特許 6873921 核酸の集団を濃縮するための組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6873921

(24)【登録日】2021年4月23日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】核酸の集団を濃縮するための組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/10 20060101AFI20210510BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20210510BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20210510BHJP

   C12Q 1/6888 20180101ALI20210510BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/10 100Z

   G01N33/50 P

   C12Q1/6869 Z

   C12Q1/6888 Z

   !C12Q1/6844 Z

【請求項の数】33

【全頁数】105

(21)【出願番号】特願2017-560813(P2017-560813)

(86)(22)【出願日】2016年5月17日

(65)【公表番号】特表2018-520652(P2018-520652A)

(43)【公表日】2018年8月2日

(86)【国際出願番号】US2016032936

(87)【国際公開番号】WO2016187234

(87)【国際公開日】20161124

【審査請求日】2019年4月24日

(31)【優先権主張番号】62/163,273

(32)【優先日】2015年5月18日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/334,348

(32)【優先日】2016年5月10日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】517401668

【氏名又は名称】カリウス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100151448

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 孝博

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100203035

【弁理士】

【氏名又は名称】五味渕 琢也

(74)【代理人】

【識別番号】100185959

【弁理士】

【氏名又は名称】今藤 敏和

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100202267

【弁理士】

【氏名又は名称】森山 正浩

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】ブラウキャンプ，ティモシー・エイ

(72)【発明者】

【氏名】クリスチャンズ，フレッド

(72)【発明者】

【氏名】ヴィルファン，イゴール・ディー

(72)【発明者】

【氏名】スミス，スコット

(72)【発明者】

【氏名】ケルテース，マイケル

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００８−５３６４８１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１０−５３７６５０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０５８０７９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１０／０２９７７１０（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１４／０２２７６９１（ＵＳ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

宿主からの核酸サンプル中の無細胞微生物核酸を濃縮する方法であって、
（ａ）前記宿主からの前記核酸サンプルを用意するステップであって、前記サンプルは、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液および洗浄液からなる群から選択され、前記宿主からの前記核酸サンプルは無細胞宿主核酸および無細胞微生物核酸を含むステップと；
（ｂ）１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを除去または単離し、それによって、
（ｉ）約１２０塩基長未満
（ｉｉ）約２４０〜約２８０塩基長、および／または
（ｉｉｉ）約４２５〜約４７５塩基長
の核酸長範囲内の無細胞微生物核酸を濃縮することで、無細胞宿主核酸に対して無細胞微生物核酸を濃縮するステップと
を含む方法。

【請求項2】

ステップ（ｂ）が１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを除去することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

ステップ（ｂ）が１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを単離することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記１つまたは複数の長さ間隔が約１８０塩基、約３６０塩基、約５４０塩基、約７２０塩基および約９００塩基からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記１つまたは複数の長さ間隔が１５０塩基またはその倍数、１６０塩基またはその倍数、１７０塩基またはその倍数、１９０塩基またはその倍数、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

ステップ（ｂ）が約１５０塩基長を超えるＤＮＡを除去することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ステップ（ｂ）が最大約１５０塩基長であるＤＮＡを単離することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記宿主からの前記核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含む、前記少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記宿主がヒトである、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

宿主中の病原体を同定する方法（医師の判断を除く）であって、
前記宿主から得られた血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液および洗浄液からなる群から選択されるサンプルを用意するステップと；
前記サンプルを無細胞微生物核酸について宿主由来無細胞核酸に対して濃縮するステップであって、前記濃縮は前記サンプルからヌクレオソームＤＮＡの長さ範囲またはヌクレオソーム会合ＤＮＡの長さ範囲を優先的に除去することを含むステップと；
前記無細胞微生物核酸を分析するステップと；
前記無細胞微生物核酸から前記宿主中の病原体を同定するステップと
を含む方法。

【請求項12】

前記濃縮するステップが、約２００塩基長を超える核酸を前記サンプルから優先的に除去することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記濃縮するステップが、約１５０塩基長を超える核酸を前記サンプルから優先的に除去することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記濃縮するステップが、約１２０塩基長を超える核酸を前記サンプルから優先的に除去することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記濃縮するステップが、前記サンプルからの約１０塩基長〜約１２０塩基長の核酸を優先的に濃縮することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項16】

前記濃縮するステップが、宿主由来核酸を優先的に消化することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

前記濃縮するステップが、前記無細胞微生物核酸を優先的に複製することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項18】

前記宿主がヒトである、請求項１１に記載の方法。

【請求項19】

前記無細胞微生物核酸が病原性生物から得られたものである、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

前記宿主由来のサンプルについて、ハイスループットシーケンシングを行うことをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記宿主サンプルについて、大量並列シーケンシングを行うことをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記無細胞微生物核酸がＤＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記無細胞微生物核酸が細菌ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、真菌ＤＮＡ、寄生生物ＤＮＡおよびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるものを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記無細胞微生物核酸がＲＮＡを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項25】

前記無細胞微生物核酸がウイルスＲＮＡを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記無細胞宿主核酸または無細胞微生物核酸が、人工的に断片化されていない、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記無細胞宿主核酸または無細胞微生物核酸が、人工的に酵素的に断片化されていない、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記１つまたは複数の長さ間隔が、１１０〜１０００塩基を含む、請求項２に記載の方法。

【請求項29】

前記宿主サンプルが血漿を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

前記サンプルが血漿を含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項31】

約１５０塩基長を超える無細胞宿主核酸を前記宿主サンプルから除去することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

前記約１５０塩基長を超える無細胞宿主ＤＮＡは、約１５０塩基対長を超える長さを有する、請求項６に記載の方法。

【請求項33】

前記濃縮は、約１５０塩基未満の長さを有する核酸を優先的に濃縮することを含む、請求項１１に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、その出願が参照により本明細書に組み込まれる、２０１５年５月１８日に出願された米国仮出願第６２／１６３２７３号および２０１６年５月１０日に出願された米国仮出願第６２／３３４３４８号の利益を主張する。

【背景技術】

【0002】

感染性疾患および障害は、プライマリケア提供者および患者にとって同様に課題であり、特に他の病気と比較して、検出率が低いことが多い。感染性疾患の不適切な検出は、正確な回答を迅速に作成することができる意味のある検査の欠如を含むいくつかの要因により得る。いくつかの診断検査の速度が遅いことを考えると、多くの医師は、待ち時間中に症状が悪化するリスクよりも、検査結果を受け取る前に病因の疑いに基づいて患者を治療することを選択する。感染性疾患の検査はまた一般的に病原体特異的であるので、医師は、検査を指示する前に、患者の症状の病因因子のいくらかの考えをもっていなければならない。いくつかの感染性疾患についての別の交絡因子は、感染の過程で感染因子が突然変異して、結果として初期診断が後の時点で患者の状態の性質を正確に反映しないことがあることである。二次感染および同時感染も、他の感染源を隠蔽したり、検出を完全に逃れる可能性があるため、診断および治療を混乱させ得る。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0003】

病原体感染の誤診および過小診断は、患者ならびにコミュニティ全般に悲惨な結果をもたらすおそれがある。例えば、抗生物質の過剰使用または誤用は抗生物質耐性菌の増加を促進するおそれがあり、これは患者だけでなく患者と接触する他の人々にとっても危険である。したがって、サンプル中の病原体を同定するための信頼性が高く、包括的で手頃な検査が当技術分野において必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0004】

本開示は、一般的に、宿主から採取され、宿主核酸が存在するサンプル中の非宿主核酸を同定する方法を提供する。このような方法は、例えば、宿主から採取した無細胞サンプルの分析を通した宿主内の感染性または病原性生物の同定を含む種々の用途を有する。一般に、本明細書に記載される方法は、宿主からの無細胞血漿サンプルなどの宿主サンプル中に由来する宿主核酸に対する非宿主核酸の選択的濃縮を含み得る。次いで、濃縮された核酸を、非宿主核酸の存在および宿主内の病原体または感染性生物の存在を同定するために分析することができる。非宿主核酸、病原体または感染性生物の存在の同定は、宿主が経験する感染性疾患または障害の検出、診断、予後、監視または病期分類を可能にし得る。

【0005】

一例では、本開示は、宿主中の病原体を同定する方法であって、宿主からの無細胞血液または血漿サンプルを用意することによって開始する方法を提供する。次いで、血液または血漿サンプルを、宿主由来核酸に対して非宿主由来核酸について濃縮し、次いで、濃縮サンプルを非宿主由来核酸について分析し、次いで、宿主中の病原体を非宿主核酸から同定することができる。

【0006】

一態様では、本開示は、宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列をプライミングまたは捕捉する方法であって、（ａ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、宿主からの核酸サンプルは宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；（ｂ）宿主からの核酸サンプルをオリゴヌクレオチドのコレクションと混合し、それによって、混合物を得るステップであって、オリゴヌクレオチドのコレクションは異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含み、異なるヌクレオチド配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列を含有するよう特異的に選択されるステップと；（ｃ）混合物中で、オリゴヌクレオチドのコレクションを核酸サンプルと接触させるステップであって、接触によって混合物中の非宿主核酸を少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列に結合させ、それによって、非宿主核酸をプライミングまたは捕捉し、接触によって宿主核酸の最大１０％を少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列に結合させるステップとを含む方法を提供する。

【0007】

いくつかの実施形態では、本方法が、反応においてプライミングまたは捕捉された非宿主核酸を優先的に増幅するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法が、次世代シーケンシングアッセイ、ハイスループットシーケンシングアッセイ、大量並列シーケンシングアッセイ、ナノポアシーケンシングアッセイまたはサンガーシーケンシングアッセイなどのシーケンシングアッセイを行うことによって、プライミングまたは捕捉された非宿主核酸を配列決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法が、プライミングまたは捕捉された非宿主核酸を優先的に単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、優先的に単離するステップが、プルダウンアッセイを行うことを含む。いくつかの実施形態では、本方法が、プライミングまたは捕捉された非宿主核酸に対してプライマー伸長反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが核酸標識を含有する。いくつかの実施形態では、プライミングまたは捕捉された非宿主核酸がＲＮＡ非宿主核酸である。いくつかの実施形態では、本方法が、プライミングまたは捕捉されたＲＮＡ非宿主核酸に対して重合反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、重合反応が逆転写酵素によって行われる。

【0008】

別の態様では、本開示は、宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を配列決定する方法であって、（ａ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、宿主からの核酸サンプルは宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；（ｂ）宿主からの核酸サンプルをオリゴヌクレオチドのコレクションと混合し、それによって、混合物を得るステップであって、オリゴヌクレオチドのコレクションは異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含み、異なるヌクレオチド配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列を含有するよう特異的に選択されるステップと；（ｃ）混合物中で、オリゴヌクレオチドのコレクションを核酸サンプルと接触させるステップであって、接触によって混合物中の非宿主核酸を少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列に結合させ、接触によって宿主核酸の最大１０％を少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列に結合させるステップと；（ｄ）シーケンシングアッセイを行うことによって、少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列に結合した非宿主核酸を配列決定するステップとを含む方法を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態では、本方法が、反応において非宿主核酸を優先的に増幅するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、シーケンシングアッセイが次世代シーケンシングアッセイ、ハイスループットシーケンシングアッセイ、大量並列シーケンシングアッセイ、ナノポアシーケンシングアッセイまたはサンガーシーケンシングアッセイである。いくつかの実施形態では、本方法が、非宿主核酸を優先的に単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離するステップが、プルダウンアッセイを行うことを含む。いくつかの実施形態では、本方法が、非宿主核酸に対してプライマー伸長反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが核酸標識を含有する。いくつかの実施形態では、非宿主核酸がＲＮＡ非宿主核酸である。いくつかの実施形態では、本方法が、ＲＮＡ非宿主核酸に対して重合反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、重合反応が逆転写酵素によって行われる。

【0010】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１００００個のオリゴヌクレオチドである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００００個のオリゴヌクレオチドである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１００００００個のオリゴヌクレオチドである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、固体支持体にコンジュゲートされない。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、最大２００個のヌクレオチドの長さを有する。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドの各々が、１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含み、１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドの各ドメインが異なるヌクレオチド配列を含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドの各ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドの各ドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドの各ドメインが哺乳動物核酸配列でない。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主が哺乳動物宿主であり、哺乳動物宿主からの核酸サンプルが哺乳動物宿主核酸および非哺乳動物核酸を含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主がヒト宿主であり、ヒト宿主からの核酸サンプルがヒト宿主核酸および非ヒト核酸を含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非ヒト核酸が微生物核酸を含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非ヒト核酸が細菌核酸を含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、本方法が少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿および便、例えば血液、血漿および血清からなる群から選択される。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、サンプルが血液、血漿および血清からなる群から選択される。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環核酸サンプルである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが核酸配列決定可能なライブラリーを含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが一本鎖ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、核酸がＤＮＡである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、核酸がＲＮＡである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが人工的に断片化された核酸を含まない。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのコレクションがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡまたはこれらの任意の組み合わせを含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのコレクションがＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのコレクションがＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。

【0011】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのコレクションがＤＮＡオリゴヌクレオチドである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのコレクションがＲＮＡオリゴヌクレオチドである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのコレクションが核酸標識または化学標識で標識される。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、化学標識がビオチンである。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのコレクションが人工的に断片化された核酸を含まない。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非宿主核酸が病原体核酸、微生物核酸、細菌核酸、ウイルス核酸、真菌核酸、寄生生物核酸およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非宿主核酸が微生物核酸である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非宿主核酸が細菌核酸である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、非宿主核酸がウイルス核酸である。

【0012】

さらに別の態様では、本開示は、宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮する方法であって、（ａ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、宿主からの核酸サンプルは宿主からの一本鎖核酸サンプルであり、宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；（ｂ）宿主からの一本鎖核酸の少なくとも一部を再生し、それによって、サンプル中に二本鎖核酸の集団を生成するステップと；（ｃ）ヌクレアーゼを用いてサンプル中の二本鎖核酸の少なくとも一部を除去し、それによって、宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮するステップとを含む方法を提供する。

【0013】

いくつかの実施形態では、本方法が、シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、本方法が少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主がヒトである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環核酸サンプルである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿および便、例えば血液、血漿および血清からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、核酸がＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸がＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本方法が、一本鎖宿主配列を宿主からの一本鎖核酸サンプルに添加するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法が、熱を用いて核酸サンプル中の核酸の少なくとも一部を変性させて、一本鎖核酸サンプルを作製するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸の少なくとも一部の再生が、設定された時間枠内で起こる。いくつかの実施形態では、核酸の少なくとも一部の再生が、９６時間以内で起こる。いくつかの実施形態では、再生がトリメチルアンモニウムクロリドの存在下での再生を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼが二本鎖特異性ヌクレアーゼ、ＢＡＬ−３１、二本鎖特異的ＤＮアーゼまたはこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼが二本鎖特異的ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼがＢＡＬ−３１である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼが二本鎖核酸に対して活性である。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼが一本鎖核酸に対して活性でない。いくつかの実施形態では、核酸が人工的に断片化されていない。

【0014】

さらに別の態様では、本開示は、宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮する方法であって、（ａ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、宿主からの核酸サンプルはヌクレオソームと会合した宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；（ｂ）ヌクレオソームと会合した宿主核酸の少なくとも一部を除去し、それによって、宿主からの核酸サンプル中の非宿主核酸を濃縮するステップとを含む方法を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態では、本方法が、シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、本方法が少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主がヒトである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環核酸サンプルである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿および便、例えば血液、血漿および血清からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における除去が電気泳動を行うことを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における除去が等速電気泳動を行うことを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における除去が多孔質フィルタを使用することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における除去がイオン交換カラムを使用することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における除去が１つまたは複数のヒストンに特異的な１つまたは複数の抗体を使用することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヒストンが、ヒストンＨ２Ａ Ｎ末端、ヒストンＨ２Ａ溶媒露出エピトープ、ヒストンＨ３中のＬｙｓ９上のモノメチル化、ヒストンＨ３中のＬｙｓ９上のジメチル化、ヒストンＨ３中のＬｙｓ５６上のトリメチル化、ヒストンＨ２Ｂ中のＳｅｒ１４上のリン酸化およびヒストンＨ２Ａ．Ｘ中のＳｅｒ１３９上のリン酸化からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の抗体がカラム上に固定化される。いくつかの実施形態では、本方法が、１つまたは複数の抗体を除去するステップをさらに含む。

【0016】

別の態様では、本開示は、宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮する方法であって、（ａ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、宿主からの核酸サンプルは宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；（ｂ）１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを除去または単離し、それによって、宿主からの核酸サンプル中の非宿主核酸を濃縮するステップとを含む方法を提供する。

【0017】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）が１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを除去することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）が１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを単離することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の長さ間隔が約１８０塩基対、約３６０塩基対、約５４０塩基対、約７２０塩基対および約９００塩基対からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の長さ間隔が約１５０塩基対、約３００塩基対、約４５０塩基対、約６００塩基対および約７５０塩基対からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の長さ間隔が約１６０塩基対、約３２０塩基対、約４８０塩基対、約６４０塩基対および約８００塩基対からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の長さ間隔が約１７０塩基対、約３４０塩基対、約５１０塩基対、約６８０塩基対および約８５０塩基対からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の長さ間隔が約１９０塩基対、約３８０塩基対、約５７０塩基対、約７６０塩基対および約９５０塩基対からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の長さ間隔が１５０塩基対またはその倍数、１６０塩基対またはその倍数、１７０塩基対またはその倍数、１９０塩基対またはその倍数、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）が約１００、１２０、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００または５００塩基長を超えるＤＮＡを除去することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）が最大約１００、１２０、１５０、１７５、２００、２５０または３００塩基長であるＤＮＡを単離することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）が約１０塩基長〜約１００塩基長、約１０塩基長〜約１２０塩基長、約１０塩基長〜約１５０塩基長、約１０塩基長〜約１７５塩基、約１０塩基長〜約２００塩基長、約１０塩基長〜約２５０塩基長、約１０塩基長〜約３００塩基長、約３０塩基長〜約１００塩基長、約３０塩基長〜約１２０塩基長、約３０塩基長〜約１５０塩基長、約３０塩基長〜約１７５塩基長、約３０塩基長〜約２００塩基長、約３０塩基長〜約２５０塩基長または約３０塩基長〜約３００塩基長であるＤＮＡを単離することを含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、本方法が、シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、本方法が少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主がヒトである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環核酸サンプルである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである。

【0019】

さらに別の態様では、本開示は、宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮する方法であって、（ａ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、宿主からの核酸サンプルは宿主核酸、非宿主核酸およびエキソソームを含むステップと；（ｂ）エキソソームの少なくとも一部を除去または単離し、それによって、宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮するステップとを含む方法を提供する。

【0020】

いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）がエキソソームの少なくとも一部を除去することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）がエキソソームの少なくとも一部を単離することを含む。いくつかの実施形態では、本方法が、シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、本方法が少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主がヒトである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿および便、例えば血液、血漿および血清からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環核酸サンプルである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである。いくつかの実施形態では、本方法が、エキソソーム内の宿主核酸を除去するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法が、非宿主核酸を単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における除去または単離が白血球由来エキソソームを除去または単離することを含む。いくつかの実施形態では、白血球がマクロファージである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における除去または単離が白血球由来エキソソームを除去または単離するために免疫沈降を使用することを含む。

【0021】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、本方法が、１つまたは複数の核酸バーコードを１つまたは複数のサンプルに添加するステップをさらに含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、本方法が、１つまたは複数の病原性遺伝子座；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に特異的な配列に特異的な１つまたは複数の核酸をサンプルに添加するステップをさらに含む。

【0022】

さらに別の態様では、本開示は、宿主からの核酸サンプル中の配列をプライミングまたは捕捉する方法であって、（ａ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップと；（ｂ）宿主からの核酸サンプルを１つまたは複数の病原性遺伝子座；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に特異的な配列に特異的な対象となる１つまたは複数の領域の核酸と混合し、それによって、混合物を得るステップと；（ｃ）混合物中で、対象となる１つまたは複数の領域の核酸を核酸サンプルと接触させるステップであって、接触によって核酸サンプル中の核酸を対象となる１つまたは複数の領域の核酸に結合させ、それによって、核酸をプライミングまたは捕捉するステップとを含む方法を提供する。

【0023】

いくつかの実施形態では、本方法が、１つまたは複数の病原性遺伝子座；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に特異的な配列に特異的な１つまたは複数の核酸を使用して核酸増幅反応を行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応、逆転写、転写媒介増幅またはリガーゼ連鎖反応を含む。いくつかの実施形態では、本方法が、１つまたは複数の病原性遺伝子座；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に特異的な配列に特異的な核酸を単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、単離するステップが、プルダウンアッセイを行うことを含む。いくつかの実施形態では、本方法が、シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、宿主がヒトである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環核酸サンプルである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである。

【0024】

別の態様では、本開示は、配列決定アダプター配列に連結した少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコレクションであって、（ａ）少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドの各々はヌクレオチドのドメインを含み；（ｂ）ヌクレオチドのドメインは１０〜２０ヌクレオチドの長さを有し；（ｃ）１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインは異なるヌクレオチド配列を有し；（ｄ）１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインは１つまたは複数のゲノムに存在しないように特異的に選択される少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコレクションを提供する。

【0025】

いくつかの実施形態では、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが２００ヌクレオチド長以下である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のゲノムが１つまたは複数の哺乳動物ゲノムである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の哺乳動物ゲノムがヒトゲノム、イヌゲノム、ネコゲノム、げっ歯動物ゲノム、ブタゲノム、ウシゲノム、ヒツジゲノム、ヤギゲノム、ウサギゲノム、ウマゲノムおよびこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の哺乳動物ゲノムがヒトゲノムである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のゲノムが１つのゲノムである。いくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが人工的に断片化された核酸を含まない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが核酸標識、化学標識または光学標識で標識される。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが少なくとも５０００個のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが少なくとも１００００個のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが少なくとも１０００００個のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが少なくとも１００００００個のオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物ゲノムに存在する異なる配列を含む１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含む。

【0026】

さらに別の態様では、本開示は、オリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法であって、（ａ）少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドは異なる配列を有する１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含むステップと；（ｂ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップと；（ｃ）少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを宿主からの核酸と混合するステップと；（ｄ）宿主からの核酸とハイブリダイズしない少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドの少なくともサブセットを単離することを含むオリゴヌクレオチドのコレクションを作製するステップとを含む方法を提供する。

【0027】

いくつかの実施形態では、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが最大２００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドのドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドのドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが一本鎖である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、宿主からの核酸が核酸標識または化学標識で標識される。いくつかの実施形態では、化学標識がビオチンである。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の単離が電気泳動を行うことを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｄ）の単離がプルダウンアッセイを行うことを含む。いくつかの実施形態では、本方法が、熱を用いて宿主からの核酸の少なくとも一部を変性させるステップをさらに含む。

【0028】

さらに別の態様では、本開示は、オリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法であって、（ａ）ゲノム、エクソームおよびトランスクリプトームからなる群から選択されるバックグラウンド集団中に存在する１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを決定するステップと；（ｂ）バックグラウンド集団中に存在しない異なる配列を有する１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含む少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコレクションを作製するステップとを含む方法を提供する。

【0029】

いくつかの実施形態では、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが最大２００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドのドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドのドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、宿主がヒトである。いくつかの実施形態では、バックグラウンド集団がゲノムである。いくつかの実施形態では、バックグラウンド集団がエクソームである。いくつかの実施形態では、バックグラウンド集団がトランスクリプトームである。いくつかの実施形態では、決定が計算的に行われる。

【0030】

別の態様では、本開示は、宿主中の病原体を同定する方法であって、宿主からのサンプルを用意するステップと；宿主由来核酸に対して非宿主由来核酸についてサンプルを濃縮するステップであって、濃縮はサンプルから約３００塩基長を超える長さの核酸を優先的に除去することを含むステップと；非宿主由来核酸を分析するステップと；非宿主核酸から宿主中の病原体を同定するステップとを含む方法を提供する。

【0031】

本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、濃縮するステップが、約１２０、約１５０、約２００または約２５０塩基長を超える核酸をサンプルから優先的に除去することを含む。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、濃縮するステップが、サンプルからの約１０塩基長〜約６０塩基長、約１０塩基長〜約１２０塩基長、約１０塩基長〜約１５０塩基長、約１０塩基長〜約３００塩基長、約３０塩基長〜約６０塩基長、約３０塩基長〜約１２０塩基長、約３０塩基長〜約１５０塩基長、約３０塩基長〜約２００塩基長、約３０塩基長〜約３００塩基長である核酸を優先的に濃縮することを含む。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、濃縮するステップが、宿主由来核酸を優先的に消化することを含む。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、濃縮するステップが、非宿主由来核酸を優先的に複製することを含む。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、非宿主核酸が、宿主由来核酸中に存在しないヌクレオチドの１つまたは複数のドメインに相補的な１つまたは複数のプライミングオリゴヌクレオチドまたは捕捉オリゴヌクレオチドを使用して優先的に複製される。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、ヌクレオチドのドメインが１０〜２０ヌクレオチド長である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、ヌクレオチドのドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、ヌクレオチドのドメインが１３ｍｅｒまたは１４ｍｅｒである。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、宿主が真核生物宿主である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、宿主が脊椎動物宿主である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、宿主が哺乳動物宿主である。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、非宿主ＤＮＡが病原性生物からのＤＮＡを含む。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、サンプルが血液または血漿サンプルを含む。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、サンプルが無細胞サンプルである。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、濃縮するステップが、宿主由来核酸に対する非宿主由来核酸の比を、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍または少なくとも１００００倍増加させる。

【0032】

別の態様では、本開示は、単一オリゴヌクレオチド中に１０個のオリゴヌクレオチド配列を含むウルトラマー（ｕｌｔｒａｍｅｒ）オリゴヌクレオチドであって、（ａ）１０個のオリゴヌクレオチド配列の各々はウラシル残基またはアプリン／アピリミジン部位によって分離されており；（ｂ）１０個のオリゴヌクレオチド配列の各々はヌクレオチドのドメインを含み；（ｃ）ヌクレオチドのドメインは１０〜２０ヌクレオチドの長さを有し；（ｄ）１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインは異なるヌクレオチド配列を有するウルトラマーオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列が２００、１５０、１００、５０、４０、３０または２０ヌクレオチド長以下である。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列が同じ長さである。いくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１つまたは複数のゲノム中に存在しない。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のゲノムが１つまたは複数の哺乳動物ゲノムである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の哺乳動物ゲノムがヒトゲノム、イヌゲノム、ネコゲノム、げっ歯動物ゲノム、ブタゲノム、ウシゲノム、ヒツジゲノム、ヤギゲノム、ウサギゲノム、ウマゲノムおよびこれらの任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の哺乳動物ゲノムがヒトゲノムである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のゲノムが１つのゲノムである。いくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが混合塩基を含む。いくつかの実施形態では、１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上または１３個以上の混合塩基を含む。いくつかの実施形態では、混合塩基がＮ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）、Ｄ（Ａ、Ｇ、Ｔ）、Ｖ（Ａ、Ｃ、Ｇ）、Ｂ（Ｃ、Ｇ、Ｔ）、Ｈ（Ａ、Ｃ、Ｔ）、Ｗ（Ａ、Ｔ）、Ｓ（Ｃ、Ｇ）、Ｋ（Ｇ、Ｔ）、Ｍ（Ａ、Ｃ）、Ｙ（Ｃ、Ｔ）、Ｒ（Ａ、Ｇ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列が同じ縮重度を有する。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列が２、３、４、６、８、９、１２、１６、１８、２４、２７、３２、３６、４８、５４、６４、７２、８１、９６、１０８、１２８、１４４、１６２、１９２、２１６、２４３または２５６の縮重度を有する。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列が２および３から選択される素因数の縮重度を有する。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列がＤＮＡである。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列がＲＮＡである。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列が合成されている。いくつかの実施形態では、ウルトラマーオリゴヌクレオチドが約または少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００個のオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ウルトラマーオリゴヌクレオチドが最大約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００または５００個のオリゴヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、１０個のオリゴヌクレオチド配列が、１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物ゲノムに存在する異なる配列を有する１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含む。

【0033】

別の態様では、本開示は、オリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法であって、（ａ）本明細書に開示されるウルトラマーオリゴヌクレオチドを用意するステップと；（ｂ）ウルトラマーオリゴヌクレオチドを加水分解し、それによって、オリゴヌクレオチドのコレクションを作製するステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）がウルトラマー中のアプリン／アピリミジン部位を加水分解することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）がエンドヌクレアーゼＩＶまたはエンドヌクレアーゼＶＩＩを用いて行われる。いくつかの実施形態では、本方法が、ウルトラマーオリゴヌクレオチド中のウラシル残基を加水分解して、アプリン／アピリミジン部位を形成するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ウラシル残基を加水分解するステップがウラシルＤＮＡグリコシラーゼを使用して行われる。いくつかの実施形態では、本方法が、オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドをビオチン化するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、ビオチン化が酵素的に（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して）または化学的に行われる。いくつかの実施形態では、本方法が、オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドにプローブを付着させるステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、プローブがジゴキシゲニンまたは蛍光プローブである。

【0034】

参照による組み込み
本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別的に示されているのと同程度に全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0035】

本発明の新規な特徴を添付の特許請求の範囲に具体的に示す。本発明の特徴および利点
のより良い理解は、本発明の原理が利用される例示的な実施形態を示す以下の詳細な説明
および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
１形態において本発明は以下を提供する。
[項目１]
宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列をプライミングまたは捕捉する方法であって、
（ａ）前記宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、前記宿主からの前記核酸サンプルは宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；
（ｂ）前記宿主からの前記核酸サンプルをオリゴヌクレオチドのコレクションと混合し、それによって、混合物を得るステップであって、前記オリゴヌクレオチドのコレクションは異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含み、前記異なるヌクレオチド配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列を含有するよう特異的に選択されるステップと；
（ｃ）前記混合物中で、前記オリゴヌクレオチドのコレクションを前記核酸サンプルと接触させるステップであって、前記接触によって前記混合物中の非宿主核酸を少なくとも１０ヌクレオチド長の前記非宿主核酸配列に結合させ、それによって、非宿主核酸をプライミングまたは捕捉し、前記接触によって前記宿主核酸の最大１０％を少なくとも１０ヌクレオチド長の前記非宿主核酸配列に結合させるステップと
を含む方法。
[項目２]
反応において前記プライミングまたは捕捉された非宿主核酸を優先的に増幅するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
[項目３]
シーケンシングアッセイを行うことによって前記プライミングまたは捕捉された非宿主核酸を配列決定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
[項目４]
前記シーケンシングアッセイが次世代シーケンシングアッセイ、ハイスループットシーケンシングアッセイ、大量並列シーケンシングアッセイ、ナノポアシーケンシングアッセイまたはサンガーシーケンシングアッセイである、項目３に記載の方法。
[項目５]
前記プライミングまたは捕捉された非宿主核酸を優先的に単離するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
[項目６]
前記優先的に単離するステップが、プルダウンアッセイを行うことを含む、項目５に記載の方法。
[項目７]
前記プライミングまたは捕捉された非宿主核酸に対してプライマー伸長反応を行うステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
[項目８]
異なるヌクレオチド配列を有する前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが核酸標識を含有する、項目７に記載の方法。
[項目９]
前記プライミングまたは捕捉された非宿主核酸がＲＮＡ非宿主核酸である、項目１に記載の方法。
[項目１０]
前記プライミングまたは捕捉されたＲＮＡ非宿主核酸に対して重合反応を行うステップをさらに含む、項目９に記載の方法。
[項目１１]
前記重合反応が逆転写酵素によって行われる、項目１０に記載の方法。
[項目１２]
宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を配列決定する方法であって、
（ａ）前記宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、前記宿主からの前記核酸サンプルは宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；
（ｂ）前記宿主からの核酸サンプルをオリゴヌクレオチドのコレクションと混合し、それによって、混合物を得るステップであって、前記オリゴヌクレオチドのコレクションは異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含み、前記異なるヌクレオチド配列は、少なくとも１０ヌクレオチド長の非宿主核酸配列を含有するよう特異的に選択されるステップと；
（ｃ）前記混合物中で、前記オリゴヌクレオチドのコレクションを前記核酸サンプルと接触させるステップであって、前記接触によって前記混合物中の非宿主核酸を少なくとも１０ヌクレオチド長の前記非宿主核酸配列に結合させ、前記接触によって前記宿主核酸の最大１０％を少なくとも１０ヌクレオチド長の前記非宿主核酸配列に結合させるステップと；
（ｄ）シーケンシングアッセイを行うことによって、少なくとも１０ヌクレオチド長の前記非宿主核酸配列に結合した前記非宿主核酸を配列決定するステップと
を含む方法。
[項目１３]
反応において前記非宿主核酸を優先的に増幅するステップをさらに含む、項目１２に記載の方法。
[項目１４]
前記シーケンシングアッセイが次世代シーケンシングアッセイ、ハイスループットシーケンシングアッセイ、大量並列シーケンシングアッセイ、ナノポアシーケンシングアッセイまたはサンガーシーケンシングアッセイである、項目１２に記載の方法。
[項目１５]
前記非宿主核酸を優先的に単離するステップをさらに含む、項目１２に記載の方法。
[項目１６]
前記単離するステップが、プルダウンアッセイを行うことを含む、項目１５に記載の方法。
[項目１７]
前記非宿主核酸に対してプライマー伸長反応を行うステップをさらに含む、項目１２に記載の方法。
[項目１８]
異なるヌクレオチド配列を有する前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが核酸標識を含有する、項目１７に記載の方法。
[項目１９]
前記非宿主核酸がＲＮＡ非宿主核酸である、項目１２に記載の方法。
[項目２０]
前記ＲＮＡ非宿主核酸に対して重合反応を行うステップをさらに含む、項目１９に記載の方法。
[項目２１]
前記重合反応が逆転写酵素によって行われる、項目２０に記載の方法。
[項目２２]
異なるヌクレオチド配列を有する前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１００００個のオリゴヌクレオチドである、項目１または１２に記載の方法。
[項目２３]
異なるヌクレオチド配列を有する前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００００個のオリゴヌクレオチドである、項目１または１２に記載の方法。
[項目２４]
異なるヌクレオチド配列を有する前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１００００００個のオリゴヌクレオチドである、項目１または１２に記載の方法。
[項目２５]
異なるヌクレオチド配列を有する前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、固体支持体にコンジュゲートされない、項目１または１２に記載の方法。
[項目２６]
異なるヌクレオチド配列を有する前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、最大２００ヌクレオチドの長さを有する、項目１または１２に記載の方法。
[項目２７]
異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドの各々が、１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含み、１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドの各ドメインが異なるヌクレオチド配列を含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目２８]
１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドの各ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である、項目２７に記載の方法。
[項目２９]
１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドの各ドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である、項目２７に記載の方法。
[項目３０]
１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドの各ドメインが哺乳動物核酸配列でない、項目２７に記載の方法。
[項目３１]
前記宿主が哺乳動物宿主であり、前記哺乳動物宿主からの前記核酸サンプルが哺乳動物宿主核酸および非哺乳動物核酸を含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目３２]
前記宿主がヒト宿主であり、前記ヒト宿主からの前記核酸サンプルがヒト宿主核酸および非ヒト核酸を含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目３３]
前記非ヒト核酸が微生物核酸を含む、項目３２に記載の方法。
[項目３４]
前記非ヒト核酸が細菌核酸を含む、項目３２に記載の方法。
[項目３５]
前記宿主からの前記核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、前記少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目３６]
前記宿主からの前記核酸サンプルが血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿および便からなる群から選択される、項目１または１２に記載の方法。
[項目３７]
前記サンプルが血液、血漿および血清からなる群から選択される、項目３６に記載の方法。
[項目３８]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環核酸サンプルである、項目１または１２に記載の方法。
[項目３９]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである、項目１または１２に記載の方法。
[項目４０]
前記宿主からの前記核酸サンプルが核酸配列決定可能なライブラリーを含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目４１]
前記宿主からの前記核酸サンプルが一本鎖ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目４２]
前記核酸がＤＮＡである、項目１または項目１２に記載の方法。
[項目４３]
前記核酸がＲＮＡである、項目１または項目１２に記載の方法。
[項目４４]
前記宿主からの前記核酸サンプルが人工的に断片化された核酸を含まない、項目１または１２に記載の方法。
[項目４５]
前記オリゴヌクレオチドのコレクションがＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡまたはこれらの任意の組み合わせを含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目４６]
前記オリゴヌクレオチドのコレクションがＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目４７]
前記オリゴヌクレオチドのコレクションがＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、項目１または１２に記載の方法。
[項目４８]
前記オリゴヌクレオチドのコレクションが核酸標識または化学標識で標識される、項目１または１２に記載の方法。
[項目４９]
前記化学標識がビオチンである、項目４８に記載の方法。
[項目５０]
前記オリゴヌクレオチドのコレクションが人工的に断片化された核酸を含まない、項目１または１２に記載の方法。
[項目５１]
前記非宿主核酸が病原体核酸、微生物核酸、細菌核酸、ウイルス核酸、真菌核酸、寄生生物核酸およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１または１２に記載の方法。
[項目５２]
前記非宿主核酸が微生物核酸である、項目１または１２に記載の方法。
[項目５３]
前記非宿主核酸が細菌核酸である、項目１または１２に記載の方法。
[項目５４]
前記非宿主核酸がウイルス核酸である、項目１または１２に記載の方法。
[項目５５]
宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮する方法であって、
（ａ）前記宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、前記宿主からの前記核酸サンプルは前記宿主からの一本鎖核酸サンプルであり、宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；
（ｂ）前記宿主からの前記一本鎖核酸の少なくとも一部を再生し、それによって、前記サンプル中に二本鎖核酸の集団を生成するステップと；
（ｃ）ヌクレアーゼを用いて前記サンプル中の前記二本鎖核酸の少なくとも一部を除去し、それによって、前記宿主からの前記核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮するステップと
を含む方法。
[項目５６]
シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む、項目５５に記載の方法。
[項目５７]
前記宿主からの前記核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、前記少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む、項目５５に記載の方法。
[項目５８]
前記宿主がヒトである、項目５５に記載の方法。
[項目５９]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環核酸サンプルである、項目５５に記載の方法。
[項目６０]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである、項目５５に記載の方法。
[項目６１]
前記宿主からの前記核酸サンプルが血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿および便からなる群から選択される、項目５５に記載の方法。
[項目６２]
前記核酸がＤＮＡである、項目５５に記載の方法。
[項目６３]
前記核酸がＲＮＡである、項目５５に記載の方法。
[項目６４]
一本鎖宿主配列を前記宿主からの前記一本鎖核酸サンプルに添加するステップをさらに含む、項目５５に記載の方法。
[項目６５]
熱を用いて前記核酸サンプル中の前記核酸の少なくとも一部を変性させて、前記一本鎖核酸サンプルを作製するステップをさらに含む、項目５５に記載の方法。
[項目６６]
前記核酸の少なくとも一部の再生が、設定された時間枠内で起こる、項目５５に記載の方法。
[項目６７]
前記核酸の少なくとも一部の再生が、９６時間以内で起こる、項目５５に記載の方法。
[項目６８]
前記再生がトリメチルアンモニウムクロリドの存在下での再生を含む、項目５５に記載の方法。
[項目６９]
前記ヌクレアーゼが二本鎖特異性ヌクレアーゼ、ＢＡＬ−３１、二本鎖特異的ＤＮアーゼまたはこれらの組み合わせである、項目５５に記載の方法。
[項目７０]
前記ヌクレアーゼが二本鎖特異的ヌクレアーゼである、項目５５に記載の方法。
[項目７１]
前記ヌクレアーゼがＢＡＬ−３１である、項目５５に記載の方法。
[項目７２]
前記ヌクレアーゼが二本鎖核酸に対して活性である、項目５５に記載の方法。
[項目７３]
前記ヌクレアーゼが一本鎖核酸に対して活性でない、項目５５に記載の方法。
[項目７４]
前記核酸が人工的に断片化されていない、項目５５に記載の方法。
[項目７５]
宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮する方法であって、
（ａ）前記宿主からの前記核酸サンプルを用意するステップであって、前記宿主からの前記核酸サンプルはヌクレオソームと会合した宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；
（ｂ）ヌクレオソームと会合した前記宿主核酸の少なくとも一部を除去し、それによって、前記宿主からの前記核酸サンプル中の前記非宿主核酸を濃縮するステップと
を含む方法。
[項目７６]
シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む、項目７５に記載の方法。
[項目７７]
前記宿主からの前記核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、前記少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む、項目７５に記載の方法。
[項目７８]
前記宿主がヒトである、項目７５に記載の方法。
[項目７９]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環核酸サンプルである、項目７５に記載の方法。
[項目８０]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである、項目７５に記載の方法。
[項目８１]
前記宿主からの前記核酸サンプルが血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿および便からなる群から選択される、項目７５に記載の方法。
[項目８２]
ステップ（ｂ）における前記除去が電気泳動を行うことを含む、項目７５に記載の方法。
[項目８３]
ステップ（ｂ）における前記除去が等速電気泳動を行うことを含む、項目７５に記載の方法。
[項目８４]
ステップ（ｂ）における前記除去が多孔質フィルタを使用することを含む、項目７５に記載の方法。
[項目８５]
ステップ（ｂ）における前記除去がイオン交換カラムを使用することを含む、項目７５に記載の方法。
[項目８６]
ステップ（ｂ）における前記除去が１つまたは複数のヒストンに特異的な１つまたは複数の抗体を使用することを含む、項目７５に記載の方法。
[項目８７]
前記１つまたは複数のヒストンが、ヒストンＨ２Ａ Ｎ末端、ヒストンＨ２Ａ溶媒露出エピトープ、ヒストンＨ３中のＬｙｓ９上のモノメチル化、ヒストンＨ３中のＬｙｓ９上のジメチル化、ヒストンＨ３中のＬｙｓ５６上のトリメチル化、ヒストンＨ２Ｂ中のＳｅｒ１４上のリン酸化およびヒストンＨ２Ａ．Ｘ中のＳｅｒ１３９上のリン酸化からなる群から選択される、項目８６に記載の方法。
[項目８８]
前記１つまたは複数の抗体がカラム上に固定化される、項目８６に記載の方法。
[項目８９]
前記１つまたは複数の抗体を除去するステップをさらに含む、項目８６に記載の方法。
[項目９０]
宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮する方法であって、
（ａ）前記宿主からの前記核酸サンプルを用意するステップであって、前記宿主からの前記核酸サンプルは宿主核酸および非宿主核酸を含むステップと；
（ｂ）１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを除去または単離し、それによって、前記宿主からの前記核酸サンプル中の前記非宿主核酸を濃縮するステップと
を含む方法。
[項目９１]
ステップ（ｂ）が１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを除去することを含む、項目９０に記載の方法。
[項目９２]
ステップ（ｂ）が１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを単離することを含む、項目９０に記載の方法。
[項目９３]
前記１つまたは複数の長さ間隔が約１８０塩基対、約３６０塩基対、約５４０塩基対、約７２０塩基対および約９００塩基対からなる群から選択される、項目９０に記載の方法。
[項目９４]
前記１つまたは複数の長さ間隔が１５０塩基対またはその倍数、１６０塩基対またはその倍数、１７０塩基対またはその倍数、１９０塩基対またはその倍数、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目９０に記載の方法。
[項目９５]
ステップ（ｂ）が約３００塩基長を超えるＤＮＡを除去することを含む、項目９０に記載の方法。
[項目９６]
ステップ（ｂ）が最大約３００塩基長であるＤＮＡを単離することを含む、項目９０に記載の方法。
[項目９７]
シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む、項目９０に記載の方法。
[項目９８]
前記宿主からの前記核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含む、前記少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含み、項目９０に記載の方法。
[項目９９]
前記宿主がヒトである、項目９０に記載の方法。
[項目１００]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環核酸サンプルである、項目９０に記載の方法。
[項目１０１]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである、項目９０に記載の方法。
[項目１０２]
宿主からの核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮する方法であって、
（ａ）前記宿主からの核酸サンプルを用意するステップであって、前記宿主からの前記核酸サンプルは宿主核酸、非宿主核酸およびエキソソームを含むステップと；
（ｂ）前記エキソソームの少なくとも一部を除去または単離し、それによって、前記宿主からの前記核酸サンプル中の非宿主配列を濃縮するステップと
を含む方法。
[項目１０３]
ステップ（ｂ）が前記エキソソームの少なくとも一部を除去することを含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０４]
ステップ（ｂ）が前記エキソソームの少なくとも一部を単離することを含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０５]
シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０６]
前記宿主からの前記核酸サンプルが少なくとも５つの非宿主核酸配列を含み、前記少なくとも５つの非宿主核酸配列を検出するステップをさらに含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１０７]
前記宿主がヒトである、項目１０２に記載の方法。
[項目１０８]
前記宿主からの前記核酸サンプルが血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿および便からなる群から選択される、項目１０２に記載の方法。
[項目１０９]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環核酸サンプルである、項目１０２に記載の方法。
[項目１１０]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである、項目１０２に記載の方法。
[項目１１１]
前記エキソソーム内の前記宿主核酸を除去するステップをさらに含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１１２]
非宿主核酸を単離するステップをさらに含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１１３]
ステップ（ｂ）における前記除去または単離が白血球由来エキソソームを除去または単離することを含む、項目１０２に記載の方法。
[項目１１４]
前記白血球がマクロファージである、項目１１３に記載の方法。
[項目１１５]
ステップ（ｂ）における前記除去または単離が前記白血球由来エキソソームを除去または単離するために免疫沈降を使用することを含む、項目１１３に記載の方法。
[項目１１６]
１つまたは複数の核酸バーコードを１つまたは複数のサンプルに添加するステップをさらに含む、項目１から１１５のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１７]
１つまたは複数の病原性遺伝子座；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に特異的な配列に特異的な１つまたは複数の核酸を前記サンプルに添加するステップをさらに含む、項目１から１１５のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１８]
宿主からの核酸サンプル中の配列をプライミングまたは捕捉する方法であって、
（ａ）前記宿主からの核酸サンプルを用意するステップと；
（ｂ）前記宿主からの前記核酸サンプルを１つまたは複数の病原性遺伝子座；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に特異的な配列に特異的な、対象となる１つまたは複数の領域の核酸と混合し、それによって、混合物を得るステップと；
（ｃ）前記混合物中で、対象となる前記１つまたは複数の領域の核酸を前記核酸サンプルと接触させるステップであって、前記接触によって前記核酸サンプル中の核酸を対象となる前記１つまたは複数の領域の核酸に結合させ、それによって、前記核酸をプライミングまたは捕捉するステップと
を含む方法。
[項目１１９]
１つまたは複数の病原性遺伝子座；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に特異的な配列に特異的な１つまたは複数の核酸を使用して核酸増幅反応を行うステップをさらに含む、項目１１８に記載の方法。
[項目１２０]
前記核酸増幅反応がポリメラーゼ連鎖反応、逆転写、転写媒介増幅またはリガーゼ連鎖反応を含む、項目１１９に記載の方法。
[項目１２１]
１つまたは複数の病原性遺伝子座；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に特異的な配列に特異的な核酸を単離するステップをさらに含む、項目１１８に記載の方法。
[項目１２２]
前記単離するステップが、プルダウンアッセイを行うことを含む、項目１２１に記載の方法。
[項目１２３]
シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む、項目１１８に記載の方法。
[項目１２４]
前記宿主がヒトである、項目１１８に記載の方法。
[項目１２５]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環核酸サンプルである、項目１１８に記載の方法。
[項目１２６]
前記宿主からの前記核酸サンプルが循環無細胞核酸サンプルである、項目１１８に記載の方法。
[項目１２７]
配列決定アダプター配列に連結した少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコレクションであって、
（ａ）前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドの各々はヌクレオチドのドメインを含み；
（ｂ）前記ヌクレオチドのドメインは１０〜２０ヌクレオチドの長さを有し；
（ｃ）１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインは異なるヌクレオチド配列を有し；
（ｄ）１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインは１つまたは複数のゲノムに存在しない
ように特異的に選択される、少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１２８]
前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが２００ヌクレオチド長以下である、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１２９]
前記１つまたは複数のゲノムが１つまたは複数の哺乳動物ゲノムである、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３０]
前記１つまたは複数の哺乳動物ゲノムがヒトゲノム、イヌゲノム、ネコゲノム、げっ歯動物ゲノム、ブタゲノム、ウシゲノム、ヒツジゲノム、ヤギゲノム、ウサギゲノム、ウマゲノムおよびこれらの任意の組み合わせから選択される、項目１２９に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３１]
前記１つまたは複数の哺乳動物ゲノムがヒトゲノムである、項目１３０に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３２]
前記１つまたは複数のゲノムが１つのゲノムである、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３３]
１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３４]
１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である、項目１３３に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３５]
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡオリゴヌクレオチドである、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３６]
前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡオリゴヌクレオチドである、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３７]
前記オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３８]
前記オリゴヌクレオチドが、人工的に断片化された核酸を含まない、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１３９]
前記オリゴヌクレオチドが核酸標識、化学標識または光学標識で標識される、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１４０]
前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが少なくとも５０００個のオリゴヌクレオチドである、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１４１]
前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが少なくとも１００００個のオリゴヌクレオチドである、項目１４０に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１４２]
前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが少なくとも１０００００個のオリゴヌクレオチドである、項目１４０に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１４３]
前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが少なくとも１００００００個のオリゴヌクレオチドである、項目１４０に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１４４]
前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物ゲノムに存在する異なる配列を含む１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含む、項目１２７に記載のオリゴヌクレオチドのコレクション。
[項目１４５]
オリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法であって、
（ａ）少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを用意するステップであって、前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドは異なる配列を有する１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含むステップと；
（ｂ）宿主からの核酸サンプルを用意するステップと；
（ｃ）前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを前記宿主からの前記核酸と混合するステップと；
（ｄ）前記宿主からの前記核酸とハイブリダイズしない前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドの少なくともサブセットを単離することを含むオリゴヌクレオチドのコレクションを作製するステップと
を含む方法。
[項目１４６]
前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが最大２００ヌクレオチドの長さを有する、項目１４５に記載の方法。
[項目１４７]
ヌクレオチドの前記ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である、項目１４５に記載の方法。
[項目１４８]
ヌクレオチドの前記ドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である、項目１４７に記載の方法。
[項目１４９]
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡである、項目１４５に記載の方法。
[項目１５０]
前記オリゴヌクレオチドが一本鎖である、項目１４５に記載の方法。
[項目１５１]
前記オリゴヌクレオチドが合成オリゴヌクレオチドである、項目１４５に記載の方法。
[項目１５２]
前記宿主からの前記核酸が核酸標識または化学標識で標識される、項目１４５に記載の方法。
[項目１５３]
前記化学標識がビオチンである、項目１５２に記載の方法。
[項目１５４]
ステップ（ｄ）における単離が電気泳動を行うことを含む、項目１４５に記載の方法。
[項目１５５]
ステップ（ｄ）における単離がプルダウンアッセイを行うことを含む、項目１４５に記載の方法。
[項目１５６]
熱を用いて前記宿主からの前記核酸の少なくとも一部を変性させるステップをさらに含む、項目１４５に記載の方法。
[項目１５７]
オリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法であって、
（ａ）ゲノム、エクソームおよびトランスクリプトームからなる群から選択されるバックグラウンド集団中に存在する１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを決定するステップと；
（ｂ）前記バックグラウンド集団中に存在しない異なる配列を有する１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含む少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチドのコレクションを作製するステップと
を含む方法。
[項目１５８]
前記少なくとも１０００個のオリゴヌクレオチドが最大２００ヌクレオチドの長さを有する、項目１５７に記載の方法。
[項目１５９]
ヌクレオチドの前記ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である、項目１５７に記載の方法。
[項目１６０]
ヌクレオチドの前記ドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である、項目１５７に記載の方法。
[項目１６１]
前記宿主がヒトである、項目１５７に記載の方法。
[項目１６２]
前記バックグラウンド集団がゲノムである、項目１５７に記載の方法。
[項目１６３]
前記バックグラウンド集団がエクソームである、項目１５７に記載の方法。
[項目１６４]
前記バックグラウンド集団がトランスクリプトームである、項目１５７に記載の方法。
[項目１６５]
前記決定が計算的に行われる、項目１５７に記載の方法。
[項目１６６]
宿主中の病原体を同定する方法であって、
前記宿主からのサンプルを用意するステップと；
前記サンプルを非宿主由来核酸について宿主由来核酸に対して濃縮するステップであって、前記濃縮は前記サンプルから約３００塩基長を超える長さの核酸を優先的に除去することを含むステップと；
前記非宿主由来核酸を分析するステップと；
前記非宿主核酸から前記宿主中の病原体を同定するステップと
を含む方法。
[項目１６７]
前記濃縮するステップが、約２００塩基長を超える核酸を前記サンプルから優先的に除去することを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１６８]
前記濃縮するステップが、約１５０塩基長を超える核酸を前記サンプルから優先的に除去することを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１６９]
前記濃縮するステップが、約１２０塩基長を超える核酸を前記サンプルから優先的に除去することを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１７０]
前記濃縮するステップが、前記サンプルからの約１０塩基長〜約１２０塩基長の核酸を優先的に濃縮することを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１７１]
前記濃縮するステップが、前記サンプルからの約３０塩基長〜約１２０塩基長の核酸を優先的に濃縮することを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１７２]
前記濃縮するステップが、前記サンプルからの約１０塩基長〜約３００塩基長の核酸の相対的増加をもたらす、項目１６６に記載の方法。
[項目１７３]
前記濃縮するステップが、宿主由来核酸を優先的に消化することを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１７４]
前記濃縮するステップが、前記非宿主由来核酸を優先的に複製することを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１７５]
前記非宿主由来核酸が、前記宿主由来核酸中に存在しないヌクレオチドの１つまたは複数のドメインに相補的な１つまたは複数のプライミングオリゴヌクレオチドを使用して優先的に複製される、項目１７４に記載の方法。
[項目１７６]
ヌクレオチドの前記ドメインが１０〜２０ヌクレオチド長である、項目１７５に記載の方法。
[項目１７７]
ヌクレオチドの前記ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である、項目１７５に記載の方法。
[項目１７８]
ヌクレオチドの前記ドメインが１３ｍｅｒまたは１４ｍｅｒである、項目１７５に記載の方法。
[項目１７９]
前記宿主が真核生物宿主である、項目１６６に記載の方法。
[項目１８０]
前記宿主が脊椎動物宿主である、項目１６６に記載の方法。
[項目１８１]
前記宿主が哺乳動物宿主である、項目１６６に記載の方法。
[項目１８２]
前記非宿主由来核酸が病原性生物からのＤＮＡを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１８３]
前記サンプルが血液または血漿サンプルを含む、項目１６６に記載の方法。
[項目１８４]
前記サンプルが無細胞サンプルである、項目１６６に記載の方法。
[項目１８５]
単一オリゴヌクレオチド中に１０個のオリゴヌクレオチド配列を含むウルトラマーオリゴヌクレオチドであって、
（ａ）前記１０個のオリゴヌクレオチド配列の各々はウラシル残基またはアプリン／アピリミジン部位によって分離されており；
（ｂ）前記１０個のオリゴヌクレオチド配列の各々はヌクレオチドのドメインを含み；
（ｃ）前記ヌクレオチドのドメインは１０〜２０ヌクレオチドの長さを有し；
（ｄ）１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインは異なるヌクレオチド配列を有する
ウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１８６]
前記１０個のオリゴヌクレオチド配列が２００ヌクレオチド長以下である、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１８７]
前記１０個のオリゴヌクレオチド配列が同じ長さである、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１８８]
１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１つまたは複数のゲノム中に存在しない、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１８９]
前記１つまたは複数のゲノムが１つまたは複数の哺乳動物ゲノムである、項目１８８に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９０]
前記１つまたは複数の哺乳動物ゲノムがヒトゲノム、イヌゲノム、ネコゲノム、げっ歯動物ゲノム、ブタゲノム、ウシゲノム、ヒツジゲノム、ヤギゲノム、ウサギゲノム、ウマゲノムおよびこれらの任意の組み合わせから選択される、項目１８８に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９１]
前記１つまたは複数の哺乳動物ゲノムがヒトゲノムである、項目１８８に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９２]
前記１つまたは複数のゲノムが１つのゲノムである、項目１８８に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９３]
１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１２〜１５ヌクレオチド長である、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９４]
１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１３〜１５ヌクレオチド長である、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９５]
１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが混合塩基を含む、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９６]
前記混合塩基がＮ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）、Ｄ（Ａ、Ｇ、Ｔ）、Ｖ（Ａ、Ｃ、Ｇ）、Ｂ（Ｃ、Ｇ、Ｔ）、Ｈ（Ａ、Ｃ、Ｔ）、Ｗ（Ａ、Ｔ）、Ｓ（Ｃ、Ｇ）、Ｋ（Ｇ、Ｔ）、Ｍ（Ａ、Ｃ）、Ｙ（Ｃ、Ｔ）、Ｒ（Ａ、Ｇ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、項目１９５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９７]
１０〜２０ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドの各ドメインが１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上または１３個以上の混合塩基を含む、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９８]
前記１０個のオリゴヌクレオチド配列が同じ縮重度を有する、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目１９９]
前記１０個のオリゴヌクレオチド配列が２、３、４、６、８、９、１２、１６、１８、２４、２７、３２、３６、４８、５４、６４、７２、８１、９６、１０８、１２８、１４４、１６２、１９２、２１６、２４３または２５６の縮重度を有する、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目２００]
前記１０個のオリゴヌクレオチド配列がＤＮＡである、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目２０１]
前記１０個のオリゴヌクレオチド配列がＲＮＡである、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目２０２]
前記１０個のオリゴヌクレオチド配列が合成される、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目２０３]
５０個のオリゴヌクレオチド配列を含む、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目２０４]
１００個のオリゴヌクレオチド配列を含む、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目２０５]
５００個のオリゴヌクレオチド配列を含む、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目２０６]
前記１０個のオリゴヌクレオチド配列が、１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物ゲノムに存在する異なる配列を含む１０〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインを含む、項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチド。
[項目２０７]
オリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法であって、
（ａ）項目１８５に記載のウルトラマーオリゴヌクレオチドを用意するステップと；
（ｂ）前記ウルトラマーオリゴヌクレオチドを加水分解し、それによって、オリゴヌクレオチドのコレクションを作製するステップと
を含む方法。
[項目２０８]
ステップ（ｂ）が前記ウルトラマーオリゴヌクレオチド中のアプリン／アピリミジン部位を加水分解することを含む、項目２０７に記載の方法。
[項目２０９]
ステップ（ｂ）がエンドヌクレアーゼＩＶまたはエンドヌクレアーゼＶＩＩを用いて行われる、項目２０８に記載の方法。
[項目２１０]
前記ウルトラマーオリゴヌクレオチド中のウラシル残基を加水分解して、アプリン／アピリミジン部位を形成するステップをさらに含む、項目２０７に記載の方法。
[項目２１１]
前記ウラシル残基を加水分解するステップがウラシルＤＮＡグリコシラーゼを使用して行われる、項目２１０に記載の方法。
[項目２１２]
前記オリゴヌクレオチドのコレクション中の前記オリゴヌクレオチドをビオチン化するステップをさらに含む、項目２０７に記載の方法。
[項目２１３]
前記ビオチン化するステップが酵素的または化学的に行われる、項目２１２に記載の方法。
[項目２１４]
前記オリゴヌクレオチドのコレクション中の前記オリゴヌクレオチドにプローブを付着させるステップをさらに含む、項目２０７に記載の方法。
[項目２１５]
前記プローブがジゴキシゲニンまたは蛍光プローブである、項目２１４に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0036】

【図1】核酸の集団を濃縮するためにオリゴヌクレオチドのコレクションを使用するプライミング戦略を示す図である。

【図2】核酸の集団を濃縮するためにオリゴヌクレオチドのコレクションを使用するプルダウン戦略を示す図である。

【図3】ハイブリダイゼーションに基づく方法を使用してオリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法を示す図である。

【図4】ヌクレオチドのドメインの長さおよび配列包括度を示す図である。１３ヌクレオチドの長さを有するヌクレオチドのドメインの約９６．５％がヒトである。

【図5】オリゴヌクレオチドのコレクションを使用して推定した対象となる集団の配列包括度を示す図である。大腸菌ゲノムの包括度をオリゴヌクレオチドのコレクションを使用して示しており、オリゴヌクレオチドはヒト以外の１３ヌクレオチドの長さのヌクレオチドのドメインを含む。

【図6】ヒト無細胞ＤＮＡ長の周期性を示す図である。

【図7】ヌクレオソーム特異的抗体によるヌクレオソーム枯渇を示す図である。

【図8A】宿主と非宿主無細胞ＤＮＡの両方についての無細胞ＤＮＡ量対ＤＮＡ断片長のプロットを示す図である。

【図8B】短い断片の無細胞ＤＮＡの選択濃縮プロセスの結果を示す図である。

【図9A】代表的なウルトラマーオリゴヌクレオチド設計を示す図である。

【図9B】Ｎ混合塩基を有するオリゴヌクレオチド配列を含有するウルトラマーオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図9C】２個のＮ混合塩基を有するオリゴヌクレオチド配列を含有するウルトラマーオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図9D】２個の混合塩基を有するオリゴヌクレオチド配列を含有するウルトラマーオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図10A】ウルトラマーオリゴヌクレオチドからオリゴヌクレオチドのコレクションを作製するための反応スキームを示す図である。

【図10B】ウルトラマーオリゴヌクレオチドの消化後の消化反応産物の例を示す図である。

【図11A】混合塩基部位を有する代表的なオリゴヌクレオチドを示す図である。

【図11B】縮重度に応じてグループ分けされた非ヒト１３ｍｅｒプローブプールの分析を示す図である。

【図12A】オリゴヌクレオチドの酵素的ビオチン化のためのプロセスの概略図である。

【図12B】オリゴヌクレオチドの化学的ビオチン化のためのプロセスの概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0037】

概要
本開示は、サンプルの圧倒的に高い割合が患者自身の核酸で構成されている患者サンプル中の病原体核酸を濃縮するための新規でかつ迅速な手法を提供する。本開示はサンプル中の複数の病原体核酸の検出を可能にするので、患者の介護者がどの病原体が患者に感染した可能性があるかについてのはっきりした考えも疑いももたない状況などの、仮説がない状況においてさえ病原体を検出することができる。一般に、本明細書で提供される組成物および方法は、宿主からの核酸と比較して病原体核酸の表現を増加させるために、核酸を含有する生物学的サンプルを濃縮するよう設計される。サンプル中の病原体核酸の濃縮は、特に分析が配列決定反応を含む場合、サンプルの分析に関連する時間およびコストを低減することができる。

【0038】

本開示は、濃縮を行ういくつかの方法を提供する。いくつかの例で、本開示は、サンプル中の非宿主核酸のセットに優先的に結合するオリゴヌクレオチドの新規なコレクションを作製する方法を提供する。オリゴヌクレオチドのコレクションを複数の異なるタイプの分子生物学アッセイで非宿主核酸を優先的に検出するために使用することができる。例えば、オリゴヌクレオチドのコレクションを、プライマー伸長反応、ＰＣＲ反応または逆転写反応におけるプライマーとして使用することができる。さらに、オリゴヌクレオチドのコレクションを、ハイブリダイゼーションアッセイおよび／またはプルダウンアッセイに使用して病原体核酸を優先的に結合および単離することができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションを、病原体核酸を濃縮するためだけでなく、このような核酸にタグを付加するためにも使用することができる。

【0039】

追加の濃縮技術も本明細書で提供する。このような技術は、単独で、またはオリゴヌクレオチドのコレクションもしくは別の濃縮方法と組み合わせて使用することができる。このような追加の濃縮技術の例としては、（ａ）核酸サンプル中の主要な集団がサンプル中の少数の集団よりも急速に自己ハイブリダイズする自己ハイブリダイゼーション（ｓｅｌｆ−ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）技術、（ｂ）遊離ＤＮＡからのヌクレオソーム会合ＤＮＡの枯渇；（ｃ）特定の長さ間隔のＤＮＡの除去および／または単離；（ｄ）エキソソームの枯渇または濃縮；ならびに（ｅ）対象となる領域の戦略的捕捉が挙げられる。

【0040】

本明細書で提供される濃縮手法は、感染した患者からの血液サンプル中に存在する循環または循環無細胞微生物核酸などの微生物核酸を検出するのに特に適している。これらの手法はまた、多数の集団が支配する混合物中の核酸の少数の集団の検出を含む任意の他の状況においても有用である。

【0041】

図１は、ヒト患者サンプル内の病原体または他の非ヒト核酸を検出するための、本明細書に開示される一般的な方法を提供する。いくつかの例で、血液サンプル（１２０）または血漿サンプル（１３０）は、病原体（例えば、微生物、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物）に感染した（または感染した疑いがある）ヒト患者（１１０）から得られる。血液サンプルは、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのコレクション（１５０）と接触させることができる循環無細胞核酸（１４０）などの核酸を含有し得る。オリゴヌクレオチドのコレクションは、病原体または非ヒト核酸配列（１７０）に優先的に結合し得る。オリゴヌクレオチドのコレクションは、核酸標識、バーコード、サンプル特異的バーコード、ユニバーサルプライマー配列、配列決定プライマー結合部位、バーコードの増幅を可能にするプライマー結合部位、シーケンサー適合性配列および／またはアダプター（例えば、配列決定アダプター）を含み得る標識（１６０）に連結され得る。いくつかの場合、核酸サンプルがＲＮＡを含む場合、オリゴヌクレオチドのコレクションが、非宿主ＲＮＡを優先的にプライミングするために、ＲＮＡ鋳型（１７０）からのｃＤＮＡ合成をプライミングするために使用され得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションをプライマー伸長反応（１７０）に使用して、サンプル中の病原体ＤＮＡ配列を優先的にプライミングすることができる。プライマー伸長反応はまた、オーバーハング配列を病原体核酸に付加することもできる。例えば、プライマー伸長反応を介して標識（１６０）内の配列（例えば、アダプター、バーコード等）を病原体核酸に付加することができる。ＰＣＲ反応を行って最終ライブラリー（１８０）を調製することができ、これをサンプル内の病原体種の検出および同定（１９５）を補助するためのシーケンシングアッセイ（１９０）に供することができる。

【0042】

図２は、ハイブリダイゼーションおよびプルダウンステップを含む本明細書で提供される別の方法におけるステップを示す。サンプルは、図１のように用意され得る（２１０、２２０、２３０）。サンプルを使用して配列決定可能なライブラリーを調製することができ、サンプル内の核酸（２４０）に標識（２５０）でタグ付けすることができる。サンプルを、その各々がビオチンタグ（２７０）などの標識とコンジュゲートすることができるオリゴヌクレオチドのコレクション（２６０）と接触させることができる。オリゴヌクレオチドは、サンプル内の非ヒト配列にハイブリダイズし（２８０、２８５）、次いで、例えば固体支持体に結合したアビジンまたはストレプトアビジンを使用したプルダウンアッセイで優先的にプルダウンすることができる（２８５）。次いで、感染宿主（例えば、ヒト）内の非宿主種（例えば、病原体）を同定するため（２９５）に、ライブラリーを配列決定することができる（２９０）。

【0043】

本明細書で提供される方法および組成物は、複雑な混合物中の対象となる少数の集団の核酸を検出する現在の方法よりも多くの利点を提供する。１つの利点は、ライブラリーサイズまたは分析される配列読み取り数を減らすことによって、配列決定コストを軽減することである。また、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのコレクションなどの標的化オリゴヌクレオチドを使用することによって、特に、バックグラウンド集団核酸（例えば、サンプルからのヒト核酸）を枯渇させることに頼っている方法などの他の方法と比較して、少数の集団をプライミング、捕捉または増幅するプロセスの速度を速めることができる。これらを使用して、サンプル中の特定の集団（例えば、病原体または微生物）を検出する感度および特異性を劇的に増加させることができる。さらに、オリゴヌクレオチドのコレクションを使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列決定ライブラリーを作製することができ；いくつかの場合、これらを使用して同じサンプルからＤＮＡ配列決定ライブラリーとＲＮＡ配列決定ライブラリーの両方を作製することができる。結果として、本明細書で提供される方法および組成物は、肺炎、結核、ＨＩＶ感染症、肝炎感染症（例えば、Ａ、ＢまたはＣ型肝炎）、敗血症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、クラミジア感染症、梅毒感染症、エボラ感染症、多剤耐性感染症、黄色ブドウ球菌感染症、腸球菌感染症およびインフルエンザを含む感染性疾患の検出の新たな、効率的な手法を提供する。別の例では、本方法および組成物を使用して、感染症に関連する症状を経験していてもいなくてもよい宿主において、例えばマイクロバイオーム中の１つまたは複数の微生物の存在を監視することができる。

【0044】

配列濃縮のためのオリゴヌクレオチドのコレクション
本開示は、核酸の複雑な混合物内の特定の核酸集団（「対象となる集団」）を濃縮、捕捉またはプライミングするのに有用なオリゴヌクレオチドのコレクションを提供する。対象となる集団は、宿主（例えば、ヒト）核酸と非宿主核酸の両方を含有する集団中の非宿主核酸（例えば、非ヒト、微生物または病原体核酸）であり得る。通常、対象となる集団は、核酸の複雑な混合物のより多数部分を構成する核酸の別の集団（「バックグラウンド」集団、例えば宿主核酸）を含み得る核酸の複雑な混合物の少数部分を構成する。いくつかの場合、本明細書で提供される方法および組成物は、対象となる集団がサンプル中の全核酸の最大１％または０．１％を構成する場合に特に有用である。

【0045】

一般的に、本明細書で提供される方法は、対象となる集団をプライミング、捕捉または濃縮するためにオリゴヌクレオチドを使用することを含む。通常、対象となる集団は、特定の属性または特徴を有し、オリゴヌクレオチドは、対象となる集団をプライミング、捕捉または濃縮し、核酸の全集団の大部分を構成すし得る別の集団（例えば、「バックグラウンド」集団）をプライミングも、捕捉も、濃縮もしないように設計される。例えば、対象となる集団は、宿主と非宿主核酸の両方を含有する集団中の非宿主（例えば、非哺乳動物、非ヒト、病原体、微生物、ウイルス、細菌、真菌または寄生生物）核酸のサブセットであり得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは、バックグラウンド集団（例えば、ヒト核酸）を除去、分離、単離または枯渇させ、それによって、対象となる集団（例えば、非ヒト核酸）を濃縮するよう設計され得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは、一定の対象となる集団の配列（例えば、非ヒト核酸配列）に（完全にまたは実質的に）一致し得るまたは（完全にまたは実質的に）相補的であり得る配列を有するヌクレオチドのドメインを含み得る。

【0046】

本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのコレクションは、対象となる集団に結合するまたは対象となる集団を認識することができる核酸配列を含み得る。オリゴヌクレオチドのコレクションを使用して、サンプル、例えばバックグラウンド集団（例えば、宿主またはヒト）および対象となる集団（例えば、非宿主または非ヒト）からの核酸を含むサンプル中の対象となる集団を特異的に標的化および検出することができる。例えば、オリゴヌクレオチドのコレクションを、宿主と非宿主核酸の両方を含むサンプル中の非宿主核酸を特異的にプライミング、捕捉、増幅、複製または検出するためのプライマーとして使用することができる。より具体的には、いくつかの場合、これらを使用して、サンプル中に存在するＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ合成をプライミングすることができる。いくつかの場合、標的配列に核酸標識または配列を付加するために、これらをプライマー伸長反応に使用することができる。いくつかの場合、これらをＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのライブラリーから非宿主配列を捕捉するためのベイトとして使用することができる。プライミング、増幅または捕捉された非宿主核酸を、シーケンシングアッセイ、特にハイスループットシーケンシングアッセイ、次世代シーケンシングプラットホーム、大量並列シーケンシングプラットホーム、ナノポアシーケンシングアッセイまたは当技術分野で公知の別のシーケンシングアッセイを行うことによるなどして、当技術分野で公知の方法によって同定することができる。

【0047】

オリゴヌクレオチドのコレクションは、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは約１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；４×１０^６；５×１０^６；６×１０^６；７×１０^６；８×１０^６；９×１０^６；１０^７；５×１０^７；１０^８；５×１０^８；または１０^９個のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは最大１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；４×１０^６；５×１０^６；６×１０^６；７×１０^６；８×１０^６；９×１０^６；１０^７；５×１０^７；１０^８；５×１０^８；または１０^９個のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは少なくとも１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；３．５×１０^６；４×１０^６；４．５×１０^６；５×１０^６；５．５×１０^６；６×１０^６；６．５×１０^６；７×１０^６；７．５×１０^６；８×１０^６；８．５×１０^６；９×１０^６；９．５×１０^６；１０^７；５×１０^７；１０^８；５×１０^８；または１０^９個のオリゴヌクレオチドを含み得る。

【0048】

オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドは同じ長さを有しても異なる長さを有してもよい。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の２つ以上のオリゴヌクレオチドが同じ長さを有する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の全てのオリゴヌクレオチドが同じ長さを有する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドが異なる長さを有する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または２０の異なる長さを有する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドが最大約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または２０の長さを有する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドが少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または２０の長さを有する。

【0049】

いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは最大１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは１０〜１０００、１０〜５００、１０〜４００、１０〜３００、１０〜２００、１０〜１００、１０〜９０、１０〜８０、１０〜７０、１０〜６０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、１０〜１５、１１〜１０００、１１〜５００、１１〜４００、１１〜３００、１１〜２００、１１〜１００、１１〜９０、１１〜８０、１１〜７０、１１〜６０、１１〜５０、１１〜４０、１１〜３０、１１〜２０、１１〜１５、１２〜１０００、１２〜５００、１２〜４００、１２〜３００、１２〜２００、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１５、１３〜１０００、１３〜５００、１３〜４００、１３〜３００、１３〜２００、１３〜１００、１３〜９０、１３〜８０、１３〜７０、１３〜６０、１３〜５０、１３〜４０、１３〜３０、１３〜２０、１３〜１５、１３〜１４、１４〜１０００、１４〜５００、１４〜４００、１４〜３００、１４〜２００、１４〜１００、１４〜９０、１４〜８０、１４〜７０、１４〜６０、１４〜５０、１４〜４０、１４〜３０、１４〜２０または１４〜１５ヌクレオチド長であり得る。

【0050】

オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドは異なるヌクレオチド配列を有し得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは異なるヌクレオチド配列を有する約１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；４×１０^６；５×１０^６；６×１０^６；７×１０^６；８×１０^６；９×１０^６；または１０^７個のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは異なるヌクレオチド配列を有する最大１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；４×１０^６；５×１０^６；６×１０^６；７×１０^６；８×１０^６；９×１０^６；または１０^７個のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは異なるヌクレオチド配列を有する少なくとも１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；４×１０^６；５×１０^６；６×１０^６；７×１０^６；８×１０^６；９×１０^６；または１０^７個のオリゴヌクレオチドを含み得る。

【0051】

異なる配列を有するオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのコレクション中に複数のコピーで存在し得る。オリゴヌクレオチドのコレクションは、同一のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含有し得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは約１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；または１０００コピーの同一ヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは最大１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；または１０００コピーの同一ヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは少なくとも１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；または１０００コピーの同一ヌクレオチド配列を含み得る。

【0052】

いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション内の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは標識されない；いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション内の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは標識される。いくつかの場合、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、例えば、核酸標識、化学標識または光学標識で標識される。いくつかの場合、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを固体支持体にコンジュゲートさせる。いくつかの場合、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを固体支持体にコンジュゲートさせない。いくつかの場合、標識をオリゴヌクレオチドの５’もしくは３’末端に、またはオリゴヌクレオチドの内部に付着させることができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション内の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは２つ以上の標識で標識される。

【0053】

オリゴヌクレオチドは核酸標識を含み得る。いくつかの場合、核酸標識は、以下の１つまたは複数を含み得る：バーコード（例えば、サンプルバーコード）、ユニバーサルプライマー配列、プライマー結合部位（例えば、それだけに限らないが、ＤＮＡ配列決定プライマー結合部位、サンプルバーコード配列決定プライマー結合部位および種々の配列決定プラットホーム要件に適合する増幅プライマー結合部位を含む、配列決定またはバーコード読み取りのためのもの）、シーケンサー適合性配列、配列決定プラットホーム付着する配列、配列決定アダプター配列またはアダプター。核酸標識は、（例えば、ライゲーションまたは合成設計によって）オリゴヌクレオチドに付着させることができる。いくつかの場合、核酸標識の長さがオリゴヌクレオチドの長さに含まれる。いくつかの場合、核酸標識の長さがオリゴヌクレオチドの長さに含まれない。

【0054】

オリゴヌクレオチドは化学標識を含み得る。化学標識のいくつかの非限定的な例としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、放射性標識、ポリペプチドおよびポリマーが挙げられる。オリゴヌクレオチドは光学標識を含み得る。光学標識のいくつかの非限定的な例としては、発蛍光団、蛍光タンパク質、色素および量子ドットが挙げられる。オリゴヌクレオチドを固体支持体にコンジュゲートさせることができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドを固体支持体にコンジュゲートさせない。固体支持体のいくつかの非限定的な例としては、ビーズ、磁気ビーズ、ポリマー、スライド、チップ、表面、プレート、チャネル、カートリッジ、マイクロ流体デバイスおよびマイクロアレイが挙げられる。１つまたは複数のオリゴヌクレオチドをアフィニティークロマトグラフィーのための固体支持体にコンジュゲートさせることができる。いくつかの場合、各オリゴヌクレオチドが異なる標識を有する。いくつかの場合、各オリゴヌクレオチドが同じ標識を有する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの各コピーが同じ標識を有する。いくつかの場合、異なる配列を有する各オリゴヌクレオチドが異なる標識を有する。

【0055】

本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、一般的に、１つまたは複数のヌクレオチドを含む。いくつかの場合、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド（例えばＡ、Ｃ、ＧまたはＴ）、リボヌクレオチド（例えばＡ、Ｃ、ＧまたはＵ）、修飾ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドであり得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはｃＲＮＡを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドはＤＮＡおよびＲＮＡを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドはＤＮＡを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドはＲＮＡを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドはペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）または架橋核酸（ＢＮＡ）などの１つまたは複数の修飾または合成核酸を含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡまたはこれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは、人工的に断片化された核酸を含まない。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは、人工的に断片化された核酸を含まない。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは、（例えば、ＤＮＡ合成による）合成核酸を含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは、（例えば、ＤＮＡ合成による）合成核酸を含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションを凍結乾燥または乾燥させることができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは水または緩衝溶液（例えば、緩衝水溶液）を含み得る。

【0056】

いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００個またはそれ以上のＰＮＡ、ＬＮＡおよび／またはＢＮＡ結合を含有することができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％のＰＮＡ、ＬＮＡおよび／またはＢＮＡ結合を含有することができる。

【0057】

ヌクレオチドのドメイン
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの１つまたは複数のドメインを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの１つのドメインを含む。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインはオリゴヌクレオチドである。いくつかの場合、異なるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの部分がヌクレオチドのドメイン内に現れる。いくつかの場合、異なるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの部分がオリゴヌクレオチド全体を構成する。いくつかの場合、異なるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドの部分がオリゴヌクレオチド内のヌクレオチドのドメインなどのオリゴヌクレオチドのサブセットを構成する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションがオリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、オリゴヌクレオチドは異なる配列を有するヌクレオチドのドメインを含み、オリゴヌクレオチドは複数のコピーで存在してもよい。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、人工的に断片化された核酸を含まない。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは（例えば、ＤＮＡ合成によって）合成される。

【0058】

いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションがオリゴヌクレオチドを含むことができ、各オリゴヌクレオチドは異なるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドのドメインを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは約１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；４×１０^６；５×１０^６；６×１０^６；７×１０^６；８×１０^６；９×１０^６；または１０^７個のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、各オリゴヌクレオチドは異なるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドのドメインを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは最大１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；４×１０^６；５×１０^６；６×１０^６；７×１０^６；８×１０^６；９×１０^６；または１０^７個のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、各オリゴヌクレオチドは異なるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドのドメインを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは少なくとも１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１０^６；１．１×１０^６；１．２×１０^６；１．３×１０^６；１．４×１０^６；１．５×１０^６；１．６×１０^６；１．７×１０^６；１．８×１０^６；１．９×１０^６；２×１０^６；２．１×１０^６；２．２×１０^６；２．３×１０^６；２．４×１０^６；２．５×１０^６；２．６×１０^６；２．７×１０^６；２．８×１０^６；２．９×１０^６；３×１０^６；４×１０^６；５×１０^６；６×１０^６；７×１０^６；８×１０^６；９×１０^６；または１０^７個のオリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、各オリゴヌクレオチドは異なるヌクレオチド配列を有するヌクレオチドのドメインを含む。

【0059】

オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドは、同一のヌクレオチド配列を有するヌクレオチドのドメインを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは、同一のヌクレオチド配列を有するヌクレオチドのドメインを含有する約１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；または１０００個のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは、同一のヌクレオチド配列を有するヌクレオチドのドメインを含有する最大１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；または１０００個のオリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは、同一のヌクレオチド配列を有するヌクレオチドのドメインを含有する少なくとも１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；または１０００個のオリゴヌクレオチドを含み得る。

【0060】

いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の各オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のバックグラウンド集団中に存在しないヌクレオチドのドメインを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の各オリゴヌクレオチドは、宿主ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトーム中に存在しないヌクレオチドのドメインを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の各オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の脊椎動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトーム中に存在しないヌクレオチドのドメインを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の各オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトーム中に存在しないヌクレオチドのドメインを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の各オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトーム中に存在しないヌクレオチドのドメインを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の各オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のヒトおよび１つまたは複数の細菌のゲノム、エクソームまたはトランスクリプトーム中に存在しないヌクレオチドのドメインを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション中の各オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のヒトおよび１つまたは複数のウイルスのゲノム、エクソームまたはトランスクリプトーム中に存在しないヌクレオチドのドメインを含み得る。

【0061】

いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、対象となる１つまたは複数の集団と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、対象となる集団のサブセットと同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、対象となる集団中の核酸の約０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、対象となる集団中の核酸の最大０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、対象となる集団中の核酸の少なくとも０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、ヌクレオチド配列の約０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が対象となる集団中の核酸と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、ヌクレオチド配列の最大０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が対象となる集団中の核酸と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、ヌクレオチド配列の少なくとも０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％が対象となる集団中の核酸と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、対象となる１つまたは複数の集団と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、図４および図５に示されるように、対象となる集団の包括度を保持することができる。

【0062】

いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、１つまたは複数のバックグラウンド集団と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、バックグラウンド集団のサブセットと同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、バックグラウンド集団中の核酸の約０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、バックグラウンド集団中の核酸の最大０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、バックグラウンド集団中の核酸の少なくとも０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、ヌクレオチド配列の約０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％がバックグラウンド集団中の核酸と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、ヌクレオチド配列の最大０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％がバックグラウンド集団中の核酸と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、ヌクレオチド配列の少なくとも０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％がバックグラウンド集団中の核酸と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもないヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、１つまたは複数のバックグラウンド集団と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的なヌクレオチド配列を含み得る。

【0063】

いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、１つまたは複数のバックグラウンド集団核酸とのミスマッチで結合するヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、１つまたは複数のバックグラウンド集団核酸との１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のミスマッチで結合するヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、１つまたは複数のバックグラウンド集団核酸との最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のミスマッチで結合するヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、１つまたは複数のバックグラウンド集団核酸との少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のミスマッチで結合するヌクレオチド配列を含み得る。

【0064】

ヌクレオチドのドメインは１つまたは複数の長さであり得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは単一の長さである。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは異なる長さである。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１３または１４ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１３ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１４ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、最大１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは最大１３または１４ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは最大１３ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは最大１４ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは、少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは少なくとも１３または１４ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは少なくとも１３ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは少なくとも１４ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１０〜２０、１１〜２０、１２〜２０、１３〜２０、１４〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１０〜１３、１１〜１９、１２〜１９、１３〜１９、１４〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１１〜１３、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、１２〜１３、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１３〜１５、１３〜１４、１４〜１８、１４〜１７、１４〜１６または１４〜１５ヌクレオチド長であり得る。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１２〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１３〜１５ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１３〜１４ヌクレオチド長である。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１４ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２１ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、２３ｍｅｒ、２４ｍｅｒまたは２５ｍｅｒなどのｋ−ｍｅｒである。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１３ｍｅｒまたは１４ｍｅｒである。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１３ｍｅｒである。いくつかの場合、ヌクレオチドのドメインは１４ｍｅｒである。

【0065】

バックグラウンド集団
本明細書で使用される場合、バックグラウンド集団は、一般的に、対象となる集団ではない集団である。核酸のバックグラウンド集団を使用して、オリゴヌクレオチドのコレクションを作製することができる。例えば、核酸のバックグラウンド集団を使用して、対象となる集団にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドのコレクションを作製することができる（例えば、バックグラウンド集団核酸を、オリゴヌクレオチドの出発異種コレクションからオリゴヌクレオチドを取り出すための「ベイト」として使用することができる）。いくつかの場合、バックグラウンド集団はサンプル中の核酸の集団である。本明細書で提供される方法および組成物を使用して、サンプル中の核酸のバックグラウンド集団を優先的に除去または単離することができる；いくつかの場合、本方法および組成物を使用して、対象となる集団が単離、除去または検出されるが、バックグラウンド集団は必ずしもされないように、優先的な様式で対象となる集団を特異的に標的化することができる。

【0066】

いくつかの場合、バックグラウンド集団は、宿主生物または宿主のゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームの配列に由来し得る（例えば、この配列中に存在する、またはこの配列と同一、ほぼ同一、相補的もしくはほぼ相補的である配列を含有する）。いくつかの場合、宿主は哺乳動物、ヒト、ヒト以外の哺乳動物、飼育動物（例えば、実験動物、家庭用ペットもしくは家畜）、または非飼育動物（例えば、野生動物）であり得る。いくつかの場合、宿主はイヌ、ネコ、げっ歯動物、マウス、ハムスター、ウシ、トリ、ニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物であり得る。いくつかの場合、宿主は哺乳動物である。いくつかの場合、宿主はヒトである。宿主が患者であってもよい。いくつかの場合、宿主は抗微生物剤、抗菌剤、抗ウイルス剤または抗寄生生物剤で治療され得る。いくつかの場合、宿主は抗微生物剤、抗菌剤、抗ウイルス剤または抗寄生生物剤で治療されていてもよいし、または治療されてもよい。いくつかの場合、宿主は（例えば、１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、菌類または寄生生物に）感染している。いくつかの場合、宿主は（例えば、１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、菌類または寄生生物に）感染していない。いくつかの場合、宿主は健康である。いくつかの場合、宿主は感受性があるまたは感染の危険性がある。

【0067】

いくつかの場合、バックグラウンド集団はイヌ、ネコ、げっ歯動物、マウス、ハムスター、ウシ、トリ、ニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に由来し得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は哺乳動物である。いくつかの場合、バックグラウンド集団はヒトである。いくつかの場合、バックグラウンド集団は宿主に由来し得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、核酸のヒトと微生物集団などの複数の集団（例えば、ヒトのみ、ヒトとウイルス、ヒトと細菌、ヒトと真菌、ヒトと寄生生物等）を含有する。

【0068】

いくつかの場合、バックグラウンド集団は、１つまたは複数のゲノム、エクソームおよび／またはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のゲノム、エクソームおよび／またはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のゲノム、エクソームおよび／またはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００個のゲノム、エクソームおよび／またはトランスクリプトームであり得る。

【0069】

いくつかの場合、バックグラウンド集団は、同じ種の複数の個々の哺乳動物からの哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、１つまたは複数の種の複数の個々の哺乳動物からの哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、同じ種の複数の１つまたは複数の雄および１つまたは複数の雌哺乳動物からの哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。バックグラウンド集団は哺乳動物ゲノムＤＮＡおよび哺乳動物ＲＮＡであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数の微生物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数の病原体ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数の細菌ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数のウイルスゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数のレトロウイルスゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数のウイルスおよび１つまたは複数の細菌ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数の寄生生物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、１つまたは複数は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。いくつかの場合、１つまたは複数は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。いくつかの場合、１つまたは複数は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。いくつかの場合、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームは非ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームである。

【0070】

いくつかの場合、哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームはヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームである。いくつかの場合、バックグラウンド集団はヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームである。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、複数の個々のヒトからのヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、１人または複数人の男性および１人または複数人の女性からのヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。バックグラウンド集団はヒトゲノムＤＮＡおよびヒトＲＮＡであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数の微生物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数の病原体ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数の細菌ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数のウイルスゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数のレトロウイルスゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数のウイルスおよび１つまたは複数の細菌ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームおよび１つまたは複数の寄生生物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。いくつかの場合、１つまたは複数は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。いくつかの場合、１つまたは複数は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。いくつかの場合、１つまたは複数は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。

【0071】

いくつかの場合、バックグラウンド集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームの約０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を構成し得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームの最大０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を構成し得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームの少なくとも０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を構成し得る。

【0072】

いくつかの場合、バックグラウンド集団は、サンプル中の核酸の全集団の約０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％を構成し得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、サンプル中の核酸の全集団の最大０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％を構成し得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、サンプル中の核酸の全集団の少なくとも０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％を構成し得る。

【0073】

いくつかの場合、バックグラウンド集団はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環核酸、循環ＤＮＡ、循環ＲＮＡ、無細胞核酸、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、循環無細胞ＤＮＡ、循環無細胞ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。バックグラウンド集団は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物であってもよい。バックグラウンド集団はゲノムＤＮＡであり得る。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、人工的に断片化された核酸を含む。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、人工的に断片化された核酸を含まない。いくつかの場合、バックグラウンド集団は、（例えば、ＤＮＡ合成による）合成核酸を含む。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸は、（例えば、ＤＮＡ合成により）合成される。いくつかの場合、バックグラウンド集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。

【0074】

いくつかの場合、バックグラウンド集団中の１つまたは複数の核酸は標識されない；いくつかの場合、バックグラウンド集団中の１つまたは複数の核酸は標識される。いくつかの場合、バックグラウンド集団中の１つまたは複数の核酸が、例えば、核酸標識、化学標識または光学標識で標識される。いくつかの場合、バックグラウンド集団中の１つまたは複数の核酸を固体支持体にコンジュゲートさせる。いくつかの場合、標識をバックグラウンド集団中の核酸の５’もしくは３’末端またはバックグラウンド集団中の核酸の内部に付着させることができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団中の１つまたは複数の核酸が２つ以上の標識で標識される。

【0075】

バックグラウンド集団中の核酸は、核酸標識を含むことができる。いくつかの場合、核酸標識は、以下の１つまたは複数を含み得る：バーコード（例えば、サンプルバーコード）、ユニバーサルプライマー配列、プライマー結合部位（例えば、それだけに限らないが、ＤＮＡ配列決定プライマー結合部位、サンプルバーコード配列決定プライマー結合部位および種々の配列決定プラットホーム要件に適合する増幅プライマー結合部位を含む、配列決定またはバーコード読み取りのためのもの）、シーケンサー適合性配列、配列決定プラットホーム付着する配列、配列決定アダプター配列またはアダプター。核酸標識を、（例えば、ライゲーションまたは合成設計によって）バックグラウンド集団中の核酸に付着させることができる。いくつかの場合、核酸標識の長さがバックグラウンド集団中の核酸の長さに含まれる。いくつかの場合、核酸標識の長さがバックグラウンド集団中の核酸の長さに含まれない。

【0076】

バックグラウンド集団中の核酸は化学標識を含み得る。化学標識のいくつかの非限定的な例としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、放射性標識、ポリペプチドおよびポリマーが挙げられる。バックグラウンド集団中の核酸は光学標識を含み得る。光学標識のいくつかの非限定的な例としては、発蛍光団、蛍光タンパク質、色素および量子ドットが挙げられる。バックグラウンド集団中の核酸を固体支持体にコンジュゲートさせることができる。固体支持体のいくつかの非限定的な例としては、ビーズ、磁気ビーズ、ポリマー、スライド、チップ、表面、プレート、チャネル、カートリッジ、マイクロ流体デバイスおよびマイクロアレイが挙げられる。バックグラウンド集団中の核酸をアフィニティークロマトグラフィー用の固体支持体にコンジュゲートさせることができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団中の各核酸は異なる標識を有する。いくつかの場合、バックグラウンド集団中の各核酸は同じ標識を有する。いくつかの場合、バックグラウンド集団中の核酸の各コピーは同じ標識を有する。いくつかの場合、異なる配列を有するバックグラウンド集団中の各核酸は異なる標識を有する。

【0077】

対象となる集団
一般に、対象となる集団は、より大きな集団の他の構成要素からそれを識別するある特徴を有する集団である。対象となる集団は、宿主核酸と非宿主核酸の複雑な混合物中に存在する非宿主核酸（例えば、細菌核酸）であり得る。

【0078】

いくつかの場合、対象となる集団はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環核酸、循環ＤＮＡ、循環ＲＮＡ、無細胞核酸、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、循環無細胞ＤＮＡ、循環無細胞ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。対象となる集団は、ＤＮＡとＲＮＡの混合物であってもよい。対象となる集団はゲノムＤＮＡであり得る。いくつかの場合、対象となる集団は、人工的に断片化された核酸を含む。いくつかの場合、対象となる集団は、人工的に断片化された核酸を含まない。いくつかの場合、対象となる集団は、（例えば、ＤＮＡ合成による）合成核酸を含む。いくつかの場合、対象となる集団は、（例えば、ＤＮＡ合成により）合成される。いくつかの場合、対象となる集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームであり得る。

【0079】

いくつかの場合、対象となる集団は非宿主である。いくつかの場合、非宿主は宿主以外の生物を指す。いくつかの場合、非宿主は宿主以外の種を指す。いくつかの場合、非宿主は宿主と同じ種の他の生物を指すことがある。いくつかの場合、非宿主は、非哺乳動物、非ヒト、非イヌ、非ネコ、非げっ歯動物、非マウス、非ハムスター、非ウシ、非トリ、非ニワトリ、非ブタ、非ウマ、非ヤギ、非ヒツジまたは非ウサギであり得る。いくつかの場合、非宿主は、微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌、寄生生物またはこれらの組み合わせであり得る。いくつかの場合、非宿主は非哺乳動物である。いくつかの場合、非宿主は非ヒトである。いくつかの場合、非宿主は非患者である。

【0080】

いくつかの場合、対象となる集団は非哺乳動物または非ヒトであり得る。いくつかの場合、対象となる集団は、微生物、細菌、ウイルス、真菌、レトロウイルス、病原体または寄生生物であり得る。いくつかの場合、対象となる集団は、非微生物、非細菌、非ウイルス、非真菌、非レトロウイルス、非病原体または非寄生生物であり得る。いくつかの場合、対象となる集団は、微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に由来し得る。いくつかの場合、対象となる集団は非哺乳動物である。いくつかの場合、対象となる集団は非ヒトである。いくつかの場合、対象となる集団は、宿主に感染する微生物または病原体に由来し得る。いくつかの場合、対象となる集団は非哺乳動物ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの場合、対象となる集団は非ヒトＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの場合、対象となる集団は、微生物、細菌、ウイルス、真菌、レトロウイルス、病原体または寄生生物のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの場合、対象となる集団は、非微生物、非細菌、非ウイルス、非真菌、非レトロウイルス、非病原体または非寄生生物のＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。

【0081】

いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数の非宿主ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、約１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００個の非宿主ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、最大１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００個の非宿主ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、少なくとも１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００個の非宿主ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、同じ非哺乳動物種の複数の個体からの非哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数の非哺乳動物種の複数の個体からの非哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、非哺乳動物ゲノムＤＮＡおよび非哺乳動物ＲＮＡを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数の微生物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数の病原体ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数の細菌ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数のウイルスゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数のレトロウイルスゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数のウイルスおよび１つまたは複数の細菌のゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、１つまたは複数の寄生生物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームを含み得る。いくつかの場合、１つまたは複数は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。いくつかの場合、１つまたは複数は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。いくつかの場合、１つまたは複数は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００であり得る。いくつかの場合、非哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームは非ヒトゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームである。いくつかの場合、非哺乳動物ゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームは、微生物、細菌、ウイルス、真菌、レトロウイルス、病原体または寄生生物のゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームである。

【0082】

対象となる集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームの一部を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームの約０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を構成し得る。いくつかの場合、対象となる集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームの最大０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を構成し得る。いくつかの場合、対象となる集団はゲノム、エクソームまたはトランスクリプトームの少なくとも０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を構成し得る。

【0083】

対象となる集団は、サンプル中の核酸の全集団の一部を占め得る。いくつかの場合、対象となる集団は、サンプル中の核酸の全集団の約０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％を構成し得る。いくつかの場合、対象となる集団は、サンプル中の核酸の全集団の最大０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％を構成し得る。いくつかの場合、対象となる集団は、サンプル中の核酸の全集団の少なくとも０．０００００１、０．０００００５、０．００００１、０．００００５、０．０００１、０．０００５、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％を構成し得る。

【0084】

バックグラウンド集団核酸は、サンプル中の対象となる集団の核酸に対して過剰量で存在し得る。対象となる集団の核酸に対するバックグラウンド集団の比は約１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１００００００；２００００００；３００００００；４００００００；５００００００；６００００００；７００００００；８００００００；９００００００；１０００００００であり得る。対象となる集団の核酸に対するバックグラウンド集団の比は最大１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１００００００；２００００００；３００００００；４００００００；５００００００；６００００００；７００００００；８００００００；９００００００；１０００００００であり得る。対象となる集団の核酸に対するバックグラウンド集団の比は少なくとも１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；１００００；２００００；３００００；４００００；５００００；６００００；７００００；８００００；９００００；１０００００；２０００００；３０００００；４０００００；５０００００；６０００００；７０００００；８０００００；９０００００；１００００００；２００００００；３００００００；４００００００；５００００００；６００００００；７００００００；８００００００；９００００００；１０００００００であり得る。比は、濃度、モルまたは質量の点から計算することができる。

【0085】

対象となる集団は、１つまたは複数の種に由来する核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、約１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；２００；３００；４００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００の種に由来する核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、最大１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；２００；３００；４００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００の種に由来する核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、少なくとも１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；２００；３００；４００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００の種に由来する核酸を含み得る。いくつかの場合、種は非哺乳動物種である。いくつかの場合、種はヒト以外の種である。いくつかの場合、種は微生物、細菌、ウイルス、真菌、レトロウイルス、病原体または寄生生物である。いくつかの場合、対象となる集団は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００の細菌またはウイルス種に由来する核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００の細菌またはウイルス種に由来する核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００の細菌またはウイルス種に由来する核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００の細菌およびウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００の細菌およびウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００の細菌およびウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、約１細菌種および１ウイルス種、２細菌種および２ウイルス種、３細菌種および３ウイルス種、４細菌種および４ウイルス種、５細菌種および５ウイルス種、６細菌種および６ウイルス種、７細菌種および７ウイルス種、８細菌種および８ウイルス種、９細菌種および９ウイルス種、１０細菌種および１０ウイルス種、１５細菌種および１５ウイルス種、２０細菌種および２０ウイルス種、２５細菌種および２５ウイルス種、３０細菌種および３０ウイルス種、３５細菌種および３５ウイルス種、４０細菌種および４０ウイルス種、４５細菌種および４５ウイルス種、５０細菌種および５０ウイルス種、６０細菌種および６０ウイルス種、７０細菌種および７０ウイルス種、８０細菌種および８０ウイルス種、９０細菌種および９０ウイルス種、１００細菌種および１００ウイルス種、２００細菌種および２００ウイルス種、３００細菌種および３００ウイルス種、４００細菌種および４００ウイルス種、５００細菌種および５００ウイルス種、または１０００細菌種および１０００ウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、最大１細菌種および１ウイルス種、２細菌種および２ウイルス種、３細菌種および３ウイルス種、４細菌種および４ウイルス種、５細菌種および５ウイルス種、６細菌種および６ウイルス種、７細菌種および７ウイルス種、８細菌種および８ウイルス種、９細菌種および９ウイルス種、１０細菌種および１０ウイルス種、１５細菌種および１５ウイルス種、２０細菌種および２０ウイルス種、２５細菌種および２５ウイルス種、３０細菌種および３０ウイルス種、３５細菌種および３５ウイルス種、４０細菌種および４０ウイルス種、４５細菌種および４５ウイルス種、５０細菌種および５０ウイルス種、６０細菌種および６０ウイルス種、７０細菌種および７０ウイルス種、８０細菌種および８０ウイルス種、９０細菌種および９０ウイルス種、１００細菌種および１００ウイルス種、２００細菌種および２００ウイルス種、３００細菌種および３００ウイルス種、４００細菌種および４００ウイルス種、５００細菌種および５００ウイルス種、または１０００細菌種および１０００ウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を含み得る。いくつかの場合、対象となる集団は、少なくとも１細菌種および１ウイルス種、２細菌種および２ウイルス種、３細菌種および３ウイルス種、４細菌種および４ウイルス種、５細菌種および５ウイルス種、６細菌種および６ウイルス種、７細菌種および７ウイルス種、８細菌種および８ウイルス種、９細菌種および９ウイルス種、１０細菌種および１０ウイルス種、１５細菌種および１５ウイルス種、２０細菌種および２０ウイルス種、２５細菌種および２５ウイルス種、３０細菌種および３０ウイルス種、３５細菌種および３５ウイルス種、４０細菌種および４０ウイルス種、４５細菌種および４５ウイルス種、５０細菌種および５０ウイルス種、６０細菌種および６０ウイルス種、７０細菌種および７０ウイルス種、８０細菌種および８０ウイルス種、９０細菌種および９０ウイルス種、１００細菌種および１００ウイルス種、２００細菌種および２００ウイルス種、３００細菌種および３００ウイルス種、４００細菌種および４００ウイルス種、５００細菌種および５００ウイルス種、または１０００細菌種および１０００ウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を含み得る。

【0086】

いくつかの場合、対象となる集団中の１つまたは複数の核酸は標識されない；いくつかの場合、対象となる集団中の１つまたは複数の核酸は標識される。いくつかの場合、対象となる集団中の１つまたは複数の核酸が、例えば、核酸標識、化学標識または光学標識で標識される。いくつかの場合、対象となる集団中の１つまたは複数の核酸を固体支持体にコンジュゲートさせる。いくつかの場合、標識を対象となる集団中の核酸の５’もしくは３’末端または対象となる集団中の核酸の内部に付着させることができる。いくつかの場合、対象となる集団中の１つまたは複数の核酸が２つ以上の標識で標識される。

【0087】

対象となる集団中の核酸は核酸標識を含むことができる。いくつかの場合、核酸標識は、以下の１つまたは複数を含み得る：バーコード（例えば、サンプルバーコード）、ユニバーサルプライマー配列、プライマー結合部位（例えば、それだけに限らないが、ＤＮＡ配列決定プライマー結合部位、サンプルバーコード配列決定プライマー結合部位および種々の配列決定プラットホーム要件に適合する増幅プライマー結合部位を含む、配列決定またはバーコード読み取りのためのもの）、シーケンサー適合性配列、配列決定プラットホーム付着する配列、配列決定アダプター配列またはアダプター。核酸標識を、（例えば、ライゲーションまたは合成設計によって）対象となる集団中の核酸に付着させることができる。いくつかの場合、核酸標識の長さが対象となる集団中の核酸の長さに含まれる。いくつかの場合、核酸標識の長さが対象となる集団中の核酸の長さに含まれない。

【0088】

対象となる集団中の核酸は化学標識を含むことができる。化学標識のいくつかの非限定的な例としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、放射性標識、ポリペプチドおよびポリマーが挙げられる。対象となる集団中の核酸は光学標識を含むことができる。光学標識のいくつかの非限定的な例としては、発蛍光団、蛍光タンパク質、色素および量子ドットが挙げられる。対象となる集団中の核酸を固体支持体にコンジュゲートさせることができる。固体支持体のいくつかの非限定的な例としては、ビーズ、磁気ビーズ、ポリマー、スライド、チップ、表面、プレート、チャネル、カートリッジ、マイクロ流体デバイスおよびマイクロアレイが挙げられる。対象となる集団中の核酸をアフィニティークロマトグラフィー用の固体支持体にコンジュゲートさせることができる。いくつかの場合、対象となる集団中の各核酸は異なる標識を有する。いくつかの場合、対象となる集団中の各核酸は同じ標識を有する。いくつかの場合、対象となる集団中の核酸の各コピーは同じ標識を有する。いくつかの場合、異なる配列を有する対象となる集団中の各核酸は異なる標識を有する。

【0089】

本明細書で提供される方法によって検出することができる微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍまたはｍｉｃｒｏｂｅ）のいくつかの非限定的な例としては、細菌、古細菌、原虫、原生生物、真菌、藻類、ウイルス、レトロウイルス、病原体または寄生生物が挙げられる。いくつかの場合、微生物は原核生物である。いくつかの場合、微生物は真核生物である。細菌のいくつかの非限定的な例としては、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、クラミドフィラ属（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）が挙げられる。真菌のいくつかの非限定的な例としては、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、ニューモシスチス属（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ）およびスタキボトリス属（Ｓｔａｃｈｙｂｏｔｒｙｓ）が挙げられる。いくつかの例では、本明細書で提供される方法によって検出される微生物は、薬剤耐性微生物または多剤耐性病原体である。薬物耐性または多剤耐性病原体の非限定的な例としては、以下が挙げられる：いくつかの場合、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）（Ｃ．ディフィシル）の薬剤耐性株、カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）、薬剤耐性淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（セファロスポリン耐性）、多剤耐性アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、薬剤耐性カンピロバクター、フルコナゾール耐性カンジダ（真菌）、広域スペクトルβ−ラクタマーゼ産生腸内細菌（ＥＳＢＬ）、バンコマイシン耐性腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（ＶＲＥ）、多剤耐性緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、薬剤耐性非チフス性サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、薬剤耐性チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｔｙｐｈｉ）、薬剤耐性シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、薬剤耐性肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）、薬剤耐性結核（ＭＤＲおよびＸＤＲ）、多剤耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、エリスロマイシン耐性ストレプトコッカスＡ群またはクリンダマイシン耐性ストレプトコッカスＢ群。

【0090】

いくつかの場合、本明細書で提供される方法および組成物を使用して、レトロウイルスまたはレンチウイルスなどのウイルスを検出することができる。いくつかの場合、ウイルスは、ボルティモアウイルス分類システムの第Ｉ群、第ＩＩ群、ＩＩＩ群、第ＩＶ群、第Ｖ群、第ＶＩ群または第ＶＩＩ群のメンバーである。いくつかの場合、ウイルスは、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、アネロウイルス科（Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ヘペウイルス科（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）またはトガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）のメンバーである。いくつかの場合、ウイルスはアデノウイルス、アムールウイルス、アンデスウイルス、動物ウイルス、アストロウイルス、トリ腎炎ウイルス、トリオルトレオウイルス、トリレオウイルス、バンナウイルス、バス・コンゴウイルス、コウモリ媒介ウイルス、ＢＫウイルス、ブルーベリーショックウイルス、鶏貧血ウイルス、ウシアデノウイルス、ウシコロナウイルス、ウシヘルペスウイルス４、ウシパルボウイルス、ヒヨドリコロナウイルスＨＫＵ１１、カリサルウイルス、カタカマスウイルス、チャンディプラウイルス、アメリカナマズウイルス、チョクロウイルス、コルティウイルス、コクサッキーウイルス、コオロギ麻痺ウイルス、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、サイトメガロウイルス、デングウイルス、ドブラバ・ベルグレドウイルス、エボラウイルス、エボラウイルス、エルモロキャニオンウイルス、内皮向性ゾウヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ネコ白血病ウイルス、口蹄疫ウイルス、ゴウウイルス（Ｇｏｕ ｖｉｒｕｓ）、グアナリトウイルス、ハンターン河ウイルス、ハンタウイルス、ＨＣｏＶ−ＥＭＣ／２０１２、ヘンドラウイルス、ヘニパウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペス１型、単純ヘルペス２型、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、ＨＩＶヒトアストロウイルス、ヒトボカウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒトヘルペスウイルス８型、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトメタニューモウイルス、ヒトパピローマウイルス、イムジンウイルス、インフルエンザウイルス、アイラビスタウイルス、ＪＣウイルス、フニンウイルス、ハバロフスクウイルス、コイヘルペスウイルス、クンジンウイルス、ラッサウイルス、ライムストーンキャニオンウイルス、Ｌｌｏｖｉｕ ｃｕｅｖａウイルス、Ｌｌｏｖｉｕウイルス、ルジョウイルス、マチュポウイルス、Ｍａｇｂｏｉウイルス、マールブルグマールブルグウイルス、マールブルグウイルス、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、メラカウイルス、メナングルウイルス、中東呼吸器症候群コロナウイルス、ミニオプトラスコウモリコロナウイルス１、ミニオプトラスコウモリコロナウイルスＨＫＵ８、サル痘ウイルス、モノンガヒラウイルス、ムジュウイルス、ムンプスウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オルビウイルス、パラインフルエンザウイルス、パルボウイルスＢ１９、フィトレオウイルス、アブラコウモリコロナウイルスＨＫＵ５、ポリオウイルス、ブタアデノウイルス、プロスペクトヒルウイルス、カルユーブウイルス、狂犬病ウイルス、Ｒａｖｎウイルス、呼吸系発疹ウイルス、レストンウイルス、細網内皮症ウイルス、キクガシラコウモリコロナウイルスＨＫＵ２、ライノウイルス、ロゼオロウイルス、ロスリバーウイルス、ロタウイルス、ルーセットオオコウモリコロナウイルスＨＫＵ９、風疹ウイルス、サーレマーウイルス、サビアウイルス、Ｓａｎｇａｓｓｏｕウイルス、ヒナコウモリコロナウイルス５１２、セランウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス、ショープ乳頭腫ウイルス、サル泡沫状ウイルス、シンノンブルウイルス、天然痘、スーチョンウイルス、スーダンエボラウイルス、スーダンウイルス、タイフォレストエボラウイルス、タイフォレストウイルス、タンザニアウイルス、トッタパラヤムウイルス（Ｔｈｏｔｔａｐａｌａｙａｍ ｖｉｒｕｓ）、トポグラホフウイルス（Ｔｏｐｏｇｒａｆｏｖ ｖｉｒｕｓ）、トレモウイルス、Ｔｕｌａウイルス、七面鳥コロナウイルス、七面鳥痘ウイルス、タケコウモリコロナウイルスＨＫＵ４、水痘帯状疱疹ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、西ナイルウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルスまたはザイールエボラウイルスである。

【0091】

病原体のいくつかの非限定的な例としては、ウイルス、細菌、プリオン、真菌、寄生生物、原生動物および微生物が挙げられる。病原体のいくつかの非限定的な例としては、アカントアメーバ（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）、ダニ類（Ａｃａｒｉ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、アクチノマイセス・イスラエリー（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒａｅｌｉｉ）、アクチノマイセス・ゲレンセリエ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｇｅｒｅｎｃｓｅｒｉａｅ）、プロピオニバクテリウム・プロピオニクス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ）、アクチノミセトーマ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｏｍａ）、ユーマイセトーマ（Ｅｕｍｙｃｅｔｏｍａ）、アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、アナプラズマ属（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｐｈａｇｏｃｙｔｏｐｈｉｌｕｍ）、アンシロストーマ・ブラジリエンセ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｂｒａｚｉｌｉｅｎｓｅ）、アンシロストーマ・デュオデナレ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、ネカトール・アメリカヌス（Ｎｅｃａｔｏｒ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ）、アンギオストロンギルス・コスタリセンシス（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｃｏｓｔａｒｉｃｅｎｓｉｓ）、アニサキス（Ａｎｉｓａｋｉｓ）、アラクニダ・イクソジダエ（Ａｒａｃｈｎｉｄａ Ｉｘｏｄｉｄａｅ）、ヒメダニ科（Ａｒｇａｓｉｄａｅ）、溶血性アルカノバクテリア（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）、原始鉤頭虫目（Ａｒｃｈｉａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ）、モニリフォルミス・モニリフォルミス（Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスカリス属（Ａｓｃａｒｉｓ）の種、回虫（Ａｓｃａｒｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）多型バベシア（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、バベシア・ビゲミナ（Ｂ．ｂｉｇｅｍｉｎａ）、バベシア・エクイ（Ｂ．ｅｑｕｉ）、バベシア・ミクロチ（Ｂ．ｍｉｃｒｏｆｔｉ）、バベシア・ダンカニ（Ｂ．ｄｕｎｃａｎｉ）、バベシア属（Ｂａｂｅｓｉａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、バラムチア・マンドリルリス（Ｂａｌａｍｕｔｈｉａ ｍａｎｄｒｉｌｌａｒｉｓ）、大腸バランチジウム（Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ）、ヘンセラ菌（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｈｅｎｓｅｌａｅ）、バイリサスカリス属（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ）、アライグマ回虫（Ｂａｙｌｉｓａｓｃａｒｉｓ ｐｒｏｃｙｏｎｉｓ）、ヒト条虫（Ｂｅｒｔｉｅｌｌａ ｍｕｃｒｏｎａｔａ）、ベルチエラ・スツデリイ（Ｂｅｒｔｉｅｌｌａ ｓｔｕｄｅｒｉ）、ＢＫウイルス、ブラストシスチス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ）、ヒトブラストシスチス（Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｉｓ ｈｏｍｉｎｉｓ）、ブラストミセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）の種、ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）、ブルセラ菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、ブルギア・チモリ（Ｂｒｕｇｉａ ｔｉｍｏｒｉ）、ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、セパシア菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）の種、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｍａｌｌｅｉ）、類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）の種、条虫綱 （Ｃｅｓｔｏｄａ）、多頭条虫（Ｔａｅｎｉａ ｍｕｌｔｉｃｅｐｓ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、オウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｓｉｔｔａｃｉ）、トコジラミ科（Ｃｉｍｉｃｉｄａｅ）、トコジラミ（Ｃｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ）、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）；クロノルキス・ビベリニ（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）の種、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ）、コクシジオイデス・ポサダシ（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｐｏｓａｄａｓｉｉ）、コクリオミア・ホミニボラクス（Ｃｏｃｈｌｉｏｍｙｉａ ｈｏｍｉｎｉｖｏｒａｘ）、コロラドダニ熱ウイルス（ＣＴＦＶ）、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｑ熱コクシエラ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｉｉ）、クリミアコンゴ出血熱ウイルス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトスポリジウム属（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、シクロスポラ・カイエタネンシス（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒａ ｃａｙｅｔａｎｅｎｓｉｓ）、サイトメガロウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）、デモデクス・フォリキュロラム（Ｄｅｍｏｄｅｘ ｆｏｌｌｉｃｕｌｏｒｕｍ）／ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）／カニス（ｃａｎｉｓ）、デングウイルス（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４）、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ヒトヒフバエ（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ ｈｏｍｉｎｉ）、槍形吸虫（Ｄｉｃｒｏｃｏｅｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｕｍ）、二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ジオクトフィーマ・レナーレ（Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅ ｒｅｎａｌｅ）、裂頭条虫属（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ）、広節裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｌａｔｕｍ）、メジナ虫（Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｍｅｄｉｎｅｎｓｉｓ）、エボラウイルス（ＥＢＯＶ）、エキノコッカス属（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、多包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）、エキノコッカス・ボゲリ（Ｅ．ｖｏｇｅｌｉ）、ヤマネコ包条虫（Ｅ．ｏｌｉｇａｒｔｈｒｕｓ）、エーリキア・シャフェンシス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）、エーリキア・エウィンギ（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｅｗｉｎｇｉｉ）、エーリキア属（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）、蟯虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、エンテロビウス・グレゴリイ（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｇｒｅｇｏｒｉｉ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロウイルス属（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、エンテロウイルス、コクサッキーＡ（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ａ）ウイルス、エンテロウイルス７１（ＥＶ７１）、有毛表皮糸状菌（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ ｆｌｏｃｃｏｓｕｍ）、紅色菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、毛瘡白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１およびＯ１０４：Ｈ４、肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｈｅｐａｔｉｃａ）、巨大肝蛭（Ｆａｓｃｉｏｌａ ｇｉｇａｎｔｉｃａ）、肥大吸虫（Ｆａｓｃｉｏｌｏｐｓｉｓ ｂｕｓｋｉ）、フィラリア上科（Ｆｉｌａｒｉｏｉｄｅａ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、フォンセカ・ペドロソイ（Ｆｏｎｓｅｃａｅａ ｐｅｄｒｏｓｏｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオトリクム・カンジドゥム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）、腸鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ）、顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｓｐｉｎｉｇｅｒｕｍ）、剛棘顎口虫（Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｈｉｓｐｉｄｕｍ）、Ａ群レンサ球菌（Ｇｒｏｕｐ Ａ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、グアナリトウイルス、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ハリケファロブス・ジンジバリス（Ｈａｌｉｃｅｐｈａｌｏｂｕｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ハートランドウイルス、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）、ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ヘペウイルス科（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）、単純ヘルペスウイルス１および２（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ホルテア・ウェルネッキ（Ｈｏｒｔａｅａ ｗｅｒｎｅｃｋｉｉ）、ヒトボカウイルス（ＨＢｏＶ）、ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）、ヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７）、ヒトメタニューモウイルス（ｈＭＰＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）、小型条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｎａｎａ）、縮小条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ ｄｉｍｉｎｕｔａ）、イソスポーラ・ベリ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ）、ＪＣウイルス、フニンウイルス、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）、クレブシエラ・グラニュロマティス（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ）、ラッサウイルス、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、鼻腔舌虫（Ｌｉｎｇｕａｔｕｌａ ｓｅｒｒａｔａ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ロア糸状虫（Ｌｏａ ｌｏａ）フィラリア、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、マチュポウイルス、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）、マンソネラ・ストレプトセルカ（Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｅｒｃａ）、マールブルグウイルス、麻疹ウイルス、横川吸虫（Ｍｅｔａｇｏｎｉｍｕｓ ｙｏｋａｇａｗａｉ）、微胞子虫門（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ ｐｈｙｌｕｍ）、中東呼吸器症候群コロナウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）、サル痘ウイルス、ケカビ目（Ｍｕｃｏｒａ
ｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）（ムコール症）、ハエカビ目（Ｅｎｔｏｍｏｐｈｔｈｏｒａｌｅｓ ｏｒｄｅｒ）（エントモフトラ症）、ムンプスウイルス、ライ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、マイコバクテリウム・レプロマトシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒｏｍａｔｏｓｉｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ネグレリア・フォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ノカルジア・アステロイデス（Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）の種、ヒツジバエ上科（Ｏｅｓｔｒｏｉｄｅａ）、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、ニクバエ科（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ）、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、タイ肝吸虫（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｖｉｖｅｒｒｉｎｉ）、ネコ肝吸虫（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ ｆｅｌｉｎｅｕｓ）、肝吸虫（Ｃｌｏｎｏｒｃｈｉｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）、オルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、パピローマウイルス科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、南アメリカ分芽菌（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、パラゴニムス・アフリカヌス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）；パラゴニムス・カリエンシス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｃａｌｉｅｎｓｉｓ）；パラゴニムス・ケリコッチ（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｋｅｌｌｉｃｏｔｔｉ）；パラゴニムス・スクリジャビニー（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｓｋｒｊａｂｉｎｉ）；パラゴニムス・ウテロビラテラリス（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｕｔｅｒｏｂｉｌａｔｅｒａｌｉｓ）、ウエステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）、パラゴニムス属（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ）の種、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、寄生双翅目ハエ幼虫、パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）、パルボウイルスＢ１９、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、ヒトジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ）、ヒトアタマジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ ｃａｐｉｔｉｓ）、コロモジラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ ｃｏｒｐｏｒｉｓ）、ケジラミ（Ｐｈｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ）、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、ピエドライア・ホルタエ（Ｐｉｅｄｒａｉａ ｈｏｒｔａｅ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫クルチシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ ｃｕｒｔｉｓｉ）、卵形マラリア原虫ワリケリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ ｗａｌｌｉｋｅｒｉ）、四日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、二日熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）、プラスモジウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、ニューモシスチス・ジロベシ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｊｉｒｏｖｅｃｉｉ）、ポリオウイルス、ポリオーマウイルス科（Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ＰＲＮＰ、ケジラミ（Ｐｔｈｉｒｕｓ ｐｕｂｉｓ）、ヒトノミ（Ｐｕｌｅｘ ｉｒｒｉｔａｎｓ）、狂犬病ウイルス、レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）、ＲＳウイルス（ＲＳＶ）、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、リノスポリジウム・セーベリ（Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｅｅｂｅｒｉ）、ライノウイルス属（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ライノウイルス、コロナウイルス、痘瘡リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ａｋａｒｉ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、発疹チフスリケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・リケッチイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｙｐｈｉ）、リフトバレー熱ウイルス、ロタウイルス、風疹ウイルス、サビア（Ｓａｂｉａ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）亜種エンテリカ（ｅｎｔｅｒｉｃａ）、血清型チフス（ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、サルコシスチス・ボビカニス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｂｏｖｉｈｏｍｉｎｉｓ）、ザルコシスチス・スイホミニス（Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サルコプテス・スカビエイ（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｃａｂｉｅｉ）、ＳＡＲＳコロナウイルス、シストソーマ属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、ビルハルツ住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、シストソーマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍａｎｓｏｎｉ）およびインターカラタム住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍ）メコン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ ｍｅｋｏｎｇｉ）、シストソーマ属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）の種、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、シンノンブルウイルス、マンソン裂頭条虫（Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａ ｅｒｉｎａｃｅｉｅｕｒｏｐａｅｉ）、スポロトリックス・シェンキィ（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）、条虫属（Ｔａｅｎｉａ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ）、有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓｏｌｉｕｍ）、細菌の科、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、カリフォルニアテラジア（Ｔｈｅｌａｚｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｅｎｓｉｓ）、東洋眼虫（Ｔｈｅｌａｚｉａ ｃａｌｌｉｐａｅｄａ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、イヌ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｎｉｓ）、ネコ回虫（Ｔｏｘｏｃａｒａ ｃａｔｉ）、トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｉｒａｌｉｓ）、トリキネラ・ブリトビ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｂｒｉｔｏｖｉ）、トリキネラ・ネルソニ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｎｅｌｓｏｎｉ）、トリキネラ・ナチバ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｎａｔｉｖａ）、トリコビルハルジア・レゲンチ（Ｔｒｉｃｈｏｂｉｌｈａｒｚｉａ ｒｅｇｅｎｔｉ）、住血吸虫科（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｔｉｄａｅ）、腟トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）、紅色菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｒｕｂｒｕｍ）、トリコフィトン・トンズランス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｔｏｎｓｕｒａｎｓ）、バイゲル毛芽胞菌（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｂｅｉｇｅｌｉｉ）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｔｒｉｃｈｉｕｒａ）、イヌ鞭虫（Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｖｕｌｐｉｓ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ）、スナノミ（Ｔｕｎｇａ ｐｅｎｅｔｒａｎｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、大痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ ｍａｊｏｒ）、小痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ ｍｉｎｏｒ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、西ナイルウイルス、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）、マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ ｍａｌａｙｉ）、黄熱病ウイルス、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ）および偽結核エルシニア菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）が挙げられる。

【0092】

オリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法
本開示は、特に対象となる集団（例えば、微生物または病原体核酸）を標的化または検出するために、本明細書で提供される方法に使用するためのオリゴヌクレオチドのコレクションを作製するための複数の手段を提供する。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションを作製する方法は、生物情報学、計算、ハイブリダイゼーションに基づく、または消化に基づく方法であり得る。

【0093】

いくつかの場合、宿主（例えば、ヒト）ゲノムＤＮＡなどのバックグラウンド集団核酸を使用して、宿主および非宿主（例えば、非ヒト、病原体）配列を含有するオリゴヌクレオチドの集団から宿主配列を除去することができる。この方法は、宿主（例えば、ヒト）および非宿主核酸に結合することができるオリゴヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドの異種コレクション（例えば、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’（ＮはＡ、Ｃ、ＧまたはＴである）などのオリゴヌクレオチドランダマーのコレクション）を提供することを含み得る。いくつかの例では、宿主ゲノムＤＮＡを、オリゴヌクレオチドの異種コレクション中の相補的配列との宿主ゲノムＤＮＡの結合を促進する条件下で、オリゴヌクレオチドの異種コレクションに導入することができる。この方法は、オリゴヌクレオチドの異種コレクションから宿主ゲノムＤＮＡに結合したオリゴヌクレオチドを枯渇させることを含み得る。通常、このような方法では、宿主核酸（例えば、宿主ゲノム核酸）が、オリゴヌクレオチドの異種コレクションに対して過剰量で提供される。枯渇は、オリゴヌクレオチドの異種コレクションからハイブリダイズもしくは結合したオリゴヌクレオチドを除去すること、ハイブリダイズもしくは結合したオリゴヌクレオチドを破壊すること、または未結合のオリゴヌクレオチドを優先的に単離することによるなど本明細書で提供される方法によって完了することができる。

【0094】

図３は、オリゴヌクレオチドのコレクション（３７０）を作製する絵画的な例を示す。本方法は、オリゴヌクレオチドの異種コレクション（３１０）を用意するステップを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、核酸標識、化学標識または光学標識（３２０）で標識されたオリゴヌクレオチドを含み得る。本方法は、オリゴヌクレオチドの異種コレクションからバックグラウンド集団核酸（例えば、宿主核酸、ヒト核酸等）と同一、ほぼ同一、相補的、またはほぼ相補的な配列を有するヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを枯渇させるステップを含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションを、バックグラウンド集団核酸がオリゴヌクレオチドの異種コレクション内のオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの相補的またはほぼ相補的なドメインにハイブリダイズまたは特異的に結合するように、バックグラウンド集団核酸（３４０）（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ）と接触させる（３６０）ことによって枯渇が達成される。ハイブリダイゼーション反応は、変性ステップおよび／または再生ステップを含むことができる。例えば、反応中の核酸を変性させるために、核酸を加熱する、または段階的加熱（例えば、９５℃で１０秒間および６５℃で３分間）に供することができる。核酸を再生するために、核酸を３６℃で一定時間、例えば数時間または数週間インキュベートすることができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸は、宿主（３３０）から誘導または単離される。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸は、核酸標識、化学標識または光学標識（３５０）で標識される。いくつかの場合、本方法は、バックグラウンド集団核酸の少なくとも一部を例えば熱によって変性させるステップをさらに含む。

【0095】

いくつかの場合、１つまたは複数のブロッカーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションステップ（３６０）中に存在してもよく、ハイブリダイゼーションステップの前または最中に含めてもよい。いくつかの例で、オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡまたはこれらの任意の組み合わせを含む。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのドメインの外側のオリゴヌクレオチドの配列に相補的であり得るので、ヌクレオチドのドメインにハイブリダイズせず、むしろ、同じ鎖上に存在する他のヌクレオチドを「ブロックする」よう設計され得る。ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在は、ヌクレオチドのドメインの外側の配列がオリゴヌクレオチドのバックグラウンド集団（例えば、ヒトゲノムＤＮＡ）に結合する可能性を低減するのに役立ち得る。よって、ブロッカーオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのバックグラウンド集団に対するオリゴヌクレオチドのコレクションの結合特異性を促進することができる。いくつかの具体例では、オリゴヌクレオチドの異種コレクションが、ブロッカーオリゴヌクレオチド（例えば、０．５Ｘ ＰＢＳ、ブロッカーオリゴヌクレオチド、ＲＮアーゼ阻害剤）を含む緩衝溶液中のゲノムＤＮＡにハイブリダイズし得る。

【0096】

通常、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのコレクションを作製するための出発集団として使用されるオリゴヌクレオチドの異種コレクションは、ランダムに作製された核酸配列のコレクション（例えば、５’ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、またはＴである）などのオリゴヌクレオチドランダマーのコレクション）である。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションを（例えば、ＤＮＡ合成によって）合成することができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、人工的に断片化された核酸を含まない。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、ヌクレオチドのドメインについて可能な配列の約５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％が存在する、ヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、ヌクレオチドのドメインについて可能な配列の最大５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％が存在する、ヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、ヌクレオチドのドメインについて可能な配列の少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％が存在する、ヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。

【0097】

いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、バックグラウンド集団核酸または対象となる集団からの核酸と同一、ほぼ同一、相補的、またはほぼ相補的な配列を有するヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、１つまたは複数のバックグラウンド集団と同一、ほぼ同一、相補的、またはほぼ相補的な配列を有するヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、１つまたは複数のバックグラウンド集団と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもない配列を有するヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、１つまたは複数の対象となる集団と同一、ほぼ同一、相補的またはほぼ相補的な配列を有するヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションは、１つまたは複数の対象となる集団と同一でも、ほぼ同一でも、相補的でも、ほぼ相補的でもない配列を有するヌクレオチドのドメインを含むオリゴヌクレオチドを含む。

【0098】

いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクション内の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは標識されない；いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクション内の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは標識される。いくつかの場合、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、例えば、核酸標識、化学標識または光学標識で標識される。いくつかの場合、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを固体支持体にコンジュゲートさせる。いくつかの場合、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドを固体支持体にコンジュゲートさせない。いくつかの場合、標識をオリゴヌクレオチドの５’もしくは３’末端に、またはオリゴヌクレオチドの内部に付着させることができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクション内の１つまたは複数のオリゴヌクレオチドは２つ以上の標識で標識される。

【0099】

バックグラウンド集団核酸は、オリゴヌクレオチドの異種コレクションに対して過剰量で提供され得る。オリゴヌクレオチドに対するバックグラウンド集団の比は、約０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。オリゴヌクレオチドに対するバックグラウンド集団の比は、最大０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。オリゴヌクレオチドに対するバックグラウンド集団の比は、少なくとも０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。オリゴヌクレオチドに対するバックグラウンド集団の比は、飽和していてもよい。オリゴヌクレオチドに対するバックグラウンド集団の比は、非飽和であってもよい。比は、濃度、モルまたは質量の点から計算することができる。

【0100】

いくつかの場合、核酸は一本鎖である。いくつかの場合、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性する。核酸は熱を用いて変性することができる。いくつかの場合、核酸を、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９℃に加熱する。いくつかの場合、核酸を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０分間加熱する。いくつかの場合、核酸を、化学的変性剤（例えば、酸、塩基、溶媒、カオトロピック剤、塩）を用いて核酸を変性する。

【0101】

一本鎖核酸サンプルを再生またはハイブリダイズさせることができる。いくつかの場合、一本鎖核酸サンプルをオリゴヌクレオチドの異種コレクションとハイブリダイズさせる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドの異種コレクションをブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。いくつかの場合、一本鎖核酸の少なくとも一部を再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６８または７０℃で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を氷上で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を室温で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは６０分、または２、３、４、５、１０、１５、２０、２２、２４、３０、４０、４６、４８、５０、６０、７０、７２、８０もしくは９６時間再生またはハイブリダイズさせる。温度、緩衝液組成、反応時間および濃度がハイブリダイゼーションの程度に影響を及ぼし得る。いくつかの場合、トリメチルアンモニウムクロリドの存在下で核酸を再生する。

【0102】

オリゴヌクレオチドの異種コレクションからハイブリダイズした核酸を除去することなどによって、本明細書で提供される方法によって枯渇を完了させることができる。バックグラウンド集団を化学的に標識および除去し、それによって、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを除去することができる。バックグラウンド集団を磁気ビーズにコンジュゲートさせ、磁石で除去し、それによって、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを除去することができる。バックグラウンド集団を核酸タグで標識することができる。核酸タグは、固体支持体にコンジュゲートしている、または化学タグでタグ付けされている核酸配列に結合またはハイブリダイズすることができる。ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドは、サイズ分離（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等）、親和性分離（例えば、ＤＮＡプルダウンアッセイ、クロマトグラフィー等）、または他の方法によって除去することができる。いくつかの場合、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動またはクロマトグラフィーなどの分離方法を使用して、ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドのサイズの差異に基づいて単離することができる。いくつかの場合、ハイブリダイズしていないバックグラウンド集団核酸を除去しない。

【0103】

いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸にハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを不活性化することによって枯渇を完了することができる。不活性化は、例えばオリゴヌクレオチドを標識されたバックグラウンド集団核酸に化学的に結合させ、次いで、非結合オリゴヌクレオチドのみを用いて増幅することによって、バックグラウンド集団核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドがプライマーとして作用するのを防ぐことができる。

【0104】

いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションは、生物情報学的または計算ツールを使用して対象となる集団（例えば、病原体核酸、非ヒト核酸）を標的とするように設計され、次いで、設計に従って合成される。いくつかの場合、合成方法はＤＮＡ合成である。本方法は、一定の長さのランダムに作製されたオリゴヌクレオチドのデータベースを得るステップを含み得る。本方法は、１つまたは複数のバックグラウンド集団（例えば、ヒトゲノム核酸）中に存在するヌクレオチドの領域を生物情報学的または計算的に決定するステップを含み得る。次いで、得られたオリゴヌクレオチドのコレクションが特定の長さ（例えば、１０、１１、１２、１３、１４または１５ヌクレオチド等）のバックグラウンド集団配列をほとんどまたは全く有さないように、ヌクレオチドのこのようなドメインに関連する配列を、オリゴヌクレオチドのランダムに作製された異種コレクションから計算上差し引くことができる。

【0105】

非宿主オリゴヌクレオチドのコレクションの合成
非宿主オリゴヌクレオチド配列の同定後、非宿主オリゴヌクレオチドのコレクションの合成を、無数の手法を介して達成することができる。例えば、非宿主オリゴヌクレオチドを、所望の長さ（例えば、１３ｍｅｒ）のオリゴヌクレオチドを産生するためにヌクレオチドを段階的に添加することによって個別的に合成することができる。

【0106】

いくつかの例では、ウルトラマーオリゴヌクレオチドを使用して本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのコレクションを合成する。一般に、ウルトラマーオリゴヌクレオチドは、それぞれが１つまたは複数のスペーサーヌクレオチドによって分離された、つなぎ合わさった多数のオリゴヌクレオチド配列単位を含有する長いオリゴヌクレオチドである。単一のウルトラマーオリゴヌクレオチドから一組のオリゴヌクレオチドを生成するために、スペーサーヌクレオチドを切断または分離することができる。図９Ａは、代表的なウルトラマーオリゴヌクレオチドの一般的な設計を示す。ここで、個々のオリゴヌクレオチド配列は、スペーサーヌクレオチドとして働くデオキシウラシルヌクレオチド（Ｕ）によって分離されている。ウルトラマーオリゴヌクレオチドを、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）（Ｎ−グリコシド結合を切断することによってＤＮＡからウラシル残基を切断する）および無塩基部位（例えば、アプリン／アピリミジン部位またはＡＰ部位）に対する特異性を有するエンドヌクレアーゼの二重作用によって消化し、それによって個々のオリゴヌクレオチド（例えば、１３ｍｅｒオリゴヌクレオチド）を生成することができる。いくつかの場合、ウルトラマーオリゴヌクレオチドを、エンドヌクレアーゼＩＶまたはエンドヌクレアーゼＶＩＩを用いて加水分解する。代表的な反応が図１０Ａに記載されている。図１０Ｂは、ＵＤＧおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩによるウルトラマーオリゴヌクレオチドの消化後の消化反応産物の例を示している。

【0107】

ウルトラマーオリゴヌクレオチドを、同じウルトラマー鎖内の個々のオリゴヌクレオチド単位が同じ縮重度を共有するように設計することができる。縮重は、一般的に、単一の可変配列から生成され得る異なる固有の配列の数を指す。これは、オリゴヌクレオチド単位内の一定の位置に１つまたは複数の混合塩基を挿入することによって達成することができる。混合塩基は、塩基のセットのいずれか１つ（例えば、４つの標準塩基：Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ塩基のいずれか１つ）を指し得る。例えば、標準的な符号化体系では、「Ｎ」混合塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ塩基のいずれか１つであり得る。同様に、「Ｄ」混合塩基はＡ、ＧまたはＴであり得る；「Ｖ」混合塩基はＡ、ＣまたはＧであり得る；「Ｂ」混合塩基はＣ、ＧまたはＴであり得る；「Ｈ」混合塩基はＡ、ＣまたはＴであり得る；「Ｗ」混合塩基はＡまたはＴであり得る；「Ｓ」混合塩基はＣまたはＧであり得る；「Ｋ」混合塩基はＣまたはＧであり得る；「Ｍ」混合塩基はＡまたはＣであり得る；「Ｙ」混合塩基はＣまたはＴであり得る；また「Ｒ」混合塩基はＡまたはＧであり得る。このような符号化体系の下では、図９Ｂおよび図１１Ａに示されるように、４つの可能な配列が生成され得るので、１つのＮ混合塩基を含有するオリゴヌクレオチド配列は、４の縮重度を有するだろう。同様に、図９Ｃおよび図１１Ａに示されるように、１６の可能な配列が生成され得るので、２つのＮ混合塩基を含有するオリゴヌクレオチド配列は、４×４＝１６の縮重度を有するだろう。図９Ｄに示されるように、８つの可能な配列が生成され得るので、１つのＮ混合塩基および１つのＷ、Ｓ、Ｋ、Ｍ、ＹまたはＲ混合塩基を含有するオリゴヌクレオチド配列は、４×２＝８の縮重度を有するだろう。６つの可能な配列が生成され得るので、１つのＲ混合塩基および１つのＤ混合塩基を含有するオリゴヌクレオチド配列は、２×３＝６の縮重度を有するだろう。

【0108】

ウルトラマー内のオリゴヌクレオチド配列が同じ縮重度を共有する場合、ウルトラマー内の各オリゴヌクレオチド配列は、おそらくウルトラマーの消化後に等しい数で表されるであろう。例えば、ウルトラマー内のオリゴヌクレオチド配列がそれぞれ４の縮重度を有する場合、１オリゴヌクレオチド配列単位当たり４つの異なる固有のオリゴヌクレオチドの各々は、結果として生じる合成プール中にほぼ等しい量で存在するであろう。しかしながら、例えば、ウルトラマーが２度の縮重度を有する１つのオリゴヌクレオチド単位および４度の縮重度を有する９つのオリゴヌクレオチド単位を含有する場合、１つの２度単位からの２つのオリゴヌクレオチドは、結果として生じる合成および消化プール中に、それぞれ約２．５％の９個の４度単位からの３６個のオリゴヌクレオチドに対して、それぞれ約５％過剰発現する。したがって、縮重度を共有したオリゴヌクレオチド単位を有するウルトラマーは、均一に分布した固有の配列を有するオリゴヌクレオチドのコレクションをもたらし得る。

【0109】

非宿主オリゴヌクレオチド配列を、縮重度によって計算的に同定およびグループ分けすることができる。配列の縮重は、一定数の位置によってのみ異なる配列、例えば、位置１および２を除いて同一である全ての配列を計算的にソーティングすることによって同定することができる。複数の縮重配列を１つまたは複数の混合塩基を有する単一の可変配列に分類するために必要とされる混合塩基の数および種類が、縮重度を決定し得る。図１１は、縮重度による非宿主オリゴヌクレオチドの計算上の分類を示す。図１１Ａは１、２または３個の「Ｎ」混合塩基部位を有する代表的なオリゴヌクレオチドを示す。図１１Ｂのヒストグラムは、縮重度に基づく非ヒト１３ｍｅｒのバケット化を示す。図１１Ｂの第１列は、縮重度が「２」である（これらが２つの可能な塩基を示す単一混合塩基（例えば、Ｗ混合塩基、Ｓ混合塩基、Ｋ混合塩基、Ｍ混合塩基、Ｙ混合塩基またはＲ混合塩基）を含有することを意味する）非ヒト１３ｍｅｒの数を示している。第２列は、３度の縮重度（例えば、Ｄ、Ｖ、ＢまたはＨ混合塩基）を有する非ヒト１３ｍｅｒの数を示す。残りの列は、４、６、８、９、１２または１６度の縮重度を有する非ヒト１３ｍｅｒの数を示す。例えば、４の縮重度を有する非ヒト１３ｍｅｒは、１つのＮ混合塩基またはＷ、Ｓ、Ｋ、Ｍ、ＹおよびＲから選択される任意の２つの混合塩基を含み得るだろう。

【0110】

非宿主（例えば、非ヒト）オリゴヌクレオチドの各縮重群の代表（例えば、１３ｍｅｒ）を、図９に示されるように、本明細書の他の箇所で議論される、同じ縮重度の他の代表と組み合わせてウルトラマーオリゴヌクレオチドにすることができる。次いで、設計されたウルトラマーオリゴヌクレオチドを、従来の核酸合成方法およびサービス提供者、例えばＩＤＴによって合成することができる。

【0111】

共有された縮重度を有するオリゴヌクレオチド単位（または配列）を含有するウルトラマーの消化を、いくつかの異なるステップのいずれかで行うことができる。いくつかの場合、全てが縮重度を共有している単位を含有するウルトラマーのグループを合わせ、次いで、消化する。例えば、得られたオリゴヌクレオチドの等モル濃度を維持するために、全てが同じ縮重度を有するオリゴヌクレオチド配列を有する複数のウルトラマーオリゴヌクレオチドを等モル濃度で組み合わせ、消化することができる。別の手法では、ウルトラマーを最初に個別に消化し、次いで、得られたオリゴヌクレオチド単位をこのような消化後に等モル濃度で組み合わせることができる。

【0112】

異なる縮重度を有するオリゴヌクレオチド単位（または配列）を含有するウルトラマーの消化を、いくつかの異なるステップのいずれかで行うことができる。いくつかの場合、各々が縮重度の異なる単位を含有するウルトラマーのグループを合わせ、次いで、消化する。例えば、得られたオリゴヌクレオチドの等モル濃度をもたらすために、各々が異なる縮重度を有するオリゴヌクレオチド配列を有する複数のウルトラマーオリゴヌクレオチドを適切な比率で組み合わせ、消化することができる。別の手法では、ウルトラマーを最初に個別に消化し、次いで、得られたオリゴヌクレオチド単位をこのような消化後に適切な比で組み合わせて、得られたオリゴヌクレオチドの等モル濃度をもたらすことができる。

【0113】

本明細書で提供されるウルトラマーオリゴヌクレオチドは、任意の数のオリゴヌクレオチド単位（または配列）を含み得る。例えば、ウルトラマーオリゴヌクレオチドは、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００または２００個以上のオリゴヌクレオチド単位または配列を含み得る。いくつかの場合、オリゴヌクレオチド単位または配列は、５〜１００ヌクレオチド（例えば、５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のヌクレオチド）の長さなどの一定の長さを有するヌクレオチドのドメインを含有する。好ましくは、ヌクレオチドのドメインは１３ｍｅｒである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチドの各ドメインが１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上、１１個以上、１２個以上または１３個以上の混合塩基を含む。いくつかの実施形態では、混合塩基がＮ（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）、Ｄ（Ａ、Ｇ、Ｔ）、Ｖ（Ａ、Ｃ、Ｇ）、Ｂ（Ｃ、Ｇ、Ｔ）、Ｈ（Ａ、Ｃ、Ｔ）、Ｗ（Ａ、Ｔ）、Ｓ（Ｃ、Ｇ）、Ｋ（Ｇ、Ｔ）、Ｍ（Ａ、Ｃ）、Ｙ（Ｃ、Ｔ）、Ｒ（Ａ、Ｇ）、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列が同じ縮重度を有する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列が２、３、４、６、８、９、１２、１６、１８、２４、２７、３２、３６、４８、５４、６４、７２、８１、９６、１０８、１２８、１４４、１６２、１９２、２１６、２４３または２５６の縮重度を有する。

【0114】

個々のオリゴヌクレオチドを、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）を使用して、または図１２に示されるように化学的にビオチン化することができる。このステップは、表面固定化または磁気ビーズの精製が必要な場合に特に有用であり得る。例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドをサンプルと組み合わせて、サンプル内の非宿主オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。ストレプトアビジンでコーティングしたビーズをサンプルに添加し、使用して、非宿主オリゴヌクレオチドをプルダウンまたは単離することができる。

【0115】

本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドを生成するためのウルトラマーの手法は、いくつかの利点を有する。いくつかの場合、このような方法は、オリゴヌクレオチドの高度に多様なコレクション（例えば、高度に多様な１３ｍｅｒオリゴヌクレオチドのコレクション）を作製するために必要な合成実行の数を減らすことができる。このような方法はまた、合成コストを低減する、過剰量のオリゴヌクレオチドの合成を減少させる、オリゴヌクレオチドを混合する手動ステップを最小化する、または高収率のオリゴヌクレオチドの合成を可能にすることができる。

【0116】

オリゴヌクレオチドのコレクションの使用
いくつかの場合、図１および図２に示されるように、オリゴヌクレオチドのコレクションをＰＣＲ増幅、ｃＤＮＡ合成、配列決定またはプライマー伸長反応のためのプライマーまたは捕捉剤として使用することができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクション（１５０）を核酸サンプル（１４０）と混合する。いくつかの場合、核酸サンプルは、生物学的サンプル、例えば、宿主（１１０）からの血液サンプル（１２０）または血漿（１３０）に由来する。多くの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションを使用して増幅、ｃＤＮＡ合成、配列決定またはプライマー伸長をプライミングする場合、オリゴヌクレオチドおよびサンプル核酸を、ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼなどの適切な重合酵素と組み合わせることができる。いくつかの場合、核酸サンプルがＲＮＡを含む場合、オリゴヌクレオチドのコレクションがＲＮＡ鋳型（１５０）からのｃＤＮＡ合成をプライミングするために使用され得る。いくつかの場合、核酸サンプルがＤＮＡを含む場合、オリゴヌクレオチドのコレクションがプライマー伸長反応（１７０）に使用され得る。プライマー伸長反応は、例えば、核酸標識、核酸タグ、バーコード（例えば、サンプルバーコード）、ユニバーサルプライマー配列、プライマー結合部位（例えば、それだけに限らないが、ＤＮＡ配列決定プライマー結合部位、サンプルバーコード配列決定プライマー結合部位および種々の配列決定プラットホーム要件に適合する増幅プライマー結合部位を含む、配列決定またはバーコード読み取りのためのもの）、シーケンサー適合性配列、配列決定プラットホーム付着する配列、配列決定アダプター配列またはアダプターを添加して、対象となる集団の核酸にオーバーハング配列を付加することができる。いくつかの場合、プライマー伸長反応は、対象となる集団（例えば、非哺乳動物、非ヒト、微生物または病原体）核酸にのみ配列決定アダプターを付加することができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションを、対象となる集団の核酸を増幅するためのＰＣＲ反応のためのプライマーとして使用することができる。いくつかの場合、標識されたオリゴヌクレオチドのコレクションを使用して対象となる集団を標識することができる。次いで、対象となる標識された集団の核酸を、例えば、ハイブリダイゼーションベースの方法またはプルダウン方法によって単離することができる。

【0117】

任意の特定の長さの非宿主オリゴヌクレオチドのプールは、ＤＮＡまたはＲＮＡから調製されたライブラリー中の非宿主配列を濃縮しようとする場合には、異なっていてもよい。例えば、宿主エクソームに完全に相補的なＮ−ｍｅｒを除去する場合と比較して、宿主ゲノムに完全に相補的なＮ−ｍｅｒを除去した後に、全ての可能なＮ−ｍｅｒのより大きな分画が残っていてもよい。非宿主エクソームのより大きな分画を、非宿主ゲノムに対してプローブすることができ、場合によってはより高い感受性を潜在的に提供することができる。さらに、非宿主ゲノムおよびエクソームをプローブするために同じ数のオリゴヌクレオチドを利用しようとする場合、宿主エクソームに相補的でないより多数のオリゴヌクレオチドが、どの非相補的なオリゴヌクレオチドがプールに含まれるかを選択する際に、追加の汎用性を提供し、所望の配列特性を有するオリゴヌクレオチドの選択を可能にし得る。

【0118】

いくつかの場合、図２に示されるように、オリゴヌクレオチドのコレクションを核酸プルダウンに使用することができる。例えば、オリゴヌクレオチドのコレクション（２５０）を、核酸サンプル（２４０）から対象となる集団を捕捉するためのベイトとして使用することができる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションを標識するまたは固体支持体にコンジュゲートさせる。オリゴヌクレオチドのコレクション中のオリゴヌクレオチドは、サンプル（２６０）内の対象となる相補的またはほぼ相補的な集団の核酸にハイブリダイズまたは特異的に結合することができる。いくつかの場合、標識されたオリゴヌクレオチドのコレクションは、ＰＣＲ増幅のためのプライマーとして機能する。いくつかの場合、ＰＣＲ増幅産物をプルダウンする。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションのオリゴヌクレオチド上の標識を使用して、オリゴヌクレオチドのコレクションおよび対象となるハイブリダイズもしくは結合した集団の核酸を（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジンまたは核酸ハイブリダイゼーション相互作用により）単離する。いくつかの場合、核酸サンプルは、循環無細胞核酸などの循環核酸を含む。いくつかの場合、核酸サンプルは、核酸の配列決定可能なライブラリーなどの、増幅された、精製されたまたは単離された核酸を含む。

【0119】

いくつかの場合、ライブラリー調製後の非宿主（例えば、病原体）配列を濃縮する方法として、オリゴヌクレオチドのコレクションを核酸プルダウンに使用することができる。いくつかの場合、標識されたオリゴヌクレオチドのコレクション（例えば、ビオチンで化学的に標識されたオリゴヌクレオチドのコレクション）は、一本鎖ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーにハイブリダイズすることができる。いくつかの場合、ポリメラーゼを使用して、例えば高忠実度条件下で、ライブラリー断片に沿ってハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを伸長させることができる。伸長したハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを、ビオチン標識のためのストレプトアビジンなどの標識の結合パートナーを用いて引き出すことができる。いくつかの場合、濃縮されたライブラリーを例えば、ＰＣＲによって増幅することができる。このような方法の利点には、宿主核酸が選択されるオープンエンド濃縮方法であることが含まれる。いくつかの場合、濃縮方法をＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーに使用することができる。いくつかの場合、非宿主ライブラリー断片の陽性選択は、改善された動力学および熱力学をもたらす。いくつかの場合、標準ライブラリー調製後に方法を適用することで、個別にバーコード化され得る複数のサンプルをバッチ処理することが可能になる。

【0120】

いくつかの場合、循環核酸などの核酸サンプル中の対象となる集団（例えば、非宿主）配列を、
（ａ）核酸サンプルを用意するステップであって、核酸サンプルがバックグラウンド集団（例えば、宿主）核酸および対象となる集団の核酸を含むステップと；
（ｂ）核酸サンプルをオリゴヌクレオチドのコレクションと混合し、それによって、混合物を得るステップであって、オリゴヌクレオチドのコレクションはヌクレオチドのドメインを有するオリゴヌクレオチドを含有するステップと、
（ｃ）混合物中でオリゴヌクレオチドのコレクションを核酸サンプルと接触させるステップであって、接触によって混合物中の対象となる集団の核酸をヌクレオチドのドメインに結合させ、それによって、対象となる集団の核酸をプライミングまたは捕捉するステップと
によってプライミングまたは捕捉することができる。

【0121】

プライミングまたは捕捉された核酸をさらに分析または処理することができる。いくつかの場合、プライミングまたは捕捉された核酸を反応（例えば、ＰＣＲ反応）において優先的に増幅することができる。いくつかの場合、プライミングまたは捕捉された核酸を、シーケンシングアッセイ（例えば、次世代シーケンシングアッセイ、ハイスループットシーケンシングアッセイ、大量並列シーケンシングアッセイ、ナノポアシーケンシングアッセイまたはサンガーシーケンシングアッセイ）を行うことによって配列決定することができる。いくつかの場合、プライミングまたは捕捉された核酸を（例えば、プルダウンアッセイを行うことによって）優先的に単離する。いくつかの場合、プライマー伸長反応を、（例えば、核酸標識をプライミングまたは捕捉された核酸に付着させるために）プライミングまたは捕捉された核酸に対して行う。いくつかの場合、プライミングまたは捕捉された核酸はＲＮＡであり、重合反応を（例えば、逆転写酵素によって）プライミングまたは捕捉されたＲＮＡ核酸に対して行う。

【0122】

いくつかの場合、循環核酸などの核酸サンプル中の対象となる集団（例えば、非宿主）の配列を、
（ａ）核酸サンプルを用意するステップであって、核酸サンプルがバックグラウンド集団（例えば、宿主）核酸および対象となる集団の核酸を含むステップと；
（ｂ）核酸サンプルをオリゴヌクレオチドのコレクションと混合し、それによって、混合物を得るステップであって、オリゴヌクレオチドのコレクションはヌクレオチドのドメインを有するオリゴヌクレオチドを含有するステップと、
（ｃ）混合物中でオリゴヌクレオチドのコレクションを核酸サンプルと接触させるステップであって、接触によって混合物中の対象となる集団の核酸をヌクレオチドのドメインに結合させるステップと；
（ｄ）シーケンシングアッセイ（例えば、次世代シーケンシングアッセイ、ハイスループットシーケンシングアッセイ、大量並列シーケンシングアッセイ、ナノポアシーケンシングアッセイまたはサンガーシーケンシングアッセイ）を行うことによって、対象となる結合集団の核酸を配列決定するステップと
によって配列決定することができる。いくつかの場合、配列決定の前に、対象となる結合集団の核酸を反応（例えば、ＰＣＲ反応）において優先的に増幅する。いくつかの場合、配列決定の前に、対象となる結合集団の核酸を（例えば、プルダウンアッセイを行うことによって）優先的に単離する。いくつかの場合、配列決定の前に、プライマー伸長反応を（例えば、核酸標識を結合核酸に付着させるために）対象となる結合集団の核酸に対して行う。いくつかの場合、対象となる結合集団の核酸はＲＮＡである。いくつかの場合、重合反応を（例えば逆転写酵素によって）ＲＮＡである対象となる結合集団の核酸に対して行う。

【0123】

オリゴヌクレオチドのコレクションを循環核酸などの核酸サンプルに接触させることによって、バックグラウンド集団（例えば、宿主）核酸の一部をヌクレオチドのドメインに結合させることができる。いくつかの場合、接触によって、バックグラウンド集団核酸の約０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％をヌクレオチドのドメインに結合させる。いくつかの場合、接触によって、バックグラウンド集団核酸の最大０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％をヌクレオチドのドメインに結合させる。いくつかの場合、接触によって、バックグラウンド集団核酸の少なくとも０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０％をヌクレオチドのドメインに結合させる。

【0124】

オリゴヌクレオチドのコレクションは、サンプル核酸に対して過剰量で提供され得る。サンプル核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は約０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。サンプル核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は最大０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。サンプル核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は少なくとも０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。サンプル核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は、飽和していてもよい。サンプル核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は、非飽和であってもよい。比は、濃度、モルまたは質量の点から計算することができる。

【0125】

オリゴヌクレオチドのコレクションは、対象となる集団の核酸に対して過剰量で提供され得る。対象となる集団の核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は約０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。対象となる集団の核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は最大０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。対象となる集団の核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は少なくとも０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。対象となる集団の核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は、飽和していてもよい。対象となる集団の核酸に対するオリゴヌクレオチドの比は、非飽和であってもよい。比は、濃度、モルまたは質量の点から計算することができる。

【0126】

いくつかの場合、循環核酸または配列決定可能なライブラリーなどの核酸は一本鎖である。いくつかの場合、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性する。核酸は熱を用いて変性することができる。いくつかの場合、核酸を、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９℃に加熱する。いくつかの場合、核酸を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０分間加熱する。いくつかの場合、核酸を、化学的変性剤（例えば、酸、塩基、溶媒、カオトロピック剤、塩）を用いて核酸を変性する。

【0127】

一本鎖核酸サンプル、例えば一本鎖循環核酸または配列決定可能なライブラリーを再生またはハイブリダイズさせることができる。いくつかの場合、一本鎖核酸サンプルをオリゴヌクレオチドのコレクションとハイブリダイズさせる。いくつかの場合、オリゴヌクレオチドのコレクションをブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせる。いくつかの場合、一本鎖核酸の少なくとも一部を再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６８または７０℃で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を氷上で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を室温で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは６０分、または２、３、４、５、１０、１５、２０、２２、２４、３０、４０、４６、４８、５０、６０、７０、７２、８０もしくは９６時間再生またはハイブリダイズさせる。温度、緩衝液組成、反応時間および濃度がハイブリダイゼーションの程度に影響を及ぼし得る。いくつかの場合、トリメチルアンモニウムクロリドの存在下で核酸を再生する。

【0128】

自己ハイブリダイゼーション方法
核酸サンプル内の対象となる集団をプライミング、捕捉または濃縮するためのさらなる方法および組成物も本明細書で提供される。いくつかの場合、対象となる集団を、自己ハイブリダイゼーション方法、例えば濃度に基づくハイブリダイゼーション速度論を利用する方法によって濃縮する。核酸ハイブリダイゼーション速度論は、ハイブリダイズする鎖の濃度に依存する。一般に、高濃度の核酸は低濃度の核酸よりも速くハイブリダイズする。核酸の複雑な集団では、豊富な核酸（例えば、バックグラウンド集団）が希少な核酸（例えば、対象となる集団）よりも速くハイブリダイズする。この濃度依存性を使用して、核酸の集団の部分的ハイブリダイゼーション後に、二本鎖核酸の少なくとも一部を除去するまたは一本鎖核酸の少なくとも一部を単離することによって豊富な核酸の量を減少させ、サンプル中の希少な核酸の量を濃縮ことができる。結果として、バックグラウンド集団（例えば、ヒト）核酸の量を減少させることができ、対象となる集団（例えば、非ヒト、微生物または病原体）核酸の量を濃縮することができる。

【0129】

いくつかの場合、バックグラウンド集団ＤＮＡ（例えば、ヒトＤＮＡ）および対象となる集団ＤＮＡ（例えば、非ヒトまたは病原体ＤＮＡ）を含むＤＮＡのサンプル（例えば、循環ＤＮＡまたは循環無細胞ＤＮＡ）が得られる。サンプル中の核酸を変性して一本鎖ＤＮＡのサンプルを作製することができる。いくつかの場合、サンプル中の核酸は一本鎖ＤＮＡであり、変性が不要である。いくつかの場合、次いで、バックグラウンド集団ＤＮＡが対象となるＤＮＡの集団よりも高濃度で存在するので、バックグラウンド集団ＤＮＡが対象となる集団ＤＮＡより速くハイブリダイズすると期待して、サンプルを定義された緩衝液中で定義された期間再生する。次いで、サンプルを、二本鎖特異的ヌクレアーゼを用いるなどして、二本鎖ＤＮＡを除去する条件に供し、それによって、サンプル中のバックグラウンド集団ＤＮＡを優先的に除去することができる。いくつかの場合、ＲＮＡを含むサンプルを、一本鎖バックグラウンド集団（例えば、ヒト）エクソーム配列の混合物と組み合わせる。いくつかの場合、サンプルを定義された期間再生し、より豊富なエクソーム配列がＲＮＡにハイブリダイズすることを可能にする。次いで、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖を除去し、それによって、サンプル中のバックグラウンド集団（例えば、ヒト）ＲＮＡを優先的に除去する。

【0130】

いくつかの場合、循環核酸などの核酸は一本鎖である。いくつかの場合、二本鎖核酸を一本鎖核酸に変性する。いくつかの場合、核酸の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は一本鎖である。いくつかの場合、核酸の最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は一本鎖である。いくつかの場合、核酸の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％は一本鎖である。核酸は熱を用いて変性することができる。いくつかの場合、核酸を、約３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９℃に加熱する。いくつかの場合、核酸を、最大３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９℃に加熱する。いくつかの場合、核酸を、少なくとも３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９℃に加熱する。いくつかの場合、核酸を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０分間加熱する。いくつかの場合、核酸を、最大０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０分間加熱する。いくつかの場合、核酸を、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０または６０分間加熱する。いくつかの場合、核酸を、化学的変性剤（例えば、酸、塩基、溶媒、カオトロピック剤、塩）を用いて核酸を変性する。

【0131】

一本鎖核酸サンプル、例えば一本鎖循環核酸を再生またはハイブリダイズさせることができる。いくつかの場合、一本鎖核酸の少なくとも一部を再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、一本鎖核酸の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、一本鎖核酸の最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、一本鎖核酸の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、約０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６８または７０℃で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、最大０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６８または７０℃で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、少なくとも０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、４０、４５、５０、５５、６０、６５、６８または７０℃で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を氷上で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を室温で再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは６０分、または２、３、４、５、１０、１５、２０、２２、２４、３０、４０、４６、４８、５０、６０、７０、７２、８０もしくは９６時間再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、最大０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは６０分、または２、３、４、５、１０、１５、２０、２２、２４、３０、４０、４６、４８、５０、６０、７０、７２、８０もしくは９６時間再生またはハイブリダイズさせる。いくつかの場合、核酸を、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０もしくは６０分、または２、３、４、５、１０、１５、２０、２２、２４、３０、４０、４６、４８、５０、６０、７０、７２、８０もしくは９６時間再生またはハイブリダイズさせる。温度、緩衝液組成、反応時間および濃度がハイブリダイゼーションの程度に影響を及ぼし得る。いくつかの場合、トリメチルアンモニウムクロリドの存在下で核酸を再生する。

【0132】

再生時に、一本鎖核酸は、二本鎖核酸にハイブリダイズまたは再アニーリングすることができる。いくつかの場合、二本鎖核酸は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖である。二本鎖核酸の少なくとも一部を除去して、核酸の濃縮集団を生成することができる。いくつかの場合、二本鎖核酸の約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を除去する。いくつかの場合、二本鎖核酸の最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を除去する。いくつかの場合、二本鎖核酸の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を除去する。

【0133】

いくつかの場合、二本鎖核酸の少なくとも一部を除去して、核酸の濃縮集団を生成する。いくつかの場合、一本鎖核酸の少なくとも一部を単離して、核酸の濃縮集団を生成する。いくつかの場合、二本鎖核酸の少なくとも一部を、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などの分離方法を用いて除去する。いくつかの場合、一本鎖核酸の少なくとも一部を、ゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などの分離方法を用いて単離する。いくつかの場合、二本鎖核酸の少なくとも一部を、１種または複数のヌクレアーゼを用いて除去する。いくつかの場合、ヌクレアーゼは二本鎖核酸に作用する。いくつかの場合、ヌクレアーゼは二本鎖ＤＮＡに作用する。いくつかの場合、ヌクレアーゼはＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖に作用する。いくつかの場合、ヌクレアーゼは一本鎖核酸に作用しない。いくつかの場合、ヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡに作用しない。いくつかの場合、ヌクレアーゼは一本鎖ＲＮＡに作用しない。ヌクレアーゼのいくつかの非限定的な例としては、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）（例えば、カムチャッカクラブ由来）、熱不安定性ＤＳＮ−ＴＬ、ＢＡＬ−３１、二本鎖特異的ＤＮアーゼ（例えば、ホッコクアカエビ、パンダラス・ボレアリス（Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ）由来）、エキソヌクレアーゼＩＩＩおよび分泌エンドヌクレアーゼ（例えば、ネッタイイエカ（Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）由来）が挙げられる。温度、緩衝液組成、反応時間、濃度およびヌクレアーゼ対基質の比がヌクレアーゼ特異性または活性に影響を及ぼし得る。例えば、ホッコクアカエビ由来の二本鎖特異的ＤＮアーゼの基質選好は、マグネシウムの存在下では二本鎖ＤＮＡであると報告されているが、ヌクレアーゼは、カルシウムの存在下では一本鎖ＤＮＡに対して活性になる（Ｎｉｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．‘‘Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｔｈｅｒｍｏｌａｂｉｌｅ ａｎｄ Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮａｓｅ ｆｒｏｍ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｓｈｒｉｍｐｓ （Ｐａｎｄａｌｕｓ ｂｏｒｅａｌｉｓ） ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ２０１０）。ヌクレアーゼの組み合わせは、直列または並列で使用することができる。いくつかの場合、核酸をヌクレアーゼ処理後に精製して、緩衝液組成を置き換える、ならびに／あるいはヌクレアーゼ、ヌクレオチドおよび／または短い核酸断片を除去する。

【0134】

いくつかの場合、核酸を含むサンプルを、一本鎖バックグラウンド集団（例えば、ヒト）核酸の混合物と組み合わせる。サンプルを所定の期間再生して、より豊富なバックグラウンド集団核酸がサンプル中の核酸にハイブリダイズすることを可能にする。次いで、二本鎖核酸を除去し、それによって、サンプル中のバックグラウンド集団（例えば、ヒト）核酸を優先的に除去する。いくつかの場合、サンプルはＲＮＡを含む。いくつかの場合、二本鎖核酸はＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖である。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸はエクソーム配列である。いくつかの場合、枯渇は、バックグラウンド集団核酸がサンプル内の相補的またはほぼ相補的なバックグラウンド集団にハイブリダイズまたは特異的に結合するように、核酸を含むサンプルをバックグラウンド集団核酸と接触させることによって達成される。いくつかの場合、本方法は、バックグラウンド集団核酸の少なくとも一部を例えば熱によって変性させるステップをさらに含む。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸配列を生物情報学的または計算的に同定することができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸は合成される。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸はＤＮＡである。

【0135】

バックグラウンド集団核酸は、サンプル核酸に対して過剰量で提供され得る。バックグラウンド集団核酸とサンプル核酸の比は約０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。バックグラウンド集団核酸とサンプル核酸の比は最大０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。バックグラウンド集団核酸とサンプル核酸の比は少なくとも０．１；０．２；０．３；０．４；０．５；０．６；０．７；０．８；０．９；１．０；１．１；１．２；１．３；１．４；１．５；１．６；１．７；１．８；１．９；２．０；２．５；３．０；３．５；４．０；４．５；５．０；５．５；６．０；６．５；７．０；７．５；８．０；８．５；９．０；９．５；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；５５；６０；６５；７０；７５；８０；８５；９０；９５；１００；２００；３００；４００；５００；６００；７００；８００；９００；１０００；２０００；３０００；４０００；５０００；６０００；７０００；８０００；９０００；または１００００であり得る。サンプル核酸に対するバックグラウンド集団の比は、飽和していてもよい。サンプル核酸に対するバックグラウンド集団の比は、非飽和であってもよい。比は、濃度、モルまたは質量の点から計算することができる。

【0136】

いくつかの場合、二本鎖核酸の少なくとも一部を除去して、核酸の濃縮集団を生成する。バックグラウンド集団核酸を、化学的に標識および除去し、それによって、二本鎖核酸を除去することができる。バックグラウンド集団核酸を磁気ビーズにコンジュゲートさせ、磁石で除去し、それによって、二本鎖核酸を除去することができる。バックグラウンド集団核酸を核酸標識で標識することができる。核酸標識は、固体支持体にコンジュゲートしている、または化学標識でタグ付けされている核酸配列に結合またはハイブリダイズすることができる。二本鎖核酸は、サイズ分離（例えば、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等）、親和性分離（例えば、プルダウンアッセイ、クロマトグラフィー等）、または他の方法によって除去することができる。いくつかの場合、二本鎖核酸を、ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動またはクロマトグラフィーなどの分離方法を使用して、一本鎖核酸と二本鎖核酸のサイズの差異に基づいて単離することができる。いくつかの場合、ハイブリダイズしていないバックグラウンド集団核酸を除去しない。

【0137】

ヌクレオソーム枯渇による濃縮
本明細書で提供される濃縮方法の別の例は、ヌクレオソーム枯渇法である。精製されたヒト無細胞ＤＮＡは、図６に示されるように、約１８０塩基対の長さ周期性を有し、ヒト無細胞ＤＮＡの大部分がヌクレオソームに会合したヒストンであることを示唆している。細菌ＤＮＡは、図６に示されるように、特定の長さ周期性を示さない。ヌクレオソームまたはヌクレオソーム会合ＤＮＡを枯渇させることによって、対象となる集団を濃縮する方法を提供することができる。

【0138】

いくつかの場合、遊離ＤＮＡ（例えば、非ヌクレオソームＤＮＡまたは非ヌクレオソーム会合ＤＮＡ）からヌクレオソームＤＮＡまたはヌクレオソーム会合ＤＮＡを分離する方法には、質量および／または正味の電荷に基づいて分離する電気泳動および等速電気泳動、形状および／またはサイズに基づいて分離する多孔質フィルタ、電荷に基づいて分離するイオン交換カラム（ヌクレオソームは正に荷電した尾部を有するヒストンを有し、ＤＮＡは負に荷電した主鎖を有する）、ならびに宿主ヌクレオソームおよび会合ＤＮＡを免疫枯渇させる宿主ヒストンに特異的な抗体が含まれる。いくつかの場合、宿主核酸の一部はヌクレオソーム会合しており、宿主核酸の一部はヌクレオソーム会合していない。

【0139】

いくつかの場合、図７に示されるように、１つまたは複数の抗体を使用してヒストンまたはヌクレオソームを免疫枯渇させることができる。いくつかの場合、抗体（７５０）は、バックグラウンド集団（例えば、宿主）ヒストンまたはヌクレオソーム（７１０）に特異的であり得る。いくつかの場合、抗体は、哺乳動物ヒストンまたはヌクレオソームに特異的であり得る。いくつかの場合、抗体はヒトヒストンまたはヒトヌクレオソームに特異的であり得る。いくつかの場合、１つまたは複数の抗体は１つまたは複数のヒストンに特異的である。いくつかの場合、ヒストンはヒストン変異体であっても、ヒストン修飾を有していてもよい。いくつかの場合、免疫枯渇は、対象となる集団（例えば、非宿主）ヌクレオソームＤＮＡ（７３０）、対象となる非ヌクレオソームＤＮＡの集団（７４０）およびバックグラウンド集団（例えば、宿主）非ヌクレオソームＤＮＡ（７２０）を保持し得る。いくつかの場合、免疫枯渇は、免疫沈降、クロマチン免疫沈降、抗体のバルク結合またはカラム固定化抗体によるアフィニティークロマトグラフィーを含み得る。いくつかの場合、１つまたは複数の抗体がカラム上に固定化される。いくつかの場合、１つまたは複数抗体が（例えば、ビーズにコンジュゲートされたまたはカラムに付着された抗免疫グロブリン抗体を使用して）除去される。いくつかの場合、１つまたは複数の抗体はモノクローナルである。いくつかの場合、１つまたは複数の抗体は、１つまたは複数のヒストンのＣ末端を標的化する。いくつかの場合、１つまたは複数の抗体は、１つまたは複数のヒストンのＮ末端を標的化する。

【0140】

ヒストン、ヒストン変種およびヒストン修飾型の非限定的な例としては、ヒストンＨ２Ａ Ｎ末端、ヒストンＨ２Ａ溶媒露出エピトープ、ヒストンＨ３中のＬｙｓ９上のモノメチル化、ヒストンＨ３中のＬｙｓ９上のジメチル化、ヒストンＨ３中のＬｙｓ５６上のトリメチル化、ヒストンＨ２Ｂ中のＳｅｒ１４上のリン酸化、ヒストンＨ２Ａ．Ｘ中のＳｅｒ１３９上のリン酸化、Ｈ２Ａ−Ｈ２Ｂ酸性パッチモチーフ、ヒストンＨ１、ヒストンＨ１．０、ヒストンＨ１．１、ヒストンＨ１．２、ヒストンＨ１．３、ヒストンＨ１．４、ヒストンＨ１．５、ヒストンＨ１．ｏｏ、精子細胞特異的リンカーヒストンＨ１様タンパク質、ヒストンＨ１ｔ、ヒストンＨ１ｔ２、ヒストンＨ１ＦＮＴ、ヒストンＨ２Ａタイプ１−Ｂ／Ｅ（例えば、ヒストンＨ２Ａ．２、ヒストンＨ２Ａ／ａ、ヒストンＨ２Ａ／ｍ）、ヒストンＨ２Ａタイプ２−Ａ（例えば、ヒストンＨ２Ａ．２、ヒストンＨ２Ａ／ｏ）、ヒストンＨ２Ａタイプ１−Ｄ（例えば、ヒストンＨ２Ａ．３、ヒストンＨ２Ａ／ｇ）、ヒストンＨ２Ａタイプ１（例えば、Ｈ２Ａ．１、ヒストンＨ２Ａ／ｐ）、ヒストンＨ２Ａタイプ２−Ｃ（例えば、ヒストンＨ２Ａ−ＧＬ１０１、ヒストンＨ２Ａ／ｑ）、ヒストンＨ２Ａタイプ１−Ａ（例えば、ヒストンＨ２Ａ／ｒ）、ヒストンＨ２Ａタイプ１−Ｃ（例えば、ヒストンＨ２Ａ／ｌ）、ヒストンＨ２Ａタイプ１−Ｈ（例えば、ヒストンＨ２Ａ／ｓ）、ヒストンＨ２Ａタイプ１−Ｊ（例えば、ヒストンＨ２Ａ／ｅ）、ヒストンＨ２Ａタイプ２−Ｂ、ヒストンＨ２Ａタイプ３、ヒストンＨ２ＡＸ（例えば、Ｈ２ａ／ｘ、ヒストンＨ２Ａ．Ｘ、ヒストンＨ２Ａ．Ｚ、Ｈ２Ａ／ｚ、Ｈ２Ａ．Ｚ．１、Ｈ２Ａ．Ｚ．２））、ヒストンＨ２Ａ．Ｖ（例えば、Ｈ２Ａ．Ｆ／Ｚ）、ヒストンＨ２Ａ．Ｊ（例えば、Ｈ２ａ／ｊ）、ｍＨ２Ａ１、ｍＨ２Ａ２、ヒストンＨ２Ａ−Ｂｂｄタイプ１（例えば、Ｈ２Ａバー小体欠損、Ｈ２Ａ．Ｂｂｄ）、ヒストンＨ２Ａ−Ｂｂｄタイプ２／３（例えば、Ｈ２Ａバー小体欠損、Ｈ２Ａ．Ｂｂｄ）、コアヒストンマクロＨ２Ａ．１（例えば、ヒストンマクロＨ２Ａ１、ｍＨ２Ａ１、ヒストンＨ２Ａ．ｙ、Ｈ２Ａ／ｙ、髄芽腫抗原ＭＵ−ＭＢ−５０．２０５、マクロＨ２Ａ）、コアヒストンマクロＨ２Ａ．２、ヒストンＨ２Ａ、ヒストンＨ２Ａ．Ｊ、ヒストンＨ２Ｂ、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．１Ａ、ヒストンＨ２Ｂ．ａ、Ｈ２Ｂ／ａ、ヒストンＨ２Ｂ．ｇ、Ｈ２Ｂ／ｇ、ヒストンＨ２Ｂ．ｈ、Ｈ２Ｂ／ｈ、ヒストンＨ２Ｂ．ｋ、Ｈ２Ｂ／ｋ、ヒストンＨ２Ｂ．ｌ、Ｈ２Ｂ／Ｉ）、Ｈ２ＢＥ、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｈ、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ａ（例えば、精巣由来のヒストンＨ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ．１、精巣特異的ヒストンＨ２Ｂ、ＴＳＨ２Ｂ）、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｂ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．１、ヒストンＨ２Ｂ．ｆ、Ｈ２Ｂ／ｆ）、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｄ（例えば、ＨＩＲＡ相互作用タンパク質２、ヒストンＨ２Ｂ．１Ｂ、ヒストンＨ２Ｂ．ｂ、Ｈ２Ｂ／ｂ）、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｊ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．１、ヒストンＨ２Ｂ．ｒ、Ｈ２Ｂ／ｒ））、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｏ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．２、ヒストンＨ２Ｂ．ｎ、Ｈ２Ｂ／ｎ）、ヒストンＨ２Ｂタイプ２−Ｅ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ−ＧＬ１０５、ヒストンＨ２Ｂ．ｑ、Ｈ２Ｂ／ｑ）、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｈ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．ｊ、Ｈ２Ｂ／ｊ））、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｍ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．ｅ、Ｈ２Ｂ／ｅ）、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｌ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．ｃ、Ｈ２Ｂ／ｃ）、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｎ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．ｄ、Ｈ２Ｂ／ｄ）、ヒストンＨ２ＢタイプＦ−Ｓ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．ｓ、Ｈ２Ｂ／ｓ）、推定上のヒストンＨ２Ｂタイプ２−Ｃ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．ｔ、Ｈ２Ｂ／ｔ）、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｋ（例えば、Ｈ２Ｂ Ｋ、ＨＩＲＡ相互作用タンパク質１）、ヒストンＨ２Ｂタイプ２−Ｆ、ヒストンＨ２Ｂタイプ２−Ｅ、ヒストンＨ２Ｂタイプ３−Ｂ（例えば、Ｈ２Ｂタイプ１２）、ヒストンＨ２ＢタイプＦ−Ｍ（例えば、ヒストンＨ２Ｂ．ｓ、Ｈ２Ｂ／ｓ）、推定上のヒストンＨ２Ｂタイプ２−Ｄ、ヒストンＨ２ＢタイプＷ−Ｔ（例えば、Ｈ２ＢヒストンファミリーメンバーＷ精巣特異的）、ヒストン１Ｈ２ｂｎアイソフォームＣＲＡ＿ｂ、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｎ、Ｈ２ＢヒストンファミリーメンバーＭ、ヒストンＨ２ＢタイプＦ−Ｍ、ヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｊ、Ｈ２ＢＦＷＴ、ヒストンＨ３、ヒストンＨ３．１（例えば、ヒストンＨ３／ａ、ヒストンＨ３／ｂ、ヒストンＨ３／ｃ、ヒストンＨ３／ｄ、ヒストンＨ３／ｆ、ヒストンＨ３／ｈ、ヒストンＨ３／ｉ、ヒストンＨ３／ｊ、ヒストンＨ３／ｋ、ヒストンＨ３／ｌ）、ヒストンＨ３．２（例えば、ヒストンＨ３／ｍ、ヒストンＨ３／ｏ）、ヒストンＨ３．３Ｃ（例えば、ヒストンＨ３．５）、ヒストンＨ３．１ｔ（例えば、Ｈ３／ｔ、Ｈ３ｔ、Ｈ３／ｇ）、ヒストンＨ３．３、ヒストンＨ３様セントロメアタンパク質Ａ（例えば、セントロメア自己抗原Ａ、セントロメアタンパク質Ａ、ＣＥＮＰ−Ａ）、ヒストンＨ３．３（ｃＤＮＡ ＦＬＪ５７９０５）、ヒストンＨ３．４、ヒストンＨ３．５、ヒストンＨ３．Ｘ、ヒストンＨ３．Ｙ、ヒストンＨ４、ヒストンＨ４様タンパク質タイプＧ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｊタンパク質、ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）Ｈ４ヒストンファミリーメンバーＮおよびヒストンＨ５が挙げられる。

【0141】

本方法は、バックグラウンド集団のヌクレオソーム会合ＤＮＡを枯渇させ得る。バックグラウンド集団のヌクレオソーム会合ＤＮＡを約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％枯渇させることができる。バックグラウンド集団のヌクレオソーム会合ＤＮＡを最大５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％枯渇させることができる。バックグラウンド集団のヌクレオソーム会合ＤＮＡを少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％枯渇させることができる。

【0142】

特定の長さ間隔のＤＮＡを除去または単離することによる濃縮
いくつかの場合、本明細書で提供される濃縮方法は、特定の長さ間隔の無細胞ＤＮＡなどの特定の長さ間隔のＤＮＡを除去することおよび／または特定の長さ間隔の無細胞ＤＮＡなどの特定の長さ間隔のＤＮＡを単離することを含む。一例では、無細胞ＤＮＡサンプルにおいて、宿主と非宿主無細胞ＤＮＡの比は、宿主と非宿主ＤＮＡの比が極小となり得る無細胞ＤＮＡ長範囲が存在し得るよういくらかの予測性をもって有意に変化し得る。無細胞サンプル中の非宿主ＤＮＡを分析することに関心がある場合、非宿主ＤＮＡと宿主ＤＮＡの比がより好ましいＤＮＡ長範囲を濃縮することによって、宿主ＤＮＡに対して非宿主ＤＮＡを濃縮することができる。例として、図６は、上のバーが宿主またはヒトＤＮＡを反映し、下のバーが非宿主ＤＮＡを表す、ヒト由来サンプルにおいてＤＮＡ長を比較するプロットを示している。多くの場合、ヒトＤＮＡとヒストンの会合は、約１７５塩基長で生じる第１のサイズの断片ならびに約１４７塩基長である断片（すなわち、単一のヒストンコアに巻き付けられたＤＮＡ長を反映する）をもたらす。図６に示されるように、ピークは、他の断片長でも同様に極大および極小を提供するヒトＤＮＡのサイズ分布を示す。

【0143】

宿主と非宿主ＤＮＡ比が例えば、示されるように低い点にあるサイズ範囲、例えば、約１２０ｂｐ未満、約２４０〜約２８０ｂｐ、または約４２５〜約４７５ｂｐの長さを選択することによって、非宿主ＤＮＡを比較的濃縮することができる。したがって、本開示の一定の態様によると、無細胞核酸サンプルが、宿主核酸よりも非宿主核酸を濃縮するために、比較的短い断片について濃縮される。多くの場合、濃縮工程は、約１０塩基長〜約３００塩基長、約１０塩基長〜約２００塩基長、約１０塩基長〜約１７５塩基長、約１０塩基長〜約１５０塩基長、約１０塩基長〜１２０塩基長、約１０塩基長〜約６０塩基長、約３０塩基長〜約３００塩基長、約３０塩基長〜約２００塩基長、約３０塩基長〜約１７５塩基長、約３０塩基長〜約１５０塩基長、約３０塩基長〜１２０塩基長、または約３０塩基長〜約６０塩基長の長さの断片を濃縮する。認識されるように、選択工程の上限および下限の選択は、上記のサイズ選択の下限および上限のいずれかを目標とすることができる。理解されるように、上記のサイズ選択は、正確なサイズを列挙することを意図するものではなく、記載される断片サイズの周りの通常のサイズ分布を含む上記の範囲の周りのサイズ選択に焦点を当てるものである。例として、所与の断片サイズ範囲を選択すると列挙される場合、濃縮サンプル内の優勢なサイズ範囲がその範囲に入る、例えば濃縮サンプル中の断片の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％またはいくつかの場合、少なくとも９０％が列挙されるサイズ範囲を反映すると認識される。他の場合、濃縮サンプル中の反映される断片が、列挙される範囲の上限および下限の実質的に約３０％以下外側、範囲の上限および下限の２０％以下、１０％以下およびいくつかの場合５％以下外側にある断片を含むと認識される。

【0144】

このような方法では、対象となる集団（例えば、病原体）ＤＮＡおよびバックグラウンド集団（例えば、ヒト）ＤＮＡを含む核酸のサンプル（例えば、循環ＤＮＡのサンプル）が得られる。いくつかの場合、特定の長さ間隔のＤＮＡを、バックグラウンド集団ＤＮＡについて濃縮し、サンプルから枯渇させ、それによって、対象となる集団のＤＮＡについて優先的に濃縮することができる。いくつかの場合、特定の長さ間隔のＤＮＡを、対象となる集団のＤＮＡについて濃縮し、サンプルから単離し、それによって、対象となる集団のＤＮＡについて優先的に濃縮することができる。いくつかの場合、特定の長さ間隔のＤＮＡを除去および／または単離する方法には、電気泳動（例えばゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動）、クロマトグラフィー（例えば液体クロマトグラフィー）、無細胞核酸精製（例えばシリカ膜カラム、緩衝液最適化）ならびに／あるいは質量、サイズおよび／または正味電荷に基づいて分離する質量分析が含まれる。

【0145】

いくつかの場合、無細胞核酸精製をシリカ膜（例えば、ＱＩＡａｍｐ Ｍｉｎｉカラムなどのシリカ膜カラム）または市販のキット（例えば、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ）を使用して行うことができる。一般に、無細胞核酸精製は、溶解、結合、洗浄および溶出の４つのステップを含む。

【0146】

溶解ステップは、タンパク質、脂質および／または小胞から核酸を放出し、ＤＮアーゼおよび／またはＲＮアーゼを不活性化し、変性条件下、高温で、および／またはプロテイナーゼＫの存在下で行うことができる。溶解ステップは緩衝液ＡＣＬおよび／またはプロテイナーゼＫを使用することができる。

【0147】

結合ステップにより、核酸をシリカ膜上に結合または吸着させることができる。結合ステップは、緩衝液ＡＣＢまたは約もしくは少なくとも約３５体積％、４０体積％、４５体積％、５０体積％、５５体積％、６０体積％、６５体積％、６６体積％、７０体積％もしくは７５体積％のアルコール（例えば、イソプロパノール）を含む結合緩衝液、例えば、約４０％もしくは約６６％のイソプロパノールを含む結合緩衝液を使用することができる。いくつかの場合、無細胞核酸精製の間に、製造業者の推奨プロトコルと比較してさらなる市販の緩衝液（例えば、緩衝液ＡＣＢ）を使用する。例えば、いくつかの場合、添加されるさらなる市販の緩衝液の体積は、製造業者の推奨プロトコルで指定される体積の約または少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０または１０．０倍である。いくつかの場合、１シリカ膜カラム当たりまたはサンプル（例えば、血清もしくは血漿）１ｍＬからの溶解液当たり、約または少なくとも約１．５、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、５．０、５．３、５．４、５．５、６．０、７．０、８．０、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０、１５．０または１６．０ｍＬの結合緩衝液または緩衝液ＡＣＢを使用する。

【0148】

洗浄ステップは、残留汚染物質を除去することができ、複数の洗浄ステップを含むことができる。洗浄ステップは、緩衝液ＡＣＷ１、緩衝液ＡＣＷ２、エタノールならびに／あるいは約または少なくとも約５０体積％、５５体積％、５６．８体積％、６０体積％、６５体積％、６６体積％、６９．８体積％、７０体積％、７５体積％、８０体積％、８５体積％、８６体積％、８７体積％、８７．４体積％、８８体積％、８９体積％、９０体積％、９５体積％、９６体積％、９７体積％、９８体積％、９９体積％または１００体積％のアルコール（例えばエタノール）を含む洗浄緩衝液、例えば、約５６．８％、約６９．８％、約８７．４％、約８９％または約１００％のエタノールを含む洗浄緩衝液を使用することができる。いくつかの場合、エタノールは９６〜１００％エタノールを指し得る。いくつかの場合、エタノールは変性アルコールではない。いくつかの場合、エタノールはメタノールもメチルエチルケトンも含有しない。いくつかの場合、洗浄ステップは、緩衝液ＡＣＷ１（例えば、１シリカ膜カラム当たり６００μＬ）による第１の洗浄ステップ、緩衝液ＡＣＷ２（例えば、１シリカ膜カラム当たり７５０μＬ）による第２の洗浄ステップおよびエタノール（例えば、１シリカ膜カラム当たり７５０μＬ）による第３の洗浄ステップを含み得る。いくつかの場合、無細胞核酸精製の間に、製造業者の推奨プロトコルと比較してさらなるエタノール（例えば、無水エタノール）を市販の緩衝液（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＡＣＷ１緩衝液、ＡＣＷ２緩衝液）に添加する。例えば、いくつかの場合、添加されるさらなるエタノールの体積は、市販の緩衝液６００μＬまたは７５０μＬ当たり、約または少なくとも約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．７５、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０または１０．０ｍＬである。いくつかの場合、添加されるさらなるエタノールの体積は、市販の緩衝液６００μＬまたは７５０μＬ当たり、最大０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．０５、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．７５、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０または１０．０ｍＬである。

【0149】

いくつかの場合、無細胞核酸精製の間に、製造業者の推奨プロトコルと比較してさらなる塩化グアニジニウムを市販の緩衝液（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＡＣＷ１緩衝液）に添加する。例えば、いくつかの場合、添加されるさらなる塩化グアニジニウムの量は、市販の緩衝液６００μＬ当たり、約または少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、１．９または２．０ｇである。いくつかの場合、添加されるさらなる塩化グアニジニウムの量は、市販の緩衝液または洗浄緩衝液６００μＬ当たり、最大０．１、０．２、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、１．９または２．０ｇである。いくつかの場合、洗浄緩衝液は、洗浄緩衝液６００μＬ当たり、約または少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７５、１．８、１．９または２．０ｇの塩化グアニジニウムを含むことができる。

【0150】

いくつかの場合、無細胞核酸精製の間に、製造業者の推奨プロトコルと比較してさらなるエタノール（例えば、無水エタノール）およびさらなる塩化グアニジニウムを市販の緩衝液（例えば、Ｑｉａｇｅｎ ＡＣＷ１緩衝液）に添加する。いくつかの場合、洗浄ステップは、塩化グアニジニウムおよび約８９．０％エタノールを含む第１の洗浄緩衝液による第１の洗浄ステップ、約８７．４％エタノールを含む第２の洗浄緩衝液による第２の洗浄ステップ、ならびにエタノールによる第３の洗浄ステップを含み得る。いくつかの場合、各洗浄緩衝液は少なくとも約６０％、６５％、６６％、６９．８％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％または８７．４％のエタノールを含む。

【0151】

溶出ステップにより核酸をシリカ膜から放出することができる。溶出にはＢｕｆｆｅｒ ＡＶＥを使用することができる。

【0152】

例えば、Ｑｉａｇｅｎ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＣＮＡ）キットの製造業者の推奨プロトコルは、以下の修飾によって修飾することができる：（ａ）３倍量のＡＣＢ緩衝液を使用する、（ｂ）ＡＣＷ１緩衝液を製造業者の推奨に従って調製し、ＡＣＷ１緩衝液６００μＬあたりさらに無水エタノール１．７５ｍＬおよび塩化グアニジニウム０．３６ｇを補足し、（ｃ）ＡＣＷ２緩衝液を製造業者の推奨に従って調製し、ＡＣＷ２緩衝液７５０μＬあたり１．０５ｍＬの無水エタノールを補足する。

【0153】

本明細書の他の箇所に記載される、他のヌクレオソーム標的枯渇法に加えて、核酸のサイズ選択／単離の方法は当該技術分野において周知である。例えば、ゲル電気泳動、ゲル排除クロマトグラフィー法などのクロマトグラフィー法を使用して、所望の長さの核酸を選択的に単離することができる。さらに、ビーズに基づく電荷分離法を使用して、所望のサイズ範囲の核酸を選択的に単離することができる。例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから入手可能なＳＰＲＩビーズシステム、および例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なＡＭＰｕｒｅビーズシステムを容易に使用して、上記のように宿主ＤＮＡに対して非宿主ＤＮＡを増幅することができる無細胞ＤＮＡのサイズ選択精製を行うことができる。

【0154】

いくつかの場合、サイズ選択濃縮は、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍およびいくつかの場合、約５００倍またはそれ以上もの非宿主ＤＮＡと宿主ＤＮＡの比の増加をもたらし得る。単なる例示のために、非宿主ＤＮＡが１：１００の宿主ＤＮＡとの比で無細胞サンプル中に存在する場合、２倍の増加をもたらす濃縮は１：５０の比を生じるであろう。いくつかの場合、非宿主ＤＮＡと宿主ＤＮＡの比の増加は、約１．５倍、２倍、３倍、４倍または５倍、および約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍またはそれ以上となる。

【0155】

１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを除去することができる。いくつかの場合、１つまたは複数の長さ間隔は、約１４０塩基対、約１４５塩基対、約１５０塩基対、約１５５塩基対、約１６０塩基対、約１６５塩基対、約１７０塩基対、約１７５塩基対、約１８０塩基対、約１８５塩基対、約１９０塩基対、約１９５塩基対、約２００塩基対、約２０５塩基対および約２１０塩基対であるの１つまたは複数の倍数から選択され得る。いくつかの場合、倍数は、各出現毎に、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０の倍数から独立に選択される。例えば、約１８０塩基対は約１８０塩基対に対して１の倍数であり、約３６０塩基対は約１８０塩基対に対して２の倍数である。いくつかの場合、１つまたは複数の長さ間隔は、約１８０塩基対、約３６０塩基対、約５４０塩基対、約７２０塩基対または約９００塩基対であり得る。

【0156】

１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを単離することができる。いくつかの場合、１つまたは複数の長さ間隔は、約１０塩基対、約２０塩基対、約３０塩基対、約４０塩基対、約５０塩基対、約６０塩基対、約７０塩基対、約８０塩基対、約９０塩基対、約１００塩基対、約１１０塩基対、約１２０塩基対、約１３０塩基対、約１４０塩基対、約１５０塩基対、約１６０塩基対、約１７０塩基対、最大約１０塩基対、最大約２０塩基対、最大約３０塩基対、最大約４０塩基対、最大約５０塩基対、最大約６０塩基対、最大約７０塩基対、最大約８０塩基対、最大約９０塩基対、最大約１００塩基対、最大約１１０塩基対、最大約１２０塩基対、最大約１３０塩基対、最大約１４０塩基対、最大約１５０塩基対、最大約１６０塩基対、最大約１７０塩基対、ならびに約７０塩基対、約７５塩基対、約８０塩基対、約８５塩基対、約９０塩基対、約９５塩基対、約１００塩基対および約１０５塩基対の１つまたは複数の倍数から選択され得る。いくつかの場合、倍数は、各出現毎に、１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７および１９の倍数から独立に選択される。例えば、約９０塩基対は約９０塩基対に対して１の倍数であり、約２７０塩基対は約９０塩基対に対して３の倍数である。いくつかの場合、１つまたは複数の長さ間隔は、約９０塩基対、約２７０塩基対、約４５０塩基対、約６３０塩基対または約８１０塩基対であり得る。

【0157】

方法により１つまたは複数の長さ間隔のＤＮＡを単離または除去することができる。特定の長さ間隔のＤＮＡの約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を単離または除去することができる。特定の長さ間隔のＤＮＡの最大５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を単離または除去することができる。特定の長さ間隔のＤＮＡの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を単離または除去することができる。

【0158】

背景集団枯渇および／または対象となる集団の濃縮ためのエキソソーム
本明細書で提供される濃縮方法のさらに別の例は、対象となる集団（例えば、非宿主）核酸についてサンプルを枯渇させるまたは濃縮するために、宿主から得られた生物学的サンプル内のエキソソーム核酸を標的化することを含む。エキソソームおよび他の細胞外小胞は細胞によって分泌され、生物流体中に存在する。これらは、原形質膜での直接的な出芽によって、または多胞体の身体経路を通して放出され得る。

【0159】

いくつかの場合、対象となる集団（例えば、病原体、非ヒト）核酸は、エキソソームの内部または外部に非対称に分布していてもよい。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸（例えば、ヒト）は、エキソソームの内部または外部に非対称に分布している。対象となる集団（例えば、非宿主、病原体）核酸がエキソソームの外部に存在する場合、本方法は、エキソソームの外部の対象となる集団の核酸を濃縮するために、サンプルからエキソソームを除去することを含み得る。同様に、バックグラウンド集団（例えば、宿主またはヒト）核酸がエキソソーム内に存在する場合、本方法は、エキソソームの外部の対象となる集団核酸を濃縮するためにエキソソームを除去することを含み得る。いくつかの場合、エキソソームを、サンプルから循環核酸などの核酸を単離する前に、生物学的サンプルから単離または除去する。

【0160】

対象となる集団（例えば、微生物または病原体）核酸がエキソソームの内部に存在する場合、本方法は、エキソソームの内部の対象となる集団の核酸を濃縮するために、エキソソームを捕捉することを含み得る。対象となる集団の核酸が白血球（例えば、マクロファージ）内に存在する、または白血球（例えばマクロファージ）によって処理される場合、本方法は、白血球由来エキソソームを抗体で免疫沈降させるなどによって白血球由来のエキソソームを優先的に単離することができる。同様に、バックグラウンド集団（例えば、宿主またはヒト）核酸がエキソソームの外部に存在する場合、本方法は、エキソソームの内部の対象となる集団の核酸を濃縮するために、サンプルからエキソソームを補足することを含み得る。

【0161】

いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸は、エキソソームの内部または外部に非対称に分布している。例えば、ヒト無細胞核酸などのヒト核酸は、エキソソームの内部または外部に非対称に分布していてもよい。一般に、血漿中のヒト無細胞ＲＮＡの大部分は、おそらく血漿中のＲＮアーゼの豊富さのために、エキソソーム内に見出される。循環核酸キットを用いた無細胞ＲＮＡの直接抽出は、無細胞ＲＮＡの分解のために高品質のＲＮＡを生じない可能性がある。エキソソーム単離は、無傷のｍＲＮＡ、１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡを含む良質のＲＮＡを生じ得る。ヒト無細胞ｍＲＮＡの大部分はエキソソーム内に存在し得る。そのため、いくつかの場合、本明細書で提供される方法は、サンプルからヒト無細胞ｍＲＮＡを枯渇させるために、サンプルからエキソソームを枯渇させることを含み得る。対照的に、一般に、おそらくエキソソームはサイトゾルをパッケージ化するため、血漿中の無ヒト細胞ＤＮＡの大部分はエキソソームに存在しない可能性がある。そのため、いくつかの場合、本明細書で提供される方法は、サンプルからヒト無細胞ＤＮＡを枯渇させるために、サンプル中のエキソソームを濃縮することを含み得る。

【0162】

いくつかの場合、本方法は、血漿、単離されたエキソソームおよび／またはエキソソーム枯渇血漿中の対象となる集団とバックグラウンド集団核酸の比を決定することを含み得る。例えば、本方法は、血漿、単離されたエキソソームおよび／またはエキソソーム枯渇血漿中の微生物とヒト核酸の比を決定することを含み得る。いくつかの場合、本方法は、血漿、単離されたエキソソームおよび／またはエキソソーム枯渇血漿中の微生物とヒトＤＮＡの比を決定することを含み得る。いくつかの場合、本方法は、血漿、単離されたエキソソームおよび／またはエキソソーム枯渇血漿中の微生物とヒトＲＮＡの比を決定することを含み得る。いくつかの場合、本方法は、血漿、単離されたエキソソームおよび／またはエキソソーム枯渇血漿中の対象となる集団の核酸の量、パーセントまたは濃度を決定することを含み得る。

【0163】

対象となる集団の核酸が白血球（例えば、マクロファージ）内に存在する、または白血球（例えばマクロファージ）によって処理される場合、本方法は、白血球由来エキソソームを抗体で免疫沈降させるなどによって白血球由来のエキソソームを優先的に単離することができる。微生物または病原体核酸が白血球内に存在する、または白血球によって処理される場合、本方法は、白血球由来エキソソームを抗体で免疫沈降させるなどによって白血球由来のエキソソームを優先的に単離することができる。いくつかの場合、本方法は、哺乳動物白血球（例えば、マクロファージ）に由来するエキソソームを濃縮することを含み得る。いくつかの場合、本方法は、ヒト白血球（例えば、マクロファージ）に由来するエキソソームを濃縮することを含み得る。いくつかの場合、本方法は、宿主白血球（例えば、マクロファージ）に由来するエキソソームを濃縮することを含み得る。エキソソームは血流に再侵入するが、ほとんどのマクロファージはしないので、本方法は深部組織感染症に関する情報にアクセスすることができる。

【0164】

方法によりエキソソームを単離または除去することができる。エキソソームの約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を単離または除去することができる。エキソソームの最大５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を単離または除去することができる。エキソソームの少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％を単離または除去することができる。エキソソームを血漿から単離するために利用可能なキットおよびプロトコルのいくつかの非限定的な例としては、Ｅｘｏ−Ｓｐｉｎ血液エキソソーム精製キット（Ｃｅｌｌ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ｅｘｏＲＮｅａｓｙ血清／血漿キット（Ｑｉａｇｅｎ）、全エキソソーム単離試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｅｘｏ−Ｆｌｏｗエキソソーム免疫精製（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＭＥキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｖｎ９６ペプチド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ）、ＰｕｒｅＥｘｏエキソソーム単離キット（１０１ Ｂｉｏ）および血漿／血清循環およびエキソソームＲＮＡ精製キット（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ）が挙げられる。

【0165】

標的宿主ＤＮＡ枯渇
いくつかの場合、無細胞サンプル中の宿主核酸の枯渇は、そのいずれかが宿主または非宿主核酸の１つに特異的となり得る特異的配列、配列構造または核酸特性もしくは修飾を標的とすることを利用することができる。例えば、宿主または非宿主核酸の１つに対して結合、引き抜き、沈降、消化、または除去もしくは選択するための機構として、特定の配列モチーフ、構造、塩基修飾等を標的とすることができる。例として、多くの場合、ヒト核酸は、非宿主または病原体関連核酸に反映され得ない塩基修飾を含み得る。このような修飾には、例えば、シトシンメチル化などのメチル化パターンが含まれる。例えば、メチル−シトシンは高等生物のＣｐＧアイランドに見出され得る。いくつかの真核生物病原体に存在するが、その存在は、他の生物と比較して、脊椎動物においてかなり高い。

【0166】

いくつかの場合、メチル化モチーフに特異的なエンドヌクレアーゼ（例えば、ＭｃｒＢＣ、ＦｓｐＥＩ、ＬｐｎＰＩ、ＭｓｐＪＩエンドヌクレアーゼ）を用いて、これらのタイプの修飾を標的とすることができる。これらのエンドヌクレアーゼは、通常、消化を行うために近接した２つの塩基修飾を必要とする。分離は、５０ｂｐ〜３ｋｂｐの任意の長さ、例えば少なくとも５０ｂｐ、少なくとも６０ｂｐ、少なくとも７０ｂｐ、少なくとも８０ｂｐ、少なくとも９０ｂｐ、少なくとも１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１ｋｂｐ、少なくとも１．５ｋｂｐ、少なくとも２ｋｂｐ、少なくとも２．５ｋｂｐまたは少なくとも３ｋｂｐであり得る。大部分は１４７〜１７５ｂｐ長であるので、これはヒトｃｆＤＮＡ断片の悪い消化効率をもたらし得る。これは、配列決定ライブラリーの調製中にライゲーションステップで提供される２つのアダプターのうちの１つにパートナー塩基修飾を導入することによって改善することができる。例えば、元のヒトｃｆＤＮＡ断片中にメチルシトシンが１つしか存在しない場合でも、Ｐ５配列担持アダプターは、ライゲーション後のＭｃｒＢＣ消化を刺激するためにＣｐＧアイランドにメチル−シトシンを含むことができる。したがって、いくつかの場合、「ヘルパー」修飾塩基を、配列ライブラリーを調製する際に使用されるアダプター配列内にメチル化塩基を含めることによって、配列ライブラリーに人工的に導入することができる。よって、宿主由来ライブラリー要素を予め消化しながら、非宿主由来ライブラリー要素が増幅および配列決定を進行するのを可能にするために、消化ステップを配列断片へのアダプターライゲーションの後に使用することができるだろう。

【0167】

代替または追加の手法では、このような要求される分離距離よりも長い配列を選択的または優先的に消化するために、このような部位の２つ以上の間にスペーシングを要求し得るペアの認識配列を使用することができる。例えば、５０塩基以上離れた（例えば、５０ｂｐ〜約３ｋｂｐ）２個のメチル化シトシンを認識し得るＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼの場合、いずれかの末端に結合したアダプター配列にメチル化塩基を提供することができる。結果として、対向するアダプター上のメチル化塩基の間に５０塩基超を維持する断片は、ＭｃｒＢＣエンドヌクレアーゼによって消化され、本明細書の他の箇所に記載されているように、非宿主断片の濃縮がより大きくなる短い核酸断片についてサンプルをの濃縮するだろう。

【0168】

複合濃縮手法
前記濃縮スキームは個々に記載されているが、前記の方法のいずれかまたは全てを、宿主ＤＮＡに対してサンプル中の非宿主ＤＮＡを濃縮することにおいて種々の組み合わせで使用することができることが認識されるであろう。例えば、無細胞サンプルを、最初に、例えばＳＰＲＩビーズシステムを用いたサイズ選択に基づくＤＮＡ精製スキームに供し、引き続いてクロマトグラフィーサイズ選択スキーム、ヌクレオソーム免疫沈降スキームなどの１つまたは複数に供することができる。

【0169】

この場合もまた、上記のように、いくつかの場合、非宿主ＤＮＡの一段階または多段階濃縮により、約２倍〜約１００００倍のサンプル中の非宿主ＤＮＡと宿主ＤＮＡの比の増加がもたらされ得る。いくつかの場合、比を少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも５０００倍またはいくつかの場合、少なくとも１００００倍増加させることができる。

【0170】

核酸スパイクインによるサンプルの分子バーコード化
サンプルを核酸バーコードスパイクインでバーコード化することができる。核酸バーコードは、１つまたは複数の長さであってもよい。いくつかの場合、核酸バーコードは、オリゴヌクレオチド、二本鎖ロングマー（ｌｏｎｇｍｅｒ）、ＰＣＲ産物および／またはプラスミドであり得る。いくつかの場合、核酸バーコードはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡまたはこれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの場合、核酸バーコードは、１つまたは複数のバックグラウンド集団、例えばヒトゲノムまたは病原体ゲノムには存在しない配列を含み得る。いくつかの場合、核酸バーコードは、１つまたは複数の対象となる集団には存在しない配列を含み得る。

【0171】

いくつかの場合、バーコードはサンプルチューブの外側のラベルとは異なり、サンプルの一部である。いくつかの場合、バーコードは、生物学的サンプルの添加前を含む任意の段階で付加することができ、（例えば、ＰＣＲもしくは配列決定によって）任意の段階でで読み取ることができる。いくつかの場合、バーコードを使用してサンプルを追跡する、交差汚染を検出する、および／または試薬を追跡することができる。いくつかの場合、バーコードを使用してサンプルの混同を減らすことができる。いくつかの場合、核酸バーコードを使用して総核酸濃度を増加させて、低濃度サンプルの回収を増加させることができる。いくつかの場合、バーコードを使用して、既知の入力を測定された出力と比較する、または比較もしくは正規化のための参照基準（例えば、正規化オリゴヌクレオチド）を提供することによってサンプル入力を推定することができる。いくつかの場合、バーコードを使用して、ライブラリーの複雑さ、サンプルの損失、感度、および／またはサイズ偏りを測定することによって、品質管理および開発を通して性能を改善することができる。

【0172】

いくつかの場合、サンプル（例えば、生物学的サンプルまたは核酸サンプル）を、正規化オリゴヌクレオチドでスパイクすることができる。いくつかの場合、正規化オリゴヌクレオチドを使用して、ＤＮＡ操作、精製および／または増幅ステップの効率を監視することができる。例えば、対象となる集団（例えば、非宿主または病原体）配列決定読み取りの絶対数を、回収された正規化オリゴヌクレオチド読み取りの絶対数と比較して、サンプル間の分子操作効率の差異について正規化することができる。いくつかの場合、正規化オリゴヌクレオチドをバーコード化目的のために、または正規化とバーコード化両方の目的のために使用することができる。

【0173】

対象となる領域の戦略的捕捉
本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのコレクションおよび方法は、対象となる領域と同一、ほぼ同一、相補的、またはほぼ相補的な核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドをさらに含み得る。対象となる領域のいくつかの非限定的な例としては、病原性遺伝子座（例えば、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の病原性遺伝子座）；抗微生物剤耐性マーカー；抗生物質耐性マーカー；抗ウイルス剤耐性マーカー；抗寄生生物剤耐性マーカー；有益な遺伝子型決定領域（例えば、宿主、ヒト、微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物由来）；２つ以上の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌および／または寄生生物に共通する配列；宿主ゲノムに組み込まれた非宿主配列；マスキング非宿主配列；非宿主模倣配列；マスキング宿主配列；宿主模倣配列；ならびに１つまたは複数の微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物に特異的な配列が挙げられる。いくつかの場合、対象となる領域は、非宿主、細菌、ウイルス、病原体、真菌または微生物ゲノム中に存在し得る。いくつかの場合、対象となる領域は、宿主、哺乳動物またはヒトゲノム中に存在し得る。対象となる領域と同一、ほぼ同一、相補的、またはほぼ相補的な核酸配列を含むことにより、遺伝子型同定、抗微生物剤耐性検出、抗生物質耐性検出、抗ウイルス剤耐性検出、抗寄生生物剤耐性検出および／または病原体検出感度増強が可能になり得る。対象となる領域と同一、ほぼ同一、相補的、またはほぼ相補的な核酸配列を、例えば、生物情報学的もしくは計算的に設計および／またはＤＮＡ合成によって化学的に合成することができる。核酸配列を、核酸増幅または検出のため、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ合成をプライミングするため、配列決定のため、プライマー伸長反応において、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションのため、および／またはＤＮＡ／ＲＮＡプルダウンのためにプライマーとして使用することができる。

【0174】

抗生物質耐性マーカーは、抗生物質耐性を付与する１つもしくは複数の突然変異、一塩基多型、遺伝子または遺伝子産物を含み得る。抗生物質耐性マーカーは、それだけに限らないが、抗生物質流出、抗生物質不活性化、抗生物質標的改変、抗生物質標的保護、抗生物質標的置換および／または抗生物質に対する低下した浸透性などの１つまたは複数の機構を通して抗生物質耐性を与え得る。いくつかの場合、抗生物質耐性マーカーは、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃ．ディフィシル）、カルバペネム耐性腸内細菌（ＣＲＥ）、薬剤耐性淋菌（セファロスポリン耐性）、多剤耐性アシネトバクター、薬剤耐性カンピロバクター、フルコナゾール耐性カンジダ（真菌）、広域スペクトルβ−ラクタマーゼ産生腸内細菌（ＥＳＢＬ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、多剤耐性緑膿菌、薬剤耐性非チフス性サルモネラ、薬剤耐性チフス菌、薬剤耐性シゲラ、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、薬剤耐性肺炎球菌、薬剤耐性結核（ＭＤＲおよびＸＤＲ）、多剤耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、エリスロマイシン耐性ストレプトコッカスＡ群またはクリンダマイシン耐性ストレプトコッカスＢ群に見出され得る。いくつかの場合、抗生物質耐性マーカーは、アクリジン色素、アミノクマリン抗生物質、アミノグリコシド、アミノヌクレオシド抗生物質、β−ラクタム、ジアミノピリミジン、エルファミシン、フルオロキノロン、グリコペプチド抗生物質、リンコサミド、リポペプチド抗生物質、大環状抗生物質、マクロライド、ヌクレオシド抗生物質、有機ヒ素抗生物質、オキサゾリジノン抗生物質、ペプチド抗生物質、フェニコール、プレウロムチリン抗生物質、ポリアミン抗生物質、リファマイシン抗生物質、ストレプトグラミン抗生物質、スルホンアミド、スルホン、テトラサイクリン誘導体またはこれらの任意の組み合わせに対する抗生物質耐性を付与し得る。いくつかの場合、抗生物質耐性マーカーは、β−ラクタム、ペニシリン、アミノペニシリン、初期世代セファロスポリン、β−ラクタマーゼ阻害剤の組み合わせ、広域スペクトルセファロスポリン、カルバペネム、フルオロキノロン、アミノグリコシド、テトラサイクリン、グリシクリン、ポリミキシン、ペニシリン、メチシリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、セフタジジム、バンコマイシン、レボフロキサシン、イミペネム、リネゾリド、セフトリアキソン、セフタロリンまたはこれらの任意の組み合わせに対する抗生物質耐性を与え得る。

【0175】

抗生物質耐性マーカーの非限定的な例としては、ａａｃ２ｉａ、ａａｃ２ｉｂ、ａａｃ２ｉｃ、ａａｃ２ｉｄ、ａａｃ２ｉ、ａａｃ３ｉａ、ａａｃ３ｉｉａ、ａａｃ３ｉｉｂ、ａａｃ３ｉｉｉ、ａａｃ３ｉｖ、ａａｃ３ｉｘ、ａａｃ３ｖｉ、ａａｃ３ｖｉｉｉ、ａａｃ３ｖｉｉ、ａａｃ３ｘ、ａａｃ６ｉ、ａａｃ６ｉａ、ａａｃ６ｉｂ、ａａｃ６ｉｃ、ａａｃ６ｉｅ、ａａｃ６ｉｆ、ａａｃ６ｉｇ、ａａｃ６ｉｉａ、ａａｃ６ｉｉｂ、ａａｄ９、ａａｄ９ｉｂ、ａａｄｄ、ａｃｒａ、ａｃｒｂ、ａｄｅａ、ａｄｅｂ、ａｄｅｃ、ａｍｒａ、ａｍｒｂ、ａｎｔ２ｉａ、ａｎｔ２ｉｂ、ａｎｔ３ｉａ、ａｎｔ４ｉｉａ、ａｎｔ６ｉａ、ａｐｈ３３ｉａ、ａｐｈ３３ｉｂ、ａｐｈ３ｉａ、ａｐｈ３ｉｂ、ａｐｈ３ｉｃ、ａｐｈ３ｉｉｉａ、ａｐｈ３ｉｖａ、ａｐｈ３ｖａ、ａｐｈ３ｖｂ、ａｐｈ３ｖｉａ、ａｐｈ３ｖｉｉａ、ａｐｈ４ｉｂ、ａｐｈ６ｉａ、ａｐｈ６ｉｂ、ａｐｈ６ｉｃ、ａｐｈ６ｉｄ、ａｒｎａ、ｂａｃａ、ｂｃｒａ、ｂｃｒｃ、ｂｌ１＿ａｃｃ、ｂｌ１＿ａｍｐｃ、ｂｌ１＿ａｓｂａ、ｂｌ１＿ｃｅｐｓ、ｂｌ１＿ｃｍｙ２、ｂｌ１＿ｅｃ、ｂｌ１＿ｆｏｘ、ｂｌ１＿ｍｏｘ、ｂｌ１＿ｏｃｈ、ｂｌ１＿ｐａｏ、ｂｌ１＿ｐｓｅ、ｂｌ１＿ｓｍ、ｂｌ２ａ＿１、ｂｌ２ａ＿ｅｘｏ、ｂｌ２ａ＿ｉｉｉ２、ｂｌ２ａ＿ｉｉｉ、ｂｌ２ａ＿ｋｃｃ、ｂｌ２ａ＿ｎｐｓ、ｂｌ２ａ＿ｏｋｐ、ｂｌ２ａ＿ｐｃ、ｂｌ２ｂｅ＿ｃｔｘｍ、ｂｌ２ｂｅ＿ｏｘｙ１、ｂｌ２ｂｅ＿ｐｅｒ、ｂｌ２ｂｅ＿ｓｈｖ２、ｂｌ２ｂ＿ｒｏｂ、ｂｌ２ｂ＿ｔｅｍ１、ｂｌ２ｂ＿ｔｅｍ２、ｂｌ２ｂ＿ｔｅｍ、ｂｌ２ｂ＿ｔｌｅ、ｂｌ２ｂ＿ｕｌａ、ｂｌ２ｃ＿ｂｒｏ、ｂｌ２ｃ＿ｐｓｅ１、ｂｌ２ｃ＿ｐｓｅ３、ｂｌ２ｄ＿ｌｃｒ１、ｂｌ２ｄ＿ｍｏｘａ、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ１０、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ１、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ２、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ５、ｂｌ２ｄ＿ｏｘａ９、ｂｌ２ｄ＿ｒ３９、ｂｌ２ｅ＿ｃｂｌａ、ｂｌ２ｅ＿ｃｅｐａ、ｂｌ２ｅ＿ｃｆｘａ、ｂｌ２ｅ＿ｆｐｍ、ｂｌ２ｅ＿ｙ５６、ｂｌ２ｆ＿ｎｍｃａ、ｂｌ２ｆ＿ｓｍｅ１、ｂｌ２＿ｇｅｓ、ｂｌ２＿ｋｐｃ、ｂｌ２＿ｌｅｎ、ｂｌ２＿ｖｅｂ、ｂｌ３＿ｃｃｒａ、ｂｌ３＿ｃｉｔ、ｂｌ３＿ｃｐｈａ、ｂｌ３＿ｇｉｍ、ｂｌ３＿ｉｍｐ、ｂｌ３＿ｌ、ｂｌ３＿ｓｈｗ、ｂｌ３＿ｓｉｍ、ｂｌ３＿ｖｉｍ、ｂｌｅ、ｂｌｔ、ｂｍｒ、ｃａｒａ、ｃａｔａ１０、ｃａｔａ１１、ｃａｔａ１２、ｃａｔａ１３、ｃａｔａ１４、ｃａｔａ１５、ｃａｔａ１６、ｃａｔａ１、ｃａｔａ２、ｃａｔａ３、ｃａｔａ４、ｃａｔａ５、ｃａｔａ６、ｃａｔａ７、ｃａｔａ８、ｃａｔａ９、ｃａｔｂ１、ｃａｔｂ２、ｃａｔｂ３、ｃａｔｂ４、ｃａｔｂ５、ｃｅｏａ、ｃｅｏｂ、ｃｍｌ＿ｅ１、ｃｍｌ＿ｅ２、ｃｍｌ＿ｅ３、ｃｍｌ＿ｅ４、ｃｍｌ＿ｅ５、ｃｍｌ＿ｅ６、ｃｍｌ＿ｅ７、ｃｍｌ＿ｅ８、ｄｆｒａ１０、ｄｆｒａ１２、ｄｆｒａ１３、ｄｆｒａ１４、ｄｆｒａ１５、ｄｆｒａ１６、ｄｆｒａ１７、ｄｆｒａ１９、ｄｆｒａ１、ｄｆｒａ２０、ｄｆｒａ２１、ｄｆｒａ２２、ｄｆｒａ２３、ｄｆｒａ２４、ｄｆｒａ２５、ｄｆｒａ２５、ｄｆｒａ２５、ｄｆｒａ２６、ｄｆｒａ５、ｄｆｒａ７、ｄｆｒｂ１、ｄｆｒｂ２、ｄｆｒｂ３、ｄｆｒｂ６、ｅｍｅａ、ｅｍｒｄ、ｅｍｒｅ、ｅｒｅａ、ｅｒｅｂ、ｅｒｍａ、ｅｒｍｂ、ｅｒｍｃ、ｅｒｍｄ、ｅｒｍｅ、ｅｒｍｆ、ｅｒｍｇ、ｅｒｍｈ、ｅｒｍｎ、ｅｒｍｏ、ｅｒｍｑ、ｅｒｍｒ、ｅｒｍｓ、ｅｒｍｔ、ｅｒｍｕ、ｅｒｍｖ、ｅｒｍｗ、ｅｒｍｘ、ｅｒｍｙ、ｆｏｓａ、ｆｏｓｂ、ｆｏｓｃ、ｆｏｓｘ、ｆｕｓｂ、ｆｕｓｈ、ｋｓｇａ、ｌｍｒａ、ｌｍｒｂ、ｌｎｕａ、ｌｎｕｂ、ｌｓａ、ｍａｃａ、ｍａｃｂ、ｍｄｔｅ、ｍｄｔｆ、ｍｄｔｇ、ｍｄｔｈ、ｍｄｔｋ、ｍｄｔｌ、ｍｄｔｍ、ｍｄｔｎ、ｍｄｔｏ、ｍｄｔｐ、ｍｅｃａ、ｍｅｃｒ１、ｍｅｆａ、ｍｅｐａ、ｍｅｘａ、ｍｅｘｂ、ｍｅｘｃ、ｍｅｘｄ、ｍｅｘｅ、ｍｅｘｆ、ｍｅｘｈ、ｍｅｘｉ、ｍｅｘｗ、ｍｅｘｘ、ｍｅｘｙ、ｍｆｐａ、ｍｐｈａ、ｍｐｈｂ、ｍｐｈｃ、ｍｓｒａ、ｎｏｒｍ、ｏｌｅｂ、ｏｐｃｍ、ｏｐｒａ、ｏｐｒｄ、ｏｐｒｊ、ｏｐｒｍ、ｏｐｒｎ、ｏｔｒａ、ｏｔｒｂ、ｐｂｐ１ａ、ｐｂｐ１ｂ、ｐｂｐ２ｂ、ｐｂｐ２、ｐｂｐ２ｘ、ｐｍｒａ、ｑａｃ、ｑａｃａ、ｑａｃｂ、ｑｎｒａ、ｑｎｒｂ、ｑｎｒｓ、ｒｏｓａ、ｒｏｓｂ、ｓｍｅａ、ｓｍｅｂ、ｓｍｅｃ、ｓｍｅｄ、ｓｍｅｅ、ｓｍｅｆ、ｓｒｍｂ、ｓｔａ、ｓｔｒ、ｓｕｌ１、ｓｕｌ２、ｓｕｌ３、ｔｃｍａ、ｔｃｒ３、ｔｅｔ３０、ｔｅｔ３１、ｔｅｔ３２、ｔｅｔ３３、ｔｅｔ３４、ｔｅｔ３６、ｔｅｔ３７、ｔｅｔ３８、ｔｅｔ３９、ｔｅｔ４０、ｔｅｔａ、ｔｅｔｂ、ｔｅｔｃ、ｔｅｔｄ、ｔｅｔｅ、ｔｅｔｇ、ｔｅｔｈ、ｔｅｔｊ、ｔｅｔｋ、ｔｅｔｌ、ｔｅｔｍ、ｔｅｔｏ、ｔｅｔｐａ、ｔｅｔｐｂ、ｔｅｔ、ｔｅｔｑ、ｔｅｔｓ、ｔｅｔｔ、ｔｅｔｕ、ｔｅｔｖ、ｔｅｔｗ、ｔｅｔｘ、ｔｅｔｙ、ｔｅｔｚ、ｔｌｒｃ、ｔｍｒｂ、ｔｏｌｃ、ｔｓｎｒ、ｖａｎａ、ｖａｎｂ、ｖａｎｃ、ｖａｎｄ、ｖａｎｅ、ｖａｎｇ、ｖａｎｈａ、ｖａｎｈｂ、ｖａｎｈｄ、ｖａｎｒａ、ｖａｎｒｂ、ｖａｎｒｃ、ｖａｎｒｄ、ｖａｎｒｅ、ｖａｎｒｇ、ｖａｎｓａ、ｖａｎｓｂ、ｖａｎｓｃ、ｖａｎｓｄ、ｖａｎｓｅ、ｖａｎｓｇ、ｖａｎｔ、ｖａｎｔｅ、ｖａｎｔｇ、ｖａｎｕｇ、ｖａｎｗｂ、ｖａｎｗｇ、ｖａｎｘａ、ｖａｎｘｂ、ｖａｎｘｄ、ｖａｎｘｙｃ、ｖａｎｘｙｅ、ｖａｎｘｙｇ、ｖａｎｙａ、ｖａｎｙｂ、ｖａｎｙｄ、ｖａｎｙｇ、ｖａｎｚ、ｖａｔａ、ｖａｔｂ、ｖａｔｃ、ｖａｔｄ、ｖａｔｅ、ｖｇａａ、ｖｇａｂ、ｖｇｂａ、ｖｇｂｂ、ｖｐｈ、ｙｋｋｃおよびｙｋｋｄが挙げられる。

【0176】

濃縮
本明細書に記載される方法により対象となる集団の核酸を濃縮することができる。いくつかの場合、対象となる集団の核酸を約５％；１０％；１５％；２０％；２５％；３０％；３５％；４０％；４５％；５０％；５５％；６０％；６５％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；１００％；１５０％；２００％；２５０％；３００％；３５０％；４００％；４５０％；５００％；５５０％；６００％；６５０％；７００％；７５０％；８００％；８５０％；９００％；９５０％；１０００％；２０００％；３０００％；４０００％；５０００％；６０００％；７０００％；８０００％；９０００％；１００００％；２００００％；３００００％；４００００％；５００００％；６００００％；７００００％；８００００％；９００００％；１０００００％；２０００００％；３０００００％；４０００００％；５０００００％；６０００００％；７０００００％；８０００００％；９０００００％；１００００００％；２００００００％；３００００００％；４００００００％；５００００００％；６００００００％；７００００００％；８００００００％；９００００００％；１０００００００％；２０００００００％；３０００００００％；４０００００００％；５０００００００％；６０００００００％；７０００００００％；８０００００００％；９０００００００％；または１００００００００％濃縮することができる。いくつかの場合、対象となる集団の核酸を最大５％；１０％；１５％；２０％；２５％；３０％；３５％；４０％；４５％；５０％；５５％；６０％；６５％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；１００％；１５０％；２００％；２５０％；３００％；３５０％；４００％；４５０％；５００％；５５０％；６００％；６５０％；７００％；７５０％；８００％；８５０％；９００％；９５０％；１０００％；２０００％；３０００％；４０００％；５０００％；６０００％；７０００％；８０００％；９０００％；１００００％；２００００％；３００００％；４００００％；５００００％；６００００％；７００００％；８００００％；９００００％；１０００００％；２０００００％；３０００００％；４０００００％；５０００００％；６０００００％；７０００００％；８０００００％；９０００００％；１００００００％；２００００００％；３００００００％；４００００００％；５００００００％；６００００００％；７００００００％；８００００００％；９００００００％；１０００００００％；２０００００００％；３０００００００％；４０００００００％；５０００００００％；６０００００００％；７０００００００％；８０００００００％；９０００００００％；または１００００００００％濃縮することができる。いくつかの場合、対象となる集団の核酸を少なくとも５％；１０％；１５％；２０％；２５％；３０％；３５％；４０％；４５％；５０％；５５％；６０％；６５％；７０％；７５％；８０％；８５％；９０％；９５％；１００％；１５０％；２００％；２５０％；３００％；３５０％；４００％；４５０％；５００％；５５０％；６００％；６５０％；７００％；７５０％；８００％；８５０％；９００％；９５０％；１０００％；２０００％；３０００％；４０００％；５０００％；６０００％；７０００％；８０００％；９０００％；１００００％；２００００％；３００００％；４００００％；５００００％；６００００％；７００００％；８００００％；９００００％；１０００００％；２０００００％；３０００００％；４０００００％；５０００００％；６０００００％；７０００００％；８０００００％；９０００００％；１００００００％；２００００００％；３００００００％；４００００００％；５００００００％；６００００００％；７００００００％；８００００００％；９００００００％；１０００００００％；２０００００００％；３０００００００％；４０００００００％；５０００００００％；６０００００００％；７０００００００％；８０００００００％；９０００００００％；または１００００００００％濃縮することができる。例えば、サンプルが、核酸の全集団のうちの５％の対象となる集団の核酸を含有し、核酸の全集団のうちの１０％の対象となる集団の核酸を含有するように濃縮される場合、対象となる集団の核酸は１００％濃縮されている。いくつかの場合、対象となる集団の核酸を約１．５倍；２倍；２．５倍；３倍；３．５倍；４倍；４．５倍；５倍；５．５倍；６倍；６．５倍；７倍；７．５倍；８倍；８．５倍；９倍；９．５倍；１０倍；１５倍；２０倍；２５倍；３０倍；３５倍；４０倍；４５倍；５０倍；５５倍；６０倍；６５倍；７０倍；７５倍；８０倍；８５倍；９０倍；９５倍；１００倍；１５０倍；２００倍；２５０倍；３００倍；３５０倍；４００倍；４５０倍；５００倍；５５０倍；６００倍；６５０倍；７００倍；７５０倍；８００倍；８５０倍；９００倍；９５０倍；１０００倍；２０００倍；３０００倍；４０００倍；５０００倍；６０００倍；７０００倍；８０００倍；９０００倍；１００００倍；２００００倍；３００００倍；４００００倍；５００００倍；６００００倍；７００００倍；８００００倍；９００００倍；１０００００倍；２０００００倍；３０００００倍；４０００００倍；５０００００倍；６０００００倍；７０００００倍；８０００００倍；９０００００倍；１００００００倍濃縮することができる。いくつかの場合、対象となる集団の核酸を最大１．５倍；２倍；２．５倍；３倍；３．５倍；４倍；４．５倍；５倍；５．５倍；６倍；６．５倍；７倍；７．５倍；８倍；８．５倍；９倍；９．５倍；１０倍；１５倍；２０倍；２５倍；３０倍；３５倍；４０倍；４５倍；５０倍；５５倍；６０倍；６５倍；７０倍；７５倍；８０倍；８５倍；９０倍；９５倍；１００倍；１５０倍；２００倍；２５０倍；３００倍；３５０倍；４００倍；４５０倍；５００倍；５５０倍；６００倍；６５０倍；７００倍；７５０倍；８００倍；８５０倍；９００倍；９５０倍；１０００倍；２０００倍；３０００倍；４０００倍；５０００倍；６０００倍；７０００倍；８０００倍；９０００倍；１００００倍；２００００倍；３００００倍；４００００倍；５００００倍；６００００倍；７００００倍；８００００倍；９００００倍；１０００００倍；２０００００倍；３０００００倍；４０００００倍；５０００００倍；６０００００倍；７０００００倍；８０００００倍；９０００００倍；１００００００倍濃縮することができる。いくつかの場合、対象となる集団の核酸を少なくとも１．５倍；２倍；２．５倍；３倍；３．５倍；４倍；４．５倍；５倍；５．５倍；６倍；６．５倍；７倍；７．５倍；８倍；８．５倍；９倍；９．５倍；１０倍；１５倍；２０倍；２５倍；３０倍；３５倍；４０倍；４５倍；５０倍；５５倍；６０倍；６５倍；７０倍；７５倍；８０倍；８５倍；９０倍；９５倍；１００倍；１５０倍；２００倍；２５０倍；３００倍；３５０倍；４００倍；４５０倍；５００倍；５５０倍；６００倍；６５０倍；７００倍；７５０倍；８００倍；８５０倍；９００倍；９５０倍；１０００倍；２０００倍；３０００倍；４０００倍；５０００倍；６０００倍；７０００倍；８０００倍；９０００倍；１００００倍；２００００倍；３００００倍；４００００倍；５００００倍；６００００倍；７００００倍；８００００倍；９００００倍；１０００００倍；２０００００倍；３０００００倍；４０００００倍；５０００００倍；６０００００倍；７０００００倍；８０００００倍；９０００００倍；１００００００倍濃縮することができる。例えば、サンプルが、核酸の全集団のうちの５％の対象となる集団の核酸を含有し、核酸の全集団のうちの１０％の対象となる集団の核酸を含有するように濃縮される場合、対象となる集団の核酸は２倍濃縮されている。

【0177】

本明細書に記載される方法によりバックグラウンド集団を枯渇させることができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸を約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％枯渇させることができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸を最大５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％枯渇させることができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸を少なくとも５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％枯渇させることができる。例えば、サンプルが核酸の全集団のうちの５０％のバックグラウンド集団核酸を含有し、核酸の全集団のうちの１０％のバックグラウンド集団核酸を含有するように枯渇している場合、バックグラウンド集団核酸は８０％枯渇している。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸を約１．５倍；２倍；２．５倍；３倍；３．５倍；４倍；４．５倍；５倍；５．５倍；６倍；６．５倍；７倍；７．５倍；８倍；８．５倍；９倍；９．５倍；１０倍；１５倍；２０倍；２５倍；３０倍；３５倍；４０倍；４５倍；５０倍；５５倍；６０倍；６５倍；７０倍；７５倍；８０倍；８５倍；９０倍；９５倍；１００倍；１５０倍；２００倍；２５０倍；３００倍；３５０倍；４００倍；４５０倍；５００倍；５５０倍；６００倍；６５０倍；７００倍；７５０倍；８００倍；８５０倍；９００倍；９５０倍；１０００倍；２０００倍；３０００倍；４０００倍；５０００倍；６０００倍；７０００倍；８０００倍；９０００倍；１００００倍；２００００倍；３００００倍；４００００倍；５００００倍；６００００倍；７００００倍；８００００倍；９００００倍；１０００００倍；２０００００倍；３０００００倍；４０００００倍；５０００００倍；６０００００倍；７０００００倍；８０００００倍；９０００００倍；１００００００倍濃縮することができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸を最大１．５倍；２倍；２．５倍；３倍；３．５倍；４倍；４．５倍；５倍；５．５倍；６倍；６．５倍；７倍；７．５倍；８倍；８．５倍；９倍；９．５倍；１０倍；１５倍；２０倍；２５倍；３０倍；３５倍；４０倍；４５倍；５０倍；５５倍；６０倍；６５倍；７０倍；７５倍；８０倍；８５倍；９０倍；９５倍；１００倍；１５０倍；２００倍；２５０倍；３００倍；３５０倍；４００倍；４５０倍；５００倍；５５０倍；６００倍；６５０倍；７００倍；７５０倍；８００倍；８５０倍；９００倍；９５０倍；１０００倍；２０００倍；３０００倍；４０００倍；５０００倍；６０００倍；７０００倍；８０００倍；９０００倍；１００００倍；２００００倍；３００００倍；４００００倍；５００００倍；６００００倍；７００００倍；８００００倍；９００００倍；１０００００倍；２０００００倍；３０００００倍；４０００００倍；５０００００倍；６０００００倍；７０００００倍；８０００００倍；９０００００倍；１００００００倍濃縮することができる。いくつかの場合、バックグラウンド集団核酸を少なくとも１．５倍；２倍；２．５倍；３倍；３．５倍；４倍；４．５倍；５倍；５．５倍；６倍；６．５倍；７倍；７．５倍；８倍；８．５倍；９倍；９．５倍；１０倍；１５倍；２０倍；２５倍；３０倍；３５倍；４０倍；４５倍；５０倍；５５倍；６０倍；６５倍；７０倍；７５倍；８０倍；８５倍；９０倍；９５倍；１００倍；１５０倍；２００倍；２５０倍；３００倍；３５０倍；４００倍；４５０倍；５００倍；５５０倍；６００倍；６５０倍；７００倍；７５０倍；８００倍；８５０倍；９００倍；９５０倍；１０００倍；２０００倍；３０００倍；４０００倍；５０００倍；６０００倍；７０００倍；８０００倍；９０００倍；１００００倍；２００００倍；３００００倍；４００００倍；５００００倍；６００００倍；７００００倍；８００００倍；９００００倍；１０００００倍；２０００００倍；３０００００倍；４０００００倍；５０００００倍；６０００００倍；７０００００倍；８０００００倍；９０００００倍；１００００００倍濃縮することができる。例えば、サンプルが核酸の全集団のうちの５０％のバックグラウンド集団核酸を含有し、核酸の全集団のうちの１０％のバックグラウンド集団核酸を含有するように枯渇している場合、バックグラウンド集団核酸は５倍枯渇している。

【0178】

サンプル
本明細書で提供される方法および組成物は、対照（例えば、ヒト宿主）から得られた多種多様なサンプル中の核酸を検出するために有用である。生物学的サンプルのいくつかの非限定的な例としては、血液、血漿、血清、全血、粘液、唾液、脳脊髄液、滑液、洗浄液、尿、組織生検、細胞サンプル、皮膚サンプルおよび便が挙げられる。サンプルは、循環無細胞核酸（例えば、循環無細胞ＤＮＡ、循環無細胞ＲＮＡ）を含む循環核酸などの核酸を含むことができる。いくつかの場合、対象から得られたサンプルがさらなる処理を受ける。例えば、サンプルを処理してＤＮＡまたはＲＮＡを抽出することができ、これを本明細書で提供される方法を使用して分析することができる。

【0179】

いくつかの場合、核酸サンプルは、生物学的サンプル、単離核酸サンプル、または循環核酸などの核酸を含有する精製核酸サンプルなどのサンプルであり得る。いくつかの場合、核酸サンプルは、宿主および非宿主配列、例えば、ヒトおよび非ヒト配列を含有し得る。いくつかの場合、核酸の配列決定可能なライブラリーなどの核酸サンプル中の核酸を（例えば、ＰＣＲ増幅反応によって）増幅する。いくつかの場合、核酸サンプル中の核酸は（例えば、超音波処理、せん断、酵素消化または化学的断片化によって）人工的に断片化されていない。いくつかの場合、核酸の長さが比較的短いため、核酸断片化は不要である。いくつかの場合、核酸サンプル中の核酸を人工的に断片化する。循環核酸サンプルは、生物学的サンプル、単離核酸サンプル、または循環無細胞核酸などの循環核酸を含有する精製核酸サンプルなどのサンプルであり得る。いくつかの場合、循環無細胞核酸サンプルは、生物学的サンプル、単離核酸サンプル、または循環無細胞ＤＮＡもしくは循環無細胞ＲＮＡなどの循環無細胞核酸を含有する精製核酸サンプルなどのサンプルであり得る。いくつかの場合、一本鎖核酸サンプルは、生物学的サンプル、単離核酸サンプル、または一本鎖循環核酸もしくは一本鎖循環無細胞核酸などの一本鎖核酸を含有する精製核酸サンプルなどのサンプルであり得る。

【0180】

いくつかの場合、核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、循環核酸、循環ＤＮＡ、循環ＲＮＡ、無細胞核酸、無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、循環無細胞ＤＮＡ、循環無細胞ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡであり得る。いくつかの場合、循環核酸は循環ＤＮＡ、循環ＲＮＡ、無細胞核酸または無細胞循環核酸である。いくつかの場合、無細胞核酸は無細胞ＤＮＡ、無細胞ＲＮＡ、循環無細胞ＤＮＡまたは循環無細胞ＲＮＡであり得る。いくつかの場合、循環無細胞核酸は循環無細胞ＤＮＡまたは循環無細胞ＲＮＡであり得る。

【0181】

いくつかの場合、サンプル中の核酸は標識されていなくてもよい；いくつかの場合、核酸は例えば、核酸標識、化学標識または光学標識で標識される。いくつかの場合、核酸を固体支持体にコンジュゲートさせる。いくつかの場合、標識を核酸の５’もしくは３’末端に、または核酸の内部に付着させることができる。いくつかの場合、核酸を２つ以上の標識で標識する。

【0182】

サンプル中の核酸を核酸標識でタグ付けしてもよい。いくつかの場合、核酸標識は、以下の１つまたは複数を含み得る：バーコード（例えば、サンプルバーコード）、ユニバーサルプライマー配列、プライマー結合部位（例えば、それだけに限らないが、ＤＮＡ配列決定プライマー結合部位、サンプルバーコード配列決定プライマー結合部位および種々の配列決定プラットホーム要件に適合する増幅プライマー結合部位を含む、配列決定またはバーコード読み取りのためのもの）、シーケンサー適合性配列、配列決定プラットホーム付着する配列、配列決定アダプター配列またはアダプター。核酸標識は、（例えば、ライゲーションまたは合成設計によって）核酸に付着させることができる。

【0183】

核酸標識は化学標識を含むことができる。化学標識のいくつかの非限定的な例としては、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、放射性標識、ポリペプチドおよびポリマーが挙げられる。核酸標識は光学標識を含むことができる。光学標識のいくつかの非限定的な例としては、発蛍光団、蛍光タンパク質、色素および量子ドットが挙げられる。核酸標識を固体支持体にコンジュゲートさせることができる。固体支持体のいくつかの非限定的な例としては、ビーズ、磁気ビーズ、ポリマー、スライド、チップ、表面、プレート、チャネル、カートリッジ、マイクロ流体デバイスおよびマイクロアレイが挙げられる。核酸をアフィニティークロマトグラフィーのための固体支持体にコンジュゲートさせることができる。いくつかの場合、各核酸が異なる標識を有する。いくつかの場合、各核酸が同じ標識を有する。いくつかの場合、サンプル中の核酸を固体支持体にコンジュゲートさせない。

【0184】

配列決定方法
いくつかの場合、核酸の濃縮された集団を配列決定する。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、シーケンシングアッセイを行うステップをさらに含む。増幅または捕捉された対象となる集団の核酸を、シーケンシングアッセイ、特にハイスループットシーケンシングアッセイ、次世代シーケンシングプラットホーム、大量並列シーケンシングプラットホーム、ナノポアシーケンシングアッセイ、サンガーシーケンシングまたは当技術分野で公知の別のシーケンシングアッセイを行うことによるなどして、当技術分野で公知の方法によって同定することができる。シーケンシングアッセイのいくつかの非限定的な例としては、ハイスループットシーケンシングアッセイ、次世代シーケンシングプラットホーム、大量並列シーケンシングプラットホーム、ナノポアシーケンシングおよびサンガーシーケンシングが挙げられる。配列決定機械の種類のいくつかの非限定的な例としては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｉｏｎ ＴｏｒｒｅｎｔおよびＮａｎｏｐｏｒｅが挙げられる。

【0185】

本明細書に記載されるプロセス方法はまた、例えば、宿主配列と非宿主配列を区別することができる、得られた配列データに適用される情報科学データ選別方法を含む、宿主核酸配列と非宿主核酸配列を区別するための他の方法と合わせて使用することができる。このようなプロセスの例としては、その全開示が全ての目的のための全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第２０１５−０１３３３９１号明細書に記載されているものが挙げられる。

【0186】

用途
本方法および組成物は、１つまたは複数の非宿主種（例えば、微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物）に感染した宿主からの生物学的サンプルを分析するのに有用である。本明細書で提供される方法および組成物は、疾患または障害、特に、微生物または病原体によって引き起こされる疾患または障害の検出、予測、診断または監視に特に有用である。本明細書で提供される方法および組成物はまた、循環無細胞ＤＮＡまたは循環無細胞ＲＮＡを含むサンプルなどの、感染した宿主から得られた一定の種類のサンプル中の対象となる集団を検出するのに有用である。

【0187】

本方法および組成物を使用してサンプル中の病原体の遺伝子型同定を可能にすることもできる。本方法および組成物はまた、微生物または病原体ゲノムの変化を検出するのに特に有用である。例えば、これらを使用して、細菌の抗生物質耐性株を検出する、または病原体、特にウイルスおよび細菌の病原性に影響を及ぼす変化を追跡することができる。

【0188】

他の場合、本方法および組成物を使用して、例えばマイクロバイオーム中の１つまたは複数の微生物の存在を監視することができる。例えば、本方法および組成物を使用して、健康なまたは感染していない宿主におけるマイクロバイオームの存在を監視することができる。本方法および組成物を使用して、複数の微生物を含有するサンプル内の微生物サインを監視することもできる。

【0189】

本明細書で提供される方法および組成物はまた、１つまたは複数の非宿主生物（例えば、微生物、病原体、細菌、ウイルス、真菌または寄生生物）に由来する核酸の仮説のない検出あるいは疾患、障害または感染症の仮説のない診断または監視も可能にすることができる。このように、本明細書で提供される方法は、特定の標的（例えば、１つまたは複数の特異的核酸配列、タンパク質または抗体）をスクリーニングし、選択された標的の検査に限定される他の診断方法とは異なり得る。いくつかの場合、本明細書で提供される方法および組成物の仮説のない特性は、稀な感染症の検出、２つ以上の疾患もしくは障害の同時発生の検出、感染源の特定、または類似のもしくは一般的な症状を有する複数の疾患もしくは障害の識別を容易にし得る。

【0190】

いくつかの具体例で、本方法は、以下のステップの１つまたは複数を任意の順序または組み合わせで含み得る：（ａ）病原体感染を有するまたは有すると疑われる対象または患者からの核酸サンプルを用意するステップ；（ｂ）核酸サンプルを本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドのコレクション、特に非宿主配列に結合するように選択的に濃縮されたオリゴヌクレオチドのコレクションと接触させるステップ；（ｃ）サンプルおよびオリゴヌクレオチドのコレクションをオリゴヌクレオチドのコレクションと核酸サンプル中の核酸分子とのハイブリダイゼーションを促進する条件に供するステップ；（ｄ）オリゴヌクレオチドのコレクションにハイブリダイズした核酸に対して、増幅アッセイ、プルダウンアッセイまたはシーケンシングアッセイなどのアッセイを行うステップ；および（ｅ）サンプル中の特定の病原体を検出するために、ハイブリダイズした核酸の配列を分析するステップ。通常、検出される特定の病原体の数は、約１０、２０、３０、４０、５０超またはそれ以上の異なる病原体など、本明細書にさらに記載されるように、かなり多い。通常、病原体の検出は、感染性疾患、感染性障害、感染症、または他の疾患もしくは障害（例えば、がん）の検出、予後、監視または診断を可能にすることができる。いくつかの場合、このような検出は、疾患もしくは障害の病期分類を容易にする、または病原性感染症の程度の指標を提供することができる。

【0191】

いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも１つの対象となる集団の配列（例えば、病原性または他の非宿主もしくは非ヒト配列）を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、対象となる少なくとも５つの集団の配列を決定することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも５つの非哺乳動物配列を決定することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも５つの非哺乳動物種の各々から少なくとも１つの非哺乳動物配列を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも５つの非ヒト配列を決定することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも５つのヒト以外の種の各々から少なくとも１つの非ヒト配列を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも１つの細菌配列および少なくとも１つのウイルス配列を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、２つ以上の時点、例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００の時点をとることをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、治療、例えば抗微生物薬の前後の時点をとることをさらに含む。

【0192】

いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、約１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；２００；３００；４００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、最大１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；２００；３００；４００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも１；２；３；４；５；６；７；８；９；１０；１５；２０；２５；３０；３５；４０；４５；５０；６０；７０；８０；９０；１００；２００；３００；４００；５００；１０００；５０００；１００００；５００００；または１０００００種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、種は非宿主種である。いくつかの場合、種は非哺乳動物種である。いくつかの場合、種はヒト以外の種である。いくつかの場合、種は微生物、細菌、ウイルス、真菌、レトロウイルス、病原体または寄生生物である。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００細菌またはウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００細菌またはウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００細菌またはウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００細菌およびウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００細菌およびウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００細菌およびウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、約１細菌種および１ウイルス種、２細菌種および２ウイルス種、３細菌種および３ウイルス種、４細菌種および４ウイルス種、５細菌種および５ウイルス種、６細菌種および６ウイルス種、７細菌種および７ウイルス種、８細菌種および８ウイルス種、９細菌種および９ウイルス種、１０細菌種および１０ウイルス種、１５細菌種および１５ウイルス種、２０細菌種および２０ウイルス種、２５細菌種および２５ウイルス種、３０細菌種および３０ウイルス種、３５細菌種および３５ウイルス種、４０細菌種および４０ウイルス種、４５細菌種および４５ウイルス種、５０細菌種および５０ウイルス種、６０細菌種および６０ウイルス種、７０細菌種および７０ウイルス種、８０細菌種および８０ウイルス種、９０細菌種および９０ウイルス種、１００細菌種および１００ウイルス種、２００細菌種および２００ウイルス種、３００細菌種および３００ウイルス種、４００細菌種および４００ウイルス種、５００細菌種および５００ウイルス種、または１０００細菌種および１０００ウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、最大１細菌種および１ウイルス種、２細菌種および２ウイルス種、３細菌種および３ウイルス種、４細菌種および４ウイルス種、５細菌種および５ウイルス種、６細菌種および６ウイルス種、７細菌種および７ウイルス種、８細菌種および８ウイルス種、９細菌種および９ウイルス種、１０細菌種および１０ウイルス種、１５細菌種および１５ウイルス種、２０細菌種および２０ウイルス種、２５細菌種および２５ウイルス種、３０細菌種および３０ウイルス種、３５細菌種および３５ウイルス種、４０細菌種および４０ウイルス種、４５細菌種および４５ウイルス種、５０細菌種および５０ウイルス種、６０細菌種および６０ウイルス種、７０細菌種および７０ウイルス種、８０細菌種および８０ウイルス種、９０細菌種および９０ウイルス種、１００細菌種および１００ウイルス種、２００細菌種および２００ウイルス種、３００細菌種および３００ウイルス種、４００細菌種および４００ウイルス種、５００細菌種および５００ウイルス種、または１０００細菌種および１０００ウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、少なくとも１細菌種および１ウイルス種、２細菌種および２ウイルス種、３細菌種および３ウイルス種、４細菌種および４ウイルス種、５細菌種および５ウイルス種、６細菌種および６ウイルス種、７細菌種および７ウイルス種、８細菌種および８ウイルス種、９細菌種および９ウイルス種、１０細菌種および１０ウイルス種、１５細菌種および１５ウイルス種、２０細菌種および２０ウイルス種、２５細菌種および２５ウイルス種、３０細菌種および３０ウイルス種、３５細菌種および３５ウイルス種、４０細菌種および４０ウイルス種、４５細菌種および４５ウイルス種、５０細菌種および５０ウイルス種、６０細菌種および６０ウイルス種、７０細菌種および７０ウイルス種、８０細菌種および８０ウイルス種、９０細菌種および９０ウイルス種、１００細菌種および１００ウイルス種、２００細菌種および２００ウイルス種、３００細菌種および３００ウイルス種、４００細菌種および４００ウイルス種、５００細菌種および５００ウイルス種、または１０００細菌種および１０００ウイルス種に由来する少なくとも１つの核酸を検出することをさらに含む。

【0193】

いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、感染症が活性であるか潜伏性であるかを決定することを含む。いくつかの場合、遺伝子発現定量化は、活性感染症を検出、予測、診断または監視する方法を提供し得る。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、活性感染症を検出することを含む。いくつかの場合、遺伝子発現を対象となる集団の検出または配列決定を通して定量化することができる。いくつかの場合、遺伝子発現定量化は、潜伏感染症を検出、予測、診断または監視する方法を提供し得る。いくつかの場合、本明細書に記載される方法は、潜伏感染症を検出することを含む。

【0194】

代表的な疾患および障害には、感染症に関連する任意の疾患または障害、例えば敗血症、肺炎、結核、ＨＩＶ感染症、肝炎感染症（例えば、Ａ型、Ｂ型またはＣ型肝炎）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症、クラミジア感染症、梅毒感染症、エボラ感染症、黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）感染症またはインフルエンザが含まれる。本明細書で提供される方法は、多剤耐性微生物を含む薬物耐性微生物による感染症を検出するのに特に有用である。疾患および障害のいくつかの非限定的な例としては、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、神経性食欲不振、不安障害、喘息、粥状動脈硬化、注意欠陥多動障害、自閉症、自己免疫疾患、双極性障害、がん、慢性疲労症候群、慢性閉塞性肺疾患、クローン病、冠動脈心疾患、認知症、うつ病、１型糖尿病、２型糖尿病、拡張型心筋症、てんかん、ギラン・バレー症候群、過敏性腸症候群、腰痛、狼瘡、メタボリックシンドローム、多発性硬化症、心筋梗塞、肥満、強迫性障害、パニック障害、パーキンソン病、乾癬、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、脳卒中、閉塞性血栓血管炎、トゥーレット症候群、脈管炎、ペスト、結核、炭疽、睡眠病、赤痢、トキソプラズマ症、白癬、カンジダ症、ヒストプラスマ症、エボラ、アシネトバクター感染症、放線菌症、アフリカ睡眠病（アフリカトリパノソーマ症）、エイズ（後天性免疫不全症候群）、アメーバ症、アナプラズマ症、炭疽、アルカノバクテリウム・ヘモリティカム（Ａｒｃａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ）感染症、アルゼンチン出血熱、回虫症、アスペルギルス症、アストロウイルス感染症、バベシア症、セレウス菌感染症、細菌性肺炎、細菌性膣炎（ＢＶ）、バクテロイデス感染症、バランチジウム症、バイリサスカリス感染症、ＢＫウイルス感染症、黒色砂毛、ヒトブラストシスチス感染症、ブラストミセス症、ボリビア出血熱、ボレリア感染症、ボツリヌス症（および乳児ボツリヌス中毒症）、ブラジル出血熱、ブルセラ症、腺ペスト、バークホルデリア感染症、ブルーリ潰瘍、カリシウイルス感染症（ノロウイルスおよびサポウイルス）、カンピロバクター症、カンジダ症（モニリア症；鵞口瘡）、ネコ引っ掻き病、蜂巣炎、シャーガス病（アメリカトリパノソーマ症）、軟性下疳、水痘、チクングニア熱、クラミジア、甲状腺炎、肺炎クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染症（台湾急性呼吸器症候群またはＴＷＡＲ）、コレラ、黒色分芽菌症、肝吸虫症、クロストリジウム・ディフィシル感染症、コクシジオイデス症、コロラドダニ熱（ＣＴＦ）、風邪（急性ウイルス性鼻咽腔炎；急性コリーザ）、クロイツフェルトヤコブ病（ＣＪＤ）、クリミアコンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）、クリプトコッカス症、クリプトスポリジア症、皮膚幼虫移行症（ＣＬＭ）、シクロスポラ症、嚢虫症、サイトメガロウイルス感染症、デング熱、二核アメーバ症、ジフテリア、裂頭条虫症、メジナ虫症、エボラ出血熱、エキノコックス症、エーリキア症、腸蟯虫症（蟯虫感染症）、エンテロコッカス感染症、エンテロウイルス感染症、発疹チフス、伝染性紅斑（第五病）、突発性発疹（第六病）、肥大吸虫症、肝蛭症、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）、フィラリア症、ウェルシュ菌による食中毒、自由生活性アメーバ感染症、フソバクテリウム感染症、ガス壊疽（クロストリジウム性筋壊死）、ゲオトリクム症、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群（ＧＳＳ）、ジアルジア症、鼻疽、顎口虫症、淋病、鼠径肉芽腫（ドノヴァン症）、Ａ群連鎖球菌感染症、Ｂ群連鎖球菌感染症、インフルエンザ菌感染症、手足口病（ＨＦＭＤ）、ハンタウイルス肺症候群（ＨＰＳ）、ハートランドウイルス病、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）感染症、溶血性尿毒症症候群（ＨＵＳ）、腎症候性出血熱（ＨＦＲＳ）、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、単純ヘルペス、ヒストプラスマ症、鉤虫感染症、ヒトボカウイルス感染症、ヒトエーリキア症、ヒト顆粒球アナプラズマ症（ＨＧＡ）、ヒトメタニューモウイルス感染症、ヒト単球性エーリキア症、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、ヒトパラインフルエンザウイルス感染、膜様条虫症、エプスタイン・バーウイルス感染性単核球症（Ｍｏｎｏ）、インフルエンザ（風邪）、イソスポラ症、川崎病、角膜炎、キンゲラ・キンゲ（Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ）感染症、クールー病、ラッサ熱、レジオネラ症（在郷軍人病）、レジオネラ症（ポンティアック熱）、リーシュマニア症、ハンセン病、レプトスピラ症、リステリア症、ライム病（ライムボレリア症）、リンパ管フィラリア症（象皮症）、リンパ性脈絡髄膜炎、マラリア、マールブルグ出血熱（ＭＨＦ）、麻疹、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）、類鼻疽（ホイットモア病）、髄膜炎、髄膜炎菌性疾患、横川吸虫症、微胞子虫症、伝染性軟属腫（ＭＣ）サル痘、ムンプス、ネズミチフス（発疹熱）、マイコプラズマ肺炎、菌腫、ハエ幼虫症、新生児結膜炎（新生児眼炎）、（新）変異クロイツフェルトヤコブ病（ｖＣＪＤ、ｎｖＣＪＤ）、ノカルジア症、オンコセルカ症（河川盲目症）、パラコクシジオイデス症（南米ブラストミセス症）、肺吸虫症、パスツレラ症、アタマジラミ寄生症（アタマジラミ）、コロモジラミ寄生症（コロモジラミ）、ケジラミ寄生症（ケジラミ、ケジラミ）、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、百日咳（百日咳）、ペスト、肺炎球菌感染症、ニューモシスチス肺炎（ＰＣＰ）、肺炎、灰白髄炎、プレボテラ感染症、原発性アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ）、進行性多巣性白質脳症、オウム病、Ｑ熱、狂犬病、ＲＳウイルス感染症、リノスポリジウム症、ライノウイルス感染症、リケッチア感染症、リケッチア痘症、リフトバレー熱（ＲＶＦ）、ロッキー山脈発疹熱（ＲＭＳＦ）、ロタウイルス感染症、風疹、サルモネラ症、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群）、疥癬、住血吸虫症、敗血症、赤痢菌感染症（細菌性赤痢）、帯状疱疹（帯状ヘルペス）、天然痘（痘瘡）、スポロトリクム症、ブドウ球菌食中毒、ブドウ球菌感染症、糞線虫症、亜急性硬化性全脳炎、梅毒、条虫症、破傷風（開口障害）、白癬性毛瘡（床屋痒み症）、頭部白癬（頭部白癬）、体部白癬（体部白癬）、股部白癬（いんきん）、手白癬（手白癬）、黒癬、足白癬（アスリートフット）、爪白癬（爪真菌症）、癜風（黒なまず）、トキソカラ症（眼幼虫移行症（ＯＬＭ））、トキソカラ症（内臓幼虫移行症（ＶＬＭ））、トラコーマ、トリノククリアシス、トリキンロシス、トリコモニアシス、鞭虫症（鞭虫感染症）、結核、野兎病、腸チフス、ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）感染症、渓谷熱、ベネズエラウマ脳炎、ベネズエラ出血熱、ウイルス性肺炎、西ナイル熱、白色砂毛（白癬）、エルシニア偽結核感染症、エルシニア症、黄熱病および接合菌症が挙げられる。

【0195】

本明細書中で使用される場合、「または」という用語は、特に指示しない限り、非排他的であることを指すために使用される、あるいは例えば「ＡまたはＢ」は「ＡではあるがＢではない」、「ＡではなくＢである」および「ＡおよびＢ」を含む。

【0196】

本明細書で使用される場合、数字または数値範囲に言及する場合の「約」という用語は、言及された数値または数値範囲が実験的変動内の（または統計的な実験誤差内の）近似であることを意味し、数値または数値範囲は例えば、明言される数または数値範囲の１％〜１５％で変化し得る。例において、「約」という用語は、明言される数または値の±１０％を指す。

【0197】

［実施例］
［実施例１］
患者全血サンプルからの無細胞ＲＮＡの調製
感染性疾患を有することが疑われる患者から全血を抜き取り、酸クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）採血管に入れる。ＡＣＤ採血管中の血液の一部（１．５ｍＬ）を取り出し、１．５ｍＬ微量遠心管に入れる。血液に標準化オリゴヌクレオチド１０μＬを添加し、よく混合する。混合物を４℃において１６００ｇで１０分間遠心分離し、上清（「正規化血漿」）５５０μＬを取り出し、新しい微量遠心管に入れる。標準化された血漿を４℃において１６０００ｇで１０分間遠心分離する。上清（「標準化無細胞血漿」）を取り出し、新しい管に入れ、−８０℃で保存する。

【0198】

標準化された無細胞血漿を室温で１０分間解凍する。標準化された無細胞血漿を４℃において１６０００ｇで１０分間遠心分離して破片を除去する。無細胞ＲＮＡを、製造者の指示に従ってＰｌａｓｍａ／Ｓｅｒｕｍ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｓｌｕｒｒｙ Ｆｏｒｍａｔ）（Ｎｏｒｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｋ Ｃｏｒｐ．）を使用して単離する。無細胞ＲＮＡを−８０℃で保存する。

【0199】

［実施例２］
計算的設計および合成によるオリゴヌクレオチドの非ヒトコレクションの調製
ヌクレオチドの約６．７×１０^６の可能な異なるドメインは、１３ヌクレオチド長を有する。この理論上の配列プールから、ヒトＤＮＡ中に見られる任意の１３個のヌクレオチド配列を捨てると、約２．３×１０^６個の固有の１３個のヌクレオチド配列、すなわち全体の３．５％が残る。これらの２．３×１０^６個の非ヒト１３個のヌクレオチド配列から、以下の基準、すなわち１）融解温度の均一性、２）十分な配列複雑性、３）既知の病原体における結合部位の存在量、４）および既知の病原体間の結合部位分布に基づいて、非ヒト配列プールに含めるための約１×１０^６個を選択する。この約１×１０^６個の非ヒト１３個のヌクレオチド配列のセットに、１４〜２０ヌクレオチド長の付加的な非ヒト配列を加えて、戦略的病原体配列などの対象となる領域の被覆度を向上させ、これらのプライマーを１）融解温度、２）配列複雑性、３）既知の病原体における結合部位の存在量、および４）既知の病原体間の結合部位分布に基づいて設計する。１３〜２０ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインの全プールは完全非ヒト配列プールと呼ばれる。非ヒト配列プール中の各１３〜２０ヌクレオチド配列に、以下の核酸標識の１つまたは複数を含有する約１５〜２５ヌクレオチド長のさらなる５’配列を付加する：１）ＤＮＡ配列決定プライマー結合部位、２）サンプルバーコード、３）サンプルバーコード配列決定プライマー結合部位、および４）種々の配列決定プラットホーム要件に適合する増幅プライマー結合部位。このオリゴヌクレオチドのコレクションは、非ヒトプライマープールと呼ばれる。非ヒトプライマープールは化学的に合成する。あるいは、完全非ヒト配列プールを化学合成し、１つまたは複数の核酸標識を（例えばライゲーションによって）付加して非ヒトプライマープールを形成する。

【0200】

［実施例３］
ハイブリダイゼーションに基づく方法を用いたオリゴヌクレオチドの非ヒトコレクションの調製
約６７００万個の異なる１３個のヌクレオチド配列（例えば、ＮがＡ、Ｃ、ＧまたはＴである５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’）を、以下の核酸標識の１つまたは複数を含有する結合１５〜２５ヌクレオチドオーバーハングで化学的に合成する：１）ＤＮＡ配列決定プライマー結合部位、２）サンプルバーコード、３）サンプルバーコード配列決定プライマー結合部位、および４）種々の配列決定プラットホーム要件に適合する増幅プライマー結合部位。オリゴヌクレオチドのこの異種コレクションを、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．５×ＰＢＳ、２４μＭブロッカーオリゴヌクレオチド、ＲＮアーゼ阻害剤）中１０００倍質量過剰のビオチン化ヒト一本鎖ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）断片に９５℃で１０秒間、６５℃で３分間および３６℃で数時間〜数週間程度の一定量の時間ハイブリダイズさせる。インキュベーション期間の最後に、ヒトｇＤＮＡ断片を、断片にハイブリダイズしたプローブと共に、ストレプトアビジンビーズによって除去する。これらの条件下でヒトｇＤＮＡに結合しなかっらプローブの残りのプールに、１４〜２０ヌクレオチド長の付加的な非ヒト配列を補足して、戦略的病原体配列などの対象となる領域の被覆度を向上させ、これらのプライマーを１）融解温度、２）配列複雑性、３）既知の病原体における結合部位の存在量、および４）既知の病原体間の結合部位分布に基づいて設計する。オリゴヌクレオチドのコレクションは、非ヒトプライマープールと呼ばれる。

【0201】

［実施例４］
高収率での高縮重オリゴヌクレオチドの非ヒトコレクションの調製
非ヒト１３ｍｅｒを、全ての可能性のある１３ｍｅｒ配列を生成し、参照ヒトゲノムに現れるものを除去することによって計算的に決定する。次いで、非ヒト１３ｍｅｒを縮重度によって分類する。図１１Ｂのヒストグラムは、縮重度に基づく非ヒト１３ｍｅｒのバケット化を示す。

【0202】

次に、同じ縮重度の非ヒト１３ｍｅｒの可変オリゴヌクレオチド配列単位をウルトラマーオリゴヌクレオチドに分類する。ウルトラマーに含まれる縮重オリゴヌクレオチド配列単位の数は、各ユニット長および確実に合成され得るウルトラマー長に基づくことができる。図９は、いくつかのこのようなウルトラマーオリゴヌクレオチドの一般的な設計を示す。個々の縮重１３ｍｅｒは、デオキシウラシルヌクレオチド（Ｕ）によって分離され得る。次いで、設計されたウルトラマーオリゴヌクレオチドを、従来の核酸合成方法およびサービス提供者、例えばＩＤＴによって合成することができる。

【0203】

次いで、ウルトラマーオリゴヌクレオチドを、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）および脱塩基部位（例えば、アプリン／アピリミジン部位またはＡＰ部位）での特異性を有するエンドヌクレアーゼにより、個々の縮重非ヒト１３ｍｅｒオリゴヌクレオチドに消化することができる。この消化は、同じ縮重度を有する縮重１３ｍｅｒを有する全てのウルトラマーオリゴヌクレオチドについて同じ管で実施することができる。代表的な反応が図１０に記載されている。

【0204】

次いで、個々の縮重１３ｍｅｒを、例えばＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔ４ ＰＮＫ）を使用して、または図１２に示されるように化学的にビオチン化することができる。このステップは、例えば、表面固定化または磁気ビーズの精製が必要な場合に、任意である。ビオチン以外の他のプローブ（例えば、ジゴキシゲニン、蛍光プローブ等）をここで適用することができる。

【0205】

［実施例５］
オリゴヌクレオチドの非ヒトコレクションを用いた濃縮配列決定ライブラリーの調製
実施例１からの無細胞ＲＮＡを、ハイブリダイゼーション緩衝液（０．５×ＰＢＳ、２４μＭブロッカーオリゴヌクレオチド、ＲＮアーゼ阻害剤）中、９５℃で１０秒間、６５℃で３分間および３６℃で一晩、非ヒトプライマープール（実施例２または３に記載されるように調製）とハイブリダイズさせる。第１の鎖ｃＤＮＡ合成マスターミックス（逆転写酵素、ブロックされた第２の鎖合成オリゴヌクレオチド、ｄＮＴＰ、ＲＮアーゼ阻害剤および適当な緩衝液）を３６℃で添加し、その後、温度を９０分間４２℃に上昇させて、第１の鎖ｃＤＮＡ合成を可能にする。次いで、混合物を７０℃で１０分間インキュベートして逆転写酵素を不活性化し、４℃で保持する。

【0206】

第１の鎖ｃＤＮＡ産物を、市販のキットを用いて精製する。第２の鎖ｃＤＮＡを、前のステップ中に第１の鎖ｃＤＮＡの５’および３’末端に付加された固定配列にハイブリダイズするプライマーを使用するＰＣＲによって生成する。ＰＣＲによる第２の鎖合成の後、以下の核酸標識の１つまたは複数をさらなるラウンドのＰＣＲによって付加することができる：１）ＤＮＡ配列決定プライマー結合部位、２）サンプルバーコード、３）サンプルバーコード配列決定プライマー結合部位、および４）種々の配列決定プラットホーム要件に適合する増幅プライマー結合部位。最終的なｃＤＮＡライブラリーを、製造者の指示に従って市販のキットを用いて精製する。

【0207】

［実施例６］
オリゴヌクレオチドの非ヒトコレクションを用いたＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト配列について濃縮された配列決定ライブラリーの調製
配列決定可能なライブラリーを調製する。非ヒトプライマープールを実施例２または３に記載されるように調製し、プール中の個々のオリゴヌクレオチドの５’ビオチン化を促進する条件に供する。次いで、５’−ビオチン化非ヒトプライマープール１ｐｍｏｌを、ハイブリダイゼーション／重合緩衝液（緩衝液、ヌクレオチド、ブロッカーオリゴヌクレオチド）中の配列決定可能なライブラリー５００ｎｇに添加する。いくつかの場合、ＤＮＡハイブリダイゼーション反応の速度または特異性を増強する分子とのオリゴヌクレオチドのプレインキュベーションによって、ＲｅｃＡまたはＭｕｔＳなどの非宿主核酸断片の捕捉を改善することができる。ＤＮＡを９５℃で１０分間変性させる。非ヒトプライマーを５０℃で４時間配列決定ライブラリーにハイブリダイズさせる。５’エキソヌクレアーゼを欠く鎖置換ＤＮＡポリメラーゼを混合物に添加する。混合物を５５℃で１５分間インキュベートして、非ヒトプライマーを少なくとも２５塩基、またはその後のステップ中の安定な二本鎖ＤＮＡハイブリダイゼーションに十分な長さまで伸長させる。ストレプトアビジンビーズを混合物に添加してＤＮＡ断片を結合させる。ビーズ上の捕捉されたＤＮＡ断片を洗浄する。捕捉されたライブラリーＤＮＡ断片を、ＤＮＡ配列決定ライブラリー断片の末端のアダプターに特異的なプライマーおよびビーズ上に捕捉されたＤＮＡフ断片を鋳型として使用して、標準的なＰＣＲ増幅法を用いて増幅する。濃縮されたライブラリーを、標準的なＤＮＡ精製方法を用いて精製する。

【0208】

ライブラリーを、ＫＡＰＡ ＤＮＡライブラリー定量化キット（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて定量化し、製造業者の指示に従ってＮｅｘｔＳｅｑ ５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定するために調製する。配列決定は１５０サイクルの単一末端読み取りと８サイクルのバーコード読み取りからなる。

【0209】

配列読み取りを病原体のゲノムに計算的にマッピングして、１つまたは複数の核酸の１つまたは複数の供給源を同定する。

【0210】

［実施例７］
抗ヒトヒストン抗体および抗イムノグロブリン抗体を用いたヒトヌクレオソーム会合ＤＮＡ枯渇
無細胞ＤＮＡを、遠心分離法またはアルブミンおよび免疫グロブリン除去法のいずれかによって調製する。いずれの方法においても、最初にヒト血漿１ｍＬを４℃において１６００ｇで１０分間遠心分離する。遠心分離法の場合、上清（９５０μＬ）を回収し、純粋な試験管に移し、４℃において１６０００ｇで１０分間、再度遠心分離する。無細胞ＤＮＡを含有する上清９００μＬを回収し、新しい試験管に移す。アルブミンおよび免疫グロブリン除去法では、最初の遠心分離からの上清（９５０μＬ）を回収し、ヒトアルブミンおよびヒト免疫グロブリン結合カラム（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＡｌｂｕｍｉｎ ａｎｄ ＩｇＧ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ＳｐｉｎＴｒａｐまたはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製のＡｌｂｕｍｉｎ／ＩｇＧ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ）に流す。無細胞ＤＮＡを含有するフロースルーを回収し、新しい試験管に移す。

【0211】

上記のように、遠心分離またはアルブミンおよび免疫グロブリン除去によって調製された無細胞ＤＮＡを、１つまたは複数の抗ヒトヒストン抗体５μｇと混合し、ゆっくり回転させながら４℃で１時間〜一晩インキュベートする。抗体はヌクレオソームに結合して複合体を形成する。抗イムノグロブリン抗体にコンジュゲートした磁性ビーズの混合物を反応に添加して、ヒトヌクレオソーム−抗体複合体を血漿サンプルから隔離する。抗イムノグロブリン抗体には、前のステップで添加された抗ヒトヒストン抗体の同位体に結合するのに必要な抗体の組み合わせが含まれる。混合物を室温で１時間、または４℃で５時間〜一晩インキュベートする。結合したヒトヌクレオソーム−抗体複合体を有する磁気ビーズを磁気スタンド上でペレット化する。上清を慎重に回収して、磁気ビーズ分画の残遺物を回収しない。得られた上清を市販のキット（例えば、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、病原体無細胞ＤＮＡを濃縮する。

【0212】

［実施例８］
プロテインＡおよび／またはＧにコンジュゲートした抗ヒトヒストン抗体および磁気ビーズを用いたヒトヌクレオソーム会合ＤＮＡ枯渇
実施例６のアルブミンおよび免疫グロブリン除去法を用いて調製された無細胞ＤＮＡを含有するフロースルーを、１つまたは複数の抗ヒトヒストン抗体５μｇと混合し、ゆっくり回転させながら４℃で１時間〜一晩インキュベートする。ヒトヌクレオソーム−抗体複合体を、プロテインＡおよび／またはＧにコンジュゲートした磁気ビーズを添加することによって、溶液から隔離する。混合物を室温で１時間、または４℃で５時間〜一晩インキュベートする。結合したヒトヌクレオソーム−抗体複合体を有する磁気ビーズを磁気スタンド上でペレット化する。上清を慎重に回収して、磁気ビーズ分画の残遺物を回収しない。得られた上清を市販のキット（例えば、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、病原体無細胞ＤＮＡを濃縮する。

【0213】

［実施例９］
抗ヒトヒストン抗体およびスピンカラムを用いたヒトヌクレオソーム会合ＤＮＡ枯渇
実施例６の抗アルブミン−免疫グロブリン法を用いて調製された無細胞ＤＮＡを含有するフロースルーを、１つまたは複数の抗ヒトヒストン抗体５μｇと混合し、ゆっくり回転させながら４℃で１時間〜一晩インキュベートする。ヌクレオソーム−抗体複合体を、プロテインＡ／Ｇまたは抗免疫グロブリン抗体で機能化したスピンカラムを通して溶液を流すことによって精製する。フロースルーを市販のキット（例えば、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、病原体無細胞ＤＮＡを濃縮する。

【0214】

［実施例１０］
ＤＮＡ沈降によるヒトヌクレオソーム会合ＤＮＡ枯渇
ＤＮＡ凝縮剤（例えば、スペルミン）を用いた血漿遠心分離の後、ヌクレオソームを含まない無細胞ＤＮＡおよびヌクレオソーム結合無細胞ＤＮＡが沈殿する。沈殿を遠心分離によって回収し、上清を捨てる。ペレットを、ヒトヌクレオソームへの抗ヒトヒストン抗体結合に最適化された緩衝液に溶解する。得られた抗原−抗体複合体を、プロテインＡ／Ｇまたは抗免疫グロブリン抗体のいずれかにコンジュゲートした磁気ビーズに結合させ、磁気ビーズを磁石スタンド上でペレット化し、上清を回収することによって隔離する。得られた上清を市販のキット（例えば、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、病原体無細胞ＤＮＡを濃縮する。

【0215】

［実施例１１］
オリゴヌクレオチドの非ヒトコレクションにおけるヌクレオチドドメインのためのヌクレオチド長の最適化
非ヒトプライマープール中のヌクレオチドドメインの長さを選択する場合に、いくつかのパラメータを最適化する。目標は、非ヒト核酸を検出するための最大限の感度を提供する、最小数の異なる配列を有するプールを生成することである。ヌクレオチドドメインの長さが増加するにつれて、ｋの長さを有するヌクレオチドのドメインが４^ｋの順列を有するので、より多数の異なるプローブが配列空間をカバーするために必要とされる。プール中のプローブの数を、個々の配列がより高い濃度で存在し、より速いハイブリダイゼーション速度論を促進するように、可能な限り少なく保つ。この考察は、より短いプライマーに有利である。同時に、プライマーの長さが増加するにつれて、その長さの可能な全配列のより小さな割合がヒト配列に結合するであろう。これは、全ゲノム空間のより高い割合が非ヒトプライマーのプールに残され、非ヒト配列のより高い被覆度をもたらし、より高い感度を提供することを意味する。例えば、１３ヌクレオチド長の可能な配列の３．５％（２３０万）のみがヒト参照ゲノムに見出されず、これは１３ヌクレオチド長の非ヒト配列のプールが非ヒト核酸中の全ての可能な１３ヌクレオチド伸長の３．５％のみに結合することを意味する。対照的に、１４ヌクレオチド長の可能な配列の１５．２％（４０７０万）はヒト参照ゲノムには見出されない。非ヒト核酸における全ての可能な１４ヌクレオチド伸長の１５．２％が理論的に検出され得る。一定の既存のベンダーを使用して合理的に合成するには、４０７０万個のプローブは多すぎる可能性がある。各プローブが総プローブ濃度の１／４０７０万で存在する場合、個々のプローブの濃度は、ハイブリダイゼーションを促進する他の手段をとらない限り、平衡状態でその相補配列に好都合に結合するには低すぎる可能性がある。この知見により、１３ヌクレオチド長より長いプローブセットを除外することができる。あるいは、１３ヌクレオチド長より短い配列は、ヒト参照ゲノムにおいてあまりに頻繁に見出されるので、ほぼ全てのプライマーが非ヒトプールから除去される。例えば、１２ヌクレオチド長では、可能性のある配列の９９．７４％がヒト参照ゲノムに見出される。これは、非ヒトプライマーのプールが、病原体中の可能な１２個のヌクレオチド配列のうち０．２６％ほどにしか結合せず、限られた感度を提供することを意味する。１３ヌクレオチド長のヌクレオチドのドメインは、ハイブリダイゼーション反応において合理的な速度論を有するのに十分少ないプローブ（１０００万個未満の異なるプローブ）で十分な感度（非ヒトゲノム中３０ヌクレオチド毎に約１結合部位）を提供する。

【0216】

［実施例１２］
無細胞ＤＮＡにおける短い断片の選択的濃縮
サイズ濃縮プロトコルを、比較的短い断片長を有する無細胞ＤＮＡの選択のために最適化した。無細胞ＤＮＡを、以下の修飾をしたＱｉａｇｅｎ ＣＮＡキットを用いてヒト無細胞血漿から抽出した：（ａ）３倍量のＡＣＢ緩衝液を使用した、（ｂ）ＡＣＷ１緩衝液を製造業者の推奨に従って調製し、ＡＣＷ１緩衝液６００μＬあたりさらに無水エタノール１．７５ｍＬおよび塩化グアニジニウム０．３６ｇを補足し、（ｃ）ＡＣＷ２緩衝液を製造業者の推奨に従って調製し、ＡＣＷ２緩衝液７５０μＬあたり１．０５ｍＬの無水エタノールを補足した。こうして単離した無細胞ＤＮＡを、アダプターライゲーションおよびライブラリー増幅後の１．８×Ａｍｐｕｒｅ精製ステップでＮｕＧｅｎのＯｖａｔｉｏｎ Ｕｌｔｒａｌｏｗ Ｖ２ライブラリーキットに使用した。次いで、ライブラリーを配列決定し、読み取りをヒトおよび病原体データベースにマッピングした。次いで、マッピングされた読み取りを調査した。

【0217】

特に、図８Ａは、宿主またはヒトＤＮＡ（ｃｈｒ２１）と非宿主または病原体ＤＮＡの両方について、無細胞ＤＮＡの量（配列読み取り数の関数として測定）対ＤＮＡ配列が由来する断片長さのプロットを示している。示されるように、非宿主ＤＮＡは、約３０〜約１００塩基長の断片長で、宿主ＤＮＡに対してはるかに好ましい比を享受する。したがって、このサイズ範囲の断片の濃縮は、宿主ＤＮＡに対して非宿主について濃縮すると予想される。

【0218】

公知のヒトまたは病原体配列にマッピングしないように構成された等モルの無細胞合成ＤＮＡサイズコントロール（例えば、３２、５２、７５、１００、１２５、１５０、１７５および３５０ｂｐの断片）を含むＤＮＡサンプルについて、修正Ｑｉａｇｅｎ ＣＮＡ精製キットを用いて、所望のサイズ範囲の断片の濃縮を試験した。

【0219】

図８Ｂは、より大きな断片（例えば、８個のＤＮＡサイズコントロール断片長のうちの１７５ｂｐのピーク濃縮で１００〜２００塩基長）について選択された通常のＣＮＡキットプロトコルを用いて処理した場合のサンプルの断片サイズプロファイルを示し、修飾されたプロトコルは、８つのＤＮＡサイズコントロール断片長のうちの７５ｂｐでピーク濃縮を有する３０塩基〜約１２０塩基の断片を選択的に濃縮した。

【0220】

本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明してきたが、このような実施形態が単なる例示として提供されることが当業者に自明であろう。本発明から逸脱することなく、当業者には多数の変形、変更および置換が思い浮かぶだろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替物が、本発明の実施において採用され得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲は本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物がこれにより網羅されることが意図される。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】