特許 6874972 プロテオグリカン分析方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6874972

(24)【登録日】2021年4月26日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】プロテオグリカン分析方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 30/88 20060101AFI20210510BHJP

   G01N 30/74 20060101ALI20210510BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20210510BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20210510BHJP

   G01N 30/78 20060101ALI20210510BHJP

   C07K 1/16 20060101ALI20210510BHJP

   C07K 14/46 20060101ALI20210510BHJP

   C07K 14/47 20060101ALI20210510BHJP

   G01N 30/00 20060101ALI20210510BHJP

   G01N 1/10 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   G01N30/88 E

   G01N30/74 Z

   G01N30/74 E

   B01J20/281 G

   G01N30/26 A

   G01N30/78

   C07K1/16

   C07K14/46

   C07K14/47

   G01N30/00 B

   !G01N1/10 B

   !G01N1/10 H

【請求項の数】5

【全頁数】14

(21)【出願番号】特願2017-46295(P2017-46295)

(22)【出願日】2017年3月10日

(65)【公開番号】特開2018-151207(P2018-151207A)

(43)【公開日】2018年9月27日

【審査請求日】2020年3月5日

(73)【特許権者】

【識別番号】000119472

【氏名又は名称】一丸ファルコス株式会社

(72)【発明者】

【氏名】高橋 達治

(72)【発明者】

【氏名】小島 弘之

【審査官】 大瀧 真理

(56)【参考文献】

【文献】 特開２０１２−２３６７７６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１４−１４１５８０（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特開２０１６−１１３３８２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０９９２１６（ＷＯ，Ａ１）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｂ０１Ｊ ２０／２８１ − ３０／２９２

Ｇ０１Ｎ ３０／００ − ３０／９６

Ｃ０７Ｋ １／１６

Ｃ０７Ｋ １４／４６

Ｃ０７Ｋ １４／４７

Ｇ０１Ｎ １／１０

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記１）から３）の工程により軟骨または軟骨抽出物を含む組成物中のプロテオグリカンを定量する方法で、
１）プロテオグリカンを含む軟骨または軟骨抽出物を含む組成物中から水または水溶液で抽出し抽出物を回収する工程、
２）分子量分画膜を有する中空状容器にて遠心分離を行い、濃縮物を回収する工程、
３）サイズ排除クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣ法でプロテオグリカンと他の成分を分離し、２００から２８０ｎｍの波長のＵＶでプロテオグリカンを検出する工程、
当該分子量分画膜を有する中空状容器が分子量５万から１０万で篩い可能な容器であり、
サイズ排除クロマトグラフィーカラムの充填剤が、平均粒子径１０μｍ以上の充填剤であり、
当該クロマトグラフィーの移動相がｐＨ５．０から１０．０の緩衝液であり、
当該プロテオグリカンの分子量が１０万から２００万である、当該方法。

【請求項2】

下記１）から３）の工程により軟骨または軟骨抽出物を含む組成物中のプロテオグリカンを定量する方法で、
１）プロテオグリカンを含む軟骨または軟骨抽出物を含む組成物中から水または水溶液で抽出し抽出物を回収する工程、
２）分子量分画膜を有する中空状容器にて遠心分離を行い、濃縮物を回収する工程、
３）サイズ排除クロマトグラフィーを用いたＨＰＬＣ法でプロテオグリカンと他の成分を分離し、示差屈折率検出によりプロテオグリカンを検出する工程、
当該分子量分画膜を有する中空状容器が分子量５万から１０万で篩い可能な容器であり、
サイズ排除クロマトグラフィーカラムの充填剤が、平均粒子径１０μｍ以上の充填剤であり、
当該クロマトグラフィーの移動相がｐＨ５．０から１０．０の緩衝液であり、
当該プロテオグリカンの分子量が１０万から２００万である、当該方法。

【請求項3】

プロテオグリカンの検出を２００から２８０ｎｍの波長のＵＶ及び示差屈折率検出により行う、請求項１記載の方法。

【請求項4】

当該波長が、２００から２２０ｎｍである、請求項１又は３に記載の方法。

【請求項5】

当該濃縮物中にコンドロイチン硫酸を実質的に含まない、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、軟骨、軟骨抽出物中又は食品中に含まれるプロテオグリカンを精密に定量する方法、及び高純度のプロテオグリカンの回収に関するものである。

【背景技術】

【0002】

プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸と共に細胞外マトリックス中の基質を形成する主要な生体高分子であって、ヒトや牛などの哺乳動物、鮭や鮫など魚類の軟骨に含まれていることが知られており、プロテオグリカンを配合した健康食品、化粧品、プロテオグリカンの製造方法等が多く報告されている。また、プロテオグリカン自体の有用性も多く報告されており、分子量の低い５０ｋＤａ〜１０００ｋＤａのプロテオグリカンは軟骨分化促進作用やひざ関節改善作用、皮膚色素沈着抑制作用など報告されている（特許文献１）。

【0003】

一方、プロテオグリカンの分析については糖鎖部分のウロン酸をカルバゾール法、タンパク質部分を２８０ｎｍのＵＶ吸収で検出した分析方法が報告されているものの（特許文献２）、遊離のコンドロイチン硫酸やヒアルロン酸、コラーゲンが存在する低分子領域では利用できない問題があった。

【0004】

また、コンドロイチン硫酸やヒアルロン酸、コラーゲンを除くためＨＰＬＣにインジェクトする前処理として、透析後１００万以上の分子量で定量する方法があるがこれでは１００万以下の分子量のプロテオグリカンに対して定量する事はできない（特許文献３）。

【0005】

プロテオグリカンに対し特異的に働く抗体を作成した報告もあるが、費用も高く工業的には実現されていない。（特許文献４）

【先行技術文献】

【特許文献】

【0006】

【特許文献1】特開２０１６−１３８０６０

【特許文献2】特開２０１６−１２８４６７

【特許文献3】特開２００２−０６９０９７

【特許文献4】特開２０１６−１６０２２６

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0007】

本発明は、ＨＰＬＣを利用し、プロテオグリカンを含む組成物中の分子量１０万〜２００万のプロテオグリカンを定量する事を目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、遊離のコンドロイチン硫酸を徹底的に除くため透析、分子量分画、ＨＰＬＣ、電気泳動、比色法等様々な条件を検討した結果、分子量分画膜を有する中空状の容器で前処理を行えば、ほぼ全てのコンドロイチン硫酸を除き、高分子量から低分子量のプロテオグリカンのみを残す事を見出した。さらにサイズ排除クロマトグラフィーを利用し、最適な条件を選択することで分子量が近いヒアルロン酸、コラーゲンとも分離できることを新たに見出した。

【発明の効果】

【0009】

本発明の分析方法によれば、分子量１０万〜２００万のプロテオグリカンに対してＵＶまたは示差屈折で検出、もしくは画分を採取することにより、プロテオグリカンを含む組成物中の定量が可能となる。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】分子量分画前後のプロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末を分析対象とした、クロマトグラム

【図2】プロテオグリカン標準品の検量線

【図3】溶出溶媒のｐＨを変更したプロテオグリカンのクロマトグラム

【図4】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例２）

【図5】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例３）

【図6】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例４）

【図7】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例５）

【図8】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例６）

【図9】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例７）

【図10】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例８）

【図11】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例９）

【図12】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例１０）

【図13】食品組成物中のプロテオグリカンのクロマトグラム（実施例１１）

【発明を実施するための形態】

【0011】

本発明の分析対象である軟骨とはプロテオグリカンを含有することが知られている魚類や軟体動物などの水棲生物、鳥類若しくは哺乳類の軟骨組織を指し、特に鮭の頭部や、鮫のヒレ部の軟骨組織が分析対象として好ましい。また、軟骨抽出物とは前記軟骨をそのまま又は粉砕後の搾取物。又は、そののまま又は粉砕後の溶媒抽出物を指し、軟骨抽出物の形状としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状いずれの形状も含み、いずれの形状でも分析対象とすることができる。

【0012】

本発明における軟骨、軟骨抽出物、またはプロテオグリカンを含む組成物に用いる抽出溶媒としては水や水溶液を用いれば良く、水酸化ナトリウムや水酸化カリウムなどのアルカリ性の水溶液や、グアニジン塩酸や尿素、酢酸、クエン酸、硫酸、硝酸などの酸性の水溶液が好ましい。

【0013】

本発明における分子量分画膜を有する中空状容器とは、主にコンドロイチン硫酸を除き使用するための容器であって、５万〜１０万の間で分子篩いが可能な膜を有し、膜の篩いによって分析対象物のプロテオグリカン含量が減少しない条件に適合する容器であればよい。特に、遠心分離に対応している容器が好ましく、ミリポア社製のメンブレンアミコンウルトラ（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ）遠心式フィルターユニット、ジーエルサイエンス社製のモノスピンＭｏｎｏＳｐｉｎ、バイラッド社製のスピンカラム、ＧＥヘルスケアジャパン社製のＶｉｖａｓｐｉｎ、日本ポール社製のマクロセップアドバンス、ザルトリウス社製のビバスピン／ビバスピンｔｕｒｂｏなどを用いるとよい。

【0014】

本発明のＨＰＬＣ法におけるサイズ排除ゲルクロマトグラフィー用のカラムとしては、分析可能な分子量が１０万〜２００万に対応しているカラムを用いればよいが、分離能がよくなることから粒子径１０ μｍ以上の充填剤を含むカラムやタンパク分析用のカラムを使用することが好ましく、特に基材がメタクリレートポリマーのカラムを用いることが好ましい。

【0015】

検出はＵＶ検出器を使用し２００〜２８０ ｎｍであればプロテオグリカンを検出することができ、特に２００〜２２０ ｎｍのＵＶ波長で検出することが好ましい。また、プロテオグリカンのピークは標準品であるプロテオグリカン, サケ鼻軟骨由来（和光純薬工業製）を用意し、分析対象の試料とクロマトグラムを重ねほぼ同じ溶出範囲にピークがあれば、そのピークがプロテオグリカンを検出したピークであることが分かる。また、予めプロテオグリカンの標準品で検量線を作成することで、試料中のプロテオグリカンの定量も行う。

【0016】

本発明の分析方法が適用可能なプロテオグリカンを含む食品としては、液状、固形状、粉末状、ペースト状、ゼリー状、ゲル状、タブレット状のいかなる形態でもよく、必要に応じて食品を粉砕、搾取、抽出を行い、ＨＰＬＣ法を適用し分析することが可能である。

【0017】

本発明の分析対象であるプロテオグリカンを含有する各種組成物については組成全体に対し０．００１％程度以上あれば検出することができ定量することが可能である。

【実施例】

【0018】

以下の実施例は本発明におけるプロテオグリカン含有物の具体例であるが、本発明は以下実施例に限定されるものではない。

【0019】

実施例１：プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末中のプロテオグリカンの定量

【0020】

（サケ鼻軟骨からプロテオグリカンの回収）
−３０℃で冷凍保管したシロサケの頭部から摘出した鼻軟骨を４００ ｇ用意し、出発原料とした。４重量％の酢酸水溶液２０００ ｇに出発原料を投入し、撹拌しながら７２時間抽出した。
この溶出液をステンレススチールメッシュ（１５０ μｍ）でろ過し、不溶物を除去した。ろ液を透析膜にて十分に透析し、得られた液にデキストリンを加えて噴霧乾燥し、プロテオグリカン２０％調製したプロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末２０ ｇを得た。

【0021】

（分子量分画膜による分離）
前記プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出末２５ ｍｇに精製水を加えて５０ ｍＬ容量に調製し、この調製液１０ ｍＬをビバスピンｔｕｒｂｏ１５ １００，０００ ＭＷＣＯ（ザルトリウス社製）に量り取り、遠心分離（３０００ｒｐｍ、１０分）した。さらに上清に精製水１０ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を３回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料１とし、分子量分画を行わなかったプロテオグリカン溶液を試料２とした。

【0022】

（標準品によるプロテオグリカンの検量線作成）
プロテオグリカンの標準品（和光純薬工業製）２ ｍｇを精密に量り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて１０ ｍＬ容量に調製した（Ａ液）。Ａ液５ ｍＬを取り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて１０ ｍＬ容量に調製したもの、Ａ液２ ｍＬを取り、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）を加えて１０ ｍＬ容量に調製したもの及びＡ液をそれぞれ検量線作成用標準液とする。検液及び標準液について０．４５ μｍのメンブレンフィルターを通した後、次の操作条件で液体クロマトグラフィーを行い、得られた検量線からプロテオグリカン量を求めた。なお、標準品：プロテオグリカン,サケ鼻軟骨由来（和光純薬工業製）は、室温減圧デシケーター（シリカゲル）で３時間乾燥してから採取した。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所社製） 検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所製）

【0023】

（プロテオグリカンの定量）
試料１の濃縮液を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、１０ ｍＬ容量に調整した。試料２は、５ ｍｇをリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、１０ ｍＬ容量に調製し、各々０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所社製） 検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所製）

【0024】

（移動相の条件検討）
プロテオグリカンのＨＰＬＣ分析に適した移動相の条件を検討するため、プロテオグリカンの標準品（和光純薬工業製）２ ｍｇを精密に量り、リン酸緩衝液に１０ ｍＬの溶液になるよう調製し、０．４５ μｍのメンブレンフィルターを通した後、移動相のリン酸緩衝液でｐＨの条件を変更し以下操作条件でＨＰＬＣを行った。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０、８．０、９．６のいずれか）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所社製） 検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所製）

【0025】

（試験結果）
試料１と試料２を比較すると（図１）、分子量分画を行った試料１はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができた。これによって標準品の検量線（図２）を利用して定量も可能となった。また、プロテオグリカンのＨＰＬＣ分析に適した移動相の条件としてはｐＨ５．０〜１０．０程度であれば可能なことを確認した。（図３）

【0026】

実施例２：食品組成物（錠剤）中のプロテオグリカン定量

【0027】

（錠剤中のプロテオグリカンの回収）
錠剤（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、II型コラーゲン含有豚軟骨エキス、Ｎ−アセチルグルコサミン、コンドロイチン硫酸含有鮫軟骨抽出物、及びヒアルロン酸配合の市販品）を乳鉢および乳棒にて粉砕し、粉砕物１５０ ｍｇに４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えた。次に超音波処理にて１５分間抽出し、遠心分離により上清を回収した。さらに沈殿物に４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を３回行った後、得られた上清液をろ過し、プロテオグリカン含有抽出液４５ ｇを得た。

【0028】

（分子量分画膜による分離）
前記プロテオグリカン含有抽出液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５， Ｕｌｔｒａｃｅｌ １００ｋ（ミリポア社製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を７回行った。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料３とし、分子量分画を行わなかったプロテオグリカン濃縮液を試料４とした。

【0029】

（プロテオグリカンの定量）
試料３、試料４の１０ ｍｇをリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２０ ｍＬの溶液を調整し、０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所製）検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所製）

【0030】

（試験結果）
試料３と試料４を比較すると（図４）、分子量分画を行った試料１はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった。

【0031】

実施例３：食品組成物（錠剤）中のプロテオグリカン定量

【0032】

（錠剤中のプロテオグリカンの回収）
錠剤（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、γーグルタミルエチルアミド、ロングペッパーエキス、クレアチン、α-リポ酸、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６、葉酸、及びビタミンＢ１配合の市販品）を乳鉢および乳棒にて粉砕し、粉砕物２７０ ｍｇに４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えた。次に超音波処理にて１５分間抽出し、遠心分離により上清を回収した。さらに沈殿物に４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を４回行った後、得られた上清液をろ過し、プロテオグリカン含有抽出液６０ ｇを得た。

【0033】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ１５ Ｔｕｒｂｏ ＭＷＣＯ １０００００（ザルトリウス製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を５回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料５とした。

【0034】

（プロテオグリカンの定量）
試料５を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２５ ｍＬ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0035】

（試験結果）
分子量分画を行った試料５はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図５）。

【0036】

実施例４：食品組成物（顆粒）中のプロテオグリカン定量

【0037】

（顆粒中のプロテオグリカンの回収）
顆粒（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、黒胡椒エキス、及びビタミンＣ配合した作製品）７３ ｍｇに４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えた。次に超音波処理にて１５分間抽出し、遠心分離により上清を回収した。さらに沈殿物に４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を４回行った後、得られた上清液をろ過し、プロテオグリカン含有抽出液６０ ｇを得た。

【0038】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有抽出液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５， Ｕｌｔｒａｃｅｌ １００ｋ（ミリポア社製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を５回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料６とした。

【0039】

（プロテオグリカンの定量）
試料６を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２０ ｍＬ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所社製）検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0040】

（試験結果）
分子量分画を行った試料６はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図６）。

【0041】

実施例５：食品組成物（錠剤）中のプロテオグリカン定量

【0042】

（錠剤中のプロテオグリカンの回収）
錠剤（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、米発酵物、ロイシン、カルシウム、グルコサミン、及びビタミンＤ配合の市販品）を乳鉢および乳棒にて粉砕し、粉砕物１１７４ ｍｇに精製水１５ ｍＬを加えた。次に超音波処理にて１５分間抽出し、遠心分離により上清を回収した。さらに沈殿物に精製水１５ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を４回行った後、得られた上清液をろ過し、そのろ液に乳酸を加えて一晩処理したプロテオグリカン含有抽出液６５ ｇを得た。

【0043】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ１５ Ｔｕｒｂｏ ＭＷＣＯ １０００００（ザルトリウス製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を５回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料７とした。

【0044】

（プロテオグリカンの定量）
試料７を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２０ ｍＬ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0045】

（試験結果）
分子量分画を行った試料７はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図７）。

【0046】

実施例６：食品組成物（錠剤）中のプロテオグリカン定量

【0047】

（錠剤中のプロテオグリカンの回収）
錠剤（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、豚軟骨エキス、ヒアルロン酸、カルシウム、及び微細藻類配合の市販品）を乳鉢および乳棒にて粉砕し、粉砕物１００ ｍｇに４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えた。次に超音波処理にて１５分間抽出し、遠心分離により上清を回収した。さらに沈殿物に４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を４回行った後、得られた上清液をろ過し、プロテオグリカン含有抽出液６０ ｇを得た。

【0048】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ１５ Ｔｕｒｂｏ ＭＷＣＯ １０００００（ザルトリウス製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を５回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料８とした。

【0049】

（プロテオグリカンの定量）
試料８を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２０ ｍＬ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所社製）検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0050】

（試験結果）
分子量分画を行った試料８はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図８）。

【0051】

実施例７：食品組成物（錠剤）中のプロテオグリカン定量

【0052】

（錠剤中のプロテオグリカンの回収）
錠剤（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、カルシウム、オルニチン、シアル酸、黒胡椒エキス、グルタミン、ナイアシン、ロイシン、パントテン酸、イソロイシン、バリン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１、及びビタミンＢ２配合の市販品）を乳鉢および乳棒にて粉砕し、粉砕物４６５ ｍｇに４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えた。次に超音波処理にて１５分間抽出し、遠心分離により上清を回収した。さらに沈殿物に４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を４回行った後、得られた上清液をろ過し、プロテオグリカン含有抽出液６０ ｇを得た。

【0053】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ１５ Ｔｕｒｂｏ ＭＷＣＯ １０００００（ザルトリウス製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を５回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料９とした。

【0054】

（プロテオグリカンの定量）
試料９を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２５ ｍＬ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所社製）検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0055】

（試験結果）
分子量分画を行った試料９はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図９）。

【0056】

実施例８：食品組成物（錠剤）中のプロテオグリカン定量

【0057】

（錠剤中のプロテオグリカンの回収）
錠剤（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、エラスチン、コラーゲン、松樹皮エキス、セラミド、ビタミンＣ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、及びビタミンＢ６配合した作製品）を乳鉢および乳棒にて粉砕し、粉砕物１０４ ｍｇに４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えた。次に超音波処理にて１５分間抽出し、遠心分離により上清を回収した。さらに沈殿物に４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を４回行った後、得られた上清液をろ過し、プロテオグリカン含有抽出液６０ ｇを得た。

【0058】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ１５ Ｔｕｒｂｏ ＭＷＣＯ １０００００（ザルトリウス製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍｌを加えて遠心分離し、この水洗を５回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料１０とした。

【0059】

（プロテオグリカンの定量）
試料１０を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２５ ｍｌ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所社製）検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0060】

（試験結果）
分子量分画を行った試料１０はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図１０）。

【0061】

実施例９：食品組成物（ハードカプセル）中のプロテオグリカン定量

【0062】

（ハードカプセル中のプロテオグリカンの回収）
ハードカプセル（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、グルコサミン塩酸塩、及びビタミンＢ群配合した作製品）を解体し、内容物３５０ ｍｇに４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えた。次に超音波処理にて１５分間抽出し、遠心分離により上清を回収した。さらに沈殿物に４Ｍ−グアニジン塩酸溶液１５ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を３回行った後、得られた上清液をろ過し、プロテオグリカン含有抽出液４５ ｇを得た。

【0063】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ１５ Ｔｕｒｂｏ ＭＷＣＯ １０００００（ザルトリウス製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を５回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料１１とした。

【0064】

（プロテオグリカンの定量）
試料１１を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２０ ｍＬ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ： 示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0065】

（試験結果）
分子量分画を行った試料１１はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図１１）。

【0066】

実施例１０：食品組成物（ドリンク）中のプロテオグリカン定量

【0067】

（ドリンク中のプロテオグリカンの回収）
ドリンク（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、コラーゲンペプチド、植物エキス、リグナン、セラミド、及びビタミンＣ配合の市販品）を均一に混合し、内容液１０ ｍＬを採取及び精秤した。

【0068】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有採取液をＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５， Ｕｌｔｒａｃｅｌ １００ｋ（ミリポア社製）に入れ、遠心分離（４０００ ｒｐｍ、２０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離し、この水洗を３回行なった。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料１２とした。

【0069】

（プロテオグリカンの定量）
試料１２を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、１０ ｍＬ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0070】

（試験結果）
分子量分画を行った試料１２はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図１２）。

【0071】

実施例１１：食品組成物（ソフトカプセル）中のプロテオグリカン定量

【0072】

（ソフトカプセル中のプロテオグリカンの回収）
ソフトカプセル（プロテオグリカン含有サケ鼻軟骨抽出物、甘草抽出物、及びトリグリセリド配合の作製品）１粒を解体し、内容物をクロロホルム１０ ｍＬで抽出した。次に５％エタノール溶液２０ ｍＬを加えて、振とう抽出した後、上清を回収した。さらに５％エタノール溶液２０ ｍＬを加えて、同様の抽出操作を５回行った。得られた上清液をろ過し、濃縮乾固により有機溶媒を除去した。乾固物に精製水を加えてプロテオグリカン含有抽出液１００ ｇを得た。

【0073】

（分子量分画膜による分離）
プロテオグリカン含有抽出液をＶｉｖａｓｐｉｎ１５ Ｔｕｒｂｏ ＭＷＣＯ １０００００（ザルトリウス製）に入れ、遠心分離（３５００ ｒｐｍ、３０分）した。さらに上清に精製水１５ ｍＬを加えて遠心分離した。水洗した上清のプロテオグリカン濃縮液を試料１３とした。

【0074】

（プロテオグリカンの定量）
試料１３を回収し、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）に溶かし、２０ ｍＬ容量に調製した。０．４５ μｍメンブレンフィルターを通した後、以下操作条件でＨＰＬＣを行い標準品の検量線からプロテオグリカン量を求めた。
カラム ：ＴＳＫｇｅｌ Ｇ５０００ＰＷＸＬ（東ソー社製）
カラム温度：４０℃
試料注入量：５０ μＬ
移動相 ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
流量 ：０．５ ｍＬ／ｍｉｎ
検出器 ：ＵＶ検出器（ＳＰＤ−２０Ａ 島津製作所社製）検出波長＝２１５ ｎｍ
及び、示差屈折率検出器（ＲＩＤ−１０Ａ 島津製作所社製）

【0075】

（試験結果）
分子量分画を行った試料１３はシャープなピークが標準品のピーク溶出時間と同じ位置で検出し、プロテオグリカン以外の不純物を除外することができ、定量も可能となった（図１３）。

【産業上の利用可能性】

【0076】

本発明は、簡単で正確なプロテオグリカンの定量方法を提供することで、プロテオグリカンを高含有する製造方法への利用、日常的な品質管理業務、あるいはＨＰＬＣ後の分画物を回収することによるプロテオグリカン純品の入手等産業上の利用可能性を有する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】