特許 6873984 ＡＸＭＩ５５４デルタ−エンドトキシン遺伝子およびその使用方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6873984

(24)【登録日】2021年4月23日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】ＡＸＭＩ５５４デルタ−エンドトキシン遺伝子およびその使用方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/31 20060101AFI20210510BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210510BHJP

   A01H 6/46 20180101ALI20210510BHJP

   A01H 6/20 20180101ALI20210510BHJP

   A01H 6/14 20180101ALI20210510BHJP

   A01H 6/82 20180101ALI20210510BHJP

   A01H 6/54 20180101ALI20210510BHJP

   A01H 6/60 20180101ALI20210510BHJP

   A01H 6/02 20180101ALI20210510BHJP

   A01H 5/00 20180101ALI20210510BHJP

   A01H 5/10 20180101ALI20210510BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20210510BHJP

   A23L 5/00 20160101ALI20210510BHJP

   A61K 8/00 20060101ALI20210510BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20210510BHJP

   A61Q 5/00 20060101ALI20210510BHJP

   A01P 5/00 20060101ALI20210510BHJP

   A01P 7/00 20060101ALI20210510BHJP

   A01P 3/00 20060101ALI20210510BHJP

   A01N 63/27 20200101ALI20210510BHJP

   A01N 63/00 20200101ALI20210510BHJP

   A23K 20/147 20160101ALI20210510BHJP

   C07K 14/21 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/31ZNA

   C12N15/63 Z

   C12N1/21

   C12N1/19

   C12N1/15

   C12N5/10

   A01H6/46

   A01H6/20

   A01H6/14

   A01H6/82

   A01H6/54

   A01H6/60

   A01H6/02

   A01H5/00 A

   A01H5/10

   C12P21/02 C

   A23L5/00 M

   A61K8/00

   A61K8/64

   A61Q5/00

   A01P5/00

   A01P7/00

   A01P3/00

   A01N63/27

   A01N63/00

   A23K20/147

   !C07K14/21

【請求項の数】26

【全頁数】56

(21)【出願番号】特願2018-519284(P2018-519284)

(86)(22)【出願日】2016年10月13日

(65)【公表番号】特表2019-501628(P2019-501628A)

(43)【公表日】2019年1月24日

(86)【国際出願番号】US2016056898

(87)【国際公開番号】WO2017066479

(87)【国際公開日】20170420

【審査請求日】2019年9月30日

(31)【優先権主張番号】62/241,220

(32)【優先日】2015年10月14日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507124988

【氏名又は名称】バイエル クロップサイエンス エルピー

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＥＲ ＣＲＯＰＳＣＩＥＮＣＥ ＬＰ

(73)【特許権者】

【識別番号】507203353

【氏名又は名称】バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100091982

【弁理士】

【氏名又は名称】永井 浩之

(74)【代理人】

【識別番号】100091487

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 行孝

(74)【代理人】

【識別番号】100082991

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤 泰和

(74)【代理人】

【識別番号】100105153

【弁理士】

【氏名又は名称】朝倉 悟

(74)【代理人】

【識別番号】100126099

【弁理士】

【氏名又は名称】反町 洋

(72)【発明者】

【氏名】エリーゼ、ロジャーズ−ビエイラ

(72)【発明者】

【氏名】キンバリー、サンプソン

(72)【発明者】

【氏名】デュアン、レーチネン

(72)【発明者】

【氏名】ペーター、レーゼル

(72)【発明者】

【氏名】ダニエラ、ポーツ

(72)【発明者】

【氏名】ナナサヘブ、チョーウール

【審査官】 原 大樹

(56)【参考文献】

【文献】 中国特許出願公開第１０４８４５９１３（ＣＮ，Ａ）

【文献】 特表２０１４−５２６８９３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１５／０３８７３４（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｐ

Ｃ０７Ｋ

Ａ０１Ｎ

Ａ０１Ｐ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

殺有害生物活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え核酸分子であって、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号２、３のいずれかに規定されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、組み換え核酸分子。

【請求項2】

前記ヌクレオチド配列が、植物における発現のために設計されている合成配列である、請求項１に記載の組み換え核酸分子。

【請求項3】

前記ヌクレオチド配列が、植物細胞における前記ヌクレオチド配列の発現を誘導することができるプロモーターに動作可能に連結されている、請求項１に記載の組み換え核酸分子。

【請求項4】

請求項１に記載の組み換え核酸分子を含むベクター。

【請求項5】

非相同ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項４に記載のベクター。

【請求項6】

請求項１に記載の組み換え核酸を含む、宿主細胞。

【請求項7】

細菌宿主細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。

【請求項8】

植物細胞である、請求項６に記載の宿主細胞。

【請求項9】

請求項８に記載の宿主細胞を含む、遺伝子組み換え植物。

【請求項10】

トウモロコシ、ソルガム、コムギ、キャベツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギおよびナタネからなる群から選択される、請求項９に記載の遺伝子組み換え植物。

【請求項11】

請求項１に記載の核酸分子を含む、遺伝子組み換え種子。

【請求項12】

ａ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
ｂ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群から選択される、殺有害生物活性を有する組み換えポリペプチド。

【請求項13】

非相同アミノ酸配列をさらに含む、請求項１２に記載のポリペプチド。

【請求項14】

請求項１２に記載のポリペプチドを含む、組成物。

【請求項15】

粉末、細粉、ペレット、顆粒、スプレー、エマルジョン、コロイドおよび溶液からなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。

【請求項16】

細菌細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈殿または濃縮によって調製される、請求項１４に記載の組成物。

【請求項17】

１重量％〜９９重量％の前記ポリペプチドを含む、請求項１４に記載の組成物。

【請求項18】

鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫または双翅類の有害生物を防除する方法であって、殺有害生物的に有効な量の請求項１２に記載のポリペプチドを前記有害生物と接触させる工程を含む、方法。

【請求項19】

鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅類の有害生物を殺滅する方法であって、殺有害生物的に有効な量の請求項１２に記載のポリペプチドを前記有害生物と接触させるか、または前記有害生物に給餌する工程を含む、方法。

【請求項20】

殺有害生物活性を有するポリペプチドを製造する方法であって、前記ポリペプチドをコードする前記核酸分子が発現される条件下において、請求項６に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。

【請求項21】

殺有害生物活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物がゲノム中に安定的に組み込まれた植物または植物細胞であって、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号２、３のいずれかに規定されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、植物または植物細胞。

【請求項22】

有害生物から植物を保護する方法であって、殺有害生物性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を植物またはその細胞において発現させる工程を含み、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号２、３のいずれかに規定されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択される、方法。

【請求項23】

前記植物が、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫または双翅類の有害生物に対する殺有害生物活性を有する殺有害生物性ポリペプチドを産生する、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

植物の収量を増加させる方法であって、殺有害生物活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築物がゲノムに安定的に組み込まれた植物またはその種子を野外で成長させる工程を含み、前記ヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号２、３のいずれかに規定されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；および
ｃ）配列番号４、５のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも９６％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択され、
前記野外において、前記ポリペプチドが殺有害活性を有する前記有害生物が蔓延している、方法。

【請求項25】

植物を有害生物から保護するための請求項１に記載の核酸の使用であって、前記核酸によってコードされる前記ポリペプチドが前記有害生物に対して殺有害生物活性を有する、使用。

【請求項26】

請求項１に記載の核酸分子またはそれによってコードされるタンパク質を含む商品生産物であって、前記生産物が、全体種子もしくは加工種子、または穀物、動物飼料、コーンもしくはダイズミール、コーンまたはダイズ粉、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質分離物、組織化ダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ダイズナッツバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、ホイップドトッピング、ショートニング、レシチン、食用全ダイズ、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、ゆば、および調理されるか、精白されるか、蒸されるか、焼かれるかもしくは湯通しされた穀物からなる群から選択される、商品生産物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１５年１０月１４日出願の米国仮特許出願第６２／２４１／２２０号明細書の優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0002】

本発明は、分子生物学の分野に関する。殺有害生物性タンパク質をコードする新規遺伝子が提供される。これらのタンパク質およびそれをコードする核酸配列は、殺有害生物性調合物の調製および遺伝子組み換え有害生物耐性植物の製造に有用である。

【背景技術】

【0003】

バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）は、特定の目および種の昆虫に特異的に毒性であるが、植物および他の非ターゲット有機体には無害である結晶性封入体を産生するその能力で特徴付けられるグラム陽性の胞子形成土壌細菌である。そのため、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）菌株またはその殺虫性タンパク質を含む組成物は、様々なヒトまたは動物疾患に関わる農業害虫または媒介昆虫を防除するための環境上許容される殺虫剤として使用することができる。

【0004】

バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からの結晶（Ｃｒｙ）タンパク（デルタ−エンドトキシン）は、主に鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａｎ）、双翅類（Ｄｉｐｔｅｒａｎ）、および鞘翅目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ）の幼虫に対して強力な殺虫活性を有する。これらのタンパク質はまた、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ）、食毛目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、およびダニ類（Ａｃａｒｉ）有害生物目、ならびに線形動物門（Ｎｅｍａｔｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、扁刑動物門（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）、および肉質鞭毛虫門（Ｓａｒｃｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ）などの他の無脊椎動物目に対しても活性を示している（Ｆｅｉｔｅｌｓｏｎ（１９９３）Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｆａｍｉｌｙ ｔｒｅｅ．Ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）。これらのタンパク質は、元々、その殺虫活性に主に基づいてＣｒｙＩ〜ＣｒｙＶとして分類されていた。主なクラスは、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）特異的（Ｉ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）特異的（ＩＩ）、甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）特異的（ＩＩＩ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）特異的（ＩＶ）、ならびに線虫特異的（Ｖ）および（ＶＩ）であった。タンパク質はさらに亜科へ分類された。各系統内のより高度に関連したタンパク質は、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃなどの分割文字を割り当てられた。各区分内のさらにより密接に関連したタンパク質は、Ｃｒｙ１Ｃ１、Ｃｒｙ１Ｃ２などの名称を与えられた。

【0005】

命名法は、昆虫ターゲット特異性よりもむしろアミノ酸配列相同に基づいたＣｒｙ遺伝子に関して記載された（Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３）。この分類において、各毒素は、第１ランク（アラビア数字）、第２ランク（大文字）、第３ランク（小文字）、および第４ランク（別のアラビア数字）を組み込んだ独特の名称を割り当てられる。ローマ数字が第１ランクにおいてアラビア数字と交換されてきた。４５％未満の配列同一性のタンパク質は、異なる第１ランクを有し、第２ランクおよび第３ランクについての判断基準は、それぞれ７８％および９５％である。

【0006】

結晶タンパクは、それが摂取され、昆虫中腸において可溶化されるまで殺虫活性を示さない。摂取されたプロトキシンは、昆虫消化管においてプロテアーゼによって活性毒性物質に加水分解される（Ｈｏｅｆｔｅ ａｎｄ Ｗｈｉｔｅｌｅｙ（１９８９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５３：２４２−２５５）。この毒素は、ターゲット幼虫の中腸において、心尖部刷子縁受容体に結合し、心尖部膜生成イオンチャネルまたは孔に入り込み、幼虫死亡をもたらす。

【0007】

デルタ−エンドトキシンは、一般に、５つの保存配列ドメインと、３つの保存構造ドメインとを有する（例えば、ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７：１９３−１９９を参照されたい）。第１保存構造ドメインは、７つのアルファヘリックスからなり、膜内挿入および孔形成に関与する。ドメインＩＩは、ギリシャキーボード配列に配置された３つのベータ−シートからなり、ドメインＩＩＩは、「ジェリー−ロール」形の２つの逆平行ベータ−シートからなる（ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．２００１、上記参照）。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、受容体認識および結合に関与し、したがって毒素特異性の考えられる決定因子である。

【0008】

デルタ−エンドトキシンは別として、いくつかの他の公知クラスの殺有害生物性タンパク毒素がある。ＶＩＰ１／ＶＩＰ２毒素（例えば、米国特許第５，７７０，６９６号明細書を参照されたい）は、他の二元（「Ａ／Ｂ」）毒素の作用モードに類似した、受容体媒介エンドサイトーシス、引き続く細胞毒化に関与すると考えられるメカニズムによって強い活性を昆虫に示す二元殺有害生物性毒素である。ＶＩＰ、Ｃ２、ＣＤＴ、ＣＳＴ、または炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）浮腫および致死毒素などのＡ／Ｂ毒素は、まず、モノマーとしての「Ｂ」成分の特異的な受容体媒介結合によってターゲット細胞と相互作用する。これらのモノマーは、次にホモヘプタマーを形成する。「Ｂ」ヘプタマー−受容体錯体は、したがって、その後に結合し、かつ受容体−媒介エンドサイトーシスによってシトソルへの酵素的「Ａ」成分の転座を可能にするドッキングプラットフォームとしての役割を果たす。細胞のシトソル内部では、「Ａ」成分は、例えば、Ｇ−アクチンのＡＤＰリボシル化、または環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）の細胞内レベルの増加によって正常な細胞機能を阻害する。Ｂａｒｔｈ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｖ ６８：３７３−４０２を参照されたい。

【0009】

Ｂ．チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ベースの殺虫剤の集中的な使用は、コナガ（ｄｉａｍｏｎｄｂａｃｋ ｍｏｔｈ）、プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）の野外集団において耐性を既に生じさせている（Ｆｅｒｒｅ ａｎｄ Ｖａｎ Ｒｉｅ（２００２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．４７：５０１−５３３）。耐性の最も一般的なメカニズムは、その特異的な中腸受容体への毒素の結合の減少である。これはまた、同じ受容体を共有する他の毒素に対する交差抵抗性を付与し得る（Ｆｅｒｒｅ ａｎｄ Ｖａｎ Ｒｉｅ（２００２））。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

昆虫がもたらし得る荒廃および害虫を防除することによる収量の向上のために、新しい形態の殺有害生物性毒素を発見することが耐えず必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0011】

殺有害生物活性を細菌、植物、植物細胞、組織および種子に付与するための組成物および方法が提供される。組成物は、殺有害生物性および殺虫性ポリペプチドのための配列をコードする核酸分子と、それらの核酸分子を含むベクターと、ベクターを含む宿主細胞とを含む。組成物はまた、殺有害生物性ポリペプチド配列と、それらのポリペプチドに対する抗体とを含む。ヌクレオチド配列は、微生物および植物を含む、有機体における形質転換および発現のためのＤＮＡ構築物または発現カセットに使用され得る。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、微生物または植物を含むが、それらに限定されない有機体における発現のために設計された合成配列であってもよい。組成物はまた、本発明のヌクレオチド配列を含む細菌、植物、植物細胞、組織、および種子を含む。

【0012】

特に、殺有害生物性タンパク質をコードする単離または組み換え核酸分子が提供される。さらに、殺有害生物性タンパク質に対応するアミノ酸配列が包含される。特に、本発明は、配列番号４〜１１に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列または配列番号１〜３に規定されるヌクレオチド配列、ならびにその生物学的な活性な変異体および断片を含む単離または組み換え核酸分子を提供する。本発明のヌクレオチド配列を相補するヌクレオチド配列、または本発明の配列もしくはその相補体にハイブリッド形成するヌクレオチド配列も包含される。本発明のヌクレオチド配列または本発明のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、ならびにそれらの生物学的に活性な変異体および断片を含むベクター、宿主細胞、植物、および種子がさらに提供される。

【0013】

本発明のポリペプチドを製造する方法、および鱗翅目、半翅目、鞘翅目、線虫、または双翅類の有害生物を防除または殺滅するためにそれらのポリペプチドを使用する方法が提供される。試料中の本発明の核酸およびポリペプチドを検出するための方法およびキットも含まれる。

【0014】

本発明の組成物および方法は、高められた有害生物抵抗性または耐性を有する有機体の製造に有用である。これらの有機体および有機体を含む組成物は、農業目的のために望ましい。本発明の組成物はまた、殺有害生物活性を有する変性もしくは改良タンパクを発生させるか、または産物もしくは有機体中の殺有害生物性タンパク質もしくは核酸の存在を検出するのに有用である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明は、有機体、特に植物または植物細胞における有害生物抵抗性または耐性を調整するための組成物および方法に関する。「抵抗性」とは、有害生物（例えば、昆虫）が本発明のポリペプチドの摂取またはポリペプチドとの他の接触時に殺滅されることを意図する。「耐性」とは、有害生物の移動、摂食、生殖、または他の機能の機能障害または低下を意図する。本方法は、有機体を、本発明の殺有害生物性タンパク質をコードするヌクレオチド配列で形質転換する工程を含む。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺有害生物活性を有する植物および微生物を調製するのに有用である。したがって、形質転換された細菌、植物、植物細胞、植物組織および種子が提供される。組成物は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）または他の種の殺有害生物性核酸およびタンパク質である。本配列は、他の相同の（または部分的に相同の）遺伝子の単離のためのプローブ、ならびにエンドトキシンのＣｒｙ１、Ｃｒｙ２、およびＣｒｙ９系統のメンバーを使用した、例えばドメイン交換またはＤＮＡシャフリングなどの当技術分野において公知の方法による変性殺有害生物性タンパク質の発生のためのプローブとして、興味のある有機体へのその後の形質転換のための発現ベクターの構築に用いられる。本タンパク質は、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、双翅類、および線虫有害生物を防除または殺滅し、かつ殺有害生物活性を有する組成物を製造するために用いられる。

【0016】

「殺有害生物性毒素」または「殺有害生物性タンパク質」とは、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、および甲虫目（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、もしくは線虫（Ｎｅｍａｔｏｄａ）門のメンバーを含むが、それらに限定されない、１種以上の有害生物に対して毒性作用を有する毒素、またはそのようなタンパク質への相同を有するタンパク質を意図する。殺有害生物性タンパク質は、例えば、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、クロストリジウム・ビフェルメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）およびパエニバチルス・ポピリアエ（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ）を含む有機体から単離されている。殺有害生物性タンパク質は、本明細書に開示される全長ヌクレオチド配列から推測されるアミノ酸配列と、代わりの下流出発部位の使用によるか、殺有害生物活性を有するより短いタンパク質を産生するプロセシングによるかのいずれかにより、全長配列よりも短いアミノ酸配列とを含む。プロセシングは、タンパク質が発現される有機体中またはタンパク質の摂取後の有害生物中で起こってもよい。

【0017】

殺有害生物性タンパク質は、デルタ−エンドトキシンを包含する。デルタ−エンドトキシンは、ｃｒｙ１〜ｃｒｙ７２、ｃｙｔ１およびｃｙｔ２、ならびにＣｙｔ様の毒素と特定されるタンパクを含む。現在、広範囲の特異性および毒性を有するデルタ−エンドトキシンの２５０超の公知種が存在する。包括的なリストについては、Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：８０７−８１３を参照されたく、また定期的なアップデートについては、ｗｗｗ．ｂｉｏｌｓ．ｓｕｓｘ．ａｃ．ｕｋ／Ｈｏｍｅ／Ｎｅｉｌ＿Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅ／Ｂｔ／ｉｎｄｅｘでのＣｒｉｃｋｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（２００３）「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｏｘｉｎ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ」を参照されたい。

【0018】

したがって、殺有害生物活性を付与する新規の単離または組み換えヌクレオチド配列が本明細書で提供される。これらのヌクレオチド配列は、公知のデルタ−エンドトキシンまたは二元毒素と相同のポリペプチドをコードする。また、殺有害生物性タンパク質のアミノ酸配列も提供される。この遺伝子の翻訳から生じるタンパク質は、細胞がそれを摂取する有害生物を防除または殺滅することを可能にする。

【0019】

単離された核酸分子、ならびにその変異体および断片
本発明の一態様は、殺有害生物性のタンパク質およびポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分、ならびに配列相同の領域を有するタンパク質をコードする核酸分子を特定するためのハイブリッド形成プローブとして使用するのに十分な核酸分子をコードするヌクレオチド配列を含む、単離または組み換え核酸分子に関する。また、本明細書において他の箇所で定義されるような厳しい条件下で本発明のヌクレオチド配列にハイブリッド形成することができるヌクレオチド配列も本明細書に包含される。本明細書で用いる場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、組み換えＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチド相似体を使用して発生したＤＮＡまたはＲＮＡの相似体を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖または二本鎖ＤＮＡであり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。用語「組み換え」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが天然に存在するものと（例えば、化学組成または構造の点で）異なるように、天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して操作されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを包含する。別の実施形態では、「組み換え」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する有機体のゲノムＤＮＡ中に自然発生する内部配列（すなわち、イントロン）を含まない。そのようなポリヌクレオチドの典型的な例は、いわゆる相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である。

【0020】

単離または組み換え核酸（またはＤＮＡ）は、その自然環境、例えばインビトロ細胞または組み換え細菌細胞もしくは植物宿主細胞にもはや存在しない核酸（またはＤＮＡ）に言及するために本明細書で用いられる。いくつかの実施形態では、単離または組み換え核酸は、核酸の側面に必然的に位置する配列（好ましくはタンパク質コーディング配列）（すなわち、核酸の５’および３’エンドにある配列）を、核酸が由来する有機体のゲノムＤＮＡ中に含まない。本発明の目的のために、核酸分子に言及するために用いられる場合の「単離された」は、単離された染色体を排除する。例えば、様々な実施形態では、単離されたデルタ−エンドトキシンコーディング核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中で核酸分子の側面に必然的に位置する、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含有することができる。様々な実施形態では、細胞物質を実質的に含まないデルタ−エンドトキシンタンパク質は、約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満の非デルタ−エンドトキシンタンパク質（本明細書では「夾雑タンパク質」とも呼ばれる）を有するタンパク質の調製を含む。いくつかの実施形態では、本発明の組み換え核酸は、配列番号１に対して１つ以上のヌクレオチド置換体、またはそれらの変異体もしくは断片を含む。

【0021】

本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１〜３に規定される配列、ならびにその変異体、断片、および相補体を含む。「相補体」とは、それが所与のヌクレオチド配列にハイブリッド形成してそれによって安定した二本鎖を形成することができるように所与のヌクレオチドを十分に相補するヌクレオチド配列を意図する。これらのヌクレオチド配列によってコードされる殺有害生物性タンパク質についての対応するアミノ酸配列は、配列番号４〜１１に規定される。

【0022】

殺有害生物性タンパク質をコードするこれらのヌクレオチド配列の断片である核酸分子も本発明によって包含される。「断片」とは、殺有害生物性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部を意図する。ヌクレオチド配列の断片は、殺有害生物性タンパク質の生物学的に活性な部分をコードし得るか、またはそれは、以下に開示される方法を用いてハイブリッド形成プローブもしくはＰＣＲプライマーとして使用することができる断片であり得る。殺有害生物性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片である核酸分子は、意図される使用に応じて、本明細書に開示される殺有害生物性タンパク質をコードする全長ヌクレオチド配列中に存在する、少なくとも約５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１３５０、１４００の連続的なヌクレオチド、または最大でその数のヌクレオチドを含む。「連続的な」ヌクレオチドとは、互いに直隣接しているヌクレオチド残基を意図する。本発明のヌクレオチド配列の断片は、殺有害生物性タンパク質の生物学的な活性を保持し、したがって殺有害生物活性を保持するタンパク質断片をコードするであろう。したがって、本明細書に開示されるポリペプチドの生物学的に活性な断片も包含される。「活性を保持する」とは、断片が、殺有害生物性タンパク質の殺有害生物活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％またはそれを超えて有するであろうことを意図する。一実施形態では、殺有害生物活性は殺鞘翅目の活性である。別の実施形態では、殺有害生物活性は殺鱗翅目の活性である。別の実施形態では、殺有害生物活性は殺線虫の活性である。別の実施形態では、殺有害生物活性は殺双翅目活性である。別の実施形態では、殺有害生物活性は殺半翅目の活性である。殺有害生物活性を測定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、すべてその全体が参照により本明細書に援用されるＣｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい。

【0023】

本発明のタンパク質の生物学的に活性な部分をコードする殺有害生物性タンパク質をコードするヌクレオチド配列の断片は、本発明の全長殺有害生物性タンパク質中に存在する、少なくとも約１５、２５、３０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０の連続的なアミノ酸、または最大でその総数までのアミノ酸をコードするであろう。いくつかの実施形態では、断片は、タンパク質分解開裂断片である。例えば、タンパク質分解開裂断片は、配列番号４〜１１に対して少なくとも約１００のアミノ酸、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、または約１６０のアミノ酸のＮ末端またはＣ末端切断を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に包含される断片は、例えば、コード配列中の終止コドンのタンパク質分解または挿入によるＣ末端結晶化ドメインの除去から生じる。

【0024】

様々な実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１〜３のいずれかの縮重した核酸を含み、ここで、前記縮重したヌクレオチド配列は、配列番号４〜１１のいずれかと同じアミノ酸配列をコードする。

【0025】

本発明の好ましい殺有害生物性タンパク質は、配列番号１〜３のヌクレオチド配列に十分に同一のヌクレオチド配列によってコードされるか、または殺有害生物性タンパク質は、配列番号４〜１１に規定されるアミノ酸配列に十分に同一である。「十分に同一の」とは、標準パラメータを使用して本明細書に記載されるアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比べて少なくとも約６０％または６５％の配列同一性、約７０％または７５％の配列同一性、約８０％または８５％の配列同一性、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意図する。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置調整などを考慮に入れることにより、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整できることを認めるであろう。

【0026】

２つのアミノ酸配列または２つの核酸のパーセント同一性を決定するために、配列は、最適比較目的のために整列される。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、パーセント同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、オーバーラップする位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。別の実施形態では、パーセント同一性は、参照配列（すなわち、配列番号１〜１１のいずれかとして本明細書に開示される配列）の全体にわたって計算される。２つの配列間のパーセント同一性は、許容ギャップありまたはなしで、以下に記載されるものに類似の技術を用いて決定することができる。パーセント同一性を計算する際、典型的には完全一致がカウントされる。ギャップ、すなわちある残基が１つの配列中に存在するが、他方には存在しないアラインメント中の位置は、非同一性残基の位置と見なされる。

【0027】

２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５８７７におけるように修正される、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の殺有害生物性様核酸分子とのヌクレオチド配列相同を得るために、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を使用して行うことができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明の殺有害生物性タンパク質分子とのアミノ酸配列相同を得るために、ＢＬＡＳＴＸプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を使用して行うことができる。比較目的のためのギャップ付アラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ ２．０において）を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９に記載されるように利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて分子間の距離関係を検出する反復検索を行うことができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）（上記参照）を参照されたい。ＢＬＡＳＴを利用する場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラム、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＮ）を用いることができる。アラインメントはまた、検査によって手動により行われ得る。

【0028】

配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）である。ＣｌｕｓｔａｌＷは、配列を比較し、アミノ酸またはＤＮＡ配列全体を整列させ、このようにしてアミノ酸配列全体の配列保存に関するデータを提供することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｐｒｏｇｒａｍ Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＡＬＩＧＮＸモジュールなど、いくつかの商業的に入手可能なＤＮＡ／アミノ酸解析ソフトウェアパッケージにおいて用いられている。ＣｌｕｓｔａｌＷでのアミノ酸配列のアラインメント後、パーセントアミノ酸同一性を評価することができる。ＣｌｕｓｔａｌＷアラインメントの解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例はＧＥＮＥＤＯＣ^ＴＭである。ＧＥＮＥＤＯＣ^ＴＭ（Ｋａｒｌ Ｎｉｃｈｏｌａｓ）は、アミノ酸（またはＤＮＡ）類似性および多種タンパク質間の同一性のアセスメントを可能にする。配列の比較のために利用される数学アルゴリズムの別の非限定的な例は、Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ １０（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．，９６８５ Ｓｃｒａｎｔｏｎ Ｒｄ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能な）の一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）へ組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを用いることができる。

【0029】

特に明記しない限り、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８（３）：４４３−４５３のアルゴリズムを用いるＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０が、以下のパラメータを用いて配列同一性または類似性を決定するために用いられるであろう：５０のＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔおよび３のＬｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔ、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いるヌクレオチド配列に関する％同一性および％類似性；８のＧＡＰウエイトおよび２の長さウエイト、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングプログラムを用いるアミノ酸配列に関する％同一性および％類似性。均等なプログラムが用いられてもよい。「均等なプログラム」とは、対象の任意の２つの配列に関して、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０によって生成する対応するアラインメントと比較される場合、同一のヌクレオチド残基一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを意図する。

【0030】

本発明はまた、変異体核酸分子を包含する。ヌクレオチド配列をコードする殺有害生物性タンパク質の「変異体」は、本明細書に開示される殺有害生物性タンパク質をコードするが、遺伝暗号の縮重のために保守的に異なるそれらの配列および上に考察されたように十分に同一であるものを含む。天然に存在する対立遺伝子変異体は、以下に概説されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリッド形成法などの周知の分子生物学技術を使用して特定することができる。変異体ヌクレオチド配列はまた、例えば、部位特異的な突然変異誘発を用いることによって発生したが、しかし、以下に考察されるような本発明に開示される殺有害生物性タンパク質を依然としてコードする合成由来ヌクレオチド配列を含む。本発明によって包含される変異体タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的活性、すなわち、殺有害生物活性を有し続けている。「活性を保持する」とは、変異体が天然タンパク質の殺有害生物活性の少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％を有するであろうことを意図する。殺有害生物活性を測定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、すべてその全体が参照により本明細書に援用されるＣｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい。

【0031】

当業者は、変更が本発明のヌクレオチド配列の突然変異によって導入され、それによってタンパク質の生物学的な活性を変更することなしに、コードされる殺有害生物性タンパク質のアミノ酸配列の変更をもたらし得ることをさらに十分理解するであろう。したがって、変異体分離（ｖａｒｉａｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｄ）核酸分子は、１つ以上のアミノ酸置換、付加または削除がコードされるタンパク質へ導入されるように、１つ以上のヌクレオチド置換、付加、または削除を本明細書に開示される対応するヌクレオチド配列へ導入することによって創製することができる。突然変異は、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準的技術によって導入することができる。そのような変異体ヌクレオチド配列も本発明によって包含される。

【0032】

例えば、保存アミノ酸置換は、１つ以上の予測される非必須のアミノ酸残基で行われてもよい。「非必須の」アミノ酸残基は、生物学的な活性を変更することなく、殺有害生物性タンパク質の野生型配列から変更することができる残基であり、一方で「必須の」アミノ酸残基は、生物学的な活性のために必要とされる。「保存アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられているものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の系統は、当技術分野において定義されている。これらの系統は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電の極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。

【0033】

デルタ−エンドトキシンは、一般に、５つの保存配列ドメインと、３つの保存構造ドメインとを有する（例えば、ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７：１９３−１９９を参照されたい）。第１保存構造ドメインは、７つのアルファヘリックスからなり、膜内挿入および孔形成に関与する。ドメインＩＩは、ギリシャキーボード配列に配置された３つのベータ−シートからなり、ドメインＩＩＩは、「ジェリー−ロール」形の２つの逆平行ベータ−シートからなる（ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．，２００１、上記参照）。ドメインＩＩおよびＩＩＩは、受容体認識および結合に関与し、したがって毒素特異性の考えられる決定因子である。

【0034】

アミノ酸置換は、機能を保持する非保存領域において行われ得る。一般に、そのような置換は、そのような残基がタンパク質活性に必須である場合、保存アミノ酸残基に関してまたは保存モチーフ内に存在するアミノ酸残基に関して行われないであろう。保存される残基およびタンパク質活性に必須であり得る残基の例としては、例えば、本発明の配列に類似のまたは関連した毒素のアラインメント中に含有されるすべてのタンパク質間で同一である残基（例えば、相同タンパク質のアラインメントにおいて同一である残基）が挙げられる。保存されるが、しかし保存アミノ酸置換を可能にし、かつ依然として活性を保持し得る残基の例としては、例えば、本発明の配列に類似のまたは関連した毒素のアラインメント中に含有されるすべてのタンパク質間に保存置換のみを有する残基（例えば、アラインメント相同タンパク質中に含有されるすべてのタンパク質間に保存置換のみを有する残基）が挙げられる。しかし、当業者は、機能性変異体が保存残基中に少ない保存または非保存変更を有し得ることを理解するであろう。

【0035】

あるいは、変異体ヌクレオチド配列は、飽和突然変異誘発によるなど、コード配列のすべてまたは一部に沿ってランダムに突然変異を導入することによって作ることができ、得られた突然変異体は、活性を保持している突然変異体を特定するために殺有害生物活性を付与する能力に関して選抜することができる。突然変異誘発後、コードされたタンパク質は、組み換え技術によって発現させることができ、タンパク質の活性は、標準アッセイ法を用いて測定することができる。

【0036】

ＰＣＲ、ハイブリッド形成などの方法を用いて、対応する殺有害生物性配列を特定することができ、そのような配列は、本発明の配列と実質的な同一性（例えば、参照配列の全体にわたって少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれを超える配列同一性）を有し、かつ殺有害生物活性を有するかまたはそれを付与する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）ならびにＩｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）を参照されたい。

【0037】

ハイブリッド形成法において、殺有害生物性ヌクレオチド配列のすべてまたは一部を、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを選抜するために用いることができる。そのようなｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築のための方法は、当技術分野において一般に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１（上記参照）に開示されている。いわゆるハイブリッド形成プローブは、ゲノムＤＮＡ断片、ｃＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片、または他のオリゴヌクレオチドであってもよく、^３２Ｐなどの検出可能な基、または他の放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、もしくは酵素補因子などの任意の他の検出可能なマーカーで標識化されていてもよい。ハイブリッド形成のためのプローブは、本明細書に開示される公知の殺有害生物性タンパク質コーディングヌクレオチド配列をベースとする合成オリゴヌクレオチドを標識化することによって作ることができる。ヌクレオチド配列中の保存ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基またはコードされるアミノ酸配列に基づいて設計される縮重プライマーをさらに使用することができる。このプローブは、典型的には、本発明の殺有害生物性タンパク質またはその断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも約１２、少なくとも約２５、少なくとも約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００の連続したヌクレオチドまで厳しい条件下でハイブリッド形成するヌクレオチド配列の領域を含む。ハイブリッド形成のためのプローブを調製する方法は、当技術分野において一般に公知であり、参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１（上記参照）に開示されている。

【0038】

例えば、本明細書に開示される殺有害生物性配列全体またはその１つ以上の部分は、対応する殺有害生物性タンパク質様配列およびメッセンジャーＲＮＡに特異的にハイブリッド形成することができるプローブとして使用されてもよい。様々な条件下で特異的なハイブリッド形成を達成するために、そのようなプローブは、独特であり、かつ長さが好ましくは少なくとも約１０のヌクレオチド、または長さが少なくとも約２０のヌクレオチドである配列を含む。そのようなプローブが、選択された有機体または飼料からの対応する殺有害生物性配列をＰＣＲによって増幅するために使用されてもよい。この技術は、追加のコード配列を所望の有機体から単離するために、または有機体中のコード配列の存在を決定するための診断アッセイとして用いられてもよい。ハイブリッド形成法は、平板培養ＤＮＡライブラリーのハイブリッド形成選抜を含む（プラークまたはコロニーのいずれか；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。

【0039】

したがって、本発明は、ハイブリッド形成のためのプローブ、ならびに本発明のヌクレオチド配列のすべてまたは一部（例えば、本明細書に開示されるヌクレオチド配列の少なくとも約３００のヌクレオチド、少なくとも約４００、少なくとも約５００、１０００、１２００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、または全長まで）にハイブリッド形成できるヌクレオチド配列を包含する。そのような配列のハイブリッド形成は、厳しい条件下で実施されてもよい。「厳しい条件」または「厳しいハイブリッド形成条件」とは、その条件下において、プローブが、検出できるほどにより大きい程度（例えば、バックグラウンドの上少なくとも２倍）まで他の配列によりもそのターゲット配列にハイブリッド形成するであろう条件を意図する。厳しい条件は配列依存性であり、異なる状況で異なるであろう。ハイブリッド形成および／または洗浄条件の厳しさを制御することにより、プローブを１００％相補するターゲット配列を特定することができる（相同プロービング）。あるいは、厳しさ条件は、より低い程度の類似性が検出されるように配列のいくらかのミスマッチングを可能にするために調整することができる（非相同プロービング）。一般に、プローブは、長さが約１０００未満のヌクレオチド、好ましくは長さが５００未満のヌクレオチドである。

【0040】

典型的には、厳しい条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に関して少なくとも約３０℃、および長いプローブ（例えば、５０超のヌクレオチド）に関して少なくとも約６０℃であるものであろう。厳しい条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成されてもよい。例示的な低厳しさ条件は、３７℃における３０〜３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液中でのハイブリッド形成と、５０〜５５℃における１×〜２×のＳＳＣ（２０×のＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中での洗浄とを含む。例示的な並厳しさ条件は、３７℃における４０〜４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中でのハイブリッド形成と、５５〜６０℃における０．５×〜１×のＳＳＣ中での洗浄とを含む。例示的な高厳しさ条件は、３７℃における５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ中でのハイブリッド形成と、６０〜６５℃における０．１×のＳＳＣ中での洗浄とを含む。任意選択的に、洗浄緩衝液は、約０．１％〜約１％のＳＤＳを含んでもよい。ハイブリッド形成の継続時間は、一般に約２４時間未満、通常、約４〜約１２時間である。

【0041】

特異性は、典型的には、ハイブリッド形成後洗浄の関数であり、決定的因子は、最終洗浄液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについて、Ｔ_ｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４の式：Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）−０．６１（％形）−５００／Ｌ（ここで、Ｍは、一価カチオンのモル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡ中のグアノシンおよびシトシンヌクレオチドの百分率であり、％形は、ハイブリッド形成溶液中のホルムアミドの百分率であり、Ｌはベース対中のハイブリッドの長さである）から近似することができる。Ｔ_ｍは、（規定のイオン強度およびｐＨ下での）温度であり、その温度で相補的ターゲット配列の５０％が完全一致プローブにハイブリッド形成する。Ｔ_ｍは、各１％のミスマッチングに対して約１℃だけ下げられ、このようにして、Ｔ_ｍ、ハイブリッド形成、および／または洗浄条件は、所望の同一性の配列にハイブリッド形成するために調整することができる。例えば、９０％以上の同一性の配列が求められる場合、Ｔ_ｍは１０℃下げることができる。一般に、厳しい条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特異的な配列およびその相補体についての熱的融点（Ｔ_ｍ）よりも約５℃低いように選択される。しかし、非常に厳しい条件は、熱的融点（Ｔ_ｍ）よりも１、２、３、または４℃低い温度でハイブリッド形成および／または洗浄を利用することができ、中程度に厳しい条件は、熱的融点（Ｔ_ｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低い温度でハイブリッド形成および／または洗浄を利用することができ、厳しさが低い条件は、熱的融点（Ｔ_ｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低い温度でハイブリッド形成および／または洗浄を利用することができる。この式、ハイブリッド形成および洗浄組成物、所望のＴ_ｍを用いて、当業者は、ハイブリッド形成および／または洗浄液の厳しさの変動が本質的に説明されることを理解するであろう。所望の程度のミスマッチングが４５℃未満（水溶液）または３２℃（ホルムアミド溶液）のＴ_ｍをもたらす場合、より高い温度を用いることができるようにＳＳＣ濃度を上げることが好ましい。核酸のハイブリッド形成の広範なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ（１９９５）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に見いだされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。

【0042】

単離されたタンパク質ならびにそれらの変異体および断片
殺有害生物性タンパク質も本発明内に包含される。「殺有害生物性タンパク質」とは、配列番号４〜１１に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質を意図する。それらの断片、生物学的に活性なタンパク質、および変異体も提供され、本発明の方法を実行するために使用されてもよい。「単離されたタンパク質」または「組み換えタンパク質」は、その自然環境、例えばインビトロ細胞または組み換え細菌細胞もしくは植物宿主細胞にもはや存在しないタンパク質に言及するために用いられる。いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質は、配列番号２〜５の変異体であり、ここで、変異体は、配列番号２〜５に対して少なくとも１つのアミノ酸置換、削除、または挿入を含む。

【0043】

「断片」または「生物学的に活性な部分」は、配列番号４〜１１に規定されるアミノ酸配列と十分に同一であり、かつ殺有害生物活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド断片を含む。殺有害生物性タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば、長さが１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、またはそれを超えるアミノ酸であるポリペプチドであり得る。そのような生物学的に活性なタンパク質は、組み換え技術によって調製し、かつ殺有害生物活性について評価することができる。殺有害生物活性を測定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、すべてその全体が参照により本明細書に援用されるＣｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい。ここで用いる場合、断片は、配列番号４〜１１の少なくとも８個の連続的なアミノ酸を含む。しかし、本発明は、タンパク質において、長さが約１０、２０、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０またはそれを超えるアミノ酸よりも大きいタンパク質中の任意の断片などの他の断片を包含する。

【0044】

「変異体」とは、配列番号４〜１１のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約６０％、６５％、約７０％、７５％、約８０％、８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを意図する。変異体はまた、厳しい条件下において、配列番号１〜３の核酸、またはそれらの相補体にハイブリッド形成する核酸分子によってコードされるポリペプチドを含む。変異体は、突然変異誘発のためにアミノ酸配列の点で異なるポリペプチドを含む。本発明によって包含される変異体タンパク質は生物学的に活性であり、すなわち、それらは天然タンパク質の所望の生物学的に活性を有し続け、すなわち殺有害生物活性を保持する。いくつかの実施形態では、変異体は、天然タンパク質と比べて改善された活性を有する。殺有害生物活性を測定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、すべてその全体が参照により本明細書に援用されるＣｚａｐｌａ ａｎｄ Ｌａｎｇ（１９９０）Ｊ．Ｅｃｏｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．８３：２４８０−２４８５；Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５２：１９９−２０６；Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３；および米国特許第５，７４３，４７７号明細書を参照されたい。

【0045】

本発明のａｘｍｉ遺伝子などの細菌遺伝子は、非常に多くの場合、オープンリーディングフレームの開始位置に近接して多重メチオニン開始コドンを有する。多くの場合、これらの開始コドンの１つ以上での翻訳開始は、機能性タンパク質の発生をもたらすであろう。これらの開始コドンは、ＡＴＧコドンを含むことができる。しかし、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）などの細菌はまた、コドンＧＴＧを開始コドンと認識し、ＧＴＧコドンで翻訳を開始するタンパク質は、第１アミノ酸でメチオニンを含有する。稀に細菌システムにおける翻訳はＴＴＧコドンで開始することができるが、このイベントにおいて、ＴＴＧはメチオニンをコードする。さらに、これらのコドンのいずれが細菌において必然的に用いられるかは、多くの場合、先験的に決定されない。したがって、代わりのメチオニンコドンの１つの使用はまた、殺有害生物性タンパク質の発生をもたらし得ることが理解される。これらの殺有害生物性タンパク質は、本発明に包含され、本発明の方法に使用されてもよい。植物において発現される場合、代わりの開始コドンを適切な翻訳のためにＡＴＧに変更することが必要であろうことが理解されるであろう。

【0046】

本発明の様々な実施形態では、殺有害生物性タンパク質は、本明細書に開示される全長ヌクレオチド配列から推測されるアミノ酸配列と、代わりの下流開始部位の使用のために全長配列よりも短いアミノ酸配列とを含む。したがって、本発明のヌクレオチド配列ならびに／または本発明のヌクレオチド配列を含むベクター、宿主細胞、および植物（ならびに本発明のヌクレオチド配列の作製および使用方法）は、配列番号５〜１１に対応するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。

【0047】

本発明のポリペプチドに対するまたはそれらの変異体もしくは断片に対する抗体も包含される。抗体を産生する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；米国特許第４，１９６，２６５号明細書を参照されたい）。

【0048】

したがって、本発明の一態様は、本発明のタンパク質またはペプチド分子およびそれらの同族体、融合体もしくは断片の１つ以上に特異的に結合する抗体、短鎖抗原結合分子、または他のタンパク質に関する。特定の好ましい実施形態では、抗体は、配列番号４〜１１に規定されるアミノ酸配列またはその断片を有するタンパク質に特異的に結合する。別の実施形態では、抗体は、配列番号４〜１１に規定されるアミノ酸配列またはその断片から選択されるアミノ酸配列を含む融合タンパク質に特異的に結合する。様々な実施形態では、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を含む融合タンパク質に特異的に結合する抗体は、天然に存在しない抗体である。

【0049】

本発明の抗体は、本発明のタンパク質もしくはペプチド分子を定量的にもしくは定性的に検出するために、またはタンパク質の翻訳後修飾を検出するために使用されてもよい。本明細書で用いる場合、抗体またはペプチドは、そのような結合が非関連分子の存在によって競合的に阻害されない場合、本発明のタンパク質またはペプチドに「特異的に結合する」と呼ばれる。

【0050】

本発明の抗体は、本発明のタンパク質またはペプチド分子の検出に有用なキット内に含有されてもよい。本発明は、本発明のタンパク質またはペプチド分子（特に、本発明の抗体に特異的に結合することができるその変異体または断片を含めて、配列番号４〜１１に規定されるアミノ酸配列によってコードされるタンパク質）を検出する方法であって、試料を本発明の抗体と接触させる工程と、試料が本発明のタンパク質またはペプチド分子を含有するかどうかを判定する工程とを含む方法をさらに含む。興味のあるタンパク質またはペプチドの検出のための抗体を利用する方法は、当技術分野において公知である。

【0051】

変性または改良された変異体
殺有害生物性タンパク質のＤＮＡ配列が様々な方法によって変更されてもよいこと、およびこれらの変更が、本発明の殺有害生物性タンパク質によってコードされるものと異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列をもたらし得ることは認められる。このタンパク質は、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１４５、約１５０、約１５５以下、またはそれを超えるアミノ酸置換、排除または挿入を含む、配列番号４〜１１の１つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、削除、および挿入を含む様々な方法で変更されてもよい。そのような操作のための方法は、一般に、当技術分野において公知である。例えば、殺有害生物性タンパク質のアミノ酸配列変異体は、ＤＮＡにおける突然変異によって調製することができる。これはまた、いくつかの形態の突然変異誘発の１つによっておよび／または指向進化において達成されてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸配列にコードされる変化は、タンパク質の機能に実質的に影響を及ぼさないであろう。そのような変異体は、所望の殺有害生物活性を有するであろう。しかし、殺有害生物性タンパク質が殺有害生物活性を付与する能力は、本発明の組成物に関するそのような技術の使用によって改善され得ることが理解される。例えば、ＸＬ−１ Ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）など、ＤＮＡ複製中の塩基誤取込みの高い率を示す宿主細胞において殺有害生物性タンパク質を発現し得る。そのような菌株での繁殖後、ＤＮＡ（例えば、プラスミドＤＮＡを調製することにより、またはＰＣＲにより増幅させ、得られたＰＣＲ断片をベクターへクローンすることにより）を単離し、殺有害生物性タンパク質突然変異体を非突然変異菌株において培養し、例えば殺有害生物活性について試験するためのアッセイを行うことにより、殺有害生物活性を有する突然変異遺伝子を特定することができる。一般に、タンパク質は、混合され、摂取アッセイに使用される。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３を参照されたい。そのようなアッセイは、植物を１つ以上の有害生物と接触させる工程と、植物が生き残るおよび／または有害生物の死亡を引き起こす能力を測定する工程とを含むことができる。毒性の増加をもたらす突然変異の例は、Ｓｃｈｎｅｐｆ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６２：７７５−８０６に見いだされる。

【0052】

あるいは、変更は、活性に実質的に影響を及ぼすことなくアミノまたはカルボキシ末端で多くのタンパク質のタンパク質配列に対して行われてもよい。これは、ＰＣＲ増幅に利用されるオリゴヌクレオチドへのアミノ酸コーディング配列の包含のため、タンパク質コード配列を変更または拡大するＰＣＲ増幅を含む、ＰＣＲなどの近代分子法によって導入される挿入、排除、または変更を含むことができる。あるいは、追加されるタンパク質配列は、タンパク質融合を発生させるために当技術分野において一般的に用いられるものなどのタンパク質コード配列全体を含むことができる。そのような融合タンパク質は、多くの場合、（１）興味のあるタンパク質の発現を増加させ、（２）結合ドメイン、酵素活性、またはエピトープを導入してタンパク質精製、タンパク質検出、または当技術分野において公知の他の実験的使用のいずれかを容易にし、（３）それらの後者が多くの場合にタンパク質のグリコシル化をもたらす、グラム陰性細菌の細胞周辺腔、または真核細胞の小胞体などの細胞内オルガネラへのタンパク質の分泌または翻訳をターゲットにするために使用される。

【0053】

本発明の変異体ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はまた、ＤＮＡシャッフリングなどの変異原性および組み換え誘導手順から誘導される配列を包含する。そのような手順を使用して、１つ以上の異なる殺有害生物性タンパク質コーディング領域は、所望の特性を有する新規殺有害生物性タンパク質を創製するために使用することができる。このようにして、組み換えポリヌクレオチドのライブラリーは、実質的な配列同一性を有する配列領域を含む関連配列ポリヌクレオチドの集団から発生し、インビトロまたはインビボで相同的に組み換えることができる。例えば、このアプローチを用いて、興味のあるドメインをコードする配列モチーフは、殺虫活性の増加などの興味のある改善された特性のタンパク質をコードする新規遺伝子を得るために、本発明の殺有害生物性遺伝子と他の公知の殺有害生物性遺伝子との間で入れ換えられてもよい。そのようなＤＮＡシャッフリングのための戦略は、当技術分野において公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：１０７４７−１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：４３６−４３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：３３６−３４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：４５０４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８−２９１；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号明細書および同第５，８３７，４５８号明細書を参照されたい。

【0054】

ドメイン交換またはシャッフリングは、変性された殺有害生物性タンパク質を発生させるための別のメカニズムである。ドメインは、殺有害生物性タンパク質間で交換され、改善された殺有害生物活性またはターゲットスペクトルを有するハイブリッドまたはキメラ毒素をもたらし得る。組み換えタンパク質を発生させかつ殺有害生物活性についてそれらを試験するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｎａｉｍｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５３２８−５３３０；ｄｅ Ｍａａｇｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１５３７−１５４３；Ｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７９５４−１７９５８；Ｓｃｈｎｅｐｆ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：２０９２３−２０９３０；Ｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．９１９９９）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６５：２９１８−２９２５を参照されたい）。

【0055】

また別の実施形態では、変異体ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、変異性ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、帰納的集団突然変異誘発、指数関数的集合突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子再構成、遺伝子部位飽和突然変異誘発、置換突然変異誘発、合成ライゲーション再構成（ＳＬＲ）、組み換え、帰納的配列組み換え、ホスホチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発、ウラシル含有テンプレート突然変異誘発、ギャップ付二本鎖突然変異誘発、ポイントミスマッチ修復突然変異誘発、修復欠損宿主株突然変異誘発、化学的突然変異誘発、放射起源突然変異誘発、排除突然変異誘発、制限−選択突然変異誘発、制限−精製突然変異誘発、人工遺伝子合成、集合突然変異誘発、キメラ核酸マルチマー創製などの１つ以上を用いて得ることができる。

【0056】

ベクター
本発明の殺有害生物性配列は、興味のある宿主細胞、例えば植物細胞または微生物での発現のための発現カセットにおいて提供され得る。「植物発現カセット」とは、植物細胞においてオープンリーディングフレームからタンパク質の発現をもたらすことができるＤＮＡ構築物を意図する。典型的には、これらは、プロモーターおよびコード配列を含有する。多くの場合、そのような構築物はまた、３’非翻訳領域を含有する。そのような構築物は、クロロプラスト（もしくは他の色素体）、小胞体、またはＧｏｌｇｉ（ゴルジ）装置などの特定の細胞内構造物へのペプチドの共翻訳または翻訳後輸送を容易にするための「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有してもよい。

【0057】

「シグナル配列」とは、細胞膜を横切って共翻訳または翻訳後ペプチド輸送をもたらすことが知られているかまたはもたらすと思われる配列を意図する。真核生物では、これは、典型的には、グリコシル化をいくらかもたらして、Ｇｏｌｇｉ装置への分泌に関与する。細菌の殺虫性毒素は、多くの場合、ターゲット有害生物の消化管においてタンパク質分解により活性化されるプロトキシンとして合成される（Ｃｈａｎｇ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５０７−５１６）。本発明のいくつかの実施形態では、シグナル配列は、天然配列中にあるか、または本発明の配列から誘導されてもよい。「リーダー配列」とは、翻訳される場合、細胞内オルガネラへのペプチド鎖の共翻訳輸送を始動させるのに十分なアミノ酸配列をもたらす任意の配列を意図する。したがって、これは、小胞体への通路、空胞への通路、クロロプラストを含む色素体、ミトコンドリアなどへの通路によって輸送および／またはグリコシル化をターゲットにするレーダー配列を含む。したがって、非相同リーダーまたはシグナル配列に動作可能に連結されている本発明のアミノ酸配列を含むポリペプチドが本明細書においてさらに提供される。

【0058】

「植物形質転換ベクター」とは、植物細胞の効率的な形質転換のために必要であるＤＮＡ分子を意図する。そのような分子は、１つ以上の植物発現カセットからなってもよく、２つ以上の「ベクター」ＤＮＡ分子で構成されてもよい。例えば、二元ベクターは、２つの非連続的なＤＮＡベクターを利用して植物細胞の形質転換のためのすべての必須のシスおよびトランス作用機能をコードする植物形質転換ベクターである（Ｈｅｌｌｅｎｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５：４４６−４５１）。「ベクター」は、異なる宿主細胞間の移動のために設計されている核酸構築物を指す。「発現ベクター」は、非相同ＤＮＡ配列または断片を異質細胞において組み込む、統合するおよび発現させる能力を有するベクターを指す。カセットは、本発明の配列に動作可能に連結された５’および／または３’調節配列を含むであろう。「動作可能に連結された」とは、プロモーター配列と第２配列との間の機能性連結を意図し、ここで、プロモーター配列は、第２配列に対応するＤＮＡ配列の転写を開始および仲介する。一般に、動作可能に連結されたとは、連結されている核酸配列が、連続的であり、２つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合に連続的でありかつ同じリーディングフレーム中にあることを意味する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、微生物宿主細胞または植物宿主細胞などの宿主細胞において前記ヌクレオチド配列の発現を誘導することができる非相同プロモーターに動作可能に連結されている。カセットは、有機体へ共翻訳されるべき少なくとも１つの追加の遺伝子をさらに含有してもよい。あるいは、追加の遺伝子は、多重発現カセット上で提供することができる。

【0059】

様々な実施形態では、本発明のヌクレオチド配列は、細胞において、例えば植物細胞または微生物においてヌクレオチド配列の発現を誘導することができる非相同プロモーターに動作可能に連結されている。「プロモーター」は、下流コード配列の転写を誘導するために機能する核酸配列を指す。他の転写および翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも称される）と一緒にプロモーターは、興味のあるＤＮＡ配列の発現のために必要である。

【0060】

そのような発現カセットは、殺有害生物性配列の挿入が調節領域の転写調節下にあるために複数の制限部位を提供される。

【0061】

発現カセットは、転写の５’−３’方向に、植物において機能的な転写および翻訳開始領域（すなわち、プロモーター）、本発明のＤＮＡ配列、ならびに翻訳および転写終端領域（すなわち、終端領域）を含むであろう。プロモーターは、植物宿主および／または本発明のＤＮＡ配列原産であってもそれらに相似であっても、植物宿主および／または本発明のＤＮＡ配列にとって異質または非相同であってもよい。さらに、プロモーターは、天然配列であっても、または合成配列であってもよい。プロモーターが植物宿主「原産」であるかまたはそれに「相同」である場合、プロモーターは、プロモーターがその中へ導入される天然植物中に見いだされることが意図される。プロモーターが本発明のＤＮＡ配列にとって「異質」または「非相同」である場合、プロモーターは、本発明の動作可能に連結されたＤＮＡ配列用の天然のまたは天然に存在するプロモーターではないことが意図される。プロモーターは、誘導性であってもまたは構成的であってもよい。それは、天然に存在しても、様々な天然に存在するプロモーターの部分からなっても、または部分的にもしくは完全に構成であってもよい。プロモーターの設計のための手引きは、Ｈａｒｌｅｙ ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：２３４３−２３６１のものなどのプロモーター構造の研究によって提供される。また、転写開始位置に対するプロモーターの位置は最適化され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：７６０−７６４を参照されたい。植物において使用するための多くの好適なプロモーターが当技術分野において周知である。

【0062】

例えば、植物において使用するための好適な構成的プロモーターは、ピーナツ萎黄病条班（ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｒｅａｋ）カウリモウイルス（ＰＣｌＳＶ）プロモーターなどの植物ウイルスからのプロモーター（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）；カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）からの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０−８１２）；クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）ウイルスメチルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーター（米国特許第５，５６３，３２８号明細書）およびゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）からの全長転写プロモーター（米国特許第５，３７８，６１９号明細書）；イネアクチンのような遺伝子からのプロモーター（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３−１７１および米国特許第５，６４１，８７６号明細書）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６１９−６３２およびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８：６７５−６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．８１：５８１−５８８）；ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：２７２３−２７３０および米国特許第５，５１０，４７４号明細書）；トウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２３１：２７６−２８５およびＡｔａｎａｓｓｏｖａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｌａｎｔ Ｊ．２（３）：２９１−３００）；セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）ＡＬＳ３（ＰＣＴ公開国際公開第９７／４１２２８号パンフレット）；植物リブロース−ビスカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）小サブユニット遺伝子；サーコウイルス（オーストラリア特許第６８９３１１号明細書）またはキャッサバ（Ｃａｓｓａｖａ）葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ、米国特許第７，０５３，２０５号明細書）；ならびに様々なアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）遺伝子のプロモーター（米国特許第４，７７１，００２号明細書；同第５，１０２，７９６号明細書；同第５，１８２，２００号明細書；および同第５，４２８，１４７号明細書を参照されたい）を含む。

【0063】

植物において使用するための好適な誘導性プロモーターは、銅に反応するＡＣＥ１システムからのプロモーター（Ｍｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：４５６７−４５７１）；ベンゼンスルホンアミド除草剤解毒剤に反応するトウモロコシＩｎ２遺伝子のプロモーター（Ｈｅｒｓｈｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２２７：２２９−２３７およびＧａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２４３：３２−３８）；ならびにＴｎ１０からのＴｅｔリプレッサーのプロモーター（Ｇａｔｚ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２２７：２２９−２３７）を含む。植物において使用するための別の誘導性プロモーターは、通常、植物がそれに反応しない誘発剤に反応するものである。このタイプの例示的な誘導性プロモーターは、その転写活性が、グルココルチコステロイドホルモンによって誘発されるステロイドホルモン遺伝子からの誘導性プロモーターである（Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１０４２１）か、またはエストラジオールによって活性化されるエストロゲン受容体ベースの誘導性植物発現システムにおいて使用するためのキメラ転写活性化剤、ＸＶＥの最近の応用である（Ｚｕｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｌａｎｔ Ｊ．，２４：２６５−２７３）。植物において使用するための他の誘導性プロモーターは、その全体が参照により本明細書に援用される欧州特許第３３２１０４号明細書、ＰＣＴ国際公開第９３／２１３３４号パンフレットおよびＰＣＴ国際公開第９７／０６２６９号パンフレットに記載されている。他のプロモーターおよび部分もしくは完全合成プロモーターの部分からなるプロモーターも使用することができる。例えば、植物において使用するためのそのようなプロモーターを記載しているＮｉ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｌａｎｔ Ｊ．７：６６１−６７６およびＰＣＴ国際公開第９５／１４０９８号パンフレットを参照されたい。

【0064】

本発明の一実施形態では、種子に特異的なプロモーター（Ｄａｔｌａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｎｎ．Ｒｅｖ．３、２６９−２９６）、とりわけ、ナピンプロモーター（欧州特許出願公開第２５５３７８Ａ１号明細書）、ファセオリンプロモーター、グルテニンプロモーター、ヘリアンチニンプロモーター（国際公開第９２／１７５８０号パンフレット）、アルブミンプロモーター（国際公開第９８／４５４６０号パンフレット）、オレオシンプロモーター（国際公開第９８／４５４６１号パンフレット）、ＳＡＴ１プロモーターまたはＳＡＴ３プロモーター（ＰＣＴ／米国特許出願第９８／０６９７８号明細書）など、植物の特定の領域または組織に特異的なプロモーター配列を、本発明の殺有害生物性タンパク質を発現させるために使用することができる。

【0065】

フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ）、キチナーゼ、グルカナーゼ、プロテイナーゼ阻害剤（ＰＩ）、ＰＲ１系統遺伝子、ノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）およびｖｓｐＢプロモーター（米国特許第５，６７０，３４９号明細書、表３）、ＨＭＧ２プロモーター（米国特許第５，６７０，３４９号明細書）、リンゴ果実ベータ−ガラクトシダーゼ（ＡＢＧ１）プロモーターおよびリンゴ果実アミノシクロプロパンカルボキシレ−トシンターゼ（ＡＣＣシンターゼ）プロモーター（国際公開第９８／４５４４５号パンフレット）から有利に選択される誘導性プロモーターが使用されてもよい。多重プロモーターを、連続を含めて本発明の構築物に使用することができる。

【0066】

プロモーターは、１つ以上のエンハンサー要素を含んでもよく、またはそれを含むために修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、複数のエンハンサー要素を含んでもよい。エンハンサー要素を含有するプロモーターは、それらを含まないプロモーターと比べてより高いレベルの転写を提供する。植物に使用するための好適なエンハンサー要素は、ＰＣｌＳＶエンハンサー要素（米国特許第５，８５０，０１９号明細書）、ＣａＭＶ ３５Ｓエンハンサー要素（米国特許第５，１０６，７３９号明細書および同第５，１６４，３１６号明細書）ならびにＦＭＶエンハンサー要素（Ｍａｉｔｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．６：１４３−１５６）；出願国際公開第８７／０７６４４号パンフレットに記載されるタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の、または例えば、Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｆｒｅｅｄ １９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：１５９０−１５９７によって記載されているタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）の翻訳活性化剤、またはトウモロコシのａｄｈ１インストロンもしくはイネアクチンのインストロン１などのインストロンを含む。ＰＣＴ国際公開第９６／２３８９８号パンフレット、国際公開第２０１２／０２１７９４号パンフレット、国際公開第２０１２／０２１７９７号パンフレット、国際公開第２０１１／０８４３７０号パンフレット、および国際公開第２０１１／０２８９１４号パンフレットも参照されたい。

【0067】

多くの場合、そのような構築物は、５’および３’非翻訳領域を含有することができる。そのような構築物は、クロロプラスト（もしくは他の色素体）、小胞体、またはＧｏｌｇｉ装置などの特定の細胞内構造物への興味のあるタンパク質の共翻訳または翻訳後輸送を容易にするための、または分泌されるべき「シグナル配列」または「リーダー配列」を含有してもよい。例えば、構築物は、小胞体へのペプチドの転移を容易にするためのシグナルペプチドを含有するように遺伝子工学で操作することができる。「シグナル配列」とは、細胞膜を横切って共翻訳または翻訳後ペプチド輸送をもたらすことが知られているまたはもたらすと思われてる配列を意図する。真核生物では、これは、典型的には、グリコシル化をいくらかもたらして、Ｇｏｌｇｉ装置への分泌に関与する。「リーダー配列」とは、翻訳される場合、細胞内オルガネラへのペプチド鎖の共翻訳輸送を始動させるのに十分なアミノ酸配列をもたらす任意の配列を意図する。したがって、これは、小胞体への通路、空胞への通路、クロロプラストを含む色素体、ミトコンドリアなどへの通路によって輸送および／またはグリコシル化をターゲットにするレーダー配列を含む。インストロンのｍＲＮＡプロセシングが発現のための必要とされるように、インストロンを含有するように植物発現カセットを遺伝子工学で操作することも好ましいことがあり得る。

【0068】

「３’非翻訳領域」とは、コード配列の下流にあるポリヌクレオチドを意図する。ｍＲＮＡ前駆体の３’エンドへのポリアデニル酸トラクトの付加に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードするポリアデニル化シグナル配列および他の配列が３’非翻訳領域である。「５’非翻訳領域」とは、コード配列の下流にあるポリヌクレオチドを意図する。

【0069】

他の上流または下流非翻訳要素は、エンハンサーを含む。エンハンサーは、プロモーター領域の発現を増加させるように機能するポリヌクレオチドである。エンハンサーは、当技術分野において周知であり、ＳＶ４０エンハンサー領域および３５Ｓエンハンサー要素を含むが、それらに限定されない。

【0070】

終端領域は、転写開始領域原産であってもよく、動作可能に連結された興味のあるＤＮＡ配列原産であってもよく、植物宿主原産であってもよく、または別のソース（すなわち、プロモーター、興味のあるＤＮＡ配列、植物宿主、もしくはそれらの任意の組み合わせと異質もしくは非相同）に由来してもよい。オクトピンシンターゼおよびノパリンシンターゼ終端領域などの好都合な終端領域は、Ａ．ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉ−プラスミドから利用可能である。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２６２：１４１−１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６７１−６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．５：１４１−１４９；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１−１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｇｅｎｅ ９１：１５１−１５８；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７８９１−７９０３；およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１５：９６２７−９６３９も参照されたい。

【0071】

適切な場合、遺伝子は、形質転換された宿主細胞における発現の増加のために最適化されてもよい（合成ＤＮＡ配列）。すなわち、遺伝子は、発現の改善のために宿主細胞優先（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ）コドンを使用して合成することができるか、または宿主優先コドン利用頻度でコドンを使用して合成されてもよい。細胞における合成ＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームの発現は、本発明のポリペプチドの産生をもたらす。合成ＤＮＡ配列は、望ましくない制限エンドヌクリアーゼ部位を簡単に除去するために、ＤＮＡクローニング戦略を容易にするために、いかなる潜在的なコドンバイアスも変更もしくは除去するために、ＧＣ含量を変更もしくは改善するために、代わりのリーディングフレームを除去もしくは変更するために、ならびに／または天然ＤＮＡ配列中に存在し得るイントロン／エクソン接合認識部位、ポリアデニル化部位、シャイン−ダルガーノ配列、望ましくないプロモーター要素などを変更もしくは除去するために有用であり得る。一般に、遺伝子のＧＣ含量は増加するであろう。例えば、宿主優先コドン利用の考察についてはＣａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９２：１−１１を参照されたい。植物優先遺伝子を合成するための方法は、当技術分野において利用可能である。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，３８０，８３１号明細書および同第５，４３６，３９１号明細書、米国特許出願公開第２００９０１３７４０９号明細書、ならびにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：４７７−４９８を参照されたい。

【0072】

合成ＤＮＡ配列が、イントロン配列の導入、クロロプラスト輸送ペプチド、アポプラスト／空胞ターゲッティングペプチド、または小胞体における得られたペプチドの保持をもたらすペプチド配列などのオルガネラターゲッティング配列へのタンパク質融合として発現されるＤＮＡ配列の創製など、ＤＮＡ配列への他の改善を導入するために利用され得ることも可能である。したがって、一実施形態では、本殺有害生物性タンパク質は、発現のためのクロロプラストをターゲットにする。このようにして、殺有害生物性タンパク質がクロロプラストへ直接挿入されない場合、発現カセットは、殺有害生物性タンパク質をクロロプラストに誘導するための輸送ペプチドをコードする核酸をさらに含有するであろう。そのような輸送ペプチドは、当技術分野において公知である。例えば、Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．９：１０４−１２６；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７５４４−１７５５０；Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．８４：９６５−９６８；Ｒｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９６：１４１４−１４２１；およびＳｈａｈ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４７８−４８１を参照されたい。

【0073】

クロロプラストをターゲットにする殺有害生物性遺伝子は、植物核とこのオルガネラとの間のコドン利用の相違を説明するためにクロロプラストでの発現について最適化されてもよい。このようにして、興味のある核酸は、クロロプラスト優先コドンを使用して合成されてもよい。例えば、参照により本明細書に援用される米国特許第５，３８０，８３１号明細書を参照されたい。

【0074】

植物形質転換
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物へ導入する工程を含む。「導入する工程」とは、構築物が植物の細胞の内部にアクセスするような方法でヌクレオチド構築物を植物に与えることを意図する。本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入するための特定の方法が用いられることを必要とせず、ヌクレオチド構築物が植物の少なくとも１つの細胞の内部にアクセスすることのみを必要とする。ヌクレオチド構築物を植物へ導入するための方法は、当技術分野において公知であり、安定した形質転換法、一過性形質転換法、およびウイルス媒介法を含むが、それらに限定されない。

【0075】

「植物」とは、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、珠芽、胚およびその子孫を意図する。植物細胞は、分化していることができ、または分化していないこともできる（例えば、カルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師部細胞、花粉）。

【0076】

「遺伝子組み換え植物」、または「形質転換された植物」、または「安定的に形質転換された」植物もしくは細胞もしくは組織は、外因性核酸配列またはＤＮＡ断片を植物細胞へ組み込んでいるまたは統合している植物を指す。これらの核酸配列は、外因性である、すなわち形質転換されていない植物細胞中に存在しないもの、ならびに内因性である、すなわち形質転換されていない植物細胞中に存在するものを含む。「非相同の」は、一般に、核酸配列がその中に存在する天然ゲノムの細胞または部分に内因性ではなく、および感染、トランスフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクションなどによって細胞に添加されている核酸配列を指す。

【0077】

本発明の遺伝子組み換え植物は、本明細書に開示される新規毒素配列の１つ以上を発現させる。いくつかの実施形態では、本発明のタンパク質またはヌクレオチド配列は、有利には、植物中において、有用な農学特性をそのような植物に付与するタンパク質またはＲＮＡをコードする他の遺伝子と組み合わせられる。形質転換された植物に有用な農学特性を付与するタンパク質またはＲＮＡをコードする遺伝子中に、１種以上の除草剤への耐性を付与するタンパク質と、特定の昆虫への耐性を付与する他のものと、特定の疾患への耐性を付与するものとをコードするＤＮＡ配列、線虫もしくは昆虫防除を提供するＲＮＡをコードするＤＮＡなどを挙げることができる。そのような遺伝子は、公開ＰＣＴ特許出願国際公開第９１／０２０７１号パンフレットおよび国際公開第９５／０６１２８号パンフレットならびに米国特許第７，９２３，６０２号明細書および米国特許出願公開第２０１００１６６７２３号明細書に特に記載されており、それらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に援用される。

【0078】

形質転換された植物細胞および植物に特定の除草剤への耐性を付与するタンパク質をコードするＤＮＡ配列中に、グルホシネート除草剤への耐性を付与する国際公開第２００９／１５２３５９号パンフレットに記載されるｂａｒまたはＰＡＴ遺伝子またはストレプトマイセス・コエリコラ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）遺伝子、グリホサートおよびその塩など、ＥＰＳＰＳをターゲットに据える除草剤への耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードする遺伝子（米国特許第４，５３５，０６０号明細書、米国特許第４，７６９，０６１号明細書、米国特許第５，０９４，９４５号明細書、米国特許第４，９４０，８３５号明細書、米国特許第５，１８８，６４２号明細書、米国特許第４，９７１，９０８号明細書、米国特許第５，１４５，７８３号明細書、米国特許第５，３１０，６６７号明細書、米国特許第５，３１２，９１０号明細書、米国特許第５，６２７，０６１号明細書、米国特許第５，６３３，４３５号明細書）、グリホサート−ｎ−アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（例えば、米国特許第８，２２２，４８９号明細書、米国特許第８，０８８，９７２号明細書、米国特許第８，０４４，２６１号明細書、米国特許第８，０２１，８５７号明細書、米国特許第８，００８，５４７号明細書、米国特許第７，９９９，１５２号明細書、米国特許第７，９９８，７０３号明細書、米国特許第７，８６３，５０３号明細書、米国特許第７，７１４，１８８号明細書、米国特許第７，７０９，７０２号明細書、米国特許第７，６６６，６４４号明細書、米国特許第７，６６６，６４３号明細書、米国特許第７，５３１，３３９号明細書、米国特許第７，５２７，９５５号明細書、および米国特許第７，４０５，０７４号明細書）、グリホサートオキシドレダクターゼをコードする遺伝子（例えば、米国特許第５，４６３，１７５号明細書）、またはＨＰＰＤ阻害剤耐性タンパク質をコードする遺伝子（例えば、国際公開第２００４／０５５１９１号パンフレット、国際公開第１９９６３８５６７号パンフレット、米国特許第６，７９１，０１４号明細書、国際公開第２０１１／０６８５６７号パンフレット、国際公開第２０１１／０７６３４５号パンフレット、国際公開第２０１１／０８５２２１号パンフレット、国際公開第２０１１／０９４２０５号パンフレット、国際公開第２０１１／０６８５６７号パンフレット、国際公開第２０１１／０９４１９９号パンフレット、国際公開第２０１１／０９４２０５号パンフレット、国際公開第２０１１／１４５０１５号パンフレット、国際公開第２０１２／０５６４０１号パンフレット、および国際公開第２０１４／０４３４３５号パンフレットに記載されるＨＰＰＤ阻害剤耐性遺伝子）を挙げることができる。

【0079】

ＥＰＳＰＳをターゲットに据える除草剤への耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列中に、植物ＥＰＳＰＳ、特にトウモロコシＥＰＳＰＳ、特に２つの突然変異体、具体的にはアミノ酸位置１０２での突然変異体およびアミノ酸位置１０６での突然変異体を含み（国際公開第２００４／０７４４４３号パンフレット）、本明細書では以下でダブル突然変異体トウモロコシＥＰＳＰＳまたは２ｍＥＰＳＰＳと命名される、特許出願米国特許第６５６６５８７号明細書に記載されるトウモロコシＥＰＳＰＳをコードする遺伝子、またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から単離されたＥＰＳＰＳをコードし、かつＣＰ４とも命名される、米国特許第５，６３３，４３５号明細書の配列番号２および配列番号３によって記載される遺伝子がより特に挙げられるであろう。

【0080】

ＥＰＳＰＳをターゲットに据える除草剤への耐性を付与する好適なＥＰＳＰＳをコードするＤＮＡ配列中に、アルスロバクター・グロビホルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）からのＥＰＳＰＳ ＧＲＧ２３、しかし、また、突然変異体ＧＲＧ２３ ＡＣＥ１、ＧＲＧ２３ ＡＣＥ２、またはＧＲＧ２３ ＡＣＥ３、特に国際公開第２００８／１００３５３号パンフレットにおける配列番号２９のＧＲＧ２３（ａｃｅ３）Ｒ１７３Ｋなど、国際公開第２００８／１００３５３号パンフレットに記載されるようなＧＲＧ２３の突然変異体または変異体をコードする遺伝子がより特に挙げられるであろう。

【0081】

ＥＰＳＰＳをコードする、より特に上記の遺伝子をコードするＤＮＡ配列の場合、これらの酵素をコードする配列は、有利には、輸送ペプチド、特に米国特許第５，５１０，４７１号明細または同第５，６３３，４４８号明細書に記載される「最適化輸送ペプチド」をコードする配列より始まる。

【0082】

本発明の核酸配列と組み合わせることができる例示的な除草剤耐性形質は、少なくとも１つのＡＬＳ（アセトアセテートシンターゼ）阻害剤（国際公開第２００７／０２４７８２号パンフレット）；突然変異アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＡＬＳ／ＡＨＡＳ遺伝子（米国特許第６，８５５，５３３号明細書）；代謝によって２，４−Ｄ（２，４−ジクロロフェノキシ酢酸）への耐性を付与する２，４−Ｄ−モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（米国特許第６，１５３，４０１号明細書）；および代謝によってジカンバ（３，６−ジクロロ−２−メトキシ安息香酸）への耐性を付与するジカンバモノオキシゲナーゼをコードする遺伝子（米国特許出願公開第２００８／０１１９３６１号明細書および米国特許出願公開第２００８／０１２０７３９号明細書）をさらに含む。

【0083】

様々な実施形態では、本発明の核酸は、１つ以上のＨＰＰＤ阻害剤除草剤耐性遺伝子、ならびに／またはグリホサートおよび／もしくはグルホシネートに耐性がある１つ以上の遺伝子を含む１つ以上の除草剤耐性遺伝子で積み重ねられている。

【0084】

昆虫への耐性の特性に関係するタンパク質をコードするＤＮＡ配列中に、文献に広く記載されかつ当業者に周知のＢｔタンパク質がより具体的に挙げられるであろう。ホトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）などの細菌から抽出されたタンパク質も挙げられるであろう（国際公開第９７／１７４３２号パンフレットおよび国際公開第９８／０８９３２号パンフレット）。

【0085】

昆虫への耐性の新規特性を付与する興味のあるタンパク質をコードするそのようなＤＮＡ配列中に、文献に広く記載されかつ当業者に周知のＢｔ ＣｒｙまたはＶＩＰタンパク質がより具体的に挙げられるであろう。これらは、Ｃｒｙ１Ｆタンパク質に由来するＣｒｙ１Ｆタンパク質またはハイブリッド（例えば、米国特許第６，３２６，１６９号明細書；米国特許第６，２８１，０１６号明細書；米国特許第６，２１８，１８８号明細書に記載されるハイブリッドＣｒｙ１Ａ−Ｃｒｙ１Ｆタンパク質、またはそれらの毒性断片）、Ｃｒｙ１Ａ−型タンパク質またはそれらの毒性断片、好ましくはＣｒｙ１Ａｃタンパク質またはＣｒｙ１Ａｃタンパク質に由来するハイブリッド（例えば、米国特許第５，８８０，２７５号明細書に記載されるハイブリッドＣｒｙ１Ａｂ−Ｃｒｙ１Ａｃタンパク質）または欧州特許第４５１８７８号明細書に記載されるようなＣｒｙ１ＡｂもしくはＢｔ２タンパク質またはその殺虫性断片、国際公開第２００２／０５７６６４号パンフレットに記載されるようなＣｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ２ＡｆもしくはＣｒｙ２Ａｇタンパク質またはその毒性断片、国際公開第２００７／１４０２５６号パンフレットに記載されるＣｒｙ１Ａ．１０５タンパク質（配列番号７）またはその毒性断片、ＮＣＢＩ登録ＡＢＧ２０４２８のＶＩＰ３Ａａ１９タンパク質、ＮＣＢＩ登録ＡＢＧ２０４２９のＶＩＰ３Ａａ２０タンパク質（国際公開第２００７／１４２８４０号パンフレットにおける配列番号２）、ＣＯＴ２０２またはＣＯＴ２０３ワタイベントにおいて産生されるＶＩＰ３Ａタンパク質（それぞれ国際公開第２００５／０５４４７９号パンフレットおよび国際公開第２００５／０５４４８０号パンフレット）、国際公開第２００１／４７９５２号パンフレットに記載されるようなＣｒｙタンパク質、Ｅｓｔｒｕｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９９６）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２８；９３（１１）：５３８９−９４および米国特許第６，２９１，１５６号明細書に記載されるようなＶＩＰ３Ａａタンパク質またはその毒性断片、国際公開第９８／０８９３２号パンフレット（例えば、Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７（１１）：５０１７−２４；Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ ａｎｄ Ｂｏｗｅｎ，２０００，Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．；５７（５）：８２８−３３）に記載されるようにホトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）からのＴｃ−タンパク質などのゼノラブダス（Ｘｅｎｏｒｈａｂｄｕｓ）（国際公開第９８／５０４２７号パンフレットに記載されるような）、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（特にＳ．エントモフィラ（Ｓ．ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）からの）またはホトルハブダス（Ｐｈｏｔｏｒｈａｂｄｕｓ）種菌株からの殺虫性タンパク質を含む。上記配列、特にそれらの毒性断片の配列のいずれかといくつかの（１−１０、好ましくは１−５）アミノ酸の点で異なるか、または色素体輸送ペプチドなどの輸送ペプチド、または別のタンパク質もしくはペプチドに融合しているこれらのタンパク質のいずれか１つの任意の変異体または突然変異体も本明細書に含まれる。

【0086】

様々な実施形態では、本発明の核酸は、除草剤耐性、昆虫耐性、乾燥耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養価、耐病性、改善された光合成、改善された繊維品質、ストレス耐性、改善された生殖などの所望の形質を付与する１つ以上の遺伝子と植物において組み合わせることができる。

【0087】

（例えば、交配することにより、または別の遺伝子組み換えイベントを含有する植物を本発明のキメラ遺伝子で再形質転換することにより）同じ種の植物において本発明の遺伝子と組み合わせられてもよい特に有用な遺伝子組み換えイベントは、イベント５３１／ＰＶ−ＧＨＢＫ０４（ワタ、昆虫防除、国際公開第２００２／０４０６７７号パンフレットに記載される）、イベント１１４３−１４Ａ（ワタ、昆虫防除、デポジットされない、国際公開第２００６／１２８５６９号パンフレットに記載される）；イベント１１４３−５１Ｂ（ワタ、昆虫防除、デポジットされない、国際公開第２００６／１２８５７０号パンフレットに記載される）；イベント１４４５（ワタ、除草剤耐性、デポジットされない、米国特許出願公開第２００２−１２０９６４号明細書または国際公開第２００２／０３４９４６号パンフレットに記載される、イベント１７０５３（イネ、除草剤耐性、ＰＴＡ−９８４３として寄託される、国際公開第２０１０／１１７７３７号パンフレットに記載される）；イベント１７３１４（イネ、除草剤耐性、ＰＴＡ−９８４４として寄託される、国際公開第２０１０／１１７７３５号パンフレットに記載される）；イベント２８１−２４−２３６（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−６２３３として寄託される、国際公開第２００５／１０３２６６号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００５−２１６９６９号明細書に記載される）；イベント３００６−２１０−２３（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−６２３３として寄託される、米国特許出願公開第２００７−１４３８７６号明細書または国際公開第２００５／１０３２６６号パンフレットに記載される）；
イベント３２７２（コーン、品質形質、ＰＴＡ−９９７２として寄託される、国際公開第２００６／０９８９５２号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００６−２３０４７３号明細書に記載される）；イベント３３３９１（コムギ、除草剤耐性、ＰＴＡ−２３４７として寄託される、国際公開第２００２／０２７００４号パンフレットに記載される）；イベント４０４１６（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１１５０８として寄託される、国際公開第１１／０７５５９３号パンフレットに記載される）；イベント４３Ａ４７（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１１５０９として寄託される、国際公開第２０１１／０７５５９５号パンフレットに記載される）；イベント５３０７（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９５６１として寄託される、国際公開第２０１０／０７７８１６号パンフレットに記載される）；イベントＡＳＲ−３６８（ベントグラス、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４８１６として寄託される、米国特許出願公開第２００６−１６２００７号明細書または国際公開第２００４／０５３０６２号パンフレットに記載される）；イベントＢ１６（コーン、除草剤耐性、寄託されない、米国特許出願公開第２００３−１２６６３４号明細書に記載される）；イベントＢＰＳ−ＣＶ１２７−９（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ Ｎｏ．４１６０３として寄託される、国際公開第２０１０／０８０８２９号パンフレットに記載される）；イベントＢＬＲ１（ナタネ、雄性不稔性の回復、ＮＣＩＭＢ ４１１９３として寄託される、国際公開第２００５／０７４６７１号パンフレットに記載される）、イベントＣＥ４３−６７Ｂ（ワタ、昆虫防除、ＤＳＭ ＡＣＣ２７２４として寄託される、米国特許出願公開第２００９−２１７４２３号明細書または国際公開第２００６／１２８５７３号パンフレットに記載される）；イベントＣＥ４４−６９Ｄ（ワタ、昆虫防除、寄託されない、米国特許出願公開第２０１０−００２４０７７号明細書に記載される）；イベントＣＥ４４−６９Ｄ（ワタ、昆虫防除、寄託されない、国際公開第２００６／１２８５７１号パンフレットに記載される）；イベントＣＥ４６−０２Ａ（ワタ、昆虫防除、寄託されない、国際公開第２００６／１２８５７２号パンフレットに記載される）；イベントＣＯＴ１０２（ワタ、昆虫防除、
寄託されない、米国特許出願公開第２００６−１３０１７５号明細書または国際公開第２００４／０３９９８６号パンフレットに記載される）；イベントＣＯＴ２０２（ワタ、昆虫防除、寄託されない、米国特許出願公開第２００７−０６７８６８号明細書または国際公開第２００５／０５４４７９号パンフレットに記載される）；イベントＣＯＴ２０３（ワタ、昆虫防除、寄託されない、国際公開第２００５／０５４４８０号パンフレットに記載される）；イベントＤＡＳ２１６０６−３／１６０６（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１０２８として寄託される、国際公開第２０１２／０３３７９４号パンフレットに記載される），イベントＤＡＳ４０２７８（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１０２４４として寄託される、国際公開第２０１１／０２２４６９号パンフレットに記載される）；イベントＤＡＳ−４４４０６−６／ｐＤＡＢ８２６４．４４．０６．１（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１３３６として寄託される、国際公開第２０１２／０７５４２６号パンフレットに記載される），イベントＤＡＳ−１４５３６−７／ｐＤＡＢ８２９１．４５．３６．２（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１３３５として寄託される、国際公開第２０１２／０７５４２９号パンフレットに記載される）、イベントＤＡＳ−５９１２２−７（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ １１３８４として寄託される、
米国特許出願公開第２００６−０７０１３９号明細書に記載される）；イベントＤＡＳ−５９１３２（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、寄託されない、国際公開第２００９／１００１８８号パンフレットに記載される）；イベントＤＡＳ６８４１６（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１０４４２として寄託される、国際公開第２０１１／０６６３８４号パンフレットまたは国際公開第２０１１／０６６３６０号パンフレットに記載される）；イベントＤＰ−０９８１４０−６（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８２９６として寄託される、米国特許出願公開第２００９−１３７３９５号明細書または国際公開第０８／１１２０１９号パンフレットに記載される）；イベントＤＰ−３０５４２３−１（ダイズ、品質形質、寄託されない、米国特許出願公開第２００８−３１２０８２号明細書または国際公開第２００８／０５４７４７号パンフレットに記載される）；イベントＤＰ−３２１３８−１（コーン、ハイブリッド形成システム、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９１５８として寄託される、米国特許出願公開第２００９−０２１０９７０号明細書または国際公開第２００９／１０３０４９号パンフレットに記載される）；イベントＤＰ−３５６０４３−５（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８２８７として寄託される、米国特許出願公開第２０１０−０１８４０７９号明細書または国際公開第２００８／００２８７２号パンフレットに記載される）；イベントＥＥ−１（ブリンジャル、昆虫防除、寄託されない、国際公開第０７／０９１２７７号パンフレットに記載される）；イベントＦＩ１１７（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ２０９０３１として寄託される、米国特許出願公開第２００６−０５９５８１号明細書または国際公開第９８／０４４１４０号パンフレットに記載される）；イベントＦＧ７２（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１０４１として寄託される、国際公開第２０１１／０６３４１３号パンフレットに記載される）、イベントＧＡ２１（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ２０９０３３として寄託される、米国特許出願公開第２００５−０８６７１９号明細書または国際公開第９８／０４４１４０号パンフレットに記載される）；イベントＧＧ２５（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ２０９０３２として寄託される、米国特許出願公開第２００５−１８８４３４号明細書または国際公開第９８／０４４１４０号パンフレットに記載される）；イベントＧＨＢ１１９（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８３９８として寄託される、国際公開第２００８／１５１７８０号パンフレットに記載される）；イベントＧＨＢ６１４（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６８７８として寄託される、米国特許出願公開第２０１０−０５０２８２号明細書または国際公開第２００７／０１７１８６号パンフレットに記載される）；イベントＧＪ１１（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ２０９０３０として寄託される、米国特許出願公開第２００５−１８８４３４号明細書または国際公開第９８／０４４１４０号パンフレットに記載される）；イベントＧＭ ＲＺ１３（テンサイ、ウイルス抵抗性、ＮＣＩＭＢ−４１６０１として寄託される、国際公開第２０１０／０７６２１２号パンフレットに記載される）；イベントＨ７−１（テンサイ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ ４１１５８またはＮＣＩＭＢ ４１１５９として寄託される、米国特許出願公開第２００４−１７２６６９号明細書または国際公開第２００４／０７４４９２号パンフレットに記載される）；イベントＪＯＰＬＩＮ１（コムギ、耐病性、寄託されない、米国特許出願公開第２００８−０６４０３２号明細書に記載される）；イベントＬＬ２７（ダイズ、
除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ４１６５８として寄託される、国際公開第２００６／１０８６７４号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００８−３２０６１６号明細書に記載される）；イベントＬＬ５５（ダイズ、除草剤耐性、ＮＣＩＭＢ ４１６６０として寄託される、国際公開第２００６／１０８６７５号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００８−１９６１２７号明細書に記載される）；イベントＬＬｃｏｔｔｏｎ２５（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３３４３として寄託される、国際公開第２００３／０１３２２４号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００３−０９７６８７号明細書に記載される）；イベントＬＬＲＩＣＥ０６（イネ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ２０３３５３として寄託される、米国特許第６，４６８，７４７号明細書または国際公開第２０００／０２６３４５号パンフレットに記載される）；イベントＬＬＲｉｃｅ６２（イネ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ２０３３５２として寄託される、国際公開第２０００／０２６３４５号パンフレットに記載される）、イベントＬＬＲＩＣＥ６０１（イネ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２６００として寄託される、米国特許出願公開第２００８−２２８９０６０号明細書または国際公開第２０００／０２６３５６号パンフレットに記載される）；イベントＬＹ０３８（コーン、品質形質、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５６２３として寄託される、米国特許出願公開第２００７−０２８３２２号明細書または国際公開第２００５／０６１７２０号パンフレットに記載される）；イベントＭＩＲ１６２（コーン、昆虫防除、ＰＴＡ−８１６６として寄託される、米国特許出願公開第２００９−３００７８４号明細書または国際公開第２００７／１４２８４０号パンフレットに記載される）；イベントＭＩＲ６０４（コーン、昆虫防除、寄託されない、米国特許出願公開第２００８−１６７４５６号明細書または国際公開第２００５／１０３３０１号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ１５９８５（ワタ、昆虫防除、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２５１６として寄託される、米国特許出願公開第２００４−２５０３１７号明細書または国際公開第２００２／１００１６３号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ８１０（コーン、昆虫防除、寄託されない、米国特許出願公開第２００２−１０２５８２号明細書に記載される）；イベントＭＯＮ８６３（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２６０５として寄託される、国際公開第２００４／０１１６０１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００６−０９５９８６号明細書に記載される）；イベントＭＯＮ８７４２７（コーン、授粉調節、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−７８９９として寄託される、国際公開第２０１１／０６２９０４号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ８７４６０（コーン、ストレス耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８９１０として寄託される、国際公開第２００９／１１１２６３号パンフレットまたは米国特許出願公開第２０１１−０１３８５０４号明細書に記載される）；イベントＭＯＮ８７７０１（ダイズ、昆虫防除、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８１９４として寄託される、米国特許出願公開第２００９−１３００７１号明細書または国際公開第２００９／０６４６５２号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ８７７０５（ダイズ、品質形質−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９２４１として寄託される、米国特許出願公開第２０１０−００８０８８７号明細書または国際公開第２０１０／０３７０１６号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ８７７０８（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９６７０として寄託される、国際公開第２０１１／０３４７０４号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ８７７１２（ダイズ、収量、ＰＴＡ−１０２９６として寄託される、国際公開第２０１２／０５１１９９号パンフレットに記載される）、イベントＭＯＮ８７７５４（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−９３８５として寄託される、国際公開第２０１０／０２４９７６号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ８７７６９（ダイズ、品質形質、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８９１１として寄託される、米国特許出願公開第２０１１−００６７１４１号明細書または国際公開第２００９／１０２８７３号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ８８０１７（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−５５８２として寄託される、米国特許出願公開第２００８−０２８４８２号明細書または国際公開第２００５／０５９１０３号パンフレットに記載される）；イベントＭＯＮ８８９１３（ワタ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４８５４として寄託される、
国際公開第２００４／０７２２３５号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００６−０５９５９０号明細書に記載される）；イベントＭＯＮ８８３０２（ナタネ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１０９５５として寄託される、国際公開第２０１１／１５３１８６号パンフレットに記載される）、イベントＭＯＮ８８７０１（ワタ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１７５４として寄託される、国際公開第２０１２／１３４８０８号パンフレットに記載される）、イベントＭＯＮ８９０３４（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−７４５５として寄託される、国際公開第０７／１４０２５６号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００８−２６０９３２号明細書に記載される）；イベントＭＯＮ８９７８８（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−６７０８として寄託される、米国特許出願公開第２００６−２８２９１５号明細書または国際公開第２００６／１３０４３６号パンフレットに記載される）；イベントＭＳ１１（ナタネ、授粉調節−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８５０またはＰＴＡ−２４８５として寄託される、国際公開第２００１／０３１０４２号パンフレットに記載される）；イベントＭＳ８（ナタネ、授粉調節−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−７３０として寄託される、国際公開第２００１／０４１５５８号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００３−１８８３４７号明細書に記載される）；イベントＮＫ６０３（コーン、除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−２４７８として寄託される、米国特許出願公開第２００７−２９２８５４号明細書に記載される）；イベントＰＥ−７（イネ、昆虫防除、寄託されない、国際公開第２００８／１１４２８２号パンフレットに記載される）；イベントＲＦ３（ナタネ、授粉調節−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−７３０として寄託される、国際公開第２００１／０４１５５８号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００３−１８８３４７号明細書に記載される）；イベントＲＴ７３（ナタネ、除草剤耐性、寄託されない、国際公開第２００２／０３６８３１号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００８−０７０２６０号明細書に記載される）；イベントＳＹＨＴ０Ｈ２／ＳＹＮ−０００Ｈ２−５（ダイズ、除草剤耐性、ＰＴＡ−１１２２６として寄託される、
国際公開第２０１２／０８２５４８号パンフレットに記載される）、イベントＴ２２７−１（テンサイ、除草剤耐性、寄託されない、国際公開第２００２／４４４０７号パンフレットまたは米国特許出願公開第２００９−２６５８１７号明細書に記載される）；イベントＴ２５（コーン、除草剤耐性、寄託されない、米国特許出願公開第２００１−０２９０１４号明細書または国際公開第２００１／０５１６５４号パンフレットに記載される）；イベントＴ３０４−４０（ワタ、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−８１７１として寄託される、米国特許出願公開第２０１０−０７７５０１号明細書または国際公開第２００８／１２２４０６号パンフレットに記載される）；イベントＴ３４２−１４２（ワタ、昆虫防除、寄託されない、国際公開第２００６／１２８５６８号パンフレットに記載される）；イベントＴＣ１５０７（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、寄託されない、米国特許出願公開第２００５−０３９２２６号明細書または国際公開第２００４／０９９４４７号パンフレットに記載される）；イベントＶＩＰ１０３４（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＡＴＣＣ ＰＴＡ−３９２５として寄託される、国際公開第２００３／０５２０７３号パンフレットに記載される）、イベント３２３１６（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−１１５０７として寄託される、国際公開第２０１１／０８４６３２号パンフレットに記載される）、イベント４１１４（コーン、昆虫防除−除草剤耐性、ＰＴＡ−１１５０６として寄託される、国際公開第２０１１／０８４６２１号パンフレットに記載される）、任意選択的にイベントＥＥ−ＧＭ１／ＬＬ２７またはイベントＥＥ−ＧＭ２／ＬＬ５５と積み重ねられたイベントＥＥ−ＧＭ３／ＦＧ７２（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１０４１）（国際公開第２０１１／０６３４１３Ａ２号パンフレットに記載される）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１０４４２、国際公開第２０１１／０６６３６０Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＤＡＳ−６８４１６−４（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１０４４２、国際公開第２０１１／０６６３８４Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＤＰ−０４０４１６−８（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１５０８、国際公開第２０１１／０７５５９３Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＤＰ−０４３Ａ４７−３（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１５０９、国際公開第２０１１／０７５５９５Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＤＰ−００４１１４−３（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１５０６、国際公開第２０１１／０８４６２１Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＤＰ−０３２３１６−８（コーン、昆虫防除、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１５０７、国際公開第２０１１／０８４６３２Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＭＯＮ−８８３０２−９（ナタネ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１０９５５、国際公開第２０１１／１５３１８６Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＤＡＳ−２１６０６−３（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１０２８、国際公開第２０１２／０３３７９４Ａ２号パンフレットに記載される）、イベントＭＯＮ−８７７１２−４（ダイズ、
品質形質、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１０２９６、国際公開第２０１２／０５１１９９Ａ２号パンフレットに記載される）、イベントＤＡＳ−４４４０６−６（ダイズ、積み重ねられた除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１３３６、国際公開第２０１２／０７５４２６Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＤＡＳ−１４５３６−７（ダイズ、積み重ねられた除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１３３５、国際公開第２０１２／０７５４２９Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＳＹＮ−０００Ｈ２−５（ダイズ、除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１２２６、国際公開第２０１２／０８２５４８Ａ２号パンフレットに記載される）、イベントＤＰ−０６１０６１−７（ナタネ、除草剤耐性、寄託なし、利用できない、国際公開第２０１２０７１０３９Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＤＰ−０７３４９６−４（ナタネ、除草剤耐性、寄託なし、利用できない、米国特許出願公開第２０１２１３１６９２号明細書）、イベント８２６４．４４．０６．１（ダイズ、積み重ねられた除草剤耐性、登録番号ＰＴＡ−１１３３６、国際公開第２０１２０７５４２６Ａ２号パンフレットに記載される）、イベント８２９１．４５．３６．２（ダイズ、積み重ねられた除草剤耐性、登録番号ＰＴＡ−１１３３５、国際公開第２０１２０７５４２９Ａ２号パンフレットに記載される）、イベントＳＹＨＴ０Ｈ２（ダイズ、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１２２６、国際公開第２０１２／０８２５４８Ａ２号パンフレットに記載される）、イベントＭＯＮ８８７０１（ワタ、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１７５４、国際公開第２０１２／１３４８０８Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＫＫ１７９−２（アルアルファ、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１８３３、国際公開第２０１３／００３５５８Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントｐＤＡＢ８２６４．４２．３２．１（ダイズ、積み重ねられた除草剤耐性、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１１９９３、国際公開第２０１３／０１００９４Ａ１号パンフレットに記載される）、イベントＭＺＤＴ０９Ｙ（コーン、ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−１３０２５、国際公開第２０１３／０１２７７５Ａ１号パンフレットに記載される）を含む。

【0088】

植物細胞の形質転換は、当技術分野において公知のいくつかの技術の１つによって達成される。本発明の殺有害生物性遺伝子は、発現を植物細胞において得るまたは高めるために修飾されてもよい。典型的には、そのようなタンパク質を発現させる構築物は、遺伝子、ならびに３’非翻訳領域の転写を推進して転写終端およびポリアデニル化を可能にするためのプロモーターを含有するであろう。そのような構築物の組織化は、当技術分野において周知である。いくつかの場合、得られたペプチドが植物細胞内に分泌されるか、または別の方法でターゲットにされるように遺伝子を遺伝子工学で操作することが有用であり得る。例えば、遺伝子は、小胞体へのペプチドの転移を容易にするためのシグナルペプチドを含有するように遺伝子工学で操作することができる。イントロンのｍＲＮＡプロセシングが発現のために必要とされるように、イントロンを含有するように植物発現カセットを遺伝子工学で操作することも好ましいことがあり得る。

【0089】

典型的には、この「植物発現カセット」は、「植物形質転換ベクター」へ挿入されるであろう。この植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要とされる１つ以上のＤＮＡベクターからなってもよい。例えば、２つ以上の連続的なＤＮＡセグメントからなる植物形質転換ベクターを利用することが当技術分野において一般的な方法である。これらのベクターは、多くの場合、「二元ベクター」と当技術分野で呼ばれる。二元ベクターならびにヘルパープラスミドを有するベクターが、ほとんどの場合、効率的な形質転換を達成するために必要とされるＤＮＡセグメントのサイズおよび複雑さが極めて大きいアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換のために使用され、別個のＤＮＡ分子上へ機能を分けることが有利である。二元ベクターは、典型的には、Ｔ−ＤＮＡ転移のために必要とされるシス作用配列を含有するプラスミドベクター（左縁および右縁）と、植物細胞において発現できるように遺伝子工学で操作される選択性マーカーと、「興味のある遺伝子」（遺伝子組み換え植物の発生が望まれる植物細胞において発現できるように遺伝子工学で操作された遺伝子）とを含有するプラスミドベクターを含有する。このプラスミドベクター上にはまた、細菌複製のために必要とされる配列も存在する。シス作用配列は、効率的な植物細胞への転移およびその中での発現を可能にする様式で配置される。例えば、選択性マーカー遺伝子および殺有害生物性遺伝子は、左縁と右縁との間にある。多くの場合、第２プラスミドベクターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）から植物細胞へのＤＮＡ転移を媒介するトランス作用因子を含有する。このプラスミドは、多くの場合、当技術分野において理解されているように、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による植物細胞の感染、ならびに境界配列での開裂によるＤＮＡの転移およびｖｉｒ−媒介ＤＮＡ転移を可能にする毒性機能（Ｖｉｒ遺伝子）を含有する（Ｈｅｌｌｅｎｓ ａｎｄ Ｍｕｌｌｉｎｅａｕｘ（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ５：４４６−４５１）。いくつかのタイプのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株（例えば、ＬＢＡ４４０４、ＧＶ３１０１、ＥＨＡ１０１、ＥＨＡ１０５など）を植物形質転換のために使用することができる。第２プラスミドベクターは、マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコールなどの他の方法によって植物を形質転換するために必要ではない。

【0090】

一般に、植物形質転換法は、非相同ＤＮＡをターゲット植物細胞（例えば、未成熟または成熟胚、懸濁培養物、未分化カルス、プロトプラストなど）へ移す工程、引き続き最大閾値レベルの適切な選択（選択可能なマーカー遺伝子に応じて）を適用して形質転換された植物細胞を形質転換されていない細胞マスから回収する工程を含む。外植体は、典型的には、同じ培地の新鮮な供給物に移され、通常の方法で培養される。その後、形質転換された細胞は、最大閾値レベルの選択剤で相補された再生培地上に置かれた後に分化して芽になる。芽は、次に、根付いた芽または小植物を回収するための選択的発根培地に移される。遺伝子組み換え小植物は、次に成熟植物へ成長し、繁殖力のある種子を産生する（例えば、Ｈｉｅｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ６：２７１−２８２；Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：７４５−７５０）。外植体は、典型的には、同じ培地の新鮮な供給物に移され、通常の方法で培養される。遺伝子組み換え植物を発生させるための技術および方法の概要は、Ａｙｒｅｓ ａｎｄ Ｐａｒｋ（１９９４）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ １３：２１９−２３９ならびにＢｏｍｍｉｎｅｎｉ ａｎｄ Ｊａｕｈａｒ（１９９７）Ｍａｙｄｉｃａ ４２：１０７−１２０に見いだされる。形質転換された物質は多くの細胞を含有するため、形質転換されたおよび形質転換されていない細胞が細胞の対象のターゲットカルスまたは組織または群のいかなる小片にも存在する。形質転換されていない細胞を殺し、かつ形質転換された細胞を急速増殖させる能力は、形質転換された植物培養物をもたらす。多くの場合、形質転換されていない細胞を除去する能力は、形質転換された植物細胞の迅速な回収および遺伝子組み換え植物の成功する発生にとっての限界である。

【0091】

形質転換プロトコルならびにヌクレオチド配列を植物へ導入するためのプロトコルは、形質転換をターゲットにする植物または植物細胞のタイプ、すなわち単子葉植物または双子葉植物に応じて変わり得る。遺伝子組み換え植物の発生は、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接遺伝子導入、植物細胞へのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）による非相同ＤＮＡの導入（アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換）、粒子に付着した非相同の異質ＤＮＡでの植物細胞の爆撃、弾道粒子加速（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）、エアゾールビーム形質転換（米国特許出願公開第２００１００２６９４１号明細書；米国特許第４，９４５，０５０号明細書；国際公開第９１／００９１５号パンフレット；米国特許出願公開第２００２０１５０６６号明細書）、Ｌｅｃ１形質転換、およびＤＮＡを転移させるための様々な他の非粒子直接媒介方法を含むが、それらに限定されないいくつかの方法の１つによって行われてもよい。

【0092】

クロロプラストの形質転換のための方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：８５２６−８５３０；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：６０１−６０６を参照されたい。本方法は、選択可能なマーカーを含有するＤＮＡのパーティクルガンデリバリーおよび相同組み換えによる色素体ゲノムへのＤＮＡのターゲッティングによる。さらに、色素体形質転換は、核符号化および色素体誘導ＲＮＡポリメラーゼの組織優先発現によるサイレント色素体が運ぶ導入遺伝子の転写促進によって達成することができる。そのようなシステムは、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５に報告されている。

【0093】

植物細胞への非相同の異質ＤＮＡの統合後、形質転換されていない細胞を殺すための培地における最大閾値レベルの適切な選択を適用し、この選択処理から生き残る推定上形質転換された細胞を分け、通常、新鮮培地に移すことによって急速増殖させる。連続的な通過および適切な選択でのチャレンジにより、プラスミドベクターで形質転換されている細胞を特定し、急速増殖させる。分子および生化学方法を次に用いて、遺伝子組み換え植物のゲノム中での興味のある統合された非相同遺伝子の存在を確認することができる。

【0094】

形質転換された細胞は、従来法に従って植物へと成長され得る。例えば、ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１−８４を参照されたい。これらの植物は、その結、果成長され、同じ形質転換された菌株または異なる菌株のいずれかで授粉され、所望の表現型特性の構成的発現を有する得られたハイブリッドが特定される。２つ以上の発生物が、所望の表現型特性の発現が安定的に維持され、継承されることを確実にするために成長され、次に種子が、所望の表現型特性の発現が達成されていることを確実にするために収穫されてもよい。このようにして、本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば、本発明の発現カセットがそれらのゲノムへ安定的に組み込まれた形質転換された種子（「遺伝子組み換え種子」とも呼ばれる）を提供する。

【0095】

植物形質転換の評価
植物細胞への非相同の異質ＤＮＡの導入後、植物ゲノム中の非相同遺伝子の形質転換または統合は、統合遺伝子に関連した核酸、タンパク質および代謝産物の分析などの様々な方法によって確認される。

【0096】

ＰＣＲ分析は、土壌への移植前の早期段階での組み込まれた遺伝子の存在について形質転換された細胞、組織または芽を選抜するための迅速な方法である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。ＰＣＲは、興味のある遺伝子またはアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ベクターバックグラウンドなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して実施される。

【0097】

植物形質転換は、ゲノムＤＮＡのＳｏｕｔｈｅｒｎ（サザン）ブロット解析（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記参照）によって確認され得る。一般に、全ＤＮＡが形質転換体から抽出され、適切な制限酵素で消化され、アガロースゲルで分画され、ニトロセルロースまたはナイロン膜に移される。膜または「ブロット」は、次に、標準技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記参照）に従って植物ゲノムへの導入された遺伝子の統合を確認するために、例えば放射標識^３２ＰターゲットＤＮＡ断片で探査される。

【0098】

Ｎｏｒｔｈｅｒｎ（ノーザン）ブロット解析では、ＲＮＡが、当技術分野において通常用いられる標準手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記参照）に従って形質転換体の特異的な組織から単離され、ホルムアルデヒドアガロースゲルで分画され、ナイロンフィルター上へブロットされる。殺有害生物性遺伝子によってコードされたＲＮＡの発現が、次に、当技術分野において公知の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ、２００１、上記参照）により、フィルターを殺有害生物性遺伝子に由来する放射活性プローブにハイブリッド形成することによって試験される。

【0099】

Ｗｅｓｔｅｒｎ（ウェスタン）ブロット、生物化学的アッセイなどが、殺有害生物性タンパク質上に存在する１つ以上のエピトープに結合している抗体を使用して標準手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１、上記参照）により、殺有害生物性遺伝子によってコードされたタンパク質の存在を確認するために遺伝子組み換え植物に関して実施されてもよい。

【0100】

植物における殺有害生物活性
本発明の別の態様では、殺有害生物活性を有する殺有害生物性タンパク質を発現させる遺伝子組み換え植物を発生させ得る。例として上に記載された方法が遺伝子組み換え植物を発生させるために利用されてもよいが、遺伝子組み換え植物細胞が発生される方法は本発明にとって決定的に重要であるわけではない。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換、バイオリスティイク形質転換、および非パーティクル媒介法などの公知のまたは当技術分野において記載されている方法が実験者の判断で用いられてもよい。殺有害生物性タンパク質を発現させる植物は、当技術分野において記載される一般的な方法により、例えばカルスの形質転換、形質転換されたカルスの選択、およびそのような遺伝子組み換えカルスからの繁殖力のある植物の再生によって単離され得る。そのような方法では、植物細胞におけるその発現が、形質転換された細胞に関して特定または選択する能力を付与する限り、任意の遺伝子を選択可能なマーカーとして使用してもよい。

【0101】

クロラムフェニコール、アミノグリコシドＧ４１８、ハイグロマイシンなどに対する耐性などの多数のマーカーが植物細胞で使用するために開発されている。クロロプラスト代謝に関与する産物をコードする他の遺伝子も選択可能なマーカーとして使用さてよい。例えば、グリホサート、ブロモキシニル、またはイミダゾリノンなどの植物除草剤への耐性を提供する遺伝子は特定の用途を見いだし得る。そのような遺伝子は報告されている（Ｓｔａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：６３１０−６３１４（耐ブロモキシニル性ニトリラーゼ遺伝子）；およびＳａｔｈａｓｉｖａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１８：２１８８（耐ＡＨＡＳイミダゾリノン性遺伝子）。さらに、本明細書に開示される遺伝子は、細菌細胞または植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。植物、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、珠芽、その胚または子孫における導入遺伝子の存在を検出するための方法は、当技術分野において周知である。一実施形態では、導入遺伝子の存在は、殺有害生物活性について試験することによって検出される。

【0102】

殺有害生物性タンパク質を発現させる繁殖力のある植物は、殺有害生物活性について試験されてもよく、最適活性を示す植物がさらなる育種のために選択されてもよい。有害生物活性について分析するための方法は、当技術分野において利用可能である。一般に、タンパク質は、混合され、摂食アッセイに使用される。例えば、Ｍａｒｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｊ．ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ ７８：２９０−２９３を参照されたい。

【0103】

本発明は、単子葉植物および双子葉植物を含むが、それらに限定されない任意の植物種の形質転換のために用いられ得る。興味のある植物の例としては、コーン（トウモロコシ）、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびナタネ、アブラナ種（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｓｐ．）、アルファルファ、ライムギ、キビ、サフラワー、ピーナッツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、ミカンの木、ココア、ティー、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴ、オリーブ、パパイヤ、カシュー、マカダミア、アーモンド、オート麦、野菜、観賞植物、ならびに針葉樹が挙げられるが、それらに限定されない。

【0104】

野菜は、トマト、レタス、サヤマメ、ライマメ、エンドウ、ならびにキュウリ、カンタロープ、およびマスクメロンなどの属キュウリ属（Ｃｕｒｃｕｍｉｓ）のメンバーを含むが、それらに限定されない。観賞植物は、ツツジ、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパスイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、および菊を含むが、それらに限定されない。好ましくは、本発明の植物は、作物（例えば、トウモロコシ、ソルガム、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネなど）である。

【0105】

殺有害生物防除における使用
本発明のヌクレオチド配列またはその変異体を含む菌株を、有害生物防除において、または他の有機体を殺有害生物剤として遺伝子工学で操作することにおいて用いるための一般的な方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，０３９，５２３号明細書および欧州特許出願公開第０４８０７６２Ａ２号明細書を参照されたい。

【0106】

本発明のヌクレオチド配列、もしくはその変異体を含有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株、または本発明の殺有害生物性遺伝子およびタンパク質を含有するべき遺伝子操作されている微生物が、農作物および製品を有害生物から保護するために使用されてもよい。本発明の一態様では、毒素（殺有害生物剤）産生有機体の全体、すなわち非溶解細胞は、細胞がターゲット有害生物の環境に散布される場合に細胞で産生された毒素の活性を引き延ばす試剤で処理される。

【0107】

あるいは、殺有害生物剤は、殺有害生物性遺伝子を細胞宿主へ導入することによって産生される。殺有害生物性遺伝子の発現は、直接的または間接的に殺有害生物剤の細胞内産生および維持をもたらす。本発明の一態様では、これらの細胞は、次に、細胞がターゲット有害生物の環境に散布される場合に細胞において産生される毒素の活性を引き延ばす条件下で処理される。得られた産物は、毒素の毒性を保持している。これらの必然的な封入された殺有害生物剤は、次に、ターゲット有害生物をホストする環境、例えば、土壌、水、および植物の枝葉への散布のための従来技術に従って調合されてもよい。例えば、欧州特許出願公開第Ａ０１９２３１９号明細書およびその中に引用されている参考文献を参照されたい。あるいは、得られた物質の殺有害生物剤としての適用を可能にするためなど、本発明の遺伝子を発現させる細胞を調合してもよい。

【0108】

本発明の活性成分は、通常、組成物の形態で散布され、かつ他の化合物と一緒に、同時にまたは連続して、処理されるべき作物エリアまたは植物に散布されてもよい。これらの化合物は、肥料、除草剤、抗凍結剤、界面活性剤、洗剤、殺有害生物性石鹸、休眠油、ポリマー、および／または調合物の単一散布後にターゲットエリアの長期投与を可能にする持続放出型もしくは生分解性キャリア調合物であってもよい。それらはまた、選択的除草剤、化学殺虫剤、殺ウイルス剤、殺菌剤（ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄｅ）、抗アメーバ薬、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｄｅ）、抗線虫剤、軟体動物駆除剤、または必要に応じて調合の技術分野において習慣的に用いられるさらなる農業上許容されるキャリア、界面活性剤もしくは散布促進補助剤と一緒にこれらの調製物のいくつかの混合物であり得る。好適なキャリアおよび補助剤は、固体および液体であり得、かつ調合技術において通常用いられる物質、例えば天然もしくは再生無機物質、溶剤、分散剤、湿潤剤、粘着性付与剤、バインダーまたは肥料に対応する。同様に、調合物は、殺有害生物性調合物のターゲット有害生物による摂食または摂取を可能にするために、可食性「餌」へと調製されても、または有害生物「トラップ」にされてもよい。

【0109】

本発明の活性成分または本発明の細菌菌株によって産生された殺有害生物性タンパク質の少なくとも１つを含有する本発明の農薬組成物を散布する方法は、葉散布、種子コーティングおよび土壌散布を含む。散布の数および散布率は、対応する有害生物による摂取の強度に依存する。

【0110】

本組成物は、粉末、細粉、ペレット、顆粒、スプレー、エマルジョン、コロイド、溶液などとして調合されてもよく、ポリペプチドを含む細胞の培養物の乾燥、凍結乾燥、均質化、抽出、濾過、遠心分離、沈殿または濃縮のような従来法によって調製されてもよい。少なくとも１つのそのような殺有害生物性ポリペプチドを含有するすべてのそのような組成物において、ポリペプチドは、約１重量％〜約９９重量％の濃度で存在してもよい。

【0111】

鱗翅目、半翅目、双翅類、または鞘翅目の有害生物は、本発明の方法によって所与のエリアにおいて殺滅されるかもしくは数が減らされてもよく、または感受性有害生物の蔓延を防ぐために環境エリアに予防的に散布されてもよい。好ましくは、有害生物は、殺有害生物的に有効な量のポリペプチドを摂取するか、またはそれと接触される。「殺有害生物的に有効な量」とは、少なくとも１つの有害生物に死をもたらすか、または有害生物成長、摂食、もしくは正常な生理的成長を著しく低下させることができる殺有害生物剤の量を意図する。この量は、例えば、防除されるべき具体的なターゲット有害生物、処理されるべき具体的な環境、場所、植物、作物、または農業用地、環境条件、ならびに殺有害生物的に有効なポリペプチド組成物を散布する方法、率、濃度、安定性、および量のような因子に応じて変わるであろう。処方はまた、気候条件、環境配慮事項および／もしくは散布の頻度、ならびに／または有害生物蔓延の重症度に関して変わってもよい。

【0112】

記載される殺有害生物剤組成物は、細菌細胞、結晶および／もしくは胞子懸濁液、または単離されたタンパク質成分のいずれかを所望の農業上許容されるキャリアと一緒に調合することによって作られてもよい。組成物は、凍結乾燥、フリーズ乾燥、乾燥方法などの適切な方法で、または生理食塩水もしくは他の緩衝液などの水性キャリア、媒体もしくは好適な希釈剤中で投与前に調合されてもよい。調合組成物は、細粉もしくは顆粒状物質、または油（植物油もしくは鉱油）中の懸濁液、または水もしくは油／水エマルジョンの形態にあっても、または湿潤性粉末としてであっても、または農業用途に好適な任意の他のキャリア材料と組み合わせてであってもよい。好適な農業キャリアは、固体または液体であり得、かつ当技術分野において周知である。用語「農業上許容されるキャリア」は、殺有害生物剤調合技術において通常使用されるすべての補助剤、不活性成分、分散剤、界面活性剤、粘着性付与剤、バインダーなどを包含し、これらは、殺有害生物剤調合の当業者に周知である。調合物は、１つ以上の固体または液体補助剤と混合され、様々な方法により、例えば、従来の調合技術を用いて殺有害生物性組成物を好適な補助剤と相同に混合し、ブレンドし、および／またはすり潰すことによって調製されてもよい。好適な調合物および散布方法は、参照により本明細書に援用される米国特許第６，４６８，５２３号明細書に記載されている。

【0113】

「有害生物」は、昆虫、真菌類、細菌、線虫、ダニ（ｍｉｔｅ），ダニ（ｔｉｃｋ）などを含むが、それらに限定されない。害虫は、目（ｏｒｄｅｒ）甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）、膜翅目（Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、食毛目（Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ）、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、直翅目（Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ）、アザミウマ類（Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ）、ハサミムシ目（Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ）、シロアリ目（Ｉｓｏｐｔｅｒａ）、シラミ目（Ａｎｏｐｌｕｒａ）、ノミ目（Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ）、毛翅目（Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ）など、特に甲虫類Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）、鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）、および双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）から選択される昆虫を含む。

【0114】

目甲虫類（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ）は、亜目食肉亜目（Ａｄｅｐｈａｇａ）および多食亜目（Ｐｏｌｙｐｈａｇａ）を含む。亜目食肉亜目（Ａｄｅｐｈａｇａ）は、上科オサムシ上科（Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ）およびミズスマシ上科（Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａ）を含み、一方、亜目多食亜目（Ｐｏｌｙｐｈａｇａ）は、上科ガムシ上科（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ）、ハネカムシ上科（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ）、ホタル上科（Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ）、カッコウムシ上科（Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ）、コメツキムシ上科（Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ）、ナガフナガタムシ上科（Ｄａｓｃｉｌｌｏｉｄｅａ）、ドロムシ上科（Ｄｒｙｏｐｏｉｄｅａ）、マルトゲムシ上科（Ｂｙｒｒｈｏｉｄｅａ）、ヒラタムシ上科（Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ）、ツチハンミョウ上科（Ｍｅｌｏｉｄｅａ）、ハナノミ上科（Ｍｏｒｄｅｌｌｏｉｄｅａ）、ゴミムシダマシ上科（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ）、ナガシンクイムシ上科（Ｂｏｓｔｒｉｃｈｏｉｄｅａ）、コガネムシ上科（Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ）、カミキリムシ上科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ）、ハムシ上科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ）、およびゾウムシ上科（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａを含む。上科オサムシ上科（Ｃａｒａｂｏｉｄｅａ）は、科ハンミョウ科（Ｃｉｃｉｎｄｅｌｉｄａｅ）、オサムシ科（Ｃａｒａｂｉｄａｅ）、およびゲンゴロウ科（Ｄｙｔｉｓｃｉｄａｅ）を含む。上科ミズスマシ上科（Ｇｙｒｉｎｏｉｄｅａ）は、科ミズスマシ科（Ｇｙｒｉｎｉｄａｅ）を含む。上科ガムシ上科（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｏｉｄｅａ）は、科ガムシ科（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｄａｅ）を含む。上科ハネカクシ上科（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｏｉｄｅａ）は、科シデムシ科（Ｓｉｌｐｈｉｄａｅ）およびハネカクシ科（Ｓｔａｐｈｙｌｉｎｉｄａｅ）を含む。上科ホタル上科（Ｃａｎｔｈａｒｏｉｄｅａ）は、科ジョウカイボン科（Ｃａｎｔｈａｒｉｄａｅ）およびホタル科（Ｌａｍｐｙｒｉｄａｅ）を含む。上科カッコウムシ上科（Ｃｌｅｒｏｉｄｅａ）は、科カッコウムシ科（Ｃｌｅｒｉｄａｅ）およびカツオブシムシ科（Ｄｅｒｍｅｓｔｉｄａｅ）を含む。上科コメツキムシ上科（Ｅｌａｔｅｒｏｉｄｅａ）は、科コメツキムシ科（Ｅｌａｔｅｒｉｄａｅ）およびタマムシ科（Ｂｕｐｒｅｓｔｉｄａｅ）を含む。上科ヒラタムシ上科（Ｃｕｃｕｊｏｉｄｅａ）は、科テントウムシ科（Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ）を含む。上科ツチハンミョウ上科（Ｍｅｌｏｉｄｅａ）は、科ツチハンミョウ科（Ｍｅｌｏｉｄａｅ）を含む。上科ゴミムシダマシ上科（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｏｉｄｅａ）は、科ゴミムシダマシ科（Ｔｅｎｅｂｒｉｏｎｉｄａｅ）を含む。上科コガネムシ上科（Ｓｃａｒａｂａｅｏｉｄｅａ）は、科クロツヤムシ科（Ｐａｓｓａｌｉｄａｅ）およびコガネムシ科（Ｓｃａｒａｂａｅｉｄａｅ）を含む。上科カミキリムシ上科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｏｉｄｅａ）は、科カミキリムシ科（Ｃｅｒａｍｂｙｃｉｄａｅ）を含む。上科ハムシ上科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｏｉｄｅａ）は、科ハムシ科（Ｃｈｒｙｓｏｍｅｌｉｄａｅ）を含む。上科ゾウムシ上科（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｏｉｄｅａ）は、科ゾウムシ科（Ｃｕｒｃｕｌｉｏｎｉｄａｅ）およびキクイムシ科（Ｓｃｏｌｙｔｉｄａｅ）を含む。

【0115】

目双翅目（Ｄｉｐｔｅｒａ）は、亜目カ亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）、ハエ亜目（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ）および環縫亜目（Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ）を含む。亜目カ亜目（Ｎｅｍａｔｏｃｅｒａ）は、科ガガンボ科（Ｔｉｐｕｌｉｄａｅ）、チョウバエ科（Ｐｓｙｃｈｏｄｉｄａｅ）、カ科（Ｃｕｌｉｃｉｄａｅ）、ヌカカ科（Ｃｅｒａｔｏｐｏｇｏｎｉｄａｅ）、ユスリカ科（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｉｄａｅ）、ブユ科（Ｓｉｍｕｌｉｉｄａｅ）、ケバエ科（Ｂｉｂｉｏｎｉｄａｅ）、およびタマバエ科（Ｃｅｃｉｄｏｍｙｉｉｄａｅ）を含む。亜目ハエ亜目（Ｂｒａｃｈｙｃｅｒａ）は、科ミズアブ科（Ｓｔｒａｔｉｏｍｙｉｄａｅ）、アブ科（Ｔａｂａｎｉｄａｅ）、ツルギアブ科（Ｔｈｅｒｅｖｉｄａｅ）、ムシヒキアブ科（Ａｓｉｌｉｄａｅ）、ムシヒキアブモドキ科（Ｍｙｄｉｄａｅ）、ツリアブ科（Ｂｏｍｂｙｌｉｉｄａｅ）、およびアシナガバエ科（Ｄｏｌｉｃｈｏｐｏｄｉｄａｅ）を含む。亜目環縫亜目（Ｃｙｃｌｏｒｒｈａｐｈａ）は、門無額嚢群（Ａｓｃｈｉｚａ）および門無額嚢群（Ａｓｃｈｉｚａ）を含む。門無額嚢群（Ａｓｃｈｉｚａ）は、科ノミバエ科（Ｐｈｏｒｉｄａｅ）、ハナアブ科（Ｓｙｒｐｈｉｄａｅ）、およびメバエ科（Ｃｏｎｏｐｉｄａｅ）を含む。門無額嚢群（Ａｓｃｈｉｚａ）は、節無弁翅亜節（Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）および弁翅亜節（Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）を含む。節節無弁翅亜節（Ａｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）は、科マダラバエ科（Ｏｔｉｔｉｄａｅ）、ミバエ科（Ｔｅｐｈｒｉｔｉｄａｅ）、ハモグリバエ科（Ａｇｒｏｍｙｚｉｄａｅ）、およびショウジョウバエ科（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌｉｄａｅ）を含む。節弁翅亜節（Ｃａｌｙｐｔｒａｔａｅ）は、科シラミバエ科（Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃｉｄａｅ）、ヒツジバエ科（Ｏｅｓｔｒｉｄａｅ）、ヤドリバエ科（Ｔａｃｈｉｎｉｄａｅ）、ハナバエ科（Ａｎｔｈｏｍｙｉｉｄａｅ）、イエバエ科（Ｍｕｓｃｉｄａｅ）、クロバエ科（Ｃａｌｌｉｐｈｏｒｉｄａｅ）、およびニクバエ科（Ｓａｒｃｏｐｈａｇｉｄａｅ）を含む。

【0116】

目鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）は、科アゲハチョウ科（Ｐａｐｉｌｉｏｎｉｄａｅ）、シロチョウ科（Ｐｉｅｒｉｄａｅ）、シジミチョウ科（Ｌｙｃａｅｎｉｄａｅ）、タテハチョウ科（Ｎｙｍｐｈａｌｉｄａｅ）、マダラチョウ科（Ｄａｎａｉｄａｅ）、ジャノメチョウ科（Ｓａｔｙｒｉｄａｅ）、セセリチョウ科（Ｈｅｓｐｅｒｉｉｄａｅ）、スズメガ科（Ｓｐｈｉｎｇｉｄａｅ）、ヤママユガ科（Ｓａｔｕｒｎｉｉｄａｅ）、シャクガ科（Ｇｅｏｍｅｔｒｉｄａｅ）、ヒトリガ科（Ａｒｃｔｉｉｄａｅ）、ヤガ科（Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ）、ドクガ科（Ｌｙｍａｎｔｒｉｉｄａｅ）、スカシバガ科（Ｓｅｓｉｉｄａｅ）、およびヒロズコガ科（Ｔｉｎｅｉｄａｅ）を含む。

【0117】

線虫は、根粒線虫、シスト線虫などの寄生性線虫、ならびにヘテロデラ種（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）、メロイドジン種（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．）、およびグロボデアラ種（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．）などの腐れ（ｌｅｓｉｏｎ）線虫；特にヘテロデラ・グリシネス（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｇｌｙｃｉｎｅｓ）（ダイズシスト線虫）；ヘテロデラ・シャッチイ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｃｈａｃｈｔｉｉ）（ビートシスト線虫）；ヘテロデラ・アベナエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ）（穀物シスト線虫）；ならびにグロボデラ・ロストキエンシス（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｒｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）およびグロボデラ・パイリダ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｐａｉｌｉｄａ）（ジャガイモシスト線虫）を含む。腐れ線虫は、プラチレンカス種（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．）を含むが、それらに限定されないシスト線虫のメンバーを含む。

【0118】

半翅目の有害生物（半翅目（Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ）、同翅目（Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ）、または異翅目（Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ）と称される種を含む）は、ウェスタンターニッシュドプラントバグ（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｔａｒｎｉｓｈｅｄ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ）（リグス・ヘスペルス（Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ））、ターニッシュドプラントバグ（リグス・リネオラリス（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ））、およびグリーンプラントバグ（ｇｒｅｅｎ ｐｌａｎｔ ｂｕｇ）（リグス・エリスス（Ｌｙｇｕｓ ｅｌｉｓｕｓ）などのリグス種（Ｌｙｇｕｓ ｓｐｐ．）；モモアカアブラムシ（ｇｒｅｅｎ ｐｅａｃｈ ａｐｈｉｄ）（ミズス・ペルシカエ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ））、ワタアブラムシ（アフィス・ゴシッピー（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ））、チェリーアブラムシまたはブラックチェリーアブラムシ（ミズス・セラシ（Ｍｙｚｕｓ ｃｅｒａｓｉ））、ダイズアブラムシ（アフィス・グリシネス・マツムラ（Ａｐｈｉｓ ｇｌｙｃｉｎｅｓ Ｍａｔｓｕｍｕｒａ））などのアブラムシ；トビイロウンカ（ｂｒｏｗｎ ｐｌａｎｔ ｈｏｐｐｅｒ）（ニラパルバタ・ルゲンス（Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ））、およびツマグロヨコバイ（ｒｉｃｅ ｇｒｅｅｎ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）（ネフォテティクス種（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｓｐｐ．））；ならびにグリーンスティンクバグ（ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）（アクロステルナム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ））、クサギカメムシ（ｂｒｏｗｎ ｍａｒｍｏｒａｔｅｄ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）（ハリオモルファ・ハリス（Ｈａｌｙｏｍｏｒｐｈａ ｈａｌｙｓ））、ミナミアオカメムシ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｇｒｅｅｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）（ネザラ・ビリデュラ（Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ））、イネカメムシ（ｒｉｃｅ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）（オエバルス・プグナクス（Ｏｅｂａｌｕｓ ｐｕｇｎａｘ））、フォレストバグ（ｆｏｒｅｓｔ ｂｕｇ）（ペンタタマ・ルフィペス（Ｐｅｎｔａｔｏｍａ ｒｕｆｉｐｅｓ））、ヨーロッパのカメムシ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）（ラフィガスター・ネブローザ（Ｒｈａｐｈｉｇａｓｔｅｒ ｎｅｂｕｌｏｓａ））、およびカメムシ（ｓｈｉｅｌｄ ｂｕｇ）トロイラス・ルリダス（Ｔｒｏｉｌｕｓ ｌｕｒｉｄｕｓ）などのカメムシ（ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）を含むが、それらに限定されない。

【0119】

主要作物についての本発明の害虫は：トウモロコシ：オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ユーロピアンコーンボーラー（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）；アグロチス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、タマナヤガ（ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、アメリカタバコガ幼虫（ｃｏｒｎ ｅａｒｗｏｒｍ）；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ツマジロクサヨトウ（ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）；ジアトラエア・グランジオセラ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サウスウェスタンコーンボーラー（ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｂｏｒｅｒ）；エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、レッサーコーンストークボーラー（ｌｅｓｓｅｒ ｃｏｒｎｓｔａｌｋ ｂｏｒｅｒ）；ジアトラエア・サッカラリス（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、サトウキビボーラー（ｓｕｇａｒｃａｎｅ ｂｏｒｅｒ）；ジアブロチカ・ビルギフェラ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）、ウェスタンコーンルートワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；ジアブロチカ・ロンギコルニス・バルベリ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｌｏｎｇｉｃｏｒｎｉｓ ｂａｒｂｅｒｉ）、ノーザンコーンルートワーム（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；ジアブロチカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルジ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）、サザーンコーンルートワーム（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）；メラノツス種（Ｍｅｌａｎｏｔｕｓ ｓｐｐ．）、ハリガネムシ（ｗｉｒｅｗｏｒｍｓ）；シクロセファラ・ボレアリス（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｂｏｒｅａｌｉｓ）、ノーザンマスクドシェイファー（ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（地虫（ｗｈｉｔｅ ｇｒｕｂ））；シクロセファラ・イマクラタ（Ｃｙｃｌｏｃｅｐｈａｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ）、サザーンマスクドシェイファー（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｍａｓｋｅｄ ｃｈａｆｅｒ）（地虫）；ポリピア・ジャポニカ（Ｐｏｐｉｌｌｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、マイコガネ（Ｊａｐａｎｅｓｅ ｂｅｅｔｌｅ）；チャエトクネマ・プリカリア（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）、コーン・フレアビートル（ｃｏｒｎ ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）；スフェノホルス・マイジス（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、トウモロコシゾウムシ（ｍａｉｚｅ ｂｉｌｌｂｕｇ）；ロパロシフム・マイジス（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）、トウモロコシアブラムシ（ｃｏｒｎ ｌｅａｆ ａｐｈｉｄ）；
アヌラフィス・マイジラジシス（Ａｎｕｒａｐｈｉｓ ｍａｉｄｉｒａｄｉｃｉｓ）、コーンルートアフィド（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔ ａｐｈｉｄ）；ブリスス・ロイコプテルス・ロイコプテルス（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、チンチバグ（ｃｈｉｎｃｈ ｂｕｇ）；メラノプルス・フェムルブルム（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、レッドレッグドグラスホッパー（ｒｅｄｌｅｇｇｅｄ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；メラノプルス・サングイニペス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）、ミグラトリーグラスホッパー（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；ヒレミア・プラツラ（Ｈｙｌｅｍｙｉａ ｐｌａｔｕｒａ）、シードコーンマゴット（ｓｅｅｄｃｏｒｎ ｍａｇｇｏｔ）；アグロミザ・パルビコルニス（Ａｇｒｏｍｙｚａ ｐａｒｖｉｃｏｒｎｉｓ）、コーンブロットリーフマイナー（ｃｏｒｎ ｂｌｏｔ ｌｅａｆｍｉｎｅｒ）；アナホトリプス・オブスクルス（Ａｎａｐｈｏｔｈｒｉｐｓ ｏｂｓｃｒｕｒｕｓ）、グラススリップス（ｇｒａｓｓ ｔｈｒｉｐｓ）；ソレノプシス・ミレスタ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｍｉｌｅｓｔａ）、盗賊アリ（ｔｈｉｅｆ ａｎｔ）；テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、ナミハダニ（ｔｗｏｓｐｏｔｔｅｄ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；ソルガム：キロ・パルテルス（Ｃｈｉｌｏ ｐａｒｔｅｌｌｕｓ）、ソルガムボーラー（ｓｏｒｇｈｕｍ ｂｏｒｅｒ）；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ツマジロクサヨトウ；スポドプテラ・コスミオイデス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）；スポドプテラ・エリダニア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、アメリカタバコガ幼虫；エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、レッサーコーンストークボーラー；フェルチア・スブテラネア（Ｆｅｌｔｉａ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、グラニュレートカットワーム（ｇｒａｎｕｌａｔｅ ｃｕｔｗｏｒｍ）；フィロファガ・クリニタ（Ｐｈｙｌｌｏｐｈａｇａ ｃｒｉｎｉｔａ）、地虫；エレオデス（Ｅｌｅｏｄｅｓ）、コノデルス（Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ）、およ
びアエオルス種（Ａｅｏｌｕｓ ｓｐｐ．）、ハリガネムシ；オウレマ・メラノプス（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）、穀類葉ビートル（ｃｅｒｅａｌ ｌｅａｆ ｂｅｅｔｌｅ）；チャエトクネマ・プリカリア（Ｃｈａｅｔｏｃｎｅｍａ ｐｕｌｉｃａｒｉａ）、コーン・フレアビートル；スフェノホルス・マイジス（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｏｒｕｓ ｍａｉｄｉｓ）、トウモロコシゾウムシ；ロパロシフム・マイジス（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｍａｉｄｉｓ）、トウモロコシアブラムシ；シファ・フラバ（Ｓｉｐｈａ ｆｌａｖａ）、黄色サトウキビアブラムシ（ｙｅｌｌｏｗ ｓｕｇａｒｃａｎｅ ａｐｈｉｄ）；ブリスス・ロイコプテルス・ロイコプテルス（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、チンチバグ；コンタリニア・ソルギコラ（Ｃｏｎｔａｒｉｎｉａ ｓｏｒｇｈｉｃｏｌａ）、ソルガムミッジ（ｓｏｒｇｈｕｍ ｍｉｄｇｅ）；テトラニクス・シンナバリヌス（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、カルミンスパイダーマイト（ｃａｒｍｉｎｅ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、ナミハダニ；コムギ：シューダレチア・ユニプンクタタ（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａｔａ）、アーミーワーム（ａｒｍｙ ｗｏｒｍ）；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ツマジロクサヨトウ；エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、レッサーコーンストークボーラー；アグロチス・オルトゴニア（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ）、ウェスタンカットワーム（ｗｅｓｔｅｒｎ ｃｕｔｗｏｒｍ）；エラスモパルプス・リグノセルス（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）、レッサーコーンストークボーラー；オウレマ・メラノプス（Ｏｕｌｅｍａ ｍｅｌａｎｏｐｕｓ）、穀類葉ビートル；ハイペラ・プンクタタ（Ｈｙｐｅｒａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、クローバー葉ゾウムシ（ｃｌｏｖｅｒ ｌｅａｆ ｗｅｅｖｉｌ；ジアブロチカ・ウンデシムプンクタタ・ホワルジ（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｕｎｄｅｃｉｍｐｕｎｃｔａｔａ ｈｏｗａｒｄｉ）、サザーンコーンルートワーム；ロシアンコムギアブラムシ（Ｒｕｓｓｉａｎ ｗｈｅａｔ ａｐｈｉｄ）；シザフィス・グラミナム（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、ムギミドリアブラムシ（ｇｒｅｅｎｂｕｇ）；マクロシフム・アベナエ（Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ）、イギリス穀物アブラムシ（Ｅｎｇｌｉｓｈ ｇｒａｉｎ ａｐｈｉｄ）；メラノプルス・フェムルブルム（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、レッドレッグドグラスホッパー；メラノプルス・ディフェレンチアリス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、ディファレンシャルグラスホッパー（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｒａｓｓｈｏｐｐｅｒ）；メラノプルス・サングイニペス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｉｐｅｓ）、ミグラトリーグラスホッパー；マエチオラ・デストラクター（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、コムギタマバエ（Ｈｅｓｓｉａｎ ｆｌｙ）；シトジプロシス・モセラナ（Ｓｉｔｏｄｉｐｌｏｓｉｓ ｍｏｓｅｌｌａｎａ）、ウィートミッジ（ｗｈｅａｔ ｍｉｄｇｅ）；メロミザ・アメリカーナ（Ｍｅｒｏｍｙｚａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）、ウィートステムマゴット（ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｍａｇｇｏｔ）；ヒレミア・コアルクタータ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｃｏａｒｃｔａｔａ）、ウィートバルブフライ（ｗｈｅａｔ ｂｕｌｂ ｆｌｙ）；フランクリニエラ・フスカ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）、タバコアザミウマ（ｔｏｂａｃｃｏ ｔｈｒｉｐｓ）；ケフス・シンクトゥス（Ｃｅｐｈｕｓ ｃｉｎｃｔｕｓ）、ウィートステムソーフライ（ｗｈｅａｔ ｓｔｅｍ ｓａｗｆｌｙ）；アセリア・ツリパエ（Ａｃｅｒｉａ ｔｕｌｉｐａｅ）、ウィートカールマイト（ｗｈｅａｔ ｃｕｒｌ ｍｉｔｅ）；ヒマワリ：スレイマ・ヘリアンサナ（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ）、サンフラワーバッドモス（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄ ｍｏｔｈ）
；ホモエオソマ・エレクテルム（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、ヒマワリガ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｍｏｔｈ）；ジゴラマ・エクスクラメーショニス（Ｚｙｇｏｇｒａｍｍａ ｅｘｃｌａｍａｔｉｏｎｉｓ）、サンフラワービートル（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｂｅｅｔｌｅ）；ボチルス・ギボスス（Ｂｏｔｈｙｒｕｓ ｇｉｂｂｏｓｕｓ）、キャロットビートル（ｃａｒｒｏｔ ｂｅｅｔｌｅ）；ネオラシオプテラ・ムルトフェルドチアナ（Ｎｅｏｌａｓｉｏｐｔｅｒａ ｍｕｒｔｆｅｌｄｔｉａｎａ）、サンフラワーシードミッジ（ｓｕｎｆｌｏｗｅｒ ｓｅｅｄ ｍｉｄｇｅ）；ワタ：ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、コットンバッドワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｂｕｄｗｏｒｍ）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、コットンボールワーム（ｃｏｔｔｏｎ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）；スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ビートアーミーワーム（ｂｅｅｔ ａｒｍｙｗｏｒｍ）；ペクチノホラ・ゴシピエラ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、ワタアカムシ（ｐｉｎｋ ｂｏｌｌｗｏｒｍ）；アントノムス・グランジス（Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｇｒａｎｄｉｓ）、ワタミハナゾウムシ（ｂｏｌｌ ｗｅｅｖｉｌ）；アフィス・ゴシッピー（Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ）、ワタアブラムシ；シューダトモスセリス・セリアツス（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ ｓｅｒｉａｔｕｓ）、ワタノミハムシ（ｃｏｔｔｏｎ ｆｌｅａｈｏｐｐｅｒ）；トリアレウロデス・アブチロネア（Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ａｂｕｔｉｌｏｎｅａ）、バンデッドウィングド・ホワイトフライ（ｂａｎｄｅｄｗｉｎｇｅｄ ｗｈｉｔｅｆｌｙ）；リグス・リネオラリス（Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、ターニッシュドプラントバグ；メラノプルス・フェムルブルム（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、レッドレッグドグラスホッパー；メラノプルス・ディフェレンチアリス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、ディファレンシャルグラスホッパー；トリプス・タバシ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）、ネギアザミウマ（ｏｎｉｏｎ ｔｈｒｉｐｓ）；フランクリニエラ・フスカ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｋｉｅｌｌａ ｆｕｓｃａ）、タバコアザミウマ；テトラニクス・シンナバリヌス（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）、カルミンスパイダーマイト；テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、ナミハダニ；イネ：ジアトラエア・サッカラリス（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、サトウキビボーラー；スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ツマジロクサヨトウ；スポドプテラ・コスミオイデス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）；スポドプテラ・エリダニア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、アメリカタバコガ幼虫；コラスピス・ブルンネア（Ｃｏｌａｓｐｉｓ ｂｒｕｎｎｅａ）、グレープコラスピス（ｇｒａｐｅ ｃｏｌａｓｐｉｓ）；リソルホプトルス・オリゾフィルス（Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ）
、イネミズゾウムシ（ｒｉｃｅ ｗａｔｅｒ ｗｅｅｖｉｌ）；シトフィルス・オリザエ（Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、ココクゾウムシ（ｒｉｃｅ ｗｅｅｖｉｌ）；ネフォテティクス・ニグロピクツス（Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｎｉｇｒｏｐｉｃｔｕｓ）、ライスリーフホッパー（ｒｉｃｅ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）；ブリスス・ロイコプテルス・ロイコプテルス（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、チンチバグ；アクロステルナム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、グリーンスティンクバグ；チル・スプレッサリス（Ｃｈｉｌｕ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ）、アジアチックライスボーラー（Ａｓｉａｔｉｃ ｒｉｃｅ ｂｏｒｅｒ）；ダイズ：シュードプルシア・インクルデンス（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ダイズルーパー（ｓｏｙｂｅａｎ ｌｏｏｐｅｒ）；アンチカルシア・ゲンマタリス（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ）；プラチペナ・スカブラ（Ｐｌａｔｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）、グリークローバーワーム（ｇｒｅｅｎ ｃｌｏｖｅｒｗｏｒｍ）；オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ユーロピアンコーンボーラー；アグロチス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、タマナヤガ；スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ビートアーミーワーム；スポドプテラ・コスミオイデス（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｃｏｓｍｉｏｉｄｅｓ）；スポドプテラ・エリダニア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）；ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、コットンバッドワーム；ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、コットンボールワーム；エピラキナ・バリベスティス（Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ）、メキシカンビーンビートル（Ｍｅｘｉｃａｎ ｂｅａｎ ｂｅｅｔｌｅ）；ミズス・ペルシカエ（Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ）、モモアカアブラムシ；エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ ｆａｂａｅ）、ポテトリーフホッパー（ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｈｏｐｐｅｒ）；アクロステルナム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、グリーンスティンクバグ；メラノプルス・フェムルブルム（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｆｅｍｕｒｒｕｂｒｕｍ）、レッドレッグドグラスホッパー；メラノプルス・ディフェレンチアリス（Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｉｓ）、ディファレンシャルグラスホッパー；ヒレミア・プラツラ（Ｈｙｌｅｍｙａ ｐｌａｔｕｒａ）、シードコーンマゴット；セリコトリプス・ヴァリアビリス（Ｓｅｒｉｃｏｔｈｒｉｐｓ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ダイズアザミウマ（ｓｏｙｂｅａｎ ｔｈｒｉｐｓ）；トリプス・
タバシ（Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ）、ネギアザミウマ；テトラニクス・ツルケスタニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉ）、ストローベリースパイダーマイト（ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）；テトラニクス・ウルチカエ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）、ナミハダニ；オオムギ：オストリニア・ヌビラリス（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ユーロピアンコーンボーラー；アグロチス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、タマナヤガ；シザフィス・グラミナム（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓ ｇｒａｍｉｎｕｍ）、ムギミドリアブラムシ；ブリスス・ロイコプテルス・ロイコプテルス・ロイコプテルス（Ｂｌｉｓｓｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）、チンチバグ；アクロステルナム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ ｈｉｌａｒｅ）、グリーンスティンクバグ；ユースキスツス・セルバス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｓｅｒｖｕｓ）、ブラウンスティンクバグ（ｂｒｏｗｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）；ユースキスツス・ヘロス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）、ネオトロピカルブラウンスティンクバグ（ｎｅｏｔｒｏｐｉｃａｌ ｂｒｏｗｎ ｓｔｉｎｋ ｂｕｇ）；デリア・プラツラ（Ｄｅｌｉａ ｐｌａｔｕｒａ）、シードコーンマゴット；マエチオラ・デストラクター（Ｍａｙｅｔｉｏｌａ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、コムギタマバエ；ペトロビア・ラテンス（Ｐｅｔｒｏｂｉａ ｌａｔｅｎｓ）、チャイロコムギダニ（ｂｒｏｗｎ ｗｈｅａｔ ｍｉｔｅ）；ナタネ：ブレビコリネ・ブラシカエ（Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、ダイコンアブラムシ（ｃａｂｂａｇｅ ａｐｈｉｄ）；フィロトレタ・クルシフェラエ（Ｐｈｙｌｌｏｔｒｅｔａ ｃｒｕｃｉｆｅｒａｅ）、ノミハムシ（Ｆｌｅａ ｂｅｅｔｌｅ）；マメストラ・コンフィグラタ（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、バーサアーミーワーム（Ｂｅｒｔｈａ ａｒｍｙｗｏｒｍ）；プルテラ・キシロステラ（ｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、コナガ；デリア種（Ｄｅｌｉａ ｓｓｐ．）、根食い虫（Ｒｏｏｔ ｍａｇｇｏｔｓ）を含む。

【0120】

植物収量を増加させるための方法
植物収量を増加させるための方法が提供される。本方法は、本明細書に開示される殺有害生物性ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現させる植物または植物細胞を提供する工程と、前記ポリペプチドがそれに対して殺有害生物活性を有する有害生物が蔓延している（またはその蔓延の影響を受けやすい）野外で植物またはその種子を成長させる工程とを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、鱗翅目、鞘翅目、双翅類、半翅目、または線虫有害生物に対して殺有害生物活性を有し、前記野外には、鱗翅目、半翅目、鞘翅目、双翅類、または線虫有害生物が蔓延している。本明細書に定義される場合、植物の「収量」は、植物によって産生されるバイオマスの品質および／または量に言及する。「バイオマス」とは、任意の計画された植物産物を意図する。バイオマス産生の増加は、計画される植物産物の収量の何らかの向上である。植物収量の増加は、いくつかの商業的応用を有する。例えば、植物葉バイオマスの増加は、ヒトまたは動物消費用の葉菜の収量を増加させ得る。さらに、葉バイオマスの増加は、植物由来の医薬品または工業製品の生産を増加させるために利用することができる。収量の増加は、殺有害生物性配列を発現させない植物と比べて収量の少なくとも１％増加、少なくとも３％増加、少なくとも５％増加、少なくとも１０％増加、少なくとも２０％増加、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも１００％またはそれを超える増加を含むが、それらに限定されないあらゆる統計的に有意な増加を含むことができる。特異的な方法では、植物収量は、本明細書に開示される殺有害生物性タンパク質を発現させる植物の向上した有害生物抵抗性の結果として増加する。殺有害生物性タンパク質の発現は、有害生物が蔓延または摂食する能力の低下をもたらす。

【0121】

植物はまた、１種以上の除草剤、殺虫剤、または殺真菌剤を含む、１種以上の化学組成物で処理することができる。例示的な化学組成物は、果実／野菜除草剤：アトラジン、ブロマシル、ジウロン、グリホサート、リニュロン、メトリブジン、シマジン、トリフルラリン、フルアジホップ、グルホシネート、ハロスルフロンゴーワン、パラコート、プロピザミド、セトキシジム、ブタフェナシル、ハロスルフロン、インダジフラム；果実／野菜殺虫剤：アルジカルブ、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｅｎｇｉｅｎｓｉｓ）、カルバリル、カルボフラン、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、シフルトリン／ベータ−シフルトリン、エスフェンバレート、ラムダ−シハロトリン、アセキノシル、ビフェナゼート、メトキシフェノジド、ノバルロン、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラン、フルアクリピリム、スピロジクロフェン、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、スピノサド、リナキシピル、サイアジピル、トリフルムロン、スピロテトラマト、イミダクロプリド、フルベンジアミド、チオジカルブ、メタフルミゾン、スルホキサフロル、シフルメトフェン、シアノピラフェン、クロチアニジン、チアメトキサム、スピノトラム、チオジカルブ、フロニカミド、メチオカルブ、エマメクチン安息香酸塩、インドキサカルブ、フェナミホス、ピリプロキシフェン、酸化フェンブタスズ；果実／野菜殺真菌剤：アメトクトラジン、アゾキシストロビン、ベンチアバリカルブ、ボスカリド、キャプタン、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シアゾファミド、シフルフェナミド、シモキサニル、シプロコナゾール、シプロジニル、ジフェノコナゾール、ジメトモルフ、ジチアノン、フェナミドン、フェンヘキサミド、フルアジナム、フルジオキソニル、フルオピコリド、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、フォルペット、ホセチル、イプロジオン、イプロバリカルブ、イソピラザム、クレソキシム−メチル、マンコゼブ、マンジプロパミド、メタラキシル／メフェノキサム、メチラム、メトラフェノン、ミクロブタニル、ペンコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロパモカルブ、プロピコナゾール、プロピネブ、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、ピリメタニル、キノキシフェン、スピロキサミン、硫黄、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；穀類除草剤：２．４−Ｄ、アミドスルフロン、ブロモキシニル、カルフェントラゾン−Ｅ、クロロトルロン、クロルスルフロン、クロジナホップ−Ｐ、クロピラリド、ジカンバ、ジクロホップ−Ｍ、ジフルフェニカン、フェノキサプロップ、フロラスラム、フルカルバゾン−ＮＡ、フルフェナセット、フルピロスルフロン−Ｍ、フルロキシピル、フルタモン、グリホサート、ヨードスルフロン、アイオキシニル、イソプロツロン、ＭＣＰＡ、メソスルフロン、メトスルフロン、ペンジメタリン、ピノキサデン、プロポキシカルバゾン、プロスルホカルブ、ピロックススラム、スルホスルフロン、チフェンスルフロン、トラルコキシジム、トリアスルフロン、トリベヌロン、トリフルラリン、トリトスルフロン；穀類殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、シフルフェンアミド、シプロコナゾール、シプロジニル、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェンプロピジン、フェンプロピモルフ、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキンコナゾール、フルキサピロキサド、イソピラザム、クレソキシム−メチル、メトコナゾール、メトラフェノン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロピコナゾール、プロキナジド、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キノキシフェン、スピロキサミン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；穀類殺虫剤：ジメトエート、ラムダ−シハルトリン、デルタメトリン、アルファ−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、クロルフィリホス、ピリミカルブ、メチオカルブ、スルホキサフロル；トウモロコシ除草剤：アトラジン、アラクロール、ブロモキシニル、アセトクロール、
ジカンバ、クロピラリド、（Ｓ−）ジメテナミド、グルホシネート、グリホサート、イソキサフルトール、（Ｓ−）メトラクロール、メソトリオン、ニコスルフロン、プリミスルフロン、リムスルフロン、スルコトリオン、ホラムスルフロン、トプラメゾン、テンボトリオン、サフルフェナシル、チエンカルバゾン、フルフェナセット、ピロキサスルホン；トウモロコシ殺虫剤：カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル、イミダクロプリド、ラムダ−シハロトリン、テフルトリン、テルブホス、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェン、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン、テブピリムホス、エチプロール、サイアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、アベルメクチン；トウモロコシ殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、シプロコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェニトロパン、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イソピラザム、メトコナゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン；イネ除草剤：ブタクロール、プロパニル、アジムスルフロン、ベンスルフロン、シハロホップ、ダイムロン、フェントラザミド、イマゾスルフロン、メフェナセット、オキサジクロメフォン、ピラゾスルフロン、ピリブチカルブ、キンクロラック、チオベンカルブ、インダノファン、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン、オキサジクロメフォン、ベンゾビシクロン、ピリフタリド、ペノキススラム、ビスピリバック、オキサジアルギル、エトキシスルフロン、プレチラクロール、メソトリオン、テフリルトリオン、オキサジアゾン、フェノキサプロップ、ピリミスルファン；イネ殺虫剤：ダイアジノン、フェノブカルブ、ベンフラカルブ、ブプロフェジン、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカルブ、チアクロプリド、クロマフェノジド、クロチアニジン、エチプロール、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、アセタミプリド、チアメトキサム、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、シペルメトリン、クロルピリホス、エトフェンプロックス、カルボフラン、ベンフラカルブ、スルホキサフロル；イネ殺真菌剤：アゾキシストロビン、カルベンダジム、カルプロパミド、ジクロサイメット、ジフェノコナゾール、エジフェンホス、フェリムゾン、
ゲンタマシン、ヘキサコナゾール、ヒメキサゾール、イプロベンホス（ＩＢＰ）、イソプロチオラン、イソチアニル、カスガマイシン、マンコゼブ、メトミノストロビン、オリサストロビン、ペンシクロン、プロベナゾール、プロピコナゾール、プロピネブ、ピロキロン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、チアジニル、トリシクラゾール、トリフロキシストロビン、バリダマイシン；ワタ除草剤：ジウロン、フルオメツロン、ＭＳＭＡ、オキシフルオルフェン、プロメトリン、トリフルラリン、カルフェントラゾン、クレトジム、フルアジホップ−ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン、ペンジメタリン、ピリチオバック−ナトリウム、トリフロキシスルフロン、テプラロキシジム、グルホシネート、フルミオキサジン、チジアズロン；ワタ殺虫剤：アセフェート、アルジカルブ、クロルピリホス、シペルメトリン、デルタメトリン、アバメクチン、アセタミプリド、エマメクチン安息香酸塩、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ラムダ−シハロトリン、スピノサド、チオジカルブ、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリダリル、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン，リナキシピル、ベータ−シフルトリン，スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、ガンマシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、フロニカミッド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホキサフロル；ワタ殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フェナミドン、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトミノストロビン、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、キントゼン、テブコナゾール、テトラコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；
ダイズ除草剤：アラクロール、ベンタゾン、トリフルラリン、クロリムロン−エチル、クロランスラム−メチル、フェノキサプロップ、ホメサフェン、フルアジホップ、グリホサート、イマザモックス、イマザキン、イマゼタピル、（Ｓ−）メトラクロール、メトリブジン、ペンジメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート；ダイズ殺虫剤：ラムダ−シハロトリン、メトミル、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチン安息香酸塩、フィプロニル、エチプロール、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマおよびラムダシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン、トリフルムロン、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン；ダイズ殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、クロロタロニル、銅、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルトリアホール、フルキサピロキサド、イソピラザム、イプロジオン、イソチアニル、マンコゼブ、マネブ、メトコナゾール、メトミノストロビン、ミクロブタニル、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロピコナゾール、プロピネブ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、テトラコナゾール、
チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン；テンサイ除草剤：クロリダゾン、デスメジファム、エトフメセート、フェンメディファム、トリアレート、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル、メタミトロン、キンメラック、シクロキシジム、トリフルスルフロン、テプラロキシジム、キザロホップ；テンサイ殺虫剤：イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジネトフラン、デルタメトリン、β−シフルトリン、ガンマ／ラムダシハロトリン、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オン、テフルトリン、リナキシピル、シアキシピル、フィプロニル、カルボフラン；キャノーラ除草剤：クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタザクロール、トリフルラリン エタメトスルフロン、キンメラック、キザロホップ、クレトジム、テプラロキシジム；キャノーラ殺真菌剤：アゾキシストロビン、ビキサフェン、ボスカリド、カルベンダジム、シプロコナゾール、ジフェノコナゾール、ジモキシストロビン、エポキシコナゾール、フルアジナム、フルオピラム、フルオキサストロビン、フルシラゾール、フルキサピロキサド、イプロジオン、イソピラザム、メピコート−クロリド、メトコナゾール、メトミノストロビン、パクロブトラゾール、ペンチオピラド、ピコキシストロビン、プロクロラズ、プロチオコナゾール、ピラクロストロビン、テブコナゾール、チオファネート−メチル、トリフロキシストロビン、ビンクロゾリン；キャノーラ殺虫剤：カルボフラン、チアクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、アセタミプリド、ジネトフラン、β−シフルトリン、ガンマおよびラムダシハロトリン、タウ−フルバレリエート、エチプロール、スピノサド、スピノトラム、フルベンジアミド、リナキシピル、サイアジピル、４−［［（６−クロルピリジン−３−イル）メチル］（２，２−ジフルオロエチル）アミノ］フラン−２（５Ｈ）−オンを含む。

【0122】

本発明の遺伝子を別の縮物へ導入する方法
本発明の核酸を別の植物へ導入する方法も本明細書において提供される。本発明の核酸、またはその断片は、循環選択、戻し交配、系統育種、系統選択、集団選択、突然変異育種および／または遺伝子マーカー強化選択によって第２植物へ導入することができる。

【0123】

したがって、一実施形態では、本発明の方法は、本発明の核酸を含む第１植物を第２植物と交配してＦ１子孫植物を産生する工程と、本発明の核酸を含むＦ１子孫植物を選択する工程とを含む。本方法は、選択された子孫植物を、本発明の核酸を含む第１植物と交配して戻し交配子孫植物を産生する工程と、本発明の核酸を含む戻し交配子孫植物を選択する工程とをさらに含んでもよい。殺有害生物活性を評価するための方法は、本明細書において他の箇所で提供される。本方法は、これらの工程を相次いで１回以上繰り返して、本発明の核酸を含む選択された第２またはそれを超える戻し交配子孫植物を産生する工程をさらに含んでもよい。

【0124】

所望の表現型のための植物の選択を含む任意の育種方法を本発明の方法に用いることができる。いくつかの実施形態では、Ｆ１植物は、分離Ｆ２世代を産生するために自己授粉してもよい。所望の表現型（例えば、殺有害生物活性）を表す個別の植物が、次に、形質が育種集団内で同型であるかまたは固定されるまで各世代（Ｆ３、Ｆ４、Ｆ５など）において選択されてもよい。

【0125】

第２植物は、除草剤耐性、昆虫耐性、乾燥耐性、線虫防除、水利用効率、窒素利用効率、改善された栄養価、耐病性、改善された光合成、改善された繊維品質、ストレス耐性、改善された生殖などの所望の形質を有する植物であり得る。第２植物は、本明細書において他の箇所に記載されたようなエリートイベントであり得る。

【0126】

様々な実施形態では、植物部分（植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根など）、種子、植物細胞、珠芽、胚など）は、下流使用（食物、飼料、バイオ燃料、油、粉、ミールなど）のために、得られた交配物から収穫することができ、および繁殖させるか集めるかのいずれかであることができる。

【0127】

植物産物の取得方法
本発明はまた、本発明の核酸を含む作物からの穀物を収穫する工程および／またはミルにかけて商品生産物を得る工程を含む、商品生産物を取得する方法に関する。動物飼料、商品、ならびにヒト消費用の食物としての使用、またはヒト消費用を意図される組成物および商品での使用を意図される植物産物および副産物、特にそのような穀物／種子から製造される（半−）加工産物をはじめとする、失活種子／穀物産物を含むが、それらに限定されない農学的および商業的に重要な産物および／または組成物であって、前記産物が、全体種子または加工種子または穀物、動物飼料、コーンまたはダイズミール、コーンもしくはダイズ粉、コーン、コーンスターチ、ダイズミール、ダイズ粉、フレーク、ダイズタンパク質濃縮物、ダイズタンパク質分離物、組織化ダイズタンパク質濃縮物、化粧品、ヘアケア製品、ダイズナッツバター、納豆、テンペ、加水分解ダイズタンパク質、ホイップドトッピング、ショートニング、レシチン、食用全ダイズ（生の、ローストされた、または枝豆としての）、ダイズヨーグルト、ダイズチーズ、豆腐、ゆば、ならびに調理されるか、精白されるか、蒸されるか、焼かれるか、または湯通しされた穀物などであるか、またはそれらを含む産物および／または組成物は、これらの産物および組成物が、検出可能な量の本明細書に規定されるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列を、そのようなヌクレオチド配列を含有する任意の植物について特徴的であるとして含有する場合、本発明の範囲内であることを意図される。

【0128】

以下の実施例は、例示の目的で提供され、限定の目的で提供されるものではない。

【実施例】

【0129】

実施例１．シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）からの新規殺有害生物性遺伝子の発見
新規殺有害生物性遺伝子は、以下のステップを用いて細菌菌株ＡＴＸ８３５５６から特定された：
・この菌株からの全ＤＮＡの調製。全ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡおよび染色体外ＤＮＡの両方を含有する。染色体外ＤＮＡは、次のもののいくつかまたはすべての混合物を含有する：様々なサイズのプラスミド；ファージ染色体；他の未特定染色体外分子。
・ＤＮＡの配列決定。全ＤＮＡは、次世代シーケンシング（Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）法によって配列決定される。
・相同および／または他のコンピュータ解析による推定毒素遺伝子の特定。
・必要に応じて、いくつかのＰＣＲまたはクローニング戦略（例えば、ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）の１つによる興味のある遺伝子の配列仕上げ。

【0130】

【表1】

【0131】

本明細書に開示される毒素遺伝子は、ｐＡＸ９８０からのＰＣＲによって増幅され、ＰＣＲ産物は、当技術分野において周知の方法により、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現ベクターｐＡＸ９１６または別の好適なベクターへクローンされる。ａｘｍｉ遺伝子を有するベクターを含有する、得られたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌株は、ＣＹＳ培地（１０ｇ／ｌのバクトカシトン；３ｇ／ｌの酵母エキス；６ｇ／ｌのＫＨ_２ＰＯ_４；１４ｇ／ｌのＫ_２ＨＰＯ_４；０．５ｍＭのＭｇＳＯ_４；０．０５ｍＭのＭｎＣｌ_２；０．０５ｍＭのＦｅＳＯ_４）などの通常の培養基上において、胞子形成が顕微鏡検査によって明らかになるまで培養される。試料が調製され、バイオアッセイで活性について試験される。

【0132】

実施例２．殺有害生物活性についてのアッセイ
本発明のヌクレオチド配列は、殺有害生物性タンパク質を産生するそれらの能力について試験することができる。有害生物への殺有害生物剤として機能する殺有害生物性タンパク質の能力は、多くの場合に多数の方法で評価される。当技術分野における周知の一方法は、摂食アッセイを行うことである。そのような摂食アッセイにおいて、有害生物は、試験されるべき化合物を含有する試料または対照試料のいずれかに曝される。多くの場合、これは、試験されるべき材料またはそのような材料の好適な希釈物を、人工飼料など、有害生物が摂取するであろう材料上へ置くことによって行われる。試験されるべき材料は、液体、固体、またはスラリーからなってもよい。試験されるべき材料は、表面上に置かれ、次に乾燥されてもよい。あるいは、試験されるべき材料は、融解人工飼料と混合され、次にアッセイチャンバーへ施されてもよい。このアッセイチャンバーは、例えば、カップ、皿、またはマイクロタイタープレートのウェルであってもよい。

【0133】

吸汁有害生物（例えば、アブラムシ）についてのアッセイは、分配によって昆虫から、理想的には試験剤の摂取を可能にするために吸汁昆虫の吸口部分によって穴を開けられ得る部分から試験材を分離することを含んでもよい。多くの場合、試験材は、試験化合物の摂取を促進するためにサッカロースなどの摂食刺激物質と混合される。

【0134】

他のタイプのアッセイは、有害生物の口または消化管、ならびに遺伝子組み換え植物の成長部への試験材のマイクロインジェクション、それに続く遺伝子組み換え植物を摂食する有害生物の能力の試験を含むことができる。植物試験は、通常、消費される植物部分、例えば、葉につながったスモールケージの単離、または昆虫を含有するケージ中の植物全体の単離を含んでもよい。

【0135】

有害生物を分析するための他の方法およびアプローチは、当技術分野において公知であり、例えばＲｏｂｅｒｔｓｏｎ ａｎｄ Ｐｒｅｉｓｌｅｒ，ｅｄｓ．（１９９２）Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ ｂｉｏａｓｓａｙｓ ｗｉｔｈ ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．に見いだすことができる。あるいは、アッセイは、雑誌Ａｒｔｈｒｏｐｏｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ＴｅｓｔｓおよびＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｃｏｎｏｍｉｃ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙに、またはＥｎｔｏｍｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ（ＥＳＡ）の会員との討論によって一般に記載されている。

【0136】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される殺有害生物性タンパク質の毒素領域をコードするＤＮＡ領域は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードするｍａｌＥ遺伝子の背後に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＭＡＬ−Ｃ４ｘへクローンされる。これらのインフレーム融合は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてＭＢＰ−Ａｘｍｉ融合タンパク質発現をもたらす。

【0137】

大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現のために、ＢＬ２１^＊ＤＥ３が個々のプラスミドで形質転換される。単一コロニーが、カルベニシリンおよびグルコースで相補されたＬＢに接種され、３７℃で一晩増殖される。翌日、新鮮な培地が一晩培養物で接種され、対数期まで３７℃で増殖される。その後、培養は、２０℃で一晩０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導される。各細胞ペレットは、２０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液、ｐＨ７．４＋２００ｍＭのＮａＣｌ＋１ｍＭのＤＴＴ＋プロテアーゼ阻害剤中に懸濁され、超音波処理される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析を、融合タンパク質の発現を確認するために用いることができる。

【0138】

全細胞を含まない抽出物が、次に、ＭＢＰ−ａｘｍｉ融合タンパク質の親和性精製のために、迅速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）に取り付けられたアミロースカラム上に流される。結合融合タンパク質は、１０ｍＭのマルトース溶液で樹脂から溶離される。精製された融合タンパク質は、次に、Ａｘｍｉタンパク質からアミノ末端ＭＢＰタグを除去するために、Ｆａｃｔｏｒ Ｘａまたはトリプシンのいずれかで開裂される。タンパク質の開裂および溶解性は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定することができる。

【0139】

実施例３．発現および精製
Ａｘｍｉ５５４．１およびＡｘｍｉ５５４．２が発現され、生物活性について分析された。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）最適化遺伝子（それぞれ配列番号４および５に規定されるアミノ酸配列をコードするそれぞれ配列番号２および３）が発現のために合成され、ｐＭａｌＣ４Ｘ発現ベクターへクローンされた。クローンは配列決定によって確認された。ｐＧｅｎ５５４−１およびｐＧｅｎ５５４−２がタンパク質の発現のためにＢｌ２１コンピテント細胞において形質転換された。各新たに形質転換されたプレートからの単一コロニーがＬＢ培地に接種され、対数期まで３７℃で増殖され、１８℃で１８時間１ｍＭのＩＰＴＧで誘導された。精製されたＡｘｍｉ５５４．１およびＡｘｍｉ５５４．２が、標準プロトコルに従って、選択された害虫に対するバイオアッセイにかけられた。結果は表１〜４に示される。

【0140】

【表2】

【0141】

【表3】

【0142】

【表4】

【0143】

【表5】

【0144】

実施例４．植物発現のための遺伝子のベクター化
本発明のコーディング領域は、植物における発現のための適切なプロモーターおよびターミネーター配列と連結される。そのような配列は、当技術分野においてよく知られており、単子葉植物における発現のためのライスアクチンプロモーターまたはトウモロコシユビキチンプロモーター、双子葉植物における発現のためのアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）ＵＢＱ３プロモーターまたはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター、およびｎｏｓまたはＰｉｎＩＩターミネーターを含んでもよい。プロモーター遺伝子−ターミネーター構築物を産生するおよび確認するための技術も当技術分野において周知である。

【0145】

本発明の一態様において、合成ＤＮＡ配列が設計され、発生される。これらの合成配列は、親配列と比べて変更されたヌクレオチド配列を有するが、親配列と本質的に同一であるタンパク質をコードする。

【0146】

本発明の別の態様において、合成遺伝子の修正版は、得られたペプチドが小胞体またはアポプラストなどの植物オルガネラをターゲットにするように設計される。融合タンパク質の植物オルガネラのターゲティングをもたらすことが知られているペプチド配列は、当技術分野において公知である。例えば、シロバナルーピンであるルピナス・アルブス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）からの酸ホスファターゼ遺伝子（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＩＤ ＧＩ：１４２７６８３８、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １２７：５９４−６０６）のＮ−末端領域は、非相同タンパク質の小胞体ターゲティングをもたらすことが当技術分野において知られている。得られた融合タンパク質が、Ｃ−末端でペプチドＮ−末端リジン−アスパラギン酸−グルタミン酸−ロイシン（すなわち、「ＫＤＥＬ」モチーフ、配列番号１１）を含む小胞体保持配列も含有する場合、融合タンパク質は小胞体をターゲットにするであろう。融合タンパク質がＣ−末端で小胞体ターゲッティング配列を欠く場合、タンパク質は小胞体をターゲットにするであろうが、最終的にアポプラストに隔離されるであろう。

【0147】

したがって、この遺伝子は、本発明のアミノ酸配列のＮ−末端に融合したシロバナルーピンであるルピナス・アルブス（Ｌｕｐｉｎｕｓ ａｌｂｕｓ）からの酸ホスファターゼ遺伝子（（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）ＩＤ ＧＩ：１４２７６８３８、Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１（上記参照）のＮ−末端３１アミノ酸、およびＣ−末端でＫＤＥＬ（配列番号１１）配列を含有する融合タンパク質をコードする。したがって、得られたタンパク質は、植物細胞における発現時に植物小胞体をターゲットにすると予測される。

【0148】

上に記載された植物発現カセットは、形質転換された細胞および組織の選択に役立つための適切な植物選択可能なマーカーと組み合わせられ、植物形質転換ベクターに結合される。これらは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換からのバイナリーベクター、またはエアゾールもしくはバイオリスチック形質転換のためのシンプルプラスミドベクターを含んでもよい。

【0149】

実施例５．ダイズ形質転換
ダイズ形質転換は、Ｐａｚ ｅｔ ａｌ．（２００６）、Ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２５：２０６によって記載されている方法を本質的に用いるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）媒介形質転換ダイズハーフ種子外植体を使用して、記載されたものなどの当技術分野において周知の方法を用いて達成される。形質転換体は、テンボトリオンを選択マーカーとして使用して特定される。若芽の外観が観察され、除草剤イソキサフルトールまたはテンボトリオンへの耐性の指標として文書化された。耐性がある遺伝子組み換え芽は、イソキサフルトールまたはテンボトリオンで処理されていない野生型ダイズ芽に匹敵する正常な緑化を示すであろうが、同じ量のイソキサフルトールまたはテンボトリオンで処理された野生型ダイズ芽は、完全に白くなるであろう。これは、ＨＰＰＤタンパク質の存在が、イソキサフルトールまたはテンボトリオンのようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤への耐性を可能にすることを示す。

【0150】

耐性がある若芽は、発根培地に移されるかまたは接ぎ木される。根付いた小植物は、順化期間後に温室に移される。導入遺伝子を含有する植物は、次に、例えば硫酸アンモニウム、メチルエステルナタネ油で相補された、１００ｇ ＡＩ／ｈａの率でのテンボトリオンまたは３００ｇ ＡＩ／ｈａの率でのメソトリオンのように、ＨＰＰＤ阻害剤除草剤を噴霧される。散布の１０日後、除草剤の散布による症候が評価され、同じ条件下での野生型植物に関して観察される症候と比較される。

【0151】

実施例６．ワタＴ０植物定着および選択
ワタ形質転換は、当技術分野において公知の方法、とりわけＰＣＴ特許公開国際公開第００／７１７３３号パンフレットに記載されるものにおける好ましい方法を用いて達成される。再生植物体は温室に移される。順化期間後、十分に成長した植物は、硫酸アンモニウムおよびメチルエステルナタネ油で相補された１００または２００ｇＡＩ／ｈａに等しい例えばテンボトリオンのようなＨＰＰＤ阻害剤除草剤を噴霧される。噴霧散布の７日後、除草剤での処理による症候が評価され、同じ条件下での同じ処理にかけられた野生型ワタ植物に関して観察される症候と比較される。

【0152】

実施例７．本明細書に記載される殺有害生物性タンパク質遺伝子でのトウモロコシ細胞の形質転換
トウモロコシ雌穂は、最良には授粉の８〜１２日後に集められる。胚が穂から単離され、サイズが０．８〜１．５ｍｍのそれらの胚が形質転換に使用するために好ましい。胚は、ＤＮ６２Ａ５Ｓ培地（３．９８ｇ／ＬのＮ６塩；（１０００×原液の）１ｍＬ／ＬのＮ６ビタミン；８００ｍｇ／ＬのＬ−アスパラギン；１００ｍｇ／Ｌのミオ−イノシトール；１．４ｇ／ＬのＬ−プロリン；１００ｍｇ／Ｌのカザミノ酸；５０ｇ／Ｌのサッカロース；（１ｍｇ／ｍＬ原液の）１ｍＬ／Ｌの２，４−Ｄ）などの好適な培養培地上において、胚盤を上にして平板培養される。しかし、ＤＮ６２Ａ５Ｓ以外の培地および塩が好適であり、当技術分野において公知である。胚は、暗所において２５℃で一晩培養される。しかし、胚を一晩培養することは本質的に必要ではない。

【0153】

得られた外植体は、メッシュスクエア（１プレート当たり３０〜４０）に移され、約３０〜４５分間浸透培地上へ移され、次にビーム放射プレート（例えば、ＰＣＴ公開国際公開第／０１３８５１４号パンフレットおよび米国特許第５，２４０，８４２号明細書を参照されたい）に移される。

【0154】

植物細胞における本発明の遺伝子のために設計されたＤＮＡ構築物は、エアゾールビーム加速器を用いて、本質的にＰＣＴ公開国際公開第／０１３８５１４号パンフレットに記載されるような条件を用いて植物組織中へ加速される。ビーム放射後、胚は、浸透培地上で約３０分間培養され、暗所において２５℃で一晩培養培地上へ置かれる。ビームされる外植体を過度に損傷することを避けるために、それらは、回復培地に移す前に少なくとも２４時間培養される。胚は、次に、暗所において２５℃で約５日間にわたり回復期培地上へ広げられ、次に選択培地に移される。外植体は、利用される特定の選択の性質および特性に応じて、８週間までにわたり選択培地で培養される。選択期間後、得られたカルスは、成熟した体細胞胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移される。得られた成熟した体細胞胚は、次に微光下に置かれ、再生のプロセスが当技術分野において公知の方法によって開始される。得られた芽は発根培地上で根付かせられ、得られた植物は、ナーセリーポットに移され、遺伝子組み換え植物として繁殖される。

【0155】

【表6】

【0156】

溶液のｐＨは１ＮのＫＯＨ／１ＮのＫＣｌでｐＨ５．８に調整され、Ｇｅｌｒｉｔｅ（ゲルライト）（Ｓｉｇｍａ）が３ｇ／Ｌまでの濃度で添加され、培地はオートクレーブ処理される。５０℃に冷却した後、２ｍｌ／Ｌの５ｍｇ／ｍｌ硝酸銀の原液（Ｐｈｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ）が添加される。

【0157】

実施例８．アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換による植物細胞における本発明の遺伝子の形質転換
穂は、最良には授粉の８〜１２日後に集められる。胚が穂から単離され、サイズが０．８〜１．５ｍｍのそれらの胚が形質転換に使用するために好ましい。胚は、好適な培養培地上において、胚盤を上にして平板培養され、暗所において２５℃で一晩培養される。しかし、胚を一晩培養することは本質的に必要ではない。胚は、Ｔｉプラスミド媒介導入のための適切なベクターを含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）菌株と約５〜１０分間接触され、次に共培養培地上で約３日間（暗所において２２℃）平板培養される。共培養後、外植体は、５〜１０日間（暗所において２５℃で）回復期培地に移される。外植体は、利用される特定の選択の性質および特性に応じて、８週間までにわたり選択培地において培養される。選択期間後、得られたカルスは、成熟した体細胞胚の形成が観察されるまで胚成熟培地に移される。得られた成熟した体細胞胚は、次に微光下に置かれ、再生のプロセスが当技術分野において公知であるように開始される。

【0158】

実施例９．イネの形質転換
適切な発育段階での胚を含有する未成熟イネ種子が、温室中で十分に制御された条件下で成長した供与体植物から集められる。種子の滅菌後、未成熟胚が摘出され、固体培地上で３日間プレ誘導される。プレ誘導後、胚は、所望のベクターを抱くアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の懸濁液中に数分間浸漬される。次に、胚は、アセトシリンゴンを含有する固体培地上で共培養され、暗所において４日間培養される。外植体は、次に、ホスフィノトリシンを選択剤として含有する第１選択的培地に移される。およそ３週間後、カリ（ｃａｌｌｉ）が、成長している胚盤をいくつかのより小さい片へ切断され、同じ選択的培地に移された。その後の継代培養は、およそ２週間おきに行われる。各継代培養時、活発に成長しているカリがより小さい片へ切断され、第２選択的培地上で培養される。数週間後、ホスフィノトリシンに明らかに耐性のカリが選択的再生培地に移される。発生した小植物は、完全伸長のために半分濃度のＭＳ上で培養される。植物は最終的には土壌に移され、温室中で成長される。

【0159】

本明細書に述べられたすべての刊行物および特許出願は、本発明が関連する技術分野の当業者の熟練度を示す。すべての刊行物および特許出願は、あたかも各個別の刊行物または特許出願が参照により援用されることを具体的かつ個別に示されているかのように同程度まで参照により本明細書に援用される。

【0160】

前述の本発明は、理解を明確にするという目的のために例示および実施例によりいくらか詳細に記載されてきたが、特定の変更形態および修正形態が添付の特許請求の範囲内でなされ得ることは明らかであろう。

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]