特許 6875500 Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む眼疾患治療用薬学組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6875500

(24)【登録日】2021年4月26日

(45)【発行日】2021年5月26日

(54)【発明の名称】Ｃａｓ９タンパク質およびガイドＲＮＡを含む眼疾患治療用薬学組成物

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20210517BHJP

   A61K 38/47 20060101ALI20210517BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20210517BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20210517BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20210517BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20210517BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20210517BHJP

【ＦＩ】

   A61K48/00ZNA

   A61K38/47

   A61P27/02

   A61P43/00 105

   A61P43/00 111

   A61P9/10

   C12N15/09 110

   C12N9/22

【請求項の数】8

【全頁数】51

(21)【出願番号】特願2019-504798(P2019-504798)

(86)(22)【出願日】2017年7月27日

(65)【公表番号】特表2019-522034(P2019-522034A)

(43)【公表日】2019年8月8日

(86)【国際出願番号】KR2017008122

(87)【国際公開番号】WO2018021855

(87)【国際公開日】20180201

【審査請求日】2019年3月20日

(31)【優先権主張番号】62/367,674

(32)【優先日】2016年7月28日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516355542

【氏名又は名称】インスティテュート フォー ベーシック サイエンス

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＡＳＩＣ ＳＣＩＥＮＣＥ

(73)【特許権者】

【識別番号】519001383

【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニバーシティ アールアンドディービー ファウンデーション

(73)【特許権者】

【識別番号】504314133

【氏名又は名称】ソウル ナショナル ユニバーシティ ホスピタル

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】特許業務法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジン−ス

(72)【発明者】

【氏名】キム，ジョン フン

(72)【発明者】

【氏名】パーク，スン ウク

(72)【発明者】

【氏名】キム，キョウン ミ

【審査官】 柴原 直司

(56)【参考文献】

【文献】 ARVO Annual Meeting Abstract, (2016.05.01), Abstract No.1159

【文献】 Cell Stem Cell, (2016.01), 18, [1], p.53-65

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ４８／００

Ａ６１Ｐ ２７／０２

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｃａｓ９タンパク質と、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の標的部位に特異的に結合する標的化配列を含むＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡとを含むリボ核酸タンパク質を含む、ＶＥＧＦ−Ａの過発現に関連する眼疾患の予防または治療用組成物であって、前記ガイドＲＮＡは、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の配列番号１〜８の中から選択された核酸配列を含む標的部位にハイブリダイズ可能なものである、前記組成物。

【請求項2】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号９〜１６の中から選択された核酸配列を含むものである、請求項１に記載の眼疾患の予防または治療用組成物。

【請求項3】

前記ＶＥＧＦ−Ａの過発現に関連する眼疾患は、黄斑変性または網膜病症である、請求項１または２に記載の眼疾患の予防または治療用組成物。

【請求項4】

Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の標的部位に特異的に結合する標的化配列を含むＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡを含むリボ核酸タンパク質であって、前記ガイドＲＮＡは、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の配列番号１〜８の中から選択された核酸配列を含む標的部位にハイブリダイズ可能なものである、前記リボ核酸タンパク質。

【請求項5】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号９〜１６の中から選択された核酸配列を含むものである、請求項４に記載のリボ核酸タンパク質。

【請求項6】

ＶＥＧＦ−Ａの過発現に関連する眼疾患の予防または治療に用いるための、Ｃａｓ９タンパク質と、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の標的部位に特異的に結合する標的化配列を含むＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡとを含むリボ核酸タンパク質を含む薬学組成物であって、前記ガイドＲＮＡは、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の配列番号１〜８の中から選択された核酸配列を含む標的部位にハイブリダイズ可能なものである、前記組成物。

【請求項7】

前記ガイドＲＮＡは、配列番号９〜１６の中から選択された核酸配列を含むものである、請求項６に記載の眼疾患の予防または治療に用いるための薬学組成物。

【請求項8】

前記ＶＥＧＦ−Ａの過発現に関連する眼疾患は、黄斑変性または網膜病症である、請求項６または７に記載の眼疾患の予防または治療に用いるための薬学組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦ−Ａを標的とするガイドＲＮＡを含む眼疾患の予防および／または治療用薬学組成物並びにＣａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦ−Ａを標的とするガイドＲＮＡを含むリボ核酸タンパク質が提供される。

【背景技術】

【0002】

ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いたＲＮＡ誘導遺伝体矯正（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｕｒｇｅｒｙまたはＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）は、多様な遺伝疾患の治療に役立つことが期待されるが、非遺伝疾患へのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼの治療効果はほとんど明らかにされていない。

【0003】

非遺伝疾患の一例として、黄斑変性（例えば、老人性黄斑変性（Ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ Ｍａｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ；ＡＭＤ））が挙げられる。ＡＭＤは、先進国の高齢人口における主な失明原因である。脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＣＮＶ）は、新生血管性ＡＭＤの主要病理学的特徴であり、主に血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦＡ）のような血管新生サイトカイン（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）によって誘発される。これまでは、ＡＭＤの治療剤としてＶＥＧＦ−Ａを標的とする単クローン抗体またはアプタマーが主に開発されてきた。しかし、ＶＥＧＦ−Ａが網膜細胞で連続的に発現し分泌されるため、これらの抗−ＶＥＧＦ−Ａ製剤は１年間で少なくとも７回以上投与されなければならない問題がある。
したがって、黄斑変性などの眼疾患のより根本的かつ持続的な治療技術の開発が要求される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】韓国特許公開第１０−２０１５−０１０１４４６号（２０１５．０９．０３公開）

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本明細書は、ＶＥＧＦ−Ａの根本的な不活性化により、その水準を病理学的閾値以下に抑えることによって、眼疾患の長期的または永久的な治療を可能にする技術を提案する。
一例は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤を含む、眼疾患の予防および／または治療用組成物を提供する。

【0006】

前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させることができるすべてのタンパク質、核酸分子（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、化学薬物（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｒｕｇ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。一例において、前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子をターゲッティングするガイドＲＮＡを含むものであってもよい。

【0007】

他の例は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる段階を含む眼疾患の予防および／または治療方法を提供する。前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる段階は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤を眼疾患の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階によって行われる。前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化は、ＲＮＡ誘導遺伝体矯正（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｒ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）によって行われ、この場合、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる段階は、Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子をターゲッティングするガイドＲＮＡを眼疾患の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階によって行われる。

【0008】

他の例は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤の眼疾患の予防および／または治療、または眼疾患の治療剤の製造に用いるための用途を提供する。
他の例は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の特定標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）を標的化するためのガイドＲＮＡを提供する。

【0009】

他の例は、Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦＡ遺伝子特異的標的化配列を含むガイドＲＮＡを含むＶＥＧＦＡ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）を提供する。
他の例は、前記ガイドＲＮＡまたはＶＥＧＦＡ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）を含む薬学組成物を提供する。

【0010】

他の例は、前記ＶＥＧＦＡ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）を眼疾患の治療および／または予防を必要とする患者に投与する段階を含む、眼疾患の治療または予防方法を提供する。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明は、遺伝子矯正技術を利用して眼疾患、例えば、ＶＥＧＦ−Ａの過発現に関連する眼疾患を治療する技術を提供する。

【0012】

一例は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤を含む、眼疾患の予防および／または治療用組成物を提供する。前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させることができるすべてのタンパク質、核酸分子（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、化学薬物（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｒｕｇ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。一例において、前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子をターゲッティングするガイドＲＮＡを含むものであってもよい。

【0013】

他の例は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる段階を含む眼疾患の予防および／または治療方法を提供する。前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる段階は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤を眼疾患の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階によって行われる。前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化は、ＲＮＡ誘導遺伝体矯正（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｒ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）によって行われ、この場合、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる段階は、Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子をターゲッティングするガイドＲＮＡを眼疾患の予防および／または治療を必要とする患者に投与する段階によって行われる。前記方法は、前記投与する段階の前に、眼疾患の予防および／または治療を必要とする患者を確認する段階を追加的に含んでもよい。前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤は、薬学的有効量で投与される。前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤は、多様な投与経路を通して投与され、例えば、眼球の病変部位の局所投与または網膜下注射によって投与される。

【0014】

他の例は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤の眼疾患の予防および／または治療、または眼疾患の治療剤の製造に用いるための用途を提供する。
前記不活性化の標的となるＶＥＧＦ−Ａ遺伝子は、眼、例えば、新生血管性眼疾患が発生した眼、または新生血管性眼疾患の病変部位に位置するものであってもよい。

【0015】

前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化は、以下からなる群より選択された１つ以上であってもよい：
（１）ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の全体または１−５０ｂｐまたは１−４０ｂｐの長さの連続的または不連続的一部分の欠失；
（２）ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子中、１−２０個、１−１５個、または１−１０個の連続的または不連続的なヌクレオチドの野生型ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子と相異なるヌクレオチドへの置換；
（３）ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内の１−２０個、１−１５個、または１−１０個のヌクレオチドの挿入（付加）、この時、前記挿入されるヌクレオチドは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧの中から選択される；および
（４）これらの組合せ。

【0016】

前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させることができるすべてのタンパク質、核酸分子（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）、化学薬物（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｒｕｇ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。一例において、前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤は、Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子をターゲッティングするガイドＲＮＡを含むものであってもよい。この場合、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化は、ＲＮＡ誘導遺伝体矯正（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｕｒｇｅｒｙ ｏｒ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ）によって行われる。

【0017】

ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化がＣａｓ９タンパク質を用いて行われる場合、前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化は、以下からなる群より選択された１つ以上であってもよい：
（１）ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内のＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ（ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）配列に隣接した１−５０ｂｐまたは１−４０ｂｐの長さの連続的または不連続的部位に位置する１つ以上のヌクレオチドの欠失；
（２）ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内のＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列に隣接した１−５０ｂｐまたは１−４０ｂｐの長さの連続的または不連続的部位に位置する１−２０個、１−１５個、または１−１０個の連続的または不連続的なヌクレオチドの野生型ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子と相異なるヌクレオチドへの置換；
（３）ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子内のＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列に隣接した１−５０ｂｐまたは１−４０ｂｐの長さの連続的または不連続的部位に１−２０個、１−１５個、または１−１０個のヌクレオチドの挿入（付加）、この時、前記挿入されるヌクレオチドは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧの中から選択される；および
（４）これらの組合せ。

【0018】

前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化のための製剤は、Ｃａｓ９タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の標的部位に特異的に結合する標的化配列を含むＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化するＤＮＡを含むものであってもよい。

【0019】

Ｃａｓ９タンパク質とＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡは、
（ａ）生体（または病変部位）または細胞などに投与される前にＣａｓ９タンパク質とＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡとが結合して形成された（つまり、投与前に予め組込まれた）複合体、つまり、リボ核酸タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＰ）形態であるか（この場合、リボ核酸タンパク質形態で細胞膜を通過して細胞内または生体内に伝達される）、
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質を暗号化するＤＮＡおよびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡがそれぞれ別個のベクターを通して生体内または細胞内に投与（または伝達）されるか、１つのベクターを通して共に生体内または細胞内に投与（または伝達）されて、生体または細胞内で複合体をなすもの、
（ｃ）Ｃａｓ９タンパク質を暗号化するＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡを含むＲＮＡ混合物形態、または
（ｄ）Ｃａｓ９タンパク質を暗号化する遺伝子（ＤＮＡ）を含む組換えベクターおよびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られる）の混合物であってもよい。

【0020】

一例において、前記ＲＮＡ混合物は、通常のＲＮＡ伝達体に含まれて細胞内または生体内に伝達されるものであってもよい。

【0021】

したがって、前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化のための製剤は、
（ａ）生体（または病変部位）または細胞などに投与される前にＣａｓ９タンパク質とＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡが結合して形成された（つまり、投与前に予め組込まれた）複合体、つまり、リボ核酸タンパク質（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ；ＲＮＰ）（この場合、リボ核酸タンパク質形態で細胞膜を通過して細胞内または生体内に伝達される）；
（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質を暗号化する遺伝子（ＤＮＡ）およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡを１つのベクターに共に含むか、または別個のベクターにそれぞれ含む組換えベクター（つまり、Ｃａｓ９タンパク質を暗号化する遺伝子を含む組換えベクターおよびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡを含む組換えベクター）、または前記組換えベクターを含む組換え細胞；
（ｃ）Ｃａｓ９タンパク質を暗号化するＲＮＡ（ｍＲＮＡ）およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡを含むＲＮＡ混合物；
（ｄ）Ｃａｓ９タンパク質を暗号化する遺伝子（ＤＮＡ）を含む組換えベクターおよびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡ（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって得られる）の混合物；または
（ｅ）これらの組合せを含むものであってもよい。

【0022】

前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化のための製剤の投与は、前記Ｃａｓ９タンパク質を暗号化する遺伝子（ＤＮＡ）を含む組換えベクターとＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡを含む組換えベクター、Ｃａｓ９タンパク質を暗号化するＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡ、またはＣａｓ９タンパク質を暗号化する遺伝子（ＤＮＡ）を含む組換えベクターとＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡを同時に投与するか、順序に関係なく順次に投与して行われる。

【0023】

他の例は、ＶＥＧＦＡ遺伝子の特定標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）を標的化するためのガイドＲＮＡを提供する。一例において、前記ガイドＲＮＡは、ＶＥＧＦＡ遺伝子の特定標的部位のいずれか１本鎖（例えば、ＰＡＭ配列が位置する鎖と相補的な鎖）の核酸配列とハイブリダイズ可能な（例えば、相補的核酸配列を有する）標的化配列（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含むものであってもよい。

【0024】

他の例は、Ｃａｓ９タンパク質およびＶＥＧＦＡ遺伝子特異的標的化配列を含むガイドＲＮＡを含むＶＥＧＦＡ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）を提供する。

【0025】

他の例は、前記ガイドＲＮＡまたはＶＥＧＦＡ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）を含む薬学組成物を提供する。前記薬学組成物は、黄斑変性（例えば、老人性黄斑変性（ＡＭＤ）など）、網膜病症（例えば、糖尿性網膜病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）など）などのような眼疾患の治療および／または予防に使用できる。

【0026】

他の例は、前記ＶＥＧＦＡ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）を眼疾患の治療および／または予防を必要とする患者に投与する段階を含む、眼疾患の治療または予防方法を提供する。前記ＶＥＧＦＡ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）は、薬学的有効量で投与され、例えば、眼球の病変部位の局所投与または網膜下注射によって投与される。

【0027】

前記眼疾患は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、例えば、ＶＥＧＦ−Ａの過発現に関連する眼疾患であってもよいし、新生血管性眼疾患（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ ｅｙｅ ｄｉｓｅａｓｅ）であってもよい。新生血管性眼疾患は、眼球の血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、例えば、脈絡膜血管新生（ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＣＮＶ）によって誘発されるすべての眼疾患であってもよいし、例えば、黄斑変性（例えば、老人性黄斑変性（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ；ＡＭＤ）、近視性脈絡膜血管新生（ｍｙｏｐｉｃ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）など）、網膜病症（例えば、糖尿性網膜病症（ｄｉａｂｅｔｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、虚血性網膜病症（ｉｓｃｈｅｍｉｃ ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ）、分枝静脈閉鎖（ｂｒａｎｃｈ ｒｅｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、中心静脈閉鎖（ｃｅｎｔｒａｌ ｒｅｔｉｎａｌ ｖｅｉｎ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、未熟児網膜病症（ｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙ ｏｆ ｐｒｅｍａｔｕｒｉｔｙ）など）などからなる群より選択されたものであってもよい。

【0028】

ＶＥＧＦ−Ａ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ Ａ）は、ヒト、サルなどの霊長類、ラット、マウスなどの齧歯類を含む哺乳類由来のものであってもよいし、例えば、Ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦ−Ａ（例えば、ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０２０５３７、ＮＰ＿００１０２０５３８、ＮＰ＿００１０２０５３９、ＮＰ＿００１０２０５４０、ＮＰ＿００１０２０５４１、ＮＰ＿００１０２８９２８、ＮＰ＿００１１６５０９３、ＮＰ＿００１１６５０９４、ＮＰ＿００１１６５０９５、ＮＰ＿００１１６５０９６、ＮＰ＿００１１６５０９７、ＮＰ＿００１１６５０９８、ＮＰ＿００１１６５０９９、ＮＰ＿００１１６５１００、ＮＰ＿００１１６５１０１、ＮＰ＿００１１９１３１３、ＮＰ＿００１１９１３１４、ＮＰ＿００１２７３９７３、ＮＰ＿００１３０３９３９、ＮＰ＿００３３６７など）、Ｍｏｕｓｅ ＶＥＧＦ−Ａ（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＰ＿００１０２０４２１、ＮＰ＿００１０２０４２８、ＮＰ＿００１１０３７３６、ＮＰ＿００１１０３７３７、ＮＰ＿００１１０３７３８、ＮＰ＿００１２７３９８５、ＮＰ＿００１２７３９８６、ＮＰ＿００１２７３９８７、ＮＰ＿００１３０３９７０、ＮＰ＿０３３５３１など）などであってもよい。

【0029】

Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、ストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する（分離された）ものであってもよい。
本明細書に使用されたところであって、
「標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ）」は、遺伝子矯正対象となる遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）を意味し、

【0030】

「標的部位（ｔａｒｇｅｔ ｓｉｔｅ ｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｇｉｏｎ）」は、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）内のＣａｓ９による遺伝子矯正（切断およびヌクレオチドの欠失、添加、および／または置換）が起こる遺伝子部位を意味するもので、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）内のＣａｓ９タンパク質が認識するＰＡＭ配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する最大長さが約５０ｂｐまたは約４０ｂｐの遺伝子部位を意味し（この場合、遺伝子矯正は、細胞１つにおける２対の染色体のうち１つまたは２つの標的部位で起こりうる）、

【0031】

「標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）内のガイドＲＮＡとハイブリダイズ可能な遺伝子部位であって、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）内のＣａｓ９タンパク質が認識するＰＡＭ配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する連続する１７ｂｐ〜２３ｂｐ、例えば、２０ｂｐの長さの核酸配列を意味し、

【0032】

「標的化配列（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、前記標的遺伝子内の標的配列とハイブリダイズ可能なガイドＲＮＡ部位であって、１７〜２３個、例えば、２０個のヌクレオチドを含むガイドＲＮＡ部位であってもよい。

【0033】

本明細書において、前記標的配列は、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）の当該遺伝子部位の２つのＤＮＡ鎖中、ＰＡＭ配列が位置する鎖の核酸配列で表される。この時、実際にガイドＲＮＡが結合するＤＮＡ鎖は、ＰＡＭ配列が位置する鎖の相補的鎖であるので、前記ガイドＲＮＡに含まれている標的化配列は、ＲＮＡ特性上、ＴをＵに変更することを除き、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）に位置する標的配列と同一の核酸配列を有する。したがって、本明細書において、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）の標的配列は、ＴとＵが相互変更されることを除き、同一の核酸配列で表される。

【0034】

前記Ｃａｓ９タンパク質がストレプトコッカスピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の場合、前記ＰＡＭ配列は、５’−ＮＧＧ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）であり、標的部位は、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）内の５’−ＮＧＧ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する遺伝子部位であって、例えば、最大長さが約５０ｂｐまたは約４０ｂｐの遺伝子部位であってもよい。

【0035】

この場合、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の不活性化は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子において、
ａ）５’−ＮＧＧ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである）配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する最大５０ｂｐまたは最大４０ｂｐの長さの核酸配列（標的部位）内の１つ以上のヌクレオチドの欠失、
ｂ）５’−ＮＧＧ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する最大５０ｂｐまたは最大４０ｂｐの長さの核酸配列（標的部位）内の１つ以上（例えば、１−２０個、１−１５個、または１−１０個）のヌクレオチドの野生型遺伝子と相異なるヌクレオチドへの置換、
ｃ）５’−ＮＧＧ−３’配列の５’末端および／または３’末端に隣接して位置する最大５０ｂｐまたは最大４０ｂｐの長さの核酸配列（標的部位）内への１つ以上（例えば、１−２０個、１−１５個、または１−１０個）のヌクレオチドの挿入（この時、挿入されるヌクレオチドは、それぞれ独立してＡ、Ｔ、Ｃ、およびＧの中から選択される）、または
ｄ）前記ａ）〜ｃ）の中から選択された２種類以上の組合せによって誘導されたものであってもよい。

【0036】

前記ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、および単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）からなる群より選択された１種以上であってもよいし、具体的には、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとが互いに結合した二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体、またはｃｒＲＮＡまたはその一部とｔｒａｃｒＲＮＡまたはその一部がオリゴヌクレオチドリンカーで連結された単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。

【0037】

前記ガイドＲＮＡの具体的配列は、Ｃａｓ９タンパク質の種類（つまり、由来微生物）によって適切に選択することができ、これは、この発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に分かる事項である。

【0038】

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｃｒＲＮＡは、次の一般式１で表現される：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（Ｘ_ｃａｓ９）_ｍ−３’（一般式１）

【0039】

前記一般式１において、
Ｎ_ｃａｓ９は、標的化配列であって、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）の標的配列によって決定される部位であり、ｌは、前記標的化配列に含まれているヌクレオチド数を示すもので、１７〜２３または１８〜２２の整数、例えば、２０であってもよく；

【0040】

前記標的配列の３’方向に隣接して位置する連続する１２個のヌクレオチド（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）（配列番号３５９）を含む部位は、ｃｒＲＮＡの必須的部分であり、

【0041】

Ｘ_ｃａｓ９は、ｃｒＲＮＡの３’末端側に位置する（つまり、前記ｃｒＲＮＡの必須的部分の３’方向に隣接して位置する）ｍ個のヌクレオチドを含む部位で、ｍは、８〜１２の整数、例えば、１１であってもよいし、前記ｍ個のヌクレオチドは、互いに同一または異なっていてもよいし、それぞれ独立してＡ、Ｕ、Ｃ、およびＧからなる群より選択されてもよい。
一例において、前記Ｘ_ｃａｓ９は、ＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号３６０）を含むことができるが、これに制限されない。

【0042】

また、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、次の一般式２で表現される：
５’−（Ｙ_ｃａｓ９）_ｐ−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式２）

【0043】

前記一般式２において、
６０個のヌクレオチド（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）（配列番号３６１）で表された部位は、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分であり、

【0044】

Ｙ_ｃａｓ９は、前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分の５’末端に隣接して位置するｐ個のヌクレオチドを含む部位で、ｐは、６〜２０の整数、例えば、８〜１９の整数であってもよいし、前記ｐ個のヌクレオチドは、互いに同一または異なっていてもよく、Ａ、Ｕ、Ｃ、およびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択されてもよい。

【0045】

また、ｓｇＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部位を含むｃｒＲＮＡ部分と、前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０個のヌクレオチド）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分とがオリゴヌクレオチドリンカーを介してヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、オリゴヌクレオチドリンカーがループ構造に相当する）。より具体的には、前記ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部分を含むｃｒＲＮＡ部分と、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分とが互いに結合した二重鎖ＲＮＡ分子において、ｃｒＲＮＡ部位の３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡ部位の５’末端がオリゴヌクレオチドリンカーを介して連結されたヘアピン構造を有するものであってもよい。

【0046】

一例において、ｓｇＲＮＡは、次の一般式３で表現される：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（オリゴヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式３）
前記一般式３において、（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌは、標的配列であって、前記一般式１で説明した通りである。

【0047】

前記ｓｇＲＮＡに含まれるオリゴヌクレオチドリンカーは、３〜５個、例えば、４個のヌクレオチドを含むものであってもよいし、前記ヌクレオチドは、互いに同一または異なっていてもよく、Ａ、Ｕ、Ｃ、およびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択されてもよい。

【0048】

前記ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端（つまり、ｃｒＲＮＡのターゲッティング配列部位の５’末端）に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含んでもよい。

【0049】

前記ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０ｎｔ）の３’末端に５個〜７個のウラシル（Ｕ）を含む終結部位を追加的に含んでもよい。

【0050】

一例において、標的遺伝子（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子）の標的配列は、以下からなる群より選択されたものであってもよい：
Ｖｅｇｆａ−１：５’−ＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号１）（ＰＡＭ配列：ＧＧＧ）；
Ｖｅｇｆａ−２：５’−ＡＧＣＴＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＡＴＧＴＧＣ−３’（配列番号２）（ＰＡＭ配列：ＴＧＧ）；
Ｖｅｇｆａ−３：５’−ＧＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＴＣＴＴＣＣ−３’（配列番号３）（ＰＡＭ配列：ＡＧＧ）；
Ｖｅｇｆａ−４：５’−ＡＣＴＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＧＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号４）（ＰＡＭ配列：ＡＧＧ）；
Ｖｅｇｆａ−５：５’−ＣＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧ−３’（配列番号５）（ＰＡＭ配列：ＡＧＧ）；
Ｖｅｇｆａ−６：５’−ＧＡＣＣＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＧＧ−３’（配列番号６）（ＰＡＭ配列：ＴＧＧ）；
Ｖｅｇｆａ−７：５’−ＣＡＣＧＡＣＣＧＣＴＴＡＣＣＴＴＧＧＣＡ−３’（配列番号７）（ＰＡＭ配列：ＴＧＧ）；および
Ｖｅｇｆａ−８：５’−ＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＣＡＣＴＧ−３’（配列番号８）（ＰＡＭ配列：ＡＧＧ）。

【0051】

前記標的配列は、哺乳類の種間保存が良くなった配列で、例えば、ヒトと齧歯類（例えば、マウス）にすべて存在する。例えば、前記標的配列は、配列番号１または配列番号２の核酸配列を含むものであってもよい。

【0052】

前記標的配列は、哺乳類の肝、例えば、ヒトＶＥＧＦ−Ａ遺伝子とマウスＶＥＧＦ−Ａ遺伝子との間によく保存されており、ｏｎ ｔａｒｇｅｔ部位での遺伝子矯正効率（例えば、ｉｎｄｅｌ頻度（％））に非常に優れ、ｏｎ ｔａｒｇｅｔ以外の部分では、ｍｉｓｍａｔｃｈｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅの個数が３個以下、２個以下、１個、または０個の部位（ｏｆｆ ｔａｒｇｅｔ部位）がほとんど存在せず、ｏｎ ｔａｒｇｅｔ以外の部分で遺伝子矯正が起こる確率が非常に低かったり無いので、安全性に優れている（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔが非常に低いかほとんどない）。

【0053】

このような優れた矯正効率および低いｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔに基づいて、本発明の一例は、前記ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化するＤＮＡおよびＣａｓ９タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）を含むＶＥＧＦ−Ａ遺伝子矯正用組成物を提供する。前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子矯正用組成物は、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質を含むリボ核酸タンパク質を含むものであってもよい。この時、前記リボ核酸タンパク質は、生体または細胞への投与前に予め組込まれたものであってもよい。

【0054】

本明細書において、標的遺伝子の標的部位と混成化可能なガイドＲＮＡの標的化配列は、標的配列が位置するＤＮＡ鎖（つまり、ＰＡＭ配列が位置するＤＮＡ鎖）の相補的な鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するもので、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。

【0055】

例えば、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの標的化配列「（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ」は、前記配列番号１〜４の標的配列と同一の配列を有するものであってもよい（ただし、ＴをＵに変更）。つまり、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、「（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ」は、配列番号９〜１６から選択された標的化配列を含むものであってもよい：
Ｖｅｇｆａ−１：５’−ＣＵＣＣＵＧＧＡＡＧＡＵＧＵＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号９）；
Ｖｅｇｆａ−２：５’−ＡＧＣＵＣＡＵＣＵＣＵＣＣＵＡＵＧＵＧＣ−３’（配列番号１０）；
Ｖｅｇｆａ−３：５’−ＧＡＣＣＣＵＧＧＵＧＧＡＣＡＵＣＵＵＣＣ−３’（配列番号１１）；
Ｖｅｇｆａ−４：５’−ＡＣＵＣＣＵＧＧＡＡＧＡＵＧＵＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１２）；
Ｖｅｇｆａ−５：５’−ＣＧＣＵＵＡＣＣＵＵＧＧＣＡＵＧＧＵＧＧ−３’（配列番号１３）；
Ｖｅｇｆａ−６：５’−ＧＡＣＣＧＣＵＵＡＣＣＵＵＧＧＣＡＵＧＧ−３’（配列番号１４）；
Ｖｅｇｆａ−７：５’−ＣＡＣＧＡＣＣＧＣＵＵＡＣＣＵＵＧＧＣＡ−３’（配列番号１５）；および
Ｖｅｇｆａ−８：５’−ＧＧＵＧＣＡＧＣＣＵＧＧＧＡＣＣＡＣＵＧ−３’（配列番号１６）。
例えば、前記ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的化配列であって、配列番号９または配列番号１０を含むことができる。

【0056】

一例において、従来、ＲＮＡを生体内または細胞内伝達時に生じる細胞生存率（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）減少の問題を解決するために、変形した形態のＲＮＡを使用することができる。例えば、ＲＮＡの５’末端にリン酸−リン酸結合を含まないように変形したＲＮＡ（例えば、５’末端にトリホスフェートまたはジホスフェートを含まない）をガイドＲＮＡとして使用することができる。あるいは、ｓｇＲＮＡ（例えば、化学的に合成されたｓｇＲＮＡ）は、５’末端および／または３’末端に１つ以上（例えば、１〜５個、または２〜４個）の変形したリボ核酸を含むことができ、この時、変形は、ホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）および／またはリボースの２’位置の変形（例えば、２’−ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ、２’ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ、またはその他の変形）などを含むことができる。一例において、前記変形したｓｇＲＮＡは、５’末端および３’末端それぞれに位置する３個のヌクレオチドにあるリボースの２’−Ｏ位置がメチレーション（メチル基添加）および／またはホスホロチオエートバックボーン（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅ）への変形などを含むものであってもよい。
他の例において、前記配列番号１〜４の中から選択された標的配列を含むガイドＲＮＡが提供される。

【0057】

前記方法において、前記ガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の細胞内への形質導入は、予め組込まれたガイドＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体（リボ核酸タンパク質）を通常の方法（例えば、電気穿孔、リポフェクションなど）で直接免疫細胞に導入するか、ガイドＲＮＡを暗号化するＤＮＡ分子とＣａｓ９タンパク質を暗号化する遺伝子（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ）（またはこれと８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の塩基配列相同性を有する遺伝子）を１つのベクターまたはそれぞれ別個のベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクターなど）に含まれている状態で細胞に導入するか、ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙにより行うことができる。

【0058】

一例において、前記ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。前記ウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ関連（ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）ウイルス（ＡＡＶ））、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）のような陰性鎖ＲＮＡウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）、例えば、狂犬病および小胞性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓ）（例えば、麻疹およびセンダイ（Ｓｅｎｄａｉ）、アルファウイルス（ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、およびピコルナウイルス（ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）のような陽性鎖ＲＮＡウイルス、およびヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ Ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスタイプ１および２、エプスタイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）−バール（Ｂａｒｒ）ウイルス、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））、アデノウイルスを含む二重−鎖のＤＮＡウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、牛痘（ｖａｃｃｉｎｉａ）、鶏痘（ｆｏｗｌｐｏｘ）、およびカナリア痘瘡（ｃａｎａｒｙｐｏｘ））などからなる群より選択されたものであってもよい。

【0059】

前記Ｃａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ、これを含むリボ核酸タンパク質、またはこれらのうちの１つ以上を含むベクターは、それぞれ電気穿孔法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクション、ウイルスベクター、ナノパーティクル（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）だけでなく、ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）融合タンパク質方法など当業界で公知の多様な方法の中から選択された適切な方法により生体内または細胞内に伝達される。

【0060】

前記Ｃａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ、これを含むリボ核酸タンパク質の核内伝達のために、前記Ｃａｓ９タンパク質および／またはガイドＲＮＡは、通常使用可能な核局在信号（ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ；ＮＬＳ）を追加的に含んでもよい。

【0061】

前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質において、Ｃａｓ９タンパク質は、微生物から分離されたもの、または組換え的方法または化学的合成方法で非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよいし、前記ガイドＲＮＡは、組換え的または化学的に生産されたものであってもよい。

【0062】

Ｃａｓ９タンパク質またはこれを暗号化する遺伝子（（ＤＮＡまたはｍＲＮＡ））およびＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の標的部位に特異的に結合する標的化配列を含むＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的ガイドＲＮＡまたはこれを暗号化するＤＮＡを含むＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤、またはＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質は、多様な投与経路を通して生体内に投与され、これに制限されないが、眼疾患（ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の過発現に関連する眼疾患）病変部位に局所投与または網膜下投与などの経路で眼球に投与される。

【0063】

前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤またはＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質の投与対象は、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子の過発現に関連する眼疾患を病んでいたり病む危険があるすべての哺乳動物、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などから選択された動物、これから分離された細胞（例えば、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）／脈絡膜／強膜複合体（ＲＰＥ／ｃｈｏｒｏｉｄ／ｓｃｌｅｒａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）など）または組織（眼球組織）、またはその培養物であってもよい。

【0064】

前記ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子を不活性化させる製剤またはＶＥＧＦ−Ａ遺伝子特異的リボ核酸タンパク質は、「薬学的有効量」で投与されるか、薬学組成物に含まれる。「薬学的有効量」は、適用部位における所望の効果、つまり、ＶＥＧＦ−Ａ遺伝子矯正効果を奏しうる量を意味し、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、投与時間、投与経路、排出速度、および反応感応性のような要因によって多様に処方される。

【発明の効果】

【0065】

本明細書で提案されるＶＥＧＦ−Ａ遺伝子矯正技術は、高い遺伝子矯正効率だけでなく、非常に低いｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔを示すことによって、効率的かつ安全に遺伝子矯正を行うことができ、これにより、ＶＥＧＦ−Ａタンパク質水準を病理学的閾値以下に抑えることによって、ＶＥＧＦ−Ａの過発現に関連する眼疾患の長期的または永久的な治療を可能にする。

【図面の簡単な説明】

【0066】

【図1A】マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞とヒトＡＲＰＥ−１９細胞のＶｅｇｆａ／ＶＥＧＦＡ遺伝子座の標的部位の配列を示す（ＰＡＭ配列：青色）；ｓｇＲＮＡ標的配列：青色）。

【図1B】ＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞でＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰまたはこれらの暗号化配列を含むプラスミドの導入によって誘導された突然変異をＴ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）の分析により確認した結果である。

【図1C】ＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞でＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰまたはこれらの暗号化配列を含むプラスミドの導入によって誘導された突然変異（ｉｎｄｅｌ）の頻度を示すグラフである。

【図1D】ＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞でＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰによって誘導される代表的なＶｅｇｆａ／ＶＥＧＦＡ遺伝子座における突然変異ＤＮＡ配列を示す。

【図1E】ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ＡＲＰＥ−１９細胞でＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰの導入によって誘導される突然変異の頻度を示すグラフである。

【図1F】Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰが形質感染したｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ水準を示すグラフである。

【図1G】Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰが形質感染したｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＶＥＧＦＡタンパク質水準を示すグラフである。

【図1H】４種のｓｇＲＮＡ（Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡ、Ｖｅｇｆａ−２ ｓｇＲＮＡ、Ｖｅｇｆａ−３ ｓｇＲＮＡ、およびＶｅｇｆａ−４ ｓｇＲＮＡ）を含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰまたはこれらの暗号化配列を含むプラスミドの導入によって誘発されるＮＩＨ３Ｔ３細胞における突然変異の頻度を示すグラフである。

【図2A】Ｃｙ３標識されたＣａｓ９ ＲＮＰ（Ｃｙ３標識されたＣａｓ９およびＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡ複合体）またはＣｙ３標識されたＣａｓ９単独（対照群）で形質感染させ、２４時間後にＮＩＨ３Ｔ３細胞を共焦点顕微鏡で観察した結果である。

【図2B】Ｃｙ３標識されたＣａｓ９ ＲＮＰまたはＣｙ３標識されたＣａｓ９単独で形質感染２４時間後の総ＤＡＰＩ陽性核の個数に対するＣｙ３陽性核の個数の比率（１００＊［Ｃｙ３陽性核の個数］／［総ＤＡＰＩ陽性核の個数］）を示すグラフである。

【図2C】形質感染２４時間後にＮＩＨ３Ｔ３細胞で誘導された突然変異をＴ７Ｅ１ ａｓｓａｙで分析した結果を示す。

【図2D】形質感染２４時間後にＮＩＨ３Ｔ３細胞で誘導された突然変異の頻度を示すグラフである。

【図2E】Ｃｙ３標識されたＣａｓ９ ＲＮＰをマウスの眼に注射してから３日目にＲＰＥ ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔを蛍光顕微鏡で観察した蛍光イメージである。

【図2F】Ｃｙ３標識されたＣａｓ９ ＲＮＰ注射後３日目に網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）／脈絡膜／強膜複合体（ＲＰＥ／ｃｈｏｒｏｉｄ／ｓｃｌｅｒａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）から分離された遺伝体ＤＮＡにおける生体内で誘導されたｉｎｄｅｌｓの頻度を示すグラフである。

【図2G】注射後２４時間および７２時間目にＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体におけるＣａｓ９タンパク質の水準をウェスタンブロッティングで確認した結果である。

【図2H】網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）／脈絡膜／強膜複合体（ＲＰＥ／ｃｈｏｒｏｉｄ／ｓｃｌｅｒａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）中の網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）の分布を蛍光顕微鏡で観察した蛍光イメージである。

【図2I】注射後２４時間および７２時間目にＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体におけるＣａｓ９タンパク質の水準をウェスタンブロッティングで確認した結果である。

【図3A】実施例３の試験過程を模式的に示す図である。

【図3B】注射後７日目、Ｒｏｓａ２６−特異性Ｃａｓ９ ＲＮＰ（対照群）またはＶｅｇｆａ−特異性Ｃａｓ９ ＲＮＰを注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおいてｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４（ＩＢ４）で染色されたｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＮＶを可視化した写真である。

【図3C】Ｖｅｇｆａ−特異性Ｃａｓ９ ＲＮＰを注射したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＣＮＶ面積を、Ｒｏｓａ２６−特異性Ｃａｓ９ ＲＮＰ注射した対照群のＣＮＶ面積と比較して示すグラフである。

【図3D】ＣＮＶ領域におけるＶｅｇｆａタンパク質の発現水準を示すグラフである。

【図3E】ＲＰＥ複合体内のＶｅｇｆａ標的部位におけるＩｎｄｅｌ頻度（％）を示すグラフである。

【図3F】ＲＰＥ複合体内のＲｏｓａ２６標的部位におけるＩｎｄｅｌ頻度（％）を示すグラフである。

【図3G】ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ染色で試料断面（ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）のＬａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＮＶ構造を可視化した結果を示す写真である。

【図3H】ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによる突然変異の分析に用いるためのＣＮＶ試料を示す。

【図3I】レーザ処理後７日目のＬａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＮＶを可視化した写真である。

【図4A】ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断部位を示すＧｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ Ｃｉｒｃｏｓ ｐｌｏｔである。

【図4B】４１個のＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅ ｓｉｔｅ（表５参照）およびＯｎ−ｔａｒｇｅｔ配列を含む４２個の配列のＳｅｑｕｅｎｃｅ ｌｏｇｏを示す。

【図4C】ヒトＡＲＰＥ−１９細胞から確認されたｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ部位およびｉｎｄｅｌ頻度を示す。

【図5】マウスＲＰＥでＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰによって誘導される突然変異ＤＮＡ配列を示すもので、ａは、ＲＮＰ注射３日後にＲＰＥにおいてＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰによって誘導される代表的な突然変異ＤＮＡ配列を示し、ｂは、ＲＮＰ注射７日後にレーザ誘導脈絡膜血管新生（ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ（ＣＮＶ））を有するＲＰＥにおける突然変異ＤＮＡ配列を示す。

【図6】マウスＲＰＥの２０個の潜在的ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ部位におけるｉｎｄｅｌ頻度（％）を示す。

【図7A】Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ注入７日後のＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ注入されたマウスおよびＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰが注入されない正常対照群のマウスの網膜から得られた蛍光断面イメージである。

【図7B】ｏｐｓｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ領域（％）を示すグラフである。

【図8】ｐＥＴ２８−ＮＬＳ−Ｃａｓ９ベクターの開裂地図である。

【図9】ｐＲＧ２ベクターの開裂地図である。

【発明を実施するための形態】

【0067】

以下、本発明を次の実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらは本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるわけではない。

【0068】

［参考例］
１．Ｃａｓ９ ＲＮＰの製造
精製されたＣａｓ９タンパク質は、ＴｏｏｌＧｅｎ Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａから購入して準備した。ｓｇＲＮＡは、Ｔ７ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、製造業者のプロトコルに従ってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成した。簡略に、２つの相補的なオリゴヌクレオチド（表１参照）をａｎｎｅａｌｉｎｇおよびｅｘｔｅｎｓｉｏｎしてｓｇＲＮＡのテンプレートを生成した。

【0069】

【表1】

【0070】

前記生成されたｓｇＲＮＡテンプレートを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼと共にＮＴＰｓ（Ｊｅｎａ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＲＮａｓｅ阻害剤（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む反応緩衝液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２ｍＭ ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．９）に入れて、３７℃で１６時間培養して転写させた。転写されたｓｇＲＮＡを、３７℃で３０分間、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に培養した。ｓｇＲＮＡをＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製し、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化した。精製されたｓｇＲＮＡｓ（６５μｇ）を、ＣＩＰ（Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ；１０００ｕｎｉｔｓ；Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）と共に３７℃で１時間培養して３−リン酸基を除去した。前記得られたｓｇＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて再び精製し、Ｎａｎｏ ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量化した。

【0071】

すべてのＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ ｓｔｏｃｋを用いて細胞生存率および遺伝体矯正（ｉｎｄｅｌ）効率を試験して、高効率のＣａｓ９タンパク質およびｓｇＲＮＡ ｓｔｏｃｋを選択してｉｎ ｖｉｖｏ ｅｙｅ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎに使用した。

【0072】

２．Ｃａｓ９タンパク質の精製
ｐＥＴ２８−ＮＬＳ−Ｃａｓ９ベクター（図８；Ｃａｓ９：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（配列番号３５８））を大腸菌菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させた後、０．５ｍＭ ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を処理して、１８℃で１２時間、Ｃａｓ９タンパク質の発現を誘導した。前記大腸菌細胞を超音波処理して溶解させ、２０，０００ｇで３０分間遠心分離した後、溶解性溶解液（ｓｏｌｕｂｌｅ ｌｙｓａｔｅ）を取ってＮｉ−ＮＴＡビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）と混合し、Ｃｙ３染料（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１：１０の比率（Ｃａｓ９タンパク質：Ｃｙ３染料分子）で添加した。前記混合物を暗条件および４℃条件で一晩（１２時間以上）培養した。溶離緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ；５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．６］、１５０−５００ｍＭ ＮａＣｌ、１０−２５％（ｗ／ｖ）グリセロール、０．２Ｍイミダゾール）を用いてＣｙ３−標識Ｃａｓ９を溶出させ、透析用緩衝液（ｄｉａｌｙｚｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ；２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）を用いて透析した。精製されたＣｙ３−標識Ｃａｓ９タンパク質をＵｌｔｒａｃｅｌ １００Ｋ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮させた。Ｃｙ３−標識Ｃａｓ９タンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定した。Ｃｙ３標識効率は、Ｃａｓ９タンパク質（２８０ｎｍ）および接合されたＣｙ３染料分子の吸収スペクトルを比較して測定した。

【0073】

３．細胞培養および形質感染
マウスＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣＲ ＣＲＬ−１６５８^ＴＭ）およびＡＲＰＥ−１９（ヒト網膜色素上皮細胞；ＡＴＣＣＲ ＣＲＬ−２３０２^ＴＭ）細胞株を、１０％（ｖ／ｖ）ＢＣＳまたはＦＢＳが補充されたＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）で、５％ＣＯ_２、３７℃、および湿潤大気条件下で培養した（ＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞はｍｙｃｏｐｌａｓｍａ汚染の有無が試験されていない）。形質感染１日前に、ＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞を２４−ウェルプレートに２ｘ１０^４細胞／ウェルの量で接種した。各ウェルには抗生剤無含有成長培地２５０μｌが添加されている。

【0074】

プラスミド伝達の場合、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って、Ｃａｓ９（１μｇ；Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来；コーディング配列（４１０７ｂｐ）：配列番号３５８）発現プラスミド（ｐＥＴ ｖｅｃｔｏｒ（Ａｄｄ ｇｅｎｅ）使用）およびｓｇＲＮＡ（１μｇ；実施例１）発現プラスミド（ｐＲＧ２ ｖｅｃｔｏｒ（図９参照）使用）で前記２４−ウェルプレートの細胞を形質感染させた。

【0075】

ＲＮＰ伝達の場合、Ｃａｓ９タンパク質（４μｇ；実施例２）を、室温で５分間、ｓｇＲＮＡ（２．２５μｇ；実施例１）と共に培養した後、５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。１０分後、前記ＲＮＰ混合物を前記２４−ウェルプレートの細胞に添加して細胞を形質感染させた。形質感染４８時間後、細胞を収穫し、Ｔ７Ｅ１分析、ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、およびｑＰＣＲを行った。

【0076】

ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ＲＰＥ（ｈｕｍａｎ ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）でＶＥＧＦ−Ａを発現させる場合、前記準備されたＡＲＰＥ−１９細胞は、ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙに到達した後、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳが含有されたＤＭＥＭ／Ｆ１２で維持させて、試験のためのｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｌａｙｅｒが形成されるようにした。ＡＲＰＥ−１９細胞を１２−ウェルプレートに入れて、Ｃａｓ９タンパク質８μｇ、ｓｇＲＮＡ４．５μｇ、およびｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００ ３μｌで形質感染させた。形質感染２日後、形質感染成長培地（ＤＭＥＭ＋１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）を新鮮な無血清培地０．５ｍｌに入れ替えた。１６時間後、細胞および培地を収穫し、ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ｑＰＣＲ、およびＥＬＩＳＡを行った。

【0077】

４．Ｃｙ３−標識Ｃａｓ９ ＲＮＰのイメージングおよびカウンティング
形質感染後１日目に、細胞を、室温で１０分間、４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させた後、室温で１５分間、４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ、１μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。前記細胞をｘ６３０倍率で共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で視角化した。スキャニング媒介変数は次の通りにした：ｓｃａｌｉｎｇ（ｘ＝０．１４μｍ／ｐｉｘｅｌ、ｙ＝０．１４μｍ／ｐｉｘｅｌ、ｚ＝１μｍ／ｐｉｘｅｌ）、ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（ｘ＝１０２４、ｙ＝１０２４、ｚ＝６、ｃｈａｎｎｅｌｓ：３、１２−ｂｉｔ）（ｗｉｔｈ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ６３ｘ／１．２０Ｗ Ｋｏｒｒ ＵＶ−ＶＩＳ−ＩＲ）。ＺＥＮ２ソフトウェア（黒色板、Ｖｅｒ１０．０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いてＣｙ３陽性核（Ｃｙ３ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎｕｃｌｅｉ）を計数した。Ｃｙ３陽性核の頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を定量化するために、我々は倍率６３０倍で観察される視野範囲でＣｙ３染色された核を有する細胞の数と全体細胞数を数え、４つの視野にわたって観察されるＣｙ３陽性核の平均百分率を計算した（ｎ＝３）。

【0078】

５．Ｔ７Ｅ１ Ａｓｓａｙ
ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者のプロトコルに従って細胞および組織から遺伝体ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を分離した。ＰＣＲを用いて標的部位を増幅させた後、生成物を熱循環器を用いて変性させアニーリングさせた。この時使用されたプライマーを下記の表２にまとめた：

【0079】

【表2】

【0080】

アニーリングされたＰＣＲ産物を、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＴｏｏｌＧｅｎ、Ｉｎｃ．）と共に３７℃で２５分間インキュベーションし、アガロースゲル電気泳動で分析した。

【0081】

６．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Ｐｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、遺伝体ＤＮＡからオン−ターゲット（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）および潜在的オフ−ターゲット（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）領域を増幅させた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（ＬＡＳ Ｉｎｃ．韓国）を用いてＰＣＲ増幅物の対をなした配列の分析を行った。使用されたプライマーを表３〜表５にまとめた：

【0082】

【表3】

【0083】

【表4】

【0084】

【表5】

ＰＡＭ配列の上流３ｂｂｐ部位周囲の突起は、Ｃａｓ９ ＲＮＰ活性による突然変異と見なされた。

【0085】

７．ＲＮＡ抽出およびｑＰＣＲ
ｅａｓｙ−ｓｐｉｎＴＭ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ抽出キット（ｉＮｔＲＯＮ、韓国）を用いて、製造会社のプロトコルに従ってＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞から全体ＲＮＡを分離した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｋｏｒｅａ）を用いて２５０ｎｇのＲＮＡを逆転写させた。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＫＡＰＡ）および次のプライマーを用いて定量的ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ；ｑＰＣＲ）を行った：

【0086】

ｍｏｕｓｅ Ｖｅｇｆａ：５’−ＡＣＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＣ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ；配列番号２８３）、５’−ＣＴＧＴＣＴＴＴＣＴＴＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴＣ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ；配列番号２８４）；

【0087】

ｍｏｕｓｅ Ｇａｐｄｈ：５’−ＧＣＴＧＡＧＴＡＴＧＴＣＧＴＧＧＡＧＴＣＴＡ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ；配列番号２８５）、５’−ＧＴＧＧＴＴＣＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＡＡ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ；配列番号２８６）；

【0088】

ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦＡ−１：５’−ＣＧＡＧＴＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＴＣＣ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ；配列番号２８７）、５’−ＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ；配列番号２８８）；

【0089】

ｈｕｍａｎ ＶＥＧＦＡ−２：５’−ＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＡＡＴ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ；配列番号２８９）、５’−ＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＧＴＡ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ；配列番号２９０）；

【0090】

ｈｕｍａｎ ＧＡＰＤＨ：５’−ＣＡＡＴＧＡＣＣＣＣＴＴＣＡＴＴＧＡＣＣ−３’（ｆｏｒｗａｒｄ；配列番号２９１）、５’−ＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡＴＣＴＣＧ−３’（ｒｅｖｅｒｓｅ；配列番号２９２）。

【0091】

８．ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ＡＲＰＥ−１９細胞を用いたＶＥＧＦＡ ＥＬＩＳＡ
ヒトＶＥＧＦＡ ＥＬＩＳＡを行うために、Ｖｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰ処理されたｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ＡＲＰＥ−１９細胞を無血清（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ）培地で１６時間培養した後、前記細胞培養物から無血清上澄液（ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を収集し、ヒトＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＤＶＥ００、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造会社の指針に従って分泌されたＶＥＧＦＡタンパク質水準を測定した。

【0092】

９．遺伝体ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｅａｖａｇｅおよびＤｉｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＡＲＰＥ−１９細胞（ＡＴＣＣ）から遺伝体ＤＮＡを分離した。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのために、遺伝体ＤＮＡを次の方法でｉｎ ｖｉｔｒｏ切断した。簡単に説明すれば、遺伝体ＤＮＡ（２０μｇ）を、Ｃａｓ９タンパク質（１６．７μｇ）およびｓｇＲＮＡ（１２．５μｇ）と共に反応緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１００μｇ／ｍｌ ＢＡＳ、ｐＨ７．９）で、３７℃の条件で３時間インキュベーションして、Ｃａｓ９による遺伝体ＤＮＡの切断が起こるようにした。切断された遺伝体ＤＮＡをＲＮａｓｅ Ａ（５０μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で３７℃で３０分間処理し、ＤＮｅａｓｙ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。Ｗｈｏｌｅ−ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇとＤｉｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇは、関連技術分野で知られた方法で行った（Ｋｉｍ，Ｄ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｋｉｍ，Ｓ．，Ｐａｒｋ，Ｊ．＆Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ２６，４０６−４１５（２０１６））。

【0093】

１０．ＲＮＰが網膜下注入された動物の準備
本明細書の実施例で使用されたすべての動物の管理、使用および治療は、Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅで定めたガイドラインおよび「ＡＲＶＯ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ ｉｎ Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ ａｎｄ Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」を厳格に遵守して行った。成体（６週齢）雄ＳＰＦ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを研究に使用した。マウスは１２時間／１２時間の明／暗周期下で維持させた。

【0094】

前記準備されたマウスに対して、次の方法でＲＮＰを網膜下注入（Ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）した。まず、Ｃａｓ９タンパク質（８μｇ）、ｓｇＲＮＡ（４．５μｇ）、およびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（２０％（ｖ／ｖ））で構成されたＲＮＰを２μｌまたは３μｌ（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ ｖｏｌｕｍｅ）となるように混合した。前記準備されたＲＮＰ（２μｌまたは３μｌ）を、手術顕微鏡（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｔｄ．）下、３３Ｇ鈍針（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）付きＮａｎｏｆｉｌ注射器を用いてマウスの網膜下空間（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｓｐａｃｅ）に注射した。網膜出血があるマウス個体は試験から除外させた。

【0095】

１１．レーザ誘導脈絡膜血管新生（Ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ；ＣＮＶ）動物モデルの作製
ｔｉｌｅｔａｍｉｎｅとｚｏｌａｚｅｐａｍを１：１の重量比で混合した混合物を２．２５ｍｇ／ｋｇ（体重）の量で腹腔内注射してマウスを麻酔させた。ｐｈｅｎｙｌｅｐｈｒｉｎｅ（０．５％（ｗ／ｖ））とｔｒｏｐｉｃａｍｉｄｅ（０．５％（ｗ／ｖ））が含まれている点眼液でマウスの瞳孔を拡張させた。Ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｈｅａｄ ｓｅｔ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｒｉｄｅｘ）とレーザシステム（Ｉｌｏｏｄａ）を用いてレーザ光凝固（Ｌａｓｅｒ ｐｈｏｔｏｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）を行った。レーザ波長は５３２ｎｍとした。レーザ媒介変数（Ｌａｓｅｒ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ）は次の通りである：スポットサイズ：２００μｍ、電力：１Ｗ、および露出時間：１００ｍｓ。変形した視神経円盤（ｏｐｔｉｃ ｄｉｓｃ）周囲の１２時位置（右眼）または６時位置（左眼）にレーザ火傷（ｌａｓｅｒ ｂｕｒｎ）を誘導させた。硝子体出血（ｖｉｔｒｅｏｕｓ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）がない泡を発生させたレーザ火傷のみを試験対象に含ませた。レーザ火傷の四分円でＲＮＰの網膜下注入を施した。Ｃａｓ９ ＲＮＰ（ｓｇＲｏｓａ２６（Ｒｏｓａ２６ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｇＲＮＡを含む）またはｓｇＶｅｇｆａ（Ｖｅｇｆａ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｇＲＮＡを含む））は、各マウスの左眼または右眼にランダムに割り当てた。Ｃａｓ９ ＲＮＰの網膜下注射によって水ぶくれ（ｂｌｅｂ）ができた。この水ぶくれがレーザ火傷部位と重なったことを確認した。水ぶくれがレーザ火傷部位と重なった個体を後の試験に使用した。レーザ処理７日後、眼球を室温で１時間４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡ（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定させた。ＲＰＥ（ｒｅｔｉｎａｌ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）複合体（ＲＰＥ／脈絡膜／強膜）をｉｓｏｌｅｃｔｉｎ−Ｂ４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ｃａｔ．ｎｏ．Ｉ２１４１３、１：１００）で４℃で一晩処理して免疫染色させた。染色されたＲＰＥ複合体を蛍光顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ ９０ｉ、Ｎｉｋｏｎ）に平らに載せてｘ４０倍率で観察した。ＣＮＶ面積は、ｂｌｉｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒがＩｍａｇｅ Ｊソフトウェア（１．４７ｖ、ＮＩＨ）を用いて測定した。

【0096】

１２．免疫蛍光染色およびイメージング
ＲＰＥ複合体中のＲＰＥ細胞数を高倍率フィールド領域（ｈｉｇｈ ｐｏｗｅｒ ｆｉｅｌｄ ａｒｅａ）（１００μｍｘ１００μｍ、ｎ＝８）でパラフィンに挿入された断片試料（ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ ｓａｍｐｌｅ、４μｍ）内のＤＡＰＩ染色された核を計数して算定した。注射後７日目に得られた断片試料（ｎ＝４）を、ａｎｔｉ−ｏｐｓｉｎ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ５４０５、１：１０００）とＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、１：５００）で免疫染色した。ｏｐｓｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ領域は、ｂｌｉｎｄ ｏｂｓｅｒｖｅｒがＩｍａｇｅ Ｊソフトウェア（１．４７ｖ、ＮＩＨ）を用いて測定した。共焦点顕微鏡（ＬＳＭ７１０、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いてＲＰＥ ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔにおけるＣｙ３−Ｃａｓ９タンパク質の細胞内分布をイメージングした。スキャニングパラメータは次の通りである：ｓｃａｌｉｎｇ（ｘ＝０．０４２μｍ／ｐｉｘｅｌ、ｙ＝０．０４２μｍ／ｐｉｘｅｌ、ｚ＝０．６０３μｍ／ｐｉｘｅｌ）、ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ（ｘ＝１０２４、ｙ＝１０２４、ｚ＝１２、ｃｈａｎｎｅｌｓ：２、８−ｂｉｔ）、ａｎｄ ｚｏｏｍ（５．０）ｗｉｔｈ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｃ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ ４０ｘ／１．２０Ｗ Ｋｏｒｒ Ｍ２７．ＺＥＮ２ソフトウェアを用いてイメージを処理した。

【0097】

１３．ＣＮＶ領域およびＲＰＥ複合体から遺伝体ＤＮＡ抽出
ＲＮＰを注射して３日目にＲＰＥ複合体から遺伝体ＤＮＡを分離し、ＣＮＶ面積の測定後にＲＮＰを注射し、７日目にＣＮＶ試料から遺伝体ＤＮＡを分離し、遺伝体ＤＮＡの分離はＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を用いて行った。ＲＮＰ効能を評価するために、各ＲＰＥ複合体を４四分円に分割し、ＲＮＰが注入された四分円を処理して遺伝体ＤＮＡを分離した。ＣＮＶ領域のＲＰＥ複合体におけるｉｎｄｅｌ頻度を評価するために、ＲＰＥ ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔをイメージングした後、ＰＢＳで洗浄した。遺伝体ＤＮＡは次の２つの領域から分離した：（ｉ）ＣＮＶのＲＮＰ注入領域を含む四分円（注入部位を代表する）；および（ｉｉ）反対四分円（ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｑｕａｄｒａｎｔ；非注入部位を代表する）。

【0098】

１４．マウスＶＥＧＦ−Ａ ＥＬＩＳＡ
マウスＶＥＧＦ−Ａ ＥＬＩＳＡの場合、眼球に計３０個のレーザ火傷を誘発させた後、ＲＮＰ（３μｌ）を網膜下空間（ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ ｓｐａｃｅ）に注射した。注射後３日目、全体ＲＰＥ複合体を網膜から分離し、追加分析のために凍結させた。ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ｌｇｅｐａｌ ＣＡ−６３０、０．５％Ｎａ．ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳ）で細胞を溶解させ、マウスＶＥＧＦ Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＭＭＶ００、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造業者の指示に従ってＶＥＧＦ−Ａ水準を測定した。

【0099】

１５．ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）
ＲＮＰの生体内伝達後、時間の経過によるＲＮＰ水準を分析するために、注射後１日および３日目に得られたＲＰＥ複合体に対してウェスタンブロッティングを行った。同量のタンパク質（２０μｇ）を含有する試料を分析し；Ｃａｓ９とアクチンは、それぞれ抗−ＨＡ高親和性抗体（Ｒｏｃｈｅ、１：１０００）および抗−β−アクチン抗体（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、１：１０００）を用いて検出した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ４０００（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてデジタルイメージングした。

【0100】

１６．統計処理
データ分析はＳＰＳＳソフトウェアバージョン１８．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて行った。Ｐ ｖａｌｕｅはｕｎｐａｉｒｅｄ、ｔｗｏ ｓｉｄｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔまたはｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡおよびＴｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔ（多数の試験群の場合）によって決定した。データはｓ．ｅ．ｍ（ｓｔａｎｄａｒｄ ｅｒｒｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅａｎ）と共に平均値で表した。

【0101】

［実施例１：Ｃａｓ９ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＲＮＰｓ）によるＶｅｇｆａ／ＶＥＧＦＡ遺伝子の標的突然変異の誘発］
マウスＮＩＨ３Ｔ３およびヒト網膜色素上皮細胞株ＡＲＰＥ−１９で、ＶＥＧＦ受容体１および２に対する結合部位を暗号化するＶｅｇｆａ遺伝子のエクソン３とエクソン４で標的部位をターゲッティングする４個の単一鎖ガイドＲＮＡｓ（ｓｇＲＮＡｓ）（Ｖｅｇｆａ−１、２、３および４で表示）を試験した。前記４種のｓｇＲＮＡ（Ｖｅｇｆａ−１、２、３および４）は参考例１を参照して作製した。

【0102】

ＶＥＧＦＡ／Ｖｅｆｇａ遺伝子内のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の標的配列（ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をターゲッティングするｓｇＲＮＡの標的化配列（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）およびヒト遺伝体とマウス遺伝体におけるｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｓｉｔｅの個数を下記の表６にまとめた：

【0103】

【表6】

【0104】

前記のように製造されたｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰをマウスＮＩＨ３Ｔ３細胞およびヒトＡＲＰＥ−１９細胞にそれぞれ導入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して、下記の試験を進行させた。前記ＲＮＰの細胞内への導入は、参考例３に記載されているように、プラスミドを介して細胞内に伝達された核酸分子を細胞内でｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質を発現させる方式（図にてｐｌａｓｍｉｄで表示）で行うか、予めｓｇＲＮＡと組換えＣａｓ９タンパク質の複合体（または混合物）を陽イオン性脂質（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）を用いて細胞内に導入させる方式（図にてＲＮＰで表示）で行った。

【0105】

マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞とヒトＡＲＰＥ−１９細胞のＶｅｇｆａ／ＶＥＧＦＡ遺伝子座の標的部位の配列を図１Ａに示した（ＰＡＭ配列：青色）；ｓｇＲＮＡ標的配列：青色）。

【0106】

形質感染２日後にＴａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（参考例６参照）を行って、前記製造された４種のｓｇＲＮＡ（Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡ、Ｖｅｇｆａ−２ ｓｇＲＮＡ、Ｖｅｇｆａ−３ ｓｇＲＮＡ、およびＶｅｇｆａ−４ ｓｇＲＮＡ）を含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰまたはこれらの暗号化配列を含むプラスミドの導入によって誘発されるＮＩＨ３Ｔ３細胞における突然変異の頻度を測定して、その結果を図１Ｈに示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）、Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ａｎｄ Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔｓ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0107】

また、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）の分析（参考例５参照）を行って、ＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞でＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰまたはこれらの暗号化配列を含むプラスミドの導入によって誘導された突然変異を検出して、図１Ｂに示した。図１Ｂで、矢印はＴ７Ｅ１によって切断されたＤＮＡバンドの予想位置を表す。

【0108】

また、形質感染２日後にＴａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（参考例６参照）を行って、ＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞でＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰまたはこれらの暗号化配列を含むプラスミドの導入によって誘導された突然変異の頻度を測定して、その結果を図１Ｃに示した（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ：ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）；Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ａｎｄ Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔｓ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0109】

ＮＩＨ３Ｔ３およびＡＲＰＥ−１９細胞でＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰ（Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含む）によって誘導される代表的なＶｅｇｆａ／ＶＥＧＦＡ遺伝子座における突然変異ＤＮＡ配列を図１Ｄに示した（下線：ｓｇＲＮＡがターゲッティングする標的配列、青色：挿入されたヌクレオチド、−：欠失部位、ＷＴ：野生型；三角形：切断位置；右の数値：挿入または欠失したヌクレオチド数）。

【0110】

また、形質感染６４時間後にｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（参考例６参照）を行って、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ＡＲＰＥ−１９細胞でＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰの導入によって誘導される突然変異（ｉｎｄｅｌ）の頻度を測定し、その結果を図１Ｅに示した。さらに、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）（参考例７参照）を行って測定された前記細胞におけるＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡの相対的水準を図１Ｆに示し、参考例８を参照してＶＥＧＦＡ ＥＬＩＳＡを行って測定された前記細胞におけるＶＥＧＦＡタンパク質水準を図２Ｇに示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒ：ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝５）、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0111】

図１Ｈに示されているように、４種のｓｇＲＮＡ中、Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡがＣａｓ９と複合体を形成してＲＮＰ形態で細胞内に導入される場合に、ＮＩＨ３Ｔ３細胞で最も高いｉｎｄｅｌ効率を示した。また、図１Ｂおよび１Ｃに示されているように、ｉｎｄｅｌ効率が最も高いＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡは、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＡＲＰＥ−１９細胞で突然変異を誘発し、特にＲＮＰ形態で導入する時、８２±５％（ＮＩＨ３Ｔ３細胞）または５７±３％（ＡＲＰＥ−１９細胞）の頻度で標的部位で小さい挿入および欠失（ｉｎｄｅｌｓ）を誘導することが確認された。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９がＲＮＰ形態で伝達される場合、プラスミドを介した形質感染よりｉｎｄｅｌ効率が高く現れた（図１Ｃ）。

【0112】

図１Ｅのように、Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ処理時、ＡＲＰＥ−１９細胞における突然変異（ｉｎｄｅｌ）は４０±８％の頻度で検出され、図１Ｆおよび１Ｇのように、Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰは、ｐｏｓｔ−ｍｉｔｏｔｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ下、ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ ＡＲＰＥ−１９細胞におけるＶＥＧＦＡ ｍＲＮＡ水準とＶＥＧＦタンパク質水準をそれぞれ２４±４％（ｍＲＮＡ水準）および５２±９％（タンパク質水準）の減少幅に減少させた。

【0113】

［実施例２：Ｃｙ３−ｌａｂｅｌｅｄ Ｃａｓ９ ＲＮＰのＩｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ伝達］
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのＣａｓ９ ＲＮＰの位置をモニタリングするために、Ｃｙ３が接合されたＣａｓ９タンパク質（参考例４）を用い、Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡと結合したり結合しないＣｙ３−Ｃａｓ９を陽イオン性脂質と混合してＮＩＨ３Ｔ３細胞に形質感染させるか、網膜下注射によりＶｅｇｆａ特異的Ｃｙ３標識または非標識Ｃａｓ９ ＲＮＰを成体マウスの眼球に注入して、下記の試験を行った。

【0114】

Ｃｙ３標識されたＣａｓ９ ＲＮＰ（Ｃｙ３標識されたＣａｓ９およびＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡ複合体）またはＣｙ３標識されたＣａｓ９単独（対照群）で形質感染させ、２４時間後にＮＩＨ３Ｔ３細胞を共焦点顕微鏡で観察して、細胞内Ｃｙ３信号の位置をイメージングした（参考例４参照）。前記得られたイメージを図２Ａに示した。図２Ａで、白い矢印はＣｙ３染料の核ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを表し、右側のｚ軸イメージはＣｙ３標識されたＣａｓ９が核内部に位置することを示す。

【0115】

また、前記形質感染２４時間後に、総ＤＡＰＩ陽性核の個数に対するＣｙ３陽性核の個数の比率（１００＊［Ｃｙ３陽性核の個数］／［総ＤＡＰＩ陽性核の個数］）を測定して、図２Ｂに示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0116】

さらに、前記形質感染２４時間後に、Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）の分析（参考例５参照）を行って、ＮＩＨ３Ｔ３細胞でＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰの導入によって誘導された突然変異を検出して、図２Ｃに示した。図２Ｃで、矢印はＴ７Ｅ１によって切断されたＤＮＡバンドの予想位置を表す。

【0117】

さらに、前記形質感染２４時間後に、Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（参考例６参照）を行って、ＮＩＨ３Ｔ３細胞でＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰの導入によって誘導された突然変異の頻度を測定して、その結果を図２Ｄに示した（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ：ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝３）；Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ａｎｄ Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔｓ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0118】

Ｃｙ３標識されたＣａｓ９ ＲＮＰをマウスの眼に注射後３日目に、代表的に選択されたＲＰＥ ｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔを蛍光顕微鏡で観察して（参考例１１および１２参照）、その結果を図２Ｅに示した。図２Ｅで、白い矢印はＣｙ３染料の核ｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎを表す。

【0119】

網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）／脈絡膜／強膜複合体（ＲＰＥ／ｃｈｏｒｏｉｄ／ｓｃｌｅｒａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）中の網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）の分布を蛍光顕微鏡で観察して（参考例１１および１２参照）、その結果を図２Ｈに示した。図２Ｈは、ＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体の代表的な断面図を示す。ＤＡＰＩ陽性ＲＰＥ細胞および他の細胞は高倍率フィールド領域（１００μｍｘ１００μｍ）で計数された。図２Ｈの黄色い線はＲＰＥと脈絡膜との間の境界を表すものであり、白い矢印はＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体中のＲＰＥ核（１０．５±２．８％、ｎ＝８）を示す。

【0120】

参考例１３を参照して、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）／脈絡膜／強膜複合体（ＲＰＥ／ｃｈｏｒｏｉｄ／ｓｃｌｅｒａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ）から分離された遺伝体ＤＮＡを用いて、生体内で誘導されたｉｎｄｅｌｓの頻度を決定した。Ｉｎｄｅｌｓ頻度は、注射後３日目にＴａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（参考例６参照）を行って分析した。得られた結果を図２Ｆに示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ａｒｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝６）、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊Ｐ＜０．０１）。

【0121】

生体内でＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰ（Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含む）によって誘導される突然変異ＤＮＡ配列を図５に示した。図５で、ａは、注射３日後にＲＰＥでＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰによって誘導される代表的な突然変異ＤＮＡ配列を示し、ｂは、注射７日後にレーザ誘導脈絡膜血管新生（ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ（ＣＮＶ））を有するＲＰＥでの突然変異ＤＮＡ配列を示す。ＰＡＭ配列は赤色で表し、ＷＴは野生型を意味し、右の数値は挿入されたり欠失したヌクレオチドの個数を表す。

【0122】

ウェスタンブロッティングを行って（参考例１５）、注射後２４時間および７２時間目にＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体におけるＣａｓ９タンパク質の水準を測定し（ｎ＝４）、その結果を図２Ｇおよび図２Ｉに示した。

【0123】

図２Ａ〜２Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果を示す。図２Ａおよび２Ｂに示されているように、Ｃｙ３−Ｃａｓ９ ＲＮＰは多数の核で検出され、図２Ｃおよび２Ｄに示されているように、標的部位でｉｎｄｅｌを誘導することが確認された。

【0124】

Ｃｙ３−Ｃａｓ９ ＲＮＰ処理時のＣｙ３陽性核の比率（４２±６％）（図２Ｂ）は、標的部位におけるｉｎｄｅｌ頻度（４０±３％）（図２Ｄ）とほぼ類似し、このような結果は、核に位置したＣａｓ９によって細胞内で標的部位がほぼ完全に切断され、このような遺伝体矯正におけるｒａｔｅ ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒがＣａｓ９の核位置化であることを意味する。一方、Ｃｙ３−Ｃａｓ９がｓｇＲＮＡなしに単独で導入された場合、核でほとんど検出されず、ｉｎｄｅｌｓを誘導しなかった（図２Ａおよび２Ｄ）。Ｃａｓ９は、ｐＩ値が９．１２の正電荷を帯びるタンパク質であり、負電荷を帯びるｓｇＲＮＡがない時、陽イオン性脂質と複合体を形成できない。Ｃｙ３−Ｃａｓ９ ＲＮＰは、Ｃｙ３標識されないＣａｓ９ ＲＮＰより活性が低く、標識されないＣａｓ９ ＲＮＰは、８０％の頻度で標的特異的突然変異を誘導した（図２Ｄ）。

【0125】

図２Ｅ〜２Ｇおよび図１０２〜図１０４は、ｉｎ ｖｉｖｏ結果を示す。Ｃｙ３−Ｃａｓ９ ＲＮＰ注射３日後に、Ｃｙ３蛍光信号が網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）の核で観察された（ｉｎ ｖｉｖｏ、図２Ｅ）。ＲＰＥは、網膜下注射によるＲＮＰ伝達の主要標的であるため、ＲＰＥ細胞単独でも突然変異の頻度を理想的に分析可能である。しかし、実際には、ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇのために、ＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体からＲＰＥ細胞を分類することが容易でない。その代わりに、ＤＡＰＩ陽性核を計算してＲＰＥ細胞の比率を計算し、ＲＰＥ細胞は、ＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体の細胞中の１１±３％を占めた（図２Ｈ）。

【0126】

特に、Ｃｙ３−非標識Ｃａｓ９ ＲＮＰの網膜下注射は、注射後３日目にｉｎｄｅｌを１６±２％の頻度で誘発し、生体内ＲＰＥ細胞のＶｅｇｆａ遺伝子の標的部位の大部分で矯正が起こった（ｎ＝６、図２Ｆおよび図５のａ）。さらに、ウェスタンブロッティング分析により、Ｃａｓ９タンパク質が注入後３日目に完全に分解されることを確認し（図２Ｇおよび２Ｉ）、これは、Ｃａｓ９が生体内で速やかに転換されることを表す。

【0127】

［実施例３：Ｖｅｇｆａを標的とするＣａｓ９ ＲＮＰの網膜下注射の老人性黄斑変性（ＡＭＤ）およびレーザ誘発脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）に対する効果試験］
Ｃａｓ９ ＲＮＰがＡＭＤマウスモデルでＣＮＶの治療に使用できるかを調べるために、レーザで誘導された脈絡膜血管新生（ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＮＶ）を有するマウスにＶｅｇｆａ特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰ（Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ；Ｖｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡを含む）またはＲｏｓａ２６特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰ（Ｒｏｓａ２６−ＲＮＰ；Ｒｏｓａ２６ ｓｇＲＮＡを含む）を網膜下注射して、以下の試験を行った。網膜下注射は、それ自体でＣＮＶの大きさを増加させるため、Ｒｏｓａ２６−ＲＮＰを対照群として使用した。

【0128】

ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＮＶを有するマウスに予め組込まれたＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰを網膜下注射で投与した。注射後７日目に、眼球内の網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）複合体をｆｌａｔ−ｍｏｕｎｔｉｎｇし、ＣＮＶ領域を分析した。Ｃａｓ９ ＲＮＰ注入領域または反対側の非注射領域（ＲＮＰのない領域）から分離された遺伝体ＤＮＡをｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇで分析した。Ｖｅｇｆａ ＥＬＩＳＡは注射後３日目に行った。前記試験過程を図３Ａに模式的に示した。

【0129】

注射後７日目、Ｒｏｓａ２６−特異性Ｃａｓ９ ＲＮＰ（対照群）またはＶｅｇｆａ−特異性Ｃａｓ９ ＲＮＰを注射したＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスでｉｓｏｌｅｃｔｉｎ Ｂ４（ＩＢ４）で染色されたｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＮＶを可視化して（参考例１１参照）、得られた代表的イメージを図３Ｂに示した。図３Ｂで、黄色い線はＣＮＶ領域を区分する。

【0130】

注射後７日目、ＣＮＶ面積を評価して治療効果を評価した。参考例１１を参照して、Ｖｅｇｆａ−特異性Ｃａｓ９ ＲＮＰを注射したＣ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるＣＮＶ面積を測定して、Ｒｏｓａ２６−特異性Ｃａｓ９ ＲＮＰ注射した対照群のＣＮＶ面積（１００％）に対する相対値（％）で図３Ｃに示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１５）、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0131】

ＣＮＶ領域におけるＶｅｇｆａ水準（ｐｇ／ｍｌ）をＥＬＩＳＡで測定して（参考例１４参照）、その結果を図３Ｄに示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝１０）、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊Ｐ＜０．０１）。

【0132】

ＲＰＥ複合体内のＶｅｇｆａ標的部位におけるＩｎｄｅｌ頻度（％）を図３Ｅに示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝７）、Ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ ａｎｄ Ｔｕｋｅｙ ｐｏｓｔ−ｈｏｃ ｔｅｓｔｓ、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。

【0133】

ＲＰＥ複合体内のＲｏｓａ２６標的部位におけるＩｎｄｅｌ頻度（％）を図３Ｆに示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝７）、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ、＊Ｐ＜０．０５）。

【0134】

ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆ｅｏｓｉｎ染色で試料断面（ｃｒｏｓｓ ｓｅｃｔｉｏｎ）のＬａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＮＶ構造を可視化して図３Ｇに示した。図３Ｇで、黄色い線はＣＮＶ境界を表し、白い三角形はＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体中の網膜色素上皮細胞（ＲＰＥ）層を表す。大部分のＲＰＥ細胞は、ＣＮＶ領域で損傷を受けたことを確認できる（Ｃｈ：脈絡膜、Ｒ：網膜、Ｓ：強膜）。

【0135】

ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによる突然変異の分析に用いるための代表的なＣＮＶ試料を図３Ｈに示した。図３Ｈで、赤色線は突然変異の分析のためのＲＰＥ／脈絡膜／強膜複合体の境界を表す。ＲＰＥ細胞は、黄色線で表されたＣＮＶ領域の外部に主に存在していた。

【0136】

レーザ処理後７日目のＬａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ＣＮＶを図３Ｉに示した。ＩＢ４マーカとＤＡＰＩで共同染色された内皮細胞をＣＮＶ領域で募集した（真ん中）。

【0137】

図３Ｂおよび３Ｃに示されているように、Ｒｏｓａ２６−ＲＮＰを注入したマウスと比較して、Ｖｅｇａｆ−ＲＮＰを注入したあるマウスにおいてＣＮＶ面積が有意に減少した（Ｒｏｓａ２６−ＲＮＰ注入マウス対比５８±４％、ｎ＝１５、Ｐ＜０．００１、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）。

【0138】

また、図３Ｄから明らかなように、Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ注入時、ＣＮＶ領域でのＶｅｇｆａタンパク質の濃度が３００±２０ｐｇ／ｍｌ（ｎ＝１０）で、Ｒｏｓａ２６−ＲＮＰ注入時（４４０±３０ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝１０）と比較して、ＣＮＶ領域でＶｅｇｆａタンパク質の濃度を効果的に減少させることを確認できる。

【0139】

さらに、図３Ｅおよび３Ｆに示されているように、Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ処理されたＣＮＶおよびＲｏｓａ２６−ＲＮＰ処理されたＣＮＶにおけるそれぞれのＲＮＰの標的部位（図５のｂ参照）でのｉｎｄｅｌ頻度がそれぞれ３．５±０．３％（Ｖｅｇｆａ ｉｎｄｅｌ）および３．３±１．０％（Ｒｏｓａ２６ ｉｎｄｅｌ）の頻度で検出されたのに対し、陰性対照群ではｉｎｄｅｌが全く検出されなかった。このような結果は、Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰの網膜下注射によって大きさの小さいマウスの眼において局所的治療が可能であることを表す。

【0140】

一方、図３Ｇから明らかなように、ＣＮＶ内の大部分のＲＰＥ細胞はレーザ処理によって死滅した。死んだ細胞ではＣａｓ９ ＲＮＰによる遺伝子矯正が起こらず、生きているＲＰＥ細胞でのみ遺伝子矯正が起こり（図３Ｈ）、その結果、ＣＮＶがない領域の細胞と比較して、生きているＲＰＥ細胞でのｉｎｄｅｌ頻度がより低い。また、レーザ治療後３日目に、内皮細胞がＣＮＶ領域に集まって新たな血管が形成されることを確認した（図３Ｉ）。この細胞は遺伝子矯正されず、ＣＮＶ領域でのｉｎｄｅｌ頻度はさらに減少する。このような結果は、Ｃａｓ９ ＲＮＰｓを用いた眼でのＶｅｇｆａの不活性化がＡＭＤまたは糖尿病性網膜症のような眼球疾患の効果的な治療のための治療的遺伝体矯正（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｓｕｒｇｅｒｙ）を可能にすることを示唆する。

【0141】

治療的遺伝体矯正における重要な問題は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的特異性である。本実験に使用されたＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰがマウスの眼またはヒトの細胞でｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ突然変異を起こしたか否かを調べた。まず、Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒを用いて、マウス遺伝体でＣａｓ９ ＲＮＰのＶｅｇｆａ−１ ｓｇＲＮＡの標的配列と相同性が最も高い２０個の潜在的なｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ部位を確認して、下記の表７にまとめた：

【0142】

【表7】

【0143】

Ｃａｓ９ ＲＮＰで処理されたマウスの眼のＣＮＶ−ｆｒｅｅ ＲＰＥ複合体から遺伝体ＤＮＡを分離してｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行って、前記２０個の潜在的ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ部位でのｉｎｄｅｌ頻度（％）を求めて図６に示した（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３ ｆｏｒ Ｃａｓ９ Ｍｏｃｋ、ｎ＝５ ｆｏｒ Ｃａｓ９ ＲＮＰ、ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）。図６で、Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅは赤色、ＰＡＭ配列は青色でそれぞれ表した。図６から明らかなように、Ｃａｓ９ ＲＮＰが処理された場合、２０個の潜在的ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ部位ともにおいてｉｎｄｅｌ頻度が０．１％を超えていないので、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ突然変異比率がシーケンシングエラー比率（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ；平均０．１％）を超えないことが立証された。つまり、本試験で使用されたＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰは、ＲＰＥでｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔを示さないことが確認された。

【0144】

［実施例４：ヒト遺伝体におけるＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰの全長遺伝体標的特異性（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）試験］
ヒト遺伝体におけるＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰの全長遺伝体標的特異性（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）をＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑで確認した（参考例６および９参照）。

【0145】

図４Ａは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断部位を示すＧｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ Ｃｉｒｃｏｓ ｐｌｏｔで、ヒト遺伝体ＤＮＡは赤色、ＲＧＥＮ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ遺伝体ＤＮＡは青色で表されている。
４１個のＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅ ｓｉｔｅ（表５参照）およびＯｎ−ｔａｒｇｅｔ配列を含む４２個の配列のＳｅｑｕｅｎｃｅ ｌｏｇｏを図４Ｂに示した。
ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってヒトＡＲＰＥ−１９細胞から確認されたｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ部位およびｉｎｄｅｌ頻度を図４Ｃに示した。図４Ｃで、ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄヌクレオチドは赤色、ＰＡＭ配列は青色でそれぞれ表した。

【0146】

図４Ａおよび４Ｂに示されたＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰの特定標的配列は、ヒトＶＥＧＦＡ遺伝子でよく保存されている。

【0147】

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ１２，２３７−２４３（２０１５））を用いて全長遺伝体特異性を確認し、この時、試験管内で（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）無細胞ヒト遺伝体ＤＮＡ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）にＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰを処理した後、全体遺伝体シーケンシングを行った。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ切断部位でのｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅａｄｓは、ランダムに整列するよりは均一に整列するもので計算的に確認され、これにより潜在的ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ部位のリストを得た。このように、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑを用いて得られたｏｎ ｔａｒｇｅｔ部位を含むＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰの４２個のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断部位を、下記の表８にまとめた：

【0148】

【表8】

【0149】

前記表８に挙げられた部位を、有効性確認のために、Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰが形質感染したＡＲＰＥ−１９細胞から分離された遺伝体ＤＮＡを用いてｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇを行った（図４Ｃ参照）。その結果、これらの部位はｉｎ ｖｉｔｒｏで効率的に切断されるが、４１個のｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ部位の切断部位ですべてｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｉｎｄｅｌ頻度がｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｅｒｒｏｒ ｒａｔｅ（平均０．１％）を超えないことが確認された。

【0150】

必要であれば、改善された特異性を有する変形したｇＲＮＡ（Ｆｕ，Ｙ．，Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．，Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．，Ｃａｓｃｉｏ，Ｖ．Ｍ．＆Ｊｏｕｎｇ，Ｊ．Ｋ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３２，２７９−２８４（２０１４）；Ｃｈｏ，Ｓ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４，１３２−１４１（２０１４））またはＣａｓ９変異体（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｎｏ ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎａｔｕｒｅ ５２９，４９０−４９５（２０１６）；Ｓｌａｙｍａｋｅｒ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｗｉｔｈ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１，８４−８８（２０１６））を使用することによって、わずかながら存在するｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔをさらに減少させたり防止することができる。

【0151】

前記結果をまとめると、本明細書で提供されるＶｅｇｆａ標的化配列を有するｓｇＲＮＡを含むＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰは、マウスとヒトともにおいて非常に高い特異性（ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ）を示すことを確認できる。

【0152】

［実施例５：Ｖｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰの副作用試験］
老人性黄斑変性（ＡＭＤ）または糖尿病性網膜症のような眼科疾患の治療のためにＶｅｇｆａ遺伝子を突然変異させる時の他の主な関心事は、眼における栄養的側面からのＶｅｇｆａの役割である。Ｖｅｇｆａ突然変異時の最も深刻な変化は円錐細胞障害（Ｃｏｎｅ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ）であるが、マウスＲＰＥでのＶｅｇｆａ遺伝子の条件付き欠失３日後に観察される。

【0153】

本明細書で提供されるＶｅｇｆａ−特異的Ｃａｓ９ ＲＮＰがこのような円錐細胞障害を起こすか否かを試験するために、参考例１２を参照してｏｐｓｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ領域を蛍光顕微鏡で観察し、その面積を計算して、図７Ａ（蛍光イメージ）および図７Ｂ（ｏｐｓｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ領域（％））に示した。

【0154】

図７Ａは、Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ注入７日後のＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ注入された正常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（レーザ処理なしにＲＮＰ注射のみ施した正常マウス）およびＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰが注入されない正常対照群のマウスの網膜から得られた蛍光断面イメージで、ｏｐｓｉｎは緑色、ＤＡＰＩは青色で表される。図７Ｂは、ｏｐｓｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ領域（％）を示すグラフで、正常対照群（３．０±０．５％）とＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰ注入群（３．１±０．５％）との間の有意な差がない（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）；＃、Ｐ＞０．０５（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ））。

【0155】

図７Ａおよび７Ｂから確認されるように、本明細書で提供されるＶｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰは、処理後７日目にも未処理正常対照群と比較して円錐細胞のｏｐｓｉｎ ｐｏｓｉｔｉｖｅ領域に差がなく、これは、円錐細胞に機能異常が発生していなかったことを意味する。このような結果は、前記Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰがＶｅｇｆａ遺伝子の標的配列のみ特異的に突然変異させ、このような突然変異が深刻な副作用を誘発しないことを表す。また、既存のＶｅｇｆａ−標的治療において、処理３日後に副作用が発生したのと比較して、Ｖｅｇｆａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｓ９ ＲＮＰを使用する場合には、処理７日後にも副作用が発生しなかった。

【0156】

以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的な思想や必須的特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。これに関連して、以上に述べた実施例はあらゆる面で例示的なものであり、限定的ではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、上記の詳細な説明よりは後述する特許請求の範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出されるあらゆる変更または変形した形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図1E】

【図1F】

【図1G】

【図1H】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図2G】

【図2H】

【図2I】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図3H】

【図3I】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図8】

【図9】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]