３９、Ａ１３９−Ｐ１４０、Ｇ４５３−Ｔ４５４、Ｎ５８７−Ｒ５８８及び／またはＲ５８８−Ｑ５８９の位置で、ＡＡＶ２カプシド残基の間に挿入される項目１に記載のカプシドタンパク質。
（項目６）
前記標的化ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の、Ｄ３８４、Ｇ３８５、Ｉ５６０、Ｔ５６１、Ｎ５６２、Ｅ５６３、Ｅ５６４、Ｅ５６５、Ｎ７０４及び／またはＹ７０５の位置で、ＡＡＶ９カプシド残基の後に挿入される項目１に記載のカプシドタンパク質。
（項目７）
前記標的化ペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含むかまたはそれからなる項目１に記載のカプシドタンパク質。
（項目８）
前記標的化ペプチドは罹患した眼細胞を標的とする項目１または２に記載のカプシドタンパク質。
（項目９）
前記標的化ペプチドは、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒの先天性黒内障、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、脊髄小脳失調症タイプ７（ＳＣＡＴ）、色盲、及びムコ多糖症（ＭＰＳ）ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症、を有する被験体の眼細胞を標的とする、項目８に記載のカプシドタンパク質。
（項目１０）
前記ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ−Ｒｈ７４（アカゲザル由来ＡＡＶ）、ＡＡＶＲｈ１０、またはこれらの血清型の改変カプシドである項目１〜９のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質。
（項目１１）
前記ＡＡＶがＡＡＶ２カプシドである項目１０に記載のカプシドタンパク質。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれか１項に記載の前記改変カプシドをコードする核酸配列。
（項目１３）
核酸配列ＧＧＧＴＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＡＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を含む項目１２に記載の核酸配列。
（項目１４）
項目１〜１１のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質を含有するＡＡＶウイルス。
（項目１５）
項目１〜１１のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質を含有するウイルスベクター。
（項目１６）
前記ウイルスベクターが、さらに、目的の核酸をコードする核酸配列を含む項目１５に記載のウイルスベクター。
（項目１７）
前記目的の核酸が治療薬である項目１６に記載のウイルスベクター。
（項目１８）
前記治療薬が酵素またはＲＮＡｉ分子である項目１７に記載のウイルスベクター。
（項目１９）
前記治療薬が、アタキシン７ ｍｉｒＲＮＡ、網膜色素上皮特異的６５ｋＤａタンパク質（ＲＰＥ ６５）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）阻害剤または可溶性ＶＥＧＦ受容体１（ｓＦｉｆ１）、（Ｒａｂエスコートタンパク質−１）ＲＥＰ１、Ｌ−オプシン、ロドプシン（Ｒｈｏ）、ホスホジエステラーゼ６（３（ＰＤＥ６Ｉ３）、ＡＴＰ結合カセット，サブファミリーＡ，メンバー４（ＡＢＣＡ４）、レシチンレチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）、網膜変性，遅い／ペリフェリン（ＲＤＳ／ペリフェリン）、チロシンタンパク質キナーゼＭｅｒ（ＭＥＲＴＫ）、イノシン−５プライムモノホスフェートデヒドロゲナーゼ，Ｉ型（ＩＭＰＤＨＩ）、グアニル酸シクラーゼ２Ｄ（ＧＵＣＹ２Ｄ）、アリール−炭化水素相互作用タンパク質様１（ＡＩＰＬ１）、網膜色素変性ＧＴＰアーゼレギュレーター相互作用タンパク質１（ＲＰＧＲＩＰＩ）、イノシン−５−プライムモノホスフェートデヒドロゲナーゼ，Ｉ型（ＩＭＰＤＨ１グアニンヌクレオチド結合タンパク質、アルファト形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）、環状ヌクレオチド依存性チャネルベータ３（ＣＮＧＢ３）、レチノサチシン１（Ｒｓ１）、眼球白内障１型（ＯＡ１）、眼皮膚白皮症型１（ＯＣＡ１）チロシナーゼ、Ｐ２１ ＷＡＦ−１／Ｃｉｐｌ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、エンドスタチンアンギオスタチン、アリールスルファターゼＢ、または１３−グルクロニダーゼである項目１７に記載のウイルスベクター。
（項目２０）
項目１４に記載のＡＡＶウイルスまたは項目１５〜１９のいずれかに１項に記載のウイルスベクター及び担体を含む組成物。
（項目２１）
項目１４に記載のＡＡＶウイルスまたは項目１５〜１９のいずれかに１項に記載のウイルスベクター及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
（項目２２）
項目１５〜１９のいずれか１項に記載のウイルスベクターによって形質導入された、またはそれを含む細胞。
（項目２３）
前記細胞が哺乳動物細胞である項目２２に記載の細胞。
（項目２４）
前記細胞がヒト細胞である項目２３に記載の細胞。
（項目２５）
前記細胞が非哺乳動物細胞である項目２３に記載の細胞。
（項目２６）
前記細胞がインビトロであり、前記任意に細胞が眼細胞である項目２２〜２５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目２７）
前記細胞がインビボであり、任意に前記細胞が眼細胞である項目２２〜２５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目２８）
項目１５〜１９のいずれか１項に記載のウイルスベクターまたは項目２２〜２７のいずれか１項に記載の細胞を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物の眼疾患を治療する方法。
（項目２９）
前記哺乳動物がヒトである項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記疾患が、網膜色素変性症、黄斑変性症、Ｌｅｂｅｒの先天性黒内障、早期発症重症網膜ジストロフィー、色覚異常、網膜分離症、眼白子症、眼皮膚白皮症、緑内障、シュタルガルト病、先天性脈絡膜欠如、加齢黄斑変性症、ＳＣＡＴ、色盲、またはＭＰＳ ＩＶ及びＭＰＳ ＶＩＩ等の角膜に影響を与えるリソソーム蓄積症である項目２８または２９に記載の方法。
（項目３１）
項目１５〜１９のいずれか１項に記載のウイルスベクターで眼細胞を形質導入して、形質導入された眼細胞が治療薬を発現し、薬剤を被験体の眼に送達することを含む、被験体の眼に薬剤を送達する方法。
（項目３２）
前記形質導入された眼細胞が、網膜外網状層（ＯＰＬ）内にあるか、それを含む項目２８に記載の方法。
（項目３３）
医学的処置または診断に使用するための、項目１５〜１９のいずれか１項に記載のウイルスベクター。
（項目３４）
哺乳動物の眼疾患を治療するために有用な医薬を調製するための、項目１５〜１９のいずれか１項に記載のウイルスベクターの使用。
（項目３５）
医学的処置または診断に使用するための、項目２２〜２５のいずれか１項に記載の細胞。
（項目３６）
哺乳動物の眼疾患を治療するために有用な医薬を調製するための、項目２２〜２５のいずれか１項に記載の細胞の使用。
（項目３７）
哺乳動物の眼疾患の予防的または治療的処置に使用するための、項目１５〜１９のいずれか１項に記載のウイルスベクター。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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