特許 6875292 修飾された非内因性単糖化合物の使用を含む、生きている細菌を特異的に標識するための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6875292

(24)【登録日】2021年4月26日

(45)【発行日】2021年5月19日

(54)【発明の名称】修飾された非内因性単糖化合物の使用を含む、生きている細菌を特異的に標識するための方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/04 20060101AFI20210510BHJP

   C12Q 1/10 20060101ALI20210510BHJP

   C12Q 1/14 20060101ALI20210510BHJP

   C12N 1/20 20060101ALN20210510BHJP

   G01N 33/569 20060101ALN20210510BHJP

   G01N 21/64 20060101ALN20210510BHJP

【ＦＩ】

   C12Q1/04

   C12Q1/10

   C12Q1/14

   !C12N1/20 Z

   !G01N33/569 F

   !G01N21/64 Z

【請求項の数】13

【全頁数】27

(21)【出願番号】特願2017-557442(P2017-557442)

(86)(22)【出願日】2016年5月3日

(65)【公表番号】特表2018-519798(P2018-519798A)

(43)【公表日】2018年7月26日

(86)【国際出願番号】EP2016059880

(87)【国際公開番号】WO2016177724

(87)【国際公開日】20161110

【審査請求日】2019年4月12日

(31)【優先権主張番号】15166250.9

(32)【優先日】2015年5月4日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】506316557

【氏名又は名称】サントル ナショナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティフィック

(73)【特許権者】

【識別番号】511025226

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ デクス−マルセイユ

【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ Ｄ’ＡＩＸ−ＭＡＲＳＥＩＬＬＥ

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】サム・デュカン

(72)【発明者】

【氏名】ボリス・ヴォゼル

(72)【発明者】

【氏名】ジョルディ・マス・ポンス

(72)【発明者】

【氏名】オレリー・バロン

【審査官】 北村 悠美子

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１５−５０５２４８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Tetrahedron，１９９０年，Vol.46, No.1, p.201-214

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｑ １／００−３／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

細菌を含む試料中の生きている細菌を特異的に標識するための方法であって、
a)前記試料の前記細菌を、第2の反応性基と化学的に反応することができる第1の反応性化学基を含む少なくとも1つの修飾された単糖化合物と共にインキュベートし、その結果、前記第1の反応性基を有する単糖残基が、前記生きている細菌のエンベロープに組み込まれる工程と、
b)前記生きている細菌のエンベロープに組み込まれた前記残基を、前記第2の反応性基を含む標識分子と接触させて、前記生きている細菌内に組み込まれた前記残基の前記第1の反応性基と前記標識分子の前記第2の反応性基との化学反応を生じさせて、共有結合を生じさせる工程と
を含み、
前記残基は、前記細菌のエンベロープの内因性ウロソン酸残基ではなく、好ましくは、前記残基は、前記細菌のエンベロープの内因性ウロソン酸残基の天然に存在しない立体異性体であり、前記修飾された単糖化合物は、以下の式(I):

【化1】

(式中、
- Aは、H、OH、NH₂であり、OH及びNH₂はアルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル及びイミドイル基から成る群から選択される保護基で置換されているか又は置換されておらず、
- Bは、OH、NH₂であり、OH及びNH₂はアルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル及びイミドイル基から成る群から選択される保護基で置換されているか又は置換されておらず、
- Cは、OH、NH₂であり、OH及びNH₂はアルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル及びイミドイル基から成る群から選択される保護基で置換されているか又は置換されておらず、
- Dは、C₂アルキル又はC₄アルキルであり、各炭素は、OH又はNH₂で置換されているか又は置換されておらず、OH及びNH₂はアルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル又はイミドイル基から成る群から選択される保護基で置換されているか又は置換されておらず、
- D基は、前記第1の反応性基Raで置換されており、
第1の反応性基Raが、アジド基からなる又は有する基及びアルキン基からなる又は有する基から選択され、前記第1の反応性基は好ましくはアジド基であり、前記第2の反応性基は、アルキン基及びアジド基からそれぞれなる又は有する基から選択され、前記第2の反応性基は好ましくはアルキン基であり、前記アジド反応性基と前記アルキン反応性基との反応は、アジド-アルキン環化付加を実施する際に行われる)
を有する化合物又はその塩であることを特徴とし、
前記生きている細菌が、以下の種の細菌:バチルス・セレウス、バチルス・セレウス・パリ、エンテロコッカス・デュランス、エンテロコッカス・フェカーリス、エシェリキア・コリ、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumophila)、レジオネラ・ニューモフィラ、リステリア・モノサイトゲネス、ミクロコッカス・ルテウス、ナイセリア・ゴノレエ、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitides)、プロテウス・ミラビリス、プロビデンシア・スチュアーティイ、シュードモナス・フルオレッセンス・ミグラ、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミス、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、ステノトロホモナス・マルトフィリア、ストレプトコッカス・アガラクティアエ及びビブリオ・コレラエから選択される、方法。

【請求項2】

前記修飾された単糖化合物は、式(I)の化合物であって、式中、D=-CHOH-CH₂-OH、A=H、B=OH、C=OHであり、B、C及びDのOHは、アルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、又はホルミル基である保護基で置換されているか又は置換されておらず、D基は、前記第1の反応性基Raで置換されている、請求項1に記載の方法。

【請求項3】

前記修飾された単糖化合物は、置換された化合物(I)であり、式中、D=-CHOH-CH₂-Ra、A=H、B=OH、C=OHであり、B、C及びDのOHは、アルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、又はホルミル基で置換されているか又は置換されていない、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】

Raは、-N₃又は-C≡CHである、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記修飾された単糖化合物は、以下の立体異性体の式(Ia):

【化2】

を有する化合物又はその塩である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記細菌が、グラム陽性細菌である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

以下の種の細菌:エンテロコッカス・フェカーリス、リステリア・モノサイトゲネス、ミクロコッカス・ルテウス、ナイセリア・ゴノレエ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス又はスタフィロコッカス・エピデルミスから選択される細菌を標識するための、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

c)前記細菌が、そのエンベロープに結合されている前記標識分子を含むかどうかを検出すること、及び/又は前記標識分子を有する前記生きている細菌を固体基質に固定化することで、生きている細菌を検出する更なる工程を含み、ここで、前記標識分子は、検出可能な物質を含むか若しくは検出可能な物質に反応若しくは結合することができる分子であるか、又は前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1の分子であり、前記第1の分子は、第2の分子及び/又は固体基質に反応又は結合することができ、好ましくは、前記第2の分子は検出可能な物質を含む及び/又は前記第2の分子は前記固体基質に結合されているか若しくは結合されうる、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

細菌を含む試料中の前記細菌の生きている細菌を特異的に標識するための、請求項8に記載の方法であって、前記標識分子は、検出可能な物質を含む検出可能な分子であり、前記方法は、c)前記細菌が、その外膜のグリカンに結合されている前記検出可能な分子を含むかどうかを検出することで、生きている細菌を検出する工程を含む、方法。

【請求項10】

前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド又は第1の結合タンパク質であり、工程c)において、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に連結された前記生きている細菌は、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質と、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に対して特異的に反応する又は結合する第2のリガンド又は第2の結合タンパク質とを接触させることにより、検出される及び/又は固定化される、請求項8又は9に記載の方法。

【請求項11】

前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド、好ましくはビオチンであり、工程c)において、前記第1のリガンドに連結されている前記生きている細菌は、前記細菌と、前記第1のリガンドに対して特異的な抗体との反応により検出され、前記抗体は、検出可能な物質、好ましくは蛍光色素若しくは発光分子又は酵素を有する、請求項8から10のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

請求項1から11のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキットであって、
- 請求項1から5のいずれか一項に定義された、式(I)の前記修飾された単糖化合物と、
- 請求項1から11のいずれか一項に定義された、前記第1の反応性基と反応することができる前記第2の反応性基を含む前記標識分子と、
- 必要であれば、前記第1の反応性基と、前記標識分子の前記第2の反応性基との反応を生じさせるための反応物質と
を含む、キット。

【請求項13】

- 前記検出可能な分子、又は蛍光色素若しくは発光分子若しくは酵素を含む検出可能な物質を有する前記第2の分子、及び/或いは
- 前記標識分子に特異的に反応又は結合することができる、前記第2の分子を有する固体基質、及び
- 好ましくは、前記細菌の増殖を可能にする培養又はインキュベーション培地
を更に含む、請求項12に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、反応性基を有する化合物を、生きている細菌に組み込むことで、前記細菌のエンベロープを標識するための方法に関する。本発明は、より詳細には、細菌の標識化を可能にする方法を提供する。

【0002】

本明細書で用語「エンベロープ」は、細菌の表面のいずれかの壁、層又は膜、特に細胞壁を含み、エンベロープは、より詳細には、細菌の内部形質膜及びペプチドグリカン層並びにグラム陰性細菌の外膜を含む。

【0003】

本発明は、修飾された単糖化合物を、生きている細菌のエンベロープに、より詳細には、細菌のエンベロープの多糖(特にLPS又はCPS)に組み込むことで、前記生きている細菌を標識するための方法に関する。本発明は、より詳細には、修飾された非内因性単糖、すなわち、そのように標識される細菌のエンベロープ内に特異的に存在していない単糖を使用して、グラム陰性及びグラム陽性細菌の両方の標識を可能にする方法を提供する。

【背景技術】

【0004】

WO2013/107759は、生きている細菌、より詳細には、グラム陰性細菌を標識する方法を開示している。この方法は、前記細菌の膜に、資化により、アジド基(-N₃)又はアルキン基(-C≡CH)等のいわゆる第1の反応性化学官能基を有するように修飾されたウロソン酸型内因性単糖化合物のアナログを組み込んで、この第1の反応性基と対応する反応性基を有する分子との、特にいわゆるクリックケミストリー反応を介した反応を可能にすることから本質的に構成される。

【0005】

より詳細には、WO2013/107759において、そのように修飾されたウロソン酸又はウロソン酸残基を含む内因性糖のアナログは、そのような残基が、細菌膜、特に全てのグラム陰性細菌のLPSのグリカンに見出すことができ、更にはグラム陰性細菌のLPSの前記グリカンに組み込まれるのと同じ形態で直接的に資化されうることにおいて、特に有利であることが開示されている。

【0006】

ウロソン酸(ケトアルドン酸又はアルドウロソン酸とも称される)は、ケトース官能基がC-2位に、及びカルボン酸がC-1位に存在しているケトースファミリーの単糖である。オクツロソン酸及びノヌロソン酸は、様々な形態の細菌グリカン(特にLPS、莢膜多糖、糖タンパク質)を含む多様な天然グリカンで見出される。これらのグリカンの合成を導く生合成経路には、一般的に、後にCMP-糖ドナーの形態で直接的に活性化される遊離のウロソン酸が中間体として関与している。全てのグラム陰性細菌のLPSは、前記ウロソン酸残基を含む。

【0007】

より明確には、WO2013/107759に開示されている方法は、細菌を含む試料中の所与のカテゴリーの細菌の生きている細菌を特異的に標識するための方法であって、
a)前記試料の前記細菌を、単糖化合物の少なくとも1つのアナログと共にインキュベートする工程であり、前記単糖は、そのような所与のカテゴリーの細菌の外膜のグリカンの内因性単糖残基であり、前記内因性単糖残基は、ウロソン酸又はウロソン酸塩残基を含み、前記単糖化合物のアナログは、標識分子の第2の反応性基と反応することができる第1の反応性化学基によって所与の位置で置換された修飾された単糖である、工程と、
b)前記細菌を前記第2の反応性基を含む前記標識分子と接触させて、前記生きている細菌の外膜の前記グリカン内に組み込まれた前記アナログ残基の前記第1の反応性基と、前記標識分子の前記第2の反応性基との反応を生じさせる工程と
を含む方法である。

【0008】

詳細には、WO2013/107759において、前記単糖のアナログは、以下の式(I'):

【0009】

【化1】

【0010】

(式中、
- A、B及びCは、独立して、H、OH、NH₂であってよく、OH及びNH₂はその保護基で置換されているか又は置換されておらず、
- Dは、C₂〜C₄アルキル鎖であり、
- A、B、C又はD基の少なくとも1つは、前記第1の反応性基で置換されている)
の1つを有する置換されたウロソン酸又はそのウロソン酸塩である。

【0011】

WO2013/107759では、工程a)で生きている細菌と共にインキュベートされ、次いで、細菌による資化後にその外膜内に組み込まれている前記単糖のアナログは、前記第1の反応性基の置換によってのみ修飾されていることを除いて、外膜のグリカン鎖に組み込まれている内因性単糖と同一でありうる。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0012】

【特許文献1】WO2013/107759

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0013】

本発明は、他の細菌又はより広い範囲の細菌、特にグラム陰性及びグラム陽性細菌の両方において資化することができ、細菌の関与するカテゴリーに対する組込みの特異性に関して有利で異なる特性を示す、他の単糖化合物を見出すことを目的とした。

【課題を解決するための手段】

【0014】

より明確には、本発明は、細菌を含む試料中の生きている細菌を特異的に標識するための方法であって、
a)前記試料の前記細菌を、第2の反応性基と化学的に反応することができる第1の反応性化学基を含む少なくとも1つの修飾された単糖化合物と共にインキュベートし、その結果、前記第1の反応性基を有する残基、好ましくは単糖残基が、前記生きている細菌のエンベロープに、特に前記細菌のエンベロープの多糖に、より特には前記細菌の外膜のLPS又はCPSに組み込まれる工程と、
b)前記生きている細菌のエンベロープに組み込まれた前記残基を、前記第2の反応性基を含む標識分子と接触させて、前記生きている細菌内に組み込まれた前記残基の前記第1の反応性基と前記標識分子の前記第2の反応性基との化学反応を生じさせて、共有結合を生じさせる工程と
を含み、
前記残基は、前記細菌のエンベロープの内因性ウロソン酸残基ではなく、好ましくは、前記残基は、前記細菌のエンベロープの内因性ウロソン酸残基の天然に存在しない立体異性体、特に、前記細菌の外膜の多糖の内因性ウロソン酸残基の天然に存在しない立体異性体であり、前記修飾された単糖化合物は、以下の式(I):

【0015】

【化2】

【0016】

(式中、
- A、B及びCは、独立して、H、OH、NH₂であってよく、OH及びNH₂はその保護基で置換されているか又は置換されておらず、好ましくはOH及びNH₂はアルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル又はイミドイル基で置換されており、
- Dは、C₂〜C₄アルキル鎖であり、各炭素は、OH又はNH₂で置換されているか又は置換されておらず、OH及びNH₂はその保護基で置換されているか又は置換されておらず、好ましくはOH及びNH₂はアルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル又はイミドイル基で置換されており、
- A、B、C又はD基の少なくとも1つは、前記第1の反応性基で置換されている)
を有する化合物又はその塩であることを特徴とする、方法を提供する。

【0017】

より詳細には、そのような式(I)の化合物は、置換されたウロソン酸又はそのウロソン酸塩である。

【0018】

表現「天然に存在しない」は、前記第1の反応性基によって修飾された前記単糖化合物、すなわち、前記修飾された単糖化合物の修飾されていない単糖残基が、前記細菌のエンベロープのグリカンの内因性単糖残基として回収されず、前記細菌のエンベロープのグリカンのそのような内因性単糖残基の生合成経路におけるその前駆体としても回収されないことを意味する。

【0019】

細菌は、グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌、並びにグラム陰性でもグラム陽性でもない細菌を含む。

【0020】

そのような式(I)の化合物は、広範囲のカテゴリーの細菌により資化されうる。

【0021】

本発明に従って、前記修飾された単糖化合物が、前記第1の反応性基を有する前記残基を組み込むことで細菌により資化される明確な機構は完全に決定されるわけではない。

【0022】

しかしながら、前記単糖化合物は、前記細菌のエンベロープの内因性単糖残基と異なり、より詳細にはグラム陰性細菌の場合には、そのような細菌の外膜の多糖、例えば細菌のLPS又は莢膜多糖(CPS)の内因性単糖残基と異なる場合があるが、それにもかかわらず、前記細菌内へ入り込み、組み込まれうる。

【0023】

表現「内因性単糖残基」は、前記細菌のエンベロープ、より詳細には前記細菌のエンベロープの多糖に天然に存在する残基を意味する。

【0024】

より詳細には、本発明の方法において、前記修飾された単糖化合物は、WO2013/107759に開示及び特許請求された上記式(I')の修飾された内因性単糖の天然に存在しない立体異性体である。本発明の化合物は、インキュベーション工程a)の間に代謝及び変換されて、前記細菌のエンベロープのグリカン内に、おそらくは、そのような細菌のエンベロープのグリカンの修飾された内因性単糖残基、すなわち前記第1の反応性基を有する点で修飾された内因性単糖残基に変換されて、組み込まれうる。

【0025】

代替的に、前記修飾された単糖化合物が、前記細菌に組み込まれた単糖残基以外の前記残基を生じる分子において、代謝、変換又は分解されるか、又は前記残基の前駆体を生じる可能性もある。

【0026】

ピラノース環を有する式(I)は、以下のフラノース環(II)と部分的に平衡でありうるが、一般的に、式(I)が優勢である:

【0027】

【化3】

【0028】

ここで、C=OHであり、EはE=CHOHDである。

【0029】

より詳細には、OHについて、保護基は、好ましくは、アルキル、ヒドロキシアルキル、アシル又はホルミル基でありうる。

【0030】

より詳細には、NH₂について、保護基は、アルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル又はイミドイル基から選択されうる。

【0031】

NH₂は、1つ又は2つの保護基、特に1つのCH₃基及び1つのアルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル又はイミドイル基、特にアセチル(Ac)、アセチミドイル(Am)、N-メチル-アセチミドイル、N,N-ジメチル-アセチミドイル、ホルミル(Fo)、又はヒドロキシブタノイル基で保護されていてもよい。

【0032】

前記修飾された単糖化合物の前記単糖残基は、前記細菌におけるエンベロープの式(I')の化合物:

【0033】

【化4】

【0034】

の内因性単糖残基の天然に存在しない立体異性体であることを理解する必要がある。

【0035】

特に、Kdoにおけるような以下の立体異性体:

【0036】

【化5】

【0037】

好ましくは、前記修飾された単糖化合物は、前記式(I):

【0038】

【化6】

【0039】

(式中:
- Aは、H、OH、NH₂であり、OH及びNH₂は前記保護基で置換されているか又は置換されておらず、
- Bは、H、OH、NH₂であり、OH及びNH₂は前記保護基で置換されているか又は置換されておらず、
- Cは、H、OH、NH₂であり、OH及びNH₂は前記保護基で置換されているか又は置換されておらず、
- Dは、C₂又はC₄アルキルであり、各炭素は、OH又はNH₂で置換されているか又は置換されておらず、OH及びNH₂はその保護基で置換されているか又は置換されておらず、好ましくはOH及びNH₂はアルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、ホルミル又はイミドイル基で置換されており、
- 少なくともD基は、前記第1の反応性基Raで置換されている)
を有する化合物又はその塩である。

【0040】

より詳細には、前記修飾された単糖化合物(monosaccharide)は、式(I)の化合物であり、式中、D=-CHOH-CH₂-OH、A=H、B=OH、C=OHであり、B、C及びDのOHは、保護基、好ましくは、アルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、又はホルミル基で置換されているか又は置換されておらず、B、C又はD基の少なくとも1つのOHは、前記第1の反応性基Raで置換されている。

【0041】

好ましくは、前記修飾された単糖化合物は、置換された化合物(I)であり、式中、D=-CHOH-CH₂-Ra、A=H、B=OH、C=OHであり、B、C及びDのOHは、好ましくは、アルキル、ヒドロキシアルキル、アシル、又はホルミル基で置換されているか又は置換されていない。

【0042】

より好ましくは、前記単糖化合物は、以下の立体異性体の式(Ia):

【0043】

【化7】

【0044】

を有する化合物又はその塩である。

【0045】

(Ia)は、8-アジド-3,8-ジデオキシ-D-グルコ-オクツロソネートと名付けられた、8-アジド-3,8-ジデオキシ-D-マンノ-オクツロソネートのC-4エピマーであり、

【0046】

【化8】

【0047】

として表すこともできる。

【0048】

前記化合物(Ia)は、内因性ウロソン酸Kdo(I-1')のC-4位での天然に存在しないエピマーである修飾された4eKdo(Ia')である:

【0049】

【化9】

【0050】

式の慣用表示に従って、上記の様々なサイクルのC-1〜C-n位の炭素原子及びこれらの炭素原子に結合している置換基Hは表していない。

【0051】

前記第1の反応性基と第2の反応性基の間の前記化学反応により、共有結合が生じ、いくつかの例では、共有結合は、リガンドが配位された金属錯体における共有結合的配位結合でありうる。

【0052】

好ましくは、前記第1の反応性基Raは、アジド基(-N₃)からなる又はアジド基(-N₃)を有する基及びアルキン基(-C≡C-)からなる又はアルキン基(-C≡C-)を有する基から選択され、前記第1の反応性基は好ましくはアジド基であり、前記第2の反応性基は、アルキン基及びアジド基からそれぞれなる又はアルキン基及びアジド基を有する基から選択され、前記第2の反応性基は好ましくはアルキン基であり、前記アジド反応性基と前記アルキン反応性基との反応は、アジド-アルキン環化付加を実施する際に行われる。

【0053】

より好ましくは、Raは、-N₃又は-C≡CHであり、好ましくは-N₃である。

【0054】

そのような式(I)の化合物は、広範囲のカテゴリーの細菌により資化されることができ、そのような細菌のエンベロープへの前記残基の組み込みを生じさせる。

【0055】

より詳細には、式(I)の化合物は、とりわけ以下の属の細菌から選択されうる細菌を標識するために使用されうる:バチルス属(Bacillus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、エシェリキア属(Escherichia)、クレブシエラ属(Klebsiella)、レジオネラ属(Legionella)、リステリア属(Listeria)、ミクロコッカス属(Micrococcus)、ナイセリア属(Neisseria)、プロテウス属(Proteus)、プロビデンシア属(Providencia)、シュードモナス属(Pseudomonas)、サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、スタフィロコッカス属(Staphylococcus)、ステノトロホモナス属(Stenotrophomonas)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)、ビブリオ属(Vibrio)。

【0056】

より詳細には、式(I)の化合物は、とりわけ以下の属の細菌から選択されうるグラム陰性細菌及びグラム陽性細菌を標識するために使用されうる:

【0057】

より詳細には、式(I)の化合物、好ましくは前記式(Ia)の化合物を資化することができるグラム陰性細菌の中で、以下の種を挙げることができる:エシェリキア・コリ(Escherichia coli)、クレブシエラ・ニューモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)、ナイセリア・ゴノレエ(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンジティディス(Neisseria meningitidis)、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、プロビデンシア・スチュアルティイ(Providentia stuartii)、シュードモナス・フルオレッセンス(Pseudomonas fluorescens)、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)、セラチア・マルセッセンス(Serratia marcescens)、ステノトロホモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholera)。

【0058】

より詳細には、式(I)の化合物、好ましくは前記式(Ia)の化合物を資化することができるグラム陽性細菌の中で、以下の種を挙げることができる:バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、エンテロコッカス・デュランス(Enterococcus durans)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス(Staphylococcus aureus aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミス(Staphylococcus epidermis)、スタフィロコッカス・サプロフィティカス(Staphylococcus saprophyticus)、ストレプトコッカス・アガラクティアエ(Streptococcus agalactiae)。

【0059】

上記細菌の中で、以下の細菌:ナイセリア・ゴノレエ、エンテロコッカス・フェカーリス、リステリア・モノサイトゲネス、ミクロコッカス・ルテウス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミス(ナイセリア・ゴノレエを除く全ての細菌がグラム陽性細菌である)は、WO2013/107759のKdo-N₃(I-1')を資化しなかった。

【0060】

より詳細には、工程a)のインキュベーション時間は、好ましくは10¹¹細胞/ml以下、より詳細には、10⁹細胞/ml以下の細菌濃度を検出するために、1時間〜24時間、好ましくは1時間〜12時間であり、修飾された単糖化合物の濃度は、10^-5M〜1Mである。

【0061】

生きている細菌は、増加することができる細菌である。衛生規則のほとんどが、増加可能な、特に固体増殖培地で増加可能な細菌の数を有利に参照するので、本発明は、より詳細には、増加することのできる細菌を特異的に標識するための方法であって、前記細菌が増加することのできる培養培地(液体培地)中又は(固体培地)上で前記細菌がインキュベートされる、方法を提供する。

【0062】

重症型の病原体は、上記細菌の間に隠れており、生きている細菌の迅速な標識化及び/又は検出は、重大な衛生的課題を示す。本発明の修飾された単糖は、細菌によって迅速に資化され、細菌を迅速に標識化及び検出することを可能にし、生きている野生型細菌に関する全工程が1日未満である。この方法は、細菌株に応じて生きている細菌の検出に通常2日から1カ月超を必要とする一般的検出法と比較して、非常に迅速である。

【0063】

有利には、本発明は、(c)前記細菌が、そのエンベロープに結合されている前記標識分子を含むかどうかを検出すること、及び/又は前記標識分子を有する前記生きている細菌を固体基質に固定化することで、前記生きている細菌を検出する更なる工程を含み、ここで、前記標識分子は、検出可能な物質を含むか若しくは検出可能な物質に反応若しくは結合することができる分子であるか、又は前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1の分子であり、前記第1の分子は、第2の分子及び/又は固体基質に反応又は結合することができ、好ましくは、前記第2の分子は検出可能な物質を含む及び/又は前記第2の分子は前記固体基質に結合されている若しくは結合されうる。

【0064】

したがって、本発明は、(a)検出された生きている細菌を数える又は識別すること、並びに(b)固体担体、特に前記第2の反応性基を有する磁気ビーズで構成される固体担体に固定化されている、生きている細菌を濃縮及び/又は単離することを可能にする。

【0065】

より詳細には、前記標識分子は、検出可能な物質を含む検出可能な分子であり、方法は、c)前記細菌が、その外膜のグリカンに結合されている前記検出可能な分子を含むかどうかを検出することで、生きている細菌を検出する工程を含む。

【0066】

前記検出工程c)は、液体培地中又は固体基質上で行われてもよい。

【0067】

より詳細には、前記標識分子は、検出可能な分子、すなわち、検出可能な物質、すなわち当業者に既知の技術、例えば蛍光、呈色又は発色によって検出されうる物質からなる又はその物質を有する分子でありうる。

【0068】

より詳細には、前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド又は第1の結合タンパク質であり、工程c)において、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に連結された前記生きている細菌は、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質と、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に対して特異的に反応する又は結合する第2のリガンド又は第2の結合タンパク質とを接触させることにより、検出される及び/又は固定化される。

【0069】

より詳細には、前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド、好ましくは、ビオチンであり、工程c)において、前記第1のリガンドに連結された前記生きている細菌は、前記細菌と、前記第1のリガンドに対して特異的な抗体又は別のタンパク質との反応により検出され、前記抗体は、検出可能な物質、好ましくは蛍光色素若しくは発光分子又は酵素を有する。

【0070】

また本発明は、本発明の方法を実施するためのキットであって、
- 式(I)の前記修飾された単糖化合物と、
- 前記第1の反応性基と反応することができる前記第2の反応性基を含む前記標識分子と、
- 必要であれば、前記第1の反応性基と、前記標識分子の前記第2の反応性基との反応を生じさせるための反応物質と、
- 好ましくは、前記細菌の増殖を可能にする、好ましくは前記細菌の増殖に特異的な、培養又はインキュベーション培地と
を含む、キットを提供する。

【0071】

好ましくは、前記第1の反応性基Raは、アジド基(-N₃)からなる又はアジド基(-N₃)を有する基及びアルキン基(-C≡C-)からなる又は有する基から選択され、前記第2の反応性基Rbは、アルキン基(-C≡C-)及びアジド基(-N₃)からそれぞれなる又はアルキン基(-C≡C-)及びアジド基(-N₃)を有する基から選択され、前記アジド反応性基と前記アルキン基(-C≡C-)との反応は、アジド-アルキン環化付加を実施する際に行われる。

【0072】

アジド-アルキン環化付加は、銅触媒の存在下又は非存在下における周知のいわゆるクリックケミストリー反応であって、アジド基とアルキン基とが反応してトリアゾールが生じる。より詳細には、反応は、トリス-トリアゾリルリガンド、好ましくは、TGTAの存在下、銅触媒条件で実施されうる。より詳細には、検出可能な分子は、末端アルキン基を有する蛍光色素である。

【0073】

より詳細には、反応は、トリス-トリアゾールリガンド、例えば、TGTA(トリス((1-(β-D-グルコピラノシル)-1H[1,2,3]-トリアゾール-4-イル)メチル)アミン)又はTBTA(トリス-[(1-ベンジル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル]アミン)と末端アルキン基を有するAlexa標識分子との存在下に触媒を用いて行われ、前記蛍光色素と前記式(I)のアナログ化合物とのアジド-アルキン環化付加が実行されてもよい。

【0074】

頻繁に使用される他の適切なリガンドは、トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA)、2-(4-((ビス((1-tert-ブチル-1H-1,2,3-トリアゾール-4-イル)メチル)アミノ)メチル)-1H-1,2,3-トリアゾール-1-イル)エタンスルホン酸(BTTES)、トリス((1-((O-エチル)カルボキシメチル)-(1,2,3-トリアゾール-4-イル))メチル)アミン、バソフェナントロリンジスルホネート、又はトリス(2-ベンゾイミダゾリルメチル)アミンである。

【0075】

代替的に、アジド-アルキン環化付加は、歪みアルキン、例えば、アザジベンゾシクロオクチン(ADIBO、DIBAC又はDBCO)又はテトラメトキシジベンゾシクロオクチン(TMDIBO)が使用される場合、銅の非存在下で実行されることもできる。

【0076】

銅フリー反応で頻繁に使用される他の適切な歪みアルキンとして、シクロオクチン(OCT)、アリール-レスシクロオクチン(ALO)、モノフルオロシクロオクチン(MOFO)、ジフルオロシクロオクチン(DIFO)、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)、ジメトキシアザシクロオクチン(DIMAC)、ビアリールアザシクロオクチノン(BARAC)、ビシクロノニン(BCN)、テトラメチルチエピニウム(TMTI、TMTH)、ジフルオロベンゾシクロオクチン(DIFBO)、オキサ-ジベンゾシクロオクチン(ODIBO)、カルボキシルメチルモノベンゾシクロオクチン(COMBO)、又はベンゾシクロノニンが挙げられる。

【0077】

他の反応性基及び他の反応も可能であり、例えば、シュタウディンガーライゲーション(第1の反応性基=アジド及び第2の反応性基=ホスフィン)、銅フリークリックケミストリー(第1の反応性基=アジド及び第2の反応性基=歪みアルキン(環内アルキン))、カルボニル縮合(第1の反応性基=アルデヒド又はケトン及び第2の反応性基=ヒドラジド又はオキシアミン)、チオール-エンクリックケミストリー(第1の反応性基=チオール及び第2の反応性基=アルケン)、ニトリル-オキシド-エンクリックケミストリー(第1の反応性基=ニトリルオキシド又はアルデヒド、オキシム又はヒドロキシモイルクロリド又はクロロオキシム(chlororoxime)及び第2の反応性基=アルケン又はアルキン)、ニトリル-イミン-エンクリックケミストリー(第1の反応性基=ニトリルイミン又はアルデヒド、ヒドラゾン、又は塩化ヒドラゾノイル又はクロロヒドラゾン及び第2の反応性基=アルケン又はアルキン)、逆電子要請型ディールス・アルダーライゲーション(第1の反応性基=アルケン及び第2の反応性基=テトラジン)、イソニトリル-テトラジンクリックケミストリー(第1の反応性基=イソニトリル及び第2の反応性基=テトラジン)、鈴木-宮浦カップリング(第1の反応性基=ハロゲン化アリール及び第2の反応性基=ボロン酸アリール)、His-タグ(第1の反応性基=オリゴ-ヒスチジン及び第2の反応性基=ニッケル錯体又はニッケルリガンド)。

【0078】

上記の反応に関与する基の列挙において、第1の反応性基と第2の反応性基とは置き換えられてもよい。上述の化学反応の全ては共有結合を生じる。

【0079】

他の及びより高い検出特異性は、細菌試料を、2つの前記の異なる修飾された単糖化合物及び2つの異なる検出可能な分子と共にインキュベートすることで得ることができる。

【0080】

本発明の方法の別の特定の実施形態では、前記工程a)のインキュベーション及び工程b)の反応は、メンブレンフィルター上で行われ、同じ元の細菌から生じる増殖された培養細菌は一緒にグループ化し、顕微鏡で可視化してもよく、前記検出可能な分子は、可視化により前記顕微鏡を用いて検出してもよい。したがって、培養可能な細菌の数はそれにより定量することができる。

【0081】

この実施形態は、前記修飾された単糖の資化の前に、前記メンブレンフィルター、例えばポリエステルメンブレン上で試験試料を濾過することを可能にし、生きている細菌が資化期間中の可能な増殖によって過大評価されるのを防ぐことができる。実際に、そのような膜の上面に固定された細胞が増殖し始めると、細胞はまとまって存在して微小なコロニーを形成し、同じ単一の細胞から生じるものとして容易に検出することができる。したがって、培養可能な細菌を計数により数えることが可能になる。

【0082】

また本発明は、前記細菌の増殖を可能にする、好ましくは前記細菌の増殖に特異的な、培養又はインキュベーション培地を更に含む、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。

【0083】

好ましくは、前記培養又はインキュベーション培地は、前記所与のカテゴリーの細菌のコロニーを形成するための増殖速度及び/又は能力を増強及び/又は加速する薬剤を更に含む。より詳細には、インキュベーション培地は、少なくとも抗酸化剤、例えば、ピルベート又はカタラーゼを含む。

【0084】

より詳細には、一実施形態では、キットは、更に
- 前記検出可能な分子、又は検出可能な物質、好ましくは蛍光色素若しくは発光分子若しくは酵素を有する前記第2の分子、及び/或いは
- 前記標識分子に特異的に反応又は結合することができる、前記第2の分子を有する固体基質
を含む。

【0085】

より詳細には、一実施形態では、本発明のキットは、更に
- 前記第1の反応性基と反応することができる前記第2の反応性基を含む前記検出可能な分子と、
- 前記修飾された単糖化合物、前記反応物質、及び前記検出可能な分子と共にインキュベートした後の細菌の可視化を可能にする固体培地と
を含む。

【0086】

またより詳細には、キットは、
- アジド又はアルキン基を含む前記第1の反応性基により置換されている前記修飾された単糖化合物と、
- アルキン基又はアジド基をそれぞれ有する検出可能な分子の前記第2の反応性基と、
- 場合により、銅触媒及びトリストリアゾリルリガンドを含む、前記反応物質と
を含む。

【0087】

第1の特定の実施形態では、前記標識分子は、検出可能な分子、すなわち、検出可能な物質、すなわち、蛍光色素又は発光物質又は酵素、例えばペルオキシダーゼ等の検出されうる物質からなる又はその物質を有する分子であることができ、前記酵素は、より詳細には、共反応物質と反応した後に検出される。

【0088】

生きている細菌の単離及び/又は濃縮に有用な、更なる特定の実施形態では、前記標識分子は、工程b)を行うときに、固体基質へ結合されていてもよい。

【0089】

更なる特定の実施形態では、前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド又は第1の結合タンパク質である分子であり、工程c)において、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に連結された前記生きている細菌は、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質と、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に対して特異的に反応する又は結合する第2のリガンド又は第2の結合タンパク質である第2の分子とを接触させることにより、検出される及び/又は固定化される。

【0090】

したがって、前記第1の又は第2のリガンド又は結合タンパク質を、例えば、蛍光色素又は発光物質又は酵素、例えばペルオキシダーゼ等の前記検出可能な物質を有し、前記第1及び/又は第2のリガンド又は結合タンパク質に特異的に結合する第3の結合タンパク質と反応又は結合させることができる点で有利である。前記検出可能な物質を、前記第2のリガンド又は第2の結合タンパク質又は第3の結合タンパク質を介して検出することにより、前記検出可能な物質のシグナルを増幅することができる。

【0091】

より詳細には、第1のリガンド又は第1の結合タンパク質は、
- ビオチンであり、次いで前記第2の結合タンパク質はアビジン若しくはストレプトアビジンであって、前記第3の結合タンパク質はビオチンに対して惹起される抗体であってもよく、又は
- アビジン若しくはストレプトアビジンであり、次いで前記第2のリガンド結合タンパク質はビオチンであって、前記第3の結合タンパク質はアビジン若しくはストレプトアビジンに対して惹起される抗体であってもよく、又は
- 第1の抗体であり、次いで前記第2の結合タンパク質は、前記第1の抗体に対して特異的な第2の抗体であって、前記第3の結合タンパク質は、前記第1の抗体に対して特異的な第3の抗体であってもよい。

【0092】

より詳細には、前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド、好ましくはビオチンであり、工程c)において、前記第1のリガンドに連結された前記生きている細菌は、前記細菌と、前記第1のリガンドに対して特異的な抗体との反応により検出され、前記抗体は、検出可能な物質、好ましくは蛍光色素若しくは発光分子又は酵素を有する。

【0093】

またより詳細には、前記標識分子は、前記第2の反応性基を有する第1のリガンド、好ましくはビオチンであり、工程c)において前記第1の結合タンパク質に連結された前記生きている細菌は、前記第1のリガンドと、前記第2の結合タンパク質、好ましくはアビジン又はストレプトアビジンに連結された固体基質、好ましくは磁気ビーズとの反応により固定化され、その後、前記生きている細菌は、細菌DNA酵素増幅により、又は前記細菌と前記第1のリガンド若しくは第2の結合タンパク質に特異的に反応若しくは結合する第3の結合タンパク質との反応により検出され、前記第3の結合タンパク質は、検出可能な物質、好ましくは、蛍光色素若しくは発光分子又は酵素を備え、前記第3の結合タンパク質は、好ましくは、前記第1のリガンド又は第1の結合タンパク質に対して特異的な抗体である。

【0094】

一実施形態では、より詳細には、標識分子は、第2の反応性基を有する酵素、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)又はウレアーゼ酵素でありうる。

【0095】

前記生きている細菌を前記固体基質に固定化するそのような実施形態により、前記細菌内に試料を濃縮させることができ、また前記生きている細菌を任意の既知の方法、例えば、PCR、特にリアルタイムPCR等のDNA酵素増幅又は標識化された抗体を用いる免疫学的反応を含む方法、例えばELISA試験により定量することができる。

【0096】

本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明並びに例証的及び非限定的な実施形態の例に照らして、より明白となる。

【実施例1】

【0097】

化合物(1a):4eKdo-N₃(6)の合成
合成において、以下の試薬及び条件を使用した:(i)TsCl、ピリジン、(ii)ピリジン、Ac₂0、(iii)アジ化ナトリウム、DMF、(iv)CH₃ONa、CH₃OH、(v)オキサロ酢酸、NaOH、H₂0、(vi)Dowex(登録商標)50(H⁺)、(viii)NH₄OH。

【0098】

薄層クロマトグラフィーは、Merck社60F₂₅₄で、UVにより、及び/又は硫酸若しくはKMnO₄若しくはリンモリブデン酸水溶液を用いた炭化により検出して実施した。シリカゲル60 40〜63μmをフラッシュカラムクロマトグラフィーに使用した。

【0099】

NMRスペクトルは、Bruker社Avance300又は500MHz分光計で、内部標準として残留プロトン化溶媒を使用して取得した。化学シフトδは、百万分率(ppm)で示し、結合定数はヘルツ(Hz)で報告する。分割パターンは、シングレット(s)、ダブレット(d)、トリプレット(t)、ダブルダブレット(dd)、ダブルダブルダブレット(ddd)として示す。解釈できなかった又は容易に可視化できなかった分割パターンは、マルチプレット(m)として示す。

【0100】

質量スペクトルは、Thermo Scientific社TSQで又はBruker社micrOTOFqで又はWaters社LCT Premier XE(ToF)で、ポジティブ(ESI+)モードでのエレクトロスプレーイオン化により検出して取得した。

【0101】

IR-FTスペクトルは、Perkin Elmer社Spectrum100分光計で記録した。特徴的な吸収はcm^-1で報告する。

【0102】

化合物(Ia又は6)を、混合物(Ia又は6)/(I-1又は6')からエピマー(Ia又は6)を最終的に精製して、以下の通り調製した。

【0103】

以下のスキーム1に、その合成の工程に関与する様々な化合物を示す。

【0104】

【化10】

【0105】

様々な工程における試薬及び条件は、以下の通りである:(i)TsCl(1.1当量)、ピリジン(1.0M)、100℃→室温、18時間。(ii)ピリジン/Ac₂0(2:1、0.7M)、18時間。(iii)NaN₃(2.0当量)、DMF(0.4M)、80℃、20時間、3工程にわたって15%。(iv)CH₃ONa(0.1当量)、CH₃OH(0.2M)、室温、3時間、99%。(v)オキサロ酢酸(1.6当量)、NaOH(pH11)、H₂0(0.5M)、室温、2時間。(vi)Dowex(登録商標)50(H⁺)。(vii)80℃、20分。(viii)NH₄OH。4工程にわたって1%の単離4eKdo-N₃。

【0106】

1)5-アジド-5-デオキシ-1,2,3-トリ-O-アセチル-D-アラビノフラノース(4)の調製:

【0107】

【化11】

【0108】

市販のD-アラビノース(1)(6.00g、40mmol)を100℃で2時間、ピリジン(40mL)中で加熱した。溶液を冷却し、更に塩化トシル(8.38g、44mmol、1.1当量)で処理し、16時間、室温で撹拌した((2)、単離しなかった)。次いで、無水酢酸(20mL)を加えた。TLCで決定されるように完全にアセチル化した後、溶媒を蒸発させ、残渣痕跡は数回トルエンと共蒸発させた((3)、単離しなかった)。残渣をDMF(100mL)に溶解し、アジ化ナトリウム(5.20g、80mmol、2.0当量)を加え、懸濁液を、80℃で20時間加熱した。酢酸エチルで希釈し、水で洗浄した後、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー(石油エーテル/酢酸エチル 7:3)で精製した。最初の溶出生成物は、予測された5-アジド-1,2,3-トリ-O-アセチル-D-アラビノフラノース(4)(1.83g、15%、α/β 約2:1)と決定された。

【0109】

【数1】

【0110】

2)5-アジド-5-デオキシ-D-アラビノフラノース(5)の調製:

【0111】

【化12】

【0112】

保護された5-アジド-1,2,3-トリ-O-アセチル-D-アラビノース(4)を、次いで無水メタノール(30mL)に溶解し、CH₃ONa(0.2mol.L^-1、3mL)のメタノール溶液で処理し、アルゴン雰囲気下、室温で3時間撹拌した。中和(Dowex(登録商標)50(H⁺))、濾過、及び濃縮後、5-アジド-5-デオキシ-D-アラビノフラノース(5)を、99%収率(1.03g)で得た。
Rf(ジクロロメタン/メタノール 92:8):0.28。
IR(cm^-1):3367、2106、1281、1040。
HRMS(ESI⁺):[M+H-N₂]⁺(C₅H₁₀NO₄)計算値m/z:148.0604、実測値:148.0610。

【0113】

アノマーアルファ(5α):

【0114】

【数2】

【0115】

アノマーベータ(5β):

【0116】

【数3】

【0117】

3)8-アジド-3,8-ジデオキシ-D-グルコ-オクツロソン酸アンモニウム(4eKdo-N₃)(6)の調製:

【0118】

【化13】

【0119】

水(2.1mL)中5-アジド-5-デオキシ-D-アラビノフラノース(5)(437mg、2.5mmol)の冷却(4℃)溶液を、水(2.5mL)中オキサロ酢酸(528mg、4.0mmol)の溶液に加え、そのpHを、NaOH水溶液(10M)の添加により約11に調整した。室温で2時間撹拌した後、溶液を中和し(Dowex(登録商標)50(H⁺))、濾過し、80℃で20分加熱した。そのpHをAcOH(0.5M)で約7に調整した後、得られたKdo-N₃/4eKdo-N₃混合物を、陰イオン交換クロマトグラフィー(Dowex(登録商標)1X8(HC0₂^-))により精製した。水での初回溶出により、未反応物(5)(150mg、34%)が得られた。ギ酸の濃縮勾配(0.5mol.L^-1から2.0mol.L^-1へ)での更なる溶出、凍結乾燥、Dowex(登録商標)50(H⁺)樹脂での処理、及びアンモニア(0.2mol.L^-1)による中和により、濃縮後、Kdo-N₃と4eKdo-N₃との混合物が得られた。(6)(Ia)と(6')(I-1)とのこの混合物を、ギ酸の緩濃縮勾配(1.5mol.L^-1から2.0mol.L^-1へ)での溶出により陰イオン交換クロマトグラフィー(Dowex(登録商標)1X8(HC0₂^-))によって再度精製し、凍結乾燥、Dowex(登録商標)50(H⁺)樹脂での処理、及びアンモニア(0.2mol.L^-1)による中和により、濃縮後、特異的マイナーエピマーの8-アジド-3,8-ジデオキシ-D-グルコ-オクツロソネートのアンモニウム塩(6又はIa)7mgが得られた。
Rf(酢酸エチル/エタノール/水 65:30:5):0.22。
Rf(イソプロピルアルコール/水 9:1):0.38。
IR(cm^-1):3296、2931、2104(N₃)、1612、1384、1283、1072、805。
LRMS(ESI^-):262.1。
HRMS(ESI^-):[M-H]^-(C₈H₁₂N₃0₇)計算値m/z:262.0681、実測値:262.0669。

【0120】

メジャー配座異性体ピラノース形態(NMR7.5):

【0121】

【数4】

【0122】

メジャー配座異性体フラノース形態(NMR3.0):

【0123】

【数5】

【0124】

マイナー配座異性体ピラノース形態(NMR1.5):

【0125】

【数6】

【0126】

マイナー配座異性体フラノース形態(NMR1.0):

【0127】

【数7】

【実施例2】

【0128】

本発明の化合物4eKdo-N₃(Ia)及び化合物Kdo-N₃(I-1)を用いた、生きている細菌の標識化の比較
1)材料及び方法
1.1)細菌株及び増殖条件
Table1(表1)に列挙した28細菌株を、Table1(表1)及びTable2(表2)に列挙した培養培地及び条件で増殖させる。全ての株は、回転式振盪機(160rpm)内で30又は37℃で増殖させた。

【0129】

【表1A】

【0130】

【表1B】

【0131】

【表2】

【0132】

1.2)銅触媒クリックケミストリー
一夜培養物を、Kdo-N₃(I-1)又は4eKdo-N₃(Ia)(10mM)を含有する新鮮培地(最終体積100μl)で100倍希釈した。細菌を、30又は37℃で24時間インキュベートし、次いでリン酸緩衝液(0.05M、pH7.5)を用いて13,000×gにて室温で2分間遠心分離することにより3回洗浄した。

【0133】

以下の式の2つの蛍光色素-アルキンプローブA488-イン(7a)及びA594-イン(7b)を使用した。

【0134】

【化14】

【0135】

CuSO₄及びTGTAを、それぞれ2mM及び4mMの最終濃度で、リン酸緩衝液(0.05M、pH7.5)中37℃で激しく振盪させながら一夜混合した。次に、アミノグアニジン、アスコルビン酸ナトリウム及び蛍光色素-アルキン(7a)又は(7b)を、それぞれ4mM、5mM及び1mMの最終濃度で、CuSO₄/TGTA一夜混合物に加えた。最後に、この溶液中で細菌を再懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。細胞を、リン酸緩衝液を用いて13,000×gにて室温で2分間遠心分離することにより3回洗浄し、顕微鏡により分析した。

【0136】

1.3)蛍光顕微鏡法
細菌を、ガラスカバースリップ上に接種し、希釈LB(リン酸緩衝液中1/10(0.05M、pH7.5))を用いて作製した薄い(厚さ1mm)半固体1%寒天パッドで覆った。画像は、CoolSNAP HQ 2カメラ(Roper Scientific、Roper Scientific SARL社、フランス)及び100×/1.4DLL対物レンズを装備した落射蛍光自動化顕微鏡(Nikon TE2000-E-PFS、Nikon社、フランス)で記録した。励起光は120Wメタルハライド光によって発生させ、シグナルを適切なフィルターを使用して監視した。デジタル解析及び画像処理は、Metamorph7.5(Molecular Devices、Molecular Devices France社、フランス)でのカスタム自動化スクリプト(Visual Basic)により実施した。

【0137】

2)結果
21.)化合物4eKdo-N₃(Ia)及びKdo-N₃(I-1)の両方を比較して用いて、28種類の細菌株を試験した。

【0138】

これらの株を、最初に化合物(Ia)又は(I-1)の存在下で増殖させ、続く工程で、細菌へのアジド化学リポーターの組込みを、先に記載した条件での銅触媒アジド-アルキン環化付加を利用して、硫酸銅、アスコルビン酸ナトリウム、TGTA、銅(I)に対する水溶性トリス(トリアゾリル)リガンド及び上記式(7a)又は(7b)に対する蛍光色素-アルキンプローブを上記のように30分間使用して、監視した。

【0139】

下記Table3(表3)において、これらの実験で、その膜上で非常に顕著な蛍光を示し、化学リポーターの有効な代謝的組込みを示した株を「+」と記し、標識化無しはTable3(表3)において「-」と記し、試験されなかった細菌はTable3(表3)において「NT」と記している。

【0140】

【表3】

【0141】

これらの実験は、本発明の化合物(Ia)が、広範囲の細菌によって資化されること、興味深いことに、化合物(Ia)が、化合物(I-1)を資化しなかった以下のグラム陽性細菌:エンテロコッカス・フェカーリス、リステリア・モノサイトゲネス、ミクロコッカス・ルテウス、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・アウレウス亜種アウレウス、及びスタフィロコッカス・エピデルミス、並びにグラム陰性のナイセリア・ゴノレエによって資化されることを示す。