特許 6873985 インビトロで肝臓構築物を産生する方法およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6873985

(24)【登録日】2021年4月23日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】インビトロで肝臓構築物を産生する方法およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20210510BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20210510BHJP

   C12M 3/00 20060101ALI20210510BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12N5/071

   C12M1/00 A

   C12M3/00

   C12Q1/02

【請求項の数】24

【全頁数】17

(21)【出願番号】特願2018-519364(P2018-519364)

(86)(22)【出願日】2016年10月14日

(65)【公表番号】特表2018-530341(P2018-530341A)

(43)【公表日】2018年10月18日

(86)【国際出願番号】US2016056942

(87)【国際公開番号】WO2017070007

(87)【国際公開日】20170427

【審査請求日】2019年10月10日

(31)【優先権主張番号】62/241,966

(32)【優先日】2015年10月15日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】507189574

【氏名又は名称】ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100096769

【弁理士】

【氏名又は名称】有原 幸一

(74)【代理人】

【識別番号】100107319

【弁理士】

【氏名又は名称】松島 鉄男

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100170379

【弁理士】

【氏名又は名称】徳本 浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】アタラ，アンソニー

(72)【発明者】

【氏名】ビショップ，コリン

(72)【発明者】

【氏名】ミード，アイヴィー

【審査官】 佐久 敬

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１５１９２１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許第０６７３７２７０（ＵＳ，Ｂ１）

【文献】 米国特許出願公開第２０１３／０２８８３７５（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Acta Biomaterialia (2015), Vol.25, p.24-34

【文献】 Developmental cell (2010), Vol.18, No.2, p.175-189

【文献】 Toxicology and Applied Pharmacology (2013), Vol.268, p.1-16

【文献】 Experimental cell research (1996), Vol.226, No.1, p.223-233

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ

Ｃ１２Ｑ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

人工肝臓構築物を作製するために有用な細胞組成物であって、
（ａ）個数で７０〜９０パーセントとなる量の肝細胞、
（ｂ）個数で５〜２０パーセントとなる量のクッパー細胞、
（ｃ）個数で２〜１０パーセントとなる量の肝星細胞、
（ｄ）個数で２〜１０パーセントとなる量の類洞内皮細胞、および
（ｅ）個数で１〜４パーセントとなる量の胆管細胞
を組み合わせて含む細胞組成物。

【請求項2】

前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載の細胞組成物。

【請求項3】

請求項１または２に記載の細胞組成物を水性培養培地中に含む培養組成物であって、前記培養培地が少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質をさらに含む、培養組成物。

【請求項4】

前記少なくとも１種のＥＣＭタンパク質がＩ型コラーゲンを含む、請求項３に記載の培養組成物。

【請求項5】

前記少なくとも１種のＥＣＭタンパク質が、１ミリリットルあたり１０ナノグラム〜１ミリリットルあたり１ミリグラムの量で含まれる、請求項３または４に記載の培養組成物。

【請求項6】

前記培養培地が、１０〜３０重量パーセントの血清をさらに含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の培養組成物。

【請求項7】

請求項１または２に記載の細胞組成物または請求項３〜６のいずれか１項に記載の培養組成物を含む、人工肝臓構築物。

【請求項8】

直径１００〜３００ミクロンを有する、請求項８に記載の人工肝臓構築物。

【請求項9】

前記人工肝臓構築物中の全細胞の総数が１００〜１０，０００である、請求項７または８に記載の人工肝臓構築物。

【請求項10】

（ｉ）肝細胞微絨毛、毛細胆管様構造、および／もしくはリソソームのうち少なくとも１つ、２つ、もしくは３つ全てが存在すること、ならびに／または
（ｉｉ）培養物中で維持すると、少なくとも１０日の期間中に尿素、アルブミン、および／もしくはアルファ１−アンチトリプシンのうち少なくとも１つ、２つ、もしくは３つ全てが産生されること
を特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載の人工肝臓構築物。

【請求項11】

前記人工肝臓構築物が凝集物の形態である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の人工肝臓構築物。

【請求項12】

請求項７〜１１のいずれか１項に記載の人工肝臓構築物を作製する方法であって、請求項３〜６のいずれか１項に記載の培養組成物を用いて、ハンギングドロップ培養法、重力強制自己組織化法または微細加工成形を使用する方法を実施するステップを含む方法。

【請求項13】

前記ハンギングドロップ培養法を実施するステップが、
請求項３〜６のいずれか１項に記載の培養組成物を含む液滴を培養基板に堆積させるステップと、次いで、
前記培養組成物中の細胞を培養するステップと
を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

（ａ）ヒドロゲル、および
（ｂ）前記ヒドロゲル中に、複数の、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の人工肝臓構築物
を含む組成物。

【請求項15】

（ａ）少なくとも１つのチャンバーを内部に含む基板、および
（ｂ）前記チャンバー内に、少なくとも１つの、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の人工肝臓構築物、または請求項１５に記載の組成物
を含むデバイス。

【請求項16】

前記デバイスが、前記チャンバー内の、ゲル化した形態の一時的な保護支持培地とともに、任意選択的に、冷却要素とともに、容器内に梱包されている、請求項１５に記載のデバイス。

【請求項17】

デバイスを作製する方法であって、
（ａ）基板を用意するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の構築物、または請求項１４に記載の組成物を、前記基板に堆積させるステップと
を含む方法。

【請求項18】

前記堆積させるステップが、バイオプリンティング、ピペッティング、マイクロインジェクション、またはマイクロ流体による堆積により実施される、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記堆積させるステップが、請求項１４に記載の組成物を前記基板にバイオプリンティングすることにより実施され、
前記ヒドロゲルが、前記堆積させるステップの前に自発的に架橋するように構成された架橋可能なプレポリマーと、前記堆積させるステップの後に前記架橋可能なプレポリマーと架橋するように構成された堆積後架橋基とを含む、
請求項１７に記載の方法。

【請求項20】

前記堆積後架橋基を前記架橋可能なプレポリマーと架橋させる架橋ステップを、前記ヒドロゲルに光を照射することにより実施するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記架橋可能なプレポリマーがポリエチレン（グリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を含み、
前記堆積後架橋基がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アルキンを含む、
請求項１９または２０に記載の方法。

【請求項22】

薬理学的および／または毒性学的活性について化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１５に記載のデバイスを用意するステップと、
（ｂ）前記人工肝臓構築物に化合物を投与するステップと、次いで
（ｃ）前記人工肝臓構築物の少なくとも１つの細胞からの、前記化合物に対する薬理学的および／または毒性学的応答を検出するステップと
を含む方法。

【請求項23】

前記応答が、細胞死、細胞増殖、前記化合物の吸収、分布、代謝もしくは排泄、または生理応答を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記人工肝臓構築物が３Ｄ肝臓スフェロイドである、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の人工肝臓構築物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願］
本出願は、その開示が全体にわたって参照により本出願の一部をなすものである、２０１５年１０月１５日出願の米国仮特許出願第６２／２４１，９６６号の利益を主張するものである。

【0002】

［政府支援］
本発明は、Ｓｐａｃｅ ａｎｄ Ｎａｖａｌ Ｗａｒｆａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｃｅｎｔｅｒ Ｐａｃｉｆｉｃ （ＳＳＣ ＰＡＣＩＦＩＣ）のもとで、アメリカ国防脅威削減局（ＤＴＲＡ）により授与された契約第Ｎ６６００１−１３−Ｃ−２０２７号に基づく政府支援を受けてなされた。米国政府は本発明に対し一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

多くの細胞培養系は従来、２次元（２Ｄ）法によるものであった。しかし従来の２Ｄ系では、インビボで見られる細胞間および細胞レベル以上の構造は復元されない。インビボでの器官生理および機能のモデルを作るため、各種３Ｄ培養系が開発されてきた。脱細胞器官などの生物由来マトリックス、合成ポリマーなどの人工マトリックス、ならびに、細胞外タンパク質と、ポリマー、ヒドロゲルおよび無機基板とのハイブリッドを使用して、３Ｄ足場構造が生成され、インビボでの器官構成が再現されている。科学者らは、これらの生体、合成、およびハイブリッド物質を、ウィービング（ｗｅａｖｉｎｇ）、エレクトロスピニング、バイオプリンティング、マイクロマシニング、および成形などの製作方法に組み込んできた。これらの方法は、有用な構造の複雑性を生成することができるものの、再現性が低く、変動性が大きく、拡張性が小さく、製造が困難であるという問題がある。概要は、Ｇｏｄｏｙ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ， ８７， １３１５−１５３０ （２０１３）； Ｋｈｅｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌａｂ Ａｕｔｏｍ． ｐｉｉ： ２２１１０６８２１４５６６９３９ （２３ Ｊａｎ ２０１５）； Ｂａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２３９（９）， １１８０−１１９１ （２０１４）を参照のこと。

【0004】

Ｃａｖｎａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌａｂ Ａｕｔｏｍ １９（２）， ２０８−２１４ （２０１４）は、デバイスの構築および３Ｄ構築物を形成する方法の開発については記載しているが、３Ｄ構築物の生体成分についての最新技術を進歩させるものではない。Ｇｕｎｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｓｃｉ． １３３（１）， ６７−７８ （２０１３）は、肝細胞および非実質細胞の混合物を使用した肝臓オルガノイドの構築は困難であり、細胞株を使用することでこれが回避されると記載している。Ｋｉｍ ａｎｄ Ｒａｊａｇｏｐａｌａｎ， ＰＬｏＳＯｎｅ ５（１１）， ｅ１５４５６ （２０１０）は、肝細胞および内皮細胞が組み合わされた３Ｄ肝臓培養物について記載している。Ｍｅｓｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ ８７， ２０９−２１３ （２０１３）は、３Ｄ肝臓スフェロイドを構築するためのハンギングドロップ法の使用について記載しているが、肝細胞、クッパー細胞、および内皮（未開示の型）細胞の未開示の混合物を使用していた。

【発明の概要】

【0005】

一部の実施形態によれば、人工肝臓構築物を作製するのに有用な細胞組成物は、（ａ）肝細胞、（ｂ）クッパー細胞、（ｃ）肝星細胞、（ｄ）類洞内皮細胞、および（ｅ）胆管細胞を組み合わせて含んでいてよい。

【0006】

一部の実施形態で、（ａ）前記肝細胞は個数で７０〜９０パーセントとなる量で含まれていてよく、（ｂ）前記クッパー細胞は個数で５〜２０パーセントとなる量で含まれていてよく、（ｃ）前記肝星細胞は個数で２〜１０パーセントとなる量で含まれていてよく、（ｄ）前記類洞内皮細胞は個数で２〜１０パーセントとなる量で含まれていてよく、（ｅ）前記胆管細胞は個数で１〜４パーセントとなる量で含まれていてよい。一部の実施形態で、前記細胞は哺乳動物細胞であってよい。

【0007】

一部の実施形態によれば、培養組成物は、上記細胞組成物を水性培養培地中に含んでいてよい。一部の実施形態で、前記培養培地は少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質をさらに含んでいてよい。

【0008】

一部の実施形態によれば、人工肝臓構築物は、上記細胞組成物または上記培養組成物を含んでいてよい。一部の実施形態で、前記人工肝臓構築物は直径１００〜３００ミクロンを有していてよい。

【0009】

一部の実施形態によれば、上記人工肝臓構築物を作製する方法は、上記培養組成物を使用して、ハンギングドロップ培養法、重力強制自己組織化法（ｇｒａｖｉｔｙ−ｅｎｆｏｒｃｅｄ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｅｔｈｏｄ）または微細加工成形を使用する方法を実施するステップを含んでいてよい。

【0010】

一部の実施形態によれば、組成物は、（ａ）ヒドロゲル、および（ｂ）前記ヒドロゲル中に、複数の上記人工肝臓構築物を含んでいてよい。

【0011】

一部の実施形態によれば、デバイスは、（ａ）その内部に少なくとも１つのチャンバーを含む基板、および（ｂ）前記チャンバー内の少なくとも１つの上記人工肝臓構築物、または前記チャンバー内の上記組成物を含んでいてよい。

【0012】

一部の実施形態によれば、デバイスを作製する方法は、（ａ）基板を用意するステップと、（ｂ）少なくとも１つの上記構築物または上記組成物を、前記基板に堆積させるステップとを含んでいてよい。一部の実施形態で、前記堆積させるステップは、バイオプリンティング、ピペッティング、マイクロインジェクション、またはマイクロ流体による堆積により実施されてよい。

【0013】

一部の実施形態によれば、薬理学的および／または毒性学的活性について化合物をスクリーニングする方法は、（ａ）上記デバイスを用意するステップと、（ｂ）前記人工肝臓構築物に化合物を投与するステップと、次いで（ｃ）前記人工肝臓構築物の少なくとも１つの細胞からの、前記化合物に対する薬理学的および／または毒性学的応答を検出するステップとを含んでいてよい。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】図１は、本発明の実施形態による２週齢の肝臓構築物についての基本的な免疫組織化学染色結果を示す画像である。

【図2】図２Ａ〜２Ｂは、本発明の実施形態による新たに形成された肝臓構築物を示す電子顕微鏡画像である。

【図3】図３は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ＡＴＰアッセイで示された、本発明の実施形態による肝臓構築物の長期的な生存を示すグラフである。

【図4】図４は、本発明の実施形態による肝臓構築物による、肝臓バイオマーカーである尿素の長期的な産生を示すグラフである。

【図5】図５は、本発明の実施形態による肝臓構築物による、肝臓バイオマーカーであるアルブミンの長期的な産生を示すグラフである。

【図6】図６は、本発明の実施形態による肝臓構築物による、肝臓バイオマーカーであるアルファ−１−アンチトリプシンの長期的な産生を示すグラフである。

【図7】図７は、２Ｄ培養物と比較した、本発明の実施形態による３Ｄ肝臓構築物による、ジアゼパムのテマゼパムへの長期的な代謝を示すグラフである。

【図8】図８は、２Ｄ培養物と比較した、本発明の実施形態による３Ｄ肝臓構築物による、ジアゼパムのノルジアゼパムへの長期的な代謝を示すグラフである。

【図9】図９は、リポ多糖（ＬＰＳ）に対する、本発明の実施形態による肝臓構築物の長期的な炎症応答を示すグラフである。

【図10】図１０ａおよび１０ｂは、本発明の実施形態による肝臓構築物の長期的な安定性および生存を示すグラフであり、図１０ｃは、本発明の実施形態による肝臓構築物のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色結果を示す画像であり、図１０ｄ〜１０ｊは、本発明の実施形態による肝臓構築物の、組織学的および免疫組織化学的染色結果を示す画像である。

【図11】図１１ａ〜１１ｅは、２Ｄ培養物と比較した、本発明の実施形態による３Ｄ肝臓構築物の長期的なベースライン肝機能および代謝を示すグラフである。

【図12】図１２は、ジアゼパムの肝臓構築物での代謝を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本発明はこれより、本発明の例示的な実施形態を示す添付の図面を参照して、以下でより十分に記載される。しかし本発明は、多くの様々な形態で具体化可能であり、本明細書で示す実施形態に限定されるものと解釈されるべきでない。そうではなくこれらの実施形態は、本開示が網羅的かつ完全であり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように提供される。本明細書で引用される全ての米国特許文献の開示は、その全内容にわたって、本明細書に参照により一部をなすものとする。

【0016】

本明細書で使用する用語は特定の実施形態について記載するためだけのものであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、別途文脈で明らかに示されない限り、複数形も含むことを意図するものである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、本明細書で使用する場合、明記される特徴、ステップ、操作、要素、成分および／またはそれらの群もしくは組合せの存在を明示するが、１つまたは複数のその他の特徴、ステップ、操作、要素、成分および／またはそれらの群もしくは組合せの存在または追加を除外するものではないことがさらに理解されるであろう。

【0017】

本明細書で使用する場合、「および／または」という語は、任意のもしくは全ての考えられる組合せ、または関連する列挙項目のうち１つもしくは複数、および代替と解釈される場合（「または」）には組合せの欠如を含む。

【0018】

別途規定されない限り、本明細書で使用する全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。通常使用される辞書で規定されるものなどの用語は、明細書および特許請求の範囲の文脈における意味と一致する意味を有するものと解釈すべきであり、本明細書で明確にそのように規定されない限り、理想的なまたは過度に形式的な意味に解釈すべきでないことがさらに理解されるであろう。簡潔性および／または明瞭性のため、周知の機能または構造は詳細に記載されない可能性がある。

【0019】

本明細書で使用する場合、「細胞」は通常、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、マウス、ウサギ、ラットの細胞などの哺乳動物細胞である。一部の好ましい実施形態では、細胞はヒト細胞である。適切な細胞は既知であり市販されている、かつ／または既知の技術に従って産生可能である。米国特許第６，７３７，２７０号を参照のこと。

【0020】

本明細書で使用する場合、「培地」または「培養培地」は、本発明を実施するのに使用される細胞の増殖、生存、または保存のために提供される水性溶液を指す。培地または培養培地は天然でも人工のものでもよい。培地または培養培地は基本培地を含んでいてよく、培地で培養される細胞の細胞生存、増殖、増加、および／または分化などの望ましい細胞活性を促進するように栄養（例えば、塩、アミノ酸、ビタミン、微量元素、抗酸化剤）が添加されてもよい。本明細書で使用する場合、「基本培地」は、基本塩栄養、または、塩ならびに正常な細胞代謝に必須の一定のバルク無機イオンおよび水を細胞に供給するその他の因子の水溶液を指し、細胞内および／または細胞外浸透圧の平衡を維持する。一部の実施形態では、基本培地は、エネルギー供給源としての少なくとも１種の糖、および／または生理的ｐＨ範囲内に培地を維持するための緩衝系を含んでいてよい。市販の基本培地の例には、これらに限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イーグル基本培地（ＢＭＥ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０、ＭＣＤＢ１３１、クリック培地、マッコイ５Ａ培地、１９９培地、ウィリアム培地Ｅ、グレース培地などの昆虫培地、ハム栄養混合物Ｆ−１０（ハムＦ−１０）、ハムＦ−１２、α−最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴー最小必須培地（Ｇ−ＭＥＭ）およびイスコフ改変ダルベッコ培地が含まれていてよい。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２０１５０１７５９５６号を参照のこと。

【0021】

本明細書で使用する場合、「細胞外マトリックスタンパク質」（または「ＥＣＭ」）は既知であり、その開示が全内容にわたって参照により本明細書の一部をなすＹ．Ｚｈａｎｇらの米国特許出願公開第ＵＳ２０１３０２８８３７５号に記載されるものを含むが、これに限定されない。Ｓｋａｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＥＣＭ ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ３−Ｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３３（１８）： ４５６５−７５ （２０１２）も参照のこと。

【0022】

通常、ヒドロゲル（架橋可能なヒドロゲルを含むがこれに限定されない）などの「バイオインク」での、細胞の「バイオプリンティング」は既知の技術であり、様々な既知の方法および器具のいずれかに従って実施可能である。例えば、米国特許出願公開第ＵＳ２００８０１９４０１０号；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１６／０６４６４８Ａ１号を参照のこと。

【0023】

細胞を培養する「ハンギングドロップ」法およびこれに有用な器具は既知であり、既知の技術に従って実施可能である。例えば、米国特許第７，１１２，２４１号；米国特許出願公開第２００３０２３５５１９Ａ１号；第２０１３００４０８５５Ａ１号；第２０１４０１７９５６１号；および第２０１３００８４６３４Ａ１号；およびＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１２１１７０８３Ａ３号を参照のこと。

【0024】

＜細胞組成物＞
人工肝臓構築物（または「オルガノイド」）を作製するのに有用な組成物は、（ａ）肝細胞、（ｂ）クッパー細胞、（ｃ）肝星細胞、（ｄ）類洞内皮細胞、および（ｅ）胆管細胞を組み合わせて含んでよい。概して、
（ａ）肝細胞は個数で７０〜９０パーセント（最も好ましくは７８パーセント）となる量で含まれ、
（ｂ）クッパー細胞は個数で５〜２０パーセント（最も好ましくは１０パーセント）となる量で含まれ、
（ｃ）肝星細胞は個数で２〜１０パーセント（最も好ましくは５パーセント）となる量で含まれ、
（ｄ）類洞内皮細胞は個数で２〜１０パーセント（最も好ましくは５パーセント）となる量で含まれ、
（ｅ）胆管細胞は個数で１〜４パーセント（最も好ましくは２パーセント）となる量で含まれる。

【0025】

＜培養組成物＞
細胞組成物を器官形成培養培地（例えば水性器官形成培養培地）中で組み合わせて、培養組成物を得ることができる。好ましい実施形態で、培養培地は少なくとも１種の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質（例えば、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチン、またはそれらの組合せ）をさらに含んでいてよい。好ましくは、少なくとも１種のＥＣＭタンパク質は少なくともＩ型コラーゲンを含んでいてよい。ＥＣＭタンパク質は任意の適切な量、通常１ミリリットルあたり１０ナノグラム〜１ミリリットルあたり１ミリグラム（好ましくは１ミリリットルあたり１〜１０マイクログラム）含まれていてよい。一部の実施形態で、器官形成培養培地は１０〜３０重量パーセント（最も好ましくは２０重量パーセント）の血清（例えば熱失活ウシ胎児血清）を含んでいてよい。

【0026】

＜人工肝臓構築物＞
本明細書に記載される細胞組成物を含むかこれより産生されうる人工肝臓構築物は、ハンギングドロップ培養などの任意の適切な技術により産生可能である。一部の実施形態で、人工肝臓構築物は、直径１００または２００〜２５０または３００ミクロンを有していてよい。一部の実施形態で、人工肝臓構築物中の細胞全ての総数は１００または１，０００〜２，０００または１０，０００（好ましくはオルガノイドあたり約１，５００または１，０００細胞）とすることができる。一部の実施形態で、人工肝臓構築物は、（ｉ）肝細胞微絨毛、毛細胆管様構造、および／もしくはリソソームのうち少なくとも１つ、２つ、もしくは３つ全てが存在すること、ならびに／または（ｉｉ）培養物中で維持すると、少なくとも１０、２０、もしくは３０日の期間中に尿素、アルブミン、および／もしくはアルファ１−アンチトリプシンのうち少なくとも１つ、２つ、もしくは３つ全てが発現することを特徴としていてよい。

【0027】

＜人工肝臓構築物を作製する方法＞
一部の実施形態で、人工肝臓構築物は、スフェロイド培養法（すなわち、足場不使用の凝集物培養法）を使用して作製可能である。スフェロイド培養法は共培養に有用である場合があり、細胞が自身を明確な層に組織化することが可能である。具体的には、ハンギングドロップ培養法を使用して、人工肝臓構築物を表す自己組織化した細胞凝集物構造を作製することができる。ハンギングドロップ培養法は、培養組成物を含む液滴を培養基板（例えばハンギングドロッププレート）に堆積させるステップと、次いで培養組成物中で細胞を培養するステップとを含んでいてよい。一部の実施形態では、ハンギングドロップ培養法は、任意選択で、細胞を培養する前に培養基板をひっくり返すステップを含んでいてよい。ハンギングドロップ培養法により、細胞が、基板表面からぶら下がる液滴の底部に凝集物を形成することができる。Ｆｏｔｙ， Ｒａｍｓｅｙ， Ａ Ｓｉｍｐｌｅ Ｈａｎｇｉｎｇ Ｄｒｏｐ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３Ｄ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ： ＪｏＶＥ， ｎｏ． ５１． ｄｏｉ：１０．３７９１／２７２０ （２０１１）。ハンギングドロップ培養法は、液滴中に播種された細胞数に基づき、均一なサイズの組織を産生することができる。例えば、Ｍｅｈｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ ａｎｄ Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｓｐｈｅｒｏｉｄｓ ａｓ Ｍｏｄｅｌｓ ｔｏ Ｔｅｓｔ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃａｃｙ， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １６４ （２）： １９２−２０４ （２０１２）を参照のこと。ＩｎＳｐｈｅｒｏ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎ）および３Ｄ Ｂｉｏｍａｔｒｉｘ（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳＡ）の市販のハンギングドロッププレートを使用して、人工肝臓構築物を生成することができる。ただし、重力強制自己組織化法（例えば、Ｋｅｌｍ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００４， ２２：１９５−２０２を参照のこと）または微細加工成形を使用する方法（例えば、Ｙｅｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＰＬｏｓ Ｏｎｅ ２０１３， ８（９）， ｅ７３３４５を参照のこと）などの、相互作用する基板の非存在下で密接な細胞間接触を促進する任意の方法も使用可能である。

【0028】

一部の実施形態では、人工肝臓構築物を形成するために機能性の添加剤を培養組成物に添加することができる。ラミニン、コラーゲンＩもしくはＩＶ、フィブロネクチン、またはエラスチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）由来の少量のタンパク質を、培養組成物に添加することができる。一部の実施形態では、肝臓細胞外マトリックス（ＥＣＭ）由来のタンパク質を培養組成物に添加することができる。細胞結合タンパク質の好ましい組成および濃度は１〜１０μｇ／ｍＬのコラーゲン（例えばＩ型コラーゲン）である。さらに、一部の実施形態で、培養組成物は１０％超、好ましくは２０％という高い割合の血清（例えば非動化ウシ胎児血清）を有する。

【0029】

＜ヒドロゲル組成物＞
上記人工肝臓構築物またはオルガノイドは、単独で使用してもよいし、さらなる用途のために、架橋可能なヒドロゲルなどのヒドロゲルと組み合わせてもよい。適切なヒドロゲルは既知であり、Ｓｋａｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｂｉｏｉｎｋ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｎａｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ， Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ２５： ２４−３４ （２０１５）に記載されるものを含んでいてよいが、これに限定されない。

【0030】

ヒドロゲルは２つの大きなカテゴリー、天然由来のヒドロゲルと、合成ヒドロゲルとに分かれる。天然由来のヒドロゲルおよび合成ヒドロゲルを混合して、ハイブリッドヒドロゲルを形成してもよい。天然由来のヒドロゲルは、細胞株から収集された天然の細胞外マトリックスタンパク質から作製されるＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）、ならびにコラーゲンおよびアルギン酸を含んでいてよい。天然由来のヒドロゲルは、脱細胞された組織抽出物を使用していてもよい。細胞外マトリックスは、特定の組織から収集してよく、その組織型の細胞を支持するのに使用可能なヒドロゲル物質と組み合わせることができる。例えば、Ｓｋａｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＥＣＭ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ ｆｏｒ ３−Ｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ３３ （１８）：４５６５−７５（２０１２）を参照のこと。キトサンヒドロゲルは、分解可能かつ数種の異なる細胞型を支持する天然由来のヒドロゲルの一例である。例えば、Ｍｏｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｃｈｉｔｏｓａｎ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ Ｐｒｅｐａｒｅｄ ｖｉａ Ｉｏｎｉｃ／Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｃｏ−Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ， Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １２ （９）： ３２７５−８４ （２０１１）を参照のこと。ヒアルロン酸ヒドロゲルも使用可能である。例えば、Ｓｋａｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｈｙｄｒｏｇｅｌ ｂｉｏｉｎｋ ｔｏｏｌｋｉｔ ｆｏｒ ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ ｎａｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｎ ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ， Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ２５： ２４−３４ （２０１５）を参照のこと。

【0031】

合成ヒドロゲルは、多くの技術を使用して様々な物質（例えば、ポリ−（エチレングリコール））から産生可能である。天然由来のヒドロゲルとは対照的に、合成ヒドロゲルは均一に産生することができ、容易に再現可能かつ特性を明らかにすることができる。しかし合成ヒドロゲルは、天然の細胞外マトリックスに見られる活性部位のような、細胞に対するいくつかの機能性シグナルを欠いていることがあり、それにより合成ヒドロゲルの、細胞を支持する潜在能力が制限される。例えば、Ｍａｈｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｉｓｓｕｅ ｉｎ Ｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ， Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２７ （１０）： ２２６５−７４ （２００６）を参照のこと。ハイブリッドヒドロゲルは折衷案となる可能性があり、これにより特定の微小環境を再構築する能力をよりよく制御することが可能となりうる。細胞外マトリックス分子（例えば細胞外マトリックスタンパク質）などの天然成分を、規定の合成ヒドロゲルと組み合わせることで、より容易に再現可能かつ機能性のヒドロゲルが産生可能である。例えば、Ｓａｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｐｈｏｔｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈｉｎ Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）−Ａｒｇｉｎｉｎｅ−Ｇｌｙｃｉｎｅ−Ａｓｐａｒｔｉｃ Ａｃｉｄ−Ｓｅｒｉｎｅ Ｔｈｉｏｌ−Ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ Ｍｉｘｅｄ−Ｍｏｄｅ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １３ （５）： １０２５−３４ （２００７）を参照のこと。

【0032】

＜人工肝臓構築物のバイオプリンティング＞
一部の実施形態では、上記人工肝臓構築物は、バイオプリンティング技術を使用することによりヒドロゲル（例えば生体適合性ヒドロゲル）と組み合わせることができる。一部の実施形態では、ヒドロゲルは押出し可能なヒドロゲル組成物（または「バイオインク」）とすることができる。ヒドロゲル組成物は、架橋可能なプレポリマーおよび堆積後架橋基を含んでいてよい。架橋可能なプレポリマーには、アクリレートベースの架橋剤（例えばポリエチレン（グリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ））が含まれていてよく、堆積後架橋基には、アルキンベースの架橋剤（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）アルキン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８アームアルキン）が含まれていてよい。ヒドロゲル組成物には、チオール化ヒアルロン酸（ＨＡ）、チオール化ゼラチン、および未改変ＨＡ、ゼラチンおよび／または細胞外マトリックス（ＥＣＭ）物質（例えば肝臓ＥＣＭ物質）も含まれていてよい。

【0033】

ヒドロゲル組成物は、チオール−アクリレート結合により調製され、自発的に架橋して、柔軟で押出し可能な物質を生じることができる。バイオプリンティングは、押出し可能なヒドロゲル組成物を堆積させることで実施可能である。一部の実施形態では、ヒドロゲル組成物は堆積の前に、室温および大気圧で硬さ０．０５、０．１または０．５〜１、５または１０キロパスカル（ｋＰａ）、またはそれを超えた数値を有していてよい。バイオプリントされた構造を、ヒドロゲル組成物の硬さを増大させるのに十分な量で、架橋可能なプレポリマーを堆積後架橋基と架橋させることにより目標の硬さにすることができる。一部の実施形態では、架橋させるステップは、ヒドロゲル組成物の硬さを、室温および大気圧で１または５から１０、２０または５０キロパスカル（ｋＰａ）、またはそれを超えて増大させることができる。架橋させるステップは、例えば、ヒドロゲル組成物を加熱すること、ヒドロゲル組成物に光（例えば、環境光、ＵＶ光）を照射すること、および／またはヒドロゲル組成物のｐＨを変化させることにより実施可能である。

【0034】

＜デバイス＞
本発明の人工肝臓構築物またはオルガノイドによるインビトロでの化合物スクリーニングに有用なデバイスは通常、（ａ）その内部に形成された少なくとも１つのチャンバー（チャンバーは、好ましくは、その内部に形成された入口および出口開口部を含む）を有する基板またはデバイス本体（例えばマイクロ流体デバイス）を用意するステップと、（ｂ）チャンバー内に、少なくとも１つの上記構築物を（単独で、またはヒドロゲルと組み合わせた組成物として）堆積させるステップとにより産生される。堆積させるステップは、バイオプリンティング、ピペッティング、マイクロインジェクション、マイクロ流体による堆積などの任意の適切な技術により実施可能である。デバイスは、「プラグイン」、すなわちポンプ、培養培地貯留容器、検出器などを含むより大きな器具に挿入するためのカートリッジの形態で提供可能である。

【0035】

デバイス本体またはマイクロ流体デバイスは、それ自体が任意の適切な物質または物質の組合せから形成されうる。これらに限定されないが、例には、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリアクリルアミド、官能化されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えばＰＥＧジアクリレート、ＰＥＧジアクリルアミド、ＰＥＧジメタクリレートなど、またはマルチアーム形態の上記ＰＥＧのいずれかなど）を含むＰＥＧ、架橋または硬化しうる天然のポリマーまたはタンパク質（例えば、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、アルギン酸など）、および架橋を支持するための化学基で官能化されたこれらの誘導体、ならびにこれらの組合せが含まれる。デバイス本体は、成形、キャスティング、付加製造（３Ｄプリンティング）、リソグラフィーなど、およびこれらの組合せを含む任意の適切な方法により形成可能である。

【0036】

＜デバイスの保存および運送＞
一旦産生されると、カートリッジ形態の上記デバイスは速やかに使用されるか、保存および／または輸送用に調製されることができる。

【0037】

製品を保存および輸送するため、室温（例えば２５℃）では流動性の液体であるが冷蔵温度（例えば４℃）ではゲル化または凝固する、水と混合されたゼラチンなどの一時的な保護支持培地をデバイスに添加して、チャンバー、および好ましくは任意の関連する導管も実質的にまたは完全に満たすことができる。任意の入口および出口を、適切な被覆部品（例えば栓）または被覆物質（例えばワックス）で被覆することができる。次いでデバイスを冷却要素（例えば、氷、ドライアイス、熱電冷却装置など）とともに梱包してよく、全てを（好ましくは断熱された）パッケージ中に配置することができる。

【0038】

一部の実施形態では、製品を保存および輸送するため、冷却温度（例えば４℃）では流動性の液体であるが室温（例えば２０℃）または体温（例えば３７℃）などの暖かい温度ではゲル化または凝固する、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）およびポリ（エチレングリコール）のブロックコポリマーなどの一時的な保護支持培地をデバイスに添加して、チャンバー、および好ましくは任意の関連する導管も実質的にまたは完全に満たすことができる。

【0039】

受け取ったら、エンドユーザーは関連するパッケージおよび冷却要素からデバイスを取り出すだけでよく、（一時的な保護支持培地の選択に応じて）温度を上昇または下降させることができ、任意の口の被覆を外すことができ、シリンジで（例えば、増殖培地で洗い流すことにより）一時的な保護支持培地を除去することができる。

【0040】

＜デバイスの使用方法＞
薬理学的および／または毒性学的活性についての１種の化合物（または複数の化合物）のインビトロスクリーニング（ハイスループットスクリーニングを含む）に上記デバイスを使用することができる。このようなスクリーニングは、（ａ）上記デバイスを用意するステップと、（ｂ）人工肝臓構築物に化合物を（例えば、構築物を含むチャンバーを通って流動する増殖培地に添加することにより）投与するステップと、次いで（ｃ）構築物の少なくとも１つの細胞からの、化合物に対する薬理学的および／または毒性学的応答を検出するステップとにより実施可能である。応答の検出は、検出される具体的な１種の応答または一連の応答に応じて、顕微鏡、組織学、イムノアッセイなど、およびこれらの組合せを含む任意の適切な技術により実施可能である。このような１種の応答または複数の応答は、細胞死（老化およびアポトーシスを含む）、細胞増殖（例えば、良性および転移性細胞増殖）、化合物の吸収、分布、代謝、もしくは排泄（ＡＤＭＥ）、または生理応答（例えば、少なくとも１つの細胞による化合物産生のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション）、または薬理学的および／もしくは毒性学的活性に関連するその他の任意の生物学的応答とすることができる。

【0041】

本発明は、以下の非限定的な実施例でより詳細に説明される。

【実施例】

【0042】

［Ａ．材料］
＜細胞供給源＞
肝細胞／胆管細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ （６ Ｄａｖｉｓ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｒｉａｎｇｌｅ Ｐａｒｋ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ ＵＳＡ ２７７０９）より製品番号ＨＵＣＰ１６として入手した。クッパー細胞は、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ （８１ Ｗｙｍａｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｗａｌｔｈａｍ， Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｓ ＵＳＡ ０２４５１）より製品番号ＨＵＫＣＣＳとして入手した。肝星細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ （６０７６ Ｃｏｒｔｅ Ｄｅｌ Ｃｅｄｒｏ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ ９２０１１）より製品番号ＨＨＳｔｅＣ／３８３０として入手した。肝臓類洞内皮細胞は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌより製品番号ＨＨＳＥＣ／５０００として入手した。

【0043】

＜器官形成培地＞
２０％熱非動化ウシ胎児血清および１０μｇ／ｍｌラット尾Ｉ型コラーゲンを含む肝細胞培養完全培地（Ｌｏｎｚａ）。培地は以下の通りに調製される。Ｌｏｎｚａ肝細胞基本培養培地（製品ＣＣ３１９７）５００ｍｌに、ｓｉｎｇｌｅ−ｑｕｏｔ添加因子（製品＃ＣＣ４１８２）アスコルビン酸、ウシ血清アルブミン（脂肪酸不含）、ヒト上皮増殖因子、トランスフェリン、インスリンおよびゲンタマイシンを製造業者が指定する量で添加する。炎症応答を増強するため、ヒドロコルチゾン添加因子は入れないでおく。この培地に、２０％熱非動化ｐｒｅｍｉｕｍ ｓｅｌｅｃｔウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ製品＃Ｓ１１５５０Ｈ）および１０μｇ／ｍｌ滅菌ラット尾Ｉ型コラーゲン（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製品＃Ａ１０４８３０１）を添加する。

【0044】

＜３Ｄ構築物維持培地＞
この培地は、ウシ胎児血清およびラット尾コラーゲンを含まない以外は上記と同様に調製された肝細胞培養完全培地からなる。

【0045】

［Ｂ．方法］
肝臓器官構築物は、肝細胞、クッパー細胞、肝星細胞、胆管細胞、および類洞内皮細胞の混合物から生成される。肝細胞の混合物は以前から使用されているが、混合物の本組成物はより長期間作用し、より性能が高い。細胞の数および器官構造の寸法も、インビボでの構造および機能をよりよく表す。具体的には、使用される細胞総数の範囲は１００〜１０，０００、最適なものは約１，０００または１，５００である。細胞混合物の１つの好ましい組成は、肝細胞、クッパー細胞、肝星細胞、類洞内皮細胞、および胆管細胞がそれぞれ個数で７８％：１０％：５％：５％：２％である。

【0046】

マイクロ肝臓構造を表す自己組織化した細胞凝集物構造を生成するため、ハンギングドロップ法が使用されてきた。本開示の重要な部分は、肝臓の細胞凝集物の形成を可能にする技術的方法である。多くの細胞株および腫瘍細胞とは異なり、本明細書で開示される細胞混合物は、培養培地で混合してハンギングドロップ中に分配させただけでは凝集物構造を容易に形成しない。本開示は、３Ｄ構造を形成させるための、細胞の本混合物用の条件および機能性の添加剤を含む。ラミニン、コラーゲンＩもしくはＩＶ、フィブロネクチン、またはエラスチンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）由来の少量のタンパク質が、細胞混合物に添加される。細胞結合タンパク質の好ましい組成および濃度は１〜１０μｇ／ｍＬのコラーゲン（例えばＩ型コラーゲン）である。さらに、細胞混合物は１０％超、好ましくは２０％という高い割合の血清、好ましくは非動化ウシ胎児血清を有する。

【0047】

培養物中で約３日後、細胞混合物は直径約２００〜２５０ミクロンの３Ｄ構築物に変形する。一旦形成されると、３Ｄ肝臓構築物は、血清の有無に関わらず従来の肝細胞維持培地で持続可能となる。３Ｄ肝臓構築物は、著しく長い期間の生存、ならびにＣＹＰ活性、炎症応答、および肝臓特異的なバイオマーカー産生などの高度に関連する生理的機能などの機能を示した。アルブミン、尿素、およびアルファ−１アンチトリプシンの産生は、３Ｄ構築物の安定かつ長期的な培養を示す（以下を参照のこと）。例としてのシトクロム４５０アイソザイム３Ａ４および２Ｃ１９の活性は、４週間を超える持続した活性を示している。さらに、肝臓器官構築物は、以下に示すように、リポ多糖（ＬＰＳ）などの炎症刺激に応答することができる。

【0048】

一旦形成されると、構築物は生体適合性ヒドロゲルに組み込まれ、そこで３Ｄ肝臓構築物が懸濁される。ヒドロゲル組成物は肝臓構築物の３Ｄ構造を維持するため開発された。従来のＥＣＭ由来または合成ヒドロゲルでは、肝臓構築物の構造を維持し、生物活性を持続させることができない。Ｓｋａｒｄａｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｂｉｏｍａｔｅｒ． ２５， ２４−３４ （２０１５）に記載される、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）およびポリエチレン−アルキンの２つの成分を使用して、ヤング率４０〜１００Ｐａを有するヒドロゲルを生成した。３Ｄ肝臓構築物がヒドロゲル中に懸濁可能であるため、バイオプリンティングが可能となる。バイオプリンティングにより、アッセイデバイスおよび器具内での、器官構築物の空間配置を制御することができる。

【0049】

［Ｃ．結果］
２週齢の肝臓構築物についての基本的な免疫組織化学染色結果を図１に示す。新たに形成された肝臓構築物の電子顕微鏡画像を図２Ａ〜２Ｂに示す。肝臓構築物の長期的な生存が、図３のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ ＡＴＰアッセイで示される。

【0050】

図４は、人工肝臓構築物による、肝臓バイオマーカーである尿素の長期的な産生を示す。図５は、人工肝臓構築物による、肝臓バイオマーカーであるアルブミンの長期的な産生を示す。図６は、人工肝臓構築物による、肝臓バイオマーカーであるアルファ−１−アンチトリプシンの長期的な産生を示す。

【0051】

図７は、２Ｄ培養物と比較した、３Ｄ肝臓構築物によるジアゼパムのテマゼパムへの長期的な代謝を示す。図８は、２Ｄ培養物と比較した、３Ｄ肝臓構築物によるジアゼパムのノルジアゼパムへの長期的な代謝を示す。

【0052】

図９は、リポ多糖（ＬＰＳ）に対する肝臓構築物の長期的な炎症応答を示す。

【0053】

図１０ａおよび１０ｂは、本発明の実施形態による肝臓構築物の長期的な安定性および生存を示し、図１０ｃは、本発明の実施形態による肝臓構築物のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色結果を示し、図１０ｄ〜１０ｊは、本発明の実施形態による肝臓構築物の、組織学的および免疫組織化学的染色結果を示す。図１０ａ：平均オルガノイド直径は２８日間を通して一定のままである。図１０ｂ：ＡＴＰａｓｅの発光測定値で決定したところ、肝臓オルガノイドは２８日間を通して代謝的に活性なままである。図１０ｃ：ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色（１４日目に示したもの）により、オルガノイド中での高い細胞生存が示される。緑色−カルセインＡＭで染色された生存細胞；赤色−エチジウムホモダイマー−１で染色された死滅細胞；直径２６１μｍ。図１０ｄ〜１０ｊ：組織学的および免疫組織化学的染色により、オルガノイド構造および構成が示される。図１０ｄ。ＨおよびＥ染色により、オルガノイド形態全体が示される。初代ヒト肝細胞はアルブミン発現により特定され（図１０ｅ）、細胞膜の周囲に、Ｅ−カドヘリン発現により示される上皮の構成を示し（図１０ｆ）、コネキシン３２（図１０ｇ）およびシトクロムＰ４５０還元酵素（図１０ｈ）も発現する。肝星細胞およびクッパー細胞はそれぞれＧＦＡＰ（図１０ｉ）、およびＣＤ６８（図１０ｊ）により特定される。紫色−ヘマトキシリンで染色された核；桃色−細胞質；茶色−示した色素；スケールバー−１００μｍ。

【0054】

図１１ａ〜１１ｅは、２Ｄ培養物と比較した、本発明の実施形態による３Ｄ肝臓構築物の長期的なベースライン肝機能および代謝を示す。ＥＬＩＳＡおよび比色分析アッセイで分析した、正規化された、培地への尿素（図１１ａ）およびアルブミン（図１１ｂ）の分泌は、２Ｄ肝細胞サンドイッチ培養物と比較して、３Ｄオルガノイド型で劇的に増加した機能的出力を示す。主にＣＹＰ２Ｃ１９およびＣＹＰ３Ａ４による、ジアゼパム代謝物であるテマゼパム（図１１ｃ）、ノルジアゼパム（図１１ｄ）、およびオキサゼパム（図１１ｅ）の定量化。統計的有意性：各時点での３Ｄおよび２Ｄの比較で、＊はｐ０．０５未満。

【0055】

図１２は、シトクロムｐ４５０アイソフォームによる、ジアゼパムの、テマゼパム、ノルジアゼパム、およびオキサゼパムへの肝臓構築物での代謝を示す。

【0056】

上記は本発明を例示するものであり、これを限定するものととらえるべきではない。本発明は以下の特許請求の範囲で規定され、特許請求の範囲の同等物がそこに含まれるものとする。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】