6875678 粘液線維肉腫の浸潤性判定補助方法および当該方法に利用される粘液線維肉腫の浸潤性判定用キット

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6875678

(24)【登録日】2021年4月27日

(45)【発行日】2021年5月26日

(54)【発明の名称】粘液線維肉腫の浸潤性判定補助方法および当該方法に利用される粘液線維肉腫の浸潤性判定用キット

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/574 20060101AFI20210517BHJP

【ＦＩ】

   G01N33/574 A

【請求項の数】4

【全頁数】13

(21)【出願番号】特願2017-35001(P2017-35001)

(22)【出願日】2017年2月27日

(65)【公開番号】特開2018-141671(P2018-141671A)

(43)【公開日】2018年9月13日

【審査請求日】2020年2月20日

(73)【特許権者】

【識別番号】510097747

【氏名又は名称】国立研究開発法人国立がん研究センター

(73)【特許権者】

【識別番号】899000079

【氏名又は名称】学校法人慶應義塾

(73)【特許権者】

【識別番号】390014960

【氏名又は名称】シスメックス株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】110000590

【氏名又は名称】特許業務法人 小野国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】菊田 一貴

(72)【発明者】

【氏名】中村 雅也

(72)【発明者】

【氏名】川井 章

(72)【発明者】

【氏名】近藤 格

【審査官】 小澤 理

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１０／００８０５１（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特開２００３−１８９８７２（ＪＰ，Ａ）

【文献】 KIM, M. et al.，Epigenetic down-regulation and suppressive role of DCBLD2 in gastric cancer cell proliferation and invasion，Mol Cancer Res，２００８年，Vol.6, No.2，p.222-230

【文献】 菊田一貴, 外，粘液線維肉腫浸潤性関連候補タンパク質同定のための蛍光２次元電気泳動法を用いたプロテオーム解析，電気泳動，２０１６年，Vol.60, No.Suppl.，p.s43

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｇ０１Ｎ ３３／５７４

Ｃ０７Ｋ １６／００

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

Ｓｃｏｐｕｓ

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

粘液線維肉腫の浸潤性の判定を補助する方法であって、
粘液線維肉腫患者の患部組織におけるDCBLD2の発現量を測定する工程を含み、前記発現量が所定の閾値以上の場合に、前記患者の粘液線維肉腫が浸潤性であると判定する、
前記方法。

【請求項2】

前記DCBLD2の発現量が前記所定の閾値未満の場合に、前記患者の粘液線維肉腫が非浸潤性であると判定する、請求項１記載の方法。

【請求項3】

請求項１または２に記載の方法に用いられる粘液線維肉腫の浸潤性判定用キットであって、前記DCBLD2の発現量を測定することができる試薬を含んでなる、キット。

【請求項4】

前記試薬が、抗DCBLD2抗体を含む、請求項３に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、粘液線維肉腫の浸潤性判定補助方法に関する。また本発明は、当該方法に利用される粘液線維肉腫の浸潤性判定用キットに関する。

【背景技術】

【0002】

DCBLD2は、CLCP1とも呼ばれ、いくつかの悪性腫瘍において高発現であることが知られている。たとえば、非特許文献1には、DCBLD2が骨肉腫のマーカーとなり得ることが記載されている。また非特許文献２には、転移性の肺癌にはCLCP1が高発現であることが記載されている。また特許文献１には、肺癌などにおける、がん細胞の遊走、細胞外マトリックス・基底膜への浸潤、増殖、転移、細胞障害活性を有する、CLCP1抗体が記載されており、転移性の肺癌において、CLCP1分子が多く発現していることが記載されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0003】

【特許文献1】米国特許出願公開第２０１１／０２９３６１８号明細書

【非特許文献】

【0004】

【非特許文献1】E. Topkas, et. al., European Journal of Cancer , Volume 50, Supplement 5, Page S60

【非特許文献2】Koshikawa K, et al., Oncogene. 2002 Apr 25;21(18):2822-8.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

しかしながら、DCBLD2と粘液線維肉腫の浸潤性との関連性については何れの文献にも記載がない。

【0006】

粘液線維肉腫に対し、放射線療法や抗がん剤療法の効果は限定的である。そのため、腫瘍の切除が確立された治療法となっているが、局所再発率は高く５０〜６０％にも達する。切除による根治性を高めるために、腫瘍組織周辺の正常組織を被包した広範囲切除が必要となる。腫瘍の浸潤性は、局所再発率に影響し、切除範囲の設定にも関わるため、浸潤性か非浸潤性かを正確に判定することが重要である。

【0007】

また粘液線維肉腫の切除において、画像に基づく術前予測よりも実際には腫瘍の範囲が広範囲に及んでいることがある。術後の組織学的な切除縁評価において不適切な切除縁と判断されると、追加広範切除や術後放射線治療が必要になる場合がある。一方、術後機能を確保するためには、必要以上に切除範囲を拡大することは望ましくない。したがって、術前においても、画像では描出されない範囲にまで浸潤が及んでいないか予測できることが望ましい。

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、粘液線維肉腫において浸潤性が認められる組織では、特にDCBLD2の発現が促進されており、その特異性及び感受性が高いため、DCBLD2の発現量に基づき粘液線維肉腫の浸潤性を判定できることを見出し、本発明を完成した。

【0009】

すなわち本発明によれば、粘液線維肉腫患者の患部組織におけるDCBLD2の発現量が所定の閾値以上の場合に、当該患者の粘液線維肉腫が浸潤性であると判定する浸潤性判定補助方法が提供される。

【0010】

また本発明によれば、上記判定補助方法に用いられる、DCBLD2の発現量を測定することができる試薬を含んでなる粘液線維肉腫の浸潤性判定用キットが提供される。

【発明の効果】

【0011】

本発明は、粘液線維肉腫の浸潤性の判定を補助する方法を提供できる。また本発明は、当該方法に利用される粘液線維肉腫の浸潤性判定用キットを提供できる。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】粘液線維肉腫の腫瘍組織のＭＲＩ画像である。Ａは浸潤例であり、中央の腫瘍塊から複数のヒゲ様突起（tail like pattern）が伸びている（矢印部分）。Ｂは非浸潤例であり、中央の腫瘍塊には明瞭な境界が認められる。

【図2】浸潤群と非浸潤群との比較において、平均値の差が２倍以上、かつ、Wilcoxon検定によるp値<0.01の基準を満たすタンパク質群のヒートマップである。

【図3】免疫組織染色の結果、染色強度の基準に基づきＧ０〜Ｇ３のいずれかと判定された各試料の顕微鏡写真である（Ａ：Ｇ３、Ｂ：Ｇ２、Ｃ：Ｇ１、Ｄ：Ｇ０）。

【図4】被験者の粘液線維肉腫の浸潤性を判定するための判定装置の一例を示した概略図である。

【図5】図４の判定装置の機能構成を示すブロック図である。

【図6】図４に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。

【図7】図４に示された判定装置を用いた、粘液線維肉腫の浸潤性を判定するためのフローチャートである。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本実施形態の粘液線維肉腫の浸潤性の判定補助方法では、粘液線維肉腫患者の患部組織におけるDCBLD2の発現量を測定する。患部組織は、腫瘍組織、その周辺の反応層及び腫瘍が疑われる組織を含む。反応層は、出血巣、変色した筋肉、浮腫状の組織などの肉眼的な変色部を含む。患部組織に該当するかは、例えば、単純Ｘ線、超音波検査、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴなどの画像に基づき判断できる。DCBLD2は、DCBLD2遺伝子によってコードされるタンパク質であり、そのアミノ酸配列は公知である。アミノ酸配列は、例えば、Swiss-Plot database Accession No.Q96PD2のものを例示できる。粘液線維肉腫は、局所再発率が高いことが知られている。局所再発とは、転移を伴う再発とは異なり、腫瘍切除後、同一組織型の腫瘍が元の腫瘍近くに出現することをいう。本明細書において、「浸潤性」とは、局所再発に関わる局所的浸潤性をいう。

【0014】

患部組織におけるDCBLD2の発現量を測定する方法は、生体試料中のDCBLD2発現量を定量的に評価できる方法であれば特に限定されない。例えば、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属標識抗体法、放射性同位元素標識抗体法等の免疫組織染色法、ウエスタンブロット法、蛍光二次元電気泳動法、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ドット・ブロッティング法等により測定できる。またDCBLD2の発現量は、DCBLD2のmRNA発現量であってもよい。mRNA発現量の測定方法としては、例えば、RT-PCR、ノーザン・ブロッティング法、Branched DNAアッセイ、in situ ハイブリダイゼーション法等を例示できる。
ここで、本実施形態で用いられる「DCBLD2の発現量」は、DCBLD2タンパク質のモル数やmRNAのコピー数など発現量を直接的に表す値であってもよいし、これらの値を表す標識量であってもよい。具体的には、標識量は、DCBLD2タンパク質の発現量は蛍光強度、波高強度などで表すことができ、DCBLD2mRNAの発現量は、蛍光強度、蛍光強度が一定の値に達するまでのPCRサイクル数や増幅反応時間などで表すことができる。

【0015】

DCBLD2の発現量の測定において、粘液線維肉腫患者から生検または手術により採取した患部組織から試料を調製できる。患部組織は腫瘍細胞を含むことが好ましい。例えば、患部組織から調製したホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)切片を試料とすることができる。またmRNA発現量を測定する場合、患部組織から調製したタンパク質抽出液又はmRNA抽出液を試料とすることができる。

【0016】

免疫組織染色法は公知の方法を採用することができ、例えば以下の方法を例示できる。まず患者から採取した患部組織をホルマリン固定する。これをパラフィン包埋してミクロトームにて厚さ3〜4μｍ程度に薄切し、スライドグラス上に貼付して切片試料とする。切片試料はキシレン処理後、アルコール溶液にくぐらせてから水に戻して脱パラフィンする。その後、抗体の浸透性を高めるためにｐＨ6.0のクエン酸緩衝液中に切片試料を漬け、オートクレーブにて121℃で10分間熱処理し抗原を賦活化する。内因性ペルオキシダーゼを失活させた後、切片試料に抗DCBLD2抗体を滴下し、常温で1時間反応させる。洗浄後、標識抗体、増幅試薬等を用いてそれぞれ反応させる。洗浄後、ＤＡＢ溶液 (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)を用いて発色を行う。流水にて洗浄後、ヘマトキシリン液にて試料の細胞核を染色する。流水にて水洗後、アルコール溶液、次いでキシレン溶液をくぐらせて脱水し、試料上に封入剤を滴下しカバーグラスを被せて、顕微鏡にてDCBLDの発色を観察する。

【0017】

本実施形態では、測定されたDCBLD2の発現量が所定の閾値以上の場合に、患者の粘液線維肉腫が浸潤性であると判定できる。一方、測定されたDCBLD2の発現量が所定の閾値未満の場合に、患者の粘液線維肉腫が非浸潤性であると判定できる。
所定の閾値は特に限定されず、種々の生体試料についてのデータの蓄積により経験的に設定できる。例えば、まずＭＲＩ画像に基づき、浸潤性と評価される患部組織と、非浸潤性と評価される患部組織に分類する。次いでそれぞれの患部組織におけるDBCLD2発現量を測定し、その結果に基づき、両者を高精度に区別し得る値を閾値として設定できる。なお、閾値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮して設定できる。またＭＲＩ画像に基づく浸潤性の評価は、例えば、ＭＲＩ画像上、腫瘍組織周縁にヒゲ様突起の存在が認められる場合は浸潤性、そのような突起が認められない場合を非浸潤性と判定できる（図１参照）。

【0018】

閾値は段階的に設けてもよい。例えば、免疫組織染色法による染色強度を、以下の基準に従ってＧ０〜Ｇ３の４段階で評価し、このうちＧ２以上（Ｇ２〜３）の場合を浸潤性、Ｇ２未満（Ｇ０〜Ｇ１）の場合を非浸潤性と判定できる。
（基準）
Ｇ３：腫瘍細胞の細胞膜全体が強く染色される。
Ｇ２：腫瘍細胞の細胞膜全体が弱く〜中程度に染色される。
Ｇ１：腫瘍細胞の細胞膜においてかすかに／かろうじて染色が認められる。
Ｇ０：腫瘍細胞は染色されない。

【0019】

別の実施形態では、DCBLD2の発現量に基づき粘液線維肉腫の浸潤性の程度を判定できる。例えば、測定されたDCBLD2の発現量が所定の閾値以上の場合に、患者の粘液線維肉腫の浸潤性の程度が高いと判定できる。これに対し、測定されたDCBLD2の発現量が所定の閾値未満の場合に、患者の粘液線維肉腫の浸潤性が低いと判定できる。
所定の閾値は特に限定されず、種々の生体試料についてのデータの蓄積により経験的に設定できる。例えば、まずＭＲＩ画像に基づき特定された腫瘍境界から所定の距離を離して切除範囲を設定し、切除後、組織学的に断端陰性と評価される患部組織と、断端陽性と評価される患部組織に分類する。次いでそれぞれの患部組織におけるDBCLD2発現量を測定し、その結果に基づき、両者を高精度に区別し得る値を閾値として設定できる。なお、閾値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮して設定できる。組織学的断端の陽性／陰性の判定は、例えば、ＭＲＩ画像に基づく腫瘍境界から所定の距離を離してMRI画像上の正常組織を含めて切除した腫瘍切除検体の表面が、組織学的に全て正常組織であると評価される場合に陰性、少なくとも一部が正常組織ではないと評価される場合に陽性と判定できる。組織学的な評価は、例えば、細胞及び組織の形態や腫瘍からの連続性などに基づき行うことができる。組織学的評価を行う割面は、腫瘍の長軸を含む割面（最大割面）及びこれに垂直な割面の２割面を含み得る。

【0020】

本発明の範囲には、粘液線維肉腫の浸潤性判定用キット（以下、単に「キット」ともいう）も含まれる。本実施形態のキットには、抗DCBLD2抗体が試薬に含まれ得る。本実施形態のキットは、例えば免疫組織染色やウエスタンブロット法などの免疫学的手法によりDCBLD2の発現量を測定できる。抗DCBLD2抗体は、DCBLD2の発現を検出し得る抗体であれば特に限定されない。例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、標識化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体及びこれらの結合活性断片などが挙げられる。また本実施形態のキットには、上記抗体のほか二次抗体、ブロッキング剤等の試薬などを含むことができる。

【0021】

粘液線維肉腫の浸潤性の判定は、例えば、図４に示される判定装置１１によって行なうことができる。以下、粘液線維肉腫の浸潤性の判定に用いることができる判定装置を、添付の図面を参照しながら、より詳細に説明するが、本発明は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。図４は、本発明の一実施形態に係る粘液線維肉腫の浸潤性判定装置の概略説明図である。図４に示された判定装置１１は、測定装置２２と、当該測定装置２２と接続されたコンピュータシステム３３とを含んでいる。

【0022】

本実施形態において、測定装置２２は、免疫組織染色法によりDCBLD2に結合した抗体からのシグナルを検出するスキャナーを含み得る。本実施形態において、前記シグナルは例えば蛍光シグナルなどのDCBLD2の発現量に関する光学的情報であり得る。得られた光学的情報はコンピュータシステム３３に送信される。

【0023】

スキャナーは、DCBLD2に基づくシグナルの検出が可能なものであればよい。DCBLD2に基づくシグナルは、標識物質によって異なることから、スキャナーは標識物質の種類に応じて、当該標識物質から生じるシグナルを検出するのに適したものを適宜選択することができる。例えば、標識物質が蛍光である場合、測定装置２２として、当該蛍光を検出可能なスキャナーを用いることができる。スキャナーで検出された光学的情報は、コンピュータシステム３３に送信される。

【0024】

コンピュータシステム３３は、コンピュータ本体３３ａと、入力デバイス３３ｂと、検体情報、判定結果などを表示する表示部３３ｃとを含む。コンピュータシステム３３は、測定装置２２から光学的情報を受信する。そして、コンピュータシステム３３のプロセッサは、前記光学的情報に基づいて、粘液線維肉腫の浸潤性を判定するプログラムを実行する。

【0025】

図５は、図４に示された判定補助装置の機能構成を示すブロック図である。
コンピュータシステム３３は、図５に示されるように、取得部３０１と、記憶部３０２と、算出部３０３と、判定部３０４と、出力部３０５とを備える。取得部３０１は、測定装置２２と、ネットワークを介して通信可能に接続されている。なお、算出部３０３と判定部３０４とは、制御部３０６を構成している。
取得部３０１は、測定装置２２から送信された情報を取得する。記憶部３０２は、判定に必要な閾値、DCBLD2発現量を算出するための式、浸潤性判定のための処理プログラムなどを記憶する。算出部３０３は、取得部３０１で取得された情報を用い、記憶部３０２に記憶された式や処理プログラム等を用いて、DCBLD2発現量を算出する。判定部３０４は、算出部３０３によって算出された値に基づき、浸潤性判定を行う。出力部３０５は、判定部３０４による判定結果を、粘液線維肉腫の浸潤性の該当性として表示部３３ｃに出力する。

【0026】

図６は、図４に示された判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
図６に示されるように、コンピュータ本体３３ａは、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）３３０と、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）３３１と、ＲＡＭ３３２と、ハードディスク３３３と、入出力インターフェイス３３４と、読出装置３３５と、通信インターフェイス３３６と、画像出力インターフェイス３３７とを備えている。ＣＰＵ３３０、ＲＯＭ３３１、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）３３２、ハードディスク３３３、入出力インターフェイス３３４、読出装置３３５、通信インターフェイス３３６および画像出力インターフェイス３３７は、バス３３８によってデータ通信可能に接続されている。
ＣＰＵ３３０は、ＲＯＭ３３１に記憶されているコンピュータプログラムおよびＲＡＭ３３２にロードされたコンピュータプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３３０がアプリケーションプログラムを実行することにより、前述した各機能ブロックが実現される。
これにより、コンピュータシステムが、粘液線維肉腫の浸潤性の判定補助装置の端末として機能する。
ＲＯＭ３３１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３３１には、ＣＰＵ３３０によって実行されるコンピュータプログラムおよびこれに用いるデータが記録されている。
ＲＡＭ３３２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３３２は、ＲＯＭ３３１およびハードディスク３３３に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＯＭ３３２はまた、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３３０の作業領域として利用される。
ハードディスク３３３は、ＣＰＵ３３０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム（粘液線維肉腫の浸潤性判定のためのコンピュータプログラム）などのコンピュータプログラムおよび当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
読出装置３３５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読出装置３３５は、可搬型記録媒体３４０に記録されたコンピュータプログラムまたはデータを読み出すことができる。
入出力インターフェイス３３４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３３４には、キーボード、マウスなどの入力デバイス３３ｂが接続されている。操作者は、当該入力デバイス３３ｂを使用することにより、コンピュータ本体３３ａにデータを入力することが可能である。
通信インターフェイス３３６は、例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）インターフェイスなどである。コンピュータシステム３３は、通信インターフェイス３３６により、プリンタへの印刷データの送信が可能である。
画像出力インターフェイス３３７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３３ｃに接続されている。これにより、表示部３３ｃは、ＣＰＵ３３０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力することができる。表示部３３ｃは、入力された映像信号にしたがって画像（画面）を表示する。

【0027】

つぎに、判定装置１１による粘液線維肉腫の浸潤性判定の処理手順を説明する。図７は、図４に示された判定装置を用いた粘液線維肉腫の浸潤性判定のフローチャートである。ここでは、被験者の患部組織から調製した切片試料のDCBLD2に結合した抗体に基づく蛍光情報を用いて判定を行なう場合を例として挙げて説明するが、本発明は、かかる実施形態のみに限定されるものではない。

【0028】

まず、ステップＳ−１において、取得部３０１は、測定装置２２から蛍光情報を取得する。そして、ステップＳ−２において、算出部３０３は、取得部３０１が取得した蛍光情報からDCBLD2発現量を算出し、記憶部３０２に送信する。
つぎに、ステップＳ−３において、算出部３０３は、記憶部３０２に取得したDCBLD2発現量が、記憶部３０２に記憶された閾値以上であるか否かの判定を行う。ここで、DCBLD2発現量が閾値以上であるとき、ステップＳ−４に進行する。そして、判定部３０４は粘液線維肉腫が浸潤性であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。一方、DCBLD2発現量が閾値よりも小さいとき、ステップＳ−５に進行する。そして、判定部３０４は、粘液線維肉腫が非浸潤性であることを示す判定結果を出力部３０５に送信する。

【0029】

その後、ステップＳ−６において、出力部３０５は、判定結果を出力し、表示部３３ｃに表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、医師などが、粘液線維肉腫が浸潤性か、非浸潤性かについて判断することを補助する情報を提供することができる。

【実施例】

【0030】

以下本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に何ら限定されるものではない。

【0031】

実施例１：蛍光二次元電気泳動（2D-DIGE）によるタンパク質の解析
（１）粘液線維肉腫患者11例の切除検体を使用した（表１）。各検体の腫瘍組織のＭＲＩ画像から浸潤性を評価し、浸潤性群及び非浸潤性群に群分けした。浸潤性の評価は、ＭＲＩ画像において、腫瘍組織周縁にヒゲ様突起（tail like pattern）が認められるか否かによって評価し（図１参照）、認められる場合を浸潤性、認められない場合を非浸潤性と判定した。

【0032】

【表1】

【0033】

（２）サンプル調製
凍結された切除検体をマルチビーズショッカー（安井器械）を用いて液体窒素で粉末状に破砕した。粉末は、尿素溶解バッファー（6 mol/L urea , 2 mol/L thiourea , 3% CHAPS, 1% Triton X-100）で処理した。15,000rpm、30分遠心分離後、上清を回収してタンパク質サンプルとした。
（３）全てのタンパク質サンプルを少量ずつ等量で混合し、内部標準サンプルを調製した。内部標準サンプルはCy3により、それぞれのサンプルはCy5（ともにCyDye DIGE Fluor saturation dye , GE Healthcare Biosciences , Uppsala , Sweden）により標識した。これらの異なる蛍光色素で標識化したサンプルを混合し、２次元電気泳動を行った。
第一次の分離は、24cm長のイモビラインゲル（IPG、pI 4-7、GE Healthcare Biosciences）と、Multiphor IITM（GE Healthcare Biosciences社）を使用し、第二次の分離は、GiantGelRunner(Biocraft , Tokyo , Japan)により作成したグラジェントゲルを用いた。電気泳動後、ゲルはレーザースキャナー（Typhoon Trio , GE Healthcare Biosciences）を用いてスキャンした。ゲル間の差異を取除くため、ソフトウェアProgenesis SameSpots(Nonlinear Dynamics , Newcastle , UK)により、Cy5強度を同じスポットのCy3強度で補正した。全てのサンプルについて3回実験を行い、補正した強度の平均値を用いて統計解析処理した。

【0034】

補正後のタンパク質スポットの蛍光強度データは、ソフトウェアExpressionist（GeneData , Basel , Switzerland）を用いてWilcoxon検定を行った。浸潤群と非浸潤群のタンパク質発現プロファイルを比較して、3453個のタンパク質スポットの中から、2群間の比較において、平均値の差が2倍以上、かつ、Wilcoxon検定によるp<0.05という基準を満たす59個のタンパク質スポットを選別した。この59個のタンパク質スポットを質量分析により解析した。
各タンパク質スポットを回収しトリプシンで分解した。得られたトリプシン分解物を、ナノイオンスプレイイオン供給源（Finnigan LTQ linear ion trap mass spectrometer,Thermo Electron Co., San Jose , CA）を備えた高速液体クロマトグラフタンデム質量分析計を用いて解析し、対応する47個のタンパク質を同定した。そのヒートマップを図２に示す。免疫染色による検証実験の結果、特に浸潤性との関連性が高いタンパク質としてDCBLD2を特定した。それ以外のタンパク質は染色が適切に行われなかった。

【0035】

実施例２：免疫組織染色による発現検証
DCBLD2発現レベルと粘液線維肉腫の浸潤性との相関を検証するために、新たな21人の粘液線維肉腫患者について検証実験を行った。全ての患者に対し、ガドリニウム増強ＭＲＩ画像診断を行って、ガドリニウム増強脂肪抑制T1強調画像から腫瘍領域の範囲を画定した。画像に基づき特定される腫瘍辺縁から遠位部2cmを切除縁とした。切除された検体からホルマリン固定パラフィン包埋組織切片試料を調製し、免疫組織染色を行った。各切片試料について、腫瘍組織の中央部と周辺部の両方を検査した。免疫組織染色は、ポリマー法（Envision Dual Ling System-HRP, Dako, DK-2600, Glostrup, Denmark)を採用した。切片試料を脱パラフィン処理及び脱水処理した後、10ml/l過酸化水素添加メタノールで30分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を除去した。10mMクエン酸塩緩衝液(pH 6.0)中で10分間121℃オートクレーブ処理して抗原賦活化を行った。DCBLD2抗体（Atlas Antibodies , Stockholm , Sweden）は100倍希釈して用い、常温で1時間反応させた。反応後3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochlorideを用いて発色させた。その後ヘマトキシリン液にて対比染色した。染色強度は2名がブラインド下で独立して以下の基準によりＧ０〜Ｇ３の４段階で評価した。Ｇ２−３をDCBLD2陽性、Ｇ０−１をDCBLD2陰性に分類した。結果を表２に併せて示す。またＧ０〜Ｇ３と評価された組織の顕微鏡写真を図３に示す。

【0036】

（基準）
Ｇ３：腫瘍細胞の細胞膜全体が強く染色される。
Ｇ２：腫瘍細胞の細胞膜全体が弱く〜中程度に染色される。
Ｇ１：腫瘍細胞の細胞膜においてかすかに／かろうじて染色が認められる。
Ｇ０：腫瘍細胞は染色されない。

【0037】

さらに術後、全ての患者について組織学的断端の陽性／陰性を判定した。組織学的断端の陽性／陰性の判定は、ＭＲＩ画像に基づく腫瘍境界から2cmの距離を離してMRI画像上の正常組織を含めて切除した腫瘍切除検体の表面が、組織学的に全て正常組織であると評価される場合に陰性、少なくとも一部が正常組織ではないと評価される場合に陽性と判定した。組織学的な評価は、腫瘍の長軸を含む割面（最大割面）及びこれに垂直な割面について、細胞及び組織の形態や腫瘍からの連続性などに基づき行った。その結果を表２に併せて示す。

【0038】

【表2】

【0039】

粘液線維肉腫の浸潤性のバイオマーカーとして、腫瘍中心部におけるDCBLD2の感度及び特異度はそれぞれ69.2％と87.5％であった。また陽性的中率及び陰性的中率は、それぞれ90％と63.6％であった。DCBLD2発現量とMRI画像に基づく浸潤性及びDCBLD2発現量と組織学的断端（陽性／陰性）との相関は、単変量解析によりいずれも統計学的に有意であった（P<0.05）。また腫瘍周辺部においてDCBLD2陽性であった10症例はいずれも、中心部でもDCBLD2高発現であった。

【0040】

粘液線維肉腫の治療では、切除による根治性を高めるために、腫瘍組織周辺の正常組織を被包した広範囲切除が必要となる。腫瘍が浸潤性を示すか否かは、局所再発率に影響し、術前計画における切除範囲の設定にも関わるため、浸潤性を高精度に判定することが重要である。
粘液線維肉腫の画像診断では、ＭＲＩ，ＣＴ，ＰＥＴなどが用いられているが、特にＭＲＩはコントラスト分解能に優れ腫瘍領域を明瞭に描出可能であるため、一般にＭＲＩ画像に基づき粘液線維肉腫の浸潤性が判定される。ＭＲＩ画像に基づく浸潤性判定とDCBLD2の発現量には有意な相関が認められ、その感度及び特異度はそれぞれ69.2％と87.5％であり、また陽性的中率及び陰性的中率はそれぞれ90％，63.6％と高い値を示した。したがって、DCBLD2をバイオマーカーとして用いる粘液線維肉腫の浸潤性判定方法は、ＭＲＩ画像に基づく判定を補完または代替する方法となり得る。

【0041】

また術後に切除検体を組織学的に評価すると、ＭＲＩ画像により特定した腫瘍境界を越えて浸潤が進展していることがある。例えば、組織学的に評価した結果、断端まで浸潤が及んでいたり、浸潤の先端部と断端までの距離が十分に確保されていないと、再発を防止するために、追加広範切除や術後放射線治療が必要とされる場合がある。その原因としてＭＲＩ画像で描出可能な組織量に満たない微小な腫瘍の存在が考えられる。
これに対し、DCBLD2発現量と組織学的断端に有意な相関が認められたことから、術前の免疫組織染色などによって測定したDCBLD2発現量に基づき、ＭＲＩ画像で描出される腫瘍境界を越えて浸潤が進展しているか、その浸潤性の程度を判定し得る。
さらに、従来の粘液線維肉腫の広範切除では、ＭＲＩ画像に基づく腫瘍境界から切除縁までの距離を、浸潤性か非浸潤性かによって２段階で設定していたが、DCBLD2発現量に応じて、切除縁までの距離をより細分化し、再発防止と術後機能の確保を考慮した適切な切除範囲を設定できる可能性がある。

【0042】

また浸潤性／非浸潤性の判定においても、従来のＭＲＩ画像に基づく判定では、描出可能な組織量に満たない微小な浸潤部分が存在していた場合に非浸潤性と判定するおそれもあるが、このような微小な腫瘍も反映し得るDCBLD2をバイオマーカーとすることでより判定の精度を高めうる。

【符号の説明】

【0043】

１１ 判定装置
２２ 測定装置
３３ コンピュータシステム
３３ａ コンピュータ本体
３３ｂ 入力デバイス
３３ｃ 表示部
３３０ ＣＰＵ
３３１ ＲＯＭ
３３２ ＲＡＭ
３３３ ハードディスク
３３４ 入出力インターフェイス
３３５ 読出装置
３３６ 通信インターフェイス
３３７ 画像出力インターフェイス
３３８ バス
３４０ 記録媒体
３０１ 取得部
３０２ 記憶部
３０３ 算出部
３０４ 判定部
３０５ 出力部

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】