特許 6876123 ワクチン産生に関する病原体不活性化中の抗原損傷から保護するための無機多原子オキシアニオン

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6876123

(24)【登録日】2021年4月27日

(45)【発行日】2021年5月26日

(54)【発明の名称】ワクチン産生に関する病原体不活性化中の抗原損傷から保護するための無機多原子オキシアニオン

(51)【国際特許分類】

   A61K 39/12 20060101AFI20210517BHJP

   A61K 39/02 20060101ALI20210517BHJP

   A61K 39/275 20060101ALI20210517BHJP

   A61K 39/145 20060101ALI20210517BHJP

   A61K 39/106 20060101ALI20210517BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20210517BHJP

   C12N 1/00 20060101ALN20210517BHJP

【ＦＩ】

   A61K39/12

   A61K39/02

   A61K39/275

   A61K39/145

   A61K39/106

   A61P37/04

   !C12N1/00 N

【請求項の数】27

【全頁数】103

(21)【出願番号】特願2019-511827(P2019-511827)

(86)(22)【出願日】2017年5月10日

(65)【公表番号】特表2019-515046(P2019-515046A)

(43)【公表日】2019年6月6日

(86)【国際出願番号】US2017032029

(87)【国際公開番号】WO2017197034

(87)【国際公開日】20171116

【審査請求日】2020年5月11日

(31)【優先権主張番号】62/334,357

(32)【優先日】2016年5月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/334,406

(32)【優先日】2016年5月10日

(33)【優先権主張国】US

(31)【優先権主張番号】62/334,588

(32)【優先日】2016年5月11日

(33)【優先権主張国】US

【早期審査対象出願】

(73)【特許権者】

【識別番号】518399575

【氏名又は名称】ナジット テクノロジーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】アマンナ， イアン ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】プア， エリザベス エー．

【審査官】 大島 彰公

(56)【参考文献】

【文献】 特表２００１−５２０６３５（ＪＰ，Ａ）

【文献】 特表２０１２−５１７９７９（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２００８／０２６２２５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 米国特許出願公開第２００７／００３１４５１（ＵＳ，Ａ１）

【文献】 Nat Med.，２０１２年１２月 １日，Vol. 18, No. 6，974-979 (page 1-14)

【文献】 Front. Immunol.，２０１６年 ２月１１日，Vol. 7, No. 34，p1-14

【文献】 Environ. Sci. Technol.，２０１０年 ３月３１日，Vol. 44, No. 9，p3351-3356

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ、Ａ６１Ｐ、Ｃ１２Ｎ

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

不活性化された病原体を含む免疫原性ワクチン組成物を産生するための方法であって、前記方法が、標準的な反応条件下でＲＮＡまたはＤＮＡゲノムを有する病原体を化学的不活性化剤のみと接触させることによって保持される病原体の抗原性および／または免疫原性と比較して、病原体の抗原性および／または免疫原性の保持を増強しながら、前記化学的不活性化剤が前記病原体を非感染性にするのに十分な量で、かつそれに十分な期間にわたって、１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在下で、前記病原体を前記化学的不活性化剤と接触させることを含み、前記無機多原子オキシアニオンが、少なくとも５０ｍＭのレベルのリン酸塩（ＨＰＯ_４^２−）、少なくとも１５０ｍＭのレベルの硫酸塩（ＳＯ_４^２−）、少なくとも０．０５ｍＭのレベルのトリメタリン酸塩（Ｐ_３Ｏ_９^３−）、または少なくとも０．０５ｍＭのレベルの三リン酸塩（Ｐ_３Ｏ_１０^５−）のうちの１つ以上を含み、前記化学的不活性化剤が、過酸化水素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、または、Ｃｕおよび／またはＦｅのイオンから選択される遷移金属イオンと組み合わせた過酸化水素を含むフェントン型試薬のうちの１つ以上を含み、ただし、ホルムアルデヒドの場合には、リン酸塩（ＨＰＯ_４^２−）のレベルが５００ｍＭ以下である、方法。

【請求項2】

前記無機多原子オキシアニオンが、少なくとも５０ｍＭのレベルのリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、少なくとも１５０ｍＭのレベルの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、少なくとも０．０５ｍＭのレベルのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、少なくとも０．０５ｍＭのレベルの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または少なくとも１５０ｍＭのレベルの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上から選択される多原子オキシアニオンである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記無機多原子オキシアニオンが、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、もしくは少なくとも１５００ｍＭのレベルのリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、もしくは少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも３０、もしくは少なくとも６０ｍＭのレベルのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、もしくは少なくとも３０ｍＭのレベルの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、もしくは少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上である、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

病原体特異的抗体、Ｂ細胞、もしくはＴ細胞免疫アッセイ、凝集アッセイ、または他の好適なアッセイを使用して、前記非感染性の病原体の免疫原性を確認することをさらに含み、不活性化された病原体を含む免疫原性ワクチン組成物を産生することが提供される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記化学的不活性化剤が、Ｃｕイオン、および／またはＦｅイオンから選択される少なくとも１つの遷移金属イオンと組み合わせた過酸化水素を含むフェントン試薬を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

異なる遷移金属イオンの混合物が、過酸化水素と組み合わせて使用される、請求項５に記載の方法。

【請求項7】

前記病原体が、ウイルス、または細菌である、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記病原体が、ウイルスである、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ウイルスが、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、またはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科由来である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記ウイルスが、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、または科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ由来である、請求項８に記載の方法。

【請求項11】

前記ウイルスが、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス血清型１〜４（ＤＥＮＶ１〜４）、および黄熱ウイルスＹＦＶ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、またはインフルエンザウイルス（科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓである、請求項８に記載の方法。

【請求項12】

前記病原体が、細菌である、請求項７に記載の方法。

【請求項13】

前記細菌が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである、請求項１２に記載の方法。

【請求項14】

前記Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒが、Ｃ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記細菌が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種である、請求項１２に記載の方法。

【請求項16】

前記細菌が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種である、請求項１２に記載の方法。

【請求項17】

前記病原体が、前記不活性化試薬と接触される前に単離または精製される、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

前記病原体を接触させることが、前記病原体を、前記１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在下で過酸化水素または前記フェントン試薬と、かつ式Ｉを有する化合物、

【化21】

（式中、Ｒ_１が独立して、Ｈ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンである）、およびそれらの薬学的に許容される塩と接触させることを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

ＸおよびＲ_２がＨであり、Ｒ_１がＨ（イサチンβ−チオセミカルバゾン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチンβ−チオセミカルバゾン）である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ＸがＨであり、Ｒ_１が−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））である、請求項１９に記載の方法。

【化22】

【請求項21】

前記病原体を接触させることが、前記病原体を、前記フェントン試薬と、各々が式ＩＩ〜Ｖ、

【化23】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンである）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化24】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンであり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化25】

（式中、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩、のうちの１つを有する１つ以上の化合物、ならびにそれらの組み合わせと接触させることを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

式（ＩＩ）のＸがＨであり、式（ＩＩ）のＲ_１がＨ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）であり、式（ＩＩＩ）のＸ、Ｒ_１、およびＲ_２がＨ（インドール、２，３−ジオン、３−ヒドラゾン）であり、式（ＩＶ）のＲ_２およびＲ_３がＨ（チオセミカルバジド）であり、式（Ｖ）のＲ_２およびＲ_３がＨ（セミカルバジド）である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記病原体を接触させることが、前記病原体を、前記フェントン試薬、チオセミカルバジド、および式ＶＩを有する化合物と接触させることを含み、

【化26】

式中、Ｒ_１が、Ｈまたは低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

Ｒ_１が、Ｈ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）である、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

Ｒ_１が、Ｈ（イサチン）である、請求項２３に記載の方法。

【請求項26】

不活性化された病原体を有する免疫原性ワクチン組成物であって、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法によって産生され、前記ワクチンが、前記化学的不活性化剤のみを用いた前記病原体の不活性化によって得られるものよりも高い抗原性および／または免疫原性を有する、免疫原性ワクチン組成物。

【請求項27】

病原体に対する免疫応答を対象において誘発するための組成物であって、前記組成物が、請求項２６に記載の方法によって調製された不活性化された病原体を有する免疫原性ワクチン組成物である、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

連邦支援研究に関する記述
この研究は、アメリカ国立衛生研究所グラント第Ｒ４４−ＡＩ０７９８９８号および同第Ｒ０１−ＡＩ０９８７２３号によって少なくとも部分的に支援を受けたため、米国政府が一定の権利を有する。

【0002】

本発明の態様は、概して、病原体を不活性化し、病原体に対して高度に免疫原性の不活性化ワクチンを産生するための方法、より具体的には、特にワクチン産生のために病原体を不活性化し、病原体の不活性化中の抗原損傷から保護するために無機多原子オキシアニオンを使用する、ウイルス性および細菌性病原体を含むが、これらに限定されないＲＮＡまたはＤＮＡゲノムのいずれかを有する病原体に対して高度に免疫原性の不活性化ワクチンを産生するための方法、ならびにさらにより具体的には、ワクチン産生のための病原体の不活性化中の抗原損傷から保護するために無機多原子オキシアニオンを使用する、驚くほどに効果的な方法に関し、ここで、不活性化が、化学的不活性化剤、例えば、酸化剤、例えば、過酸化水素、またはフェントン型化学（二重酸化）、またはアルキル化および／もしくは架橋剤、例えば、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、もしくはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）不活性化を使用することによることを含む。本方法は、特に病原体ワクチン産生のための標準的な不活性化プロセスの使用を上回る実質的な有益性を提供する。追加の態様は、本方法、および不活性化された病原体（複数可）を含有するワクチン組成物を投与することによって対象において免疫応答を誘発するための方法によって不活性化された病原体を含有するワクチン組成物（薬品）に関する。

【背景技術】

【0003】

不活性化ワクチンは、医学および獣医学の両方に関するヘルスケアシステムの重要な成分を表す。しかしながら、不活性化（例えば、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）不活性化、および過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）による不活性化）方法は、標的病原体の重要な抗原性エピトープに損傷を与え、最適以下のインビトロおよびワクチンにおけるインビトロ応答、ならびにインビボワクチンの効能の低減をもたらし得る。例えば、ホルムアルデヒドは、極端に反応性である化学的薬剤であり、一級アミドおよびタンパク質分子のアミノ基との化学的結合を形成することによって作用する。故に、インビトロにおいて、それは、タンパク質、ＤＮＡ、およびＲＮＡと反応し、例えば、胞子の厚い壁さえも貫通し得る。ホルムアルデヒドは、変異原性可能性も有し得、それは、カルボキシル、スルフヒドリル、およびヒドロキシル基におけるその作用により強力なアルキル化剤になる。ホルムアルデヒドは、タンパク質−ＤＮＡ架橋を形成する。β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）は、核酸およびタンパク質を含む多くの求核試薬と反応するアルキル化剤である。ＢＰＬは、主にプリン残基（特に、グアニン）との反応後、核酸の構造を変化させ、ＤＮＡにおいて切れ目を誘導し、ＤＮＡとタンパク質との間、ならびに二重らせん内でＤＮＡ鎖間に架橋する。結果的に、ＢＰＬは、ウイルス（ＤＮＡおよびＲＮＡウイルス）の不活性化のために幅広く使用される。エチレンイミンモノマー（ＥＩ）またはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）は、優先的にプリンのＮ−７、Ｎ−３、およびＮ−１で、ならびにわずかにピリミジンのＮ−３に（アルキル化）核酸を変化させるために使用される。アルキル化剤は、Ｎ−７アルキル化プリン（例えば、グアニン）のイミダゾール環の開放を増強し、それにより、複製が停止される。ＥＩは、グアノシンをアルキル化して、Ｎ−７（アルキルグアノシン）を形成するよりも高いイミダゾール環開放率を有するＮ−７（アミノエチル）グアノシンを形成する。ＥＩは、ウイルス性または非ウイルス性生体分子の非ゲノム成分も変化させる。エチレンイミン（ＥＩ）は、求電子性不活性化剤である。

【0004】

最近の研究（例えば、米国特許第８，１２４，３９７号および同第８，７１６，０００号を参照されたい）は、当該技術分野において、化学的酸化剤（例えば、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２））が、病原体を破滅および死滅させる能力に関してのみ以前から既知であり、かつ使用されているが、免疫原性の不活性化ウイルス性ワクチンを調製するための方法において使用され得ることを示している。しかしながら、さらにかかる単純な化学的酸化剤は、重要な抗原性エピトープにある程度損傷を与えることによって最適以下の結果をもたらし得、この問題を回避するために、免疫原性を最適に保持しながら、病原体を不活性化するためのより良好で広く適用可能な方法に対する明白な未だ対処されていない必要性が依然として存在する。

【0005】

例えば、「流感」として一般的に既知のインフルエンザは、インフルエンザウイルス、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の５つの属のうちの３つを構成するＲＮＡウイルスによって引き起こされる感染性疾患である。インフルエンザは、毎年の大流行で世界中に拡散し、約３百万〜５百万件の重度の症例および約２５０，０００〜５００，０００件の死亡をもたらす。

【0006】

デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）は、例えば、デング熱の原因である。それは、蚊媒介性で、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科、Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ属の正の向きの１本鎖のＲＮＡウイルスである。ウイルスの５つの血清型が見出され、それらの全ては、疾患の完全なスペクトラムを引き起こし得る。そのゲノムは、３つの構造タンパク質（カプシドタンパク質Ｃ、膜タンパク質Ｍ、外被タンパク質Ｅ）および７つの非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２ａ、ＮＳ２ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４ａ、ＮＳ４ｂ、ＮＳ５）に対してコードする。それは、５’および３’端の両方において短い非コード領域も含む。

【0007】

チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）は、例えば、ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ属、およびＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科のメンバーである。それは、約１１．６ｋｂの正の向きの１本鎖のゲノムを有するＲＮＡウイルスである。それは、セムリキ森林ウイルス複合体のメンバーであり、ロスリバーウイルス、オニョンニョンウイルス、およびセムリキ森林ウイルスに密接に関連する。それは、節足動物、いわゆる蚊によって伝染されるため、それは、アルボウイルス（節足動物媒介性ウイルス）とも称され得る。米国において、それは、カテゴリーＣ優先病原体として分類され、作業には生物安全性レベルＩＩＩの警戒を必要とする。症状には熱および関節痛が含まれ、典型的には、曝露後の２日から１２日後に発生する。他の症状には、頭痛、筋肉痛、関節の腫れ、および蕁麻疹が含まれ得る。ほとんどの人々は、１週間以内に回復するが、時折、関節痛は、何カ月も継続する場合がある。死亡のリスクは、約１，０００分の１である。かなりの若年者、高齢者、および他の健康問題を有する者には、より重度の疾患のリスクがある。

【0008】

Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（グラム陰性菌）は、例えば、網羅的なヒト病原体を表し、各年、細菌性胃腸炎の最大４億〜５億件の症例の原因となる。この細菌性疾患の経済的な負担は相当であり、年間の米国のコストは、最大＄５６億と推定される。ヒトＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染症に利用可能な市販のワクチンは存在せず、安全で効果的なワクチンの開発は、重要な未だ対処されていない臨床的な必要性を表す。ヒト疾患において最も頻繁に報告される種は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（亜種、ｊｅｊｕｎｉ）およびＣ．ｃｏｌｉである。Ｃ．ｌａｒｉおよびＣ．ｕｐｓａｌｉｅｎｓｉｓなどの他の種も、下痢性疾患を有する患者から単離されているが、あまり頻繁に報告されていない。

【0009】

Ｌｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ；グラム陽性菌）は、最も悪性の食品媒介性病原体のうちの１つであり、食品媒介性リステリア症に起因する死亡率は、リスクが高い個体において２０〜３０％に達する。米国（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ）（米国（Ｕ．Ｓ．））で毎年推定される１，６００件の症例および２６０件の死亡率の原因として、リステリア症は、食品媒介性細菌性病原体における死亡の総数で第３位にランクされ、死亡率は、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍさえも超える。欧州連合において、リステリア症の率は、２００８年に始まった上方傾向に従い、２０１４年には、２０１３年よりも１６％多い、２，１６１件の症例が確認され、２１０件の死亡が報告された。米国と同様に、リステリア症死亡率は、ＥＵでも他の食品媒介性の病原体と比較してより高い。

【0010】

Ｓｈｉｇｅｌｌａ（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ；グラム陰性菌）は、世界中の下痢の主な細菌性原因のうちの１つであり、これは、毎年、推定８，０００万〜１億６，５００万件の症例を引き起こす。それが引き起こす死亡数は、各年、７４，０００〜６００，０００と推定され、それは、アフリカおよび南アジアの子どもにおいて中〜重度の下痢を引き起こす上位４つの病原体に入る。Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉは、世界中で最も頻繁に単離される種であり、発展途上国において症例の６０％を占め、Ｓ．ｓｏｎｎｅｉは、発展途上国においては症例のわずか１５％を引き起こすのと比較して先進国において症例の７７％を引き起こし、Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅは通常、特に難民キャンプなどの人々の密集地において赤痢の大流行を引き起こす。
本開示は、より良好なワクチンに対するこれらの要件および他の要件を満たす。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0011】

【特許文献1】米国特許第８，１２４，３９７号明細書

【特許文献2】米国特許第８，７１６，０００号明細書

【発明の概要】

【0012】

出願者は、病原体の不活性化およびワクチン産生に関する病原体の化学的不活性化中の抗原損傷からの保護のための高レベルの無機多原子オキシアニオンの使用を本明細書にて初めて開示および実証する。例えば、ＣｕＣｌ_２およびＨ_２Ｏ_２、ならびに他の遷移金属／Ｈ_２Ｏ_２組み合わせ（フェントン反応組み合わせ）とのフェントン型化学を用いた無機多原子オキシアニオンの使用、例えば、二重酸化系における無機多原子オキシアニオンの使用により、標準的な手法の使用によりワクチン開発において著しい有益性が提供された。多様な化学的不活性化剤と組み合わせた無機多原子オキシアニオンを使用して、同様の保護の結果が見られ、例えば、ここで、化学的不活性化剤は、１つ以上の化学的酸化剤、アルキル化剤、または架橋剤、例えば、過酸化水素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、エチレンイミン（ＥＩ）、またはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）であった。

【0013】

フェントン型不活性化に関して、Ｈ_２Ｏ_２もＣｕＣｌ_２もいずれも、例えば、単独では、ロバストな抗原性を維持しながら、完全なウイルス不活性化も確実にすることができず、これらはいずれも、不活性化ワクチンの成功の基礎をなす重要な成分である。例えば、ＣｕＣｌ_２およびＨ_２Ｏ_２の両方の組み合わせを使用して、例えば、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）のための抗原性および免疫原性ワクチンが開発された。これは、無機多原子オキシアニオン陰イオンの使用によってさらに改善された。例えば、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス血清型１〜４（ＤＥＮＶ１〜４）および黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ）、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、またはインフルエンザウイルス（科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）のための様々な抗原性および免疫原性ワクチンが提供される。

【0014】

同様に、過酸化水素（のみ）媒介性不活性化について、不活性化速度および抗原性保持の両方が、無機多原子オキシアニオンの使用によって改善された。

【0015】

したがって、特定の態様は、標準的な反応条件下での過酸化水素またはフェントン−試薬（複数可）のみで保持された免疫原性と比較して免疫原性を驚くほどに効果的に保持する微生物不活性化をもたらす、無機多原子オキシアニオンと組み合わせた過酸化水素を伴うか、または酸化的副産物を形成するために過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）と組み合わせた、および無機多原子オキシアニオンと組み合わせた酸化還元活性遷移金属（例えば、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｃｓなど）を使用したフェントン型化学（酸化反応）を伴う効果的な単一および二重酸化手法を提供する。

【0016】

追加の驚くべき態様において、いずれの場合も無機多原子オキシアニオンと組み合わせた本開示の単一酸化方法（例えば、過酸化水素）またはフェントン型化学を伴う二重酸化方法は、以下により詳述されるように、メチサゾン、メチサゾン類似体、またはメチサゾン官能基（複数可）／下部構造（複数可）の使用をさらに含む。単一（例えば、過酸化水素）または二重酸化のみに対してさらにより効率的な微生物不活性化、および無機多原子オキシアニオンと組み合わせた単一酸化（例えば、過酸化水素）または二重酸化と比較して免疫原性のさらにより効果的な保持を提供する。

【0017】

特定の態様は、不活性化された病原体を含む免疫原性ワクチン組成物を産生するための方法を提供し、本方法は、病原体抗原性および／または免疫原性の保持を増強しながら（例えば、標準的な反応条件下で病原体を化学的不活性化剤のみと接触させることによって保持された病原体抗原性および／または免疫原性と比較して）、化学的不活性化剤が病原体を非感染性にするのに十分な量で、かつそれに十分な期間にわたって、１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在下で、病原体を化学的不活性化剤と接触させることを含む。化学的不活性化剤は、１つ以上の化学的酸化剤、アルキル化剤、または架橋剤、例えば、過酸化水素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、エチレンイミン（ＥＩ）またはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、または遷移金属と組み合わせた過酸化水素を含むフェントン型試薬（複数可）のうちの１つ以上であり得る。本方法において、無機多原子オキシアニオンは、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、もしくは硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上から選択される無機多原子オキシアニオンであり得るか、または無機多原子オキシアニオンは、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルのリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、少なくとも５、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも３０、もしくは少なくとも６０ｍＭのレベルのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、もしくは少なくとも３０ｍＭのレベルの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、および少なくとも１５００ｍＭ）のレベルの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上であり得る。本方法において、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、および／または硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）の濃度の好ましい範囲は、２０〜１，５００ｍＭ、２０〜１，０００ｍＭ、２０〜７５０ｍＭ、２０〜５００ｍＭ、２０〜２５０ｍＭ、２０〜１００ｍＭ、２０〜７５ｍＭ、２０〜５０ｍＭ、２０〜２５ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。本方法において、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）の濃度の好ましい範囲は、０．０５ｍＭ〜６０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、および０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。本方法において、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）の濃度の好ましい範囲は、０．０５ｍＭ〜３０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、および０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。

【0018】

本方法は、病原体特異的抗体、Ｂ細胞もしくはＴ細胞免疫アッセイ、凝集アッセイ、または他の好適なアッセイを使用して、非感染性の病原体の免疫原性を確認することをさらに含み得、不活性化された病原体を含む免疫原性ワクチン組成物を産生することが提供される。

【0019】

本方法において、フェントン試薬は、Ｃｕイオン、および／もしくはＦｅイオン、および／もしくはＣｓイオンから選択される少なくとも１つの遷移金属イオンと組み合わせた過酸化水素を含み得るか、または異なる遷移金属イオンの混合物が過酸化水素と組み合わせて使用され得る。

【0020】

本方法において、病原体は、好ましくは、病原体ゲノムであり、ＲＮＡまたはＤＮＡ（例えば、ウイルス、細菌）を含む。例えば、ウイルスは、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、またはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科由来であり得る（例えば、ウイルスは、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、もしくまたは科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ由来であり得るか、またはウイルスは、例えば、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス血清型１〜４（ＤＥＮＶ１〜４）および黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、もしくはインフルエンザウイルス（科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓであり得る。

【0021】

本方法において、病原体は、細菌（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは、Ｃ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉである）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種など）であり得る。

【0022】

本方法において、病原体は、好ましくは、不活性化試薬と接触される前に単離または精製される。

【0023】

病原体を不活性化するための、かつ免疫原性を保持しながら病原体を不活性化することによってワクチンを産生するための本明細書に開示される本開示の単一酸化方法および二重酸化方法は、病原体を、単独酸化剤（例えば、過酸化水素、または二重フェントン試薬（いずれの場合も高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンと組み合わせたもの）、および「メチサゾン試薬」、例えば、メチサゾン、メチサゾン類似体（複数可）、もしくは１つ以上のメチサゾン官能基（複数可）／下部構造（複数可）、またはそれらの組み合わせと接触させることを含み得る。例えば、本明細書に記載される二重酸化方法は、病原体をフェントン試薬（複数可）ならびに式Ｉを有する化合物、

【化1】

（式中、Ｒ_１が独立して、Ｈまたは−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆなど）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩と接触させることを含み得る。特定の態様において、Ｒ_２がＨであり、Ｒ_１が独立して、Ｈ（イサチンβ−チオセミカルバゾン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチンβ−チオセミカルバゾン）である。好ましくは、Ｒ_２は、Ｈであり、Ｒ_１は、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））である。好ましくは、メチサゾンが使用される。

【化2】

【0024】

あるいは、または加えて、本明細書に記載される二重酸化方法は、病原体を、フェントン試薬および各々が式ＩＩ〜Ｖ、

【化3】

（式中、Ｒ_１が、Ｈまたは−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆなど）である）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化4】

（式中、Ｒ_１が、Ｈまたは−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆなど）であり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化5】

（式中、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩、のうちの１つを有する１つ以上の化合物、ならびに各々が式ＩＩ〜Ｖのうちの１つを有する（または各々が式Ｉ〜Ｖのうちの１つを有する）かかる化合物の組み合わせと接触させることを含み得る。好ましくは、式ＩＩのＸは、Ｈであり、式（ＩＩ）のＲ_１は、Ｈ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）であり、式（ＩＩＩ）のＸ、Ｒ_１、およびＲ_２は、Ｈ（インドール、２，３−ジオン、３−ヒドラゾン）であり、式（ＩＶ）のＲ_２およびＲ_３は、Ｈ（チオセミカルバジド）であり、式（Ｖ）のＲ_２およびＲ_３は、Ｈ（セミカルバジド）である。好ましくは、病原体を接触させることは、病原体を、フェントン試薬、チオセミカルバジド、および式ＶＩを有する化合物と接触させることを含み、

【化6】

式中、Ｒ_１が、Ｈまたは低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である。好ましくは、式ＶＩのＲ_１は、Ｈ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）である。好ましくは、式ＶＩのＲ_１は、Ｈ（イサチン）である。

【化7】

【0025】

本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される化学的に不活性化された病原体を有する免疫原性ワクチン組成物も提供される。好ましくは、不活性化された病原体は、病原体特異的抗体、Ｂ細胞、もしくはＴ細胞応答を誘発するか、または病原体による感染症を軽減するか、または病原体による感染症に起因する症状を緩和するのに好適な生物学的に活性な病原体の１つ以上の優勢な抗原性エピトープを保持する。本方法において、病原体ゲノムは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。本組成物について、使用される化学的不活性化剤は、１つ以上の化学的酸化剤、アルキル化剤、または架橋剤、例えば、過酸化水素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、エチレンイミン（ＥＩ）もしくはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）不活性化、または遷移金属と組み合わせた過酸化水素を含むフェントン型試薬（複数可）（いずれの場合も高レベル（例えば、標準的なリン酸緩衝生理食塩水反応条件下で病原体を化学的不活性化剤のみと接触させることによって保持されるレベルと比較して病原体の免疫原性の保持を増強するのに十分なレベル）の１つ以上の無機多原子オキシアニオンと組み合わせたもの）のうちの１つ以上であり得る。

【0026】

病原体に対する免疫応答を誘発する方法も提供され、本方法は、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって産生される化学的に不活性化された病原体を有する免疫原性ワクチン組成物を得ることと、免疫原性ワクチン組成物を対象に投与し、それにより、対象における病原体に対する免疫応答を誘発することとを含む。本方法において、病原体ゲノムは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。

【0027】

本方法において、使用される化学的不活性化剤は、１つ以上の化学的酸化剤、アルキル化剤、または架橋剤、例えば、過酸化水素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、エチレンイミン（ＥＩ）もしくはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）、または遷移金属と組み合わせた過酸化水素を含むフェントン型試薬（複数可）のうちの１つ以上であり得る。好ましくは、過酸化水素またはフェントン型試薬（複数可）が使用される。

【0028】

好ましくは、無機多原子オキシアニオンは、無機多原子オキシアニオンである（例えば、無機多原子オキシアニオンは、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上からなる群から選択される。好ましい実施形態において、多原子オキシアニオンは、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルのリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、少なくとも５、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも３０、もしくは少なくとも６０ｍＭのレベルのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、もしくは少なくとも３０ｍＭのレベルの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上である。本方法において、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、および／または硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）の濃度の好ましい範囲は、２０〜１，５００ｍＭ、２０〜１，０００ｍＭ、２０〜７５０ｍＭ、２０〜５００ｍＭ、２０〜２５０ｍＭ、２０〜１００ｍＭ、２０〜７５ｍＭ、２０〜５０ｍＭ、２０〜２５ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。本方法において、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）の濃度の好ましい範囲は、０．０５ｍＭ〜６０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、および０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。本方法において、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）の濃度の好ましい範囲は、０．０５ｍＭ〜３０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、および０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。

【0029】

加えて、病原体をより急速に不活性化するための方法（例えば、免疫原性の保持の程度にかかわらず）が提供され、本方法は、（例えば、病原体を、例えば、標準的な反応条件下で、過酸化水素またはフェントン試薬のいずれかのみと接触させることによってもたらされる速度と比較して増大した速度で）過酸化水素またはフェントン試薬が病原体を非感染性にするのに十分な量で、かつそれに十分な期間にわたって、１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在下で、病原体を、過酸化水素、または遷移金属と組み合わせた過酸化水素を含有するフェントン試薬と接触させることを含む。本方法において、病原体の不活性化は、好ましくは、（例えば、標準的な反応条件下で）病原体を過酸化水素またはフェントン試薬のいずれかのみと接触させることによってもたらされる速度と比較して増大した速度で継続する。

【0030】

本方法において、無機多原子オキシアニオンは、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、もしくは硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）からなる群から選択される１つ以上の無機多原子オキシアニオン（複数可）であり得るか、または無機多原子オキシアニオンは、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルのリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、少なくとも５、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも３０、もしくは少なくとも６０ｍＭのレベルのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、もしくは少なくとも３０ｍＭのレベルの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、および少なくとも１５００ｍＭ）のレベルの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上であり得る。本方法において、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、および／または硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）の濃度の好ましい範囲は、２０〜１，５００ｍＭ、２０〜１，０００ｍＭ、２０〜７５０ｍＭ、２０〜５００ｍＭ、２０〜２５０ｍＭ、２０〜１００ｍＭ、２０〜７５ｍＭ、２０〜５０ｍＭ、２０〜２５ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。本方法において、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）の濃度の好ましい範囲は、０．０５ｍＭ〜６０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、および０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。本方法において、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）の濃度の好ましい範囲は、０．０５ｍＭ〜３０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、および０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。

【0031】

本方法において、フェントン試薬は、Ｃｕ、Ｆｅ、およびＣｓからなる群から選択される少なくとも１つの遷移金属イオンと組み合わせた過酸化水素を含み得る。本方法において、異なる遷移金属イオンの混合物は、過酸化水素と組み合わせて使用され得る。病原体ゲノムは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。病原体は、ウイルスまたは細菌であり得る。ウイルスは、例えば、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、またはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科由来であり得る。ウイルスは、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、または科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ由来であり得る。ウイルスは、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス血清型１〜４および黄熱ウイルス（ＤＥＮＶ１〜４、ＹＦＶ、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、またはインフルエンザウイルス（科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓであり得る。細菌は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｃ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉ）であり得る。細菌は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、またはＬｉｓｔｅｒｉａ種であり得る。好ましくは、病原体は、接触前に単離または精製される。

【0032】

これらの不活性化方法は、病原体を、式Ｉを有する化合物、

【化8】

（式中、Ｒ_１が独立して、Ｈ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンである）、およびそれらの薬学的に許容される塩と接触させることをさらに含む。好ましくは、ＸおよびＲ_２は、Ｈであり、Ｒ_１は、Ｈ（イサチンβ−チオセミカルバゾン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチンβ−チオセミカルバゾン）であり、好ましくは、Ｒ_１は、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン）、式ＶＩＩ）である。

【化9】

【0033】

本不活性化方法において、メチサゾン試薬は、各々が式ＩＩ〜Ｖ、

【化10】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンである）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩、

【化11】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンであり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩、

【化12】

（式中、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩、のうちの１つを有する１つ以上の化合物、ならびにそれらの組み合わせを含み得る。好ましくは、式（ＩＩ）のＸは、Ｈであり、式（ＩＩ）のＲ_１は、Ｈ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）であり、式（ＩＩＩ）のＸ、Ｒ_１、およびＲ_２は、Ｈ（インドール、２，３−ジオン、３−ヒドラゾン）であり、式（ＩＶ）のＲ_２およびＲ_３は、Ｈ（チオセミカルバジド）であり、式（Ｖ）のＲ_２およびＲ_３は、Ｈ（セミカルバジド）である。メチサゾン試薬は、チオセミカルバジドおよび式ＶＩを有する化合物を含み得、

【化13】

式中、Ｒ_１が、Ｈまたは低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である。好ましくは、Ｒ_１は、Ｈ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）である。好ましくは、Ｒ_１は、Ｈ（イサチン）である。

【0034】

本明細書に記載される方法の全ての有用性／効能／結果は、少なくとも６つの理由から、驚くべきことであり、予想外である。

【0035】

第１に、出願者の米国特許第８，１２４，３９７号および同第８，７１６，０００号（以下、「’３９７」および「’０００」特許とし、それらは、ワクチン産生のための酸化反応においてＨ_２Ｏ_２のみの使用を包含する特許請求の範囲を有する）に先んじて、Ｈ_２Ｏ_２は、強力な酸化体と見なされ、故に、Ｈ_２Ｏ_２反応は、当該技術分野において病原体を効果的に破滅および死滅させる能力に関してのみ知られており、使用されたが、出願者の従前の３９７および‘０００特許において驚くべきことに開示されているように、免疫原性ワクチン産生のためにはＨ_２Ｏ_２の酸化反応は使用されないか、それを使用することに対する提案がないか、または合理的な期待はなかった。同様に、出願者の本開示に先んじて、および以下でより詳細に考察されているように、フェントン型酸化反応（Ｈ_２Ｏ_２＋遷移金属イオン）は、当該技術分野において病原体を効果的に破滅および死滅させる能力に関してのみ知られており、本開示および本特許請求の範囲のような、ウイルス不活性化または免疫原性ワクチン産生のいずれかのためにはフェントン型酸化反応は使用されないか、それを使用することに対する提案がないか、または合理的な期待はなかった。さらに、当該技術分野において、本開示および本特許請求の範囲のような、過酸化水素またはフェントン試薬（複数可）と組み合わせた高レベル（例えば、標準的なリン酸緩衝生理食塩水反応条件下で、病原体を化学的不活性化剤（複数可）のみと接触させることによって保持される病原体免疫原性と比較して、病原体免疫原性の保持を増強するのに十分なレベル）の１つ以上の無機多原子オキシアニオンの使用の提案または動機付けはなかった。

【0036】

第２に、フェントン型化学（Ｈ_２Ｏ_２および＋遷移金属イオン）を使用する本開示の二重酸化手法の調査の初期において、フェントン型化学を使用するウイルス不活性化が、タンパク質依存性ではないＨ_２Ｏ_２のみを使用する事例とは全く異なり、ウイルス性タンパク質濃度依存性であることが発見され（本明細書の図１Ａおよび図１Ｂを比較されたい）、これは、根本的に異なる機構が、Ｈ_２Ｏ_２単独に基づく病原体不活性化（単独酸化系）と比較して、フェントン型化学に基づく病原体不活性化（二重酸化系）に関与していたことを示す。さらに、二重酸化系において、不活性化速度が、ウイルス性タンパク質の完全性／免疫原性を保持しようとする方法においてフェントン型化学に基づく病原体不活性化の使用に禁忌を示すより高いウイルス性タンパク質濃度で低下し、これは、フェントン型化学の包含が、ウイルス性タンパク質抗原を標的とし得ることを示す。したがって、本明細書に開示されるように、フェントン型化学に基づく病原体不活性化が事実、ウイルス性タンパク質の完全性／免疫原性の保持を実質的に改善したことは、驚くべきことであり、予想外であった。

【0037】

第３に、メチサゾン試薬の使用をさらに含む二重酸化方法に関して、当該技術分野において、フェントン試薬（例えば、Ｈ_２Ｏ_２およびＣｕ）と組み合わせたメチサゾン試薬（例えば、メチサゾン）は使用されなかったか、またはそれを使用することに対する提案はなく、故に、当該技術分野において、いずれのワクチン調製ではない文脈を含むいずれの文脈においてもフェントン型化学におけるメチサゾンの潜在的な効果がある場合でも、それらに関する知識がなかった。出願者が、事実、本明細書に開示および特許請求されるようにフェントン試薬と組み合わせたメチサゾン試薬の使用を開示する第一人者である。

【0038】

第４に、以下でより詳細に考察されるように、メチサゾンは、当該技術分野において、核酸およびタンパク質の両方と結び付くことで知られており、故に、本明細書に開示されるものなどの方法における使用に対して禁忌であり、これらの方法は、病原体タンパク質エピトープの完全性および免疫原性を最大限に保持することを目的とし、特に、ここで、関連病原体タンパク質エピトープは、病原体の内部封鎖核酸に対して病原体表面上で曝露される。さらに、メチサゾンのタンパク質の親和性は特に、上記で考察されるような出願者の初期の発見を考慮すると、出願者の二重酸化反応が、ウイルス性タンパク質濃度依存性（不活性化速度はウイルス性タンパク質濃度が増加すると低下する、本明細書の図１Ｂ）であり、故に、タンパク質と結び付くかそれを標的とするさらに別の薬剤の添加に対して禁忌を示すことが憂慮されていた。

【0039】

第５に、メチサゾンは、当該技術分野において、遷移金属イオンを複合／封鎖することで知られており、これは、化学的技術分野の当業者に、メチサゾンが、フェントン型化学（Ｈ_２Ｏ_２＋遷移金属イオン、例えば、Ｃｕ）を競合的に妨害し得ることを示し、故に、フェントン型化学と組み合わせたその使用に対して禁忌を示す。以下でより詳細に考察されるように、金属イオンは、フェントン型酸化反応において触媒であり、故に、メチサゾン試薬によるかかる触媒の封鎖は、特に憂慮されるものであるであろう。しかしながら、驚くべきことに、メチサゾン試薬は、フェントン型化学媒介性病原体不活性化の速度、および不活性化された病原体のタンパク質の完全性／免疫原性の保持の両方を実質的に増加させた。

【0040】

第６に、病原体を不活性化するための本開示の方法に関して、当業者は、以前において、過酸化水素およびメチサゾン試薬を使用するか、またはフェントン化学およびメチサゾン試薬を使用するかのいずれにおいても病原体を不活性化しておらず、免疫原性保持の検討にかかわらず、過酸化水素のみ、またはフェントン化学のみと比較して病原体不活性化速度の増加を予想できなかった。さらに、当該技術分野において、本開示および本特許請求の範囲のような、これらの文脈において、高レベル（例えば、標準的なリン酸緩衝生理食塩水反応条件下で、病原体を化学的不活性化剤（複数可）のみと接触させることによって保持される病原体免疫原性と比較して、病原体免疫原性の保持を増強するのに十分なレベル）の１つ以上の無機多原子オキシアニオンのさらなる使用の提案または動機付けはなかった。

【0041】

したがって、少なくともこれらの６つの理由に関して、本明細書に開示される結果は、驚くべきことであり、かつ予想外であり、単純な化学的酸化剤（例えば、Ｈ_２Ｏ_２）を用いた出願者自身の以前の研究を含む、先行技術（米国特許第８，１２４，３９７号および同第８，７１６，０００号）に基づいて予想できなかった。

【0042】

先端方法（例えば、二重酸化方法）は、４つの関連しないウイルス科（例えば、ＣＨＩＫＶ（科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス血清型１〜４（ＤＥＮＶ１〜４）、および黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、およびインフルエンザウイルス（科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：ＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＡ））を表す８個の例示的なウイルス性ワクチン標的に成功裏に適用され、それらに関して、単純な（例えば、Ｈ_２Ｏ_２のみを用いた）酸化が最適以下であることが見出された。

【0043】

加えて驚くべき先端二重酸化方法は、細菌性ワクチン標的（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａなど）にも成功裏に適用され、ここで、単純な（例えば、Ｈ_２Ｏ_２のみを用いた酸化）が、（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの場合の）ワクチン開発にとってあまりに有害であることが見出された。

【0044】

フェントン型化学（ならびに、最適にメチサゾン、メチサゾン類似体、メチサゾン官能基（複数可）／下部構造（複数可）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるメチサゾン型試薬の使用をさらに含む本明細書に記載される方法）を使用して、および特に、高レベルの無機多原子オキシアニオン（例えば、標準的なリン酸緩衝生理食塩水反応条件下で病原体を化学的不活性化剤（複数可）のみと接触させることによって保持される病原体の免疫原性と比較して、病原体の免疫原性の保持を増強するのに十分なレベル）の存在下で行われる本開示の単独酸化（例えば、過酸化水素）、および二重酸化方法は、抗原性特性を維持しながら急速な病原体不活性化、およびロバストな病原体不活性化を提供して、ワクチン接種後の免疫応答の増強をもたらす高度に効果的なワクチンを提供する。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
不活性化された病原体を含む免疫原性ワクチン組成物を産生するための方法であって、前記方法が、標準的な反応条件下で病原体を化学的不活性化剤のみと接触させることによって保持される病原体の抗原性および／または免疫原性と比較して、病原体の抗原性および／または免疫原性の保持を増強しながら、前記化学的不活性化剤が前記病原体を非感染性にするのに十分な量で、かつそれに十分な期間にわたって、１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在下で、前記病原体を前記化学的不活性化剤と接触させることを含む、方法。
（項目２）
前記化学的不活性化剤が、１つ以上の化学的酸化剤、アルキル化剤、または架橋剤である、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記化学的酸化剤が、過酸化水素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）不活性化、または遷移金属と組み合わせた過酸化水素を含むフェントン型試薬（複数可）のうちの１つ以上を含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記無機多原子オキシアニオンが、多原子オキシアニオンである、項目１に記載の方法。
（項目５）
前記無機多原子オキシアニオンが、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上から選択される多原子オキシアニオンである、項目４に記載の方法。
（項目６）
前記無機多原子オキシアニオンが、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルのリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、少なくとも５、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも３０、もしくは少なくとも６０ｍＭのレベルのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、もしくは少なくとも３０ｍＭのレベルの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上である、項目５に記載の方法。
（項目７）
病原体特異的抗体、Ｂ細胞、もしくはＴ細胞免疫アッセイ、凝集アッセイ、または他の好適なアッセイを使用して、前記非感染性の病原体の免疫原性を確認することをさらに含み、不活性化された病原体を含む免疫原性ワクチン組成物を産生することが提供される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記フェントン試薬が、Ｃｕイオン、および／またはＦｅイオン、および／またはＣｓイオンから選択される少なくとも１つの遷移金属イオンと組み合わせた過酸化水素を含む、項目３に記載の方法。
（項目９）
異なる遷移金属イオンの混合物が、過酸化水素と組み合わせて使用される、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記病原体が、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記病原体が、ウイルス、または細菌である、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記病原体が、ウイルスである、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記ウイルスが、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、またはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科由来である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記ウイルスが、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、または科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ由来である、項目１２に記載の方法。
（項目１５）
前記ウイルスが、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス血清型１〜４（ＤＥＮＶ１〜４）、および黄熱ウイルスＹＦＶ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、またはインフルエンザウイルス（科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓである、項目１２に記載の方法。
（項目１６）
前記病原体が、細菌である、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記細菌が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒが、Ｃ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉである、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記細菌が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種である、項目１６に記載の方法。
（項目２０）
前記細菌が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種である、項目１６に記載の方法。
（項目２１）
前記病原体が、前記不活性化試薬と接触される前に単離または精製される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記病原体を接触させることが、前記病原体を、前記１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在下で過酸化水素または前記フェントン試薬と、かつ式Ｉを有する化合物、

【化21】

（式中、Ｒ_１が独立して、Ｈ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンである）、およびそれらの薬学的に許容される塩と接触させることを含む、項目３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
ＸおよびＲ_２がＨであり、Ｒ_１がＨ（イサチンβ−チオセミカルバゾン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチンβ−チオセミカルバゾン）である、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
ＸがＨであり、Ｒ_１が−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））である、項目２３に記載の方法。

【化22】

（項目２５）
前記病原体を接触させることが、前記病原体を、前記フェントン試薬と、各々が式ＩＩ〜Ｖ、

【化23】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンである）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化24】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンであり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化25】

（式中、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩、のうちの１つを有する１つ以上の化合物、ならびにそれらの組み合わせと接触させることを含む、項目３〜２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
式（ＩＩ）のＸがＨであり、式（ＩＩ）のＲ_１がＨ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）であり、式（ＩＩＩ）のＸ、Ｒ_１、およびＲ_２がＨ（インドール、２，３−ジオン、３−ヒドラゾン）であり、式（ＩＶ）のＲ_２およびＲ_３がＨ（チオセミカルバジド）であり、式（Ｖ）のＲ_２およびＲ_３がＨ（セミカルバジド）である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記病原体を接触させることが、前記病原体を、前記フェントン試薬、チオセミカルバジド、および式ＶＩを有する化合物と接触させることを含み、

【化26】

式中、Ｒ_１が、Ｈまたは低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である、項目２５に記載の方法。
（項目２８）
Ｒ_１が、Ｈ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）である、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
Ｒ_１が、Ｈ（イサチン）である、項目２７に記載の方法。
（項目３０）
不活性化された病原体を有する免疫原性ワクチン組成物であって、項目１〜２９のいずれか一項に記載の方法によって産生される、免疫原性ワクチン組成物。
（項目３１）
病原体に対する免疫応答を誘発する方法であって、前記方法が、
項目３０に記載の方法によって調製された不活性化された病原体を有する免疫原性ワクチン組成物を得ることと、
前記免疫原性ワクチン組成物を対象に投与し、それにより、前記対象における前記病原体に対する免疫応答を誘発することと、を含む、方法。
（項目３２）
病原体を不活性化するための方法であって、前記方法が、過酸化水素またはフェントン試薬のいずれかのみと接触させることによってもたらされる速度と比較して増大した速度で、前記過酸化水素または前記フェントン試薬が前記病原体を非感染性にするのに十分な量で、かつそれに十分な期間にわたって、１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在下で、前記病原体を、前記過酸化水素、または遷移金属と組み合わせた過酸化水素を含有する前記フェントン試薬と接触させることを含む、方法。
（項目３３）
前記化学的不活性化剤が、１つ以上の化学的酸化剤、アルキル化剤、または架橋剤である、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記化学的酸化剤が、過酸化水素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）不活性化、または遷移金属と組み合わせた過酸化水素を含むフェントン型試薬（複数可）のうちの１つ以上を含む、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記無機多原子オキシアニオンが、多原子オキシアニオンである、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
前記無機多原子オキシアニオンが、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上から選択される多原子オキシアニオンである、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記無機多原子オキシオキシアニオン（ｏｘｙｏｘｙａｎｉｏｎ）が、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルのリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、少なくとも５、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも３０、もしくは少なくとも６０ｍＭのレベルのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、もしくは少なくとも３０ｍＭのレベルの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上である、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記フェントン試薬が、Ｃｕ、Ｆｅ、およびＣｓからなる群から選択される少なくとも１つの遷移金属イオンと組み合わせた過酸化水素を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３９）
異なる遷移金属イオンの混合物が、過酸化水素と組み合わせて使用される、項目３２に記載の方法。
（項目４０）
前記病原体ゲノムが、ＲＮＡまたはＤＮＡを含む、項目３２に記載の方法。
（項目４１）
前記病原体が、ウイルス、または細菌である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記病原体が、ウイルスである、項目４１に記載の方法。
（項目４３）
前記ウイルスが、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、またはＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科由来である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記ウイルスが、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ、または科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ由来である、項目４２に記載の方法。
（項目４５）
前記ウイルスが、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス血清型１〜４および黄熱ウイルス（ＤＥＮＶ１〜４、ＹＦＶ、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、またはインフルエンザウイルス（科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓである、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記病原体が、細菌である、項目４１に記載の方法。
（項目４７）
前記細菌が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒである、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒが、Ｃ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記細菌が、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種である、項目４６に記載の方法。
（項目５０）
前記細菌が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種である、項目４６に記載の方法。
（項目５１）
前記病原体が、前記接触の前に単離または精製される、項目４６に記載の方法。
（項目５２）
前記病原体を接触させることが、前記病原体を、式Ｉを有する化合物、

【化27】

（式中、Ｒ_１が独立して、Ｈ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンである）、およびそれらの薬学的に許容される塩と接触させることをさらに含む、項目３２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５３）
ＸおよびＲ_２がＨであり、Ｒ_１がＨ（イサチンβ−チオセミカルバゾン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチンβ−チオセミカルバゾン）である、項目５２に記載の方法。
（項目５４）
Ｒ_１が−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））である、項目５３に記載の方法。
（項目５５）
前記メチサゾン試薬が、各々が式ＩＩ〜Ｖ、

【化28】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４）アルキルであり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンである）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化29】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲンであり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化30】

（式中、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩、のうちの１つを有する１つ以上の化合物、ならびにそれらの組み合わせを含む、項目３２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目５６）
式ＩＩのＸがＨであり、式（ＩＩ）のＲ_１がＨ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）であり、式（ＩＩＩ）のＸ、Ｒ_１、およびＲ_２がＨ（インドール、２，３−ジオン、３−ヒドラゾン）であり、式（ＩＶ）のＲ_２およびＲ_３がＨ（チオセミカルバジド）であり、式（Ｖ）のＲ_２およびＲ_３がＨ（セミカルバジド）である、項目５５に記載の方法。
（項目５７）
前記メチサゾン試薬が、チオセミカルバジドおよび式ＶＩを有する化合物を含み、

【化31】

式中、Ｒ_１が、Ｈまたは低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）である、項目５５に記載の方法。
（項目５８）
Ｒ_１が、Ｈ（イサチン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）である、項目５７に記載の方法。
（項目５９）
Ｒ_１が、Ｈ（イサチン）である、項目５７に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0045】

【図1A】図１Ａおよび１Ｂは、特定の態様に従って、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化系を使用するウイルス不活性化の速度は、タンパク質濃度依存性である一方で、標準的なＨ_２Ｏ_２系ウイルス不活性化がタンパク質濃度非依存性あることを示す。

【図1B】図１Ａおよび１Ｂは、特定の態様に従って、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化系を使用するウイルス不活性化の速度は、タンパク質濃度依存性である一方で、標準的なＨ_２Ｏ_２系ウイルス不活性化がタンパク質濃度非依存性あることを示す。

【図2A】図２Ａおよび２Ｂは、特定の態様に従って、標準的なＨ_２Ｏ_２に基づく不活性化が、ＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープに損傷を与え、ワクチン接種後にインビボにおいて中和応答を誘導できないことを示す。

【図2B】図２Ａおよび２Ｂは、特定の態様に従って、標準的なＨ_２Ｏ_２に基づく不活性化が、ＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープに損傷を与え、ワクチン接種後にインビボにおいて中和応答を誘導できないことを示す。

【図3A】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、特定の態様に従って、本開示の二重酸化フェントン型酸化系の使用が、ＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープの維持を改善しながら、効率的な不活性化を提供することを示す。

【図3B】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、特定の態様に従って、本開示の二重酸化フェントン型酸化系の使用が、ＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープの維持を改善しながら、効率的な不活性化を提供することを示す。

【図3C】図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃは、特定の態様に従って、本開示の二重酸化フェントン型酸化系の使用が、ＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープの維持を改善しながら、効率的な不活性化を提供することを示す。

【図4】図４は、特定の態様に従って、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種が、急速な中和抗体応答を誘導することを示す。

【図5A】図５Ａおよび５Ｂは、特定の態様に従って、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種が、ＣＨＩＫＶ関連病変から保護することを示す。

【図5B】図５Ａおよび５Ｂは、特定の態様に従って、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種が、ＣＨＩＫＶ関連病変から保護することを示す。

【図6A】図６Ａおよび６Ｂは、特定の態様に従って、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）を用いた本開示の二重酸化手法の使用が、ワクチン接種後の中和エピトープ（抗原性）に結合する抗体の保持の増強および免疫原性の改善を実証することを示す。

【図6B】図６Ａおよび６Ｂは、特定の態様に従って、黄熱ウイルス（ＹＦＶ）を用いた本開示の二重酸化手法の使用が、ワクチン接種後の中和エピトープ（抗原性）に結合する抗体の保持の増強および免疫原性の改善を実証することを示す。

【図7】図７は、特定の態様に従って、本開示の二重酸化フェントン型酸化系の使用が、デング熱ウイルス３特異的中和エピトープを維持しながら、不活性化の増強を実証することを示す。

【図8】図８は、特定の態様に従って、本開示のＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化系の使用が、アカゲザル（ＲＭ）において四価のＤＥＮＶワクチンを用いた免疫化後、４つのＤＥＮＶ血清型のうちの３つに対してインビボ免疫原性を増強することを示す。

【図9】図９は、特定の態様に従って、本開示のＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化系の使用が、マウスにおいて四価のＤＥＮＶワクチンを用いた免疫化後、４つのＤＥＮＶ血清型のうちの４つに対してインビボ免疫原性を増強することを示す。

【図10】図１０は、特定の態様に従って、本開示のＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２系ウイルス不活性化が、Ｈ_２Ｏ_２のみよりも著しく良好にインフルエンザ赤血球凝集活性を維持することを示す。

【図11A】図１１Ａおよび１１Ｂは、特定の態様に従って、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２で不活性化されたインフルエンザが、ロバストな赤血球凝集抑制力価を誘導し、致死的攻撃から保護することを示す。

【図11B】図１１Ａおよび１１Ｂは、特定の態様に従って、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２で不活性化されたインフルエンザが、ロバストな赤血球凝集抑制力価を誘導し、致死的攻撃から保護することを示す。

【図12A】図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、特定の態様に従って、本開示の二重酸化系ウイルス不活性化方法に関する例示的な酸化還元活性金属の比較を示す。

【図12B】図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、特定の態様に従って、本開示の二重酸化系ウイルス不活性化方法に関する例示的な酸化還元活性金属の比較を示す。

【図12C】図１２Ａ、１２Ｂ、および１２Ｃは、特定の態様に従って、本開示の二重酸化系ウイルス不活性化方法に関する例示的な酸化還元活性金属の比較を示す。

【図13】図１３は、特定の態様に従って、金属の組み合わせが、良好な抗原性を維持しながら、完全な不活性化を達成するために使用され得ることを示す。

【図14A】図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、特定の態様に従って、細菌性形態の改善された維持のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの最適化された不活性化のための本開示の二重酸化フェントン型酸化系の使用を示す。

【図14B】図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、特定の態様に従って、細菌性形態の改善された維持のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの最適化された不活性化のための本開示の二重酸化フェントン型酸化系の使用を示す。

【図14C】図１４Ａ、１４Ｂ、および１４Ｃは、特定の態様に従って、細菌性形態の改善された維持のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの最適化された不活性化のための本開示の二重酸化フェントン型酸化系の使用を示す。

【図15】図１５は、特定の態様に従って、最適化されたＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２式への曝露が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの急速な不活性化をもたらしたことを示す。

【図16A】図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃは、特定の態様に従って、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−Ｃ．ｃｏｌｉが、免疫原性であり、アカゲザル（ＲＭ）を自然獲得Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染症から保護することを示す。

【図16B】図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃは、特定の態様に従って、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−Ｃ．ｃｏｌｉが、免疫原性であり、アカゲザル（ＲＭ）を自然獲得Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染症から保護することを示す。

【図16C】図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃは、特定の態様に従って、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−Ｃ．ｃｏｌｉが、免疫原性であり、アカゲザル（ＲＭ）を自然獲得Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染症から保護することを示す。

【図17A】図１７Ａは、特定の態様に従って、例示的なサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を例示する棒グラフを示し、ここで、２つのデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）特異的中和モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、１５Ａ５および６Ｈ６を使用して、異なる濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４を含む条件下で、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２を用いた不活性化後のウイルス粒子の保持された抗原性を測定した。

【図17B】図１７Ｂは、特定の態様に従って、ウイルス不活性化の速度が、高いＮａ_２ＨＰＯ_４の存在下または不在下で同様であることを示す線グラフを示す。標準的な緩衝液条件は、１０ｍＭのＮａＰＯ_４、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＨ_２Ｏ_２、および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有し、高リン酸条件は、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４［ｐＨ＝７．０］、２％のＤ−ソルビトール、および１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有した。

【図18】図１８は、特定の態様に従って、標準的なＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化条件（２０時間、室温、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、ならびに０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μＭのＣｕＣｌ_２を含有する１１０ｍＭのＮａＣｌ）下で、または高リン酸塩（１５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４）の存在下での標準的な不活性化条件下で調製された精製ＤＥＮＶ４ウイルスを使用したＤＥＮＶ４ワクチンの免疫原性の改善を例示する棒グラフを示す。

【図19A】図１９Ａおよび１９Ｂは、特定の態様に従って、三リン酸ナトリウム（Ａ）およびトリメタリン酸ナトリウム（Ｂ）などの他のリン酸系多原子オキシアニオンが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを示す棒グラフを示す。

【図19B】図１９Ａおよび１９Ｂは、特定の態様に従って、三リン酸ナトリウム（Ａ）およびトリメタリン酸ナトリウム（Ｂ）などの他のリン酸系多原子オキシアニオンが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを示す棒グラフを示す。

【図20A】図２０Ａ〜２０Ｄは、特定の態様に従って、高濃度の無機多原子オキシアニオン、硫酸塩が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを示す。

【図20B】図２０Ａ〜２０Ｄは、特定の態様に従って、高濃度の無機多原子オキシアニオン、硫酸塩が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを示す。

【図20C】図２０Ａ〜２０Ｄは、特定の態様に従って、高濃度の無機多原子オキシアニオン、硫酸塩が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを示す。

【図20D】図２０Ａ〜２０Ｄは、特定の態様に従って、高濃度の無機多原子オキシアニオン、硫酸塩が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを示す。

【図21A】図２１Ａは、特定の態様に従って、異なる形態のリン酸塩（例えば、Ｎａ_２ＨＰＯ_４およびＮａ_３Ｐ_３Ｏ_９）が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２を用いた不活性化中に生物学的に関連する中和エピトープを保護するために組み合わせて使用され得ることを示す。

【図21B】図２１Ｂは、特定の態様に従って、リン酸塩および硫酸塩が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２を用いた不活性化中に生物学的に関連する中和エピトープを保護するために組み合わせて使用され得ることを示す。

【図22】図２２は、特定の態様に従って、リン酸塩（Ｎａ２ＨＰＯ４）およびトリメタリン酸塩などの無機多原子オキシアニオンの添加が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中のチクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）抗原性を改善することを示す。

【図23】図２３は、特定の態様に従って、リン酸塩（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）または硫酸塩（Ｎａ_２ＳＯ_４）などの無機多原子オキシアニオンの添加が、ホルムアルデヒド系ウイルス不活性化中の抗原損傷から保護することを示す。

【図24】図２４は、特定の態様に従って、リン酸塩（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）または硫酸塩（Ｎａ_２ＳＯ_４）などの無機多原子オキシアニオンの添加が、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）を用いたウイルス不活性化中に起こる抗原損傷から保護することを示す。

【図25】図２５は、特定の態様に従って、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）などの無機多原子オキシアニオン添加が、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）を用いたウイルス不活性化中に起こる抗原損傷から保護することを示す。

【図26A】図２６Ａ、２６Ｂ、および２６Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンが、単独および二重酸化系ウイルス不活性化の両方の速度を増強したことを示す。

【図26B】図２６Ａ、２６Ｂ、および２６Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンが、単独および二重酸化系ウイルス不活性化の両方の速度を増強したことを示す。

【図26C】図２６Ａ、２６Ｂ、および２６Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンが、単独および二重酸化系ウイルス不活性化の両方の速度を増強したことを示す。

【図27A】図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンが、二重酸化系細菌性不活性化の速度を増強したことを示す。

【図27B】図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンが、二重酸化系細菌性不活性化の速度を増強したことを示す。

【図27C】図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンが、二重酸化系細菌性不活性化の速度を増強したことを示す。

【図28A】図２８Ａおよび２８Ｂは、特定の態様に従って、メチサゾンが、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持しながら、不活性化速度を増強したことを示す。

【図28B】図２８Ａおよび２８Ｂは、特定の態様に従って、メチサゾンが、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持しながら、不活性化速度を増強したことを示す。

【図29A】図２９Ａ、２９Ｂ、および２９Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンの化学的類似体、またはメチサゾン官能基／下部構造が、二重酸化系ウイルス不活性化中の不活性化および抗原性の維持を増強したことを示す。

【図29B】図２９Ａ、２９Ｂ、および２９Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンの化学的類似体、またはメチサゾン官能基／下部構造が、二重酸化系ウイルス不活性化中の不活性化および抗原性の維持を増強したことを示す。

【図29C】図２９Ａ、２９Ｂ、および２９Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンの化学的類似体、またはメチサゾン官能基／下部構造が、二重酸化系ウイルス不活性化中の不活性化および抗原性の維持を増強したことを示す。

【図30】図３０は、特定の態様に従って、メチサゾンが多原子オキシアニオンと相乗して、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持することを示す。

【図31】図３１は、特定の態様に従って、二重酸化系の遷移金属成分と比較して増加レベルのメチサゾンが、二重酸化系の抗原性および不活性化プロファイルを改善したことを示す。

【発明を実施するための形態】

【0046】

不活性化ワクチンは、医学および獣医学の両方に関するヘルスケアシステムの重要な成分を表すが、不活性化の先行技術プロセスは、標的病原体（例えば、ウイルス性および細菌性）の重要な抗原性エピトープに損傷を与え、ワクチンにおける最適以下の応答およびワクチン効能の低減をもたらす。

【0047】

本発明の特定の態様は、フェントン型化学を伴う開示された二重酸化手法の文脈において含む、高濃度の無機多原子オキシアニオン（例えば、標準的なリン酸緩衝生理食塩水反応条件下で、病原体を化学的不活性化剤（複数可）のみと接触させることによって保持される病原体免疫原性と比較して、病原体免疫原性の保持を増強するのに十分なレベル）を使用する代替的な手法を提供することによってこの問題を回避する。無機多原子オキシアニオンを使用して同様の保護結果が見られ、ここで、化学的不活性化剤は、１つ以上の化学的酸化剤、アルキル化剤、または架橋剤、例えば、過酸化水素、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）、エチレンイミン（ＥＩ）、またはバイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）のうちの１つ以上であった。フェントン型酸化反応は、酸化副産物を形成するために過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）と組み合わせた酸化還元活性遷移金属（例えば、Ｃｕ、Ｆｅ、Ｃｓなど）の使用を必要とし、微生物不活性化をもたらす。

【0048】

加えて、本開示の方法において、高濃度の無機多原子オキシアニオンも、メチサゾン試薬と相乗して、病原体不活性化の速度をさらに増加しながら、ワクチン産生の目的のための免疫原性のよりさらに改善された保持を含む。

【0049】

本開示の先端フェントン型二重酸化プロセスは、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ（例えば、Ｃ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、およびＬｉｓｔｅｒｉａ（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を含む３つの例示的な細菌（グラム陽性およびグラム陰性の例の両方であり、全てＤＮＡゲノムを有する）、ならびにワクチン標的として４つの関連しないウイルス科（例えば、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、科：Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、属：Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）、デング熱ウイルス血清型１〜４（ＤＥＮＶ１、ＤＥＮＶ２、ＤＥＮＶ３、ＤＥＮＶ４）および黄熱ウイルス（ＹＦＶ）、科：Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ＶＶ、科：Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、属：Ｏｒｔｈｏｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ならびにインフルエンザウイルス（科：Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、属：ＩｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓＡ））における８個のウイルス（７つのＲＮＡゲノムウイルスおよび１つのＤＮＡゲノムウイルス）を含む、ＲＮＡまたはＤＮＡゲノムのいずれかを有する病原体に成功裏に適用され、ここで、単純な（例えば、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）のみ）酸化が最適以下であることが見出された。ＣＨＩＫＶ、ＤＥＮＶ、およびＹＦＶに関して、感受性中和エピトープで配向されるモノクローナル抗体に基づいて、ウイルス特異的ＥＬＩＳＡ試験を通してインビトロ抗原性を評価した。ウイルス性タンパク質機能の直接的な測定である、赤血球凝集活性（ＨＡ）を通してインフルエンザに関する抗原性を評価した。ワクチン接種後、中和抗体力価（ＣＨＩＫＶ、ＤＥＮＶ、およびＹＦＶ）または赤血球凝集抑制（ＨＡＩ、インフルエンザ）応答などの、機能的体液免疫アッセイを通してワクチン抗原のインビボ増強を評価した

【0050】

本開示の二重酸化に基づく不活性化条件、および特に高レベルの無機多原子オキシアニオンの使用をさらに含むものが、例えば、Ｈ_２Ｏ_２のみと比較すると、インビトロ抗原性の維持を増強すると成功裏に実証され、ＣＨＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＹＦＶ、およびインフルエンザに関して、二重酸化に基づく不活性化手法は、高い抗原性、ならびに完全なウイルス不活性化を実証した。これらのワクチンをインビボで試験すると、それらは、標準的なＨ_２Ｏ_２に基づく不活性化条件で達成されたのと同等またはそれより優れた抗ウイルス性免疫応答（例えば、免疫原性）、およびいくつかの事例においては、生ウイルスで見られるのと同等またはそれよりも良好な抗ウイルス性免疫応答を提供した。故に、フェントン型化学を使用して行われた二重酸化は、ワクチン接種後、抗原性特性を維持し、免疫応答を増強しながら、ロバストな病原体不活性化を提供した。

【0051】

フェントン型反応
フェントン型化学的反応は概して、（例えば、Ｂａｒｂｕｓｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｆｅｎｔｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｙ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００９．１６（３）：ｐ．３４７−３５８、フェントン型反応物質および反応に関連するその教示に関して、その全体で本明細書に組み込まれる）以下の化学式を使用して記載される。

【数1】

【0052】

等式１において、Ｍは、Ｈ_２Ｏ_２と相互作用し得る遷移金属である。この反応は、Ｈ_２Ｏ_２の分解をもたらし、ヒドロキシルイオン（ＨＯ⁻）および高度に反応性であるヒドロキシルラジカル（ΗΟ・）の産生をもたらす。ＦｅおよびＣｕなどのある特定の遷移金属だけが、酸化還元活性があると見なされ、この反応を効率的に促進できることに留意されたい。完全な反応において、金属イオンは、Ｈ_２Ｏ_２との追加の反応を通して、その元の酸化状態に戻され、金属イオンを真の触媒（Ｉｄ）にする。例として、Ｃｕ^２＋との全体の反応は、以下のように書くことができる。

【数2】

【0053】

等式２において、Ｈ_２Ｏ_２は、Ｃｕ^２＋をＣｕ^＋に低減する低減薬剤として作用する。等式３において、同様に、Ｃｕ^＋は、Ｈ_２Ｏ_２を低減し、反応性ヒドロキシルラジカルの産生をもたらし、Ｃｕ^２＋酸化状態に戻し、触媒作用の後のラウンドを可能にする。記載されるように、フェントン型反応（Ｉｄ）中に起こる追加の副反応がある場合がある。

【0054】

フェントン型酸化の先行技術の使用は、広範囲にわたる滅菌および病原体除染系としての使用のみであった。
上述の通り、本開示の前の出願者の米国特許第８，１２４，３９７号および同第８，７１６，０００号の前のＨ_２Ｏ_２の他に比を見ない殺菌性物質の使用に関する事例と同様に、フェントン型反応は、当該技術分野において、微生物病原体の不活性化／滅菌に関してのみ知られていた（例えば、Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｌ．Ｂ．Ｒｏｕｔｓｏｎ，ａｎｄ Ｃ．Ｄ．Ｌｙｔｌｅ，Ｖｉｒｕｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｐｐｅｒ ｏｒ ｉｒｏｎ ｉｏｎｓ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄｅ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３．５９（１２）：ｐ．４３７４−６、Ｎｉｅｔｏ−Ｊｕａｒｅｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＳ２ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ ｉｎ Ｆｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｎｔｏｎ−ｌｉｋｅ ｓｙｓｔｅｍｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔａｌｓ，ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｓｕｎｌｉｇｈｔ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０．４４（９）：ｐ．３３５１−６を参照されたい）。

【0055】

例えば、フェントン型酸化は、強力な抗菌プラットホームとして複数の基によって認識されている。ＦＤＡ研究者は、まず、医療デバイスの滅菌における使用を具体的に目的とする抗菌手法としてフェントン型反応の組織的研究を詳述した（Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｅｔａｌ−ｂａｓｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２．５８（９）：ｐ．３１５７−６２）。モデル病原体としてフニンウイルス（ｓｓＲＮＡ、属：アレナウイルス）を使用すると、急速な不活性化が観察され、レドックス反応（等式１）における触媒としてＦｅ^３＋およびＣｕ^２＋の両方は、最適化後の標準的な滅菌手法（２％のグルタルアルデヒド）としても良好に作用した。当時の作者により記述されているように、これらの金属のいずれかの使用が、正常なヒト血清が、比較的多量のＦｅおよびＣｕの両方を含有することを考慮すると、医療用には特に優良であった。例えば、正常な対象における総血清Ｃｕレベルは、７００〜１５００μｇ／Ｌ（１１〜２４μＭ）の範囲にあるが（ＭｃＣｌａｔｃｈｅｙ，Ｋ．Ｄ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２ｎｄ ｅｄ．２００２，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．ｘｉｖ，ｐ．４５２）、Ｆｅレベルは、５００〜１７００μｇ／Ｌ（９〜３０μΜ）の範囲にある（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．，Ｎｕｒｓｉｎｇ．Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ．Ｎｕｒｓｉｎｇ．２００８，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ．ｖｉｉ，ｐ．１３）。この同じ研究グループは、Ｃｕ系フェントン反応をさらに展開し続け、φΧ１７４バクテリオファージ（ｓｓＤＮＡ）、Ｔ７バクテリオファージ（ｄｓＤＮＡ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ、ｄｓＤＮＡ）、およびφ６バクテリオファージ（ｄｓＲＮＡ）などの複数のウイルス性標的に対する抗菌活性を実証した（Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｌ．Ｂ．Ｒｏｕｔｓｏｎ，ａｎｄ Ｃ．Ｄ．Ｌｙｔｌｅ，Ｖｉｒｕｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｐｐｅｒ ｏｒ ｉｒｏｎ ｉｏｎｓ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄｅ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３．５９（１２）：ｐ．４３７４−６）。Ｈ_２Ｏ_２／Ｃｕ^２＋系（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１６μΜのＣｕ^２＋）を使用するＨＳＶを用いた追加の研究により、急速な不活性化が確認され、核酸の直接的な酸化は、ウイルス不活性化を確証することが提示され（Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１９９７．４１（４）：ｐ．８１２−７）、確認研究により、核酸に対するＣｕ^２＋の高親和性（Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｐ．Ｌ．Ｇｏｅｒｉｎｇ，ａｎｄ Ａ．Ｌａｍａｎｎａ，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｂｙ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔａｌｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９１．１１０（３）：ｐ．４７７−８５）および核酸内の鎖切断を誘導するＨ_２Ｏ_２／Ｃｕ^２＋系の能力が実証された（Ｔｏｙｏｋｕｎｉ，Ｓ．ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ８−ｈｙｄｒｏｘｙ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｐｐｅｒ ａｎｄ ｉｒｏｎ，ｉｎ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ”Ｍｅｄ．１９９６：Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，ｐ．８５９−６４）。いくつかの他のグループも、Ｈ_２Ｏ_２／Ｃｕ^２＋系の病原体不活性化の潜在性を実証した。Ｎｉｅｔｏ−Ｊｕａｒｅｚらは、５０μΜのＨ_２Ｏ_２（０．０００１７％）および１μΜのＣｕ^２＋を使用してＭＳ２バクテリオファージ（ｓｓＲＮＡ）の急速な不活性化を実証し、作者は、排水除染に関してその潜在性を提示した（Ｎｉｅｔｏ−Ｊｕａｒｅｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＳ２ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ ｉｎ Ｆｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｎｔｏｎ−ｌｉｋｅ ｓｙｓｔｅｍｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔａｌｓ，ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｓｕｎｌｉｇｈｔ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０．４４（９）：ｐ．３３５１−６）（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｕｐｒｉｃ ｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈ２Ｏ２：ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｎｔｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ、２０１３．４７（２３）：ｐ．１３６６１−７も参照されたい）。

【0056】

結果的に、これらの先行技術研究は、除染の文脈において厳密であり、Ｈ_２Ｏ_２／Ｃｕ^２＋系がモデル病原体を効率的に死滅／滅菌できることで知られていたことを実証するだけである。

【0057】

Ｈ_２Ｏ_２を用いた単純な酸化は、ある特定の病原体標的でワクチン免疫原性を限定した。
出願者は、以前より、単純な酸化剤としてのＨ_２Ｏ_２の単独使用が、多様なワクチン候補のための好適な不活性化薬剤を提供することを示している（例えば、米国特許第８，１２４，３９７号および同第８，７１６，０００号）。

【0058】

しかしながら、Ｈ_２Ｏ_２のみを用いた酸化の継続的な開発において、不活性化プロセス中、抗原性および免疫原性が低減されたある特定の病原体を用いた事例が偶然にも発生した。例えば、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）ワクチン候補の最近の初期段階の開発において、本明細書で呈示されるように、実施例１の作業中、標準的な条件下で３％のＨ_２Ｏ_２を用いた処理が、中和エピトープを破滅し、エンベロープ特異的ＭＡｂｓを使用するインビトロ効能試験により判断されるように抗原性のほぼ完全な損失をもたらしたことが見出された（図２Ａ）。Ｈ_２Ｏ_２で不活性化されたＣＨＩＫＶで免疫化された動物が、測定可能な中和抗ウイルス性抗体応答を開始できなかったため、測定された抗原性のこの損失は、インビボ免疫原性に対して著しい関係を有した（図２Ｂ）。

【0059】

二重酸化系微生物不活性化がＨ_２Ｏ_２のみでの単純な酸化とは根本的に異なる機構を有することが出願者によって見出され、したがって、先端的な有効なワクチン抗原の開発のための二重酸化系微生物不活性化の潜在的使用は当初は推奨されなかった。
フェントン型反応が病原体を死滅させるためのみに先行技術で使用されており、ワクチンの開発に使用されておらず、その使用も提案されていない一方で、出願者は、それでもなお、実施例２で本明細書に示されるように、ワクチン産生の目的のために微生物病原体を不活性化する潜在性についてかかる反応を試験した。Ｈ_２Ｏ_２とは対照的に、不活性化手順中の溶液の総タンパク質濃度がＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化不活性化速度に影響を及ぼすことが見出されたため、初期の不活性化データは、驚くべきことであり、予想外であった。タンパク質濃度は、出願者の標準的なＨ_２Ｏ_２手法を使用してウイルス不活性化に影響を及ぼさないことが以前に示された。ＤＥＮＶ２について図１Ａおよび１Ｂに示されるように、二重酸化手法を使用して、タンパク質濃度は、ウイルス不活性化速度に実質的に影響を及ぼし、より高いタンパク質レベルがより遅いウイルス不活性化をもたらした。

【0060】

二重不活性化中の溶液の総タンパク質濃度における予想外の依存性は、出願者の以前の単純な（例えば、Ｈ_２Ｏ_２のみを用いる）酸化に基づく方法（例えば、米国特許第８，１２４，３９７号および同第８，７１６，０００号）におけるようなＨ_２Ｏ_２のみと比較して根本的に異なる機構が関与しており、故に、効果的なワクチン産生のための二重酸化に基づく不活性化手順の効能／使用が全体的に疑わしく、予想不可能であることを示した。

【0061】

異なるタンパク質濃度依存性機構の発見にかかわらず、それでもなお出願者は、フェントン型二重酸化反応が驚くべきことに、微生物病原体を効果的に不活性化し、高度に免疫原性であり効果的なワクチンを提供するために使用され得ることを示すために、本明細書で考察され、以下の実施例に含まれる追加の実験を行った。

【0062】

先端ワクチン抗原の開発における二重酸化に基づく不活性化
フェントン型酸化（例えば、Ｈ_２Ｏ_２／Ｃｕ^２＋系）は、当該技術分野において、ワクチンの開発のために使用されていなかったか、または使用を提案されていなかった。根本的に異なる機構が関与していた（すなわち、タンパク質濃度依存性）という出願者の発見にかかわらず、それでもなお出願者は、ＣＨＩＫＶに対するワクチン候補の開発におけるこの系の有用性を探求し、それは、この標的が、標準的なＨ_２Ｏ_２不活性化手法を使用する中和抗体の誘導無しに、乏しい免疫原性を実証していたためである（図２Ａおよび２Ｂ）。

【0063】

この系のみの各成分（Ｈ_２Ｏ_２またはＣｕＣｌ_２、Ｃｕ^２＋イオンの源）をまず、適切な抗原性を維持しながら、ウイルスを完全に不活性化するそれらのそれぞれの能力について評価した。抗原性は、特定のウイルス中和エピトープに結合するモノクローナル抗体を使用して、ウイルス表面上の無傷のタンパク質エピトープを測定する能力によって定義される。あるいは、構造抗原性も、インフルエンザウイルスの赤血球凝集活性を測定するために使用されるものなどの、生理学的タンパク質機能／結合アッセイによって定義され得る。ＣＨＩＫＶに結合するモノクローナル抗体に基づく抗原性結果は、実施例３で本明細書に示される。

【0064】

除染試薬（図３Ａおよび３Ｂ）のいずれかの濃度の増加が、不活性化の増強をもたらしたが、代わりに中和エピトープの損傷に起因して抗原性は著しく低下した。

【0065】

驚くべきことに、対照的に、結合Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系を使用して、完全なウイルス不活性化をもたらすと同時に抗原性を完全に維持した最適な不活性化条件が特定された（図３Ｃ）。

【0066】

ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種は、急速でロバストな中和抗体力価をもたらし、関節炎症性疾患からの完全な保護を実証した。
Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で処理したＣＨＩＫＶ候補の免疫原性を評価するために、ワクチン抗原をミョウバンアジュバントとともに配合し、複数回用量レベル（動物当たり１０または４０μｇ）でマウスを免疫化するために使用した。実施例４で本明細書に示されるように、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種は、急速でロバストな中和抗体力価をもたらし（図４）、関節炎症性疾患からの完全な保護を実証した（図５）。

【0067】

Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系酸化は、不活性化ＹＦＶワクチンの開発において成功裏に使用された。
ＣＨＩＫＶ、モデルアルファウイルスを用いて実証された有望な結果に基づいて、ＹＦＶなどのフラビウイルスに対するこの系の有用性が探求された。

【0068】

実施例５で本明細書に示されるように、予備的分析は、０．００２％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２の濃度が、抗原性と急速なウイルス不活性との間の機能的バランスを表したことを提示した（図６Ａ）。０．１０％のＨ_２Ｏ_２および１μＭのＣｕＣｌ_２（完全な不活性化を確実にするため）のさらに最適化された条件を使用して、ＹＦＶ用のワクチン材料を産生し、成体ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。ワクチン接種後、全ての動物は、Ｈ_２Ｏ_２のみを使用して調製されたＹＦＶワクチンで免疫化された動物に関する４０未満の中和力価と比較して、２４０の平均中和力価で測定可能な中和力価を示した（図６Ｂ）。ワクチン接種後の免疫原性におけるこれらの差異は、ＹＦＶが３％のＨ_２Ｏ_２で２０時間処理されたときに観察される中和エピトープ（すなわち、抗原性）に対する重度の損傷に基づいて予測され得る。図６Ａおよび６Ｂは、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系酸化が不活性化ＹＦＶワクチンの開発において成功裏に使用されたことを示す。

【0069】

Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系酸化は、不活性化ＤＥＮＶワクチンの開発において成功裏に使用された。
ＹＦＶ、別のモデルフラビウイルスを用いて実証された有望な結果に基づいて、デング熱３（ＤＥＮＶ３）をＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系で試験した。

【0070】

実施例６で本明細書に示されるように、ＹＦＶを用いた初期の試験は、０．００２％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２濃度が、高い抗原性を維持すると同時に、完全なウイルス不活性化も提供するための最適な手法を表したことを示した（図７）。これらの予備的なＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化条件を使用して、各ＤＥＮＶ血清型のワクチンロットを産生し、０．１０％の水酸化アルミニウムでアジュバント化された四価のデング熱ワクチン中に配合し、成体アカゲザルを免疫化するために使用した。単一の追加免疫化後、全てのサルが、４つのデング熱ウイルス血清型のうちの３つに関して中和抗体応答の改善およびＨ_２Ｏ_２のみでの不活性化と比較して幾何平均力価の平均８倍の増加を実証したＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化手法で血清転換した（ＮＴ_５０≧１０）（図８）。これらの研究において抗原用量にわずかな差異（１μｇ／血清型対２μｇ／血清型）があるため、同じ用量の四価のデング熱ワクチン抗原でワクチン接種されたマウスにおいて実験を繰り返した（図９）。

【0071】

これらの実験において、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化の二重酸化手法は、４つ全てのデング熱ウイルス血清型に関して３％のＨ_２Ｏ_２よりも免疫原性であり、中和抗体力価においては８倍〜８００倍超の増加をもたらした。

【0072】

ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２系酸化は、インフルエンザウイルスで抗原性の改善を実証した。
２つのウイルス科（ＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅおよびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）にわたって観察された肯定的な結果を考慮して、この新しい不活性化プラットホームを使用して試験するための追加のウイルス科を選択した。

【0073】

実施例７で本明細書に示されるように、標準的な３％のＨ_２Ｏ_２手法、紫外線不活性化、または最適化されたＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２系（０．００２％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２）を使用してインフルエンザＡウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科）の不活性化を試験した。抗原性を評価するために、赤血球凝集活性（ＨＡ）滴定アッセイを使用した。インフルエンザウイルスは、赤血球を自然に凝集させ、不活性化中のこの活性の維持は、最終ワクチン産物の免疫原性にとって重要であると見なされる。図１０に示されるように、出願者のＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２系は、未処理の生抗原に関して観察されるのと同様のＨＡ力価を維持した。比較により、ＵＶ不活性化は、ＨＡ活性を無視し得るレベルまで低減させた。このＨＡ破壊のインビボ結果は、図１１で見ることができ、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２は、ロバストな保護血清抗体赤血球凝集素抑制（ＨＡＩ）力価を誘導するが、ＵＶで処理された抗原は、マウスにおいて機能的抗体を誘導せず、致死的攻撃からの最小保護を誘導した。

【0074】

複数の遷移金属は、ワクチン抗原開発に対する二重酸化手法で使用され得る。
（ＣｕＣｌ_２の形態の）Ｃｕ^２＋は、ＣＨＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＹＦＶ、およびインフルエンザウイルスに関して記載される二重酸化ワクチン抗原開発研究で試験された初期の金属であった。しかしながら、上述されるように、他の金属も同様の様式で機能に対する潜在性を有する。

【0075】

実施例８で本明細書に示されるように、モデルウイルスとしてＤＥＮＶ３を使用して、ＣｕＣｌ_２（Ｃｕ^２＋）、ＦｅＣｌ_３（Ｆｅ^３＋）、またはＣｓＣｌ（Ｃｓ^＋）、およびＨ_２Ｏ_２の希釈液からなる不活性化研究を、ワクチン抗原の開発におけるそれらの潜在性について試験した。

【0076】

図１２Ａ〜１２Ｃに示されるように、３つ全ての金属は、高レベルの抗原性を維持した条件を提供すると同時に、完全なウイルス不活性化を示した。

【0077】

遷移金属の組み合わせは、二重酸化ワクチン系における相乗効果を実証する。
上記の図１１および実施例８に示されるように、異なる金属は、ウイルスのＨ_２Ｏ_２不活性化を増強するために組み合わせて使用され得る。

【0078】

実施例９で本明細書に示されるように、潜在的な相乗効果を調査するために、ＤＥＮＶ３モデルウイルスをＨ_２Ｏ_２（０．０１％）の設定量でＣｕＣｌ_２（Ｃｕ^２＋）およびＦｅＣｌ_３（Ｆｅ^３＋）の組み合わせで活性化した。いくつかのＣｕＣｌ_２／ＦｅＣｌ_３条件は、良好な抗原性を維持しながら完全な不活性化を提供し、これは、同じ不活性化条件で複数の金属を使用することが実行可能であることを実証する（図１３）。確かに、０．０５μΜおよび０．１０μΜのＣｕＣｌ_２濃度で、ＦｅＣｌ_３濃度が増加すると、抗原性が増強し、これは、これら２つの金属との相乗効果を示す。

【0079】

細菌性形態の改善された維持のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの最適化された不活性化を提供するために二重酸化を使用した。
実施例１０で本明細書に示されるように、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは、典型的には直径約０．２μｍおよび長さ約２〜８μｍの小さならせん形状細菌である（図１４Ａ）。

【0080】

標準的な３％のＨ_２Ｏ_２溶液を用いた室温での５時間の不活性化後、細菌に形態が明白に変化するように実質的に損傷を与え、これには、総細胞構造および実質的な集塊の損失が含まれる（図１４Ｂ）。

【0081】

しかしながら、０．０１％のＨ_２Ｏ_２および２μΜのＣｕＣｌ_２を使用して二重酸化手法を最適化する際に、出願者は、驚くべきことに、二重酸化が、未処理の対照とは区別不能なままであった微生物での処理期間を通じて優れた細菌性形態を維持しながら、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ（Ｃ．ｃｏｌｉ）を完全に不活性化し得ることを見出した（図１４Ｃ）。

【0082】

保持された構造に加えて、不活性化全細胞ワクチンを調製するために必要不可欠なパラメータは、完全な微生物不活性化を確実にすることである。上述される最適な条件を使用して、不活性化速度研究を行った。図１５に示されるように、Ｃ．ｃｏｌｉは、約１５分の減衰率半減期（Ｔ_１／２）とともに急速な不活性化を実証した。これらの速度は、全２０時間の不活性化期間中の２０ログ超の不活性化を示す。パイロット製造ロットにおける細菌性力価（約１０^９ＣＦＵ／ｍＬ）に基づいて、このレベルの不活性化は、全体の細菌性構造を依然として維持しながら、製造プロセス中、高い安全マージン（最大１億倍の理論上の過剰不活性化）を提供した（図１４Ｃ）。

【0083】

ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−Ｃ．ｃｏｌｉワクチン接種は、アカゲザルにおいて保護免疫を提供した。
実施例１１で本明細書に示されるように、出願者は、２つの野外シェルタードハウジング群からの６０匹のＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−Ｃ．ｃｏｌｉで免疫化されたアカゲザルにおけるワクチン効能を決定し、次いで、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ培養により感染が確認された腸の疾患に関して動物を監視した。

【0084】

この研究に関して、（０．０１％のＨ_２Ｏ_２および２μΜのＣｕＣｌ_２を使用して不活性化された）ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−Ｃ．ｃｏｌｉワクチン候補で、動物を筋肉内ワクチン接種し、追加免疫用量を６ヶ月後に投与した。病歴に基づいて、ワクチン接種された群を選択し、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染症の歴史的に高い発生率を有した群を好ましいとした。この手法は、保護効能を評価する上で増加したロバスト性を提供した。全ての成体／若年期（ｎ＝５９）は、４０μｇのミョウバンでアジュバント化された用量を受け、２匹の乳児（体重２Ｋｇ未満）は、半分の用量（２０μｇ）を受けた。プロトコルに従って、ワクチン接種後の最初の１４日間にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連下痢と診断されたいずれの動物も、ワクチン媒介性保護がこの初期期間中に起こる可能性が低いため排除される。ワクチン接種後その日にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連下痢に起因して研究からある成体動物を排除した。血清試料を、一次ワクチン接種後０日目および６ヶ月目に全ての残りのワクチン接種された動物（ｎ＝５９）から収集し、この時点で、動物は、追加免疫用量のワクチンを受けた。

【0085】

一次ワクチン接種後、出願者は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連下痢性疾患からの保護に加えて、同じシェルター群（図１６Ｂ、Ｐ＝０．０３８）内の過去の数年と比較して、または２０１５年のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒシーズン中の他のシェルター群（図１６Ｃ、Ｐ＝０．０２０）と比較して、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ特異的血清抗体力価（図１６Ａ、Ｐ＜０．００１）の著しい増加を観察した。ＮＨＰの健康は毎日監視され、下痢性疾患は、検索可能中央データベースにおいて文書化される。ワクチン接種されたコホート内で下痢発生率を監視し、他の同様のシェルター群においておよそ１，０００匹のワクチン接種されていない対照動物と比較した。糞便試料を下痢症状の発現を経験している任意の動物から収集し、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ種について試験したが、それは、これらが動物における下痢に関連付けられる主な腸の病原体を表すためである。

【0086】

一次ワクチン接種後６ヶ月時点の中間分析は、ワクチン接種されていない動物におけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連下痢の７６の症例に対して、ワクチン接種された群におけるＣ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉ関連下痢の症例を示し、これは、単一のワクチン接種後のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ培養陽性下痢性疾患（Ｐ＝０．０３５）に対する統計的に有意な保護効果を表す。

【0087】

ほぼ全てのヒトワクチンが最適な保護効能のために少なくとも２回分の用量を必要とし、免疫記憶の耐久性が追加免疫ワクチン接種後にしばしば改善されるため、出願者は、保守的な手法に続いて、６ヶ月時点で追加免疫ワクチン接種を施し、次いで、ＮＨＰにおける下痢性疾患の発生率を監視し続けた。一次ワクチン接種の２５０日後、ワクチン接種されていない集団においてより多くのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連の腸疾患の症例が発生し続けた（８．７％または合計９２匹の動物に達する）一方で、ワクチン接種されたコホートにおける動物のいずれも（０／５９）疾患の徴候を示さず、２つの群間の統計的有意性はＰ＝０．０２０に増加した。

【0088】

高リン酸塩濃度は、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中にデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）抗原性を維持すると同時に、急速なウイルス不活性化速度を示した。
驚くべきことに、出願者は、高濃度の無機多原子オキシアニオンが、フェントン試薬（複数可）（例えば、過酸化水素および塩化銅の組み合わせ（Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２））での不活性化中の病原体の抗原性エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0089】

本明細書に示されるように、実施例１２では、デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を使用して、Ｎａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］の増加濃度（例えば、２５、５０、７５、１００、１５０、２５０、５００、７５０、および１５００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４）が、室温で２０時間にわたるＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２条件を使用したウイルス不活性化中の抗原損傷から保護したことを示した。従来の／標準的な条件（Ｓｔｄ．、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］を含む）下で、ウイルス上の中和エピトープが不活性化中に実質的に損傷されたが、これらのエピトープは、不活性化が高濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４（例えば、２５、５０、７５、１００、１５０、２５０、５００、７５０、および１５００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４）の存在下で行われた場合に損傷から保護された。

【0090】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図１７Ａに示される。標準的な不活性化条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］を含む）は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、Ｎａ_２ＨＰＯ_４の増加濃度の存在下で不活性化されたウイルスは、完全なウイルス不活性化をもたらし、ＥＬＩＳＡシグナルの増加を示し、天然抗体結合部位の保持の改善および抗原組成の改善を示した。

【0091】

図１７Ｂに示されるように、高リン酸塩濃度の存在下でさえも、ウイルス不活性化速度は急速であり、不活性化ワクチンを調製するためのこの無機多原子オキシアニオン手法の実現可能性を示した。

【0092】

出願者は、ｐＨを７．０〜８．０のｐＨの範囲に変動させてもウイルス不活性化速度に著しく影響しなかったことも決定した。点線は、検出の限界を示す。

【0093】

高リン酸塩濃度を伴う条件下での不活性化がワクチン免疫原性を改善する
驚くべきことに、出願者は、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で不活性化されたウイルスの免疫原性が高濃度のリン酸塩の存在下での不活性化によって改善されることも見出した。

【0094】

本明細書に示されるように、実施例１３では、マウスは、標準的な条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬと定義される）下で、または選択された高リン酸塩不活性化条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．０］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬ）下で、室温で２０時間にわたって、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンで免疫化された。

【0095】

例示的なワクチン研究の結果が図１８に示される。標準的な不活性化技法を使用して調製されたワクチンが群平均ＮＴ_５０力価＝１６０をもたらした一方で、高リン酸条件下で調製されたＤＥＮＶ４ワクチンは、群平均ＮＴ_５０力価＝７４７を引き起こし、中和抗体の４．７倍の増加を表す。これらの結果は、高リン酸塩を含有する不活性化条件がインビトロで抗原性の改善を示したことを示し（図１７Ａおよび１７Ｂ）、インビボで実質的に改善されたワクチン媒介性免疫応答も提供する。

【0096】

複数のリン酸塩系無機多原子オキシアニオンが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中の抗原損傷から保護する
驚くべきことに、出願者は、高濃度の他のリン酸塩系無機多原子オキシアニオンが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２の組み合わせでの不活性化中の病原体の生物学的に関連する中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0097】

本明細書に示されるように、実施例１４では、ＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡが、実施例１２に記載される通りであるが、標準的な条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬと定義される）下で、または０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．５、３、１０、１５、もしくは３０ｍＭの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．５、３、１０、１５、３０、もしくは６０ｍＭのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）を含む代替的な無機リン酸塩系多原子オキシアニオン源の存在下にて標準的な条件下で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４を使用して行われた。Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化の２０時間後、試料がカタラーゼで処理されて、残留Ｈ_２Ｏ_２を除去し、次いで、連続１０倍希釈し、５０ＰＦＵ／ｍＬの検出限度で、ベロ細胞上でプラークアッセイにより生ウイルスについて試験された。

【0098】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図１９に示され、これは、三リン酸ナトリウム（図１９Ａ）およびトリメタリン酸ナトリウム（図１９Ｂ）などの他の無機リン酸塩系多原子オキシアニオンがＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護したことを示す棒グラフを示す。

【0099】

標準的な不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、ウイルスが高濃度の三リン酸ナトリウム（図１９Ａ）またはトリメタリン酸ナトリウム（図１９Ｂ）のいずれかの存在下で完全に不活性化されると同時に、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加も示した例がいくつか存在する。

【0100】

硫酸塩は、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中に抗原性を改善する別の無機多原子オキシアニオンを代表する。
驚くべきことに、出願者は、硫酸塩などの高濃度の非リン酸塩無機多原子オキシアニオンがＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中の中和エピトープの維持を改善することも見出した。

【0101】

本明細書に示されるように、実施例１５では、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡは、実施例１２に記載される通りであるが、ＳＯ_４^２−多原子オキシアニオン源として硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）の存在下または不在下で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４を使用して行われた。比較のために、不活性化実験も単原子陰イオン源のみとして塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を用いて行われた。

【0102】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図２０Ａ〜２０Ｄに示され、これらは、高濃度の無機多原子オキシアニオン、硫酸塩が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを例示する。精製されたＤＥＮＶ４は、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌからなる標準的な（Ｓｔｄ．）緩衝液条件下で、室温で２０時間、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２（０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２で不活性化され、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡによる抗原性の保持について試験された。これらの標準的な不活性化条件は、（図２０Ａ）硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）の増加濃度、（図２０Ｂ）硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）の増加濃度のいずれかで補完され、より高い濃度の硫酸塩が抗原性の改善に対応した。対照的に、単原子陰イオン（Ｃｌ⁻）源として異なる濃度の（図２０Ｃ）塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）または（図２０Ｄ）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の添加は、抗原性には保護効果を示さなかった。不活性化後、試料は、残留生ウイルスについて試験された。完全なウイルス不活性化（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示した試料は、棒上に（−）を有し、残留感染性ウイルスを示した試料は、棒上に（＋）で示される。破線は、標準的な不活性化条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、ならびに０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有する１１０ｍＭのＮａＣｌ、室温で２０時間）下で観察されたＥＬＩＳＡシグナルを示す。

【0103】

したがって、標準的な不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、高濃度の硫酸ナトリウム（図２０Ａ）または硫酸マグネシウム（図２０Ｂ）のいずれかの存在下で不活性化されたウイルスが完全なウイルス不活性化をもたらすと同時に、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加も示した例がいくつか存在する。塩化マグネシウム（図２０Ｃ）または塩化ナトリウム（図２０Ｄ）などの単原子陰イオンの増加濃度の存在下で行われた不活性化実験は、保護効果または抗原性の改善を示さない。

【0104】

無機多原子オキシアニオンの組み合わせは、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中に抗原性を改善した
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンの混合物が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中の中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0105】

本明細書に示されるように、実施例１６では、ＥＬＩＳＡは、実施例１２に記載される通りであるが、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）およびトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）の多様な組み合わせ、またはリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）および硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）の多様な組み合わせの存在下で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行われた。

【0106】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図２１Ａおよび２１Ｂに示される。

【0107】

具体的に、図２１Ａは、異なる形態のリン酸塩（例えば、Ｎａ_２ＨＰＯ_４およびＮａ_３Ｐ_３Ｏ_９）を組み合わせて使用して、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中に生物学的に関連する中和エピトープを保護することができることを示す。

【0108】

具体的に、図２１Ｂは、リン酸塩および硫酸塩を組み合わせて使用して、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中に生物学的に関連する中和エピトープを保護することができることを示す。

【0109】

したがって、標準的な不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウム／三リン酸ナトリウム（図２１Ａ）または高濃度のリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム（図２１Ｂ）のいずれかの存在下で完全に不活性化されると同時に、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加も示した例がいくつか存在する。

【0110】

無機多原子オキシアニオンが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中のチクングニア熱ウイルスの抗原損傷から保護する
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンが、追加のウイルスモデルを使用してＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中の中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0111】

本明細書に示されるように、実施例１７では、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）特異的サンドイッチＥＬＩＳＡが行われた。

【0112】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図２２に示され、これは、リン酸塩（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）およびトリメタリン酸塩などの無機多原子オキシアニオンの添加が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中のチクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）抗原性を改善することを示す。

【0113】

したがって、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、感染性ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウム／トリメタリン酸塩の存在下で完全に不活性化されたが、これらの試料は、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。

【0114】

無機多原子オキシアニオンが、ホルムアルデヒドでの不活性化中に起こる抗原損傷から保護する
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンがホルムアルデヒドでの不活性化中の中和エピトープの維持を改善することも見出した。

【0115】

本明細書に示されるように、実施例１８では、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡは、実施例１２に記載される通りであるが、高濃度のリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）または硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）の存在下または不在下で、ホルムアルデヒド（ＣＨ_２Ｏ）で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行われた。

【0116】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図２３に示され、これは、リン酸塩（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）または硫酸塩（Ｎａ_２ＳＯ_４）などの無機多原子オキシアニオンの添加が、ホルムアルデヒド系ウイルス不活性化中の抗原損傷から保護することを示す。

【0117】

したがって、標準的なホルムアルデヒドに基づく不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、感染性ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウムまたは硫酸ナトリウムのいずれかの存在下で完全に不活性化されたが、試料のうちの多くは、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。

【0118】

無機多原子オキシアニオンが、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）不活性化中の抗原損傷から保護する
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンが、ＢＰＬでの不活性化中の中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0119】

本明細書に示されるように、実施例１９では、ＥＬＩＳＡは、実施例１２に記載される通りであるが、高濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４またはＮａ_２ＳＯ_４の存在下または不在下で標準的なＢＰＬ不活性化手法で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行われた。

【0120】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図２４に示され、これは、リン酸塩（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）または硫酸塩（Ｎａ_２ＳＯ_４）などの無機多原子オキシアニオンの添加が、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）でのウイルス不活性化中に起こる抗原損傷から保護することを示す。

【0121】

したがって、標準的なＢＰＬに基づく不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、感染性ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウムまたは硫酸ナトリウムのいずれかの存在下で完全に不活性化されたが、試料のうちの多くは、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。

【0122】

無機多原子オキシアニオンが、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）不活性化中の抗原損傷から保護した
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンが、ＢＥＩでの不活性化中の中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0123】

本明細書に示されるように、実施例２０では、ＥＬＩＳＡは、実施例１２に記載される通りであるが、高濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４の存在下または不在下で典型的な範囲のＢＥＩ濃度（Ａａｒｔｈｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３２（２００４）１５３−１５６）で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行われた。

【0124】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図２５に示され、これは、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）などの無機多原子オキシアニオンの添加が、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）でのウイルス不活性化中に起こる抗原損傷から保護することを示す。

【0125】

したがって、ＢＥＩに基づく不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、感染性ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウムの存在下で完全に不活性化されたが、これらの試料は、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。

【0126】

メチサゾン試薬
上記で詳細に開示および考察されるように、酸化遷移金属（例えば、Ｃｕ^２＋、Ｆｅ^３＋など）は、抗原損傷を限定しながら、ウイルス不活性化を増強するために過酸化物系ワクチン開発プラットホームと併せて使用され得る。これは、本明細書に開示されるように高レベルの無機多原子オキシアニオンの使用によってさらに増大される。しかしながら、いくつかの病原体に関して、抗原性劣化がこの先端二重酸化手法を使用するときでも起こり得ることが記述された。ワクチン開発をさらに改善するために、本開示の二重酸化に基づく不活性化手法と相乗的に相互作用して、免疫原性タンパク質抗原に対する損傷をさらに低減しながら不活性化の速度を増加する能力に関して追加の化合物が探索／スクリーニングされた。この探索を通して、メチサゾン（ｍｅｔｈｉｓａｚｏｎｅ）（Ｎ−メチルイサチンβ−チオセミカルバゾン、ＣＡＳ １９１０−６８−５、Ｃ_１０Ｈ_１０Ｎ_４ＯＳ、ＭＷｔ ２３４．３ Ｄａ、同義語：メチサゾン（ｍｅｔｉｓａｚｏｎｅ）、マルボラン（Ｍａｒｂｏｒａｎ）、マルボラン（Ｍａｒｂｏｒａｎｅ）３３Ｔ５７、Ｍ−ＩＢＴ、１−メチルイサチン３−チオセミカルバジド、Ｎ−メチルイサチンβ−チオセミカルバゾン）が出願者により特定された。メチサゾンは、１９５０年代にＷｅｌｌｃｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって開発された一連の抗ウイルス性薬物のうちの１つである（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＬ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９５３；７０：２２９−３４；Ｂａｕｅｒ ＤＪ．，Ｂｒ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ．１９５５；３６：１０５−１４）。オルソポックスウイルスを用いた小動物効能研究に基づいて、メチサゾンは、市販製品であるＭａｒｂｏｒａｎ（登録商標）に開発され、ワクシニア合併症の治療、ならびに予防、および痘瘡の処理の両方を含むいくつかの臨床治験で試験された（Ｂａｕｅｒ ＤＪ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９６５；１３０：１１０−７）。

【0127】

Ｂａｕｅｒ（Ｉｄ）に従って、ワクシニア合併症（ワクチニア性湿疹およびワクシニア壊疽）の治療におけるメチサゾンの使用に関する初期の症例レポートは、それが、効果的ではあるが制御を欠き、抗ワクシニア性ガンマグロブリンの付随使用（いくつかの事例において）により、効能を確認することが困難になることを示す。それにもかかわらず、重篤有害事象の欠如は有望である。平均の初期用量は、１５２ｍｇ／ｋｇであり、３．７５日間かけて与えられた総平均用量の８０９ｍｇ／ｋｇであった。推定されるヒト対象の７０ｋｇの体重に関して、これは、用量当たり約１０グラム、および治療経過当たり約６０グラムに換算する。Ｂａｕｅｒは、ワクシニアワクチン接種前にメチサゾンを予防的に使用し、合併症（Ｉｄ）を低減したことが報告されたことを記述する。

【0128】

故に、歴史的インビボデータは、メチサゾンが安全であり、微量の本化合物でさえも新しいワクチンおよび製剤において問題にならないことを実証する。

【0129】

メチサゾンに関する最も印象的なデータのいくつかは、インドのマドラスでの大発生中に報告されたように痘瘡の予防に関する（Ｂａｕｅｒ ＤＪ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，１９６３；２：４９４−６）。メチサゾンを受けた密に接触した者のうち、３／１１０１（０．２７％）のみが軽症の痘瘡（死亡なし）を発症した一方で、７８／１１２６（６．９％）が痘瘡を発症し、１２人が死亡した。ワクチン接種されていない対象のみに着目すると、２／１０２のメチサゾンで処理された対象が痘瘡に罹患（２％）したが、未処理の対照の２８／１００（２８％）が痘瘡に罹患し、１１人が死亡した。投与量を、臨床治験を通じて変更し、（１）経口用、食後、１日２回、４日間の１．５グラム（合計１２グラム）、（２）経口用、食後、１日２回、４日間の３グラム（合計２４グラム）、（３）経口用、１２時間周期の３グラムの２回分の用量（合計６グラム）のいずれかで構成された。ＣｕＳＯ_４と組み合わせたメチサゾンは、ウイルスの除染に関して記載されている（Ｆｏｘ ＭＰ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９７７；２８４：５３３−４３、Ｌｏｇａｎ ＪＣ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１９７５；２８：２７１−８３）が、ワクチン産生に関しては記載されておらず、Η_２Ｏ_２と併せて使用されていない。

【0130】

フェントン型化学およびメチサゾン試薬
驚くべきことに、出願者は、本明細書に記載されるメチサゾン試薬が、本開示の二重酸化に基づく不活性化手法と相乗的に相互作用して、免疫原性タンパク質抗原に対する損傷をさらに低減しながら不活性化の速度を実質的に増加することを発見した。

【0131】

したがって、追加の態様において、フェントン型化学を伴う本開示の二重酸化方法は、実施例において以下により詳細に記載されるように、二重酸化のみと比較してさらにより効果的な微生物不活性化を提供し、二重酸化のみと比較して免疫原性のさらにより効果的な保持を有するメチサゾン、メチサゾン類似体、またはメチサゾン官能基（複数可）／下部構造（複数可）の使用をさらに含む。

【0132】

本開示の方法におけるメチサゾンに関する作用の正確な様式は明白ではないが、研究は、メチサゾンが、銅と複合化し得、この複合体が、核酸（Ｍｉｋｅｌｅｎｓ ＰＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７６；２５：８２１−７）およびタンパク質（Ｒｏｈｄｅ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７９；１０：１８３−９４）の両方に結合する能力を有することを示している。機構により束縛されることなく、出願者の結果を説明するために、出願者は、メチサゾン−銅複合体が、病原体全体の核酸に優先的に結合し得、一度結合すると、次いで、Ｈ_２Ｏ_２は、伝統的なフェントン型反応においてメチサゾン−銅複合体のＣｕ^２＋と相互作用して、結合核酸（例えば、核酸集中酸化）に近接して高度に活性なヒドロキシルラジカルを放出し得るという仮説を設けた。次いで、酸化的ラジカルのこの放出は、実質的であるが、局所的な核酸の損傷および病原体の不活性化をもたらし得る。したがって、出願者は、典型的には病原体を不活性化するために必要とされるであろうよりも低量のＨ_２Ｏ_２が使用され得、故に、タンパク質エピトープに対するオフサイト／付随的な損傷を限定し得ると推測をした。加えて、またはあるいは、イサチンβ−チオセミカルバゾン化合物は、核酸に直接的に結合すると示されており（Ｐａｋｒａｖａｎ＆Ｍａｓｏｕｄｉａｎ，Ｉｒａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１５；１４：１１１−２３）、このクラスの化合物のみが、核酸巨大分子を（例えば、挿入、および／または小溝結合によって）開放できる可能性があると提示している。出願者は、これが正しい場合、それが、核酸標的への酸化剤のより優れたアクセスを可能にし、酸化系ウイルス不活性化を増強し得る推測をした。

【0133】

メチサゾンは、単一および二重酸化系ウイルス不活性化の両方の速度を増強した。
実施例２１で本明細書に示されるように、出願者は、メチサゾンが、単一および二重酸化系ウイルス不活性化の両方の速度を増強したと決定した。図２６Ａ〜Ｃに示されるように、メチサゾンの添加が、ワクシニアウイルス（ＶＶ、ＤＮＡゲノム）、ならびにデング熱ウイルス血清型４（ＤＥＮＶ４、ＲＮＡゲノム）およびチクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、ＲＮＡゲノム）に関して二重酸化に基づく不活性化の速度を実質的に増加することができた。

【0134】

さらに、メチサゾンのみがウイルス不活性化に最小限の影響しか及ぼさなかった（図２６Ｂおよび２６Ｃ）が、メチサゾンおよびＨ_２Ｏ_２はともに（銅の不在下でさえも）、ウイルス不活性化に対する相乗的な増強を実証した。したがって、さらなる驚くべき態様は、以下により詳述されるように、Ｈ_２Ｏ_２のみと比較してより効率的な微生物不活性化を提供し、免疫原性の効果的な保持を有するメチサゾン、メチサゾン類似体、またはメチサゾン官能基（複数可）／下部構造（複数可）の使用をさらに含む過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）を伴う効果的な単独酸化方法を提供する。

【0135】

メチサゾンは、二重酸化系細菌性不活性化の速度を増強した。
実施例２２で本明細書に示されるように、出願者は、メチサゾンが、二重酸化系細菌性不活性化の速度を増強したと決定した。

【0136】

実施例２１の結果をＤＮＡコード細菌に拡張し（図２７Ａ〜Ｃ）、ここで、この場合もやはり、メチサゾンの二重酸化手法（例えば、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２）への添加が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ（例示的なグラム陰性菌）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（例示的なグラム陽性菌）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（例示的なグラム陰性菌）に対する不活性化速度を実質的に増強した。

【0137】

メチサゾンは、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持しながら不活性化速度を増強した。
実施例２３で本明細書に示されるように、出願者は、メチサゾンが、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持しながら不活性化速度を増強したと決定した。不活性化中の抗原性へのメチサゾンの影響を評価するために、例示的なモデルウイルスＣＨＩＫＶおよびＤＥＮＶ４を、高濃度Ｈ_２Ｏ_２（単独酸化系）、二重酸化（本明細書に記載されている）、またはメチサゾンを用いた二重酸化の複数の不活性化手法を用いて処理した。図２８Ａ（チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ））および２８Ｂ（デング熱ウイルス血清型４（ＤＥＮＶ４））のＥＬＩＳＡデータによって示されるように、二重酸化手法へのメチサゾンの添加は、不活性化の速度をおよそ１０〜２０倍増加しながら、中和エピトープに対する損傷を低減することによって抗原性を維持したか、または著しく改善した。

【0138】

メチサゾンの化学的類似体、またはメチサゾン官能基／下部構造、またはそれらの組み合わせは、二重酸化系ウイルス不活性化中の不活性化および抗原性の維持を増強した。
本実施例２４で本明細書に示されるように、出願者は、メチサゾンの化学的類似体、またはメチサゾン官能基／下部構造、またはそれらの組み合わせは、二重酸化系ウイルス不活性化中の不活性化および抗原性の維持を増強したと決定した。

【0139】

いくつかの関連化合物を、それらがワクチン開発のための病原体不活性化に同様の増強をもたらしたかを決定するために試験した（図２９Ａ〜Ｃ）。例示的なモデルウイルスＤＥＮＶ４で示されるように、イサチンβ−チオセミカルバゾンおよびＮ−プロピルイサチンβ−チオセミカルバゾンなどのこれらの化合物のいくつかは、二重酸化系においてより優れた抗原性を維持しながら、不活性化の増強された速度を含むメチサゾンと同様の結果を実証した。興味深いことに、チオセミカルバジド部分だけを使用しても、不活性化の増強およびより優れた抗原性が依然として観察されるであろう一方で、イサチンまたはセミカルバジドは、不活性化の速度を増加させそうにないが、それでも不活性化中の酸化的な損傷からのタンパク質抗原の保護を実証する。メチサゾン関連化合物の別々の主な成分（官能基／下部構造）が最適な不活性化を再現するために組み合わせられ得るかを探求するために、イサチン＋チオセミカルバジドまたはイサチン＋セミカルバジドの混合物を試験した。イサチン＋セミカルバジドは、依然として抗原保護を示した一方で、ウイルス不活性化を増強しなかった。対照的に、イサチン＋チオセミカルバジドは、急速な不活性化（いずれの成分のみよりも急速）、ならびに大幅に増加した抗原性の両方をもたらした。

【0140】

メチサゾンは、無機多原子オキシアニオンと相乗して、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持した。
本実施例２５に示されるように、出願者は、メチサゾンが、無機多原子オキシアニオンと相乗して、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持したと決定した。

【0141】

二重酸化不活性化中の無機多原子オキシアニオンと併せたメチサゾンの使用を調査した。図３０に示されるように、メチサゾンは、無機多原子オキシアニオンと相乗して、単離におけるいずれかの手法によって達成され得るよりも高い抗原性をもたらした。

【0142】

二重酸化系の遷移金属成分と比較して増加レベルのメチサゾンが、二重酸化系の抗原性および不活性化プロファイルを改善した。
実施例２６で本明細書に示されるように、驚くべきことに、出願者は、二重酸化系の遷移金属成分と比較して増加レベルのメチサゾンが、二重酸化系の抗原性および不活性化プロファイルを改善したと決定した。これは、上記で考察されるように、メチサゾンが金属イオンを複合／封鎖すると知られているため非常に驚くべきことであり、出願者は、金属イオン（複数可）の触媒的役割に依存するフェントン反応を競合的に阻害するメチサゾンについて憂慮した。

【0143】

二重酸化系におけるメチサゾンおよび遷移金属の相対濃度の影響（図３１）を考察した。遷移金属と比較してメチサゾン濃度が増加することにより、１０：１（メチサゾン：遷移金属）の好ましいモル比とともに、保持された抗原性および増加したウイルス不活性化速度の両方において付随する改善が実証されたことを見出した。

【0144】

メチサゾン試薬の使用および／または高レベル（例えば、標準的なリン酸緩衝生理食塩水反応条件下で病原体を化学的不活性化剤（複数可）のみと接触させることによって保持される病原体の免疫原性と比較して、病原体の免疫原性の保持を増強するのに十分なレベル）の１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含むものを含む二重酸化に基づく不活性化方法は、ウイルス性および細菌性病原体を含むが、これらに限定されないＲＮＡまたはＤＮＡゲノムのいずれかを有する病原体に対する先端ワクチンの開発において広い有用性を有する。
上記で考察され、かつ本明細書の実施例で示されるように、メチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含むものを含む二重酸化に基づく不活性化方法は、４つの異なるウイルス科内の８個のウイルスだけでなく、３つの例示的な細菌性種（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、グラム陰性菌、ヒト疾患と関係がある少なくとも１２の種（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉおよびＣ．ｃｏｌｉが最も一般的である））、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（例示的なグラム陽性菌）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（例示的なグラム陰性菌）にもわたって有用性を有すると示された。

【0145】

さらなる態様に従って、メチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含むものを含む二重酸化に基づく不活性化方法は、以下の例示的な微生物を使用するが、これらに限定されない高度に免疫原性のワクチンを産生する上で有用性を有する。
ウイルス。二重酸化を使用して不活性化され得るウイルスの非限定的な例には、以下の科が含まれる：Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｌｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｐｈａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ａｌｐｈａｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｌｖｅｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｍａｌｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｍｐｕｌｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｎｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ、Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｖｉｒｉｎａｅ、Ａｖｓｕｎｖｉｒｏｉｄａｅ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｅｎｙｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｅｔａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｅｔａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｂｉｃａｕｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｒｍｏｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃａｕｌｉｍｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｈｒｙｓｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｉｒｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌａｖａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｌｏｓｔｅｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｍｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｎａｅ、Ｃｏｒｔｉｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｃｙｓｔｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｅｎｄｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｅｎｔｏｍｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ、Ｅｕｃａｍｐｙｖｉｒｉｎａｅ、Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｆｕｓｅｌｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇａｍｍａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ、Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｌｏｂｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｇｏｋｕｓｈｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｇｕｔｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｙｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｈｙｔｒｏｓａｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｆｌａｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｅｖｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｉｐｏｔｈｒｉｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｌａｃｏｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｇａｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｓｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｅｔａｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｉｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｎｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｎａｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｉｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｏｄａｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｎｙａｍｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｐｈｉｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｏｒｔｈｏｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｅｄｕｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｅｒｍｕｔｏｔｅｔｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｈｙｃｏｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｉｃｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｌａｓｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｄｎａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｓｐｉｖｉｒｏｉｄａｅ、Ｐｏｔｙｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｑｕａｄｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｏｎｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｒｕｄｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｅｃｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｅｄｏｒｅｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｌｉｐｏｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｉｎａｒｅｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｉｒａｖｉｒｉｄａｅ、Ｓｐｏｕｎａｖｉｒｉｎａｅ、Ｓｐｕｍａｒｅｔｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｅｃｔｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｅｖｅｎｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｍｂｕｓｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｏｒｏｖｉｒｉｎａｅ、Ｔｏｔｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｕｒｒｉｖｉｒｉｄａｅ、Ｔｙｍｏｖｉｒｉｄａｅ、およびＶｉｒｇａｖｉｒｉｄａｅ。

【0146】

例示的なウイルス種には、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、風疹ウイルス、東部、西部、およびベネズエラ馬脳炎ウイルス、ラッサウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、西ナイルウイルス、デング熱ウイルス、黄熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ジカウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）を含むレトロウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、伝染性軟属腫、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス、チクングニア熱ウイルス、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、イヌジステンパーウイルス、イヌパルボウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパラインフルエンザウイルス、ならびにイヌコロナウイルスが含まれる。

【0147】

細菌。細菌性病原体も、高度に免疫原性のワクチン組成物を産生するのに使用するためのメチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化を含む二重酸化を使用して不活性化され得る。二重酸化を使用して不活性化され得る細菌の非限定的な例には、以下の科が含まれる：Ａｃａｎｔｈｏｐｌｅｕｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ａｃｉｄｉｌｏｂａｃｅａｅ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ａｃｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｐｏｌｙｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｓｐｉｃａｃｅａｅ、Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｔａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ａｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｃａｃｅａｅ、Ａｌｇｉｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａｃｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ａｎａｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ａｑｕｉｆｉｃａｃｅａｅ、Ａｑｕｉｆｉｃａｃｅａｅ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂａｃｅａｅ、Ａｒｍａｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｖｏｒａｃａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂｄｅｌｌｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｃｅａｅ、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａｃｅａｅ、Ｂｅｕｔｅｎｂｅｒｇｉａｃｅａｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂｌａｔｔａｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂｏｇｏｒｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂｒｅｖｉｎｅｍａｔａｃｅａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃａｌｄｉｃｏｐｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａｃｅａｅ、Ｃａｌｄｉｓｅｒｉｃａｃｅａｅ、Ｃａｌｄｉｓｐｈａｅｒａｃｅａｅ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃａｒｄｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃａｒｙｏｐｈａｎａｃｅａｅ、Ｃａｔａｌｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃａｔｅｎｕｌｉｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｅｌｅｒｉｎａｔａｎｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘａｃｅａｅ、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｈｒｏｍａｔｉａｃｅａｅ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎａｃｅａｅ、Ｃｈｒｙｓｉｏｇｅｎａｃｅａｅ、Ｃｈｔｈｏｎｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａｃｅａｅ、Ｃｏｈａｅｓｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｏｍａｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｏｎｅｘｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｏｘｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｃｒｅｎｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｃｒｙｏｍｏｒｐｈａｃｅａｅ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｃｙｃｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｃｙｔｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｆｅｒｒｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｆｌｕｖｉｉｔａｌｅａｃｅａｅ、Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄａｃｅａｅ、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｍｅｑｕｉｎａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆａｒｃｕｌａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｈａｌｏｂｉａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｎａｔｒｏｎａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍａｃｅａｅ、Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍａｃｅａｅ、Ｄｉｅｔｚｉａｃｅａｅ、Ｅｃｔｏｔｈｉｏｒｈｏｄｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｃｅａｅ、Ｅｌｕｓｉｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｅｎｔｏｍｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｕｚｅｂｙａｃｅａｅ、Ｆｅｒｒｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａｃｅａｅ、Ｆｅｒｖｉｄｉｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｆｉｍｂｒｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｆｌａｍｍｅｏｖｉｒｇａｃｅａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｌｅｘｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｃｅａｅ、Ｆｒａｎｋｉａｃｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｇａｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｇａｌｌｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｇｅｍｍａｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｇｅｏｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｇｌｙｃｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｇｏｒｄｏｎｉａｃｅａｅ、Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｇｒａｎｕｌｏｓｉｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｈａｈｅｌｌａｃｅａｅ、Ｈａｌａｎａｅｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｈａｌｏｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｈｅｌｉｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｈｅｒｐｅｔｏｓｉｐｈｏｎａｃｅａｅ、Ｈｏｌｏｐｈａｇａｃｅａｅ、Ｈｏｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｈｏｌｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈｉｌａｌｅｓ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｈｙｐｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｉａｍｉａｃｅａｅ、Ｉｄｉｏｍａｒｉｎａｃｅａｅ、Ｉｇｎａｖｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｉｎｔｒａｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｊｉａｎｇｅｌｌａｃｅａｅ、Ｊｏｎｅｓｉａｃｅａｅ、Ｋｉｌｏｎｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｋｉｎｅｏｓｐｏｒｉａｃｅａｅ、Ｋｏｆｌｅｒｉａｃｅａｅ、Ｋｏｒｄｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｌｅｎｔｉｓｐｈａｅｒａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｌｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａｃｅａｅ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃａｃｅａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｌｉｔｏｒｉｃｏｌａｃｅａｅ、Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍａｒｉｎｉｌａｂｉｌｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｒｅｇｕｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｅｔａｃｅａｅ（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｅｒｍｉｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｍｉｃｒｏｓｐｈａｅｒａｃｅａｅ、Ｍｏｏｒｅｉａｃｅａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｍｙｒｏｉｄａｃｅａｅ、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｎａｋａｍｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｎａｎｎｏｃｙｓｔａｃｅａｅ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｎａｕｔｉｌｉａｃｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｃｅａｅ、Ｎｅｖｓｋｉａｃｅａｅ、Ｎｉｔｒｉｌｉｒｕｐｔｏｒａｃｅａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｎａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓａｃｅａｅ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ、Ｏｌｅｉｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｏｌｉｇｏｓｐｈａｅｒａｃｅａｅ、Ｏｐｉｔｕｔａｃｅａｅ、Ｏｒｂａｃｅａｅ、Ｏｓｃｉｌｌｏｃｈｌｏｒｉｄａｃｅａｅ、Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｏｘａｌｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｐａｒａｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａｃｅａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐａｓｔｅｕｒｉａｃｅａｅ、Ｐａｔｕｌｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｅｒｅｄｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｐｈａｓｅｌｉｃｙｓｔｉｄａｃｅａｅ、Ｐｈｙｃｉｓｐｈａｅｒａｃｅａｅ、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｐｉｓｃｉｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｐｌａｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｏｌｙａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｃｅａｅ、Ｐｒｏｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｎｏｃａｒｄｉａｃｅａｅ、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｐｕｎｉｃｅｉｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉａｃｅａｅ、Ｒａｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒｈａｂｄｏｃｈｌａｍｙｄｉａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｂｉａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｃｙｃｌａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ、Ｒｈｏｄｏｔｈｅｒｍａｃｅａｅ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ

、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｉｋｅｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｒｏｓｅｉｆｌｅｘａｃｅａｅ、Ｒｕａｎｉａｃｅａｅ、Ｒｕｂｒｉｔａｌｅａｃｅａｅ、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｓａｎｄａｒａｃｉｎａｃｅａｅ、Ｓａｎｇｕｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓａｐｒｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｓｃｈｌｅｉｆｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒａｃｅａｅ、Ｓｅｒｐｕｌｉｎａｃｅａｅ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｓｉｍｋａｎｉａｃｅａｅ、Ｓｉｍｋａｎｉａｃｅａｅ、Ｓｉｎｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｎｅａｔｈｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ｓｏｌｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｏｌｉｒｕｂｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｐｈａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｃｈｅｔａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｓｐｏｒｉｃｈｔｈｙａｃｅａｅ、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｓｕｃｃｉｎｉｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｃｅａｅ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔａｃｅａｅ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈａｃｅａｅ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｓｙｎｔｒｏｐｈｏｒｈａｂｄａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｄｅｓｕｌｆｏｂｉａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｇｅｍｍａｔｉｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｌｅｏｐｈｉｌａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｍｏｎｏｓｐｏｒａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａｔａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａｃｅａｅ、Ｔｈｉｏａｌｋａｌｉｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｔｈｉｏｔｒｉｃｈａｃｅａｅ、Ｔｒｕｅｐｅｒａｃｅａｅ、Ｔｓｕｋａｍｕｒｅｌｌａｃｅａｅ、Ｔｕｒｉｃｉｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｖｅｒｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａｃｅａｅ、Ｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ、Ｖｉｃｔｉｖａｌｌａｃｅａｅ、Ｗａｄｄｌｉａｃｅａｅ、Ｗａｄｄｌｉａｃｅａｅ、Ｗｉｌｌｉａｍｓｉａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｙａｎｉｅｌｌａｃｅａｅ、Ａｕｒａｎｔｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｃｅｎａｒｃｈａｅａｃｅａｅ，Ｈａｌｉａｎｇｉａｃｅａｅ、Ｈｙｄｒｏｇｅｎｉｍｏｎａｃｅａｅ、Ｋｏｒｄｉｉｍｏｎａｄａｃｅａｅ、Ｍａｒｉｐｒｏｆｕｎｄａｃｅａｅ、Ｎｉｔｒｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｐａｒｖｕｌａｒｃｕｌａｃｅａｅ、Ｐｒｏｃａｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｓｐｉｒｉｌｌａｃｅａｅ、およびＳａｌｉｎｉｓｐｈａｅｒａｃｅａｅ。

【0148】

例示的な細菌性種には、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種、Ｂｒｕｃｅｌｌａ種、Ｂｏｒｒｅｌｉａ種、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ種、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ種、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｍ ａｎｔｈｒａｃｉｓが含まれる。例えば、グラム陽性およびグラム陰性菌が概して包含される。

【0149】

真菌。高度に免疫原性のワクチン組成物は、メチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化を含む二重酸化を使用して不活性化された真菌類病原体からも産生され得る。例示的な真菌類病原体には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ種、Ｃａｎｄｉｄａ種、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ種、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ種、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｆｕｓａｒｉｕｍ種、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ種、Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ種、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ種、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ種、Ｅｘｓｅｒｏｈｉｌｕｍ種、およびＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ種が含まれる。

【0150】

寄生体。本明細書に開示され、かつメチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化を含む二重酸化方法は、高度に免疫原性のワクチンのための寄生体（例えば、細胞内寄生体）、および特に、原虫寄生体、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよび他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａおよびＧｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種、ならびにＴｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ、およびＢａｂｅｓｉａ種を不活性化するためにも使用され得る。

【0151】

免疫原性組成物
本開示の方法を使用して、不活性化された病原体を含有するワクチンなどの免疫原性組成物も提供される。例えば、本組成物（または、薬品）は、免疫原性組成物が調製された生物学的活性病原体の１つ以上の優勢な抗原性エピトープを保持する、病原体を含有する凍結乾燥された免疫原性組成物（例えば、ワクチン調製物）であり得る。凍結乾燥された組成物は、防腐剤不含であり、かつ一切の不活性化剤が欠如（例えば、Ｈ_２Ｏ_２などが欠如）した状態で調製され得る。本組成物は、薬学的に許容される希釈液中で凍結乾燥された組成物を再構成することによって調製された液体でもあり得る。任意に、本組成物は、抗原の抗原性効能を増加させる好適なアジュバントを含み得る。

【0152】

メチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含むものを含む本開示の二重酸化手法を用いた不活性化は、効果的なワクチンが他の方法（過酸化物のみによる方法を含む）によって産生され得ない病原体に対するワクチンを含むワクチン産生のための改善された方法を提供するだけでなく、ＵＶ不活性化、熱不活性化、またはホルムアルデヒドもしくはベータプロピオラクトンを用いた不活性化と比較していくつかの追加の著しい利益も提供する。

【0153】

第１に、メチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化を含む、過酸化水素および遷移金属イオン（フェントン型反応）を用いた二重酸化は、免疫原性エピトープを維持するという点で、他のいずれかの方法よりも著しくより良好である。故に、メチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化を含む二重酸化不活性化は、免疫学的に重要なエピトープを変性または破滅させる方法を使用して産生されたワクチンよりも、生病原体による後の感染症から保護する可能性がかなり高い、免疫応答を産生するために使用され得るワクチンなどの高度に効果的な免疫原性組成物を産生する。

【0154】

第２に、ホルムアルデヒドまたはベータプロピオラクトンなどの他の化学的不活性化剤とは異なり、本開示の二重酸化方法で使用されるＣｕおよびＦｅイオンは、対象においては自然に生じることはないが、非毒性の量での反応中に存在する。さらに、残留遷移金属、および／またはメチサゾン試薬は、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、流濾過（例えば、タンジェント流濾過）、脱塩カラム、血液透析濾過、透析、超遠心分離、スクロース勾配精製、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などを使用して下流精製によって除去され得る。

【0155】

同様に、任意の残留過酸化水素は、任意の遷移金属除去のための上述されるような後の精製ステップを使用するか、または凍結乾燥を使用するかのいずれかによってワクチン組成物から実質的にまたは完全に除去される。例えば、病原体および過酸化水素および遷移金属イオンを含有する溶液は、滅菌バイアル中に分配され、凍結乾燥され得る。凍結乾燥プロセスの間、過酸化水素は、蒸気の形態で除去され、後には、必要になるまで容易に保管ができる安定した滅菌ワクチン組成物が残る。凍結乾燥により、ワクチン組成物からある程度、ほとんど、またはさらには全ての検出可能な過酸化水素が除去され、所望される場合、実質的に過酸化水素不含のワクチン組成物が産生される。凍結乾燥は、免疫原性エピトープの熱変性が起こる温度以下に維持される限り、当該技術分野において既知の本質的に任意の方法によって行われ得る。故に、凍結乾燥は、過酸化水素／病原体溶液）の予備凍結の後、または予備凍結することなく行われ得る（例えば、周囲温度を約０〜４℃〜約４２℃を維持する条件下で、例えば、ＳＰＥＥＤ−ＶＡＣ（登録商標）濃縮器を使用して、凍結を上回る周囲温度で）。ヒトまたは動物対象への投与のためのワクチンなどの免疫原性組成物を製造する目的のために、凍結乾燥は典型的には、ワクチンの産生のための現在の良好な製造手順（ｃＧＭＰ）に従って行われる。不活性化および凍結乾燥は、希釈、透析、遠心分離、または精製などのプロセスステップが一切介在することなく達成され得る。病原体／過酸化水素溶液が、凍結乾燥前に清潔な滅菌容器（例えば、バイアル、アンプル、管など）中に分配される（または、分割される）限り、得られたワクチン組成物は滅菌状態になり、投与前の追加の防腐剤の添加は不要である。例えば、ワクチン組成物が単回用量で投与されるべきである場合、凍結乾燥されたワクチン組成物は、薬学的に許容される希釈液中に単に懸濁され（または、溶解され）て、防腐剤不含液体ワクチン組成物を産生する。凍結乾燥されたワクチン組成物が複数回投与（例えば、単一の対象へ複数回連続投与、または複数の対象へ１回以上投与）されることが意図される場合、希釈液は、薬学的に許容される防腐剤を含み得る。

【0156】

所望される場合、遷移金属イオンおよび／または過酸化水素は、上述されるような精製ステップによって除去され得る。例えば、残留Ｈ_２Ｏ_２および遷移金属（例えば、ＣｕまたはＦｅのいずれか）は、タンジェント流濾過、透析、脱塩カラム、イオン交換クロマトグラフィー（ウイルスに結合するが残留不活性化成分に結合しない条件下で）、親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの１つ以上の精製手法の使用によって除去され得る。

【0157】

あるいは、重亜硫酸ナトリウム（ＮａＨＳＯ_３）および／またはメタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５）は両方共、Ｈ_２Ｏ_２を中和するために使用され得る（１ｍｏｌのメタ重亜硫酸塩が２ｍｏｌの重亜硫酸塩に分解し、次いで、Ｈ_２Ｏ_２と直接反応する）。
Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_５＋２Ｈ_２Ｏ→２ＮａＨＳＯ_３＋Ｈ_２Ｏ （１）
２ＮａＨＳＯ_３＋２Ｈ_２Ｏ_２→２ＮａＨＳＯ_４＋２Ｈ_２Ｏ （２）

【0158】

使用前に、ワクチンは、薬学的に許容される希釈液を使用して再構成されて、従来の投与手段によって送達を容易にし得る。これは、有害量の有毒で発癌性化合物を含有しない滅菌ワクチン組成物の産生を可能にし、それにより、ワクチンの安全性が増加する。

【0159】

加えて、二重酸化不活性化、またはメチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化後、得られたワクチン組成物に防腐剤（チメロサールなど）を添加する必要はない。滅菌組成物は、長期間（例えば、凍結乾燥された状態で）維持され得、これにより、潜在的に有毒な防腐剤の添加が不要になる。故に、本組成物は、実質的にまたは完全に防腐剤不含になるように作製され得る。任意に、防腐剤は、本組成物中に提供され得る。

【0160】

メチサゾン試薬の使用および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含むものを含む二重酸化方法は、ワクチンなどの免疫原性組成物を提供し、故に、不活性化された病原体を含む薬品を調製するための方法を提供する。本方法は、組成物が産生される感染性の病原体の優勢な免疫性エピトープを保持する、免疫学的に活性である非感染性の病原体を含有する組成物を提供する。典型的には、不活性化された病原体は、病原体に対する保護免疫応答を誘発する１つ以上の免疫学的に優性のエピトープを保持する。この方法は、ウイルス、細菌、真菌、および寄生体、例えば、細胞内寄生体（例えば、原虫寄生体）を含むＲＮＡまたはＤＮＡゲノムのいずれかを有する不活性化された病原体を含有する免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を産生するのに好適である。任意に、本組成物は、病原体の１つを超える種または菌株を含有し、例えば、ワクチンの組み合わせは、本方法を使用して産生され得る。本組成物は、複数のウイルス、例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、および風疹ウイルス、ならびに／または本明細書に開示されるような他のウイルスを含み得る。同様に、本組成物は、複数の細菌、例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、下痢、ジフテリア、百日咳、および破傷風それぞれの起因菌、ならびに／または本明細書に開示されるような他の細菌性を含み得る。本組成物は、異なる分類（科）の生物から選択される複数の病原体も含み得る。

【0161】

二重酸化方法は、病原体を非感染性にするのに十分な期間にわたって、病原体を有効量の二重酸化剤（例えば、フェントン試薬、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、および遷移金属イオン）もしくは二重酸化剤およびメチサゾン試薬を含有する溶液、および／または＿高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在と接触させることを伴う。任意に、病原体は、二重酸化剤と接触される前に精製されるか、または単離される。

【0162】

典型的には、溶液は、少なくとも約０．００１％または０．００２％の過酸化水素（ｗｔ／ｖｏｌ）を含み、最大約０．１０％の過酸化水素を含有し得る。典型的には、溶液は、少なくとも１μΜまたは２μΜの遷移金属（例えば、ＣｕＣｌ_２）を含む。最も典型的には、少なくとも０．００１％または０．００２％の過酸化水素（ｗｔ／ｖｏｌ）は、少なくとも１μΜまたは２μΜの遷移金属（例えば、ＣｕＣｌ_２）と組み合わせて使用される。例えば、溶液は、約０．００２％の過酸化水素（ｗｔ／ｖｏｌ）と、約１μΜまたは２μΜのＣｕＣｌ_２とを含み得る。さらなる実施形態において、過酸化水素濃度は、上述されるレベルの遷移金属と組み合わせて、０．０００１％の低さか、または１．０％の高さになり得る。遷移金属の濃度範囲は、再度、本開示のいずれかのレベルの過酸化水素と合わせて、０．００１μΜの低さか、または１０００μΜの高さになり得る。メチサゾン試薬を含む反応において、好ましい量のメチサゾン試薬、メチサゾン類似体、またはメチサゾン官能基もしくはメチサゾン官能下部構造を表す化学物質は、本開示のいずれかのレベルの過酸化水素または遷移金属と合わせて、０．０１μΜの低さ、または１０，０００μΜの高さになり得る。

【0163】

二重酸化不活性化の機構が、単純な過酸化水素媒介性酸化の機構とは驚くほどに異なることが見出された（すなわち、タンパク質濃度依存性であることが見出された）が、それでもなお本出願者は、絶対量および／または相対量の過酸化水素（ｗｔ／ｖｏｌ）および遷移金属イオン（例えば、ＣｕＣｌ_２）は、広いアレイの病原体に対する免疫原性を保持しながら、不活性化を最適化するために変化し得ることおよび調整され得ることを見出した。出願者は、メチサゾン試薬を使用する反応において変化する２つの変数（過酸化水素濃度および遷移金属濃度）、およびさらには３つの変数を有することにより、単一の薬剤を使用する先行技術の方法を上回る増強された微調整能力が提供されることを見出した。さらに、出願者は、驚くべきことに、２つのフェントン成分（過酸化水素濃度および遷移金属濃度）、ならびにそれらを含む反応におけるメチサゾン試薬、ならびに高レベルの無機多原子オキシアニオンが、相乗的に作用して、単一の薬剤のみの使用では達成し得ない結果を提供することを（実施例で本明細書に示されるように）見出した。加えて、相乗効果を利用するために、遷移金属（例えば、ＣｕＣｌ_２（Ｃｕ^２＋）と、ＦｅＣｌ_３（Ｆｅ^３＋）またはＣｓＣｌ（Ｃｓ^＋））と、メチサゾン試薬と、無機多原子オキシアニオンとの組み合わせが用いられ得る。例えば、０．０５μΜおよび０．１０μΜのＣｕＣｌ_２濃度で、ＦｅＣｌ_３濃度が増加すると、抗原性が増強し、これは、これら２つの金属との相乗効果を示す。これらの微調整および相乗的な態様は、本開示の二重酸化手法に関する広い有用性を支持する。

【0164】

病原体を完全に不活性化するのに十分な時間の長さは、数分〜数時間の間で変化し得る。例えば、病原体は、約１時間〜２４時間の範囲内の時間、またはより短い期間にわたって、二重酸化溶液、またはメチサゾン試薬、および／もしくは無機多原子オキシアニオンをさらに含む二重酸化溶液と接触させられ得る。典型的には、二重酸化反応に関して、少なくとも１μΜまたは２μΜの遷移金属（例えば、ＣｕＣｌ_２）と組み合わせて使用される少なくとも０．００１％または０．００２％の過酸化水素（ｗｔ／ｖｏｌ）を使用するとき、約２０時間（±２時間）が使用される。概して、病原体を不活性化するのに十分な時間の長さは、特定の病原体および試薬の濃度に応じ、当業者は、本開示の教示に基づいて、試薬の濃度、必要とされる反応時間の長さ、および反応温度を経験的に決定することができるであろう。さらなる実施形態において、過酸化水素濃度は、上述されるレベルの遷移金属と組み合わせて、０．０００１％の低さか、または１．０％の高さになり得る。遷移金属の濃度範囲は、再度、本開示のいずれかのレベルの過酸化水素と合わせて、０．００１μΜの低さか、または１０００μΜの高さになり得る。好ましい濃度のメチサゾン試薬、メチサゾン類似体、またはメチサゾン官能基もしくはメチサゾン官能下部構造を表す化学物質は、本開示のいずれかのレベルの過酸化水素または遷移金属と合わせて、０．０１μΜの低さ、または１０，０００μΜの高さになり得る。

【0165】

病原体不活性化は、凍結温度〜免疫学的に関連するエピトープが変性する温度の任意の温度で行われ得る。最も一般的に、不活性化プロセスは、４℃以上〜約４２℃未満で行われる。例えば、室温または約２５℃で不活性化を行うことが簡便である。

【0166】

概して、メチサゾン試薬および／または無機多原子オキシアニオンをさらに含むものを含む二重酸化条件は、全体の抗原性構造を依然として維持しながら、製造プロセス中、高い安全マージン（例えば、最大１億倍の理論上の過剰不活性化）を提供すると決定される。

【0167】

次いで、不活性化された病原体は、長時間の（例えば、数ヶ月以上または１年を超える）期間にわたって保管することができる。次いで、不活性化された病原体を含有する溶液は、例えばワクチンとして、病原体に対する免疫応答を誘発する目的のために対象に直接投与され得る。より一般的に、不活性化された病原体を含む溶液は、免疫原性組成物を産生するために上述されるようにさらに処理または凍結乾燥される。

【0168】

したがって、本開示は、本明細書に開示される方法に従って産生された免疫原性（例えば、ワクチン）組成物を提供する。例えば、本組成物（例えば、薬品）は、生物学的活性病原体の１つ以上の優勢な抗原性エピトープを保持する、不活性化された病原体を含む凍結乾燥および／または精製された組成物である。典型的には、本組成物は、実質的にまたは完全に防腐剤または不活性化剤、例えば、過酸化水素、ホルムアルデヒド、もしくはベータプロピオラクトン不含である。別の実施形態において、本組成物は、薬学的に許容される希釈液中で凍結乾燥または精製された組成物を懸濁または溶解する（可溶化する）ことによって産生された液体である。任意に、希釈液は、防腐剤を含有する。任意に、ワクチン組成物は、アジュバントを含む。凍結乾燥された形態において、アジュバントは、例えばアルミニウム（例えば、ミョウバンまたはアルミニウム塩）アジュバントであり得る。凍結乾燥されたワクチン組成物から液体配合物を調製すると、アジュバントは、脂質配合物（例えば、エマルションを形成することができる油）であり得る。不活性化された病原体ゲノムは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。

【0169】

不活性化された病原体を含有する組成物を投与することによって対象において免疫応答を誘発するための方法も提供される。
追加の態様に従って、免疫原性組成物を投与することによって病原体に対する免疫応答を誘発する方法が提供される。典型的には、免疫応答は、１つ以上の病原体による感染症を予防または低減する保護免疫応答である。例えば、免疫応答は、（免疫原性を保持しながら）病原体を非感染性にするのに十分な期間にわたって、病原体を、二重酸化試薬（複数可）を含有する溶液と接触させることによって組成物を調製し、本組成物を対象に投与することによって、対象において誘発され得、それにより、対象において病原体に対する免疫応答（例えば、保護免疫応答）を誘発する。いくつかの応用例において、溶液は、二重酸化剤（複数可）を溶液から除去することなく対象に投与される。他の応用例において、本組成物は、本明細書に記載されるように凍結乾燥および／またはそうでない場合は精製され、二重酸化試薬（複数可）のいくつかまたは全て（または、実質的に全て）を除去する。プロセス組成物は、粉末形態で（例えば、分散粉末としてまたはペレットとして、例えば、粉末ＪＥＣＴ（登録商標）経皮粉末注射デバイスを使用して）投与され得る。あるいは、凍結乾燥された組成物は、ワクチンを対象に送達するのに好適な任意の方法、例えば、免疫原性組成物（例えば、ワクチン）の筋肉内、皮内、経皮、皮下もしくは静脈注射、口腔送達、または鼻腔内、または他の粘膜送達を使用して投与するために薬学的に許容される希釈液中で再構成される。

【0170】

用語
別途説明されない限り、全ての専門用語および化学用語は、本開示が属する分野の当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙにおける一般用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９４（ＩＳＢＮ ０−１９−８５４２８７−９）によって出版されているＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ Ｖ、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０−６３２−０２１８２−９）によって出版されているＫｅｎｄｒｅｗ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、およびＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ １−５６０８１−５６９−８）によって出版されているＲｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅで見ることができる。

【0171】

単称語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に示さない限り複数の対象を含む。同様に、「ｏｒ」という用語は、別途文脈が明確に示さない限り「ａｎｄ」を含むことが意図される。

【0172】

本明細書に記載されるものと同様であるかまたは同等である方法および材料が、本開示の実践または試験において使用され得るが、好適な方法および材料が以下に記載される。「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」を意味する。「例えば（ｅ．ｇ．）」という略語は、ラテン語の「例えば（ｅｘｅｍｐｌｉ ｇｒａｔｉｓ）」からの派生語であり、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。故に、「例えば」という略語は、「例えば」という用語と同義である。

【0173】

本開示の多様な実施形態の概説を容易にするために、特定の用語の以下の説明が提供される。
「免疫原性組成物」または「ワクチン組成物」または「ワクチン」は、例えば、病原体に対する特定の免疫応答を誘発することができるヒトまたは動物対象への投与に好適な物質の組成物である。このように、免疫原性組成物またはワクチンは、１つ以上の抗原または抗原性エピトープを含む。抗原は、文脈において、単離タンパク質もしくはタンパク質のペプチド断片であり得るか、または病原体に由来する部分的に精製された調製物であり得る。あるいは、抗原は、文脈において、全ての生病原体または不活性化された病原体であり得る。典型的には、免疫原性組成物またはワクチンが生病原体を含むとき、病原体は弱毒化し、つまり、免疫学的に適格性の対象において疾患を引き起こすことができない。他の事例において、免疫原性組成物またはワクチンは、全て不活性化された（または、死滅した）病原体を含む。不活性化された病原体は、免疫学的に適格性の対象の少なくとも一部分において疾患を（不活性化されない場合）反対に引き起こすであろう野生型病原性生物、または弱毒化もしくは変異菌株、または単離病原体のいずれかであり得る。本開示の文脈において、免疫原性および／またはワクチン組成物は、全ての（野生型、弱毒化、または変異）病原体を含有する。

【0174】

「免疫応答」または「インビボ免疫応答」は、免疫系の細胞、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、または単球の刺激に対する応答である。いくつかの事例において、免疫応答は、Ｔ細胞の応答、例えば、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答である。あるいは、応答は、Ｂ細胞の応答、および特定の抗体の産生における結果である。いくつかの事例において、応答は、特定の抗原に対して特異的（つまり、「抗原特異的応答」）である。抗原が病原体に由来する場合、抗原特異的応答は、「病原体特異的応答」である。「保護免疫応答」は、病原体の有害な機能もしくは活性を阻害するか、病原体による感染症を低減するか、または病原体による感染症に起因する症状（死亡を含む）を低下する免疫応答である。保護免疫応答は、例えば、プラーク減少アッセイもしくはＥＬＩＳＡ中和化アッセイにおけるウイルス複製もしくはプラーク形成の抑制によって、またはインビボにおけるウイルス攻撃に対する耐性を測定することによって測定され得る。

【0175】

「免疫学的に有効な量」は、対象において免疫応答を誘発するために使用される組成物の量である。ワクチン投与文脈において、所望の結果は典型的には、保護病原体特異的免疫応答である。しかしながら、免疫適格性の対象において病原体に対する保護免疫を得るために、複数回分の投与のワクチン組成物が一般的に必要とされる。故に、本開示の文脈において、免疫学的に有効な量という用語は、前または後の投与と組み合わせて、保護免疫応答を達成するのに寄与する分割用量を包含する。

【0176】

「抗原」は、動物に注射、吸収、またはそうではない場合、導入される組成物を含む、動物における抗体の産生および／またはＴ細胞応答を刺激し得る化合物、組成物、物質である。「抗原」という用語は、全ての関連抗原性エピトープを含む。「エピトープ」または「抗原性決定基」という用語は、Ｂおよび／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。

【0177】

「優勢な抗原性エピトープ」は、機能的に著しい宿主免疫応答、例えば、抗体応答またはＴ細胞応答が作製されるエピトープである。故に、病原体に対する保護免疫応答に関して、優勢な抗原性エピトープは、宿主免疫系によって認識されるときに、病原体によって引き起こされる疾患からの保護をもたらす抗原性部分である。

【0178】

「抗原性」という用語は、例えば、特定のモノクローナル抗体の結合または赤血球凝集アッセイなどの多様なインビトロ測定によって決定されるような免疫原性エピトープ構造（複数可）の相対的な維持を指す。インビボ文脈における「抗原性」は典型的には、「免疫原性」と本明細書で称される。

【0179】

「アジュバント」は、非特異的様式で免疫応答の産生を増強する薬剤である。一般的なアジュバントは、抗原が吸着される鉱物（例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液、または抗原溶液が油中で乳化される油中水型エマルション（ＭＦ−５９、不完全フロイントアジュバント）を含む。多様なアジュバントに関する追加の詳細は、Ｄｅｒｅｋ Ｏ’Ｈａｇａｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２０００で見ることができる。

【0180】

本明細書で使用されるような「病原体」という用語は、ＲＮＡまたはＤＮＡゲノムのいずれかを有する生物を指し、ウイルス（ＲＮＡおよびＤＮＡゲノム系の両方）、細菌（ＤＮＡゲノム系、グラム陽性およびグラム陰性の両方）、真菌、および寄生体を包含する。特定の好ましい態様において、「病原体」は、ＲＮＡまたはＤＮＡゲノムのいずれかを有する生物を指し、ウイルス（ＲＮＡおよびＤＮＡゲノム系の両方）、および細菌（ＤＮＡゲノム系、グラム陽性およびグラム陰性の両方）を包含する。

【0181】

「病原体全体」という用語は、生物の感染性形態の構成要素の全てまたは実質的に全てを含むウイルス、細菌、真菌、または寄生体などの病原性生物を指す。典型的には、病原体全体は、複製することができる。それでもなお「病原体全体」という用語は、「野生型」病原体という用語とは異なり、「病原体全体」という用語は、病原性生物の野生型、ならびに弱毒化および他の変異形態を包含する。故に、病原体全体は、免疫適格性の宿主において疾患を引き起こすことができないが、それでもなお、感染性病原体の構成要素の全てまたは実質的に全てを含む弱毒化病原体であり得る。同様に、病原体全体は、１つ以上の無傷の（野生型）遺伝子および／またはタンパク質を欠く病原体の変異形態であり得る。病原体ゲノムは、ＲＮＡまたはＤＮＡを含み得る。

【0182】

「不活性化された病原体」は、人工的な手段によって疾患を引き起こすことができないようにされている（例えば、非感染性にされている）病原体全体である。典型的には、不活性化された病原体は、「死滅病原体」であり、つまり、複製することができない。病原体は、それが複製することができないまたは疾患を引き起こすのに十分なレベルに複製することができない場合、非感染性である。

【0183】

出願者の方法との関連で本明細書において使用される場合、「免疫原性的に活性であるワクチン」は、本開示の方法によって不活性化された病原体であり、つまり、免疫学的に適格性の対象に導入されると、免疫応答を誘発することができる。本明細書に開示されるように不活性化された病原体を含む免疫原性的に活性であるワクチンへの曝露に応じて産生された免疫応答は、それぞれの感染性病原体の優勢な抗原性エピトープによって産生される免疫応答に対して、好ましくは同一であるか、実質的に同一であるか、またはより優れている。

【0184】

「過酸化水素」（Ｈ_２Ｏ_２）は、１．７８ボルトの標準的な電極電位を有する例示的な好ましい酸化剤である。一貫性の目的のために、本明細書に開示される実施例にあるような溶液中の過酸化水素の割合は、１体積当たりの重量とされる（ｗｔ／ｖｏｌ）。例えば、０．０１％のＨ_２Ｏ_２は、０．０１％ｗｔ／ｖｏｌで存在しているＨ_２Ｏ_２を指す。

【0185】

本明細書で使用される場合、「二重酸化剤」は、過酸化水素および少なくとも１つの遷移金属（例えば、ＣｕＣｌ_２（Ｃｕ^２＋）、ＦｅＣｌ_３（Ｆｅ^３＋）、またはＣｓＣｌ（Ｃｓ^＋））を含むフェントン型二重酸化試薬を指す。

【0186】

「二重酸化剤（複数可）を含む溶液」は、溶媒と二重酸化剤（複数可）との任意の混合物の組み合わせを含む。最も一般的に、本明細書に開示される方法の文脈において、溶媒は、水、例えば、脱イオン水、または緩衝塩水溶液である。典型的には、溶液という用語は、液体相溶液を含む。一貫性の目的のために、溶液中の過酸化水素の割合は、１体積当たりの重量とされる（ｗｔ／ｖｏｌ）。

【0187】

「過酸化水素が実質的に不含」という語句は、微量以下（自然に存在するものとして経験的に検出可能な量）が本組成物中に存在することを示す。

【0188】

「凍結乾燥する」という動詞は、真空下で凍結して乾燥することを意味する。このプロセスは、「凍結乾燥」と呼ばれる。いくつかの事例において、乾燥（例えば、脱水）される試料は、乾燥前に凍結される。他の事例において、乾燥される材料は、前の相を変化させることなく乾燥プロセスにかけられる。凍結乾燥のプロセス中、溶媒の蒸発は、試料の凍結をもたらす溶媒／溶質混合物の融解温度以下の温度への試料の冷却をもたらす。溶媒は、昇華によって凍結試料から除去される。凍結乾燥を受ける産物は、「凍結乾燥される」。本開示で使用される場合、凍結乾燥という用語は、具体的には噴霧乾燥および噴霧凍結乾燥を含む、試料を過剰熱に曝露することなく乾燥プロセスを促進する機能的に同等の手順も包含する。

【0189】

本明細書で使用される場合、特定の態様において「メチサゾン」および「メチサゾン類似体」という用語は、以下の式を有する化合物、

【化14】

（式中、Ｒ_１が独立して、Ｈ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、例えば、Ｒ_１が、Ｈ、−ＣＨ_３、またはプロピルなどであり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）であり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲン（例えば、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩を指す。好ましくは、ＸおよびＲ_２はＨであり、Ｒ_１はＨ（イサチンβ−チオセミカルバゾン）、−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（メチサゾン））、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチンβ−チオセミカルバゾン（ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎ））である。好ましくは、メチサゾンが使用される。

【化15】

【0190】

本明細書で使用される場合、特定の態様において「メチサゾン官能基」または「メチサゾン機能的下部構造」という用語は、以下の式を有する化合物、

【化16】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、例えば、Ｒ_１はＨ（イサチン）もしくは−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）などであり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲン（例えば、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ）である）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化17】

（式中、Ｒ_１がＨ、または−ＯＨで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）、例えば、Ｒ_１がＨ（インドール、２，３−ジオン、３−ヒドラゾン）などであり、Ｘが独立して、Ｈまたはハロゲン（例えば、Ｉ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ）であり、Ｒ_２が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびその薬学的に許容される塩を含む塩、

【化18】

（式中、Ｒ_２およびＲ_３が独立して、Ｈ、−ＯＨまたはアリールで任意に置換される低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ２アルキル）である）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩、ならびにそれらの組み合わせを指す。

【0191】

特定の態様において、「メチサゾン官能基」または「メチサゾン官能下部構造」の以下の組み合わせ、

【化19】

（式中、Ｒ_１がＨまたは低級アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ４アルキル）であり、例えば、Ｒ_１がＨ（イサチン）もしくは−ＣＨ_３（Ｎ−メチル−イサチン）、またはプロピル（Ｎ−プロピル−イサチン）などである）、およびそれらの薬学的に許容される塩を含む塩が使用される。

【0192】

特定の態様において、「メチサゾン官能基」または「メチサゾン官能下部構造」の以下の組み合わせが使用される。

【化20】

【0193】

当該技術分野において既知の「リン酸緩衝生理食塩水」または「ＰＢＳ」という語句は、リン酸水素二ナトリウム、塩化ナトリウム、およびいくつかの配合物では、塩化カリウムおよびリン酸二水素カリウムを含有する水系塩溶液である。溶液のオスモル濃度およびイオン濃度は、一般に、ヒト身体の（等張）濃度と一致する。典型的なＰＢＳ配合物は、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、および２．７ｍＭのＫＣｌであるが、成分の濃度のいくらかの変化を包含し得る。

【0194】

実施例にあるように本明細書で称される「標準的な反応条件」、「標準的なリン酸緩衝生理食塩水反応条件」、または「標準的なＸ反応条件」（ここで、Ｘは、使用される化学的不活性化薬剤である）という語句は、典型的には、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌを意味し、本明細書に記載されるある量の１つ以上の化学的不活性化剤（複数可）をさらに含む。特定の反応において、「標準的な反応条件」におけるＮａ_２ＨＰＯ_４の量は、規定されるようにいくらか変化し得る。

【0195】

「標準的な反応条件下で病原体を化学的不活性化剤のみと接触させることによって保持される免疫原性と比較して病原体の免疫原性の保持を増強する」という語句は、本明細書で使用される場合、特定の化学的不活性化剤を用いて「標準的な反応条件」下で見られる保持された病原体の免疫原性の量と、ある量の本明細書に記載される１つ以上の種類の無機多原子オキシアニオン（複数可）を補充し、かつ／またはある量の本明細書に記載される１つ以上のメチサゾン試薬（複数可）を補充して特定の化学的不活性化剤を用いて「標準的な反応条件」下で見られる保持された病原体の免疫原性の量との間の差異を指す。本明細書に開示される場合、化学的不活性化反応を無機多原子オキシアニオン（複数可）および／またはメチサゾン試薬（複数可）を補充することにより、化学的に不活性化された病原体の抗原性および／または免疫原性の保持が増強される（例えば、インビボ免疫応答が増強される）。

【0196】

「高レベルの無機多原子オキシアニオン」という語句は、本明細書で使用される場合、典型的には、従来使用されるレベル、例えば、従来技術におけるリン酸塩レベルよりも高い（例えば、１０〜２０ｍＭのリン酸塩よりも高い）レベルを指す。好ましい態様において、「高レベルの無機多原子オキシアニオン」とは、標準的なリン酸緩衝生理食塩水反応条件（標準的な反応条件））下で病原体を化学的不活性化剤（複数可）のみと接触させることによって保持される病原体の抗原性および／または免疫原性と比較して病原体の抗原性および／または免疫原性の保持を増強するのに十分なレベルを指す。本方法において、無機多原子オキシアニオンは、好ましくは、硫酸塩系またはリン酸塩系無機多原子オキシアニオンである。例えば、無機多原子オキシアニオンは、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、もしくは硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上から選択される多原子オキシアニオンであり得るか、または無機多原子オキシアニオンは、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルのリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、少なくとも５、少なくとも１５、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも５００ｍＭ、少なくとも７５０ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、および少なくとも１５００ｍＭのレベルの硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも３０、もしくは少なくとも６０ｍＭのレベルのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）、少なくとも０．０５、少なくとも０．１、少なくとも０．５、少なくとも１．５、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも１５、もしくは少なくとも３０ｍＭのレベルの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２５０、少なくとも５００、少なくとも７５０、少なくとも１０００、および少なくとも１５００ｍＭ）のレベルの硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）のうちの１つ以上であり得る。

【0197】

本方法において、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）、および／または硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）、および／または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）の濃度の好ましい範囲は、２０ｍＭ〜１，５００ｍＭ、２０ｍＭ〜１，０００ｍＭ、２０ｍＭ〜７５０ｍＭ、２０ｍＭ〜５００ｍＭ、２０ｍＭ〜２５０ｍＭ、２０ｍＭ〜１００ｍＭ、２０ｍＭ〜７５ｍＭ、２０ｍＭ〜５０ｍＭ、２０ｍＭ〜２５ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。

【0198】

本方法において、トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）の濃度の好ましい範囲は、０．０５ｍＭ〜６０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、および０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。

【0199】

本方法において、三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）の濃度の好ましい範囲は、０．０５ｍＭ〜３０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜３ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．５ｍＭ、０．０５ｍＭ〜１．０ｍＭ、０．０５ｍＭ〜０．５ｍＭ、および０．０５ｍＭ〜０．１ｍＭから選択される範囲、ならびにそれらの全ての可能な部分範囲および値である。

【0200】

本開示の文脈において、「室温」は、約１６℃（およそ６１°Ｆ）〜約２５℃（およそ７７°Ｆ）の温度の範囲内の任意の温度を指す。一般的に、室温は、約２０℃〜２２℃（６８°Ｆ〜７２°Ｆ）である。概して、室温という用語は、追加のエネルギーが試料または周囲温度を冷却（例えば、冷蔵）または加熱するために消費されないことを示すために使用される。

【0201】

「防腐剤」は、化学変化または微生物作用に起因する分解を防止するために組成物に添加される薬剤である。ワクチン産生との関連で、防腐剤は典型的には、微生物（例えば、細菌および真菌）成長を防止するために添加される。ワクチン産生で使用される最も一般的な防腐剤は、チメロサール、水銀含有有機化合物である。故に、「防腐剤不含」という用語は、防腐剤が本組成物に添加されていない（または、存在していない）ことを示す。

【0202】

「精製」（例えば、病原体または病原体を含有する組成物に関して）という用語は、組成物から成分、つまり所望されない存在を除去するプロセスを指す。精製は、相対用語であり、全ての微量の望ましくない成分が本組成物から除去されることを必要としない。ワクチン産生との関連で、精製は、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィー、親和性精製、沈殿、ならびに本明細書に開示される他の方法（例えば、凍結乾燥など）のようなかかるプロセスを含む。かかる精製プロセスは、本明細書に開示されるようにそれぞれの病原体を不活性化するために使用される試薬から不活性化された病原体成分を分離するために使用され得る。例えば、過酸化水素、金属試薬、「メチサゾン」、「メチサゾン類似体」、「メチサゾン官能基」、または「メチサゾン官能下部構造」は、不活性化された病原体成分から分離されて、精製されたワクチン組成物を提供し得る。例えば、残留メチサゾン、メチサゾン類似体、またはメチサゾン官能基もしくはメチサゾン官能下部構造を表す化学物質は、ワクチン抗原調製のために使用されるとき、０．０００１〜１０ｍＭの範囲にあり得る。最後の配合前にワクチン抗原からこれらの残留成分を除去または分離するために、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、混合様式／多様式クロマトグラフィー、ゲル濾過／サイズ排除クロマトグラフィー、脱塩クロマトグラフィー、タンジェント流濾過／血液透析濾過、密度勾配遠心分離、遠心濾過、透析、ワクチン抗原沈殿、またはワクチン抗原吸着を含むが、これらに限定されない広範な標準的な精製技法が使用され得る。

【0203】

「薬学的に許容される」という形容詞は、対象（例えば、ヒトまたは動物対象）への投与に対して、対象が生理学的に許容可能であることを示す。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）は、ワクチンを含む、治療および／または予防用組成物の薬学的送達に好適な組成物および配合物（希釈液を含む）を記載している。

【0204】

概して、希釈液の性質は、用いられる特定の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口配合物は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール、またはビヒクルなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射可能な流体を含む。ある特定の配合物（例えば、固体組成物、例えば、粉末、ピル、タブレット、またはカプセルの形態）において、液体希釈液は用いられない。かかる配合物において、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含む非毒性の固体担体が使用され得る。

【0205】

ワクチン産生で用いられる方法および手順に関する「適正製造規範」または「ＧＭＰ」という語句は具体的に、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）によって確立された一式の方法、プロトコル、および手順を指す。世界保健機関によって同様の推奨およびガイドラインが普及している。略語「ｃＧＭＰ」は具体的に、ＦＤＡ（例えば、ワールドワイドウェブのｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｄｍｐｑで利用可能である、２１の連邦規則集、パート２１０および２１１の下）によって現在承認されているプロトコルおよび手順を示す。経時的に、ｃＧＭＰ遵法手順は変化し得る。本明細書に開示される任意の方法は、ＦＤＡによって義務付けられる新しいｃＧＭＰ要件に従って適合され得る。

【0206】

病原体の不活性化
メチサゾン試薬、および／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含むものを含む二重酸化剤（複数可）を使用して病原体を不活性化するために、当該技術分野において成長させる（例えば、特定の生物を培養する）のに許容可能な任意の手順に従って生病原体を所望の密度（例えば、培養液の飽和密度）まで成長させる。典型的には、細胞性病原体に関して、かかる生物は、後のプロセスにおける負荷に対して、対数増殖相で収集されたものよりも概してより耐性があるため、病原体を固定相に培養することが望ましい。培養液における成長は、分光光度法を使用する培養液の光学密度の測定などの当該技術分野において既知の方法を使用して監視され得る。病原体がウイルスであるとき、成長は、選択されたウイルスのために確立された標準的な方法を使用するウイルスの力価によって監視され得る。例えば、動物ウイルスを成長させるための方法は、例えば、ＤＮＡ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｌａｎ Ｊ．Ｃａｎｎ（ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｒａｎａｇｅ（ｅｄｓ．）Ｖａｃｃｉｎｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００３、およびこれらに引用される参照文献で見ることができる。病原体細菌を培養するための方法も当該技術分野において知られており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．１−３，ｅｄ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９で見ることができる。マラリアなどの寄生体を培養するための方法も、例えば、Ｄｅｎｉｓｅ Ｄｏｏｌａｎ（ｅｄ．）Ｍａｌａｒｉａ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，２００２、およびこれらに引用される参照文献など、当該技術分野において知られている。

【0207】

典型的には、病原性生物は、ＲＮＡまたはＤＮＡゲノム（例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生体）を有し得、培地から精製され、ここで、それらが成長または培養され、中で複製する病原体の場合、細胞が他の細胞性成分から精製される。例えば、病原体を含む懸濁液の非病原体成分の相対濃度は、病原体の粗調製物と比較して、少なくとも５０％、例えば、約７０％、もしくは８０％の高さ、またはさらに９０％、９５％以上低下され得る。ウイルスなどの細胞内病原体は、当該技術分野において既知の多様な方法によって、それらが感染する細胞の多様な成分から単離または精製され得る。

【0208】

例えば、ワクチン産生のためのウイルスは典型的には、ｃＧＭＰ手順に従って生物学的および化学的に定義される培養培地を使用して認定される細胞株内で、制御された条件下で成長する。細胞は通常、感染症（ＭＯＩ）の適切な多重度でウイルスを用いて感染され、細胞は、培養条件下で、ウイルスの複製が高い力価になるのが可能になる十分な期間維持される。次いで、細胞は、（接着細胞の場合、培養液の表面から放出後）遠心分離によって収集され、適切に緩衝された溶液中で再懸濁される。回復を容易にするために、緩衝溶液は典型的には、細胞と比較して低浸透圧性であり、これにより、細胞の膨張が引き起こされる。任意に、細胞懸濁液は、周期的に撹拌されて、より均一な細胞の低浸透圧性溶液への曝露を確実にする。次いで、細胞は、例えば、均質化によって溶解されて、ウイルスを放出する。可溶化液は、遠心分離されて、細胞核などの巨大粒子物質を除去し、上清は、追加の細胞の残屑を除去するために濾過される。次いで、ウイルスは、スクロース密度勾配などの好適な分離培地の上に濾過された上清を重ねることによってさらに精製され得る。任意に、核ペレットは、さらに加工され、ウイルスの収率を増加し得る。核ペレットは、低浸透圧性緩衝液中で再度再懸濁され、均質化される。核可溶化液は、遠心分離され、得られた上清は、分離培地に重ねる前に濾過される。任意に、２つのウイルス懸濁液は、組み合わせられて、およそ等しい体積分離勾配を達成する。次いで、分離培地／ウイルス懸濁液は、超遠心分離によってプロセスされる（例えば、４℃で１〜１．５時間、５５，０００ｘｇで。ウイルスは、このプロセスによってペレット中に収集される一方で、膜状の細胞残屑が境界面に残る。上清は、（典型的には、吸引によって）除去され、ペレットは、緩衝液中で再懸濁される。次いで、精製されたウイルスは、回復および生存能に関して（例えば、それぞれタンパク質濃度を決定することによっておよびプラークアッセイによって）評価され得る。所望される場合、回復されたウイルスは、凍結され、使用するまで保管され得る。

【0209】

細胞内寄生体（例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍおよび他のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ（種）、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、およびＧｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｌｉａ、ならびにＴｏｘｏｐｌａｓｍａ、Ｅｉｍｅｒｉａ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ、およびＢａｂｅｓｉａ種を含む原虫寄生体）などの非ウイルス性病原体を精製するための同様の手順が当該技術分野において知られている。

【0210】

再構成および投与
粉末（例えば、凍結乾燥された粉末）として産生される、ワクチンなどの免疫原性組成物は典型的には、投与のために液体と混合される。このプロセスは、「再構成」として知られており、使用される液体は一般的に、「希釈液」と称される。特にヒト対象への投与の目的のために、希釈液が薬学的に許容される配合物であることが重要である。凍結乾燥された組成物の再構成は典型的には、希釈液の各バイアル用の滅菌シリンジおよび針を使用して行われる。各型およびバッチのための正確な希釈液は、得られた混合物の十分な効能、安全性、および滅菌性を確実にするために使用される。希釈液は具体的に、選択された組成物の送達および効能を最適化するように作られる。一般的な希釈液は、ワクチンの熱安定性を改善するための安定剤、粉末を液体中に溶解するのを補助するための界面活性剤などの薬剤、および再構成された組成物の正確な酸性バランスを確実にするための緩衝液としてかかる添加剤を含む。任意に、希釈液は、防腐剤（例えば、殺菌剤および／または防カビ剤）を含有して、再構成後の滅菌性を維持し得る。防腐剤は典型的には、組成物が複数回の用量の配合物に再構成されるとき（例えば、ＦＤＡによって）必要とされる。

【0211】

ワクチンなどの免疫原性組成物の投与（治療方法）
本明細書に開示される免疫原性組成物（ワクチンまたは他の薬品など）を対象に投与して、病原体に対する免疫応答を誘発することができる。最も一般的に、本組成物は、対象がまだ曝露されていない病原性生物に対する予防的免疫応答を誘発するために投与される。例えば、二重酸化で不活性化された病原体を含むワクチン組成物が、局所的または幅広いワクチン接種試みの一環として投与され得る。かかるワクチン組成物の投与によって誘発された免疫応答には、典型的には、中和抗体応答が含まれ、加えて、Ｔ細胞応答、例えば、細胞性病原体を標的とする細胞傷害性Ｔ細胞応答が含まれ得る。したがって、二重酸化で不活性化された病原体を含有する薬品または薬学的組成物を作製するための方法が本明細書に含まれる。薬学的組成物（薬品）は、二重酸化剤（複数可）を含有する溶液との接触によって、またはメチサゾン試薬をさらに含む二重酸化剤との接触によって、かつ／または高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在下で不活性化された少なくとも１つの病原体を薬学的に許容される担体または賦形剤中に含む。

【0212】

いくつかの事例において、免疫原性組成物は、ウイルス（例えば、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス）の組み合わせなどの病原体の組み合わせ、または細菌（例えば、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ種、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ、Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）の組み合わせ、または異なるクラスの生物から選択される病原体の組み合わせ、例えば、１つ以上のウイルスおよび１つ以上の細菌、１つ以上の細菌および１つ以上の寄生体などを含み得る。

【0213】

本組成物中に含まれる病原体の量は、対象に投与されたときに免疫応答を誘発するのに十分である。例えば、１つ以上の用量で対象に投与された場合、不活性化された病原体を含有するワクチン組成物は、有利に、病原体に対する保護免疫応答を誘発する。ワクチン組成物の用量は、少なくとも約０．１ｗｔ／ｗｔ％の不活性化された病原体〜約９９ｗｔ／ｗｔ％の不活性化された病原体を含み得、ワクチン組成物のバランスは、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容される希釈液などの薬学的に許容される構成要素で構成される。ワクチン配合物に関するガイドラインは、例えば、米国特許第６，８９０，５４２号および同第６，６５１，６５５号で見つけることができる。特定の非限定的な一例において、ワクチン組成物（薬品）は、少なくとも約１ｗｔ／ｗｔ％、例えば、約５ｗｔ／ｗｔ％、約１０ｗｔ／ｗｔ％、約２０ｗｔ／ｗｔ％、約３０ｗｔ／ｗｔ％、または約５０ｗｔ／ｗｔ％の不活性化された病原体を含む。当業者には明らかであろうように、ワクチン配合物中に存在する病原体の量は、本組成物が液体であるか固体であるかに依存する。固体組成物中の不活性化された病原体の量は、液体組成物中で耐えられる量を上回り得る。あるいは、不活性化された病原体の量は、免疫応答をもたらすのに必要とされる生または不活性化された病原体の同程度の量に関して計算され得る。例えば、約１０^６〜約１０^１２のプラーク形成単位（ＰＦＵ）の生ウイルスまたは弱毒化ウイルスを形成するためのウイルス粒子中の同等の投与量が、ワクチン組成物の用量中に含まれ得る。同様に、ワクチン組成物は、約１０^３〜約１０^１０の生の生物と同等な量の（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡゲノムで）不活性化された病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌、または寄生体を含み得る。あるいは、投与量は、タンパク質含有量または濃度に関して提供され得る。例えば、用量は、およそ０．１μｇ以上、例えば、少なくとも約０．５μｇのタンパク質を含み得る。例えば、用量は、約１μｇの単離または精製されたウイルスもしくは最大約１００μｇの他の病原体、またはより多くの選択された病原体を含み得る。感染単位（例えば、ＰＦＵ）での同等の用量が病原体によって変化し得るが、適切なタンパク質用量は、推定される（例えば、ＰＦＵから）か、または経験的に決定され得る。例えば、典型的な調製中、１μｇの精製されたワクシニアウイルスは、およそ２×１０^６ＰＦＵと同等である。同様の変換が、目的とする任意の病原体について決定され得る。

【0214】

典型的には、ワクチン組成物（薬品）の調製は、本質的にピロゲン不含、ならびにヒトまたは動物に有害であり得る任意の他の不純物不含の薬学的組成物の調製を伴う。典型的には、薬学的組成物は、組成物の成分を安定させ、かつ抗原提示細胞によるワクチン抗原の適切なプロセシングおよび提示を可能にするのに適切な塩および緩衝液を含有する。かかる成分は、凍結乾燥形態で供給され得るか、または凍結乾燥形態から投与に好適な液体形態への再構成のために使用される希釈液中に含まれ得る。あるいは、不活性化された病原体が（例えば、粉末またはペレットとして）固体形態での投与のために調製される場合、好適な固体担体が配合物中に含まれる。

【0215】

水性組成物は、典型的には、薬学的に許容される希釈液または水性媒体中に分散した（例えば、溶解または懸濁した）有効量の不活性化された病原体を含む。「薬学的に許容される」という語句は、ヒトまたは動物対象に投与されたときに有害反応、アレルギー反応、または他の望ましくない反応をもたらさない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などが含まれる。任意に、薬学的に許容される担体または希釈液は、抗菌性、抗真菌性、または他の防腐剤を含み得る。薬学的に活性な物質のためのかかる媒体および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。いずれの従来の媒体も薬剤も不活性化された病原体による免疫応答の発生と不適合である場合を除き、免疫原性組成物におけるその使用が企図される。補足の活性成分も本組成物中に組み込まれ得る。例えば、ある特定の薬学的組成物は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの好適な界面活性剤と混合された水性希釈液中に不活性化された病原体を含み得る。分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物、ならびに油中に調製され得る。いくつかの事例において（例えば、液体配合物が望ましいと見なされる場合、または凍結乾燥されたワクチン組成物が単一の容器内で複数回投与のために再構成される場合）、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための防腐剤を含有する。

【0216】

薬学的に許容される担体、賦形剤、および希釈液は、当業者に既知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）に記載されており、不活性化された病原体の薬学的送達に好適な組成物および配合物について説明している。

【0217】

概して、担体の性質は、用いられる特定の投与様式に依存するであろう。例えば、非経口配合物は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロール、またはビヒクルなどの薬学的および生理学的に許容される流体を含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、ピル、タブレット、またはカプセル形態）に関して、従来の非毒性の固体担体は、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、微量の非毒性の補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有し得る。

【0218】

例えば、薬学的組成物（薬品）は、安定化洗剤、ミセル形成剤、および油のうちの１つ以上を含み得る。好適な安定化洗剤、ミセル形成剤、および油は、米国特許第５，５８５，１０３号、米国特許第５，７０９，８６０号、米国特許第５，２７０，２０２号、および米国特許第５，６９５，７７０号に詳述されている。安定化洗剤は、エマルションの成分が安定したエマルションのまま留まることを可能にする任意の洗剤である。かかる洗剤には、ポリソルベート、８０（ＴＷＥＥＮ８０）（ソルビタン−モノ−９−オクタデカノエート−ポリ（オキシ−１，２−エタンジイル、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥによって製造されたもの）、ＴＷＥＥＮ ４０（商標）、ＴＷＥＥＮ ２０（商標）、ＴＷＥＥＮ ６０（商標）、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（商標）３〜１２、ＴＥＥＰＯＬ ＨＢ７（商標）、およびＳＰＡＮ ８５（商標）が含まれる。これらの洗剤は、通常、およそ０．０５〜０．５％、例えば、約０．２％の量で提供される。ミセル形成剤は、ミセル様構造が形成されるように他の成分と形成されたエマルションを安定させることができる薬剤である。かかる薬剤は、一般に、マクロファージを動員して細胞性応答を増強するために注射部位にいくらかの刺激を引き起こす。かかる薬剤の例としては、例えば、Ｓｃｈｍｏｌｋａ，Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．５４：１１０，１９７７、およびＨｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １２９：１２４４，１９８１に記載されるポリマー界面活性剤、ならびにＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｌ６２ＬＦ、Ｌ１０１、およびＬ６４、ＰＥＧ１０００、およびＴＥＴＲＯＮＩＣ（商標）１５０１、１５０Ｒ１、７０１、９０１、１３０１、および１３０Ｒ１などの薬剤が挙げられる。かかる薬剤の化学構造は、当該技術分野において周知である。一実施形態において、本薬剤は、Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１３３：３１６７，１９８４によって定義されるように、０〜２の親水性物質−脂溶性物質バランス（ＨＬＢ）を有するように選択される。本薬剤は、例えば、０．５〜１０％の有効量で、または１．２５〜５％の量で提供され得る。

【0219】

本組成物中に含まれる油は、水中油型エマルション中での病原体の保持を促進し、好ましくは、エマルションが室温で形成されるか、またはエマルションの温度が室温に調整された時点で形成されるかのいずれかが起こるように６５℃未満の融解温度を有するように選択される。かかる油の例としては、スクアレン、スクアラン、ＥＩＣＯＳＡＮＥ（商標）、テトラテトラコタン、グリセロール、およびピーナッツ油、または他の植物油が挙げられる。特定の非限定的な一例において、油は、１〜１０％または２．５〜５％の量で提供される。油は、身体が油を経時的に分解することができ、かつ油の使用時に有害作用が顕著に表れないように、生分解性および生体適合性の両方であるべきである。

【0220】

任意に、薬学的組成物または薬品は、病原体に対する免疫応答を増加するのに好適なアジュバントを含み得る。本明細書で使用される場合、「アジュバント」は、免疫応答の任意の増強剤または促進剤である。「好適な」という用語は、ワクチン接種された対象に有害反応をもたらすことなく、免疫応答を増大するために選択される病原体と組み合わせて使用され得る任意の物質を含むよう意図されている。特定のアジュバントの有効量は、ワクチン接種された対象の免疫応答へのアジュバントの増強効果を最適化するように容易に決定され得る。例えば、好適なアジュバントは、ワクチン配合物との関連で、０３％〜５％（例えば、２％）水酸化アルミニウム（または、リン酸アルミニウム）およびＭＦ−５９油エマルション（０．５％ポリソルベート８０および０．５％トリオレイン酸ソルビタンを含む。スクアレン（５．０％）水性エマルション）は、ワクチンとの関連で有利に利用されている別のアジュバントである。例えば、アジュバントは、Ｐｒｏｖａｘ（登録商標）（ＤＥＣ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の名称で入手可能な安定化洗剤、ミセル形成剤、および油の混合物であり得る。アジュバントは、ＣｐＧモチーフを含む核酸などの免疫刺激核酸でもあり得る。他のアジュバントには、鉱物、水エマルションとの植物油または魚油、不完全フロイントアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｊ５、硫酸デキストラン、硫酸鉄、酸化鉄、アルギン酸ナトリウム、バクトアジュバント、ある特定の合成ポリマー、例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（ＢＦ Ｇｏｏｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、ポリアミノ酸およびアミノ酸コポリマー、サポニン、カラギーナン、ＲＥＧＲＥＳＳＩＮ（Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｇａ．）、ＡＶＲＩＤＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−プロパンジアミン）、Ｏ−アセチル化基が散在した長鎖多分散ベータ（１，４）結合マンナンポリマー（例えば、ＡＣＥＭＡＮＮＡＮ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種の非病原性菌株（例えば、ＥＱＵＩＭＵＮＥ，Ｖｅｔｒｅｐｈａｒｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．，Ａｔｈｅｎｓ Ｇａ．）に由来する高度に精製された除タンパク細胞壁抽出物、モノオレイン酸マンナイト（ｍａｎｎｉｔｅ ｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）、パラフィン油、およびムラミルジペプチドが含まれる。好適なアジュバントは、当業者によって選択され得る。

【0221】

薬学的組成物（薬品）は、治療または予防レジメン（例えば、ワクチン）での使用のために調製され得、１つ以上の病原体に対する免疫応答を誘発するためにヒトまたは非ヒト対象に投与され得る。例えば、本明細書に記載される組成物は、１つ以上の病原体に対する保護免疫応答を誘発するためにヒト（または、非ヒト）対象に投与され得る。免疫応答を誘発するために、治療的に効果的な（例えば、免疫学的に効果的な）量の不活性化された病原体が、ヒト（または、非ヒト）対象などの対象に投与される。

【0222】

「治療有効量」は、治療されている対象における所望の効果を達成するために使用される組成物の量である。例えば、これは、免疫応答を刺激するか、感染症を防止するか、症状を軽減するか、または病原体の伝染を阻止するのに必要な量であり得る。対象に投与される場合、インビトロ効果を達成するために経験的に決定された標的組織濃度（例えば、抗原提示細胞中）を達成する投与量が一般に使用されるであろう。かかる投与量は、当業者による過度の実験なしで決定され得る。

【0223】

不活性化された病原体を含有するワクチン組成物などの免疫原性組成物は、当業者に既知の任意の手段により、例えば、筋肉内注射、皮下注射、または静脈注射により投与され得るが、口腔、経鼻、および経皮ミュート（ｍｕｔｅｓ）も企図される。一実施形態において、投与は、皮下注射または筋肉内注射によるものである。不活性化された病原体が応答を刺激するのに利用可能である時間を延長するために、ペプチドは、油性注射、微粒子状系、またはインプラントとして提供され得る。微粒子状系は、微粒子、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、または同様の粒子であり得る。合成ポリマーベースの微粒子状担体は、制御放出の提供に加えて、免疫応答を増強するためのアジュバントとして作用することが示されている。

【0224】

液体配合物の代替として、本組成物は、固体形態で、例えば、粉末、ペレット、またはタブレットとして投与され得る。例えば、ワクチン組成物は、経皮無針注射デバイス、例えば、ヘリウムによって作動するＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（登録商標）注射デバイスを使用して、粉末として投与され得る。この装置は、ワクチン組成物の粉末配合物、例えば、不活性化された病原体を含有するワクチン組成物の粉末配合物を高速で推進するために加圧ヘリウムガスを使用し、ワクチン粒子が角質層を穿孔して表皮に着地するようになる。

【0225】

ポリマーも制御放出のために使用され得る。制御された薬物送達に使用するための多様な分解性および非分解性ポリマーマトリックスが、当該技術分野において既知である（Ｌａｎｇｅｒ，Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２６：５３７，１９９３）。例えば、ブロックコポリマーであるポラキサマー４０７は、低温で粘性であるが可動性の液体として存在するが、体温で半固体ゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの配合および持続送達にとって効果的なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４２５，１９９２、およびＰｅｃ，Ｊ．Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．４４（２）：５８，１９９０）。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質の制御放出の微小担体として使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．１１２：２１５，１９９４）。なお別の態様において、リポソームが、脂質でカプセル化された薬物の制御放出、ならびに薬物標的のために使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，１９９３）。治療用タンパク質の制御送達のための多数のさらなる系が既知である（例えば、米国特許第５，０５５，３０３号、米国特許第５，１８８，８３７号、米国特許第４，２３５，８７１号、米国特許第４，５０１，７２８号、米国特許第４，８３７，０２８号、米国特許第４，９５７，７３５号、および米国特許第５，０１９，３６９号、米国特許第５，０５５，３０３号、米国特許第５，５１４，６７０号、米国特許第５，４１３，７９７号、米国特許第５，２６８，１６４号、米国特許第５，００４，６９７号、米国特許第４，９０２，５０５号、米国特許第５，５０６，２０６号、米国特許第５，２７１，９６１号、米国特許第５，２５４，３４２号、および米国特許第５３３０９６号）。

【0226】

特定の非限定的な例において、不活性化された病原体（例えば、原虫寄生体などの寄生体、または細菌性病原体）が、細胞性免疫応答（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答）を誘発するために投与される。インビトロおよびインビボの両方での細胞性応答を誘導するためのいくつかの手段が既知である。脂質が、多様な抗原に対するＣＴＬ応答のインビボでのプライミングを補助することができる薬剤として特定されている。例えば、米国特許第５，６６２，９０７号に記載されているように、パルミチン酸残基は、リジン残基のアルファおよびエプシロンアミノ基に結合し、次いで、ｌｉｎｋｅｄ（例えば、１つ以上の連結残基、例えば、グリシン、グリシン−グリシン、セリン、セリン−セリン等を介して）免疫原性ペプチドまたはタンパク質に連結することができる。次いで、脂質化ペプチドは、ミセル形態で直接注射され得るか、リポソーム中に組み込まれ得るか、またはアジュバント中で乳化され得る。別の例として、Ｅ ｃｏｌｉリポタンパク質、例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステインリセリル−セリンが、適切なペプチドに共有結合したときに腫瘍特異的ＣＴＬをプライミングするために使用され得る（Ｄｅｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：５６１，１９８９を参照されたい）。さらに、中和抗体の誘導として、適切なエピトープを提示するペプチドにコンジュゲートされる同じ分子でプライミングされてもよく、２つの組成物を組み合わせて、望ましいと見なされる場合、体液性応答および細胞媒介性応答の両方を誘発することができる。

【0227】

対象における免疫応答、例えば、保護免疫応答を誘発するのに十分な投与量の不活性化された病原体が投与される。ウイルス性病原体に関して、投与量は、典型的には、感染性（例えば、毒性または弱毒化）ウイルスの特定力価と同等の生物学的物質の量に基づいて計算される。例えば、約１０^６、または約１０^７、または約１０^８、または約１０^９、または約１０^１０、または約１０^１１、または約１０^１２と同等の用量、または１用量当たりより多くの生ウイルスが、対象における免疫応答を誘発するために投与され得る。いくつかの事例において、この用量は、不活性化ワクチンが対象への投与後に数を増加させることができないため、免疫応答を誘発するために利用される生ウイルスの量の過剰量を含む。細胞性病原体、例えば、細菌、真菌、または寄生体の量を計算する場合、その量は、配合物に応じて、生細菌の用量との比較、例えば、約１０^３の細胞または生物〜約１０^１０の生きている生物との比較によって計算され得る。例えば、この用量は、約２５ｍｇ（例えば、約１０ｍｇ、または約１５ｍｇ、または約２０ｍｇ）、またはさらにより多くの不活性化された病原体に対して１用量につき少なくとも約１００ナノグラム（または、２００ナノグラム、または５００ナノグラム、または１マイクログラム）のタンパク質抗原を含み得る。典型的には、ワクチン組成物は、追加の薬学的に許容される構成要素または成分を含む。したがって、ワクチン組成物は、少なくとも約０．１ｗｔ／ｗｔ％の不活性化された病原体〜約９９ｗｔ／ｗｔ％の不活性化された病原体を含み得、ワクチン組成物のバランスは、薬学的に許容される構成要素、例えば、１つ以上の薬学的に許容される担体、薬学的に許容される安定剤、および／または薬学的に許容される希釈液で構成される。ワクチン配合物に関するガイドラインは、例えば、米国特許第６，８９０，５４２号および同第６，６５１，６５５号で見つけることができる。用量は、タンパク質濃度（または、ＰＲＪなどの感染単位等価物の感染単）に基づいて計算され得る。最適な投与量は、例えば、マウスおよび非ヒト霊長類での前臨床研究、続いて、第Ｉ相臨床治験におけるヒトでの試験において経験的に決定され得る。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に既知であるか、または当業者に明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１９９５などの出版物により詳細に記載されている。

【0228】

典型的であって必ずしもではないが、ワクチン組成物は、病原体、例えば、ワクチンへの対象の曝露前に投与される。ワクチン組成物は、本明細書に記載される方法に従って、二重酸化条件を使用して、またはメチサゾン試薬（複数可）および／もしくは高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化条件を使用して、様々な病原体を不活性化することによって調製され得る。例えば、ワクチン組成物は、病原性ウイルスを、二重酸化試薬（複数可）を含有する溶液、またはメチサゾン試薬（複数可）をさらに含む二重酸化試薬（複数可）を含有する溶液で不活性化することによって調製され得る。ワクチン産生のための二重酸化方法によって不活性化され得るウイルスの非限定的な例が、本明細書に開示される。

【0229】

細菌性病原体も、ワクチン組成物での使用のために、二重酸化試薬（複数可）を使用して、またはメチサゾン試薬（複数可）および／もしくは高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化条件を使用して不活性化され得る。ワクチン産生のための二重酸化方法によって不活性化され得る細菌の非限定的な例が、本明細書に開示される。

【0230】

ワクチン組成物は、二重酸化試薬（複数可）を使用して、またはメチサゾン試薬（複数可）および／もしくは高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化条件を使用して、不活性化された菌類病原体からも産生され得る。ワクチン産生のための二重酸化方法によって不活性化され得る真菌性病原体の非限定的な例が、本明細書に開示される。

【0231】

ワクチン組成物は、二重酸化試薬（複数可）を使用して、またはメチサゾン試薬（複数可）および／もしくは高レベルの１つ以上の無機多原子オキシアニオンの存在をさらに含む二重酸化条件を使用して不活性化された寄生性病原体からも産生され得る。ワクチン産生のための二重酸化方法によって不活性化され得る寄生性病原体の非限定的な例が、本明細書に開示される。

【0232】

記載される方法または組成物の正確な詳細が記載される本発明の主旨から逸脱することなく変更または修正され得ることが明らかであろう。以下の実施例は、ある特定の具体的な特徴および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本発明を記載される具体的な特徴または実施形態に限定するように解釈されるべきではない。以下に引用される参考文献は各々、全ての目的のために参照により組み込まれる。

【実施例】

【0233】

実施例１
（標準的なＨ_２Ｏ_２に基づく不活性化がＣＨＩＫＶを不活性化することが示されたが、ＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープを損傷し、ワクチン接種後のインビボでの中和応答を誘導できなかった）
図２は、標準的なＨ_２Ｏ_２に基づく不活性化がＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープを破壊し、ワクチン接種後のインビボでの中和応答を誘導できないことを示す。

【0234】

図２Ａでは、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）試料は、処理を受けない（生ＣＨＩＫＶ）か、または標準的な濃度のＨ_２Ｏ_２（３％のＨ_２Ｏ_２ＣＨＩＫＶ）で、室温で７時間処理された。処理後、抗原を、Ｅ１およびＥ２構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＣＨＩＫＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡで試験した。ＥＬＩＳＡ値を、生ウイルス対照のパーセンテージとして表す。

【0235】

図２Ｂでは、Ｈ_２Ｏ_２で処理されたＣＨＩＫＶ（３％のＨ_２Ｏ_２ＣＨＩＫＶ）を試験し、０．１％のミョウバンとともに配合された残留生ウイルスに対して陰性であることを見出し、０日目および２８日目に成体ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝８）を免疫化するために使用した。対照マウス（偽、ｎ＝３）を希釈液中のミョウバンで同じスケジュールで免疫化した。最後の免疫化の２週間後、末梢血を収集し、血清に処理し、群毎にプールした。プールした血清を、標準的なＣＨＩＫＶ ５０％プラーク減少中和アッセイ（ＰＲＮＴ_５０）を使用して試験した。３％のＨ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶ群および偽ワクチン接種群からの試料は血清反応陰性であり、破線で示されるように、ＰＲＮＴ_５０力価が１０未満であった。比較のために、皮内足蹠経路により生ＣＨＩＫＶで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝５）（１，０００ＰＦＵのＣＨＩＫＶ−ＳＬ１５６４９）を示し（図２Ｂの最左の棒グラフ）、中和力価を感染の３６日後に試験した。検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。

【0236】

実施例２
（出願者により、Ｈ_２Ｏ_２のみでの単純な酸化と比較して根本的に異なる機構を有する二重酸化系微生物不活性化が見出され、したがって、先端的な有効なワクチン抗原の開発のための二重酸化系微生物不活性化の潜在的な使用は推奨されなかった）
フェントン型反応が病原体を死滅させるためのみに使用されており、ワクチンの開発に使用されておらず、その使用も提案されていない一方で、それでもなお、かかる反応を、ワクチン産生の目的のために微生物病原体を不活性化する潜在性について試験した。Ｈ_２Ｏ_２とは対照的に、不活性化手順中の溶液の総タンパク質濃度がＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化不活性化速度に影響を及ぼすことが見出されたため、初期の不活性化データは、驚くべきことであり、予想外であった。タンパク質濃度が出願者の標準的なＨ_２Ｏ_２手法を使用してウイルス不活性化に影響を及ぼさないことが以前に示されたため、このＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系の結果は予想外であった。しかしながら、ＤＥＮＶ２について図１Ａおよび１Ｂに示されるように、タンパク質濃度は、ウイルス不活性化速度実質的に影響を及ぼし、より高いタンパク質レベルがより遅いウイルス不活性化をもたらした。

【0237】

具体的に、図１Ａおよび１Ｂは、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化系を使用するウイルス不活性化の速度がタンパク質濃度依存性である一方で、標準的なＨ_２Ｏ_２系ウイルス不活性化はタンパク質濃度非依存性であることを示す。図１Ａにおいて、精製されたＤＥＮＶ２を、３％のＨ_２Ｏ_２、または図１Ｂにおいて、０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μＭのＣｕＣｌ_２のいずれかで、室温で処理し、示されるように、総ウイルス性タンパク質の濃度を増加させた。試料を予め特定した時点で除去し、標準的なプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイを使用してウイルス力価について評価した。検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。

【0238】

二重不活性化手順中の溶液の総タンパク質濃度への依存性は予想外であり、Ｈ_２Ｏ_２のみと比較して根本的に異なる機構が関連しており、故に、出願者の以前の単純な酸化（例えば、Ｈ_２Ｏ_２のみで）（例えば、米国特許第８，１２４，３９７号および同第８，７１６，０００号）に基づく方法を考慮して、効果的なワクチン産生のための二重酸化に基づく不活性化手順の効能／使用が疑わしく、予想不可能であったことを示す。

【0239】

実施例３
（二重酸化フェントン型酸化系を使用して、ＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープの維持を改善すると同時に、効率的な不活性化を提供した）
図３は、二重酸化フェントン型酸化系の使用が、ＣＨＩＫＶ特異的中和エピトープの維持を改善すると同時に、効率的な不活性化を提供することを示す。

【0240】

図３Ａにおいて、精製されたＣＨＩＫＶをＨ_２Ｏ_２のみの増加濃度で処理した。

【0241】

図３Ｂ、精製されたＣＨＩＫＶをＣｕＣｌ_２のみで処理した。

【0242】

図３Ｃでは、精製されたＣＨＩＫＶを、Ｈ_２Ｏ_２の増加濃度を有するＣｕＣｌ_２（１０μΜ）で処理して、二重酸化フェントン型系を得た。抗原処理を室温で２０時間継続させた。

【0243】

処理後、抗原を、Ｅ１およびＥ２構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＣＨＩＫＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡで試験した。ＥＬＩＳＡ値を、生ウイルス対照のパーセンテージとして表す。処理後、材料を、標準的なプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイを使用して生ウイルスについても試験した。結果として得られたウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を条件毎に示す。除染試薬（図３Ａおよび３Ｂ）のいずれの増加濃度も不活性化の増強をもたらしたが、抗原性を著しく低下させた。驚くべきことに、対照的に、組み合わせられたＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系を使用して、完全なウイルス不活性化をもたらすと同時に抗原性を完全に維持した最適な不活性化条件が特定された（図３Ｃ）。検出可能な生ウイルス（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示さなかった成功した条件を星印で示す。１０μΜのＣｕＣｌ_２および０．００２％のＨ_２Ｏ_２の最適な条件のみが９０％以上の抗原性の保持（破線で示す）を達成すると同時に、検出可能な生ウイルスを示さなかったことに留意されたい。

【0244】

実施例４
（ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種が急速な中和抗体応答を誘導し、ＣＨＩＫＶ関連病変から保護した）
Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で処理したＣＨＩＫＶ候補の免疫原性を評価するために、ワクチン抗原をミョウバンアジュバントとともに配合し、複数回用量レベル（動物当たり１０または４０μｇ）でマウスを免疫化するために使用した。図４に示されるように、ワクチン接種が、従来のＨ_２Ｏ_２手法とは全く対照的に、急速かつロバストな中和抗体力価をもたらした（図２）。ワクチン効能の最終試験として、免疫化マウスを野生型ＣＨＩＫＶに曝露し、関節炎症性疾患からの完全な保護を実証した（図５）。

【0245】

図４は、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種が急速な中和抗体応答を誘導したことを示す。具体的に、最適化されたＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチンを１０μｇまたは４０μｇ用量で０．１％のミョウバンとともに配合し、一次用量を０日目に与え、１４日目に追加免疫用量を与えた（矢印で示す）。血清試料を示される時点で収集し、標準的なプラーク減少中和力価アッセイ（ＰＲＮＴ_５０）を使用してＣＨＩＫＶ特異的中和活性についてアッセイした。１０μｇ群の中和力価は、動物を２１日目にＣＨＩＫＶに曝露する前の最後の時点であるため、一次ワクチン接種後２０日目に終わる。群平均（±ＳＥＭ）を時点毎に示す。この研究の検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。未処理のワクチン接種されていない対照も試験し、ＬＯＤ未満であることを見出した。

【0246】

図５Ａおよび５Ｂは、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種が急速な中和抗体応答を誘導し、ＣＨＩＫＶ関連病変から保護したことを示す。具体的に、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチンを１０μｇまたは４０μｇ用量でミョウバンとともに配合し、一次免疫化を０日目に与え、追加免疫用量を成体Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝５／群）または偽ワクチン接種された対照（ミョウバンのみ）に１４日目に投与した。マウスの右足蹠を、一次ワクチン接種の３２日後（４０μｇ群）または２１日後（１０μｇ群）のいずれかで１，０００ＰＦＵのＣＨＩＫＶ−ＳＬ１５６４９（ＣＨＩＫＶの毒性菌株）に曝露した。（図５Ａ）４０μｇ用量または（図５Ｂ）１０μｇ用量でワクチン接種したマウスにおけるＣＨＩＫＶ関連脚膨張をキャリパーで１４日間にわたって測定した。有意差を星印で示す（スチューデントｔ検定、Ｐ＜０．０５）。

【0247】

ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−ＣＨＩＫＶワクチン接種は、急速かつロバストな中和抗体力価（図４）をもたらし、関節炎症性疾患からの完全な保護を実証した（図５）。

【0248】

実施例５
（Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系酸化を使用して、効果的な不活性化ＹＦＶワクチンを開発した）
ＣＨＩＫＶ、モデルアルファウイルスを用いて実証された有望な結果に基づいて、ＹＦＶなどのフラビウイルスに対するこの系の有用性が探求された。予備的分析は、０．００２％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２の濃度が、抗原性と急速なウイルス不活性化との間の機能的バランスを表したことを提示した（図６Ａ）。

【0249】

０．０１０％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２（完全な不活性化を確実にするため）のさらに最適化された条件を使用して、ＹＦＶ用のワクチン材料を産生し、成体ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化するために使用した。ワクチン接種後、全ての動物は、Ｈ_２Ｏ_２のみを使用して調製されたＹＦＶワクチンで免疫化された動物に関する４０未満の中和力価と比較して、２４０の平均中和力価で測定可能な中和力価を示した（図６Ｂ）。ワクチン接種後の免疫原性におけるこれらの差異は、ＹＦＶを３％のＨ_２Ｏ_２で２０時間処理したときに観察される中和エピトープ（すなわち、抗原性）に対する重度の損傷に基づいて予測され得る。

【0250】

図６Ａおよび６Ｂは、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系酸化が、不活性化ＹＦＶワクチンの開発において成功裏に使用され、ワクチン接種後の中和エピトープに結合する抗体の保持の増強（抗原性）および免疫原性の改善を実証することを示す。

【0251】

具体的に、図６Ａに示されるように、精製されたＹＦＶを示される条件で、室温で２０時間処理した。処理後、抗原を、エンベロープ構造タンパク質に特異的な中和モノクローナル抗体からなるＹＦＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して試験した。ＥＬＩＳＡ値を、生ウイルス対照のパーセンテージとして表す。処理後、材料を、標準的なプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイを使用して生ＹＦＶについても試験した。結果として得られたウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を条件毎に示す。検出可能な生ウイルスを示さなかった成功した条件を星印で示す。

【0252】

具体的に、図６Ｂに示されるように、標準的なＨ_２Ｏ_２に基づく不活性化ＹＦＶ（３％のＨ_２Ｏ_２、７時間）でのマウスの免疫化を、最適化されたＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１ｕＭ ＣｕＣｌ_２、室温で２０時間）と比較した。不活性化後、ワクチン調製物を試験し、生ウイルスに対して陰性であることを見出した。各ワクチンを５μｇ（３％のＨ_２Ｏ_２）または１０μｇ（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μＭのＣｕＣｌ_２）用量でミョウバンとともに配合し、一次免疫化を０日目に与え、追加免疫用量を１４日目および２５日目に成体ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５／群）に投与した。動物を４２日目に中和抗体力価について試験した。検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。

【0253】

したがって、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系酸化が不活性化ＹＦＶワクチンの開発において成功裏に使用され、ワクチン接種後の中和エピトープに結合する抗体の保持の増強（抗原性）および免疫原性の改善を実証する。

【0254】

実施例６
（Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系酸化が不活性化ＤＥＮＶワクチンの開発において成功裏に使用された）
ＹＦＶ、別のモデルフラビウイルスを用いて実証された有望な結果に基づいて、デング熱３（ＤＥＮＶ３）をＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２系で試験した。

【0255】

ＹＦＶを用いて、初期の試験は、０．００２％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２濃度が、高い抗原性を維持すると同時に、完全なウイルス不活性化も提供するための最適な手法を表したことを示した（図７）。

【0256】

具体的に、図７は、二重酸化フェントン型酸化系の使用が、デング熱ウイルス３特異的中和エピトープを維持しながら不活性化の増強を実証したことを示す。精製されたデング熱ウイルス３（ＤＥＮＶ３）を示される条件で、室温で２０時間処理した。処理後、抗原を、エンベロープ構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡで試験した。ＥＬＩＳＡ値を、生ウイルス対照のパーセンテージとして表す。処理後、材料を、標準的なプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイを使用して生ＤＥＮＶ３についても試験した。結果として得られたウイルス力価（ＰＦＵ／ｍＬ）を条件毎に示す。検出可能な生ウイルス（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示さなかった成功した条件を星印で示す。１μΜのＣｕＣｌ_２および０．００２％のＨ_２Ｏ_２の最適な条件のみが高い抗原性を保持すると同時に、検出可能な生ウイルスを示さなかったことに留意されたい。

【0257】

これらの予備的Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化条件を使用して、各ＤＥＮＶ血清型のワクチンロットを産生し、０．１０％の水酸化アルミニウムでアジュバント化された四価のデング熱ワクチン中に配合し、成体アカゲザルを免疫化するために使用した。単一の追加免疫化後、全てのサルが、４つのデング熱ウイルス血清型のうちの３つに関して中和抗体応答の改善およびＨ_２Ｏ_２のみでの不活性化と比較して幾何平均力価の平均８倍の増加を実証したＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化手法で血清転換した（ＮＴ_５０≧１０）（図８）。

【0258】

具体的に、図８は、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化系が、アカゲザルにおける四価のＤＥＮＶワクチンに対してインビボ免疫原性を増強したことを示す。精製されたＤＥＮＶを、３％のＨ_２Ｏ_２（７時間、室温）またはＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２（０．００２％のＨ_２Ｏ_２のいずれかおよび１μΜのＣｕＣｌ_２、２０時間、室温）で処理した。完全な不活性化を標準的なプラークアッセイおよび共培養で確認した。ワクチン抗原を等しい濃度（３％のＨ_２Ｏ_２の場合１μｇ／血清型、またはＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２の場合２μｇ／血清型）でブレンドし、０．１％のミョウバンとともに配合した。成体アカゲザル（ｎ＝４／群）を０日目および２８日目に筋肉内に免疫化し、中和力価（ＮＴ_５０）を追加免疫化の１ヶ月後に測定した。検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。

【0259】

これらの研究において抗原用量（１μｇ／血清型対２μｇ／血清型）にわずかな差異しかなく、したがって、実験を同じ用量の四価のデング熱ワクチン抗原でワクチン接種されたマウスで繰り返した（図９）。

【0260】

具体的に、図９は、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２二重酸化系がマウスにおける四価のＤＥＮＶワクチンに対してインビボ免疫原性を増強することを示す。精製されたＤＥＮＶを、３％のＨ_２Ｏ_２（７時間、室温）またはＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２（０．００２％のＨ_２Ｏ_２のいずれかおよび１μΜのＣｕＣｌ_２、２０時間、室温）で処理した。完全な不活性化を標準的なプラークアッセイおよび共培養で確認した。ワクチン抗原を等しい濃度（２μｇ／血清型）でブレンドし、０．１％のミョウバンとともに配合した。成体ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４〜５／群）を０日目、１４日目、および２８日目に皮下に免疫化し、中和力価（ＮＴ_５０）を最終免疫化の２週間後に測定した。検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。

【0261】

これらの実験において、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化の二重酸化手法は、４つ全てのデング熱ウイルス血清型に関して３％のＨ_２Ｏ_２よりも免疫原性であり、中和抗体力価においては８倍〜８００倍超の改善をもたらした。

【0262】

実施例７
（ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２系酸化は、インフルエンザウイルスでの抗原性の改善を実証した）
２つのウイルス科（ＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅおよびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）にわたって観察された肯定的な結果を考慮して、この新しい不活性化プラットホームを使用して試験するための追加のウイルス科を選択した。

【0263】

本実施例に示されるように、インフルエンザＡウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科）を、標準的な３％Ｈ_２Ｏ_２手法、紫外線不活性化、または最適化されたＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２系（０．００２％のＨ_２Ｏ_２および１μＭのＣｕＣｌ_２）を使用して試験した。抗原性を評価するために、赤血球凝集活性（ＨＡ）滴定アッセイを使用した。インフルエンザウイルスは、赤血球を自然に凝集させ、不活性化中のこの活性の維持は、最終ワクチン産物の免疫原性にとって重要であると見なされる。図１０に示されるように、出願者のＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２系は、未処理の抗原に関して観察されるのと同様のＨＡ力価を維持した。

【0264】

具体的に、図１０は、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２系ウイルス不活性化が、Ｈ_２Ｏ_２のみよりも良好なインフルエンザ赤血球凝集活性を維持したことを示す。精製されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を、Ｈ_２Ｏ_２（３％、２時間、室温）、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２（１μΜのＣｕＣｌ_２、０．００２％のΗ_２Ｏ_２、２０時間、室温）、紫外線光（ＵＶ、１０ジュール）、または未処理のまま（生）で不活性化した。不活性化後、抗原調製物を赤血球凝集（ＨＡ）活性について直接試験した。抗原調製物を、完全なＨＡ活性を依然として示した最も低い抗原濃度によりスコア化し、この濃度の逆数をグラフ化した。ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２は、生インフルエンザとは区別不能なレベルでタンパク質機能（すなわち、赤血球凝集活性）を維持した。

【0265】

比較により、ＵＶ不活性化は、ＨＡ活性を無視し得るレベルまで低減させた。このＨＡ破壊のインビボ結果を図１１で見ることができ、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２がロバストな保護血清抗体赤血球凝集素抑制（ＨＡＩ）力価を誘導することができる一方で、ＵＶで処理された抗原は、マウスにおいて機能的抗体を誘導せず、致死的攻撃からの最小保護を誘導した。

【0266】

具体的に、図１１は、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２で不活性化されたインフルエンザがロバストな赤血球凝集抑制力価を誘導し、致死的攻撃から保護したことを示す。精製されたインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）を、Ｈ_２Ｏ_２（３％、２時間、室温）、ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２（１μΜのＣｕＣｌ_２、０．００２％のＨ_２Ｏ_２、２０時間、室温）、または紫外線光（ＵＶ、１０ジュール）で不活性化し、完全な不活性化をフォーカス形成アッセイ生存能試験により確認した。不活性化後、抗原調製物をタンパク質含有量によって正規化し、０．１０％水酸化アルミニウムとともに配合した。成体雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを５μｇのワクチンで皮下に免疫化した。

【0267】

図１１Ａは、動物の血清インフルエンザ特異的赤血球凝集素抑制（ＨＡＩ）力価をワクチン接種後２ヶ月時点で決定したことを示す。ワクチン接種されていない対照マウスの結果を比較のために示す。アッセイの検出限界（ＬＯＤ）を破線で示す。

【0268】

図１１Ｂは、免疫化後２ヶ月時点で、マウスを６×１０^４ＥＩＤ_５０の生インフルエンザ（Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）、２０ＬＤ_５０）に鼻腔内曝露し、体重の変化を毎日追跡したことを示す。初期開始重量の７５％以下に達したいずれの動物も人道的に安楽死させた。

【0269】

ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２で不活性化されたウイルスまたはＨ_２Ｏ_２で不活性化されたウイルスでワクチン接種されたマウスは、インフルエンザ曝露後に高度に著しい保護を示した（それぞれ、Ｐ＝０．００３１およびＰ＝０．０１５）。一方で、ＵＶで不活性化されたウイルスでワクチン接種されたマウスは、著しい保護を示さなかった（Ｐ＝０．２５）。

【0270】

実施例８
（複数の遷移金属をワクチン抗原開発のための二重酸化手法で成功裏に使用した）
（ＣｕＣｌ_２の形態の）Ｃｕ^２＋は、ＣＨＩＫＶ、ＤＥＮＶ、ＹＦＶ、およびインフルエンザウイルスに関して記載される二重酸化ワクチン抗原開発研究で試験された初期の金属であった。しかしながら、上述されるように、出願者は、他の金属も同様の様式で機能する潜在性を有すると決定した。

【0271】

ＤＥＮＶ３をモデルウイルスとして使用した本実施例に示されるように、ＣｕＣｌ_２（Ｃｕ^２＋）、ＦｅＣｌ_３（Ｆｅ^３＋）、またはＣｓＣｌ（Ｃｓ^＋）、およびＨ_２Ｏ_２の希釈液からなる不活性化研究を、ワクチン抗原の開発におけるそれらの潜在性について試験した。

【0272】

図１２Ａ〜Ｃに示されるように、３つ全ての金属が、高レベルの抗原性を維持した条件を提供すると同時に、完全なウイルス不活性化を示した。

【0273】

具体的に、図１２Ａ〜Ｃは、二重酸化系ウイルス不活性化に関する酸化還元活性金属の比較を示す。精製されたＤＥＮＶ３を、ＣｕＣｌ_２（図１２Ａ）、ＦｅＣｌ_３（図１２ Ｂ）、およびＣｓＣｌ（図１２Ｃ）の増加濃度の存在下で、示される広範なＨ_２Ｏ_２濃度で処理した（２０時間、室温）。処理後、中和抗体結合部位の維持（すなわち、抗原性）を、ＤＥＮＶ外被タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。ＥＬＩＳＡ値を、生ウイルス対照のパーセンテージとして表す。処理後、材料を、標準的なプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイを使用して生ＤＥＮＶ３についても試験した。検出可能な生ウイルス（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示さなかった成功した条件を星印で示す（「Ｎ．Ｔ．」は、試験されていない）。

【0274】

３つ全ての金属が、高レベルの抗原性を維持した条件を提供すると同時に、完全なウイルス不活性化を示した。

【0275】

実施例９
（遷移金属の組み合わせが、二重酸化ワクチン系における相乗効果を実証した）
上記の図１２および実施例８に示されるように、異なる金属を組み合わせて使用して、ウイルスのＨ_２Ｏ_２不活性化を増強することができる。

【0276】

本実施例に示されるように、潜在的な相乗効果を調査するために、ＤＥＮＶ３モデルウイルスを、Ｈ_２Ｏ_２（０．０１％）の設定量でＣｕＣｌ_２（Ｃｕ^２＋）およびＦｅＣｌ_３（Ｆｅ^３＋）の組み合わせで不活性化した。いくつかのＣｕＣｌ_２／ＦｅＣｌ_３条件は、良好な抗原性を維持しながら完全な不活性化を提供し、これは、同じ不活性化条件で複数の金属を使用することが実行可能であることを実証する（図１３）。確かに、０．０５μΜおよび０．１０μΜのＣｕＣｌ_２濃度で、ＦｅＣｌ_３濃度が増加すると、抗原性が増強し、これは、これら２つの金属との相乗効果を示す。

【0277】

具体的に、図１３は、金属の組み合わせが、良好な抗原性を維持しながら完全な不活性化を達成することができることを示す。精製されたＤＥＮＶ３を、Ｈ_２Ｏ_２（０．０１％）および示される範囲のＣｕＣｌ_２およびＦｅＣｌ_３濃度で処理した。処理後、抗原を、エンベロープ構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡで試験した。ＥＬＩＳＡ値を、生ウイルス対照のパーセンテージとして表す。処理後、材料を、標準的なプラーク形成単位（ＰＦＵ）アッセイを使用して生ＤＥＮＶ３についても試験した。検出可能な生ウイルス（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示さなかった成功した条件を星印で示す。０．０５μΜおよび０．１０μＭのＣｕＣｌ_２濃度で、ＦｅＣｌ_３濃度が増加すると、抗原性が増強し、これは、これらの２つの金属との相乗効果を示す。

【0278】

実施例１０
（細菌性形態の改善された維持のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの最適化された不活性化を提供するために二重酸化を使用した）
本実施例に示されるように、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒは、典型的には直径約０．２μｍおよび長さ約２〜８μｍの小さならせん形状細菌である（図１４Ａ）。

【0279】

標準的な３％のＨ_２Ｏ_２溶液を用いた室温での５時間の不活性化後、細菌に形態が明白に変化するように実質的に損傷を与え、これには、総細胞構造および実質的な集塊の損失が含まれる（図１４Ｂ）。しかしながら、０．０１％のＨ_２Ｏ_２および２μＭのＣｕＣｌ_２を使用して二重酸化手法の最適化する際に、出願者は、驚くべきことに、二重酸化が、未処理の対照とは区別不能なままであった微生物での処理期間を通じて優れた細菌性形態を維持しながら、細菌を完全に不活性化し得ることを見出した（図１４Ｃ）。

【0280】

具体的に、図１４Ａ〜１４Ｃは、細菌性形態の改善された維持のためのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの最適化された不活性化を示す。

【0281】

図１４Ａでは、Ｃ．ｃｏｌｉを成長させ、精製し、未処理のままにした。

【0282】

図１４Ｂでは、Ｃ．ｃｏｌｉを成長させ、精製し、高濃度であるが有害な濃度のＨ_２Ｏ_２（３％のＨ_２Ｏ_２、５時間）で不活性化した。

【0283】

図１４Ｃでは、Ｃ．ｃｏｌｉを成長させ、精製し、２μＭのＣｕＣｌ_２および０．０１％のＨ_２Ｏ_２で不活性化した。データは、スライドに適用し、かつグラムサフラニンで染色した各条件からの試料を示す。

【0284】

保持された構造に加えて、不活性化全細胞ワクチンを調製するために必要不可欠なパラメータは、完全な微生物不活性化を確実にすることである。上述される最適な条件を使用して、不活性化速度研究を行った。図１５に示されるように、Ｃ．ｃｏｌｉは、約１５分の減衰率半減期（Ｔ_１／２）とともに急速な不活性化を実証した。

【0285】

具体的に、図１５は、最適化されたＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２式への曝露が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの急速な不活性化をもたらすことを示す。Ｃ．ｃｏｌｉの精製された調製を、最適化されたＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２式および緩衝液条件、または偽不活性化（ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２なし）で処理した。試料を示される時点で取り出し、生存Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒについて試験した。開き記号は、生細菌の不在を示す。破線は、検出限界を示す。これらの速度は、全２０時間の不活性化期間中の２０ログ超の不活性化を示す。パイロット製造ロット（約１０^９ＣＦＵ／ｍＬ）における細菌性力価に基づいて、このレベルの不活性化は、全体の細菌性構造を依然として維持しながら、製造プロセス中、高い安全マージン（最大１億倍の理論上の過剰不活性化）を提供する（図１４Ｃ）。

【0286】

実施例１１
（二重酸化Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒワクチン接種は、アカゲザルにおいて保護免疫を提供する）
本実施例に示されるように、出願者は、ワクチン接種されていない対照動物と比較した６０匹のＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−Ｃ．ｃｏｌｉで免疫化されたアカゲザルにおけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ培養により感染が確認された腸疾患率の監視により、ワクチン効能を決定した。

【0287】

この研究に関して、（０．０１％のＨ_２Ｏ_２および２μΜのＣｕＣｌ_２を使用して不活性化された）ＣｕＣｌ_２／Ｈ_２Ｏ_２−Ｃ．ｃｏｌｉワクチン候補で、動物を筋肉内ワクチン接種し、追加免疫用量を６ヶ月後に投与した。病歴に基づいて、ワクチン接種された群を選択し、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染症の歴史的に高い発生率を有した群を好ましいとした。この手法は、保護効能を評価する上で増加したロバスト性を提供した。全ての成体／若年期（ｎ＝５９）は、４０μｇのミョウバンでアジュバント化された用量を受け、２匹の乳児（体重２Ｋｇ未満）は、半分の用量（２０μｇ）を受けた。プロトコルに従って、ワクチン接種の最初の１４日間にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連下痢と診断されたいずれの動物も、ワクチン媒介性保護がこの初期期間中に起こる可能性が低いため排除される。ワクチン接種後その日にＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連下痢に起因して研究からある成体動物を排除した。血清試料を、一次ワクチン接種後０日目および６ヶ月目に全てのワクチン接種された動物（ｎ＝６０）から収集し、この時点で、動物は、追加免疫用量のワクチンを受けた。

【0288】

一次ワクチン接種後、我々は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連下痢性疾患からの保護に加えて、同じシェルター群（図１６Ｂ、Ｐ＝０．０３８）内の過去の数年と比較して、または２０１５年のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒシーズン中の他のシェルター群（図１６Ｃ、Ｐ＝０．０２０）と比較して、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ特異的血清抗体力価（図１６Ａ、Ｐ＜０．００１）の著しい増加を観察した。ＮＨＰの健康は毎日監視され、下痢性疾患は、検索可能中央データベースにおいて文書化される。ワクチン接種されたコホート内で下痢発生率を監視し、他の同様のシェルター群においておよそ１，０００匹のワクチン接種されていない対照動物と比較した。糞便試料を下痢症状の発現を経験している任意の動物から収集し、Ｃ．ｃｏｌｉ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ、およびＳｈｉｇｅｌｌａ種について試験したが、それは、これらが動物における下痢に関連付けられる主な腸の病原体を表すためである。

【0289】

具体的に、図１６Ａ〜１６Ｃは、二重酸化Ｃ．ｃｏｌｉが免疫原性であり、ＲＭを自然獲得Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ感染症から保護することを示す。

【0290】

図１６Ａにおいて、血清試料を、ワクチン接種の直前に、または一次免疫化の６ヶ月後に動物から収集し、最適化された全細胞ＥＬＩＳＡを使用して、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ特異的抗体応答についてアッセイし、全ての血清試料をＳｈｉｇｅｌｌａ（グラム陰性腸細菌）に対して予め吸着させて、非特異的結合を低減した。有意性試験を、対応のあるスチューデントｔ検定を使用して行った。

【0291】

ワクチン接種後、動物を８ヶ月間にわたってＣ．ｃｏｌｉ関連下痢について追跡し、同じシェルター内の前年の下痢率と比較し（図１６Ｂ）、または２０１５年に監視した他の同時シェルター（約１，０００匹の対照動物）の下痢発生率と比較した（図１６Ｃ）。黒色の矢印は、追加免疫ワクチン接種の時点を示す。

【0292】

一次ワクチン接種後６ヶ月時点の中間分析は、ワクチン接種されていない動物におけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連下痢の７６の症例に対して、ワクチン接種された群におけるＣ．ｃｏｌｉまたはＣ．ｊｅｊｕｎｉ関連下痢の症例を示さず、これは、単一のワクチン接種後のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ培養陽性下痢性疾患（Ｐ＝０．０３５）に対する統計的に有意な保護効果を表す。

【0293】

ほぼ全てのヒトワクチンが最適な保護効能のために少なくとも２回分の用量を必要とし、免疫記憶の耐久性が追加免疫ワクチン接種後にしばしば改善されるため、保守的な手法に続いて、６ヶ月時点で追加免疫ワクチン接種を施し、次いで、ＮＨＰにおける下痢性疾患の発生率を監視し続けた。一次ワクチン接種の２５０日後、ワクチン接種されていない集団においてより多くのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ関連腸疾患の症例が発生し続けた（８．７％または合計９２匹の動物に達する）一方で、ワクチン接種されたコホートにおける動物のいずれも（０／６０）疾患の徴候を示さず、これらの２つの群間の統計的有意性はＰ＝０．０２０に増加した。

【0294】

実施例１２
（高リン酸塩濃度が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中に抗原性を維持すると同時に、急速なウイルス不活性化速度を示した）
本実施例に示されるように、出願者は、驚くべきことに、高濃度の無機多原子オキシアニオンが、フェントン試薬（複数可）（例えば、過酸化水素および塩化銅の組み合わせ（Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２））での不活性化中の病原体の抗原性エピトープの維持を改善することができることを見出した。

【0295】

本実施例に示されるように、デング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を行った。ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ウイルスの表面上の中和エピトープに特異的な２つのＤＥＮＶ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、１５Ａ５および６Ｈ６を使用した。ＭＡｂ１５Ａ５を使用してＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、捕捉抗体としての役目を果たした一方で、ビオチン化ＭＡｂ６Ｈ６を検出抗体として使用した。このサンドイッチＥＬＩＳＡを、未処理の精製された生デング熱血清型４（ＤＥＮＶ４）ビリオン（菌株：ＴＶＰ−３６０）、または標準的な条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、８×１０^８ＰＦＵ／ｍＬと同等のウイルスタンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬと定義する）下で、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で不活性化されたか、またはＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］の増加濃度、例えば、２５、５０、７５、１００、１５０、２５０、５００、７５０、および１５００ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４で、室温で２０時間活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。試料を本アッセイの線形範囲に達するように連続希釈し、ＭＡｂ１５Ａ５をコーティングした予めブロックされたＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをビオチン化ＭＡｂ６Ｈ６とともに１時間インキュベートした。別の洗浄ラウンド後、プレートをストレプトアビジンポリ−ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに１時間インキュベートした。最終洗浄ステップ後、比色検出試薬（ｏ−フェニレンジアミン、ＯＰＤ）、次いで、１Ｍ塩酸を添加して、発色現像を停止させ、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで、４９０ｎｍで読み取った。生光学密度（Ｏ．Ｄ．）をブランクウェルからバックグラウンド除去し、未処理の生ＯＤ値と比較し、未処理の生ウイルスを１００％ＥＬＩＳＡシグナルと定義した。標準的な不活性化条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬ）下で、または選択高リン酸塩不活性化条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．０］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬ）下で、ウイルス不活性化の速度を測定して、高Ｎａ_２ＨＰＯ_４条件のウイルス不活性化速度への影響を評価した。Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化剤の添加後、少量の一定分量をカタラーゼで処理して残留Ｈ_２Ｏ_２を除去し、次いで、連続１０倍希釈し、不活性化後０．５、１、２、４、および６時間時点で、ベロ細胞上で、プラークアッセイにより生ウイルスについて試験した。検出限界は、５０ＰＦＵ／ｍＬであった。

【0296】

例示的なＥＬＩＳＡの結果を図１７Ａに示す。標準的な不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、Ｎａ_２ＨＰＯ_４の増加濃度の存在下で不活性化されたウイルスは、完全なウイルス不活性化をもたらし、ＥＬＩＳＡシグナルの増加を示し、天然抗体結合部位の保持の改善および抗原組成の改善を示した。

【0297】

具体的に、図１７Ａは、例示的なサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を例示する棒グラフであり、ここで、２つのデング熱ウイルス（ＤＥＮＶ）特異的中和モノクローナル抗体（ＭＡｂ）、１５Ａ５および６Ｈ６を使用して、異なる濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４を含む条件下でＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化後にウイルス粒子の保持された抗原性を測定した。等量のＤＥＮＶ血清型４（ＤＥＮＶ４）を各事例で使用し、モノクローナルＤＥＮＶ特異的抗体を使用して、不活性化ウイルスが生ウイルスと比較してどの程度良好に認識されるかを決定した。標準的な条件（Ｓｔｄ．）下で、ウイルス上の中和エピトープが不活性化中に実質的に損傷されたが、これらのエピトープは、不活性化を高濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４の存在下で行った場合、損傷から保護された。破線は、標準的な不活性化条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、ならびに０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有する１１０ｍＭのＮａＣｌ、２０時間、室温）下で観察されたＥＬＩＳＡシグナルを示す。完全なウイルス不活性化（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示した試料は、棒上に（−）を有し、残留感染性ウイルスを示した試料は、棒上に（＋）で示される。

【0298】

図１７Ｂに示されるように、高リン酸塩濃度の存在下でさえも、ウイルス不活性化速度は急速であり、不活性化ワクチンを調製するためのこの無機多原子オキシアニオン手法の実現可能性を示した。

【0299】

具体的に、図１７Ｂは、ウイルス不活性化の速度が高Ｎａ_２ＨＰＯ_４の存在下または不在下で同様であることを示す線グラフである。標準的な緩衝液条件は、１０ｍＭのＮａＰＯ_４、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＨ_２Ｏ_２、および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有し、高リン酸条件は、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４［ｐＨ＝７．０］、２％のＤ−ソルビトール、および１０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＨ_２Ｏ_２、および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有した。緩衝液のｐＨは、ｐＨ＝７．０〜７．５の範囲であった。出願者は、ｐＨをｐＨ７．０〜８．０の範囲内で変化させてもウイルス不活性化速度に著しく影響しなかったことも決定した。点線は、検出の限界を示す。

【0300】

実施例１３
（高リン酸塩濃度を伴う条件下での不活性化がワクチン免疫原性を改善した）
本実施例に示されるように、出願者は、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で不活性化されたウイルスの免疫原性が高濃度のリン酸塩の存在下での不活性化によって改善されることも見出した。

【0301】

本実施例に示されるように、マウスを、標準的な条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬと定義される）下で、または選択された高リン酸塩不活性化条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μＭのＣｕＣｌ_２、１５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．０］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬ）下で、室温で２０時間にわたって、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンで免疫化した。不活性化後、ウイルスを、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ Ｓｕｌｆａｔｅクロマトグラフィーを使用して精製した。各不活性化ロットの少なくとも５％を使用して、共培養試験を、その後の７日成長期間でＤＥＮＶワクチンを感受性ベロ細胞に接種することによって行ってウイルス拡大（生ウイルスが存在する場合）を可能にし、その後、プラークアッセイ試験を行って、生存ウイルスを数え上げた。各アッセイは、アッセイ性能を監視するために、陽性対照フラスコ（１０プラーク形成単位（ＰＦＵ）のＤＥＮＶ４を添加したもの）および陰性対照フラスコ（培地のみ）を組み込んだ。本手法を使用して、各ロットが生ウイルスに対して陰性であることを見出した。不活性化ＤＥＮＶ４を０．１０％水酸化アルミニウムとともに配合し、成体ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝３／群）に、０、１４、および２８日目に、２μｇの不活性化ウイルスで腹腔内にワクチン接種した。最終免疫化後の１４日目に、血清を収集し、ＤＥＮＶ４に対する中和抗体力価について試験した。中和抗体力価を、以前の記述（Ｌｉｕ，Ｌ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２ Ｊａｎ；１９（１）：７３−８）と同様の９６ウェルマイクロ中和試験を使用して測定した。９６ウェルプレートの各ウェルに１．５×１０^４ベロ細胞を播種し、細胞がおよそ９０％コンフルエントになるまで、５％ＣＯ_２中で、３７℃で一晩インキュベートした。血清試料を細胞培養培地中で連続２倍希釈し、次いで、等体積のウイルスと混合し、希釈して、およそ４０フォーカス形成単位（ＦＦＵ）／ウェルをもたらした。この血清：ウイルス混合物を３７℃で２時間インキュベートして、ウイルス中和が起こるのを可能にし、次いで、３７℃および５％ＣＯ_２で１時間にわたってベロ細胞に添加した。細胞単層を、ＤＭＥＭ培地中１．０％メチルセルロース、２％熱不活性化ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンからなる半固形培地で覆い、３７℃および５％ＣＯ_２中で２日間にわたってインキュベートした。半固形培地を除去し、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、サポニンで透過性にした。処理された細胞をウイルス特異的ＭＡｂ４Ｇ２で染色し、フォーカスをＡＥＣ溶液（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で現像した。フォーカスを数え上げ、未処理のウイルス試料と比較したフォーカスのパーセント減少を計算した。ＤＥＮＶ４特異的血清中和力価（ＮＴ_５０力価）を、５０％以上のフォーカス低減を達成した最終血清希釈の逆数と定義した。

【0302】

例示的なワクチン研究の結果を図１８に示す。標準的な不活性化技法を使用して調製されたワクチンが群平均ＮＴ_５０力価＝１６０をもたらした一方で、高リン酸条件下で調製されたＤＥＮＶ４ワクチンは、群平均ＮＴ_５０力価＝７４７を引き起こし、中和抗体の４．７倍の増加を表す。

【0303】

具体的に、図１８は、標準的なＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、ならびに０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μＭのＣｕＣｌ_２を含有する１１０ｍＭのＮａＣｌ、２０時間、室温）下で、または高リン酸塩（１５０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４）の存在下での標準的な不活性化条件下で調製された精製されたＤＥＮＶ４ウイルスを使用したＤＥＮＶ４ワクチンの免疫原性の改善を例示する棒グラフを示す。残留生ウイルスに関する試験により完全な不活性化が確認され、ワクチンを０．１０％の水酸化アルミニウムとともに配合した。成体ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝３／群）に、０、１４、および２８日目に、２μｇの不活性化ＤＥＮＶ４抗原で腹腔内にワクチン接種した。最終免疫化後の１４日目に、血清を収集し、ＤＥＮＶ４に対する中和抗体力価について試験した。ＮＴ_５０力価は、感染性ＤＥＮＶ４ウイルスの５０％がインビトロで中和される最も高い血清希釈を表す。群平均（平均の±標準誤差）を示す。

【0304】

これらの結果は、高リン酸塩を含有する不活性化条件がインビトロで抗原性の改善を示したことを示し（図１７Ａおよび１７Ｂ）、インビボで実質的に改善されたワクチン媒介性免疫応答も提供する。

【0305】

実施例１４
（複数のリン酸塩系多原子オキシアニオンが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中の抗原損傷から保護した）
本実施例に示されるように、驚くべきことに、出願者は、高濃度の他のリン酸塩系多原子オキシアニオンが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２の組み合わせでの不活性化中の病原体の生物学的に関連する中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0306】

本実施例に示されるように、ＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを、実施例１２に記載される通りであるが、標準的な条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬと定義する）下で、または０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．５、３、１０、１５、もしくは３０ｍＭの三リン酸ナトリウム（Ｎａ_５Ｐ_３Ｏ_１０）、または０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．５、３、１０、１５、３０、もしくは６０ｍＭのトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）を含む代替的なリン酸塩系多原子オキシアニオン源の存在下での標準的な条件下で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４を使用して行った。２０時間のＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化後、試料をカタラーゼで処理して残留Ｈ_２Ｏ_２を除去し、次いで、連続１０倍希釈し、５０ＰＦＵ／ｍＬの検出限界で、ベロ細胞上でプラークアッセイにより生ウイルスについて試験した。

【0307】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図１９に示され、これは、三リン酸ナトリウム（図１９Ａ）およびトリメタリン酸ナトリウム（図１９Ｂ）などの他のリン酸塩系多原子オキシアニオンがＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを示す棒グラフを示す。２つのＤＥＮＶ特異的モノクローナル抗体、１５Ａ５および６Ｈ６を使用して、異なる濃度の（Ａ）三リン酸ナトリウム（Ｎａ５Ｐ_３Ｏ_１０）または（Ｂ）トリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）を含む条件下でのＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化後のウイルスの抗原性の保持を測定した。等量のＤＥＮＶ４を各事例で使用し、モノクローナルＤＥＮＶ特異的抗体を使用して、不活性化ウイルスが生ウイルスと比較してどの程度良好に認識されるかを決定した。標準的な条件（Ｓｔｄ．）下で、ウイルス上の中和エピトープが不活性化中に実質的に損傷されたが、これらのエピトープは、不活性化を高濃度のＮａ_５Ｐ_３Ｏ_１０またはＮａ_３Ｐ_３Ｏ_９の存在下で行った場合、損傷から保護された。不活性化後、試料を残留生ウイルスについて試験した。完全なウイルス不活性化（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示した試料は、棒上に（−）を有し、残留感染性ウイルスを示した試料は、棒上に（＋）で示される。破線は、標準的な不活性化条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、ならびに０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有する１１０ｍＭのＮａＣｌ、２０時間、室温）下で観察されたＥＬＩＳＡシグナルを示す。

【0308】

したがって、標準的な不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、ウイルスが高濃度の三リン酸ナトリウム（図１９Ａ）またはトリメタリン酸ナトリウム（図１９Ｂ）のいずれかの存在下で完全に不活性化されると同時に、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加も示した例がいくつか存在する。

【0309】

実施例１５
（硫酸塩は、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中に抗原性を改善した別の無機多原子オキシアニオンを代表する）
驚くべきことに、出願者は、硫酸塩などの高濃度の非リン酸塩多原子オキシアニオンがＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中の中和エピトープの維持を改善することも見出した。

【0310】

本実施例に見られるように、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡを、実施例１２に記載される通りであるが、ＳＯ_４^２−多原子オキシアニオン源として硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）または硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）の存在下または不在下で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４を使用して行った。比較のために、不活性化実験も単原子陰イオン源のみとして塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を用いて行われた。ＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを、精製された生ＤＥＮＶ４ビリオン、または標準的な条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬと定義する）下で、またはＮａ_２ＳＯ_４の増加濃度（１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２５０、および５００ｍＭ）、ＭｇＳＯ_４の増加濃度（１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２５０、５００、７５０、１０００、および１５００ｍＭ）、ＭｇＣｌ_２の増加濃度（１０、５０、および１５０ｍＭ）、もしくはＮａＣｌの増加濃度（１５０、２５０、５００、７５０、１０００、および１５００ｍＭ）で、室温で２０時間の標準的な不活性化条件下で、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で不活性化されたＤＥＮＶ４ビリオンで行った。Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化の２０時間後、試料をカタラーゼで処理して残留Ｈ_２Ｏ_２を除去し、次いで、連続１０倍希釈し、５０ＰＦＵ／ｍＬの検出限界で、ベロ細胞上でプラークアッセイにより生ウイルスについて試験した。

【0311】

例示的なＥＬＩＳＡの結果が図２０Ａ〜２０Ｄに示され、これらは、高濃度の無機多原子オキシアニオン、硫酸塩が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化中のウイルスエピトープ損傷から保護することを例示する。精製されたＤＥＮＶ４を、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌからなる標準的な（Ｓｔｄ．）緩衝液条件下で、室温で２０時間にわたって、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２（０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２で不活性化し、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡにより抗原性の保持について試験した。これらの標準的な不活性化条件は、（図２０Ａ）硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）の増加濃度、（図２０Ｂ）硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ_４）の増加濃度のいずれかで補完され、より高い濃度の硫酸塩が抗原性の改善に対応した。対照的に、単原子陰イオン（Ｃｌ⁻）源として異なる濃度の（図２０Ｃ）塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ_２）または（図２０Ｄ）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）の添加は、抗原性には保護効果を示さなかった。不活性化後、試料を残留生ウイルスについて試験した。完全なウイルス不活性化（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示した試料は、棒上に（−）を有し、残留感染性ウイルスを示した試料は、棒上に（＋）で示される。破線は、標準的な不活性化条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、ならびに０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有する１１０ｍＭのＮａＣｌ、室温で２０時間）下で観察されたＥＬＩＳＡシグナルを示す。

【0312】

したがって、標準的な不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、高濃度の硫酸ナトリウム（図２０Ａ）または硫酸マグネシウム（図２０Ｂ）のいずれかの存在下で不活性化されたウイルスが完全なウイルス不活性化をもたらすと同時に、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加も示した例がいくつか存在する。塩化マグネシウム（図２０Ｃ）または塩化ナトリウム（図２０Ｄ）などの単原子陰イオンの増加濃度の存在下で行われた不活性化実験は、保護効果または抗原性の改善を示さない。

【0313】

実施例１６
（無機多原子オキシアニオンの組み合わせが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中に抗原性を改善した）
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンの混合物が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中の中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0314】

本実施例に示されるように、ＥＬＩＳＡを、実施例１２に記載される通りであるが、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）およびトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）の多様な組み合わせまたはリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）および硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）の多様な組み合わせの存在下で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。サンドイッチＥＬＩＳＡを、未処理の精製されたＤＥＮＶ４ビリオン、または標準的な条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、１μΜのＣｕＣｌ_２、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬ）下で、または各々がＮａ_３Ｐ_３Ｏ_９（０、０．１、０．５、１、２、および３ｍＭ）の増加濃度と組み合わせられたＮａ_２ＨＰＯ_４の増加濃度（１０、５０、１００、および１５０ｍＭ）で、室温で２０時間にわたって、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。あるいは、標準的な不活性化条件に、室温で２０時間にわたって各々がＮａ_２ＳＯ_４の異なる濃度（０、１０、または５０ｍＭ）と組み合わせられたＮａ_２ＨＰＯ_４の増加濃度（２、１０、５０、１００、２５０、または５００ｍＭ）を補充した。２０時間のＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化後、試料をカタラーゼで処理して残留Ｈ_２Ｏ_２を除去し、次いで、連続１０倍希釈し、５０ＰＦＵ／ｍＬの検出限界で、ベロ細胞上でプラークアッセイにより生ウイルスについて試験した。

【0315】

例示的なＥＬＩＳＡの結果を図２１Ａおよび２１Ｂに示す。

【0316】

具体的に、図２１Ａは、異なる形態のリン酸塩（例えば、Ｎａ_２ＨＰＯ_４およびＮａ_３Ｐ_３Ｏ_９）を組み合わせて使用して、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中に生物学的に関連する中和エピトープを保護することができることを示す。精製されたＤＥＮＶ４を、１０ｍＭのＮａＣｌ、２％のＤ−ソルビトール、ならびに異なるトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９）濃度（０、０．１、０．５、１．０、２．０、および３．０ｍＭ）と組み合わせたＮａ_２ＨＰＯ_４（１０、５０、１００、または１５０ｍＭ）からなる異なる緩衝液条件下で、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２（０．０１％）Ｈ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２、２０時間、室温）で不活性化し、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡにより抗原性の保持について試験した。破線は、標準的な不活性化条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、ならびに０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜＣｕＣｌ_２を含有する１１０ｍＭのＮａＣｌ、２０時間、室温）下で観察されたＥＬＩＳＡシグナルを示す。不活性化後、全ての試料を試験し、各棒上の（−）で示されるように、残留生ウイルス（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）に対して陰性であることを見出した。

【0317】

具体的に、図２１Ｂは、リン酸塩および硫酸塩を組み合わせて使用して、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中に生物学的に関連する中和エピトープを保護することができることを示す。精製されたＤＥＮＶ４を、１０ｍＭのＮａＣｌ、２％のＤ−ソルビトール、ならびに異なる硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）濃度（０、１０、および５０ｍＭ）と組み合わせたＮａ_２ＨＰＯ_４（２、１０、５０、１００、２５０、または５００ｍＭ）からなる異なる緩衝液条件下で、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２（０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２、２０時間、室温）で不活性化し、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡにより抗原性の保持について試験した。破線は、標準的な不活性化条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、ならびに０．０１％のＨ_２Ｏ_２および１μΜのＣｕＣｌ_２を含有する１０ｍＭのＮａＣｌ、２０時間、室温）下で観察されたＥＬＩＳＡシグナルを示す。不活性化後、試料を残留生ウイルスについて試験した。完全なウイルス不活性化（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）を示した試料は、棒上に（−）を有し、残留感染性ウイルスを示した試料は、棒上に（＋）で示される。

【0318】

したがって、標準的な不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウム／三リン酸ナトリウム（図２１Ａ）または高濃度のリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム（図２１Ｂ）のいずれかの存在下で完全に不活性化されると同時に、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加も示した例がいくつか存在する。

【0319】

実施例１７
（無機多原子オキシアニオンが、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中のチクングニア熱ウイルスの抗原損傷から保護した）
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンが、追加のウイルスモデルを使用してＨ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２での不活性化中の中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0320】

本実施例に示されるように、チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを行った。ＣＨＩＫＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ウイルスの表面上の中和エピトープに特異的な２つのＣＨＩＫＶ特異的モノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）、１５２および１６６を使用した。ＭＡｂ１５２を使用してＥＬＩＳＡプレートをコーティングし、捕捉抗体としての役割を果たした一方で、ビオチン化ＭＡｂ１６６を検出抗体として使用した。このサンドイッチＥＬＩＳＡを、未処理の精製された生ＣＨＩＫＶビリオン（菌株：１８１／２５）、または標準的な条件（０．０１％のＨ_２Ｏ_２、５μΜのＣｕＣｌ_２、６ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．４］、０．７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、１３０ｍＭのＮａＣｌ、０．６％のＤ−ソルビトール、１×１０^１０ＰＦＵ／ｍＬと同等のウイルスタンパク質濃度＝２００μｇ／ｍＬと定義する）下で、または高濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４（１５０ｍＭ、ｐＨ＝７．５）、または高濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４（１５０ｍＭ）およびトリメタリン酸ナトリウム（Ｎａ_３Ｐ_３Ｏ_９、３ｍＭ）の組み合わせで、室温で２０時間にわたって、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２で不活性化された精製されたＣＨＩＫＶビリオンを使用して行った。試料をカタラーゼで処理して残留Ｈ_２Ｏ_２を除去し、次いで、本アッセイの線形範囲に達するように連続希釈し、ＭＡｂ１５２をコーティングした予めブロックされたＥＬＩＳＡプレートに添加し、１時間インキュベートした。洗浄後、プレートをビオチン化ＭＡｂ１６６とともに１時間インキュベートした。別の洗浄ラウンド後、プレートをストレプトアビジンポリ−ＨＲＰ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とともに１時間インキュベートした。最終洗浄ステップ後、比色検出試薬（ｏ−フェニレンジアミン、ＯＰＤ）、次いで、１Ｍ塩酸を添加して、発色現像を停止させ、プレートをＥＬＩＳＡプレートリーダーで、４９０ｎｍで読み取った。生光学密度（Ｏ．Ｄ．）をブランクウェルからバックグラウンド除去し、未処理の生ＯＤ値と比較し、未処理の生ウイルスを１００％ＥＬＩＳＡシグナルと定義した。２０時間の不活性化期間の終わりに、各条件（カタラーゼで処理して残留Ｈ_２Ｏ_２を除去したもの）の１０％を共培養により試験し、残留生ウイルス（１００ＰＦＵ／ｍＬの推定ＬＯＤ）に対して陰性であることを見出した。

【0321】

例示的なＥＬＩＳＡの結果を図２２に示す。

【0322】

具体的に、図２２は、リン酸塩（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）およびトリメタリン酸塩などの無機多原子オキシアニオンの添加が、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２不活性化中のチクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ）抗原性を改善することを示す。精製されたＣＨＩＫＶを、標準的な緩衝液条件（リン酸緩衝生理食塩水［ｐＨ＝７．４］、０．６％のＤ−ソルビトール）下で、または示されるように、増加したＮａ_２ＨＰＯ_４もしくはトリメタリン酸塩を補充して、Ｈ_２Ｏ_２（０．０１％）およびＣｕＣｌ_２（５μΜ）で、室温で２０時間にわたって処理した。未処理の生ＣＨＩＫＶを比較のために示す。処理期間後、試料を、Ｅ１およびＥ２構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＣＨＩＫＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して抗原性の保持についてアッセイした。２０時間の不活性化期間の終わりに、各条件の１０％を共培養により試験し、残留生ウイルス（１００ＰＦＵ／ｍＬの推定ＬＯＤ）に対して陰性であることを見出した。

【0323】

したがって、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２に基づく不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、感染性ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウム／トリメタリン酸塩の存在下で完全に不活性化されたが、これらの試料は、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。

【0324】

実施例１８
（無機多原子オキシアニオンが、ホルムアルデヒドでの不活性化中に起こる抗原損傷から保護する）
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンが、ホルムアルデヒドでの不活性化中の中和エピトープの維持を改善することも見出した。

【0325】

本実施例に示されるように、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡを、実施例１２に記載される通りであるが、高濃度のリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）または硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）の存在下または不在下で、ホルムアルデヒド（ＣＨ_２Ｏ）で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。ＥＬＩＳＡを、未処理の精製されたＤＥＮＶ４ビリオン、または標準的な条件（０．０１％ホルムアルデヒド、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬと定義する）下で、またはリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）（５、５０、１００、５００、および７５０ｍＭ）または硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）（５、５０、１００および５００ｍＭ）の増加濃度で、３７℃で２０日間にわたって、ホルムアルデヒドで不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。２０日間のホルムアルデヒドに基づく不活性化後、試料を連続１０倍希釈し、５０ＰＦＵ／ｍＬの検出限界で、ベロ細胞上でプラークアッセイにより生ウイルスについて試験した。

【0326】

例示的なＥＬＩＳＡの結果を図２３に示す。

【0327】

具体的に、図２３は、リン酸塩（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）または硫酸塩（Ｎａ_２ＳＯ_４）などの無機多原子オキシアニオンの添加が、ホルムアルデヒド系ウイルス不活性化中の抗原損傷から保護することを示す。精製されたＤＥＮＶ４を、未処理のままにした（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ中でインキュベートした）か、または標準的な条件（０．０１％のホルムアルデヒド、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ）下で、またはＮａ_２ＨＰＯ_４もしくはＮａ_２ＳＯ_４の増加濃度での標準的な条件下で、３７℃で２０日間にわたって、ホルムアルデヒドで不活性化した。不活性化後、試料を、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡを使用して抗原性の保持について試験した。破線は、標準的な不活性化条件で観察されたＥＬＩＳＡシグナルを示す。不活性化後、全ての試料を試験し、各棒上の（−）で示されるように、残留生ウイルス（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）に対して陰性であることを見出した。

【0328】

したがって、標準的なホルムアルデヒドに基づく不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、感染性ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウムまたは硫酸ナトリウムのいずれかの存在下で完全に不活性化されたが、試料のうちの多くは、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。

【0329】

実施例１９
（無機多原子オキシアニオンが、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）不活性化中の抗原損傷から保護する）
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンが、ＢＰＬでの不活性化中の中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0330】

本実施例に示されるように、ＥＬＩＳＡを、実施例１２に記載される通りであるが、高濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４またはＮａ_２ＳＯ_４の存在下または不在下で標準的なＢＰＬ不活性化手法で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。ＥＬＩＳＡを、未処理の精製されたＤＥＮＶ４ビリオン、または標準的な条件（０．１％ＢＰＬ［Ｃ_３Ｈ_４Ｏ_２］、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬと定義する）下で、またはリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）（５，５０、１００、５００、および７５０ｍＭ）または硫酸ナトリウム（Ｎａ_２ＳＯ_４）（５、５０、１００、および５００ｍＭ）の増加濃度の存在下で行われる標準的な不活性化条件下で、室温で２０時間にわたって、ＢＰＬで不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。２０時間のＢＰＬに基づく不活性化後、試料を連続１０倍希釈し、５０ＰＦＵ／ｍＬの検出限界で、ベロ細胞上でプラークアッセイにより生ウイルスについて試験した。

【0331】

例示的なＥＬＩＳＡの結果を図２４に示す。

【0332】

具体的に、図２４は、リン酸塩（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）または硫酸塩（Ｎａ_２ＳＯ_４）などの無機多原子オキシアニオンの添加が、β−プロピオラクトン（ＢＰＬ）でのウイルス不活性化中に起こる抗原損傷から保護することを示す。精製されたＤＥＮＶ４を、未処理のままにした（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ中でインキュベートした）か、または示されるように、Ｎａ_２ＨＰＯ_４もしくはＮａ_２ＳＯ_４の増加濃度で、標準的な条件（０．１％ＢＰＬ［Ｃ_３Ｈ_４Ｏ_２］、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬ）下で、室温で２０時間にわたって、ＢＰＬで不活性化した。不活性化後、試料を、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡを使用して抗原性の保持について試験した。破線は、標準的な不活性化条件で観察されたＥＬＩＳＡシグナルを示す。不活性化後、全ての試料を試験し、各棒上の（−）で示されるように、残留生ウイルス（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）に対して陰性であることを見出した。

【0333】

したがって、標準的なＢＰＬに基づく不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、感染性ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウムまたは硫酸ナトリウムのいずれかの存在下で完全に不活性化されたが、試料のうちの多くは、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。

【0334】

実施例２０
（無機多原子オキシアニオンが、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）不活性化中の抗原損傷から保護した）
驚くべきことに、出願者は、無機多原子オキシアニオンが、ＢＥＩでの不活性化中の中和エピトープの維持を改善することができることも見出した。

【0335】

本実施例に示されるように、ＥＬＩＳＡを、実施例１２に記載される通りであるが、高濃度のＮａ_２ＨＰＯ_４の存在下または不在下で典型的な範囲のＢＥＩ濃度（Ａａｒｔｈｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ３２（２００４）１５３−１５６）で不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。ＥＬＩＳＡを、未処理の精製されたＤＥＮＶ４ビリオン、または標準的な緩衝液条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ、タンパク質濃度＝５０μｇ／ｍＬ）下で、またはリン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１５０ｍＭ）の増加濃度の存在下で行われた標準的な緩衝液条件下で、３７℃で２０時間にわたって、ＢＥＩで不活性化された精製されたＤＥＮＶ４ビリオンを使用して行った。２０時間のＢＥＩに基づく不活性化後、試料を連続１０倍希釈し、５０ＰＦＵ／ｍＬの検出限界で、ベロ細胞上でプラークアッセイにより生ウイルスについて試験した。

【0336】

例示的なＥＬＩＳＡの結果を図２５に示す。

【0337】

具体的に、図２５は、リン酸ナトリウム（Ｎａ_２ＨＰＯ_４）などの無機多原子オキシアニオンの添加が、バイナリーエチレンイミン（ＢＥＩ）でのウイルス不活性化中に起こる抗原損傷から保護することを示す。精製されたＤＥＮＶ４を、未処理のままにした（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ中でインキュベートした）か、または標準的な緩衝液条件（１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール、および１１０ｍＭのＮａＣｌ）下で、Ｎａ_２ＨＰＯ_４を１５０ｍＭに増加させて、示されるＢＥＩの増加濃度で、３７℃で２０時間にわたって不活性化した。不活性化後、試料を、ＤＥＮＶ特異的ＥＬＩＳＡを使用して抗原性の保持について試験した。不活性化後、全ての試料を試験し、各棒上の（−）で示されるように、残留生ウイルス（５０ＰＦＵ／ｍＬ未満）に対して陰性であることを見出した。

【0338】

したがって、ＢＥＩに基づく不活性化条件は、抗体結合部位の破壊に起因してウイルス特異的中和エピトープの損失およびＥＬＩＳＡシグナルの損失をもたらした。対照的に、感染性ウイルスが高濃度のリン酸ナトリウムの存在下で完全に不活性化されたが、これらの試料は、天然抗体結合部位の保持の増強および抗原組成の改善を示すＥＬＩＳＡシグナルの増加を示した。

【0339】

実施例２１
（メチサゾンが、単一および二重酸化系ウイルス不活性化の両方の速度を増強した）
本実施例に示されるように、出願者は、メチサゾンが、単一および二重酸化系ウイルス不活性化の両方の速度を増強したと決定した。図２６Ａ〜Ｃに示されるように、メチサゾンの添加が、ワクシニアウイルス（ＶＶ、ＤＮＡゲノム）、ならびにデング熱ウイルス血清型４（ＤＥＮＶ４、ＲＮＡゲノム）およびチクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、ＲＮＡゲノム）に関して二重酸化に基づく不活性化の速度を実質的に増加することができた。

【0340】

さらに、メチサゾンのみがウイルス不活性化に最小限の影響しか及ぼさなかった（図２６Ｂおよび２６Ｃ）が、メチサゾンおよびＨ_２Ｏ_２はともに（銅の不在下でさえも）、ウイルス不活性化に対する相乗的な増強を実証した。

【0341】

具体的に、図２６Ａ、２６Ｂ、および２６Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンが単一および二重酸化系ウイルス不活性化の両方の速度を増強したことを示す。（Ａ）ワクシニアウイルス（ＰＢＳ、ｐＨ＝７．５）、（Ｂ）デング熱ウイルス血清型４（ＤＥＮＶ４、１１０ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール中）、および（Ｃ）チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４を補充したＰＢＳ［ｐＨ＝７．５］中）を各々、図に示される不活性化試薬で処理した。異なる成分の濃度は、以下の通りであった：Ｈ_２Ｏ_２＝０．００４％（ＣＨＩＫＶ）または０．００２％（ＤＥＮＶ４およびＶＶ）、ＣｕＣｌ_２＝１μΜ（全てのウイルス）、メチサゾン（ＭＺ）＝１０μΜ（全てのウイルス）。点線は、検出限界（ＬＯＤ）を示す。本実施例は、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４を用い、これは、本明細書に開示される無機多原子オキシアニオンの増加範囲内の例示的な濃度である。

【0342】

実施例２２
（メチサゾンは、二重酸化系細菌性不活性化の速度を増強した）
本実施例に示されるように、出願者は、メチサゾンが二重酸化系細菌性不活性化の速度を増強したと決定した。

【0343】

実施例２１の結果を細菌に拡張し（図２７Ａ〜Ｃ）、ここで、この場合もやはり、メチサゾンの二重酸化手法（例えば、Ｈ_２Ｏ_２／ＣｕＣｌ_２）への添加が、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ（例示的なグラム陰性菌）、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（例示的なグラム陽性菌）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ（例示的なグラム陰性菌）に対する不活性化速度を実質的に増強した。

【0344】

具体的に、図２７Ａ、２７Ｂ、および２７Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンが二重酸化系細菌性不活性化の速度を増強したことを示す。（Ａ）Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ（Ｂ）Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよび（Ｃ）Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅを、１０ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、および２％のＤ−ソルビトールに緩衝液交換し、各パネルに示される不活性化成分で処理した。１ｍＬ当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ）により決定した不活性化後の生存能を経時的に追跡した。不活性化成分の濃度を、以下の通り：Ｃ．ｃｏｌｉ：Ｈ_２Ｏ_２＝０．０１％、ＣｕＣｌ_２＝２μΜ、メチサゾン（ＭＺ）＝２０μΜ；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ：Ｈ_２Ｏ_２＝０．１０％、ＣｕＣｌ_２＝１０μΜ、メチサゾン（ＭＺ）＝１００μΜ；Ｓ．ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ：Ｈ_２Ｏ_２＝０．１０％、ＣｕＣｌ_２＝１０μΜ、ＭＺ＝１００μΜに各種類の細菌に対して最適化し、開き記号がＭＺなしの条件を表す一方で、閉じ記号はＭＺの添加を示す。検出限界は、１０ＣＦＵ／ｍＬであった。本実施例は、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４を用い、これは、本明細書に開示される無機多原子オキシアニオンの増加範囲内の例示的な濃度である。

【0345】

実施例２３
（メチサゾンは、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持しながら不活性化速度を増強した）
本実施例に示されるように、出願者は、メチサゾンが、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持しながら不活性化速度を増強したと決定した。不活性化中の抗原性へのメチサゾンの影響を評価するために、例示的なモデルウイルスＣＨＩＫＶおよびＤＥＮＶ４を、高濃度Ｈ_２Ｏ_２（単独酸化系）、二重酸化（本明細書に記載されている）、またはメチサゾンを用いた二重酸化の複数の不活性化手法を用いて処理した。図２８Ａ（チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ））および２８Ｂ（デング熱ウイルス血清型４（ＤＥＮＶ４））のＥＬＩＳＡデータによって示されるように、二重酸化手法へのメチサゾンの添加は、不活性化の速度をおよそ１０〜２０倍増加しながら、中和エピトープに対する損傷を低減することによって抗原性を維持したか、または著しく改善した。

【0346】

具体的に、図２８Ａおよび２８Ｂは、特定の態様に従って、メチサゾンが二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持しながら不活性化速度を増強したことを示す。チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４を補充したＰＢＳ［ｐＨ＝７．５］中）およびデング熱ウイルス血清型４（ＤＥＮＶ４、１１０ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール中）を各々、図に示される不活性化成分で、室温で２０時間処理した。ウイルス処理後、抗原保持を、（Ａ）Ｅ１およびＥ２構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＣＨＩＫＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡ、または（Ｂ）エンベロープ構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡのいずれかで試験した。ＥＬＩＳＡ値は、中和エピトープの保持を示し、生ウイルス対照のパーセンテージとして表す。両方のウイルスを、損傷不活性化手法による中和エピトープの損失を示すために、３％のＨ_２Ｏ_２でも処理した。各条件の不活性化半減期を示す。本実施例は、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４を用い、これは、本明細書に開示される無機多原子オキシアニオンの増加範囲内の例示的な濃度である。

【0347】

実施例２４
（メチサゾンの化学的類似体、またはメチサゾン官能基／下部構造、またはそれらの組み合わせは、二重酸化系ウイルス不活性化中の不活性化および抗原性の維持を増強した）
本実施例に示されるように、出願者は、メチサゾンの化学的類似体、またはメチサゾン官能基／下部構造、またはそれらの組み合わせが、二重酸化系ウイルス不活性化中の不活性化および抗原性の維持を増強したと決定した。

【0348】

上述の通り、メチサゾンは、インビボ抗ウイルス剤として本来開発された化合物である。我々は、いくつかの関連化合物を試験して、それらがワクチン開発のための病原体不活性化に同様の増強をもたらしたかを決定した（図２９Ａ〜Ｃ）。例示的なモデルウイルスＤＥＮＶ４で示されるように、イサチンβ−チオセミカルバゾンおよびＮ−プロピルイサチンβ−チオセミカルバゾンなどのこれらの化合物のいくつかは、二重酸化系においてより優れた抗原性を維持しながら、不活性化の増強された速度を含むメチサゾンと同様の結果を実証した。興味深いことに、チオセミカルバジド部分だけを使用しても、不活性化の増強およびより優れた抗原性が依然として観察されるであろう一方で、イサチンまたはセミカルバジドは、不活性化の速度を増加させそうにないが、それでも不活性化中の酸化的な損傷からのタンパク質抗原の保護を実証する。メチサゾン関連化合物の別々の主な成分（官能基／下部構造）が最適な不活性化を再現するために組み合わせられ得るかを探求するために、我々は、イサチン＋チオセミカルバジドまたはイサチン＋セミカルバジドの混合物を試験した。イサチン＋セミカルバジドが依然として抗原保護を示した一方で、ウイルス不活性化を増強しなかった。対照的に、イサチン＋チオセミカルバジドは、急速な不活性化（いずれの成分のみよりも急速）、ならびに大幅に増加した抗原性の両方をもたらした。

【0349】

具体的に、図２９Ａ、２９Ｂ、および２９Ｃは、特定の態様に従って、メチサゾンの化学的類似体、またはメチサゾン官能基／下部構造、またはそれらの組み合わせが、二重酸化系ウイルス不活性化中の不活性化および抗原性の維持を増強したことを示す。（Ａ）イサチンβ−チオセミカルバゾンクラスの関連化学的化合物を示す。（Ｂ）デング熱ウイルス血清型４（ＤＥＮＶ４、１１０ｍＭのＮａＣｌ、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４［ｐＨ＝７．５］、２％のＤ−ソルビトール中）を、異なるＭＺ様化合物の不在または存在下で、各パネルに示される二重酸化成分（Ｈ_２Ｏ_２＝０．０１％、ＣｕＣｌ_２＝１μＭ）で処理し、各化合物を１０μＭの濃度で使用した。不活性化を評価するために、生存ウイルスを不活性化の１時間後にプラークアッセイにより試験した。点線は、検出の限界を示す。（Ｃ）抗原性を定量化するために、エンベロープ構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを不活性化の２０時間後に行った。ＥＬＩＳＡ値は、中和エピトープの保持を示し、生ウイルス対照のパーセンテージとして表す。本実施例は、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４を用い、これは、本明細書に開示される無機多原子オキシアニオンの増加範囲内の例示的な濃度である。

【0350】

実施例２５
（メチサゾンが多原子オキシアニオンと相乗して、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持した）
本実施例に示されるように、出願者は、メチサゾンが多原子オキシアニオンと相乗して、二重酸化系ウイルス不活性化中に抗原性を維持したと決定した。

【0351】

二重酸化不活性化中の多原子オキシアニオンと併せたメチサゾンの使用を調査した。図３０に示されるように、メチサゾンは、多原子オキシアニオンと相乗して、単離におけるいずれかの手法によって達成され得るよりも高い抗原性をもたらした。

【0352】

具体的に、図２１は、特定の態様に従って、デング熱ウイルス血清型４（ＤＥＮＶ４、１１０ｍＭのＮａＣｌ、２％のＤ−ソルビトール中）を、メチサゾン化合物（１０μＭ）有りまたは無しで、標準的な（１０ｍＭ）濃度または高（１５０ｍＭ）Ｎａ_２ＨＰＯ_４濃度（ｐＨ＝７．５）を使用して、二重酸化手法（Ｈ_２Ｏ_２＝０．００２％、ＣｕＣｌ_２＝１μＭ）で、室温で２０時間処理したことを示す。処理後、抗原損傷を、エンベロープ構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＤＥＮＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して決定した。ＥＬＩＳＡ値を、未処理の対照の生ウイルスのパーセンテージとして表す。

【0353】

実施例２６
（二重酸化系の遷移金属成分と比較して増加レベルのメチサゾンが、二重酸化系の抗原性および不活性化プロファイルを改善した）
本実施例に示されるように、出願者は、二重酸化系の遷移金属成分と比較して増加レベルのメチサゾンが、二重酸化系の抗原性および不活性化プロファイルを改善したと決定した。

【0354】

我々は、二重酸化系におけるメチサゾンおよび遷移金属の相対濃度の影響を考察した（図３１）。遷移金属と比較してメチサゾン濃度が増加することにより、１０：１（メチサゾン：遷移金属）の好ましいモル比とともに、保持された抗原性および増加したウイルス不活性化速度の両方において付随する改善が実証されたことを見出した。

【0355】

具体的に、図３１は、特定の態様に従って、二重酸化系の遷移金属成分と比較して増加レベルのメチサゾンが、二重酸化系の抗原性および不活性化プロファイルを改善したことを示す。チクングニア熱ウイルス（ＣＨＩＫＶ、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４を補充したＰＢＳ［ｐＨ＝７．５］中）を、メチサゾンの減少濃度の存在下で、室温でＨ_２Ｏ_２（０．０２％）およびＣｕＣｌ_２（１μＭ）で処理した。処理後、ウイルスを、不活性化を評価するためにプラークアッセイにより１時間時点で試験し、Ｅ１およびＥ２構造タンパク質に特異的な２つの中和モノクローナル抗体からなるＣＦＨＫＶ特異的サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、２０時間時点の抗原性の保持について試験した。プラークアッセイの検出限界を点線で示す。本実施例は、１５０ｍＭのＮａＰＯ_４を用い、これは、本明細書に開示される無機多原子オキシアニオンの増加範囲内の例示的な濃度である。

【0356】

実施例を支持する参考文献が、それらのそれぞれの教示のために参照により本明細書に組み込まれる。
Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｌ．Ｂ．Ｒｏｕｔｓｏｎ，ａｎｄ Ｃ．Ｄ．Ｌｙｔｌｅ，Ｖｉｒｕｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｏｐｐｅｒ ｏｒ ｉｒｏｎ ｉｏｎｓ ａｌｏｎｅ ａｎｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄｅ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９３．５９（１２）：ｐ．４３７４−６．
Ｎｉｅｔｏ−Ｊｕａｒｅｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＭＳ２ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ ｉｎ Ｆｅｎｔｏｎ ａｎｄ Ｆｅｎｔｏｎ−ｌｉｋｅ ｓｙｓｔｅｍｓ：ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｍｅｔａｌｓ，ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｐｅｒｏｘｉｄｅ ａｎｄ ｓｕｎｌｉｇｈｔ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０．４４（９）：ｐ．３３５１−６．
Ｂａｒｂｕｓｉｎｓｋｉ，Ｋ．，Ｆｅｎｔｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ−Ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｙ ｃｏｎｃｅｒｎｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００９．１６（３）：ｐ．３４７−３５８．
Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｍｅｔａｌ−ｂａｓｅｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｍｉｃｒｏｂｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９９２．５８（９）：ｐ．３１５７−６２．
ＭｃＣｌａｔｃｈｅｙ，Ｋ．Ｄ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２ｎｄ ｅｄ．２００２，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ．ｘｉｖ，１６９３ｐ．
Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ．，Ｎｕｒｓｉｎｇ．Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ．Ｎｕｒｓｉｎｇ．２００８，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ．ｖｉｉ，６６４ｐ．
Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１９９７．４１（４）：ｐ．８１２−７．
Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ｊ．Ｌ．，Ｐ．Ｌ．Ｇｏｅｒｉｎｇ，ａｎｄ Ａ．Ｌａｍａｎｎａ，Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ａｎｄ ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ ｂｙ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔａｌｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ Ａｐｐｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１９９１．１１０（３）：ｐ．４７７−８５．
Ｔｏｙｏｋｕｎｉ，Ｓ．ａｎｄ Ｊ．Ｌ．Ｓａｇｒｉｐａｎｔｉ，Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ８−ｈｙｄｒｏｘｙ−２’−ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｃｏｐｐｅｒ ａｎｄ ｉｒｏｎ，ｉｎ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ”Ｍｅｄ．”１９９６：Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ，ｐ．８５９−６４．
Ｎｇｕｙｅｎ，Ｔ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｕｐｒｉｃ ｉｏｎ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｈ２Ｏ２：ｒｏｌｅ ｏｆ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｎｔｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ，２０１３．４７（２３）：ｐ．１３６６１−７．
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＲＬ，Ｍｉｎｔｏｎ ＳＡ，Ｊｒ．，Ｏｆｆｉｃｅｒ ＪＥ，Ｈｉｔｃｈｉｎｇｓ ＧＨ．Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅｓ ｏｎ ｖａｃｃｉｎｉａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９５３；７０：２２９−３４．
Ｂａｕｅｒ ＤＪ．Ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ａｎｄ ｓｙｎｅｒｇｉｃ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｓａｔｉｎ ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ ａｎｄ ｃｅｒｔａｉｎ ｐｈｅｎｏｘｙｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｉａ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ．Ｂｒ Ｊ Ｅｘｐ Ｐａｔｈｏｌ．１９５５；３６：１０５−１４．
Ｂａｕｅｒ ＤＪ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｒｕｇ ｍａｒｂｏｒａｎ （１−ｍｅｔｈｙｌｉｓａｔｉｎ ３−ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ）．Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９６５； １３０：１１０−７．
Ｂａｕｅｒ ＤＪ，Ｓｔｖｉｎｃｅｎｔ Ｌ，Ｋｅｍｐｅ ＣＨ，Ｄｏｗｎｉｅ ＡＷ．Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｐｏｘ Ｃｏｎｔａｃｔｓ ｗｉｔｈ Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓａｔｉｎ Ｂｅｔａ−Ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ （Ｃｏｍｐｏｕｎｄ ３３ｔ５７，Ｍａｒｂｏｒａｎ）．Ｌａｎｃｅｔ．１９６３；２：４９４−６．
Ｆｏｘ ＭＰ，Ｂｏｐｐ ＬＨ，Ｐｆａｕ ＣＪ．Ｃｏｎｔａｃｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｉｓａｔｉｎ ｂｅｔａ−ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ ａｎｄ ＣｕＳＯ４．Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１９７７；２８４：５３３−４３．
Ｌｏｇａｎ ＪＣ，Ｆｏｘ ＭＰ，Ｍｏｒｇａｎ ＪＨ，Ｍａｋｏｈｏｎ ＡＭ，Ｐｆａｕ ＣＪ．Ａｒｅｎａｖｉｒｕｓ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｃｏｎｔａｃｔ ｗｉｔｈ Ｎ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｉｓａｔｉｎ ｂｅｔａ−ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅｓ ａｎｄ ｃｅｒｔａｉｎ ｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．１９７５；２８：２７１−８３．
Ｍｉｋｅｌｅｎｓ ＰＥ，Ｗｏｏｄｓｏｎ ＢＡ，Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ＷＥ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｉｓａｔｉｎ−ｂｅｔａ−ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ ａｎｄ ｃｏｐｐｅｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９７６；２５：８２１−７．
Ｒｏｈｄｅ Ｗ，Ｓｈａｆｅｒ Ｒ，Ｉｄｒｉｓｓ Ｊ，Ｌｅｖｉｎｓｏｎ Ｗ．Ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ ｉｓａｔｉｎ ｂｅｔａ−ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ−ｃｏｐｐｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ．Ｊ Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７９；１０：１８３−９４．
Ｐａｋｒａｖａｎ Ｐ，Ｍａｓｏｕｄｉａｎ Ｓ．Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｉｓａｔｉｎ−ｂｅｔａ−Ｔｈｉｏｓｅｍｉｃａｒｂａｚｏｎｅ ａｎｄ Ｃａｌｆ Ｔｈｙｍｕｓ ＤＮＡ ｂｙ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｉｒａｎ Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ．２０１５；１４：１１１−２３．

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図16C】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19A】

【図19B】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図20D】

【図21A】

【図21B】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図26C】

【図27A】

【図27B】

【図27C】

【図28A】

【図28B】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図30】

【図31】