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特許6875126迅速かつ包括的なＴ細胞免疫モニタリング用の細胞プラットフォーム

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6875126

(24)【登録日】2021年4月26日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】迅速かつ包括的なＴ細胞免疫モニタリング用の細胞プラットフォーム

(51)【国際特許分類】

C12N 15/62 20060101AFI20210510BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20210510BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20210510BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20210510BHJP

C12N 5/10 20060101ALI20210510BHJP

C12N 7/01 20060101ALI20210510BHJP

C07K 14/705 20060101ALI20210510BHJP

C07K 16/00 20060101ALI20210510BHJP

C07K 19/00 20060101ALI20210510BHJP

C07K 14/01 20060101ALI20210510BHJP

C12Q 1/02 20060101ALI20210510BHJP

C07K 14/74 20060101ALI20210510BHJP

G01N 33/48 20060101ALI20210510BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 ZZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N7/01

C07K14/705

C07K16/00

C07K19/00

C07K14/01

C12Q1/02

C07K14/74

G01N33/48 P

【請求項の数】14

【全頁数】54

(21)【出願番号】特願2016-546026(P2016-546026)

(86)(22)【出願日】2015年1月21日

(65)【公表番号】特表2017-506882(P2017-506882A)

(43)【公表日】2017年3月16日

(86)【国際出願番号】US2015012160

(87)【国際公開番号】WO2015112541

(87)【国際公開日】20150730

【審査請求日】2018年1月16日

(31)【優先権主張番号】61/929,651

(32)【優先日】2014年1月21日

(33)【優先権主張国】US

【前置審査】

(73)【特許権者】

【識別番号】515314797

【氏名又は名称】アルバートアインシュタインカレッジオブメディシン

(74)【代理人】

【識別番号】100102978

【弁理士】

【氏名又は名称】清水初志

(74)【代理人】

【識別番号】100102118

【弁理士】

【氏名又は名称】春名雅夫

(74)【代理人】

【識別番号】100160923

【弁理士】

【氏名又は名称】山口裕孝

(74)【代理人】

【識別番号】100119507

【弁理士】

【氏名又は名称】刑部俊

(74)【代理人】

【識別番号】100142929

【弁理士】

【氏名又は名称】井上隆一

(74)【代理人】

【識別番号】100148699

【弁理士】

【氏名又は名称】佐藤利光

(74)【代理人】

【識別番号】100128048

【弁理士】

【氏名又は名称】新見浩一

(74)【代理人】

【識別番号】100129506

【弁理士】

【氏名又は名称】小林智彦

(74)【代理人】

【識別番号】100205707

【弁理士】

【氏名又は名称】小寺秀紀

(74)【代理人】

【識別番号】100114340

【弁理士】

【氏名又は名称】大関雅人

(74)【代理人】

【識別番号】100114889

【弁理士】

【氏名又は名称】五十嵐義弘

(74)【代理人】

【識別番号】100121072

【弁理士】

【氏名又は名称】川本和弥

(72)【発明者】

【氏名】サイデルロナルドディー．ザサード

(72)【発明者】

【氏名】チャパーロロドルフォ

(72)【発明者】

【氏名】ヒルリッチブランダンエス．

(72)【発明者】

【氏名】アルモスティーブンシー．

【審査官】山本匡子

(56)【参考文献】

【文献】特表２００９−５３７１７５（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２００５−５０６０５８（ＪＰ，Ａ）

【文献】米国特許出願公開第２００８／０２１９９４７（ＵＳ，Ａ１）

【文献】特表２００４−５０１３６４（ＪＰ，Ａ）

【文献】特表２０１５−５３７０４３（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Spang, HCL, et al.，Heterodimeric Barnase-Barstar Vaccine Molecules: Influence of One versus Two Targeting Units Specific for Antigen Presenting Cells，PLoS One，２０１２年，7（９），e45393

【文献】 Margalit, A., et al.，Induction of Antitumor Immunity by CTL Epitopes Genetically Linked to Membrane-Anchored β2-Microglobulin，J. Immunol，２００６年，176，217-224

【文献】 Wen, F., et al.，Construction and Screening of an Antigen-Derived Peptide Library Displayed on Yeast Cell Surface for CD4+ T Cell Epitope Identification，Immunoproteomics，２０１３年，245-264

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ１５／００−９０

Ｃ１２Ｎ１／００−５／２８

Ｃ１２Ｑ

ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）レンチウイルス様粒子または（ｉｉ）レンチウイルスであって、前記レンチウイルス様粒子またはレンチウイルスに会合している哺乳動物細胞膜部分および哺乳動物膜貫通ドメインを介して、発現産物に物理的に会合しており、前記発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接するクラスＩ主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する前記哺乳動物膜貫通ドメイン、
これに隣接する、ＧＰ４１エンベロープタンパク質の残基７０６〜７１３を含むウイルスパッケージング配列
を含む、前記レンチウイルス様粒子またはレンチウイルス。

【請求項2】

複数の、請求項１に記載の単離されたレンチウイルスまたは単離されたレンチウイルス様粒子。

【請求項3】

少なくとも１００個の異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む、請求項２に記載の複数のもの。

【請求項4】

それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分であって、前記発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接するクラスＩ主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、
これに隣接する、ＧＰ４１エンベロープタンパク質の残基７０６〜７１３を含むウイルスパッケージング配列
を含む、前記単離された懸濁適合細胞または細胞の膜結合部分。

【請求項5】

前記発現産物を含む、請求項４に記載の細胞の膜結合部分。

【請求項6】

微小胞またはエキソソームである、請求項４または５に記載の細胞の膜結合部分。

【請求項7】

前記細胞が、前記免疫グロブリンＦｃドメインの配列を含む前記発現産物を発現する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の、単離された懸濁適合細胞または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。

【請求項8】

前記細胞が、前記蛍光タンパク質を含む前記発現産物を発現する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の、単離された懸濁適合細胞または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。

【請求項9】

前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、請求項４〜８のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。

【請求項10】

少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む、複数の請求項４〜９のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の複数の膜結合部分であって、前記コードされた１つのペプチド若しくは複数の前記コードされたペプチドが前記細胞の細胞外表面上に提示される、前記複数の懸濁適合細胞または複数の膜結合部分。

【請求項11】

少なくとも１００個の異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む、請求項１０に記載の複数の単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の複数の膜結合部分。

【請求項12】

Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む、複数の請求項４〜１１のいずれか一項に記載の単離された懸濁適合細胞もしくは発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分とを、またはそのような細胞の膜部分に会合した請求項１〜３のいずれか一項に記載のレンチウイルス様粒子もしくはレンチウイルスとを接触させる工程、
懸濁適合細胞または膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡを配列決定する工程、および
前記ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。

【請求項13】

前記Ｔ細胞が、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記対象がヒト対象である、請求項１３に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は２０１４年１月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／９２９，６５１号の利益を主張し、本内容は、参照により本明細書中に組み込まれる。

【0002】

政府支援の陳述
本発明は、ＮＩＧＭＳ、国立衛生研究所により授与された認可番号３Ｕ５４ＧＭ０９４６６２−０２及び５Ｕ０１ＧＭ０９４６６５−０２の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明における特定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

発明の背景
本出願を通して、様々な出版物が角括弧で参照される。これらの参考文献の完全な引用は、明細書の最後に見出すことができる。本発明が関連する先行技術をより十分に説明するために、これらの出版物、並びに本明細書において参照される全ての特許、特許出願公開、及び書籍の開示は、それらの全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

【0004】

臨床的に重要な疾患状態及び治療への差動応答に関連する分子署名を同定するためのゲノム技術［１３〜１５］及びプロテオミクス技術［１６−１９］の開発及び応用は、過去１０年間に著しく成長している。これらの進歩により、診断が個別化される可能性がある［２０］。一例として、ＡｄａｐｔｉｖｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓは、試料内のＴＣＲレパートリーの完全な分析を研究者に提供するため、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）β鎖の超可変ドメインの高スループットシークエンシングを利用する［２１］。このベンチャーキャピタルが出資する取り組みは現在、バイオマーカー発見のために３億ドルが見積もられた市場深度を有する出来高払いの事業である。高スループット技術の急速な進歩は、生物製剤（例えば、モノクローナル抗体、治療用タンパク質、及びペプチド）の段階的な臨床開発と並行して行われ［２２〜２５］、免疫媒介性疾患の治療に革命をもたらした。例えば、主に抗体反応を介して免疫力を高める従来のワクチンとは異なり、ＧｅｎｏｃｅａＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、細胞内病原体に対する強固なＴ細胞応答を引き起こすことに焦点が置かれた、新規の生物製剤ベースのワクチンを開発している。同様に、欧州のバイオテクノロジー企業のＡｐｉｔｏｐｅ社は、Ｔ細胞が重要な病原性の役割を果たす自己免疫疾患の治療のための治療用ペプチドを開発している。Ａｐｔｉｏｐｅ社は最近、治療用の主力ＭＳペプチドの継続的な開発のためにＭｅｒｃｋ−Ｓｅｒｏｎｏ社と提携した。Ｔ細胞免疫をモニター、強化、または変更しようとする試みは、臨床的に関連するＴ細胞エピトープを同定する能力に大きく依存する。

【0005】

ＣＤ８媒介の適合免疫応答を含む分子事象の中核には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と、Ｔ細胞エピトープと呼ばれる主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子により非共有結合的に提示される小ペプチド抗原との関与がある。これは、免疫系の標的化機構を示し、Ｔ細胞活性化及びエフェクター機能のために必要な分子間相互作用である。Ｔ細胞の発生の間、ゲノム編集処理は、３００万個以上の非反復配列の推定深さを有する、すべての免疫細胞上の固有のＴＣＲの発現をもたらし［１］、かつＴ細胞が応答することができる抗原の膨大な多様性を占めている。しかし、Ｔ細胞エピトープは従来、各々のＴＣＲが、特異性に対して、及び更なる研究のためのカスタム試薬の開発（例えば、四量体）に対して、個々の特性評価を必要とするため、研究が困難であった。臨床的には、この課題は、免疫応答が、一般的には、多数のＴ細胞特異性、例えば、単一の病原体応答のためのウイルス除去に効果をもたらすための標的となる複数のウイルス抗原を伴うという事実により悪化する。それ故、所与の疾患状態のためにエピトープ全体のアンサンブルを体系的に識別する能力は、診断法の開発、並びに感染症、自己免疫、及び癌に対する潜在的な標的をかなり絞った治療薬の開発のための独自の機会ということになる。

【0006】

発現［３，４］及び合成ペプチドライブラリー［５，６］、位置スキャンライブラリ［７］、ｐＭＨＣマイクロアレイ［８］のスクリーニング、並びに自然発生するエピトープの質量分析同定［９〜１１］を含む、エピトープ発見のための実験的手法が多数存在する。Ｍａｒｒａｃｋ及びＫａｐｐｌｅｒは、潜在的なペプチドミモトープのライブラリーに共有結合したＭＨＣクラス−Ｉ分子のためのディスプレイプラットフォームとして、バキュロウイルス感染昆虫細胞戦略を開発した［４］。ミモトープは、未知のペプチドエピトープの配列と異なるが、それにもかかわらず、特異的ＣＤ８Ｔ細胞受容体により認識される。しかし、多くの場合、同定されたミモトープを天然エピトープに結合させることは困難である。また、バキュロウイルスディスプレイシステムは、同族ＴＣＲを精製して四級化するための要件と相まって、ミモトープを溶解するために、細胞選別、ウイルス発生、拡大、及び再感染に５〜１０回の時間のかかるラウンドを必要とする。部分的にこれらの問題に対処することにより、Ｎｅｗｅｌｌらは、驚異的な感度を有するヒト血液試料から直接、ｐＭＨＣ四量体の組み合わせの小さなセットをスクリーニングするために、フローサイトメトリー及び質量分析と組み合わせた従来のＭＨＣ四量体の重同位体タッギング（マスサイトメトリーと呼ばれている）を活用したが、この技術では、現在、そのような組み合わせは、アッセイ１回あたり約１００個までに限定されている［１２］。これらの手法のそれぞれは、Ｔ細胞エピトープに対する貴重な洞察に寄与しているが、これらの方法は、時間のかかる労働集約型であり、高いユーザ熟練度を必要とする。

【0007】

本発明は、Ｔ細胞エピトープのレパートリーの効率的かつ体系的同定のための新規で改良された技術の必要性に対処する。

【発明の概要】

【0008】

本発明は、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞を提供する。

【0009】

本発明はまた、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する、単離された懸濁適合細胞を提供し、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
これに隣接する８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する蛍光タンパク質配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメイン
を含む。

【0010】

また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する蛍光タンパク質、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインを含む、組換え核酸が提供される。

【0011】

また、Ｔ細胞と、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞とを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインを含み、複数の単離された懸濁適合細胞がそれらの細胞の中で、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
回収したＴ細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。

【0012】

また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。

【0013】

また、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する、単離された懸濁適合細胞が提供され、その発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメイン
を含む。

【0014】

５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメイン
を含む、組換え核酸が提供される。

【0015】

また、Ｔ細胞と、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞とを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインを含み、複数の単離された懸濁適合細胞がそれらの細胞の中で、８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することに可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
回収したＴ細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピドープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。

【0016】

また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。

【0017】

また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む。

【0018】

【0019】

また、複数の単離された懸濁適合細胞、または、複数の発現産物を発現するような細胞の膜結合部分が提供され、当該複数が、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む。

【0020】

本明細書に記載の単離された懸濁適合細胞により産生される、（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスが提供され、そのウイルス様粒子またはウイルスが、それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合し、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、
これに隣接するウイルスパッケージング配列
を含む。

【0021】

また、記載された複数のウイルス様粒子または記載された複数のウイルスが提供される。

【0022】

また、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸が提供される。

【0023】

また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。

【0024】

また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物が組換えポリペプチド構築物を含み、組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０のアミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている。

【0025】

また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチド
を含む異種核酸を含むウイルス、プラスミドまたはウイルスベクターにより形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。

【0026】

それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合する、請求項４６に記載の細胞により産生される（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスであって、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、組換えポリペプチド構築物を含み、組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている、（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。

【0027】

また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸が提供される。

【0028】

Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分とを接触させる工程であって、各々の細胞または膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、その発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを含み、複数の単離された懸濁適合細胞または膜結合部分がこれらの細胞または膜結合部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。

【0029】

Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはその細胞の膜結合部分とを接触させる工程であって、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現し、その発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、複数の単離された懸濁適合細胞またはその膜結合部分がこれらの細胞または部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。

【0030】

Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む単離された懸濁適合細胞、またはこのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、細胞または膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、その発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を含み、複数の単離された懸濁適合細胞、または細胞の膜部分に会合した複数のウイルス様粒子またはウイルスがこれらの細胞またはウイルス様粒子またはウイルスの中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
複数の懸濁適合細胞と、複数のウイルス様粒子と、または複数のウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、またはウイルス様粒子またはウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡまたはＲＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。

【0031】

Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはそのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、複数の単離された懸濁適合細胞、複数のウイルス様粒子、またはウイルスがそれらの細胞の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と、膜部分に会合したウイルス様粒子と、または膜部分に会合したウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、またはウイルス様粒子またはウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡまたはＲＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
[本発明1001]
5'から3'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、5〜20アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第1のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β2ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第3のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第4のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞。
[本発明1002]
5'から3'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、5〜20アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第1のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β2ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第3のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第4のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、本発明1001の単離された懸濁適合細胞。
[本発明1003]
5'から3'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、5〜20アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第1のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β2ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第3のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第4のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、本発明1001の単離された懸濁適合細胞。
[本発明1004]
それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分であって、前記発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
5〜20アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第1のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ2ミクログロブリン配列、
これに隣接する第2のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第3のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第4のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む、単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1005]
本発明1004の細胞の前記発現産物を発現する、膜結合部分。
[本発明1006]
微小胞またはエキソソームである、本発明1004または1005の細胞の膜結合部分。
[本発明1007]
前記細胞が、前記免疫グロブリンＦｃドメインの配列を含む前記発現産物を発現する、本発明1004、1005、1006、または1007のいずれかの、単離された懸濁適合細胞または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1008]
前記細胞が、前記蛍光タンパク質を含む前記発現産物を発現する、本発明1004、1005、または1006のいずれかの、単離された懸濁適合細胞または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1009]
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、本発明1001〜1008のいずれかの単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1010]
前記異種核酸が、前記哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して3'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む、本発明1001〜1003、1007、1008、または1009のいずれかの単離された懸濁適合細胞。
[本発明1011]
前記発現産物が、前記哺乳動物膜貫通ドメインに関してＣ末端側であるウイルスパッケージング配列を更に含む、本発明1004〜1009のいずれかの単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1012]
ウイルス様粒子である、本発明1011の細胞の前記発現産物を発現する膜結合部分。
[本発明1013]
前記β2ミクログロブリンがヒトβ2ミクログロブリンと同一の配列を有する、本発明1001〜1012のいずれかの単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1014]
主要組織適合性複合体重鎖配列がヒトＨＬＡ−Ａ配列と同一の配列を有する、本発明1001〜1013のいずれかの単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1015]
膜貫通ドメインが、ヒト主要組織適合複合体Ｉ重鎖膜貫通ドメインと同一の配列を有する、本発明1001〜1014のいずれかの単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1016]
少なくとも2つの異なるコードされた5〜20アミノ酸のペプチドを含む、複数の本発明1001〜1015のいずれかの単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の複数の膜結合部分。
[本発明1017]
少なくとも100個の異なるコードされた5〜20アミノ酸のペプチドを含む、本発明1016の複数のもの。
[本発明1018]
コードされた前記ペプチドが、1つの九量体若しくは複数の九量体である、本発明1001〜1015のいずれかの単離された懸濁適合細胞、若しくは前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分、または、本発明1016若しくは1017の複数の単離された懸濁適合細胞若しくは膜結合部分。
[本発明1019]
コードされた1つのペプチド若しくは複数の前記ペプチドが前記細胞の細胞外表面上に提示される、本発明1001〜1015のいずれかの単離された懸濁適合細胞、若しくはその膜結合部分、または、本発明1016、1017、若しくは1018のいずれかの複数の単離された懸濁適合細胞若しくはその膜結合部分。
[本発明1020]
前記発現産物を発現する、本発明1001〜1019のいずれかの単離された懸濁適合細胞の膜結合部分。
[本発明1021]
本発明1001〜1019のいずれかの単離された懸濁適合細胞。
[本発明1022]
異種核酸が前記ウイルスパッケージング配列をコードし、かつ、前記細胞が、前記異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターにより形質導入またはトランスフェクトされる、本発明1010〜1019、または1021のいずれかの単離された懸濁適合細胞。
[本発明1023]
それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合する、本発明1022の細胞により産生される（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスであって、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
5〜20アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第1のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ2ミクログロブリン配列、
これに隣接する第2のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第3のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第4のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、
これに隣接するウイルスパッケージング配列
を含む、（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
[本発明1024]
前記細胞がレトロウイルストランスフェクションシステムを用いてトランスフェクトされる、本発明1023の（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
[本発明1025]
前記トランスフェクションがレンチウイルストランスフェクションシステムを用いて実施される、本発明1023の（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
[本発明1026]
前記レトロウイルストランスフェクションシステムがパッケージングプラスミドを含み、前記パッケージングプラスミドがその中に、1つまたは複数のエンベロープタンパク質をコードする1つのオリゴヌクレオチド配列または複数のオリゴヌクレオチド配列の代わりに、
5〜20アミノ酸のペプチドをコードする1つのオリゴヌクレオチド配列または複数のオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する第1のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ2ミクログロブリン配列、
これに隣接する第2のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第3のリンカーペプチド配列、
これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、
これに隣接する第4のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む、本発明1023、1024、または1025のいずれかの（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
[本発明1027]
前記細胞から出芽した、本発明1023〜1026のいずれかの単離されたウイルス。
[本発明1028]
前記細胞から出芽した、本発明1023〜1026のいずれかの単離されたウイルス様粒子。
[本発明1029]
組換えレトロウイルスである、前記細胞から出芽した単離された本発明1027のウイルス。
[本発明1030]
複数の本発明1027または1029の単離されたウイルス。
[本発明1031]
複数の本発明1028の単離されたウイルス様粒子。
[本発明1032]
それらのコードされた5〜20アミノ酸のペプチドが異なっている複数のウイルスを含む、前記複数の単離されたウイルス。
[本発明1033]
それらのコードされた5〜20アミノ酸のペプチドが異なっている複数のウイルス様粒子を含む、前記複数の単離されたウイルス様粒子。
[本発明1034]
5'から3'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列をコードする配列、
これに隣接する、5〜20アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第1のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β2ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第3のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第4のリンカーペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸。
[本発明1035]
前記蛍光タンパク質をコードする前記オリゴヌクレオチド配列を含む、本発明1034の組換え核酸。
[本発明1036]
前記免疫グロブリンＦｃドメインをコードする前記オリゴヌクレオチド配列を含む、本発明1034の組換え核酸。
[本発明1037]
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、本発明1034、1035、若しくは1036のいずれかの組換え核酸。
[本発明1038]
前記組換え核酸が、前記哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して3'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む、本発明1034〜1037のいずれかの組換え核酸。
[本発明1039]
ベクターである、本発明1034〜1038のいずれかの組換え核酸。
[本発明1040]
前記ベクターがウイルスベクターである、本発明1039の組換え核酸。
[本発明1041]
前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、本発明1040の組換え核酸。
[本発明1042]
前記ベクターがプラスミドである、本発明1041の組換え核酸。
[本発明1043]
前記核酸がｃＤＮＡを含む、本発明1001〜1015、1018、1019、1021、若しくは1022のいずれかの単離された懸濁適合細胞、または本発明1016および1017のいずれかの複数の単離された懸濁適合細胞、または本発明1034〜1042のいずれかの組換え核酸。
[本発明1044]
5'から3'の順に、
第1のＢ2Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された5〜20アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第1のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ2Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第2のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第3のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のＢ2Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第4のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第5のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞。
[本発明1045]
それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分であって、前記発現産物が組換えポリペプチド構築物を含み、前記組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第1のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ2Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第2のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第2のペプチド配列により結合された、事前に選択された5〜20アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第4のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第5のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを有する、アミノ酸配列に、1つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている、単離された懸濁適合細胞、または、前記発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分。
[本発明1046]
5'から3'の順に、
第1のＢ2Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された5〜20アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第1のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ2Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第2のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第3のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のＢ2Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第4のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第5のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチド
を含む異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターにより形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞。
[本発明1047]
前記第3のアミノ酸リンカーが発現後に自己切断する、本発明1044または1046の単離された懸濁適合細胞。
[本発明1048]
それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインによって物理的に会合する、本発明1046の細胞により産生される（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスであって、発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、組換えポリペプチド構築物を含み、前記組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第1のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ2Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第2のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第2のペプチド配列により結合された、事前に選択された5〜20アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第4のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第5のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を有するアミノ酸配列に、一つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている、（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルス。
[本発明1049]
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、本発明1044、1045、1046、若しくは1047のいずれかの単離された懸濁適合細胞または本発明1048の（ｉ）ウイルス様粒子若しくは（ｉｉ）ウイルス。
[本発明1050]
前記異種核酸が、前記哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して3'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む、本発明1044または1047の単離された懸濁適合細胞。
[本発明1051]
前記事前に選択された第2のペプチドが、Ｔ細胞調節ドメイン、抗体エピトープ、蛍光タンパク質、核酸結合タンパク質、または同時調節タンパク質である、本発明1044〜1047のいずれかの単離された懸濁適合細胞または本発明1048若しくは1049の（ｉ）ウイルス様粒子若しくは（ｉｉ）ウイルス。
[本発明1052]
5'から3'の順に、
第1のＢ2Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された5〜20アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第1のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ2Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第2のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第3のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第2のＢ2Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第4のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第5のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む、組換え核酸。
[本発明1053]
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、本発明1052の組換え核酸。
[本発明1054]
前記哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して3'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む、本発明1052または1053の組換え核酸。
[本発明1055]
Ｔ細胞と、少なくとも2つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分とを接触させる工程であって、各々の細胞または膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、前記発現産物の各々が、5〜20アミノ酸のペプチド、これに隣接する第1のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ2ミクログロブリン配列、これに隣接する第2のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第3のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第4のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを含み、前記複数の単離された懸濁適合細胞または前記膜結合部分が前記細胞または前記膜結合部分の中で、5〜20アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも2つの異なるコードされた5〜20アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡを配列決定する工程、
前記ＤＮＡにコードされた前記5〜20アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
[本発明1056]
Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも2つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはその膜結合部分とを接触させる工程であって、前記発現産物の各々が、（ｉ）第1のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ2Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第2のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第2のペプチド配列により結合された、事前に選択された5〜20アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第4のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第5のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、1つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、前記複数の単離された懸濁適合細胞またはその膜結合部分が前記細胞または前記部分の中で、5〜20アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも2つの異なるコードされた5〜20アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡを配列決定する工程、
前記ＤＮＡにコードされた前記5〜20アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
[本発明1057]
複合体を形成しているＴ細胞がフローサイトメトリーにより回収される、本発明1054または1056の方法。
[本発明1058]
配列決定する工程の前に、回収した前記ＤＮＡを増幅する工程を含む、本発明1055、1056、または1057のいずれかの方法。
[本発明1059]
前記増幅する工程が、1つ以上のユニバーサルプライマーを用いて行われる、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記ユニバーサルプライマーの1つ以上が、前記異種核酸の配列の一部に方向付けられているが、前記細胞の天然β2ミクログロブリン配列をコードする核酸に相補的ではない、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、本発明1055〜1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
前記Ｔ細胞が、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む、本発明1055〜1061のいずれかの方法。
[本発明1063]
前記対象がヒトである、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記複数の単離された懸濁適合細胞の前記ＤＮＡにおける前記5〜20アミノ酸のペプチドの存在に比べて回収した前記ＤＮＡでは濃縮されている、前記ＤＮＡにコードされた前記5〜20アミノ酸のペプチドのいずれかを同定して、それにより、1つ以上の免疫優性のＴ細胞エピトープを同定する工程を更に含む、本発明1055〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記単離された懸濁適合細胞がＨＥＫ細胞である、本発明1055〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記単離された懸濁適合細胞が使用される、本発明1055〜1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記発現産物を発現する前記細胞である懸濁適合細胞の単離された前記膜結合部分が使用される、本発明1055〜1065のいずれかの方法。
[本発明1068]
Ｔ細胞と、少なくとも2つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはそのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子またはウイルスとを接触させる工程であって、前記細胞または前記膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、前記発現産物の各々が、5〜20アミノ酸のペプチド、これに隣接する第1のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ2ミクログロブリン配列、これに隣接する第2のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第3のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第4のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を含み、前記複数の単離された懸濁適合細胞、または前記細胞の前記膜部分に会合した複数の前記ウイルス様粒子若しくは複数の前記ウイルスが前記細胞または前記ウイルス様粒子若しくは前記ウイルスの中で、5〜20アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも2つの異なるコードされた前記5〜20アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
複数の懸濁適合細胞と、複数のウイルス様粒子と、または複数のウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、前記ウイルス様粒子または前記ウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡを配列決定する工程、
前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡにコードされた前記5〜20アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
[本発明1069]
Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも2つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、または、そのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、前記発現産物の各々が、（ｉ）第1のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ2Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第2のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第2のペプチド配列により結合された、事前に選択された5〜20アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第4のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第5のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、1つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、前記複数の単離された懸濁適合細胞、前記ウイルス様粒子、または前記ウイルスがそれらの細胞の中で、5〜20アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも2つの異なるコードされた5〜20アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と、膜部分に会合したウイルス様粒子と、または膜部分に会合したウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
前記懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、または、前記ウイルス様粒子若しくは前記ウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収した前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡを配列決定する工程、
前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡにコードされた前記5〜20アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法。
[本発明1070]
複合体を形成しているＴ細胞がフローサイトメトリーにより回収される、本発明1068または1069の方法。
[本発明1071]
配列決定する工程の前に、回収した前記ＤＮＡまたは前記ＲＮＡを増幅する工程を含む、本発明1068、1069、または1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
前記増幅する工程が、1つ以上のユニバーサルプライマーを用いて行わる、本発明1071の方法。
[本発明1073]
前記ユニバーサルプライマーの1つ以上が、前記異種核酸の配列の一部に方向付けられているが、前記細胞の天然β2ミクログロブリン配列をコードする核酸に相補的ではない、本発明1072の方法。
[本発明1074]
前記哺乳動物膜貫通ドメインが主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである、本発明1068〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
前記Ｔ細胞が、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む、本発明1068〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
前記対象がヒトである、本発明1075の方法。
[本発明1077]
前記複数の単離された懸濁適合細胞の前記ＤＮＡにおける前記5〜20アミノ酸のペプチドの存在に比べて回収した前記ＤＮＡでは濃縮されている、前記ＤＮＡにコードされた前記5〜20アミノ酸のペプチドのいずれかを同定し、それにより、1つ以上の免疫優性Ｔ細胞エピトープを同定する工程を更に含む、本発明1068〜1076のいずれかの方法。
[本発明1078]
前記ウイルスがレトロウイルスである、本発明1077の方法。
[本発明1079]
（ｉ）複合体を形成しているＴ細胞と、Ｔ細胞表面マーカー分子に対して作製された抗体または抗体フラグメントを磁気ビーズの外部表面に結合させた前記磁気ビーズとを接触させること、および（ｉｉ）前記磁気ビーズを回収するように前記ビーズに磁場を印加することにより、前記複合体を形成しているＴ細胞が回収される、本発明1055〜1078のいずれかの方法。
[本発明1080]
前記Ｔ細胞表面マーカー分子がＣＤ8分子である、本発明1079の方法。
[本発明1081]
前記懸濁適合細胞またはその膜部分が前記蛍光タンパク質を発現し、かつ複合体を形成しているＴ細胞が、前記蛍光タンパク質の蛍光に基づく蛍光活性化細胞選別により回収される、本発明1055〜1078のいずれかの方法。
[本発明1082]
前記ウイルス様粒子または前記ウイルスが、二次抗体ベースシステムにより回収され、前記二次抗体が、発現した前記構築物中のエピトープに対して作製されている、本発明1069〜1078のいずれかの方法。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープの高スループット同定のための「ｅｐｉＣＥＬＬ」免疫モニタリングプラットフォームの概要を示す。ｓｃ−ｐＭＨＣベクターのライブラリーを、プールして、ｅｐｉＣＥＬＬプールを産生する懸濁適合ＨＥＫ２９３細胞に、まとめてトランスフェクトする。プールされた発現ライブラリーは、患者由来の末梢Ｔ細胞と混合し、複合体を形成できるが、これは、磁気分離により、または従来のフローサイトメトリー選別法により回収される。磁気ビーズは、使用される場合、ＬｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＣＤ８、及びＭｉｌｔｅｎｙｉからのＣＤ８マイクロビーズ（ＭＡＣＳ）を含む、任意の商業的供給源から得ることができる。例えば、全血液、骨髄、軟膜、単核細胞（ＭＮＣ）、及び組織消化物を含む、任意の試料から直接ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の容易な単離または枯渇を可能にする抗ヒトＣＤ８抗体と結合した超常磁性ビーズである。濃縮されたプールメンバーからのエピトープ配列は、ユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、取得プロセスにより濃縮されたエピトープを同定するために、次世代の大規模シークエンシングに供する。

【図2】膜結合型クラスＩｓｃ−ｐＭＨＣ構築物のデザインである。構築物は、直後に候補エピトープ（ペプチドと表記）が続き、これがさらに、リンカー領域（第１のリンカー、第２のリンカー、第３のリンカーのそれぞれに対しての４個の反復ＧＧＧＧＳ、及び任意に蛍光タンパク質とＨＣＴＭとの間の第４のリンカーとしての２個の反復ＧＧＧＧＳ）を介して、天然Ｂ２Ｍ分子、ヒトＨＬＡ−Ａ０２：０１、及び表面に露出したｍＣｈｅｒｒｙの発現プロキシに結合されている、ヒト天然Ｂ２Ｍリーダー配列を用いている。全体の構築物は、天然のクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメイン（ＨＣＴＭ）を介して膜に保持されている。ユニバーサルプライマー（順方向、逆方向として表示）は、疾患関連エピトープを直接同定するために、Ｔ細胞投与後、非反復２７ヌクレオチド配列（九量体ペプチド）を増幅するために使用される。

【図3】ＭＨＣ対照の表面発現の検証である。本発明者らのｓｃ−ｐＭＨＣｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームに表示される４つの独立したウイルス性病原体に結合された、４つの既知の病原性ＨＬＡ−Ａ０２拘束性エピトープの発現の検証である。検査される構築物は、ＣＭＶｐｐ６５タンパク質の残基４９５〜５０４［ＣＭＶ］、インフルエンザマトリックスタンパク質５８〜６６［ＦＬＵ］、ＨＴＬＶＴａｘ１１〜１９［ＨＴＬＶ］、及びＨＩＶｇａｇｐ１７７６〜８４［ＨＩＶ］である。構築物の表面発現は、ｍＣｈｅｒｒｙのプロキシ発現及び抗ｍＣｈｅｒｒｙの表面発現をモニターする蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析により検証された。特に、この図の作成の後に、追加（第５）の対照エピトープは、同定され、ＥＢＶＢＭＬＦ１残基２５９〜２６７［ＥＢＶ］に設定されたコードを試験するために加えられた。ＥＢＶの表面発現プロファイルは、他の４つの対照で観察されるものを反映している（データは図示せず）。

【図4】適切な折り畳み及びＭＨＣ対照のエピトープ提示の検証である。ここでは、Ｗ６／３２抗ＭＨＣクラスＩｍＡｂを使用した、クラス−ＩＨＬＡ：Ｂ２Ｍ錯体の原形質膜表面染色が示され、１）クラスＩＭＨＣの内因性発現（親として表示）；２）天然ヒトＢ２Ｍの５'ＵＴＲをターゲットにするｓｈＲＮＡのレンチウイルス送達による約９５％ノックダウン（ノックダウン）；及び３）本発明者らのｓｃ−Ｐ構築物の添加時のクラス−ＩＭＨＣ発現のレスキュー（レスキュー）が図示されている。特に、このように５'ＵＴＲを含有していない構築物は、ｓｈＲＮＡの下方制御に影響されない。使用したｍＡｂＷ６／３２では、ＭＨＣ及びＢ２Ｍの両方が適切に折り畳まれ、かつ膜が結合のため局在化されることが必要である。

【図5】ＨＥＫ細胞におけるＴＣＲ発現及び膜局在化のために使用された構築物である。対照ＴＣＲの発現を可能にするために、１つのレンチウイルス構築物が、種々のウイルス２Ａペプチドにより結合された完全なＣＤ３遺伝子カセット（上部）を保有する、レンチウイルスの同時形質導入技術を用いた。使用された２Ａ「自己切断型」ペプチドは、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス（Ｔ２Ａ）、及びウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）に由来したものであった。第２の構築物（下部）は、ブタテシオウイルス−１（Ｐ２Ａ）ペプチドで結合されたＴＣＲのα鎖及びβ鎖を担持して、各鎖の化学量論的な発現を可能にするが、これは、このペプチドが、哺乳動物細胞で最も高い「切断」効果を示すためである［２］。ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（ＢＬＵＥ）発現プロキシは、β鎖の膜貫通セグメントに従う。

【図6】ＨＥＫ細胞の原理証明研究における、活性ヘテロダイマーＴＣＲの制御構造の表面発現を示す。これは、上述のＨＬＡ分子について５個の同族ＴＣＲ（ＴＣＲＲＡ１４［ＣＭＶペプチドに特異的に結合する］、ＪＭ２２［ＦＬＵ］、ＡＳ０１［ＥＢＶ］、Ａ０６［ＨＴＬＶ］、及び１８０３［ＨＩＶ］）を用いる。表面発現及び活性Ｔ細胞複合体の形成は、表面抗−ＣＤ３（ＦＩＴＣで標識：ｘ軸）、表面ＭＨＣ五量体染色（フィコエリトリン［ＰＥ］、ｙ軸）に対するＦＡＣＳ分析により確認した。形質導入されていない細胞は、陰性対照（ＣＮＴＲＬ）として使用した。

【図7】ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームの初期検証のために配置された細胞−細胞のＦＡＣＳ分析である。５個のＴＣＲ（ＲＡ１４、ＪＭ２２、ＡＳＯｌ、１８０３、Ａ０６）は、個別に５個の同族ｓｃ−ｐＭＨＣｅｐｉＣＥＬＬ（ＣＭＶ、ＦＬＵ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）を補完するために発現した。細胞質ｍＣｈｅｒｒｙを（ＣＹＴＯ）及び表面が発現したｍＣｈｅｒｒｙ（ＭＨＣ、ＳＴＡＬＫなし）は、陰性対照として使用した。個人及び混合集団のＦＡＣＳ分析からのヒストグラムは、同族ＭＨＣ：ＴＣＲペアを発現する細胞が両方存在し、かつ従来の五量体投与と相関するとき（図６）にのみ特定の細胞間相互作用を表すシグナルが、顕著に増加したのを明示した（Ａ０６：ＨＴＬＶ相互作用の１００倍）。正の相互作用は赤い矢印でマークされている。

【図8】ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームの結果である。２つのｅｐｉＣＥＬＬ構築物（ＣＭＶ及びＦＬＵ）は、プールされ、独立したＴＣＲ保有ＨＥＫ細胞（ＪＭ２２）とともに投与され、形成された複合体において選別された（ＴＣＲ発現プロキシとしてｅｐｉＣＥＬＬ及びｍＣｅｒｕｌｅａｎを追跡するために、ｍＣｈｅｒｒｙの表面発現プロキシを使用した）。（蛍光タンパク質は、磁気分離が使用されているとき、構造物の必要な部分ではないが、手動または低スループットプロセスのためには便利である）。各プールからゲノムＤＮＡを抽出し、そしてエピトープの周りの隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲの約３０サイクル実施した。事前選別されたｅｐｉＣＥＬＬプール（Ｐｒｅとして表示）及びＪＭ２２が投与されたセットに対して得られたＰＣＲバンドが（上部）に示されている。これらのアンプリコンは、ライブラリーの調整のために提示され、続いて、次世代シークエンシングがイルミナＭｉＳｅｑプラットフォーム上で実施された。シークエンシングファイルを分析して、エピトープを容易に同定した。各々に対して、観察されたエピトープ配列の絶対数は、本発明者らのＱＣフィルターを通過する全ての観測されたＮＧＳ読み取りの割合として計算され、標準化された。標識は、ＣＭＶ及びＦＬＵ（下）のための病原体のエピトープを表す。

【図9】５個のｅｐｉＣＥＬＬ構築物（ＣＭＶ、ＦＬＵ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）をプールし、独立したＴＣＲ保有ＨＥＫ細胞（Ｒ１４、ＪＭ２２、ＡＳ０１、Ａ０６）とともに投与し、形成した複合体において選別した（ＴＣＲ発現プロキシとしてｅｐｉＣＥＬＬ及びｍＣｅｒｕｌｅａｎを追跡するために、ｍＣｈｅｒｒｙの表面発現プロキシを使用した）。各プールからゲノムＤＮＡを抽出し、エピトープの周りに隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲの約３０サイクル実施した。得られたＰＣＲバンドのためのバイオアナライザーの出力は、事前選別されたｅｐｉＣＥＬＬプール（Ｐｒｅとして表示）及びＴＣＲ投与セットのために（上部）に示されている。これらのアンプリコンはライブラリーの調整のために提示され、続いて、次世代シークエンシングを、イルミナＭｉＳｅｑプラットフォーム上で実施した。シークエンシングファイルを分析して、エピトープを容易に同定した。事前選別した集団（ライブラリー）内で同定されたエピトープは、１６〜２３％の範囲内であった（データは図示されず）。ＴＣＲ投与セットデータそれぞれでは、すべての観測したエピトープ配列の絶対数は、本発明者らのＱＣフィルターを通過する全ての観測されたＮＧＳ読み取りの割合として計算されて標準化され、かつＺスコアを計算するために使用された。

【図10】図１０Ａ及び１０Ｂは、ｅｐｉＣＥＬＬ及びその誘導体、例えば、ビラトープにおいて使用するための、例示的な代替の表面発現構築物である。変異体は、直後に候補エピトープ（ペプチドとして表示）が続き、これがさらに、リンカーＬ１を介してＢ２Ｍ分子に結合されている、天然ヒトＢ２Ｍリーダー配列を用いている。１０Ａ：Ａ（ｌ）は、先端のＣ末端にウイルスパッケージングシグナル（例えば、ＧＰ４１のｅｎｖ残基７０６〜７１３など、ＶＰとして表示）を付加した「従来の」ｅｐｉＣＥＬＬベースの提示に類似する。二価の表示を可能にするために、Ｆｃ融合ベースの構築物は、用いられてＡ（２）、再度、ＶＰパッケージングシグナルで終了する。この例では、従来の抗体用のエピトープ（例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ等）は、表面検知を可能にするためにリンカーＬ４に配置されている。最後に、ｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングプラットフォームのモジュール性／柔軟性を高めるために、ｓｙｎＴａｃベースの発現構築物が用いられる。ｓｙｎＴａｃは、ＭＨＣを、ペプチド及びタンパク質の両方を様々な末端（例えば、Ａ（３）及び図式的にパネル１０Ｂに示されている構築物）に融合することにより、重鎖と軽鎖のそれぞれに分割する。全ての成分が、真核細胞（例えば、ＨＥＫ、ＣＨＯ）及び自己組織化内で産生中に会合する。個々の鎖は、ジスルフィド結合（赤線で示す）を介して共有結合的に連結されている。すべての構築物は、天然のクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメイン（ＴＭ）を介して膜に保持される。

【図11】図１１Ａ及び１１Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲ及びビラトープ粒子からの次世代配列を示す。各ビラトーププールからのゲノムＲＮＡを、溶解を介して抽出した。各ビラト―ププールからのゲノムＲＮＡは、細胞溶解により抽出され、一連の逆転写（室温、４２℃、２０分間）に供され、その後、エピトープの周囲の隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲの約３０サイクル実施した。得られたＰＣＲバンドをパネル１１Ａに示す。特に、ＰＣＲバンドは、最初のＲＴステップ（レーン１）の存在下でのみ観察され、ＲＴが省略された場合（レーン２）存在せず、ｅｐｉＣＥＬＬ由来のコンピテントレトロウイルスの再生を支援する。これらのアンプリコンは、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）及びエピトープが容易に識別されるために提示された（パネル１１Ｂ）。

【図12】図１２Ａ及びＢは、ビラトープ：抗原特異的Ｔ細胞集団を検出するためのペプチドＨＬＡ−Ａ^＊０２０１Ｆｃ融合タンパク質でシュードタイプ化されたレンチウイルス粒子である。β２ミクログロブリンに結合したペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１、及びヒトＩｇＧ１Ｆｃからなる単鎖構築物（図１０Ａ、番号２）は、第３の世代のレンチウイルストランスフェクションシステムの包絡線成分と置換された。構築物はまた、二次抗体（Ｌ４リンカー領域に配置された）による検出のためのＦＬＡＧエピトープタグを含んでいた。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１の関連で提示されたペプチドエピトープは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのＮＬＶＰＭＶＡＴＶペプチドエピトープ、または、インフルエンザ（ＦＬＵ）からのＧＩＬＧＦＶＦＴＬペプチドエピトープのいずれかであった。採取されたレンチウイルスを濃縮し、特定のまたは無関係のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいずれかで以前にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞に適合させた。余分なレンチウイルスを細胞から洗浄し、細胞に結合した残りのレンチウイルスを、ＰＥ結合抗ＦＬＡＧ抗体を介して検出した。レンチウイルスは、特定のペプチド−ＭＨＣ五量体による染色に匹敵するような手法で、それぞれの同族ＴＣＲ発現ＨＥＫ細胞に結合した無関係なエピトープでなく、同族エピトープでシュードタイプ化された。

【発明を実施するための形態】

【0033】

発明の詳細な説明
単離された懸濁適合細胞が提供され、細胞は、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするかまたは免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされる。

【0034】

本明細書において考察した、免疫グロブリンＦｃドメインを含む細胞、他の細胞、及び構築物の実施形態では、免疫グロブリンＦｃドメインは、ヒトＩｇＦｃの配列、好ましくはヒトＩｇＧ１Ｆｃの配列を有することができる。別の実施形態では、かかる免疫グロブリンＦｃドメインは、マウスＩｇＧ２ａＦｃの配列を有することができる。特に、各々が免疫グロブリンＦｃドメインを含む発現した構築物が存在する場合、自発的な二価融合が生じる可能性がある。従って、考察された、形質導入またはトランスフェクトされた細胞、発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分、並びに本明細書中に記載のウイルス様粒子及びウイルスによって、発現した免疫グロブリンＦｃドメインの二価融合を実証することができる。

【0035】

本明細書中に記載のコードまたは発現された５〜２０アミノ酸のペプチドの実施形態において、ペプチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長のうちの１つである。実施形態において、ペプチドは、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸長である。実施形態では、ペプチドは、九量体（即ち、９アミノ酸長）である。配列を要望通りに事前に選択することができる。

【0036】

哺乳動物膜貫通ドメインを含む本明細書中で考察される細胞並びに他の細胞及び構築物の実施形態では、膜貫通ドメインは、哺乳動物膜貫通ドメインの配列を有するが、哺乳動物自体から取得されるものではなく、例えば、哺乳動物膜貫通ドメインタンパク質の配列と同一若しくは類似した配列を有するように設計した配列である。実施形態では、配列は、哺乳動物ＭＨＣ膜貫通配列と同一である。実施形態では、配列は、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインと同一である。実施形態では、配列は、クラスＩ主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインと同一である。ＭＨＣＩα３配列は、当該分野で公知である。実施形態では、配列は、ヒトのクラスＩ主要組織適合性複合体重鎖膜貫通ドメインと同一である。本明細書で使用される、２つのヌクレオチド配列に関する「〜に隣接する」は、第１の配列が、例えば、ホスホジエステル結合を介して、第２の配列と連続していることを意味する。本明細書で使用される、２つのペプチド／オリゴペプチド配列に関する「〜に隣接する」は、第１の配列が、例えば、ペプチド結合を介して、第２の配列と連続していることを意味する。

【0037】

任意の核酸でコードされた蛍光タンパク質は、本明細書に記載の本発明で使用可能である。そのようなタンパク質は、当該分野で公知である。非限定の例としては、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＦＲＵＩＴ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ−単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ−Ｓａｐｐｈｉｒｅが挙げられる。

【0038】

懸濁適合細胞は、懸濁培養液中で生存または増殖することができるものである。異種核酸は、それがトランスフェクトまたは形質導入された細胞に対して異種であるものであり、異種核酸は全体として、トランスフェクションまたは形質導入の前の細胞内には天然に存在しない。

【0039】

リンカー配列は、当該分野で公知の短い反復ペプチド配列を含む短いペプチド配列である。リンカー配列は一般的に、それらが結合するドメインまたは領域の他のコードされたペプチド機能に干渉しないか、それに最小限の機能的影響を与えるにすぎない。例えば、リンカーは、１つ以上のリンカーについてＧＧＧＧＳの４反復であってよい。本明細書に記載されるリンカーは、本明細書に参照される自己切断型リンカーの特定の例外は別として、自己切断しない点において安定している。参照する例外に関しては、自己切断型リンカー、例えば、そのようなものの非限定的な例は、ウイルスＰ２Ａペプチドであり、このペプチドは、哺乳動物細胞における良好な自己切断効率を示す。

【0040】

単離された懸濁適合細胞の実施形態では、細胞は、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされる。

【0041】

単離された懸濁適合細胞の実施形態では、細胞は、５'から３'の順に、
リーダーオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、主要組織適合複合体重鎖配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされる。

【0042】

また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物が、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する、第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、β２ミクログロブリン配列、
これに隣接する、第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を含む。

【0043】

実施形態では、細胞の発現産物を発現する膜結合部が提供される。実施形態では、膜結合部分は、微小胞またはエキソソームである。

【0044】

実施形態では、細胞は免疫グロブリンＦｃドメインの配列を含む発現産物を発現する。

【0045】

本発明はまた、そのリンカー、例えば第４のリンカーが表面発現のためのプロキシとして公知の抗体（例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ）のための蛍光タンパク質（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙなど）、またはエピトープに更に結合される場合を除く、記載された細胞、または膜結合部分を提供する。実施形態では、記載される細胞のリンカーまたは膜結合部分は、そのようなものを含まず、リンカーのみである（例えば、本明細書の他の箇所に記載される通り）。

【0046】

単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態では、細胞は、蛍光タンパク質を含む発現産物を発現する。

【0047】

単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態では、細胞は、免疫グロブリンＦｃドメインを含む発現産物を発現する。

【0048】

単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態では、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。

【0049】

実施形態では、異種核酸は更に、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む。

【0050】

単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態において、発現産物は更に、哺乳動物膜貫通ドメインに関してＣ末端側であるウイルスパッケージング配列を含む。

【0051】

本明細書に記載の形質導入された細胞、組換え核酸、またはウイルスパッケージング配列をコードする異種核酸の実施形態において、関連する核酸は、実施形態では、ＲＮＡ配列であり得る。実施形態では、ウイルスパッケージング配列は、レトロウイルスパッケージング配列である。

【0052】

実施形態では、本明細書に記載の細胞の発現産物を発現する膜結合部、及びウイルス様粒子が提供される。

【0053】

本明細書に記載の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態において、β２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンと同一の配列を有する。

【0054】

本明細書に記載の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態において、主要組織適合複合体重鎖配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ配列と同一の配列を有する。

【0055】

本明細書に記載の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分の実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒト主要組織適合複合体Ｉ重鎖膜貫通ドメインと同一の配列を有する。

【0056】

また、記載の複数の単離された懸濁適合細胞が提供される。また、発現産物を発現するようなそのような細胞の複数の膜結合部分が提供され、当該複数が、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む。

【0057】

複数についての実施形態では、当該複数が、少なくとも１００個の異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含む。

【0058】

また、記載の単離された懸濁適合細胞、または発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分、またはコードされたペプチドが九量体若しくは九量体である、記載の複数の単離された懸濁適合細胞、若しくは膜結合部分が提供される。実施形態では、コードされた５〜２０アミノ酸の１つのペプチド若しくは複数のペプチドは、細胞の細胞外表面に提示される。

【0059】

また、発現産物を発現する記載の単離された懸濁適合細胞の膜結合部分が提供される。

【0060】

また、記載の単離された懸濁適合細胞が提供される。

【0061】

単離された懸濁適合細胞の実施形態では、異種核酸は、ウイルスパッケージング配列をコードし、細胞は、異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターにより形質導入されるか、または異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターでトランスフェクトされる。

【0062】

また、本明細書に記載の形質導入若しくはトランスフェクトされた細胞により産生される（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスが提供され、そのウイルス様粒子またはウイルスは、それらに結合している細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合し、発現産物は、Ｎ末端からＣ末端の順に、
５〜２０アミノ酸のペプチド、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する、蛍光タンパク質、または免疫グロブリンＦｃドメインの配列、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、
これに隣接するウイルスパッケージング配列
を含む。

【0063】

（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスの実施形態において、細胞は、レトロウイルストランスフェクションシステムを用いてトランスフェクトする。（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスの実施形態では、トランスフェクションは、レンチウイルストランスフェクションシステムを使用して実施される。

【0064】

（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスの実施形態において、レトロウイルストランスフェクションシステムはパッケージングプラスミドを含み、パッケージングプラスミドがその中に、１つ以上のエンベロープタンパク質をコードする１つのオリゴヌクレオチド配列または複数のオリゴヌクレオチド配列の代わりに、
５〜２０アミノ酸のペプチドをコードする１つのオリゴヌクレオチド配列または複数のオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、
これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、
これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、
これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、
これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、
これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、
これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、
これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン
を有する。

【0065】

また、本明細書に記載の細胞から出芽した単離されたウイルスが提供される。出芽したウイルスは、それらが一緒になって細胞の膜の一部を受け入れるか、または細胞の膜の一部に会合されて、その結果、本明細書に記載の発現し膜に配置された構築物に会合される。

【0066】

また、本明細書に記載の細胞から出芽した単離されたウイルス様粒子が提供される。出芽したウイルスは、それらが一緒になって細胞の膜の一部を受け入れるか、または細胞の膜の一部に会合されて、その結果、本明細書に記載の発現し膜に配置された構築物に会合される。

【0067】

実施形態では、ウイルスは、レトロウイルスである。実施形態では、ウイルスはレンチウイルスである。実施形態では、レトロウイルスは、組換え体である。

【0068】

また、本明細書に記載の複数の単離されたウイルスが提供される。実施形態では、当該複数が、それらのコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドが異なっているウイルスを含む。

【0069】

また、本明細書に記載の複数の単離されたウイルス様粒子が提供される。実施形態では、当該複数が、それらのコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドが異なっているウイルス様粒子を含む。

【0070】

ウイルスの実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質を含む。ウイルスの実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。ウイルス様粒子の実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、蛍光タンパク質を含む。ウイルス様粒子の実施形態では、発現された組換えポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメインを含む。

【0071】

【0072】

実施形態では、組換え核酸は、蛍光タンパク質をコードするオリゴヌクレオチド配列を含む。実施形態では、組換え核酸は、免疫グロブリンＦｃドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列を含む。実施形態では、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。実施形態では、哺乳動物膜貫通ドメインは、哺乳動物のＨＬＡ−Ａ^＊０２０１ドメインと同一のドメインを有する。実施形態では、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１はヒトである。

【0073】

実施形態では、組換え核酸は、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを更に含む。実施形態では、組換え核酸は、ベクターである。実施形態において、組換え核酸は、ウイルスベクターである。実施形態において、組換え核酸は、レトロウイルスベクターである。実施形態では、組換え核酸はレンチウイルスベクターである。実施形態では、組換え核酸ベクターは、プラスミドである。

【0074】

組換え核酸または単離された懸濁適合細胞の実施形態では、異種核酸または組換え核酸は、ｃＤＮＡを含む。

【0075】

また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列に同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物貫通膜ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列
を含む異種核酸により形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。

【0076】

実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、免疫系のエフェクター分子である。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、検出可能なエピトープである。非限定的な実施例では、検出可能なエピトープは、ＦＬＡＧエピトープ、または、ＭＹＣエピトープである。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、本明細書に記載される蛍光タンパク質である。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、例えば、細胞表面グリカン、または他の翻訳後修飾（例えば、硫酸化）を標的とする自然発生のまたは合成された親和性試薬であり得る。例としては、ＴＮＦ／ＴＮＦＲのファミリー（ＯＸ４０Ｌ、ＩＣＯＳＬ、ＦＡＳＬ、ＬＴＡ、ＬＴＢＴＲＡＩＬ、ＣＤ１５３、ＴＮＦＳＦ９、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＮＦＳＦ１３ｂ、ＴＮＦＳＦ１４、ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦＳＦ１８、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤ７０）、または、ＴＮＦ／ＴＮＦＲファミリーメンバー向けの親和性試薬；免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー（ＶＩＳＴＡ、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤＬ２、Ｂ７１、Ｂ７２、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＴＩＭ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、Ｔ細胞受容体鎖、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンド、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、ＢＴＬＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ３、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＩｇＳＦ；ＣＤ２、ＣＤ５８、ＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９、ＣＤ２４４、ＩＣＡＭ−１を含むＣＡＭＳ）；白血球免疫グロブリン様受容体（ＬIＬＲ）、キラー細胞免疫グロブリン様授与体（ＫＩＲ））、レクチンスーパーファミリーメンバー、セレクチン、サイトカイン／ケモカイン及びサイトカイン／ケモカイン受容体、成長因子及び成長因子受容体）、接着分子（インテグリン、フィブロネクチン、カドヘリン）、または、マルチスパン内在性膜タンパク質の細胞外ドメイン、または、免疫グロブリンスーパーファミリー及び列挙された遺伝子産物向けの親和性試薬が挙げられるが、それに限定されない。更に、これらの遺伝子産物の活性ホモログ／オルソログは、ウイルス配列（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ）、細菌配列、真菌の配列、真核生物の病原体（例えば、住血吸虫、マラリア原虫、バベシア、アイメリア、タイレリア、トキソプラズマ、アメーバ、リーシュマニア、及びトリパノソーマ）、並びに哺乳動物由来のコード領域が挙げられるが、それらに限定されない。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、Ｔ細胞刺激性ドメインであり得るか、またはＴ細胞抑制ドメインであり得る。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列は、細胞表面タンパク質の細胞外ドメインであってもよい。

【0077】

また、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現する単離された懸濁適合細胞、または、発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分が提供され、その発現産物は組換えポリペプチド構築物を含み、組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを有する、アミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている。実施形態では、事前に選択された第２のペプチド配列、及びその他の成分は、本明細書の他の箇所に記載の通りである。

【0078】

また、５'から３'の順に、
第１のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第１のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のアミノ酸リンカー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、事前に選択された第２のペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第３のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第２のＢ２Ｍリーダー配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ＭＨＣ重鎖と同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第４のアミノ酸リンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、第５のリンカーをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列、
これに隣接する、ウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチド
を含む異種核酸を含むウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターにより形質導入またはトランスフェクトされた、単離された懸濁適合細胞が提供される。ウイルスパッケージング配列またはシグナルは、当該分野で公知であり、また、本明細書に記載されている。実施形態では、第３のアミノ酸リンカーは発現後に自己切断する。自己切断型リンカーは、ウイルスＰ２Ａペプチドとして、本明細書に記載されている。

【0079】

また、インスタント細胞により産生された（ｉ）ウイルス様粒子または（ｉｉ）ウイルスが提供され、そのウイルス様粒子またはウイルスは、それらに結合された細胞膜部分を介して哺乳動物膜貫通ドメインにより物理的に会合され、発現産物は、Ｎ末端からＣ末端の順に、組換えポリペプチド構築物を含み、組換えポリペプチド構築物が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する免疫グロブリＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を有する、アミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されている。（ｉ）ウイルス様粒子、または、（ｉｉ）ウイルスの実施形態において、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。実施形態において、異種核酸は更に、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む。（ｉ）ウイルス様粒子、または（ｉｉ）ウイルスの実施形態において、事前に選択された第２のペプチドは、Ｔ細胞調節ドメイン、抗体エピトープ、蛍光タンパク質、核酸結合タンパク質、または、同時調節タンパク質である。

【0080】

【0081】

組換え核酸の実施形態では、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。組換え核酸の実施態様において、組換え核酸は更に、哺乳動物膜貫通ドメインをコードするオリゴヌクレオチド配列に関して３'側のウイルスパッケージング配列をコードするオリゴヌクレオチドを含む。

【0082】

また、Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、または、発現産物を発現するそのような細胞の膜結合部分とを接触させる工程であって、細胞または膜結合部分の各々が、それに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、その発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメインを含み、複数の単離された懸濁適合細胞、または膜結合部分がこれらの細胞または膜結合部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピドープのを同定する方法が提供される。

【0083】

本明細書に記載の方法においてＴ細胞を回収する実施形態では複合体を回収する。

【0084】

また、Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはその膜結合部分とを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列により結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合により結合されており、複数の単離された懸濁適合細胞、またはその膜結合部分がこれらの細胞または部分の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞とまたは膜結合部分と複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡの配列を決める工程、
ＤＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。

【0085】

本方法の実施形態では、複合体を形成しているＴ細胞は、フローサイトメトリーにより回収される。本方法の実施形態では、複合体を形成しているＴ細胞は、蛍光活性化細胞選別により回収される。

【0086】

方法の実施形態において、本方法は、配列決定する工程の前に、回収したＤＮＡを増幅する工程を含む。本方法の実施形態において、増幅する工程は、１つ以上のユニバーサルプライマーを用いることにより達成する。本方法の実施形態において、ユニバーサルプライマーの１つ以上は、異種核酸の配列の一部に方向付けられているが、細胞の天然β２ミクログロブリン配列をコードする核酸に相補的ではない。

【0087】

本方法の実施形態において、哺乳動物膜貫通ドメインは、主要組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインである。本方法の実施形態において、Ｔ細胞は、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む。本方法の実施形態において、対象はヒトである。

【0088】

本方法の実施形態において、本方法は更に、複数の単離された懸濁適合細胞のＤＮＡにおける５〜２０アミノ酸のペプチドの存在に比べて回収したＤＮＡでは濃縮されている、ＤＮＡをコードする５〜２０アミノ酸のペプチドのいずれかを同定して、それにより１つ以上の免疫優性のＴ細胞エピトープを同定する工程を含む。

【0089】

本方法の実施形態において、本方法は更に、組換え技術によって設計されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）発現対照細胞である対照のレベルとＴ細胞複合体のレベルとを比較する工程を含み、対照を超えるレベルは、免疫優性エピトープを示す。

【0090】

本方法の実施形態では、単離された懸濁適合細胞は、哺乳動物細胞である。実施形態では、単離された懸濁適合細胞は、ＨＥＫ細胞である。

【0091】

本方法の実施形態において、単離された懸濁適合細胞が使用される。本方法の実施形態において、発現産物を発現する細胞である懸濁適合細胞の単離された膜結合部分が使用される。

【0092】

また、Ｔ細胞と、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはこのような細胞の膜部分に会合されるウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、細胞または膜結合部分が、それらに形質導入またはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を発現し、その発現産物の各々が、５〜２０アミノ酸のペプチド、これに隣接する第１のリンカーペプチド配列、これに隣接するβ２ミクログロブリン配列、これに隣接する第２のリンカーペプチド配列、これに隣接する主要組織適合複合体重鎖配列、これに隣接する第３のリンカーペプチド配列、これに隣接する蛍光タンパク質または免疫グロブリンＦｃドメイン、これに隣接する第４のリンカーペプチド配列、これに隣接する哺乳動物膜貫通ドメイン、これに隣接するウイルスパッケージング配列を含み、複数の単離された懸濁適合細胞、または細胞の膜部分に会合された複数のウイルス様粒子若しくはウイルスがこれらの細胞、またはウイルス様粒子若しくはウイルスの中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
複数の懸濁適合細胞と、ウイルス様粒子と、またはウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、またはウイルス様粒子若しくはウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡまたはＲＮＡにコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。

【0093】

また、Ｔ細胞と、それに形質導入若しくはトランスフェクトした異種核酸の発現産物を各々が発現する、少なくとも２つの細胞を含む複数の単離された懸濁適合細胞、またはそのような細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子若しくはウイルスとを接触させる工程であって、その発現産物の各々が、（ｉ）第１のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するヒト天然Ｂ２Ｍペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第２のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する事前に選択された第２のペプチド配列によって結合された、事前に選択された５〜２０アミノ酸のペプチドを含み、（ｉ）が、（ｉｉ）ＭＨＣ重鎖の配列、これに隣接する第４のアミノ酸リンカー、これに隣接する、免疫グロブリンＦｃドメインと同一のアミノ酸配列、これに隣接する第５のアミノ酸リンカー、これに隣接する、哺乳動物膜貫通ドメインを有するアミノ酸配列に、１つまたは複数のジスルフィド結合によって結合されており、複数の単離された懸濁適合細胞、ウイルス様粒子、またはウイルスがそれらの細胞の中で、５〜２０アミノ酸のペプチドとＴ細胞が結合することを可能にする条件下で、少なくとも２つの異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを発現する、工程、
懸濁適合細胞と、膜部分に会合したウイルス様粒子と、または膜部分に会合しウイルスと複合体を形成しているＴ細胞を回収する工程、
懸濁適合細胞からＤＮＡを回収するか、またはウイルス様粒子若しくはウイルスからＲＮＡを回収する工程、
回収したＤＮＡまたはＲＮＡを配列決定する工程、
ＤＮＡまたはＲＮＡをコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを同定して、それによりＴ細胞エピトープを同定する工程
を含む、Ｔ細胞エピトープを同定する方法が提供される。

【0094】

実施形態では、細胞の膜部分に会合したウイルス様粒子またはウイルスは、そのような細胞から出芽している。

【0095】

本方法の実施形態では、複合体を形成しているＴ細胞は、フローサイトメトリーにより回収される。本方法の実施形態では、Ｔ細胞複合体は、ＦＡＣＳまたは二次抗体染色方法により回収される。実施形態では、二次抗体は、事前に選択された第２のペプチド配列に対して作製されている。

【0096】

実施形態では、本方法は、配列決定する工程の前に、回収したＤＮＡまたはＲＮＡを増幅する工程を含む。実施形態において、増幅する工程は、１つ以上のユニバーサルプライマーを用いて行われる。

【0097】

実施形態では、（ｉ）複合体を形成しているＴ細胞と、Ｔ細胞表面マーカー分子に対して作製された抗体または抗体フラグメントを磁気ビーズの外部表面に結合させた磁気ビーズとを接触させること、および（ｉｉ）磁気ビーズを回収するようにビーズに磁場を印加することにより、複合体を形成しているＴ細胞は回収される。

【0098】

実施形態では、Ｔ細胞表面マーカー分子は、ＣＤ８分子である。

【0099】

本方法の実施形態では、懸濁適合細胞、またはその膜部分は、構築物を形成する蛍光タンパク質を発現し、複合体を形成しているＴ細胞は、該蛍光タンパク質の蛍光に基づく蛍光活性化細胞選別により回収される。

【0100】

本方法の実施形態では、ウイルス様粒子またはウイルスは、二次抗体ベースシステムにより回収され、二次抗体は、発現した構築物中のエピトープに対して作製されている。そのようなエピトープの非限定的な例としては、ＦＬＡＧ及びＭＹＣエピトープが挙げられる。

【0101】

記載された本発明の単離された懸濁適合細胞の実施形態では、β２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンと同一の配列を有する。単離された懸濁適合細胞の実施形態では、組織適合複合体重鎖配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ配列と同一の配列を有する。単離された懸濁適合細胞の実施形態では、組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインは、ヒト主要組織適合複合体Ｉ重鎖膜貫通ドメインと同一の配列を有する。

【0102】

記載された本発明の実施形態では、複数は、少なくとも１００個の異なるコードされた５〜２０アミノ酸のペプチドを含むことができる。実施形態では、ペプチドは、８、９、１０、１１、または、１２アミノ酸のペプチドである。実施形態では、複数は、少なくとも１０００個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数は、少なくとも１０,０００個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数は、少なくとも１００,０００個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数、少なくとも１×１０^６個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数は、少なくとも１×１０^７個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。実施形態では、複数は、少なくとも１×１０^８個の異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む。

【0103】

単離された懸濁適合細胞、または複数の単離された懸濁適合細胞の実施形態では、コードされたペプチドは九量体（９アミノ酸長）である。

【0104】

記載された本発明の実施形態では、コードされたペプチドは、細胞の細胞外表面上に提示される。

【0105】

実施形態では、組換え核酸はベクターである。実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。

【0106】

単離された懸濁適合細胞、複数の懸濁適合細胞、または組換え核酸の実施形態において、核酸はＤＮＡを含む。

【0107】

実施形態において、ユニバーサルプライマーの１つ以上は、異種核酸の配列の一部に方向付けられているが、細胞の天然β２ミクログロブリン配列をコードする核酸に相補的ではない。

【0108】

実施形態において、Ｔ細胞は、対象から得られた末梢Ｔ細胞を含む。

【0109】

本明細書に記載の方法の実施形態では、対象はヒトである。

【0110】

実施形態では、本方法は、得られた結果と、組換え技術によって設計されたＴＣＲ発現対照細胞の結果とを比較する工程を含む。実施形態では、組換え技術によって設計されたＴＣＲ発現対照細胞は、ＨＥＫ細胞である。

【0111】

細胞の実施形態では、β２ミクログロブリンは、ヒトβ２ミクログロブリンと同一の配列を有する。実施形態では、組織適合複合体重鎖配列は、ヒトＨＬＡ−Ａ配列と同一の配列を有する。実施形態では、組織適合複合体重鎖膜貫通ドメインは、ヒトの主要組織適合複合体Ｉ重鎖膜貫通ドメインと同一の配列を有する。

【0112】

少なくとも２つの異なるコードされた８、９、１０、１１または１２アミノ酸のペプチドを含む、複数の単離された懸濁適合細胞が提供される。

【0113】

同質遺伝子細胞株（細胞１個当たりの単一の組込み）の分野では、実用限界は使用するライブラリーの複雑さと同じである。言い換えれば、反応における細胞数、例えば、１０^６〜１０^８個に基づいて、スケール変更される^。

【0114】

本発明の実施形態において、β２ミクログロブリンと主要組織適合複合体重鎖との間のリンカーを除去することにより、２つの分離した産物をもたらすことができる。これらは、細胞内で自然に集合する。

【0115】

実施形態では、核酸は以下の配列を含み、
（ｎ）_ｘは、８、９、１０、１１または１２アミノ酸をコードするヌクレオチド配列であり、ｘは、それぞれ２４、２７、３０、３３、または３６ヌクレオチドである：

。実施形態では、２４、２７、３０、３３、または３６ヌクレオチドは、それぞれ、８、９、１０、１１、または、１２個のコドンまたは等価物で構成されている。

【0116】

実施形態では、組換え核酸は、レンチウイルス送達のためには最大約３０００ｎｔである。実施形態では、組換え核酸は、プラスミド送達のためには最大約１０，０００ｎｔである。

【0117】

実施形態では、核酸は以下の配列をコードするか、または発現産物は以下の配列を含み、Ｘ_（ｎ）は、８、９、１０、１１、または１２アミノ酸のペプチド配列であり得る：

。_（ｎ）は、８、９、１０、１１、または１２のいずれか１つ、あるいはその部分範囲であり得る。

【0118】

リーダー配列は、哺乳動物細胞で処理することができる任意のシグナルペプチドを含む。このような配列は、当該分野で公知である。

【0119】

本発明で使用可能な蛍光タンパク質は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ｍＦＲＵＩＴを含む。任意の核酸コード可能な蛍光タンパク質は、例えば、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ−Ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ−単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＥＧＦＰ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＧＦＰを使用することができる。

【0120】

例示的な非限定的Ｂ２Ｍリーダーは、

である。

【0121】

例示的な非限定的Ｂ２Ｍ配列は、

である。

【0122】

例示的な非限定的ＭＨＣ重鎖配列は、

である。

【0123】

例示的な非限定的免疫グロブリンＦｃドメイン配列は、

である。

【0124】

例示的な非限定的ウイルスパッケージング（ＶＰ）配列（シグナル）は、

である。一実施形態では、ウイルスパッケージング配列は、８〜２０アミノ酸長である。一実施形態では、ウイルスパッケージング配列は、８アミノ酸長である。

【0125】

一実施形態では、非切断型リンカーはそれぞれ独立して５〜４０アミノ酸長である。一実施形態では、非切断型リンカーはそれぞれ独立して５〜３０アミノ酸長である。一実施形態では、非切断型リンカーはそれぞれ独立して５〜２０アミノ酸長である。一実施形態では、非切断型リンカーはそれぞれ２０アミノ酸長である。

【0126】

本明細書中で使用される通り、「同一の配列」を有することは、参照配列の確立された機能または既知の機能を妨げることなく、参照配列との９５％以上の配列類似性を有することを意味する。実施形態では、同一の配列を有することは、参照配列と完全に同一の配列を有することを意味する。

【0127】

本明細書に記載の種々の要素の組み合わせの全ては、本明細書に示されない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明の範囲内にある。

【0128】

本発明は、以下の実施例の詳細からより良く理解されるであろう。しかし、当業者は、考察される特定の方法及び結果が、以下の特許請求の範囲により完全に記載される本発明を単に示すものであることを、容易に理解するであろう。

【0129】

実験の詳細
本明細書において、患者試料の高スループットＴ細胞エピトープマッピングのための候補Ｔ細胞エピトープ（「ｅｐｉＣＥＬＬ」）を提示するための、好ましくは、読み出し用として高感度かつ大量並列型の次世代シーケンシングを用いた新規な哺乳動物細胞ディスプレイプラットフォーム（免疫モニタリング）が記載されている。

【0130】

この手法では、例えば、ＨＥＫ細胞の表面上にクラスＩＭＨＣに関連する多数のＴ細胞エピトープが提示されるのを可能にするために、新規な膜結合型単鎖ペプチドＭＨＣ（ｓｃ−ｐＭＨＣ）の哺乳動物細胞ディスプレイプラットフォームの使用に重点が置かれている。これらの発現プールには、非限定的実施例において、カテゴリーＡ〜Ｃの病原体の疾患、治療、及び中和に直接関連するそれらのエピトープを同定するために、例えば、健康な患者、感染した患者、治療した患者、免疫化された患者由来のＴ細胞を投与している。病原体から同定された免疫優性署名は、集合させられて病原体エピトープコレクションを構築し、迅速かつポータブル診断ツールとして使用して全血から直接検出することができる。

【0131】

好ましい戦略は、疾患関連エピトープを直接同定するために、哺乳動物細胞の表面に表示されかつ患者／コホートの特異的な末梢Ｔ細胞に対して投与された、ｓｃ−ｐＭＨＣ構築物のライブラリーを活用する。図１に示すように、ｓｃ−ｐＭＨＣベクターのライブラリーはプールされ、ＨＥＫ２９３細胞などの懸濁適合細胞に一斉にトランスフェクトされること（または、例えば、レンチウイルスプールの場合、形質導入されること）ができ、このようにしてｅｐｉＣＥＬＬプールが生成される。

【実施例】

【0132】

実施例１
ｅｐｉＣＥＬＬプールを、患者由来の末梢Ｔ細胞と混合して（標準的なプロトコールを使用して全血試料から精製［２６］）、ＴＣＲと、ｅｐｉＣＥＬＬプールによって発現されたそれらの同族ｓｃ−ｐＭＨＣリガンドとが特異的に会合することによって複合体を形成することを可能にする。次いで、例えば、複数の患者の試料を同時に処理するための磁気分離、または単一の試料用のより一般的なフローサイトメトリー選別法により、複合体を回収する。濃縮されたプールメンバー由来のエピトープ配列を、ＰＣＲ（ユニバーサルプライマーを使用する）により増幅させ、大規模な次世代シークエンシングに供して、取得プロセスにより濃縮されたエピトープを同定する。これらの濃縮されたエピトープにより、免疫優性のＴ細胞エピトープが直接同定される。更に、所望の場合、その後の検証を、生体外の方法（例えば、サイトカインＥＬＩＳｐｏｔ、ＦＡＣＳ）により、実行することができる［２７］。この戦略によって、単一の患者試料から、すべての疾患に関連する免疫優性エピトープを迅速に同定することが可能になる。注目すべきことに、この手法を、インデックス付きのアダプタ、例えば、ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）の使用により多重化して、スループットを大幅に向上させてコストを削減することができる（例えば、複数の患者の試料は、ＮＧＳフローセルの単一レーン上で実行することができる）。

【0133】

構築物：膜に固定されたクラスＩｓｃ−ｐＭＨＣ分子の１つの全体的なデザインは、図２に示される。簡単に言えば、この構築物は、直後に候補エピトープ（ペプチドとして表示）が続く、プラズマ膜局在化を可能にするための天然ヒトＢ２Ｍリーダー配列を用いている。ＥＲでリーダー配列を完全に除去すると、ＭＨＣ結合ポケット中にペプチドを提示することができる。これは更に、天然Ｂ２Ｍ分子、ヒトＨＬＡ−Ａ０２：０１対立遺伝子、及びリンカー領域を介して、表面に露出したｍＣｈｅｒｒｙ発現プロキシに結合している（各リンカーについて

の４個の反復）。全体の構築物を、天然のクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメイン（ＨＣＴＭ）を介して膜に保持する。ＭＨＣクラス−Ｉ分子への抗原性ペプチドの共有結合は、十分に確立されており、生体外及び生体内の両方で非常に有効である［２８〜３０］。この戦略は、非共有結合ペプチド複合体の交換（交差提示）、特に弱く結合しているものの交換から生じる、意図しないＴ細胞結合／活性化に関連する困難さを排除する。更に、このモジュール設計は、所定のＭＨＣ対立遺伝子に関連する異なるペプチド配列をコードする大きなライブラリーの生成（及びその後の照合）のための高スループットの分子生物学的操作（例えば、クローニング／シークエンシング）に容易に受け入れられる。このプラットフォームは、一本鎖構造の「普遍的」な性質を利用する。このパラダイムでは、ライブラリーの中での唯一の違いは、九量体ペプチド自体をコードする２７ヌクレオチドの配列である（例えば、エピトープ）。この非反復配列は、「ユニバーサルプライマー」（図２において順方向／逆方向として表示）を用いて増幅することができ、かつ、大規模シークエンシング、及びそれに続くＴ細胞投与後の翻訳によって、容易に識別されることができる［３１〜３４］。特に、「ユニバーサル」プライマーアニーリングのためのコンセンサス領域を形成するヌクレオチド配列は、内因性Ｂ２Ｍプールからバックグラウンド増幅を回避するために、天然Ｂ２Ｍヌクレオチド配列から離れて改変されている（すなわち、ＨＥＫ細胞からのＢ２Ｍ）。

【0134】

ＭＨＣ対照。本発明者らのグループレバレッジの５個の既知病原性のＨＬＡ−Ａ０２限定エピトープ内の初期実行可能性調査は、５つの独立したウイルス性病原体（サイトメガロウイルスｐｐ６５タンパク質残基４９５〜５０４［以後ＣＭＶと呼ばれる］、インフルエンザマトリックスタンパク質５８〜６６［ＦＬＵ］、エプスタイン・バーウイルスＢＭＬＦ１２５９〜２６７［ＥＢＶ］、ヒトＴリンパ球向性ウイルスタックス１１〜１９［ＨＴＬＶ］、及び、ＨＩＶｇａｇｐ１７７６〜８４［ＨＩＶ］）に結合されている。ＨＥＫ２９３の安定な細胞株を、図２に示す天然のヒトクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメインを介して膜に固定された表面ｍＣｈｅｒｒｙの発現プロキシを有するｓｃ−ｐＭＨＣ構築物を担持しているウイルスのレンチウイルス形質導入により作製した。本発明者らの構築物の表面発現を、ｍＣｈｅｒｒｙのプロキシ発現及び抗ｍＣｈｅｒｒｙの表面発現をモニタリングする蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を介して検証して（図３に示されているもの４つ）、そして、構築物が発現して適切に形質膜を標的とすることを立証する。特に、ＥＢＶ対照ペプチドは、この図の生成後に添加したが、ＥＢＶの表面発現プロファイルは、他の４つの対照で観察されるものを反映している（データは図示せず）。

【0135】

このシステムでは、ｍＣｈｅｒｒｙの表面提示は、変性タンパク質がより頻繁にＥＲ／ゴルジに閉じ込められている／保持されているにつれて、ＭＨＣ構築物の適切な折り畳みの指標となるが［３５］、しかしながらＭＨＣの折り畳みの直接評価がもちろん望ましい。ＨＥＫ２９３細胞が、自然にＨＬＡ及びＢ２Ｍ分子を発現するため、表面Ｂ２ＭまたはＨＬＡを直接染色して適切な折り畳みをモニターすることは困難である。単鎖膜を固定したＭＨＣデザインによって、天然ヒトＢ２Ｍの５'非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的とする、適切に折り畳まれた材料ｓｈＲＮＡヘアピン（ｐＧＩＰＺクローンＶＡ２８２［カタログ番号：ＲＨＳ４４３０−１０１０９８３４５］がもたらされることを確実にするために、ＥｉｎｓｔｅｉｎのｓｈＲＮＡコア施設によって提供されるノックダウン細胞）を活用して、Ｂ２Ｍ及びＨＥＫ細胞内の表面ＭＨＣの内因性発現を下方調節した（Ｂ２Ｍは、ＭＨＣのアイソタイプに関係なく、ＭＨＣ折り畳み／局在化には不可欠であるので、下方制御のために選択した）。この実装には、統合された構築物の持続的な発現を促進するために、５'ＵＴＲが含まれていない。図４で示す通り、天然ＨＬＡの９５％超を、立体配座依存性の抗ＭＨＣクラスＩ抗体に対する表面染色によりモニターした通り、ｓｈＲＮＡ戦略を使用して効果的に下方制御した（使用したｍＡｂＷ６／３２は、ＭＨＣとＢ２Ｍの両方が結合するために適切に折り畳まれていることが必要である［３６］。特に、リーダーペプチドの及びエピトープ提示の適切な処理は、ＭＨＣの安定性／折りたたみの要件である。）。ＭＨＣ表面の発現は、ライブラリー（ＣＭＶ）からの代表的な構築物による形質導入により回復された。まとめると、これは、構築物が適切に局在すること（抗ｍＣｈｅｒｒｙよりモニターされる通り）、及び十分に折りたたまれていること（抗ＨＬＡでモニターした通り、図４）の両方を示唆する。

【0136】

ＴＣＲ対照。この実験室内での懸濁適合ＨＥＫ細胞株の広範囲な使用を考え、当然、ＨＥＫ細胞を、対照ＴＣＲ株の生成のために発現宿主として必然的に選択した。ＨＥＫ２９３細胞は、ＴＣＲ遺伝子を内因的に発現せず、また修飾なしにＴＣＲ構築物を発現することもできない（本発明者ら自身［データは示されていない］、及び他者により観察される通り［３７］）。ＴＣＲは、不変のＣＤ３鎖分子との複合体の一部として発現される、ジスルフィドで結合した膜固定ヘテロ二量体（α／β鎖）である。ＣＤ３鎖はＴＣＲとともに、Ｔ細胞受容体複合体として知られるものを形成する。完全な複合体は、適切な発現及び形質膜局在化のために必要とされる。対照ＴＣＲの発現を可能にするために、レンチウイルス同時形質導入技術を用いたが、この技術は、１つのレンチウイルス構築物が、種々のウイルス２Ａ「自己切断型」ペプチドで結合された完全なＣＤ３遺伝子カセットを保有し［３７］（図５、上部）、第２のレンチウイルス構築物が、単一のＰ２Ａペプチドによって結合されたＴＣＲのα鎖及びβ鎖を担持して、Ｐ２Ａペプチドが哺乳動物細胞中で最も高い「切断」効率を示すときに化学量論的発現を可能にする、［２］。ｍＣｅｒｕｌｅａｎ（ＢＬＵＥ）発現プロキシは、β鎖の膜貫通セグメント（図５、下部）に従う。原理証明の研究は、以上で考察されたＨＬＡ分子のために５個の同族ＴＣＲ（ＴＣＲＲＡ１４［ＣＭＶペプチドに特異的に結合する］、ＪＭ２２［ＦＬＵ］、ＡＳ０１［ＥＢＶ］、Ａ０６［ＨＴＬＶ］、及び１８０３［ＨＩＶ］）を用いる。構築物の表面発現を、同族ＭＨＣ五量体染色（図６、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅから購入した五量体）により確認された抗ＴＣＲ、及び抗ＣＤ３抗体染色（データは図示せず）並びに活性Ｔ細胞複合体形成により確認した。形質導入されていない細胞を陰性対照として使用した。

【0137】

ｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングプラットフォーム。従来のＭＨＣ四量体（またはより最近の五量体）ベースの提示によって、単一のタンパク質に対する結合活性が強化されるが、真核細胞の細胞膜上でクエリータンパク質が発現することにより、抗原密度がより大きくなり、結合活性が顕著により高くなり、かつより微弱なｐＭＨＣ：ＴＣＲの相互作用を検出するためのダイナミックレンジが拡大することが期待される。５個のＴＣＲを個別に発現させて、５個の同族ｓｃ−ｐＭＨＣのｅｐｉＣＥＬＬを補完した。細胞質ｍＣｈｅｒｒｙ（ＣＹＴＯとして表示）、及び表面発現したｍＣｈｅｒｒｙを（ＭＨＣなし、ＳＴＡＬＫとして表示）を、陰性対照として使用した。個体集団及び混合集団のフローサイトメトリー分析によって、同族ＭＨＣ：ＴＣＲ対を発現する細胞は、両方提示されるときのみ（図７）、特定の細胞−細胞間の相互作用を表すシグナルが顕著に増加する（１００倍、Ａ０６：ＨＴＬＶ相互作用）ことが明示された。次に、２つのｅｐｉＣＥＬＬ（ＣＭＶ及びＦＬＵ）はプールされ、独立したＴＣＲ保有ＨＥＫ細胞（ＪＭ２２のみ）を用いて投与され、かつ、形成された複合体上で選別された。各プールからゲノムＤＮＡを抽出し、エピトープの周りの隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いて、ＰＣＲの約３０サイクル実施した（図２、上部）。得られたＰＣＲバンドは、図８（上部）に示され、これらのアンプリコンは、ライブラリー調製（例えば、多重ＴｒｕＳｅｑでインデックス付けされたアダプタの追加）のために提示し、その後の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を実施した（イルミナＭｉＳｅｑ）。ライブラリー調製及びシークエンシングは、ＥｉｎｓｔｅｉｎＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓのコア施設で実施した。ＮＧＳの実行から得られたＦＡＳＴＱファイルを分析して、エピトープを容易に同定した（図８、下部）。それぞれでは、観測されたエピトープ配列の絶対数は、本発明者らのＱＣフィルターを通過する全ての観測されたＮＧＳの読み取りの割合として計算して標準化した。注目すべきは、これらは、ライブラリー内の第１の検証された構築物であったので、ＣＭＶ及びＦＬＵは、最初のスクリーニングのために選択したことである。

【0138】

更なる実施例において、ＥＢＶＢＭＬＦ１タンパク質を表す全ての重複九量体（約４００個のｅｐｉＣＥＬＬの１プール）に対する完全なスクリーンは、ＥＢＶ感染患者からの免疫優性署名を同定するために調査することができる（３５歳未満の成人の約９５％がＥＢＶ反応性末梢Ｔ細胞を維持するため、この対象が選択された）。

【0139】

ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームは、ヒト疾患に関連する生体関連Ｔ細胞エピトープの全体集合を定義するのに使用することができる。エピトープマッピングのための、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）をベースとするｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームは、より大規模な「コンビナトリアル」ライブラリーと組み合わせて、選択したＴＣＲに対するミモトープスクリーニングの拡張を可能にし、それによって親和性／反応速度が変更された結合物質を同定することができ、更に、同時に包括的な適用範囲に匹敵する感度で単一の患者試料内の全ての免疫学的反応性の調査にまで拡大適用することができる。ペプチド抗原エピトープ（及びミモトープ）の同定は、保護及び病理学的免疫応答に関与するクラスＩＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の同定、単離、及び調節における重要な第１のステップである。特に、記載される方法は、クラスＩＩ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）反応性の類似する徹底的な調査に容易に拡大適用／変更することができる。

【0140】

実施例２
この実験では、５個のＭＨＣを保有する全てのｅｐｉＣＥＬＬ用のレンチウイルス（ＣＭＶ、ＦＬＵ、ＥＢＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ）を、個別に形質導入し、等しい比率でプールし、４個の同族ＴＣＲを有する細胞（ＲＡ１４、ＪＭ２２、ＡＳ０１、Ａ０６）に対して別々に投与して、形成された複合体上で選別した。各プールからのゲノムＤＮＡを抽出し、エピトープの周りの隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲの約３０サイクル実施した。得られたＰＣＲバンドは、図９（上部）に示されており、これらのアンプリコンは、ライブラリー調製のために提示し（例えば、多重ＴｒｕＳｅｑ（登録商標）のインデックス付きアダプタの追加）、その後の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を実施した（イルミナＭｉＳｅｑ）。ライブラリーの調製及びシークエンシングは、アルバート・アインシュタイン医科大学のエピゲノミクスのコア施設で実施した。ＮＧＳの実行から得られたＦＡＳＴＱファイルを分析して、エピトープを容易に同定した（図９、下部）。事前に選別された集団（ライブラリー）内で同定されたエピトープは、１６〜２３％の範囲内であった（データは図示せず）。ＴＣＲ投与データセットのそれぞれでは、観察されたエピトープ配列の絶対数は、ＱＣフィルターを通過する全ての観測されたＮＧＳ割合として計算して標準化し、事前に選別したプールから採取された平均及び標準偏差パラメータを用いて、Ｚスコアを計算するために使用した。これらの結果は、ｅｐｉＣＥＬＬプラットフォームの有用性を強調し、更には非最適化結合／洗浄プロトコールを使用するスクリーンの頑強性を示す。

【0141】

実施例３
ｅｐｉＣＥＬＬの有用性は、単一鎖構築物（Ｆｃ融合による二価の提示の有り及び無し）だけではなく、分割構築物（ｓｙｎＴａｃ）も含み、それによってｅｐｉＣＥＬＬに関連する複合タンパク質またはペプチド断片の部分提示を可能にするように拡大することができる。また、ｅｐｉＣＥＬＬプール由来の断片を含有する小細胞膜（例えば、微小胞、エキソソーム、ウイルス様粒子［ＶＬＰ］、及びレトロウイルス［例えば、レンチウイルスなど］）の使用により、スクリーニングのための反応体積の大幅な減少が可能となっている（これらのウイルス粒子ベースの手法は、しばしば、本明細書において、「ビラトープ」と称される）。これらの発現プール（ｅｐｉＣＥＬＬまたはビラトープ）に、健康な患者、感染した患者、治療された患者、免疫を与えられた患者由来のＴ細胞を投与して、疾患、診断、治療、中和、並びに疾患の進行及び治療応答のモニタリングに直接関連するそれらのエピトープを同定する。

【0142】

例示的な変異体は、直後にリンカーＬ１を介してＢ２Ｍ分子に共有結合されている候補ペプチドエピトープが続く、天然ヒトＢ２Ｍリーダー配列と同一の配列を、引き続き用いている（図１０Ａに図示されている）。しかし、３つの新しい構築物は、それらの全体的な構築様式、及び、共有組織が異なる。第１の変異体（図１０Ａ（１）参照）は、従来のｅｐｉＣＥＬＬベースの提示に類似するが、先端のＣ末端にウイルスパッケージングシグナルが加えられている（例えば、ＶＰとして表示されたＧＰ４１エンベロープタンパク質の残基７０６〜７１３）。ＶＰ配列の存在は、従来のｅｐｉＣＥＬＬベースのスクリーニングの分野では影響がないが、ｅｐｉＣＥＬＬプールから出芽したとき、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）またはレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）へのパッケージングを可能にする。表面発現した構築物の局所的結合価を高めるために、ＶＰ配列で再度終結するＦｃ融合ベースの構築物を使用して（図１０Ａ（２）、ヒトＩｇＧｌＦｃ、マウスＩｇＧ２ａＦｃなど）、ウイルスパッケージングを可能にする。表面発現のプロキシ（すなわち、ｍＣｈｅｒｒｙ）を、この変異体から除去しているので、従来の抗体のためのエピトープ（例えば、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ等）を、リンカーＬ４中に置き、それにより、抗体染色を介して細胞膜の局在化を検出することができるようになっている。現在記載されているこれらの構築物（Ａ.ｌ及びＡ.２）は、一本鎖構造を利用しており、したがって、スクリーニング目的のために代替タンパク質結合を介してシステムを拡張する能力に制限される。追加のタンパク質またはペプチド結合の包含を介してｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングプラットフォームのモジュール性／柔軟性を高めるために、この実験室においてまた開発されたｓｙｎＴａｃベースの発現構築物を用いる。簡単に言えば、戦略の基礎的をなすｓｙｎＴａｃは、ＭＨＣ構築物を、ペプチドとタンパク質の両方を様々な末端に（図１０Ａ.（３）及び図１０Ｂに図示する）に融合することにより、重鎖と軽鎖のそれぞれに分割する。この構築物によって、ペプチドエピトープが軽鎖（Ｂ２Ｍ）のＮ末端に共有結合的に融合し、次いで、軽鎖のカルボキシ末端が本発明者らのＭＯＤエフェクター分子に延長する、図１０Ｂ。このシナリオにおいて、重鎖（ＨＬＡ分子）は、Ｆｃドメインに融合される。すべての成分は、真核細胞（例えば、ＨＥＫ、ＣＨＯ）の産生中に会合して、自己組織化する。特に、２つの鎖は、ジスルフィド結合を介して共有結合的に連結されている（赤線で示す）。この場合のＭＯＤは、任意のタンパク質、ペプチド、またはスクリーニングのために必要な他の化学物質であり得る。例としては、二次染色のための抗体のエピトープ（ＦＬＡＧ、ＭＹＣなど）、直接蛍光検出のための蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ｍＦｒｕｉｔなど）、核酸結合タンパク質、または、同時調節タンパク質がある。全ての構築物は、天然のクラス−Ｉ重鎖膜貫通ドメインを介して細胞膜（ＴＭ、これは、任意のヒト、マウス、または他のＴＭドメインであってよい）に局在化する。ユニバーサルプライマーを使用して、Ｔ細胞投与後にこの構築物で見出される非反復２７ヌクレオチド配列（九量体ペプチド）を増幅し、それによって、疾患関連エピトープを直接同定する。しかし、５〜２０アミノ酸で変動するがそれに限定されていない長さのペプチドは、候補エピトープである。

【0143】

レンチウイルスディスプレイ用ｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングプラットフォームの拡張：ビラトープ。完全なコンビナトリアルスクリーニングの分野において（例えば、ペプチド配列が完全にランダム化されたとき）、従来のｅｐｉＣＥＬＬを用いたとき、完全なライブラリーの適用範囲を確保にする体積（すなわち、１０^９個のエピトープ）は、１０〜１００ミリリットルの範囲であり得る。この要件は、主として、高濃度（例えば、１ｍｌあたり１千万超の濃度）での乏しい細胞生存性に加えて、ｅｐｉＣＥＬＬディスプレイに使用されるＨＥＫ細胞の比較的大きなサイズに起因する。レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）は、日常的に、エンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇなど）と共に、特定のウイルスがコードされた遺伝子（ヘルパープラスミドと呼ばれる）を含有するパッケージングプラスミドでのトランスフェクションを介してＨＥＫ細胞から生成する。注目すべきことに、これらの細胞から出芽したレトロウイルス粒子は、極端な濃度（１ｍｌ当たり１０億超の）で安定している。減少した反応体積及び強化された安定性を利用するために、表面発現ＭＨＣ構築物内で、ウイルスパッケージングシグナル（ＶＰ）を活用して、ヘルパープラスミド単独での（エンベローププラスミドの添加なしの）ｅｐｉＣＥＬＬプールのトランスフェクション後のウイルス粒子へのパッキングを可能にし、それによって、ペプチドＭＨＣにより出芽レンチウイルスを効果的にシュードタイプ化させる。具体的には、単鎖構築物（図１０Ａ.（２））は、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１に結合されたペプチドエピトープから成り、ヒトＩｇＧ１Ｆｃは、第３世代のレンチウイルストランスフェクションシステムのエンベロープ成分と置換した。構築物はまた、（Ｌ４リンカー領域に配置された）二次抗体による検出のためのＦＬＡＧエピトープタグを含有した。ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１との関連で提示されるペプチドエピトープは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の

ペプチドエピトープ、またはインフルエンザ（ＦＬＵ）由来の

ペプチドエピトープのいずれかである。採取したレンチウイルスを、超遠心分離により１００倍濃縮して４℃で保存した。各ビラトーププールからのゲノムＲＮＡ（ＤＮＡとは対照的）は、抽出して、一連の逆転写（ＲＴ）を行い、続いて、エピトープの周囲の隣接領域を標的とするユニバーサルプライマーを用いてＰＣＲを約３０サイクル実施した。得られたＰＣＲバンドは、図１１Ａに示されている。特に、ＰＣＲバンドは、最初のＲＴステップ（レーン１）の存在下でのみ観察され、逆転写酵素を省略したときは（レーン２）、存在せず、それによって、コンピテントな（例えば、ＲＮＡを負荷した）レトロウイルスの生成が実証される。これらのアンプリコンは、ライブラリーの調製のために提示され（例えば、多重化ＴｒｕＳｅｑのインデックス付きアダプタの追加）、及びその後の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、ｅｐｉＣＥＬＬスクリーニングとのプロセスの互換性を確保するために実施した（ｉｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑ）。ライブラリー調製及びシークエンシングは、ＥｉｎｓｔｅｉｎＥｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓのコア施設で実施した。ＮＧＳの実行から得られたＦＡＳＴＱファイルを分析して、エピトープを容易に同定した（図１１Ｂ）。続いて、以前のｅｐｉＣＥＬＬ結合実験と同様に、ビラトープを、特定の、または、無関係のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のいずれかでトランスフェクトしたＨＥＫ細胞に適合した。余分なビラトープ粒子を細胞から洗浄し、残りの細胞に結合したレンチウイルスは、ＰＥ結合抗ＦＬＡＧ抗体を介して検出した。無関係なエピトープではなく、同族体によりシュードタイプ化したビラトープは、特定のペプチドのＭＨＣ五量体による染色に匹敵する方法（図１２）で、それぞれのＴＣＲ発現ＨＥＫ細胞に結合し、それによって、特異性、及び、エピトープスクリーニングのためのｅｐｉＣＥＬＬプール由来のビラトープ粒子の特異性及び一般的な有用性が実証された。

【0144】

エピトープマッピングのための現行の次世代シークエンシング（ＮＧＳ）ベースのｅｐｉＣＥＬＬ／ビラトーププラットフォームは、より大きな「コンビナトリアル」ライブラリーと組み合わせて、選択したＴＣＲに対するミモトープスクリーニングの拡張を可能にし、それによって親和性／反応速度が変更された結合物質を同定することができ、更に、同時に、包括的な適用範囲に匹敵する感度で、単一の患者試料内の全免疫学的反応性の調査にまで拡大適用することができる。ペプチド抗原エピトープ（及びミモトープ）の同定は、保護及び病理学的免疫応答に関与するクラスＩＭＨＣ拘束性Ｔ細胞の同定、単離、及び調節において重要である。上述の方法は、クラスＩＩ（ＣＤ４^＋Ｔ細胞）反応性の類似する調査に容易に拡大適用される。

【0145】

参考文献