特許 6874062 三次元組織培養のためのデバイス及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6874062

(24)【登録日】2021年4月23日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】三次元組織培養のためのデバイス及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20210510BHJP

   C12M 1/42 20060101ALI20210510BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12M3/00 A

   C12M1/42

   C12M1/34 A

【請求項の数】94

【外国語出願】

【全頁数】162

(21)【出願番号】特願2019-117620(P2019-117620)

(22)【出願日】2019年6月25日

(62)【分割の表示】特願2016-550898(P2016-550898)の分割

【原出願日】2014年10月30日

(65)【公開番号】特開2019-176874(P2019-176874A)

(43)【公開日】2019年10月17日

【審査請求日】2019年7月25日

(31)【優先権主張番号】61/897,276

(32)【優先日】2013年10月30日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516131500

【氏名又は名称】ミリカ・ラディシック

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ジェイソン・ミクラス

(72)【発明者】

【氏名】ミリカ・ラディシック

(72)【発明者】

【氏名】ニマラン・サヴァンディラン

(72)【発明者】

【氏名】サラ・ヴァスコンセロス

(72)【発明者】

【氏名】ユン・シャオ

(72)【発明者】

【氏名】ボヤン・ジャン

(72)【発明者】

【氏名】イム・ジャオ

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１３／０５６０１９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１２／１７０４９０（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０００−５１１０９１（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２００５−５２３４１７（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Nature Methods，２０１３年 ８月，Vol.10, No.8，pp.781-787

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｍ １／００− ３／１０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

バイオリアクター中で成熟心組織を製造するための方法であって、
前記バイオリアクターが、
そこに播種された細胞から組織を成長させるために構成されたウェルを有するデバイスであって、前記ウェルが底部を有するデバイス；及び
測定エレメントとウェルの底部との間に隙間があるように、ウェルを横断して配置されており、(a)その間に形成された組織を接着させ、それによりウェルの底部上に組織を吊り下げるようにする、ならびに(b)測定エレメント上に組織により発揮される収縮力に応答して変形し、それにより組織に対する天然の生理学的環境をシミュレートする、および／または収縮力の測定を可能とするように構成された、少なくとも２つの弾性測定エレメント
を含み、
(i)ウェル中に複数の心筋細胞を播種する工程；
(ii)複数の心筋細胞に、1Hzの電気刺激を導入する工程；及び
(iii)6Hzまで、徐々に毎日電気刺激を増大させる工程
を含む方法。

【請求項2】

バイオリアクターがウェルあたり2個から25個の測定エレメントを含む、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

バイオリアクターがマルチウェルプレートである、請求項1に記載の方法。

【請求項4】

マルチウェルプレートが、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、又は1536ウェルを含む、請求項3に記載の方法。

【請求項5】

測定エレメントが、合成ポリマー及び生物学的ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含み、ポリマーが生分解性又は非分解性ポリマーである、請求項1に記載の方法。

【請求項6】

ポリマーが、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシアルカン酸、キトサン、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(L-ラクチド)(PLA)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(セバシン酸グリセロール)、ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート)(POMaC)、クエン酸を含まないPOMaC、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリウレタン、絹、ナノファブリケーション材料、コポリマー、混合ポリマー、又はその任意の組合せである、請求項5に記載の方法。

【請求項7】

ポリマーがPOMaCである、請求項6に記載の方法。

【請求項8】

測定エレメントが、ナノ構造でドーピングされているポリマーを含む、請求項1に記載の方法。

【請求項9】

測定エレメントが、腸管材料、モノクリル、ポリグリコリド、プロレン、ポリグラクチン、ポリジオキサノン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項1に記載の方法。

【請求項10】

測定エレメントが、重合反応の間その機械的特性を調整可能であるポリマーを含む、請求項1に記載の方法。

【請求項11】

測定エレメントが多孔性であり、それにより栄養素及び成長因子の心組織への送達を可能とする、請求項1に記載の方法。

【請求項12】

測定エレメントが約20kPa〜0.5MPaの弾性を有する、請求項1に記載の方法。

【請求項13】

測定エレメントがポリマーワイヤである、請求項1に記載の方法。

【請求項14】

ウェルが長手方向軸を有するよう構成されている、請求項1に記載の方法。

【請求項15】

測定エレメントが、ウェルの長手方向に対して垂直な配向、平行な配向、又は対角の配向を有する、請求項14に記載の方法。

【請求項16】

バイオリアクターが、バイオリアクターのウェルを通る電流を生じるように構成された電極を更に含む、請求項1に記載の方法。

【請求項17】

複数の心筋細胞が、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、アガロース、メチルセルロース、又はヒアルロナンを含むヒドロゲル中に播種される、請求項1に記載の方法。

【請求項18】

電気刺激を1日当たり0.83Hzの速度で増大させる、請求項1に記載の方法。

【請求項19】

電気刺激を7日間導入する、請求項1に記載の方法。

【請求項20】

バイオリアクター中で、試験薬剤の発癌性を検出するための方法であって、
前記バイオリアクターが、
そこに播種された細胞から組織を成長させるために構成されたウェルを有するデバイスであって、前記ウェルが底部を有するデバイス；及び
測定エレメントとウェルの底部との間に隙間があるように、ウェルを横断して配置されており、(a)その間に形成された組織を接着させ、それによりウェルの底部上に組織を吊り下げるようにする、ならびに(b)測定エレメント上に組織により発揮される収縮力に応答して変形し、それにより組織に対する天然の生理学的環境をシミュレートする、および／または収縮力の測定を可能とするように構成された、少なくとも２つの弾性測定エレメント
を含み、
(i)組織を試験薬剤と接触させる工程；及び
(ii)形質転換した表現型について組織中の細胞をスクリーニングする工程であって、形質転換した表現型の存在が試験薬剤の発癌性を示す工程
を含む方法。

【請求項21】

工程(ii)が遺伝子発現又はタンパク質レベルの変化を検出することを含む、請求項20に記載の方法。

【請求項22】

工程(ii)が、増殖及び細胞表面マーカーの発現の変化をもたらす異常な細胞サイクルを検出することを含む、請求項20に記載の方法。

【請求項23】

バイオリアクターがウェルあたり2個から25個の測定エレメントを含む、請求項20に記載の方法。

【請求項24】

バイオリアクターがマルチウェルプレートである、請求項20に記載の方法。

【請求項25】

マルチウェルプレートが、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、又は1536ウェルを含む、請求項24に記載の方法。

【請求項26】

測定エレメントが、合成ポリマー及び生物学的ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含み、ポリマーが生分解性又は非分解性ポリマーである、請求項20に記載の方法。

【請求項27】

ポリマーが、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシアルカン酸、キトサン、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(L-ラクチド)(PLA)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(セバシン酸グリセロール)、ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート)(POMaC)、クエン酸を含まないPOMaC、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリウレタン、絹、ナノファブリケーション材料、コポリマー、混合ポリマー、又はその任意の組合せである、請求項26に記載の方法。

【請求項28】

ポリマーがPOMaCである、請求項27に記載の方法。

【請求項29】

測定エレメントが、ナノ構造でドーピングされているポリマーを含む、請求項20に記載の方法。

【請求項30】

測定エレメントが、腸管材料、モノクリル、ポリグリコリド、プロレン、ポリグラクチン、ポリジオキサノン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項20に記載の方法。

【請求項31】

測定エレメントが、重合反応の間その機械的特性を調整可能であるポリマーを含む、請求項20に記載の方法。

【請求項32】

測定エレメントが多孔性であり、それにより栄養素及び成長因子の心組織への送達を可能とする、請求項20に記載の方法。

【請求項33】

測定エレメントが約20kPa〜0.5MPaの弾性を有する、請求項20に記載の方法。

【請求項34】

測定エレメントがポリマーワイヤである、請求項20に記載の方法。

【請求項35】

ウェルが長手方向軸を有するよう構成されている、請求項20に記載の方法。

【請求項36】

測定エレメントが、ウェルの長手方向に対して垂直な配向、平行な配向、又は対角の配向を有する、請求項35に記載の方法。

【請求項37】

バイオリアクターが、バイオリアクターのウェルを通る電流を生じるように構成された電極を更に含む、請求項20に記載の方法。

【請求項38】

細胞が、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、アガロース、メチルセルロース、又はヒアルロナンを含むヒドロゲル中に播種される、請求項20に記載の方法。

【請求項39】

組織が心組織である、請求項20に記載の方法。

【請求項40】

(i)そこに播種された細胞から損傷組織を成長させるために構成されたウェルを有するデバイスであって、前記ウェルが底部を有するデバイス；及び
測定エレメントとウェルの底部との間に隙間があるように、ウェルを横断して配置されており、(a)その間に形成された損傷組織を接着させ、それによりウェルの底部上に損傷組織を吊り下げるようにする、ならびに(b)測定エレメント上に損傷組織により発揮される収縮力に応答して変形し、それにより損傷組織に対する天然の生理学的環境をシミュレートする、および／または収縮力の測定を可能とするように構成された、少なくとも２つの弾性測定エレメント
を含むバイオリアクター；ならびに
(ii)バイオリアクター中で生育した損傷組織
を含む疾患モデル。

【請求項41】

損傷組織が、細胞損傷を引き起こしうる薬剤と健康な組織を接触させることにより誘導される、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項42】

細胞が、既存の条件を有するドナーから回収される、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項43】

バイオリアクターがウェルあたり2個から25個の測定エレメントを含む、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項44】

バイオリアクターがマルチウェルプレートである、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項45】

マルチウェルプレートが、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、又は1536ウェルを含む、請求項44に記載の疾患モデル。

【請求項46】

測定エレメントが、合成ポリマー及び生物学的ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含み、ポリマーが生分解性又は非分解性ポリマーである、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項47】

ポリマーが、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシアルカン酸、キトサン、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(L-ラクチド)(PLA)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(セバシン酸グリセロール)、ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート)(POMaC)、クエン酸を含まないPOMaC、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリウレタン、絹、ナノファブリケーション材料、コポリマー、混合ポリマー、又はその任意の組合せである、請求項46に記載の疾患モデル。

【請求項48】

ポリマーがPOMaCである、請求項47に記載の疾患モデル。

【請求項49】

測定エレメントが、ナノ構造でドーピングされているポリマーを含む、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項50】

測定エレメントが、腸管材料、モノクリル、ポリグリコリド、プロレン、ポリグラクチン、ポリジオキサノン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項51】

測定エレメントが、重合反応の間その機械的特性を調整可能であるポリマーを含む、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項52】

測定エレメントが多孔性であり、それにより栄養素及び成長因子の心組織への送達を可能とする、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項53】

測定エレメントが約20kPa〜0.5MPaの弾性を有する、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項54】

測定エレメントがポリマーワイヤである、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項55】

ウェルが長手方向軸を有するよう構成されている、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項56】

測定エレメントが、ウェルの長手方向に対して垂直な配向、平行な配向、又は対角の配向を有する、請求項55に記載の疾患モデル。

【請求項57】

バイオリアクターが、バイオリアクターのウェルを通る電流を生じるように構成された電極を更に含む、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項58】

細胞が、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、アガロース、メチルセルロース、又はヒアルロナンを含むヒドロゲル中に播種される、請求項40に記載の疾患モデル。

【請求項59】

疾患モデルを成長させるための方法であって、
(i)バイオリアクター中に、既存の条件を有するドナーから回収した複数の損傷細胞を播種する工程であって、前記バイオリアクターが、
そこに播種された複数の損傷細胞から損傷組織を成長させるために構成されたウェルを有するデバイスであって、前記ウェルが底部を有するデバイス；及び
測定エレメントとウェルの底部との間に隙間があるように、ウェルを横断して配置されており、(a)その間に形成された損傷組織を接着させ、それによりウェルの底部上に損傷組織を吊り下げるようにする、ならびに(b)測定エレメント上に損傷組織により発揮される収縮力に応答して変形し、それにより損傷組織に対する天然の生理学的環境をシミュレートする、および／または収縮力の測定を可能とするように構成された、少なくとも２つの弾性測定エレメント
を含む工程；ならびに
(ii)複数の損傷細胞を培養して、損傷組織を形成する工程
を含む方法。

【請求項60】

バイオリアクターがウェルあたり2個から25個の測定エレメントを含む、請求項59に記載の方法。

【請求項61】

バイオリアクターがマルチウェルプレートである、請求項59に記載の方法。

【請求項62】

マルチウェルプレートが、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、又は1536ウェルを含む、請求項61に記載の方法。

【請求項63】

測定エレメントが、合成ポリマー及び生物学的ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含み、ポリマーが生分解性又は非分解性ポリマーである、請求項59に記載の方法。

【請求項64】

ポリマーが、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシアルカン酸、キトサン、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(L-ラクチド)(PLA)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(セバシン酸グリセロール)、ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート)(POMaC)、クエン酸を含まないPOMaC、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリウレタン、絹、ナノファブリケーション材料、コポリマー、混合ポリマー、又はその任意の組合せである、請求項63に記載の方法。

【請求項65】

ポリマーがPOMaCである、請求項64に記載の方法。

【請求項66】

測定エレメントが、ナノ構造でドーピングされているポリマーを含む、請求項59に記載の方法。

【請求項67】

測定エレメントが、腸管材料、モノクリル、ポリグリコリド、プロレン、ポリグラクチン、ポリジオキサノン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項59に記載の方法。

【請求項68】

測定エレメントが、重合反応の間その機械的特性を調整可能であるポリマーを含む、請求項59に記載の方法。

【請求項69】

測定エレメントが多孔性であり、それにより栄養素及び成長因子の心組織への送達を可能とする、請求項59に記載の方法。

【請求項70】

測定エレメントが約20kPa〜0.5MPaの弾性を有する、請求項59に記載の方法。

【請求項71】

測定エレメントがポリマーワイヤである、請求項59に記載の方法。

【請求項72】

ウェルが長手方向軸を有するよう構成されている、請求項59に記載の方法。

【請求項73】

測定エレメントが、ウェルの長手方向に対して垂直な配向、平行な配向、又は対角の配向を有する、請求項72に記載の方法。

【請求項74】

バイオリアクターが、バイオリアクターのウェルを通る電流を生じるように構成された電極を更に含む、請求項59に記載の方法。

【請求項75】

複数の損傷細胞が、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、アガロース、メチルセルロース、又はヒアルロナンを含むヒドロゲル中に播種される、請求項59に記載の方法。

【請求項76】

疾患モデルを成長させるための方法であって、
(i)バイオリアクター中に、複数の健康な細胞を播種する工程であって、前記バイオリアクターが、
そこに播種された複数の健康な細胞から健康な組織を成長させるために構成されたウェルを有するデバイスであって、前記ウェルが底部を有するデバイス；及び
測定エレメントとウェルの底部との間に隙間があるように、ウェルを横断して配置されており、(a)その間に形成された健康な組織を接着させ、それによりウェルの底部上に健康な組織を吊り下げるようにする、ならびに(b)測定エレメント上に健康な組織により発揮される収縮力に応答して変形し、それにより健康な組織に対する天然の生理学的環境をシミュレートする、および／または収縮力の測定を可能とするように構成された、少なくとも２つの弾性測定エレメント
を含む工程；
(ii)複数の健康な細胞を培養して、健康な組織を形成する工程；ならびに
(iii)細胞損傷を引き起こしうる薬剤と健康な組織を接触させる、又は組換え技術により健康な組織に疾患状態を誘導する工程
を含む方法。

【請求項77】

前記薬剤が、毒素、突然変異原、放射線、感染性因子、又は化学薬品である、請求項76に記載の方法。

【請求項78】

前記組換え技術が、細胞中に導入遺伝子を挿入すること、又は目的遺伝子の遺伝子発現をノックアウトすることを含む、請求項76に記載の方法。

【請求項79】

バイオリアクターがウェルあたり2個から25個の測定エレメントを含む、請求項76に記載の方法。

【請求項80】

バイオリアクターがマルチウェルプレートである、請求項76に記載の方法。

【請求項81】

マルチウェルプレートが、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、又は1536ウェルを含む、請求項80に記載の方法。

【請求項82】

測定エレメントが、合成ポリマー及び生物学的ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含み、ポリマーが生分解性又は非分解性ポリマーである、請求項76に記載の方法。

【請求項83】

ポリマーが、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、ポリ(カプロラクトン)、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシアルカン酸、キトサン、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(L-ラクチド)(PLA)、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリ(セバシン酸グリセロール)、ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート)(POMaC)、クエン酸を含まないPOMaC、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリウレタン、絹、ナノファブリケーション材料、コポリマー、混合ポリマー、又はその任意の組合せである、請求項82に記載の方法。

【請求項84】

ポリマーがPOMaCである、請求項83に記載の方法。

【請求項85】

測定エレメントが、ナノ構造でドーピングされているポリマーを含む、請求項76に記載の方法。

【請求項86】

測定エレメントが、腸管材料、モノクリル、ポリグリコリド、プロレン、ポリグラクチン、ポリジオキサノン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル又はそれらの組み合わせの少なくとも１つを含む、請求項76に記載の方法。

【請求項87】

測定エレメントが、重合反応の間その機械的特性を調整可能であるポリマーを含む、請求項76に記載の方法。

【請求項88】

測定エレメントが多孔性であり、それにより栄養素及び成長因子の心組織への送達を可能とする、請求項76に記載の方法。

【請求項89】

測定エレメントが約20kPa〜0.5MPaの弾性を有する、請求項76に記載の方法。

【請求項90】

測定エレメントがポリマーワイヤである、請求項76に記載の方法。

【請求項91】

ウェルが長手方向軸を有するよう構成されている、請求項76に記載の方法。

【請求項92】

測定エレメントが、ウェルの長手方向に対して垂直な配向、平行な配向、又は対角の配向を有する、請求項91に記載の方法。

【請求項93】

バイオリアクターが、バイオリアクターのウェルを通る電流を生じるように構成された電極を更に含む、請求項76に記載の方法。

【請求項94】

複数の健康な細胞が、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、アガロース、メチルセルロース、又はヒアルロナンを含むヒドロゲル中に播種される、請求項76に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれている、2013年10月30日に出願の米国仮特許出願第61/897,276号の優先権を主張するものである。

【0002】

本開示は、それだけに限定されないが天然の組織の天然の生理、組織構築、血管構造、及び他の特性等の天然の条件及び構造を正確に模倣する三次元の生体組織並びに組織足場を作製及び使用するための方法、組成物、及びデバイスに関する。合成又は工学的に作製した組織には、それだけに限定されないが、心臓、肝臓、神経、血管、腎臓、及び筋肉組織が含まれ得る。方法、組成物、及びデバイスは、薬物試験、組織修復、組織置換、処置、再生医療、又はその組合せを含む様々な適用において使用し得る。

【背景技術】

【0003】

組織工学とは、生物学的な構造及び/又は機能を改善、置換、又は模倣するために、細胞、操作工学、材料、及び方法、並びに適切な生化学的(例えば成長因子)及び物理化学的因子(例えば化学的に改変された細胞外マトリクス)の組合せを使用することである。組織工学は、組織機能又は臓器全体を回復、維持、又は改善させる生物学的代替品の開発に向けて操作工学及び生命科学の原理を適用する学際的な分野として広く認められている。工学的に作製した組織系は、再生医療の領域において損傷組織又は患部組織(例えば心筋梗塞)を回復及び/又は修復させる顕著な潜在性を有するだけでなく、薬理学的薬剤に関連する薬物動態及び薬力学的な応答を予測及び/又は試験するために、より正確かつ生理的に関連性のあるモデル系を利用可能にするものとして、創薬及び薬物開発における使用も提案されている。

【0004】

組織工学が直面する主な課題のうちの1つは、天然の組織の構造、生理、及び機能をより良好に模倣する、より複雑かつ生理的に関連性のある、工学的に作製した組織の必要性である。このことは、治療剤をスクリーニング、試験、及び/又は評価するために工学的に作製した組織の使用を試みる際に特に重要かつ困難である。

【0005】

創薬及び薬物開発は、実験細胞及び動物モデルにおける薬理学的効果の実証から始まり、患者における薬物の安全性及び有効性の研究に終わる、根気を要する試験プロセスからなる。5,000個のスクリーニングした化合物のうち、1個のみが安全かつ有効な新規医薬としてFDAの認可を受けると推定されている。化合物の約25%が前臨床の毒物学的研究において排除される。したがって、前臨床開発における有意な数の薬物候補が、試験系における許容できないレベルの毒性が原因でこの段階から進み出ることができない。

【0006】

典型的には、薬物候補を評価する際には複数の薬理学的パラメータが考慮される。ヒト(及び毒性学の評価に使用される動物)における薬物及びその代謝物の吸収、分布、代謝、及び排泄(ADME)プロフィールの知識は、集団内の個体間における効果の相違を理解するため、及び投薬の態様を最適化するために重要である。吸収及び生体利用度は、全身循環又は局所的作用部位に分布する生物活性材料の量の標準の測度である。薬物作用の持続期間は、多くの場合、薬物代謝酵素による化学修飾に関与する代謝、又は結合及び身体内の生物活性部位から離れる輸送に関与する排泄のいずれかによって、身体がどれだけ迅速に活性分子を排出するかに依存する。したがって、典型的な前臨床研究は、上皮膜(例えば胃腸粘膜)を渡る浸透のモニタリング、薬物代謝の研究、血漿タンパク質の結合の同定、並びに組織、特に、腎臓及び肝臓等の薬物製品を排出する臓器の内外への輸送の評価を含む。

【0007】

現在の前臨床の毒性及び薬理学の研究は、典型的には、培養細胞又は細胞内小器官に関与するin vitroアッセイ、並びにin vivo動物モデルを利用して、薬物の代謝、毒性、及び潜在的な有効性を調査する。細胞学的、分子学的、及び生化学的アッセイの技術進歩は顕著な発展を見せているが、いくつかの顕著な問題が依然として存在する。最初に、精製又は組換え酵素及び細胞培養物を使用したin vitroアッセイは、動物モデルにおいてそれ以降に使用する薬理学的及び毒性学的パラメータを決定するための最初の工程を提供するが、これらは多くの場合、天然のヒト組織又は系における薬物代謝中に起こる無数の事象を考慮するには単純化されすぎている。第2に、動物モデルにおいて得られたデータはヒト系へ外挿することが困難な場合がある。第3に、HIV感染症又はアルツハイマー病等の慢性疾患を処置するために使用されている多くの薬物は、長期間にわたって、また一部の事例では個体の一生にわたって施用される投薬レジメンを必要とする。現在、長期の患者使用中に慢性毒性の発生が最も実際的に観察されている。

【0008】

薬物候補の高い不成功率及び高コスト、並びにそのような不成功に関連する他の妨げを考慮すると、薬物に関連する毒性、有効性、並びに全体的な薬力学及び/又は薬物動態特性を含めた、薬物がどのようにヒト対象と相互作用し得るかの様々な側面を信頼性をもって理解かつ予測することができる、より有効な前臨床モデル及びアッセイ系の大きな必要性が存在する。対象に対する薬理学的薬剤の相互作用及び効果を有効に、信頼性をもって、かつ正確に評価するために使用することができる、心臓、神経、血管、腎臓、及び筋肉組織等の天然の組織の天然の生理、構築、及び他の特性を正確に模倣する三次元の生体組織を提供する解決策は、組織工学であり得る。しかし、薬効を評価するために信頼性をもって使用し得る適切な工学的に作製した組織系の開発において多くの顕著な複雑さを考慮すると、現在、薬物試験及び開発における工学的に作製した組織の使用は有用性及び価値が限られている。

【0009】

このことは、工学的に作製した心血管組織モデルを用いた薬物スクリーニングにおいて特にそうである。心血管病は、典型的に高い罹患率及び死亡率に関連しているため、薬理学的治療の重要な標的である。In vitroで工学的に作製したモデルは、改善された系の制御及びより高いスループットのため、動物モデルの対費用効果の高い代替物として役割を果たし得る。近年では、組織工学的方法が顕著に進歩して、天然の心筋の複雑さ及び電気機械的機能をより良好に再現する機能的な三次元(3D)の心組織がin vitroで作製されている。しかし、現在の系は天然の心組織の構築の複雑さを厳密に再現しきれておらず、したがって、実際の天然の心組織の生理的側面との関連性が不十分である。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0010】

【特許文献1】米国特許第8,715,436号

【特許文献2】米国特許第8,609,013号

【特許文献3】米国特許第8,445,324号

【特許文献4】米国特許第8,236,480号

【特許文献5】米国特許第8,003,300号

【特許文献6】米国特許第6,245,566号

【特許文献7】米国特許第5,843,780号

【特許文献8】米国特許第6,200,802号

【特許文献9】米国特許第5,486,359号

【特許文献10】米国特許第5,849,553号

【特許文献11】米国特許第5,061,620号

【特許文献12】WO 01/11011

【特許文献13】米国特許第6,488,872号

【特許文献14】米国特許第6,027,935号

【非特許文献】

【0011】

【非特許文献1】Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版、1994年)

【非特許文献2】The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker編、1988年)

【非特許文献3】The Glossary of Genetics、第5版、R. Riegerら(編)、Springer Verlag (1991年)

【非特許文献4】Hale及びMarham、the Harper Collins Dictionary of Biology (1991年)

【非特許文献5】Sambrookら(2000年、Molecular Cloning--A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratories)

【非特許文献6】Ausubelら(1994年、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク)

【非特許文献7】S. Van Vlierbergheら、「Biopolymer-Based Hydrogels As Scaffolds for Tissue Engineering Applications: A Review」、Biomacromolecules、2011年、12(5)、1387〜1408頁

【非特許文献8】Introduction to Microfabrication (2004年)、S. Franssila. ISBN 0-470-85106-6

【非特許文献9】Tranら、「Synthesis and characterization of a biodegradable elastomer featuring a dual crosslinking mechanism」、Soft Matter、2010年1月1日; 6(11): 2449〜2461頁

【非特許文献10】Rossoら、「Smart materials as scaffolds for tissue engineering」、J Cell Physiol.、2006年12月;209(3):1054頁

【非特許文献11】Dhandayuthapaniら、「Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science、第2011巻(2011年)、1〜19頁

【非特許文献12】Xuら、Nat. Biotechnol.、19、971頁、(2001年)

【非特許文献13】Evansら(1981年)、Nature、292:154〜156頁

【非特許文献14】Matsuiら(1991年)、Nature、353:750〜2頁

【非特許文献15】Thomsonら(1995年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、92:7844〜8頁

【非特許文献16】Thomsonら(1998年)、Science、282:1145〜1147頁

【非特許文献17】Shamblottら(1998年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95:13726〜31頁

【非特許文献18】Teebkenら、Eur J. Vasa Endovasc. Surg.、19、381頁、(2000年)

【非特許文献19】Ranucciら、Biomaterials、21、783頁、(2000年)

【非特許文献20】Burgら、J. Biomed. Mater. Res、51、642頁、(2000年)

【非特許文献21】Jaeger、Introduction to Microelectronic Fabrication (Addison-Wesley Publishing Co.、マサチューセッツ州Reading、1988年)

【非特許文献22】Runyanら、Semiconductor Integrated Circuit Processing Tehnology (Addison-Wesley Publishing Co.、マサチューセッツ州Reading、1990年)

【非特許文献23】Proceedings of the IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference 1987〜1998年

【非特許文献24】Rai-Choudhury編、Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication (SPIE Optical Engineering Press、ワシントン州Bellingham、1997年)

【非特許文献25】Whitesidesら、Angew chem. Int編、37; 550〜575頁、(1998年)

【非特許文献26】Beebeら、Nature; 404:588〜59頁(2000年)

【非特許文献27】Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization;第2版; CRC Press: Boca Raton、1997年

【非特許文献28】Becker, H.、及びLocascio, L. E. 「Polymer microfluidic devices.」Talanta、56(2):267〜287頁、2002年

【非特許文献29】Quake, S. R.、及びScherer, A. 「From micro- to nanofabrication with soft materials.」Science、290(5496):1536〜1540頁、2000年

【非特許文献30】Whitesides, G. M.、及びStroock, A. D. 「Flexible methods for microfluidics.」Physics Today、54(6):42〜48頁、2001年

【非特許文献31】Chatwin, C.、Farsari, M.、Huang, S. P.、Heywood, M.、Birch, P.、Young, R.、及びRichardson, J. 「UV microstereolithography system that uses spatial light modulator technology.」Applied Optics、37(32):7514〜7522頁、1998年

【非特許文献32】Cumpston, B. H.、Ananthavel, S. P.、Barlow, S.、Dyer, D. L.、Ehrlich, J. E.、Erskine, L. L.、Heikal, A. A.、Kuebler, S. M.、Lee, I. Y. S.、McCord-Maughon, D.、Qin, J. Q.、Rockel, H.、Rumi, M.、Wu, X. L.、Marder, S. R.、及びPerry, J. W. 「Two-photon polymerization initiators for three-dimensional optical data storage and microfabrication.」Nature、398(6722):51〜54頁、1999年

【非特許文献33】Neckers, D. C.、Hassoon, S.、及びKlimtchuk, E. 「Photochemistry and photophysics of hydroxyfluorones and xanthenes.」Journal of Photochemistry and Photobiology A--Chemistry、95(1):33〜39頁、1996年

【非特許文献34】Becker, H.、及びHeim, U. 「Hot embossing as a method for the fabrication of polymer high aspect ratio structures.」Sensors and Actuators A--Physical、83(1-3):130〜135頁、2000年

【非特許文献35】Anderson, J. R.、Chiu, D. T.、Jackman, R. J.、Cherniavskaya, O.、McDonald, J. C.、Wu, H. K.、Whitesides, S. H.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of topologically complex three-demensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping.」Analytical Chemistry、72(14):3158〜3164頁、2000年

【非特許文献36】Duffy, D. C.、McDonald, J. C.、Schueller, O. J. A.、及びWhitesides, G. M. 「Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).」Analytical Chemistry、70(23):4974〜4984頁、1998年

【非特許文献37】Love, J. C.、Anderson, J. R.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of three-dimensional microfluidic systems by soft lithography.」MRS Bulletin、26(7):523〜528頁、2001年

【非特許文献38】Wu, H. K.、Odom, T. W.、Chiu, D. T.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of complex three-dimensional microchannel systems in PDMS.」Journal of the American Chemical Society、125(2):554〜559頁、2003年

【非特許文献39】Xia, Y. N.、及びWhitesides, G. M. 「Soft lithography.」Annual Review of Materials Science、28:153〜184頁、1998年

【非特許文献40】Hanemann, T.、Ruprecht, R.、及びHausselt, J. H. 「Micromolding and photopolymerization.」Advanced Materials、9(11):927〜929頁、1997年

【非特許文献41】Khoury, C.、Mensing, G. A.、及びBeebe, D. J. 「Ultra rapid prototyping of microfluidic systems using liquid phase photopolymerization.」Lab On a Chip、2(1):50〜55頁、2002年

【非特許文献42】Beebe, D. J.、Moore, J. S.、Yu, Q.、Liu, R. H.、Kraft, M. L.、Jo, B. H.、及びDevadoss, C. 「Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.」Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、97(25):13488〜13493頁、2000年

【非特許文献43】Beebe, D. J.、Moore, J. S.、Bauer, J. M.、Yu, Q.、Liu, R. H.、Devadoss, C.、及びJo, B. H. 「Functional hydrogel structures for autonomous flow control inside microfluidic channels.」Nature、404(6778):588〜590頁、2000年

【非特許文献44】De, S. K.、Aluru, N. R.、Johnson, B.、Crone, W. C.、Beebe, D. J.、及びMoore, J. 「Equilibrium swelling and kinetics of pH-responsive hydrogels: Models, experiments, and simulations.」Journal of Microelectromechanical Systems、11(5):544〜555頁、2002年

【非特許文献45】Hasselbrink, E. F.、Shepodd, T. J.、及びRehm, J. E. 「High-pressure microfluidic control in lab-on-a-chip devices using mobile polymer monoliths.」Analytical Chemistry、74(19):4913〜4918頁、2002年

【非特許文献46】Kirby, B. J.、Shepodd, T. J.、及びHasselbrink, E. F. 「Voltage-addressable on/off microvalves for high-pressure microchip separations.」Journal of Chromatography A、979(1-2):147〜154頁、2002年

【非特許文献47】Peters, E. C.、Svec, F.、Frechet, J. M. J.、Viklund, C.、及びIrgum, K. 「Control of porous properties and surface chemistry in "molded" porous polymer monoliths prepared by polymerization in the presence of TEMPO.」Macromolecules、32(19):6377〜6379頁、1999年

【非特許文献48】Tripp, J. A.、Svec, F.、及びFrechet, J. M. J. 「Grafted macroporous polymer monolithic disks: A new format of scavengers for solution-phase combinatorial chemistry.」Journal of Combinatorial Chemistry、3(2):216〜223頁、2001年

【非特許文献49】Yang, H.、Deschatelets, P.、Brittain, S. T.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of high performance ceramic microstructures from a polymeric precursor using soft lithography.」Advanced Materials、13(1):54〜58頁、2001年

【非特許文献50】Liew, L. A.、Zhang, W. G.、Bright, V. M.、An, L. N.、Dunn, M. L.、及びRaj, R. 「Fabrication of SiCN ceramic MEMS using injectable polymer-precursor technique.」Sensors and Actuators A--Physical、89(1-2):64〜70頁、2001年

【非特許文献51】Liew, L. A.、Liu, Y. P.、Luo, R. L.、Cross, T.、An, L. N.、Bright, V. M.、Dunn, M. L.、Daily, J. W.、及びRaj, R. 「Fabrication of SiCN MEMS by photopolymerization of pre-ceramic polymer?」Sensors and Actuators A--Physical、95(2-3):120〜134頁、2002年

【非特許文献52】Liew, L. A.、Saravanan, R. A.、Bright, V. M.、Dunn, M. L.、Daily, J. W.、及びRaj, R. 「Processing and characterization of silicon carbon-nitride ceramics: application of electrical properties towards MEMS thermal actuators.」Sensors and Actuators A--Physical、103(1-2):171〜181頁、2003年

【非特許文献53】Seok, W. K.、及びSneddon, L. G. 「Synthesis and ceramic conversion reactions of decaborane-CERASET polymers: New processable precursors to SiC/Si3N4/BN ceramics.」Bulletin of the Korean Chemical Society、19(12):1398〜1402頁、1998年

【非特許文献54】Sambrook、Fritsch及びManiatis、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年

【非特許文献55】Lewin, B.、Genes V、Oxford University Press、ニューヨーク、1994年、968〜997頁

【非特許文献56】Capecchi, M.、(1989年)、Science、244:1288〜1292頁

【非特許文献57】Capecchi, M.、(1989年)、Trends Genet.、5 (3):70〜76頁

【非特許文献58】Thompson、McInnes及びWillard、Genetics in Medicine、第5版、W.B. Saunders Company、1991年

【非特許文献59】Mutchnick, M. G.ら、Antiviral Research (1994年)、24:245〜257頁

【非特許文献60】Coates, J. A. V.ら、Exp. Opin. Ther. Patents、(1995年)、5 (8): 747〜756頁

【非特許文献61】Gish, R. G.ら、Exp. Opin. Invest. Drugs、(1995年)、4 (2):95〜115頁

【非特許文献62】Coates, J. A. V.ら、Exp. Opin. Ther. Patents、(1995年)、5 (8):747〜765頁

【非特許文献63】Walker, M. L.及びRosenbaum, D. S.、(2003年)、Cardiovasc. Res. 57: 599〜614頁

【非特許文献64】Gold, M. R.、及びSpencer, W. (2003年)、Curr. Opin. Cardiol. 18: 1〜5頁

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0012】

改善された工学的に作製した組織モデル系は、薬物の安全性及び有効性に関する有意義な前臨床情報を得るためのより良好な機会を提供するであろう。そのような系は、根気を要する薬剤開発及び発見のプロセスを改善するであろう。そのような必要性が当分野において存在する。本開示は、数ある適用の中でとりわけ、薬物試験、組織修復、移植、疾患の処置、再生医療、又はその組合せで使用するための、例えば心臓、神経、血管、及び筋肉組織等の天然の組織の天然の生理、構築、及び他の特性を正確に模倣する三次元の生体組織を作製するための方法、組成物、及びデバイスを提供することによって、これらの当分野で認識されている問題に対する様々な解決策を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0013】

本開示は、数ある適用の中でとりわけ、薬物試験、組織修復、移植、疾患の処置、再生医療、又はその組合せで使用するための、天然の組織の天然の生理、構築、及び他の特性を正確に模倣する生体組織、好ましくは三次元組織を作製及び使用するための方法、組成物、及びデバイスを提供する。

【0014】

一態様では、本開示は、工学的に作製した組織構築物、好ましくは三次元組織構築物を培養、成長、及び/又は試験するための、様々な組織培養物又は組織工学的バイオリアクター系を提供する。

【0015】

別の態様では、本開示は、本発明の様々な組織培養系から成長させた又は調製した、工学的に作製した組織構築物、例えば三次元組織構築物に関する。

【0016】

更に別の態様では、本開示は、本明細書に記載の組織培養系及びその中で成長させた組織構築物のどちらにも関する。

【0017】

更に別の態様では、本開示は、それだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む様々な適用において本発明の三次元組織構築物、デバイス、及び/又は系を使用する方法に関する。

【0018】

様々な他の態様では、本開示は、組織、特定の実施形態では三次元組織を培養するためのデバイス及び方法を提供する。

【0019】

さらなる態様では、本開示は、本発明のデバイス及び系を製作するための方法も提供する。

【0020】

様々な形態では、本開示の様々な組織系は、心組織、肝組織、腎組織、軟骨組織、皮膚、骨髄組織、又はそのような組織の組合せから構成される。特定の実施形態では、三次元組織系は心組織を含む。他の特定の実施形態では、組織系は腎組織から構成される。特定の実施形態では、本明細書に記載の系において形成された組織は三次元組織である。

【0021】

第1の態様では、本開示は、ウェル又はチャネルを有するバイオリアクターと、ウェル又はチャネルを横断して支えられている又は吊り下げられている長手足場、縫合糸、又は他の細胞成長エレメントとを含むバイオリアクター系に関する。ウェル又はチャネルは、その中に播種された細胞、並びに増殖培地及び/又は栄養素及び/又は因子を受け入れるように構成されている。細胞は、播種された後に培養されて、組織培養物を形成し、好ましくは特定の実施形態では、長手足場、縫合糸、又は他の細胞成長エレメント上、その周囲、その上方に含有される、及び/又はそれと一体化している三次元組織鎖を形成する。

【0022】

第2の態様では、本開示は、組織培養物、例えば三次元組織鎖を成長させるためのバイオリアクター系に関する。バイオリアクター系には、細胞を播種するのに適したウェル又はチャネルと、1つ又は複数の管腔を有し、ウェル又はチャネルの上方に、例えばウェル又はチャネルの長手方向軸に沿って支えられている又は吊り下げられている、灌流可能な足場とが含まれる。細胞がウェル又はチャネル内に、細胞の培養に適した任意選択の適切な増殖培地、成長因子、及び他の栄養素と共に播種された後、細胞は成長して、灌流可能な足場を取り囲む及び/又はそれと一体化した組織鎖を形成する。使用において、栄養素及び成長因子並びに試験薬剤(例えば、薬物、タンパク質、毒素等)は、そのような物質を送達するための手段と一体化している灌流可能な管腔(例えば、チューブ又は血管を介して管腔に接続しているリザーバーエレメント)を介して組織鎖に送達し得る。更に、様々な実施形態では、バイオリアクター系には、灌流可能な管腔から出る通路、例えば、排出物及び他の代謝産物が組織鎖から灌流可能な管腔内へと拡散されて端末リザーバーを通って出ることを可能にする、排出管又は他の端末リザーバーも含まれ得る。心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する様々な実施形態では、バイオリアクターは、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、灌流可能な管腔エレメントの全長に沿って形成される組織鎖の長手方向軸に平行又は垂直な方向である。

【0023】

第3の態様では、本発明は、収縮力を測定するのに適した組織培養物、例えば三次元組織鎖を成長させるためのバイオリアクター系に関する。本発明のこの態様は、ウェル又はチャネルを有するバイオリアクターと、ウェル又はチャンバー内に配置されており、その間に形成された三次元組織鎖のための少なくとも2つの固着点を形成するように機能する、少なくとも一組の対向する足場エレメント(単一の足場又は別々の足場から形成することができる)とを含むことができる。好ましくは、少なくとも一組の対向する足場エレメントは、ウェル又はチャネルの壁に可逆的に取り付けられているが、ウェル又はチャンバーの底部とエレメントとの間に隙間があるように、その上方に吊り下げられている。第3の態様のバイオリアクターは、2つのそのようなエレメントを有することに限定されず、2つより多く、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、若しくは10個、又はそれより多くのそのようなエレメントが含まれ得る。組織鎖が対向する足場エレメントの組又は複数の組の間に配置され、チャネル又はウェルの上方に吊り下げられているように、対向するエレメントのそれぞれの周りに形成されて、その間で結合される、三次元組織鎖を形成する能力が存在する限りは、1つのチャネルあたり任意の数のエレメントを提供し得る。

【0024】

足場エレメントは、好ましくは偏向可能、変形可能、屈曲可能等であり、これらは、足場エレメント上の組織鎖によって発揮された収縮力の測定を可能にするように更に構成されている。

【0025】

第3の態様の好ましい実施形態では、ウェル又はチャネルのそれぞれは、一組(2つ)の対向する足場エレメントを用いて構成されており、好ましくは、単一の足場エレメントは、ウェル又はチャネルの長手方向軸の対向する末端に、又はその付近に配置されている。

【0026】

第3の態様の特定の実施形態では、足場エレメントは、ウェル又はチャネルの底部表面から離れるように持ち上げられている。

【0027】

第4の態様では、本発明は、1つ又は複数の管腔通路(例えば血管新生した三次元組織構造を模倣するもの)がその中に一体化された、三次元の分枝状組織足場又はマトリックスを含む三次元組織を成長させるためのバイオリアクター系に関する。三次元の足場又はマトリックスは、播種した細胞を成長させるための第1の部分又は領域と、第1の部分を通る又はそれと一体化している相互接続したチャネルを提供するための第2の部分又は領域とを含有し得る。好ましくは、相互接続したチャネルは、第1の部分に関して灌流可能であり、生体血管構造を模倣するように構成されていてもよい。第1の部分は1つ又は複数のオープン領域又はチャンバーを含有して、それにより細胞及び/又は組織を成長させるためのチャンバーのオープンネットワークを提供することができる。また、三次元の足場又はマトリックスは、全ての構成要素の間に細孔又はオープン接続を含有していてもよい。例えば、オープン細孔又は接続は、細胞を成長させるためのチャンバーのオープンネットワークの間に位置することができる。更に、オープン細孔又は接続は、1つ又は複数の管腔通路と共に配置する又はそれと一体化させることができる。オープン細孔又は接続は、バイオリアクター系を通る細胞、培地、成長因子、栄養素、及び排出物の動きを容易にする。バイオリアクターは、バイオリアクター系を横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、足場又はマトリックスに概して垂直又は平行な方向である。

【0028】

第5の態様では、本開示は、収縮力を測定するのに適した組織培養物、例えば三次元の灌流可能な組織鎖を成長させるためのバイオリアクター系に関する。バイオリアクター系には、細胞を播種するのに適したウェル又はチャネルと、1つ又は複数の管腔を有し、ウェル又はチャネルの上方に、例えばウェル又はチャネルの長手方向軸に沿って支えられている又は吊り下げられている、灌流可能な足場とが含まれる。更に、灌流可能な足場は、灌流可能な足場の長手方向軸に沿ってウェル又はチャンバー内に配置されており、その間に形成された三次元組織鎖のための少なくとも2つの固着点を形成するように機能し、かつ組織鎖の収縮状態に応答して変形又は屈曲することができる、一組以上の対向する足場エレメント(単一の足場又は別々の足場から形成することができる)を用いて構成されている。第5の態様のバイオリアクターは、2つのそのような変形可能なエレメントを有することに限定されず、2つより多く、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、若しくは10個、又はそれより多くのそのようなエレメントが含まれ得る。組織鎖が対向する足場エレメントの組又は複数の組の間に配置され、チャネル又はウェルの上方に吊り下げられているように、対向するエレメントのそれぞれの周り及び灌流可能なエレメントの長手方向の全長に沿って形成されて、その間で結合される、三次元組織鎖を形成する能力が存在する限りは、1つのチャネルあたり任意の数のエレメントを提供し得る。

【0029】

足場エレメントは、好ましくは偏向可能、変形可能、屈曲可能等であり、これらは、足場エレメント上の組織鎖によって発揮された収縮力の測定を可能にするように更に構成されている。

【0030】

第5の態様の好ましい実施形態では、ウェル又はチャネルのそれぞれは、一組(2つ)の対向する足場エレメントを用いて構成されており、好ましくは、単一の足場エレメントは、所定のウェル又はチャネルの長手方向軸の対向する末端に、又はその付近に配置されている。

【0031】

細胞が所定のウェル又はチャネル内に、細胞の培養に適した適切な増殖培地、成長因子、及び他の栄養素と共に播種された後、細胞は成長して、灌流可能な足場及び屈曲可能なエレメントを取り囲む及び/又はそれと一体化した組織鎖を形成する。使用において、栄養素及び成長因子並びに試験薬剤(例えば、薬物、タンパク質、毒素等)は、そのような物質を送達するための手段と一体化している灌流可能な管腔(例えば、チューブ又は血管を介して管腔に接続しているリザーバーエレメント)を介して組織鎖に送達し得る。更に、様々な実施形態では、バイオリアクター系には、灌流可能な管腔から出る通路、例えば、排出物及び他の代謝産物が組織鎖から灌流可能な管腔内へと拡散されて端末リザーバーを通って出ることを可能にする、排出管又は他の端末リザーバーも含まれ得る。心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する様々な実施形態では、バイオリアクターは、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、灌流可能な管腔エレメントの全長に沿って形成される組織鎖の長手方向軸に平行な方向である。

【0032】

5つの特定の態様を上述し、本明細書に更に記載されているが、本発明はこれらの態様及びその実施形態に限定されない。本開示は、これらの態様及び実施形態、並びにその組合せの任意の他の適切な変形を企図する。

【0033】

企図される実施形態のうちの任意のものにおいて、本明細書に記載のバイオリアクターによって成長させる三次元組織は、心組織、肝組織、腎組織、軟骨組織、皮膚、骨髄組織、又はそのような組織の組合せ等からの細胞等の、任意の単一の細胞種から形成することができる。三次元組織を成長させるために使用する細胞は、任意の市販の供給源を含めてどこでも供給源とすることができ、又は個々の対象若しくは患者を供給源とすることさえもできる。例えば、本発明の組織鎖は、市販の肝細胞系の種から開始して成長させ得る。別の例では、本発明の組織鎖は、対象から直接得た細胞の種、例えば生検から単離した細胞から開始して成長させ得る。他の実施形態では、本発明の三次元組織は、異なる細胞の混合物から成長させることができる。そのような細胞の混合物には、同じ若しくは異なる組織からの健康な細胞若しくは疾患細胞の混合物、異なる供給源若しくは患者からの細胞の混合物、又は患者及び市販の供給源の両方からの細胞の混合物を含めることができる。また、本発明の組織を成長させるために使用する細胞は、薬物耐性又は薬物感受性の工学的に作製した細胞系等の、遺伝子操作した細胞であることもできる。

【0034】

他の実施形態では、本発明の三次元組織を成長させるために使用する細胞は、胚性幹細胞(「ESC」)、胎児幹細胞(「FSC」)、及び成体(又は体性)幹細胞(「SSC」)を含めた幹細胞であり得る。幹細胞は、分化能の潜在性に関して、全能性(別名万能性)(胚細胞及び胚以外の細胞種へと分化することができる幹細胞)、多能性幹細胞(ほぼ全ての細胞へと分化することができる)、多分化能幹細胞(いくつかの細胞種へと分化することができる)、少能性幹細胞(数種の細胞種へのみ分化することができる)、又は単能性細胞(1つの細胞種のみ生じることができる)であり得る。幹細胞は商業的に得るか、又は患者から直接、若しくは任意の他の適切な供給源から得る/単離することができる。

【0035】

更に他の実施形態では、オピオイド鎮痛剤、抗ヒスタミン剤及び非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)等の抗炎症薬、炭酸脱水酵素阻害剤、ループ利尿剤、強力利尿剤、チアジド及びチアジド様薬剤、並びにカリウム保持性利尿剤等の利尿剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤等の腎臓系及び心血管系に作用する薬剤、有機硝酸塩等の心臓病の薬、カルシウムチャネル遮断剤、交感神経遮断剤、血管拡張剤、ベータ-アドレナリン作動性受容体作用剤及び拮抗剤、アルファ-アドレナリン作動性受容体作用剤及び拮抗剤、強心配糖体、抗不整脈薬、3-ヒドロキシメチルグルタリル-補酵素A(HMG-CoA)阻害剤等の高リポタンパク質血症に影響を与える薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物、抗生物質、及び他の薬物等の抗新生物剤、免疫調節物質、抗糖尿病剤、並びに抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、及び抗蠕虫剤等の抗微生物剤を含めた、任意の適切な実験的薬物又は薬理学的試験薬剤を、発明の三次元の系によって試験し得る。

【0036】

本発明の実施形態のうちの任意のものにおいて、足場、マトリックス、又は他の屈曲可能なエレメントは、例えば、ポリ(ジメチルシロキサン(PDMS))、ポリ(メチルメタクリレート(PMMA))、ポリスチレン、ポリスチレンを含めた、任意の適切な材料から作製し得る。足場は生分解性材料から作製し得る。他の適切な材料には、数ある中でとりわけ、ポリ(セバシン酸グリセロール)、クエン酸を含まないPOMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン及びそのコポリマー、絹、微細構造、ナノファブリケーション材料、並びに/又はナノロッド若しくは量子ドット等のナノ構造でドーピングされている材料が含まれ得る。任意選択で、特定の実施形態では、足場材料は、は、水並びにタンパク質、薬物、栄養素、及び代謝老廃物を含めた分子の交換及び/又は通過を可能にするために灌流可能であり得る。特定の他の実施形態では、灌流性は、足場材料中に細孔を形成することによって実装し得る。更に他の実施形態では、足場は、微細製作、ソフトリソグラフィー加工(それだけに限定されないが、ステップアンドフラッシュインプリントリソグラフィー(SFIL)、3D印刷(すなわち付加製造)、熱エンボス加工、押し出し成形、射出成形、移相エッジリソグラフィー、及びナノスカイビングが含まれる)を含めた任意の適切な手段によって製作し得る。

【0037】

特定の態様では、本発明は、組織鎖を培養するためのバイオリアクターであって、それぞれが、その中で三次元組織鎖を成長させるのに適した長手チャンバーを含む複数のウェルと、それぞれの長手チャンバーに実質的に垂直な配向で取り付けられた一対の直線状かつ柔軟な足場とを含むバイオリアクターに関する。

【0038】

別の態様では、本発明は、組織鎖の収縮力を測定するためのマルチウェルバイオリアクターであって、平面上にパターンで配置された複数の密封されたウェルを有するデバイスと、それぞれがその中に播種された細胞から組織鎖を成長させるのに適した複数の成長チャンバーであって、それぞれの密封されたウェルが単一の成長チャンバーで構成されている成長チャンバーと、成長チャンバー内で形成された後に組織鎖によって被包されるように構成されている、それぞれの成長チャンバーに柔軟に接続された複数の直線状の足場とを含むバイオリアクターを提供する。

【0039】

更に別の態様では、本発明は、組織鎖を培養するためのデバイスであって、組織培養のために種細胞を受けるための長手バイオリアクターチャネルと、バイオリアクターチャネルの全長の上方に吊り下げられるように支持された長手足場とを含み、足場が、種細胞が足場の全長に沿って組織構造を形成するための支持体を提供するデバイスに関する。

【0040】

更に別の態様では、本発明は、組織鎖を培養するためのデバイスであって、組織培養のために種細胞を受けるための長手バイオリアクターチャネルと、バイオリアクターチャネルの全長の上方に吊り下げられるように支持された長手足場と含み、足場が、種細胞が全長に沿って組織構造を形成するための支持体を提供し、また、管腔を有し、管腔を介した組織構造の灌流を可能にするデバイスに関する。

【0041】

更に別の態様では、本発明は、分枝状の組織を培養するためのデバイスであって、組織培養のために種細胞を受けるためのバイオリアクターチャンバーと、バイオリアクターチャンバーに受け入れられている足場であって、支柱及び灌流チャネルの三次元ネットワークを含み、種細胞が三次元ネットワークの周囲に組織構造を形成するための支持体を提供する足場とを含むデバイスを提供する。

【0042】

特定の実施形態では、バイオリアクターはマルチウェルプレートである。

【0043】

特定の実施形態では、バイオリアクターは、12個のウェル、96個のウェル、384個のウェル、又は1536個のウェルを有するマルチウェルプレートである。

【0044】

特定の実施形態では、バイオリアクターはポリマーから構成される。

【0045】

特定の実施形態では、ポリマーは生分解性ポリマーである。生分解性ポリマーは、ポリ乳酸、ポリ(乳酸-co-グリコール酸)、若しくはポリ(カプロラクトン)、ポリグリコリド、ポリラクチド、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシアルカン酸、キトサン、ヒアルロン酸、ヒドロゲル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(L-ラクチド)(PLA)、又はその任意の組合せである、ことができる。ポリマーは、ポリ(ジメチルシロキサン(PDMS))、ポリ(メチルメタクリレート(PMMA))、ポリスチレン、ポリ(セバシン酸グリセロール)、クエン酸を含まないPOMac、ポリ(ε-カプロラクトン)、ポリウレタン、絹、又はナノファブリケーション材料、又は重縮合反応によって作製されるポリマー、又はそのコポリマー若しくは混合ポリマーであり得る。ポリマーは、ナノ構造でドーピングすることができる。

【0046】

様々な実施形態では、足場は金属、絹、又はポリマーから構成される。特定の実施形態では、足場は、腸管材料、モノクリル、ポリグリコリド、プロレン、ポリグラクチン、ポリジオキサノン、ポリプロピレン、ナイロン、又はポリエステルから構成される。

【0047】

特定の実施形態では、長手チャンバーは、細胞によって播種されるように構成されている。

【0048】

様々な実施形態では、細胞は、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、収縮細胞、血液細胞、免疫系細胞、生殖細胞、神経細胞、上皮細胞、ホルモン分泌細胞、骨髄細胞、又は幹細胞であり得る。

【0049】

様々な実施形態では、それぞれの長手チャンバーに取り付けられている足場は、長手チャンバーの配向に対して実質的に垂直な配向、実質的に平行な配向、又は実質的に対角の配向にある。足場は、組織鎖が成長した際に組織鎖によって包埋又は部分的に包埋されるように構成することができる。足場は、成長した組織鎖によって被包又は部分的に被包されるように構成されており、組織鎖が足場の動きと連動して動くようにそれに付着していることができる。

【0050】

様々な実施形態では、本発明のバイオリアクターは、バイオリアクターの成長チャンバーを通る電流を生じるように構成された一対の電極(又は複数の電極)を含むことができる。

【0051】

特定の実施形態では、それぞれの長手チャンバーに柔軟に接続された足場は、長手チャンバーの配向に対して実質的に垂直な配向、実質的に平行な配向、又は実質的に対角の配向にある。そのような足場は、成長した組織鎖によって被包又は部分的に被包された後に、足場の動きと連動して動くようにそれに付着している。

【0052】

特定の実施形態では、バイオリアクターは、目的の治療剤又は毒素又は試験薬剤への曝露により生じた、その中に形成された組織鎖の収縮性に対する効果を測定するために使用することができる。

【0053】

様々な実施形態では、本発明のバイオリアクターは、(a)実験的薬理学的薬剤の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、並びに(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供において使用することができる。

【0054】

別の態様では、本発明は、組織の収縮力に対する試験薬剤の効果を測定する方法であって、(a)バイオリアクターの組織鎖の収縮力を測定する工程と、(b)試験薬剤が収縮力に影響を与えるのに十分な条件下で、バイオリアクターの組織鎖を試験薬剤と接触させる工程と、(c)試験薬剤への曝露後の、組織鎖の収縮力を測定する工程と、(a)と(c)とを比較することによって、試験薬剤が収縮力に影響を与えるかどうかを決定する工程とを含み、収縮力を測定する工程が、外力を使用して長手足場を静止位置から第2の位置へと動かした際に、長手足場に対して組織鎖によって課された力の量を測定することを含む方法に関する。

【0055】

特定の実施形態では、収縮力は、電子顕微鏡画像化と併せた屈曲試験によって測定する。

【0056】

別の態様では、本発明は、組織に対する試験薬剤の安全性及び有効性を評価する方法であって、(a)バイオリアクターの組織鎖を試験薬剤と接触させる工程と、(b)安全性及び/又は有効性の指標となる1つ又は複数の生理的パラメータに対する効果を測定する工程と、(b)を、試験薬剤に曝露させていない対照バイオリアクターから測定した、同じ生理的パラメータと比較する工程とを含み、(c)と比較した、(b)における生理的パラメータの統計的に有意な変化が、試験薬剤が安全性及び/又は有効性を欠くことを示す方法を提供する。

【0057】

更に別の態様では、本発明は、組織鎖を培養するためのバイオリアクターを製作する方法であって、それぞれがその中で三次元組織鎖を成長させるのに適した長手チャンバーを用いて形成されている、密封されたウェルのアレイを含むプレートを微細製作する工程と、長手チャンバー内で形成された後に組織鎖によって被包されるように構成されている、一対の直線状の足場をそれぞれの長手チャンバーに取り付ける工程とを含み、直線状の足場が、長手チャンバーに対して概して長手方向に配向している方法に関する。

【0058】

適用される場合又は具体的に否定されていない場合は、実施形態が本発明の異なる態様の下で記載されているにも関わらず、本明細書に記載の実施形態の任意の1つを任意の他の1つ又は複数の実施形態と組合せ可能であることが企図される。

【0059】

これら及び他の実施形態は、以下の発明を実施するための形態に開示されている、又はそれから明らかである、かつそれによって包含されている。

【0060】

本発明を、記載される特定の実施形態だけに限定することを意図するものではないが、例として与えられる以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて最良に理解することができる。ここで、本出願の例示的実施形態を示す添付の図面を、例として参照する。

【図面の簡単な説明】

【0061】

【図1】図1a〜図1cは、天然の心筋における心筋束の例を示す。

【図2】図2a〜図2bは、本発明の第1の実施形態、すなわち、単ワイヤ式3D組織培養実施形態(例えば、バイオワイヤ系)を記載する略図を提供する。Bは、ワイヤの周囲に形成される三次元(3D)組織鎖としてパートIVに時間と共に得られる、増殖チャンバー中での組織培養の進行を示す。

【図3】図3a〜図3bは、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて心臓組織を生成するのに好適な例示的電気刺激レジメン、及び生成された組織からの心臓細胞の単離を示す。

【図4】図4a〜図4dは、心臓組織鎖の長期培養のための例示的プロトコール及び本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて培養された心臓組織の収縮装置の組織化を示す。

【図5】図5a〜図5cは、本開示の例示的バイオワイヤ系に従う、7日間にわたる心臓組織の生成を示す。

【図6】図6a〜図6dは、単層組織と比較した、本開示の例示的バイオワイヤ系に従って培養された心臓細胞の形状及び配向を示す。

【図7】図7a〜図7cは、本開示の例示的バイオワイヤ系に従って生成されたラット心臓細胞の電気刺激からの例示的結果を示す。

【図8】図8a〜図8dは、本開示の例示的バイオワイヤ系に従うヒト心臓細胞の生成からの例示的画像及び結果を示す。

【図9】図9a〜図9dは、電気刺激により促進された生理的細胞肥大及び改良された心筋細胞表現型と共に培養された本開示の例示的バイオワイヤ系に従って調製された培養組織鎖細胞の例を示す。

【図10】図10a〜図10cは、本開示の例示的バイオワイヤ系に従って調製された培養組織鎖の形態を示し、その形態がPDMS鋳型からの除去後も維持されたことを示す。

【図11】図11a〜図11dは、本開示の例示的バイオワイヤ系に従って増殖させたhiPSC由来心筋細胞組織鎖が、電気刺激にかけられた場合に成熟の兆候を示したことを示す。

【図12】図12a〜図12bは、本開示の例示的バイオワイヤ系に従って増殖させた他の幹細胞由来心筋細胞組織鎖の電気刺激により促進される成熟の例を示す。

【図13】図13は、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて調製された培養組織鎖中の細胞に関する細胞アスペクト比の棒グラフ分析を示し、年齢一致させた胚様体に由来する細胞(EBd34)と比較した、電気刺激された組織鎖における、よりロッド状に向かう形状の変化が確認される。

【図14】図14は、胎児心臓遺伝子プログラムの下方調節及びカリウムチャネル遺伝子の上方調節を示す、本開示の例示的バイオワイヤ系に従って増殖させた組織鎖に由来する様々な細胞における遺伝子発現分析のチャートを示す。

【図15】図15は、EBにおけるよりも低い本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された組織鎖における心筋細胞増殖を例示するチャートを示す。

【図16】図16は、細胞集団が培養後も有意には変化しなかったことを示す、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された組織鎖におけるマーカーの普及率を例示するチャートを示す。

【図17】図17a〜図17dは、本開示の例示的バイオワイヤ系に従って生成された組織鎖の機能的評価からの例示的結果を示す。

【図18】図18a〜図18bは、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された組織鎖からの心臓細胞における電気刺激及び捕捉率を示す。

【図19】図19は、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された心臓細胞におけるデスモソームの存在と相関する伝導速度のチャートを示す。

【図20】図20a〜図20hは、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された心臓細胞中のCa²⁺ハンドリング特性の電気刺激により促進される改善を示す。

【図21】図21a〜図21hは、対照と比較した、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された組織鎖から単離された単一細胞の心筋細胞における電気生理学的特性を例示するチャートを示す。

【図22】図22a〜図22gは、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された組織から単離された単一の心筋細胞におけるhERG電流及びIK1に対する電気刺激の効果を例示するチャートを示す。

【図23】図23a〜図23hは、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された組織から単離された単一の心筋細胞における、Na⁺電流、活動電位ピーク、膜コンダクタンス、膜コンダクタンス-休止電位曲線及びIK1-休止電位曲線に対する電気刺激の効果を例示するチャートを示す。

【図24】図24a〜図24eは、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された組織における活動電位持続時間率依存的適応及び休止電位を例示するチャートを示す。

【図25】図25a〜図25bは、本開示の例示的バイオワイヤ系を用いて生成された組織鎖における選択された心臓タンパク質の発現を示す。

【図26】図26は、本開示の例示的バイオワイヤ系に従って生成された組織に対して行われた測定値の表を示す。

【図27】図27は、開示されたデバイスの例を用いて培養された組織におけるCa²⁺ハンドリング特性の変化に関する表を示す。

【図28】図28は、本開示の例による、組織の生成のために用いられる例示的オリゴヌクレオチド配列の表を示す。

【図29】図29は、管腔を提供する灌流可能な長手エレメントを含む本発明の第2の実施形態、すなわち、灌流可能な単ワイヤ式3D組織培養実施形態(例えば、バイオチューブ)を記載する写真及び略図を提供する。

【図30】図30a〜図30dは、本開示の例示的バイオチューブ系に従って生成された、灌流可能な心臓組織鎖の生成を例示する画像である。

【図31】図31a〜図31dは、本開示の例示的バイオチューブ系に従って生成されたヒトチューブ鋳型組織上での一酸化窒素(NO)処理を例示する。

【図32】図32a〜図32bは、本開示の例示的バイオチューブ系に従って生成された、灌流及び電気刺激を用いて生成された組織の機能特性を例示するチャートを示す。

【図33】図33a〜図33bは、(a)臨床in vivo評価によるin vitro試験からの標準的な薬物スクリーニングプロセスの略図及び(b)伝統的な薬物スクリーニングプロセスに伴う様々な問題に関する本発明により提供される解決法を提供する。

【図34】図34は、溝を横断してマイクロウェルに取り付けられたポリマーワイヤを含む、本開示の例示的バイオロッド/バイオワイヤII系(例えば、バイオロッド)の様々な構成要素を示す略図を提供する。播種された細胞(例えば、心筋細胞)は、時間と共に、溝付きの成長チャンバーのそれぞれの末端でポリマーワイヤに取り付けられ、その間に伸長する三次元組織鎖を形成する。ある特定の実施形態(例えば、POMac)におけるポリマーワイヤは、UV照明下で蛍光を発する。

【図35】図35は、96ウェル形式での本開示の例示的バイオロッド系の構成を示す略図を提供する。

【図36】図36は、ステージ1(ウェルが播種され、細胞が増殖する組織形成)、ステージ2(細胞が電気刺激により成熟する)、及びステージ3(薬物試験ステージ)を含む、本開示の例示的バイオロッド系を操作する際の予定表を記載する略図を提供する。

【図37a】図37は、組織鎖上での収縮力、すなわち、収縮力組織培養実施形態の測定を可能にする本開示の例示的バイオロッド系を記載する写真及び略図を提供する。(a)〜(c)は、(d1〜d3)に記載されるデバイスに関する例示的製作プロセスを記載する。特に、(a)は、熱エンボス加工PMMAベース、その上に取り付けられたポリマーワイヤ、無底96ウェルプレートオーバーレイ、及びプレートキャップを含む、96ウェル形式を記載する。

【図37b】図37は、組織鎖上での収縮力、すなわち、収縮力組織培養実施形態の測定を可能にする本開示の例示的バイオロッド系を記載する写真及び略図を提供する。(a)〜(c)は、(d1〜d3)に記載されるデバイスに関する例示的製作プロセスを記載する。略図(b)は、PMMAベースの形成を記載し、実際のPMMAベースの画像を含む。

【図37c】図37は、組織鎖上での収縮力、すなわち、収縮力組織培養実施形態の測定を可能にする本開示の例示的バイオロッド系を記載する写真及び略図を提供する。(a)〜(c)は、(d1〜d3)に記載されるデバイスに関する例示的製作プロセスを記載する。略図(c)は、ポリマー(例えば、POMac)ワイヤの形成を記載する。

【図37d】図37は、組織鎖上での収縮力、すなわち、収縮力組織培養実施形態の測定を可能にする本開示の例示的バイオロッド系を記載する写真及び略図を提供する。略図(d)は、ウェル/成長チャンバー上でのポリマーワイヤの配置を記載する。

【図38】図38は、図37a〜図37dのプロセスに従って製作された開示されたデバイスの例の写真を提供する。

【図39A】図39aは、本開示の例示的バイオロッド系に従って生成された組織中での組織圧縮及び力の測定を例示する。

【図39B】図39bは、本開示の例示的バイオロッド系に従って生成された組織中での組織圧縮及び力の測定を例示する。

【図39C】図39cは、本開示の例示的バイオロッド系に従って生成された組織中での組織圧縮及び力の測定を例示する。

【図39D】図39dは、本開示の例示的バイオロッド系に従って生成された組織中での組織圧縮及び力の測定を例示する。

【図39E】図39eは、本開示の例示的バイオロッド系に従って生成された組織中での組織圧縮及び力の測定を例示する。

【図40】図40a〜図40bは、本開示の例示的バイオロッド系に従って生成された組織の力測定検証を例示する。

【図41】図41a〜図41bは、本開示の例示的バイオロッド系に従って生成された組織の機能評価を示す。

【図42】図42a〜図42bは、本開示の例示的バイオロッド系に従う組織収縮性評価である。

【図43】図43a〜図43bは、本開示の例示的バイオロッド系に従って生成された組織上での薬物試験の結果を示す。

【図44】図44は、アルファ-アクチニン(細胞骨格染色)及びDAPI(核を示すため)について染色された本開示の例示的バイオロッド系の組織鎖の細胞の蛍光顕微鏡画像である。

【図45】図45は、本開示の例示的バイオロッド系の組織鎖が弾力性に関してヒト心筋を刺激することを示す実験結果を提供する。

【図46】図46は、3カ月にわたる本開示の例示的バイオロッド系のPOMacポリマーワイヤの安定性(弾性係数を単位とする)を示す棒グラフを提供する。

【図47】図47は、本開示の例示的バイオロッド系のPOMacポリマーワイヤを、弾性係数に影響することなくガンマ照射により滅菌することができることを示すデータを提供する。

【図48】図48は、本開示の例示的バイオロッド系のバッチ画像を、市販の装置(例えば、Molecular Devices社)を用いて獲得することができる1つの様式を示す略図を提供する。

【図49】図49は、組織鎖が、本開示の例示的バイオロッド系に従う単一の96ウェルプレート内で一貫した、再現性の高いデータをもたらすことを示すデータを提供する。

【図50】図50は、細胞のその配向を示すためにアルファ-アクチニンで染色された本開示の例示的バイオロッド系の細胞の蛍光顕微鏡画像を提供する。

【図51A】図51(a)は、温和な条件下での迅速な集合のために用いることができ、加水分解により分解するUV重合性ポリマーである、POMac[生分解性エラストマー、ポリ(オクタメチレンマレイン酸(無水物)クエン酸]プレポリマー溶液の合成を記載する略図を提供する。POMacは、非毒性モノマー(クエン酸、マレイン酸無水物、1,8-オクタンジオール)から合成される。差込図は、AngioChip足場表面のSEMを示し、しわ状ナノ細孔を示す。PEGMEポロゲンを、PBS中で1日間浸出させた。スケールバー:500nm。

【図51B】図51(b)は、3-Dスタンピングを用いるAngioChip足場マイクロ製作プロセスの略図を提供する。

【図51C】図51(c)は、AngioChip表面へのゲル/細胞調製物の播種(2)、次いで、AngioChipの周辺及び内部のゲルの圧縮(3)を記載する。右図(ii)は、AngioChipを増殖させるための3つの別々のチャンバーを含むバイオリアクターを記載する。

【図51D】図51(d)は、異なる構成及び孔径のAngioChip足場の微小構造を示すSEM画像を提供する。

【図51E】図51(e)は、10μmの微小孔を有するAngioChip足場のSEM画像を提供する。(A)は、そのネットワーク壁を通じてパターン化された10μmの通り穴を有するAngioChip足場の画像を提供する。スケールバー:600μm。画像は複数の画像から縫い合わせたものである。(B)は、異なる角度から見た10μmの通り穴を有するAngioChip足場のSEMである。スケールバーは画像中に示される。

【図51F】図51(f)は、3-D AngioChip足場のマイクロCTを提供する。(A)足場の長端方向に沿って入口から分枝に向かう3-D AngioChip足場の横断面のマイクロCTスキャンである。スケールバー:400μm。(B)異なる角度から見たAngioChipの内部ネットワークのマイクロCTである。足場を、その内部ネットワークを介して硫酸バリウム溶液で灌流し、従って、可視化の改善のためその密度を増大させた。足場ネットワーク壁の厚さは50μmであった。入口、出口、及び一次分枝は、50μm×200μmの内部管腔寸法を有していた。二次分枝は、50μm×100μmの内部管腔寸法を有していた。一次及び二次分枝中の内皮細胞が同レベルの剪断ストレスを経験するようにネットワークを設計した。各層上のネットワークを、垂直チャネルにより接続し、z軸において300μm離した。足場メッシュを50μmの支柱から作った。支柱を、長端方向に250μm離して、短端方向に100μm離して、及びz軸中に50μm離して配置した。

【図51G】図51(g)は、POMacポリマー溶液の分子構造特性を提供する。(A)フーリエ変換赤外(FTIR)分光分析。(B)核磁気共鳴(NMR)分光分析。

【図52】図52は、バイオリアクター集合である。(A)バイオリアクターの4つの構成要素(キャップ、ポリカーボネート本体、PDMSベース、及びポリカーボネートベース)の画像。(差込図)AngioChip足場を置いたPDMSベース上のトレンチ構造の画像。細胞が底部から足場の周囲を包むことができるように、マイクロポストのアレイを用いて、AngioChip足場をベースから約200μm持ち上げた。PDMSトレンチの全高は700μmである。細胞/ゲル懸濁液を、足場を設置したトレンチに投入し、頂部まで充填した。(B)着色染料で灌流した3つの心臓組織を含む組み立てられたバイオリアクターの画像。(差込図)主要ウェル中の灌流された心臓組織の拡大画像。

【図53】図53a〜図53dは、AngioChip足場の物理特性の評価の結果を示す。

【図54】図54a〜図54fは、AngioChip実施形態に従って生成された組織の形成及び血管形成を例示する。

【図55】図55a〜図55dは、バイオブランチ実施形態に従って生成された血管形成された心臓組織の検証を例示する。

【図56】図56は、例示的なAngioChip足場の製作及び可視化である。(a)スライドガラス上に同時にパターン化された複数のAngioChip足場の画像。(b)スケールのためのボールペンの先端のそばの、着色染料で灌流されたAngioChip肝臓組織の画像。(c)バイオリアクターの集合及び血管形成された組織の集合の略図。(d)AngioChip組織の一部の略図。(e〜g)3-Dスタンピング技術を用いて作出された、(e)1-Dチューブ(スケールバー:1.5mm及び500μm)、(f)2-D AngioChip足場(スケールバー:1mm及び300μm)並びに(g)3-D AngioChip足場(スケールバー:1mm及び500μm)のSEM。(h)硫酸バリウム溶液で灌流された3-D AngioChip足場の内部3-DネットワークのマイクロCT画像。(i)チャネル壁上の10μmの微小孔を有するAngioChip足場のSEM。スケールバー:200μm。(差込図)10μmの微小孔の横断面のSEM。赤色の矢印は微小孔を指示する。スケールバー:50μm。(j)無孔性及びナノ細孔性AngioChip足場に関するポロゲン浸出から1日での質量減少(平均±s.d.、n=3)。無孔性及びナノ細孔性は、それぞれ、ポロゲンを使用せずに、又は使用して製作された足場に対応する。(k)ポロゲン浸出後のAngioChip足場の表面のSEM。スケールバー:500nm。

【図57】図57は、AngioChip足場の物理特性である。(a〜b)(a)PBS及び(b)0.1M NaOH溶液中のナノ細孔を有する、又は有さないAngioChip足場の質量減少(平均±s.d.、n=3)。(c)AngioChip足場(平均±s.d.、n=4)及びラット大腿静脈(平均±s.d.、n=6)の破裂圧。(d〜f)マクロ多孔性が増大する格子マトリックスを有するAngioChip足場のSEM:(d)設計A(スケールバー:1mm及び200μm)、(e)設計B(スケールバー:1mm及び200μm)、並びに(f)設計C(スケールバー:1mm及び300μm)。(g)3つの異なる格子マトリックス設計を有するAngioChip足場の代表的な一軸引張応力-ひずみプロット。長端方向(LD)及び短端方向(SD)は、それぞれ、心臓の円周軸及び縦軸に対応する。(h)10μmの通り穴を有するAngioChipの内蔵型ネットワークから周囲の格子マトリックスに拡散する332DaのFITCの低速度撮影蛍光画像。スケールバー:300μm。最後の画像は複数の画像から縫い合わせたものである。(i)内蔵型ネットワークから、生細胞により切断される周囲の心臓組織に拡散するカルボキシフルオレセインジアセテート(CFDA、557Da)の低速度撮影画像。スケールバー:300μm。

【図58】図58は、例示的なAngioChipネットワークの内皮化である。(a〜f)(a)全ネットワークの視野(スケールバー:100μm、画像は複数の画像から縫い合わせたものである)、(b)角の視野(スケールバー:100μm)、及び(c)まっすぐのセグメント(スケールバー:100μm)、及び(d)分枝を有するAngiochip足場の内部血管構造の免疫染色(CD31)。(e)まっすぐのセグメント(スケールバー:100μm)、及び(f)分枝(スケールバー:100μm)における10μmの微小孔を有する血管構造の免疫染色(CD31)。白色の矢印は、横断面の視野からの微小孔の位置を示す。(g)内皮化されたAngioChipネットワークを介するヒト全血灌流の略図。AngioChip足場は、主要ウェル中に位置する。矢印は、流動方向を示す。(h〜i)(h)未処理の足場ネットワークの管腔表面及び(i)15dyne/cm²で30分間、ヘパリン化されたヒト全血で灌流した後の内皮化されたネットワークの管腔表面のSEM。スケールバー:(h、i)100μm、及び(差込図)50μm。白色の矢印は、代表的な血小板を標識する。(j)血小板で覆われた足場ネットワークの管腔表面積の定量化(平均±s.d.、n=3)。(k)内皮化されたネットワークによるマクロファージの灌流の略図。(l)ネットワーク分枝中の蛍光標識されたRAW267細胞の接着及び蓄積を示す蛍光画像。スケールバー:200μm。白色の矢印は、マクロファージ凝集体を示す。(m)足場ネットワークの内皮化された表面上で横方向に移動する蛍光標識されたマクロファージの低速度撮影画像。スケールバー:10μm。白色の矢印は、マクロファージ移動の方向を示す。白色の点は、以前の捕捉枠における追跡された細胞の位置を示す。(n)チャネル壁上の10μmの微小孔を介する蛍光標識されたマクロファージの壁間移動。スケールバー:100μm。(差込図)スケールバー:50μm。白色の矢印は、移動しているマクロファージを示す。

【図59】図59は、血管形成された肝臓組織集合である。(a)5日間にわたる例示的AngioChip足場上でのラット肝細胞の組織再モデリングプロセスの低速度撮影画像。スケールバー:800μm。最後の画像は複数の画像から縫い合わせたものである。(b)CFDAで蛍光標識された、肝臓組織の免疫染色(F-アクチン)は、肝細胞の周囲のラット線維芽細胞の分布及び形態を示す。スケールバー:200μm。(c)CFDA及びヨウ化プロピジウム(PI)で染色された肝臓組織の蛍光画像は、高い細胞生存能力を示す。スケールバー:200μm。(d)青色染料で灌流した肝臓組織の明視野画像。スケールバー:600μm。(e〜g)(e、f)内皮細胞を同定するためのCD31(スケールバー:200μm)及び(g)肝細胞を同定するためのアルブミン(スケールバー:200μm)について染色された肝臓組織の組織横断面。(h)肝臓組織からの尿素分泌及び血管壁から肝臓組織に拡散した後、フェキソフェナジンに変換され、血管構造中に放出されて戻るテルフェナジンの略図。(i)経時的なバイオリアクター主要ウェル及び出口ウェルへの尿素分泌の定量化(平均±s.e.m.、n=4)。*はp<0.05での群間の有意差を示す。(j)入口ウェルから10μMでのテルフェナジンの24時間灌流後のバイオリアクター入口ウェル、主要ウェル、及び出口ウェルにおけるフェキソフェナジンの濃度(平均±s.e.m.、n=4)。

【図60】図60は、血管形成された心臓組織集合である。(a)5日間にわたるラット心臓組織再モデリングの低速度撮影画像。(b)ラット(ラット-CM)とヒトの心筋細胞(HESC-CM)の両方に関する組織圧縮に起因する組織幅の減少の定量化(平均±s.d.、n=3)。(c〜d)電気的興奮性パラメータ(平均±s.d.、n=3)。(e)4〜6日目の間のヒト心臓組織の収縮の振幅パーセント(平均±s.e.m.、n=4)。(f〜i)(f、g)ヒト心臓組織(スケールバー:20μm)及び(h、i)ラット心臓組織(スケールバー:10μm)上でのサルコメア-α-アクチニン及びF-アクチンの免疫染色。(j)着色染料で灌流されたヒト心臓組織パッチの明視野画像。スケールバー:400μm。(k〜m)(k)ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)、(l)マッソントリクローム、及び(m)内皮細胞を同定するためのCD31で染色されたヒト心臓組織の組織横断面。スケールバー:200μm。(n)H&Eで染色された約1mmの厚さのヒト心臓組織の組織横断面。スケールバー:100μm。(o)hESC由来心臓組織の伝導速度活性化マップ。(差込図)電気刺激に対する電気活動応答。(p〜q)(p)10μMのエピネフリン又は(q)10μMのジゴキシンで灌流されたヒト心臓組織の初期自発的収縮痕跡及び薬物刺激収縮痕跡。(r)媒体灌流を用いて、又は用いずに培養されたラット心臓組織の横断面のCFDA及びPI染色画像。スケールバー:200μm。(s)媒体灌流を用いて、又は用いずに培養されたラット心臓組織からの乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)分泌の定量化(平均±s.d.、n=4)。*はp<0.05を有する群間の有意差を示す。

【図61】図61は、心臓組織の外科的吻合である。(a〜b)(a)動脈間移植片及び(b)動脈-静脈移植片の構成におけるラット大腿血管上でのAngioChip心臓組織の外科的吻合。血液灌流を、吻合の直後に確立した。より良好な視覚的コントラストのために、画像化中に埋込み体の下に紙を置いた。(c〜n)動脈-静脈移植片の構成における直接吻合を(c〜h)用いない又は(i〜n)用いた、外科手術の1週間後のラット心臓組織埋込み体の横断面。切片を、(c〜d、i〜j)マッソントリクローム、(e、k)H&E、(f、l)CD31、(g、m)平滑筋アクチンで染色した。スケールバー:(c、i)200μm及び(d〜h、j〜n)100μm。動脈-静脈移植片の構成における直接吻合を(h)用いない又は(n)用いた外科手術の1週間後の、ラット心臓組織埋込み体の横断面上での心臓トロポニンT及びDAPIに関する免疫染色。(h、n)スケールバー:50μm。(o)動脈-静脈移植片の構成における直接吻合を用いた外科手術の1週間後のラット後肢上の埋込み体の画像。白色の点線は、AngioChip埋込み体の輪郭である。(p)平滑筋アクチンにより染色された面積の定量化(平均±s.d.)。

【図62】図62は、異なる設計のAngioChip足場に関して単軸方向で測定された有効剛性(ELD、ESD)、異方性比(ELD/ESD)、最大引張応力(UTSLD、UTSSD)及びひずみ-破壊(εfLD及びεfSD)の概要である(平均±s.d.)。成体ラット心筋の対応する特性を比較のために示す。長端方向(LD)及び短端方向(SD)はそれぞれ、心臓の円周軸及び縦軸に対応する。

【図63】図63は、標準的な、及び拡張されたバイオリアクター設定を用いる培養培地及び血液灌流の特性評価である。所与の圧力水頭レベルを有するAngioChip足場を通過する流量をモデル化するために、所与の高さを有する流体カラムから生成される圧力を、式P=hgp(式中、Pは圧力を表し、hは高さを表し、gは重力定数を表し、pは流体の密度を表す)に基づいて最初に計算した。次いで、注入圧力水頭値をCOMSOLマルチフィジックス中に入力し、AngioChipネットワークの幾何モデルを作出した。次いで、内蔵型Navier-Stokes式を用いて、ネットワークを通過する体積流量をモデルから誘導した。壁剪断応力を、式:

【数1】

(式中、τは剪断応力を表し、μは粘度を表し、wはチャネルの幅を表し、Hはチャネルの高さを表し、Qは体積流量を表す)
に基づいて、誘導された体積流量から計算した。実験的体積流量を、灌流の1日後に収集された流体の量から誘導し、剪断応力を対応する体積流量から誘導した。

【図64】図64は、3つの異なる格子設計を有するAngioChip足場の単軸引張応力-ひずみプロットである。0〜0.1のひずみ間のプロットのセグメントを、線形回帰を用いて適合化して、有効剛性(E)を計算した。線形回帰式及びR値を示す。引張応力の有意な低下前の最後のデータ点を用いて、最大引張応力(UTS)及びひずみ-破壊(εf)を計算した。

【図65】図65は、ラット成体心室筋の単軸引張応力-ひずみプロットである。長端方向(LD)及び短端方向(SD)はそれぞれ、心臓の円周軸及び縦軸に対応する。0〜0.1のひずみ間のプロットのセグメントを、線形回帰を用いて適合化して、有効剛性を計算した。線形回帰式及びR値を示す。

【図66】図66は、AngioChip足場ネットワークの内皮化を示す。(A〜C)ネットワーク壁上でパターン化された10μmの微小孔を有する足場ネットワーク上での内皮細胞(CD31免疫染色された)被覆の共焦点走査である。スケールバー:(A)100μm、(B)100μm、(C)200μm。(D)足場ネット枠-上での内皮細胞(VE-カドヘリン免疫染色された)被覆の共焦点走査。スケールバー:50μm。

【図67】図67は、15dyne/cm²で30分間のヒト全血の灌流後の、内皮細胞被覆を有する、又は有さないAngioChip足場ネットワークの管腔表面の代表的なSEMである。ヒト血液を1%ヘパリン(v/v)でヘパリン化して、取り扱い中の凝固を防止した。スケールバーを画像中に示す。

【図68】図68は、HES-3 NKX2-5 GFP陽性細胞由来心筋細胞混合物のフローサイトメトリー分析である。FL1-Hは、NKX2-5発現に対応する。NKX2-5陽性細胞は、心筋細胞であると考えられた。それぞれの細胞混合物中の心筋細胞のパーセントを、W0ゲート領域により決定した。

【図69】図69は、動脈-静脈移植片の構成における直接外科的吻合を用いた、又は用いない1週間後の心臓組織埋込み体のH&E染色された組織横断面である。低倍率画像を左欄に示す。スケールバー:400μm。高倍率画像を右欄に示す。スケールバー:150μm。

【図70】図70は、動脈-静脈移植片の構成における直接外科的吻合を用いる、又は用いない1週間後の心臓組織埋込み体のマッソントリクローム染色された組織横断面である。低倍率画像を左欄に示す。スケールバー:400μm。高倍率画像を右欄に示す。スケールバー:150μm。

【図71】図71は、動脈-静脈移植片の構成における直接外科的吻合を用いる、又は用いない1週間後の心臓組織埋込み体のCD31染色された組織横断面である。低倍率画像を左欄に示す。スケールバー:400μm。高倍率画像を右欄に示す。スケールバー:150μm。

【図72】図72は、動脈-静脈移植片の構成における直接外科的吻合を用いる、又は用いない1週間後の心臓組織埋込み体の平滑筋アクチン(SMA)染色された組織横断面である。低倍率画像を左欄に示す。スケールバー:400μm。高倍率画像を右欄に示す。スケールバー:150μm。

【図73】図73は、動脈-静脈移植片の構成における直接外科的吻合を用いる、又は用いない1週間後の心臓組織埋込み体の組織横断面の免疫染色である。トロポニンT、DAPI。スケールバー:50μm。

【図74】図74は、2つの主要ウェルがそれぞれの入口ウェルと出口ウェルとの間に含まれた二重ウェルバイオリアクターの画像である。2つのAngioChip足場を連続して接続し、入口ウェルから出口ウェルまで連続的に灌流することができる。(差込図)2つのAngioChip足場を設置した二重ウェルの拡大画像。肝細胞を第1の足場上に播種することができる一方、心筋細胞を第2の足場上に播種して、臓器レベルでの薬物相互作用を精査するための「臓器チップ」系を作出することができる。心臓組織を刺激するために、第2のチャンバー中に一対の電極を設置した。

【図75】図75は、それぞれのチャンバーが、ウェル内に配置された浸透性/灌流性チューブの周囲に3D組織鎖を播種し、増殖させるための1つ又は複数のウェルを含有する、チャンバーのアレイを含むマルチウェル灌流可能系を含む本開示の例示的AngioTube系の略図を提供する。それぞれのチャンバーはまた、組織鎖を固定するための少なくとも2つの対立エレメントを含有してもよく、3D組織鎖の収縮/弛緩サイクル中のその動きを識別及び測定することができる。また、チャンバーを、心臓組織を刺激するための電極を用いて構成することができる。

【図76】図76は、バイオリアクターの傾斜高の関数としての流量(μl/分)又は剪断応力(dyne/cm²)により測定された例示的なAngioTubeマルチウェル灌流可能バイオリアクターの受動的灌流の結果を示す。

【図77】図77は、例示的なAngioTubeバイオリアクターの単一のチャンバー中での3D組織鎖の発達の時間経過を示す。一連の最初の画像は、細胞がバイオリアクターチャンバー中に最初に播種される点を示す。時間が進むにつれて、細胞は増殖し、可撓性エレメント間の組織接続を維持しながら、チャンバー中の2つの可撓性カンチレバーエレメントに向かって凝集し始める。写真で示される特定の実施形態は、実施形態に過ぎず、他の構成も本発明によって企図される。例えば、異なる形状及び/又は長さ(例えば、曲線型の、丸型の、非線形の、平坦な、丸い、曲がった、厚さ)を有する可撓性カンチレバーエレメントを形成させ、カンチレバー移動の測定及び/又は検出を検出することができるように、異なる角度又は配向で浸透性管状エレメントに結合することができる。チャンバーは心臓細胞を刺激するための電極を含有してもよい。右側のバーは、3D組織鎖の形成中に観察することができるカンチレバー移動の程度を示す。

【図78】図78は、例示的なAngioTubeバイオリアクターチャンバー展示において形成された3D組織鎖の組織可視化である。組織鎖の光学顕微鏡画像(左の画像)。F-アクチンで染色された同じ組織鎖(中央の画像)。組織鎖の細胞の分布及び形態及び配向を示すためのCFDAで染色された3D組織の細胞の免疫染色。

【図79】図79は、播種後の増殖の5日後及び10日後の3D組織鎖のカンチレバー移動(ピクセルで測定される)を測定する。

【図80】図80は、96ウェルプレート形式と適合するようにそれぞれ構成された、例示的なバイオワイヤ、バイオロッド、及びアンギオチューブ系を比較する。

【図81】図81は、固定されたステーション(A)及び可動性ステーション(B)を含むポリマーシートの機械的特性を測定するための系の略図を提供する。

【図82】図82は、異なる化合物で処理されたバイオワイヤの光学及び蛍光顕微鏡観察である。

【図83】図83は、遺伝子発現に対する慢性薬物曝露の効果を記載する。

【図84】図84は、ELISAによる未処理のhESC-微小組織(対照)の、又は異なる肥大薬物で処理された、条件化培地中での可溶性ヒトBNPの定量化である。N=3。平均±標準偏差。交差反応の問題のため、本発明者らはAngII-処理された試料中のBNPを定量することができなかった。

【図85】図85は、ISO、Et-1及びAngIIによるバイオワイヤの処理は、心筋細胞の肥大を誘導する。培養の終わりにバイオワイヤから解離した単一のHes2 hESC由来心筋細胞上で実施された測定。細胞の面積(μm²)、平均±s.e.m.、n=3。

【図86】図86は、ISO、AngII、及びET-1処理されたバイオワイヤ試料中での収縮力に対する効果を示す。

【図87】図87は、バイオワイヤ中の代表的な伝導速度活性化マップである。

【発明を実施するための形態】

【0062】

以下は、当業者が本発明を実施することを助けるために提供する、本発明の詳細な説明である。当業者は、本発明の精神又は範囲を逸脱せずに、本明細書に記載の実施形態に改変及び変形を行い得る。別段に定義しない限りは、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において本発明の説明に使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのみのものであり、本発明を限定することを意図しない。

【0063】

本明細書で引用又は言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、図、及び他の参考文献、並びに本明細書で引用された文書中で引用又は言及されている全ての文書は、本明細書又は本明細書に参照により組み込まれている全ての文書中で言及されている全ての製品の任意の製造業者の指示、説明書、製品仕様書、及びプロダクトシートと共に本明細書に参照により組み込まれており、本発明の実施において用い得る。

【0064】

本明細書に記載したものに類似又は均等である任意の方法及び材料も、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料をここに記載する。本明細書で言及する全ての刊行物は、刊行物が引用されているものに関連する方法及び/又は材料を開示及び説明するために、本明細書に参照により組み込まれている。

【0065】

別段に定義しない限りは、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の技術者によって一般的に理解される意味を有する。その開示全体が本明細書に参照により組み込まれている以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する(本明細書で別段に定義されていない限り):Singletonら、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (第2版、1994年)、The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker編、1988年)、The Glossary of Genetics、第5版、R. Riegerら(編)、Springer Verlag (1991年)、並びにHale及びMarham、the Harper Collins Dictionary of Biology (1991年)。一般に、本明細書に記載されている、又は本発明に固有の分子生物学的方法の手順等は、当分野において使用される一般的な方法である。そのような標準技法は、例えば、Sambrookら(2000年、Molecular Cloning--A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Laboratories)、及びAusubelら(1994年、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、ニューヨーク)等の参考資料中に見つけることができる。

【0066】

以下の用語は、別段に指定しない限りは、以下で割り当てる意味を有し得る。しかし、当業者によって知られている又は理解されている他の意味も可能であり、かつ本発明の範囲内にあることを理解されたい。本明細書で引用されている全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体で参照により組み込まれている。矛盾する場合は、定義を含めて本明細書が支配する。更に、材料、方法、及び実施例は例示的のみであり、限定することを意図しない。

【0067】

定義
具体的に示す又は内容から明白でない限りは、本明細書で使用する用語「約」とは、当分野の通常の許容範囲内、例えば平均の2標準偏差単位以内であると理解される。約とは、示した値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、又は0.01%以内であると理解することができる。内容からそうでないということが明白でない限りは、本明細書に提供する全ての数値は、用語、約によって修飾することができる。

【0068】

「作用剤」とは、薬物、薬剤、又は化合物であり、これは何らかの様式でその同族受容体と結合してそれを活性化して、直接又は間接的に生理的効果を引き起こす。

【0069】

「拮抗剤」とは、受容体と結合する薬剤であり、これは立ち代って他の分子による結合を妨げる。

【0070】

エレメントが別のエレメントと「接続」又は「カップリング」していると言及される場合、他のエレメントと直接接続又はカップリングされていることができるか、又は介在エレメントが存在し得ることを理解されたい。対照的に、エレメントが別のエレメントと「直接接続」又は「直接カップリング」していると言及される場合、介在エレメントは存在しない。同様の数字は全体にわたって同様のエレメントを示す。本明細書で使用する用語「及び/又は」には、関連する列挙した事項のうちの1つ又は複数の任意かつ全ての組合せが含まれる。

【0071】

製薬分野では、用語「有効性」とは、単一の薬物-受容体の複合体から生じる、組織における応答の強度を説明することができる。本開示の文脈では、「有効性」とは、細胞又は組織の表現型を改善させる薬物又は試験薬剤によって誘発された応答として定義することもできる。

【0072】

用語「第1の」、「第2の」等は、様々なエレメント、構成要素、領域、層及び/又はセクションを説明するために本明細書において使用し得るが、これらのエレメント、構成要素、領域、層及び/又はセクションはこれらの用語によって限定されるべきでないことを理解されたい。これらの用語は、1つのエレメント、構成要素、領域、層、又はセクションを別のエレメント、構成要素、領域、層、又はセクションから識別するためのみに使用される。したがって、実施例の実施形態の教示から逸脱せずに、以下に記述する第1のエレメント、構成要素、領域、層、又はセクションを第2のエレメント、構成要素、領域、層、又はセクションと呼ぶことができる。「下方」、「下」、「下側」、「上」、「上側」等の空間関係の用語は、図中に例示する1つのエレメント又は特長の、別のエレメント又は特長との関係性を説明する際に、説明を容易にするために、本明細書において使用し得る。空間関係の用語には、図中に示した配向に加えて、使用又は稼働中のデバイスの様々な配向が包含されることを意図することが理解されよう。例えば、図中のデバイスが裏返しになっている場合、他のエレメント又は特長の「下」又は「下方」として記載されているエレメントは、他のエレメント又は特長の「上」に配向されていることとなる。したがって、例示的な用語「下」は、上及び下のどちらの配向も包含することができる。デバイスはその他の配向の場合があり(90度回転している又は他の配向にある)、本明細書で使用する空間関係の記述子はそれに応じて解釈される。

【0073】

本明細書で使用する用語「ヒドロゲル」とは、大量の水を吸収することができ、組織工学的足場を形成するための一般的な材料である物理的又は化学的に架橋結合したポリマーネットワークをいう。これらは、調製方法、電荷、並びに機械的及び構造的特徴を含めた様々なパラメータに応じて様々なカテゴリーに分類することができる。本明細書に参照により組み込まれているS. Van Vlierbergheら、「Biopolymer-Based Hydrogels As Scaffolds for Tissue Engineering Applications: A Review」、Biomacromolecules、2011年、12(5)、1387〜1408頁を参照することができる。

【0074】

本明細書で使用する用語「微細製作」とは、微細製作及びナノファブリケーションを含めた、ナノメートル又はマイクロメートルレベルでの製作が含まれる概念である。微細製作の方法は当分野で周知である。本発明において適用可能であり得る特定の微細製作技法の参照には、例えば、そのそれぞれが本明細書に参照により組み込まれている米国特許第8,715,436号、第8,609,013号、第8,445,324号、第8,236,480号、第8,003,300号及びIntroduction to Microfabrication (2004年)、S. Franssila. ISBN 0-470-85106-6が含まれる。

【0075】

本明細書で使用する用語「微細製作した構造」とは、ナノメートル又はマイクロメートルスケールで製作した構造を含めた、二次元又は三次元の空間を占有する1つ又は複数の構造が含まれる概念である。用語「二次元」とは、垂直又は水平空間のどちらかの中の表面上を意味する。

【0076】

本明細書で使用する用語「薬物動態」とは、薬物に対する身体の作用をいう。薬物動態プロセスには、それだけに限定されないが、薬物の吸収、分布、代謝、及び排出が含まれる。

【0077】

本明細書で使用する用語「薬力学」とは、身体に対する薬物の作用をいう。特定のクラスの薬物は身体に対して類似の効果を示すため、薬力学的特性は、薬物又は薬剤がどの群に分類されるかを決定する。

【0078】

本明細書で使用する用語「PDMS」とは、ポリマーであるポリ(ジメチルシロキサン)をいう。ポリジメチルシロキサン(PDMS)は、一般的にシリコンと呼ばれる高分子有機ケイ素化合物の群に属する。PDMSは最も幅広く使用されているケイ素に基づく有機ポリマーであり、その珍しい流体力学的(又は流動)特性が特に知られている。PDMSは光学的に透明であり、一般に不活性、無毒性、及び不燃性である。これはジメチコンとも呼ばれ、数種存在するシリコン油(重合シロキサン)のうちの1つである。

【0079】

本明細書で使用する用語「PMMA」とは、ポリ(メチルメタクリレート)をいう。ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)は、多くの場合軽量又は耐破砕性ガラス代替品として使用される、透明な熱可塑性物質である。厳密にいえばガラスの一種ではないが、この物質は歴史的にアクリルガラスと呼ばれる場合があり、プレキシグラス、アクリライト、ルサイト、及びパースペックスとして知られる。化学的には、これはメチルメタクリレートの合成ポリマーである。PMMAは、極端な強度は必要でない場合の、ポリカーボネート(PC)の経済的な代替品である。更に、PMMAは、ポリカーボネート中に見つかる潜在的に有害なビスフェノール-Aサブユニットを含有しない。改変していないPMMAは、荷重負荷した際、特に衝撃力の下で脆性を示し、慣用の無機ガラスよりも擦り傷ができやすいが、改変したPMMAは擦り傷及び衝撃に対する高い耐性を達成することができる。

【0080】

本明細書で使用する用語「POMac」とは、ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート)(POMaC)又はPOMacプレポリマーをいい、これは1,8-オクタンジオール、クエン酸、及び無水マレイン酸の混合物を含む。その全体で本明細書に参照により組み込まれているTranら、「Synthesis and characterization of a biodegradable elastomer featuring a dual crosslinking mechanism」、Soft Matter、2010年1月1日; 6(11): 2449〜2461頁を参照することができる。

【0081】

「試験薬剤」とは、対象において疾患を診断、治癒、緩和、処置、若しくは予防するその能力について評価する、又は対象の身体の構造若しくは機能を変更することを意図する、任意の物質である。一実施形態では、試験薬剤は、米国食品医薬品化粧品法の第321条(g)(1)の下で定義されている「薬物」であり得る。試験薬剤には、それだけに限定されないが、化学物質、生物剤、タンパク質、ペプチド、抗体、核酸、脂質、多糖、サプリメント、診断剤、及び免疫変調剤が含まれ、「薬理学的薬剤」とも呼ばれ得る。

【0082】

本明細書で使用する用語「毒性」とは、望まれない又は過剰に誇張された薬理学的効果を含めた、試験薬剤、又は他の医薬品と組み合わせた試験薬剤によって引き起こされた、ヒト細胞又は組織に対する全ての望まれない効果として定義される。この文脈において使用される類似の用語は「有害反応」である。

【0083】

本明細書で使用する用語「組織鎖」とは、様々な実施形態、例えば、バイオワイヤ、バイオチューブ、バイオロッド、又はアンギオチューブの実施形態において成長チャンバー等に最初に播種することによって形成される三次元組織培養物をいい、成長チャンバーは、組織鎖を成長させるのに十分な、1つ又は複数の吊り下げられた成長表面、例えば、ワイヤ、チューブを含む。組織鎖は、単一の成長表面、例えばポリマーワイヤ若しくはチューブの周りに成長する若しくは形成させることができるか、又は、組織鎖は、例えばバイオロッド実施形態のように、1つ若しくは複数の成長エレメントの間で成長することができる。

【0084】

本明細書において、「調整可能な」ポリマー、例えばPOMacに関連して使用する用語「調整可能性」とは、生じるポリマー生成物が、弾性、剛性、及び/若しくは反応性、又は他の特性等の、様々な機械的及び/又は物理的特性を有するように形成されることを可能にする様式でポリマーの重合プロセスを調節する能力をいう。この概念は、本発明のデバイスの様々な構成要素、例えば、ポリマーワイヤ、足場、足場層、及び他の構成要素を形成するために、バイオワイヤ、バイオチューブ、バイオロッド、アンギオチップ、及びアンギオチューブの実施形態を含めた本発明の様々な実施形態/デバイスにおいて有利に使用し得る、POMac等の特定のポリマーの文脈において言及する。POMac等の調整可能なポリマーは、例えば、(a)UV架橋結合の度合若しくは量、又は(b)ポリマーを形成するプレポリマー単位の比、例えば、POMacの場合は1,8-オクタンジオール、クエン酸、及び無水マレイン酸の比を調節することによって、調節可能又は「調整可能」な特性を有し得る。更に、アンギオチップの実施形態等の特定の実施形態は、様々な大きさの細孔を有するように形成されたポリマー足場を含む。細孔の制御形成も調整可能性の側面としてみなすことができ、具体的には、本明細書に例示するように、孔径は、UV架橋結合段階中に様々な量のポリエチレングリコールジメチルエーテル(PEGDME)又は均等物を含めることによって制御することができ、ここで、PEGDMEは架橋結合ネットワークを形成するためのスペーサーとして作用し、それによって様々な大きさの細孔を与える。

【0085】

組織培養デバイス
本発明は、天然の組織の天然の生理、組織構築、血管構造、及び他の特性を正確に模倣する三次元の生体組織を作製及び使用するための、様々な組織培養系を企図する。模倣織には、それだけに限定されないが、心臓、肝臓、神経、血管、腎臓、及び筋肉組織が含まれ得る。この方法、組成物、及びデバイスは、薬物試験、組織修復及び/又は処置、並びに再生医療を含めた様々な適用において使用し得る。本発明の組織培養デバイスは、特に、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む方法において使用することができる。

【0086】

一態様では、本開示は、構築的及び電気的合図を組み合わせて、三次元の(3D)心組織又は他の収縮組織の成熟をもたらす微小環境を生じ得るバイオリアクター系を提供する。また、本開示は、開示したデバイスを製作するため、開示したデバイスを使用して組織を培養するため、並びにその結果生じる組織を移植及び他の適用に使用するための方法及び技法も提供する。

【0087】

別の態様は、細胞を、ヒドロゲル、例えばコラーゲンゲル中で、足場(例えば鋳型縫合糸)の周りに、バイオリアクターチャネル又はチャンバー(例えば微細製作したウェル)内に播種する、バイオリアクター系に関する。この例において、種細胞(特に、心細胞等、細胞が電気的特徴を有する場合)を、特定の時点での特定の頻度の刺激(例えば数日間にわたる漸進的な頻度の増加)を定義する定義済みのレジメンに従った電場刺激に供することができる。成熟と一貫して、生じた組織(例えば心組織)は、顕著な度合の超微細構造的構成、改善された伝導速度、並びに増強されたCa2+処理及び電気生理学的特性を示す。

【0088】

他の態様では、管腔(例えば、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブ鋳型等のチューブ鋳型)を有する灌流可能な足場がバイオリアクターチャネル又はチャンバー(例えば微細製作したバイオリアクターチャネル)内に吊り下げられている、灌流可能なバイオリアクター系を生じ得る。足場は、細胞が整列して伸長するためのガイダンスを提供し得る。そのようなデバイスの、薬物試験における実行可能性を実証するために、一酸化窒素(NO)を細胞培養チャネル中に供給して、心組織内の心筋細胞に生化学的刺激をもたらすことができる。灌流したニトロプルシドナトリウム(SNP)溶液からNOを放出させ、足場の管腔から組織培養物へと灌流させて(例えば、NOはチューブ壁を通る)、心筋細胞を有する組織空間に達成させる。また、開示したバイオリアクターデバイスの一例は電気刺激と一体化していることもでき、これは、例えば心筋細胞の表現型を更に改善させ得る。

【0089】

他の態様では、本開示は、培養した組織の収縮力の測定を可能にするデバイスを提供する。一部の例では、デバイスはマルチウェルの立体配置を有していてよく(例えば、96ウェルのプレートとして構成されていていよい)、これにより、デバイスが薬物スクリーニング及び/又は非侵襲性オンライン機能モニタリングに匹敵することが可能となり得る。

【0090】

更に他の態様では、本開示は、微小流体組織を作製するためのハイブリッド手法を提供する。そのような手法には、一体型の血管構造(たとえは生分解性エラストマー、(ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート)(POMaC))から構成される)に機械的支持体を提供するために、薄いチャネル壁を有する3-Dの分枝状マイクロチャネルネットワークを有するデバイスの一例を提供することが含まれ得る。心細胞が水性マトリックスを再モデリングし、3-Dネットワークの一体型の血管構造の周りに圧縮されて、生理的細胞密度を有する、巨視的に収縮性の血管新生した心筋を形成し得るように、種細胞(例えば心細胞)を包埋したヒドロゲル(例えばコラーゲンに基づくヒドロゲル)をネットワークの周りに投じ得る。生じる分枝状の組織、又は分枝状の透過性ポリマー足場を単独で移植に使用し得る。

【0091】

更に他の態様では、開示したバイオリアクター系は、天然の組織構築の複雑さに類似している、又はそれをin vitroで再現しており、したがって、培養した細胞が、それらがin vivoでとると想定される構造をとることが可能となり得る。この構造を再現することは、細胞が成熟し、それらがin vivoで有するであろう機能と類似のものを装うことを可能にし得る。様々な例では、開示したデバイスは、数ある中でとりわけ、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等の筋肉細胞、並びにニューロン等の興奮性組織及び肝細胞等の血管に富んだ構造を必要とし得る細胞の培養に適切であり得る。様々な例では、開示したデバイスは、数ある適用の中でとりわけ、in vitroでの薬物試験、いくつかの異なる区画を有する人体チップ(human-on-a-chip)の構築、並びに動物又はヒト患者内への直接吻合及び/又は移植に適切であり得る。移植には、透過性ポリマー足場を単独で、数ある中でとりわけ、外科的カフ、バイパス移植片、瘻孔、又は動脈-心室シャントとして使用することが含まれ得る。また、培養した組織を、直接吻合あり(例えば動脈-心室シャントの形態で)又は直接吻合なしで、所望の標的組織の位置に移植することも可能であり得る。

【0092】

以下、本開示の例示的な態様を詳細に言及する。具体的には、以下の実施例は、バイオワイヤ系(実施例1、シングルワイヤの組織培養実施形態)、バイオチューブ系(実施例2、灌流可能なワイヤの組織培養実施形態)、バイオロッド/バイオワイヤII系(実施例3、収縮力の組織培養実施形態)、バイオブランチ/アンギオチップ系(実施例4、血管新生した組織培養実施形態)、及びアンギオチューブ系(実施例5、灌流可能な収縮力の組織培養実施形態)と呼び得る本開示の5つの例示的な態様を開示する。本開示を例示的な態様と併せて説明するが、本開示をこれらの態様に限定することを意図しないことを理解されたい。それとは反対に、代替物、改変、実施形態の組合せ、及び均等物を、本発明の精神及び範囲内に含まれ得るものとして網羅することを意図する。

【0093】

バイオワイヤ系
本明細書で使用し得る、本開示のバイオリアクター系の第1の態様は、「バイオワイヤ系又はデバイス」と呼ぶことができ、本明細書に記載の特長及び成分を含むバイオリアクター系をいうことを意図する。本発明のバイオワイヤ系において形成される細胞培養物を「バイオワイヤ」と呼び得る。本明細書におけるバイオワイヤ系の説明は、本開示をこれらの態様又は任意の特定の実施形態に限定することを意図しないことを理解されたい。それとは反対に、代替物、改変、実施形態の組合せ、及び均等物を、本発明の精神及び範囲内に含まれ得るものとして網羅することを意図する。

【0094】

第1の態様では、本開示は、ウェル又はチャネルを有するバイオリアクターと、ウェル又はチャネルを横断して支えられている又は吊り下げられている長手足場、縫合糸、又は他の細胞成長エレメントとを含むバイオリアクター系に関する。ウェル又はチャネルは、その中に播種された細胞、並びに増殖培地及び/又は栄養素及び/又は因子を受け入れるように構成されている。細胞は、播種された後に培養されて、組織培養物を形成し、好ましくは特定の実施形態では、長手足場、縫合糸、又は他の細胞成長エレメント上、その周囲、その上方に含有される、及び/又はそれと一体化している三次元組織鎖を形成する。

【0095】

第1の態様の特定の実施形態では、長手足場、縫合糸、又は他の細胞成長エレメントは、ウェル又はチャネルの底部表面から離れるように持ち上げられている。

【0096】

第1の態様の様々な実施形態では、長手足場、縫合糸、又は他の細胞成長エレメントは任意の適切な材料であり得、これには、コラーゲン及びコラーゲン誘導体、天然の縫合材料(例えば動物の腸管)、セルロース及びセルロース誘導体、プロテオグリカン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニン等の天然材料、並びに様々なポリマー及びナノ材料を含めた合成材料が含まれ得る。

【0097】

第1の態様の特定の実施形態では、当業者には、本発明の足場において使用するための生体材料として適切な材料を選択するための基準が理解されるであろう。そのような選択肢は、その材料化学、分子量、溶解度、形状及び構造、親水性/疎水性、潤滑性、表面エネルギー、吸水、分解、並びに腐食機構が含まれ得る様々なパラメータに基づくことができる。

【0098】

第1の態様の特定の実施形態では、本発明の足場はポリマー足場であり得る。そのような足場は、一般に、高い表面積対体積率、非常に小さな孔径を有する高い空隙率、生物分解、及び機械的特性等のそのユニークな特性が原因で高い注目を集めている。これらは、生体適合性、化学の多用途性、並びに組織工学及び臓器置換の適用において顕著である生物学的特性という明確な利点を提供する。

【0099】

足場材料は、合成又は生物学的、分解性又は非分解性であり得る。ポリマーの特性は、それを構成する高分子の組成、構造、及び配置に依存する。これは、その構造的、化学的、及び生物学的特徴に関して、様々な種類、例えば、セラミック、ガラス、ポリマー等へと分類することができる。天然に存在するポリマー、合成生分解性ポリマー、及び合成非生分解性ポリマーは全て、本発明の足場を形成するためのポリマーとして使用することができる。

【0100】

天然ポリマーを、本明細書に記載したバイオリアクター系の足場又は細胞成長基質として使用できることを理解されたい。天然材料は、生物活性特性のおかげで、潜在的に細胞とより良好に相互作用することができ、それにより、これらが本明細書に記載の生物系において細胞の性能を増強させることが可能となる。天然ポリマーは、タンパク質(絹、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、エラスチン、ケラチン、アクチン、及びミオシン)、多糖(セルロース、アミロース、デキストラン、キチン、及びグリコサミノグリカン)、若しくはポリヌクレオチド(DNA、RNA)等、又はこれらの物質の組合せとして分類することができる。

【0101】

また、本発明のバイオリアクター系において使用する足場には合成生体材料も含まれ得、これらは構造の回復及び損傷組織又は患部組織の機能を促進し得る。合成ポリマーは、その特性(例えば、空隙率、分解時間、及び機械的特徴)を特定の適用のためにあつらえることができるため、生物医学分野において非常に有用である。合成ポリマーは、多くの場合、生物学的足場よりも安価であり、大量かつ均一に生成することができ、長い保管寿命を有する。多くの市販の合成ポリマーは、生体組織のものに匹敵する物理化学的及び機械的特性を示す。合成ポリマーは生分解性ポリマーの最大の群を表し、これらは制御された条件下で生成することができる。これらは、一般に、引張力、弾性係数、及び分解速度等の、予測可能かつ再現可能な機械的及び物理的特性を示す。PLA、PGA、及びPLGAコポリマーは、組織工学において最も一般的に使用される合成ポリマーの一部である。PHAは微生物ポリエステルのクラスに属し、組織工学における適用が次第に検討されている。これらの合成ポリマーは全て本明細書に企図される。

【0102】

更に、本開示の第1の態様のバイオリアクター系は、Rossoら、「Smart materials as scaffolds for tissue engineering」、J Cell Physiol.、2006年12月;209(3):1054頁に開示されているもの等の、半合成のものも使用し得る。そのような足場は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的なオリゴペプチド切断配列、インテグリン結合ドメイン、成長因子、抗トロンビン配列、プラスミン分解部位、及び形態発生タンパク質を含有し得る。そのような半合成材料は、合成材料(例えば、加工性、機械的強度)並びに天然材料(例えば、特定の細胞の認識、細胞侵入、及び分化/増殖シグナルを供給する能力)の両方によって提供される利点を有する「知的な」半合成生体材料を与えることを目的とする。その特徴のおかげで、これらの半合成生体材料は、本明細書に記載の足場の材料源として役立つことが臨床的に期待されている、新規かつ多用途のバイオミメティックハイブリッド材料のクラスを表す。

【0103】

参照点として、以下のポリマー及び材料が、本明細書に記載のバイオリアクターにおいて使用することが企図される。
PU:ポリウレタン、PS:ポリスルホン、CP:リン酸カルシウム、
HA:ヒアルロン酸、PP:ポリプロピレン、BG:生物活性ガラス、ECM:細胞外基質、
PVA:ポリビニルアルコール、PGA:ポリグリコリド、PLA:ポリ乳酸、PPF:ポリ(プロピレンフマレート)、
PCA:ポリシアノアクリレート、PCL:ポリ(ε-カプロラクトン)、
PDO:ポリジオキサノン、PHA:ポリヒドロキシアルカノエート、
POE:ポリ(オルトエステル)、
PEE:ポリ(エーテルエステル)、
PEO:ポリ(酸化エチレン)、
PBT:ポリブチレンテレフタレート、
HAP:ヒドロキシアパタイト、
TCP:リン酸三カルシウム、
PEG:ポリ(エチレングリコール)、
PEU:ポリ(エステルウレタン)、
PAA:ポリ(アクリル酸)、
LDI:リシンジイソシアネート、
BCP:二相性リン酸カルシウム、
PAam:ポリアクリルアミド、
PMMA:ポリメチルメタクリレート、
PLLA:ポリ(L-乳酸)、
PLGA:ポリ(l-ラクチド-co-グリコリド)、
PTMC:ポリ(トリメチレンカーボネート)、
PDMS:ポリジメチルシロキサン、
PTFE:ポリテトラフルオロエチレン、
PEVA:ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)、
PGCL:ポリ(グリコリド-co-ε-カプロラクトン)、
PLCL:ポリ(l-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PDLLA:ポリ(DL-ラクチド)、
PLDLA:ポリ-L/D-ラクチド、
PLAGA:ポリ(乳酸-グリコール酸)、
PHBHV:ポリ(3-ヒドロキシブチレート)3-ヒドロキシバレレート、
PCLTMC:ポリ(カプロラクトン-co-トリメチレンカーボネート)、
PNIPAAm:ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、
PDMAEM:ポリ(ジメチルアミノエチルメタクリレート)塩酸塩、
PDLLA-CL:ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PLLA-CL:ポリ(l-ラクチド-co-ε-カプロラクトン)、及び
TCP:リン酸三カルシウム。
POMac。

【0104】

特定の実施形態では、本明細書に記載の足場は、ポリ(ジメチルシロキサン(PDMS))、ポリ(メチルメタクリレート(PMMA))、ポリスチレン、若しくはポリスチレン、又はその組合せから作製し得る。足場は生分解性材料から作製し得る。他の適切な材料には、数ある中でとりわけ、ポリ(セバシン酸グリセロール)、クエン酸を含まないPOMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン及びそのコポリマー、絹、微細構造、ナノファブリケーション材料、並びに/又はナノロッド若しくは量子ドット等のナノ構造でドーピングされている材料が含まれ得る。任意選択で、特定の実施形態では、足場材料は、は、水並びにタンパク質、薬物、栄養素、及び代謝老廃物を含めた分子の交換及び/又は通過を可能にするために灌流可能であり得る。

【0105】

当業者には、組織工学的足場の作製及び使用に関して最新技術の入手可能な資料を参照することができ、具体的には、Dhandayuthapaniら、「Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science、第2011巻(2011年)、1〜19頁に記載の足場材料を参照できることが理解されよう。

【0106】

ウェル又はチャネルの形状は任意の特定の様式に限定されず、正方形、長方形、円形、卵型、横長、三角形、又は形状の任意の組合せであり得る。また、ウェル又はチャネルの他の寸法も、任意の適切な様式で変動し得る。例えば、チャネルの深さ、壁の高さ、及びチャネルの長さ、及びチャネルの全体的な体積は、任意の適切な方法で変動させ得る。

【0107】

例えば、チャネルの長さ、高さ、及び幅は、約0.1〜1mm、若しくは約0.2〜2mm、若しくは約0.3〜3mm、若しくは約0.4〜4mm、若しくは約0.5〜5mm、若しくは約0.6〜6mm、若しくは約0.7〜7mm、若しくは約0.8〜8mm、若しくは約0.9〜9mm、若しくは約1〜10mm、又はそれ以上であり得る。

【0108】

また、チャネルの表面を、化学修飾(例えば、リガンド、帯電物質、結合剤、成長因子、抗生物質、抗真菌剤等)、又は物理的修飾(例えば、スパイク、曲線部分、折り畳み、細孔、不均一部分、若しくは様々な形状及びトポグラフィー等)を含めた、組織培養プロセスを促進し得る任意の適切な表面処理を用いて修飾してもよい。

【0109】

第1の態様の様々な実施形態では、本明細書に開示する組織培養系において播種及び培養し得る細胞には、それだけに限定されないが、心細胞、肝細胞、腎細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、又はそのような組織の組合せが含まれ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示する組織培養系は、心組織、肝組織、又は腎組織を成長させるために適している。特定の実施形態では、本明細書に記載の系において形成された組織は三次元組織である。

【0110】

第1の態様の様々な他の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクター系を、成熟組織型、例えば、成熟心組織、肝組織、又は腎組織へと発生することができる幹細胞又は他の前駆細胞を用いて播種し得る。幹細胞には、それだけに限定されないが、胚性幹細胞及び成体幹細胞が含まれ得る。更に、全能性/万能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、少能性細胞、又は単能性細胞(例えば前駆細胞)を含めて、本明細書に記載したデバイスを用いて使用することが企図される幹細胞は、任意の度合の分化能を有し得る。

【0111】

心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する実施形態では、本明細書に記載のバイオリアクター系には、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、チャネル(並びにチャネル内で足場上及びその周りで成長させた後に生じる組織鎖)の長手方向軸に概して平行な方向、又はチャネル(及び生じる組織鎖)の長手方向軸に概して垂直な方向である。しかし、電界の配向は限定されず、電極の位置決めは、適切な電界を生じることができるような任意の適切な様式であり得る。特定の実施形態、例えば心細胞では、電界は、細胞が成熟して実際の組織、例えば心組織の生理的及び電気的特性をより厳密に模倣する組織を形成することを促進する。

【0112】

第1の態様の特定の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクターは、複数の組織鎖の成長、試験、測定、及び評価等を同時の様式で行い得るように、複数の個々のバイオリアクター、例えば、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、及び1536ウェルのプレート等のマルチウェルプレートの様式で構築し得る。

【0113】

第1の態様の更に別の実施形態では、本開示は、それだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)対象に対する薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む様々な適用において本開示の三次元組織構築物、デバイス、及び/又は系を使用する方法に関する。

【0114】

また、バイオワイヤ系は、ヒドロゲルを用いて、又はそれが含まれるように形成し得る。ヒドロゲルとは、大量の水を吸収することができる、物理的又は化学的に架橋結合したポリマーのネットワークである。これらは、調製方法、電荷、並びに機械的及び構造的特徴を含めた様々なパラメータに応じて様々なカテゴリーに分類することができる。ヒドロゲルは、多くの組織の細胞外基質に構造的に類似しており、多くの場合は比較的緩和な条件下で加工することができ、最小限に侵襲性の様式で送達し得るため、魅力的な足場材料である。その結果、ヒドロゲルを本明細書において足場材料として利用することができる。ヒドロゲルには、数ある材料の中でとりわけ、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、及び大量の親水性基を有するコポリマーが含まれ得る。天然ヒドロゲル材料には、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、及び他の天然由来のポリマーが含まれる。

【0115】

バイオチューブ系
本明細書で使用し得る、本開示のバイオリアクター系の第2の態様は、「バイオチューブ系又はデバイス」と呼ぶことができ、本明細書に記載の特長及び成分を含むバイオリアクター系をいうことを意図する。本開示のバイオチューブ系において形成される細胞培養物を「バイオチューブ」と呼び得る。本明細書におけるバイオチューブ系の説明は、本開示をこれらの態様又は任意の特定の実施形態に限定することを意図しないことを理解されたい。それとは反対に、代替物、改変、実施形態の組合せ、及び均等物を、本発明の精神及び範囲内に含まれ得るものとして網羅することを意図する。

【0116】

第2の態様では、本開示は、灌流可能な管腔を有する組織培養物、例えば三次元組織鎖を成長させるためのバイオリアクター系に関する。バイオリアクター系には、細胞を播種するのに適したウェル又はチャネルと、1つ又は複数の管腔を有し、ウェル又はチャネルの上方に、例えばウェル又はチャネルの長手方向軸に沿って支えられている又は吊り下げられている、灌流可能な足場とが含まれる。細胞がウェル又はチャネル内に、細胞の培養に適した適切な増殖培地、成長因子、及び他の栄養素と共に播種された後、細胞は成長して、灌流可能な足場を取り囲む及び/又はそれと一体化した組織鎖を形成する。使用において、栄養素及び成長因子並びに試験薬剤(例えば、薬物、タンパク質、毒素等)は、そのような物質を送達するための手段と一体化している灌流可能な管腔(例えば、チューブ又は血管を介して管腔に接続しているリザーバーエレメント)を介して組織鎖に送達し得る。更に、様々な実施形態では、バイオリアクター系には、灌流可能な管腔から出る通路、例えば、排出物及び他の代謝産物が組織鎖から灌流可能な管腔内へと拡散されて端末リザーバーを通って出ることを可能にする、排出管又は他の端末リザーバーも含まれ得る。心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する様々な実施形態では、バイオリアクターは、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、灌流可能な管腔エレメントの全長に沿って形成される組織鎖の長手方向軸に平行な方向である。

【0117】

第2の態様の特定の実施形態では、灌流可能な長手足場、縫合糸、又は他の細胞成長エレメントは、ウェル又はチャネルの底部表面から離れるように持ち上げられている。

【0118】

第2の態様の様々な実施形態では、灌流可能な長手足場、縫合糸、又は他の細胞成長エレメントは任意の適切な材料であり得、これには、コラーゲン及びコラーゲン誘導体、天然の縫合材料(例えば動物の腸管)、セルロース及びセルロース誘導体、プロテオグリカン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニン等の天然材料、並びに様々なポリマー及びナノ材料を含めた合成材料(例えばPOMac)が含まれ得る。

【0119】

第2の態様の特定の実施形態では、当業者には、本発明の灌流可能な足場において使用するための生体材料として適切な材料を選択するための基準が理解されるであろう。そのような選択肢は、その材料化学、分子量、溶解度、形状及び構造、親水性/疎水性、潤滑性、表面エネルギー、吸水、分解、並びに腐食機構が含まれ得る様々なパラメータに基づくことができる。

【0120】

第2の態様の特定の実施形態では、本発明の灌流可能な足場はポリマー足場であり得る。そのような足場は、一般に、高い表面積対体積率、非常に小さな孔径を有する高い空隙率、生物分解、及び機械的特性等のそのユニークな特性が原因で高い注目を集めている。これらは、生体適合性、化学の多用途性、並びに組織工学及び臓器置換の適用において顕著である生物学的特性という明確な利点を提供する。

【0121】

灌流可能な足場材料は、合成又は生物学的、分解性又は非分解性であり得る。ポリマーの特性は、それを構成する高分子の組成、構造、及び配置に依存する。これは、その構造的、化学的、及び生物学的特徴に関して、様々な種類、例えば、セラミック、ガラス、ポリマー等へと分類することができる。天然に存在するポリマー、合成生分解性ポリマー、及び合成非生分解性ポリマーは全て、本発明の足場を形成するためのポリマーとして使用することができる。

【0122】

天然ポリマーを、本明細書に記載したバイオリアクター系の灌流可能な足場又は細胞成長基質として使用できることを理解されたい。天然材料は、生物活性特性のおかげで、潜在的に細胞とより良好に相互作用することができ、それにより、これらが本明細書に記載の生物系において細胞の性能を増強させることが可能となる。天然ポリマーは、タンパク質(絹、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、エラスチン、ケラチン、アクチン、及びミオシン)、多糖(セルロース、アミロース、デキストラン、キチン、及びグリコサミノグリカン)、若しくはポリヌクレオチド(DNA、RNA)等、又はこれらの物質の組合せとして分類することができる。

【0123】

また、本発明のバイオリアクター系において使用する灌流可能な足場には合成生体材料も含まれ得、これらは構造の回復及び損傷組織又は患部組織の機能を促進し得る。合成ポリマーは、その特性(例えば、空隙率、分解時間、及び機械的特徴)を特定の適用のためにあつらえることができるため、生物医学分野において非常に有用である。合成ポリマーは、多くの場合、生物学的足場よりも安価であり、大量かつ均一に生成することができ、長い保管寿命を有する。多くの市販の合成ポリマーは、生体組織のものに匹敵する物理化学的及び機械的特性を示す。合成ポリマーは生分解性ポリマーの最大の群を表し、これらは制御された条件下で生成することができる。これらは、一般に、引張力、弾性係数、及び分解速度等の、予測可能かつ再現可能な機械的及び物理的特性を示す。PLA、PGA、及びPLGAコポリマーは、組織工学において最も一般的に使用される合成ポリマーの一部である。PHAは微生物ポリエステルのクラスに属し、組織工学における適用が次第に検討されている。これらの合成ポリマーは全て本明細書に企図される。

【0124】

更に、本開示の第2の態様のバイオリアクター系は、Rossoら、「Smart materials as scaffolds for tissue engineering」、J Cell Physiol.、2006年12月;209(3):1054頁に開示されているもの等の、半合成のものも使用し得る。そのような足場は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的なオリゴペプチド切断配列、インテグリン結合ドメイン、成長因子、抗トロンビン配列、プラスミン分解部位、及び形態発生タンパク質を含有し得る。そのような半合成材料は、合成材料(例えば、加工性、機械的強度)並びに天然材料(例えば、特定の細胞の認識、細胞侵入、及び分化/増殖シグナルを供給する能力)の両方によって提供される利点を有する「知的な」半合成生体材料を与えることを目的とする。その特徴のおかげで、これらの半合成生体材料は、本明細書に記載の足場の材料源として役立つことが臨床的に期待されている、新規かつ多用途のバイオミメティックハイブリッド材料のクラスを表す。

【0125】

参照点として、以下のポリマー及び材料が、本明細書に記載の第2の態様のバイオリアクターにおいて使用することが企図される。
PU:ポリウレタン、PS:ポリスルホン、CP:リン酸カルシウム、
HA:ヒアルロン酸、PP:ポリプロピレン、BG:生物活性ガラス、ECM:細胞外基質、
PVA:ポリビニルアルコール、PGA:ポリグリコリド、PLA:ポリ乳酸、PPF:ポリ(プロピレンフマレート)、
PCA:ポリシアノアクリレート、PCL:ポリ(ε-カプロラクトン)、
PDO:ポリジオキサノン、PHA:ポリヒドロキシアルカノエート、
POE:ポリ(オルトエステル)、
PEE:ポリ(エーテルエステル)、
PEO:ポリ(酸化エチレン)、
PBT:ポリブチレンテレフタレート、
HAP:ヒドロキシアパタイト、
TCP:リン酸三カルシウム、
PEG:ポリ(エチレングリコール)、
PEU:ポリ(エステルウレタン)、
PAA:ポリ(アクリル酸)、
LDI:リシンジイソシアネート、
BCP:二相性リン酸カルシウム、
PAam:ポリアクリルアミド、
PMMA:ポリメチルメタクリレート、
PLLA:ポリ(L-乳酸)、
PLGA:ポリ(l-ラクチド-co-グリコリド)、
PTMC:ポリ(トリメチレンカーボネート)、
PDMS:ポリジメチルシロキサン、
PTFE:ポリテトラフルオロエチレン、
PEVA:ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)、
PGCL:ポリ(グリコリド-co-ε-カプロラクトン)、
PLCL:ポリ(l-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PDLLA:ポリ(DL-ラクチド)、
PLDLA:ポリ-L/D-ラクチド、
PLAGA:ポリ(乳酸-グリコール酸)、
PHBHV:ポリ(3-ヒドロキシブチレート)3-ヒドロキシバレレート、
PCLTMC:ポリ(カプロラクトン-co-トリメチレンカーボネート)、
PNIPAAm:ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、
PDMAEM:ポリ(ジメチルアミノエチルメタクリレート)塩酸塩、
PDLLA-CL:ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PLLA-CL:ポリ(l-ラクチド-co-ε-カプロラクトン)、及び
TCP:リン酸三カルシウム。
POMac。

【0126】

第2の態様の特定の実施形態では、本明細書に記載の灌流可能な足場は、ポリ(ジメチルシロキサン(PDMS))、ポリ(メチルメタクリレート(PMMA))、ポリスチレン、若しくはポリスチレン、又はその組合せから作製し得る。足場は生分解性材料から作製し得る。他の適切な材料には、数ある中でとりわけ、ポリ(セバシン酸グリセロール)、クエン酸を含まないPOMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン及びそのコポリマー、絹、微細構造、ナノファブリケーション材料、並びに/又はナノロッド若しくは量子ドット等のナノ構造でドーピングされている材料が含まれ得る。任意選択で、特定の実施形態では、足場材料は、は、水並びにタンパク質、薬物、栄養素、及び代謝老廃物を含めた分子の交換及び/又は通過を可能にするために灌流可能であり得る。

【0127】

当業者には、組織工学的足場の作製及び使用に関して最新技術の入手可能な資料を参照することができ、具体的には、Dhandayuthapaniら、「Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science、第2011巻(2011年)、1〜19頁に記載の足場材料を参照できることが理解されよう。

【0128】

ウェル又はチャネルの形状は任意の特定の様式に限定されず、正方形、長方形、円形、卵型、横長、三角形、又は形状の任意の組合せであり得る。また、ウェル又はチャネルの他の寸法も、任意の適切な様式で変動し得る。例えば、チャネルの深さ、壁の高さ、及びチャネルの長さ、及びチャネルの全体的な体積は、任意の適切な方法で変動させ得る。

【0129】

例えば、チャネルの長さ、高さ、及び幅は、約0.1〜1mm、若しくは約0.2〜2mm、若しくは約0.3〜3mm、若しくは約0.4〜4mm、若しくは約0.5〜5mm、若しくは約0.6〜6mm、若しくは約0.7〜7mm、若しくは約0.8〜8mm、若しくは約0.9〜9mm、若しくは約1〜10mm、又はそれ以上であり得る。

【0130】

また、チャネルの表面を、化学修飾(例えば、リガンド、帯電物質、結合剤、成長因子、抗生物質、抗真菌剤等)、又は物理的修飾(例えば、スパイク、曲線部分、折り畳み、細孔、不均一部分、若しくは様々な形状及びトポグラフィー等)を含めた、組織培養プロセスを促進し得る任意の適切な表面処理を用いて修飾してもよい。

【0131】

第2の態様の様々な実施形態では、本明細書に開示する組織培養系において播種及び培養し得る細胞には、それだけに限定されないが、心細胞、肝細胞、腎細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、又はそのような組織の組合せが含まれ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示する組織培養系は、心組織、肝組織、又は腎組織を成長させるために適している。特定の実施形態では、本明細書に記載の系において形成された組織は三次元組織である。

【0132】

第2の態様の様々な他の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクター系を、成熟組織型、例えば、成熟心組織、肝組織、又は腎組織へと発生することができる幹細胞又は他の前駆細胞を用いて播種し得る。幹細胞には、それだけに限定されないが、胚性幹細胞及び成体幹細胞が含まれ得る。更に、全能性/万能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、少能性細胞、又は単能性細胞(例えば前駆細胞)を含めて、本明細書に記載したデバイスを用いて使用することが企図される幹細胞は、任意の度合の分化能を有し得る。

【0133】

心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する実施形態では、本明細書に記載のバイオリアクター系には、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、チャネル(並びにチャネル内で足場上及びその周りで成長させた後に生じる組織鎖)の長手方向軸に概して平行な方向、又はチャネル(及び生じる組織鎖)の長手方向軸に概して垂直な方向である。しかし、電界の配向は限定されず、電極の位置決めは、適切な電界を生じることができるような任意の適切な様式であり得る。特定の実施形態、例えば心細胞では、電界は、細胞が成熟して実際の組織、例えば心組織の生理的及び電気的特性をより厳密に模倣する組織を形成することを促進する。

【0134】

第2の態様の特定の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクターは、複数の組織鎖の成長、試験、測定、及び評価等を同時の様式で行い得るように、複数の個々のバイオリアクター、例えば、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、及び1536ウェルのプレート等のマルチウェルプレートの様式で構築し得る。

【0135】

第2の態様の更に別の実施形態では、本開示は、それだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む様々な適用において本開示の三次元組織構築物、デバイス、及び/又は系を使用する方法に関する。

【0136】

特定の実施形態では、長手エレメントは複数の管腔を含み得る。エレメントの厚さ及び/又は直径は、任意の適切な様式で変動し得る。管腔の直径は、例えば、0.1〜5ミクロン、0.2〜10ミクロン、0.3〜15ミクロン、0.4〜20ミクロン、0.5〜30ミクロン、0.5〜50ミクロン、1.0〜100ミクロン、2.0〜200ミクロン、3.0〜500ミクロン、4.0〜800ミクロン、5.0ミクロン〜1ミリメートル、若しくは1〜10ミリメートル、又はそれ以上を含めた、任意の適切な範囲にわたって大きさが変動し得る。管腔は一定の直径を有し得るか、又は、直径は長手エレメントの全長にわたって変動し得る。長手エレメントの表面は、滑らかな表面、粗い表面、棘のある表面等を有することを含めた、任意の適切な特性を有し得る。更に、エレメントは、エレメントと接触する細胞が長手エレメントに接着することを援助し得る、リガンド、抗体、荷電分子、疎水性分子等の追加の成分と共有的又は非供給的にカップリングしていてよい。

【0137】

足場の配向、具体的には灌流可能な長手エレメントの配向は、ウェル内の成長チャンバーの配向に対して変動させ得る。一実施形態では、成長チャンバーは、一般的に長手の成長チャンバーであってよく、長手エレメントの配向に対して概して垂直に配向され得る。別の実施形態では、長手エレメントは、成長チャンバーの配向に対して概して垂直な配向に配向され得る。更に別の実施形態では、長手エレメントは、成長チャンバーの配向に対して一般に平行な配向に配向され得る。更に他の実施形態では、長手エレメントは、成長チャンバーの配向に対して一般に対角の配向に配向され得る。

【0138】

長手エレメントのバイオリアクタープレートのウェルへの付着は、任意の適切な手段、例えば、接着剤、溶接、又は他の機械的手段によるものであり得る。ウェルと長手エレメントとの間の付着点は、秩序的、ランダム、連続的、又は非連続的であり得る。

【0139】

また、特定の実施形態では、長手エレメントは、栄養素、代謝老廃物、タンパク質、又は更には全細胞の通過を許可する、灌流可能な材料も含むことができる。灌流性は、エレメントを形成するために使用する材料の特性としてのものを含めた任意の適切な手段によって、又はエレメントを形成する材料中に1つ若しくは複数の細孔を形成することによって、確立し得る。灌流可能な材料は、栄養素、代謝廃棄物、及び更には全細胞がバイオチューブの管腔とバイオリアクターの成長チャンバーとの間を自由に移動することを可能にする。

【0140】

本開示のバイオリアクターのうちの任意のものの、バイオリアクターの構成要素(例えば、反応器本体、蓋、カバー、成長チャンバー、足場、長手エレメント等)は、ポリ(L-ラクチド)(PLA)等のポリラクトン、ポリ(グリコリド)(PGA)、及びそのコポリマー(PLGA)、PDMS(ポリ(ジメチルシロキサン))、PMMA(ポリ(メチルメタクリレート))、並びにPOMac(ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート、1,8-オクタンジオール、クエン酸、及び無水マレイン酸の混合単位)を含めた生分解性ポリマー等の、様々なポリマー(FDA認可されているものが含まれる)を含めた任意の適切な材料から作製し得る。その全体で本明細書に参照により組み込まれているTranら、「Synthesis and characterization of a biodegradable elastomer featuring a dual crosslinking mechanism」、Soft Matter、2010年1月1日; 6(11): 2449〜2461頁を参照することができる。ポリマーは、任意の適切な天然に存在するポリマー(それだけに限定されないが、セルロース、絹、シェラック、ゴム、若しくはそれらの誘導体等)、又は任意の適切な合成ポリマー(それだけに限定されないが、ナイロン、ポリ塩化ビニル(PVC若しくはビニル)、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、PVB、シリコン、及びそれらの誘導体が含まれる)であり得る。ポリマーは、バイオリアクター内の組織の成長及び/又は維持を促進し得るリガンド、抗体、荷電分子、疎水性分子等の追加の成分を用いて、共有的又は非供給的に修飾し得る。特定の種類のポリマー、その修飾体等は、本明細書に記載のそれぞれの適用に固有の限界物理(critical physical)、質量輸送、及び生物学的設計変数に取り組むために、適切な材料を見つけることに左右されることを理解されたい。

【0141】

また、本明細書に記載のバイオリアクターには、細胞を播種するため、又は足場の構造的成分のためのヒドロゲルも含まれ得る。ヒドロゲルとは、大量の水を吸収することができる、物理的又は化学的に架橋結合したポリマーのネットワークである。これらは、調製方法、電荷、並びに機械的及び構造的特徴を含めた様々なパラメータに応じて様々なカテゴリーに分類することができる。ヒドロゲルは、多くの組織の細胞外基質に構造的に類似しており、多くの場合は比較的緩和な条件下で加工することができ、最小限に侵襲性の様式で送達し得るため、魅力的な足場材料である。その結果、ヒドロゲルを本明細書において足場材料として利用することができる。ヒドロゲルには、数ある材料の中でとりわけ、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、及び大量の親水性基を有するコポリマーが含まれ得る。天然ヒドロゲル材料には、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、及び他の天然由来のポリマーが含まれる。

【0142】

バイオロッド系
本明細書で使用し得る、本開示のバイオリアクター系の第3の態様は、「バイオロッド系又はデバイス」と呼ぶことができ、本明細書に記載の特長及び成分を含むバイオリアクター系をいうことを意図する。本開示のバイオチューブ系において形成される細胞培養物を「バイオロッド」と呼び得る。本明細書におけるバイオチューブ系の説明は、本開示をこれらの態様又は任意の特定の実施形態に限定することを意図しないことを理解されたい。それとは反対に、代替物、改変、実施形態の組合せ、及び均等物を、本発明の精神及び範囲内に含まれ得るものとして網羅することを意図する。

【0143】

第3の態様では、本発明は、収縮力を測定するのに適した組織培養物、例えば三次元組織鎖を成長させるためのバイオリアクター系に関する。本発明のこの態様は、ウェル又はチャネルを有するバイオリアクターと、ウェル又はチャンバー内に配置されており、その間に形成された三次元組織鎖のための少なくとも2つの固着点を形成するように機能する、少なくとも一組の対向する足場エレメント(単一の足場又は別々の足場から形成することができる)とを含むことができる。好ましくは、少なくとも一組の対向する足場エレメントは、ウェル又はチャネルの壁に可逆的に取り付けられているが、ウェル又はチャンバーの底部とエレメントとの間に隙間があるように、その上方に吊り下げられている。第3の態様のバイオリアクターは、2つのそのようなエレメントを有することに限定されず、2つより多く、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、若しくは10個、又はそれより多くのそのようなエレメントが含まれ得る。(a)組織鎖が対向する足場エレメントの組又は複数の組の間に配置され、チャネル又はウェルの上方に吊り下げられているように、対向するエレメントのそれぞれの周りに形成されて、その間で結合される三次元組織鎖を形成する能力が存在する限りは、1つのチャネルあたり任意の数のエレメントを提供し得る。

【0144】

足場エレメントは、好ましくは偏向可能、変形可能、屈曲可能等であり、これらは、足場エレメント上の組織鎖によって発揮された収縮力の測定を可能にするように更に構成されている。

【0145】

第3の態様の好ましい実施形態では、ウェル又はチャネルのそれぞれは、一組(2つ)の対向する足場エレメントを用いて構成されており、好ましくは、単一の足場エレメントは、ウェル又はチャネルの長手方向軸の対向する末端に、又はその付近に配置されている。

【0146】

第3の態様の特定の実施形態では、足場エレメントは、ウェル又はチャネルの底部表面から離れるように持ち上げられている。

【0147】

第3の態様の様々な実施形態では、足場エレメントは任意の適切な材料から作製することができ、これには、コラーゲン及びコラーゲン誘導体、天然の縫合材料(例えば動物の腸管)、セルロース及びセルロース誘導体、プロテオグリカン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニン等の天然材料、並びに様々なポリマー及びナノ材料を含めた合成材料(例えばPOMac)が含まれ得る。

【0148】

第3の態様の特定の実施形態では、当業者には、本発明の足場エレメントにおいて使用するための生体材料として適切な材料を選択するための基準が理解されるであろう。そのような選択肢は、その材料化学、分子量、溶解度、形状及び構造、親水性/疎水性、潤滑性、表面エネルギー、吸水、分解、並びに腐食機構、具体的にはその変形能、柔軟性、及び屈曲性等が含まれ得る様々なパラメータに基づくことができる。

【0149】

第3の態様の特定の実施形態では、足場エレメントはポリマー足場であり得る。そのような足場は、一般に、高い表面積対体積率、非常に小さな孔径を有する高い空隙率、生物分解、及び機械的特性等のそのユニークな特性が原因で高い注目を集めている。これらは、生体適合性、化学の多用途性、並びに組織工学及び臓器置換の適用において顕著である生物学的特性という明確な利点を提供する。

【0150】

足場エレメントは、合成又は生物学的、分解性又は非分解性であり得る。ポリマーの特性は、それを構成する高分子の組成、構造、及び配置に依存する。これは、その構造的、化学的、及び生物学的特徴に関して、様々な種類、例えば、セラミック、ガラス、ポリマー等へと分類することができる。天然に存在するポリマー、合成生分解性ポリマー、及び合成非生分解性ポリマーは全て、本発明の足場を形成するためのポリマーとして使用することができる。

【0151】

天然ポリマーを、本明細書に記載したバイオリアクター系の足場エレメントとして使用できることを理解されたい。天然材料は、生物活性特性のおかげで、潜在的に細胞とより良好に相互作用することができ、それにより、これらが本明細書に記載の生物系において細胞の性能を増強させることが可能となる。天然ポリマーは、タンパク質(絹、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、エラスチン、ケラチン、アクチン、及びミオシン)、多糖(セルロース、アミロース、デキストラン、キチン、及びグリコサミノグリカン)、若しくはポリヌクレオチド(DNA、RNA)等、又はこれらの物質の組合せとして分類することができる。

【0152】

また、本発明のバイオリアクター系において使用する足場エレメントには合成生体材料も含まれ得、これらは構造の回復及び損傷組織又は患部組織の機能を促進し得る。合成ポリマーは、その特性(例えば、空隙率、分解時間、及び機械的特徴)を特定の適用のためにあつらえることができるため、生物医学分野において非常に有用である。合成ポリマーは、多くの場合、生物学的足場よりも安価であり、大量かつ均一に生成することができ、長い保管寿命を有する。多くの市販の合成ポリマーは、生体組織のものに匹敵する物理化学的及び機械的特性を示す。合成ポリマーは生分解性ポリマーの最大の群を表し、これらは制御された条件下で生成することができる。これらは、一般に、引張力、弾性係数、及び分解速度等の、予測可能かつ再現可能な機械的及び物理的特性を示す。PLA、PGA、及びPLGAコポリマーは、組織工学において最も一般的に使用される合成ポリマーの一部である。PHAは微生物ポリエステルのクラスに属し、組織工学における適用が次第に検討されている。これらの合成ポリマーは全て本明細書に企図される。

【0153】

更に、本開示の第3の態様のバイオリアクター系は、Rossoら、「Smart materials as scaffolds for tissue engineering」、J Cell Physiol.、2006年12月;209(3):1054頁に開示されているもの等の、半合成のものも使用し得る。そのような足場は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的なオリゴペプチド切断配列、インテグリン結合ドメイン、成長因子、抗トロンビン配列、プラスミン分解部位、及び形態発生タンパク質を含有し得る。そのような半合成材料は、合成材料(例えば、加工性、機械的強度)並びに天然材料(例えば、特定の細胞の認識、細胞侵入、及び分化/増殖シグナルを供給する能力)の両方によって提供される利点を有する「知的な」半合成生体材料を与えることを目的とする。その特徴のおかげで、これらの半合成生体材料は、本明細書に記載の足場の材料源として役立つことが臨床的に期待されている、新規かつ多用途のバイオミメティックハイブリッド材料のクラスを表す。

【0154】

参照点として、以下のポリマー及び材料が、本明細書に記載の第3の態様のバイオリアクターにおいて使用することが企図される。
PU:ポリウレタン、PS:ポリスルホン、CP:リン酸カルシウム、
HA:ヒアルロン酸、PP:ポリプロピレン、BG:生物活性ガラス、ECM:細胞外基質、
PVA:ポリビニルアルコール、PGA:ポリグリコリド、PLA:ポリ乳酸、PPF:ポリ(プロピレンフマレート)、
PCA:ポリシアノアクリレート、PCL:ポリ(ε-カプロラクトン)、
PDO:ポリジオキサノン、PHA:ポリヒドロキシアルカノエート、
POE:ポリ(オルトエステル)、
PEE:ポリ(エーテルエステル)、
PEO:ポリ(酸化エチレン)、
PBT:ポリブチレンテレフタレート、
HAP:ヒドロキシアパタイト、
TCP:リン酸三カルシウム、
PEG:ポリ(エチレングリコール)、
PEU:ポリ(エステルウレタン)、
PAA:ポリ(アクリル酸)、
LDI:リシンジイソシアネート、
BCP:二相性リン酸カルシウム、
PAam:ポリアクリルアミド、
PMMA:ポリメチルメタクリレート、
PLLA:ポリ(L-乳酸)、
PLGA:ポリ(l-ラクチド-co-グリコリド)、
PTMC:ポリ(トリメチレンカーボネート)、
PDMS:ポリジメチルシロキサン、
PTFE:ポリテトラフルオロエチレン、
PEVA:ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)、
PGCL:ポリ(グリコリド-co-ε-カプロラクトン)、
PLCL:ポリ(l-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PDLLA:ポリ(DL-ラクチド)、
PLDLA:ポリ-L/D-ラクチド、
PLAGA:ポリ(乳酸-グリコール酸)、
PHBHV:ポリ(3-ヒドロキシブチレート)3-ヒドロキシバレレート、
PCLTMC:ポリ(カプロラクトン-co-トリメチレンカーボネート)、
PNIPAAm:ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、
PDMAEM:ポリ(ジメチルアミノエチルメタクリレート)塩酸塩、
PDLLA-CL:ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PLLA-CL:ポリ(l-ラクチド-co-ε-カプロラクトン)、及び
TCP:リン酸三カルシウム。
POMac。

【0155】

第3の態様の特定の実施形態では、本明細書に記載の足場エレメントは、ポリ(ジメチルシロキサン(PDMS))、ポリ(メチルメタクリレート(PMMA))、ポリスチレン、若しくはポリスチレン、又はその組合せから作製し得る。足場は生分解性材料から作製し得る。他の適切な材料には、数ある中でとりわけ、ポリ(セバシン酸グリセロール)、クエン酸を含まないPOMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン及びそのコポリマー、絹、微細構造、ナノファブリケーション材料、並びに/又はナノロッド若しくは量子ドット等のナノ構造でドーピングされている材料が含まれ得る。任意選択で、特定の実施形態では、足場材料は、は、水並びにタンパク質、薬物、栄養素、及び代謝老廃物を含めた分子の交換及び/又は通過を可能にするために灌流可能であり得る。

【0156】

当業者には、組織工学的足場の作製及び使用に関して最新技術の入手可能な資料を参照することができ、具体的には、Dhandayuthapaniら、「Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science、第2011巻(2011年)、1〜19頁に記載の足場材料を参照できることが理解されよう。

【0157】

足場エレメントが、その間で接続された組織鎖の収縮作用又は活性に応答して、変形、屈曲、又は他の様式で形状を変化することができ、また、そのような変形、屈曲、又は他の形状の変化を、信頼性をもって測定できる限りは、足場エレメントの形状、厚さ、長さ、配向、及び表面組織分布の特性は、いくつもの適切な様式で変動することができる。

【0158】

ウェル又はチャネルの形状は任意の特定の様式に限定されず、正方形、長方形、円形、卵型、横長、三角形、又は形状の任意の組合せであり得る。また、ウェル又はチャネルの他の寸法も、任意の適切な様式で変動し得る。例えば、チャネルの深さ、壁の高さ、及びチャネルの長さ、及びチャネルの全体的な体積は、任意の適切な方法で変動させ得る。

【0159】

例えば、チャネルの長さ、高さ、及び幅は、約0.1〜1mm、若しくは約0.2〜2mm、若しくは約0.3〜3mm、若しくは約0.4〜4mm、若しくは約0.5〜5mm、若しくは約0.6〜6mm、若しくは約0.7〜7mm、若しくは約0.8〜8mm、若しくは約0.9〜9mm、若しくは約1〜10mm、又はそれ以上であり得る。

【0160】

また、チャネルの表面を、化学修飾(例えば、リガンド、帯電物質、結合剤、成長因子、抗生物質、抗真菌剤等)、又は物理的修飾(例えば、スパイク、曲線部分、折り畳み、細孔、不均一部分、若しくは様々な形状及びトポグラフィー等)を含めた、組織培養プロセスを促進し得る任意の適切な表面処理を用いて修飾してもよい。

【0161】

第3の態様の様々な実施形態では、本明細書に開示する組織培養系において播種及び培養し得る細胞には、それだけに限定されないが、心細胞、肝細胞、腎細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、又はそのような組織の組合せが含まれ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示する組織培養系は、心組織、肝組織、又は腎組織を成長させるために適している。特定の実施形態では、本明細書に記載の系において形成された組織は三次元組織である。

【0162】

第3の態様の様々な他の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクター系を、成熟組織型、例えば、成熟心組織、肝組織、又は腎組織へと発生することができる幹細胞又は他の前駆細胞を用いて播種し得る。幹細胞には、それだけに限定されないが、胚性幹細胞及び成体幹細胞が含まれ得る。更に、全能性/万能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、少能性細胞、又は単能性細胞(例えば前駆細胞)を含めて、本明細書に記載したデバイスを用いて使用することが企図される幹細胞は、任意の度合の分化能を有し得る。

【0163】

心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する実施形態では、本明細書に記載のバイオリアクター系には、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、チャネル(並びにチャネル内で足場上及びその周りで成長させた後に生じる組織鎖)の長手方向軸に概して平行な方向、又はチャネル(及び生じる組織鎖)の長手方向軸に概して垂直な方向である。しかし、電界の配向は限定されず、電極の位置決めは、適切な電界を生じることができるような任意の適切な様式であり得る。特定の実施形態、例えば心細胞では、電界は、細胞が成熟して実際の組織、例えば心組織の生理的及び電気的特性をより厳密に模倣する組織を形成することを促進する。

【0164】

第3の態様の特定の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクターは、複数の組織鎖の成長、試験、測定、及び評価等を同時の様式で行い得るように、複数の個々のバイオリアクター、例えば、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、及び1536ウェルのプレート等のマルチウェルプレートの様式で構築し得る。

【0165】

第3の態様の更に別の実施形態では、本開示は、それだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む様々な適用において本開示の三次元組織構築物、デバイス、及び/又は系を使用する方法に関する。特に第3の態様に関連して、バイオリアクター系は、組織鎖、例えば心組織鎖の収縮力を測定するために特に使用することができる。そのような測定は、製薬の導入、遺伝子改変、疾患細胞若しくは組織の存在、毒素、又は研究中の組織の生理に影響を与え得る薬剤と併せて実施してもよい。

【0166】

第3の態様のバイオロッド系は、ヒドロゲルを用いて、又はそれが含まれるように形成し得る。ヒドロゲルとは、大量の水を吸収することができる、物理的又は化学的に架橋結合したポリマーのネットワークである。これらは、調製方法、電荷、並びに機械的及び構造的特徴を含めた様々なパラメータに応じて様々なカテゴリーに分類することができる。ヒドロゲルは、多くの組織の細胞外基質に構造的に類似しており、多くの場合は比較的緩和な条件下で加工することができ、最小限に侵襲性の様式で送達し得るため、魅力的な足場材料である。その結果、ヒドロゲルを本明細書において足場材料として利用することができる。ヒドロゲルには、数ある材料の中でとりわけ、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、及び大量の親水性基を有するコポリマーが含まれ得る。天然ヒドロゲル材料には、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、及び他の天然由来のポリマーが含まれる。

【0167】

アンギオチップ系
本明細書で使用し得る、本開示のバイオリアクター系の第4の態様は、「アンギオチップ系又はデバイス」と呼ぶことができ、本明細書に記載の特長及び成分を含むバイオリアクター系をいうことを意図する。本開示のアンギオチップ系において形成される細胞培養物を「アンギオチップ又はバイオブランチ」と呼び得る。本明細書におけるバイオチューブ系の説明は、本開示をこれらの態様又は任意の特定の実施形態に限定することを意図しないことを理解されたい。それとは反対に、代替物、改変、実施形態の組合せ、及び均等物を、本発明の精神及び範囲内に含まれ得るものとして網羅することを意図する。

【0168】

第4の態様では、本発明は、1つ又は複数の管腔通路(例えば血管新生した三次元組織構造を模倣するもの)がその中に一体化された、三次元の分枝状組織足場又はマトリックスを含む三次元組織を成長させるためのバイオリアクター系に関する。三次元の足場又はマトリックスは、播種した細胞を成長させるための第1の部分と、第1の部分を通る相互接続したチャネルを提供するための第2の部分とを含有し得る。好ましくは、相互接続したチャネルは、第1の部分に関して灌流可能であり、生体血管構造を模倣するように構成されていてもよい。第1の部分は1つ又は複数のオープン領域又はチャンバーを含有して、それにより細胞及び/又は組織を成長させるためのチャンバーのオープンネットワークを提供することができる。また、三次元の足場又はマトリックスは、全ての構成要素の間に細孔又はオープン接続を含有していてもよい。例えば、オープン細孔又は接続は、細胞を成長させるためのチャンバーのオープンネットワークの間に位置することができる。更に、オープン細孔又は接続は、1つ又は複数の管腔通路と共に配置する又はそれと一体化させることができる。オープン細孔又は接続は、バイオリアクター系を通る細胞、培地、成長因子、栄養素、及び排出物の動きを容易にする。バイオリアクターは、バイオリアクター系を横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは一方向である。

【0169】

第4の態様の様々な実施形態では、三次元の足場又はマトリックスは任意の適切な材料から作製することができ、これには、コラーゲン及びコラーゲン誘導体、天然の縫合材料(例えば動物の腸管)、セルロース及びセルロース誘導体、プロテオグリカン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニン等の天然材料、並びに様々なポリマー及びナノ材料を含めた合成材料(例えばPOMac)が含まれ得る。

【0170】

第4の態様の特定の実施形態では、当業者には、三次元の足場又はマトリックスにおいて使用するための生体材料として適切な材料を選択するための基準が理解されるであろう。そのような選択肢は、その材料化学、分子量、溶解度、形状及び構造、親水性/疎水性、潤滑性、表面エネルギー、吸水、分解、並びに腐食機構、具体的にはその変形能、柔軟性、及び屈曲性等が含まれ得る様々なパラメータに基づくことができる。

【0171】

第4の態様の特定の実施形態では、三次元の足場又はマトリックスは、ポリマー足場から作製することができる。そのような足場は、一般に、高い表面積対体積率、非常に小さな孔径を有する高い空隙率、生物分解、及び機械的特性等のそのユニークな特性が原因で高い注目を集めている。これらは、生体適合性、化学の多用途性、並びに組織工学及び臓器置換の適用において顕著である生物学的特性という明確な利点を提供する。

【0172】

三次元の足場又はマトリックスは、合成又は生物学的、分解性又は非分解性であり得る。ポリマーの特性は、それを構成する高分子の組成、構造、及び配置に依存する。これは、その構造的、化学的、及び生物学的特徴に関して、様々な種類、例えば、セラミック、ガラス、ポリマー等へと分類することができる。天然に存在するポリマー、合成生分解性ポリマー、及び合成非生分解性ポリマーは全て、本発明の足場を形成するためのポリマーとして使用することができる。

【0173】

天然ポリマーを、本明細書に記載したバイオリアクター系の足場エレメントとして使用できることを理解されたい。天然材料は、生物活性特性のおかげで、潜在的に細胞とより良好に相互作用することができ、それにより、これらが本明細書に記載の生物系において細胞の性能を増強させることが可能となる。天然ポリマーは、タンパク質(絹、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、エラスチン、ケラチン、アクチン、及びミオシン)、多糖(セルロース、アミロース、デキストラン、キチン、及びグリコサミノグリカン)、若しくはポリヌクレオチド(DNA、RNA)等、又はこれらの物質の組合せとして分類することができる。

【0174】

また、三次元の足場又はマトリックスには合成生体材料も含まれ得、これらは構造の回復及び損傷組織又は患部組織の機能を促進し得る。合成ポリマーは、その特性(例えば、空隙率、分解時間、及び機械的特徴)を特定の適用のためにあつらえることができるため、生物医学分野において非常に有用である。合成ポリマーは、多くの場合、生物学的足場よりも安価であり、大量かつ均一に生成することができ、長い保管寿命を有する。多くの市販の合成ポリマーは、生体組織のものに匹敵する物理化学的及び機械的特性を示す。合成ポリマーは生分解性ポリマーの最大の群を表し、これらは制御された条件下で生成することができる。これらは、一般に、引張力、弾性係数、及び分解速度等の、予測可能かつ再現可能な機械的及び物理的特性を示す。PLA、PGA、及びPLGAコポリマーは、組織工学において最も一般的に使用される合成ポリマーの一部である。PHAは微生物ポリエステルのクラスに属し、組織工学における適用が次第に検討されている。これらの合成ポリマーは全て本明細書に企図される。

【0175】

更に、本開示の第4の態様のバイオリアクター系は、Rossoら、「Smart materials as scaffolds for tissue engineering」、J Cell Physiol.、2006年12月;209(3):1054頁に開示されているもの等の、半合成のものも使用し得る。そのような足場は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的なオリゴペプチド切断配列、インテグリン結合ドメイン、成長因子、抗トロンビン配列、プラスミン分解部位、及び形態発生タンパク質を含有し得る。そのような半合成材料は、合成材料(例えば、加工性、機械的強度)並びに天然材料(例えば、特定の細胞の認識、細胞侵入、及び分化/増殖シグナルを供給する能力)の両方によって提供される利点を有する「知的な」半合成生体材料を与えることを目的とする。その特徴のおかげで、これらの半合成生体材料は、本明細書に記載の足場の材料源として役立つことが臨床的に期待されている、新規かつ多用途のバイオミメティックハイブリッド材料のクラスを表す。

【0176】

参照点として、以下のポリマー及び材料が、本明細書に記載の第4の態様のバイオリアクターにおいて使用することが企図される。
PU:ポリウレタン、PS:ポリスルホン、CP:リン酸カルシウム、
HA:ヒアルロン酸、PP:ポリプロピレン、BG:生物活性ガラス、ECM:細胞外基質、
PVA:ポリビニルアルコール、PGA:ポリグリコリド、PLA:ポリ乳酸、PPF:ポリ(プロピレンフマレート)、
PCA:ポリシアノアクリレート、PCL:ポリ(ε-カプロラクトン)、
PDO:ポリジオキサノン、PHA:ポリヒドロキシアルカノエート、
POE:ポリ(オルトエステル)、
PEE:ポリ(エーテルエステル)、
PEO:ポリ(酸化エチレン)、
PBT:ポリブチレンテレフタレート、
HAP:ヒドロキシアパタイト、
TCP:リン酸三カルシウム、
PEG:ポリ(エチレングリコール)、
PEU:ポリ(エステルウレタン)、
PAA:ポリ(アクリル酸)、
LDI:リシンジイソシアネート、
BCP:二相性リン酸カルシウム、
PAam:ポリアクリルアミド、
PMMA:ポリメチルメタクリレート、
PLLA:ポリ(L-乳酸)、
PLGA:ポリ(l-ラクチド-co-グリコリド)、
PTMC:ポリ(トリメチレンカーボネート)、
PDMS:ポリジメチルシロキサン、
PTFE:ポリテトラフルオロエチレン、
PEVA:ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)、
PGCL:ポリ(グリコリド-co-ε-カプロラクトン)、
PLCL:ポリ(l-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PDLLA:ポリ(DL-ラクチド)、
PLDLA:ポリ-L/D-ラクチド、
PLAGA:ポリ(乳酸-グリコール酸)、
PHBHV:ポリ(3-ヒドロキシブチレート)3-ヒドロキシバレレート、
PCLTMC:ポリ(カプロラクトン-co-トリメチレンカーボネート)、
PNIPAAm:ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、
PDMAEM:ポリ(ジメチルアミノエチルメタクリレート)塩酸塩、
PDLLA-CL:ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PLLA-CL:ポリ(l-ラクチド-co-ε-カプロラクトン)、及び
TCP:リン酸三カルシウム。
POMac。

【0177】

第4の態様の特定の実施形態では、本明細書に記載の足場エレメントは、ポリ(ジメチルシロキサン(PDMS))、ポリ(メチルメタクリレート(PMMA))、ポリスチレン、若しくはポリスチレン、又はその組合せから作製し得る。足場は生分解性材料から作製し得る。他の適切な材料には、数ある中でとりわけ、ポリ(セバシン酸グリセロール)、クエン酸を含まないPOMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン及びそのコポリマー、絹、微細構造、ナノファブリケーション材料、並びに/又はナノロッド若しくは量子ドット等のナノ構造でドーピングされている材料が含まれ得る。任意選択で、特定の実施形態では、足場材料は、は、水並びにタンパク質、薬物、栄養素、及び代謝老廃物を含めた分子の交換及び/又は通過を可能にするために灌流可能であり得る。

【0178】

当業者には、組織工学的足場の作製及び使用に関して最新技術の入手可能な資料を参照することができ、具体的には、Dhandayuthapaniら、「Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science、第2011巻(2011年)、1〜19頁に記載の足場材料を参照できることが理解されよう。

【0179】

足場又はマトリックスが三次元組織の成長を支持(支持する)し得る限りは、足場マトリックス及びその中の様々なエレメント(例えば、一体化した管腔部分、及び成長チャンバー又は細胞の相互接続したネットワーク)の形状、厚さ、長さ、配向、及び表面組織分布の特性は、いくつもの適切な様式で変動することができる。

【0180】

ネットワークを含むウェル又は成長チャンバーの形状は任意の特定の様式に限定されず、正方形、長方形、円形、卵型、横長、三角形、又は形状の任意の組合せであり得る。また、ウェル又はチャネルの他の寸法も、任意の適切な様式で変動し得る。例えば、チャネルの深さ、壁の高さ、及びチャネルの長さ、及びチャネルの全体的な体積は、任意の適切な方法で変動させ得る。

【0181】

例えば、細胞の長さ、高さ、及び幅は、約0.1〜1mm、若しくは約0.2〜2mm、若しくは約0.3〜3mm、若しくは約0.4〜4mm、若しくは約0.5〜5mm、若しくは約0.6〜6mm、若しくは約0.7〜7mm、若しくは約0.8〜8mm、若しくは約0.9〜9mm、若しくは約1〜10mm、又はそれ以上であり得る。

【0182】

細胞、ウェル、又はまた、チャネルの表面を、化学修飾(例えば、リガンド、帯電物質、結合剤、成長因子、抗生物質、抗真菌剤等)、又は物理的修飾(例えば、スパイク、曲線部分、折り畳み、細孔、不均一部分、若しくは様々な形状及びトポグラフィー等)を含めた、組織培養プロセスを促進し得る任意の適切な表面処理を用いて修飾してもよい。

【0183】

第4の実施形態の様々な実施形態では、組織培養系を使用して、心細胞、肝細胞、腎細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、又はそのような細胞の組合せに基づく組織を成長させ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示する組織培養系は、心組織、肝組織、又は腎組織を成長させるために適している。特定の実施形態では、本明細書に記載の系において形成された組織は三次元組織である。

【0184】

第4の態様の様々な他の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクター系を、成熟組織型、例えば、成熟心組織、肝組織、又は腎組織へと発生することができる幹細胞又は他の前駆細胞を用いて播種し得る。幹細胞には、それだけに限定されないが、胚性幹細胞及び成体幹細胞が含まれ得る。更に、全能性/万能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、少能性細胞、又は単能性細胞(例えば前駆細胞)を含めて、本明細書に記載したデバイスを用いて使用することが企図される幹細胞は、任意の度合の分化能を有し得る。

【0185】

心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する実施形態では、本明細書に記載のバイオリアクター系には、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、バイオリアクター系の長手方向軸に概して平行な方向である。しかし、電界の配向は限定されず、電極の位置決めは、適切な電界を生じることができるような任意の適切な様式であり得る。特定の実施形態、例えば心細胞では、電界は、細胞が成熟して実際の組織、例えば心組織の生理的及び電気的特性をより厳密に模倣する組織を形成することを促進する。

【0186】

第4の態様の更に別の実施形態では、本開示は、それだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む様々な適用において本開示の三次元組織系、デバイス、及び/又は系を使用する方法に関する。第4の態様の特定の実施形態では、2つ以上のバイオリアクター系は、機能的に相互に作用するように互いに接続され得る。例えば端と端を直列に接続された、一緒に結合された2つ以上のバイオリアクター系は、同じ種類の組織又は完全に異なる組織から形成され得る。例えば、心組織を含む第1のバイオリアクター系が肝臓の第2のバイオリアクター系と直列に結合されている系が企図される。この組の系は、最初の2つの系と直列に更に結合される、1つ又は複数の追加のバイオリアクター系を用いて更に改変することができる。別の例では、健康な心組織を含む第1のバイオリアクター系を、疾患心組織を含む第2のバイオリアクター系と直列に結合させることができる。このようにして、第1の組織を含む第1のバイオリアクター系に対する薬物、毒素、又は他の試験薬剤の効果だけでなく、下流の第2のバイオリアクター系、例えば肝組織に対する代謝された薬物、毒素、又は他の薬剤の効果も試験することができる。

【0187】

また、バイオリアクターの足場エレメント及び他のエレメントは、ヒドロゲルを用いても形成し得る。ヒドロゲルとは、大量の水を吸収することができる、物理的又は化学的に架橋結合したポリマーのネットワークである。これらは、調製方法、電荷、並びに機械的及び構造的特徴を含めた様々なパラメータに応じて様々なカテゴリーに分類することができる。ヒドロゲルは、多くの組織の細胞外基質に構造的に類似しており、多くの場合は比較的緩和な条件下で加工することができ、最小限に侵襲性の様式で送達し得るため、魅力的な足場材料である。その結果、ヒドロゲルを本明細書において足場材料として利用することができる。ヒドロゲルには、数ある材料の中でとりわけ、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、及び大量の親水性基を有するコポリマーが含まれ得る。天然ヒドロゲル材料には、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、及び他の天然由来のポリマーが含まれる。

【0188】

様々な実施形態では、複数のアンギオチップ系を直列に構成してよく、第1のアンギオチップは1つの種類の細胞又は組織(例えば心臓)から形成され、第2の「下流」又は「上流」のアンギオチップは第2の種類の細胞又は組織から形成される(例えば疾患の心臓又は肝臓)。このようにして、薬物の相互作用を多臓器又は組織系の状況で試験し得る。例えば、試験薬剤を、心組織から調製した第2のアンギオチップの下流に連結されていてよい、肝組織から調製したアンギオチップ内に導入し得る。このようにして、薬物は肝組織と最初に相互作用してよく、それから生じる全ての代謝産物は下流の心組織アンギオチップへと流れてよく、それにより、心機能に対する薬物の代謝の効果を試験することが容易となる。したがって、本発明は、身体における臓器間の薬物の相互作用の試験において使用するための、タンデム(すなわち直列)の様式で配置された複数のアンギオチップデバイスを企図する。任意の考えられる組織の組合せを、タンデムで、例えば心臓/肝臓又は肝臓/心臓で試験することができる。

【0189】

アンギオチューブ系
本明細書で使用し得る、本開示のバイオリアクター系の第5の態様は、「アンギオチューブ系又はデバイス」と呼ぶことができ、本明細書に記載の特長及び成分を含むバイオリアクター系をいうことを意図する。本開示のアンギオチップ系において形成される細胞培養物を「アンギオチューブ」と呼び得る。本明細書におけるアンギオチューブ系の説明は、本開示をこれらの態様又は任意の特定の実施形態に限定することを意図しないことを理解されたい。それとは反対に、代替物、改変、実施形態の組合せ、及び均等物を、本発明の精神及び範囲内に含まれ得るものとして網羅することを意図する。

【0190】

第5の態様では、本開示は、収縮力を測定するのに適した組織培養物、例えば三次元組織鎖を成長させるためのバイオリアクター系に関する。バイオリアクター系には、細胞を播種するのに適したウェル又はチャネルと、1つ又は複数の管腔を有し、ウェル又はチャネルの上方に、例えばウェル又はチャネルの長手方向軸に沿って支えられている又は吊り下げられている、灌流可能な足場とが含まれる。更に、灌流可能な足場は、灌流可能な足場の長手方向軸に沿ってウェル又はチャンバー内に配置されており、その間に形成された三次元組織鎖のための少なくとも2つの固着点を形成するように機能し、かつ組織鎖の収縮状態に応答して変形又は屈曲することができる、一組以上の対向する足場エレメント(単一の足場又は別々の足場から形成することができる)を用いて構成されている。第5の態様のバイオリアクターは、2つのそのような変形可能なエレメントを有することに限定されず、2つより多く、例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、若しくは10個、又はそれより多くのそのようなエレメントが含まれ得る。組織鎖が対向する足場エレメントの組又は複数の組の間に配置され、チャネル又はウェルの上方に吊り下げられているように、対向するエレメントのそれぞれの周り及び灌流可能なエレメントの長手方向の全長に沿って形成されて、その間で結合される、三次元組織鎖を形成する能力が存在する限りは、1つのチャネルあたり任意の数のエレメントを提供し得る。

【0191】

足場エレメントは、好ましくは偏向可能、変形可能、屈曲可能等であり、これらは、足場エレメント上の組織鎖によって発揮された収縮力の測定を可能にするように更に構成されている。

【0192】

第5の態様の好ましい実施形態では、ウェル又はチャネルのそれぞれは、一組(2つ)の対向する足場エレメントを用いて構成されており、好ましくは、単一の足場エレメントは、ウェル又はチャネルの長手方向軸の対向する末端に、又はその付近に配置されている。

【0193】

細胞がウェル又はチャネル内に、細胞の培養に適した適切な増殖培地、成長因子、及び他の栄養素と共に播種された後、細胞は成長して、灌流可能な足場及び屈曲可能なエレメントを取り囲む及び/又はそれと一体化した組織鎖を形成する。使用において、栄養素及び成長因子並びに試験薬剤(例えば、薬物、タンパク質、毒素等)は、そのような物質を送達するための手段と一体化している灌流可能な管腔(例えば、チューブ又は血管を介して管腔に接続しているリザーバーエレメント)を介して組織鎖に送達し得る。更に、様々な実施形態では、バイオリアクター系には、灌流可能な管腔から出る通路、例えば、排出物及び他の代謝産物が組織鎖から灌流可能な管腔内へと拡散されて端末リザーバーを通って出ることを可能にする、排出管又は他の端末リザーバーも含まれ得る。心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する様々な実施形態では、バイオリアクターは、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、灌流可能な管腔エレメントの全長に沿って形成される組織鎖の長手方向軸に平行な方向である。

【0194】

第5の態様の特定の実施形態では、灌流可能な長手足場及び屈曲可能なエレメントは、三次元組織鎖がそれ上に形成され得るように、ウェル又はチャネルの底部表面から離れるように持ち上げられている。

【0195】

第5の態様の様々な実施形態では、灌流可能な長手足場及び屈曲可能なエレメントは任意の適切な材料であり得(かつ同じ又は異なる材料であり得)、これには、コラーゲン及びコラーゲン誘導体、天然の縫合材料(例えば動物の腸管)、セルロース及びセルロース誘導体、プロテオグリカン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、ヒアルロン酸、エラスチン、フィブロネクチン、及びラミニン等の天然材料、並びに様々なポリマー及びナノ材料を含めた合成材料(例えばPOMac)が含まれ得る。

【0196】

第5の態様の特定の実施形態では、当業者には、本発明の灌流可能な足場又は屈曲可能なエレメントにおいて使用するための生体材料として適切な材料を選択するための基準が理解されるであろう。そのような選択肢は、その材料化学、分子量、溶解度、形状及び構造、親水性/疎水性、潤滑性、表面エネルギー、吸水、分解、屈曲性/変形能、及び腐食機構が含まれ得る様々なパラメータに基づくことができる。

【0197】

第5の態様の特定の実施形態では、灌流可能な足場及び屈曲可能なエレメントはポリマー足場であり得る。そのような足場は、一般に、高い表面積対体積率、非常に小さな孔径を有する高い空隙率、生物分解、及び機械的特性等のそのユニークな特性が原因で高い注目を集めている。これらは、生体適合性、化学の多用途性、並びに組織工学及び臓器置換の適用において顕著である生物学的特性という明確な利点を提供する。

【0198】

灌流可能な足場材料及び屈曲可能なエレメントは、合成又は生物学的、分解性又は非分解性であり得る。ポリマーの特性は、それを構成する高分子の組成、構造、及び配置に依存する。これは、その構造的、化学的、及び生物学的特徴に関して、様々な種類、例えば、セラミック、ガラス、ポリマー等へと分類することができる。天然に存在するポリマー、合成生分解性ポリマー、及び合成非生分解性ポリマーは全て、本発明の足場を形成するためのポリマーとして使用することができる。

【0199】

天然ポリマーを、本明細書に記載したバイオリアクター系の灌流可能な足場又は屈曲可能なエレメントとして使用できることを理解されたい。天然材料は、生物活性特性のおかげで、潜在的に細胞とより良好に相互作用することができ、それにより、これらが本明細書に記載の生物系において細胞の性能を増強させることが可能となる。天然ポリマーは、タンパク質(絹、コラーゲン、ゼラチン、フィブリノーゲン、エラスチン、ケラチン、アクチン、及びミオシン)、多糖(セルロース、アミロース、デキストラン、キチン、及びグリコサミノグリカン)、若しくはポリヌクレオチド(DNA、RNA)等、又はこれらの物質の組合せとして分類することができる。

【0200】

また、本発明のバイオリアクター系において使用する灌流可能な足場及び屈曲可能なエレメントには合成生体材料も含まれ得、これらは構造の回復及び損傷組織又は患部組織の機能を促進し得る。合成ポリマーは、その特性(例えば、空隙率、分解時間、及び機械的特徴)を特定の適用のためにあつらえることができるため、生物医学分野において非常に有用である。合成ポリマーは、多くの場合、生物学的足場よりも安価であり、大量かつ均一に生成することができ、長い保管寿命を有する。多くの市販の合成ポリマーは、生体組織のものに匹敵する物理化学的及び機械的特性を示す。合成ポリマーは生分解性ポリマーの最大の群を表し、これらは制御された条件下で生成することができる。これらは、一般に、引張力、弾性係数、及び分解速度等の、予測可能かつ再現可能な機械的及び物理的特性を示す。PLA、PGA、及びPLGAコポリマーは、組織工学において最も一般的に使用される合成ポリマーの一部である。PHAは微生物ポリエステルのクラスに属し、組織工学における適用が次第に検討されている。これらの合成ポリマーは全て本明細書に企図される。

【0201】

更に、本開示の第5の態様バイオリアクター系は、Rossoら、「Smart materials as scaffolds for tissue engineering」、J Cell Physiol.、2006年12月;209(3):1054頁に開示されているもの等の、半合成のものも使用し得る。そのような足場は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)に特異的なオリゴペプチド切断配列、インテグリン結合ドメイン、成長因子、抗トロンビン配列、プラスミン分解部位、及び形態発生タンパク質を含有し得る。そのような半合成材料は、合成材料(例えば、加工性、機械的強度)並びに天然材料(例えば、特定の細胞の認識、細胞侵入、及び分化/増殖シグナルを供給する能力)の両方によって提供される利点を有する「知的な」半合成生体材料を与えることを目的とする。その特徴のおかげで、これらの半合成生体材料は、本明細書に記載の足場の材料源として役立つことが臨床的に期待されている、新規かつ多用途のバイオミメティックハイブリッド材料のクラスを表す。

【0202】

参照点として、以下のポリマー及び材料が、本明細書に記載の第5の態様のバイオリアクターにおいて使用することが企図される。
PU:ポリウレタン、PS:ポリスルホン、CP:リン酸カルシウム、
HA:ヒアルロン酸、PP:ポリプロピレン、BG:生物活性ガラス、ECM:細胞外基質、
PVA:ポリビニルアルコール、PGA:ポリグリコリド、PLA:ポリ乳酸、PPF:ポリ(プロピレンフマレート)、
PCA:ポリシアノアクリレート、PCL:ポリ(ε-カプロラクトン)、
PDO:ポリジオキサノン、PHA:ポリヒドロキシアルカノエート、
POE:ポリ(オルトエステル)、
PEE:ポリ(エーテルエステル)、
PEO:ポリ(酸化エチレン)、
PBT:ポリブチレンテレフタレート、
HAP:ヒドロキシアパタイト、
TCP:リン酸三カルシウム、
PEG:ポリ(エチレングリコール)、
PEU:ポリ(エステルウレタン)、
PAA:ポリ(アクリル酸)、
LDI:リシンジイソシアネート、
BCP:二相性リン酸カルシウム、
PAam:ポリアクリルアミド、
PMMA:ポリメチルメタクリレート、
PLLA:ポリ(L-乳酸)、
PLGA:ポリ(l-ラクチド-co-グリコリド)、
PTMC:ポリ(トリメチレンカーボネート)、
PDMS:ポリジメチルシロキサン、
PTFE:ポリテトラフルオロエチレン、
PEVA:ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)、
PGCL:ポリ(グリコリド-co-ε-カプロラクトン)、
PLCL:ポリ(l-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PDLLA:ポリ(DL-ラクチド)、
PLDLA:ポリ-L/D-ラクチド、
PLAGA:ポリ(乳酸-グリコール酸)、
PHBHV:ポリ(3-ヒドロキシブチレート)3-ヒドロキシバレレート、
PCLTMC:ポリ(カプロラクトン-co-トリメチレンカーボネート)、
PNIPAAm:ポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)、
PDMAEM:ポリ(ジメチルアミノエチルメタクリレート)塩酸塩、
PDLLA-CL:ポリ(D,L-ラクチド-co-カプロラクトン)、
PLLA-CL:ポリ(l-ラクチド-co-ε-カプロラクトン)、及び
TCP:リン酸三カルシウム。
POMac。

【0203】

第5の態様の特定の実施形態では、本明細書に記載の灌流可能な足場及び屈曲可能なエレメントは、ポリ(ジメチルシロキサン(PDMS))、ポリ(メチルメタクリレート(PMMA))、ポリスチレン、若しくはポリスチレン、又はその組合せから作製し得る。足場は生分解性材料から作製し得る。他の適切な材料には、数ある中でとりわけ、ポリ(セバシン酸グリセロール)、クエン酸を含まないPOMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン及びそのコポリマー、絹、微細構造、ナノファブリケーション材料、並びに/又はナノロッド若しくは量子ドット等のナノ構造でドーピングされている材料が含まれ得る。任意選択で、特定の実施形態では、足場及び屈曲可能なエレメントは、水並びにタンパク質、薬物、栄養素、及び代謝老廃物を含めた分子の交換及び/又は通過を可能にするために灌流可能であり得る。

【0204】

当業者には、組織工学的足場の作製及び使用に関して最新技術の入手可能な資料を参照することができ、具体的には、Dhandayuthapaniら、「Polymeric Scaffolds in Tissue Engineering Application: A Review; International Journal of Polymer Science、第2011巻(2011年)、1〜19頁に記載の足場材料を参照できることが理解されよう。

【0205】

ウェル又はチャネルの形状は任意の特定の様式に限定されず、正方形、長方形、円形、卵型、横長、三角形、又は形状の任意の組合せであり得る。また、ウェル又はチャネルの他の寸法も、任意の適切な様式で変動し得る。例えば、チャネルの深さ、壁の高さ、及びチャネルの長さ、及びチャネルの全体的な体積は、任意の適切な方法で変動させ得る。

【0206】

例えば、チャネルの長さ、高さ、及び幅は、約0.1〜1mm、若しくは約0.2〜2mm、若しくは約0.3〜3mm、若しくは約0.4〜4mm、若しくは約0.5〜5mm、若しくは約0.6〜6mm、若しくは約0.7〜7mm、若しくは約0.8〜8mm、若しくは約0.9〜9mm、若しくは約1〜10mm、又はそれ以上であり得る。

【0207】

また、チャネルの表面を、化学修飾(例えば、リガンド、帯電物質、結合剤、成長因子、抗生物質、抗真菌剤等)、又は物理的修飾(例えば、スパイク、曲線部分、折り畳み、細孔、不均一部分、若しくは様々な形状及びトポグラフィー等)を含めた、組織培養プロセスを促進し得る任意の適切な表面処理を用いて修飾してもよい。

【0208】

第5の態様の様々な実施形態では、本明細書に開示する組織培養系において播種及び培養し得る細胞には、それだけに限定されないが、心細胞、肝細胞、腎細胞、軟骨細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、又はそのような組織の組合せが含まれ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示する組織培養系は、心組織、肝組織、又は腎組織を成長させるために適している。特定の実施形態では、本明細書に記載の系において形成された組織は三次元組織である。

【0209】

第5の態様の様々な他の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクター系を、成熟組織型、例えば、成熟心組織、肝組織、又は腎組織へと発生することができる幹細胞又は他の前駆細胞を用いて播種し得る。幹細胞には、それだけに限定されないが、胚性幹細胞及び成体幹細胞が含まれ得る。更に、全能性/万能性細胞、多能性細胞、多分化能細胞、少能性細胞、又は単能性細胞(例えば前駆細胞)を含めて、本明細書に記載したデバイスを用いて使用することが企図される幹細胞は、任意の度合の分化能を有し得る。

【0210】

心細胞(又は他の電気刺激した細胞)に関与する実施形態では、本明細書に記載のバイオリアクター系には、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生じるように構成された電極が含まれるように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向であり得るが、好ましくは、チャネル(並びにチャネル内で灌流可能な足場上及びその周りで成長させた後に生じる組織鎖)の長手方向軸に概して平行な方向、又はチャネル(及び生じる組織鎖)の長手方向軸に概して垂直な方向である。しかし、電界の配向は限定されず、電極の位置決めは、適切な電界を生じることができるような任意の適切な様式であり得る。特定の実施形態、例えば心細胞では、電界は、細胞が成熟して実際の組織、例えば心組織の生理的及び電気的特性をより厳密に模倣する組織を形成することを促進する。

【0211】

第5の態様の特定の実施形態では、本明細書に開示されているバイオリアクターは、複数の組織鎖の成長、試験、測定、及び評価等を同時の様式で行い得るように、複数の個々のバイオリアクター、例えば、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、及び1536ウェルのプレート等のマルチウェルプレートの様式で構築し得る。

【0212】

第5の態様の更に別の実施形態では、本開示は、それだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含むそれだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む様々な適用における、本開示の三次元組織構築物、デバイス、及び/又は系を使用する方法に関する。

【0213】

第5の態様の特定の実施形態では、2つ以上のバイオリアクター系は、機能的に相互に作用するように互いに接続され得る。例えば端と端を直列に接続された、一緒に結合された2つ以上のバイオリアクター系は、同じ種類の組織又は完全に異なる組織から形成され得る。例えば、心組織を含む第1のバイオリアクター系が肝臓の第2のバイオリアクター系と直列に結合されている系が企図される。この組の系は、最初の2つの系と直列に更に結合される、1つ又は複数の追加のバイオリアクター系を用いて更に改変することができる。別の例では、健康な心組織を含む第1のバイオリアクター系を、疾患心組織を含む第2のバイオリアクター系と直列に結合させることができる。このようにして、第1の組織を含む第1のバイオリアクター系に対する薬物、毒素、又は他の試験薬剤の効果だけでなく、下流の第2のバイオリアクター系、例えば肝組織に対する代謝された薬物、毒素、又は他の薬剤の効果も試験することができる。

【0214】

足場の配向、具体的には長手エレメント及び/又は屈曲可能なエレメントの配向は、ウェル内の成長チャンバーの配向に対して変動させ得る。一実施形態では、成長チャンバーは、一般的に長手の成長チャンバーであってよく、長手エレメントの配向に対して概して垂直に配向され得る。別の実施形態では、長手エレメントは、成長チャンバーの配向に対して概して垂直な配向に配向され得る。更に別の実施形態では、長手エレメント及び/又は屈曲可能なエレメントは、成長チャンバーの配向に対して一般に平行な配向に配向され得る。更に他の実施形態では、長手エレメント及び/又は屈曲可能なエレメントは、成長チャンバーの配向に対して一般に対角の配向に配向され得る。

【0215】

様々な実施形態では、複数の長手エレメントを含む足場は、成長チャンバー内に播種される細胞が組織鎖へと培養されるにつれて、組織鎖が、ウェルに接触する長手エレメント及び屈曲可能なエレメントの全体又は少なくとも一部分の上に成長するように、バイオリアクターの複数のウェルに取り付けられている(永久的若しくは可逆的のどちらか)又は付着している(永久的若しくは可逆的のどちらか)。すなわち、長手エレメント及び屈曲可能なエレメントが組織鎖の細胞によって被包される、又は長手エレメントの少なくとも一部分が組織鎖の細胞によって被包される若しくは少なくとも接触され、長手エレメントは互いに固定して接続される。本明細書で使用する用語「固定して接続される」とは、組織鎖の動き(例えば心組織の鼓動)が屈曲可能なエレメントの動きに反映されるように、組織鎖と長手/屈曲可能なエレメントとの間に確立される接続をいう。

【0216】

好ましい実施形態では、屈曲可能なエレメントは、一般に同じ配向にある、例えば、互いに平行で長手エレメントに垂直であり得る。他の実施形態では、屈曲可能なエレメントは、一般に十文字交差した様式で配置し得る。更に他の実施形態では、屈曲可能なエレメントは、正弦波、ジグザグ、曲線等の形態をとり得る。

【0217】

屈曲可能なエレメントの長手エレメントへの付着、及び長手エレメントのバイオリアクタープレートのウェルへの付着は、任意の適切な手段、例えば、接着剤、溶接、又は他の機械的手段によるものであり得る。ウェルと長手エレメントとの間の付着点は、秩序的、ランダム、連続的、又は非連続的であり得る。

【0218】

また、特定の実施形態では、長手エレメントは、栄養素、代謝老廃物、タンパク質、又は更には全細胞の通過を許可する、灌流可能な材料も含むことができる。灌流性は、エレメントを形成するために使用する材料の特性としてのものを含めた任意の適切な手段によって、又はエレメントを形成する材料中に1つ若しくは複数の細孔を形成することによって、確立し得る。このことは、長手エレメントが成長チャンバーを横断する際に、チャンバーの交差した部分間に分割密封又は部分密封を有効に形成するように置かれている特定の実施形態において有用であり得る。すなわち、特定の実施形態では、長手エレメントは、チャネルの基部に接触せずに、成長チャネルの全幅の上方に吊り下げられていてよい(すなわち、チャネルの側面とのみ接続を形成する)。特定の他の実施形態では、長手エレメントは、成長チャネルと長手エレメントとの間に1つの接続(又は複数の接続)が作られるような様式で、成長チャンバーを通過し得る。灌流可能な材料は、栄養素、代謝廃棄物、及び更には全細胞が、長手エレメントがチャンバーと接触する点を含めて、成長チャンバー内を自由に移動することを可能にする。

【0219】

バイオリアクターの構成要素(例えば、反応器本体、蓋、カバー、成長チャンバー、足場、長手エレメント、屈曲可能なエレメント等)は、ポリ(L-ラクチド)(PLA)等のポリラクトン、ポリ(グリコリド)(PGA)、及びそのコポリマー(PLGA)、PDMS(ポリ(ジメチルシロキサン))、PMMA(ポリ(メチルメタクリレート))、並びにPOMac(ポリ(オクタメチレンマレエート(無水物)シトレート、1,8-オクタンジオール、クエン酸、及び無水マレイン酸の混合単位)を含めた生分解性ポリマー等の、様々なポリマー(FDA認可されているものが含まれる)を含めた任意の適切な材料から作製し得る。その全体で本明細書に参照により組み込まれているTranら、「Synthesis and characterization of a biodegradable elastomer featuring a dual crosslinking mechanism」、Soft Matter、2010年1月1日; 6(11): 2449〜2461頁を参照することができる。ポリマーは、任意の適切な天然に存在するポリマー(それだけに限定されないが、セルロース、絹、シェラック、ゴム、若しくはそれらの誘導体等)、又は任意の適切な合成ポリマー(それだけに限定されないが、ナイロン、ポリ塩化ビニル(PVC若しくはビニル)、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、PVB、シリコン、及びそれらの誘導体が含まれる)であり得る。ポリマーは、バイオリアクター内の組織の成長及び/又は維持を促進し得るリガンド、抗体、荷電分子、疎水性分子等の追加の成分を用いて、共有的又は非供給的に修飾し得る。特定の種類のポリマー、その修飾体等は、本明細書に記載のそれぞれの適用に固有の限界物理、質量輸送、及び生物学的設計変数に取り組むために、適切な材料を見つけることに左右されることを理解されたい。

【0220】

また、バイオリアクターの足場エレメント及び他のエレメントは、ヒドロゲルを用いても形成し得る。ヒドロゲルとは、大量の水を吸収することができる、物理的又は化学的に架橋結合したポリマーのネットワークである。これらは、調製方法、電荷、並びに機械的及び構造的特徴を含めた様々なパラメータに応じて様々なカテゴリーに分類することができる。ヒドロゲルは、多くの組織の細胞外基質に構造的に類似しており、多くの場合は比較的緩和な条件下で加工することができ、最小限に侵襲性の様式で送達し得るため、魅力的な足場材料である。その結果、ヒドロゲルを本明細書において足場材料として利用することができる。ヒドロゲルには、数ある材料の中でとりわけ、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリレートポリマー、及び大量の親水性基を有するコポリマーが含まれ得る。天然ヒドロゲル材料には、アガロース、メチルセルロース、ヒアルロナン、及び他の天然由来のポリマーが含まれる。

【0221】

様々な実施形態では、複数のアンギオチューブ系を直列に構成してよく、第1のアンギオチューブは1つの種類の細胞又は組織(例えば心臓)から形成され、第2の「下流」又は「上流」のアンギオチューブは第2の種類の細胞又は組織から形成される(例えば疾患の心臓又は肝臓)。このようにして、薬物の相互作用を多臓器又は組織系の状況で試験し得る。例えば、試験薬剤を、心組織から調製した第2のアンギオチューブの下流に連結されていてよい、肝組織から調製したアンギオチューブ内に導入し得る。このようにして、薬物は肝組織と最初に相互作用してよく、それから生じる全ての代謝産物は下流の心組織アンギオチューブへと流れてよく、それにより、心機能に対する薬物の代謝の効果を試験することが容易となる。したがって、本発明は、身体における臓器間の薬物の相互作用の試験において使用するための、タンデム(すなわち直列)の様式で配置された複数のアンギオチューブデバイスを企図する。任意の考えられる組織の組合せを、タンデムで、例えば心臓/肝臓又は肝臓/心臓で試験することができる。

【0222】

細胞/組織
開示したデバイスは、心組織、骨格筋組織、平滑筋組織、肝組織、腎組織、軟骨組織、皮膚、骨髄組織、又はそのような組織の組合せ等からの細胞等の、任意の細胞に由来する組織と併せて使用し得る。三次元組織を成長させるために使用する細胞は、任意の市販の供給源を含めてどこでも供給源とすることができ、又は個々の対象若しくは患者を供給源とすることさえもできる。例えば、本発明の組織鎖は、市販の肝細胞系の種から開始して成長させ得る。別の例では、本発明の組織鎖は、対象から直接得た細胞の種、例えば生検から単離した細胞から開始して成長させ得る。他の実施形態では、本発明の三次元組織は、異なる細胞の混合物から成長させることができる。そのような細胞の混合物には、同じ若しくは異なる組織からの健康な細胞若しくは疾患細胞の混合物、異なる供給源若しくは患者からの細胞の混合物、又は患者及び市販の供給源の両方からの細胞の混合物を含めることができる。また、本発明の組織を成長させるために使用する細胞は、薬物耐性若しくは薬物感受性の工学的に作製した細胞系等の遺伝子操作した細胞、又はGFP等の様々なバイオマーカーを発現するものを含めた他の種類の遺伝子操作した細胞であることもできる。

【0223】

特定の実施形態では、本明細書で企図される任意のデバイスによって調製された本発明の三次元組織は、心筋細胞、例えばヒト心筋細胞を使用して調製又は成長させ得る。心筋細胞は、GE Healthcare Lifesciences社、3H Biomedical、Sciencell Research Laboratories社等の供給元から商業的に得ることができる。細胞は、例えば、b-ミオシン重鎖、a-心臓アクチン、トロポニンI、トロポニンT、筋肉特異的中間体フィラメントタンパク質であるデスミン、心筋細胞特異的ペプチドホルモンである心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、並びにカップリングしたギャップ結合タンパク質であるコネキシン-43及びコネキシン-40等の特定のマーカーを発現するとして特徴付け得る。

【0224】

他の実施形態では、本発明の三次元組織を成長させるために使用する細胞は、胚性幹細胞(「ESC」)、胎児幹細胞(「FSC」)、及び成体(又は体性)幹細胞(「SSC」)を含めた幹細胞であり得る。幹細胞は、分化能の潜在性に関して、全能性(別名万能性)(胚細胞及び胚以外の細胞種へと分化することができる幹細胞)、多能性幹細胞(ほぼ全ての細胞へと分化することができる)、多分化能幹細胞(いくつかの細胞種へと分化することができる)、少能性幹細胞(数種の細胞種へのみ分化することができる)、又は単能性細胞(1つの細胞種のみ生じることができる)であり得る。幹細胞は商業的に得るか、又は患者から直接、若しくは任意の他の適切な供給源から得る/単離することができる。

【0225】

本明細書で使用する「発生的により弱い細胞」とは、限定的な多系統分化が可能、又は単一系統の組織特異的な分化が可能な細胞であり、例えば、未処理の間葉系幹細胞は、とりわけ骨細胞及び軟骨細胞、すなわち間葉系統の細胞へと分化することができるが、他の系統(例えば神経系統)の細胞へと分化する能力が限定されている。

【0226】

本明細書で使用する「発生的により強力な細胞」とは、その対応する発生的により弱い細胞よりも多種類の細胞種へと容易に分化することができる細胞である。例えば、間葉系幹細胞は、骨細胞及び軟骨細胞へと容易に分化することができるが、神経又は網膜系統の細胞へと分化する能力が限定されている(すなわち、この状況において発生的により弱い細胞である)。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法に従って処理した間葉系幹細胞は、例えば間葉系統及び神経系統の細胞種へと容易に分化することができるため、発生的により強力となり得る。本発明の方法に従って処理した場合に細胞の可塑性が増加する。

【0227】

本発明のデバイス中で形成される組織には、典型的には、平滑筋又は骨格筋細胞、筋細胞(筋肉幹細胞)、線維芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、繊維筋芽細胞、管細胞及び皮膚細胞を含めた外胚葉細胞、肝細胞及び他の肝細胞(例えば、類洞肝内皮細胞、クッパー細胞、及び肝星細胞)、腎細胞、膵島細胞、腸管中に存在する細胞、他の実質細胞、肺中に存在する細胞、骨芽細胞及び骨又は軟骨を形成する他の細胞、並びに造血細胞等の、機能的な間葉又は実質細胞のうちの1つ又は複数の種類が含まれる。一部の事例では、神経細胞を含めることが望ましい場合もあり得る。血管構造は、典型的には内皮細胞から形成される。「実質細胞」には、フレームワーク又は間質とは区別される、臓器の機能的エレメントが含まれる。「間葉細胞」には、結合組織及び支持組織、平滑筋、血管内皮並びに血液中の細胞が含まれる。

【0228】

また、最終的には三次元組織を形成する所望の細胞を播種する前に、デバイスの腔外又は腔内(特定の実施形態)の表面上に内皮層を成長させるために、デバイスに内皮細胞系を事前に播種してもよい。

【0229】

細胞は、生きたドナー、細胞培養物、又は検屍から生検を行う又は採取することによって得ることができ、全ての技法が当分野で周知である。細胞は好ましくは自己である。移植する細胞は、コラゲナーゼ、トリプシン、又は他のプロテアーゼ溶液を用いた消化等の標準技法を使用して解離させ、その直後又は培養中で維持した後に、鋳型又はポリマー足場内へと播種することができる。細胞は、正常であるか、又は追加若しくは正常の機能を提供するために遺伝子操作したものであり得る。また、胚細胞又は胎児細胞、幹細胞、及び免疫抑制の必要性を回避するために遺伝子操作した細胞等の免疫学的に不活性な細胞も使用することができる。免疫抑制のための方法及び薬物は移植分野の技術者に知られている。

【0230】

また、未分化又は部分的に分化した前駆細胞も使用し得る。例えば、本発明は、全て参照により組み込まれている、胚性生殖細胞(Gearhartら、米国特許第6,245,566号)、胚性幹細胞(Thomson、米国特許第5,843,780号及び第6,200,802号)、間葉系幹細胞(Caplanら、米国特許第5,486,359号)、神経幹細胞(Andersonら、米国特許第5,849,553号)、造血幹細胞(Tsukamoto、米国特許第5,061,620号)、多分化能成体幹細胞(Furchtら、WO 01/11011)を使用し得る。細胞は、線維芽細胞フィーダー層と共に同時培養することによって(Thomson、米国特許第5,843,780号及び第6,200,802号)、又は線維芽細胞馴化培地を用いた無フィーダー培養によって(Xuら、Nat. Biotechnol.、19、971頁、(2001年))、未分化状態に保つことができる。未分化又は部分的に分化した前駆細胞は、当分野で知られている成長因子又は他の細胞種特異的誘導因子若しくは薬剤を含有する培地中で培養することによって、特定の発生経路に沿うように誘導することができる。そのような因子の一部の例には、血管内皮成長因子、ソニックヘッジホッグ、インスリン様成長因子II、オステオゲニン、細胞傷害性T細胞分化因子、ベータ-カテニン、骨形態形成タンパク質2、インターロイキン2、トランスフォーミング成長因子ベータ、神経成長因子、インターロイキンI、線維芽細胞成長因子2、レチノイン酸、及びWnt3が含まれる。

【0231】

幹細胞は、それだけに限定されないが、胚性幹細胞、成体幹細胞、神経幹細胞、筋肉幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、末梢血幹細胞、及び心臓幹細胞を含めた、当分野で知られている任意のものであり得る。好ましくは、幹細胞はヒトである。「幹細胞」とは、無期限に自己複製性の細胞分裂を行って表現型及び遺伝子型が同一の娘細胞を生じさせることができ、最終的には少なくとも1つの最終細胞種へと分化することができる、多能性、多分化能性、又は全能性の細胞である。

【0232】

胚性幹細胞(ES)は、無限の自己複製並びに多分化能性及び/又は多能性の分化潜在性を有しており、したがって任意の臓器、組織型、又は細胞種へと発生する能力を保有しているため、これが典型的な幹細胞である。これらの細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来することができるか、又は移植後の胚からの始原生殖細胞(胚性生殖細胞すなわちEG細胞)に由来することができる。ES及びEG細胞はこれまではマウスに由来しており、より最近では非ヒト霊長類及びヒトにも由来している。Evansら(1981年)、Nature、292:154〜156頁、Matsuiら(1991年)、Nature、353:750〜2頁、Thomsonら(1995年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA.、92:7844〜8頁、Thomsonら(1998年)、Science、282:1145〜1147頁、及びShamblottら(1998年)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、95:13726〜31頁。

【0233】

用語「幹細胞」、「胚性幹細胞」、「成体幹細胞」、「前駆細胞」、及び「前駆細胞集団」とは、本発明に従って、成体の組織又は臓器の任意の供給源に由来することができ、未分化又は分化系統決定細胞として複製することができ、少なくとも1つ、好ましくは複数の細胞系列へと分化する潜在性を有する細胞を意味すると理解されたい。

【0234】

本発明のバイオリアクターデバイスを調製した後、デバイス自体又はデバイスと一体化している足場材料(例えば、単線ワイヤ足場、二線ワイヤ足場、中空管状足場、一体化したチャネル/血管系を有する三次元足場)に、所望の細胞又は細胞の組を播種することができる。細胞は、当分野で知られている方法、例えば、Teebkenら、Eur J. Vasa Endovasc. Surg.、19、381頁、(2000年)、Ranucciら、Biomaterials、21、783頁、(2000年)を使用して、秩序的な様式でデバイス又は足場上に播種することができる。また、組織工学的に作製したデバイスは、Burgら、J. Biomed. Mater. Res、51、642頁、(2000年)の方法を使用して、ポリマー足場の全体にわたって細胞を播種し、移植前の事前に決定した一定期間の間、細胞をin vitroで増殖させることによって改善することができる。

【0235】

本発明の目的のために、「動物細胞」は、内皮細胞、実質細胞、骨髄細胞、造血細胞、筋肉細胞、骨芽細胞、幹細胞、間葉細胞、胚性幹細胞、又は線維芽細胞を含むことができる。実質細胞は、心臓、肝臓、膵臓、腸管、脳、腎臓、生殖組織、肺、筋肉、骨髄、又は幹細胞を含めた任意の臓器に由来することができる。

【0236】

一実施形態では、最初に、鋳型又はポリマー足場に肝細胞若しくは近位尿細管細胞等の実質細胞、又は内皮細胞の層を播種する。この層は、集団の倍化を得るために、一定期間、例えば一週間程度の間培養を維持することができる。これは、内部の細胞への十分な酸素供給を確実にするために、灌流バイオリアクター中で維持することができる。

【0237】

細胞の組を本発明の三次元の装置/デバイス内に添加又は播種することができ、これは、添加又は播種した細胞による細胞接着及び成長の鋳型として役割を果たすことができる。添加又は播種した細胞は、肝細胞又は近位尿細管細胞等の実質細胞であり得る。幹細胞も使用することができる。内皮細胞等の第2の細胞組は、第1の細胞組を播種するために使用したものとは異なる容器を介して組み立てた装置上に添加又は播種することができる。細胞の播種はゆっくりとした流れによって行う。実際には、装置の幾何学が流速を決定する。一般に、内皮細胞は、約10〜50μmの微細機械加工したチャネル内に入り、血管壁を形成することができる。したがって、組み立てた装置は、臓器の機械的フレームワークとして役割を果たすことに加えて、細胞が自身を位置づけして肝臓中の血管等の下位系を形成するための機械的マップを有するように、臓器の全ての微細構造的な複雑さの鋳型を提供する。

【0238】

成長因子又はホルモン等の分子は、デバイス/足場の表面(例えば吸収による)に物理的に捕捉される、又はそれに共有的に付着されて、それ上で培養された細胞の成長、分裂、分化、又は成熟をもたらす。他の実施形態では、本明細書に開示したバイオリアクター系のデバイス/足場には、デバイス/足場を構成するポリマー中に直接一体化された(例えば共有又は非共有的な相互作用)、例えばポリマー材料と共有結合又は非共有結合を形成し、ポリマーのバルク加工中に添加することができる、成長因子及びホルモン並びに他の適切な組織培養剤等の材料が含まれ得る。

【0239】

製造方法
様々な実施形態では、開示したデバイスは、任意の適切な微細製作技法を使用して組み立て及び/又は製造することができる。そのような方法及び技法は当分野で広く知られている。更に、例示的な製作方法は、本明細書に提供する実施例に例示されている。

【0240】

本明細書に開示したバイオリアクターデバイスの作製に使用することができる微細製作プロセスには、リソグラフィー、エッチング技法、例えば、レーザー、プラズマエッチング、フォトリソグラフィー、若しくは湿式化学、ドライ、及びフォトレジスト除去等の化学エッチング、又は三次元印刷(3DP)、ステレオリソグラフィー(SLA)、選択的レーザー焼結(SLS)、弾道粒子製造(BPM)、及び融合蒸着モデリング(FDM)を含めた固体フリーフォーム技法、微細機械加工、ケイ素の熱酸化、電気メッキ及び無電解メッキ、ホウ素、リン、ヒ素、及びアンチモンの拡散等の拡散プロセス、イオン注入、膜蒸着、例えば、蒸発(フィラメント、電子ビーム、フラッシュ、シャドーイング、及びステップカバレージ)、スパッタリング、化学蒸着(CVD)、エピタクシー(蒸気相、液相、及び分子線)、電気メッキ、スクリーニング印刷、ラミネート、又はその組合せによるものが含まれる。Jaeger、Introduction to Microelectronic Fabrication (Addison-Wesley Publishing Co.、マサチューセッツ州Reading、1988年)、Runyanら、Semiconductor Integrated Circuit Processing Tehnology (Addison-Wesley Publishing Co.、マサチューセッツ州Reading、1990年)、Proceedings of the IEEE Micro Electro Mechanical Systems Conference 1987〜1998年、Rai-Choudhury編、Handbook of Microlithography, Micromachining & Microfabrication (SPIE Optical Engineering Press、ワシントン州Bellingham、1997年)を参照されたい。鋳型として使用する材料の選択により、表面がどのように構成されて分枝状の構造を形成するかが決定される。以下の方法が鋳型の作製に好ましい。

【0241】

例えば、フォトリソグラフィープロセス及び半導体業界に由来する方法を利用した、微小電気機械系(MEMS)を製作する最新技術プロセスを使用し得る。より近年に開発された方法には、「ソフトリソグラフィー」(Whitesidesら、Angew chem. Int編、37; 550〜575頁、(1998年))及び微小流体構築学(米国特許第6,488,872号、Beebeら、Nature; 404:588〜59頁(2000年))が含まれる。ポリマー微小デバイスの製作に関する総説及び他の記述には、そのそれぞれが本明細書に参照により組み込まれているMadou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization;第2版; CRC Press: Boca Raton、1997年、Becker, H.、及びLocascio, L. E. 「Polymer microfluidic devices.」Talanta、56(2):267〜287頁、2002年、Quake, S. R.、及びScherer, A. 「From micro- to nanofabrication with soft materials.」Science、290(5496):1536〜1540頁、2000年、並びにWhitesides, G. M.、及びStroock, A. D. 「Flexible methods for microfluidics.」Physics Today、54(6):42〜48頁、2001年が含まれる。

【0242】

また、微細ステレオリソグラフィー技法も本発明のデバイスの製作に企図される。微細ステレオリソグラフィーとは、光活性単量体を用いて集束光源を取り込む技法である(そのそれぞれが本明細書に参照により組み込まれているChatwin, C.、Farsari, M.、Huang, S. P.、Heywood, M.、Birch, P.、Young, R.、及びRichardson, J. 「UV microstereolithography system that uses spatial light modulator technology.」Applied Optics、37(32):7514〜7522頁、1998年、Cumpston, B. H.、Ananthavel, S. P.、Barlow, S.、Dyer, D. L.、Ehrlich, J. E.、Erskine, L. L.、Heikal, A. A.、Kuebler, S. M.、Lee, I. Y. S.、McCord-Maughon, D.、Qin, J. Q.、Rockel, H.、Rumi, M.、Wu, X. L.、Marder, S. R.、及びPerry, J. W. 「Two-photon polymerization initiators for three-dimensional optical data storage and microfabrication.」Nature、398(6722):51〜54頁、1999年、Neckers, D. C.、Hassoon, S.、及びKlimtchuk, E. 「Photochemistry and photophysics of hydroxyfluorones and xanthenes.」Journal of Photochemistry and Photobiology A--Chemistry、95(1):33〜39頁、1996年)。連続的な断面層を互いの上に硬化させることにより三次元構造がもたらされる。多くの場合、このプロセスは高度に並行の製作を容易にはせず、高解像度の微細構造の製作には比較的長い時間が必要である。このようなプロセスを使用して本発明のデバイスを製作し得る。

【0243】

また、開示したデバイスは、ポリマーデバイスの製作の別の戦略である熱エンボス加工を含む技法も企図する(そのそれぞれが本明細書に参照により組み込まれているMadou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization;第2版; CRC Press: Boca Raton、1997年、Becker, H.、及びHeim, U. 「Hot embossing as a method for the fabrication of polymer high aspect ratio structures.」Sensors and Actuators A--Physical、83(1-3):130〜135頁、2000年)。これにはエンボス加工ツールとして知られる金属又は半導体のスタンプ又は鋳型を必要とし、これをポリマー基質のガラス転移温度より高くまで加熱する。ツールに圧力を与え、凹のトポグラフィーが柔らかくなったポリマーに転写される。系を冷却し、スタンプを取り除き、ポリマーはエンボス加工ツールのレリーフ構造を保持している。高解像度のデザインをもたらすが、元となるツールの微細機械加工を行う施設を必要とする。更に、デザインは一層に限定されるか、又は複数の層を正確に一致させて一緒にラミネートしなければならない。

【0244】

また、本発明は、開示したデバイスを製作するためにソフトリソグラフィーも用い得る。ソフトリソグラフィーは様々な具体的な技法を包含する。一般に、これらのプロセスはフォトリソグラフィーを必要とせず、エラストマー製のマスター(多くの場合はポリ(ジメチルシロキサン)、PDMS)を任意のレリーフ構造から作製し、これを使用して、ポリマーを含めたいくつかの異なる表面上に特長をパターン形成する(Anderson, J. R.、Chiu, D. T.、Jackman, R. J.、Cherniavskaya, O.、McDonald, J. C.、Wu, H. K.、Whitesides, S. H.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of topologically complex three-demensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping.」Analytical Chemistry、72(14):3158〜3164頁、2000年、Duffy, D. C.、McDonald, J. C.、Schueller, O. J. A.、及びWhitesides, G. M. 「Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).」Analytical Chemistry、70(23):4974〜4984頁、1998年、Love, J. C.、Anderson, J. R.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of three-dimensional microfluidic systems by soft lithography.」MRS Bulletin、26(7):523〜528頁、2001年、Wu, H. K.、Odom, T. W.、Chiu, D. T.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of complex three-dimensional microchannel systems in PDMS.」Journal of the American Chemical Society、125(2):554〜559頁、2003年、xia, Y. N.、及びWhitesides, G. M. 「Soft lithography.」Annual Review of Materials Science、28:153〜184頁、1998年)。全体的な方法はいくつかの具体的な技法に分類されている(例えば、微細接触印刷、レプリカ成形(REM)、微細転写成形、毛細管内微細成形(MIMIC)、及び溶媒支援微細成形(SAMIM)(Xia, Y. N.、及びWhitesides, G. M. 「Soft lithography.」Annual Review of Materials Science、28:153〜184頁、1998年))。しかし、ソフトリソグラフィーの方法に含まれる個々の技法は全て、PDMSマスターをレリーフ構造から製作することを必要とし、これは多くの場合は表面を微細機械加工したケイ素ウエファーである。これらの技法のそれぞれを、開示したデバイスを微細製作するために本発明において用い得る。

【0245】

また、微細成形技法も企図される。微細成形技法は周知である(そのそれぞれが参照により組み込まれているAnderson, J. R.、Chiu, D. T.、Jackman, R. J.、Cherniavskaya, O.、McDonald, J. C.、Wu, H. K.、Whitesides, S. H.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of topologically complex three-demensional microfluidic systems in PDMS by rapid prototyping.」Analytical Chemistry、72(14):3158〜3164頁、2000年、Duffy, D. C.、McDonald, J. C.、Schueller, O. J. A.、及びWhitesides, G. M. 「Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane).」Analytical Chemistry、70(23):4974〜4984頁、1998年、Wu, H. K.、Odom, T. W.、Chiu, D. T.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of complex three-dimensional microchannel systems in PDMS.」Journal of the American Chemical Society、125(2):554〜559頁、2003年、Hanemann, T.、Ruprecht, R.、及びHausselt, J. H. 「Micromolding and photopolymerization.」Advanced Materials、9(11):927〜929頁、1997年)。手短に述べると、この技法は、PDMS鋳型の陥凹領域を単量体又はポリマーの溶液で埋め、硬化させる又は溶媒を蒸発させてポリマーを固化させることを伴う。これらの方法では、鋳型の凹の転写が得られる。最後に、マスターを取り除き、同じ様式で再利用することができる。他のソフトリソグラフィー技法と同様、それぞれの層は別々のマスターを必要とする。更に、多くの場合、隣接
する層は物理的に接着されている。或いは、多層PDMS構造の場合、隣接する層は接触する際に共有結合し、このことは、接触の前に正確に一致させることが重要であることを示唆している。

【0246】

また、ステップアンドフラッシュインプリントリソグラフィー(S-FIL)も企図される。S-FILとは、機械的インプリントに基づくナノパターン形成の別の技法であるが、液体レジストとしてUV硬化性液体材料を使用する。S-FILでは、液体レジストを液滴の形態で基質上に分注し、その後、鋳型を基質と接触させ、基質に対して押しつけて液体レジストを拡げ、それによって液体レジストのフィルムを形成する。その後、UV光への露光によってこのフィルムを硬化させる。S-FILは室温で実施することができ、したがって、慣用のNILのように高温を必要としない。しかし、S-FILで使用する慣用のUV硬化性液体材料は、典型的にはアクリル官能性の単量体及びオリゴマーのフリーラジカル重合に関与する機構に基づいているため、S-FILは未だ理想的ではない。UV硬化性液体材料は、典型的には硬化後に大幅な収縮を示す。更に、UV硬化性液体材料は酸素感受性となりやすく、酸素がフリーラジカル種を除去してレジストフィルムの表面での重合を阻害する。その結果、レジストフィルムは、レジストフィルムにおいて形成される結果的なパターンにおいて、欠陥が生じやすい。

【0247】

また、フォトポリマーの直接フォトリソグラフィーも企図される。この技法は、ポリマー微小デバイスを製作するための頑強な方法である。この技術の最も一般的な適用は、任意のフォトリソグラフィーの適用における、フォトレジストの使用である。ほとんどのフォトレジストは3つの成分、すなわち、レジストを基質上に拡げるための溶媒、エッチング液に抵抗する有機ポリマー、及びUV照射に曝露された後にポリマーの反応又は溶解(化学及び加工工程に依存する)を引き起こす光増感剤を含有する(Madou, M. J. Fundamentals of Microfabrication: The Science of Miniaturization;第2版; CRC Press: Boca Raton、1997年)。パターン形成したレジストは、単純なデバイスとして使用することができるか、又は別のポリマーの凹型の鋳型として使用することができる(例えばソフトリソグラフィー技法のレリーフ構造)。所望のポリマーをレジスト鋳型中で硬化させた後、標準の方法によってレジストを取り出すことができる。

【0248】

Beebeら(米国特許第6,488,872号)は、微小スケール流体チャネルを有する基質から製造した微細製作したデバイスに関し、Beebeらの微小スケール流体チャネルは約1ミクロンから約1ミリメートルの断面直径を有しており、その開示された技法は、本発明に適用してよく、本明細書に参照により組み込まれている。ポリマー成分は、液相の重合可能な混合物の直接フォトパターン形成を介して、カートリッジ内で作製される。Beebeらは、物体間で起こる部分重合が原因で、すぐ近くにある構造(すなわち約300ミクロン)は典型的には同時には製作されないと述べている。Beebe及び共同研究者(Khoury, C.、Mensing, G. A.、及びBeebe, D. J. 「Ultra rapid prototyping of microfluidic systems using liquid phase photopolymerization.」Lab On a Chip、2(1):50〜55頁、2002年、Beebe, D. J.、Moore, J. S.、Yu, Q.、Liu, R. H.、Kraft, M. L.、Jo, B. H.、及びDevadoss, C. 「Microfluidic tectonics: A comprehensive construction platform for microfluidic systems.」Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、97(25):13488〜13493頁、2000年、Beebe, D. J.、Moore, J. S.、Bauer, J. M.、Yu, Q.、Liu, R. H.、Devadoss, C.、及びJo, B. H. 「Functional hydrogel structures for autonomous flow control inside microfluidic channels.」Nature、404(6778):588〜590頁、2000年)は、多官能性単量体の光重合を使用して、微小流体系のためのチャネル、弁、及びポンプを製作した。具体的には、Beebeらは、様々な弁及びセンサーの設計のために、ヒドロゲルネットワーク(すなわち緩く架橋結合した、水の存在下で膨潤する親水性ポリマー)を疎水性ポリマーチャネル内に取り込ませた。巨視的ネットワークで中の膨潤の動力学は、弁操作にははるかに遅すぎるが、微小スケールでの表面積対体積率の顕著な増加は、ヒドロゲル弁の比較的速い作動を容易にする(数秒間単位)(De, S. K.、Aluru, N. R.、Johnson, B.、Crone, W. C.、Beebe, D. J.、及びMoore, J. 「Equilibrium swelling and kinetics of pH-responsive hydrogels: Models, experiments, and simulations.」Journal of Microelectromechanical Systems、11(5):544〜555頁、2002年)。他のグループは、微小流体弁を形成するためのチャネル内のモノリスの直接光重合(Hasselbrink, E. F.、Shepodd, T. J.、及びRehm, J. E. 「High-pressure microfluidic control in lab-on-a-chip devices using mobile polymer monoliths.」Analytical Chemistry、74(19):4913〜4918頁、2002年、Kirby, B. J.、Shepodd, T. J.、及びHasselbrink, E. F. 「Voltage-addressable on/off microvalves for high-pressure microchip separations.」Journal of Chromatography A、979(1-2):147〜154頁、2002年)、及び分離又はコンビナトリアル化学プラットフォーム(Peters, E. C.、Svec, F.、Frechet, J. M. J.、Viklund, C.、及びIrgum, K. 「Control of porous properties and surface chemistry in "molded" porous polymer monoliths prepared by polymer
ization in the presence of TEMPO.」Macromolecules、32(19):6377〜6379頁、1999年、Tripp, J. A.、Svec, F.、及びFrechet, J. M. J. 「Grafted macroporous polymer monolithic disks: A new format of scavengers for solution-phase combinatorial chemistry.」Journal of Combinatorial Chemistry、3(2):216〜223頁、2001年)を使用している。

【0249】

特定の実施形態では、ケイ素、炭素、及び窒素を含有するマルチビニル単量体の前駆材料(すなわちCeraset)を微細製作に使用することができる。(Yang, H.、Deschatelets, P.、Brittain, S. T.、及びWhitesides, G. M. 「Fabrication of high performance ceramic microstructures from a polymeric precursor using soft lithography.」Advanced Materials、13(1):54〜58頁、2001年、Liew, L. A.、Zhang, W. G.、Bright, V. M.、An, L. N.、Dunn, M. L.、及びRaj, R. 「Fabrication of SiCN ceramic MEMS using injectable polymer-precursor technique.」Sensors and Actuators A--Physical、89(1-2):64〜70頁、2001年、Liew, L. A.、Liu, Y. P.、Luo, R. L.、Cross, T.、An, L. N.、Bright, V. M.、Dunn, M. L.、Daily, J. W.、及びRaj, R. 「Fabrication of SiCN MEMS by photopolymerization of pre-ceramic polymer?」Sensors and Actuators A--Physical、95(2-3):120〜134頁、2002年、Liew, L. A.、Saravanan, R. A.、Bright, V. M.、Dunn, M. L.、Daily, J. W.、及びRaj, R. 「Processing and characterization of silicon carbon-nitride ceramics: application of electrical properties towards MEMS thermal actuators.」Sensors and Actuators A--Physical、103(1-2):171〜181頁、2003年、Seok, W. K.、及びSneddon, L. G. 「Synthesis and ceramic conversion reactions of decaborane-CERASET polymers: New processable precursors to SiC/Si3N4/BN ceramics.」Bulletin of the Korean Chemical Society、19(12):1398〜1402頁、1998年)。直接フォトリソグラフィーUV露光による光重合の後、微細製作したポリマーを熱分解して、高温での適用に有用性を有する非晶質Si--C--Nセラミックを作製することができる。

【0250】

微細機械加工を、直径が約50〜300ミリメートル(mm)の範囲、好ましくは約100mm、厚さが約200〜1200μmの範囲の標準のバルク単結晶ケイ素ウエファーに対して行うことができる。これらのウエファーは、標準の半導体材料の多数の販売者から入手することができ、切り取って研磨することで、正確な寸法であり、均一な結晶学的配向であり、高度に研磨された、光学的に平らな表面を提供する。また、パイレックス(登録商標)ホウケイ酸又は他のガラスから作られたウエファーも、入手して微細機械加工プロセスに挿入することができ、代替方法を使用してガラス質材料をエッチングする。

【0251】

本発明のバイオリアクターデバイスの幾何学、特に、必要な異なる特長の深さの数は、製作するための特定の工程シーケンスを決定する因子である。最も単純な事例は、鋳型の単一の深さ寸法の例である。具体的には、ケイ素基質では、工程シーケンスは以下のとおりである。まず、ケイ素ウエファーを清浄にし、感光性材料の層を表面に塗布する。典型的には、層を高い回転率で回転させて、均一な厚さのコーティングを得る。フォトレジストを焼成し、その後、半透明のマスクを通してウエファーを紫外線又は他の短波長の光に露光させる。この工程は、所望の画像解像度に応じて、いくつかのマスキング技法のうちの任意の1つを使用して達成することができる。その後、レジストを適切な展開化学において展開させ、ウエファーを硬化焼成させて過剰の溶媒をレジストから除去する。リソグラフィー工程が完了した後、いくつかの可能な化学のうちの1つを使用して、ウエファーをプラズマ反応器内でエッチングすることができる。エッチングは、二次元のパターンを第3の寸法、すなわちウエファー内の特定の深さに転写する役割を果たす。プラズマパラメータは、生じる溝の所望の形状(半円状、直線壁のプロフィール、傾斜側壁)、及びマスキングフォトレジストよりケイ素を優先するエッチング液の選択性によって決定される。エッチングが完了した後、フォトレジストを取り出し、ウエファーを組織成形工程において使用するために調製することができる。

【0252】

本発明は、本明細書で具体的に同定したもの、及び本明細書で明確に開示していないが当業者には知られている任意の他の適切な微細製作プロセスを含めた、本発明のデバイスを作製するための任意の適切な微細製作プロセスを企図する。

【0253】

適用
本発明の三次元組織系は、それだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけに限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e) 損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む様々な適用に有用である。

【0254】

特定の実施形態では、本発明の三次元組織系は、様々な組織構築の培養及び生成に適切であり得る。開示したデバイスは、細胞がin vivoにおいて通常するであろうように成熟及び機能することを可能にするために、in vivoで見つかる天然の組織構造を模倣又は再現するin vitroプラットフォームを提供するように設計し得る。

【0255】

他の実施形態では、開示したデバイスは、数ある中でとりわけ、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等の筋肉細胞、並びにニューロン等の興奮性組織及び肝細胞等の血管に富んだ構造を必要とし得る細胞を含めた様々な組織の培養に適切であり得る。

【0256】

更に他の実施形態では、開示したデバイスは、数ある適用の中でとりわけ、in vitroでの薬物試験、いくつかの異なる区画を有する人体チップの構築、並びに動物又はヒト患者内への直接吻合及び移植を含めた様々な適用に適切であり得る。

【0257】

特定の実施形態では、本発明の三次元の組織工学的に作製した系を使用して、試験薬剤の代謝、毒性、及び有効性を試験することができる。本発明の方法を使用して、代謝又は薬物動態プロフィールが知られていない実験薬物又は「試験薬剤」をスクリーニングすることができ、これにより、毒性を評価するために必要な情報を含めたそのような情報を得る。毒性は、多くの場合は薬物間相互作用の結果として起こる場合がある。したがって、本発明の方法を使用して、試験薬剤と既知の薬物又は他の試験薬剤との組合せを研究することができる。これらの方法は、多くの患者が複数の薬物で処置されているため、臨床設定における使用に特に関連する。

【0258】

一般に、試験薬剤を、治療的であると推定される用量範囲で、効果(例えば、代謝効果又は毒性若しくは有効性を示す効果)を生じるために十分な期間の間、本発明の三次元の組織工学的に作製した系と共にインキュベートすることができる。インキュベーション時間は約1時間〜24時間の範囲であり得るか、又は、必要に応じて数日間、若しくは更には数週間延長することができる。インキュベーション条件は、典型的には、摂氏約37度の培養温度及び選択された特定の細胞種に適合する培養培地を含めた、当分野で知られている標準の培養条件を含む。

【0259】

本発明の方法に従って分析することができる試験薬剤には、それだけに限定されないが、オピオイド鎮痛剤、抗ヒスタミン剤及び非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)等の抗炎症薬、炭酸脱水酵素阻害剤、ループ利尿剤、強力利尿剤、チアジド及びチアジド様薬剤、並びにカリウム保持性利尿剤等の利尿剤、アンギオテンシン変換酵素(ACE)阻害剤等の腎臓系及び心血管系に作用する薬剤、有機硝酸塩等の心臓病の薬、カルシウムチャネル遮断剤、交感神経遮断剤、血管拡張剤、ベータ-アドレナリン作動性受容体作用剤及び拮抗剤、アルファ-アドレナリン作動性受容体作用剤及び拮抗剤、強心配糖体、抗不整脈薬、3-ヒドロキシメチルグルタリル-補酵素A(HMG-CoA)阻害剤等の高リポタンパク質血症に影響を与える薬剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物、抗生物質、及び他の薬物等の抗新生物剤、免疫調節物質、抗糖尿病剤、並びに抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤、及び抗蠕虫剤等の抗微生物剤が含まれるが、これらの薬剤に限定されない。

【0260】

例えば、本発明の三次元組織系を使用して、治療剤に関連する毒性(例えば、心毒性、又は薬物投与に関連する肝毒性)を検出/評価することができる。毒性には3つの一般的なクラスが存在する。急性毒性とは、薬物への曝露から約24時間未満に起こる毒性効果である。亜急性毒性はそれより後の、薬物への曝露から約14〜90日間に起こる。慢性毒性は薬物への曝露から約90日間(以上)に起こる。当分野における現在の方法は、生きた対象を長期間の間モニタリングする必要があるため、亜急性及び慢性毒性の検出に使用するためには最適以下である。本発明の方法は、これらの長い間隔の曝露を包含することができるが、効果はより迅速に検出し得るため、試験薬剤のインキュベーション時間を延長する必要がない。したがって、インキュベーション時間は約1時間〜24時間の範囲であり得るか、又は、必要に応じて数日間、若しくは更には数週間延長することができる。

【0261】

試験薬剤の投与によって引き起こされる毒性の望ましくない効果は、いくつかの方法でスクリーニングすることができる。本発明の組織工学的に作製した系を使用して、試験薬剤の毒性の線量測定の範囲を決定することができる。目的組織に対する漸増する濃度の試験薬剤(すなわち用量)の効果をモニタリングして、毒性を検出することができる。毒性効果を観察する場合は、試験薬剤の濃度/細胞のcm²の測定値と同等とみなすことができる。組織工学的に作製した系における細胞の分布にしたがって毒性濃度を計算することによって、当業者は、生きた系に外挿して、様々な体重及び発生段階にある対象における毒性を推定することができる。

【0262】

本発明の方法を使用し、様々な用量の個々の試験薬剤及び試験薬剤と他の医薬品とのの組合せをスクリーニングして、それだけに限定されないが、不規則な代謝、心毒性、肝毒性、発癌性、腎臓及び神経毒性、並びに細胞死を含めた毒性効果を検出する。代謝の不規則な変化を検出するためには、それだけに限定されないがグルコース代謝及び酵素アッセイを含めた、代謝物の産生をアッセイするための当分野で知られている標準の方法を使用することができる。アッセイする特定の代謝経路、又は測定する代謝物は、選択された組織型に応じて変動する場合がある。

【0263】

発癌性の検出にあたって、当分野で周知の方法、例えば、遺伝子発現の変化、タンパク質レベルの変化、増殖をもたらす異常な細胞サイクル、及びそれだけに限定されないが抗原決定基を含めた細胞表面マーカーの発現の変化を検出する方法を使用して、細胞を形質転換した表現型についてスクリーニングすることができる。遺伝子発現パターンは、例えば、RT-PCR、in situハイブリダイゼーション、及び蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)等の標準のハイブリダイゼーション技法、ノーザン分析又はマイクロチップに基づく分析に従って、目的遺伝子のmRNAレベルを評価することによって決定することができる。タンパク質の発現パターンは、当分野で知られている任意の方法、例えば、定量的ウエスタンブロット、免疫組織化学、免疫蛍光、及び酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、アミノ酸配列分析、並びに/又はタンパク質濃度アッセイによって決定することができる。詳細にはSambrook、Fritsch及びManiatis、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年を参照されたい。FACS分析等の細胞計数及び/又は分離技法を用いて、増殖を測定する、又は異常な細胞表面マーカー発現を検出することができる。

【0264】

また、それだけに限定されないがトンネルアッセイを含めた当分野で周知の標準の方法も、細胞死を検出するために使用することができる。毒物学的スクリーニングにおけるin vitro毒性学の従来の手法は、乳酸デヒドロゲナーゼの放出等の細胞死のプロセス中の比較的遅い事象の測定、又はトリパンブルー、4,6-ジアミノフェニルインドール(DAPI)、ヨウ化プロピジウム、及びMolecular Probes社から入手可能なLIVE/DEAD染色等の生体染色色素を使用した生細胞及び死細胞の示差的計数であった。in vivoでの致死性の予測は、この種のin vitroスクリーニングの1つの提案されている適用であるが、細胞死は、毒性薬剤への急性曝露に続いて動物の死が誘導される共通の機構ではない。対照的に、カスパーゼの活性化は、慢性毒性、細胞死、過剰増殖、及び炎症性反応の共通の特長の中心にある。カスパーゼ活性は、蛍光分光分析によって毒性の侵襲後に比較的素早く測定することができ(30分〜4時間)、したがって高スループットのスクリーニング技法に適する。細胞のアポトーシス又は壊死をモニタリングするために一般的に使用されている他のマーカー及びアッセイには、それだけに限定されないが、罹患細胞の形質膜の外葉におけるホスファチジルセリンの存在、アネキシンV染色、及び末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼニック末端標識アッセイ(TUNEL)を含めることができる。

【0265】

本発明の方法を使用し、様々な用量の個々の試験薬剤及び試験薬剤の組合せを、多様な遺伝的背景を有する組織から構成されるパネルにおいてスクリーニングして、試験薬剤の薬理遺伝学的毒性プロフィールを決定する。例えば、複数用量の試験薬剤、又はそれとの組合せを、1つ又は複数の遺伝的背景に特異的な毒性効果についてスクリーニングする。遺伝分散についてスクリーニングする毒性効果には、それだけに限定されないが、不規則な代謝、発癌性、及び細胞死が含まれる。

【0266】

本発明の組織工学的に作製したデバイスを並行して改変して、様々な代謝酵素の現在知られている遺伝的多型性の包括的なアレイを作製することができる。顕著な例は、集団が、薬物代謝、薬物クリアランス、及び毒性の予測モデルに影響を与えて複雑化する複数のアイソフォーム及び多型性を含む、CYP450モノオキシゲナーゼ系である。例えば、チオグアニン等のチオプリンの代謝では、律速酵素は異なる多型形態を有するメチルトランスフェラーゼである。メチルトランスフェラーゼの多型性はチオプリンの代謝に影響を与えることが知られている。多型性がチオプリンのより遅い代謝をもたらす場合は臨床上の利点が減少し、多型性が代謝率の増加をもたらす場合は毒性が生じる場合がある。したがって、本発明の方法を使用して、メチルトランスフェラーゼ等の酵素の様々な多型形態の存在下における、様々な試験薬剤の代謝プロフィールを決定することができる。

【0267】

多型変動又は他の遺伝的欠陥が原因の示差的毒性の試験において、薬物代謝及び毒性に影響を与えることが知られている特定の酵素の遺伝子ノックアウト又はノックインを含む遺伝子操作細胞を、本発明の系において使用することができる。数ある中でとりわけ、RNA干渉(RNAi)、アンチセンス技術、リボザイム、部位特異的突然変異誘発等の、当業者に知られている技法を使用して細胞を改変することができる。

【0268】

代謝に対する効果を評価する場合、液体クロマトグラフィー等の当分野で周知の方法を使用して、知られている場合は代謝物のレベルを代謝活性の反映として検出することができる。液体クロマトグラフィーと連結させたタンデム質量分析検出(LC/MS/MS)を、初期吸収、分布、代謝、及び排出試験をモニタリングするための分析方法として使用することができる。この方法は、優れた感度、特異性、及び高試料スループットを提供する。三連四重極機器での反応のモニタリングによって得られる定量的選択性は、高いクロマトグラフィー解像度又は大規模な試料の精製の必要性を排除する。オンラインカラムスイッチ等の自動試料処理技法を、高試料密度マイクロタイタープレートと組み合わせて使用することで、分析スループットを更に最大化することができる。また、最新のLC/MS/MSは、最小限の量の生物学的マトリックスのみを使用して、1mlあたりナノグラム未満の範囲までの検出限界の拡張も提供する。

【0269】

LC/MS/MSは、新しい薬物候補の迅速かつ感受性の高い定量を可能にし、また、代謝物に関する重要な構造情報を提供する。完全走査LC/MS分析は、観察されるイオン種に基づいて、可能性のある酸化的変化及び/又は抱合代謝の変化を最初に示唆することができる。MS/MSモードでは、機器を選択された目的前駆イオンに調整することができ、その後、これは更に断片化されて、代謝をユニークに同定する生成物イオンを形成する(生成物イオン走査)。

【0270】

選択性は、一連の電極によって拘束された空間内にイオンを「トラップ(捕捉)する」デバイスである、四重極イオントラップによって更に増強することができる。イオントラップのユニークな特長は、MS/MS実験(又は実際にはマルチステップMS実験)を単一の質量分析器内で逐次的に行い、豊富な構造情報を入手できることである。また、ハイブリッド四重極-飛行時間(Q-TOF)LC/MS/MS系も、代謝物プロフィールの特徴付けに使用することができる。Q-TOFの立体配置は様々な走査モードにおいて質量分解能の高感度及び質量の正確さをもたらす。

【0271】

液体クロマトグラフィーと連結させた核磁気共鳴分光分析(LC-NMR)は、絶対的な分子立体配置を確認する方法を提供する。線形イオントラップ質量分析装置は、三連四重極MSの全ての走査機能を保持したまま、顕著に増強された生成物イオン走査能力を保有する。フーリエ変換イオン-サイクロトロン共鳴MS(FI-ICRMS)の超高解像度及び感度は、生物学的混合物の分析及び特徴付けに有用な場合がある。また、データ処理及び解釈のソフトウェアパッケージも、本発明の組織工学的に作製したデバイスを使用した代謝物の効率的な同定及び定量を可能にする。

【0272】

in vitro薬物代謝を研究するために幅広く使用されている方法は、組織ホモジネートの使用である。本発明の三次元の系内の組織を試験薬剤の存在下で培養し、採取して、酵素分析において使用するための組織ホモジネート調製物を得ることができる。組織ホモジネートの調製は当分野で周知であり、組織のホモジナイゼーション及び細胞成分の分画の工程により、薬物代謝において日常的に研究されている2つの主画分、すなわちポストミトコンドリア上清及び小胞体(ミクロソーム)画分を得ることを含む。

【0273】

また、本発明の三次元組織培養デバイスを使用して試験薬剤の有効性を評価することもできる。有効性は、本発明の三次元の系中で成長させた損傷組織を含む疾患モデルの修復、増強、改善、及び/又は再生に関連する個々のパラメータを測定することによって検出することができる。本発明の疾患モデルにおいて、傷害は、誘導することができるか、又は、遺伝性の遺伝子異常に関連する条件を含めた、組織ドナーにおける既存の条件の結果であり得る。誘導又は既存の条件はどちらも以前の薬物曝露の結果生じた脆弱状態を含むことができる。試験薬剤又は試験薬剤の組合せを、本発明の疾患モデルにおいて有効性について分析することができる。

【0274】

一実施形態では、選択された目的組織を、細胞損傷を引き起こすことが当分野で知られている薬剤(例えば、毒素、突然変異原、放射線、感染性因子、及び化学薬品)で処理して、組織中に傷害を誘導することができる。別の実施形態では、選択された目的組織を、標準の組換え技法を使用して変更して、病状を誘導することができる。例えば、相同組換えの技法を使用して、細胞内に導入遺伝子を挿入するか、又は目的遺伝子の遺伝子発現を「ノックアウト」することができる。相同組換えの総説には、Lewin, B.、Genes V、Oxford University Press、ニューヨーク、1994年、968〜997頁、及びCapecchi, M.、(1989年)、Science、244:1288〜1292頁、Capecchi, M.、(1989年)、Trends Genet.、5 (3):70〜76頁を参照されたい。別の実施形態では、選択された目的組織は、遺伝性の遺伝的欠陥の結果として損傷しており、これは単一の遺伝子欠損又は多因子欠損であり得る。遺伝性の障害の記述には、Thompson、McInnes及びWillard、Genetics in Medicine、第5版、W.B. Saunders Company、1991年を参照されたい。

【0275】

本発明の組織工学的に作製した系を使用して、試験薬剤の有効な線量測定の範囲を決定することができる。目的組織に対する漸増する濃度の試験薬剤(すなわち用量)の効果をモニタリングして、有効性を検出することができる。治療効果を観察する場合は、濃度/細胞のcm²の測定値と同等とみなすことができる。組織工学的に作製した系における細胞の分布にしたがって有効濃度を計算することによって、当業者は、生きた系に外挿して、様々な体重の対象における治療的用量を推定することができる。

【0276】

本発明の方法を使用し、様々な用量の個々の試験薬剤及び試験薬剤の組合せを、多様な遺伝的背景を有する組織から構成されるパネルにおいてスクリーニングして、試験薬剤の薬理遺伝学的有効性プロフィールを決定する。例えば、複数用量の試験薬剤、又はそれとの組合せを、1つ又は複数の遺伝的背景に特異的な有効性、又はその欠如についてスクリーニングする。

【0277】

本発明の方法は、任意の種類の組織を使用して実施することができる。以下の説明は、肝臓、心臓、及び腎臓に由来する細胞と共に本発明の系/デバイスを使用することが含まれる、本発明の3つの好ましい実施形態に関する具体的な情報を提供する。

【0278】

肝臓
肝臓は、インスリンホルモンの影響下で血液からグルコースを除去し、グリコーゲンとしてそれを補完することによって、炭水化物の代謝において主要な役割を果たす。血中のグルコースのレベルが低下した場合、グルカゴンホルモンは、肝臓がグリコーゲンを分解してグルコースを血中に放出することを引き起こす。また、肝臓は、主にアミノ酸の脱アミノ化、及びそれにより生じる毒性があるアンモニアを尿素へと変換することによって、タンパク質の代謝においても重要な役割を果たし、尿素は腎臓によって排泄することができる。更に、肝臓は、トリグリセリドの保管、脂肪酸の分解、及びリポタンパク質の合成によって、脂質代謝に関与する。また、肝臓は脂肪、コレステロール、リン脂質、及びリポタンパク質の消化を助ける胆汁も分泌する。

【0279】

代謝機能の分析は肝臓中の毒性を示す。したがって、本発明の肝臓の組織工学的に作製した系では、特定の試験薬剤の毒性を検出するための代謝アッセイが好ましい。それだけに限定されないが、チトクロムP450、アルカリホスファターゼ、アルファ-ガラクトシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、アルファ-グルコシダーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、アルファ-グルクロニダーゼ、ベータ-グルクロニダーゼ、及びアルファ-アミラーゼ等の糖分解酵素、NADPH-チトクロムP450レダクターゼ、チトクロムb₅、N-デメチラーゼ、O-デメチラーゼ、数あるエステラーゼの中でとりわけアセチルコリンエステラーゼ、偽コリンエステラーゼ、エポキシド加水分解酵素、アミダーゼ、ウリジン二リン酸(UDP)-グルクロノシルトランスフェラーゼ、フェノールスルホトランスフェラーゼ、アルコールスルホトランスフェラーゼ、ステリッドスルホトランスフェラーゼ、及びアリールアミンスルホトランスフェラーゼ、UDP-グリコシルトランスフェラーゼ、プリンホスホリボシルトランスフェラーゼ、N-アセチルトランスフェラーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフェラーゼ、非特異的N-メチルトランスフェラーゼ、イミダゾールN-メチルトランスフェラーゼ、カテコール-O-メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシインドール-O-メチルトランスフェラーゼ、及びS-メチルトランスフェラーゼ、アルコール脱水素酵素、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、キサンチンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、例えばモノアミンオキシダーゼ、ジアミンオキシダーゼ、フラビンタンパク質N-オキシダーゼ、及びヒドロキシラーゼ、アロマターゼ、システインコンジュゲートベータ脱離酵素、及びアルキルヒドラジンオキシダーゼを含めた代謝酵素を、当分野で周知のアッセイを使用して代謝活性について試験することができる(このことは、本出願の他の部分に詳述されている)。試験することができるチトクロムp450酵素には、それだけに限定されないが、CYP1A1、CYP1A2、CYP2A3、CYP2B6、CYP2B7、CYP2B8、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2D6、CYP2D7、CYP2D8、CYP2E1、CYP2F1、CYP3A3、CYP3A4、CYP3A5、及びCYP4B1が含まれる。

【0280】

一実施形態では、試験薬剤は抗ウイルス活性、最も好ましくは肝炎に対する抗ウイルス活性を含む。現在、安全かつ有効な肝炎の処置の大きな必要性が存在する(Mutchnick, M. G.ら、Antiviral Research (1994年)、24:245〜257頁)。例えば、慢性B型肝炎を処置するためのヌクレオシド類似体フィアルウリジン(FIAU)の使用に関する臨床試験は、一部の患者に死をもたらした薬物関連の肝不全が原因で、最近一時中断された。また、肝炎に対して有効性を実証する試験薬剤も、投与後に代謝機能、好ましくはチトクロムP450及びアルカリホスファターゼの代謝機能をモニタリングすることによって、急性、亜急性、及び慢性毒性についてスクリーニングすることができる。

【0281】

試験薬剤は、それだけに限定されないが、潰瘍性大腸炎及びクローン病等の炎症性腸疾患の合併症として高頻度で発生すると報告されている、癌、糖尿病、急性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎、肝硬変、脂肪肝、アルコール性肝障害、薬物誘導性肝障害(薬物嗜癖肝炎)、鬱血性肝炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、及び肝性ポルフィリン症、並びに胆管周囲炎、硬化性胆管炎、肝線維症、及び慢性活動性肝炎を含めた疾患に罹患した肝細胞を含む本発明の組織工学的に作製した系における有効性についてスクリーニングすることができる。

【0282】

好ましくは、試験薬剤を、肝細胞壊死の進行を低下若しくは予防する、及び/又は肝臓の再生を加速するその能力についてアッセイする。例えば、肝組織の再生中にアップレギュレーションされる遺伝子であるRasp-1の発現レベルを、試験薬剤の投与後にモニタリングすることができる。Rasp-1は、Rasp-1の配列、抗体、及びアッセイに関する記述についてその内容が本明細書に参照により組み込まれている米国特許第6,027,935号に記載されている。

【0283】

好ましい実施形態では、試験薬剤を、肝炎ウイルス感染症、特にB型肝炎及びC型肝炎の感染症の処置における有効性についてスクリーニングする。ヒト疾患の媒介物として顕著である他の肝炎ウイルスには、A型肝炎、デルタ型肝炎、E型肝炎、F型肝炎、及びG型肝炎が含まれる(Coates, J. A. V.ら、Exp. Opin. Ther. Patents、(1995年)、5 (8): 747〜756頁)。試験薬剤は、例えば、ヌクレオシド類似体抗ウイルス剤、免疫調節物質、免疫賦活剤(例えばインターフェロン及び他のサイトカイン)、又は、それだけに限定されないが、胸腺ペプチド、イソプリノシン、ステロイド、ツカレソール、レバミソール等のシッフ塩基形成サリチルアルデヒド誘導体等を含めた他の免疫系に影響を与える薬物候補を含むことができる(Gish, R. G.ら、Exp. Opin. Invest. Drugs、(1995年)、4 (2):95〜115頁、Coates, J. A. V.ら、Exp. Opin. Ther. Patents、(1995年)、5 (8):747〜765頁)。

【0284】

試験薬剤の抗肝炎有効性は、当分野で知られている方法に従って決定することができる。例えば、試験薬剤を用いた処置の後、培養培地中の肝炎ウイルス又はウイルスDNAの量をPCR分析(例えば沈降した粒子の分析)によって決定することができる。DNA測定をウイルス複製と相関させて、処理後の感染力を評価することができる。或いは、ウイルス量を直接測定することができる。有効性の他の測度には、それだけに限定されないが、SGOT、ALT、及びLDHを含めた酵素レベルの測定、組織学的分析、並びに凝固因子等の全肝臓タンパク質の正常な産生が含まれる。

【0285】

好ましい実施形態では、試験薬剤の有効性を、C型肝炎ウイルスに感染した肝組織において決定する。好ましい実施形態では、試験薬剤を、肝臓癌の処置における有効性についてスクリーニングする。試験薬剤を用いた処置に応答した、形質転換した肝細胞の低下又は排出は、高カルシウム血症及びCEA発現の減少を測定することによって検出することができる。また、増殖の低下は、細胞の計数によって決定することができる。

【0286】

心臓
本発明の心臓の組織工学的に作製した系における試験薬剤の毒性効果は、当分野で知られている様々なアッセイを使用して検出することができる。例えば、特定の試験薬剤の毒性を検出するためのアッセイは、好ましくは、QT間隔、電気生理学的変化(例えばK⁺/Ca²⁺チャネルhERGの変化)、及び/又はT波交互脈(TWA)による不整脈の測定を含む。

【0287】

心電図の交互性とは、1つおきの拍動で起こる、ECGの成分の振幅及び/又は形態の変化として定義される(Walker, M. L.及びRosenbaum, D. S.、(2003年)、Cardiovasc. Res. 57: 599〜614頁)。TWAとはT波振幅の拍動間での変化であり、心臓における電気的不安定性と密に関連している。拍動間のT波のマイクロボルトの周期的変動は、高解像度の電極及びシグナル処理技法を使用して検出することができる(Gold, M. R.、及びSpencer, W. (2003年)、Curr. Opin. Cardiol. 18: 1〜5頁)。多数の拍動、一般には128回をサンプリングし、T波上の複数の対応する点の電位を計算して平均を出す。高速フーリエ変換によって、これらの連続した振幅をスペクトルで表示し、いくつかの周波数のピークが得られる。これらのピークは、呼吸に伴う胸部可動域、他の反復性の身体の動き、及び周囲の電気ノイズに対応する。0.5サイクル/拍動でのピークが存在する場合、これはTWAによって引き起こされている。交互性の規模であるV_altは偶数又は奇数の拍動間の差を表し、平均振幅はマイクロボルトである。1.9uVの閾値を有意性に使用する。交互性の比(k)は、測定した別のパラメータであり、バックグラウンドノイズのSDに対する交互性の振幅の比を表す。有意性のためには3.0より高いことが必要である。更に、TWAは1分間より長く持続しなければならない。

【0288】

試験薬剤は、それだけに限定されないが、鬱血性心不全、冠動脈疾患、心筋梗塞、心筋虚血、アテローム性動脈硬化症又は高血圧の効果、心筋症、心不整脈、筋ジストロフィー、筋肉量異常、筋変性、重症筋無力症、感染性心筋炎、薬物及び毒素誘導性の筋肉異常、過敏症心筋炎、自己免疫性心内膜炎、及び先天性心疾患を含めた疾患に罹患した心細胞を含む本発明の組織工学的に作製した系における有効性についてスクリーニングすることができる。好ましくは、試験薬剤を、心臓の再生を加速させる、又は収縮の特性を改善させるその能力についてアッセイする。一般に、有効性は、改善された収縮性、電気機械的伝導及び/又は関連、電気的機能不全に対する感受性、心室細動(突然死)、イオノトロピー、変時性、並びに酵素の漏れの減少(例えばCPK及びSGOT)の検出によって示すことができる。

【0289】

様々な実施形態では、本発明のデバイスは、薬効及び複数の組織との相互作用を研究するために、例えば直列(すなわちタンデム)、平行又はその組合せを含めて、一緒に利用又は連結させることがで、第1の組織種(例えば肝臓)から調製した第1のデバイスを第2の組織種(例えば心臓)から調製した第2のデバイスと直列に連結させることができる。例えば、複数のアンギオチップ又はアンギオチューブ系直列に構成してよく、第1のアンギオチップ/アンギオチューブは1つの種類の細胞又は組織(例えば心臓)から形成され、第2の「下流」又は「上流」のアンギオチップ/アンギオチューブは第2の種類の細胞又は組織から形成される(例えば疾患の心臓又は肝臓)。このようにして、薬物の相互作用を多臓器又は組織系の状況で試験し得る。例えば、試験薬剤を、心組織から調製した第2のアンギオチップ/アンギオチューブの下流に連結されていてよい、肝組織から調製したアンギオチップ/アンギオチューブ内に導入し得る。このようにして、薬物は肝組織と最初に相互作用してよく、それから生じる全ての代謝産物は下流の心組織アンギオチップ/アンギオチューブへと流れてよく、それにより、心機能に対する薬物の代謝の効果を試験することが容易となる。したがって、本発明は、身体における臓器間の薬物の相互作用の試験において使用するための、タンデム(すなわち直列)の様式で配置された複数のデバイスを企図する。任意の考えられる組織の組合せを、タンデムで、例えば心臓/肝臓又は肝臓/心臓で試験することができる。

【0290】

腎臓
医薬品及び生物製剤は腎臓傷害(すなわち腎毒性)の一般的な原因であり、急性腎不全(ARF)の後天性の発症の約20%を引き起こしている。入院患者における急性腎不全(ARF)の発症は、5倍から8倍高い死亡の危険性をもたらす。血液透析、血液濾過、及び腹膜透析の処置は、その小さな溶質及び流体クリアランス機能により高カリウム血症、容積負荷及び心膜炎等の尿毒合併症による死を予防してきたが、ARFに罹患している患者はそれでも50を超える死亡率を有する。これは濾過機能を提供するのみであり、止血、調節、代謝、及び内分泌の機能を交換しないため、完全な腎臓の置換療法ではない。透析中の末期腎臓病の患者は大きな医学的、社会的、及び経済的な問題を抱え続けている。腎毒性を引き起こすことが判明しているほとんどの薬物は、1つ又は複数の共通の発病機構によって毒性効果を発揮する。これらには、糸球体内の血行動態の変更、尿細管細胞毒性、炎症、クリスタル腎症、横紋筋融解症、及び血栓性微小血管症が含まれる。原因薬物及びそれらの腎臓傷害の特定の発病機構に関する知識は、薬物誘発性の腎機能障害を認識及び予防するために重要である。薬物及び生物製剤の腎毒性の潜在性を測定するためのより安全かつより有効なアッセイは、今日の医薬が原因の腎臓傷害の量を低下させることを間違いなく顕著に助けるであろう。したがって、特定の実施形態では、それだけに限定されないが、バイオワイヤ系、バイオチューブ系、バイオロッド系、アンギオチップ系、又はアンギオチューブ系を含めた、本明細書に記載のバイオリアクター系を使用して、腎組織を評価する、具体的には、腎臓に対する薬物及び生物製剤の腎毒性効果を測定又は評価することができる。

【0291】

それだけに限定されないが、バイオワイヤ系、バイオチューブ系、バイオロッド系、アンギオチップ系、又はアンギオチューブ系を含めた本明細書に記載の方法及びバイオリアクター系を使用して、目的の任意の薬物又は生物製剤を試験することができる。そのような薬剤には、X線造影剤(例えば「造影剤」又は「色素」)、非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)、アムホテリシン、シスプラチン、メトトレキサート、アシクロビル、ゲンタマイシン、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、他の腎毒性薬物、並びに腫瘍溶解の産物及び横紋筋融解症の産物並びに感染症又は敗血症に関連する毒素等の内部で産生される物質等の、腎毒性であることが知られている活性剤を含めることができ、本発明の方法は、そのような腎毒性物質の過量又は他の摂取、吸収、若しくは曝露が原因の腎臓損傷を予防又は緩和させるためにも使用し得る。

【0292】

様々な実施形態では、本発明のデバイスは、薬効及び複数の組織との相互作用を研究するために、例えば直列(すなわちタンデム)、平行又はその組合せを含めて、一緒に利用又は連結させることができ、第1の組織種(例えば腎臓)から調製した第1のデバイスを第2の組織種(例えば心臓)から調製した第2のデバイスと直列に連結させることができる。例えば、複数のアンギオチップ又はアンギオチューブ系を直列に構成してよく、第1のアンギオチップ/アンギオチューブは1つの種類の細胞又は組織(例えば心臓)から形成され、第2の「下流」又は「上流」のアンギオチップ/アンギオチューブは第2の種類の細胞又は組織から形成される(例えば疾患の心臓又は腎臓)。このようにして、薬物の相互作用を多臓器又は組織系の状況で試験し得る。例えば、試験薬剤を、腎組織から調製した第2のアンギオチップ/アンギオチューブの下流に連結されていてよい、肝組織から調製したアンギオチップ/アンギオチューブ内に導入し得る。このようにして、薬物は肝組織と最初に相互作用してよく、それから生じる全ての代謝産物は下流の腎組織アンギオチップ/アンギオチューブへと流れてよく、それにより、臓器機能に対する薬物の代謝の効果を試験することが容易となる。したがって、本発明は、身体における臓器間の薬物の相互作用の試験において使用するための、タンデム(すなわち直列)の様式で配置された複数のデバイスを企図する。任意の考えられる組織の組合せを、タンデムで、例えば腎臓/肝臓又は肝臓/腎臓で試験することができる。

【実施例】

【0293】

ここで、本発明の例示的実施形態を詳細に参照する。特に、以下の実施例は、バイオワイヤ(実施例1、単ワイヤ式組織培養実施形態)、バイオチューブ(実施例2、灌流可能なワイヤの組織培養実施形態)、バイオロッド/バイオワイヤII(実施例3、収縮力組織培養実施形態)、バイオブランチ/アンギオチップ(実施例4、血管形成された組織培養実施形態)、アンギオチューブ(実施例5、灌流可能な収縮力組織培養実施形態)と呼ぶことができる本発明の5つの例示的実施形態を開示する。本発明を例示的実施形態と共に説明するが、それが本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではないことが理解される。それとは反対に、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神及び範囲内に含まれるものとして、実施形態の代替物、改変物、組合せ、及び等価物を包含することが意図される。

【0294】

(実施例1)
バイオワイヤ
例示的単ワイヤ式実施形態(すなわち、バイオワイヤ)の構造、調製、及び使用
第1の実施形態では、本発明は、ウェル又はチャネル、チャネルの長さにわたって支持された、又は吊り下げられた長手足場又は支柱を有するバイオリアクターを含む三次元組織を増殖させるためのバイオリアクターデバイスに関し、ここで、バイオリアクター及びチャネルは、長手足場の周囲に3D組織鎖を形成するのに十分に播種された細胞を受け取るように構成される。様々な実施形態では、長手足場は、ポリマーフィラメント、例えば、POMac(ポリ(オクタメチレンマレイン酸(無水物)クエン酸)又はその他の任意の好適なポリマー足場材料であってもよい。

【0295】

心臓細胞(又は他の電気刺激された細胞)を含む実施形態では、バイオリアクターを、バイオリアクターのチャネルにわたる電界を生成するように構成された電極を含むように更に構成することができる。電界の方向は、任意の方向にあってよいが、好ましくは、チャネル(及び得られる組織鎖)の長さに対して平行である、又はチャネル(及び得られる組織鎖)の長さに対して垂直である方向にある。

【0296】

本明細書で用いられる場合、本発明の第1の実施形態を、それだけに限定されないが、組織鎖自体(すなわち、本明細書に記載のバイオリアクターデバイス上で増殖する細胞)又は組織鎖とバイオリアクターとを一緒に含む系を指してもよい「バイオワイヤ」と呼ぶことができる。また、バイオワイヤを、組織鎖自体、又は組織鎖と、組織鎖が増殖した、若しくは配置されたバイオリアクターデバイスとを含む系の両方を包含する、BIOWIRE(商標)のその市販名として本明細書で呼ぶこともできる。この実施形態では、デバイスを、複数の三次元組織鎖を同時に増殖させることができるような、複数のバイオリアクターチャネルと長手足場とを含む構成にスケールアップすることができる。

【0297】

この第1の実施形態はまた、バイオリアクター中で組織鎖を増殖させるための方法、三次元組織鎖自体、バイオリアクターと増殖した組織鎖の両方を含む系、並びにそれだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)個別化医療を含む様々な適用において組織鎖(若しくは組織鎖を含む系)を使用及び/又は試験する方法に関する。この実施形態では、デバイスを、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、及び1536ウェルプレート等のマルチウェルプレートで構成することができる。

【0298】

図2a〜図2bは、開示されるデバイスの一例の略図を示す。この例示的デバイスは、組織鎖を生成するのに好適であってよく、ここで、デバイスは組織中での細胞の整列及び伸長を促進することができる特徴を含む。

【0299】

例示的デバイスは、組織培養のために播種された細胞を受け取ることができる長手バイオリアクターチャネルを含んでもよい。長手足場を、チャネルの長さにわたって支持する(例えば、吊り下げる)ことができる。足場は、足場の長さに沿って組織構造を形成させるための種細胞のための支持体として働くことができる。足場とチャネルの構成は、組織の培養中の細胞の整列及び伸長を可能にし得る。

【0300】

図2aは、微細製作されたバイオリアクターとしてのデバイスの例示的設計を示す。この例においては、デバイスは、足場として、バイオリアクターチャネル又はウェル中に吊り下げられた縫合糸(例えば、6-0縫合糸)鋳型を含む。デバイスを、好適な微細製作技術を用いて製造し、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)等の任意の好適な材料から作製することができる。ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリスチレン又はPOMac等の他のポリウレタンを含む他の材料を用いることができる。例示的な寸法を図面中に示すが、他のサイズも好適であり得る。

【0301】

図2bは、例示的デバイスを用いた、3D組織鎖、本実施例では、心筋細胞鎖の生成における例示的工程を示す。Iでは、足場(例えば、外科縫合糸)を、チャネルの中心に置いた。IIでは、I型コラーゲンゲル中の心筋細胞懸濁液を、縫合糸の周囲で主要チャネル中に播種した。IIIでは、hESC-心筋細胞の事前培養物をチャネル中に導入し、所定の時間長にわたって培養した。細胞がゲルを再モデリングし、縫合糸の周囲で収縮することができるためには、7日の時間長が好適であることがわかった。IVでは、得られる組織鎖は、所定の時間後に安定であり、デバイスから除去することができる。

【0302】

種細胞懸濁液をデバイスに供給するゲルは、コラーゲン又はコラーゲン由来材料等の、送達される細胞を支持することができる任意の好適なゲルであってもよい。ゲルはまた、それだけに限定されないが、炭水化物、タンパク質及び/又はアミノ酸、線維芽細胞成長因子(FGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ベータ-神経成長因子(BNGF)、インターロイキン(例えば、IL-4、IL-2、IL-6、IL-18、IL-15、IL-1)、サイトカイン、IL-6、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、幹細胞因子(SCF)、インターフェロンガンマ(IFN-ガンマ)、上皮成長因子(EGF)、組換えヒト肝細胞(RHH)、組換えヒトインスリン(RHI)等の、様々な成長因子、細胞培地成分、及び/又は栄養素を含有してもよい。当業者には理解されるように、成長因子は、バイオリアクター中で培養される特定の組織にとって特異的、例えば、心臓特異的又は肝細胞特異的成長因子であってもよい。そのような因子は、当分野で周知である。

【0303】

例示的デバイスを、ソフトリソグラフィ技術等の任意の好適な技術を用いて製作することができる。一例では、2層SU-8(Microchem Corp.社)マスターを用いて、PDMSを成型した。簡単に述べると、デバイスの特徴を、2層設計に対応する2フィルムマスク(CADART)上に印刷した。SU-8 2050を4インチのシリコンウェハー上でスピンし、焼き、第1層マスクの下でUV光に曝露して、縫合糸チャネル及び厚さ185μmのチャンバーを含む第1層を作出した。厚さ115μmの厚さのチャンバーのみを含む第2層を、頂部でスピンした。更に焼いた後、第2層マスクを、第1層の上で特徴に対して整列させた後、UV曝露した。最後に、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート(Doe & Ingalls Inc.社)を用いてウェハーを現像した。次いで、PDMSをSU-8マスター上に投入し、70℃で2時間焼いた。デバイスを、足場、本実施例では、細胞懸濁ゲルを添加することができるチャネル中に吊り下げられた(例えば、中心に)、外科縫合糸の小片を保持するように構成した。

【0304】

ある特定の材料、技術及び寸法が上に記載されるが、例示的デバイスのために他の好適な材料、技術及び寸法を用いることもできる。外科用絹製縫合糸が記載されるが、他の長い材料[例えば、ポリ(グリセロールセバケート)、POMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン並びにそのコポリマー]等の他の支持体を、組織鎖の培養を支援するための足場として用いることができる。

【0305】

B.例示的バイオワイヤ組織培養系の実験的試験
成熟し、鼓動しているラット及びヒトの心臓組織を、実施例1Aのデバイスを用いて生成し、生成された組織を、機能的及び構造的特性について評価した。

【0306】

例示的方法及び分析
新生児ラット心筋細胞を、以前に記載²¹のように、及びUniversity of Toronto Committee on Animal Careにより認可されたプロトコールに従って、2日齢の新生児Sprague-Dawleyラットから取得した。培養培地は、10%(v/v)のウシ胎仔血清、1%の[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸](HEPES)、100U/mlのペニシリン-ストレプトマイシン、1%のグルタミン、及び残りのDulbeccoの改変Eagle培地を含有していた。

【0307】

用いた心筋細胞は、2つの異なるヒト胚性幹細胞株(hESC、Hes2及びHes3)並びに2つの異なるhiPSC株(CDI-MRB及びHR-I-2Cr-2R)から誘導されたものであった。hESC株とhiPSC株HR-I-2Cr-2Rの両方を、記載^2、4のように維持した。胚様体(EB)を、以前に記載^2、4のように、心血管系列に分化させた。簡単に述べると、EBを、BMP4(1ng/ml)を含有するStemPro-34 (Invitrogen社)培地中での培養により生成した。1日目に、EBを収獲し、誘導培地[StemPro-34、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF;2.5ng/ml)、アクチビンA(6ng/ml)及びBMP4(10ng/ml)]中に懸濁した。4日目に、EBを誘導培地から収獲し、血管内皮成長因子(VEGF;10ng/ml)及びDKK1(150ng/ml)を添加したStemPro-34中で再培養した。8日目に、培地を再度交換し、実験期間にわたってVEGF(20ng/ml)及びbFGF(10ng/ml)を含有するStemPro-34中でEBを培養した。培養物を最初の12日間については低酸素環境(5%CO₂、5%O₂)で維持した後、残りの培養期間については5%CO₂に移動させた。特定の細胞学的分析及び電気生理学的分析のために、20日目(EBd20)並びに34日目(EBd34)及び40〜44日目(EBd44)で組織中への播種のためにEBを解離させた。CDI-MRB hiPSC由来心筋細胞を、Cellular Dynamics International社から購入し、解凍の直後に組織産生のために用いた。

【0308】

新生児ラット単離物からの心臓細胞を最初に、4.5μg/mlグルコース、1%(v/v)HEPES、10%(v/v)Matrigel(BD Biosciences社)、及び2μg/ml NaHCO₃を添加したI型コラーゲン系ゲル[1N NaOH及び製造業者により記載された10×M199培地で中和された2.5mg/mlのラット尾部I型コラーゲン(BD Biosciences社)]中に2億個/ml(別途特定しない限り)で懸濁した。次いで、懸濁された心臓細胞を、例示的デバイスの細胞培養チャネル中に播種した(組織鎖あたり3μl)。ゲル化を誘導するために37℃で30分間インキュベートした後、適切な培地を添加した。心臓組織鎖を、2〜3日毎に培地交換しながら、最大で14日間、培養物中で保持した。異なる細胞密度(1億個及び2億個/ml)から開始する心臓組織鎖を播種して、細胞播種密度の効果を試験した。コラーゲン系ゲルを、心臓細胞を充填することなく例示的デバイスの細胞培養チャネル中に播種して、無細胞対照として用いた。非常に長い心臓組織鎖を、上記と同様の様式で製作された5cm長のバイオリアクターを有する例示的デバイスを用いて生成し、新生児ラット心筋細胞を播種した。播種後、光学顕微鏡(Olympus社CKX41)を用いて毎日(n=3/群)、組織鎖の明視野画像を撮影し、5つの異なる位置での組織鎖の直径を、画像分析を用いて平均した。

【0309】

ヒト心臓組織鎖については、上記のように生成された20日目のEBを、ハンクス平衡塩溶液(NaCl、136mM;NaHCO₃、4.16mM;Na₃PO₄、0.34mM;KCl、5.36mM;KH₂PO₄、0.44mM;デキストロース、5.55mM;HEPES、5mM)中のコラゲナーゼI型(1mg/ml;Sigma社)及びDNAse(1mg/ml、CalBiochem社)中、37℃で2時間インキュベートした。EBを遠心分離(800r.p.m.、5分)し、トリプシン(0.25%、Gibco社)と共に37℃で5分間インキュベートし、穏やかにピペッティングして、細胞を解離させた。解離後、細胞を遠心分離(1,000r.p.m.、5分)し、計数し、0.5×10⁶個の細胞/0.5cmの長さの鎖で播種した。この比率を、より長い組織鎖の生成のために維持した。細胞懸濁液を例示的デバイスの主要チャネル中にピペッティングすることにより、細胞をI型コラーゲンゲル[4μl/0.5cmワイヤ長;1X M199培地+10%の成長因子を減少させたMatrigel(BD Biosciences社)中の、24.9mMグルコース、23.81mM NaHCO₃、14.34mM NaOH、10mM HEPES中の2.1mg/mlのラット尾部I型コラーゲン(BD Biosciences社)]中に播種した。CDI-MRB hiPSC由来心筋細胞を解凍し、計数し、hESC由来心筋細胞と同じ濃度で播種した。播種後、細胞を7日間、培養物中で保持して、縫合糸の周囲にコラーゲンマトリックスを再モデリング及び集合させた。

【0310】

異なる電気刺激条件を、以前に記載²のように、ラット心臓組織鎖に印加した。平行刺激チャンバーに、組織鎖に対して垂直に、2cm離して置いた2つの1/4インチ直径のカーボンロッド(Ladd Research Industries社)を取り付け(電界が組織鎖の長軸と平行となるように)、白金ワイヤ(Ladd Research Industries社)と共に刺激装置(S88X、Grass社)に接続した。垂直刺激チャンバーを、組織鎖と平行に1cm離して置いた2つのカーボンロッドと共に構築した(すなわち、電界は組織鎖の長軸に対して垂直であった)。組織鎖構造が確立されるまで4日間、組織鎖を事前培養し、その自発的鼓動を同期させた後、培養培地中に10μMアスコルビン酸を添加して4日間、電界刺激(二相、矩形、1ms持続時間、1.2Hz、3.5〜4V/cm)にかけたが、対照組織鎖は電気刺激なしに培養した。電気刺激の終わりに、ラット心臓組織鎖をcTnT及びCx-43に対して染色したか、又はその機械的特性を原子間力顕微鏡(AFM)により測定した。

【0311】

ヒト心臓組織鎖については、7日間の事前培養後、組織鎖を、2cm離して置いた2つの1/4インチ直径のカーボンロッド(Ladd Research Industries社、Burlington、VT)を取り付けた刺激チャンバーに移し、白金ワイヤ(Ladd Research Industries社)と共に心臓刺激装置(Grass社、s88x)に接続した。組織鎖を電極に対して垂直に置き、7日間、電気刺激(矩形、二相、1ms、3〜4V/cm)にかけたか、又は電気刺激なしに(非刺激対照若しくはCTRL)培養した。2つの電界刺激プロトコールを用いた:(I)刺激を1Hzで開始し、徐々に、3Hzまで毎日増大させ(1、1.83、2.66及び3Hz)、それを週の残りについて維持した、又は(II)刺激を1Hzで開始し、週を通して6Hzまで徐々に増大させた(1、1.83、2.66、3.49、4.82、5.15及び6Hz、毎日の周波数)。図3Aは、実施例1のデバイス中で培養された組織に印加された例示的な電気刺激レジメンを示す。事前培養された組織鎖を3〜4V/cmで1週間、電気刺激にかけた。電気刺激を1Hzで開始し、3Hzまで次第に増大させ、それを週の残りについて保持した(低周波数増大刺激レジメン又は3Hz群)。更に、刺激速度を、1から6Hzまで次第に増大させた(高周波数増大刺激レジメン又は6Hz群)。

【0312】

培養時間の増加は成熟に影響することが示されたため^11、28、年齢一致させたEB(EBd34)を、さらなる対照として用いた。長期刺激実験のために、組織鎖を上記のように7日間事前培養した後、7日間の6Hz増大プロトコールを行い、その時点で周波数を1Hzに低下させ(出産後の心拍低下を模倣するため)、更に14日間維持した。図4Aは、このために用いられた例示的電気刺激レジメンを示す。

【0313】

培養された心筋細胞組織鎖が単一細胞ベースで成熟を真に示したことを検証するために、単一細胞を用いるアッセイを実施した。図3Bは、刺激レジメンの終わりに、培養された組織鎖に由来する細胞がどのように単離され、機能的、超微細構造的、細胞的及び分子的応答について評価されたかを示す。

【0314】

培養された組織鎖を、ハンクス平衡塩溶液(NaCl、136mM;NaHCO₃、4.16mM;Na₃PO₄、0.34mM;KCl、5.36mM;KH₂PO₄、0.44mM;デキストロース、5.55mM;HEPES、5mM)中のコラゲナーゼI型(1mg/ml;Sigma社)及びDNAse(1mg/ml、CalBiochem社)で、37℃で4時間消化し、遠心分離(800r.p.m.、5分)し、37℃で5分間、トリプシン(0.25%、Gibco社)と共にインキュベートし、穏やかにピペッティングして細胞を解離させた。単離された単一細胞を、以下に記載のようなMatrigel又はラミニンで被覆されたスライドガラス上に播種した後、面積、カルシウム移行及びパッチクランプ測定を実施した。

【0315】

組織集合の進行を、培養物中で2週間(すなわち、7日間のゲル圧縮、次いで、7日間の刺激)後、様々なレベル:機能レベル[興奮閾値(ET)、最大捕捉率(MCR)、伝導速度、Ca²⁺ハンドリング];超微細構造レベル(サルコメア発達、デスモソームの頻度)、細胞レベル(細胞のサイズ及び形状、増殖、心臓タンパク質:アクチン、トロポニンT及びα-アクチニンの分布)、電気生理学レベル(hERG、I_K1、I_Na)及び分子レベル(心臓遺伝子及びタンパク質の発現レベル)で評価した。

【0316】

核の伸長及び整列を定量化した。組織鎖内の細胞核をDAPI染色により可視化し、3μm間隔で共焦点顕微鏡によりzスタック画像を取得した。共焦点画像のそれぞれのスタックを、Xuら²⁷により記載された自動化アルゴリズムを用いてImageJ 1.45s(National Institutes of Health、USA)中で分析し、試料あたり約1000個の核を分析した。核の伸長を、核の長軸と短軸の比である核アスペクト比として特徴付け、核の整列を配向角により特徴付けた。対照単層群においては、核の配向を任意に定義された配向と比較して特徴付けたが、組織鎖群においては、縫合糸鋳型の配向を参照として設定した。

【0317】

ラット心臓組織鎖を、4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.25%Triton X-100により透過処理し、10%ウシ血清アルブミン(BSA)で遮断した。以下の抗体:マウス抗心臓トロポニンT(cTnT)(Abcam社;1:100)及びウサギ抗コネキシン43(Cx-43)(Abcam社;1:200)、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488(Jackson Immuno Research社;1:400)及び抗ウサギTRITC(Invitrogen社;1:200)を用いて免疫染色を実施した。核を、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Biotium社;1:100)で対抗染色した。ファロイジン-Alexa 600(Introgen社;1:600)を用いて、F-アクチン線維を染色した。共焦点顕微鏡観察のために、染色された心臓組織鎖を、倒立型共焦点顕微鏡(Olympus社IX81)又は直立型共焦点顕微鏡(Zeiss社LSM 510)の下で可視化した。

【0318】

ヒト心臓組織鎖の免疫染色を、以下の抗体:マウス抗cTNT(1:100、Thermo Scientific社;MS-295-P1)、マウス抗α-アクチニン(1:200、Abcam社、ab9465)、抗マウスAlexa Fluor 488(1:400、Invitrogen社、A21202)、抗Ki67(1:250、Millipore社、AB9260)、抗ウサギTRITC(1:400、Invitrogen社、81-6114)を用いて実施した。DAPIを用いて、核を対抗染色した。ファロイジンAlexa Fluor 660(1:1000、Invitrogen社、A22285)を用いて、アクチン線維を検出した。染色された細胞を、蛍光顕微鏡(Leica社、CTR6000)を用いて可視化し、Leica Application Suiteソフトウェアを用いて画像を捕捉した。共焦点顕微鏡観察のために、蛍光共焦点顕微鏡(Zeiss社LSM-510)を用いて細胞を可視化した。

【0319】

4日間の電気刺激の印加後、ラット心臓組織鎖を、倒立型光学顕微鏡(Nikon社、Eclipse-Ti)上に載せた市販の原子間力顕微鏡(AFM)(Bioscope Catalyst;Bruker社)を用いて試験した。力圧入測定を、1Hzの圧入速度で5nNのトリガー力を用いて心臓組織鎖の中心を均等に被覆する9つの異なるスポットで球形チップ(半径=5〜10μm)を用いて行った。カンチレバー(MLCT-D、Bruker社)は0.03N/mの定格ばね定数を有していた。Hertzモデルをフォースカーブに適用して、ヤング率を見積もり、詳細なデータ分析を他の場所に記載した³⁰。全てのAFM測定を、室温で流体環境中で行った。

【0320】

また、組織を、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いて調査した。組織鎖を、0.1M PBS中の4%パラホルムアルデヒド、1%グルタルアルデヒドで少なくとも1時間固定し、PBS pH7.2で3回洗浄した。後固定を、0.1M PBS、pH7.2中の1%四酸化オスミウムを用いて1時間行い、25〜100%のエタノール系列を用いて脱水した。組織を、Epon樹脂を用いて浸潤させ、40℃で48時間、プラスチック皿中で重合させた。組織を、切片化した後、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。画像化をHitachi H-7000透過型電子顕微鏡で実施した。

【0321】

光学的マッピングのために、組織鎖を、温Tyrode溶液(NaCl 118mM、KCl 4.7mM、CaCl₂ 1.25mM、MgSO₄ 0.6mM、KH₂PO₄ 1.2mM、NaHCO₃ 25mM、グルコース6mM;使用直前に少なくとも20分間、カルボゲン95%O₂、5%CO₂を気泡化することにより酸素供給した)中、37℃で20分間、電圧感受性染料(ジ-4-ANEPPS 5μM、Invitrogen社)と共にインキュベートした。蛍光染料を、高速CMOSカメラ(Ultima-L、Scimedia社)^29〜30を装備したMVX-10 Olympus蛍光顕微鏡上で記録した。1cmのセンサーは、100×100ピクセルの解像度を有し、空間解像度は50〜100μm/ピクセルで変化した。画像化を、200フレーム/sで実施した。緑色フィルター(Olympus社U-MWIG2フィルターキューブ)を有する水銀アーク源(X-Cite Exacte)を用いて、蛍光を励起した。ステンレススチール針中に挿入された2つの微細なワイヤ(AWG#32)から作られた双極電極を用いて構築物を電気的に点刺激し、これをマイクロマニピュレーター(World Precision Instruments社)上に載せた。電界刺激のために、図3に記載のチャンバーを用いた。組織鎖を含有するプレートを加熱したプレート(MATS-U55S、Olympus社)上に置き、温度を38℃に調節した。データ分析を、Brain Visionソフトウェア(Scimedia社)を用いて実施した。

【0322】

細胞内記録も取った。37±0.5℃で高インピーダンスガラス微小電極(50〜70MΩ、3M KClで充填)を用いて組織鎖中で活動電位を記録した。組織鎖を、95%O₂及び5%CO₂で平衡化させた、(単位mM)118のNaCl、4.2のKCl、1.2のKH₂PO₄、1.8のCaCl₂、1.2のMgSO₄、23のNaHCO₃、20のグルコース、2のNa-ピルビン酸を含有し、最終pHが7.4であるクレブス液で表面灌流した。微小電極を、Axopatch 200B増幅器(Axon Instrument社)電流クランプに接続した。シグナルを1KHzでフィルタリングし、2KHzでサンプリングし、Clampfit 10(Axon Instrument社)を用いて分析した。休止電位を、I=0モードで測定した。いくつかの実験のために、組織鎖を、興奮閾値の2倍に設定した電界刺激を用いてペーシングした。

【0323】

パッチクランプの記録を取った。パッチクランプ実験を実施する前に一晩、培養組織鎖又はEBから単離された単一細胞を、ラミニン被覆されたスライドガラス(Laminin、Sigma-Aldrich社、10μg/cm²)上に播種した。全細胞パッチクランプを、室温(23〜25℃)でAxopatch 200B増幅器を用いて作製した。データを、Clampfit 8.0(Axon Instrument社)を用いて分析した。細胞の休止電位を測定する場合、増幅器をI=0に設定した。電流クランプモード法を用いることにより、活動電位を記録した。筋細胞を1Hzで刺激し、膜脱分極の最大速度、活動電位ピーク及び10番目の活動電位のAPD90を測定した。膜電位を、液間電位について補正せず、用いた溶液について15.9mVであると見積もった(Clampfit 8.0を用いて見積もった)。また、Na⁺電流、hERG電流及びI_K1電流を、70〜80%直列抵抗補償を用いる電圧クランプ条件下で記録した。安定状態の不活化測定のために、10mVの増分で500msにわたって-120mV〜+30mVの範囲の一連の試験パルス、次いで、100msにわたって-10mVまでの試験パルスを印加することにより、-80mVの保持電位からNa⁺電流を誘導した。このプロトコールは重複電圧依存的Ca²⁺電流を同時に活性化するが、これらのCa²⁺電流は、誘発されたNa⁺電流の3%未満であると見積もられた(プレパルスプロトコールを用いて)。2,000msにわたって15mVの増分で-45mV〜60mVの範囲の電圧ステップへの脱分極後に-50mV(500msにわたる)へのステップに応答するテール電流を測定することにより、hERGを評価した。hERGテール電流のピーク振幅を測定し、比較した。I_K1電流を、これらの試験について等価であることがわかった2つの方法で測定した。完全なI-V関係のために、Ba²⁺の非存在下で測定された電流から、500μMのBa²⁺の存在下で測定された電流を減算することにより(-40mVの保持電位から10mVの増分で-120〜-10mVの範囲の電圧ステップについて微量ずつ)、Ba²⁺感受性電流を評価した。I_K1密度を測定するために、バックグラウンド電流を、-100mVでBa²⁺の非存在下で測定したものから差し引いた。

【0324】

NaOHでpH7.35に調整された、(単位mM)140のNaCl、4のKCl、1のMgCl₂、1.2のCaCl₂、10のHEPES、10のD-グルコースを含有する浴液中で、パッチクランプ記録を実施した。KOHでpH7.2に調整された、(単位mM)120のアスパラギン酸カリウム、20のKCl、4のNaCl、1のMgCl₂、5のMgATP、10のHEPES、10のEGTAを含有する溶液を充填した場合、ピペット抵抗は約5.5〜7.5MΩであった(K⁺の計算された逆転電位は、pH調整後に-95.6mVであった)。ドフェチリド100nM³¹及びBaCl₂ 500μM¹¹を用いて、それぞれ、hERG電流及びI_K1を遮断した。

【0325】

カルシウム移行測定を取った。上で詳細に説明されたように、コラゲナーゼ及びトリプシンと共にインキュベートすることにより、組織鎖を解離させた。解離した心筋細胞を、成長因子を含まないMatrigel(RPMI培地中に1:60に希釈)で被覆された25mmの顕微鏡カバーガラス上に一晩プレーティングした。次いで、細胞を、37℃で2時間、培養培地中で5μMのフルオ-4アセトキシメチルエステル(フルオ-4 AM)と共にインキュベートした。続いて、心筋細胞を無染料培地で2回洗浄し、インキュベータ中に30分間戻した。レーザー走査共焦点顕微鏡(Zeiss社LSM 510)を用いて、フルオ-4 AMの蛍光強度を測定した。フルオ-4 AMを充填した心筋細胞を含有するカバーガラスを、特殊チャンバー上に移動させ、きつく締め付けた。約1.8〜1.9mlの培養培地をチャンバーに添加し、顕微鏡上の温度制御されたプレート(37℃)上に置いた。フルオ-4をアルゴンレーザー(488nm)により励起し、放射された蛍光を505nmの放射フィルターにより収集した。細胞質ゾルカルシウム濃度の移行変動を示す、フルオ-4 AM蛍光強度の変化を、フレーム及びラインスキャンモデルにおいて記録した。画像及び蛍光データを、Zeissソフトウェアにより獲得した。蛍光データを、Origin 8.5ソフトウェアを用いて分析した。フルオ-4 AMを充填した後、蛍光シグナル(F)をベースライン蛍光に対して正規化した。シグナルの上昇フェーズを、線形モデルにより適合させた一方、シグナルの減衰フェーズを、Offsetモデルを用いるExpDecayにより適合させた。カフェイン、ベラパミル(Sigma社)及びタプシガルギン(Invitrogen社)を、図面に示される濃度での画像化中に心筋細胞を含有するチャンバーに直接添加した。類似する平均鼓動周波数で鼓動する細胞(対照については9.4±0.7bpm、3Hzについては9±0.7bpm、及び6Hzレジメンについては10±0.8bpm)を、カルシウム移行測定について使用して、拍動数の差異が測定に影響しないことを確保した。

【0326】

定量的RT-PCRを、以前に記載³²のように実施した。全RNAをHigh Pure RNA Isolation Kit(Roche社)を用いて調製し、RNase-free DNase(Roche社)で処理した。RNAを、SuperScript VILO(Invitrogen社)と共にランダムヘキサマー及びオリゴ(dT)を用いてcDNAに逆転写した。LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche社)を用いるLightCycler 480(Roche社)上で、RT-qPCRを実施した。発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子TATAボックス結合タンパク質(TBP)又はグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対して正規化した。オリゴヌクレオチド配列を、図28に示されるTable 3にまとめる。

【0327】

フローサイトメトリー分析を実施した。上記のようにコラゲナーゼ及びトリプシンを用いる解離により組織鎖又はEBから細胞を取得し、室温で10分間、4%パラホルムアルデヒドで固定した。細胞内エピトープについて、5%ウシ胎仔血清(FBS)及び0.1%Triton Xを含有するPBS中、氷上で10分間、細胞を透過処理した後、PBS中の5%FBSで30分間、ブロッキング工程を行った。細胞を、氷上で1時間、ブロッキングバッファー中の下記抗体:抗CD31-PE(1:100)、抗CD90-APC(1:500、BD Biosciences社、それぞれ、553373及び559879);抗cTNT(1:100、Thermo Scientific社、MS-295-P1);抗カルポニンH1(1:250、Abcam社、ab46794);抗ビメンチン(1:100、Sigma Aldrich社、V6630)と共にインキュベートした。用いた二次抗体は、抗マウスAlexa Fluor 488(1:400、Invitrogen社、A21202)及び抗ウサギCy5(1:500、Jackson ImmunoResearch社、111-175-144)であった。それぞれのアッセイにおける心筋細胞のパーセンテージの固有の変動性のため、それぞれのマーカーについて陽性である細胞のパーセンテージ(上記の二次抗体のみの対照)を、各実験の出発細胞集団(EBd20)に対して正規化して、細胞集団の変化が起こっているかどうかを正確に評価した。

【0328】

組織鎖を、(2X)Novexトリス-グリシンSDS試料バッファー(Life technologies社)中で可溶化し、Novexトリス-グリシンゲル(Life technologies社)中での電気泳動によりタンパク質を分離し、Biotrace NT(ニトロセルロース、Pall Corp.社)に移した。膜を、抗ミオシン重鎖(全、Abcam社、ab15)、ホスホランバン1D11(Dr.A.Gramolini、University of Torontoから)又はGAPDH(Millipore社、MAB374)抗体のいずれかでプローブ化した。用いた二次抗体を、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした(DAKO社、P0448又はP0447)。膜を、ECL試薬Luminata Classico Substrate(Millipore社)を用いて現像した。

【0329】

SigmaPlot 12.0を用いて統計分析を実施した。実験群間の差異を、Studentのt検定又は二元配置ANOVAにより分析した。正規性検定(Shapiro-Wilk)及びペアワイズ多重比較手順(Holm-Sidak法)を、データの正規性及び分散に基づいて、必要に応じて二元配置ANOVA検定又はカイ二乗検定のために用いた。P<0.05は全ての統計検定について有意であると考えられた。

【0330】

例示的結果及び考察
ラット心臓組織鎖の生成及び特徴付け
開示されるデバイスは、天然の心筋の高度に異方性の構造をin vitroで再現することができる。支持ワイヤは、in vivoの毛細血管と類似する機能を果たし、心筋細胞が伸長し、整列する周囲の鋳型として役立つことができる。一次新生児ラット心筋細胞を用いて、I型コラーゲン系ゲル内で微細製作されたPDMSプラットフォーム中に懸濁された鋳型を播種することにより、3Dの自己集合した心臓組織鎖を生成した。播種された新生児ラット心筋細胞(875万個の細胞/ml)は、1週間以内に縫合糸鋳型の周囲のコラーゲンゲルマトリックスを再モデリングし、収縮させて、組織鎖構造を形成した(図5aを参照されたい)。無細胞ゲルは培養時間中に圧縮又は分解しなかったため、ゲル圧縮は、播種された細胞の存在下でのみ起こり、圧縮速度は細胞播種密度と正に相関していた。例示的デバイスの寸法をカスタマイズすることにより、異なる寸法の心臓組織鎖を生成することができる。例えば、図5bに示されるように、5cm程度の長さの組織鎖を生成することができる。好適な寸法のデバイスを用いれば、より長い組織鎖の生成も可能である。

【0331】

図5cは、ゲル圧縮の定量化及び心筋細胞の初期播種密度に対するその依存性を示す(平均±SD、n=3)。心筋細胞を播種しない場合(ゲルのみ)、ゲルは圧縮せず、組織鎖構造を形成しなかった。より高い播種密度(2億個の細胞/ml)での組織鎖は、再モデリングの間により低い播種密度(1億個の細胞/ml)でのものよりも速く圧縮した。

【0332】

図6に示されるように、縫合糸鋳型は、組織鎖において心筋細胞が伸長及び整列するための地形的合図を提供することができる。図6aは、DAPIで対抗染色された核(左)及びAlexa 488で染色された心臓トリポニン-T(cTnT)(右)を有する組織鎖の共焦点画像を示す。DAPIで対抗染色された細胞核の画像分析により、縫合糸鋳型の軸に沿った核の伸長及び整列が示された。図6bにおいては、単層として培養された、対組織鎖中に播種された心臓細胞の核アスペクト比(試料あたり約1000個の核が特徴付けられる)を、2群間の有意差(***、p<0.001)と共に、第1四分位数、中央値、及び第3四分位数を示すボックスプロットに示す。図6cは、組織鎖群と単層群の核アスペクト比の分布を示すヒストグラムである(平均±SD、n=3/群)。単層群の低い方のアスペクト比範囲において有意により高い頻度が存在し(*、p<0.05)、組織鎖群の高い方のアスペクト比範囲においてより高い頻度が存在していた(#、p<0.05)。また、核の配向の特徴付け(図6dを参照されたい)により、単層群における核の無作為な分布(無作為の方向を0°とする)が示された一方、培養された組織鎖における細胞核は縫合糸鋳型の軸に沿って向いていた(縫合糸鋳型の配向を0°とする)。

【0333】

新生児ラット心臓組織鎖は、播種後3〜4日で自発的に鼓動し始め、ゲル圧縮中に鼓動を続けたが、これは、例示的デバイスがヒドロゲルマトリックス内の細胞の電気機械的カップリングを可能にしたことを示している。より高い播種密度(2億/ml)での組織鎖の自発的鼓動は、より低い播種密度(1億/ml)でのものよりも早く開始し、より顕著であったが、これは、より多くの心筋細胞及びより良好なカップリングの存在の結果であると考えられる。免疫組織化学染色により、ラット心臓組織鎖がサルコメアタンパク質であるcTnTを発現することが示された(図6a、右側を参照されたい)。

【0334】

ラット組織鎖の電気刺激
開示された実施例1のデバイスの多用途性を示すために、電気刺激を印加して、心筋細胞の表現型を更に改良した。図7aは、異なる電気刺激条件下での組織鎖の実験設定を示す。外部刺激装置に接続されたカーボンロッドは、4日目で開始して4日間にわたって心臓組織鎖に対して平行又は垂直の電界刺激を提供した。

【0335】

免疫組織化学染色を実行した。図7bは、異なる電気刺激条件の印加後の培養されたラット心筋細胞組織鎖の代表的な共焦点画像を示す。平行刺激された組織鎖は、非刺激(対照)及び垂直刺激された組織鎖と比較して、縫合糸鋳型に沿って向いたより多くのcTnT+構造(左)及びコネキシン43(Cx-43)のより強い発現(右)を示した。Cx-43は、隣接する心筋細胞間のギャップ結合のためのマーカーであり、心筋細胞間のより良好なカップリングを指示する。

【0336】

デバイスの外部でラット心臓組織鎖を取り扱う場合、平行刺激された組織鎖が非刺激対照よりも固いことに留意した。これをAFM分析(n=3/群)により更に評価し、非刺激対照と比較して平行刺激された組織鎖の有意に(p=0.009)改善された機械的特性が示された(図7cを参照されたい)。

【0337】

ヒト心臓組織鎖の工学的作製
指向性分化プロトコールから得られたhPSC心筋細胞及び支持細胞を用いて、I型コラーゲンゲル中の滅菌外科用縫合糸の周囲の鋳型ポリジメチルシロキサン(PDMS)チャネル中への細胞播種により、3Dの自己集合した心臓組織鎖を生成した。図8a〜dは、Hes2 hESC由来心筋細胞について得られた結果を示す。図8aは、デバイス鋳型中で7日間のhESC心筋細胞の事前培養の例示的画像を示す。播種された細胞は再モデリングし、第1週の間にコラーゲンゲルマトリックスを収縮させ、約40%のゲル圧縮を示した。図8bは、培養の示された日におけるゲル圧縮の定量化[平均±s.d.、n=3(0日目)、n=4(1〜7日目)]を示し、約600μmの最終幅を示す。これにより、PDMS鋳型からの培養された組織鎖の除去が可能になった。

【0338】

組織学的分析により、縫合糸の軸に沿った細胞の整列が示された。図8cは、組織鎖切片のヘマトキシリン及びエオシン(H&E)並びにマッソントリクローム(MT)染色を示す(矢印は縫合糸軸を表す)。組織鎖は、播種後2〜3日で同期的及び自発的に鼓動し、ゲル圧縮後も鼓動を続けることがわかったが、これは、この設定が電気機械的細胞カップリングを可能にすることを示している。組織鎖を、電気的に調整し、自発的鼓動周波数を増大させることにより、エピネフリン(β-アドレナリン刺激)等の生理的アゴニストに対して応答させることができる。図8dは、インパルス伝播の光学的マッピングを示す。インパルス伝播記録(左のトレース記録)と共に自発的電気的活動、電気刺激に対する応答(中央のトレース記録、刺激周波数は以下の赤色のトレースに記載される)及び薬理学的刺激(エピネフリン、右のトレース記録)の下での自発的応答の頻度の増加を示す、電位差滴定フルオロフォア(DI-4-ANEPPS)を用いて画像化される組織鎖の代表的な写真(左)。

【0339】

1週間の事前培養後、組織鎖を、7日間、電界刺激にかけたか、又は刺激せずに(非刺激対照)培養した(図3aに示される)。刺激速度を次第に、及び毎日、1から3Hzまで(図3a中の、低周波数増大レジメン、ここから低周波数若しくは3Hzと呼ばれる)又は1から6Hzまで(図3a中、高周波数増大レジメン、ここから高周波数若しくは6Hzと呼ばれる)増大させる2つの異なるプロトコールを用いて、効果が刺激速度に依存するかどうかを評価した。

【0340】

ヒト刺激組織鎖における生理的肥大
培養物中で2週間後、免疫染色により、組織鎖を通して細胞が心臓収縮タンパク質サルコメアのα-アクチニン、アクチン及び心臓トロポニンTを強く発現することが示された(図9a、図10、図11及び図12を参照されたい)。

【0341】

図9は、電気刺激と組み合わせた培養組織鎖が生理的細胞肥大を促進し、心筋細胞表現型を改善したことを示す。図9aは、非刺激組織鎖(対照)及び電気刺激された組織鎖(3及び6Hz増大)の代表的共焦点画像を示し、心筋細胞の整列及び頻繁なZディスクを示している(矢印は縫合糸軸を表す)。スケールバーは20μmである。図9bは、異なる条件での心筋細胞形状の分析を示す(平均±s.d.、ロッド状及び丸状の両方についてのEBd34対3Hz P=0.01;丸状及びロッド状の両方についてのEBd34対6Hz P=0.03)。n=3/群。図9cは、非刺激組織鎖(対照)及び電気刺激された組織鎖の代表的な微細構造画像を示し、サルコメア構造(サルコメアパネル、白色のバー;Zディスク、黒色の矢印;Hゾーン、白色の矢印;m、ミトコンドリア)及びデスモソームの存在(デスモソームパネル、白色の矢印)を示している。スケールバーは1μmである。図9dは、形態学的分析(平均±s.d.)を示し、Hゾーンとサルコメアの比率(CTRL対6Hz、P=0.005)、IバンドとZディスクの比率(CTRL対3Hz、P=0.01;CTRL対6Hz、P=0.003)及び膜の長さあたりのデスモソームの数(CTRL対6Hz、P=0.0003)を示している。n=4/条件。*は群と対照との統計的有意差を示す。正常な成体細胞中では、Hゾーンとサルコメアの比率は1であり、IバンドとZディスクの比率は2である。図9a〜図9dは、Hes2 hESC由来心筋細胞に関する結果を示す。

【0342】

図10は、培養組織鎖の形態を示す。図10aは、組織鎖がPDMS鋳型からの除去後も構造を維持したことを示す。図10bは、(I)ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)並びに(II)マッソントリクローム(MT)染色された組織鎖切片の低い方の拡大画像を示す。(III)縫合糸/細胞含有ゲル境界面の詳細を示すMT染色された切片の高拡大画像。図10cは、サルコメア構造の詳細を示す、α-アクチニン及びアクチン染色された組織鎖の高拡大共焦点画像を示す。矢印は、縫合糸軸を表す。図10a〜図10cは、Hes2細胞株から得られたhESC由来心筋細胞に関する結果を示す。

【0343】

図11は、CDI-MRB系hiPSC由来心筋細胞組織鎖もまた、電気刺激にかけた場合に成熟の兆候を示したことを示すものである。図11aは、非刺激組織鎖(対照)及び電気刺激された組織鎖(6Hz増大プロトコール)の代表的な共焦点画像を示し、心筋細胞の整列及び頻繁なZディスクを示している(矢印は縫合糸軸を表す)。図11bは、電気刺激が興奮閾値及び組織相互接続性を改善したことを示す(最大捕捉率;CTRL対6Hz、点刺激により測定された場合、P=0.03)。微細構造分析により、高周波数での電気刺激(6Hz増大レジメン)が心筋細胞の自己組織化を誘導することが示された。図11cは、サルコメア構造を示す非刺激組織鎖(対照)及び電気刺激された組織鎖を示す(サルコメア、白色のバー;Zディスク、黒色の矢印;Hゾーン、白色の矢印; m、ミトコンドリア;発生期境界板、赤色の矢印)。スケールバーは1μmである。図11dは、形態学的分析(平均±s.d.)を示し、Hゾーンとサルコメアの比率(CTRL対6Hz、P=0.001)及びIバンドとZディスクの比率(CTRL対6Hz、P=0.004)を示す。正常な成体細胞においては、Hゾーンとサルコメアの比率は1であり、IバンドとZディスクの比率は2である。n=3〜4/条件。

【0344】

図12は、電気刺激が他のhPSC由来心筋細胞の成熟を促進したことを示す。図12aはHes3細胞株hESC由来心筋細胞組織鎖の結果を示し、図12bはHR-I-2Cr-2R細胞株hiPSC由来心筋細胞組織鎖の結果を示す。図12a(I)及び図12b(I)は、非刺激組織鎖(対照)及び電気刺激された組織鎖(6Hz増大プロトコール)の代表的な共焦点画像を示し、心筋細胞の整列及び頻繁なZディスクを示す。図12a(II)及び図12b(II)は、電気刺激がhESC由来及びiPSC由来心臓組織鎖の興奮閾値及び組織相互接続性(点刺激により測定される最大捕捉率)を改善したことを示す。n=4〜7/条件。平均±s.d.。*は統計的有意性を示す。図12a(III)及び図12b(III)は、心筋細胞組織鎖自己組織化の微細構造分析を示す(Zディスク、黒色の矢印;発生期境界板、赤色の矢印)。スケールバーは1μmである。

【0345】

これらの例示的結果は、収縮装置のサルコメア束(図9a、図11及び図12を参照されたい)及び縫合糸軸に沿った筋原線維整列が、成体の心臓の構造と質的に類似していたことを示す²²。3週間及び4週間にわたって培養物中で保持された組織鎖は、共焦点電子顕微鏡及び透過型電子顕微鏡により照明されるように、細胞の整列及びその収縮装置を維持していた(図4を参照されたい)。

【0346】

心臓発生の初期には、心筋細胞は丸い形状の細胞であり、誕生後にロッド状の表現型に分化する³³。成体ヒト心筋細胞は、構造的に剛性の構築を示し、解離直後はロッド状の形状³⁴を保持する一方、hESC心筋細胞は丸型を保持する。年齢一致させたEB(EBd34)と組織鎖を解離させ、細胞をMatrigelで被覆されたプレート中に播種した。EBd34に由来する約80%の心筋細胞は丸型の表現型を示したが、この数は電気刺激された試料中では有意に少なかった(約50%少ない)(図9bを参照されたい)。ロッド状の心筋細胞のパーセンテージは、EBd34と比較して電気刺激された組織鎖において有意に高かった(約4倍)(図9bを参照されたい)。

【0347】

図13は、培養された組織鎖中の細胞に関する細胞アスペクト比の分析を示す。分析により、年齢一致させた胚様体(EBd34)に由来する細胞と比較した場合、電気刺激された組織鎖において、よりロッド状に向かう細胞形状の変化が確認された。心臓細胞を、0.5ビンの増分でそのアスペクト比に従ってプロットした(n=3)。組織鎖からの解離後、単一細胞hESC由来心筋細胞(Hes2細胞株)中で測定を実施した。

【0348】

発生中に、心筋細胞は細胞サイズの増大、次いで、サルコメア構造の変化及び胎児遺伝子の下方調節を特徴とする生理学的肥大を受ける³⁵。年齢一致させたEB(EBd34)に由来する心筋細胞と比較した組織鎖条件において心筋細胞サイズ(プレーティングされた細胞の面積)の有意な増大が存在していた(図26中のTable 1、EBd34対CTRL P=0.034;EBd34対3Hz P=0.003;EBd34対6Hzレジメン P=0.01を参照されたい)。Table 1においては、培養の終わりに組織鎖から解離した単一のHes2 hESC由来心筋細胞上で測定を実施した。*は、群とEBd34との間の統計的有意性を示す。細胞面積(μm²)、平均±s.d.、n=3。心房性ナトリウム利尿ペプチド(NPPA)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(NPPB)及びα-ミオシン重鎖(MYH6)は、胎児心筋細胞中で高度に発現され、疾患を有する成体心室心筋細胞中での病理学的肥大の間に上方調節される分子である。

【0349】

図14は、培養組織鎖の遺伝子発現分析を示す。分析により、心臓胎児遺伝子プログラムの下方調節及びカリウムチャネル遺伝子の上方調節が示された。心臓トロポニン(TNNT)、コネキシン43(GJA1)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(NPPB)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(NPPA)、α-ミオシン重鎖(MYH6)、β-ミオシン重鎖(MYH7)、リアノジン受容体2(RYR2)、内向き整流性カリウムチャネル遺伝子(KCNJ2)。心臓胎児遺伝子NPPA、NPPB及びMYH6は、hESC由来心筋細胞組織鎖中で有意に下方調節された一方、KCNJ2は年齢一致させたEB(EBd34;平均±s.e.m.、n=3〜6)と比較して上方調節された。Hes2細胞株hESC由来心筋細胞。

【0350】

hESC由来心筋細胞組織鎖中での胎児心臓遺伝子プログラム(NPPA、NPPB、MYH6)の下方調節(図14を参照されたい)は、年齢一致させたEBと比較して、細胞サイズの増大と協調して、生理学的肥大及びより成熟した表現型を示唆した。細胞興奮性及びK⁺恒常性において重要な役割を果たす³⁶、内向き整流性カリウムチャネル遺伝子(KCNJ2)は、EBd34と比較して上方調節されていた。

【0351】

組織鎖中で培養されたhESC心筋細胞はまた、EB中でのものよりも低い増殖速度を示し(図15を参照されたい)、それぞれの条件での心筋細胞のパーセンテージは2週間の培養後に未変化のままであった(48.2±10.7%、図16を参照されたい)。

【0352】

図15は、培養組織鎖における心筋細胞増殖がEBにおけるよりも低かったことを示す例示的結果を示す。増殖を、サルコメアα-アクチニン及びKi67に関する二重染色により評価した(n=3〜4/条件、平均±s.d.)。*、**、#及び&は、EBd34と比較した統計的有意差を表す(EBd20対EBd34、P=0.002;EBd34対CTRL、P=0.019;EBd34対3Hz、P=0.016;EBd34対6Hz、P=0.015)。測定を、組織鎖からの解離後に単一のHes2 hESC由来心筋細胞上で実施した。

【0353】

図16は、組織鎖中の細胞集団が培養後に有意に変化しなかったことを示す例示的結果を示す。異なるマーカーについて陽性である細胞のパーセンテージを、EBd20(出発集団)に対して正規化した。EBd20、EBd34及び組織鎖(CTRL及び6Hz)からの細胞を、CD31(内皮細胞)、CD90(線維芽細胞)、カルポニン(平滑筋細胞)、ビメンチン(全ての非筋細胞)及び心臓トロポニンT(心筋細胞)について染色し、フローサイトメトリーにより分析した(n=3〜6/条件、平均±s.d.)。組織鎖からの解離後のhESC由来心筋細胞Hes2細胞株に関する結果を示す。

【0354】

EBd20集団におけるCD31(2.4±1.5%、内皮細胞³²)、CD90(34.4±23%、線維芽細胞³²)、カルポニン(35±22%、平滑筋細胞)又はビメンチン(80±22%、非筋細胞)陽性細胞の初期パーセンテージは、組織鎖培養後に大きく維持されたが、これは、観察された改善が特定の細胞型の誘導と関連しなかったことを示唆している。

【0355】

培養されたヒト組織鎖における収縮装置の成熟
非刺激組織鎖中の細胞は、明確に定義されたZディスク及び筋原線維(図9c、図11及び図12を参照されたい)を示したが、Zディスク整列の兆候は示さなかった。対照的に、高周波数レジメン下で刺激された組織鎖は、整列したZディスクを包含し、示す頻繁な筋原線維を有する組織化されたサルコメア束(図9c、6Hz;図11及び図12を参照されたい)、いくつかのミトコンドリア(図9c、6Hz;図11及び図12を参照されたい)及びデスモソーム(図9cを参照されたい)等の、成熟の兆候を示した。6Hz条件では、ミトコンドリアは対照又は3Hz条件におけるよりも収縮装置のより近くに位置していた(図9c、6Hz;図11及び図12を参照されたい)。

【0356】

電気刺激された試料は、サルコメアあたりのHゾーン(図9d、CTRL対6Hz、P=0.005;図11d、CTRL対6Hz、P=0.001を参照されたい)及びZディスクあたりのIバンド(図11d、CTRL対3Hz、P=0.01;CTRL対6Hz、P=0.003;図11d、CTRL対6Hz、P=0.004を参照されたい)の有意により高い存在により示されるように、非刺激対照よりも成熟細胞とより適合するサルコメア組織化を示した。6Hzレジメンで刺激された組織鎖はまた、非刺激対照と3Hz刺激された組織鎖の両方よりも膜の長さあたりのデスモソームの有意により多い数を示した(図9d、P=0.0003を参照されたい)。hiPSC由来心筋細胞組織鎖において、発生期境界板を有する領域が頻繁に見られた(図11c及び図12bを参照されたい)。

【0357】

ヒトの工学的に作製した組織鎖の機能的評価
図17は、工学的に作製した組織鎖の機能的評価からの例示的結果を示す。電気刺激は、興奮閾値(図17a)[電界刺激及びビデオ顕微鏡観察により測定されるように、CTRL(n=4)対6Hz(n=3)、P=0.03;3Hz、n=3]、最大捕捉率(図17b)[点刺激及び光学マッピングにより測定されるように、CTRL(n=4)対6Hz(n=4)、P=0.022;3Hz、n=3]及び電気インパルス伝播率(図17c)[点刺激及び光学マッピングにより測定されるように、CTRL(n=13)対3Hz(n=10)、P=0.014;CTRL対6Hz(n=5)、P=0.011]を改善することがわかった。平均±s.d.。図17dは、組織鎖中での伝導速度活性化マップの代表的な画像を示す。*は、群と対照との間の統計的有意差を示す。ヒートマップ=0〜200ms。図17a〜図17dは、Hes2細胞株から得られたhESC由来心筋細胞に関する結果を示す。

【0358】

図18は、6Hz増大刺激組織鎖の最大捕捉率が、点刺激と比較して電界刺激に関してより高かったことを示す例示的結果を示す。図18aは、例示的な電気的点刺激を示す。図18a(I)において、刺激周波数を赤色で示し、刺激部位に対して近位(下のトレーシング)及び遠位(上のトレーシング)の捕捉を黒色で示す。各シグナル間の時間遅延は、伝導速度を示す。近位部位と遠位部位の両方における増殖シグナルの一貫した捕捉は、組織鎖中での機能的遮断の非存在及び良好な電気的統合を示した。図18a(II)において、3、4、5及び6HzでIで示されるシグナルの増幅は、捕捉が2:1になった時、1:1の捕捉が4Hzより上で失われることを示した。4Hzより上で刺激した場合、近位部位と遠位部位との間の増殖は1:1のままであった。画像中の赤色の丸は、点刺激の部位を表す。図18bは、例示的電界刺激を示す。図18b(I)において、電界刺激周波数を赤色のトレーシングで示し、組織鎖の異なる部位での捕捉を黒色で示す。予想通り、各シグナル間で時間遅延は観察されず、これは、細胞がほぼ同時に電気刺激を受け取ったことを示している。1:1での捕捉率は、それが図18b(II)に示されるように6Hzで間欠的になった場合、5.2Hzより上で失われた。図18a〜図18bは、hESC由来心筋細胞Hes2細胞株に関する結果を示す。

【0359】

図19は、伝導速度の改善がデスモソームの存在と相関していたことを示す例示的結果を示す。伝導速度は、細胞内フィラメントを細胞表面タンパク質に連結し、収縮及び力伝播の間の心筋の完全性を維持するのを担う、細胞接着タンパク質の分子複合体であるデスモソームの数と直接相関していた(R2=0.8526、CV対面積あたりのデスモソームの平均数)。Hes2細胞株hESC由来心筋細胞。

【0360】

6Hzレジメンを用いる電気刺激は、培養組織鎖の電気特性を有意に改善し、インパルス伝播の光学マッピングと同時に培養の終わりでの点刺激により分析されたように、興奮閾値の統計的に有意な低下(図19a、CTRL対6Hz、P=0.03を参照されたい)及び最大捕捉率の増加(図19b、CTRL対6Hz、P=0.002、図11、図12を参照されたい)をもたらした(図18aを参照されたい)。光学マッピングにより、点刺激(4Hz)よりも電界刺激(5.2Hz)に関してより高いMCRが示された(図18b、6Hzでの間欠的捕捉と共に5.2Hz捕捉を参照されたい)。電界刺激の間に、全ての細胞は同時に刺激を受け取り、応答はそれぞれの細胞の増殖限界により制限されなかった。培養の終わりでの点刺激の際に評価された、伝導速度(CV)は、非刺激対照よりも培養中に電気刺激された試料において約40%及び約50%(それぞれ、3Hz及び6Hz)高かった(図17c及び図17d、CTRL対3Hz、P=0.014;CTRL対6Hz、P=0.011を参照されたい)。電気的特性(ET、MCR及びCV)の改善は、低周波数レジメンよりも高周波数レジメンについてより顕著であった。伝導速度の改善は、細胞間接着タンパク質の分子複合体であるデスモソームの平均数と直接相関することがわかった(図19、R²=0.8526を参照されたい)。

【0361】

刺激は培養されたヒト組織鎖におけるCa²⁺ハンドリング特性を改善する
図20は、電気刺激がCa²⁺ハンドリング特性の改善を促進したことを示す例示的結果を示す。例示的結果は、非刺激対照細胞(図20a)、3Hz増大プロトコール(図20b)及び6Hz増大プロトコール(図20c)におけるカフェインに応答したCa²⁺の放出を示す。図20dは、異なる実験群間でのピーク蛍光強度のカフェイン誘導性変化を示す例示的結果を示す(カフェインの投与前のピーク蛍光強度を正規化した後の平均±s.e.m.)[CTRL対3Hz、P=1.1×10-6;CTRL対6Hz、P=2.1×10-7;3Hz対6Hz、P=0.003;n=10(CTRL)、n=8(3Hz)及びn=9(6Hz)]。図20eは、6Hz刺激細胞における5mM(矢印)のカフェインの投与の前後のCa²⁺移行の代表的な蛍光記録を示す。例示的結果はまた、カフェインの添加前の6Hz細胞中でのベラパミル(図20f)又はニフェジピン(図20g)によるL型Ca²⁺チャネルの阻害及びタプシガルギン(図20h)によるSERCAチャネルの遮断も示す。*は、群と対照との間の統計的有意差を示す。#は、3Hzと6Hz群との間の統計的有意差を示す。図20a〜図20hは、Hes2細胞株から得られたhESC由来心筋細胞に関する結果を示し、組織鎖からの解離後の単一細胞の心筋細胞中で実施された測定を表す。

【0362】

hESC心筋細胞の全部¹⁰又は大部分¹²はいずれも、収縮のための筋小胞体Ca²⁺放出よりもむしろ筋線維鞘Ca²⁺流入に依拠し、成体心筋とは顕著に異なる。組織鎖から単離された単一細胞における細胞質ゾルCa²⁺に対する、筋小胞体リアノジンチャネルの開口因子であるカフェインの効果を試験した。以前の研究¹⁰と一致して、非刺激対照中のhESC心筋細胞はいずれもカフェインに応答しなかったが(図20aを参照されたい)、3及び6Hzの両方の条件における電気刺激された細胞は細胞質ゾルCa²⁺の増加を誘導することによりカフェインに応答した(図20b及び図20cを参照されたい)。Ca²⁺移行振幅の定量化は、電気刺激された細胞が、刺激周波数依存的様式で、非刺激対照よりもカフェインに応答して有意により高い振幅強度を示すことを示していた(図20d及び図20eを参照されたい)。ベラパミル(図20fを参照されたい)又はニフェジピン(図20gを参照されたい)のいずれかを用いる6Hz組織鎖からの細胞中でのL型Ca²⁺チャネルの遮断は、成熟細胞において予想されたように、Ca²⁺移行の停止をもたらした。L型Ca²⁺チャネルの遮断後のカフェインの添加は、細胞質ゾル中へのCa²⁺の放出をもたらした(図20f及び図20gを参照されたい)。タプシガルギンの添加による筋小胞体Ca²⁺ATPase(SERCA)のイオン輸送活性の遮断(図20hを参照されたい)は、筋小胞体からのCa²⁺の枯渇に起因して、時間と共にカルシウム移行の停止をもたらす。6Hz条件からの心筋細胞はまた、細胞質ゾルへのCa²⁺放出の動力学を表すパラメータである、ピークまでのより速い上昇勾配及び時間、並びに細胞質ゾルからのCa²⁺のクリアランスの動力学を表すパラメータである、ベースまでのより速いτ-崩壊及び時間も示した(図27中のTable 2を参照されたい)。Table 2は、6Hzレジメンで刺激された心筋細胞におけるCa²⁺ハンドリング特性の変化がより成熟したCa²⁺ハンドリング特性と適合していたことを示す例示的結果を示す。培養の終わりに組織鎖から解離した単一化された心筋細胞に対して測定を実施した。*は、非刺激対照に対する統計的有意性を示す(平均±s.e.m.)。

【0363】

まとめると、これらのデータは、培養中に6Hz刺激レジメンを受けた心臓組織鎖が機能的筋小胞体と適合するCa²⁺ハンドリング特性を示すことを示した。

【0364】

刺激は培養されたヒト組織鎖の電気生理学的特性を変化させる
図21は、培養組織鎖又は胚様体から単離され、パッチクランプを用いて記録された単一細胞の心筋細胞における電気生理学的特性を示す例示的結果を示す。6Hzで刺激された組織鎖(黒色)、対照組織鎖(白色)、EBd44及びEBd20を示す。例示的結果は、hERGテール電流密度(図26a)、-100mVで測定されたIK1電流密度(図21b)、細胞電気容量(図21c)、休止膜電位(図21d)、活動電位の最大脱分極速度(図21e)、活動電位ピーク電圧(図21f)、90%の再分極で測定された活動電位持続時間(図21g)及び自発的鼓動を示す(自動性)、又は自発的鼓動を示さない(非自動性)細胞の比率(図21h)を示す。図21a〜図21hは、Hes2細胞株から得られたhESC由来心筋細胞に関する結果を示す。平均±s.e.m.。

【0365】

図22は、6Hz又は対照組織鎖から単離された単一の心筋細胞におけるhERG電流及びIK1に対する電気刺激の効果を示す例示的結果を示す。例示的結果は、hERG電流の代表的トレース(図22a及び図22b)、6Hzで刺激された組織鎖から単離された心筋細胞の活動電位構成に対するドフェチリドの効果(図22c)、hERGテール電流の電流密度-電圧関係(差込図はhERGのテール電流部分及び記録プロトコールの拡大図を示す)(図22d)、IK1の代表的トレース(図22e及び図22f)、並びにIK1の電流密度-電圧曲線(図22g)を示す。図22a〜図22gは、組織鎖からの解離後のhESC由来心筋細胞Hes2細胞株に関する結果を示す。平均±s.e.m.。

【0366】

図23は、組織鎖から単離された単一の心筋細胞におけるNa+電流に対する電気刺激の効果、活動電位ピーク、膜コンダクタンス、膜コンダクタンス-休止電位曲線及びIK1-休止電位曲線を示す例示的結果を示す。例示的結果は、6Hz及び対照組織鎖から記録された代表的なNa+電流定常状態不活化トレースの拡大図(図23a及び図23b、差込図は元のトレース及び記録プロトコールの全体図である)、Na+電流定常状態不活化曲線、6Hz群のV1/2=-61.06±0.65mV;対照群のV1/2=-71.24±0.24mV及びEBd44群のV1/2=-70.35±0.60mV(図23c)、Na+電流密度(図23d)、活動電位振幅(図23e)、-100mVでの膜コンダクタンス(図23f)、膜コンダクタンス-休止電位関係曲線(図28g)、並びにIK1-休止電位関係曲線(図23h)を示す。図23a〜図23hは、hESC由来心筋細胞Hes2細胞株に関する結果を示す。平均±s.e.m.。

【0367】

図24は、高インピーダンスガラス微小電極を用いて記録されたインタクトな6Hz組織鎖における活動電位持続時間率依存的適合及び休止電位を示す例示的結果を示す。例示的結果は、1、3及び5.5Hzでの電界刺激を用いて記録された6Hz増大組織鎖の活動電位(図24a)、6Hz組織鎖における自発的活動(図24b)、6Hz増大刺激レジメンを受けた組織鎖における90%再分極(APD90)で測定された活動電位持続時間の速度依存的適合(図24c)、休止電位(図24d)及びインタクトな組織鎖における活動電位のピーク電圧(図24e)を示す。図24a〜図24eは、hESC由来心筋細胞Hes2細胞株に関する結果を示す。平均±s.e.m.。

【0368】

成熟度を評価するために、組織鎖及びEBから誘導された心筋細胞中の活動電位、hERG及びI_K1電流¹¹を測定した(図21を参照されたい)。hERG電流は、非刺激対照(0.52±0.10pA/pF)よりも6Hzで刺激された組織鎖(0.81±0.09pA/pF)においてより高く(P=0.0434)(図21aを参照されたい)、その生物物理特性の差異はなかった(図22を参照されたい)。両方の組織鎖群に由来する心筋細胞は、20日目又は44日目にEBに由来するものと比較してより高いhERGレベルを有していた(図21aを参照されたい)。同様に、I_K1密度は対照(0.94±0.14pA/pF、CTRL)よりも6Hz組織鎖(1.53±0.25pA/pF、6Hz)においてより高く(P=0.0406)、両組織鎖群におけるI_K1レベルはEB由来心筋細胞において記録されたものよりも高かった(P=0.0005)(図21bを参照されたい)。細胞サイズの尺度である細胞電気容量は、対照組織鎖(14.23±0.90pF;CTRL)と比較して6Hz組織鎖(19.59±1.41pF;6Hz)においてより高い(P=0.0052)値を示し、EB由来心筋細胞においてより小さい(P=0.0041)電気容量を示した(図21cを参照されたい)。組織鎖からの心筋細胞の休止膜電位(V_rest)は、EB心筋細胞におけるよりも負(P<0.0001)であった(図21dを参照されたい)。興味深いことに、約16mVであった液体結合電位について補正した後、パッチクランプ法を用いて組織鎖心筋細胞中で記録されたV_restの値は、K⁺に関するネルンスト電位(E_K=-96mV)の平衡電位より良好に下であったが、これは、おそらくNa⁺ポンプ^37〜38により生成されたものである過分極電流がV_restに強く影響したことを示唆している。それと一致して、組織鎖からの心筋細胞は非常に低い休止膜コンダクタンスを有し、V_restと相関していた一方(R=0.5584、P<0.0001)、I_K1電流はV_restとの負の相関を示した(R=0.2267、P=0.0216、図23を参照されたい)。最大脱分極速度(図21eを参照されたい)及び活動電位のピーク電圧(図21fを参照されたい)は、2つの組織鎖群間で異ならなかった。しかしながら、両方の特性が、EBと比較して改善された(それぞれ、P=0.5248及びP=0.0488)。活動電位持続時間は、組織鎖由来心筋細胞よりもEB由来心筋細胞においてより長く(P=0.0021)、変動性も高かった(図21g及び図24を参照されたい)が、これは、組織鎖における電気生理学的多様性が低く、成熟度が高いことを示唆している。自動性は、対照組織鎖と比較してEB由来心筋細胞においてより高く(P=0.0414)(図21hを参照されたい)、これは6Hzで刺激された組織鎖と同等であった。まとめると、これらの結果は、6Hzレジメンでの組織鎖及び電気刺激が電気生理学的成熟を促進したという結論を支持する。

【0369】

培養されたヒト組織鎖における電気生理学的測定
縫合糸は周囲の心臓組織よりも固いため、縫合糸の存在は、活動力及び機械的刺激の両方の直接測定を阻害した。この制限は、生分解性縫合糸の使用によって将来の研究において克服することができる。従って、提示される電気生理学的測定(図21を参照されたい)を用いて、条件付けられた細胞の機能的成熟を正確に測定した。hERG電流、I_K1電流、細胞電気容量、休止膜電位、最大脱分極速度、活動電位のピーク電圧、活動電位持続時間及び自動性の全ての測定値は、EB対照において培養されたものと比較して、組織鎖において培養された心筋細胞において改善を示した。組織鎖の電気刺激はhERG、I_K1及び細胞電気容量を増強したが(図21a〜図21bを参照されたい)、他の測定によれば刺激された組織鎖と非刺激組織鎖との間に差異はなかった。具体的には、活動電位中の膜脱分極の最大速度は、6Hzと対照組織鎖との間で異ならず(P=0.5248)(図21e、122.5±9.30mV/ms;6Hz対111.8±14.67mV/ms;CTRLを参照されたい)、組織鎖群間のNa⁺電流密度の差異の欠如と相関する観察であった(図23dを参照されたい)。V_restは、単一の単離された筋細胞のパッチクランプ記録(-98.58±2.87mV;6Hz対-99.44±5.37mV;CTRL)又はインタクトな組織鎖中の鋭い微小電極記録(-97.08±3.95mV;6Hz対-98.5±6.09mV;CTRL、P=0.8425、図24を参照されたい)を用いた場合、組織鎖群間で異ならなかった(P=0.88)。6Hzで刺激された組織鎖はまた、1Hzから5.5Hzまでの刺激周波数の増加と共に減少する活動電位の持続時間との活動電位持続時間の速度依存的適合を示した(図24を参照されたい)。

【0370】

細胞電気容量の測定値は、非刺激対照と比較して6Hz刺激レジメンにおいてTable 1(図26を参照されたい)中のサイズ測定値と一致していたが、これは、電気刺激が組織鎖中の心筋細胞の成熟を誘導したことを示唆している。電気容量測定値はEBと比較して6Hzで刺激されたhESC心筋細胞組織鎖の細胞サイズの改善を示したが、その値はヒト成人の心室筋細胞と一致するサイズが達成されなかったことを明確に示していた。新鮮に単離された健康なヒト成人の心室筋細胞の電気容量は179〜227pFの範囲にあると報告された³⁹;新鮮に単離されたヒト成人の心房心筋細胞の電気容量は66pFであると報告された。興味深いことに、2D基質上での培養の1日後、成体心房心筋細胞の電気容量は23pFまで減少したが⁴⁰、その3D環境からの心筋細胞の除去は細胞電気容量に劇的に影響し得ることを示唆している。ここで報告される電気容量値は、心臓特異的内因性MYH6プロモーターから制御されるブラスチシジン耐性遺伝子発現を工学的に作製することにより誘導されるiPSC心筋細胞について他者により報告されたもの(15.8〜88.7pF)⁴よりも小さかったが、他のhESC心筋細胞(21.6±1.3pF、7〜40pFの範囲)及びヒト胎児心筋細胞の報告(90〜110日の日齢、20.3±4.6pF)^41〜42と類似していた。hPSCの分化した子孫は非常に初期のヒト発生(6週未満)を反映すると記載されたため⁴³、in vitroでの成熟にとって必要とされる電気刺激速度はin vivoでの胚発生と異なってもよいと考えられる。それにも関わらず、次第に高くなる電気刺激速度を用いて得られたin vitroの心臓組織鎖の顕著な成熟は、in vitroでのより成熟した収縮心臓組織を生成するための重要なツールを提供した。

【0371】

培養組織鎖は類似するレベルでミオシン重鎖及びホスホランバンの発現を示した
図25は、組織鎖中での選択された心臓タンパク質の発現が異なる条件において類似していたことを示す例示的結果を示す。例示的結果は、組織鎖溶解物のウェスタンブロッティングにより評価された全心臓ミオシン重鎖発現(図25a)及びホスホランバン発現(図25b)を示す(n=3)。図25a〜図25bは、hESC由来心筋細胞Hes2細胞株に関する結果を示す。

【0372】

心筋細胞の筋原線維微細構造の変化が収縮タンパク質発現の変化と関連するかどうかを調べるために、全ミオシン重鎖(MHC)の発現を、ウェスタンブロッティングにより組織鎖中で分析したところ(図25aを参照されたい)、全MHCが電気刺激(3及び6Hz)された心臓組織鎖、及び非刺激(CTRL)心臓組織鎖において類似するレベルで発現されることが見出された。更に、Ca²⁺取込みの調節に関与し、機能的筋小胞体を示さないhESC心筋細胞中に存在しないとして以前に記載¹⁰された筋小胞体分子であるホスホランバンの発現も調べた。事実、ホスホランバンは、類似するレベルでhESC心筋細胞組織鎖中に存在することが見出された(図25bを参照されたい)。

【0373】

hESC心筋細胞における機能的筋小胞体の欠如の可能性のある原因は、ホスホランバンの発現の欠如であると報告された¹⁰。全ての条件において類似するレベルで本研究における細胞中でホスホランバン発現を検出することができたが、これが電気刺激によるCa²⁺ハンドリング特性の改善の原因ではなかったことを示唆している。本研究及び以前の研究¹⁰における細胞間のホスホランバン発現の差異は、本研究は指向性分化プロトコールを用いた一方、他の研究¹⁰は血清に基づく自発的分化に由来する心筋細胞を用いたという事実によって説明することができる。

【0374】

以前には一次供給源及び動物組織に由来する細胞と共に電界刺激が用いられたが^22〜23、3D組織集合の幾何学的制御と、hPSC由来心筋細胞及び支持細胞の電気刺激との組合せが、ヒト心臓組織の電気的特性及び微細構造特性を改善し、細胞の成熟をもたらすことがここで初めて示される。組織鎖縫合糸は、マトリックス再モデリング中にデバイスプラットフォームに固定されたままであり、縫合糸軸に沿った細胞整列をもたらす張力を生成した。

【0375】

正常なヒト胎児心拍は有意に変化し、ほとんどの時間で約3Hzに維持される⁴⁴一方、成人の安静時心拍は約1Hzである⁴⁴。心拍の変化は、収縮タンパク質発現の変化と関連し、刺激速度への心臓成熟の依存の可能性を示唆する。胎児の平均心拍は3Hzである⁴⁴ため、1から6Hzまでの進行的増加は、試験した最良の条件であったという事実は驚くべきものであった。これはin vitro設定における他の重要な細胞型及び細胞間発生誘導の欠如の代償機構であり得る。電界刺激周波数を培養物中で7日間にわたって徐々に増加させたため、6Hz群は刺激の最終日に捕捉を失うに過ぎない(5.2Hzの速度を超える)。従って、それは最も高い可能な速度での刺激であってよく、速度自体はin vitroでの心筋細胞成熟を支配する合図ではない。

【0376】

明確に目に見えるZディスク、Hゾーン及びIバンドに関する、刺激条件における細胞及び筋線維構造の改善は、より低いET、より高いMCR、より高い伝導速度、改善された電気生理学的及びCa²⁺ハンドリング特性、並びに内向き整流性カリウムチャネル遺伝子(KCNJ2)の上方調節等の刺激された組織鎖のより良好な電気的特性と相関していた。以前の報告^45〜46と一致して、M線及びT管の欠如は、最終分化の非存在を示した。EBと比較して組織鎖において構造タンパク質mRNAの下方調節があったが、タンパク質レベルの変化は観察されなかった。機械的刺激は、ミオシン重鎖等の構造タンパク質の強固な誘導をもたらし、hPSC由来心筋細胞の増殖を誘導することが報告され^14、47、6Hzでの組織鎖の電気刺激がより良好な機械的刺激環境を単に提供するものではなかったことを示唆している。以前には、機械的刺激は電気生理学的成熟をもたらさなかった⁴⁷。心臓負荷の模倣としてのストレッチと関連する電気刺激の使用¹⁴は、同時的に、又は連続的に、hPSC由来心筋細胞の最終分化を誘導し、筋フィラメントタンパク質の発現を上方調節するために必要であり得る。他の戦略は、T3甲状腺ホルモン⁴⁸、インスリン様成長因子-1⁴⁹の存在下での培養、ヒドロゲル混合物中へのラミニン又は天然脱細胞心臓ECMの添加⁵⁰及びより固い基質上での培養^51、52を含んでもよい。

【0377】

いくらかのヒト幹細胞株は他のものよりも心筋生成性(cardiomyogenic)であり^12、16、これらの差異が産生される細胞の成熟度と関連し得ることはよく受け入れられている。以前の報告^10、11、53では、多くの、通常はほとんどの細胞は分化の終わりではカフェインに対して反応しなかった。従って、Ca²⁺ハンドリング特性における差異もまた、細胞株の変動性に起因し得る。ここで、所与の細胞株内で、組織鎖中の培養物及び電界刺激は、機能的筋小胞体と一致する心筋細胞のCa²⁺ハンドリング特性を増強したことが示される。

【0378】

組織鎖心筋細胞は、EBd20又はEBd44から得られた心筋細胞よりも明確により成熟しており、自動性に関するより高い傾向、より脱分極した膜電位、減少した細胞電気容量並びに低いhERG及びI_K1電流を示した。EBd20心筋細胞の電気生理学的測定は組織鎖へのその取込みの前に細胞特性を表した一方、EBd44心筋細胞を、成熟に対する培養時間の独立した効果の評価を可能にする組織鎖培養時間よりもわずかに長い期間にわたって培養した^54、11。心筋細胞は胚状態からの成熟を受けるため、低い膜コンダクタンスとE_Kより低いV_restとの組合せが、「中間」の表現型であり得ると考えることは興味深い。

【0379】

組織鎖中のhPSC心筋細胞の特性と、マウス又はヒトの発生とを相関付けることは、成熟段階を正確に測定するのに役立ち得るが、げっ歯類の心筋細胞は生理学的に異なり、年齢で定義された健康な人の心臓試料は十分ではない。更に、in vitroでの成熟は、胚発生と適合しない場合がある。ゲル圧縮の際の組織鎖の小さいサイズ(約300μmの半径)を、組織鎖を灌流することなく培養物中で維持することができることを確保するために酸素供給の拡散限界に近くなるように選択した。血管細胞の添加は、将来のin vivoでの研究における宿主組織の生存を改善し、それとの統合を促進するために必須である¹⁴。したがって、実施例1Aに記載のデバイスは、将来のin vivoでの研究において、最も少ない副作用(例えば、不整脈)で成体心臓において生存し、統合する細胞の最も高い能力をもたらす最適な成熟レベルを決定するために用いることができる段階的な成熟レベルのヒト心臓組織の生成を可能にするユニークなプラットフォームを提供することができる。

【0380】

(実施例2)
バイオチューブ
A.例示的な中空の/灌流可能なワイヤの実施形態(すなわち、バイオチューブ)の構造、調製、及び使用
第2の実施形態において、本発明は、ウェル又はチャネル、チャネルの長さにわたって支持される、又は吊り下げられる管腔を含む長手足場を有するバイオリアクターを含む灌流可能な管腔を含む三次元組織を増殖させるためのバイオリアクターデバイスであって、バイオリアクター及びチャネルが、管腔を含む組織鎖を形成するのに十分な播種された細胞を受け取るように構成されるデバイスに関する。心臓細胞(又は他の電気的に刺激された細胞)を含む実施形態において、バイオリアクターを、バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生成するように構成される電極を含むように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向にあってよいが、好ましくは、チャネル(及び得られる組織鎖)の長さに対して平行である方向にあるか、又はチャネル(及び得られる組織鎖)の長さに対して垂直である方向にある。本明細書で用いられるように、本発明の第2の実施形態を「バイオチューブ」と呼ぶことができ、それだけに限定されないが、組織鎖自体(すなわち、本明細書に記載されるバイオリアクターデバイス上で増殖する細胞)又は組織鎖とバイオリアクターとを一緒に含む系を指してもよい。バイオチューブはまた、本明細書ではBIOTUBE(商標)のその商業名を指してもよく、組織鎖自体、又は組織鎖と、組織鎖が増殖したか、若しくは置かれたバイオリアクターデバイスとを含む系の両方を包含する。この実施形態では、デバイスを、管腔を含む複数の三次元組織鎖を同時に増殖させることができるような、複数のバイオリアクターチャネル及び長手足場を含む構成にスケールアップすることができる。この第2の実施形態はまた、バイオリアクター中で組織鎖を増殖させるための方法、三次元組織鎖自体、バイオリアクターと増殖した組織鎖の両方を含む系、並びにそれだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)オーダーメイド医療を含む様々な適用において組織鎖(若しくは組織鎖を含む系)を使用及び/又は試験する方法に関する。この実施形態では、デバイスを、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、及び1536ウェルプレート等のマルチウェルプレートで構成することができる。

【0381】

図29は、灌流可能な組織鎖の培養にとって好適な例示的デバイスの略図及び画像を示す。バイオチューブのデバイスは、実施例1のバイオワイヤのデバイスと類似していてもよく、培養された組織鎖の灌流を可能にする追加された特徴を有する。

【0382】

例示的デバイスは、組織培養のための種細胞を受け取ることができる長手バイオリアクターチャネルを含んでもよい。長手足場を、バイオリアクターチャネルの長さにわたって支持する(例えば、吊り下げる)ことができる。足場は、種細胞が足場の長さに沿って組織構造を形成するための支持体として役立ち得る。足場はまた、管腔を有してもよく、管腔を介する培養された組織鎖の灌流を可能にしてもよい。

【0383】

この実施形態では、バイオリアクターチャネルの一方の末端の入口との流体連結に流体リザーバー(例えば、薬物リザーバー)が追加で存在してもよい。バイオリアクターチャネルの反対側の末端の出口は、外部の陽圧又は陰圧源との流体連結にあってもよい(例えば、接続チャネルを介する)。陰圧又は陽圧の使用は、足場の管腔を通過する流体の流動及び/又は灌流を促進するのに役立ち得る。流体リザーバー及び/又は接続チャネルは、例示的デバイスの一部であってもよく、又はこれらのものはデバイスに接続可能な別の構成要素であってもよい。これらの構成要素を全て、スライドガラス等の基質によって支持し、その上に結合することができる。実際の画像を図29の左上の角に示す。

【0384】

例示的デバイスは、微細製作されたバイオリアクターチャネル又はチャンバーを含んでもよく、微細製作されたプラットフォーム(例えば、PDMSから作られる)及び吊り下げられた管状鋳型の形態の足場(例えば、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)マイクロチューブから作られる)を含んでもよい。管腔を有する足場(例えば、管状鋳型)を用いて組織を培養することにより、得られる組織に、組織の灌流を可能にする管腔を提供することができる。

【0385】

バイオチューブの実施形態を、実施例1のバイオワイヤデバイスのものと類似する様式で製作することができる。一例において、PDMSプラットフォームを製作するために、標準的なソフトリソグラフィ技術を用いて、2層のSU-8(Microchem Corp.社、Newton、MA)マスター²⁰を作製した。第1の層は鋳型チャネルと細胞培養チャンバーとを含んでいた一方、第2の層は細胞培養チャンバーのみを含んでいた。次いで、PDMSをSU-8マスター上に投入し、70℃で2時間焼いた。次いで、管状鋳型をPDMSプラットフォームの2つの末端に固定した後、70%エタノール中、及び一晩のUV照射によりバイオリアクターを滅菌した。管状鋳型を介する灌流を提供するために、2つの微細製作されたモジュール、薬物リザーバー及び接続チャネルを、例示的バイオリアクターデバイスに追加した。単層のSU-8マスター(長さ×幅×高さ=10×1×0.3mm)を用いてPDMSを最初に成型することにより、両モジュールを製作した。8mmの生検パンチ(Sklar社)を用いてPDMSを通して切断することにより、薬物リザーバーを作出した。PTFEチューブ[内径(ID)=0.002インチ、外径(OD)=0.006インチ、Zeus社]を用いて、バイオリアクターチャネルを薬物リザーバー及び接続チャネルに接続した。Tygonチューブ(ID=0.01インチ、OD=0.03インチ、Thomas Scientific社)は、灌流系を蠕動ポンプにより生成された外部陰圧に接続した。灌流速度を、蠕動ポンプからの出口で収集された液体容量により特徴付けた。エポキシ接着剤により全ての接続点を固定し、3つの微細製作されたモジュールをスライドガラスにプラズマ結合させた。

【0386】

ある特定の材料、技術及び寸法が上記されたが、他の好適な材料、技術及び寸法を、例示的デバイスのために用いることができる。他の好適な材料の例としては、それだけに限定されないが、ポリ(グリセロールセバケート)、POMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン並びにそのコポリマーが挙げられる。ある特定の型の管及び接続が記載されるが、流体連結の他の手段を用いてもよい。例えば、リザーバー、バイオリアクターチャネル及び接続チャネルを全て、別々の構成要素というよりもむしろ、一緒に微細製作することができる。

【0387】

B.例示的バイオチューブ実施形態の実験的試験
例示的方法及び分析
実施例1のデバイスの調査のために、新生児ラット心筋細胞又はヒトESC由来心筋細胞を、上記のように取得した。或いは、HES3 hESCのNKX2-5遺伝子座中に挿入されたeGFP cDNAを含有するNKX2-5-eGFPリポーターヒト胚性幹細胞(hESC)株²²を、記載²³のように維持した。心臓分化の前に、TrypLE Express(Gibco社)を用いて細胞を単一の細胞に渡し、薄層の成長因子が減少したMatrigel(BD Biosciences社)上に260,000細胞/cm²の密度でプレーティングし、マウス胚性線維芽細胞条件培地(MEF-CM)を用いて培養した。心臓分化を誘導するために、マトリックスサンドイッチプロトコールを、50〜100ng/mLのアクチビンA及び7〜10ng/mLのBMP4を用いて記載²⁴のように用いた。得られる心筋細胞単層培養物を、以前に記載¹⁹のように19日目に消化した。

【0388】

組織鎖を4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.25%Triton X-100により透過処理し、10%ウシ血清アルブミン(BSA)により遮断した。以下の抗体:マウス抗心臓トロポニンT(cTnT)(Abcam社;1:100)、マウス抗α-アクチニン(Abcam社;1:200)及び抗ウサギTRITC(Invitrogen社;1:200)、抗マウスTRITC(Jackson Immuno Research社;1:200)を用いて、免疫染色を実施した。核を、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(Biotium社;1:100)で対抗染色した。ファロイジン-Alexa 660(Introgen社;1:600)を用いて、F-アクチン線維を染色した。共焦点顕微鏡観察のために、染色された心臓組織鎖を、倒立型共焦点顕微鏡(Olympus社、IX81)又は直立型共焦点顕微鏡(Zeiss社、LSM 510)の下で可視化した。

【0389】

新生児ラット心臓細胞を、管状鋳型を有する例示的灌流可能バイオリアクターデバイス中に播種した。7日間培養した後、培養された心臓組織鎖を切片化し、環境制御型SEM(Hitachi社、S-3400N)の下で可視化した。組織鎖を、70Pa及び15kVの可変圧力モード下で、チャンバー温度は-20℃で画像化した。

【0390】

横断面を可視化するために、灌流可能な心臓組織鎖をcTnT抗体、次いで、TRITCで染色した。次いで、染色された組織鎖を、クリオスタット(Leica社、CM3050S)を用いて500μmの厚さの切片に凍結切片化し、Superfrost Plusスライドガラス(VWR社)上に載せた。切片化された組織鎖の画像を、Olympus社の蛍光顕微鏡(IX81)により獲得した。

【0391】

例示的デバイスの実現可能性を証明するために、FITC標識されたポリスチレンビーズ(Spherotech Inc.社)を薬物リザーバー中に添加し、ラット心臓組織鎖を通して灌流したが、それは8日目に自発的に鼓動した。明視野及び蛍光ビデオ及び画像を、蛍光顕微鏡(Olympus社、IX81)を用いて獲得した。

【0392】

NO灌流の定量化を実行した。ニトロプルシドナトリウム(SNP)(Sigma社)を蒸留水に溶解して、200mMのSNP溶液を作製した後、薬物リザーバーに添加した。管状鋳型を介する灌流を、外部蠕動ポンプにより駆動した。一度、SNP溶液がチューブを通って灌流したら、蠕動ポンプを停止させ、全灌流系を細胞培養インキュベータ中で保持した。細胞培養チャネル(PTFEチューブの外部)中のNO量を、蛍光測定Nitric Oxide Assay Kit(Calbiochem社、482655)を用いて定量した。簡単に述べると、異なる時点(0.5時間、6時間、及び24時間)で細胞培養チャネルから収集された試料(8μl、n=3)を、硝酸リダクターゼにより亜硝酸化合物に変換した後、蛍光化合物1-H-ナフトトリアゾールに展開させた。蛍光シグナルを、プレートリーダー(Apollo LB911、Berthold Technologies社)により定量し、硝酸標準と比較した。

【0393】

ヒト心臓組織鎖のNO処理を実行した。7日目に、ヒト心臓組織鎖のNO処理を、200mMのSNP溶液を灌流させることにより開始し、SNP溶液がチューブを通って灌流されたら、蠕動ポンプを停止させた。ヒト心臓組織鎖を37℃で保持しながら、組織鎖の鼓動活動を、Olympus社IX81により、処理前及び処理後24時間、16.67フレーム/秒で記録した。ヒト心臓組織鎖の鼓動活動を、Sageら²⁸により記載された画像分析法により定量した。簡単に述べると、NO処理の前後でのヒト心臓組織鎖上の同じ位置の1つのスポットの移動を特徴付けた。

【0394】

電気刺激及び灌流を実行した。ヒト灌流可能心臓組織鎖については、平行電気刺激のみを上記のように印加した。4日目に開始して、電界刺激(二相、直角、1ms持続時間、1Hz、3.5〜4V/cm)を4日間にわたって印加した一方、対照組織鎖は電界刺激なしに培養した。刺激された組織鎖と対照組織鎖の両方を、外部シリンジポンプ(PHD Ultra;Harvard Apparatus社)により駆動されたPTFEチューブ内で2μl/分の流量で培養培地を用いて灌流した。電界刺激の終わりに、刺激されたヒト心臓組織鎖及び対照ヒト心臓組織鎖の電気特性を、以前に記載²⁹のように、外部電界ペーシングの下で興奮閾値(ET)及び最大捕捉率(MCR)に関して特徴付けた。

【0395】

統計的分析を、SigmaPlot 11.0を用いて実施した。実験群間の差異を、t検定又は一元配置ANOVAを用いて分析し、有意差をp<0.05と考えた。

【0396】

例示的結果及び考察
灌流可能心臓組織鎖の生成及び特徴付け
一次新生児ラット及びhESC由来の心筋細胞を用いて、灌流可能心臓組織鎖を生成した。

【0397】

図30は、培養された灌流可能心臓組織鎖の例示的画像を示す。図30aは、新生児ラット心筋細胞(2億個の細胞/ml)がゲルを再モデリングし、管状鋳型の周囲にまとまった(ID=50.8μm、OD=152.4μm)ことを示す。組織鎖の末端のチューブ管腔を示す詳細図を右上に示す。図30bは、心臓組織がチューブ表面に付着し、再モデリング後に均一な薄層を形成したことを示すSEM画像を示す。図30cは、心臓トロポニンT(cTnT)を発現する灌流可能心臓組織鎖の環状形態の横断面を示す代表的な位相差画像(左)及び共焦点画像(右)を示す。図30dは、FITC標識されたポリスチレンビーズ(直径1μm)で灌流した、チューブを鋳型とする組織鎖を示す。破線は、細胞培養チャネルの壁を示す。FITC標識されたビーズを、矢印で示した。星印は心臓組織鎖内の心筋細胞からの自己蛍光を示す。蛍光ビーズをより良好に可視化するために、この画像を過剰露出させた。

【0398】

両細胞型は、心筋組織鎖を形成し、自発的に鼓動することができた(図30aを参照されたい)。SEM画像に示されるように、細胞は自己再モデリング後にPTFEチューブの平滑な表面に付着した(図30bを参照されたい)。これらの灌流可能組織鎖の横断面は、自己再モデリングされた細胞が管状鋳型を取り囲み、cTnTを発現することを示していた(図30cを参照されたい)。

【0399】

灌流可能組織鎖を培養するための例示的デバイスの実現可能性を、FITC標識された蛍光ビーズを用いる灌流により証明した。蠕動ポンプにより駆動された灌流速度は、2±0.16μl/分であると定量された(n=3)。明視野ビデオは、ラット心臓組織鎖の自発的鼓動活動と、蛍光ビーズの灌流との両方を示した。ビーズの動きは、蛍光視野下でより良好に可視化された。ビデオのスナップショット(図30dを参照されたい)を過剰露出させて、蛍光ビーズのより良好な可視化を提供した。心臓組織鎖はまた、心筋細胞の自己蛍光に起因してこの画像中で見えた。

【0400】

灌流による培養されたヒト心臓組織鎖のNO処理
図31は、ヒトのチューブを鋳型とする組織鎖上での一酸化窒素(NO)処理の例示的結果を示す。図31aは、SNP(200mM)を0.5時間、6時間、及び24時間灌流した後のチューブ壁を通過するNO量の定量化を示す。図31bは、24時間のNO処理が基底レベルと比較して組織鎖の鼓動を有意に減速させたが、非処理組織鎖においては有意な変化はなかった(n=3/群、p<0.01)ことを示す。図31cは、画像分析による定量化を示し、24時間のNO処理後の組織鎖の鼓動速度が基底レベルと比較して低頻度であったことを示している。図31dは、対照(右)と比較したNO処理された組織鎖(左)内のα-アクチニン構造の破壊を示す。

【0401】

灌流可能心臓組織鎖における薬物試験の実現可能性を証明するために、薬理学的薬剤、NOドナーSNPを、チューブ管腔を介して灌流された培養培地に印加した。NOがチューブ管腔で生成されるにつれて、それはチューブ壁を通って拡散し、細胞培養物外部チャネルに到達し、そこでNOの総量を定量した。200mMのSNPから放出されたNOの量を、蛍光測定アッセイにより定量し、数時間にわたってSNP溶液からのNO放出の持続性を検証した(図31aを参照されたい)。細胞培養チャネル中の累積NO量は100μM(8μl中の800pmol)であり、in vivoでのNOの生理学的レベルを超えていた³¹。

【0402】

ゲル圧縮の際に、組織鎖内のhESC由来心筋細胞は自発的鼓動を開始した。チューブ管腔を介するNOドナーSNPの灌流により実施される24時間のNO処理の後、ヒト心臓組織鎖の自発的鼓動は減速し、これを画像分析により更に特徴付けた(図31b及び図31cを参照されたい)。異なる組織鎖間の鼓動周波数変化を比較するために、24時間のNO処理後の周波数を、基底レベル(処理前)に対して正規化した。NO処理後の鼓動周波数は、基底レベルよりも有意に低かったが(74±3%、n=3)、対照組織鎖は同じままであった(100±9%、n=3)。

【0403】

灌流を介するNO処理により引き起こされたhESC由来心筋細胞に基づく組織鎖内での心筋細胞の細胞骨格の分解を、α-アクチニンに関する免疫染色と共に共焦点顕微鏡を用いて特徴付けた(図31dを参照されたい)。対照組織鎖中でα-アクチニンで標識されたサルコメアZディスクの筋のあるパターンを明確に識別することができたが、NO処理された組織鎖は全体として点状のパターンを示した。また、Alexa 488標識されたα-アクチニン染色を、NKX2-5上で遺伝的に印を付けられた緑色蛍光タンパク質(GFP)から識別することができることにも留意した。

【0404】

培養された心臓組織鎖の電気刺激及び灌流
図32は、灌流及び電気刺激と共に培養された組織鎖の機能特性を示す例示的結果を示す。図32aは、hESC由来心筋細胞に基づく電気刺激され、灌流された組織鎖が、非刺激対照と比較して低い興奮閾値を有していたことを示す(***、p<0.001)。図32bは、hESC由来心筋細胞に基づく電気刺激され、灌流された組織鎖が、非刺激対照と比較して高い最大捕捉率を有していたことを示す(*、p<0.05)。

【0405】

チューブを通る培地灌流と電気刺激とを同時に受けた灌流可能ヒト心臓組織鎖は、電界刺激の下でのET及びMCRにより評価された場合、非刺激対照と比較して改善された電気特性を示した。ETは、同期的収縮を誘導するのに必要とされる最小電界電圧であり、刺激された組織鎖のETの減少(図32aを参照されたい)は、より良好な電気的興奮性を示していた。MCRは、同期的収縮を維持しながら達成できる最大鼓動周波数であり、刺激された組織鎖のMCRの増大(図32bを参照されたい)は、細胞の整列及び相互接続性の改善を示していた。

【0406】

天然の心筋は、支持血管構造を有する空間的に明確に定義された心筋束からなり(図1aを参照されたい)、心筋束内の心筋細胞は高度に異方性である(図1bを参照されたい)。本開示は、実施例2Aのデバイスにおいて、天然の心筋束の構造及び機能をin vitroで再現する心臓組織鎖を生成するための微細製作されたバイオリアクターを提供する。これは、心筋束モデル内での灌流による心筋細胞に対する薬物の効果を検査する初めての研究であり、他の工学的に作製した心臓組織と比較して天然の心筋物質移動特性を良好に模倣する。この例示的デバイスは、心臓細胞が伸長し、整列するための局所的な合図を提供し、他の合図、例えば、電気刺激と統合された。

【0407】

ゲル圧縮は、in vivoでの埋込み³²及びin vitroモデル^16、33のための3D微小組織構築物を作出するための組織工学において広く適用されてきた。足場に基づく構築物と比較して、ゲル圧縮に由来する自己集合した構築物は、圧縮後のより高い細胞密度のため、収縮力の増大をもたらす³⁴。更に、微小組織構築物は従来のモデルよりもはるかに高いスループットを提供するため^{16、33、35、36}、薬物試験のためのマイクロアレイとしてゲル圧縮により作製された微小組織構築物における興味が増大している。この研究においては、I型コラーゲンは天然の心筋の主要なECM成分の1つであるため、それを主要ゲルマトリックスとして選択した。以前のin vitroコラーゲン系モデルは、その弱い機械的特性のため³³、数日間だけインタクトなままであった。本実施例の微細製作されたデバイスにおいては、吊り下げられた鋳型により提供された機械的支持体と共に、心臓組織鎖は数週間にわたってバイオリアクター中で安定なままであった。他のin vitroモデルと比較して大きいスケール(5cm長まで)で心臓組織を生成することができ、細胞培養チャネルの寸法を容易にカスタマイズし、心臓組織鎖の形態に関して更に制御することができた。細胞培養チャネルを、最初は、酸素及び栄養素の供給の制限を考慮して300μmの高さとなるように設計した³⁷。更に、鋳型の存在は、バイオリアクターデバイスからの組織鎖の容易な分解及びさらなる特徴付けのための培養の終わりでの心臓組織鎖の容易な取り扱いを可能にした。

【0408】

いくつかの例において、微細製作されたバイオリアクターデバイスはまた、5cm長である心臓組織鎖を生成することもできたが、これはヒト心臓の高さと同等である。大規模組織鎖を作出する能力と一緒に個々の心臓組織鎖を取り扱う実現可能性は、Onoeら³⁸により記載れたのと類似する方法を用いて、より厚い構造を生成するためにそれらを一緒に束にする、又は織ることにより複数の心臓組織鎖の整列を調査する見込みを上昇させた。心臓組織鎖又は心臓組織鎖束により生成された力を特徴付けるために、分解性縫合糸を用いて、鋳型がない心臓組織鎖を生成することができた。

【0409】

例示的な微細製作されたバイオリアクターデバイスを検証するために、新生児ラット心筋細胞を予備研究において用いた。天然のラット心筋における細胞密度と同等である(約10⁸個の細胞/ml)³⁹、より高い細胞密度(>5x10⁷個の細胞/ml)で播種した場合にのみ、心臓組織鎖は3〜4日目に自発的鼓動を開始した。鋳型は、細胞が伸長し、一緒に整列するための接触誘導を提供し、天然の心筋における心筋細胞の異方性特性を再現した。3D組織内で細胞膜を定義することは難しいため、細胞核に対して画像分析を行った。しかしながら、核の整列は細胞の整列を示すのに十分なものであり、天然の心筋の特質の1つでもある(図1cを参照されたい)。

【0410】

例示的デバイスを更に開発するために、6-0絹製縫合糸の代わりに、PTFEチューブを鋳型として用いた。商業的に入手可能なPTFEチューブは生体適合性(USPクラスVI)であり、極端に非吸収性であり、サイズにおいて後毛細管細静脈の規模で寸法が小さい(ID=50μm、OD=150μm)ため⁵⁴、それを選択したが、他の材料及び寸法も好適であり得る。内部管腔のサイズが小さいため、陽圧の代わりに陰圧を用いて灌流を駆動した。2つの微細製作されたモジュールを例示的な系に追加して、組織鎖の長期間の灌流及びインキュベーションを可能にした。自己再モデリング中の組織鎖の短縮により示されるように、PTFEチューブへの細胞の付着は、絹製縫合糸のものほど強力ではなく、これは主に、PTFEチューブ表面の平滑性のためである(図30bを参照されたい)。しかしながら、細胞-ゲル複合物は、依然として、環状の横断面を有するチューブの周囲に自己集合することができた。

【0411】

本研究においては、(1)NOは天然の心筋中の内皮細胞によって産生された後、心筋細胞に対して放射状の方向に輸送され⁴⁰、これは例示的デバイスが再現することを目標とするシナリオである;(2)NOは血管依存的及び血管非依存的効果の両方による心筋機能の調節において重要な役割を果たす⁴⁰;(3)NOが虚血-再灌流傷害等の心筋細胞疾患の発生及び防止に直接関与することを示す多くの証拠がある⁴¹;(4)NOは小さい気体分子であり、チューブ壁を容易に通過することができる、という理由のため、NOをモデル薬物として選択した。SNPは臨床試験において用いられる一般的なNOドナーであるため^42、43、SNPをNOドナーとして選択した。更に、SNP水性溶液は、in vitroで数時間にわたって一定の速度でNOを放出すると報告された⁴⁴。

【0412】

NO処理試験のために、ヒト心臓組織鎖をhESC由来心筋細胞から生成した。ヒト心臓組織鎖は、1日目の早さで自発的鼓動を開始し、鼓動は7日以内に同期した。NO処理の24時間後、ヒト心臓組織鎖の鼓動周波数はその基底レベルと比較して有意に減速した。この結果は、in vivo⁴⁵での、及びChiusaら⁴⁶により見出された、筋原線維細胞骨格の分解により引き起こされる、NOの血管拡張効果と一致する。しかしながら、NOは、多様な細胞内機構と共に、より低濃度では双極性の変力効果を示し、in vitroモデル⁴⁰の標準化がなされていないため、研究間で相違があった。従って、例示的な微細製作されたバイオリアクターデバイスは、組織レベルで心筋細胞に対するNOの効果を明らかにするためのプラットフォームとして役立ち得る。

【0413】

開示されるデバイスの多用途性を証明するために、電気刺激は心筋細胞の表現型を改善すると報告されているため^2、20、電気刺激を系と統合した。心臓組織鎖中の細胞は異方性であったため、ラット組織鎖上で平行及び垂直の両方の電界刺激を試験した。単離された新生児ラット心臓筋原線維(61kPa)⁴⁷により近い、平行電気刺激の下でのより固い組織は、免疫組織化学染色により特徴付けられるより組織化された細胞収縮装置に帰するものであった。灌流可能なヒト心臓組織鎖を、同時に電気刺激及び灌流したところ、これにより、電気刺激と生理的様式で送達される薬理学的薬剤との相互作用を研究する見込みが得られた。ヒト多能性心筋細胞に基づく組織鎖の電気刺激のみに関するより詳細な研究を行ったところ、次第に増大する周波数の電気刺激が、筋原線維構造及び電気特性に関してhPSC由来心筋細胞の成熟を顕著に改善することが示された¹⁹。

【0414】

灌流は酸素及び栄養素供給を有意に改善するため⁴⁸、培地灌流はin vitroで心臓構築物内の心筋細胞の生存能力及び機能を改善すると認識されている。多くの以前の研究において、心筋細胞を流れに直接曝露しながら、細胞を含む多孔性足場を差し込むことにより、バイオリアクターは培地灌流を提供した^48〜50。これは、血液供給が、輸送距離を最小化するだけでなく、剪断から心筋細胞を保護する密な血管ネットワークを通って流動する天然の心筋を正確に再現するものではない⁵¹。より最近では、電気刺激と培地灌流とを同時に提供するためのバイオリアクターが開発され、灌流と刺激が心臓構築物の収縮機能の改善に対する相乗効果を有することが示された^52、51。しかしながら、これらの系における心臓構築物は、等方性多孔性足場に基づくものであり、従って、異方性心臓組織に対する電気刺激の効果に関する情報を提供することはできなかった。

【0415】

以前の研究は、心臓構築物に関する高スループットのin vitro薬物試験を可能にする灌流バイオリアクターの設計を記載する^53、50。Kanekoらは、薬物試験のための単一細胞レベルの相互作用を評価するためのマイクロチャンバーレイチップを設計した⁵³。Agarwalらは、リアルタイムに異方性心臓微小組織により生成される拡張及び収縮応力を特徴付けることができるカンチレバーのマイクロアレイから構成されるバイオリアクターを設計し、バイオリアクターはこれらの心臓微小組織に対する電気刺激を提供することができた⁵⁰。これらの2つの研究は、単一細胞又は単層レベルで心臓機能を特徴付けたが、これは複雑な天然の系におけるように心疾患の正確な情報を提供するには不十分なものである。更に、これらの研究において調査された薬物は、血液区画の代わりに、細胞に直接印加され、流動の存在は心筋細胞に対する剪断応力を生成し、その両方とも心筋細胞が天然の心臓において経験するものと比較して非生理学的な環境の生成に寄与していた。

【0416】

開示されるデバイスは、(1)それらが異方的に整列する天然の心筋束構造をより良好に模倣する;(2)鋳型の存在が、後の特徴付けのためのより容易な取り扱いを可能にし、数週間にわたって安定な全構造を保持する;(3)デバイスを、高スループット薬物スクリーニングのために容易にカスタマイズし、適用することができる;(4)デバイスがそれ自体によって局所的刺激提供する;(5)デバイスが多用途であり、他の刺激原(例えば、機械的刺激)と同様に統合することができる;(6)灌流可能な例示的な系が心筋束模倣体を介する灌流により心筋細胞に印加された薬理学的薬剤を試験するための初めてのプラットフォームであり、心疾患の発生及び治療剤に関する価値ある知識を提供することができる、のうちの1つ又は複数を含む、1つ又は複数の利点を提供することができる。

【0417】

低分子だけがチューブ壁を通って感知できるほどに拡散することができ、タンパク質はできないため、商業的に入手可能なPTFEチューブの透過性は、試験することができる薬物候補を制限し得る。しかしながら、他の材料を用いてもよく、例えば、チューブ材料はより良好な透過性のため微小孔性であるべきである。さらなる試験を行って、他の関連する薬理学的薬剤を調査し、内皮細胞と心筋細胞との相互作用を研究するためにチューブ管腔に内皮細胞を播種することができる。

【0418】

結論として、例示的デバイス中での培養は、以下の1つ又は複数:1)hESC心筋細胞の構築の改善及び生理的肥大の誘導、2)サルコメア成熟の誘導並びに3)刺激周波数依存的様式での電気生理学的特性の改善を提供することができ、これは成体様ヒト心筋細胞を取得するための第1の工程である。

【0419】

(実施例3)
バイオロッド
図33は、薬物探索経路の典型的なシナリオを記載する。理解されるように、薬物の探索及び開発は、in vitroの実験細胞及び動物モデルにおける薬理学的効果の実証から始まり、薬物の安全性及び有効性試験、臨床及び前臨床試験で終わる、達成が困難な試験プロセスからなる。ごく少数の化合物のみが安全かつ有効な新薬としてFDAの認可を受けると見積もられている。およそ25%の化合物が、前臨床毒性試験において排除される。したがって、前臨床開発における有意な数の薬物候補は、試験系における許容できないレベルの毒性のため、この段階から前進することができない。失敗の多くが、現在の方法及び技術を用いて評価するのが困難である薬物により引き起こされる心臓毒性効果と関連していた。

【0420】

細胞、分子、及び生化学アッセイにおいてかなりの技術的進歩が遂げられてきたが、薬物の毒性効果を評価するための現在利用可能な技術に関するいくつかの大きな問題が依然として存在する。第1に、精製された、又は組換えの酵素及び細胞培養物を用いるin vitroでのアッセイは、その後、動物モデルにおいて用いられる薬理学的及び毒性学的パラメータの決定における第一歩を提供するが、天然のヒト組織又は系における薬物代謝の間に起こる多因子事象を説明するには単純化されすぎていることが多い。第2に、動物モデルにおいて得られるデータは、ヒト系に確実に外挿することができない。第3に、HIV感染又はアルツハイマー病等の慢性疾患を処置するために用いられる多くの薬物は、長期間にわたって、いくつかの場合においては、個体の生涯にわたって適用される投薬レジメンを必要とする。現在、慢性毒性の発生は長期的な患者使用中に最も実際的に観察される。

【0421】

特に、心臓毒性に関する、薬物候補の高い失敗率を考慮すると、毒性、特に、心臓毒性を決定する、測定する、評価する、及びさもなくば検出するための新規かつ改良された方法が、高く望まれる。

【0422】

A.例示的二重ワイヤ収縮力組織培養実施形態(すなわち、バイオロッド又はバイオワイヤII)の構造、調製、及び使用
第3の実施形態において、本発明は、収縮力を測定するのに好適である三次元組織を増殖させるためのバイオリアクターデバイスに関する。

【0423】

図34は、本明細書では「バイオロッド」又は「バイオワイヤII」と呼ぶことができる、本発明の二重ワイヤ収縮力組織培養実施形態の設計の略図を提供する。略図に示されるように、バイオロッド実施形態は、マイクロウェル又はマイクロチャンバー及び一般的には垂直の配置にあるマイクロチャンバーと交差する一対の溝が形成されたマクロウェル又はマクロチャンバーを含む。マイクロチャンバーは、細胞及び/又は組織を増殖させるのに適しており、所望の組織の細胞を播種することができる。溝は、ポリマーワイヤが溝の中に置かれた場合にマイクロチャンバーの開いた空間を横断するような、一対のポリマーワイヤを受け取るのに適している。マイクロチャンバーに対するポリマーワイヤ/溝の配向は、垂直の構成に限定されないが、得られる3D組織鎖が、チャネルを形成し、ポリマーワイヤのそれぞれの末端で付着して、細胞がポリマーワイヤ間に相互接続又は細胞架橋又は鎖を形成する限り、任意の好適な角度であってもよい。好ましくは、ポリマーワイヤは一般的には互いに平行に、一般的にはマイクロチャネルと垂直に配置される。しかしながら、任意の好適な構成が企図される。例えば、ポリマーワイヤと溝を、一般的には互いに平行に、一般的にはマイクロチャネルの全体的な配向に対して垂直に配置することができる。他の実施形態では、ポリマーワイヤと溝を、マイクロチャネルの全体的な配向に関して異なる角度で配置することができる。更に、ポリマーワイヤは一般的には直鎖状の構成で記載されるが、曲線及び/又はそうでなければ非直鎖部分を有するワイヤを構成することもできる。ポリマーワイヤは、好ましくは、偏向性、変形性、屈曲性等であってもよく、ポリマーワイヤ上の組織鎖により発揮される収縮力の測定を可能にするように更に構成することができる。また、バイオロッド実施形態を、ポリマーワイヤが収縮力の測定を同時に容易にする異なる特性を有するように構成することもできる。例えば、一方のワイヤが偏向性、変形性、屈曲性等であり、他方のワイヤが剛性であるバイオロッドを構成することもできる。この様式で、可撓性ワイヤの動きに基づいて収縮活動をモニタリングする、及び/又は測定することができる。組織鎖の収縮力を測定することができる限り、任意の好適な構成のワイヤが想定され、用いることができる。また、バイオロッド実施形態を、それぞれ、マクロウェル及びマイクロチャンバー及びポリマーワイヤを含む、個々のバイオロッド成長チャンバーのアレイとして図35に従って構成することもできる。

【0424】

図36に示されるように、マイクロウェルを、心臓細胞を刺激するための2つの電極と共に(マイクロチャネルの末端で)構成することができる。図36はまた、バイオロッド系を用いて薬物を試験するのに必要とされる典型的な時間枠を記載し、「段階1」(組織鎖形成)、「段階2」(電気刺激を用いる組織の成熟)、及び「段階3」(試験段階)を含む。より詳細には、薬物スクリーニング適用として、工学的に作製した心臓組織は、強力なデータを提供するために健康な成体心臓組織をできる限り模倣するべきである。高い忠実度の心臓組織を有するために、この実施形態に電気刺激を組み込むことができる。比較により、心臓分化の現在の技術は未熟な心筋細胞を提供することができるに過ぎない。電気刺激は、心臓組織の成熟度を有意に増強することがわかっている。従って、培養の第1週は組織形成に集中し、第2週は組織を成熟させるために電気刺激を導入し、第3週等は短期及び長期薬物試験のために用いることができる。しかしながら、この特定のプロトコールは、限定を意味するものではなく、他の電気刺激プロトコールもここで想定及び企図される。当業者であれば、電気刺激の持続時間及びペーシング周波数等の、任意の好適な方法でプロトコールパラメータを調整することができる。

【0425】

図37に記載されるように、本発明のバイオロッド実施形態は、ウェル又はチャネル及び一般的にはバイオリアクターチャネルの長手寸法に対して垂直に向いた、チャネルの反対側に、又はその近くに、幅にわたってチャネルを配置した2つの長手エレメント(例えば、ワイヤ又は縫合糸)を含む足場を有するバイオリアクターを含んでもよい。長手エレメントは、バイオリアクターチャネル中での細胞の播種のためのアンカー又は支持体として機能して、両方のエレメントを中に含む組織鎖を形成することができる。

【0426】

長手エレメントは、好ましくは、偏向性、変形性、屈曲性等であってもよく、長手エレメント上で組織鎖により発揮される収縮力の測定を可能にするように更に構成される。バイオリアクターのチャネルを横断する電界を生成するように構成される電極を含むように、バイオリアクターを更に構成することができる。電界の方向は任意の方向にあってよいが、好ましくは、チャネルの長さ(及び得られる組織鎖)に対して平行である方向にあるか、又はチャネルの長さ(及び得られる組織鎖)に対して垂直である方向にある。

【0427】

本明細書で用いられる用語「バイオロッド」は、それだけに限定されないが、組織鎖自体(すなわち、本明細書に記載のバイオリアクターデバイス上で増殖する細胞)又は組織鎖とバイオリアクターとを一緒に含む系を指してもよい。また、バイオロッドは、本明細書ではBIOROD(商標)のその商業名を指してもよく、組織鎖自体、又は組織鎖と、組織鎖が増殖したか、若しくは置かれたバイオリアクターデバイスとを含む系の両方を包含する。

【0428】

バイオロッド実施形態を、収縮力を測定するための複数の三次元組織鎖を同時に、例えば、図37Aに示されるような96ウェルプレート形式で増殖させることができるような複数のバイオリアクターチャネル及び長手足場を含む構成にスケールアップすることができる。

【0429】

また、バイオロッド実施形態は、バイオリアクター中で組織鎖を増殖させるための方法、三次元組織鎖自体、バイオリアクターと増殖した組織鎖の両方を含む系、並びにそれだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供、並びに(f)例えば、組織鎖への試験薬剤の投与に応答して、長手エレメント上の組織鎖により発揮された収縮力の測定を含む様々な適用において組織鎖(若しくは組織鎖を含む系)を使用及び/又は試験する方法に関する。この実施形態では、デバイスを、6ウェル、12ウェル、24ウェル、96ウェル、384ウェル、及び1536ウェルプレート等のマルチウェルプレートで構成することができる。

【0430】

図37及び図38は、収縮力の測定にとって好適であってよい組織の培養にとって好適な例示的バイオロッドデバイスの略図及び画像を示す。この例においては、デバイスを、複数の組織鎖の同時的培養のために、複数のウェルを有するプレート構成にスケールアップすることができる。しかしながら、他の例においては、デバイスを、単一の組織鎖(例えば、単一のウェルを有する)を培養するために構成することができる。

【0431】

例示的デバイスは、組織培養のための種細胞を受け取ることができる長手バイオリアクターチャネルを含んでもよい。バイオリアクターチャネルに対して垂直の配向の2つのワイヤを含む足場を、バイオリアクターチャネルの反対側の末端の近くでバイオリアクターチャネルの幅にわたって支持する(例えば、吊り下げる)ことができる。ワイヤは、バイオリアクターチャネルの長さに沿って組織構造を形成するための種細胞のためのアンカーとして役立つことができる。ワイヤは偏向性であってもよい。デバイスは、組織鎖により発揮される収縮力の測定を可能にする。

【0432】

いくつかの例においては、デバイスは、それぞれのウェルがバイオリアクターチャネルと上記の足場とを含む、複数のバイオリアクターウェルを有するマルチウェルデバイスであってもよい。

【0433】

図37aに示されるように、デバイスは、マルチウェルプレートとして構成された場合、4つの構成要素:ベース層、支持体(例えば、ワイヤ)、ウェル-プレート(例えば、96ウェルを定義する)及びプレートキャップを含んでもよい。少ないウェルが存在する例においては、デバイスを、少ない層を用いて微細製作することができる(例えば、ただ1つのウェルしか存在しない場合は、ウェル-プレートは必要ないことがある)。ウェル及び/又はワイヤの寸法の比例的変化を、必要に応じて、デバイスのスケールアップ(例えば、384ウェルプレート形式に)又はスケールダウンにおいて用いることができる。例えば、ウェル及び/又はワイヤの寸法の比例的変化を用いて、6ウェル、12ウェル及び24ウェルプレート等の他のマルチウェルプレート構成を作出することができる。実施例1及び実施例2のデバイスの製作のために用いられる技術、並びに特に、熱エンボス加工及び注入-成型技術を含む、任意の好適な技術を用いて、例示的デバイスを製作することができる。

【0434】

図37B1は、熱エンボス加工技術を用いてポリ(メチルメタクリレート)PMMAを生成するための例示的製作プロセスを図示する。図37B2は、個々のウェルの寸法の詳細図と共に熱エンボス加工後のSU-8マスター及びPMMAベースを示す。図37Cは、ワイヤ製作プロセス(右)及び製作後のワイヤ(左)の例示である。図37D1は、ワイヤが取り付けられた96ウェルプレートに基づくPMMAベースの略図である。図37D2は、プレートの単一のウェルの詳細図である。図37D3は、ウェルの1つの行にワイヤが取り付けられた製作されたPMMAベースの画像であり、ワイヤを有する単一のウェルの上から見た詳細図である。

【0435】

例において、ベース層パターンをAutoCAD中で予め設計し、標準的なソフトリソグラフィ技術によりSU-8マスターに移転させた。次いで、SU-8マスターを熱エンボス加工マスターに転移させ、好適な熱エンボス加工技術を用いてPMMA内にマイクロウェルのアレイを生成するために用いた(図37B1を参照されたい)。或いは、組織培養ポリスチレンを用いるか、又はそれはポリカーボネート等の任意数の生物学的に不活性な成型性ポリマーであってもよい。1つのバイオリアクターマイクロウェルを、96ウェルプレートの単一のウェルの中心に配置した。マイクロウェルの寸法は、長さ5mm×幅1mm×深さ300μmであった。異なる組織型のために他の寸法を用いることができる。マイクロウェルの全てのカラムにわたる2つの遍在する溝を、マイクロウェルの両短側から1mmに配置した(図37B2を参照されたい)。溝は幅100μm×深さ100μmであった。他の溝の寸法は異なる組織にとって好適であってもよい。溝を用いて、細胞集合のための足場(例えば、ワイヤ)を収納した。しかしながら、ワイヤをマイクロウェルの頂部に結合させることができるため、溝は任意選択であり、機能にとって必要とされない。

【0436】

示される例においては、ポリマーワイヤを、バイオリアクターマイクロウェル中で組織を培養するための支持体として用いた。制御された寸法(横断面において100μm×100μm)を有するワイヤは、ポリ[オクタメチレンマレイン酸(無水物)クエン酸](POMaC)から作られていた(図37Cを参照されたい)。ポリ[オクタメチレンマレイン酸(無水物)クエン酸](POMaC)プレポリマーを調製するために、1,8-オクタンジオール、クエン酸、及びマレイン酸無水物を、5:1:4のモル比で混合し、窒素パージ下、160℃で融解した。次いで、温度を140℃まで低下させ、混合物を3時間撹拌した。次いで、得られたプレポリマー溶液を、1,6ジオキサンに溶解し、蒸留水中で滴下沈降により精製した。沈降したポリマーを2日間凍結乾燥した後、5%w/w UVイニシエータ(Irgacure 2959)と混合した。ワイヤを製作するために、マイクロチャネルを有するPDMSキャップを、標準的なソフトリソグラフィを用いてSU-8マスターを用いて生成した。次いで、PDMSキャップをスライドガラス上に軽く押しつけた。次いで、POMaCのプレポリマー溶液を、シリンジポンプにより、又は単に毛細管効果により、これらのマイクロチャネル中で灌流した。プレポリマーが全チャネルに行き渡った後、それをUVランプ下で45分間架橋させた。所望の機械的特性、すなわち、調整可能性を達成するために、他の好適な硬化時間も可能である。PDMSキャップを剥がしたところ、ワイヤはスライドガラス上に残った。POMaCはPDMSよりもガラスに対する親和性が高いため、ワイヤはPDMSマイクロチャネルから遊離した。次いで、これらのワイヤを、PMMAベース層上の溝の中に入れた(図37D1〜図37D3を参照されたい)。

【0437】

集合後、全てのマイクロウェルは、2つの支持体、本実施例においては、ウェルの端部に位置する、自己蛍光性ワイヤ及び可撓性ワイヤの足場を含んでいた。商業的に入手可能な96ウェル底なしプレート及びキャップを用いて、プレートの集合を完了させた。具体的には、96ウェル底なしプレートをPMMAベース層の上に置いて、ワイヤを定位置に固定し、交差夾雑しない独立ウェルを作出した。

【0438】

図38a〜図38cは、上記のように製作された例示的デバイスの実際の画像を示す。1つのバイオリアクターウェルは、96ウェルプレートのそれぞれのウェルに位置する。バイオリアクターウェルの側面に置かれたワイヤは、収縮力測定を可能にする。図38aは、上部及び底部から見た図を示す。図38bは、単一のウェルの詳細図を示す。図38cは、96ウェルプレートの複数のウェルの図を示す。

【0439】

ある特定の材料、技術及び寸法が上に記載されるが、例示的デバイスのために他の好適な材料(例えば、特に、ポリスチレン及び/又はポリウレタン)、技術及び寸法を用いることもできる。用いられるものとしてポリマーワイヤが記載されるが、他の長い材料等の他の支持体も好適であってよい。例えば、ワイヤを、ポリ(グリセロールセバケート)、POMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン並びにそのコポリマー、絹、微細構造、ナノファブリケーション材料、及び/又は特に、ナノロッド若しくは量子ドット等のナノ構造でドーピングされた材料から作製することができる。

【0440】

B.例示的バイオロッド/バイオワイヤII実施形態の実験的試験
例示的方法及び分析
心筋細胞を、ヒト胚性幹細胞株(hESC、Hes2)から誘導した。胚様体(EB)を心血管系列に分化させ、デバイス1の方法に以前に記載されたように解離させた。細胞を播種する前に、マイクロウェルの表面を5%(w/v)プルロニック酸(Sigma社、P2443)で洗浄した後、生物安全キャビネット中で空気乾燥させた。hESC由来心筋細胞を、0.45g/mlグルコース、1%(v/v)HEPES、10%(v/v)Matrigel(BD Biosciences社)、及び0.2g/ml NaHCO₃を添加したI型コラーゲン系ゲル[1N NaOHにより中和された3.0mg/mlのラット尾部I型コラーゲン(BD Biosciences社)及び製造業者により記載された10×M199培地]中、2億個/ml(別途特定しない限り)で懸濁した。次いで、懸濁された心筋細胞を細胞培養チャネル中に播種した(ウェルあたり2.5μl)。ゲル化を誘導するために37℃で30分間インキュベートした後、適切な培地を添加した。播種後、細胞を7日間、培養物中で保持して、コラーゲンマトリックスの再モデリング及びワイヤの周囲への集合を可能にした。心臓組織鎖を、2〜3日毎に培地を交換しながら、最大で21日間にわたって培養物中で保持した。好ましくは、組織鎖を少なくとも2週間、培養物中で保持して、成熟を可能にするべきである;しかしながら、最大培養期間に関する制限はない。心臓組織鎖を播種して、長期培養における組織の安定性及び再現性を観察した。播種後、組織鎖の明視野画像(例えば、図39Aを参照されたい)を、光学顕微鏡(Olympus社、CKX41)を用いて毎日撮影し(n=3/群)、4つの異なる位置での組織鎖の直径を、imageJを用いて分析した(例えば、図39Bを参照されたい)。また、組織鎖の長さを、同じ方法を用いて分析した。

【0441】

図39は、マルチウェルプレート構成を有する開示されるデバイス中での組織圧縮及び力測定を示す例示的結果を示す。ヒト胚性幹細胞(hESC)由来心筋細胞を、細胞供給源として用いた。図39Aは、播種(0日目)から出発して、ゲル圧縮(1日目〜6日目)を介して、安定期(6日目〜21日目)に至る心臓組織形成と安定化を示す。図39Bは、3週間の連続培養の間の圧縮及び組織再モデリングの間の組織の幅及び長さの定量化を示す(平均±SD、n=3)。幅と長さは両方とも、第1週のうちに有意に変化し、次の2週間の培養については安定なままであった。

【0442】

実施例3のデバイスを用いて培養された組織鎖における電気刺激の検証のために、便宜上、同じ寸法を有するPDMSマイクロウェルを用いた。実施例1のデバイスの調査と同様の設定を用いて、電気刺激を組織に印加した。2つの1/4インチ直径のカーボンロッド(Ladd Research Industries社)を、内端から2cm離して置いた。組織をカーボンロッドに対して垂直に置き、カーボンロッドの中心と同じ高さにした。2つのカーボンロッドを、白金ワイヤ(Ladd Research Industries社)を有する外部電気刺激装置(Grass S88X)に接続した。細胞圧縮の7日後、刺激チャンバー中で組織を電気刺激に導入した。実施例1のデバイスの調査において記載されたように、ペーシング周波数は1Hzで開始し、週を通して6Hzまで徐々に、毎日増大した(1、1.83、2.66、3.49、4.82、5.15及び6Hz、毎日の周波数)。1Hzの電気ペーシングを用いて更に1週間培養を続けて、組織成熟及び長期又は短期薬物試験実験にとって十分な時間静置した。

【0443】

PMMAプレートのために、金電極を、マイクロウェルの両方の短端に印刷し(図37D2を参照されたい)、プレートの端部まで延長して、電界刺激のために外部電気刺激装置(Grass S88x)と接続する。この例において、寸法は0.2mm×1mm×0.1mmの高さである。

【0444】

組織収縮挙動の追跡及び測定を実行した。POMacは、広範囲の波長で自己蛍光性である;従って、ワイヤを、DAPIチャネル(例えば、461nmの波長)下で蛍光顕微鏡を用いて画像化して、ワイヤの屈曲運動を追跡した。POMacはFITC及びTritcチャネル等の広範囲の波長で自己蛍光性である。画像を、25フレーム/秒(fps)で撮影した(図39Cを参照されたい)。画像シーケンスを、トラッキングプラグインを用いるImageJソフトウェアにより分析した。心臓組織から生じた力を計算するために、中央のセクションにおける均一に分布した負荷に関するビーム偏向式をここで用いた。図39Cは、時間経過における工学的に作製された心臓組織の収縮挙動に起因する単ワイヤの屈曲挙動を示す。工学的に作製された心臓組織を2Hzの周波数でペーシングした。この画像シーケンスから、鼓動の収縮及び弛緩時間を見積もることができる。図39Dは、2つの固定された末端に関するビーム偏向シナリオの例示を示す。組織を伸長させるワイヤは、均一に分布した負荷、Wo(力を担持する長さあたりの負荷)と考えてもよく、これを画像シーケンスにおけるワイヤの中心点の移動を用いて計算することができ、Fも同様に計算することができる。図39Eは、静的張力F1(細胞圧縮及び再モデリングに起因する)及び動的張力F2(組織の収縮に起因する)及び両方の力を切り離すための手順を示す。簡単に述べると、全ビーム長は、Lであった。組織を包むワイヤのセクションは負荷を経験していた。ここで、負荷はこのセクションを通して均等に分布すると仮定され、Woは長さあたりの負荷であった。プルロニック酸コーティングのため、組織形成は非常に対称的であり、ワイヤに対して垂直であった。組織の側面とウェル壁との間の距離はaであり、両側について等しいと仮定した。中心点での偏向はyであった。

【0445】

図39D中の式によれば、画像分析を用いて、中心点での偏向を容易に得ることができる。Wo及び横断面の面積あたりの力を計算した(組織の中点での応力)。ワイヤの偏向は2つの異なる張力に依存していた。1つの張力は、ゲル圧縮及び細胞集合プロセスにより生成されたものであった。この張力は、組織が弛緩状態にある場合、y1から計算される短時間枠(例えば、時間)で静的であるF1である(図39Eを参照されたい)。全偏向y2は、2つの張力、F1及びF2により引き起こされたものであった。張力F2は動的であり、組織の収縮挙動を受けたものであった。張力F2は測定の標的であった。正確な収縮力F2を測定するために、圧縮張力F1は切り離す必要があった。

【0446】

力測定の検証を実行した。全ての直接的力測定を、Biograf力変換器(Kent Scientific社)により行った。組織及びワイヤのサイズが小さいため、ワイヤを含むウェルのスケールアップを、幾何学的相似性規則を用いて設定した。

【0447】

図40は、力測定の検証を例示する。式を検証するために、力変換器の感度のため、スケールアップされた設定が必要であった。図40Aは、計算された力と測定された力とを比較するためのスケールアップされた設定の略図を示す。力は、偏向y、ワイヤの長さL、並びにワイヤに固定された末端及び力プローブの端部からの距離aを、図40Dに提示される式に代入することにより計算される。測定された力を、Biograf装置(Kent Scientifics社)を用いて取得した。2つの異なるワイヤ横断面を用いて、式を検証した。図40Bから、同じ試料からの測定データ及び計算データは、最大0.5mmのワイヤ偏向と一致する。この場合、力の計算値は、偏向がワイヤの長さの20%を超えた場合、正確であると考えなかった(n=3)。

【0448】

ウェルの幅Lは2.5mmであり、力変換器プローブ直径は0.6mmであり、従って、プローブを中心点に置いた場合、a=0.95mmであった。POMaCの弾性係数を、その経度に沿って伸長する応力-ひずみ曲線により計算した。試験中に、力プローブは中心点でPOMacワイヤに対して移動していた(図40Aを参照されたい)。力の読取り及び移動を同時に記録した。2つの異なるワイヤサイズの横断面は、0.3mm×0.3mm及び0.4mm×0.4mmであった。移動、弾性係数及び横断面の面積を用いる式から計算された力を、変換器からの力読取りと比較した。

【0449】

21日目に、刺激された、及び対照ヒト心臓組織鎖の電気特性を、実施例1のデバイスの調査のための上記の外部電界ペーシングの下での興奮閾値(ET)及び最大捕捉率(MCR)に関して特徴付けた。

【0450】

免疫染色及び共焦点顕微鏡観察を、実施例3のデバイス中で培養された心臓組織の特徴付けのために実行した。例示的結果を、図41に示す。図41Aは、終点測定としての21日目での興奮閾値及び最大捕捉率を用いた電気特性の評価を示す(平均±SD、n=3)。図41Bは、播種後21日目(終点評価)での細胞タンパク質発現に関する蛍光画像を示す:ギャップ結合タンパク質、コネキシン43(Cx43);サルコメアタンパク質である心臓トロポニンT(cTnT)及びF-アクチン(Infrared Red);アルファ-アクチニン。f-アクチン及びアルファ-アクチニンに関する染色は、同時局在化された独特の線条構造を示した。図42Aは、自発的鼓動の収縮力を定量するために2、3、6、10、13、17、21日目で撮影したビデオからの結果を示す。収縮力は第1週に急速に増大し、第2週及び第3週にプラトーに達した。図42Bは、0.5Hz〜3Hzのペーシング周波数で21日目(終点評価)の偏向から計算された横断面あたりの力を示す。0.5Hzで生成された力に対して正規化した後、図42Bは正の力-周波数関係を示した(平均±SD、n=3)。

【0451】

3週の終わりに、組織鎖をcTnT、コネキシン43、F-アクチン及びアルファ-アクチニンについて染色した。組織鎖を4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.25%Triton X-100により透過処理し、5%ウシ胎仔血清(FBS)により遮断した。免疫染色を、以下の抗体:マウス抗心臓トロポニンT(cTnT)(Abcam社;1:200)、ウサギ抗コネキシン43(Cx-43)(Abcam社;1:200)、マウス抗α-アクチニン(Abcam社;1:200)、ヤギ抗マウスAlexa Fluor 488(Jackson Immuno Research社;1:400)、抗ウサギTRITC(Invitrogen社;1:200)、抗マウスTRITC(Jackson Immuno Research社;1:200)を用いて実施した。ファロイジン-Alexa 660(Invitrogen社;1:200)を用いて、F-アクチン線維を染色した。共焦点顕微鏡観察のために、染色された心臓組織鎖を、直立型共焦点顕微鏡(Zeiss社、LSM510)の下で可視化した(図41Bを参照されたい)。

【0452】

7つの異なる時点(播種後2、3、6、10、13、17、21日)で、自発的鼓動の収縮挙動を評価した。異なる時点での評価のために、蛍光顕微鏡に関して正確に同じ設定を使用し、良好な比較を確保するために組織を同じ位置に配置した。

【0453】

薬物試験を実行した。薬理学的薬剤に対する応答を試験するためのこれらの組織鎖の可能性を証明するために、試験は、組織がノルエピネフリン、E-4301及びイソプロテレノール等の周知の心臓化合物に対して適切に応答するかどうかを検査した。

【0454】

例示的結果及び考察
医薬品開発において払われた多大の努力及び費用にも関わらず、心臓に関連する副作用のために撤回にいたる、市場に入る多くの薬物が依然として存在する。多くの研究グループが、現在は、臨床試験が開始される前に資格のない薬物候補を取り除くための薬物候補の心臓組織特異的in vitroスクリーニングに焦点を合わせている^55〜59。本出願のための良好なプラットフォームを設計するために、様々な基準を考慮することができる。まず第1に、ウェル中の薬物濃度に影響しないことが、デバイス中で用いられる材料にとって有用であり得る。従って、プラットフォーム全体を、不活性の非吸収性材料を用いて製作することができる。PDMSは、微細な特徴に容易に操作及び製作することができる非常に人気がある材料である。従って、多くのグループは、心臓薬物試験のためのマイクロデバイスを構築するためにPDMSを用いている^60、61。しかしながら、PDMSは薬物吸収性が高く、この材料への大きく容易な薬物吸収をもたらす大部分の薬物候補の疎水性のため、薬物送達媒体として用いることが認可されている^62〜65。この場合、PDMS及び他の薬物吸収性ポリマーは、デバイス中で試験している間薬物と接触して用いることはできない。

【0455】

第2に、適切な細胞成熟及び薬物効果の調査を可能にするために少なくとも3週間にわたって安定な培養物中で容易に再現され、維持されることが、工学的に作製された心臓組織(ECT)にとって有用であり得る。これらの3週間の培養の間の観察を、組織を破壊することなく完了させるべきである。偏向後の特徴付けは、組織収縮挙動を特徴付けるためのよく受け入れられている方法である^{55、58、60、61、66〜68}。このアプローチにおいて、心臓微小組織は、一対の円筒状ポストを含有するマイクロウェル中で生成される。組織はポストの周囲に集合し、ポストの偏向は収縮力の測定を可能にする。しかしながら、このプロセスは制御が困難であることが多い。ポストの有意な変形のため、組織はポストから滑落することが多い。これは培養プロセス中の標本の喪失を引き起こし得る。試料の喪失を防ぐためにポストの上部にキャップを追加しようとする場合、製作プロセスは有意により困難になる。更に、ポスト偏向設計の力測定は、ポスト上の組織の位置に有意に依拠する。組織は一般的には長期培養の間に上方へ移動し、顕微鏡による測定を正確に行うのは容易ではない。事実、ポスト上の組織の正確な位置を決定するために、ウェルを切断し、組織を側面から画像化する必要がある。

【0456】

上記の例示的デバイスは、高スループット薬物試験デバイスとして役立ち、1つ又は複数の上記の有用な基準を満たすことができる。実施例3の例示的デバイスは、1つ又は複数の上記制限を克服することができる。細胞が自己集合する周囲の支持ワイヤは、全て同じレベルで配置してもよく、したがって、組織は常に同じ場所にあってもよい。支持ワイヤを、ウェル内に固く固定し、自由な末端がなくてもよく、したがって、組織はワイヤから滑落しなくてもよい。更に、ワイヤの偏向は、収縮力の正確な測定並びに能動的張力からの受動的張力の切り離しを可能にし得る。

【0457】

この例示的デバイスにおいて、PMMA及びPOMaCを、培養物中の培地及び組織と接触する材料として用いた。POMaCは、PDMSと比較して疎水性が低く⁶⁹、従って、薬物吸収の機会を減少させることができる。更に、デバイスのウェルは不活性のPMMAから構築されるため、最小容量のPOMaCを用いることができる。例におけるPOMaCワイヤは、天然の、及び工学的に作製された心臓組織の機械的特性に近い25kPaの弾性係数を有し⁴⁷、生理学的に関連する微小環境を提供することができる。様々なUV硬化エネルギーを用いてPOMaCワイヤの調整可能な機械的特性を用いて異なる予備負荷をシミュレートすることができる。従って、得られるデータは、生理学的事例と病理学的事例の両方についてより臨床的に関連していてもよい。更に、力測定は、PDMS等のより固い材料と比較してPOMaCのようなより柔らかい材料に関してより感受性が高くてもよい。これは、小型化された組織サイズを用いる高スループット設計にとって有益であり得る。本明細書の実施例に開示されるように、熱エンボス加工技術を用いて、製作プロセスを商業的製造にスケールアップすることができる(図38を参照されたい)。

【0458】

実施例3の例示的デバイスは、培養された組織の高さの評価に関する必要性を低下させる、又は除去することができる。播種容量及び細胞密度が定義され、ワイヤは全て同じ一定の位置に置かれるため、工学的に作製された心臓組織は全培養期間で常に同じ位置にあってもよい。力の計算のためのパラメータを、偏向追跡画像シーケンスにおいて容易に回収することができる。ポスト中に見出されるもの等の自由末端がなければ、ECTが滑落し、試料喪失を引き起こすことは決してない。図39Cは、組織収縮の間にワイヤがどのような屈曲したかを示す蛍光画像の時間経過の試料である。心臓組織は播種後2日目に鼓動を開始し、全培養期間を通して鼓動し続けた。これは、ヒドロゲルマトリックス内での細胞の高レベルの電気機械的カップリングを示していた。更に、電気刺激を用いる培養の21日後に、図39Bは、組織の寸法が第1週の間に迅速に変化し、第2週の開始時にプラトーに達し、全培養期間にその寸法を維持することを示した。その結果、ヒト心臓組織が第1週にゲル圧縮及び自己集合を終了させることが確認された。標準偏差が小さいことから、組織の再現性が高いことが示唆される。

【0459】

検証実験は、2つの態様、力測定検証と組織特徴付けとを有する。図40における力測定に関する検証試験により、偏向がワイヤの長さの20%以内である場合、図39D中の式を用いる計算が正確であることが確認された。より大きい偏向は他の式の使用を必要とし得る。ECTの電気特性は、電気刺激後に改善され、特に、興奮閾値(ET)は刺激された試料において有意に低下した。最大捕捉率(MCR)は有意に変化しなかったが、その傾向は改善を示すと考えられた(図41Aを参照されたい)。コネキシン43の免疫染色は、ギャップ結合タンパク質が細胞表面に発現されることを示していた。cTnT染色により、細胞中のサルコメアタンパク質の存在が確認された。心筋細胞のサルコメア-α-アクチニン及びf-アクチン構造も一緒に提示及び局在化され、ECTにおいて細胞伸長を示した(図41Bを参照されたい)。

【0460】

図42Aは、培養の3週間以内に収縮力の変化を示す。7つの異なる時点(播種の2、3、6、10、13、17、21日後)で、自発的鼓動の収縮挙動を評価した。ヒドロゲル中の細胞の電気的カップリングの上昇のため、収縮力は第1週に有意に増大した。培養の第2週及び第3週は、収縮力に対する有意な改善を示さなかった。図42Bに提示される力-周波数の関係は、ECTが天然の心臓組織と似ており、2.5Hzまでの電気刺激でBowditch階段現象を示すことを示唆している。

【0461】

図43は、薬物試験からの例示的結果を示す。ノルエピネフリンは、心拍を直接増加させることにより、闘争逃走反応において作用するストレスホルモンである⁷²。図43Aは、対照と比較した、薬物の所与の濃度での代表的な組織鼓動パターンを示す。10μMでのノルエピネフリンの添加は、鼓動周波数の有意な増加をもたらした。E4301はヒトI_kr心臓イオンチャネルの遮断剤として作用し、その遮断は後脱分極及び危険な不整脈をもたらし得る⁵⁶。100nMでのE4301の添加は、鼓動後たまに弛緩の延長をもたらし、この薬剤の機能を明確に表す。イソプロテレノールは、心拍出量を増加させる非選択的ベータ-アドレナリンアゴニストである。高用量は組織を脱感作し、逆の効果を引き起こし得る⁷³。図43Bは、薬物添加の前の力に対して正規化された組織収縮力の用量応答傾向を示した。組織は、100nM及び1μMでは正の変力作用(収縮性の増加)を有し、10μMではわずかに負の変力効果(収縮性の減少)を有していた。

【0462】

図43は、薬物試験からの例示的結果を示す。ノルエピネフリンは、心拍数を直接増加させることにより、闘争逃走反応において作用するストレスホルモンである⁷²。図43Aは、対照と比較した、薬物の所与の濃度での代表的な組織鼓動パターンを示す。10μMでのノルエピネフリンの添加は、鼓動周波数の有意な増加をもたらした。E4301はヒトI_kr心臓イオンチャネルの遮断剤として作用し、その遮断は後脱分極及び危険な不整脈をもたらし得る⁵⁶。100nMでのE4301の添加は、鼓動後たまに弛緩の延長をもたらし、この薬剤の機能を明確に表す。イソプロテレノールは、心拍出量を増加させる非選択的ベータ-アドレナリンアゴニストである。高用量は組織を脱感作し、逆の効果を引き起こし得る⁷³。図43Bは、薬物添加の前の力に対して正規化された組織収縮力の用量応答傾向を示した。組織は、100nM及び1μMでは正の変力作用(収縮性の増加)を有し、10μMではわずかに負の変力効果(収縮性の減少)を有していた。

【0463】

まとめると、この例示的デバイスは、高スループットな様式で少なくとも部分的に成熟したヒト心臓組織を生成することができる。設計は、PDMSの使用を減少させる、又は除去することができ、それは一般的に用いられる96ウェルプレート形式と完全に適合していた。力並びに鼓動周波数、収縮及び弛緩時間等の収縮特性の他の重要な態様の小型化及び自動化測定を、上手く実行することができる。ヒト心臓組織はまた、周知の薬物:ノルエピネフリン、E-4301及びイソプロテレノールに適切に応答した。

【0464】

例示的デバイスは多用途であってよく、様々な改変にかけてもよい。例えば、2つの支持ワイヤが1つのウェルに取り付けられるため、1つのワイヤの材料を変化させて、他の目的を容易にすることができる。例えば、1つのワイヤを白金ワイヤ又は他の電導性ポリマーに変化させて、点電気刺激を行うことができる。磁気材料(ポリマー)から作られたワイヤを用いて、外部磁界は心臓負荷の模倣体として電気刺激と機械刺激を同時に容易にすることができる⁷⁴。この設定は、ECTの成熟を更に推し進めるのに役立ち得る。

【0465】

図44は、アルファ-アクチニン(細胞骨格の染色)及びDAPI(核を示すため)について染色されたバイオロッド実施形態の組織鎖の細胞の顕微鏡画像を提供する。それぞれ、電気刺激の結果として高度に成熟した心臓組織を示す、組織における高い程度の細胞整列を有する完全に伸長した細胞と共に、明確なサルコメア構造を見ることができる。

【0466】

図45は、バイオロッド実施形態の組織鎖が弾性に関してヒト心筋をシミュレートすることを示す実験結果を提供する。ヒト心筋の組織弾性は、約20kPa〜0.5MPaの範囲である。置きかえ心臓組織を埋め込む場合、埋め込まれる組織の固定点がin vitro及びin vivoの両方における適用にとって理想的である、天然の生理学的環境をシミュレートするために天然の組織と類似する機械的特性を有することを確保することが重要である。好ましい態様においては、バイオロッドデバイスのポリマーの機械的特性は、異なる架橋エネルギーを用いて重合を制御することにより調整可能である。また、調整可能性を、重合反応の間のポリマー単位の混合物の比によって制御することもできる。棒グラフは、バイオロッドデバイスのPOMacポリマーワイヤ/屈曲性エレメントを2つの異なるエネルギーレベルで架橋する場合、異なる弾性係数を示す。両エネルギー(4320mJ/cm²及び8610mJ/cm²)での弾性係数は、成体心筋の範囲にすぐに低下するが、硬化エネルギーの低下と共にその弾性係数は低下する。ポリマーワイヤの機械的特性を、硬化エネルギーの増加を用いて増加させて、特定の病態を作出することもできる。

【0467】

図46は、3カ月間にわたるバイオロッド実施形態のPOMacポリマーワイヤの安定性(弾性係数を単位とする)を示す棒グラフを提供する。データは、3カ月後でも、弾性係数は相対的に一定のままであることを示し、POMacワイヤが時間と共に実質的に安定であることを示している。

【0468】

図47は、バイオロッド実施形態のPOMacポリマーワイヤを、2つの異なる硬化エネルギーでも、弾性係数に影響することなくガンマ照射によって滅菌することができることを示すデータを提供する。

【0469】

図48は、バイオロッドプレートのバッチ画像を、市販の装置(例えば、Molecular Devices社)を用いて獲得することができる1つの様式を示す略図を提供する。ゲル圧縮及び組織圧縮により作出される受動的張力に関してバッチ式で写真を撮影するために、本発明者らの研究室ではMolecular Devices社からの市販のSpectramaxデバイスが用いられている。

【0470】

図49は、ラット新生児細胞供給源を用いて、組織鎖により単一の96ウェルプレート内で一貫した、再現性の高いデータが得られることを示すデータを提供する。異なる試験からの試料の力を比較した。また、図49の右下の棒グラフに示されるように、同じ鼓動周波数下での組織収縮、弛緩、及び休止時間を含むパラメータは、変動性が小さい。これらの証拠は、バイオロッドデバイスにおける組織鎖の高レベルの再現性を示す。図50は、96ウェルプレート中のバイオロッド組織鎖のin situでのアルファ-アクチニン免疫蛍光画像であり、細胞構造の伸長、一貫した配向、及び細胞内構造を示す。

【0471】

上記の実験試験により支持されるように、バイオロッド実施形態は、いくつかの利点及び特徴を有し、少なくとも以下のものを含む。
容易な取り扱い及び長期の観察を可能にする。
組織工学分野における高スループットプラットフォームを提供する。
薬物試験のための完全な薬物不活性環境を提供する。
PDMSを含まない。
高い忠実度の心臓組織。
成熟を押し進める電気刺激を含む。
異なる硬化エネルギーを用いたポリマーの重合、及びポリマー単位組成/比によるポリマーワイヤ(すなわち、屈曲性エレメント)の制御された(すなわち、調整可能な)機械的特性。
in situでの長期的及び終点評価。
カルシウム移行測定。
IHC染色。
様々な適用を可能にする他の材料への1つの側面をおそらく変化させる。
Ptワイヤを用いる点電気刺激。
磁場を用いる機械的伸長。

【0472】

(実施例4)
バイオブランチ/アンギオチップ
A.例示的血管形成組織培養実施形態(すなわち、バイオブランチ/アンギオチップ)の構造、調製、及び使用
第4の実施形態において、本発明は、1つ又は複数の管腔通路を有する三次元分枝状組織を含む(例えば、血管形成された三次元組織構造を模倣する)三次元組織を増殖させるためのバイオリアクターデバイスに関する。本発明のこの実施形態は、播種された細胞を増殖させるための第1の部分と、第1の部分を通過する相互接続されたチャネルを提供するための第2の部分とを含有する、三次元形状の足場又は細胞外マトリックス単位を有するバイオリアクターを含んでもよい。バイオリアクターを、生物学的血管構造を模倣するように構成することができる。足場は、播種された細胞のための支持体として役立ち、チャネル、好ましくは灌流可能なチャネルのネットワークが形成される組織構造を形成することができる。また、チャネルのネットワークは、チャネルの透過性を促進する、並びに細胞(例えば、単球)の移動を容易にするためにチャネル壁上に微小孔(直径10〜20μm)を含んでもよい。バイオリアクターを、バイオリアクターを横断する電界を生成するために構成される電極を含むように更に構成することができる。電界の方向は任意の方向にあってもよいが、好ましくは、一般的には足場の長手方向軸と平行である方向にある。別の実施形態では、電界の方向は、一般的には足場の長手方向軸と垂直にあってもよい。本明細書で用いられる場合、本発明の第4の実施形態を、「バイオブランチ」と呼ぶことができ、それだけに限定されないが、三次元組織形成自体(すなわち、本明細書に記載のバイオリアクターデバイス上で増殖する細胞)又は組織形成とバイオリアクターとを一緒に含む系を指してもよい。また、バイオブランチを、組織形成自体、又は組織形成と、組織が増殖した、若しくは置かれたバイオリアクターデバイスとを含む系の両方を包含する、「BIOBRANCH(商標)」のその商業名として本明細書で呼ぶこともできる。この第4の実施形態はまた、分枝状バイオリアクター中で組織を増殖させるための方法、三次元組織自体、バイオリアクターと、増殖した組織との両方を含む系(すなわち、統合されたバイオリアクター)、並びにそれだけに限定されないが、(a)実験的薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の有効性及び安全性(毒性を含む)の試験、(b)薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の薬物動態及び/又は薬力学の定義付け、(c)薬理学的薬剤(それだけには限定されないが、小分子薬物、生物製剤、核酸に基づく薬剤を含む)の特性及び対象に対する治療効果の特徴付け、(d)新しい薬理学的薬剤のスクリーニング、(e)損傷組織及び/又は患部組織を処置するための再生医療における使用のための埋め込み型の工学的に作製した組織の提供[例えば、電気伝導の欠陥を有する患者を含む心疾患状態を研究するための本開示の組織構築物、デバイス、及び/又は系の使用(iPSC-CM)]、並びに(f)オーダーメイド医療を含む様々な適用において組織鎖(若しくは組織鎖を含む系)を使用及び/又は試験する方法に関する。

【0473】

図51及び図52は、分枝状血管構造を含んでもよい分枝状組織の培養にとって好適な例示的デバイスを示す。実施例4のデバイスは、実施例1のデバイスと類似していてもよいが、実施例4におけるデバイスは、単一のチャネルの代わりに、三次元分枝状チャネルを有してもよい。実施例4のデバイスの製作のための例示的方法は、以下に記載される。

【0474】

例示的デバイスは、組織培養のための種細胞を受け取ることができるバイオリアクターチャンバーを含んでもよい。足場を、バイオリアクターチャンバー中で受け取ることができる。バイオリアクターチャンバーは、ベース上で足場を支持するための突出部(例えば、ポスト)を含んでもよい。これにより、培養された組織は足場を被包することができる。足場は、支柱及び灌流チャネルの三次元ネットワークを含んでもよい。足場を、生物学的血管構造を模倣するように構成することができる。足場は、種細胞のための支持体として役立ち、三次元ネットワークの周囲に組織構造を形成し、三次元的に分枝した血管構造を有する組織構造の生成を可能にし得る。

【0475】

本開示は、分枝状組織構造を培養するのに好適な足場を製作するための方法を提供する。足場は、内部空洞(例えば、チューブ、2Dの分枝状微小チャネルネットワーク、若しくは3-Dの分枝状微小チャネルネットワーク)及び/又は吊り下げられた構造(例えば、メッシュ若しくは格子マトリックス)を含んでもよく、生分解性材料(又はPOMaC)から形成させることができる。

【0476】

例示的製作方法は、内部空洞を有する3-D構造及び/又は吊り下げられた構造を製作するための3-Dスタンピング法を用いる。本実施例における3-D構造を、2つ又は複数のパターン化されたポリマーシートを一緒に整列させ、積み重ね、結合することを含む、層ずつのプロセスにおいて製作することができる。したがって、2つ以上の層を有し、その層により定義される内部空洞及び/又は吊り下げられた構造を有する3-D足場を製作することができる。

【0477】

微細製作方法は、足場材料[例えば、図51(a)に示されるようなPOMaC等の、バイオポリマー材料又は生分解性材料]に対する第1の接着強度を有する材料から形成される鋳型を用いてもよい。鋳型を、足場材料に対する第2の接着強度を有する基質上に提供することができる。第2の接着強度は第1の接着強度よりも大きく、鋳型中で層を成型した後に、基質に接着したままにしながら、層を鋳型から遊離させることができる。本開示は、PDMS及び基質としてのスライドガラスを用いた鋳型の形成は、足場材料としてのPOMaCに関する好適な示差的接着強度を達成することを見出した。

【0478】

足場材料のプレポリマーを鋳型中に導入し、硬化させ、基質によって支持される足場の第1層を形成することができる。足場材料は鋳型に対するよりも基質に対するより高い接着強度を有するため、基質への接着を維持しながら、層を鋳型から遊離させることができる。これにより、足場を層ずつに構築しながら、足場をより容易に操作することができる。

【0479】

さらなる層を、足場のために形成させることができる。さらなる層を、同じ鋳型又は異なる鋳型を用いて形成させることができる。例えば、さらなる層を、同じ鋳型材料から形成され、同じ鋳型材料から形成される鋳型ベースにより支持される異なる第2の鋳型を用いて形成させることができる。さらなる層を第2の鋳型中で硬化させた後、それを、第2の鋳型に接着したままにしながら、鋳型ベースから遊離させることができる。これにより、それぞれのさらなる層をより容易に操作し、したがって、足場が層ずつに構築されるため、より正確なアラインメント、積み重ね及び結合が可能になる。さらなる層は第1層又は予め結合した層に適切に結合した後、さらなる層は、第2の鋳型から遊離し、したがって、次のさらなる層をすぐに受け取ることができる。

【0480】

したがって、足場の全ての層が結合し、足場が完成した時、足場を基質から遊離させることができる。

【0481】

製作方法[図51(b)に示される]の例において、PDMS鋳型は、標準的なソフトリソグラフィを用いて足場構造のそれぞれ個々の層について製作される。1つの鋳型を、ベース層(底部の第1層)のために作出し、複数の鋳型を他の全てのその後の上部層のために作出することができる。ベース層のためのPDMS鋳型に、スライドガラス等の基質上で非永続的にキャップを付けることができる。次いで、その後の全ての上部層のためのPDMS鋳型に、別の平坦なPDMSシート上で非永続的にキャップを付けることができる。

【0482】

次いで、ポリマー混合物を鋳型中に注入することができる。ポリマー混合物を含む鋳型をUV光に曝露し、部分的に架橋させ、固体化することができる。次いで、スライドガラスキャップを有するベース層のためのPDMS鋳型のキャップを、スライドガラスから外してもよい。注入されたポリマーは、一度架橋したら、PDMS鋳型に対するよりもスライドガラスに対してより強い結合を示し、従って、スライドガラスに結合したままにしながら、PDMS鋳型から遊離させることができる。

【0483】

次いで、PDMSシートキャップを有するその後の全ての上部層のためのPDMS鋳型のキャップを、PDMSシートから外すことができる。PDMS鋳型は、PDMSよりもポリマーと接触する表面積が大きい。従って、ポリマーはPDMSシートよりもPDMS鋳型上に強く結合し、従って、PDMS鋳型から遊離しない。

【0484】

次いで、上部層のためのPDMS鋳型内のそれぞれの重合したポリマーを、PDMS鋳型を用いて比較的容易に操作し、さらなるUV架橋を用いてスライドガラス上のベース層ポリマーに整列させ、積み重ね、結合させることができる。UV架橋後、全ての積み重ねられたポリマー層を、互いに永続的に結合させることができる。

【0485】

スライドガラスはPDMS鋳型よりもポリマー足場に対して強く接着し、ここで上部ポリマー層を保持することができる。従って、ポリマー足場はPDMS鋳型から剥離し、PDMS鋳型が除去された場合でもスライドガラス上に結合したままであってもよい。

【0486】

上部足場層のためのパターン化されたポリマーを有するより多くの鋳型を、同じ方法で現在の足場上に転移させ、積み重ね、結合させて、より厚い足場を作出することができる。

【0487】

ポリマー足場はスライドガラスに永続的に結合することはできないため、足場を水又はバッファー溶液に浸すだけで足場全体をスライドガラスから遊離させることができる。

【0488】

本実施例の製作方法は、従来の3-D製作技術の1つ又は複数の欠点を克服することができる。例えば、従来の3-Dポリマー足場製作に関する制限は、薄くパターン化されたポリマーシートを転移させ、それらを一緒に積み重ねるための容易かつ実用的な方法の欠如を含む。ポリマーシートがその鋳型から完全に遊離した場合、薄いシートを容易かつ正確に取り扱うことができず、したがって正確なアラインメントは典型的には困難であるか、又は不可能である。正確なアラインメントがなければ、正確な内部空洞(正確かつ薄いチャネル壁を有するマイクロチャネル等)及び吊り下げられた構造を作出することは困難であるか、又は不可能である。

【0489】

POMaCは、ガラス(より強い接着)及びPDMS(より弱い接着)に対する示差的な非永続的接着強度を示す。開示される製作方法は、PDMS鋳型を用いて薄いPOMaCポリマーシートを捕捉し、遊離させる、並びにより高い制御及び精度で他のパターン化されたシートを整列させ、結合させるためにこの特性を用いる。

【0490】

開示される製作方法はPOMaC材料を用いて記載されたが、他の材料を用いることもできる。開示される製作方法を、成型することができ、材料に対する示差的な非永続的接着強度を示すそのような一対の基質(ガラスとPDMS等)が存在する場合、任意の材料について機能すると予想することができる。

【0491】

本開示は、従来は達成されなかった、スライドガラスとPDMSだけを用いて容易かつ正確に転移させることができる生分解性材料を用いる製作方法を提供する。例えば、PGS等の類似する生分解性材料はPDMSに完全に粘着し、従って同じ方法で用いることはできない。本開示は、この製作方法にとって好適である材料を見出し、その技術を証明した。

【0492】

3-D印刷と比較して、開示される製作方法は、材料を犠牲にすることなく、生体材料足場中での吊り下げられた構造並びに内部空洞の作出を可能にし得る。3-D印刷を用いる場合、印刷される生体材料と適合する犠牲となる材料を発見することは、典型的には困難である。犠牲となる材料を使用しない場合、吊り下げられた構造を作出するためには、材料を空中で印刷しなければならず、生体材料を用いる場合にはこれは極めて困難である。開示される方法は、それぞれ個々のポリマーシートの事前パターン化を可能にした後、シートを単純に一緒に積み重ね、それぞれの層を遊離させて、吊り下げられた構造を比較的容易に作出することができる。しかしながら、現在の3D印刷の限界にも関わらず、分枝状ネットワーク、マクロ孔、及びマイクロ孔を含む記載される微細構造を形成させることができる限り、本発明は3D印刷法の使用を排除するものではない。

【0493】

開示される方法を用いて、特に、ワイヤ、チューブ、2-Dの分枝状ネットワーク、3-Dの分枝状ネットワーク、及びメッシュ構造等の、様々な1-D、2-D及び3-D構造を作製することができる。開示される方法は、チューブ、2-D、3-Dの分枝状ネットワーク及びメッシュ構造等の、内部空洞を有する構造を作出するのに特に有用であってもよい。

【0494】

本明細書に開示される2-D及び3-Dのマイクロチャネルネットワーク足場及びその製作は、足場の設計、足場中への内蔵型マイクロチャネルネットワークの含有、並びに好適な生体材料を用いて、そのような足場を正確に製作する能力等の、様々な方法において従来の技術よりも有利であってもよい。

【0495】

例において、デバイスを、プレポリマー溶液を用いて製作した。図51(a)は、例示的プレポリマー溶液の化学合成、並びにポリマー光架橋機構及びナノ細孔形成の略図を示す。図51(a)中の差込図は、ナノスケールの皺状孔を示す例示的な得られる足場表面のSEM画像を示す(スケールバー:500nm)。

【0496】

例において、ポリ[オクタメチレンマレイン酸(無水物)クエン酸](POMac)プレポリマーを調製するために、1,8-オクタンジオール、クエン酸、及びマレイン酸無水物を5:1:4モル比で混合し、窒素パージ下、160℃で融解した。次いで、温度を140℃まで低下させ、混合物を3時間撹拌した。次いで、得られるプレポリマー溶液を1,6ジオキサン中に溶解し、蒸留水中での滴下沈降により精製した。沈降したポリマーを2日間凍結乾燥した後、60%w/w及び5%w/wのUVイニシエーター(Irgacure 2959)でポリ(エチレングリコール)ジメチルエーテル(PEGDM、Mw約500、Sigma社)と混合した。

【0497】

プレポリマー成分の比率を変更して、得られるポリマーの物理特性を調整した。

【0498】

足場パターンを、AutoCAD中で事前設計し、以前に記載された標準的なソフトリソグラフィ技術によりSU-8マスターに移転させた。シリコーンエラストマー[ポリ(ジメチルシロキサン)、PDMS]を、SU-8マスターに対して成型し、室温で2日間硬化した。

【0499】

次いで、足場の第1層及び他の層のためのパターン化されたPDMSをスライドガラス及び平坦なPDMSにそれぞれ一時的に結合させて、静的接着により閉じたチャネルを形成させた。次いで、プレポリマー溶液をパターン化されたチャネルに注入し、室温で一晩静置した。次に、注入されたポリマー溶液をUVランプ下で5分間架橋した後、第1層はスライドガラスに付着し、パターン化されたPDMSから剥離するが、他の層はパターン化されたPDMSに付着し、平坦なPDMSから剥離するように、PDMS鋳型を剥離して、パターン化されたポリマー構造を遊離させた。全てのパターン化された層を整列させ、UV整列器(Q2001、Quintel Co.社、San Jose、CA)を用いて第1層又は以前の層に対して圧縮した後、更に1分間、UVに曝露して、層を一緒に永続的に結合させた。製作された足場を、最後にPSB中に一晩含浸させて、PEGDMポロゲンを浸出させた。本実施例では、4つの足場を同時に製作することができた。

【0500】

図51(b)(1〜5)は、例示的血管足場の層ずつの成型及び単一層血管ネットワーク製作のための結合手順の略図である。差込図はチャネル管腔の横断面のSEM画像を示す(スケールバー:100μm)。図51(b)(6)は、多層血管ネットワーク製作の例を示す略図である。

【0501】

例示的デバイスは、培地灌流下、足場上での内皮細胞と心筋細胞との同時培養のためのバイオリアクターとして役立ち得る。本実施例では、デバイスは、4つの構成要素:キャップ、リザーバー、PDMSスラブ、及びベースを含んでいた[図51(c)(ii)を参照されたい]。本実施例におけるデバイスは、別々の培養チャンバー中で3つの足場を同時に培養するように設計された。リザーバーの小片(厚さ2.5cm)は、足場ネットワークを介して灌流し、培養組織に酸素及び栄養素を供給する内皮増殖培地を入れるための6つのウェルと、栄養素を組織表面に提供する心筋細胞増殖培地を含有する3つのウェルとを含む。PDMSスラブ(厚さ2mm)は、足場を置くことができる3つのトレンチを含む。トレンチは、細胞/ゲルが足場全体を被包することができるように、足場を底部から持ち上げるのに役立つようにマイクロポストを含有させたベース層を有する。トレンチはまた、足場の入口及び出口が正確に適合する開いた入口及び出口チャネルも含む。

【0502】

図52は、実施例4のデバイスのための例示的ホルダーを示す。本実施例においては、ホルダーはゲルの浸潤及びより効率的な再モデリングを可能にするのに役立つように組織を吊り下げられたままにするように設計されるトレンチ及びポストを含む。トレンチの例示的寸法を、図面に示す。

【0503】

足場をトレンチ上に配置した後、PDMSの開いた入口及び出口チャネルがリザーバー構成要素によってキャップされ、従って、足場を固定するように、PDMSスラブを、ベース構成要素とリザーバー構成要素との間に差し込むことができる。3つの構成要素をステンレススチール製ねじで固定し、キャップを付けた。内皮細胞培地を、2つのウェル間の上部圧力差により駆動される底部ウェルに出た足場ネットワークを介して上部ウェルからキャップ付チャネルに灌流させた。

【0504】

図51(c)(i)は、ゲル圧縮を示す例示的デバイスを用いた心臓細胞播種/組織形成の例示的プロセスを示す。

【0505】

図51(d)は、(i)2-D血管足場、及び(ii)3-D血管足場の横断面図を示すSEM画像を示す。異なる格子マトリックス設計を有する単層血管足場の上面図を示すSEM画像を、単一メッシュ層設計を例示する図51D(iii)、ポストにより吊り下げられた2つの高密度メッシュ層を有する設計を例示する図51D(iv)、及びポストにより吊り下げられた2つの緩いメッシュ層を有する設計を例示する図51D(v)に示す。

【0506】

図51(e)は、10μmの微小孔を有するAngioChip足場のSEM画像を提供する。(A)は、ネットワーク壁を通してパターン化された10μmの通り穴を有するAngioChip足場の画像を提供する。スケールバー:600μm。画像は複数の画像から縫い合わせたものである。(B)異なる角度から見た10μmの通り穴を有するAngioChip足場のSEM。スケールバーを画像中に示す。

【0507】

図51(f)は、3-D AngioChip足場のマイクロCTを提供する。(A)足場の長端方向に沿ってその入口から分枝に向かう3-D AngioChip足場の横断面のマイクロCTスキャン。スケールバー:400μm。(B)異なる角度から見たAngioChipの内部ネットワークのマイクロCT。足場を、その内部ネットワークを介して硫酸バリウム溶液で灌流し、従って、改善された可視化のためにその密度を増加させた。足場ネットワーク壁の厚さは50μmであった。入口、出口、及び第一次分枝は、50μm×200μmの管腔寸法を有していた。第二次分枝は50μm×100μmの管腔寸法を有していた。第一次及び第二次分枝中の内皮細胞が同レベルの剪断応力を経験するようにネットワークを設計した。各層上のネットワークを、垂直チャネルにより接続し、z軸中で300μm離した。足場メッシュを50μmの支柱から作製した。支柱は長端方向に250μm、短端方向に100μm、及びz軸中に50μm離して置いた。

【0508】

図51(g)は、POMacポリマー溶液の分子構造の特徴付けを提供する。(A)フーリエ変換赤外(FTIR)分光分析。(B)核磁気共鳴(NMR)分光分析。

【0509】

ある特定の材料、技術及び寸法が上に記載されるが、例示的デバイスのために他の好適な材料、技術及び寸法を用いることもできる。例えば、異なる分枝構成を有する組織の培養を可能にするために、異なるチャネル及び層構成を有するデバイスを設計することができる。

【0510】

開示されるデバイスを、任意の好適な技術を用いて任意の好適な材料から形成させることができる。例えば、デバイスを、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)又はポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)材料等の、ポリマー材料を用いて形成させることができる。いくつかの例においては、細胞、組織及び/又は培養培地と接触するようになると予想されるデバイスの部分(例えば、バイオリアクターチャネル又はチャンバー及び足場)は、ポリ(ジメチルシロキサン)(PDMS)を実質的に含まなくてもよい。足場を、生分解性材料から作製することができる。他の好適な材料は、ポリ(グリセロールセバケート)、クエン酸を含まないPOMac、ポリ(乳酸)、ポリ(グリコール酸)、ポリ(ε-カプロラクトン)、様々なポリウレタン並びにそのコポリマー、絹、微細構造のナノファブリケーション材料、及び/又は特に、ナノロッド若しくは量子ドット等のナノ構造でドーピングされた材料を含んでもよい。

【0511】

開示されるデバイスは、特に、in vitroでの薬物試験、動物若しくはヒト患者における直接的な吻合、又は動物若しくはヒト患者における埋め込み等の様々な適用にとって有用であってもよい。開示されるデバイスを、微細製作されたチップの形態で提供することもできる。

【0512】

本開示はまた、開示されるデバイスを用いて組織を培養するための方法も提供する。例示的方法を、以下で更に考察する。方法は、種細胞を、デバイスのバイオリアクターチャネル又はバイオリアクターチャンバー中に導入することを含んでもよい(例えば、種細胞が包埋されているゲルの導入)。次いで、種細胞をバイオリアクターチャネル又はバイオリアクターチャンバー中で培養することができる。培養中に、特定の時間での刺激の特定の周波数を規定する、規定のレジメンに従って、電気刺激を細胞に提供することができる。

【0513】

開示されるデバイス及び方法を、筋肉細胞(例えば、心筋細胞、骨格筋細胞、若しくは平滑筋細胞)、興奮性細胞(例えば、ニューロン)又は血管構造を必要とする細胞(例えば、肝細胞)等の、ヒト又は動物組織の培養のために用いることができる。他の細胞を一緒に培養することもできる。例えば、特に、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、及び多能性幹細胞、間葉系幹細胞、臍帯血由来幹細胞等の様々な型の幹細胞、並びにこれらの細胞型の分化した子孫を同様に培養することができる。

【0514】

開示されるデバイスのより高い評価及び理解を可能にするために、例示的デバイスを用いる組織培養の例を、以下に記載する。また、開示されるデバイスの例を用いて生成される組織を調査するために、例示的試験を実行した。これらの例示的試験は、いくつかの異なる区分を有する人体チップを構築するため、並びに他の適用の中でも、特に動物又はヒト患者への直接的吻合及び埋め込みのために、in vitroでの薬物試験を含む様々な適用にとって好適であってよい生物学的に関連する組織を生成するための開示されるデバイスの使用を検証するのに役立ち得る。

【0515】

B.AngioChip:臓器チップ工学及び直接外科吻合のための内蔵型血管構造を有する生分解性足場
新しい3-Dスタンピング技術を用いて、本実施例は合成生分解性エラストマー[ポリ(オクタメチレンマレイン酸(無水物)クエン酸-POMac]から製造されたAngioChip足場を教示する。AngioChipは、内皮細胞で被覆され、格子マトリックス中に包埋され、様々な型の実質細胞の集合を支援する調整可能な機械的特性を有する内部3-D型の、灌流可能な分枝状微小チャネルネットワークを含有する。ポリマー反応中の架橋エネルギーの量及び/又は異なるポリマー単位の比率を少なくとも調整することにより、調整可能性を達成することができる。例えば、POMacの場合、当業者であれば、より固い特性を有するより疎水性の高いポリマーを作製するためにクエン酸の量を減少させることができる。この設計により、実質中への細胞播種のための材料選択から工学的に作製した血管ネットワークのための材料選択を効率的に切り離し、開いたチャネルを維持しながら大規模な再モデリングが可能になった。血管壁へのナノ細孔及び微小孔の組込みは、血管透過性を増強し、細胞間クロストーク及びモデル炎症細胞の溢出を許容した。AngioChipを用いて工学的に作製された、血管形成した肝臓組織及び心臓組織は、その内部血管構造を通して送達された臨床的に関連する薬物をプロセシングすることが示された。また、AngioChip心臓組織をラット後肢の大腿血管に直接外科吻合により埋め込んで、直接血液灌流を確立した。

【0516】

序論
多細胞インタフェースチップの工学的作製の成功は、閉じた2-Dのマイクロ流体プラットフォーム中での異なる臓器(例えば、肺、腸)の血管インタフェースに主に焦点を当ててきた。しかしながら、固形臓器(例えば、心筋、肝臓)について、組織レベルでの組織的構造の形成は、3-D環境を含む。例えば、心筋の肉眼的収縮及び生理学的成熟は、伸長した細胞を含む整列した組織束の形成に依拠する。肝臓組織は幹細胞の3-D凝集を必要とする。実質細胞から構成される現在の3-D微小組織は、血管構造の非存在下で研究されてきたが、血管構造チップは主に実質細胞とは別に研究されてきた。従って、3-Dの機能的組織環境内への必須の血管インタフェースの組込みは、高忠実度の臓器チップモデルに対する重要なステップである。

【0517】

同様の血管形成の試みが大規模に経験された。いくつかの組織型がin vitroで上手く工学的に作製されたが、臨床的翻訳は薄い組織又は代謝要求が低い組織(例えば、皮膚、軟骨及び膀胱)についてのみ達成された。大きい固形組織(例えば、心筋、肝臓)は酸素レベルに対して高感受性であり、酸素供給がなければ数時間以内に脆弱になる。これらの固形組織はin vitroでの迅速な血管形成及びin vivoでの直接的な血管統合から大きな恩恵を受ける。今までのところ、血管形成した組織の外科的吻合は、血管床を収獲するために複数の戦略を必要とする、血管外植片を用いて証明されているに過ぎない。

【0518】

ヒドロゲル中に犠牲となる炭水化物-ガラス格子、プルロニックF127、乾燥アルギネート線維、又はゼラチンを包埋することにより、血管ネットワークを、減算的製作を用いて工学的に作製することができる。しかしながら、柔らかいヒドロゲルは、不安定な中空ネットワークのための一時的な構造的支持を提供するに過ぎず、大規模な組織再モデリング許容せず、ヒドロゲル構造を必然的に変化させ、包埋されたネットワークを崩壊させる。合成生分解性ポリマーは、工学的に作製された血管に対する十分な構造的支持を提供するが、その低い透過性は血管と実質空間との生体分子交換及び細胞移動を防止する。更に、現在の製作技術は、播種された実質細胞が3-D中で相互接続された組織を形成することを防止する物理的障壁を有する層になったチャネルネットワークを作出することしかできない。

【0519】

これらの2つの反対の材料基準に適合させるために、これは、本発明者らの新しい3-Dスタンピング技術により実現される2つの独特の特徴を含む内蔵型分枝状マイクロチャネルネットワークを有する安定な生分解性足場であるAngioChipを提供する。第1に、合成内蔵型血管壁は薄く可撓性であるが、収縮する組織中で灌流可能な血管構造を機械的に支持するために十分に強く、直接的外科的吻合を可能にした。第2に、より効率的な分子交換及び細胞移動を可能にするために、ナノ細孔及び微小孔を血管壁に組み込んだ。AngioChip内に安定で透過性の血管ネットワークを確立することにより、材料の制約は限定され、大規模な組織再モデリングを許容する実質空間中に細胞が包埋された任意の柔らかい天然の細胞外マトリックス(例えば、コラーゲン、Matrigel)の使用が可能になった。再モデリングされた組織を構造的に強化するために、AngioChipの実質空間構造を微調整して、そうでなければ均一なヒドロゲルを用いて達成することが難しい、天然組織(例えば、心筋)の異方性機械的特性を模倣することもできる。この方法に基づいて、微小規模の臓器チップモデル及び組織置きかえの両方のための機能的及び血管形成された心臓及び肝臓組織を作出した。

【0520】

結果
AngioChip足場を、生分解性エラストマーであるポリ[オクタメチレンマレイン酸(無水物)クエン酸](POMaC)を用いる新しい3-Dスタンピング技術を用いて構築した(図51A)。POMaCは、UV重合性であり、緩和な条件下での迅速な集合を可能にし、加水分解により分解し、非毒性モノマー(クエン酸、マレイン酸無水物、1,8-オクタンジオール)から合成される(図51A)。3-Dスタンピングを用いて、薄いPOMaCシートを、UV照明下、拡張可能な様式(図51B)で予めパターン化し、互いの上に、層ずつにスタンプして、数μm以下の正確なアラインメントを有する、複雑な吊り下げられた構造、及び内部空洞を形成させた。POMaCは、PDMSの表面上でのフリーラジカル重合を酸素誘導的に阻害し、境界面のPOMaC層を重合しないままにするため、光架橋後にガラス(強い)及びポリジメチルシロキサン(PDMS)(弱い)への非永続的かつ示差的な接着を示した。この特徴を用いて、パターン化されたPOMaCシートを強固に転移させ、整列させ、1つの基質(PDMS)から遊離させた後、ガラス基質により支持されるPOMaC構造に結合させた(図51B)。この方法は、従来の3-D印刷に関するような空中に生物材料を印刷する課題を回避し、犠牲となる材料の使用を回避した。3-Dスタンピングにより、1-Dチューブ(図56e)から、実質細胞を支持するように調整された、格子マトリックス内の血管床を模倣する(図f、g、h及び図51b)、2-Dの分枝する導管(図56f)又は3-Dの分枝状ネットワーク(図56g)への様々な複雑な構造へのPOMaCのパターン形成が可能になった。

【0521】

x-y並びにy-z平面で分枝した相互接続された内部ネットワークは、単一の入口及び出口を通って灌流可能であった(図56h、図51f)。ネットワーク中の最も小さいマイクロチャネルは、100μm×50μmであり、壁の厚さは25〜50μmであった。チャネル壁を横断する生体分子の交換及び細胞移動を改善するために、10μmの微小孔を上側のチャネル壁中でパターン化した(図56i、図51e)。酸素及び栄養素交換を更に増強するために、ポロゲンを包埋した後、浸出させることにより、POMaCポリマー材料の塊にナノ細孔を組み込み、質量の減少により確認し(図56j)、記載のような皺状のナノ細孔を得た(図56k)。

【0522】

灌流培養のために、AngioChip足場を、カスタマイズされたバイオリアクターの入口ウェルと出口ウェルとの間の主要ウェル中に取り付けた(図56c)。培養培地又は内皮細胞(EC)懸濁液を、入口ウェルと出口ウェルとの間の液体圧力水頭差により駆動される内部ネットワークを介して灌流した(図56c、図52、図62)。この設計は嵩高い外部ポンプの必要性を除去し、従って、単純な道具(例えば、マイクロピペット)を用いて組織実質空間と内部血管構造の両方へのアクセスを可能にし、容易な組織除去を可能にする開いた構成を保存する(図56b)。ECを内部ネットワーク内で培養した一方、実質細胞を、天然細胞外マトリックス(ECM)を有する格子マトリックス内で培養し、組織再モデリングを可能にした(図56d)。

【0523】

AngioChip足場は、数カ月にわたってリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で徐々に分解し、アルカリ条件(0.1M NaOH)下では4日間で最後まで分解した(図57a、b)。AngioChip破裂圧は、ラット大腿静脈のものと同等であり(図57c)、ラット(130mmHg)又はヒト(120mmHg)における正常な収縮期血圧よりもほぼ7倍高く、ネットワークが末梢循環における血液灌流に耐えるのに十分であることを示している。

【0524】

実質細胞を支持することを意図する足場格子は、垂直のポスト(50μm直径)により接続された複数の層のメッシュから構成されていた。この独特の特徴は、他の製作方法(例えば、レーザーマイクロアブレーション)を用いては達成できず、格子内の100%の相互接続性を提供し、厚い構築物中での細胞播種を容易にし、実質細胞はx-y及びy-z平面の両方において相互接続された組織を形成することができる。格子の形状及び密度を3つの異なる設計において変化させて、設計Bにおけるような成体ラット心室心筋の異方性剛性と類似する足場の機械的特性を微調整した(図57d〜f、図64、図65、図62)。異方性は、短端方向(SD)よりも長端方向(LD)において高い支柱の空間密度を有する、長方形のメッシュにより可能になった(図57g)。有効剛性(E)と最終引張強度(UTS)は両方とも、格子密度の増大と共に増大した。さらなる設計の反復により、特定の適用(例えば、ヒト心筋又はヒト肝臓)のために調整された機械的特性を有する足場が得られる。

【0525】

合成ポリマーの限られた透過性は、他の生分解性マイクロ流体足場の成功を制限する。10μmの微小孔を有する無細胞性AngioChip足場ネットワークは、微小孔を有さないもの[それぞれ、(2.0±0.2)×10^-6cms^-1の透過性及び(0.9±0.03)×10^-6cms^-1の透過性、n=3]よりも、小分子[332DaのFITC、(4.4±0.1)×10^-6cms^-1、n=3、図57h]に対する透過性が2倍高く、大分子[70kDaのTRITC-デキストラン、(3.7±1.5)×10^-6cms^-1の透過性、n=3]に対する透過性が4倍高かった。両方の場合、足場ネットワークの透過性は、70kDaのFITC-デキストランに関するin vivoでの哺乳動物小静脈の透過性よりも高かった[(0.15±0.05)×10^-6cms^-1]。無細胞ネットワークの高い透過性により、ECコーティングが、ECがin vivoでの血管の透過性を制御する方法と類似する、マイクロ流体血管の最終的な透過性を決定する際の支配的因子であることが可能になる。実質空間中に拡散した生体分子の分布及び代謝変換を検証するために、肝臓細胞の追跡染料、カルボキシフルオレセインジアセテート(CFDA、557Da)を、実質中の肝臓細胞を染色する(図57i)、心臓細胞により取り囲まれた足場ネットワークを介して灌流させ、高密度の組織内の代謝変換及び分子分散と一致していた。

【0526】

ヒト臍帯静脈EC(HUVEC)を用いる内皮化の際に、CD31免疫染色により、内蔵型ネットワークの管腔表面上に集密な内皮が示され(2日目、図58a〜d)、VE-カドヘリンが細胞間結合で発現された(図66)。ECは血管壁上の微小孔を物理的に被覆し(図58e、f;図66)、3-Dネットワークの分枝点でも血管壁を共形かつ集密に被覆した。血液適合性を評価するために、ヒト全血を、15dyne/cm²(約5μL/分;Re、0.023)でのECコーティングを有する、又は有さないAngioChipネットワークを通して灌流した(図58g)。第一次及び第二次分枝中のEcが同じ剪断応力を経験するように、AngioChipネットワークを設計した。ECコーティングがなければ、有意により多い血小板がネットワーク表面に結合し(図58j、図67)、その伸長した仮足形態により示されるように、活性化されるようになった(図58h、i)。付着した血小板は、血流パターンに従って拡散する傾向を示し、分枝及び曲がり角の停滞領域により多く蓄積した(図38h;図67)。灌流したRaw264.7マクロファージは、分枝点でのいくらかの蓄積及び接着(図58k、l)、内皮化された表面に沿った移動(図58m)及び血管壁上の微小孔から実質空間への移住(図58n)を示した。内蔵型血管構造と実質空間との間のこの溢出は、AngioChip足場の典型的な特徴であり、足場分解とは無関係に1日目で観察された。

【0527】

3D血管形成された肝臓組織を作出するために、10%ラット一次線維芽細胞と混合したラット一次肝細胞(ECM再モデリング及びゲル圧縮を容易にするため)を、内皮化されたAngioChip足場の実質空間中に播種し、ネットワーク周囲への生細胞の凝集をもたらした(図59a〜d)。組織横断面は、格子を通って血管ネットワークの周囲に分布した肝細胞(アルブミン染色した)を示した一方、EC(CD31染色した)はネットワークの内部管腔を被覆した(図59e〜g)。出口ウェルにおける尿素の分泌は、内皮化されたAngioChip組織中で維持されたが、内皮化しない場合、時間と共に減少し(図58h、i)、ECからの持続的パラクリンシグナリングが記載のように肝細胞の健康を維持することを示した。主要ウェルと比較して出口ウェルにおける尿素のより高い濃度は、内蔵型血管構造に対する分泌を指令する肝細胞の極性化を示唆し得る。心臓毒性のため市場から撤退した抗ヒスタミン剤であるテルフェナジンで肝組織をチャレンジした(図59h)。テルフェナジンは一般に、肝臓中で、シトクロムP450 CYP3A4アイソフォーム酵素によって、非心臓毒性フェキソフェナジンに代謝される。液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)により、出口ウェル中でのフェキソフェナジンの存在が示され、これは、灌流された薬物が内蔵型血管構造から肝組織に送達され、代謝された後、血管構造中に放出されて戻ったことを示している(図59j)。

【0528】

心臓組織を、5日以内に濃縮された組織を形成する血管ネットワークの周囲に圧縮する新生児ラット又はヒト胚性幹細胞(hESC)由来心筋細胞から作出した(図60a、b)。同期的肉眼的収縮が早ければ4日で観察され、ヒトとラットの両方の組織の電気的興奮性パラメータは標準的な範囲内にあった(図60c、d)。収縮する組織はそれぞれの鼓動で足場を圧縮し、収縮の振幅は時間と共に増大し、組織が成熟するにつれて収縮力が増大することを示していた(図60e)。内蔵型の機械的に安定な血管構造により、心臓組織は灌流されながら自発的に収縮することができた(図60j)。収縮タンパク質サルコメア-α-アクチニン及び構造タンパク質F-アクチンは、伸長した細胞中で見えた(図60f〜i)。7日目での組織横断面により、ECは血管腔を被覆する一方、心筋細胞は格子を通じて分布し、1mmの厚さの多層AngioChip足場(図60n)中でも血管の周囲に密に充填されることが示された(図60k〜m)。ヒト心臓組織(31±6%の心筋細胞、n=9、図68)により、伝導遮断がなく、組織全体にわたるCa²⁺波動の増幅(3.5±2.6cms^-1、n=5)が示された(図60o)。組織集合の前に心筋細胞集団を富化し、電気機械刺激を印加することにより、伝導速度を更に改善することができる。エピネフリン(10μM)及びジゴキシン(10μM)を、内蔵型血管構造を介して灌流して、心臓組織を刺激した。30分以内に、組織はエピネフリンに対する予想された陽性変時応答(図60p)及びジゴキシンに対する陰性変時応答(図60q)を示した。流動の重要性を評価するために、ラット心臓組織を、培地灌流あり、又はなしで培養した。生存能力は、7日目で壊死性コアを生じた非灌流組織と比較して灌流組織内でより高かった(図60r)。多くの細胞死(すなわち、乳酸デヒドロゲナーゼ放出)は最初の3日以内に起こり、培地灌流は2日目及び3日目に細胞死を軽減するのに役立った(図60s)。

【0529】

AngioChip足場は、成体Lewisラットの後肢の大腿血管へのラット心臓組織の直接的吻合を可能にした(図61)。類似するクエン酸に基づくポリマーは、血管移植片において抗血栓性であり、in vivoでECの増殖を支援することが示されている。この概念実証研究のために、最悪のシナリオを検査した:動物を手術中にのみヘパリン処理し、ECは用いなかった。AngioChip組織の入口及び出口(100μm×200μmの内径及び200μm×300μmの外径)を、2つの構成において接続した:動脈-動脈移植片(図61a)又は動脈-静脈移植片(図61b)。両構成において、内蔵型ネットワークを介する血液灌流を、手術の直後に確立した。より顕著には、動脈-動脈構成において血液脈動も観察された。in vivoで1週間後、拒絶の組織学的兆候は観察されず、細胞はAngioChipを密に包んだ(図61c〜n;図69〜73)。赤血球は、直接吻合を用いて埋め込まれた組織のネットワーク中でのみ観察された(図61i、j、o)。埋込み体の周囲の血管の存在から見られるように、天然の血管形成も起こった(図61f、l)。心筋細胞の存在を、トロポニンT免疫染色を用いて確認したところ、AngioChipの格子内で絡み合っている伸長した心筋細胞が示された(図61h、n)。平滑筋アクチン(SMA)陽性細胞の存在は、単離された新生児ラット心臓細胞中の2%に過ぎなかった;有意なSMA染色(図61g、m)は、埋め込まれた組織中への壁細胞又は筋線維芽細胞の浸透が治癒応答と一致することを示唆していた。宿主再モデリングにとって重要な、拡散した細胞浸潤は、AngioChip実質空間の開いた多孔性構造のおかげである。直接的吻合を有する埋込み体は、対照よりも有意に高い細胞浸潤を示したが、これは、より高い程度の組織再モデリングが誘導されたことを示唆している(図61p)。

【0530】

考察
AngioChip足場設計において、本発明者らは、実質空間のための材料選択から工学的に作製された血管ネットワークのための材料選択を効率的に切り離すことによって、本発明者らは実質細胞の生理学的再モデリングを持続させながら、血管構造の初期構築を制御し、in vitro及びin vivoでの即時の灌流を確立することができた。AngioChip足場は実質細胞の集合の前に、1日以内に完全に内皮化された内蔵型の灌流可能な血管ネットワークを有していたため、この微細工学アプローチは、組織血管形成の遅延をもたらさなかった。新しい3-Dスタンピング技術により、本発明者らは、10μmの孔を有する25μmの薄さのポリマーシートを取り扱って、通常は非常に短距離(約10個の細胞)のうちに有意に崩壊する、わずか2〜3個の細胞の厚さの血管を作出し、したがって、ECと実質空間とのパラクリンシグナリングを持続させることができた。ナノ細孔及び微小孔と組み合わせた薄いチャネル壁は、以前はヒドロゲル系を用いた場合にのみ達成できた、効率的な分子交換を可能にする重要な特徴であった。この設計により、血管形成された3-D組織モデル中への細胞溢出、及び伝達-拡散による試験薬物の送達のための生理学的に関連する様式が可能になった。異なる臓器中の独特の環境と一致させるために血管透過性を更に微調整するために、臓器特異的ECを用いるべきである。

【0531】

AngioChipプラットフォームは、複数のAngioChipを直列に連結して、臓器レベルの相互作用を再現することにより、単一のデバイス上での異なる組織(例えば、肝臓と心臓)の容易な統合を可能にする(図74)。従来のマイクロ流体は、統合を困難にする嵩高い外部設定を必要とする。従来のチップの閉じた構成は、マイクロピペットを用いた液体の分注のために開いたウェルに大きく依拠する、生物実験室及び製薬業界における現在の実務とは適合しない。本発明者らのプラットフォームは、標準的なマルチウェルプレートと同様、実質空間と内部血管構造の両方が単純なピペッティングにより容易にアクセスすることができ、それぞれの型の組織のためにそれぞれの区画中で異なる培地を用いることができるような開いた構成を維持し、したがって、同時培養条件を最適化する必要性を除去する。

【0532】

大規模な組織置きかえとして、AngioChip足場製造方法は拡張性があり、より大きい臓器の製作に向かって移動させるために自動化することができる。これは、外科的吻合のための十分な機械的安定性を示し、同時に血管透過性を改善した初めての工学的に作製された血管ネットワークである。それはまた、ヒドロゲルを用いた場合には達成が困難な、実質空間中での長方形(異方性のため)又は正方形(等方性のため)の格子を用いた組織剛性の微調整も可能にする。AngioChip足場を、血栓形成を減少させるための存在する方法を用いてヘパリンを共有的に固定することにより、化学的に改変することもできる。壁細胞が効率的に動員された後の宿主再モデリングにとって、適切な足場分解速度が重要である。従って、天然の壁細胞及びECMが合成ポリマー血管壁の役割を徐々に引き継ぐことができるポリマー鎖上のクエン酸含量を調整することにより、in vivoでのAngioChipの長期的分解を将来検査し、特定の適用のために微調整するべきである。

【0533】

まとめると、AngioChipを用いて、規定の血管構造を有するin vitroの心臓及び肝臓組織モデルと、直接的外科的吻合を有するin vivoの埋込み体との両方を生成した。独自に、このプラットフォームは、有効な再生戦略のin vivoでの検証及び開発へのin vitroでの試験結果の直接かつ迅速な翻訳を可能にした。

【0534】

方法
POMaCの合成。ポリ[オクタメチレンマレイン酸(無水物)クエン酸](POMaC)プレポリマーを調製するために、1,8-オクタンジオール、クエン酸、及びマレイン酸無水物を5:1:4のモル比で混合し、窒素パージ下、160℃で融解した。混合後、温度を140℃に低下させ、混合物を2〜3時間撹拌した。次いで、得られたプレポリマー溶液を、1,6ジオキサン中に溶解し、Direct-Q5 Water Purification System(Millipore社、Billerica、MA)から生成された脱イオン蒸留水中、滴下沈降により精製した。沈降したポリマーを収集し、2日間凍結乾燥した。光架橋の前に、POMaCプレポリマーを5%(w/w)UVイニシエーター(Irgacure 2959、Sigma社)と混合した。ナノ細孔性足場を作製するために、POMaCポリマーを60%(w/w)のポロゲンポリ(エチレングリコール)ジメチルエーテル(PEGDM、Mw約500、Sigma社)とも混合した(図51a)。無孔性足場を、PEGDMを添加せずに作製した。

【0535】

核磁気共鳴(NMR)分光分析及びフーリエ変換赤外分光分析(FTIR)。1D 1H CPMGT2スペクトルを、1Hのために699.806MHzで運転するAgilent DD2分光計(Agilent社、Walnut Creek、CA)上、25℃で獲得した。分光計に、5mm HFCN Cold Probeを装備した。スペクトルを、200msのCPMGT2フィルターを用いる100446ポイント、10sのリサイクル遅延、2の安定状態スキャン、及び16の移行を用いる11160.7Hzのスペクトルウィンドウ上で獲得した。MNovaソフトウェア(v.9.0.0、Santiago de Compostela社、Spain)を用いて、NMRプロセシングを実行した。簡単に述べると、分析の前に、スペクトルをフーリエ変換し、位相化し、ベースライン補正した。透過スペクトルを、高速回復重水素化硫酸トリグリシン検出器(PerkinElmer,Inc.社、Waltham、MA)を備えたSpectrum One FTIR分光計と連結したATRトッププレートアクセサリーを用いて取得した。スペクトルを、4000〜650cm^-1の領域で記録した。

【0536】

AngioChipの製作。AngioChip足場の各層を、AutoCAD中で最初に生成し、以前に記載された標準的なソフトリソグラフィ技術により個々のSU-8マスターに移転させた。シリコーンエラストマー[ポリ(ジメチルシロキサン)、PDMS]を、SU-8マスターに対して成型し、室温で2日間硬化させた(図51b)。3-D足場のベース層及び上部層のためのパターン化されたPDMS鋳型を、それぞれ、スライドガラス及び平坦なPDMSシートにキャップを付けた。次いで、POMaC溶液を、入口及び出口を介してパターン化されたネットワーク中に注入し、室温で一晩静置した。一滴のPOMaC溶液を入口孔の上に添加し、穏やかな陽圧を印加することにより、注入を達成した。一晩、POMaC溶液は、主要メッシュネットワークから外へ伸長する垂直カラムを含む全PDMS鋳型を充填した。PDMSは多孔性であり、空気を逃がすことができるため、入口での穏やかな陽圧は、捕捉された空気を鋳型内部に押し出した。次に、注入されたPOMaC溶液を、ポロゲン、60%(w/w)PEGDM/POMaC溶液と混合したポリマーについては4分間、又はPEGDMを添加しない場合は10分間、10mJ/cm²sの強度のUV光の下で架橋させた。その後、PDMS鋳型のキャップを外し、パターン化されたポリマー構造を露出させた。第1層のためのパターン化されたPOMaCシートをスライドガラス上に付着させたが、その後の層のためのパターン化されたPOMaCシートをPDMS鋳型上に付着させた。次いで、PDMS鋳型上の露出したPOMaCシートを整列させ、カスタマイズされたUVマスクアライナー(Q2001、Quintel Co.社、CA)を用いてスライドガラス上のパターン化されたPOMaCシートに対してプレスした。次いで、層を一緒に結合するために、PEGDMを添加しない場合、4分間又は10分間、10mJ/cm²sの強度のUVに試料を曝露した。次いで、UV曝露後、PDMS鋳型を遊離させ、2つのパターン化されたPOMaCシートを一緒に結合し、スライドガラスに付着させたままにした。このプロセスを繰り返して、確立されたベース構造にさらなるパターン化されたPOMaCシートを結合させた。最後に、製作された足場をPSBに浸して、スライドガラスからそれらを遊離させ、室温で一晩インキュベートして、PEGDMポロゲンを溢出させた。単一のプロセスにおいて単一のスライドガラス上で同時に複数の足場をパターン化した(図56a)。

【0537】

走査型電子顕微鏡観察。AngioChipの構造を例示するために、AngioChip足場を、ポロゲン溢出の前にHitachi SEM S-3400を用いて画像化した。足場の切断は横断面を横断的に示した。足場のナノ細孔を画像化するために、PBS中でのポロゲン溢出後に、足場をエタノール中で最初に脱水した後、超臨界点乾燥を用いて調製し、従って、画像化の前にナノ細孔構造の崩壊を防止した。

【0538】

マイクロCT。AngioChip足場の内部構造を可視化するために、μCT40(Scanco medical社)を用いて、ポリスチレンスライド上に固定された足場を走査した。μCT Ray V40プログラムを用いて、バックグラウンドを排除するために獲得された画像に閾値を適用し、3-Dで足場を再構築した。足場の内部の内蔵型ネットワークを可視化するために、ネットワークに、1:1(v/v)の比でPBS中の2%(w/v)ゼラチン(ブタ皮膚、A型、Sigma社)と混合した硫酸バリウム懸濁液(105%w/v、Polibar plus、Therapex社)を充填した。注入溶液を室温でゲル化させ、μCTで画像化し、閾値を獲得された画像に適用して、足場の他の構造に対する内蔵型ネットワークを示した。

【0539】

足場の分解。ナノ細孔性足場試料を調製するために、60%ポロゲン含量を有する足場(3mm×10mm×200μm)を、10mJ/cm²sの強度で4分間、最初にUV架橋させた後、蒸留水中で洗浄して、ポロゲンを浸出させた。無孔性足場試料を調製するために、0%ポロゲン含量を有する足場(3mm×10mm×200μm)を、10mJ/cm²sの強度で10分間、UV架橋した。PBS(pH7.4、37℃)又は0.1M NaOH中で経時的に足場の質量減少を追跡することにより、足場の分解速度を決定した。それぞれのインキュベーション期間の後、試料を蒸留水中で最初に完全に洗浄した後、乾燥させた。初期質量を、特定の時点で測定された質量と比較することにより、質量減少を算出した。

【0540】

破裂圧。AngioChip足場の破裂圧を決定するために、足場の入口を、Tygonチューブを用いて圧力計を有する窒素タンクに接続した一方、足場の出口をエポキシ接着剤で密封した。足場ネットワークからの溢出が観察されるまで圧力を徐々に増大させ、ピーク圧力を破裂圧として記録した。入口又は出口での結合部からの浸出が最初に観察された場合、記録を廃棄した。

【0541】

機械的試験。AngioChip足場の機械的特性を、AngioChip足場の円周(長端に沿う)及び長手方向(短端に沿う)でMyograph(Kent Scientific社)を用いてPBS中で測定した。0〜0.1のひずみからの一軸引張応力-ひずみ曲線の勾配を用いて、AngioChip足場全体の有効剛性を算出した(図64、図65)。ひずみ-破壊値を、曲線に沿った破壊点でのひずみから決定した。成体ラット心筋の機械的剛性を、University of Toronto Animal Care Committeeにより認可されたプロトコールに従って犠牲にしたLewisラットの成体心臓から測定した。成体ラット心筋を、心臓の円周方向又は長手方向に沿って、幅2〜4mm及び厚さ2〜4mmを有する長さ7mmの小片にスライスした。心筋の一軸機械的剛性を、0〜0.1のひずみから引張応力-ひずみ曲線の勾配から決定した。異方性比を、円周方向の有効剛性を長手方向の有効剛性で除算することにより決定した。3つの異なる足場設計は異なる格子構造を有していたが、50μmの壁の厚さ、入口、出口及び第一次分枝については50μm×200μmの内部管腔寸法、並びに第二次分枝については50μm×100μmの内部管腔寸法を有する同じ内蔵型ネットワークを有していた。足場格子は50μmの支柱からできていた。設計Aにおいて、支柱を、長端方向に250μm離して、短端方向に100μm離して、z軸中では離さずに置いた。設計Bにおいては、支柱を、長端方向に250μm離して、短端方向に100μm離して、及びz軸中に50μm離して置いた。設計Cにおいては、支柱を、長端方向に550μm離して、短端方向に175μm離して、及びz軸中に50μm離して置いた。

【0542】

透過性。内蔵型ネットワークから周囲の水性溶液への大分子及び小分子の透過性を、蛍光染料:それぞれ、TRITC-デキストラン(約70kDa、Sigma社)及びFITC(約400Da、Sigma社)を用いて測定した。TRITC-デキストラン及びFITC溶液を、10又は100μMの入口濃度で20時間、ネットワークを介して0.7μL/分で灌流した。20時間後、中央のウェル中の溶液を収集し、蛍光分子の濃度を、蛍光プレートリーダーを用いて決定された標準曲線に対して補正した。小分子及び大分子に対するAngioChip足場全体のチャネル透過性を、ネットワーク内部の蛍光分子の平均濃度が入口でのものと同じであるという仮定でFickの法則を用いて、拡散の正味の速度(中央のチャンバー中の蓄積された蛍光分子の合計/時間)及びネットワークの管腔表面積から決定した。

【0543】

バイオリアクターの設計。AngioChip足場の入口及び出口を通る流体灌流を可能にする、並びに組織集合を容易にするために、バイオリアクターをカスタマイズした。バイオリアクターは4つの構成要素:キャップ、ポリカーボネート本体、PDMSベース、及びポリカーボネートベースで構成されていた(図56c)。バイオリアクターを、別々のチャンバー中に3つの足場を同時に収納するように設計した。ポリカーボネート本体(厚さ2.5cm)は、3行に配置された9個のウェルを含んでいた:上の行は入口ウェルを包含し、中央の行はAngioChip足場が配置される主要ウェルを包含し、下の行は出口ウェルを包含していた。PDMSスラブ(厚さ1mm)は、AngioChip足場が置かれる3つのトレンチ(深さ700μm)を含んでいた。トレンチの底部で、マイクロポスト(高さ200μm)をパターン化して、AngioChip足場をベースから持ち上げ、細胞/ゲルが足場の下部に浸透し、足場全体を被包することできるようにした。トレンチはまた、AngioChip足場の入口及び出口が正確に適合することができる開いた入口及び出口チャネルも含んでいた。AngioChip足場を配置した後、PDMSベース上の開いた入口及び出口チャネルが、その中で適合したAngioChipの入口及び出口でキャップされるように、PDMSベースをポリカーボネートベースとポリカーボネート本体との間に差し込んだ。3つの構成要素を、ステンレススチール製ねじで固定した。溶液及び/又は細胞懸濁液を、入口及び出口ウェルの圧力水頭差により駆動される、AngioChip足場の内蔵型ネットワークを介して入口ウェルから出口ウェルに向かって灌流した(図63)。埋め込み又は分析のために、バイオリアクターを無菌条件で分解して、AngioChip組織を除去した。

【0544】

内皮細胞培養。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、Lonza社から購入し、製造業者の説明書に従って内皮増殖培地(EGM、Lonza社)を用いて培養した。継代3回目のHUVECを、全ての実験に用いた。

【0545】

内皮化及び組織集合。AngioChip上並びに内部ネットワーク中での細胞付着を増強するために、集合の前にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の0.2%w/vゼラチン(ブタ皮膚由来、A型、Sigma社)で2時間、足場を被覆した。PDMSベース上への細胞付着を防止するために、集合の前にPBS中の5%w/vプルロニックF-127(Sigma社)で2時間、PDMSベースを被覆した。AngioChip足場をバイオリアクター中に入れた後、内皮細胞培地中の濃縮内皮細胞懸濁液(2500万個の細胞/mL)の20μLをネットワーク中で1分間灌流することにより、内皮細胞を足場の内蔵型ネットワーク中に最初に播種した。次いで、流動を停止させて、静的条件下で2時間、細胞を付着させた。入口ウェルに1mLの内皮細胞培地を添加し、したがって、0.7μL/分(0.62dyne/cm²、Re、0.01)未満の流量の下でAngioChip足場を介して灌流を開始して、細胞に十分な培地を供給しながら、細胞に最小限のストレスを加えることによって、付着しなかった細胞を洗い流した。ネットワーク内で、一晩、内皮細胞を増殖させ、集密なネットワークを形成させた。1日目に、肝臓組織を作出するために、一次成体ラット肝細胞を、AngioChip足場上に15μLのMatrigel(BD Biosciences社)と共に1億個の細胞/mLで播種した。心臓組織を作出するために、新生児ラットから単離された、又はヒト胚性幹細胞(hESC)から誘導された心筋細胞を、それぞれのAngioChip足場上に、1億個の細胞/mLで15μL(単層ネットワーク)又は40μL(三層ネットワーク)のコラーゲン/Matrigel混合物と共に播種した。コラーゲン/Matrigel混合物の組成は以下の通りであった:4.5μgml^-1のグルコース、1%のHEPES、10%(v/v)のMatrigel(BD Biosciences社)、及び2μgml^-1のNaHCO₃を添加した、1N NaOH及び製造業者により記載された10×M199培地により中和された2.5mgml^-1のラット尾部I型コラーゲン(BD Biosciences社)。37℃で30分間ゲル化した後、1mLの心筋細胞培地又は肝細胞培地を中央のウェルに添加した。実質細胞の播種後、更に4mLの内皮細胞培地も入口ウェルに添加し、培地灌流速度を0.7μL/分(0.62dyne/cm²、Re、0.01)に増大させた。

【0546】

全血灌流。ヒト全血を、University of Torontoの組織指針に従って、及び認可されたResearch Ethics Boardプロトコールの下で3人のドナーから収集した。全血を1%(v/v)のヘパリンで処理して、取り扱い中の凝固を防止した⁴⁵。全血を、37℃で30分間、15dyne/cm²で内皮化された足場又は内皮化されていない足場を介して灌流した。伸長した圧力カラムを入口ウェルに結合させた改変型バイオリアクターを用いて、高い剪断応力の灌流を達成した(図63)。伸長したカラムに、0.25mの高さまで血液を充填し、AngioChip足場ネットワーク内で5μL/分(15dyne/cm²、Re、0.023)の流量を生成した。血液灌流は30分しか続かなかったため、わずかに約150μLの血液が灌流され、30分の時間にわたってカラムの高さ及び流量を有意に変化させなかった。灌流後、ネットワークを塩水で洗い流し、4℃で48時間、PBS中の2%(v/v)グルタルアルデヒド中で固定した。固定された足場を、ネットワークの内部管腔表面を示すために凍結切片化し、SEMを用いて画像化した。Adobe Photoshopを用いてそれぞれの細胞クラスターの輪郭を描くことにより、血小板の面積を手動で定量した。分析を、盲検的に実施した。

【0547】

マクロファージの接着及び移動。Raw264.7マクロファージを、4.5g/Lグルコース、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FBS、Gibco社、Canada)、1%(v/v)HEPES(100ユニット/mL、Gibco社、Canada)及びペニシリン-ストレプトマイシン(100mg/mL、Gibco社、Canada)を含有するDulbeccoの改変イーグル培地(DMEM、Gibco社、Canada)中で培養した。Raw264.7マクロファージを、継代10回目で用いた。実験の前に、マクロファージを、CellTrackerαRed CMPTX(Molecular Probes社)又はCellTrackerαGreen(Molecular Probes社)のいずれかで標識した。2日目の内皮化された足場を、0.7μL/分(0.62dyne/cm²、Re、0.01)の流量にて37℃で1時間、1000万個の細胞/mLのマクロファージ懸濁液で灌流した。内皮化されたチャネル管腔表面上でのマクロファージの側方移動を、1時間の灌流中に捕捉した。マクロファージ接着画像を、蛍光顕微鏡を用いて1時間の灌流の終わりに捕捉した。1時間の灌流後、足場を37℃で一晩、再度インキュベートした。その後、足場を4%パラホルムアルデヒド中で固定し、Olympus FV5-PSU共焦点顕微鏡を用いて画像化して、10μmの小孔を通過するマクロファージの移動を見た。

【0548】

肝細胞の単離及び培養。University Toronto Animal Care Committeeにより認可されたプロトコールに従って8週齢のオスのSprague Dawleyラットから改変された2ステップの単離手順を用いて、一次ラット肝細胞を単離した。簡単に述べると、ラットをヘパリン処理した後、イソフルランで麻酔した。麻酔下で、腹腔を開き、大静脈と下行大動脈とを結紮することにより、血管系から肝臓を単離した。次いで、PE-50チューブを用いて肝臓にカニューレを挿入し、灌流した。最初に、肝臓を250mLの洗浄バッファー[12.5mMの4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)及び0.5mMのエチレングリコール四酢酸(EGTA)を含有するハンクス平衡塩溶液、HBSS(Gibco社)]、次いで、250mLの消化バッファー[4mMのCaCl₂及び0.1%の2型コラゲナーゼ(Worthington社)を含有するHBSS]で灌流した。肝臓を取り出し、Krebs-Henseleitバッファー(Sigma-Aldrich社、K3753)中、手動で解離させ、細胞懸濁液中に入れた。細胞懸濁液をコットンガーゼ及び100μmフィルターに通過させることにより、不溶性破片を除去した。300×gで開始し、50×gまで低下させる一連の遠心分離工程により、肝細胞を精製した。用いた肝細胞の細胞懸濁液は、90%より高い生存性及び95%より高い純度を示すと決定された。肝細胞をすぐに用いたか、又は後の使用のために凍結した。肝細胞を、DMEM(Gibco社)及びMCDB-131完全(Vec Tech Inc社)培地+10%(v/v)ウシ胎仔血清(FBS)、1%(v/v)ペニシリンストレプトマイシン及び1×インスリン-トランスフェリン-セレン-X(Gibco社)の50:50の混合物中で培養した。

【0549】

新生児ラット心筋細胞の単離及び培養。University of Toronto Animal Care Committeeにより認可されたプロトコールに従って以前に記載されたように新生児ラット心臓を消化することにより、新生児ラット心筋細胞及び線維芽細胞を単離した。新生児(1〜2日齢)のSprague-Dawleyラットをin vitroでの実験のために用いた一方、新生児(1〜2日齢)のLewisラットをin vivoでの実験のために用いた。簡単に述べると、新生児ラットを最初に安楽死させた。心臓を取り出し、四等分した。四等分された心臓を、4℃で一晩、Ca²⁺及びMg²⁺を含まないバッファー[HBSS(Gibco社)]中のトリプシン(Sigma社、Canada)の0.06%(w/v)溶液中で消化した。次いで、HBSS中のコラゲナーゼII(Worthington社、USA、220ユニット/mL)を用いて、一連の5回の4〜8分間の消化において37℃で四等分された心臓を更に消化した。コラゲナーゼ消化の後、細胞を40分間にわたって事前プレーティングした。心筋細胞について富化された、非接着細胞を収集し、再度、使用又はプレーティングし、使用前に一晩培養した。ラット心筋細胞を、4.5g/Lグルコース、10%(v/v)ウシ胎仔血清(FBS、Gibco社、Canada)、1%HEPES(100ユニット/mL、Gibco社、Canada)及びペニシリン-ストレプトマイシン(100mg/mL、Gibco社、Canada)を含有するDulbeccoの改変イーグル培地(DMEM、Gibco社、Canada)中で培養した。

【0550】

hESC由来CMの分化及び培養。HES-3 NKX2-5 GFP陽性細胞を、以前に記載された技術を用いて培養した。マウス胚性線維芽細胞(MEF)を有糸分裂的に不活化したマイトマイシンC上の6ウェル組織培養プレート中の20%ノックアウト血清置換物、100μM非必須アミノ酸、2mMグルタミン、50U/mLペニシリン、50μg/mLストレプトマイシン(Invitrogen社)、10〜4Mのβ-メルカプトエタノール(Sigma社)及び20ng/mLのhbFGF(R&D Systems社)を添加したDMEM/F12[50/50(v/v)、Mediatech社]からなるhESC培地中で、細胞を維持した。一度集密になったら、Tryple E Express(Life Technologies社)を用いて、細胞を室温で単一の細胞に解離させ、条件培地⁴⁸中、13万〜33万個の細胞/cm²の濃度でES品質のMatrigel(BD Sciences社)で被覆されたプレート上に移した。MEFから予め収集された条件培地に、h-bFGFを添加し、分化の誘導まで毎日変更した。RPMI/B27(Life Technologies社)中での誘導前に細胞を洗浄し、培地を、6〜12μMの範囲のCHIR99021(Stemgent社)を添加したRPMI/B27と交換して、分化を誘導した。誘導の正確に24時間後、培地を新鮮なRPMI/B27と交換した。融合の72時間後、各ウェル中の1mLの培地を、5μMのWnt阻害剤IWP-4(Stemgent社)を含む1mLの新鮮なRPMI/B27と混合した。培地を5日目に交換し、7日目にインスリン(Life Technologies社)を含むRPMI/B27に変更した後、解離までその後3日毎に交換した。37℃及び5%CO₂インキュベータ中、120分間にわたって、20〜30日目にII型コラゲナーゼ(1mg/ml)を用いて細胞単層を解離させた後、37℃の水浴中で5分間、Triple E Express中で更に解離させた。FACScalibur(BD Sciences社)を用いて細胞分析を達成して、NKX2-5 GFPリポーターにより決定される最終CM濃度を決定した。

【0551】

組織学的分析及び免疫蛍光染色。免疫蛍光染色を実施して、培養されたAngioChip組織の形態を評価した。組織を最初に室温で15分間、PBS中の4%(w/v)パラホルムアルデヒド中で固定した。次いで、組織をin situで透過処理し、PBS中の5%FBS及び0.25%Triton X100で1時間遮断した。次に、AngioChip心増組織を、4℃で一晩、一次抗体であるサルコメアα-アクチニン(マウス、1:200希釈、Sigma社)中でインキュベートした後、対応する二次抗体であるAlexa 488コンジュゲート化抗マウスIgG(1:200希釈、Sigma社)及びF-アクチン(ファロイジン660コンジュゲート化、Sigma社)と共に1時間インキュベートした。心臓組織を、Olympus FV5-PSU共焦点顕微鏡を用いて画像化した。AngioChip肝臓組織を、最初にCFDAで標識した後、上記のように固定し、F-アクチン(ファロイジン660コンジュゲート化、Sigma社)で1時間染色した。血管構造を可視化するために、内皮化されたAngioChip足場を4%PFA中で固定し、5%FBS中で1時間遮断した。次いで、足場を一次抗体であるCD31(マウス、1:200希釈、Sigma社)中でインキュベートした後、二次抗体であるAlexa 647コンジュゲート化抗マウスIgG(1:200希釈、Sigma社)と共にインキュベートした。生細胞及び死細胞の染色を、37℃で30分間、PBS中のカルボキシフルオレセインジアセテート(CFDA、1:1000希釈、Invitrogen社)及びヨウ化プロピジウム(PI、Invitrogen社)を用いて実施した。生細胞及び死細胞が染色された心臓組織の横断面を可視化するために、組織を横に半分にスライスし、手動で回転させて、横断面を示した。内皮細胞と実質細胞の両方を可視化するために、Pathology Research Program Laboratory of Toronto University Health Networkでの組織学的分析のために、培養された組織を4℃で3日間、10%ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋し、4μmのスライスに切片化した。組織学的切片は、横方向の組織横断面を示し、ヘマトキシリン及びエオシン(H&E)、マッソントリクローム染料、CD31、又はアルブミンを用いて染色した。

【0552】

尿素アッセイ。AngioChip肝臓組織を、主要ウェル中、10mM重炭酸アンモニウムを含有する1mLの肝細胞培地と共にインキュベートし、入口ウェルから、10mM重炭酸アンモニウムを含有する1mLの内皮細胞培地を灌流した。それぞれ24時間のインキュベーション後、主要ウェル及び出口ウェルからの培地を収集した。培地を簡単に遠心分離(300×gで5分間)して細胞を除去し、-20℃で凍結した。製造業者の説明書に従ってQuantiChrom Ureaアッセイキット(BioAssay Systems社)を用いて、尿素を検出した。典型的には、検出のために培地を希釈しないまま用いた。

【0553】

肝臓薬物試験。培養の3日目に、肝細胞培養培地中のテルフェナジン(10μM、Sigma社)を入口ウェルに入れ、0.7μL/分(0.62dyne/cm²、Re、0.01)で内皮化された肝臓組織を介して24時間灌流した。24時間のインキュベーション後、入口ウェル、中央ウェル、及び出口ウェル中の培地を収集し、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)を用いてフェキソフェナジンの濃度について分析し、標準曲線と相関付けた。最初に、DMSOを用いて薬物を溶解させた。培地中のDMSOの最終濃度は常に0.1%未満であった。

【0554】

工学的に作製された心臓組織の機能的特徴付け。AngioChip心臓組織を刺激し、その電気的興奮性パラメータを測定するために、1cm離した2つのカーボン電極を、それぞれの主要ウェル中、組織の反対側に同時に置いた。電極を、白金ワイヤを用いて外部電気刺激装置(Grass社s88x)に接続した。2ms持続時間及び1パルス/秒の周波数の単相パルスを用いて、興奮閾値(視野中の組織の75%の同期的収縮を観察することができる最小電圧)を最初に決定した。次いで、最大捕捉率(最大鼓動周波数)を、決定された興奮閾値電圧の200%で決定した。組織収縮の振幅を、収縮間で工学的に作製された組織における幅の変化から決定した。組織再モデリングの進行を評価するために、心臓組織の明視野画像を、細胞播種後最初の5日間、毎日撮影した。中心短端にわたる組織の幅を、ImageJを用いて画像から測定した。

【0555】

光学マッピング。蛍光画像化を用いる、IDL(Exelis社、McLean VA、USA)で書かれた特注プログラムを用いて、活性化マップを生成した。カルシウム染料Fluo-4を使用し、482nmで帯域通過フィルタリングされたShort Arc Mercury光源(X-Cite Exacte、Lumen Dynamics社、Mississauga ON、Canada)を用いて励起し、1.6〜2.5×の範囲の光学倍率を有する蛍光マクロズーム顕微鏡系(MVX-10、Olympus Corporation社、Tokyo、Japan)中に取り付けられた488nmロングパスフィルター(Semrock Corp社、Rochester NY、USA)により放射を測定した。蛍光を、200フレーム/秒で高速CMOSカメラ(Micam-L、Scimedia USA社、Costa Mea CA、USA)を用いて記録した。1cm²のセンサーは100×100ピクセルを有し、40〜60μm/ピクセルの解像度が得られた。

【0556】

ラクトースデヒドロゲナーゼ(LDH)アッセイ。AngioChip心臓組織を、0.7μL/分(0.62dyne/cm²、Re:0.01)での内蔵型ネットワークを介する培地灌流を用いて、又は用いずに心筋組織培地を用いて培養した。組織が存在する中央ウェルから、1mLの心筋細胞培地を収集し、6日間にわたって毎日新しい培地と置きかえた。収集された培地を、製造業者の説明書に従ってLDH毒性アッセイキット(Cayman Chemical社)を用いてラクトースデヒドロゲナーゼ(LDH)濃度について分析し、標準曲線と相関付けた。

【0557】

心臓薬物試験。培養の7日目に、心臓組織の自発的収縮を、明視野ビデオとして記録した。次いで、心臓培養培地中のエピネフリン(10μM、Sigma社)又はジゴキシン(10μM、Sigma社)を入口ウェルに入れ、内皮化された心臓組織を介して30分間、0.7μL/分(0.62dyne/cm²、Re:0.01)で灌流した。30分間のインキュベーション後、心臓組織の自発的収縮を、再度明視野ビデオとして記録した。imageJを用いて、記録されたビデオから収縮の周波数を分析した。DMSOを用いて、薬物を溶解した。培養培地中のDMSOの最終濃度を、0.1%(v/v)未満に希釈した。

【0558】

ラット大腿血管手術。以下の手順は全て、Committee on Animal Careにより認可されたプロトコールの下で、Department of Comparative Medicine Animal Facility、University of Torontoで実施される。Lewis新生児ラット心筋細胞と共に培養されたAngioChip足場を7日目に埋め込み実験のために用いた。AngioChip足場を、in vivo実験のために内皮化しなかった。第1に、Charles River社からの成体オスLewisラット(150〜250g)を、1L/分の流量で1〜3%イソフルランを用いて麻酔した。鎮痛剤を投与し(5mg/kgのケトプロフェン、SQ)、両方の後肢を手術のために調製した。外科的手順のために、解剖顕微鏡を用いて、後肢の拡大図を得た。皮膚の毛を剃り、膝から開始して大腿内側まで約2cm長の切り口を左脚上で作製した。次いで、皮下脂肪組織及び下にある神経血管束を示した。大腿動脈及び静脈を切開し、神経から分離させた。動脈バイパス構成のために、大腿動脈の断片(長さ約1.5cm)を完全に露出させ、AngioChip心臓組織の挿入のために結紮した。動脈の2つの末端を、顕微鏡下近似クランプでクランプして、手術中に一時的に血流を停止させた。1つの25ゲージカフ(ポリイミドチューブ)を動脈のそれぞれの末端に挿入し、7-0縫合糸で固定した。生分解性手術用カフを、将来の適用において用いることもできる。次いで、AngioChip心臓組織の入口及び出口をカフ中に挿入し、組織接着剤(シアノアクリレート)で密封した。次いで、クランプを除去し、血液灌流を確立した。動脈-静脈構成のために、大腿動脈及び大腿静脈の断片(長さ約5mm)を完全に露出し、AngioChip心臓組織の挿入のために結紮した。動脈及び静脈の2つの末端を、顕微鏡下近似クランプでクランプして、手術中に一時的に血流を停止させた。1つの25ゲージカフ(ポリイミドチューブ)を動脈のそれぞれの末端に挿入し、7-0縫合糸で固定した。動脈及び静脈の底部末端を7-0縫合糸で固定した。次いで、AngioChip心臓組織の入口及び出口をカフ中に挿入し、組織接着剤(シアノアクリレート)で密封した。次いで、クランプを除去し、血液灌流を再確立した。最後に、別の心臓組織パッチを、対照として役立つように同様の様式であるが吻合せずに皮下的に右脚に埋め込んだ。術後疼痛の管理のために、ラットは2日間、ケトプロフェン(5mg/kg、毎日皮下注射した)を受けた。1週の時点で、動物を人道的に安楽死させ、組織切片化のために組織埋込み体を単離した。

【0559】

統計分析。実験群間の有意差を、独立両側Studentのt検定を用いて決定した。図59jにおいては、出口ウェル中のフェキソフェナジン濃度は増大するだけと予想され、フェキソフェナジンを含有しない入口ウェル対照より低くなることはないため、対になった片側Studentのt検定を用いた。Studentの検定に加えて、図59iにおいては、Sigma Plotにおける三元配置ANOVAを用いて統計も行った。正規性検定(Shapiro-Wilk)及びペアワイズ多重比較手順(Holm-Sidak法)を用いた。全ての統計検定についてP<0.05が有意であると考えた。

【0560】

適用例
実施例において本明細書に開示される例示的デバイスは、様々な組織構造の培養及び生成にとって好適であり得る。細胞がin vivoで通常はそうするように成熟及び機能することができるように、in vivoで見出される天然の組織構造を模倣するか、又は再現するin vitroのプラットフォームを提供するために、開示されるデバイスを設計することができる。

【0561】

様々な例において、開示されるデバイスは、特に、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞等の筋肉細胞を含む様々な組織、並びにニューロン等の興奮性組織及び肝細胞等の豊富な血管構造を必要とし得る細胞の培養にとって好適であってもよい。

【0562】

様々な例において、開示されるデバイスは、特に、いくつかの異なる区画を有する人体チップを構築するため、並びに動物又はヒト患者への直接的吻合及び埋め込みのための、in vitroでの薬物試験を含む様々な適用にとって好適であってよい。

【0563】

上記の本開示の実施形態は、例に過ぎないことが意図される。本開示を、他の特定の形態で具体化することができる。本開示に対する変化、改変及び変更を、本開示の意図される範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に開示され、示される系、デバイス及びプロセスは、特定数のエレメント/成分、系、デバイス及びアセンブリを含んでもよく、さらなる、又はより少ない数のそのようなエレメント/成分を含むように改変することもできる。例えば、任意の開示されるエレメント/成分は単数形として言及してもよい一方、本明細書に開示される実施形態を、複数のそのようなエレメント/成分を含むように改変することができる。1つ又は複数の上記の実施形態から選択される特徴を組み合わせて、明示的に記載されない代替的な実施形態を作出することができる。開示される範囲内の全ての値及びサブ範囲も開示される。本明細書に記載の主題は、技術の全ての好適な変化を対象にし、包含することを意図する。記載される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0564】

(実施例5)
アンギオチューブ
序論
本実施例では、本発明者らは、アンギオチューブと命名された灌流可能なマイクロチューブが包埋された96ウェルプレートであるAngioTubeプレートを提唱する。包埋されたアンギオチューブを一晩で急速に内皮化させて、血管模倣体を形成させることができる。アンギオチューブの周囲に、心筋細胞、肝細胞、平滑筋、及び有足細胞等の様々な細胞を集合させて、機能的3-D組織を形成させることができる。この単純な構成を普遍的に適用して、様々な組織型に3-D血管インタフェースを組み込むことができる。アンギオチューブは、小さい生体分子と大きい生体分子の交換のためのパターン化された10μmの微小孔を有する薄いチャネル壁(25〜50μm)を有し、並びに血管インタフェースを横断する、単球等の細胞の移動を可能にする。従って、血管壁を横断する細胞間相互作用、血管透過性、及び走化性を、全て試験することができる。

【0565】

実質組織の受動的張力及び能動的収縮の測定を可能にするカンチレバー構造等の、さらなる外部的特徴をアンギオチューブ上に組み込むこともできる。この特徴は、平滑筋組織の収縮及び弛緩並びに心筋組織の能動的収縮を検査する際に重要である。この型のリードアウトは、外部刺激に対する価値ある組織レベル応答を提供し、組織を破壊することなくオンラインで連続的に実施することができる。

【0566】

最後に、アンギオチューブは複数のウェルを介して接続する96ウェルプレート内に包埋されるため、異なる型の組織を、異なるウェル内の同じアンギオチューブの周囲で培養することができる。同じアンギオチューブを介して、複数の組織単位は自動的に一緒に連結されるようになり、ユーザーはin vitroでの統合されたヒト生理を再現する臓器間レベルの相互作用を容易に精査することができる。例えば、多くの薬物は、それらが他の重要臓器に送達される前に、肝臓によって複数の形態に変換及びプロセシングされる。薬物は初期スクリーニング中にはその元の形態で非毒性的であり得るが、動物又はヒト試験においては毒性的になる。従って、肝臓組織単位と他の臓器単位との統合は、初期スクリーニング段階で臓器間レベルの毒性を示す可能性がある。

【0567】

予備的結果
AngioTubeマルチウェル灌流可能系は、各チャンバーがウェル内に配置された透過可能/灌流可能なチューブの周囲で3D組織鎖を播種、増殖させるための1つ又は複数のウェルを含有する、チャンバーのアレイを含む(図75)。各チャンバーはまた、組織鎖を固定するための少なくとも2つの対立するエレメントを含有してもよく、3D組織鎖の収縮/弛緩サイクル中にその動きを識別及び測定することができる(図75)。また、チャンバーを、心臓組織を刺激するための電極と共に構成することもできる。

【0568】

プレートをある角度に傾斜させ、従って、入口ウェルと出口ウェルとの間の圧力水頭差を生成することによって入口ウェルから出口ウェルに向かってアンギオチューブを灌流することができる。図76は、バイオリアクターの傾斜高さの関数としての流量(μl/分)又は剪断応力(dyne/cm²)により測定されるAngioTubeマルチウェル灌流可能バイオリアクターの受動的灌流の結果を示す。PBSをアンギオチューブに灌流させた。

【0569】

AngioTubeバイオリアクターの単一のチャンバー中での3D組織鎖の発達の時間経過を示すために、コラーゲン/Matrigelマトリックス中のAngioTubeにラット心筋細胞を投入した(図77)。一連の最初の画像は、細胞がバイオリアクターチャンバー中に最初に播種される点を示す。時間が進行するにつれて、細胞は増殖し、可撓性エレメント間で組織接続を維持しながら、チャンバー中の2つの可撓性カンチレバーエレメントに向かってクラスター化し始める。写真に示される特定の実施形態は、1つの実施形態のみであり、他の構成も本発明によって企図される。例えば、異なる形状及び/又は長さ(例えば、曲線型、丸型、非直線型、平面型、丸い、曲がった、厚さ)を有する可撓性カンチレバーエレメントを形成させ、カンチレバー移動の測定及び/又は検出を検出することができるように、異なる角度又は配向で透過性チューブエレメントに結合させることができる。チャンバーはまた、心臓細胞を刺激するための電極を含有してもよい。右側のバーは、3D組織鎖の形成中に観察することができるカンチレバー移動の程度を示す。

【0570】

組織鎖の光学顕微鏡画像は、カンチレバーの周囲を包む組織を示す(図78、左の画像)。AngioTubeの周囲に形成された3-D組織鎖の形態を示すために、組織をサルコメア-α-アクチニン及びF-アクチンで染色し(図78)、組織鎖の細胞の分布及び形態及び配向を示した。

【0571】

カンチレバーを用いて心臓組織鎖の能動的収縮を検出することができることを証明するために、本発明者らは、播種後の増殖の5日後及び10日後にカンチレバー移動を測定した(ピクセルにより測定される)(図79)。本発明者らは、カンチレバーの湾曲の程度の増加を見た。この傾向は、時間と共に組織鎖の成熟を示す。

【0572】

結論
アンギオチューブプレートは、様々な型の組織を作出するために普遍的構成を用いる多用途のプラットフォームである。その構成は単純であるが、3-D環境における内蔵型血管インタフェースにわたる複雑な細胞相互作用を再現することができる。最も重要なことに、その設定は多臓器構成に拡大するために天然に適合化される。従来の96ウェルプレート形式のアンギオチューブプレートも、ロボット液体分注装置及びマルチウェルプレートリーダー等の、高スループット薬物毒性スクリーニングにおける存在する産業基盤に容易に適合化される。

【0573】

(実施例6)
バイオワイヤ(in vitroでの慢性薬物曝露のヒト幹細胞由来心臓モデル)
疾患の分子ベースにおける重要な洞察を提供する際に、動物モデル系が有益であった。そのような情報はヒト疾患の研究に上手く適用されてきたが、この翻訳はヒト細胞に基づくモデルの利用可能性によって有意に強化される。ヒト心筋細胞の生理はげっ歯類とは有意に異なるため、これは心血管疾患にとって特に重要である。ここで、本発明者らは、組織工学及びヒト胚性幹細胞由来心筋細胞(hESC-CM)を介してヒト心筋の3次元モデルを使用して、hESC-CMがイソプロテレノール、エンドセリン-1又はアンギオテンシンIIを用いる慢性処置に対して応答し、慢性薬物曝露と適合する変化を受けることができるかどうかを問題にした。本発明者らは、イソプロテレノール、エンドセリン-1又はアンギオテンシンIIで処理されたhESC-CMが、筋原線維整列の破壊、細胞サイズの増大、及び収縮力の有意な低下を示したことを示す。イソプロテレノール処理されたhESC-CM組織は、ヒト心不全の現在の至適基準バイオマーカーである、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)及び心房性ナトリウム利尿因子(ANF)遺伝子発現の誘導を示す。BNPはまた、イソプロテレノールとエンドセリン-1の両方で処理された細胞の条件培地中にも見出される。これは、hESC-CMが適切な環境ストレスシグナルに応答し、in vivoでの慢性薬物曝露と適合する変化を受けることができることを示している。

【0574】

序論
心疾患をモデル化し、新しい薬物の安全性及び有効性を試験するためには、動物モデルが一般的に用いられる。相対的な入手可能性及びゲノムを正確に操作する可能性のため、マウスが最も一般的に用いられる動物モデルである[1]。しかしながら、マウスとヒトの心臓生理には有意差がある。例えば、マウスの心拍はヒトよりも10倍速い。α-及びβ-ミオシン重鎖等の収縮タンパク質も、マウスとヒトにおいて示差的発現を有する。更に、マウス心筋細胞の再分極は、I_to、I_K,slow1、I_K,slow2、I_SSイオンチャネルによって主に駆動されるが、ヒト心筋細胞においては、それはI_kr及びI_ksによって主に駆動される[1〜3]。これは、薬物に対する異なる応答をもたらし、従って、薬物スクリーニングモデルとしてのその効率的使用を阻害し得る。

【0575】

利用可能なヒト薬物スクリーニングモデルは、遺伝的に不安定であり得る、及び/又は心臓細胞の特異性を欠く腫瘍由来細胞株又は患者の試料に依拠する。今までのところ、心臓毒性/不整脈の研究の多くは、単一のイオンチャネル遺伝子が非心臓細胞中で発現される異種発現系に依拠してきた。これらのモデルは心筋細胞の多くの特徴を複製することができず、従って、ヒト組織のin vitroモデルを生成するには理想的ではないため、これらのモデルはいくつかの制限を有する。

【0576】

ヒト胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞(それぞれ、hESC及びiPSC)の生成並びにそれらから真正な心筋細胞に分化する可能性[4〜6]は、健康な[7、8]及び疾患を有するヒト心臓組織[9、10]のin vitroモデルを作出するための例外的な機会である。従って、hESC及びiPSC由来心筋細胞(CM)は、前臨床薬物スクリーニングのためのプラットフォームの開発及び臨床使用のための最適化のための可能性を保持する[7、11]。これらの技術を用いて、動物モデルにおいては毒性的でないことが多いがヒト心臓細胞に対する毒性を示し得る薬物をトリアージすることができる。

【0577】

疾患を有する心筋細胞のヒトモデルは、in vitroで疾患の特徴を複製する特異的突然変異を有する細胞株の使用に依拠してきた。最近では、QT延長症候群等の心臓不整脈をモデル化するために、ヒトiPSC由来CMが用いられている[12〜14]。この珍しい遺伝的障害のため、心筋が再分極するためにより長くかかり、突然死をもたらし得る不整脈をもたらす。QT延長症候群患者から誘導されるiPSC株に由来する心筋細胞を用いて、著者らは、生成されたCMが疾患の電気生理学的シグネチャーを示し、発症機構の研究及び治療薬試験のための強力な系を確立することを証明した。また、様々な遺伝性心臓障害を有する患者からのヒトiPSC-CMのライブラリーを用いて、異なる遺伝的背景の患者に関する心臓薬物毒性に対する感受性の差異をモデル化し、前臨床薬物スクリーニングのためにヒト細胞を使用する重要性を強調した[15]。しかしながら、非遺伝的心筋症の高い有病率のため、健康なhESC-CMは新しい治療剤の有効性のためのin vitroスクリーニングプラットフォームとしての使用のための大きな可能性を有するため、健康なhESC-CMからの非遺伝的疾患モデルの開発は非常に有益である。

【0578】

心筋症は、特に、心筋梗塞、遺伝子突然変異、及び慢性薬物曝露の結果であり得る。イソプロテレノール、アンギオテンシンII及びエンドセリン-1は、動物モデルにおいて心筋症を再現するために上手く用いられてきた分子である。従って、それらは慢性薬物曝露のため心筋症と適合する副作用のin vitroでのスクリーニングのための手段としてのヒト幹細胞由来CMの適用可能性を調査するための手段としての使用のための好適な候補である。

【0579】

慢性薬物適用の研究にとって好適な心臓組織モデルとして役立つhESC-CMの可能性を評価するために、本発明者らは、hESC-CMから3次元心臓組織を生成し、イソプロテレノール、エンドセリン-1又はアンギオテンシンIIへの慢性曝露に対するその応答を調査した。これらの薬剤で処理した後、ヒト組織は、サルコメア組織化の破壊、胎児遺伝子プログラムの誘導[脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)及び心房性ナトリウム利尿因子(ANF)の上方調節]、BNPの分泌、細胞サイズの増大並びに収縮力の有意な低下等の、病的肥大の特質を示す。これは、hESC-CMがin vivoモデルと適合する様式で慢性薬物曝露に応答することができ、慢性薬物曝露のための前臨床適用において有用であり得ることを示している。

【0580】

材料及び方法
ヒト胚性幹細胞の維持及び分化。本発明者らは、記載[5、16]されたように維持されたHes2 hESC株から誘導された心筋細胞を用いた。胚様体(EB)を、以前に記載[5、16]のように心血管系列に分化させた。簡単に述べると、EBを、BMP4(1ng/ml)を含有するStemPro-34(Invitrogen社)培地中での培養により生成した。1日目に、EBを収獲し、誘導培地[StemPro-34、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF;2.5ng/ml)、アクチビンA(6ng/ml)及びBMP4(10ng/ml)]中に懸濁した。4日目に、誘導培地からEBを収獲し、血管内皮成長因子(VEGF;10ng/ml)及びDKK1(150ng/ml)を添加したStemPro-34中で再培養した。8日目に、培地を再度変更し、実験の持続期間にわたってVEGF(20ng/ml)及びbFGF(10ng/ml)を含有するStemPro-34中でEBを培養した。培養物を、最初の12日間については低酸素環境(5%CO₂、5%O₂)中で維持した後、残りの培養期間については5%CO₂中に移した。EBを、バイオワイヤ中への播種のために20日目(EBd20)に解離させた。

【0581】

バイオワイヤの生成:20日目のEBを、37℃で2時間、ハンクス平衡塩溶液(NaCl、136mM;NaHCO₃、4.16mM;Na₃PO₄、0.34mM;KCl、5.36mM;KH₂PO₄、0.44mM;デキストロース、5.55mM;HEPES、5mM)中のI型コラゲナーゼ(1mg/ml;Worthington社)及びDNAse(1mg/ml、CalBiochem社)中でインキュベートした。EBを遠心分離(800r.p.m.、5分)し、37℃で5分間、トリプシン(0.25%、Gibco社)と共にインキュベートし、穏やかにピペッティングして、細胞を解離させた。解離後、細胞を遠心分離(1,000r.p.m.、5分)し、計数し、0.5×10⁶個の細胞/長さ0.5cmのワイヤで播種した。この比を、より長いバイオワイヤの生成のために維持した。細胞懸濁液をPDMS鋳型の主要チャネル中にピペッティングすることにより、1X M199培地+10%の成長因子を減少させたMatrigel(BD Biosciences社)中、24.9mMのグルコース、23.81mMのNaHCO₃、14.34mMのNaOH、10mMのHEPES中のI型コラーゲンゲル(4μl/0.5cmワイヤ長;2.1mg/mlのラット尾部I型コラーゲン;BD Biosciences社)中に細胞を播種した。播種後、細胞を7日間培養物中で保持して、コラーゲンマトリックスを再モデリングさせ、記載のように縫合糸の周囲に集合させた[8]。

【0582】

7日間の事前培養後、バイオワイヤを6ウェルプレートに無作為に移し、イソプロテレノール(100nM)、アンギオテンシンII(200nM[17])又はエンドセリン-1(150nM)(Sigma社)の非存在下又は存在下で7日間、StemPro-34培地中で培養した。記載[18]のようにマウスの慢性処置を複製するために、このプロトコールを選択した。単一細胞分析のために、バイオワイヤを、37℃で4時間、ハンクス平衡塩溶液(NaCl、136mM;NaHCO₃、4.16mM;Na₃PO₄、0.34mM; KCl、5.36mM;KH₂PO₄、0.44mM;デキストロース、5.55mM;HEPES、5mM)中のI型コラゲナーゼ(1mg/ml;Sigma社)及びDNAse(1mg/ml、CalBiochem社)で消化し、遠心分離(800r.p.m.、5分)し、37℃で5分間、トリプシン(0.25%、Gibco社)と共にインキュベートし、穏やかにピペッティングして、細胞を解離させた。単離された単一細胞を、Matrigelで被覆されたカバーガラス上に播種した後、細胞面積及びカルシウム移行測定を実施した。

【0583】

或いは、工学的に作製された3D心臓組織により生成される力を測定するために、8つの微小組織を収納することができるPDMS組織チャンバーからなるバイオリアクターを用いた。それぞれの工学的に作製された心臓組織は、以前に記載[19]のように25μLのI型コラーゲンヒドロゲル(3.0mg/mL)中に懸濁された、EBの解離から得られた1.5×10⁶個の細胞からなっていた。簡単に述べると、PDMSチャンバーの各ウェルは、ゲル圧縮中の各心臓組織のための固定点として働く2つのポストを有していた。更に、ポストの偏向を追跡することにより、生成された心臓組織の収縮力を決定した。心臓組織は、7日間の事前培養、次いで、エンドセリン-1、アンギオテンシンII又はイソプロテレノールによる7日間の処理を受けた。処理後、CellSensソフトウェア(Olympus社)を用いて0.5又は1Hzでペーシングしながら、各心臓組織のポストの上面を、1つずつ、ビデオ記録することにより、各心臓組織の収縮力を決定した。次いで、各ビデオを一連のTiff画像としてエクスポートし、ImageJ中で開いた。ImageJのプラグインSpotTracker[20]を用いて、ポストが移動した距離を決定した。カンチレバービーム-部分均一偏向の重ね合わせの方法を用いて、点の力を計算した後、組織横断面積に対して正規化して(環状と推定される)、面積あたりの心臓の力を決定した。

【0584】

評価。組織集合の進行を、様々なレベル:微細構造レベル(サルコメア構造)、細胞レベル(細胞のサイズ及び形状、増殖、心臓タンパク質:アクチン、トロポニンT及びα-アクチニンの分布)、分子レベル(遺伝子発現レベル)、並びに機能レベル(収縮力、伝導速度、Ca²⁺ハンドリング)で評価した。

【0585】

免疫染色及び蛍光顕微鏡観察。以下の抗体:マウス抗cTNT(1:100、Thermo Scientific社;MS-295-P1)、マウス抗α-アクチニン(1:200、Abcam社、ab9465)、抗マウスAlexa Fluor 488(1:400、Invitrogen社、A21202)、抗ウサギTRITC(1:400、Invitrogen社、81-6114)を用いて、免疫染色を実施した。DAPIを用いて核を対抗染色した。ファロイジンAlexa Fluor 660(1:1000、Invitrogen社、A22285)を用いて、アクチン線維を検出した。染色された細胞を、蛍光顕微鏡(Leica社、CTR6000)を用いて可視化し、Leica Application Suiteソフトウェアを用いて画像を捕捉した。共焦点顕微鏡観察のために、蛍光共焦点顕微鏡(Zeiss社、LSM-510)を用いて細胞を可視化した。

【0586】

透過型電子顕微鏡観察(TEM)。組織を0.1M PBS中の4%パラホルムアルデヒド、1%グルタルアルデヒドで少なくとも1時間固定し、PBS pH7.2で3回洗浄した。後固定を0.1M PBS、pH7.2中の1%四酸化オスミウムで1時間行い、25〜100%のエタノール系列を用いて脱水した。組織を、Epon樹脂を用いて浸潤させ、40℃で48時間、プラスチック皿の中で重合させた。組織を、切片化の後、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で染色した。Hitachi社H-7000透過型電子顕微鏡で画像化を実施した。

【0587】

光学マッピング。バイオワイヤを、温Tyrode溶液(NaCl 118mM、KCl 4.7mM、CaCl₂ 1.25mM、MgSO₄ 0.6mM、KH₂PO₄ 1.2mM、NaHCO₃ 25mM、グルコース6mM;使用直前に少なくとも20分間、カルボゲン95%O₂、5%CO₂で気泡化することにより酸素を供給した)中、37℃で20分間、電圧感受性染料(ジ-4-ANEPPS 5μM、Invitrogen社)と共にインキュベートした。染料の蛍光を、高速CMOSカメラ(Ultima-L、Scimedia社)を装備したMVX-10 Olympus蛍光顕微鏡上で記録した[21、22]。1cmのセンサーは100×100ピクセルの解像度を有し、空間解像度は50〜100μm/ピクセルで変化した。画像化を、200フレーム/sで実施した。緑色フィルター(Olympus社、U-MWIG2フィルターキューブ)を有する水銀アーク源(X-Cite Exacte)を用いて蛍光を励起した。マイクロマニピュレーター(World Precision Instruments社)上に載せたステンレススチール針に挿入された2つの微細なワイヤ(AWG#32)から作られた双極性電極を用いて、構築物を電気的に点刺激した。バイオワイヤを含有するプレートを、加熱したプレート(MATS-U55S、Olympus社)上に置き、温度を38℃に調節した。データ分析を、BrainVisionソフトウェア(Scimedia社)を用いて実施した。

【0588】

カルシウム移行測定。ハンクス平衡塩溶液(NaCl、136mM;NaHCO₃、4.16mM;Na₃PO₄、0.34mM;KCl、5.36mM;KH₂PO₄、0.44mM;デキストロース、5.55mM;HEPES、5mM)中のI型コラゲナーゼ(1mg/ml;Worthington社)及びDNAse(1mg/ml、CalBiochem社)と共に37℃で2時間インキュベートすることにより、バイオワイヤを解離させた。次いで、バイオワイヤを遠心分離(800r.p.m.、5分)し、37℃で5分間、トリプシン(0.25%、Gibco社)と共にインキュベートし、穏やかにピペッティングして細胞を解離させた。解離した心筋細胞を、成長因子非含有Matrigel(RPMI培地中に1:60希釈された)で被覆された25mmの顕微鏡カバーガラス上に一晩プレーティングした。次いで、細胞を、培養培地中の5μMのRhod-3 AMカルシウム画像化染料(Invitrogen社)と共に37℃で2時間インキュベートした。続いて、心筋細胞を、無染料培地で2回洗浄し、インキュベータ中に30分間戻した。レーザー走査共焦点顕微鏡(Zeiss社、LSM 510)を用いて、蛍光強度を測定した。Rhod-3 AMを充填した心筋細胞を含有するカバーガラスを特殊チャンバー上に移動させ、きつく締め付けた。約1.8〜1.9mlの培養培地をチャンバー中に添加し、顕微鏡上の温度制御されたプレート(37℃)上に置いた。細胞質ゾルカルシウム濃度の移行変動を示す、Rhod-3 AM蛍光強度の変化を、フレーム及びラインスキャンモデルにおいて記録した。画像及び蛍光データを、Zeissソフトウェアにより獲得した。蛍光データを、Origin 8.5ソフトウェアを用いて分析した。フルオ-4 AMを充填した後、蛍光シグナル(F)をベースライン蛍光に対して正規化した。シグナルの上昇フェーズを、線形モデルにより適合させたが、シグナルの減衰フェーズを、Offsetモデルを用いるExpDecayにより適合させた。

【0589】

ELISA。条件培地からの可溶性BNPの定量化を、市販のELISAキットを用いて実施した。

【0590】

定量的RT-PCR。RT-PCRを、以前に記載[23]されたように実施した。全RNAを、High Pure RNA Isolation Kit(Roche社)を用いて調製し、RNase非含有DNase(Roche社)で処理した。SuperScript VILO(Invitrogen社)と共にランダムヘキサマー及びオリゴ(dT)を用いて、RNAをcDNAに逆転写した。LightCycler 480 SYBR Green I Master(Roche社)を用いて、LightCycler 480(Roche社)上でRT-qPCRを実施した。発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子TATAボックス結合タンパク質(TBP)又はグリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)に対して正規化した。

【0591】

統計分析。SigmaPlot 12.0を用いて、統計分析を実施した。二元配置ANOVAを用いて統計を行った。正規性検定(Komogorov-Smirnov)を、等分散検定により行った。正規性検定が失敗した場合、Ranks上のKruskal-Wallis一元配置ANOVAを実施した。全ての統計検定について、P<0.05を有意と考えた。

【0592】

結果
心臓の構造は高度に洗練されている。in vitroでその特徴のいくつかを複製するために、本発明者らは、本発明者らのin vitroアッセイにおいて以前に記載された[8]、バイオワイヤ等の3次元の自己集合した心臓組織模倣体を用いた。胚様体の解離から得られたヒトESC由来CMを、I型コラーゲンゲル中に播種した。図82Aに記載されるような、マトリックス再モデリング及びゲル圧縮[8]を可能にする、培養物中で1週間後、1週間にわたるイソプロテレノール(ISO、100nM)、エンドセリン-1(Et-1、150nM[17、24])、又はアンギオテンシンII(AngII、200nM)を用いる処理により、バイオワイヤを異なる化合物に慢性的に曝露した。心臓毒性及びin vivoでその結果生じる心臓肥大の原因となる慢性処置を複製するために、このプロトコールを選択した[18]。次いで、本発明者らは、サルコメア構造、胎児遺伝子プログラムの発現、脳性ナトリウム利尿ペプチド(BNP)及びトロポニンの分泌、細胞サイズ及び収縮力の変化を分析することにより、ヒトESC由来CMの変化がin vivoで記載される変化と一致するかどうかを評価した。

【0593】

共焦点顕微鏡によるα-アクチニン、アクチン、心臓トロポニンT及びコネキシン43の分析により、ISOによる慢性処置が、処置されていないバイオワイヤ対照と比較してサルコメア構造の実質的破壊を引き起こすことが示された(図82B)。Et-1及びAngIIによる処置も、ISOよりも少ない程度であるが、α-アクチニン染色により示されるように、組織化された筋原線維線条パターンの破壊をもたらした(図82B)。透過型電子顕微鏡分析(図82C)により、未処理の対照と比較して、ISO、Et-1及びAngIIで処理されたhESC-CMにおける異なるZディスクの有意な非存在及び規定のサルコメア構造の欠如により示されるように、ヒトCM収縮装置におけるこれらの分子の破壊効果が確認された。

【0594】

有害な心臓効果を示す慢性薬物曝露は、胎児遺伝子プログラム、特に、BNP及び心房性ナトリウム利尿因子(ANF)の誘導をもたらし得る。本発明者らの試料中での胎児遺伝子プログラムの発現の分析により、ISOを用いる処理は未処理の対照と比較してANF及びBNP遺伝子発現を有意に誘導したが(図84)、AngII及びEt-1を用いる処理に関しては遺伝子発現の変化は検出されないことが示された。興味深いことに、初期及び後期時点での処理された細胞の条件培地の分析により、処理後既に2日目で、ISO及びEt-1条件におけるBNPの分布の、それぞれ、2.5倍及び5倍の増加が示された。培地変更の後、培地中のBNPのレベルを、2日目及び7日目で分析した。24時間だけ(BNPを48h条件付けられた培地中で測定した2日目の条件と比較して)の条件付けにも関わらず、7日目で、ISO及びEt-1処理条件で、それぞれ、70%及び7倍の増加を依然として検出することができた。AngII条件からの条件培地の分析は、ELISAにおけるBNPとAngIIとの交差反応性のため不可能であった。

【0595】

[8]に記載のように処理の終わりに細胞サイズの変化をバイオワイヤの解離により分析した。次いで、単一の細胞を、材料及び方法のセクションに記載されたようなMatrigel被覆ウェル上に低密度で播種し、CMマーカー心臓トロポニンTで染色した後、面積の測定を実施した。処理条件で細胞サイズが増大する傾向があった。ET-1で処理された細胞において細胞サイズの100%の増大が観察されたが、ISO及びAngIIで処理された細胞は、それぞれ、35%及び38%のサイズの増大を示した。

【0596】

次に、本発明者らは、それぞれの条件における3Dヒト心臓組織の収縮力を評価した。バイオワイヤ中での縫合糸の存在によって力測定ができないため、本発明者らは、偏向性ポストが3D心臓組織の収縮力を計算するために用いられるラット新生児心筋細胞[19]を用いて、本発明者らによって以前に開発及び検証されたプラットフォームを用いた。未処理の対照と比較して、全ての条件においてhESC由来CMの3D組織の収縮力の有意な低下があった(図86)。これは、図87に観察される収縮機構組織化の破壊と適合する。生細胞/死細胞の染色を用いる3D組織中の細胞生存能力の評価により、ISOと非処理対照との差異が示されなかった(図87)。培養の終わりでの点刺激の際に評価された伝導速度も、ISOと非処理対照との間で同じであった(図87)。更に、培養の終わりでのバイオワイヤから単離された単一細胞からのカルシウム移行の分析により、ISO処理された細胞と非処理細胞の両方が同様の特徴を示すことが示された。

【0597】

実施例6のための参考文献:以下の参考文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

【0598】

【表1A】

【0599】

【表1B】

【0600】

明細書で引用された参考文献
以下の参考文献のそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。
(参考文献)

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37A】

【図37B】

【図37C】

【図37D】

【図38】

【図39AB】

【図39C】

【図39D】

【図39E】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51A】

【図51B】

【図51C】

【図51D】

【図51E】

【図51F】

【図51G】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【図67】

【図68】

【図69】

【図70】

【図71】

【図72】

【図73】

【図74】

【図75】

【図76】

【図77】

【図78】

【図79】

【図80】

【図81】

【図82】

【図83】

【図84】

【図85】

【図86】

【図87】