特許 6876628 細胞表面上にペプチドを提示するためのシステム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6876628

(24)【登録日】2021年4月28日

(45)【発行日】2021年5月26日

(54)【発明の名称】細胞表面上にペプチドを提示するためのシステム

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20210517BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20210517BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210517BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20210517BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20210517BHJP

   C07K 17/02 20060101ALI20210517BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20210517BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20210517BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20210517BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20210517BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/09 ZZNA

   C12N15/62 Z

   C12N5/10

   C07K19/00

   C07K14/705

   C07K17/02

   A61K35/12

   A61P37/04

   A61K39/00 Z

   A61K47/65

【請求項の数】20

【全頁数】43

(21)【出願番号】特願2017-564948(P2017-564948)

(86)(22)【出願日】2016年3月4日

(65)【公表番号】特表2018-508237(P2018-508237A)

(43)【公表日】2018年3月29日

(86)【国際出願番号】EP2016054682

(87)【国際公開番号】WO2016139354

(87)【国際公開日】20160909

【審査請求日】2019年2月14日

(31)【優先権主張番号】102015002851.0

(32)【優先日】2015年3月5日

(33)【優先権主張国】DE

(73)【特許権者】

【識別番号】517309869

【氏名又は名称】ペーター ウント トラウドル エンゲルホーン−シュティフトゥング ツア フェアデルング デア レーベンスヴィッセンシャフテン

(74)【代理人】

【識別番号】230104019

【弁護士】

【氏名又は名称】大野 聖二

(74)【代理人】

【識別番号】100119183

【弁理士】

【氏名又は名称】松任谷 優子

(74)【代理人】

【識別番号】100149076

【弁理士】

【氏名又は名称】梅田 慎介

(74)【代理人】

【識別番号】100173185

【弁理士】

【氏名又は名称】森田 裕

(74)【代理人】

【識別番号】100162503

【弁理士】

【氏名又は名称】今野 智介

(74)【代理人】

【識別番号】100144794

【弁理士】

【氏名又は名称】大木 信人

(72)【発明者】

【氏名】イヴァヌジック，ダニエル

【審査官】 林 康子

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１４／１８６６４９（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１５−５００８２６（ＪＰ，Ａ）

【文献】 Ryu F et al，Cell Structure and Function，２０００年，25，317-327

【文献】 Stickney Z et al，Biochem Biophys Res Commun，２０１６年 ２月１８日，472，53-59

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １５／０９

Ｃ１２Ｎ ５／１０

Ｃ０７Ｋ １９／００

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

ＵｎｉＰｒｏｔ／ＧｅｎｅＳｅｑ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のドメイン（ｉ）と、第２のドメイン（ｉｉ）と、第３のドメイン（ｉｉｉ）とを含む融合タンパク質であって、前記第２のドメインは前記第１のドメインと前記第３のドメインとの間に配置されており、
（ｉ）は膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）、小型細胞外ループ（ＳＥＬ）、膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）、小型細胞内ループ（ＳＩＬ）および膜貫通ドメイン３（ＴＭ３）を含む、配列番号１８、２０、２２、２４又は２６で表されるテトラスパニンの部分配列、またはその全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｉ）は配列番号１８、２０、２２、２４又は２６で表されるテトラスパニンの大型細胞外ループ（ＬＥＬ）の配列とは異なるものであり、前記ＬＥＬの部分配列を含む場合、前記配列番号１８、２０、２２、２４又は２６で表されるテトラスパニンのＬＥＬの全長にわたって７０％未満の配列同一性を有する所定のアミノ酸配列を有するペプチドを含み、
（ｉｉｉ）は膜貫通ドメイン４（ＴＭ４）を含む、配列番号１８、２０、２２、２４又は２６で表されるテトラスパニンの部分配列またはその全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含み、
可撓性リンカーが前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間および／または前記第２のドメインと前記第３のドメインとの間に配置されており、前記リンカーがセリンおよびアルギニンを含まず、
細胞膜に固定され細胞表面上に前記所定のアミノ酸配列を有するペプチドを提示することができる、融合タンパク質。

【請求項2】

前記第２のドメイン（ｉｉ）が、所定のアミノ酸配列を有するペプチドに対してＣ末端および／またはＮ末端で配置されている、テトラスパニンの前記ＬＥＬの１つもしくは複数の部分配列またはその全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する配列をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。

【請求項3】

前記第２のドメイン（ｉｉ）が、所定のアミノ酸配列を有するペプチドに対してＣ末端および／またはＮ末端で配置されている、１つまたは複数のプロテアーゼ認識配列をさらに含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。

【請求項4】

前記ペプチドがエピトープ、タンパク質、抗原または酵素から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項5】

融合タンパク質のＮ末端に第４のドメイン（ｉｖ）および／または融合タンパク質のＣ末端に第５のドメイン（ｖ）をさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。

【請求項6】

前記第４および／または第５のドメインがタグ、例えばアフィニティータグまたは蛍光タグを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。

【請求項7】

請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。

【請求項8】

好ましくは発現制御配列と作動可能に連結している、請求項７に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項9】

請求項７に記載の核酸分子または請求項８に記載のベクターを含む細胞。

【請求項10】

真核細胞、好ましくは、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞である、請求項９に記載の細胞。

【請求項11】

少なくとも１個のさらなる核酸分子または少なくとも１個のさらなる発現ベクターでさらに形質転換またはトランスフェクトされた、請求項９または１０に記載の細胞。

【請求項12】

請求項９から１１のいずれか一項に記載の細胞から得られた膜調製物。

【請求項13】

膜と、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項７に記載の核酸分子または請求項８に記載のベクターとを含む、合成膜系。

【請求項14】

細胞表面上に所定のアミノ酸配列を有するペプチドを提示する方法であって、
（ａ）請求項９から１１のいずれか一項に記載の細胞を用意するステップと、
（ｂ）請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質が発現する条件下で前記細胞を培養するステップと
を含む方法。

【請求項15】

膜上に所定のアミノ酸配列を有するペプチドを固定する方法であって、
（ａ）膜を用意するステップと、
（ｂ）融合タンパク質の固定が前記膜で起こる条件下で、前記膜を請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質と接触させる、または請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質が発現し、前記膜に固定される条件下で、前記膜を請求項７に記載の核酸分子または請求項８に記載のベクターと接触させるステップと
を含む方法。

【請求項16】

−ペプチドの相互作用対をスクリーニングする方法における、
−ペプチドと相互作用対の相互作用を試験するための、
−ペプチドを産生する方法における、
−抗体産生方法における免疫化試薬としての、または
−検出試薬としての、
請求項９から１１のいずれか一項に記載の細胞、請求項１２に記載の膜調製物または請求項１３に記載の合成膜系の使用。

【請求項17】

ワクチンまたは医薬品として使用するための、請求項９から１１のいずれか一項に記載の細胞、請求項１２に記載の膜調製物または請求項１３に記載の合成膜系。

【請求項18】

第１の配列セグメント（ｉ）と、第２の配列セグメント（ｉｉ）と、第３の配列セグメント（ｉｉｉ）とを含む核酸分子であって、前記第２の配列セグメントは前記第１の配列セグメントと前記第３の配列セグメントとの間に配置されており、
（ｉ）は膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）、小型細胞外ループ（ＳＥＬ）、膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）、小型細胞内ループ（ＳＩＬ）および膜貫通ドメイン３（ＴＭ３）を含む、配列番号１８、２０、２２、２４又は２６で表されるテトラスパニンの部分配列、またはその全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する配列をコードし、
（ｉｉ）はマルチクローニングサイトを含み、
（ｉｉｉ）は膜貫通ドメイン４（ＴＭ４）を含む、配列番号１８、２０、２２、２４又は２６で表されるテトラスパニンの部分配列またはその全長にわたって少なくとも９５％の配列同一性を有する配列をコードし、ならびに、
前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間および／または前記第２のドメインと前記第３のドメインとの間に配置され、セリンおよびアルギニンを含まない可撓性リンカーをコードし、
細胞膜に固定され細胞表面上に外来ペプチドを提示することができる融合タンパク質をコードする、核酸分子。

【請求項19】

好ましくは発現制御配列と作動可能に連結している、請求項１８に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項20】

（ｉ）請求項７もしくは１８に記載の核酸分子または請求項８もしくは１９に記載のベクターと、
（ｉｉ）細胞または膜と
を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願の主題は、細胞外ループが、全体的にまたは部分的に、異なる組成のペプチド配列によって置き換えられているテトラスパニンタンパク質に基づく融合タンパク質に関し、その製造および輸送媒体としての使用にも関する。開示される融合タンパク質は、細胞膜に固定され、細胞表面上にこれらのタンパク質と融合した外来ペプチドを提示するために使用され得る。

【背景技術】

【0002】

細胞の構造計画およびその生理学は遺伝子によってコードされる。遺伝子はＤＮＡからなり、ゲノム中または染色体外要素上のいずれかに見られる。遺伝子は、ＲＮＡおよびタンパク質などの一次および二次遺伝子産物を発現する。これらの遺伝子産物は種々の方法で酵素的にさらに修飾され得る。

【0003】

遺伝子産物は主にサイトゾル中に見られる。タンパク質は、一部はコンパートメントの細胞内膜、および外細胞膜、およびおそらくは細胞壁にも見られる。真核生物の場合、タンパク質およびＲＮＡ前駆体は細胞核中に見られる。タンパク質はサイトゾルの細胞内膜中で選別され、細胞コンパートメントに分配されるが、分泌によって細胞から運び出されることもある。小胞体（ＥＲ）からの輸送タンパク質はさらに、輸送中にゴルジ体でグリコシル化され得る。

【0004】

特定のタンパク質種である膜固定タンパク質は、活発に細胞膜に向けられ、そこで自身を膜に垂直に固定する。しかしながら、対照的に、膜固定タンパク質は、膜流動性により、水平に膜内を柔軟に移動することができる。いくつかの膜タンパク質は他の異種膜タンパク質と集塊して複合体化する。よって、ヒトタンパク質の８０％は会合したタンパク質複合体で作用する¹。ある種は膜で協同的に互いと相互作用し、そこで安定な構造を形成する。

【0005】

細胞が環境と相互作用することを可能にする複数のシグナル過程は、膜タンパク質を介して制御される。外分泌過程に関連した細胞膜を介したタンパク質の膜輸送も同様に可能である。

【0006】

エピトープの提示について、細胞内の潜在的な侵入病原体を同定するために、免疫系は細胞上のＭＨＣ膜タンパク質を使用する。これらの生理学的過程は、大部分は細胞で十分確立されており、関与するタンパク質はこの機能のために極めて特異的に、すなわち、大部分は一定の機能に向けて極めて特異的に進化している。そのため、これらの機能に干渉するさらなる人工アミノ酸配列を予測することができる。

【0007】

テトラスパニンは、哺乳動物において３３種類のメンバーが存在するタンパク質スーパーファミリーに属する。テトラスパニンの主な特徴は、呼称ももたらしているその４つの膜貫通ドメインＴＭ１〜４である。テトラスパニンはさらにＳＥＬおよびＬＥＬとしても知られている小型および大型細胞外タンパク質ループ（小型および大型細胞外ループ）を含む。ＬＥＬは高度に保存されたＣＣＧアミノ酸モチーフを含む。さらに、細胞内タンパク質ループ（小型細胞内ループ、ＳＩＬ）がその中に含まれる。Ｎ末端およびＣ末端は細胞内に局在する³⁴〜³⁶。横のタンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）を用いて、テトラスパニンは、テトラスパニンの豊富なマイクロドメイン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎ）（ＴＥＭ）に自身を組織化する^37、38。

【0008】

異種組成の外来タンパク質およびエピトープを意図した方法で、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞の表面に輸送し、これらをそこで提示するために、特に適した担体タンパク質（担体）が必要とされる。膜を介した高い転移効率での細胞表面へのタンパク質輸送を保証するために、担体タンパク質は十分な起電力を有し、膜電位を使用することができなければならない²〜⁸。従来から、「ディスプレイ」システム、一般的に、遺伝子組換えすることによって外来タンパク質を提示するために担体タンパク質として使用することができる膜固定タンパク質が公知であった。最も周知のタンパク質ディスプレイシステムの１つがファージディスプレイである。これは、細菌系で糸状バクテリオファージの表面上へのタンパク質構成要素の提示に使用される⁹〜¹²。しかしながら、従来から、グラム陽性およびグラム陰性菌の場合には、異種タンパク質もファージディスプレイを使用することなく最外膜上にうまく提示されてきた。これについては、タンパク質を細菌細胞の最外膜に向けるために、細菌細胞内の異なる輸送機序が利用された¹³〜²⁰。タンパク質折りたたみおよび組換えタンパク質の修飾、例えば、Ｎ−グリコシル化などを確保するために、ディスプレイシステムのさらなる開発は酵母および昆虫細胞などの真核細胞系に焦点を当てた²¹〜²⁹。哺乳動物系で使用するための初期のディスプレイシステムも既に開発されている³⁰〜³³。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Proteomics 7, 2833-2842, (2007).

【非特許文献2】Cell 95, 883-889 (1998).

【非特許文献3】Annu Rev Immunol 23, 101-125, (2005).

【非特許文献4】Annu Rev Biochem 75, 707-712, (2006).

【非特許文献5】Molecular BioSystems 3, 705-713, (2007).

【非特許文献6】Molecular cell biology. (W.H. Freeman, 2013).

【非特許文献7】Biochim Biophys Acta 1838, 1451-1466, (2014).

【非特許文献8】Anal Chem 85, 2558-2568, (2013).

【非特許文献9】Science 228, 1315-1317 (1985).

【非特許文献10】Eur J Biochem 226, 53-58 (1994).

【非特許文献11】Protein Sci 4, 1108-1117, (1995).

【非特許文献12】Chem Rev 105, 4056-4072, (2005).

【非特許文献13】Biotechnol Bioeng 79, 496-503, (2002).

【非特許文献14】Appl Environ Microbiol 68, 525-531 (2002).

【非特許文献15】Trends Biotechnol 21, 45-52 (2003).

【非特許文献16】Microb Cell Fact 5, (2006).

【非特許文献17】Appl Environ Microbiol 74, 4359-4365, (2008).

【非特許文献18】Trends Biotechnol 29, 79-86, (2011).

【非特許文献19】Crit Rev Microbiol, doi: 10.3109/1040841 X.2013.804032 (2013).

【非特許文献20】Han, M.-J. & Lee, S. H. An efficient bactenal surface display system based on a novel outer membrane anchoring element from the Escherichia coli protein Yia T. (2014).

【非特許文献21】Biotechnology (N Y) 13, 1079-1084 (1995).

【非特許文献22】BioTechniques 22, 730-735 (1997).

【非特許文献23】Yeast 19, 1153-1163, (2002).

【非特許文献24】J Gen Virol 84, 2023-2031 (2003).

【非特許文献25】Nat Biotechnol 22, 1399-1408, (2004).

【非特許文献26】Mol Ther 9, 282-291, (2004).

【非特許文献27】BioTechniques 41, 266, 268, 270 passim (2006).

【非特許文献28】Glycobiology 16, 91R-101R, (2006).

【非特許文献29】Biotechnol Lett 29, 1561-1566, (2007).

【非特許文献30】J Immunol Methods 193, 17-27 (1996).

【非特許文献31】J Mol Recognit 17, 316-322, (2004).

【非特許文献32】MAbs 2, 508-518, (2010).

【非特許文献33】Biochem Biophys Res Commun 441 , 59-64, (2013).

【非特許文献34】Trends Biochem Sci 28, 106-112 (2003).

【非特許文献35】BMC Struct Biol 5, 11, (2005).

【非特許文献36】Nat Rev Drug Discov 7, 747-758, (2008).

【非特許文献37】Nat Rev Immunol 5, 136-148, (2005).

【非特許文献38】Eur J Immunol 26, 2657-2665, (1996).

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の目的は、形質膜に任意の所望の異種ペプチドを固定し、細胞表面上にこれらを提示するための、この先行技術から出発する新たな可能性の提供であった。驚くべきことに、テトラスパニンが媒体として見事に適しており、細胞表面上に固定および提示するために自身と融合した外来ペプチドを極めて効率的に輸送する能力を有することがここで分かった。テトラスパニンは、外来ペプチドを、小胞体およびゴルジ体を介して哺乳動物細胞の形質膜に極めて効率的に誘導することができる。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】本発明による融合体および融合タンパク質の局在の概略図である。

【図1B】本発明による融合体および融合タンパク質の局在の概略図である。

【図2A】代表的なｔＡＮＣＨＯＲベクター系の概略構造を示す図である。

【図2B】ＣＤ６３のコード野生型（ＷＴ）配列（配列番号１７）からのＣＤ６３Δ ＬＥＬ配列（配列番号３）の誘導を示す図である。

【図2C】代表的なベクターｐＡＥ２１１＿ＣＭＶ−Ｐ−ＣＤ６３ΔＬＥＬにおけるＣＤ６３ΔＬＥＬと組み合わせた本発明による種々のリンカー変異体の例を示す図である。

【図3A】ｃＬＳＭによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の融合タンパク質の局在を示す図である。

【図3B】ｃＬＳＭによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の融合タンパク質の局在を示す図である。

【図3C】ｃＬＳＭによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の融合タンパク質の局在を示す図である。

【図4】エピトープの細胞外配向調査の概略図である。

【図5A】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の金粒子（１０ｎｍ）のＳＥＭ像を示す図である。

【図5B】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の金粒子（１０ｎｍ）のＳＥＭ像を示す図である。

【図5C】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の金粒子（１０ｎｍ）のＳＥＭ像を示す図である。

【図5D】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の金粒子（１０ｎｍ）のＳＥＭ像を示す図である。

【図6】作製したｔＡＮＣＨＯＲベクターによりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウエスタンブロット解析を示す図である。

【図7】Ｖ５−６ｘＨｉｓリンカーを含む内部融合部位によるタンパク質輸送に関してさらなるテトラスパニンを調査するための構築物の概略図である。

【図8】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の融合タンパク質の局在を示す図である。

【図9】抗体を検出するためのｔＡＮＣＨＯＲシステムの適用を示す図である。

【図10】低セリンおよび低アルギニンリンカーの使用による効率増加を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0012】

テトラスパニンファミリーのタンパク質は、野生型の膜貫通ドメインＴＭ３とＴＭ４との間にタンパク質ループ（大型細胞外ループ、ＬＥＬ）を有する。驚くべきことに、この細胞外ループは、全体的にまたは部分的に、異なる組成のペプチド配列によって置き換えられていてもよく、よって、挿入された異種ペプチドを、テトラスパニン担体タンパク質を介して膜上に輸送し、膜にこれを固定することが可能であることが本発明の枠組みの中で発見された。

【0013】

本発明は、細胞膜およびそこでの固定を介した特異的輸送媒体の機能と合わせたモジュラータンパク質発現系の柔軟で可変的な配列調節のための均一な分子構造の単純性に基づく。

【0014】

提供されるベクター系により、単純なクローニング戦略（例えば、個々のエピトープを付加する、およびタンパク質ライブラリー全体を作製する）によってタンパク質構成要素を柔軟に置き換えるまたは付加することが可能になる。

【0015】

（一過的にまたは安定にゲノムに組み込まれた）本発明によるテトラスパニン融合構築物の発現後、膜内の融合タンパク質の局在は、ほぼ定量的である。テトラスパニンタンパク質は膜上に極めて効率的に移行する。既に知られている系はこの形態での移行を達成するものではない（例えば、ＥＧＦＲ受容体）。

【0016】

本発明によるテトラスパニン融合タンパク質の発現は比較的迅速に、通常は一晩で起こる一方で、他の輸送系の発現は通常は２日間にわたって起こる。

【0017】

それとは別に、サイトゾル分解産物の蓄積が見られないので、融合構築物の安定性およびその長寿命は、７回膜貫通ドメインを有する公知のタンパク質と比べて優れている（組換えＧＰＣＲ受容体は不安定なことが知られている）。

【0018】

４回膜貫通ドメインのみを有する本発明による系では、１つまたは複数のタンパク質を細胞表面上に安定的かついかなる問題もなく輸送し、これらのタンパク質をそこで例えば、小分子、さらなるタンパク質（抗体など）、および他のタンパク質（例えば、触媒酵素）、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび糖等との相互作用実験における固定対として固定および固定化することが可能である。

【0019】

ここで、膜上の融合タンパク質の反応物質が周囲溶液から膜上のタンパク質およびグリコシル残基との特異的反応に柔軟に入ることができる。

【0020】

これらの反応の必要条件は、タンパク質の機能的コンフォメーションである。これは、本発明による融合タンパク質に関する限りは完全に保証される。

【0021】

そのため、本発明の第１の主題は、第１のドメイン（ｉ）と、第２のドメイン（ｉｉ）と、第３のドメイン（ｉｉｉ）とを含む融合タンパク質であって、第２のドメインは第１のドメインと第３のドメインとの間に配置され、
（ｉ）は膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）、小型細胞外ループ（ＳＥＬ）、膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）、小型細胞内ループ（ＳＩＬ）および膜貫通ドメイン３（ＴＭ３）を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性を有するこれと相同な配列を含み、
（ｉｉ）はテトラスパニンの大型細胞外ループ（ＬＥＬ）に関して全長にわたって７０％未満の配列同一性を有する所定のアミノ酸配列を有するペプチドを含み、
（ｉｉｉ）は膜貫通ドメイン４（ＴＭ４）を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性を有するこれと相同な配列を含む、
融合タンパク質である。

【0022】

本発明で、配列ＴＭ１〜３およびＴＭ４が膜上への融合タンパク質の固定を担うことが分かった。そのため、本発明による融合タンパク質は、第１に、膜貫通ドメインＴＭ１〜ＴＭ３を有するテトラスパニンの部分配列を含む第１のドメイン（ｉ）、および第２に、膜貫通ドメインＴＭ４を有するテトラスパニンの部分配列を含むドメイン（ｉｉｉ）あるいはそれらと相同な配列を含む。

【0023】

本発明の意味において、「テトラスパニン」という用語は、テトラスパニンファミリー、より具体的には３３種のヒトテトラスパニンの任意の所望のタンパク質を記載するものである。テトラスパニンは、膜内で互いとの特異的相互作用に入ることができる。この挙動は、膜上への輸送およびそこでの固定に好都合である。この効果を、ドメイン（ｉｉ）の外来ペプチドを膜上に有効に輸送し、これを固定するためにも、本発明による融合タンパク質に使用することができる。本発明の意味におけるテトラスパニンの好ましい例は、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ８１、ＣＤ１５１およびＣＤ５３（ＤＮＡ配列およびタンパク質配列については配列記録参照）である。特に好ましくは、本発明による融合タンパク質に含まれる部分配列がテトラスパニンＣＤ６３（ＤＮＡおよびタンパク質配列については配列記録参照）に由来する。

【0024】

基本的な原理として、ドメイン（ｉ）に第１のテトラスパニンの部分配列を選択し、ドメイン（ｉｉｉ）に別のテトラスパニンの部分配列を選択することが可能である。しかしながら、好ましくは、全ての部分配列が同じテトラスパニン、例えばＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ８１、ＣＤ１５１またはＣＤ５３、好ましくはＣＤ６３（ＤＮＡおよびタンパク質配列については配列記録参照）からのものである。

【0025】

ドメイン（ｉ）は、好ましくはテトラスパニンの膜貫通ドメインＴＭ１、小型細胞外ループ（ＳＥＬ）、膜貫通ドメインＴＭ２、小型細胞内ループ（ＳＩＬ）および膜貫通ドメインＴＭ３を含み、種々の膜貫通ドメインおよびループは、いかなる追加の異種配列セグメントも間に挿入されることなく、直接互いに続いている。特に好ましくは、部分配列が、例えば、単一のまたは複数のアミノ酸の置換、挿入または欠失の形態のいかなる逸脱もなしに、テトラスパニンの野生型に相当する。しかしながら、野生型テトラスパニンに対して配列の全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性を有する限り、ドメイン（ｉ）にテトラスパニンの修飾部分配列を使用することが原則として可能である。より好ましくは、配列同一性が、ドメイン（ｉ）に含まれるテトラスパニンの部分配列の全長にわたって少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％である。

【0026】

本発明の特に好ましい実施形態では、第１のドメイン（ｉ）が、テトラスパニンの上記部分配列または全長にわたって少なくとも７０％（より好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％）の配列同一性を有するこれと相同な配列からなる。

【0027】

ドメイン（ｉｉｉ）は、テトラスパニンの膜貫通ドメインＴＭ４を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性を有するこれと相同な配列を含む。より好ましくは、野生型テトラスパニンの部分配列との配列同一性が、全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％である。特に好ましい実施形態では、ドメイン（ｉｉｉ）が、テトラスパニンの上記部分配列またはこれと相同な配列からなる。

【0028】

ドメイン（ｉｉ）は所定のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。本明細書中では、これを「外来ペプチド」または「外来タンパク質」とも呼ぶ。外来ペプチドのアミノ酸配列は、野生型テトラスパニン、より具体的にはドメイン（ｉ）および（ｉｉｉ）のテトラスパニン（複数可）の大型細胞外ループ（ＬＥＬ）の配列とは異なる。野生型テトラスパニンのＬＥＬと比較すると、全長にわたる配列同一性は７０％未満、好ましくは５０％未満、より好ましくは４０％未満または３０％未満である。

【0029】

ドメイン（ｉｉ）のアミノ酸配列は基本的にランダムに選択され得る。外来ペプチドまたはドメイン（ｉｉ）の配列にかかわりなく、本発明による融合タンパク質は、細胞、より具体的には哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ−ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ））の表面上に固定および提示され得る。

【0030】

本発明の意味において、「ペプチド」とはペプチド結合を介して一緒に連結されている少なくとも２個のアミノ酸の組合せを表す。ペプチドの長さは基本的には限定されない。最大１０個のアミノ酸を含むオリゴペプチド、１０個超のアミノ酸を含むポリペプチドおよび１００個超のアミノ酸を含むマクロペプチドも全て含まれる。好ましい実施形態では、ペプチドの大きさが１００ｋＤａ未満、好ましくは５０ｋＤａ未満または３０ｋＤａ未満、例えば１０〜３０ｋＤａである。

【0031】

本発明の意味において、「アミノ酸」という用語は、好ましくは各場合でＬ−異性体である２０種の天然起源のペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質に見られるアミノ酸を表す。しかしながら、本発明によると、この用語は、アミノ酸の類似体ならびにアミノ酸のＤ−異性体およびその類似体も含む。

【0032】

本発明の意味において、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語はそれぞれ互換的に使用される。好ましい実施形態では、ペプチドが少なくとも５０個のアミノ酸を含むタンパク質である。これについては、タンパク質が、例えば、タンパク質の所望の機能に要求される所定の折りたたみを採用することが好ましい。

【0033】

ドメイン（ｉｉ）では、所定のアミノ酸配列を有するペプチドが、例えば、抗原または抗原のエピトープを含むことができる。ここで、「エピトープ」とは、抗体またはＴ細胞受容体が特異的に結合する抗原の領域を表す。単一抗原は１つまたは複数のエピトープを含むことができる。本発明の一実施形態では、所定のアミノ酸配列を有するペプチドが、リンカーによって一緒に連結されている複数のエピトープを含む。例えば、これらのエピトープは抗原の複数のエピトープであり得るだろう。エピトープの例には、がんエピトープ、ＨＩＶエピトープ（例えば、ＨＩＶ−１のｇｐ４１）がある。これらの例には、Ｖ５−６ｘＨｉｓ（配列番号３５、３６）または２Ｆ５−４Ｅ１０（配列番号３７、３８）がある。

【0034】

本発明のさらなる実施形態では、ドメイン（ｉｉ）の所定のアミノ酸配列を有するペプチドが、所望の機能を有するタンパク質、例えば、酵素（例えば、プロテアーゼなど）を含む。

【0035】

所定のアミノ酸配列を有するペプチドに加えて、第２のドメイン（ｉｉ）は、テトラスパニンのＬＥＬの１つもしくは複数の部分配列または全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性を有するこれと相同な配列を含むことができる。好ましくは、配列同一性が少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％である。テトラスパニンのＬＥＬの部分配列は、所定のアミノ酸配列を有するペプチドに対してＣ末端および／またはＮ末端で配置され得る。好ましくは、ドメイン（ｉｉ）のＬＥＬの部分配列が、ドメイン（ｉ）および（ｉｉｉ）の配列セグメントと同じテトラスパニンに由来する。

【0036】

本明細書で使用される「相同」は、２つのポリペプチド、分子間または２つの核酸間の配列類似性を記載するものである。２つの比較される配列の両方のある位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、この位置の対応する分子は相同である。２つの配列の間の相同性の割合は、２つの配列によって共有される一致または相同な位置の数÷比較される位置の数×１００の関数である。例えば、２つの配列中の１０個の位置の中の６個が一致しているまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。一般的に、２つの配列を、最大限可能な相同性が得られるよう整列させて比較を行う。このような整列は、例えば、Ｎｉｅｄｅｌｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３、１９７０の方法を用いて提供することができ、コンピュータプログラムによって簡便に実施することができる。

【0037】

相同配列は、同一のまたは類似のアミノ酸残基を共有し、類似の残基とは整列された基準配列中の対応するアミノ酸残基の保存的置換またはその許容される点突然変異である。この点について、基準配列中の残基の「保存的置換」は、対応する基準残基と物理的または機能的に類似である、例えば、類似の大きさ、形状、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合を形成する能力を含む）などを有する置換である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら、「Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、５：補遺３、第２２章：３５４〜３５２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、１９７８の許容される点突然変異について定義された基準を満たすものである。

【0038】

本発明による融合タンパク質のドメインは、各場合で、（ｉ）−（ｉｉ）−（ｉｉｉ）の順に配置される。ここで、「融合」という用語は、個々のペプチド骨格を介したドメインの共線カップリングを指す。

【0039】

ドメイン（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）は、場合により直接または可撓性リンカーを介して結合することができる。第１の実施形態では、ドメイン（ｉｉ）が直接ドメイン（ｉ）に隣接する。あるいはまたはさらに、ドメイン（ｉｉｉ）が直接ドメイン（ｉｉ）に隣接する。

【0040】

さらなる実施形態では、可撓性リンカーが第１のドメインと第２のドメインとの間および／または第２のドメインと第３のドメインとの間に配置される。存在するリンカーは同じであっても異なっていてもよい。本発明による融合タンパク質に使用するための代表的なリンカーは、例えば、グリシンポリマー（Ｇ）_n（ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマーおよび当業者に公知の他の可撓性リンカーを含む。本質的にセリンを含まないおよびアルギニンを含まないリンカーが好ましく；セリンを含まないおよびアルギニンを含まないリンカーが特に好ましい。極めて特に好ましいのはリンカーＬＱＥＦＤＩＧＧＧＧ（配列番号４１、４２に相当する）である。さらなるリンカーは図２Ｃに記載される（配列番号３９、４０も参照）。

【0041】

ドメイン（ｉｉ）は、酵素で分離され得る１つまたは複数の認識配列をさらに含むことができる。例には、特異的プロテアーゼ、ヌクレアーゼまたはエンドグリコシダーゼの認識部位がある。あるいは、認識部位は、特異的ヒドロラーゼ酵素、例えば、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、アミダーゼまたはエステラーゼの基質認識部位を含むことができる。「プロテアーゼ認識配列」という用語は、本明細書において、酵素的に分離することができる任意の認識配列に略式で使用される。これらの配列は、所定のアミノ酸配列を有するペプチドにＣ末端および／Ｎ末端で配置され得る。特定の好ましい実施形態では、プロテアーゼ認識配列が、直接所定のアミノ酸配列を有するペプチドに隣接する。基本的な原理として、任意の所望のプロテアーゼ認識配列がこれに適している。所定のアミノ酸配列を有するペプチドとは別に、第２のドメイン（ｉｉ）がテトラスパニンのＬＥＬの１つまたは複数の部分配列も含む場合、各場合で、ＬＥＬ部分配列と所定のアミノ酸配列を有するペプチドのＣまたはＮ末端との間にプロテアーゼ認識配列を挿入することが好ましい。

【0042】

さらなる実施形態では、本発明による融合タンパク質が、融合タンパク質のＮ末端に第４のドメイン（ｉｖ）および／またはＣ末端に第５のドメイン（ｖ）をさらに含むことができる。ドメイン（ｉｖ）および（ｖ）は、各場合で、直接または上に定義される可撓性リンカーを介して結合され得る。例えば、ドメイン（ｉｖ）は、ドメイン（ｉ）のＮ末端に直接または可撓性リンカーを介して結合され得る。ドメイン（ｖ）は、ドメイン（ｉｉｉ）のＣ末端に直接または可撓性リンカーを介して結合され得る。さらに、上に定義されるプロテアーゼ認識配列をドメイン（ｉｖ）と（ｉ）との間および／またはドメイン（ｉｉｉ）と（ｖ）との間、ならびに存在する場合には、リンカーとドメイン（ｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）の１つまたは複数との間に配置することが可能である。

【0043】

細胞の形質膜中のテトラスパニンの固定に関して、テトラスパニンのＣ末端およびＮ末端は細胞質側にある。同じことが本発明による融合タンパク質の膜固定にも同様に当てはまる。

【0044】

本発明による融合タンパク質の第４のドメイン（ｉｖ）および第５のドメイン（ｖ）は、例えば、マーカー基またはタグとして知られているものを含むように選択され得る。ここで、「タグ」とは、標識および同定のための短いペプチド配列、例えばタンパク質タグ、例えば、フラッシュタグまたは蛍光レポータータンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを表す。

【0045】

本発明による融合タンパク質は少なくともドメイン（ｉｉ）のために野生型テトラスパニンとは異なるが、それにもかかわらず、野生型テトラスパニンと同様に正しく折りたたむことが分かった。これは、ドメイン（ｉｉ）で蛍光タンパク質ＣＦＰおよびＹＦＰの例を使用して証明された（図３Ｂ参照）。膜貫通ドメインＴＭ３とＴＭ４との間のエピトープを走査電子顕微鏡法を利用して細胞外配向で細胞表面上に検出することができる（図４）。テトラスパニンのＴＭ３とＴＭ４との間のエピトープの導入ならびに細胞外配向で細胞表面への輸送及びＮ末端およびＣ末端上のエピトープが、例えば、走査電子顕微鏡法によってＣＤ６３について証明された（図５Ａ〜図５Ｄ）。蛍光タンパク質のタンパク質発現の成功をウエスタンブロット解析によってさらに確認した。ここでは、ＦＬＡＧおよびｍＣｈｅｒｒｙエピトープを介して、それぞれの融合タンパク質について特異的バンドを検出することができた（図６）。細胞表面上のさらなるテトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ８２およびＣＤ１５１）についての局在も同様に示された（図８）。さらに、低セリンおよび低アルギニンリンカーの使用によって、細胞表面上の局在化の効率が増加することが示された（図１０）。

【0046】

本発明のさらなる主題は、本発明による融合タンパク質をコードする核酸分子である。本発明による核酸分子は、上記融合タンパク質のためのコード配列セグメントを含む、またはこの配列セグメントからなる。この配列セグメントは、本明細書において、「融合遺伝子」とも記載される。特に好ましくは、本発明による核酸分子は単離された形態で存在する。

【0047】

本発明の意味における「核酸分子」は、天然起源の核酸塩基、塩基類似体、塩基誘導体またはこれらの組合せ形態の配列に関する。この用語は、より具体的にはＤＮＡおよびＲＮＡならびに例えば、ｃＤＮＡおよびｍＲＮＡなどのこれらに由来する核酸も含む。本発明の意味において、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＳＮＡ（ホスホチオエート核酸（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ））などの核酸類似体も核酸の中に含まれる。これらの核酸類似体は、原則として、天然起源の核酸塩基を有することができるが、これらの塩基は例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡとは異なる方法で一緒に連結している。例えば、ヒポキサンチン、２，５−ジアミノプリン（diaminoporin）および／またはメチルシトシンなどの核酸誘導体ならびに修飾された、より具体的には標識された核酸を有する核酸も核酸の中に含まれる。塩基誘導体とは別に、これらの核酸誘導体は、原則として、天然起源の核酸塩基も有することができる。標識を塩基および／または骨格に導入することができる。連結はＤＮＡまたはＲＮＡまたは核酸類似体に対応し得る。核酸は二本鎖または一本鎖の、直鎖、分岐または環状であり得る。

【0048】

本発明はさらに、上記の核酸分子を含むベクターに関する。好ましくは、核酸分子は発現制御配列と作動可能に連結している。

【0049】

本発明の意味における「発現制御配列」という用語は、転写レベルで発現を調節する要素、例えば、エンハンサーまたはサイレンサーなどと、転写後レベルで発現を調節する要素（例えば、スプライシング、核外輸送またはｍＲＮＡ安定性）の両方を含む。この用語は、転写レベルと転写後レベルで発現を調節する複数の要素、および転写調節要素と転写後調節要素の組合せも含む。発現増加および発現制御配列の単離をもたらす発現制御配列を同定するための技術および助けは、当業者におそらく周知の日常的技術である。発現制御配列は、より具体的にはプロモーター、好ましくは真核生物プロモーター、例えばＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーターなど；原核生物プロモーターまたはファージ特異的プロモーター、例えばＳＰ６またはＴ７プロモーターなどであり得る。特に好ましくは、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。ベクターは、終止および／または核酸分子のポリアデニル化のための配列セグメントをさらに含むことができる。

【0050】

本発明によるベクターは、さらに好ましくは、選択マーカー遺伝子、すなわち、選択マーカーをコードする配列セグメントを含む。選択マーカーの例には抗生物質耐性または栄養素要求性マーカーがある。好ましくは、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素などの増幅可能な選択マーカー遺伝子を使用する。場合により、本発明によるベクターはさらに複製起点を含むことができる。

【0051】

本出願の意味において、「作動可能に連結している」という用語は、意図した機能を行うことができるように配置された２つ以上の核酸配列または部分配列の連結を記載するものである。例えば、プロモーター／エンハンサーがシス位で連結した遺伝子配列の転写を制御または調節することができる場合、プロモーター／エンハンサーはコードされる遺伝子配列と機能的に連結している。一般的に、必ずしもそうではないが、機能的に連結した配列は、近接して位置しており、２つのコード遺伝子配列が連結している場合または分泌シグナル配列の場合、同じリーディングフレームに位置している。機能的に連結したプロモーターは一般的にコード遺伝子配列の上流に位置するが、必ずしも近接している必要はない。同様に、エンハンサーも遺伝子配列の転写を促進する限り、近接して存在する必要はない。この目的のために、エンハンサーはおそらくはいくらかの距離離れて、遺伝子配列の上流と下流の両方に存在することができるだろう。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を介してポリアデニル化シグナルまで進行するように遺伝子配列の３’末端に位置する場合、遺伝子配列と機能的に連結している。連結は、例えば、ＰＣＲ技術によって、適当な制限部位でのライゲーションによってまたはスプライシングによって、通常の組換え方法により起こり得る。適当な制限部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターをそれ自体公知の様式で使用することができる。好ましくは、機能的連結がイントロン配列を介して起こらない。

【0052】

本発明によるベクターは、好ましくは少なくとも１個の（宿主）細胞、より具体的にはこの細胞中でのベクターの複製および／またはこの細胞中でのタンパク質もしくはペプチドの発現に適している。複製は、原核細胞および／または真核細胞で起こり得る。発現は好ましくは真核細胞で起こる。ベクターはプラスミドであり得る。

【0053】

先行技術による真核細胞発現のためのベクター構築物は、概して、できる限り細胞型特異的でない強力な真核生物プロモーター（例えば、ＣＭＶまたはＳＶ４０プロモーター）と、転写終止およびポリアデニル化を担う配列部分（例えば、ＳＶ４０終止−ポリＡ）とを有する。これらの２つの要素の間に位置するのが、開始コドンの周りのいくぶん明確に定義されたコザック配列が頭についた、発現されるＣＤＳ（コード配列）である。本発明によるベクター構築物の場合、発現されるＣＤＳはテトラスパニンスーパーファミリーの遺伝子である。ここで、膜上への所望の輸送能力を提供するこの遺伝子スーパーファミリーの遺伝子を有する全ての生物種の全てのテトラスパニン遺伝子が本発明によるものである。しかしながら、本発明による融合遺伝子は、内部およびおそらくは末端融合物として少なくとも１つの人工的に導入された異種ＤＮＡ配列を有することができることを特徴とする。末端ＣＤＳ融合物は、融合タンパク質またはペプチドをテトラスパニン遺伝子に対して５’近位および／または３’遠位にコードする異種ＤＮＡ配列である。本発明によると、第３（ＴＭ３）と第４（ＴＭ４）の膜貫通ドメインの間に、内部コード異種ＤＮＡ配列が導入される。テトラスパニンの膜貫通ドメインは、中でも、膜への異種コード配列の輸送、膜を通した輸送およびそこでの固定を担う。

【0054】

分子生物学に習熟した当業者であれば、おそらく関連文献³⁹の助けを借りて、機能的ＤＮＡ融合構築物を作製することができるだろう。

【0055】

本発明によるさらに進化したベクター構築物をここで特に強調すべきである。一般的な真核生物プロモーターの代わりに、これらのベクター構築物は、細菌およびファージ特異的プロモーターならびに細胞分化に依存した発現を可能にする真核細胞型特異的および器官特異的プロモーターも有する。用途にかかわらず、本発明による遺伝子構築物を使用するために、このようなプロモーター型を使用することができる。インビトロまたはおそらくはインビボでｍＲＮＡ分子を極めて効率的に作製するために、本発明によるさらなるベクター実施形態は、例えば、ファージのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有することもできる。例には、インビトロでｍＲＮＡ分子を産生するためのＳＰ６またはＴ７特異的プロモーターなどのファージプロモーターがあるので、融合遺伝子ｍＲＮＡをおそらく治療目的および用途のために供給することができる。この変異体は、ゲノム中での核酸の組換えを防ぐと考えられているので、調節因子の医薬形態として歓迎されている。

【0056】

細菌または酵母でのテトラスパニン遺伝子誘導体の発現を使用して融合タンパク質を単離し、人工膜に使用することができる。しかしながら、真核細胞分化特異的および細胞特異的（例えば、粘膜または筋細胞での）発現を使用してＤＮＡワクチンを細胞特異的に発現させることもできる（例えば、欧州特許第１３９０４９０Ｂ１号参照）。

【0057】

治療剤の認可手続きでは、このような高度に特異的な発現特性を必須条件にする規制が確立されている。

【0058】

さらに、本発明によるベクター系は、単一ベクター構築物によって同一細胞内での複数の融合タンパク質の発現を可能にする特異的な設計を有する（特許出願ドイツ特許第１０２０１３００６４８７Ａ９号参照）。この設計により、さらなる要素を単純化された様式で追加することができる。

【0059】

本発明の主題はまた、上に定義されるが、所定のアミノ酸配列を有するペプチドのコード配列の代わりに、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を介して所定のアミノ酸配列を有する任意の所望のペプチドをコードする遺伝子のクローニングを可能にするマルチクローニングサイトのみが存在する、融合タンパク質をコードするセグメントを有する核酸およびベクターに関する。さらに、マルチクローニングサイトは、Ｎ末端および／またはＣ末端ドメイン（ｉｖ）および（ｖ）に関して５’位および／または３’位に存在することができる。

【0060】

そのため、本発明の一態様は、第１の配列セグメント（ｉ）と、第２の配列セグメント（ｉｉ）と、第３の配列セグメント（ｉｉｉ）とを含む核酸分子であって、第２の配列セグメントは第１の配列セグメントと第３の配列セグメントとの間に配置され、
（ｉ）は膜貫通ドメイン１（ＴＭ１）、小型細胞外ループ（ＳＥＬ）、膜貫通ドメイン２（ＴＭ２）、小型細胞内ループ（ＳＩＬ）および膜貫通ドメイン３（ＴＭ３）を含むテトラスパニンの部分配列、または全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性を有するこれと相同な配列をコードし、
（ｉｉ）はマルチクローニングサイトを含み、
（ｉｉｉ）は膜貫通ドメイン４（ＴＭ４）を含むテトラスパニンの部分配列または全長にわたって少なくとも７０％の配列同一性を有するこれと相同な配列をコードする、
核酸分子に関する。

【0061】

ここで、配列セグメント（ｉ）〜（ｉｉｉ）は、好ましくは５’から３’に配置される。「マルチクローニングサイト」は、制限エンドヌクレアーゼのための、一方が他方のすぐ後ろにある複数の制限部位を含む。マルチクローニングサイトは、より具体的には核酸分子の組込みに適しており、リーディングフレームに組み込まれた核酸分子が、提示されるべきペプチドを第１の配列セグメント（ｉ）および第３の配列セグメント（ｉｉｉ）と共にコードする。ペプチドは、好ましくはテトラスパニンの大型細胞外ループ（ＬＥＬ）に対して、全長にわたって７０％未満の配列同一性を有する所定のアミノ酸配列を含む。

【0062】

本発明はさらに、好ましくは発現制御配列と作動可能に連結している、上記核酸分子を含むベクターに関する。

【0063】

先行技術では、ほとんどの様々な制限エンドヌクレアーゼおよびここで関連する制限エンドヌクレアーゼについても多数の認識配列が知られている。好ましくは、認識配列としての少なくとも６個のヌクレオチドからなる配列が使用される。適当な同定配列のリストは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に見出すことができる。

【0064】

マルチクローニングサイトを有する本発明によるベクターの特異的配列要素は、テトラスパニン遺伝子（例えば、ＣＤ６３など）自体の対応する末端および内部の、機能的に許容される位置への異種ＤＮＡ配列の取込みに関する。よって、何回も、新たなエピトープＣＤＳを「特有の」、すなわち、個々の制限部位に挿入することができ、ならびに種々の遺伝子および遺伝子フラグメントを既存のベクター構築物へサイクル反応中に相加的に挿入することができる。例を本発明によるベクターｐＡＥ２１１によって図２Ａ、配列番号１に提供する。制限部位は膜貫通ドメインＴＭ３とＴＭ４との間の位置に位置している。この位置については、これが膜輸送の機能に干渉しないので、異種ペプチドをコードする異種ＤＮＡ配列との融合物に特に適していることが実験的に示されている。この部位で、細胞培養物中でのテトラスパニンタンパク質の形質膜へのタンパク質輸送に有意に干渉することなく、その配列が可変的であり得る膜上に突出するタンパク質ループが位置している。

【0065】

Ｎ末端融合タンパク質を作製するための５末端ＣＤＳ融合物を、コザック配列が開始領域で再生されるように、ＣＤ６３遺伝子の５’領域中の２つのＮｃｏＩによって導入することができる。このことはユニークである。

【0066】

Ｃ末端タンパク質融合物をもたらす可能な３’末端ＣＤＳ融合要素は、構築物中でＮｄｅＩおよびＢｃｌＩのための特異的末端を生じるＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼＢｓａＩによって挿入される。これらの部位を使用しておそらく３’末端遺伝子融合要素を挿入することもできる。

【0067】

ベクター系の上記認識は例であり、記載される制限−ライゲーション方法とは別に、ベクターを修飾するための任意の他の方法または技術、例えば、インビボならびにインビトロでの適当な組換え系による系の配列調節なども等しく本発明に用いることができる。

【0068】

本発明のさらなる主題は、本発明による核酸分子または本発明によるベクターを含む細胞である。

【0069】

本発明による実施形態では、融合タンパク質および適当な遺伝子制御機能をコードする配列を含む核酸分子またはベクターがゲノムに安定に組み込まれる、あるいは細胞内の染色体外に存在し、そして本発明による融合タンパク質がそこで構成的または誘導的または抑制的に発現する。

【0070】

本発明の意味における細胞は、好ましくは真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばより具体的にはヒト細胞である。適当な哺乳動物細胞のさらなる例には、齧歯動物の細胞株（例えば、マウス、ラットおよびハムスター細胞など）、または類人猿細胞がある。本発明による核酸分子または本発明によるベクターを、それ自体公知の技術を利用して、細胞、より具体的には真核細胞に導入することができる。トランスフェクションの成功によって、形質転換、遺伝子組換え、組換えまたはトランスジェニック細胞が得られる。

【0071】

本発明による核酸分子または本発明によるベクターによる真核宿主細胞のトランスフェクションは、通常の方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９４）により生じる。適当なトランスフェクション方法は、例えば、リポソーム媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈、電気穿孔、ポリカチオン（例えば、ＤＥＡＥ−デキストラン）媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、微量注入およびウイルス感染である。本発明によると、好ましくは、構築物が宿主細胞もしくは人工染色体／ミニ染色体のゲノムに組み込まれる、または宿主細胞のエピソームに安定した様式で含まれる安定なトランスフェクションを介して細胞が得られる。それぞれの宿主細胞中で異種遺伝子の最適なトランスフェクション頻度および発現を可能にするトランスフェクション方法がこれにとって好ましい。定義によって、導入される配列または導入される遺伝子が宿主細胞の内在性配列または内在性遺伝子と同一である場合でさえ、宿主細胞に導入される各配列または各遺伝子は、宿主細胞に対して「異種配列」または「異種遺伝子」と記載される。

【0072】

本発明による実施形態では、細胞が種々の細胞型のトランスジェニック細胞結合体の細胞であり得、本発明による融合遺伝子が異なる細胞分化状態でも発現する。これらの細胞を生体外で作製し、おそらくはその後、インビボで治療的に使用することができる。

【0073】

本発明によるさらなる実施形態では、細胞がトランスジェニック生物の細胞結合体の細胞であり、その細胞は生殖系列を経て多細胞系、好ましくは生命生物に発達する。

【0074】

好ましい実施形態では、本発明による細胞をさらに、少なくとも１個のさらなる核酸分子または少なくとも１個のさらなる発現ベクターによって形質転換またはトランスフェクトした。さらなる核酸分子またはさらなる発現ベクターは、好ましくはさらなる所定のタンパク質をコードするセグメントを含む。さらなる核酸分子または発現ベクターも、一実施形態によると、同様に本発明による核酸分子または本発明による発現ベクターであることができ、この場合、別の所定のアミノ酸配列を有する別のペプチドをドメイン（ｉｉ）に選択した。別の実施形態では、さらなる核酸分子またはさらなる発現ベクターが酵素、例えばプロテアーゼをコードするセグメントを含む。このような細胞で、本発明による核酸分子およびさらなる核酸分子を発現する場合、所定のアミノ酸配列を有するドメイン（ｉｉ）のペプチドと、さらなるタンパク質の両方が膜表面上に提示される。例えば、ドメイン（ｉｉ）のペプチドにプロテアーゼ認識配列が隣接している場合、さらなる核酸分子を介して発現されたプロテアーゼがこれらの認識部位上で切断することができるので、ペプチドを放出することができるだろう。

【0075】

本発明によると、宿主細胞は、好ましくは無血清条件下、おそらくは動物タンパク質／ペプチドを含まない培地中で確立、順応および培養される。

【0076】

本発明のさらなる主題は、本発明による細胞から得られた膜調製物である。

【0077】

本発明の意味における膜調製物は、少なくとも単離された膜、より好ましくは単離された細胞膜、さらにより好ましくは単離された細胞形質膜および／または単離された他の細胞小器官の細胞膜を含む。本発明の意味における「膜」という用語は、少なくとも１種の脂質および場合により少なくとも１種のタンパク質を含む自己完結型システムを記載するものである。膜の脂質は通常、脂質二重膜を形成する。膜調製物は、好ましくは膜粒子、より好ましくは膜小胞を含む。

【0078】

膜調製物は、当業者に公知の方法によって、好ましくは細胞の溶解（細胞溶解物）によって、より好ましくは細胞の溶解ならびにその後の細胞膜の単離および場合により洗浄（単離および場合により洗浄された膜）によって、本発明による細胞から得ることができる。場合により、例えば、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００などの界面活性剤を使用して膜を可溶化することができる。この方法はさらに、細胞片を除去するためのステップを含むことができる。膜粒子の直径は１〜１０００ｎｍ、好ましくは５０〜５００ｎｍ、より好ましくは７５〜２００ｎｍの範囲内にあり得る。膜粒子の少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％が、本明細書に記載される範囲の１つの直径を有する。

【0079】

本発明による膜調製物は、本発明による核酸分子または本発明によるベクターを含む本発明による細胞から得られる。細胞内で、本発明による融合タンパク質が核酸分子またはベクターによって発現される。そのため、本発明による膜調製物は、好ましくは本発明による少なくとも単離された膜および少なくとも融合タンパク質を含む。ここで、本発明による融合タンパク質は、好ましくは膜、より好ましくは膜の表面上、さらに具体的には膜の細胞外側に固定される。本発明による融合タンパク質は、膜上、好ましくは膜の表面上、より具体的には膜の細胞外側に提示される。膜調製物は場合によりさらに１つまたは複数の野生型テトラスパニンを含むことができる。

【0080】

一実施形態では、本発明による膜系は、少なくとも本発明による融合タンパク質が一過的に発現する、例えばインビトロ細胞培養物の、細胞の外膜である。

【0081】

本発明はさらに、上記の膜と、融合タンパク質と、核酸分子またはベクターとを含む合成膜系に関する。

【0082】

膜は細胞（天然）膜であっても合成（人工）膜であってもよい。細胞膜は、より具体的には、典型的には細胞の表面（外層）上に位置する細胞形質膜である。本発明の意味における細胞膜は細胞の一部であってもよいし、または細胞から単離されている、すなわち、単離された細胞膜であってもよい。細胞膜は、典型的には非対称であり、細胞質を向いた側（原形質または細胞内側、内側）と、細胞質から外を向いた側（原形質外側または細胞外側、外側）とを有する。

【0083】

合成膜は、合成および／または単離された細胞膜を含むことができる。より具体的には、合成膜の脂質および／またはタンパク質組成は、細胞膜の天然起源の組成と異なっていてもよい。合成膜は、好ましくは細胞の一部ではなく、より具体的には単離された合成膜として存在する。当業者であれば、脂質および／またはタンパク質の選択を通して合成膜の特性に影響を及ぼすことができる。

【0084】

一実施形態では、本発明による核酸分子または本発明によるベクターを含む合成膜系が、それによって融合タンパク質が発現され得る核酸分子またはベクターを発現するための系をさらに含む。タンパク質を発現するための系は先行技術で公知であり、好ましくは無細胞である。発現のための系は、好ましくは核酸分子、より具体的にはＲＮＡまたはｍＲＮＡを翻訳するための系；および場合により、より具体的にはＲＮＡまたはｍＲＮＡを得るために、核酸分子またはベクターを転写するための系を含む。

【0085】

代替実施形態では、本発明による膜系を得るために、融合タンパク質を膜に直接付加することができる。

【0086】

膜系の場合、発現または付加された融合タンパク質が膜、好ましくは膜の表面上、より具体的には膜の外側に固定される。本発明による融合タンパク質は、膜上、好ましくは膜の表面上、より具体的には膜の外側に提示される。

【0087】

合成膜系でも、本発明による融合タンパク質を表面に向け、輸送し、そこで固定することができることが分かった。この場合、人工の非標準アミノ酸をインビボまたはインビトロで本発明による融合タンパク質に組み込むことが可能である。無細胞タンパク質合成を用いて、合成膜に装着させるのにも適した融合タンパク質を得て、そこで固定して提示させることが可能であるだろう。

【0088】

本発明のさらなる態様は、細胞表面上に所定のアミノ酸配列を有するペプチドを提示する方法であって、
（ａ）上記の本発明による細胞を用意するステップと、
（ｂ）本発明による融合タンパク質が発現する条件下で細胞を培養するステップと
を含む方法である。

【0089】

本発明はさらに、膜上に所定のアミノ酸配列を有するペプチドを固定する方法であって、
（ａ）膜を用意するステップと、
（ｂ）融合タンパク質の固定が膜で起こる条件下で、膜を上記の融合タンパク質と接触させる、または融合タンパク質が発現し、膜に固定される条件下で、膜を上記の核酸または上記のベクターと接触させるステップと
を含む方法に関する。

【0090】

本発明のさらなる主題は、ペプチドの相互作用対をスクリーニングする方法における、ペプチドと相互作用対（例えば、抗体）の相互作用を試験するための、ペプチドを産生する方法における、抗体産生方法における免疫化試薬としてのおよび／または検出試薬としての、上記細胞、膜調製物または合成膜系の使用である。

【0091】

本発明はさらに、ワクチンおよび／または医薬品として使用するための、上記の細胞、膜調製物または合成膜系に関する。

【0092】

本発明による実施形態では、研究および開発に利用するため、ならびにおそらくは商業化可能な用途のための方法またはキットの一部としても供給するために、融合タンパク質が、トランスフェクトされた、一過的もしくは安定に発現している細胞、トランスジェニック生物または合成膜系から取り出される。例には生物分析−診断システムおよび治療剤の製造がある。

【0093】

本発明によるさらなる実施形態では、研究および開発に利用するため、ならびにおそらくは商業化可能な用途のための方法またはキットの一部としても供給するために、融合タンパク質を含む膜が細胞、トランスジェニックまたは合成膜系から取り出される。例には生物分析−診断システムおよび治療剤の製造がある。

【0094】

本発明の発現した融合タンパク質は、固定反応物質としてトランスフェクトされた細胞の細胞表面上に示され、他の分子との特異的相互作用を分析するために使用され得る。ここで、一つには、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体パラトープ・エピトープ相互作用、コイルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）相互作用および製薬医薬の多くの特異的相互作用、より具体的には分子機構の重要性）が興味深い。テトラスパニン融合分子を他の分子、例えば、単糖および多糖、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ならびにより具体的には小化学分子、例えば天然物質および化学物質ライブラリーとの相互作用の分析に利用することもできる。

【0095】

細胞中での複数のテトラスパニン融合分子またはタンパク質種のタンパク質変異体の発現は、種々の相互作用タンパク質の組合せ使用として一定の実験調製物にとってまさに興味深い。

【0096】

本発明の一実施形態では、本発明による細胞が、別のタンパク質ドメイン（Ｂ）と極めて特異的に相互作用することができるタンパク質ドメイン（Ａ）を発現する。ここで、タンパク質ドメイン（Ａ）は本発明による融合タンパク質のドメイン（ｉｉ）の所定のアミノ酸配列を有するペプチドに相当する。

【0097】

次いで、この外部タンパク質ドメインを種々の機能的なさらなるタンパク質ドメインと結合することができるだろう。これら全てのタンパク質ドメインモジュールについて、これらが、外来起源のものである場合、発現している細胞のカウンタードメイン（Ａ）上に特異的に結合するので、その一部について、再度結合することができるタンパク質リガンドを置き換えることができ、それによって、特異的相互作用によって媒介される種々のタンパク質モジュールの共存が細胞表面上で検出され得ることを保証することができるだろう。

【0098】

本発明による融合タンパク質、ベクター、細胞および膜系の用途の好ましい例を以下でさらに詳細に説明する。

【0099】

タンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）の分析
表面上の利用可能な固定タンパク質は、それぞれのタンパク質の表面上の特定の構造によってさらなるタンパク質との特異的接触を確立することができる。これらのさらなるタンパク質は、互いを認識することができる同種および異種タンパク質複合体のタンパク質構築ブロックであり、または抗体や単鎖などの特異的タンパク質でもあり得、これは特定のタンパク質表面構造に特異的におよび標的化された様式で結合することができる。他のタンパク質との特異的相互作用に入るゲノムでコードされた天然起源のタンパク質は多くの細胞機能−細胞核での機能から多様なサイトゾルおよび膜機能までを行う。これらの特異的および機能的タンパク質−タンパク質相互作用（ＰＰＩ）は進化の過程で現れたものであり、重要な程度に細胞機能の完全性を担っている。標的化ＰＰＩは表面との特異的相互作用を有するタンパク質変異体の細胞過程および選択によって媒介される。免疫系は、生物の表面の変化に対する敏感な反応のために設計され、極めて短期間での抗体の表面相互作用および細胞傷害性の最適化において特殊化される。体液性免疫では、大量のエピトープ特異的ポリクローナル抗体が短時間で産生される。ラクダ科の特定の単鎖抗体（単鎖）および高度に特異的なタンパク質相互作用を発達する他の天然起源の免疫原性システムが知られるようになった。

【0100】

医学研究では、モノクローナル抗体を作製するこれらの方法が細胞培養技術によって技術的に実施されており、このようにして、インビトロで特異的ＰＰＩを生じることが可能になってきた。

【0101】

抗体工学は、抗体分子に組み込むために、エピトープを特異的に認識することができるディスプレイ技術（リボソームディスプレイ、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ）によって作製された人工パラトープを使用する。ここに記載されるｔＡＮＣＨＯＲシステムのタンパク質ユニットの効率的な輸送機能およびその膜への固定は、ＰＰＩ分析に高度に適している。さらに、糖で特異的に修飾されたタンパク質を、ｔＡＮＣＨＯＲ技術によって細胞表面上に提示することができる。

【0102】

当業者が特異的ＰＰＩを同定することができる検出システムは、細胞選別システム（ＦＡＣＳ）、蛍光または生物発光に基づく画像化システム、およびＦＲＥＴ光量子機器としても商業的に提供されている。質量分析も分析ツールとして優れた可能性となるだろう。

【0103】

まさに、使用される細胞系によって、作製されるデータの品質および決定的な相違がもたらされる。細胞系は−光学の解像度に匹敵する−プロセスチェーンの最後に得られるデータの品質を定義する全てのさらなるプロセスステップの決定的なパラメータである。

【0104】

ｔＡＮＣＨＯＲシステムは、特定の方法で、生物分析−診断用途および治療剤のためにもディスプレイ機能を提供するのに適している。このシステムにより、タンパク質構造の完全性が、例えば、構造エピトープの保持と共に構造的に無傷のままであることができ、互いの間の細胞調節因子タンパク質のＰＰＩ中の結合ドメインの完全性も同じである。

【0105】

ｔＡＮＣＨＯＲ構築物による小分子の分析
構造的に無傷のタンパク質構造によって、細胞上に提示されたタンパク質により小分子によるＰＰＩ結合の結合とＰＰＩ結合からの変位の相互作用試験をさらに行うことが可能である。小分子の興味深い相互作用はＰＰＩに干渉するものであり、そこでは一定のタンパク質凝集体が小分子の影響下で再度溶解することができるだろう。ＰＰＩ分析は、小分子有効成分の発見および開発に特によく適している。

【0106】

ｔＡＮＣＨＯＲ技術は、ＰＰＩ分析のための優れたツールを提供し、タンパク質発現を、細胞表面上へのタンパク質の同時固定と共に利用可能にする。さらなる発現源からの適当なタンパク質対と合わせて、またはおそらくは種々のｔＡＮＣＨＯＲ分子の共発現により、そこから小分子とタンパク質複合体の相互作用を分析するための試験システムを確立することが可能である¹、⁴⁰〜⁴⁸。

【0107】

さらに、細胞表面上に局在化した本発明による融合タンパク質のセグメントは、おそらくは高度に特異的な切断分泌プロテアーゼ（例えば、ＴＥＶプロテアーゼ）の誘導性の共発現によって、指定される部位で特異的に切断され得るので、溶解され得るだろう。欠陥のある融合タンパク質は、膜の再合成サイクルで絶えず交換され得るので、それによって持続した過剰発現も保証され得るだろう。

【0108】

よって、（例えば、二次代謝産物を発現している生物の抽出物からの）小分子は本発明によるタンパク質上に結合するので、これらを標的として同定することができるだろう。

【0109】

本発明による小分子と提示されたタンパク質セグメントの得られた複合体では、小分子を、細胞表面上に固定された標的ペプチドに特異的に、または担体ペプチドとして溶液中に存在する既に切断された標的ペプチドに結合することができる。

【0110】

次いで、得られた複合体ならびにそれによる小分子およびその結合対を質量分析によって同定することができるだろう。例えば、非ペプチド性小分子の場合、これらを、溶液中に存在する複合体の単離および例えば、非特異的酵素タンパク質分解等によるペプチドの破壊後に、質量分析によって同定することができるだろう。

【0111】

免疫診断装置の開発および製造
本発明の一実施形態によると、興味深い用途は、抗体を、ｔＡＮＣＨＯＲを用いて露出したエピトープとの結合について、一定のフォーマット、例えば標準化９６ウェルフォーマットで試験するものである。例えば、本発明によるシステムによって、細胞を９６ウェルフォーマットのマイクロタイタープレートに播種し、融合構築物を一過的にトランスフェクトされた状態で発現させる。これは融合タンパク質を発現する安定な細胞株でも可能である。

【0112】

例として、ｔＡＮＣＨＯＲシステムの使用を、ＥＬＩＳＡ実験での抗体の検出について示す（図９）。

【0113】

融合タンパク質は、細胞表面上に見られ、そこで提示される。膜のこの人工構成物を、分析および治療用途の開発および製造のために直接実施することができる。

【0114】

このようにして、例えば、開発している特定の用途に適した患者コホートの適当な血清を臨床研究のために試験することができる分析システムを作製することができる。免疫診断装置および治療剤を開発するため、より具体的にはコンパニオン診断のために、このようなシステムを用いて、患者の血清を抗体の存在およびその結合特性について定性的および定量的に調べることが可能である。

【0115】

さらに、トランスジェニック細胞が増殖したマイクロタイタープレートおよび他のフォーマットを固定および乾燥して、大規模で生物分析試験システムおよびこれらのシステムを用いる診断装置を製造し、大規模でこれらを作製することが可能である。

【0116】

さらに、テトラスパニンタンパク質融合産物を発現するトランスジェニック生物の膜を使用し、これらを精製することも可能である。同様に、本発明による融合産物を含む人工膜を上記のこのような使用に供給することもできる。

【0117】

ペプチドまたは発現および精製したタンパク質による割高なコーティングが存在しないので、ここでは経費節約が莫大である。

【0118】

純粋なタンパク質の獲得
研究および開発において、ならびに大規模製造においても、特にタンパク質を機能的に折りたたまれた状態およびおそらくは修飾された形態で精製することを望む場合に、発現によって高い特異的活性を有する十分な量の標的タンパク質を獲得することは、依然として困難な課題である。このため、本発明によるシステムを使用することは有利である。培地中、細胞の外側の所望の標的タンパク質の局在は、細胞内のサイトゾルよりもはるかに複雑でない環境であるので、これは大いに有利となり得る。したがって、濃縮および単離することが容易である。通常、発現したタンパク質は細胞内に見出され、サイトゾルから精製される。

【0119】

本発明によるこの使用の一実施形態では、ｔＡＮＣＨＯＲで発現した膜固定タンパク質の切断は、アミノ酸配列モチーフに特異的なプロテイナーゼによって膜から切断することができる。特異的プロテアーゼを、一方では、培地に外因的に供給することができる、または標的タンパク質と内因的に共発現させることができる。この手順はおそらく培地中で活性化される配列特異的エンドプロテアーゼの代用形を要するだろう。タンパク質を単離することを目的とした細胞の長期培養では、ｔＡＮＣＨＯＲによって放出された標的タンパク質が、タンパク質の完全性の喪失のために膜に絶えず供給され続けるので、特異的標的タンパク質の濃縮が最後に培地中で起こる。

【0120】

治療用途としてのＤＮＡワクチン接種
極めて特異的な標的細胞中でのみ発現を見出す分化特異的および／または種特異的プロモーター（獣医学分野を含む）と合わせて、ｔＡＮＣＨＯＲシステムは、効率的な膜輸送のために、生物のインタクトな細胞中でさえ異種遺伝子融合要素を発現することができる。これらは細胞内に外因的に運ばれ得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の接種のために、「遺伝子銃」または「粒子銃」として知られているものによって、テトラスパニン融合構築物を高速で細胞に直接発射し、打たれたトランスフェクト細胞が融合タンパク質を一過的に発現するように誘導することが可能である。これらのタンパク質は、その適合性について事前に試験された抗原または亜種抗原決定基、エピトープであり得る。ｔＡＮＣＨＯＲ技術を、この目的に適した診断生物検定の提供と治療的ワクチン接種の両方のために使用することができる。

【0121】

ＤＮＡは遺伝子銃粒子で打たれた細胞のゲノムに組み込まれ、おそらく例えば、腫瘍抑制遺伝子への組込みを通してそこで損傷を引き起こし得ることが議論されている。しかしながら、経験により、高く妥当な組込み率を実際に生み出すために、本発明による遺伝子構築物と共に極めて広範な相同遺伝子領域が必要であることが教示されている。このような要素は、本発明による構築物で想起されない。しかしながら、ｍＲＮＡワクチンは、敏感な調節因子の一部に対するＤＮＡワクチン接種の危険性に関連して、注目されている。よって本発明によると、例えば、インビトロ転写によって、真核細胞中での発現のために最適化されたｍＲＮＡ分子を作製し、これらの分子を安定化し、これらの分子をナノビーズ上に固定する、またはこれらの分子を適当なミクロ〜ナノコンパートメント（ウイルス様粒子、ＶＬＰ）に詰め、この形態のｍＲＮＡを治療用途に供給することも可能である。

【0122】

テトラスパニン融合物の特異的特性のために、こうして発現したタンパク質は、発現している細胞の細胞膜上に輸送され、そこで外側に示される。

【0123】

特定のアミノ酸配列の露出は、免疫系によって認識され、そこで、対応する所望の免疫応答の体液性または細胞傷害性免疫応答をもたらすことができる。

【0124】

単離された細胞または細胞膜を用いる治療用途
さらに、理想的には、ＨＬＡ不適合性基およびおそらくはそれに関連する有害な免疫応答のために、生体外抽出後、おそらくは中期培養期後または中にインビトロで、自己細胞にトランスフェクトさせることさえ可能である。ｔＡＮＣＨＯＲシステムに基づくＤＮＡ構築物による試験対象（例えば、ヒトであるが、動物も）の自己細胞のトランスフェクションによって、これらを自己または自家ワクチン接種に使用させることが可能になる。この点について、品質について試験したインタクトな自己細胞およびこのような細胞から単離した細胞膜の使用も可能である。これらは、例えば、密度勾配超遠心法により得ることができる。ここで、エピトープと全タンパク質の比を改善し、それによって、免疫応答の特異的活性の増加に寄与することができる。非特異的随伴応答および自己免疫応答が減らされる。

【0125】

おそらく複数のｔＡＮＣＨＯＲ構築物と細胞内で共発現させることができる発現アジュバントの組合せは、本発明によるｔＡＮＣＨＯＲシステムの用途における改善の可能性の範囲内にある変異体といえる。

【0126】

物理化学特性、例えば、膜の溶解度を改善する種々のタンパク質の共発現は、ワクチン接種のために細胞から単離された膜をかなり改善することができるだろう。天然のアジュバントもＣＤ６３抗原／エピトープ融合体との共発現によりワクチン接種応答を改善するのに役立ち得るだろう。

【0127】

本発明のさらなる主題は、
（ｉ）上記の核酸分子またはベクターと、
（ｉｉ）細胞または膜と
を含むキットである。

【0128】

さらに、意図した用途に応じて、本発明によるキットは、例えば、対照プラスミド、対照タンパク質または同様の物品、および種々の用途のための特別なプラスミドなどの種々の成分を含むことができる。

【0129】

本発明を、以下の図面および実施例によりさらに詳細に説明する。

【0130】

図及び表

【0131】

図１：本発明による融合体および融合タンパク質の局在の概略図。
（Ａ）先行技術により、融合および挿入により種々の実用的な課題解決手法を果たすことができる位置。ｔＡＮＣＨＯＲシステムとも記載される本発明によるシステムは、４つの膜貫通ドメイン（４ＴＭ）からなる。エピトープまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列をＴＭ３とＴＭ４との間にクローニングすることができる。例として、エピトープＦＬＡＧタグをＮ末端上に実施し、例えば、蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙを、遺伝子融合によりｔＡＮＣＨＯＲシステムでＣＤ６３のＣ末端上にトランスフェクション対照としてさらに実施した（図２も参照）。（Ｂ）開発されたｔＡＮＣＨＯＲシステムにより、ヒト細胞によって発現されたエピトープまたは抗原が形質膜上に局在していることを明確に見出すことができる。ｔＡＮＣＨＯＲシステムは、高い効率で、融合タンパク質を形質膜に向け、そこでこれらのタンパク質を固定することができる。

【0132】

図２Ａ：代表的なｔＡＮＣＨＯＲベクター系の概略構造。
第１の代表的なｔＡＮＣＨＯＲベクター系は、モジュラーマルチ発現ベクターｐＡ４Ｅ２１１（配列番号１）およびこのベクターの機能的誘導体をもとにする。ＣＤ６３ΔＬＥＬ成分（図２Ｂ）およびＦＬＡＧエピトープのＮ末端融合体および例えば、ｍＣｈｅｒｒｙまたはポンテリナ・プルマタ（Ｐｏｎｔｅｌｌｉｎａ ｐｌｕｍａｔａ）のＧＦＰなどの蛍光レポータータンパク質のＣ末端融合の配列アレンジメントの概要をさらに表す。

【0133】

【表1】

【0134】

図２Ｂ：ＣＤ６３のコード野生型（ＷＴ）配列（配列番号１７）からのＣＤ６３Δ ＬＥＬ配列（配列番号３）の誘導。
野生型ＣＤ６３タンパク質配列は２３８個のアミノ酸からなる。ＣＤ６３ΔＬＥＬを作製するために、膜貫通ドメイン１〜３および４のコードＤＮＡ配列（下線を付した配列ＣＤ６３ ＴＭ１〜３、ＣＤ６３ ＴＭ４）を使用した。ＣＤ６３のＬＥＬ（ΔＬＥＬ）の配列を含まないリンカーをフラグメントＣＤ６３ ＴＭ１〜３とＣＤ６３ ＴＭ４との間に置く（配列番号４２）。さらに、リンカー中のＧＧＧＧ構造モチーフを挿入する。アミノ酸配列ＫＬＩＤＴＶＤＬＥＫ（配列番号４６）を有するリンカーについての遺伝子配列（配列番号４５）を、遺伝子配列ＣＤ６３ΔＬＥＬと蛍光タンパク質についての遺伝子配列との間に含めることができる。

【0135】

【表2】

【0136】

ｔＡＮＣＨＯＲ ＣＤ６３タンパク質提示システム（ディスプレイシステム）についての陽性および陰性対照ベクター。（０）ｔＡＮＣＨＯＲ技術の機能的要素の正式な表示：ＣＤＸＸ−（＝種々のテトラスパニンタンパク質種）ＣＤＳ（＝コード配列）（１）ＣＤ６３遺伝子、内部ＣＤ６３挿入および末端レポーターを含まないｔＡＮＣＨＯＲベクター（２）ＣＤ６３遺伝子を含み、内部ＣＤ６３挿入とＣＤ６３遺伝子を有するｔＡＮＣＨＯＲベクターの末端レポーターを含まず、内部ＣＤ６３挿入として例えば、ＦＬＡＧタグエピトープを含み、末端レポーターを含まないｔＡＮＣＨＯＲベクター（３）ＣＤ６３遺伝子、および内部ＣＤ６３挿入としてｇｐ４１エピトープ、ＣＤ６３遺伝子を含むｔＡＮＣＨＯＲベクターの末端レポーターも含むｔＡＮＣＨＯＲベクター（４）例えば、ＣＤ６３遺伝子および内部ＣＤ６３挿入としてのＹＦＰエピトープおよびＣ末端レポーターＧＦＰ（例えば、緑色蛍光タンパク質遺伝子）を含むｔＡＮＣＨＯＲベクター。（５）内部ＣＤ６３挿入として、分析に使用される、例えば、ＰＯＩ−ｂｉｏＰｅｐＩＤエピトープ（複数可）（対象となるタンパク質／ペプチド）およびＣ末端レポーターｅＧＦＰ（例えば、緑色蛍光タンパク質遺伝子）を含むｔＡＮＣＨＯＲベクター、ならびに（６）さらなるレポーター遺伝子、例えばＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質遺伝子）を含み、関連する実験で対象となるタンパク質の融合体（ＰＯＩ融合体）を含むｔＡＮＣＨＯＲベクター。（７）実験設計に応じて、ＰＯＩ融合体等の融合体を含むｔＡＮＣＨＯＲベクター。ｂｉｏＰｅｐＩＤはＰｅｐＩＤ型のバイオペプチドライブラリーである（欧州特許第０９０００８９３．９号）。これらをｔＡＮＣＨＯＲシステムに使用することができる。ＡｂｓＩ−ＳｇｒＤＩおよびＡｓｃＩ−ＭａｕＢＩならびにＡｓｉＳＩ−ＰａｃＩは複数の遺伝子の発現の多重化のための８ｍｅｒ認識配列を有する、互いに互換性を有する制限エンドヌクレアーゼである。本発明による用途の任意の他の実施形態も特許文書によって等しく網羅される。

【0137】

図２Ｃ：代表的なベクターｐＡＥ２１１＿ＣＭＶ−Ｐ−ＣＤ６３ΔＬＥＬにおけるＣＤ６３ΔＬＥＬと組み合わせた本発明による種々のリンカー変異体の例。
制限部位ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩが標準的なクローニング法またはシームレスクローニングのためのクローニング法による複数の連続エピトープユニットの挿入に可能である。（１）配列１、本発明による制限部位のみであり、機能（Ｒ部位）ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶおよびｎ^*Ｎ＝スペーサー配列に関して試験した（２）配列（１）＋Ｈｉｓ６−タグ、（３）配列（１）＋ＣＭｙｃエピトープ、（４）配列（１）＋Ｈｉｓ６−タグ＋Ｃ−Ｍｙｃ（５）発現した外来タンパク質を選択的に収穫するために、中心クローニング部位を含む、ＴＥＶタンパク質分解部位。（６）構築物に合わせられた（８）で命名されている全ての翻訳および非翻訳分子機能的要素（配列番号３９、４０）。（９）細胞表面に輸送するための最小リンカーｚｕｒ（配列番号４１、４２）。

【0138】

図３：ｃＬＳＭによるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の融合タンパク質の局在。
（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にそれぞれのベクターでコトランスフェクトした。局在化試験では、ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３−ＹＦＰが発現した野生型ＣＤ６３−ＹＦＰタンパク質についての対照とした。ｔＡＮＣＨＯＲ技術を含む全てのタンパク質（ＣＤ６３ΔＬＥＬ、図２Ｂ）について、細胞表面上の顕著な局在を融合レポータータンパク質ｍＣｈｅｒｒｙによって検出した。ｔＡＮＣＨＯＲ融合体を含まないｍＣｈｅｒｒｙタンパク質は細胞質内で、均等に分布している。これは細胞表面上への顕著性を示さない。さらに、例えば、膜貫通ドメイン（ｇｐ４１ΔＴＭ）を含むおよび含まないＨＩＶ−１の糖タンパク質ｇｐ４１などのさらなるタンパク質が表面上に提示され得る。（Ｂ）タンパク質折りたたみを、表面上のＣＦＰおよびＹＦＰ局在によってチェックした。発蛍光団に特異的な発光波長である４０５ｎｍ（ＣＦＰ）または５１４ｎｍ（ＹＦＰ）のダイオード／アルゴンレーザーによって励起した後、両蛍光タンパク質を検出することができる。（Ｃ）通常はサイトゾルに分散して生じる発現タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙが、ｔＡＮＣＨＯＲシステムによって極めて効率的に形質膜に向けられる。このようにして、実施したｔＡＮＣＨＯＲ技術を含むｍＣｈｅｒｒｙが、野生型ＣＤ６３−ＹＦＰの場合のように、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の糸状仮足（白色矢印）中でさえ検出可能である。スケールバーの長さは、図３Ａ及び３Ｂでは１０μｍであり、図３Ｃでは１μｍである。

【0139】

図４：エピトープの細胞外配向調査の概略図。
エピトープ配向の検出を、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔの表面上で走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）によって行った。タンパク質に一次抗体を結合し、金粒子（１０ｎｍ）とのコンジュゲート二次抗体によって可視化した。モデルエピトープの場合、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ｇｐ４１およびｇｐ４１ΔＴＭ結合抗体を免疫金粒子によって表面上で可視化することができた（図５）。

【0140】

図５Ａ−Ｄ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の金粒子（１０ｎｍ）のＳＥＭ像。
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、それぞれエピトープ配向に関して調べた。このために、それぞれのエピトープに特異的一次抗体を結合し、次いで、これらを金コンジュゲート二次抗体で検出した。ｔＡＮＣＨＯＲ技術を含む全てのエピトープについて、細胞外配向を有するエピトープとし得た。全ての図面のスケールバーの長さは３００ｎｍである。

【0141】

図６：作製したｔＡＮＣＨＯＲベクターによりトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のウエスタンブロット解析。
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞をウエスタンブロット解析に供した。分離した細胞溶解物中の発現タンパク質を、Ｃ末端レポータータンパク質ｍＣｈｅｒｒｙに対する一次抗体によって整列させ、Ｎ末端エピトープＦＬＡＧに対して検出した。ベクターｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１によるトランスフェクションは、このベクターがＦＬＡＧエピトープについての配列を含まないために、抗ＦＬＡＧ抗体とのインキュベーションに関してバンドを示さず、発現タンパク質の特異的検出のための対照とする。

【0142】

図７：Ｖ５−６ｘＨｉｓリンカーを含む内部融合部位によるタンパク質輸送に関してさらなるテトラスパニンを調査するための構築物の概略図。
テトラスパニンスーパーファミリー内の大型細胞外ループと独立したタンパク質輸送の妥当性を調べるために、ＣＤ６３ΔＬＥＬに基づくｔＡＮＣＨＯＲ原型構築物による第３の膜貫通ドメインと第４の膜貫通ドメインとの間に内部融合Ｖ５−６ｘＨｉｓを含む発現ベクターを作製した。内部融合Ｖ５６ｘＨｉｓはＥｃｏＲＩとＥｃｏＲＶとの間にリンカーを含む（配列番号３５、３６）。ＦＬＡＧ融合体をＮ末端で組み込み；Ｃ末端で、レポータータンパク質として、野生型テトラスパニン構築物の場合、蛍光タンパク質ＹＦＰを融合し、ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ構築物の場合、ｍＣｈｅｒｒｙを融合する。

【0143】

図８：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上の融合タンパク質の局在。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を作製したベクター（Ａ）ｐＣＭＶ−ＣＤ９−ＹＦＰ／ｐＣＭＶ−ＣＤ９ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ、（Ｂ）ｐＣＭＶ−ＣＤ８１−ＹＦＰ／ｐＣＭＶ−ＣＤ８１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ、（Ｃ）ｐＣＭＶ−ＣＤ８２−ＹＦＰ／ｐＣＭＶ−ＣＤ８２ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙおよび（Ｄ）ｐＣＭＶ−ＣＤ１５１−ＹＦＰ／ｐＣＭＶ−ＣＤ１５１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙによりコトランスフェクトした。全ての発現タンパク質を細胞表面上でレポータータンパク質ｍＣｈｅｒｒｙの蛍光によって優位に検出することができる。テトラスパニンＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ８２およびＣＤ１５１の第３の膜貫通ドメインと第４の膜貫通ドメインとの間にリンカーＶ５−６ｘＨｉｓとの内部融合体を含む構築物（図７）が蛍光タンパク質ＹＦＰの融合体を含む対応する発現野生型テトラスパニンと共存する。全ての図のスケールバーの長さは１０μｍである。

【0144】

図９：抗体を検出するためのｔＡＮＣＨＯＲシステムの適用。
（Ａ）９６ウェルフォーマット中のｔＡＮＣＨＯＲシステムによるＥＬＩＳＡ実験⁵³の結果。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞表面上のＶ５エピトープをＨＲＰコンジュゲート抗Ｖ５抗体で検出した。ｔＡＮＣＨＯＲタンパク質のタンパク質発現を抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体によって濃度依存的にかつ有意に検出することができる。（Ｂ）ＣＤ６３の第３の膜貫通ドメインと第４の膜貫通ドメインとの間のリンカー２Ｆ５−４Ｅ１０（配列番号３７、３８）の概略図。リンカーをベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬに導入した。（Ｃ）ＨＩＶ−１中和抗体抗２Ｆ５および抗４Ｅ１０を、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞プライマー１ウェル当たり０．６μｇの一定ＤＮＡ量で２Ｆ５および４Ｅ１０エピトープに結合させた。結合した抗２Ｆ５および抗４Ｅ１０抗体を有意に検出することができた。（Ｅ）発現融合タンパク質ＣＤ６３ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓおよびＣＤ６３ΔＬＥＬ−２Ｆ５−４Ｅ１０も対照に対してＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上に顕著に局在化させることができた。全ての図のスケールバーの長さは１０μｍである。

【0145】

図１０：低セリンおよび低アルギニンリンカーの使用による効率増加を示す図である。（Ａ）使用したリンカーをＤＮＡおよびアミノ酸配列レベルで表す図である。（Ｂ）２種の異なるリンカー（配列番号４１、４２および配列番号４３、４４）を含む融合タンパク質の細胞内の局在の分析が、ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ隣接制限部位の使用がＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面への高効率のタンパク質輸送をもたらし、融合タンパク質が細胞上に形成した糸状仮足（白色矢印）上で検出可能であることを明確に示す。全ての図のスケールバーの長さは１０μｍである。

【実施例】

【0146】

１．局在化実験を行うためのＣＤ６３系モデルベクターの作製
ＣＤ６３系モデルベクターの作製は、ベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の使用に基づいた。確立されたクローニング技術によって、それぞれのＤＮＡ配列を、制限部位を介してこのベクターに導入した³⁹。ＣＤ６３の全長配列（アミノ酸１〜２３８、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ９９８０８６）を含む、ｐＣＭＶ−ＣＤ６３−ＹＦＰ−ＦＬＡＧ⁴⁹としても記載される対照ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３−ＹＦＰを使用して、制限部位ＸｈｏＩおよびＡｐａＩを介して、プライマーＰＡ１−０１／ＰＡ１−０２および鋳型ベクターｐｍＣｈｅｒｒｙ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｅｈ）によって、使用した赤色蛍光レポータータンパク質、ｍＣｈｅｒｒｙのＤＮＡ配列を導入した。膜貫通ドメインＴＭ１〜３（アミノ酸１〜１１０ ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ９９８０８６）を含む部分配列を、プライマーＰＡ１−０３／ＰＡ１−０４を用いて制限部位ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩを介して導入し、その後、ＴＭ４（アミノ酸２０１〜２３８、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ９９８０８６）を、プライマーＰＡ１−０５／ＰＡ１−０６および鋳型ベクターｐＰＲ３−Ｎ−ＣＤ６３⁴⁹を用いてＥｃｏＲＶおよびＨｉｎｄＩＩＩを介してベクターｐＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂに導入した。得られたベクターはＬＥＬを含まないＣＤ６３遺伝子配列（ｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ）を含む（図２Ｂ）。

【0147】

タンパク質の簡易的な検出のために、ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３−ｍＣｈｅｒｒｙの制限ｍＣｈｅｒｒｙ ＤＮＡフラグメントを、制限部位ＸｈｏＩおよびＡｐａＩを介して制限ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬに連結した。プライマーＰＡ１−０７／ＰＡ１−０８および鋳型ベクターｐＳＣＦＰ３Ａ−Ｃ１またはｐＳＹＦＰ２−Ｃ１⁵⁰を用いて、制限部位ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶを介してベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−ＣＦＰおよびｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−ＹＦＰを作製した。同様に、プライマーＰＡ１−０９／ＰＡ１−０１０およびＰＡ１−０９／ＰＡ１−１１ならびに鋳型ベクターｐＮＬ４−３⁵¹を用いて、ＨＩＶ−１のｇｐ４１タンパク質の遺伝子配列を含むベクターｐＣＭＶ−ｇｐ４１ΔＴＭおよびｐＣＭＶ−ｇｐ４１を作製した。

【0148】

２．トランスフェクションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡法（ｃＬＳＭ）
発現した融合タンパク質の局在を調べるために、実施例１で作製したプラスミドを、トランスフェクション試薬によってＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。このために、ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚腎臓細胞２９３Ｔ）細胞をｉｂｉＴｒｅａｔ８ウェルに播種し、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを加えたダルベッコ改変イーグル培地で培養した。約５０％コンフルエンスで、細胞に、製造業者の指示にしたがって、作製したプラスミドをＭｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）ＰＲＯ（Ｂｉｏｎｔｅｘ）によってトランスフェクトした。２４時間後、トランスフェクトされた細胞をＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、０．１％ｐ−フェニレンジアミンおよびＤＡＰＩ（４’，６’−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を含むＰＢＳ中９０％グリセロールにマウントして核を可視化した。トランスフェクトされた細胞を、細胞内の局在に関して、逆共焦点レーザー顕微鏡ＬＳＭ７８０（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で調べた（図３Ａ〜図３Ｃ）。励起および発光波長の設定は、ＬＳＭ７８０ソフトウェアＺＥＮ２０１０のＳｍａｒｔ Ｓｅｔｕｐオプションによって、蛍光タンパク質ＣＦＰ、ＹＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ用に選択した。

【0149】

３．走査電子顕微鏡法によるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上のエピトープの配向分析
発現したタンパク質を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質膜上の金で免疫標識されたタンパク質について走査電子顕微鏡法によって検出した（図４）。このために、トランスフェクトされ、ＰＢＳ中２％パラホルムアルデヒドで固定された細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡ／０．１％ゼラチンでブロッキングした。タンパク質ＣＤ６３ΔＬＥＬ−ＣＦＰおよびＣＤ６３ΔＬＥＬ−ＹＦＰを、ウサギ抗ＧＦＰ（ａｂ６５５６、Ａｂｃａｍ）と共にインキュベートし、洗浄し、ヤギ抗ウサギにより一次抗体をコンジュゲート１０ｎｍ金粒子で検出した。免疫標識に続いて、グルタルアルデヒド（ＨＥＰＥＳ０．０５Ｍ中２．５％）で後固定した。これに続いて、スキャンの準備をした。このために、試料を、各場合で１５分間、エタノール段階（３０％、５０％、７０％、９０％、９６％）で段階的に乾燥させ、無水エタノール中で３０分間静置し、ＨＭＤＳ（ヘキサメチルジシラザン）中に移し、ＨＭＤＳで完全に乾燥させ、試料表面を蒸発カーボンでコーティングした。金粒子を、後方散乱検出器（Ｃｅｎｔａｕｒｕｓ）によって、Ｌｅｏ１５３０ Ｇｅｍｉｎｉ走査電子顕微鏡で可視化した。同様に、ｇｐ４１タンパク質を、ヒト抗２Ｆ５抗体（国立衛生研究所、ＮＩＨ）、さらにコンジュゲートＩｇＧ Ｈ＆Ｌ １０ｎｍ金粒子を含む抗ヒトヤギ抗体（ＢＢＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して検出した（図５Ａ〜図５Ｄ）。

【0150】

４．発現した蛍光タンパク質のウエスタンブロット解析
タンパク質発現を調べるため、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の細胞溶解物をウエスタンブロット解析に供した。このために、ベクターでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、製造業者の指示にしたがって、ＭＥＴＡＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）ＰＲＯを用いて６ウェルフォーマット中で、トランスフェクトした。４８時間後、培地を完全に除去し、１００μｌのＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液２×および２５Ｕのセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）由来のエンドヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標））をそれぞれの６ウェルに加えた。細胞を溶解し、約１０分後、β−メルカプトエタノール５μｌを試料に添加し、９５℃で５分間変性させた。これらの細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、マウス抗ｍＣｈｅｒｒｙ（ａｂ１２５０９６、Ａｂｃａｍ）またはヤギ抗ＦＬＡＧ（ＮＢ６００−３４４、ＮｏｖｕｓＢｉｏ）抗体およびＨＲＰコンジュゲート抗マウス／抗ヤギ抗体（Ｄａｋｏ）で検出し、そして結合したＨＲＰコンジュゲート抗体をＰｉｅｒｃｅ ＥＣＬウエスタンブロット基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって検出した。ＰＶＤＦ膜をＲｏｔｉ（登録商標）−Ｆｒｅｅ Ｓｔｒｉｐｐｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ２．２ｐｌｕｓ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）で処理したので、同タンパク質をさらなる一次抗体で検出することができた（図６）。

【0151】

５．テトラスパニンスーパーファミリー由来のテトラスパニン系ハイブリッドタンパク質の細胞内局在の調査
テトラスパニンスーパーファミリー内の細胞表面上のペプチドの提示を調べるために、遺伝子合成⁵⁴（ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ）および標準化されたクローニング法によって、発現ベクターを概略図（図７）にしたがって作製した。ＣＤ９（配列番号１９）、ＣＤ８１（配列番号２１）、ＣＤ８２（配列番号２３）およびＣＤ１５１（配列番号２５）の遺伝子配列を、ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３−ＹＦＰ中で置き換え、ＣＤ９ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ（配列番号２７）、ＣＤ８１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ（配列番号２９）、ＣＤ８２ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ（配列番号３１）およびＣＤ１５１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ（配列番号３３）の遺伝子配列を、制限部位ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩを介してＣＤ６３のテトラスパニン配列を含むベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３−ｍＣｈｅｒｒｙ（１：局在化実験を行うためのＣＤ６３系モデルベクターの作製を参照）中で置き換え、野生型遺伝子配列の以下の発現ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ９−ＹＦＰ、ｐＣＭＶ−ＣＤ８１−ＹＦＰ、ｐＣＭＶ−ＣＤ８２−ＹＦＰ、ｐＣＭＶ−ＣＤ１５１−ＹＦＰ、ならびに大型細胞外ループの欠失突然変異体（ΔＬＥＬ）を、第２節のトランスフェクションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡法（ｃＬＳＭ）に記載されるように内部リンカーＶ５−６ｘＨｉｓ−ｐＣＭＶ−ＣＤ９ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＣＭＶ−ＣＤ８１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ、ｐＣＭＶ−ＣＤ８２ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙおよびｐＣＭＶ−ＣＤ１５１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙを用いてトランスフェクトし、細胞内の局在に関してｃＬＳＭによって調べた（図８）。

【0152】

６．ＥＬＩＳＡ法⁵³による抗体検出へのｔＡＮＣＨＯＲシステムの適用
ｔＡＮＣＨＯＲシステムによる融合タンパク質の極めて効率的な表面発現は、提示されたペプチド上の結合抗体の検出に適している。モデルとして、第１節の局在化実験を行うためのＣＤ６３系モデルベクターの作製に記載されるように、リンカーＶ５−６ｘＨｉｓを、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶにより構築物ｐＣＭＶ−ＣＤ９ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙから単離し、標準的なクローニング法によりベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−ｍＣｈｅｒｒｙに挿入した。同様に、プライマーＰＡ１−１２／ＰＡ１−１３および鋳型ベクターｐＮＬ４−３によって、エピトープ２Ｆ５および４Ｅ１０（ＨＩＶ−１）をベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−ｍＣｈｅｒｒｙに挿入した（図９Ｂ）。（図９Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔの表面上の結合抗体を検出するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞および（図９Ｃ）ＨｅＬａ細胞を９６ウェルフォーマットに播種し、製造業者の指示にしたがって、Ｍｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（登録商標）ＰＲＯによって、プラスミドｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓ−ｍＣｈｅｒｒｙ（図９Ａ）およびｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−２Ｆ５−４Ｅ１０−ｍＣｈｅｒｒｙ（図９Ｃ）をトランスフェクトした。２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒド（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）で２０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン等級Ｖ（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）および２％鶏卵アルブミン（Ｃａｒｌ Ｒｏｔｈ）の溶液で一晩ブロッキングした。その後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１：３０００希釈の希釈抗体（図９Ａ）抗Ｖ５−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および（図９Ｃ）ヒト抗２Ｆ５／ヒト抗４Ｅ１０（ＮＩＨ）と共に１時間インキュベートした。図９Ｃの場合、一次抗体を１：１０００希釈のノウサギ抗ヒトＨＲＰ（ＤＡＫＯ）によって結合させ、ＥＬＩＳＡ基質として３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴う改変ＥＬＩＳＡを製造業者の指示にしたがっていずれも使用し、ＯＤ値を９６ウェルプレートインサート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にてＭｕｌｔｉｓｃａｎ（商標）ＧＯ分光光度計を用いて４５０ｎｍで測定した。第１節の局在化実験を行うためのＣＤ６３系モデルベクターの作製のように、ｃＬＳＭによって融合タンパク質の発現を検出した。

【0153】

７．ｔＡＮＣＨＯＲシステムにおける隣接ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ制限部位の使用によるヒト細胞表面へのタンパク質輸送効率の増加
ｔＡＮＣＨＯＲシステムにおける隣接ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ制限部位の使用により、細胞表面への輸送効率が増加する。最小リンカー（ＬＱＥＦＤＩＧＧＧＧ）へのさらなる制限部位の導入は、ＣＤ６３の第３の膜貫通ドメインと第４の膜貫通ドメインとの間のリンカー中にセリンおよびアルギニンの翻訳（ＧＳＳＧＲＲＳＬＱＧＧＧＧ）をもたらす（図１０Ａ）。第２節のトランスフェクションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡法（ｃＬＳＭ）で既に記載されているように、さらなる部位を有するベクターを、遺伝子合成⁵⁴（ＡＴＧ：Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ）により作製し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で発現させ、細胞内の局在に関して調べた（図１０Ｂ）。

【0154】

配列記録
配列番号１：ｐＡ４Ｅ２１１（ＣＤ６３ΔＬＥＬ）のＤＮＡ配列
配列番号２：ＣＤ６３ΔＬＥＬのＤＮＡ配列
配列番号３：ＣＤ６３ΔＬＥＬのタンパク質配列
配列番号４：プライマーＰＡ１−０１
配列番号５：プライマーＰＡ−０２
配列番号６：プライマーＰＡ１−０３
配列番号７：プライマーＰＡ１−０４
配列番号８：プライマーＰＡ１−０５
配列番号９：プライマーＰＡ１−０６
配列番号１０：プライマーＰＡ１−０７
配列番号１１：プライマーＰＡ１−０８
配列番号１２：プライマーＰＡ１−０９
配列番号１３：プライマーＰＡ１−１０
配列番号１４：プライマーＰＡ１−１１
配列番号１５：プライマーＰＡ１−１２
配列番号１６：プライマーＰＡ１−１３
配列番号１７：ＣＤ６３、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＫＦ９９８０８６
配列番号１８：ＣＤ６３のタンパク質配列
配列番号１９：ＣＤ９のＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００１７６９．３）
配列番号２０：ＣＤ９のタンパク質配列
配列番号２１：ＣＤ８１のＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００４３５６．３）
配列番号２２：ＣＤ８１のタンパク質配列
配列番号２３：ＣＤ８２のＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿００２２３１．３）
配列番号２４：ＣＤ８２のタンパク質配列
配列番号２５：ＣＤ１５１のＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＴ００７３９７．１）
配列番号２６：ＣＤ１５１のタンパク質配列
配列番号２７：ＣＤ９ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓのＤＮＡ配列
配列番号２８：ＣＤ９ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓのタンパク質配列
配列番号２９：ＣＤ８１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓのＤＮＡ配列
配列番号３０：ＣＤ８１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓのタンパク質配列
配列番号３１：ＣＤ８２ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓのＤＮＡ配列
配列番号３２：ＣＤ８２ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓのタンパク質配列
配列番号３３：ＣＤ１５１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓのＤＮＡ配列
配列番号３４：ＣＤ１５１ΔＬＥＬ−Ｖ５−６ｘＨｉｓのタンパク質配列
配列番号３５：Ｖ５−６ｘＨｉｓリンカーのＤＮＡ配列
配列番号３６：Ｖ５−６ｘＨｉｓリンカーのタンパク質配列
配列番号３７：２Ｆ５−４Ｅ１０リンカーのＤＮＡ配列
配列番号３８：２Ｆ５−４Ｅ１０リンカーのタンパク質配列
配列番号３９：リンカーバージョン（８）のＤＮＡ配列
配列番号４０：リンカーバージョン（８）のタンパク質配列
配列番号４１：ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−ｍＣｈｅｒｒｙ中のリンカー（最小リンカー（９））のＤＮＡ配列
配列番号４２：ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−ｍＣｈｅｒｒｙ中のリンカー（最小リンカー（９））のタンパク質配列
配列番号４３：ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−Ｖ２−ｍＣｈｅｒｒｙ中のリンカーのＤＮＡ配列
配列番号４４：ベクターｐＣＭＶ−ＣＤ６３ΔＬＥＬ−Ｖ２−ｍＣｈｅｒｒｙ中のリンカーのタンパク質配列
配列番号４５：ＣＤ６３ΔＬＥＬと蛍光タンパク質との間のリンカーのＤＮＡ配列
配列番号４６：ＣＤ６３ΔＬＥＬと蛍光タンパク質との間のリンカーのタンパク質配列

【0155】

本発明の好ましい態様を以下に要約する：
１．
ａ．少なくとも部分的に、例えば、ヒト遺伝子ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ８２、ＣＤ８１、ＣＤ１５１、ＣＤ５３などのテトラスパニンのタンパク質クラスのメンバーの配列からなることができるが、
ｂ．少なくとも部分的に、他の生物の配列相同テトラスパニンからもなることができ、
ｃ．ａ．およびｂ．によると、その融合産物が、適当なシステムで、これらと結合した天然または人工ペプチドおよびタンパク質ユニットを
ｉ．１つまたは複数の表面に向け、
ｉｉ．表面上にこれらを輸送し、
ｉｉｉ．これらを表面に堅く固定し、
ｉｖ．これらを表面上に永続的に提示する
ことができる分子を作製する、
間接的に、少なくとも部分的に鋳型分子からコードされている、または完全に合成的である意図した人工アミノ酸配列を有するタンパク質／ペプチドを使用する方法。
２．
ａ．表面上で修飾される、例えばグリコシル化される、および／または
ｂ．表面上で機能的コンフォメーションを採用することができる
タンパク質ユニットを産生するのに間接的に役立つ、１．に記載の天然および／または人工アミノ酸組成を有するキメラタンパク質分子。
３．
ａ．インビボで、
ｂ．インビトロで、
コード鋳型を介して間接的に産生され、コード鋳型の少なくとも１つの少なくとも部分的なユニットの融合体から現れ、および種々の配列の組合せから、産生され、おそらく濃縮および単離され、おそらくその間に処理もされ得る、１．および２．に記載の分子。
４．
ｉ．インビボで、組換え的に、ゲノム内で、（ＴＮ７系）または
ｉｉ．インビボで、染色体外遺伝要素（ベクター）によって、または
ｉｉｉ．インビボで、環状または直鎖状核酸分子によって天然または非天然起源の核酸分子（ＲＮＡ等）によって、
あるいは
ｉｖ．インビトロで、共役転写または翻訳系で、
ｖ．インビボで、人工アミノ酸の組込みによって、
本発明によりインビボおよびインビトロでコード核酸分子を発現するコード核酸分子を表す、１．、２．および３．に記載の分子。
５．天然細胞の天然起源の細胞膜または人工膜系を表す、１．から３．に記載の分子を固定するための表面。

【0156】

６．生物検定で、種々の分子種（小分子（有効成分ライブラリー、天然物質）、ＲＮＡ、タンパク質およびＤＮＡ）の特異的結合および／または触媒作用に関しての構造的、生物分析および（獣医学的）診断の問題を解決するため、ならびに結果に対する生物分析システム（生物検定）、診断装置、おそらくはコンパニオン診断装置および／または療法を構築するために、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、１．から４．に記載の分子。
７．免疫分析および免疫診断の分野の問題を解決するため、免疫分析および診断の問題を解決し、おそらくそれに対する治療を構築するために、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、１．から４．に記載の分子。
８．分析的ハイスループットシステムを開発するためまたはこれらを操作するために、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、１．から４．に記載の分子。
９．直接的に使用される免疫療法剤（同様の可能な用途を有するポリクローナルもしくはモノクローナル抗体または人工分子）を開発するために、直接的または間接的に、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、１．から４．に記載の分子。
１０．使用および利用のために発酵／生物生産から大量に第三者に提供される、その遺伝子産物、トランスフェクトされた細胞または細胞の一部を供給する、１．から３．に記載の分子。

【0157】

参考文献

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]