特許 6876732 α−ＭＳＨのＣｌｐＢタンパク質模倣体を介した食欲の調節に及ぼす細菌の影響

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6876732

(24)【登録日】2021年4月28日

(45)【発行日】2021年5月26日

(54)【発明の名称】α−ＭＳＨのＣｌｐＢタンパク質模倣体を介した食欲の調節に及ぼす細菌の影響

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/74 20150101AFI20210517BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20210517BHJP

   A61P 3/04 20060101ALI20210517BHJP

   A61K 35/741 20150101ALI20210517BHJP

   C07K 14/37 20060101ALI20210517BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20210517BHJP

   C12N 1/20 20060101ALI20210517BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210517BHJP

【ＦＩ】

   A61K35/74 ZZNA

   A61K38/16

   A61P3/04

   A61K35/741

   C07K14/37

   C12N15/31

   C12N1/20 E

   C12N1/21

【請求項の数】12

【全頁数】46

(21)【出願番号】特願2019-19913(P2019-19913)

(22)【出願日】2019年2月6日

(62)【分割の表示】特願2016-536831(P2016-536831)の分割

【原出願日】2014年12月4日

(65)【公開番号】特開2019-89815(P2019-89815A)

(43)【公開日】2019年6月13日

【審査請求日】2019年2月6日

(31)【優先権主張番号】13306673.8

(32)【優先日】2013年12月5日

(33)【優先権主張国】EP

(31)【優先権主張番号】14306552.2

(32)【優先日】2014年10月2日

(33)【優先権主張国】EP

(73)【特許権者】

【識別番号】511074305

【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）

(73)【特許権者】

【識別番号】516164494

【氏名又は名称】センター ホスピタリエ ユニバーシティ デ ロウエン

(73)【特許権者】

【識別番号】516164483

【氏名又は名称】ユニバーシティ デ ロウエン

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】フェティソヴ，サーグエイ

(72)【発明者】

【氏名】デ，エマニュエル

(72)【発明者】

【氏名】テノウネ，ナオエル

(72)【発明者】

【氏名】ブレトン，ジョナサン

(72)【発明者】

【氏名】チャン−チ−ソン，フィリップ

(72)【発明者】

【氏名】デシェロッテ，ピエール

(72)【発明者】

【氏名】ルグラン，ロマン

【審査官】 原口 美和

(56)【参考文献】

【文献】 特表２０１１−５０００６８（ＪＰ，Ａ）

【文献】 国際公開第２０１２／０１１１７４（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 Poultry Science，２００１年，Vol. 80，pp. 562-571

【文献】 British Journal of Nutrition，２０１２年，Vol. 107，pp. 1429-1434

【文献】 J Ind Microbiol.，１９９３年，Vol. 11, No. 4，pp. 253-257，要約, online, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7763897

【文献】 Clinical Nutrition，２０１３年 ９月，Vol. 32, Suppl. 1，p. S4，OP009

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ａ６１Ｋ ３５／７４

Ａ６１Ｋ ３５／７４１

Ａ６１Ｋ ３８／１６

Ａ６１Ｐ ３／０４

Ｃ０７Ｋ １４／３７

Ｃ１２Ｎ １／２０

Ｃ１２Ｎ １／２１

Ｃ１２Ｎ １５／３１

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒト対象または非ヒト哺乳類対象の肥満の治療または予防における使用のための経口組成物であって、
前記経口組成物は、ＣｌｐＢタンパク質を発現する非病原性細菌を含み、
前記ＣｌｐＢタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を提示し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である、
経口組成物。

【請求項2】

それを必要とするヒト対象または非ヒト哺乳類対象において食欲を減少させるのに使用するための経口組成物であって、
前記経口組成物は、ＣｌｐＢタンパク質を発現する細菌を含み、
前記ＣｌｐＢタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を提示し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である、
経口組成物。

【請求項3】

それを必要とするヒト対象または非ヒト哺乳類対象において体重を減少させるのに使用するための経口組成物であって、
前記経口組成物は、ＣｌｐＢタンパク質を発現する細菌を含み、
前記ＣｌｐＢタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を提示し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である、
経口組成物。

【請求項4】

それを必要とするヒト対象または非ヒト哺乳類対象においてカロリー摂取量を減少させるのに使用するための経口組成物であって、
前記経口組成物は、ＣｌｐＢタンパク質を発現する細菌を含み、
前記ＣｌｐＢタンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列を提示し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である、
経口組成物。

【請求項5】

前記細菌が共生非病原性細菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。

【請求項6】

前記細菌がプロバイオティクスである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。

【請求項7】

前記細菌が、前記ＣｌｐＢタンパク質を過剰発現している、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。

【請求項8】

前記細菌が、腸内細菌科の細菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。

【請求項9】

前記細菌が大腸菌である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。

【請求項10】

前記細菌が大腸菌Ｋ１２である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。

【請求項11】

医薬組成物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。

【請求項12】

前記細菌が、１日あたり１０億〜１００億ＵＦＣの量である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の経口組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細菌ＣｌｐＢタンパク質およびＣｌｐＢ発現細菌、ならびに摂食障害に及ぼすこれらの影響に関する。さらに本発明は、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤を含む組成物、およびＣｌｐＢタンパク質を発現しないプロバイオティクスを含む組成物、および摂食障害の治療または予防におけるそれらの使用に関する。また本発明は、対象が摂食障害を治療する方法に応答する可能性があるか否かを決定するための診断ツール、および摂食障害に対する免疫方法に関する。

【背景技術】

【0002】

摂食障害は、過去５０年にわたり男性および女性を問わず全世界中で増加している。特に、西側諸国の人々が摂食障害を発症するリスクが最も高く、西洋化の度合いがこのリスクを高めていることを示唆する証拠がある。近年の進歩に伴い、科学者らは、食欲の中心プロセスの理解を深めている。動機づけ、ホメオスタシス、および自己調節制御のプロセス間の相互作用が、摂食行動に関与しており、これらが摂食障害の鍵となる構成要素であることが知られている。

【0003】

近年の科学において、さらなる調節因子であるヒトのマイクロバイオームが発見された。ハイスループットＤＮＡシークエンシング技術の進歩により、ヒトのマイクロバイオームが探索され、これにより宿主とその細菌叢との間の分子的な関係の理解は大きく進歩した。この「第２のゲノム」である、マイクロバイオームは、４〜５００万超の重複していない微生物の推定の遺伝子、および１〜２，０００種の一般的に認められる細菌種の一覧である。各個体は、少なくとも１６０の共通の種と、個体の群を定義する多くの良好につり合いのとれた宿主‐微生物の分子的関係を有する。

【0004】

微生物の共同体と、それらのヒト宿主との間の共生関係の本質的な特性を理解することにより、常在性の共同体の特定の特性から、健康状態などの宿主の表現型を予測することが可能であり得ると考えられる。

【0005】

たとえば腸内細菌叢の組成は、肥満および糖尿病ならびに精神神経障害を含む宿主の代謝表現型に関連しており、腸内細菌が、脳により制御される機能および活動に影響を及ぼし得ることが示唆されている。

【0006】

よって本明細書の文脈において、細菌叢を宿主の行動と関連づける分子的機構を決定することが、宿主の生理機能における特定の微生物の役割を定義するために必要なステップと考えられる。

【0007】

神経性食欲不振症（ＡＮ）、過食症（ＢＮ）、およびむちゃ食い障害（ＢＥＤ）を含む摂食障害の原因となる分子的機構は現在わかっていない。従来のデータから、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）と反応する免疫グロブリン（Ｉｇｓ）または自己抗体が、食物摂取量および感情の調節に関与していることが示されたが、このような自己抗体の起源はわかっていない。

【発明の概要】

【0008】

本発明者らは、プロテオミクスを使用して、共生腸内細菌大腸菌Ｋ１２のＣｌｐＢシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の立体構造模倣体であることを発見した。

【0009】

本発明者らは、ＣｌｐＢ免疫マウスが、食物摂取、体重、不安、およびメラノコルチン受容体４のシグナリングに影響するα−ＭＳＨと交差反応性である抗ＣｌｐＢ ＩｇＧを産生することを示す。さらに、本発明者らは、マウスにおいて大腸菌が長期間胃に送達されると、食物摂取量を減少させ、ＣｌｐＢおよびα−ＭＳＨ反応性抗体の形成を刺激するが、一方ＣｌｐＢ欠損大腸菌は、食物摂取または抗体のレベルに影響を与えなかったことを示す。最終的に、本発明者らは、α−ＭＳＨと交差反応性である抗ＣｌｐＢＩｇＧの血漿中レベルが、ＡＮ、ＢＮ、およびＢＥＤの患者で増加しており、摂食障害患者におけるＥＤ（摂食障害）調査票‐２スコア（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ−２ ｓｃｏｒｅ）が、抗ＣｌｐＢのＩｇＧおよびＩｇＭと相関することを示す。

【0010】

結果として、本発明者らは、いくつかの共生および病原性の微生物に存在する細菌ＣｌｐＢタンパク質が、α−ＭＳＨと交差反応性の自己抗体の産生の原因であり得て、摂食障害を有するヒトの食物摂取の変化および感情の変化に関連し得ることを示している。

【0011】

さらに、本発明者らは、摂食障害を罹患している患者のＣｌｐＢタンパク質の血漿中濃度が増加することを示す。

【0012】

よって、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の存在は、摂食障害、ならびに食欲および感情の調節障害に関連し得る。

【0013】

抗ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の存在は、摂食障害および食欲の調節障害と相関していることにより、代わりにＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下させることによって、食欲を調節することができ、これにより摂食障害の治療として使用することができる。

【0014】

よって、本発明は、摂食障害の治療または予防に使用するための少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物に関する。

【0015】

さらに本発明は、対象の食欲を調製する非治療的な方法であって、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。

【0016】

よって本発明は、摂食障害の治療または予防に使用するための、ＣｌｐＢを発現しないプロバイオティクスを含む組成物にも関する。

【0017】

さらに本発明は、対照の食欲を調節する非治療的な方法であって、ＣｌｐＢを発現しないプロバイオティクスを含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。

【0018】

また本発明は、ワクチンまたは免疫原性組成物として使用するためのＣｌｐＢタンパク質を含む組成物に関する。

【0019】

具体的に、上記使用するための組成物は、摂食障害に対する免疫に使用される。

【0020】

具体的に、上記使用するための組成物は、摂食障害の予防に使用される。

【0021】

また本発明は、対象の摂食障害を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）上記対象由来の生物学的試料中のＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを測定することと、
ｂ）上記ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の測定レベルを参照値と比較することと、
ｃ）これら比較から対象が摂食障害を罹患しているか否かを推測することと
を含む、方法に関する。

【0022】

さらに本発明は、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下させる治療に応答する可能性があるとして摂食障害を罹患している対象を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）上記対象由来の生物学的試料中のＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを測定することと、
ｂ）上記ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の測定レベルを参照値と比較することと、
ｃ）ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下させる治療に関して対象を選択することであって、上記ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下させる治療が、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する１つの抗生剤を含む組成物の有効量を上記対象に投与することと、および／またはＣｌｐＢを発現しないプロバイオティクスを含む組成物の有効量を上記対象に投与することと、および／またはそれらの組み合わせを含む、ことと
を含む、方法に関する。

【0023】

本発明者らは、マウスにおける大腸菌の胃内送達が、細菌中のＣｌｐＢタンパク質の存在により、食物摂取量および体重を減少させることを示し、さらに本発明は、肥満の治療または予防に使用するための、ＣｌｐＢタンパク質を過剰発現（ｓｕｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）するプロバイオティクスを含む組成物に関する。

【発明を実施するための形態】

【0024】

発明の詳細な説明
本発明者らは、プロテオミクスを使用して、共生腸内細菌大腸菌Ｋ１２のＣｌｐＢシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α―メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の立体構造模倣体であること、およびＣｌｐＢ発現細菌の存在が食欲の調節障害をもたらすことを発見した。

【0025】

よって、本発明は、摂食障害の治療または予防に使用するための少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物に言及する。

【0026】

本明細書中で使用される「ＣｌｐＢ発現細菌」は、シャペロンタンパク質ＣｌｐＢを発現する細菌を指す。

【0027】

「タンパク質脱凝集シャペロン」、「シャペロンタンパク質ＣｌｐＢ」、「ＣｌｐＢタンパク質」、または「ＣｌｐＢ」は、ヒートショックタンパク質Ｆ８４．１としても知られており、六量体ＡＡＡ＋−ＡＴＰアーゼのＨｓｐ１００／ＣｌｐＢファミリーのメンバーである。このファミリーは、細菌、真菌、および植物のＨｓｐ１００ ＡＴＰアーゼを含み、ＣｌｐＢは、代表的な細菌ＡＴＰアーゼである。ストレス誘導性マルチシャペロンシステムの一部として、ＣｌｐＢは、ストレス条件下で細胞が生存するための重大なプロセスであるタンパク質の脱凝集においてＨｓｐ７０システム（ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、およびＧｒｐＥ）と協調して熱誘導性損傷からの細胞の回復に関与している。

【0028】

感染プロセスの際に、細菌病原体は、病原体を除去するために宿主防御により生成されたストレス状態に晒され、熱ショックタンパク質および他のストレスタンパク質の合成を増加させることにより、その宿主防御に応答する。本発明の文脈において、ＣｌｐＢは、熱耐性の獲得にとって必須の因子として、ならびに黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｒａｌｅｎｓｉｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）などのいくつかのグラム陰性およびグラム陽性の病原性細菌のビルレンスおよび感染性にとって必須の因子として説明されている。

【0029】

大腸菌Ｋ１２では、シャペロンタンパク質ＣｌｐＢは熱ショックタンパク質Ｆ８４．１またはｈｔｐＭとしても知られている、アミノ酸８５７個のタンパク質である。

【0030】

典型的に、シャペロンタンパク質ＣｌｐＢは、配列番号：１（ＮＣＢＩの参照番号：ＮＰ＿４１７０８３．１（２０１３年１１月６日時点で利用可能）および／またはＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ番号：Ｐ６３２８４（２０１３年１１月６日時点で利用可能））を有する大腸菌Ｋ１２由来のシャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列を含む、またはからなる。好ましくは、シャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列と８０〜１００％同一のアミノ酸配列を含む、またはからなる。好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号１と９０〜１００％同一、より好ましくは９５〜１００％、最も好ましくは９５、９６、９７、９８、９９、または１００％同一である。

【0031】

よって、ＣｌｐＢ発現細菌は、上記に定義されているシャペロンタンパク質ＣｌｐＢ、または配列番号１のアミノ酸配列と８０〜１００％同一、より好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と９５〜１００％、最も好ましくは９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％同一であるアミノ酸配列を含む、もしくはからなるポリペプチド、を発現または過剰発現する細菌を指す。

【0032】

本発明のクエリーアミノ酸配列とたとえば少なくとも９５％「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドでは、対象ポリペプチド配列が、クエリーアミノ酸配列のアミノ酸各１００個あたり最大５個のアミノ酸変化を含み得ることを除き、対象のポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であると意図される。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中のアミノ酸残基のうち最大５％（１００個のうち５個）が、別のアミノ酸を挿入、欠失、または置換され得る。

【0033】

本出願の文脈において、同一性のパーセンテージは、グローバルアライメントを使用して計算される。（すなわち２つの配列を、それらの全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性を比較する方法は、当業者によく知られている。たとえば「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムを使用してもよく、これは、長さ全体を考慮する場合、２つの配列の最適なアライメント（ギャップを含む）を見つけ出すためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ‐Ｗｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０ Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３−４５３）を使用する。ｎｅｅｄｌｅプログラムは、たとえば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋワールドワイドウェブサイトで入手可能である。本発明に係る同一性のパーセンテージは、好ましくは、１０．０に等しい「ギャップ開始」パラメータ、０．５に等しい「ギャップ伸長」パラメータ、およびＢｌｏｓｕｍ６２行列を用いてＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ（グローバル）プログラムを使用して計算する。

【0034】

参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である」アミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して、欠失、挿入、および／または置換などの変異を含み得る。置換の場合、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは異なる種由来の相同配列に対応し得る。

【0035】

アミノ酸の置換は、保存的または非保存的であり得る。好ましくは、置換は保存的置換であり、ここでは１つのアミノ酸が、類似の構造および／または化学的な特性を有する別のアミノ酸に置換されている。好ましくは、置換は、以下の表に記載される保存的置換に対応する。

【表1】

【0036】

ＣｌｐＢ発現細菌は、当業者によく知られており、従来のいずれかの技術により同定され得る。

【0037】

一実施形態では、ＣｌｐＢ発現細菌は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）属、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｒａｌｅｎｓｉｓ）属、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）属、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）属、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｈｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）属、大腸菌、腸内細菌科、ソンネ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）属、フレクスナー赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）属、志賀赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）属、ボイド赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｂｏｙｄｉｉ）属、シトロバクター ヤンガエ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｙｏｕｎｇａｅ）属、サルモネラ・ボンゴール（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｂｏｎｇｏｒｉ）属、およびサルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）属で構成される群から選択される。

【0038】

ＣｌｐＢタンパク質は、２つのヌクレオチド結合ドメイン（ＡＴＰ１およびＡＴＰ２）と、２つのオリゴマー形成ドメイン（ＮＢＤ１およびＮＢＤ２）とを含む。Ｎ末端ドメインは、基質識別ドメインとして機能し、凝集したタンパク質をＣｌｐＢ六量体に動員し、かつ／または結合したタンパク質を安定化させる。ＮＢＤ２ドメインは、オリゴマー形成の原因であり、一方ＮＢＤ１ドメインは、おそらくはＡＴＰ依存的に六量体を安定化させる。コイルドコイルドメインの運動は、おそらくは、機能的な六量体において隣接するＣｌｐＢサブユニットのコイルドコイルモチーフ間で結合されている大きな凝集したタンパク質を引き離すことにより、ＣｌｐＢがタンパク質を凝集状態から救出する能力にとって必須である。

【0039】

本発明者らは、共生腸内細菌大腸菌Ｋ１２のＣｌｐＢシャペロンタンパク質が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドである、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の立体構造模倣体であることを同定した。

【0040】

「α−ＭＳＨ」は、「α−メラニン細胞刺激細胞ホルモン」、「アルファ−ＭＳＨ」「α−ＭＳＨ」、「α―メラノトロピン」、「α―メラノコルチン」、または「α−インターメジン」としても知られており、トリデカペプチド構造を有するメラノコルチンファミリーの天然に存在する内在性ペプチドホルモンである。好ましくは、α−ＭＳＨのアミノ酸配列は、アミノ酸配列ＳＹＳＭＥＨＦＲＷＧＫＰＶ（配列番号：３）（Ｇｅｎ Ｐｅｐｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＩＤ， ＰＲＦ：２２３２７４（２０１３年１２月２日時点で利用可能））を含む、またはからなる。しかしながら、そのアセチル状態が異なる３種類のα―メラニン細胞刺激ホルモンが存在し、このうちデスアセチルα−ＭＳＨは、アセチル基を欠損しており；モノアセチルα−ＭＳＨでは、配列番号３のＳｅｒ−１のアミノ基がアセチル化されており；ジアセチルα−ＭＳＨでは、配列番号３のＳｅｒ−１のアミノ基およびヒドロキシル基の両方がアセチル化されている。本明細書において使用されるα−ＭＳＨは、特にモノアセチル化α−ＭＳＨを指す。

【0041】

α−ＭＳＨは、中枢および末梢の両方で作用して、メラノコルチン受容体４型（ＭＣ４Ｒ）の活性化を介してエネルギー収支の調節およびエネルギー消費の増加に大いに関与する。ヒトおよびマウスのいずれにおいても、血漿中のα−ＭＳＨレベルは、体重変化に関連する。さらにα−ＭＳＨは、不安を増大させることにより、気分および感情を調節する。

【0042】

「模倣体」は、別のタンパク質を模倣するタンパク質を指す。タンパク質が、それが模倣するタンパク質と特定の特徴を共有する場合、このような模倣が可能である。

【0043】

「立体構造模倣体」は、別のタンパク質と少なくとも部分的に同じ立体構造を共有するタンパク質を指す。

【0044】

本発明者らは、ＣｌｐＢタンパク質が、α−ＭＳＨと配列番号１由来の５４２〜５４８番目のアミノ酸の間に、アミノ酸配列「ＲＷＴＧＩＰＶ」（配列番号：２として引用）の不連続な配列相同性を共有することを証明した。理論に拘束されるものではないが、このＣｌｐＢの立体構造は、ＣｌｐＢおよびα−ＭＳＨの両方に対する抗体の産生を刺激することができる。

【0045】

よって、本明細書中の「立体構造模倣体」は、ＣｌｐＢに対する抗体の産生およびα−ＭＳＨに対する自己抗体の刺激能を指す。

【0046】

「少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤」は、本明細書中で、ＣｌｐＢ発現細菌の増殖を阻害し、かつ／またはＣｌｐＢ発現細菌の量を減少させ、かつ／またはＣｌｐＢ発現細菌を破壊する抗菌化合物を指す。

【0047】

少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤は、好ましくは選択的または優先的にＣｌｐＢ発現細菌の増殖を阻害し、量を減少させ、かつ／または破壊する。上記抗生剤は、好ましくは、真核細胞に負の影響を与えるものではない。

【0048】

ＣｌｐＢ発現細胞を特異的に標的化する抗生剤は、当業者によく知られており、Ｍａｒｔｉｎ， Ｉ ｅｔ ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２０１３， ５６： ７１７７−７１８９）にさらに記載されている。

【0049】

少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤は、ＣｌｐＢに結合し、その活性を調節することができる。

【0050】

特に、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤は、
ｉ）ＣｌｐＢのＡＴＰアーゼ活性を調節し、および／または
ｉｉ）ＣｌｐＢの遊離型および／または基質結合型を阻害し、および／または
ｉｉｉ）ＣｌｐＢの活性化を阻害する。

【0051】

一実施形態では、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤は、ベンジルベンゼンをスキャフォールドとするサリチルアルデヒド誘導体であり、詳しくは、５−（２−クロロベンジル）−２−ヒドロキシ−３−ニトロベンズアルデヒド（ＣＡＳ Ｎｕｍｂｅｒ ２９２６４４−３２−７， Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）または（２−｛［（３，４−ジクロロフェニル）アミノ］チオキソメチルチオ｝エトキシ）−Ｎ−ベンズアミド（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ Ｎｕｍｂｅｒ ＳＴ０３４３９８，ＴｉｍＴｅｃ）である。

【0052】

本発明の少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する抗生剤の典型的な用量は、たとえば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得るが、特に上述の要因を考慮して、この例示的な範囲より下、またはこの範囲より上の用量が想定される。経口１日量の投与計画は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ全体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ全体重、特には、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。患者の進捗を、定期的な評価によりモニターして、用量をそれに応じて調節することができる。

【0053】

本発明では、本明細書中で使用される用語「治療する」または「治療」は、当該用語が適用される障害の進行、または当該障害もしくは病態の１つ以上の症状を反転、軽減、阻害することを意味する。

【0054】

「予防する」は、当該用語が適用される障害が発症するのを防止する、または障害の初期段階で障害を予防するために取られる手段を指す。予防するは、さらに、当該用語が適用される障害のさらなる進行を阻害することを指す。

【0055】

摂食障害の治療または予防は、好ましくは本明細書中、治療すべき対象のＣｌｐＢ発現細菌の量または濃度の減少を指す。

【0056】

本発明では、「対象」は、ヒト、またはげっ歯類（ラット、マウス、ウサギ）、霊長類（チンパンジー）、ネコ科（ネコ）、もしくはイヌ科（イヌ）などの非ヒト哺乳類を指す。好ましくは、対象はヒトである。本発明に係る対象は、具体的には、雄性または雌性であり得る。

【0057】

好ましくは、本発明に係る対象は、１３歳超である。

【0058】

好ましくは、対象は雌性である。

【0059】

「摂食障害」（ＥＤ）は、精神障害の診断と統計マニュアル第５版（ＤＳＭ−５）およびそれ以前の版（ＤＳＭ−４など）の基準により定義される精神疾患を意味する。異常な食習慣は、不十分または過剰な食物摂取を伴い、それによって個体の身体および精神の健康に損害を与え得る。神経性過食症（ＢＮ）、神経性食欲不振症（ＡＮ）、およびむちゃ食い障害（ＢＥＤ）は、摂食障害の最も一般的な具体的形態である。ＤＳＭ−５の基準によると、神経性食欲不振症を有すると診断されるのは、顕著な低体重（年齢、性別、成長曲線、および身体的な健康で予測される最小限の体重に関連して）をもたらす持続的なエネルギー摂取制限、体重増加もしくは太ることへの強い恐怖、または体重増加を妨害する持続的な行動（顕著な低体重にもかかわらず）、自身の体重または体形が経験した障害、自己評価に関する体形および体重の不当な影響、または現在の低体重の重大性に関する認識の持続的な欠如を呈する人である。

【0060】

ＤＳＭ−５の基準によると、神経性過食症と診断されるのは、再発性の過食エピソードを示す人である。過食エピソードは、別々の期間（たとえば任意の２時間以内）で、大部分の人々が同様の期間および同様の環境で摂食する量よりも明らかに多い量の摂食、およびエピソードの際の摂食に対する制御が欠如しているという認識（たとえば摂食を止めることができない、または何をまたはどのくらい摂食するかを制御できない感覚）、自己誘導型の嘔吐、下剤、利尿剤、もしくは他の薬物の誤用、絶食、または過度の運動などの体重増加を防止するための不適切な代償行為の繰り返しの両方を特徴とする。むちゃ食い障害および不適切な代償行為はいずれも、平均して、３か月の間少なくとも週に一度起こる。自己評価は、体形および体重により不当に影響を受けている。

【0061】

ＤＳＭ−５の基準によると、むちゃ食い障害と診断されるのは、再発性のむちゃ食いエピソードを示す人である。むちゃ食いのエピソードは、別々の時間（たとえば任意の２時間以内）で、大部分の人々が同様の期間および同様の環境で摂食する量よりも明らかに多い量の摂食、エピソードの際の摂食に対する制御が欠如しているという認識（たとえば摂食を止めることができない、または何をもしくはどのくらい摂食するかを制御できない感覚）の両方を特徴とする。むちゃ食いは、以下の、
正常よりも著しく早く食べること、
食べ過ぎで不快になるまで食べること、
身体が空腹と感じていない場合に大量の食物を食べること、
大量に食べることによる困惑した感情のために１人で食べること、
後に自己嫌悪、落胆、または顕著な罪悪感を感じること
のうちの３つ以上に関連している。過食は、平均して、３か月の間少なくとも週に一度起こる。

【0062】

他の種類の摂食障害には、他の特定される食行動障害または摂食の障害（ＯＳＦＥＤ）が挙げられる。

【0063】

ＤＳＭ−５の基準によると、ＯＳＦＥＤと診断される人は、臨床上顕著な苦痛および機能野の障害を引き起こすが、他の食行動および摂食の障害のいずれかに関する完全な基準を満たしていない食行動または摂食行動を示す人である。症状が別の障害（たとえば神経過食症‐低頻度）の特徴と一致しない特定の理由を明記する診断が割り当てられることもある。以下は、ＯＳＦＥＤのさらなる例である：
‐非定型性神経性食欲不振：顕著な体重減少があるにも関わらず個体の体重が正常の範囲内または正常な範囲より上である場合を除き、すべての基準を満たす。
‐（低頻度および／または限定された期間の）むちゃ食い障害：低頻度および／または３か月未満の場合を除き、ＢＥＤのすべての基準を満たす；
‐（低頻度および／または限定された期間の）神経性過食症：むちゃ食いおよび不適切な代償行動が低頻度および／または３か月未満で起こることを除き、神経性過食症のすべての基準を満たす。
‐排出性障害：過食がない中で体重または形状に影響する再発性の排出行動
‐夜間摂食症候群：再発性の夜間摂食エピソード、睡眠から目覚めた後の摂食、または夕食後の過剰な食物の消費。この行動は、環境の影響または社会的な規範ではうまく説明されない。この行動は、顕著な苦痛／機能障害を引き起こす。この行動は、別の精神健康障害（たとえばＢＥＤ）によりうまく説明されない。
‐特定不能な食行動または摂食の障害（ＵＦＥＤ）：ＤＳＭ−５の基準によると、このカテゴリーは、この行動が臨床的に顕著な苦痛／機能障害を引き起こすが、食行動または摂食の障害のいずれかの完全な基準を満たさない場合に当てはまる。このカテゴリーは、より具体的な診断を下すための情報が不十分であり得る（たとえば救急室での状況での）症状を含む、基準が満たされない理由を明記しない選択を行う場合に、臨床医によって用いられ得る。

【0064】

よって本発明の文脈において、摂食障害は、上述の障害リストを指すことができる。

【0065】

一実施形態では、摂食障害は、神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、むちゃ食い障害（ＢＥＤ）、過食、多食症、カヘキシーなどの消耗性疾患からなる群から選択される。

【0066】

「食欲」は、空腹として感じられる、食物を摂食する欲望を意味する。食欲は、すべての高等生物に存在し、代謝のニーズを維持するために適切なエネルギー摂取を調節するために役立つ。食欲は、消化管と、脂肪組織および肝臓などのエネルギー貯蔵臓器、ならびに脳の間の密接な相互作用により調節される。食欲は、摂取する食物量を測定すること、および対象の摂食欲求を評価することにより対象において評価される。

【0067】

「食欲の調節障害」は、持続して存在するかまたは１週間に数回再発する食欲の増加および食欲の減少を含み、それにより神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシー、消耗性疾患、過食、むちゃ食い障害、および多食症に関与する異常な食欲を指す。

【0068】

一実施形態では、対象は、神経性食欲不振症、神経性過食症、むちゃ食い障害、カヘキシーおよび消耗性疾患、より具体的には、神経性食欲不振症、神経性過食症およびむちゃ食い障害からなる群から選択される摂食障害を罹患する。

【0069】

「食欲不振」は、食欲を感じることが低下することにより、食欲が低下することを指す。多くの場合、非科学的な刊行物でのこの用語は、神経性食欲不振症と互換的に使用されているが、食欲の減少には多くの潜在的な原因が存在しており、このうちの一部は無害であり得るが、その他は重篤な臨床病態を示し、または顕著なリスクをもたらす。

【0070】

「神経性食欲不振症」（ＡＮ）は、本発明では、正常な体重の少なくとも８５％の体重を維持することができないことを特徴とする摂食障害を指す。さらに、神経性食欲不振症を罹患している対象は、体重の増加に関する極度の恐れならびに歪んだ自己認識を有しており、対象は、確かな反証があるにも関わらず彼自身／彼女自身を、過体重であると考えている。

【0071】

よって、神経性食欲不振症を罹患している人は、好ましくは、身体の不満、痩せ願望、完全主義、無力感、対人不信、社会的不安定、および快感消失からなる群から選択される心理学的な特徴のうちの少なくとも１つを有する。好ましくは、神経性食欲不振症を罹患している人は、身体の不満、痩せ願望、および完全主義からなる群から選択される心理学的な特徴のうち少なくとも１つを有する。さらに好ましくは、神経性食欲不振症を罹患している人は、無力感、対人不信、社会的不安定、および快感消失からなる群から選択される心理学的な特徴のうち少なくとも１つを有する。

【0072】

さらなる実施形態では、神経性食欲不振症を罹患している対象は、１７未満のＢＭＩを有する。

【0073】

「ＢＭＩ」または「肥満度指数」は、対象の体重を対象の身長の２乗により除算することにより定義される。医療において一般的に使用される式は、ｋｇ／ｍ^２の測定単位を生じる。

【0074】

「過食症」または「神経性過食症」は、むちゃ食いと排出、または短時間での大量の食物の消費後の、典型的に嘔吐、下剤または利尿剤の摂取、および／または過剰な運動により消費した食物を自身から取り除こうとする努力（排出）を特徴とする摂食障害である。一部の対象は、神経性過食症と神経性食欲不振症とを交互に有する傾向があり得る。過食症を罹患している対象は、通常２５未満の正常なＢＭＩの範囲を特徴としてもよい。

【0075】

「むちゃ食い障害」または「ＢＥＤ」は、別々の期間（たとえば任意の２時間以内）に、大部分の人々が同様の期間および同様の環境で摂食する量よりも多い食物の摂食からなるむちゃ食い特徴とする摂食障害を指し、制御不能の感覚を伴う。このむちゃ食いは、平均して、６か月間に少なくとも１週間に２回起こる。過食症とは反対に、むちゃ食いは、不適切な代償行動の繰り返しに関連していない。ＢＥＤを罹患している対象は、むちゃ食いを深刻に心配している。さらに、ＢＥＤを罹患している対象は、身体的に不快となるまで、または消費した食物量により吐き気がするまで摂食し、および／または倦怠感または不安がある場合に摂食し、および／または現実に空腹ではない場合であっても大量の食物を摂食し、および／または食物に対する困惑した感情および／またはむちゃ食い後の嫌悪感、消沈、または罪悪感により摂食が正常な期間でも１人で摂食する。むちゃ食い障害を有する対象は、衝動的に行動し、摂食に関する制御が欠如していると感じる。さらに、むちゃ食い障害を罹患している対象は、ストレス、不安、怒り、悲しみ、倦怠、および心配に対処する問題を有している。

【0076】

本発明では、ＢＥＤを罹患している対象は、好ましくは肥満であり、３０超のＢＭＩを有する。

【0077】

「過食」は、生物が消費する（または排泄を介して排出する）エネルギーに関連する過剰な食物の消費であり、体重増加をもたらす。過食は、場合によっては、むちゃ食い障害または過食症の１つの症状であり得る。強制過食者は、ストレスを感じる、うつ病の発作が起きる、かつ無力感を有している場合に自身を慰めるため食物に依存する。

【0078】

「多食症」は、「過食症」としても知られており、過剰な空腹（強迫性）または食欲の増加を指す。一実施形態では、多食症は、糖尿病、クライネ・レヴィン症候群、遺伝障害のプラダー・ウィリー症候群およびバルデ・ビードル症候群などの障害により引き起こされ得る。

【0079】

「消耗性疾患」は、衰弱性の疾患が、筋肉組織および脂肪組織を「消耗させる」プロセスを指す。消耗は、非常に低いエネルギー摂取（たとえば飢餓により引き起こされる）、感染症による栄養の喪失、または低摂取および高喪失の組み合わせにより引き起こされ得る。

【0080】

「カヘキシー」は、体重減少、および／または筋萎縮症、および／または疲労、脱力、および食欲の顕著な喪失に関連する消耗性の症候群であり、癌、ＡＩＤＳ、慢性閉塞性肺疾患、多発性硬化症、うっ血性心不全、結核、家族性アミロイドポリニューロパチー、水銀中毒（肢端疼痛症）、およびホルモンの欠損により引き起こされ得る。カヘキシーはまた消耗とも呼んでよく、ＡＩＤＳ、癌、後股関節骨折（ｐｏｓｔ ｈｉｐ ｆｒａｃｔｕｒｅ）、慢性心不全、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＬＤ）および／または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの慢性肺疾患、肝硬変、腎不全、ならびに関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患、敗血症、ならびに重篤な感染症などのいくつかの疾患に伴って見られる。さらに、消耗は老化に伴い見られる。

【0081】

一部の実施形態では、カヘキシーは癌により引き起こされる。

【0082】

カヘキシーの主要な兆候は、脂肪組織のみならず、筋肉組織、さらには骨の重量の損失である。この非脂肪性の組織は、「除脂肪体重」としても知られている。

【0083】

さらに、食欲の喪失、脱力（無力症）、およびヘモグロビンレベルの低下（貧血）が存在する。

【0084】

カヘキシーは、癌、感染症、ＡＩＤＳ、うっ血性心不全、関節リウマチ、結核、後股関節骨折（ｐｏｓｔ ｈｉｐ ｆｒａｃｔｕｒｅ）、嚢胞性線維症、およびクローン病などの多くの異なる臨床病態の末期的な状態として、または慢性疾患において見出される。またカヘキシーは、疾患のいかなる明らかな症状も有さない高齢者でも起こり得る。

【0085】

「食欲の増大」は、対象が、身体が必要とするよりも多くの食物を摂取する食欲を指す。これは、体重の増加をもたらしても、もたらさなくてもよい。

【0086】

よって、「正常な食欲」は、対象が、身体が必要とする食物量に対応する食物を摂取することを指す。

【0087】

「食欲の減少」および／または「食欲の低下」は、身体が必要とするよりも少ない食物を対象が摂取する食欲を指す。これは、体重の減少をもたらしても、もたらさなくてもよい。

【0088】

「食物摂取量」は、たとえば、日記またはアンケートを使用した自己の記録、摂取前の食物の重量を使用した、ビュッフェ料理からのカロリー摂取の測定、またはペアにした食物の量の重量測定および分析を含む多数の技術を使用して測定することができる。食物摂取量は、食事ごとに、１日ごとに、週ごとに、または月ごとに測定してもよい。

【0089】

一実施形態では、本組成物は、対象の体重を減少させるためのものである。

【0090】

本組成物は、たとえば、食欲の増加が、むちゃ食い障害または過食によるものである、食欲を減少させるために使用され得る。

【0091】

本発明の一実施形態では、治療により、治療開始前の食物摂取量の平均値の２％の減少、より好ましくは３％または５％または７％の減少、さらにより好ましくは１０％未満の減少などの少なくとも１％の食物摂取量の減少がもたらされる。

【0092】

別の実施形態では、脂肪、炭水化物、およびタンパク質などの様々な食品が、食品量あたり異なる量のカロリーを含むことから、摂取した食物量が摂取したカロリー摂取量に直接関連しない場合があるため、本治療は、食物摂取量の変化に関係なくカロリー摂取量の減少をもたらす。

【0093】

本発明の一実施形態では、本治療は、治療開始前の平均カロリー摂取量の２％の減少、より好ましくは３％、または５％、または７％の減少、さらにより好ましくは１０％未満の減少などの、カロリー摂取量の少なくとも１％の減少をもたらす。

【0094】

一実施形態では、本組成物は、対象の体重増加を増大させるためのものである。

【0095】

本組成物はたとえば、食欲の低下が、食欲不振、神経性食欲不振症、神経性過食症、カヘキシーまたは消耗性疾患、特には食欲不振、神経性食欲不振症、または神経性過食症によるものである、食欲を刺激するために使用してもよい。

【0096】

本発明の一実施形態では、本治療は、治療の開始前と比較して、食物摂取量の１％の増加、たとえば２％の増加、より好ましくは平均食物摂取量を３％、または５％、または７％、さらにより好ましくは１０％超の増加をもたらす。

【0097】

別の実施形態では、脂肪、炭水化物、およびタンパク質などの様々な食物の成分が食物の量あたり異なる量のカロリーを含むことから、摂取した食物量が摂取したカロリー摂取量に直接関連しない場合があるため、本治療は、食物摂取量の変化に関係なくカロリー摂取量を増加させる。

【0098】

本発明の好ましい実施形態では、本治療は、処置開始前と比較して、カロリー摂取量の少なくとも１％の増加、たとえば２％の増加、より好ましくは３％または５％または７％の増加、さらにより好ましくは１０％の増加をもたらす。

【0099】

一部の実施形態では、本組成物は、神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、むちゃ食い障害（ＢＥＤ）、過食、多食症、カヘキシーなどの消耗性疾患からなる群から選択され、より具体的には神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）およびむちゃ食い障害（ＢＥＤ）から選択される障害の治療または予防に使用するためのものである。

【0100】

また、対象の摂食障害を治療または発症の機会を減少させる方法であって、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物を、それを必要とする対象に投与すること、および／またはＣｌｐＢを発現しないプロバイオティクスを含む組成物の有効量を上記対象に投与すること、および／またはその組み合わせを含む、方法を提供する。

【0101】

それを必要とする対象は、本明細書中で定義される摂食障害、特には神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、むちゃ食い障害（ＢＥＤ）、多食症、カヘキシーなどの消耗性疾患からなる群から選択され、より具体的には神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）およびむちゃ食い障害（ＢＥＤ）から選択される摂食障害を罹患する対象である。

【0102】

また、本明細書中で定義される摂食障害の治療または予防を意図する薬物の製造のため、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物の使用を提供する。

【0103】

本発明者らは、食欲の調節障害が、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の存在に関連しており、抗α−ＭＳＨ反応性抗体、好ましくは抗ＣｌｐＢのＩｇＧおよび／またはＩｇＭ、ならびに抗α−ＭＳＨ反応性ＩｇＧおよび／またはＩｇＭの血漿中レベルの増加に関連することを発見した。

【0104】

一実施形態では、対象のＣｌｐＢ発現細菌の量または濃度を低下させることにより、上記対象の食欲が正常となる。

【0105】

理論に拘束されるものではないが、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物は、ＣｌｐＢ発現細菌の量を減少させ、これにより、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルまたは濃度を低下させ、かつ／または抗α−ＭＳＨ反応性抗体のレベルを低下させることにより、食欲を正常化させる。

【0106】

一実施形態では、本発明の文脈において使用する組成物は医薬組成物である。

【0107】

本発明の文脈において使用される医薬組成物は、好ましくは、選択された投与形式または投与経路にとって適切であるよう設計されており、薬学的に許容可能な希釈剤、キャリアー、および／または分散剤、バッファー、界面活性剤、保存剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などの賦形剤を適宜使用する。当該組成物は、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， １９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｇｅｎｎａｒｏ， Ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ １９９５に開示される従来の技術に従い設計することができる。

【0108】

医薬組成物に適切なキャリアーは、本発明の抗生剤と組み合わせる場合に、抗生剤の分子活性を保持し、対象の免疫系と反応しない任意の物質を含む。

【0109】

本発明に係る医薬組成物は、適切な医薬的単位剤形の形態で経口投与され得る。本発明の医薬組成物は、錠剤、硬ゼラチンまたは軟ゼラチンカプセル、水溶剤、懸濁剤、およびリポソーム、および成形ポリマーゲルなどの他の徐放製剤を含む多くの形態で調製され得る。

【0110】

投与様式および剤形は、所定の治療用途にとって望ましく有効な治療剤または組成物の特性と密接に関連している。適切な剤形は、限定するものではないが、経口投与、静脈内投与、直腸投与、舌下投与、粘膜投与、経鼻投与、点眼投与、皮下投与、筋肉内投与、経皮投与、脊髄投与、髄腔内投与、関節内投与、動脈内投与、くも膜下投与、気管支投与、およびリンパ管投与、ならびに活性成分の全身性送達用の他の投与剤形が挙げられる。

【0111】

本発明の医薬組成物は、限定するものではないが、経皮（パッチ、ゲル、クリーム、軟膏、またはイオン導入を介して受動的に）、静脈内（ボーラス、点滴）；皮下（点滴、デポー）；経粘膜的（頬側および舌下、たとえば口腔内分散錠、ウェーハ、フィルム、および発泡製剤；結膜（点眼液）；直腸（坐剤、浣腸）；または皮内（ボーラス、点滴、デポー）を含む当業者に知られたいずれかの技術により投与され得る。

【0112】

経口の液体医薬組成物は、たとえば、水性または油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の形態であり得るか、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで構成するための乾燥生成物として提示され得る。当該液体医薬組成物は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を含み得る）、または保存剤などの従来の添加剤を含んでもよい。

【0113】

本発明の医薬組成物はまた、非経口投与（たとえば注射、たとえばボーラス注射または持続点滴による投与）用に製剤化されてもよく、アンプル、充填済シリンジ、少量の注入容器、または添加保存剤を含む多回用量容器中に単位投与剤形で存在してもよい。本医薬組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁剤、溶剤、または乳剤などの剤形をとってもよく、懸濁剤、安定化剤、および／もしくは分散剤などの処方用薬剤を含んでもよい。あるいは、本発明の医薬組成物は、使用前に、適切なビヒクル、たとえば滅菌水、パイロジェンフリー水で構成するための、滅菌固体の無菌的単離、または溶液からの凍結乾燥によって得た粉末剤形であってもよい。

【0114】

キャリアーが固体である直腸投与に適した医薬組成物は、最も好ましくは単位用量の坐剤として示される。適切なキャリアーは、ココアバターおよび当技術分野において一般的に使用される他の物質を含み、坐剤は、医薬組成物を軟化または融解するキャリアーと混合後、冷却し成型することにより、従来通り形成され得る。

【0115】

吸入による投与では、本発明に係る医薬組成物は、吹送器、ネブライザー、または加圧パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の簡便な手段から、従来通り送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の適切な気体などの適切な推進剤を含み得る。加圧エアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することにより投与単位を決定してもよい。あるいは、吸入または吹送による投与では、本発明の医薬組成物は、医薬組成物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤との粉末混合物といった、乾燥粉末組成物の形態をとってもよい。粉末組成物は、たとえば、カプセルまたはカートリッジ、またはたとえば粉末が吸入器または吹送器を用いて投与され得るゼラチンまたはブリスターパックの単位投与剤形として示されてもよい。

【0116】

鼻腔内投与では、本発明の医薬組成物は、プラスチックボトルのアトマイザを介するなど、液体の噴霧を介して投与され得る。これらの典型的な例は、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒｇ（イソプロテレノール吸入器‐ウィントロープ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（登録商標）（イソプロテレノール吸入器‐ライカー）がある。

【0117】

また、本発明の医薬組成物は、芳香剤、着色剤、抗菌剤、または保存剤などの賦形剤も含んでもよい。

【0118】

投与計画は、たとえば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００日の期間であってもよい。

【0119】

投与範囲は、投与される組成物に依存し、上記に定義されている。

【0120】

医学の技術分野においてよく知られているように、任意の１人の対象の用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身健康状態、ならびに同時投与される他の薬剤を含む多くの要因に依存する。

【0121】

本発明の一態様では、本発明の治療または予防方法により、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物を投与することにより安定した体重の維持が可能となる。

【0122】

過体重または極端な低体重はまた、特定の文化では、あまり魅力的でないと考えられる容貌であると考えられる場合がある。

【0123】

よって、一実施形態では、本発明は、対象の食欲を調節する非治療的方法であって、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する少なくとも１つの抗生剤を含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法を指す。

【0124】

上述のすべての定義は、上記非治療的方法にもあてはまる。

【0125】

一実施形態では、有効量または治療的有効量は、対象に治療上の利点または利点を与えるために必要である活性剤の少なくとも最小用量であるが、中毒量未満の量を指す。言い換えると、たとえば摂食障害を治療するためのそのような量は、食物摂取の調節として対象の状態の改善を誘導、軽減、または引き起こす量である。

【0126】

一実施形態では、上記非治療的方法は、美容上の方法である。

【0127】

上述のように、また本発明は、摂食障害の治療または予防に使用するためのＣｌｐＢタンパク質を発現しないプロバイオティクスを含む組成物に関する。

【0128】

上述のすべての定義は、上記組成物にも当てはまるものである。

【0129】

一実施形態では、摂食障害は、神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、むちゃ食い障害（ＢＥＤ）、多食症、カヘキシーなどの消耗性疾患からなる群から選択され、より具体的には神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、およびむちゃ食い障害（ＢＥＤ）から選択される。

【0130】

さらに、本発明は、対象の食欲を調節する非治療的方法であって、ＣｌｐＢタンパク質を発現しないプロバイオティクスを含む組成物の有効量を上記対象に投与することを含む、方法に関する。

【0131】

上述のすべての定義は、上記の非治療的方法にも当てはまる。

【0132】

「プロバイオティクス」は、食事に導入することが意図される微生物の有効量を含む食品添加剤である。ＷＨＯによると、プロバイオティクスは、適切な量を投与すると、宿主の健康に利益を与える生きた微生物である（ＷＨＯ，２００１）。

【0133】

本発明の文脈において、食事に導入される細菌は、ＣｌｐＢタンパク質を発現していない細菌である。特に、ＣｌｐＢタンパク質を通常発現するがこのタンパク質の発現が欠失している細菌である。

【0134】

ＣｌｐＢ発現細菌は、当業者によく知られており、従来のいずれかの方法により同定され得る。

【0135】

一実施形態では、タンパク質の発現が欠失しているＣｌｐＢ発現細菌は、ヒトのプロバイオティクスまたは共生非病原性細菌、たとえば非病原性大腸菌で構成される群から選択される。

【0136】

ＣｌｐＢタンパク質を発現しない細菌は、当業者に知られた方法により調製することができる。これは、たとえばＤＮＡ組み換えにより行うことができる。

【0137】

「有効量」は、本発明の文脈において、摂食障害の治療または予防における所望の効果を出現させる細菌の量を意味する。特に、有効量は、１日あたり１０億〜１００億ＵＦＣの量を意味する。

【0138】

上述のように、本発明は、ワクチンまたは免疫原性組成物として使用するためのＣｌｐＢタンパク質を含む組成物にも関する。

【0139】

「免疫原性組成物」は、本発明の文脈において、個体に投与すると免疫応答を誘発もしくは免疫調節（すなわち免疫抑制もしくは免疫刺激）する、または個体に投与すると抗体の産生を誘導する、ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物を意味する。

【0140】

「ワクチン」は、特にその作用剤により、疾病から個体を保護または治療する、免疫応答を免疫調節するために投与される本明細書中に記載される免疫原性組成物などの組成物を意味する。本発明のワクチンは、特に、摂食障害の発症前に個体に投与するための予防ワクチン（予防接種）である。

【0141】

特に、上記組成物は、摂食障害に対する免疫において使用するためのものである。

【0142】

具体的には、上記組成物は、摂食障害を予防するために使用するためのものである。

【0143】

また、対象の免疫またはワクチン接種の方法であって、ＣｌｐＢタンパク質を含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。

【0144】

特に、上記方法は、対象の摂食障害の発症の機会を低下させるためのものである。

【0145】

それを必要とする対象は、摂食障害を罹患しやすい対象である。

【0146】

同様に、摂食障害に対する免疫のためのワクチンまたは免疫原性組成物の製造のためのＣｌｐＢタンパク質を含む組成物の使用を提供する。

【0147】

特に、上記組成物は、摂食障害の予防のためのものである。

【0148】

特に、上記摂食障害は、神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、むちゃ食い障害（ＢＥＤ）、過食、多食症、カヘキシーなどの消耗性疾患、特に神経性食欲不振症、神経性過食症、およびむちゃ食い障害から選択される。

【0149】

一実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書中に開示されるＣｌｐＢタンパク質の組み合わせを含み得る。

【0150】

ワクチン組成物または免疫原性組成物を得る方法は、当技術分野においてよく知られている。一般的に、当該方法は、超音波処理、タンパク質消化、熱処理、凍結融解処理、浸透圧ショック処理などの技術を使用して細菌調製物からタンパク質を抽出することを含む。人工的な細菌調製物の例として、合成または組み換えの方法により一部分または全体が得られたタンパク質調製物が挙げられる。

【0151】

ＣｌｐＢを含むワクチンまたは免疫原性組成物の典型的な用量は、たとえば、約０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇの範囲であり得るが、この例示的な範囲より下または上の用量が想定されている。特に、上記用量は、約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ全体重〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ全体重、好ましくは約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、より具体的には、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、特に０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重である。

【0152】

上記ワクチンおよび免疫原性組成物に関して、注射可能な用途に適した剤形は、滅菌性の水溶液または分散液と、滅菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末とを含む。すべての場合、剤形は無菌的でなければならず、容易に注射針を通過する程度の流体でなければならない。剤形は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。キャリアーは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体のポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／または植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。たとえば、適切な流動性は、レシチンなどのコーティングの使用により、分散の場合必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持され得る。微生物の作用の保護は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールによりもたらすことができる。多くの場合、たとえば糖または塩化ナトリウムといった等張剤を含むことが好ましい。注射可能組成物の持続吸収は、吸収を遅らせる薬剤、たとえばステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において使用することによりもたらすことができる。

【0153】

水溶液の非経口投与では、たとえば、溶液は、必要に応じて適切に緩衝されているべきであり、液体の希釈剤は、十分な生理食塩水またはグルコースでまず等張にしなければならない。これら特定の水溶液は、特に、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腫瘍内投与、および腹腔内投与に適している。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者によく知られている。たとえば、１つの用量を、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解してもよく、これを１０００ｍｌの皮下点滴療法の流体に添加、または提案される点滴部位に注射してもよい（たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， ２１ ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ， ２００５参照）。治療する対象の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こる。さらに、ヒトの投与では、調製物は、ＦＤＡの生物学的製剤基準部により必要とされる無菌性、発熱性、一般的な安全性、および純度の基準を満たさなければならない。

【0154】

滅菌注射可能な溶液は、ろ過滅菌により適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込むことにより調製される。

【0155】

本明細書中に使用される「キャリアー」は、限定するものではないが、溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、バッファー、キャリアー溶液、懸濁剤、コロイド、リポソームおよびＢｏｍｓｅｌ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３４：２６９−２８０に記載されるものなどのビロソームが挙げられる。医薬活性物質のためのそのような媒体および作用剤の使用は当技術分野においてよく知られている。

【0156】

「薬学的に許容可能な」または「薬理学的に許容可能な」との文言は、ヒトに投与した場合にアレルギーまたは類似の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を指す。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は当技術分野においてよく理解されている。典型的に、当該組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製されており、注射前に、液体の溶液または懸濁液にするために適した固体剤形もまた調製できる。

【0157】

本発明の特定の実施形態では、免疫原性組成物またはワクチン組成物は、１つまたは複数のアジュバントをさらに含む。

【0158】

本明細書中使用される用語「アジュバント」は、免疫原性組成物、特にワクチンの内容物に添加されている生成物を指し、上記組成物を投与する宿主に誘導される免疫反応の強さを増大させる。アジュバントは、特に、上記哺乳類が、上記組成物の投与後に産生できる特異的抗体の量を増加させ、よって免疫の有効性を増大させることができる。

【0159】

好ましくは、アジュバントは、ヒト宿主において副作用を示さない。

【0160】

アジュバントは、保護的免疫応答を増大させるよう作用する任意の化合物または複数の化合物を含む。アジュバントは、たとえば、乳化剤；ムラミルジペプチド；アブリジン；水酸化アルミニウムなどの水性アジュバント；酸素含有金属塩；キトサンベースのアジュバント、および様々なサポニン、油、ならびにＡｍｐｆａｉｇｅｎ、ＬＰＳ、細菌細胞壁抽出物、細菌ＤＮＡ、ＣｐＧ配列、合成オリゴヌクレオチドおよびそれらの組み合わせ（Ｓｃｈｉｊｎｓ ｅｔ ａｌ（２０００） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ， １２：４５６）、Ｍｙｃｏｈａｃｔｅｒｉａｌｐｌｉｌｅｉ（ｐｈｌｅｉ）細胞壁抽出物（ＣＷＥ）（米国特許第４，７４４，９８４号）、Ｍ．ｐｈｌｅｉ ＤＮＡ（Ｍ−Ｄ Ａ）、およびＭ−ＤＮＡ−Ｍ ｐｈｌｅｉ細胞壁複合体（ＭＣＣ）、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）、コレラ毒素（ＣＴ）、コレラ毒素Ｂサブユニット（ＣＴＢ）、重合化リポソーム、変異毒素、たとえばＬＴＫ６３およびＬＴＲ７２、マイクロカプセル、インターロイキン（たとえばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＮＦγ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＤＦ誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ＬＰＳ、ＭＰＬ、ホスファゼン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈａｚｅｎｅ）、Ａｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（登録商標）、グルカン、抗原製剤、リポソーム、ＤＤＥ、ＤＨＥＡ、ＤＭＰＣ、ＤＭＰＧ、ＤＯＣ／ミョウバン複合体、不完全フロイントアジュバント、ＩＳＣＯＭｓ（登録商標）、ＬＴ経口アジュバント、ムラミルジペプチド、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルトリペプチド、およびホスファチジルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）などの当技術分野において知られている他の物質のいずれかを含むことができる。乳化剤として役立ち得る化合物として、天然および合成の乳化剤、ならびに陰イオン性、陽イオン性、および非イオン性の化合物が挙げられる。酸素含有金属塩として、硫酸塩、水酸化物、リン酸塩、硝酸塩、ヨウ素酸塩、臭素酸塩、炭酸塩、水和物、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、および酒石酸塩であるＡｌ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｂａ、Ｎａ、Ｌｉ、Ｂ、Ｂｅ、Ｆｅ、Ｓｉ、Ｃｏ、Ｃｕ、Ｎｉ、Ａｇ、Ａｕ、およびＣｒの塩、ならびにその混合物が挙げられ、それらには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、リン酸カルシウム、マーロックス（水酸化アルミニウムと水酸化マグネシウムの混合物）、水酸化ベリリウム、水酸化亜鉛、炭酸亜鉛、塩化亜鉛、および硫酸バリウムが挙げられる。合成化合物のうち、陰イオン性乳化剤は、たとえば、ラウリン酸およびオレイン酸のカリウム、ナトリウム、およびアンモニウムの塩、脂肪酸のカルシウム、マグネシウム、およびアルミニウムの塩、ならびにラウリル硫酸ナトリウムなどの有機スルホン酸塩が挙げられる。合成陽イオン性薬剤として、たとえば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ｃｅｔｙｌｔｒｈｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｌｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）が挙げられ、合成非イオン性薬剤は、グリセリルエステル（たとえばモノステアリン酸グリセリル）、ポリオキシエチレングリコールのエステルおよびエーテル、ならびにソルビタン脂肪酸エステル（たとえばソルビタンモノパルミタート）およびそれらのポリオキシエチレン誘導体（たとえばポリオキシエチレンソルビタンモノパルミタート）により例示される。天然の乳化剤として、アカシア、ゼラチン、レシチン、およびコレステロールが挙げられる。

【0161】

他の適切なアジュバントは、単一の油、油の混合物、油中水型エマルジョンまたは水中油型エマルジョンなどの油状成分と共に形成することができる。油は、鉱油、植物油、または動物油であり得る。鉱油は、蒸留技術を介して石油から得た液体の炭化水素であり、当技術分野において流動パラフィン、流動ワセリン、または白色鉱油とも呼ばれる。適切な動物油は、たとえば、タラ肝油、ハリバ肝油、メンヘーデン油、オレンジラフィー油、およびサメ肝油が挙げられ、これらすべては市販されている。適切な植物油として、たとえば、キャノーラ油、アーモンド油、綿実油、コーン油、オリーブ油、ピーナッツ油、ベニバナ油、ゴマ油、ダイズ油などが挙げられる。完全フロイントアジュバント（ＦＣＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＦＩＡ）は、ワクチンの調製に一般的に使用されている２つの一般的なアジュバントであり、本発明での使用にも適している。ＦＣＡおよびＦＩＡはいずれも、鉱油中水型のエマルジョンであるが、ＦＣＡは、マイコバクテリウム種の死菌をも含む。粘膜ワクチンに特に好ましいアジュバントは、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：４１７−４２５に記載されるようにガラクトシルセラミド（ＧａｌＣｅｒ）を含む。

【0162】

免疫調節性サイトカインもまた、たとえば、アジュバントとして、ワクチンの有効性を高めるためにワクチン組成物に使用することができる。当該サイトカインの非限定的な例として、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、および顆粒球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

【0163】

ワクチンおよび免疫原性組成物は、静脈内投与、動脈内投与、内視鏡的投与、病変内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、随腔内投与、眼窩内投与、皮内投与、腹腔内投与、経気管投与、表皮下投与、胸骨内注射、静脈内、動脈内、皮内、経皮、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、吸入、または鼻腔内噴霧、または気管内経路などにより投与され得る。組成物の投与は、点滴または注射（たとえば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、髄腔内、十二指腸内、腹腔内など）による投与であり得る。さらに上記組成物は、「無針」送達システムにより投与することができる。

【0164】

注射は、複数回の注射に分けることができ、そのような分割された接種物は、好ましくは実質的に同時に投与される。分割接種として投与する場合、免疫原の用量は、好ましくは、必ずしも必要ではないが、各分割注射に等しく配分される。アジュバントがワクチン組成物に存在する場合、アジュバントの用量は、好ましくは、必ずしも必要ではないが、各分割注射に等しく配分される。分割接種のための個別の注射は、好ましくは、患者の身体で互いに実質的に近接して投与される。一部の好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約１ｃｍ離して投与されている。一部の好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約２．５ｃｍ離して投与される。非常に好ましい態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約５ｃｍ離して投与され、一部の態様では、注射は、身体で互いに少なくとも約１０ｃｍ離して投与され、一部の態様では、注射は、身体で互いに１０ｃｍ超離して投与され、たとえば、身体で互いに少なくとも約１２．５ｃｍ、１５ｃｍ、１７．５ｃｍ、２０ｃｍ、またはそれ以上離して投与される。

【0165】

様々な代替的な医薬送達システムを使用してもよい。当該システムの非限定的な例として、リポソームおよびエマルジョンが挙げられる。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒を使用してもよい。さらに、タンパク質を含有する固体のポリマーの半透性マトリックスなどの徐放システムを使用して、ワクチン組成物を送達してもよい。様々な徐放物質は当業者によく知られている。徐放カプセルは、その化学的性質に応じて、数日間〜数週間〜数か月間の範囲にわたりワクチン組成物を放出することができる。

【0166】

本組成物は、理想的には、摂食障害の発症の前、または摂食障害のいずれかの症状の前に対象に投与される。

【0167】

投与は、非経口経路または経口経路を介してもよい。投与経路は、たとえば静脈内、動脈内（ｉｎｔｒａｒｔｅｒｉａｌ）、皮内、経皮、筋肉内、粘膜、皮下、経皮、気管内、腹腔内、灌流および洗浄を含む。たとえば、投与は、粘膜経路、たとえば経鼻、経口（消化管の粘膜を介した）、膣内、頬側、直腸、舌下、眼性、尿（ｕｒｉｎａｌ）、肺性、または耳鼻科（耳を介した）経路を介している。

【0168】

免疫は、様々な「単位用量」を含み得る。

【0169】

単位用量は、１回注射として投与される必要はなく、設定された期間にわたる持続点滴を含み得る。単位用量は、０．０１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０００ｎｍｏｌ／ｋｇを含み得る。特に、上記用量は、約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ全体重〜約１００ｎｍｏｌ／ｋｇ全体重、好ましくは約０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約２０ｎｍｏｌ／ｋｇ、より具体的には、０．１ｎｍｏｌ／ｋｇ〜約１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、特に０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｎｍｏｌ／ｋｇ体重である。

【0170】

一実施形態では、ワクチン組成物は、１日１回用量で投与されてもよく、または総１日量を、分割用量、たとえば１日に２、３、または４回に分けて投与してもよい。さらに、ワクチン組成物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所的な使用を介した鼻腔内剤形で、または当業者によく知られている経皮スキンパッチの剤形を使用して経皮経路を介して；埋め込み可能なポンプにより、または他のいずれかの適切な投与手段により投与することができる。経皮送達システムの剤形で投与する場合、用量の投与は、当然、投与計画全体を通して間欠的投与よりも持続的投与であろう。

【0171】

ワクチンの投与は、プライムブースト法をさらに含み得る。これらの方法では、１つまたは複数のプライミング免疫の後に１回また複数回の追加免疫を行う。実際の免疫原性組成物は、それぞれの免疫および免疫原性組成物の種類に関して同じまたは異なることができ、免疫原の経路および製剤もまた変化させることができる。１つの有益なプライムブースト法は、４週間離して２回のプライミング免疫後、最後のプライミング免疫から４週間後および８週間後に２回の追加免疫を提供する。

【0172】

免疫スケジュール（または投与計画）は、動物（ヒトを含む）に関してよく知られており、特定の対象および組成物に関して容易に決定することができる。よって、本組成物を、対象に１回または複数回投与できる。好ましくは、免疫原性組成物の個別の投与の間には、既定の時間間隔がある。この間隔は対象ごとに変化するが、典型的に１０日から数週間の範囲であり、多くの場合、２、４、６、または８週間である。ヒトでは、この間隔は、典型的に２〜６週間である。本発明の特に好ましい実施形態では、この間隔は、より長く、好ましくは約１０週間、１２週間、１４週間、１６週間、１８週間、２０週間、２２週間、２４週間、２６週間、２８週間、３０週間、３２週間、３４週間、３６週間、３８週間、４０週間、４２週間、４４週間、４６週間、４８週間、５０週間、５２週間、５４週間、５６週間、５８週間、６０週間、６２週間、６４週間、６６週間、６８週間、または７０週間である。

【0173】

免疫法は、典型的に本組成物の１〜６回の投与を行うが、わずか１、２、３、４、または５回であってもよい。免疫応答を誘導する方法は、組成物と共にアジュバントの投与をも含むことができる。一部の例では、年に１回、２回、または他のより長い間隔（５〜１０年）で追加免疫を行うと、最初の免疫プロトコルを補完することができる。

【0174】

本発明の特定の実施形態は、本発明のワクチンまたは免疫原性組成物を対象に１回または複数回投与することにより、対象の摂食障害に対する免疫応答を誘導する方法であって、ＣｌｐＢタンパク質が、対象の特異的免疫応答を誘導するために十分なレベルにある、方法を提供する。当該免疫は、望ましい免疫法に従って少なくとも２、４、または６週間（またはそれ以上）の時間間隔で複数回反復することができる。

【0175】

本発明者らは、ＣｌｐＢタンパク質および抗ＣｌｐＢ抗体、特には抗ＣｌｐＢ ＩｇＧと、摂食障害、特には神経性食欲不振症および神経性過食症との間の相関を発見した。

【0176】

結果として、本発明はまた、対象の摂食障害を診断するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）上記対象由来の生物学的試料中のＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを測定することと、
ｂ）上記ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の測定レベルを参照値と比較することと、
ｃ）対象が摂食障害を罹患しているか否かを推測することと
を含む、方法に関する。

【0177】

本発明の文脈において、対象は、抗ＣｌｐＢ抗体と呼ばれる、細菌タンパク質ＣｌｐＢに対する抗体を産生する。

【0178】

本発明の文脈における対象により産生される抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＥの抗体、特にはＩｇＧおよび／またはＩｇＭの抗体であり得る。

【0179】

本発明の文脈において、ＣｌｐＢ発現細菌株の形態での上記ＣｌｐＢタンパク質の存在は、ＣｌｐＢに対する抗体および／またはα−ＭＳＨに対する抗体の産生を増大させる。

【0180】

対象により産生されるα−ＭＳＨに対する抗体は、自己抗体とも呼ばれる。

【0181】

用語「自己抗体」は、免疫系により産生される、対象自身のタンパク質に対する抗体を指す。

【0182】

好ましくは、抗ＣｌｐＢ抗体は、上記に定義されるようにα−ＭＳＨと交差反応する。

【0183】

よって、一実施形態では、抗ＣｌｐＢ抗体は、抗α−ＭＳＨ抗体でもある。

【0184】

「抗体」または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに結合し、各重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に結合する天然または通常の抗体であり得る。ラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能的な活性を決定する５つの主な重鎖のクラス（または同位体）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。各鎖は、別々の配列ドメインを含む。軽鎖は、２つのドメインまたは領域、すなわち可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４つのドメイン、すなわち可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、集合的にＣＨと呼ばれる）を含む。軽鎖（ＶＬ）および重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域は、抗原に対する結合の認識および特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）および重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、抗体の鎖の会合、分泌、胎盤通過性、補体結合、およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）に対する結合などの重要な生物学的特性を与える。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部であり、１つの軽鎖および１つの重鎖の可変部からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原性決定基との間の構造上の相補性に存在する。抗体結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に由来する残基で構成される。時に、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）の残基が、ドメイン全体の構造に影響を与え、それにより結合部位に影響を与える。相補性決定領域またはＣＤＲは、本来の免疫グロブリン結合部位の天然のＦｖ領域の結合親和性および特異性を共に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ、ＣＤＲ１−Ｌ、ＣＤＲ２−Ｌ、ＣＤＲ３−ＬおよびＣＤＲ１−Ｈ、ＣＤＲ２−Ｈ、ＣＤＲ３−Ｈと呼ばれる３つのＣＤＲを有する。よって、通常の抗体の抗原結合部位は、重鎖および軽鎖のＶ領域のそれぞれからのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。

【0185】

「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に介在するアミノ酸配列、すなわち、単一の種において異なる免疫グロブリン間で比較的保存されている免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の可変領域の一部を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖はそれぞれ、ＦＲ１−Ｌ、ＦＲ２−Ｌ、ＦＲ３−Ｌ、ＦＲ４−Ｌ、およびＦＲ１−Ｈ、ＦＲ２−Ｈ、ＦＲ３−Ｈ、ＦＲ４−Ｈと呼ばれる４つのＦＲを有する。

【0186】

本明細書中で使用される「ヒトフレームワーク領域」は、天然に存在するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一（約８５％以上、特に９０％、９５％、９７％、９９％、または１００％同一）であるフレームワーク領域である。

【0187】

本明細書中で使用される「診断のための方法」または「診断方法」または単純に「診断」は、対象の可能性がある疾患または障害を判定または同定するための方法を指す。本発明の文脈において、診断方法は、摂食障害、特に、神経性食欲不振症（ＡＮ）、神経性過食症（ＢＮ）、むちゃ食い障害（ＢＥＤ）、過食、多食症、カヘキシーなどの消耗性疾患、特に神経性食欲不振症、神経性過食症およびむちゃ食い障害から選択される摂食障害を決定または同定することに関する。

【0188】

本明細書中で使用される用語「生物学的試料」は、生物起源の物質を意味する。生物学的試料の例として、限定するものではないが、血液、血漿、血清、または唾液が挙げられる。好ましくは、本発明に係る生物学的試料は、血液、血清、および／または血漿の試料であり、特には血漿の試料である。本発明に係る生物学的試料は、当業者に知られている任意の適切な採取手段により対象から得てもよい。

【0189】

本発明に係る摂食障害の診断方法は、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の測定レベルを参照値と比較するステップｂ）を含む。

【0190】

好ましくは、参照値は、本発明の方法のステップａ）の対象の生物学的な試料と同じ組織起源からの試料で測定される。

【0191】

好ましくは、「参照値」は、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の正常なレベルに対応する。

【0192】

本明細書において意図されるＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の「正常なレベル」は、生物学的試料中のＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルがＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体に関する標準のカットオフ値内であることを意味する。この標準は、生物学的な試料の種類、および生物学的な試料中のｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを測定するために使用される方法に依存する。特に、正常なレベルは、健常な集合のｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の平均レベルである。

【0193】

特に、参照値は、健康な対象のｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルに対応する。よって、参照値は、健常な対象由来の参照試料中のｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルに対応し得る。

【0194】

特に、参照値は、健康な対象のＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルに対応し、特に、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルがステップａ）で測定される場合の健康な対象のＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルに対応する。

【0195】

本明細書中で使用される「健康な集団」は、以前に摂食障害と診断されていない対象から構成される集団を意味する。また健康な集団の対象は、好ましくは、そうでなければ摂食障害のいかなる症状も示さない。言い換えると、当該対象は、医師が診察した場合に健康であること、および疾患の症状を有していないことを特徴とする。

【0196】

よって、「健康な対象」は、以前に摂食障害と診断されていない対象を意味する。また、健常な対象は、そうでなければ摂食障害の症状を示さない。言い換えると、当該健常な対象は、医師が診察した場合、健康であること、および疾患の症状を有しないことを特徴とする。

【0197】

好ましくは、健康な対象は、上述の摂食障害のいかなるものも示さない。

【0198】

本発明の文脈において、ＣｌｐＢタンパク質、抗ＣｌｐＢ抗体のレベルは、当業者に知られたいずれかの方法、たとえば酵素結合免疫吸着測定法により測定してもよい。

【0199】

特にＣｌＢタンパク質のレベルを、イムノアッセイもしくはイムノブロット、または、たとえば質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー―質量分析法（ＬＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）などの分析方法により測定する。

【0200】

本発明により使用される用語「イムノアッセイ」は、競合的、直接反応、またはサンドイッチ型のアッセイを含む。当該アッセイは、限定するものではないが、凝集反応試験、ＥＬＩＳＡなどの酵素標識型および媒介型のイムノアッセイ、ビオチン／アビジン型アッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫電気泳動、および免疫沈降を含み、より直接的にはＥＬＩＳＡに関連する。

【0201】

質量分析（ＭＳ）、キャピラリー電気泳動−質量分析（ＣＥ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）は、すべてが、本発明に係る方法を実行するために適している、当業者に非常によく知られた分析方法である。

【0202】

特定の実施形態では、ＣｌｐＢのＤＮＡのレベルは、たとえば、ＣｌｐＢのＤＮＡアッセイの下で以下の実験の部分に開示される方法により対象の便のＣｌｐＢのＤＮＡを定量することにより測定する。または以下の通り測定する：ＤＮＡを、細菌細胞株の培養物から抽出し、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）のＤＮＡ ｓｔｏｏｌ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、フランス）を使用して糞便から精製する。細菌を水に溶解し、５分間１００℃で煮沸し、１１，０００ｒｐｍで１分間遠心した後、ＤＮＡを含む上清を−２０℃で保存した。ＮＣＢＩプライマー設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｊａｓｔ／）を使用して、同定された１つのα−ＭＳＨ様エピトープを含むＣｌｐＢタンパク質フラグメントをコードする１８０ｂｐのＤＮＡ領域を増幅する以下のヌクレオチドプライマーを設計する（フォワード：５’−ＧＣＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＡ−３’（配列番号：４）およびリバース：５’−ＡＣＣＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴ−３’（配列番号：５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ，フランス、セルジー ポンドワーズ））。ＰＣＲを、ＭｉｃｒｏＡｍｐチューブ（エッペンドルフ，ドイツハンブルク）中でサーマルサイクラーにおいて実施する。反応を、Ｇｏ Ｔａｑ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ２×（Ｐｒｏｍｅｇａ，ウィスコンシン州マディソン）２５μｌ、各プライマー１μｌ（２０ｐｍｏｌ）、２回蒸留水２１μｌ、および細菌ＤＮＡ１μｌを含む５０μｌの容量で行った。ＰＣＲの条件は以下の通りである：（９４℃で３分間の後に、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、および７３℃で１．５分間を３５サイクル）。ＰＣＲ産物を、１％のアガロースゲル（シグマ）で可視化し、予想サイズ１８０ｂｐおよび特異性を、ＣｌｐＢ変異株を使用してバリデートした。

【0203】

特に、ＣｌｐＢと反応する抗体のレベルを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定する。

【0204】

典型的に、ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を、典型的に、１００μｌおよび典型的に１００ｍＭのＮａＨＣＯ_３バッファー（ｐＨ９．６）中で２μｇ／ｍｌの濃度を使用してＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ， ニューヨーク州ロチェスター）に、典型的に４℃で７２時間コーティングする。プレートを、たとえば、典型的に０．０５％のＴｗｅｅｎ ２００（ｐＨ７．４）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で（たとえば５分×３）洗浄し、次に、たとえば、ＰＢＳで１：２００に希釈したマウスまたはラットの血漿１００μｌと共に４℃で一晩インキュベートして遊離の抗体レベルを決定するか、または解離性の３ＭのＮａＣＩ、１．５Ｍグリシンバッファー（ｐＨ８．９）中で１：２００に希釈して総抗体レベルを決定した。プレートを洗浄（３回）し、典型的に、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ（１：２０００）、抗ラットＩｇＭ（１：１０００）、抗マウスＩｇＧ（１：２０００）、または抗マウスＩｇＭ（１：１０００）１００μｌと共にインキュベートする。これらの抗体はすべてＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州ウェスト・グローブ）製である。洗浄（３回）した後、典型的にｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（シグマ）１００μｌをアルカリホスファターゼの基質として添加する。典型的に室温で４０分間インキュベートした後、３ＮのＮａＯＨを添加して反応を停止させる。ＯＤ（吸光度）を、典型的に、マイクロプレートリーダーＭｅｔｅｒｔｅｃｈ ９６０（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ Ｉｎｃ．，台湾台北市）を使用して４０５ｎｍで決定する。血漿試料を添加していないプレートの読み取りから得られたブランクのＯＤ値を、試料のＯＤ値から減算する。各決定は、典型的に２回の反復実験で行われる。反復実験の値の間の変動は、典型的に５％未満である。

【0205】

典型的に、類似のプロトコルを使用して、典型的に対応する抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭのＡＰコンジュゲート抗体を使用して典型的に１：４００に希釈したヒト血漿中の抗ＣｌｐＢのＩｇＧおよびＩｇＭを測定する。

【0206】

好ましくは、特に、抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを、酵素結合免疫吸着測定法を使用して測定する場合、抗ＣｌｐＢ抗体の参照値は、特に血漿中の抗ＣｌｐＢ ＩｇＧのＯＤで測定され、このＯＤ値は、０〜３、より好ましくは２．０〜３．０．および／または０．０〜１．０である。

【0207】

好ましくは、本発明の方法では、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の測定レベルは、本発明に係る参照値よりも高い（増加している）または低い（減少している）。

【0208】

さらに本発明者らは、対照において抗ＣｌｐＢ ＩｇＧが、いくつかの心理学的特徴の正常範囲と負に相関するが、ＡＮ患者では、抗ＣｌｐＢ ＩｇＧが、身体の不満および痩せ願望などの中心となる精神病理学的特徴と正に相関することを発見した。

【0209】

よって、本方法は、摂食障害を特徴付ける心理学的な兆候を評価するステップｂ２）をさらに含む。

【0210】

一実施形態では、参照値よりも増加した抗ＣｌｐＢ ＩｇＧ抗体の値は、摂食障害、特にＡＮの存在を示す。

【0211】

一実施形態では、摂食障害の存在を表す精神病理学的特徴は、身体の不満および痩せ願望である。

【0212】

特定の実施形態では、参照値よりも増加した抗ＣｌｐＢ ＩｇＧ抗体の値、および／またはステップｂ２）における摂食障害と関連する身体的特徴の検出は、摂食障害、特にＡＮの存在を示す。

【0213】

摂食障害に関連する「心理学的な特徴」を評価する方法は、当業者に知られている。

【0214】

一例では、摂食障害に関連する心理学的特徴候は、摂食障害調査票−２を使用してアッセイすることができる。

【0215】

「摂食障害調査票（ＥＤＩ）」は、（ａ）神経性食欲不振症、制限型およびむちゃ食い型／排出型の両方；（ｂ）神経性過食症；および（ｃ）むちゃ食い障害（ＢＥＤ）を含む他で特定されない摂食障害といった摂食障害の存在を評価するために使用する自己記録型アンケートである。元となるアンケートは、８つのサブスケールに分けられる６４の質問から構成された。ＥＤＩ―２は、１９９１年の改訂版を指す。

【0216】

一実施形態では、本発明の診断方法のステップｃ）は、対象が摂食障害を罹患しているか否かを推測することを指し、ここでは、参照値よりも増加した抗ＣｌｐＢ抗体の値が、好ましくは摂食障害の存在を示す。

【0217】

別の実施形態では、ステップｂ２）で検出される摂食障害を有する身体的特徴の検出は、摂食障害の存在を示す。

【0218】

よって、本方法は、ステップａ）で決定した抗ＣｌｐＢ ＩｇＧの総レベルと比較した、上記試料中のα−ＭＳＨと交差反応する抗ＣｌｐＢ ＩｇＧのレベルの比率を決定するさらなるステッププレ‐ｃ）を含んでもよい。

【0219】

α−ＭＳＨと交差反応する抗ＣｌｐＢ ＩｇＧのレベルの比率は、たとえば、典型的に１０^−６Ｍのα−ＭＳＨペプチド（Ｂａｃｈｅｍ）と共に、ＰＢＳで１：４００に希釈したヒト血漿試料を、たとえば４℃で一晩プレインキュベートした後に、ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）でコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）に試料を添加することにより決定され得る。ＣｌｐＢと反応性のあるＩｇＧ抗体は、対応する抗ヒトＡＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）を使用して、典型的にＥＬＩＳＡにより検出する。α−ＭＳＨと交差反応性であるＣｌｐＢ ＩｇＧのパーセンテージは、それぞれ、１００％に等しい個々の血漿試料で吸収処理を行わずに検出された抗ＣｌｐＢ ＩｇＧのレベルと比較して計算され得る。

【0220】

特定の実施形態では、参照値よりも増加した、抗ＣｌｐＢ抗体の総レベルと比較したα−ＭＳＨと交差反応する抗ＣｌｐＢ ＩｇＧのレベルの比率は、摂食障害の存在を示す。

【0221】

さらに、本発明は、それを必要とする対象の摂食障害を治療または発症の機会を低下させる方法であって、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する１つの抗生剤を含む組成物を上記対象に投与すること、および／またはＣｌｐＢを発現しないプロバイオティクスを含む組成物を上記対象に投与すること、および／またはそれらの組み合わせを含み、上記対象は、
ａ）上記対象由来の生物学的試料中のＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを測定することと、
ｂ）上記ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の測定レベルを参照値と比較することと、
ｃ）対象が摂食障害を罹患しているか否かを推測することと
により摂食障害を罹患していると上記対象を診断する、
方法に関する。

【0222】

上述したすべての定義は上記方法にも当てはまる。

【0223】

さらに、本発明は、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下させる治療に応答する可能性がある、摂食障害を罹患している対象を選択するｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）上記対象由来の生物学的な試料中のＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを測定することと、
ｂ）上記ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の測定レベルを参照値と比較することと、
ｃ）ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下する治療に関して対象を選択することと
を含み、
上記ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下させる治療が、少なくとも１つのＣｌｐＢ発現細菌に対する１つの抗生剤を含む組成物の有効量を上記対象に投与すること、および／またはＣｌｐＢを発現しないプロバイオティクスを含む組成物の有効量を上記対象に投与すること、および／またはその組み合わせを含む、
方法に関する。

【0224】

一実施形態では、参照値よりも増加したＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の値を有する対象は、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下させる治療に応答する可能性があると選択される。

【0225】

一実施形態では、よって本方法は、摂食障害を特徴づける心理学的特徴が上記に定義されるように評価されるステップｂ２）をさらに含んでもよい。

【0226】

本発明の診断方法のステップｃ）は、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを減少させる治療に関して対象を選択することを指し、ここで参照値よりも増加したＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の値を有する対象が、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを低下させる治療に応答する可能性があるとして選択される。

【0227】

特定の実施形態では、参照値よりも増加したＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体の値を有する、かつ／またはステップｂ）で検出された摂食障害に関連する身体的特徴を有する対象は、ＣｌｐＢタンパク質および／または抗ＣｌｐＢ抗体のレベルを減少させる治療に応答する可能性があるとして選択される。

【0228】

一実施形態では、摂食障害の存在を示す精神病理学的特徴は、身体の不満および痩せ願望である。

【0229】

さらに、本発明者らは、マウスにおける大腸菌の長期的な胃内送達が食物摂取を減少させることを示したことから、さらに本発明は、肥満の治療または予防に使用するための、ＣｌｐＢタンパク質を過剰発現するプロバイオティクスを含む組成物に関する。

【0230】

「肥満」は、本明細書中では、好ましくは対象のＢＭＩが３０を超える医学的な状態を指す。

【0231】

「過剰発現する」は、量が増加した遺伝子の発現によるタンパク質の人工的な発現を意味し、ここではＣｌｐＢタンパク質をコードする遺伝子の発現の増加を意味する。

【0232】

ＣｌｐＢタンパク質を過剰発現する細菌は、当業者に知られた方法により調製できる。これは、たとえばＣｌｐＢのＤＮＡを発現するベクターによる細菌の形質転換により行うことができる。

【0233】

一実施形態では、ＣｌｐＢ過剰発現細菌は、プロバイオティックまたは共生性のヒトの非病原性細菌として知られている細菌、たとえば非病原性大腸菌から選択されている。

【0234】

「有効量」は、望ましい効果の発現を可能にする細菌の量を意味する。特に、有効量は、１日あたり１０億〜１００億ＵＦＣの量を意味する。

【0235】

本願を通して、用語「含む」は、具体的に記載したすべての特性、ならびに任意の特性、追加的な特性、特定していない特性を含むと解釈すべきである。本明細書中で使用されるように、用語「含む」の使用はまた、具体的に言及された特性以外のいかなる特性も存在しない（すなわち「〜からなる」）実施形態を開示する。

【0236】

本発明を、以下の図面および実施例を参照してより詳細に記載する。

【0237】

配列
配列番号１：ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿４１７０８３．１として参照され、Ｕｎｉ−Ｐｒｏｔ ｅｎｔｒｙ Ｐ６３２８４として参照される大腸菌Ｋ１２由来のシャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列を示す。
配列番号２：配列番号１の大腸菌Ｋ１２由来のシャペロンタンパク質ＣｌｐＢのアミノ酸配列の５４２〜５４８番目のアミノ酸を示す。
配列番号３：Ｇｅｎ Ｐｅｐｔの配列ＩＤ ＰＲＦ：２２３２７４として参照されるホモサピエンス由来のα−ＭＳＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号４：ヌクレオチドプライマーＣｌｐＢの核酸配列を示す。
配列番号５：ヌクレオチドプライマーＣｌｐＢの核酸配列を示す。

【図面の簡単な説明】

【0238】

【図1】大腸菌Ｋ１２タンパク質とα−ＭＳＨとの間の分子模倣性のプロテオミクスによる同定 （ａ）大腸菌の細胞質タンパク質の二次元ゲル電気泳動。（ｂ、ｃ）α−ＭＳＨであらかじめ吸着させた（ｃ）または吸着させていない（ｂ）、Ｒｂ抗α−ＭＳＨ ＩｇＧで検出した大腸菌タンパク質のイムノブロット。スポット周囲の赤色の丸は、α−ＭＳＨ ＩｇＧにより特異的に認識され、タンパク質同定のために使用した。青色の丸は、非特異的スポットを示す。スポット１〜４で同定されたタンパク質は、ＣｌｐＢのアイソフォームである。（ｄ）ストレッチャープログラムを使用したα−ＭＳＨおよびＣｌｐＢのアミノ酸配列のアライメント。（ｅ）抗α−ＭＳＨ ＩｇＧで明らかにした組み換えＣｌｐＢのウェスタンブロット。レーン１および２は、それぞれ２０および１０μｇのＣｌｐＢである。

【図2】マウスにおけるＣｌｐＢの免疫 ＣｌｐＢ免疫マウス（ＣｌｐＢ＋Ａｄｊ）を、アジュバント（Ａｄｊ）、ＰＢＳ、または対照（Ｃｔｒ）を投与したマウスと比較した。（ａ）３２日の試験期間の体重変化。食物摂取および食行動パターンを、ＢｉｏＤＡＱケージで最後の２週間で試験した。試験の最後の１０日間での毎日の平均食物摂取量（ｂ）、食事の量（ｃ）、および食事の回数（ｄ）。（ｅ）α−ＭＳＨ（１００μｇｋｇ^−１体重、ｉ．ｐ）またはＰＢＳの注射後２４時間にわたる食物摂取量。（ｆ）１０^−６Ｍのα−ＭＳＨによる吸着の前後のＣｌｐＢ反応性ＩｇＧの血漿中レベル。（ｇ）平衡解離定数（ＫＤ値）として示される抗ＣｌｐＢ ＩｇＧの親和性。（ｈ）α−ＭＳＨ反応性総ＩｇＧの血漿中レベル。（ｉ）抗α−ＭＳＨ ＩｇＧの親和性（ＫＤ）。（ｊ）α−ＭＳＨ単独で刺激後の、またはＣｌｐＢ免疫マウスもしくはＡｄｊ注射マウスからプールしたＩｇＧ（０．５ｍｇｍｌ^−１）と共に刺激後のＭＣ４Ｒを過剰発現するヒト胎児腎２９３細胞のｃＡＭＰアッセイ。（ｋ）ｃＡＭＰアッセイを、抗α−ＭＳＨ ＩｇＧを枯渇させたＩｇＧで実施した。（ａ）α−ＭＳＨ注射（１００μｇｋｇ^−１体重，ｉ．ｐ．）前の二元配置繰り返し測定の分散分析（ＡＮＯＶＡ）、Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニの事後検定、＊ａ：少なくともＰ＜０．０５、ＣｌｐＢ群対対照＜；＊ｂ：少なくともＰ＜０．０５、アジュバント群対対照＜；＊ｃ：Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定（ＣｌｐＢ群対＜ＰＢＳ）；および＊ｄ：Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定（ＣｌｐＢ群対対照＜）。（ｂ）ＡＮＯＶＡ Ｐ＝０．０００２，テューキーの検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊Ｐ＜０．０１，＃Ｐ＜０．０５，スチューデントのｔ検定。（ｃ）ＡＮＯＶＡ Ｐ＝０．００７，テューキーの検定（＊＊Ｐ＜０．０１）。（ｅ）スチューデントのｔ検定（＊Ｐ＜０．０５）。（ｆ，ｇ）ＡＮＯＶＡ Ｐ＜０．０００１，テューキーの検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１ ＣｌｐＢ＋Ａｄｊｖｓ他の群），対応のあるｔ検定（＃＃Ｐ＜０．０１，＃＃＃Ｐ＜０．００１）。（ｈ）ＡＮＯＶＡ（Ｐ＝０．０００２），テューキーの検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊Ｐ＜０．０５）；（ｉ）クラスカル・ワリス検定（Ｐ＝０．００３），ダンの事後検定（＊＊Ｐ＜０．０１，（平均値±ｓ．ｅ．ｍ、ｎ＝８）。（ｊ）ＡＮＯＶＡ（Ｐ＝０．００５，テューキーの検定＊Ｐ＜０．０５）；ＡＮＯＶＡ（Ｐ＝０．０４），スチューデントのｔ検定（＃Ｐ＜０．０５、ａ：ＣｌｐＢ対α−ＭＳＨ、ｂ：ＣｌｐＢ対アジュバント（平均値±ｓ．ｅ．ｍ．；ｊ，ｎ＝６、ｋ，ｎ＝３））

【図3】マウスにおける大腸菌の補充 マウスにおける大腸菌Ｋ１２の野生型（ＷＴ）、ＣｌｐＢ欠失（ＡＣｌｐＢ）大腸菌Ｋ１２、またはＬＢ培地のいずれかの毎日胃内強制投与（１〜２１日）の、体重（ａ）、食物摂取量（ｂ）、食事量（ｃ）、および食事の回数（ｄ）に及ぼす効果。（ｅ）細菌ＣｌｐＢのＤＮＡの１８０塩基対のフラグメントのＰＣＲの検出、第１のレーンは分子量マーカーであり、第２のレーンは、大腸菌Ｋ１２のＷＴのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物由来のＤＮＡ、第３のレーンは、大腸菌Ｋ１２ △ＣｌｐＢのｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物由来のＤＮＡであり、残りのレーンは、２１日目に回収したマウスの糞便由来のＤＮＡである。１０^−６Ｍのα−ＭＳＨによる吸着の前後の、抗ＣｌｐＢ ＩｇＭ（ｆ）、およびＩｇＧ（ｇ）の酵素結合免疫吸着測定法における吸光度で表す血漿中レベル 抗α−ＭＳＨ ＩｇＭ（ｈ）、およびＩｇＧ（ｉ）の血漿中レベル。（ｊ）抗α−ＭＳＨ ＩｇＧの親和性（平衡定数）。（ａ）二元配置繰り返し測定の分散分析（ＡＮＯＶＡ）（Ｐ＝０．３），ボンフェローニの事後検定（２日目）、（＊＊Ｐ＜０．０１ 対照対野生型大腸菌）。（ｂ）ＡＮＯＶＡ １〜２日目（Ｐ＝０．０００６）、テューキーの検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊Ｐ＜０．０５，野生型大腸菌対ａ：対照およびｂ：ＬＢ）。（ｃ）クラスカル・ワリス（Ｋ−Ｗ）検定（３週目、Ｐ＝０．０００１）、ダンの事後検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊Ｐ＜０．０１，野生型大腸菌対ａ：対照、ｂ：ＬＢ、およびＣ：△ＣｌｐＢ）。（ｄ）ＡＮＯＶＡ １〜２日目（Ｐ＝０．００６）、テューキーの検定（＊＊Ｐ＜０．０１、＊Ｐ＜０．０５）， Ｋ−Ｗ検定、３週目（Ｐ＜０．０００１），ダンの事後検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１、野生型大腸菌対ａ：対照、ｂ：ＬＢ、およびＣ：△ＡＣｌｐＢ）（ｆ）吸着前のＫ−Ｗ検定（Ｐ＝０．０２）、ダンの事後検定（＊Ｐ＜０．０５）、吸着後のＡＮＯＶＡ（Ｐ＜Ｏ．０００１）、テューキーの事後検定（＊＊Ｐ＜０．０１、野生型大腸菌対他の群）。（ｇ）吸着前のＡＮＯＶＡ（Ｐ＝０．０１）、テューキーの事後検定（＊Ｐ＜０．０５）、野生型大腸菌対他の群）、対応のあるt検定（＃＃Ｐ＜０．０１）。（ｈ）スチューデントのｔ検定（野生型大腸菌対他の群 ＊Ｐ＜０．０５。（ｊ）Ｋ−Ｗ検定 Ｐ＝０．０２、（ダンの検定 ＊Ｐ＜０．０５）、マン・ホイットニー検定、（＃Ｐ＜０．０５（平均値±ｓ．ｅ．ｍ．，ｎ＝８）。

【図4】ＥＤ患者における抗ＣｌｐＢ抗体 健康な女性（対照、Ｃｔｒ）、およびＡＮ、ＢＮ、およびＢＥＤを伴う患者における抗ＣｌｐＢ ＩｇＧ（ａ）およびＩｇＭ（ｂ）の血漿中レベル。１０^−６Ｍのα−ＭＳＨによる吸着の前後のＣｌｐＢ ＩｇＧ（ｃ）およびＩｇＭ（ｄ）の血漿中レベル。α−ＭＳＨ交差反応性の抗ＣｌｐＢのＩｇＧ（ｅ）およびＩｇＭ（ｆ）のパーセンテージ。（ｂ）スチューデントｔ検定（＊Ｐ＜０．０５）。（ｃ，ｄ）対応のあるt検定（＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．０１）。（ｅ）クラスカル・ワリス検定（Ｐ＜０．０００１）、ダンの事後検定，（＊＊Ｐ＜０．０１）、マン・ホイットニー検定＃Ｐ＜０．０５。（ｆ）分散分析（Ｐ＝０．０２）、テューキーの事後検定（＊Ｐ＜０．０５（平均値±ｓ．ｅ．ｍ．、対照：ｎ＝６５，ＡＮ：ｎ＝２７、ＢＮ：ｎ＝３２およびＢＥＤ：ｎ＝１４））

【図5】摂食障害および健康な対照（Ｃｔｒ）、ＡＮ、神経性食欲不振症、ＢＮ、神経性過食症、ＢＥＤ、むちゃ食い障害を伴う患者の細菌ＣｌｐＢタンパク質の血漿中濃度。＊ｐ＜０．０５、ＣｌｐＢ濃度の平均値対対照のスチューデントｔ検定。対照の平均値＋２標準偏差（ＳＤ）より高いＣｌｐＢ濃度を有する患者のパーセンテージ（％）。

【実施例】

【0239】

実施例
以下の実施例は、共生腸内細菌大腸菌Ｋ１２が、エネルギー代謝および感情の調節に関与する神経ペプチドであるα―メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）の立体構造模倣体であることを例証する。またこれら実施例は、ＣｌｐＢ発現腸内細菌と、ＣｌｐＢタンパク質およびα−ＭＳＨと交差反応性である抗ＣｌｐＢ抗体の産生を介した動機づけ行動および感情の調節との分子的関連を明らかにするものである。またさらに、ＣｌｐＢタンパク質およびＣｌｐＢ抗体の産生の増大におけるＣｌｐＢ発現微生物の関与、ならびに異常な食行動および感情の確立を裏付ける。

【0240】

実施例１
材料および方法
大腸菌Ｋ１２培養物およびタンパク質抽出物
この試験で使用する細菌細胞株は大腸菌Ｋ１２であり、フランスのルーアン大学のＵＭＲ ６２７０ ＣＮＲＳ研究所により提供されたものであった。大腸菌Ｋ１２を、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，フランス、イルキルシュ）中、３７℃で２４時間培養した。タンパク質の抽出を、Ｍａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．（ＰＬｏＳ ＯＮＥ ２０１１，ｅ２６０３０）に記載されるように実施した。簡潔に説明すると、細菌を、４０００ｇ、４℃で３０分間の遠心分離により収集し、得られたペレットを、抽出バッファー（３００ｍＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８））に再懸濁した。懸濁物を、超音波処理（３×３分，パルスをＯＮ（１秒間）、ＯＦＦ（１秒間）、振幅の２１％で）により破砕し、１００００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上清を回収し、６００００ｇ、４℃で４５分間超遠心分離し、タンパク質を細胞質（上清）とエンベロープ（ペレット）の分画にさらに分離した。タンパク質の濃度を、２−Ｄ Ｑｕａｎｔキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， 米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して測定した。

【0241】

二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動
二次元（２Ｄ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）のため、４００μｇの大腸菌Ｋ１２タンパク質抽出物を、等電点電気泳動バッファー（ｉｓｏ−ｅｌｅｃｔｒｏ ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（７Ｍの尿素、２Ｍのチオウレアおよび０．５％の両性電解質（ｐＨ４〜７）、２０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＴＢＰ、２％のＣＨＡＰＳ、および０．００５％のブロモフェノールブルー）に添加し、軽く振盪させながら室温で６０分間可溶化した。一次元のゲル分離を、ＲｅａｄｙＳｔｒｉｐ ＩＰＧ Ｓｔｒｉｐ（１８ｃｍ、ｐＨ４−７ＮＬ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ、フランス、ルマルヌ＝ラ＝コケット）を使用して行った。等電点電気泳動バッファーによってストリップを受動的に２４時間再水和させた後に、タンパク質試料を、カソードから１．５ｃｍの場所に配置したローディングカップを通してストリップに添加した。等電点電気泳動を、Ｅｔｔａｎ ＩＰＧｐｈｏｒ ３システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、フランスオルセー）により、４段階（３１，５００Ｖｈ）：５００Ｖで１時間、１０００Ｖの勾配、１０ ０００Ｖの勾配、および１０ ０００ Ｖで２時間）で行った。２％のＤＴＴおよび２．５％のヨードアセトアミドをそれぞれ用いる２回の平衡段階の後、第２の次元、すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥ，（１０％のポリアクリルアミドゲル、２０ｃｍ×１８ｃｍ×１ｍｍ）を、ゲルあたり１２ｍＡで、Ｅｔｔａｎ Ｄａｌｔｓｉｘ ｖｅｒｔｉｃａｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、２Ｄゲルを、２％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）オルトリン酸および５０％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のメタノール中、室温で２時間固定した。次にゲルを水ですすぎ、タンパク質のスポットを、ＣＢＢ Ｇ−２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）染色用（３４％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）メタノール、１７％（ｗｔ：ｖｏｌ）硫酸アンモニウム、２％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）オルトリン酸および０．６６ｇのＣＢＢ Ｇ−２５０／リットル）により可視化した。

【0242】

イムノブロッティング
２Ｄ−ＰＡＧＥの後、大腸菌の細胞質タンパク質を、ドライ式転写法（Ｔｒａｎｓ Ｂｌｏｔ Ｃｅｌｌ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ，米国）および膜の大きさ１平方センチあたり一定の電流（０．８ｍＡ．ｃｍ^−２）により、Ｈｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ ＰＶＤＦメンブレン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に２時間転写した。転写後、膜を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ；１０ｍｍｏｌ．ｌ^−１のＴｒｉｓ（ｐＨ８）および１５０ｍＭ．ｌ^−１のＮａＣＩ）プラス０．０５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）のＴｗｅｅｎ ２０中５％（ｗｔ容量）のミルクでブロッキングした。洗浄した後、膜を、ポリクローナルウサギ抗α−ＭＳＨ ＩｇＧ（１：１０００，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， 米国カリフォルニア州 サン・カルロス）と共に一晩インキュベートし、洗浄した後、次にポリクローナルブタ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートＩｇｓ（１：３０００；Ｄａｋｏ，フランス、トラップ）と共にインキュベートした。イムノブロットを、ＥＣＬ検出システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により明らかにし、グレースケールマーカー（Ｋｏｄａｋ）を使用してあらかじめ較正したＩｍａｇｅＳｃａｎｎｅｒ ＩＩ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でスキャンし、Ｌａｂｓｃａｎ ６．００ ソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で可視化した。１０^−６Ｍのα−ＭＳＨペプチド（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ，スイス、ブーベンドルフ）によるウサギ抗α−ＭＳＨ ＩｇＧの吸着後に同じ技法を実施した。

【0243】

タンパク質の同定
関心対象のタンパク質のスポットを、Ｅｔｔａｎ Ｓｐｏｔ Ｐｉｃｋｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してＣＰＰＧ−２５０染色した２Ｄゲルから切除し、タンパク質の自動ゲル内消化を、Ｅｔｔａｎ Ｄｉｇｅｓｔｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で実施した。次にタンパク質抽出物を、５％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）アセトニトリル／０．１％（ｖｏｌ：ｖｏｌ）ギ酸１０μＬに再懸濁し、次にナノスプレー源（ｎａｎｏｓｐｒａｙ ｓｏｕｒｃｅ）およびＨＰＬＣ−チップキューブのインターフェース（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， フランス、クールタブフ）を備えた６３４０ イオントラップ質量分析器に結合したｎａｎｏ−ＬＣ１２００で分析した。簡潔に述べると、ペプチドを濃縮し、４０ｎｌのＲＰＣ１８トラップカラムで脱塩し、Ｚｏｒｂａｘ（３０−ｎｍの孔径、５−μｍの粒径）Ｃ１８カラム（４３ｍｍ長×７５μｍの内径；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分離した。９分間の直線勾配（０．１％のギ酸中３〜８０％のアセトニトリル）を流速４００ｎｌ．ｍｉｎ^−１で使用し、溶離液を、イオントラップ質量分析器で分析した。タンパク質同定のため、ＭＳ／ＭＳピークのリストを抽出し、ＭＡＳＣＯＴ Ｄａｅｍｏｎ バージョン２．２．２（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ）検索エンジンを使用することによりタンパク質データベースと比較した。この検索を、以下の特定のパラメータ：酵素の特異性、トリプシン；残った１つの切断部位は許容される；固定修飾なし；可変修飾、メチオニン酸化、システイン、カルバミドメチル化、セリン、チロシン、およびスレオニンのリン酸化；モノアイソトピック；ペプチド電荷２＋および３＋；前駆体イオンの質量許容差、１．５Ｄａ；断片化に関する質量許容差、０．６Ｄａ；機器としてのＥＳＩ−ＴＲＡＰ；分類、大腸菌；国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベース（ＮＣＢＩｎｒ ２０１２０５３１（１８２８０２１５の配列、６２６５２７５２３３の残基）；米国メリーランド州ベセスダ）を用いて実施した。以下の基準：それぞれＭＡＳＣＯＴスコア４５４（Ｐ＜０．０１）を有する少なくとも２つの上位にランク付けされたペプチド（赤色の太字）、またはそれぞれＭＡＳＣＯＴ スコア４４７（Ｐ＜０．０５）を有する少なくとも２つの上位にランク付けされたペプチドによる同定のうち１つを満たす場合、タンパク質のヒットが自動的にバリデートされた。偽陽性の比率を評価するために、すべての初回データベース検索を、ＭＡＳＣＯＴの「デコイ」を使用して実施した。偽陽性の比率が決して１％を超えなければ、結果は適切であると考えられる。

【0244】

ＯＦＦＧＥＬからのタンパク質の同定
大腸菌Ｋ１２のタンパク質の２４分画への高分解能の分離を、ＯＦＦＧＥＬ ｐＨ３−１０キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して３１００ ＯＦＦＧＥＬ フラクショネーターで行った。タンパク質の試料（４００μｇ）の調製およびＯＦＦＧＥＬシステムのすべての部品の組み立てを、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｑｕｉｃｋ ｓｔａｒｔ Ｇｕｉｄｅに記載される手順に従って行った。ＯＦＦＧＥＬ分画を、３０時間後に６４ＫＶｈに達するまで最大制限電流パラメータ（８０００Ｖ、５０μΑ、および２００ｍＷ）を用いて標準的なプログラムＯＧ２４ＰＲＯを使用して実施した。実験の最後に、すべての画分を、０．８ｍｌのディープウェル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，フランス イルキルシュ）に移し、−２０℃で保存した。ＯＦＦＧＥＬの中心部から回収した９個のタンパク質含有分画を、ウサギ抗α−ＭＳＨ ＩｇＧ（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用するウェスタンブロットにより調べた後、上述のようにタンパク質を同定した。

【0245】

マウスにおける免疫および行動
すべての実験プロトコルを、アメリカ国立衛生研究所のガイドラインおよびＥＵの指令（ＵＳ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ ＥＵ ｄｉｒｅｃｔｉｖｅｓ）に従い行い、動物実験は、施設内倫理委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）により承認された。２ヶ月齢の雄性Ｃ５７Ｂｌ６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，フランスラ・トゥーレット）を、１２時間の明暗周期（７００時間の光）で１週間動物施設に馴化させ、標準的なマウス保持ケージ（ｎ＝８）で維持した。マウスに、常時入手可能である飲料水と共に標準的なげっ歯類固形飼料（ＲＭ１ ｄｉｅｔ，ＳＤＳ，ＵＫ）を自由に与え、毎日優しく保持して体重を測定した。馴化の最中にマウスを、ケージあたりのマウスあたりの平均体重が類似するように４つのケージに分けた。１週間馴化した後、各ケージのマウスを、４つの試験群の１つに割り当て、以下の処置：（（ｉ）群１、ＣｌｐＢ免疫（ｎ＝８）：ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ベルギーゴスリ）５０μｇ／マウスを、完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ，米国ミズーリ州セントルイス）とＰＢＳの１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）混合物２００μｌ中で腹腔内（ｉ．ｐ）投与；（ｉｉ）群２、アジュバント注射対照（ｎ＝８）：完全フロイントアジュバントを含むＰＢＳ（１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ），ｉ．ｐ．）２００μｌ；（ｉｉｉ）群３；ＰＢＳ注射対照（ｎ＝８）：２００μｌのＰＢＳ（ｉ．ｐ）；および（ｉｖ）群４、未処置の対照（ｎ＝８）：注射をしていない）を行い、次にすべてのマウスを保持ケージに戻した。１５日後、マウスに、追加免疫を行い、以下の処置：（（ｉ）群１（ｎ＝８）、ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）５０μｇ／マウスを含む不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ）とＰＢＳの１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）混合物２００μｌのｉ．ｐ．；（ｉｉ）群２（ｎ＝８）；不完全フロイントアジュバントを含むＰＢＳ２００μｌ（１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ），ｉ．ｐ．）；（ｉｉｉ）群３（ｎ＝８）：ＰＢＳ２００μｌ（ｉ．ｐ．）；およびｉｖ）群４（ｎ＝８）：注射投与なし）を行った。追加免疫の翌日に、自動給餌モニタをそれぞれ備えるＢｉｏＤＡＱマウスケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．，米国ニュージャージー州ニューブランズウィック）にマウスを個々に入れた。食料（Ｓｅｒｌａｂ， フランス、モンタテール）および飲料水を自由に入手可能な状態にし、体重を毎日測定した。ＢｉｏＤＡＱケージに３日間馴化させた後に、マウスに以下の処置：（（群１、２、および３（それぞれｎ＝８）すなわちＣｌｐＢで免疫したマウスに、アジュバントおよびＰＢＳをそれぞれ注射し、すべてのマウスにα−ＭＳＨペプチド（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ）１００μｇ．ｋｇ^−１ 体重を含むＰＢＳ１００μｌ（ｉ．ｐ．）を、１０００時間目に急性的に注射した）を行った。対照のマウス（ｎ＝８）にはＰＢＳのみ（ｉ．ｐ．）を投与した。給餌データを、ＢｉｏＤＡＱ データビューワー２．３．０７（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）を使用して連続的にモニターして分析した。食事のパターン分析のため、食事の間隔を、３００秒に設定した。

【0246】

給餌試験の後、マウスを、食料および水を自由に入手可能な個々のマウス保持ケージに入れ、２日間連続して行ったＯ迷路（Ｍｅｄ Ａｓｓｏｃｉａｔｅ， Ｉｎｃ．， 米国バーモント州セントオールバンズ）試験において自発運動活性および不安について分析した。Ｏ迷路試験から２時間後に、マウスをギロチンでの頭部切断により屠殺し、体躯の血液をＥＤＴＡ含有チューブに回収した。血漿を、３５００ｒｐｍ（１．４ｇ）、４℃で１５分間遠心分離することにより分離し、アッセイするまで−８０℃で保存した。

【0247】

自発運動活性および不安の試験
ＢｉｏＤＡＱケージでの給餌試験の後に、マウスを、Ｖｅｒｓａｍａｘ動物活性モニター（ＡｃｃｕＳｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．，米国、オハイオ州コロンバス）を使用して自発運動活性に関して分析した。自発運動活性試験の翌日に、すべてのマウスを、高架式Ｏ迷路での不安に関して試験した。高架式Ｏ迷路は、げっ歯類の不安を試験するために薬理学的に検証されたより一般的に使用される高架式十字迷路法の変形である。Ｏ迷路の利点は、従来の十字迷路の曖昧な中心の四角がない点である。Ｏ迷路は、床から８０ｃｍの高さの円形の赤外線プラットフォームからなり、灰色のプラスチック製の２つのオープン区画および２つのクローズド区画を特徴とした。クローズド区画は、迷路の表面から２０ｃｍ上に延びた壁により囲まれており、黒色の赤外線プレキシグラスのふたで覆われていた。各試験を、２つのクローズド区画の一方にマウスを配置することにより開始した。試験は５分間続行し、Ｏ迷路の上方に配置したビデオカメラおよびＥｔｈｏＶｉｓｉｏｎビデオ追跡ソフトウェア（Ｎｏｌｄｕｓ ＩＴ、オランダヴァーヘニンゲン）を使用して記録した。開口部および閉鎖部で費やした距離および時間の測定値を分析した。それぞれのマウスの試験のあいだに、Ｏ迷路を３０％のエタノールで清潔にした。

【0248】

ＣｌｐＢおよびα−ＭＳＨ自己抗体アッセイ
ＣｌｐＢ、α−ＭＳＨ、および副腎皮質刺激ホルモンと反応する自己抗体Ａｂｓの血漿中レベルを、公開されているプロトコル（Ｆｅｔｉｓｓｏｖ ＳＯ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｂｉｏｌ Ｍｏｌ ２０１１）に従って酵素結合免疫吸着測定法を使用して測定した。簡潔に説明すると、ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、α−ＭＳＨ、または副腎皮質刺激ホルモンペプチド（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ）を、１００ｍＭのＮａＨＣＯ_３バッファー中１００μｌおよび２μｇ／ｍｌの濃度（ＰＨ９．６）で使用して、９６ウェルのＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ， ニューヨーク州ロチェスター，ＵＳＡ）の上に４℃で７２時間コーティングした。プレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２００を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し（５分間、３回）、次にＰＢＳで１：２００に希釈したマウス血漿１００μｌと共に４℃で一晩インキュベートして遊離の自己抗体のレベルを決定するか、または解離性の３ＭのＮａＣｌおよび１．５Ｍのグリシンバッファー（ｐＨ８．９）で１：２００に希釈して総自己抗体のレベルを決定した。プレートを洗浄し（３回）、１００μｌのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）コンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（１：２０００）または抗マウスＩｇＭ（１：１０００）と共にインキュベートした。これらはすべてＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．（米国ペンシルベニア州ウェスト・グローブ）から入手した。洗浄（３回）を行った後、１００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（Ｓｉｇｍａ）を、ＡＰの基質として添加した。室温で４０分間インキュベートした後、３ＮのＮａＯＨを添加することにより、反応を停止させた。吸光度をマイクロプレートリーダーＭｅｔｅｒｔｅｃｈ ９６０（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ Ｉｎｃ．， 台湾、台北市）を使用して４０５ｎｍで決定した。血漿試料を添加していないプレートの読み取りから得たブランクの吸光度の値を、試料の吸光度の値から除算した。各決定を２回の反復実験で行った。反復実験値間の変動は、５％未満であった。同様のプロトコルを使用して、対応する抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭ ＡＰコンジュゲート抗体（１：２０００， Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用して、ヒト血漿（１：４００）中の抗ＣｌｐＢのＩｇＧおよびＩｇＭを測定した。

【0249】

α−ＭＳＨによるＣｌｐＢ抗体の吸収
ＰＢＳで１：２００に希釈したマウスの血漿試料、またはＰＢＳで１：４００に希釈したヒトの血漿試料を、４℃で一晩１０^−６Ｍのα−ＭＳＨペプチド（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ）と共にプレインキュベートした後、試料を、ＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）でコーティングした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）に添加した。ＣｌｐＢと反応性であるＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を、対応する上述の抗マウスまたは抗ヒトＡＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を使用する酵素結合免疫吸着測定法により検出した。α−ＭＳＨと交差反応性のＣｌｐＢ抗体のパーセンテージを、１００％に等しい個々のそれぞれの血漿試料中で吸収することなく検出した抗ＣｌｐＢ抗体のレベルと比較して計算した。

【0250】

血漿からのＩｇＧの精製
ＩｇＧの精製および親和性のアッセイを、公開されているプロトコル（Ｌｅｇｒａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｏｃ Ｅｘｃｈ ２０１４， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｐｒｏｔｅｘ２０１４．００４）に従って行った。血漿グロブリンの抽出を、Ｃ１８ＳＥＰカラム（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， 米国カリフォルニア州バーリンゲーム）上での血漿の酸性化および分離により行い、次にマウスの血漿５００μｌをバッファーＡ（１％のトリフルオロ酢酸水溶液）５００μｌと混合した。カラムを、７００ｒｐｍで３分間の遠心により１ｍｌのバッファーＢ（６０％のアセトニトリルの１％トリフルオロ酢酸溶液）中で活性化し、バッファーＡ ３ｍｌで３回すすいだ。希釈した血漿（Ａバッファーに１：１で希釈）をカラムに添加し、溶離液（１ｍｌ）をＩｇＧのさらなる精製のため保存した（−２０℃で凍結保存）。総ＩｇＧを、Ｍｅｌｏｎ Ｇｅｌキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国イリノイ州ロックフォールド）を使用してマウス血漿試料の溶離液から精製した。キットの精製バッファーで１：４に希釈した血漿の溶離液を、カラムに沈着させた洗浄済みのｍｅｌｏｎ ｇｅｌ上に添加した。カラムを６０００ｒｐｍで１分間スピンさせ、ＩｇＧ含有溶離液を残して−２０℃で凍結保存した後、凍結乾燥した。凍結乾燥したＩｇＧを、ＨＢＳ−ＥＰバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ， 米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）で再構成した。環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）の実験のため、ＣｌｐＢ群およびアジュバント対照群の８匹のマウスから精製したＩｇＧを、それぞれ、２つに分けた２つのプールにそれぞれ混合した。１つのパートをｃＡＭＰアッセイに直接使用し、もう一方を、活性化したＵｌｔｒａＬｉｎｋビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ，米国イリノイ州ロックフォールド）にコーティングしたα−ＭＳＨ（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ）に対するアフィニティクロマトグラフィーを使用することによりさらに精製した。α−ＭＳＨ ＩｇＧを枯渇させたＩｇＧ溶離液を保存し、凍結乾燥し、ＰＢＳで希釈した。

【0251】

親和性動態アッセイ
ＣｌｐＢおよびα−ＭＳＨに関するマウスＩｇＧの親和性動態を、ＢＩＡｃｏｒｅ １０００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）での表面プラズモン共鳴現象に基づく生体分子特異的相互作用分析により決定した。α−ＭＳＨ（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ）またはＣｌｐＢタンパク質（Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．０）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中０．５ｍｇ．ｍｌ^−１に希釈し、アミンカップリングキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用することによりセンサーチップＣＭ５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に共有結合させた。すべての測定を、同じα−ＭＳＨまたはＣｌｐＢコーティングチップで実施した。親和性動態分析では、８４０ｎｍｏｌおよびブランクの試料（ＨＢＳ−ＥＰバッファーのみ）の２回の反復実験を含む、各ＩｇＧの試料の５つの段階希釈液：３３６０、１６８０、８４０、４２０、および２１０（ｎｍｏｌ）についてマルチサイクル法を実行した。各サイクルは、２分間の分析物の注射と、流速３０μｌ／分での２５℃、５分間の解離を含んだ。

【0252】

各試料の注射の間、結合表面を、１０ｍＭのＮａＯＨで再生し、センサーグラムの同じベースラインレベルを得た。親和性動態のデータを、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ ．１プログラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して分析した。動態データを適合させるために、Ｌａｎｇｍｕｒの１：１のモデルを使用し、ブランクの値を減算することにより、試料の値を補正した。

【0253】

Ｉｎ ｖｉｔｒｏでのｃＡＭＰアッセイ
ヒトＭＣ４Ｒを発現するヒト胎児腎２９３細胞の安定した細胞株を、レンチウイルスの形質導入技術を使用して作製し、Ａｍｓｂｉｏ（英国、オクソン）から購入した。トランスフェクトした細胞中のＭＣ４Ｒ ｍＲＮＡの高い発現を、Ａｍｓｂｉｏおよび本出願人の研究室での逆転写ＰＣＲによりバリデートした。各実験の前に細胞中のトランスジーンの存在を、ＭＣ４Ｒレンチウイルスベクターと同じ状況ではあるが、異なるプロモーターの下で遺伝子を挿入した緑色蛍光タンパク質の蛍光顕微鏡での可視化により確認した。α−ＭＳＨペプチド（Ｂａｃｈｅｍ ＡＧ）を、誘導バッファー：ＰＢＳ、５００μΜのＩＢＭＸ、１００μΜのＲＯ ２０−１７２４（Ｓｉｇｍａ）、２０ｍＭのＭｇＣｌ_２中で、それぞれ、０．６、３、４．５、６、１５、３０、４５、６０および１２０ｐｍｏｌのα−ＭＳＨの用量に対応する２、１、７５０、５００、２５０、１００、７５、５０および１０ｎＭの最終濃度に希釈した。同様に、１つのブランクの試料を含めた。解凍した後、湿潤細胞培養インキュベーターにおいて、２５０ｍｌの組織培養フラスコ（ＢＤ−Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ 米国マサチューセッツ州ベドフォード）中で、（２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％の胎児仔ウシ血清、０．１ｍＭの非必須アミノ酸および１％のペニシリン‐ストレプトアビジン）を補充したダルベッコ変法イーグル培地４．５ｇ．ｌ^−１グルコース（Ｅｕｒｏｂｉｏ，フランス、クールタブフ）で細胞を８〜１０日間、３７℃および５％のＣＯ２で培養した。実験日に、培養したＭＣ４Ｒヒト胎児腎２９３細胞を、０．２５％のトリプシン‐ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で処理し、細胞のペレットをＰＢＳに再懸濁して、無処置のバイオルミネセンス白色９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ，デンマーク、ロスキレ）中に、ウェル（１０μｌ）あたり５０００個の細胞を得た。生物発光アッセイｃＡＭＰ−Ｇｌｏ Ｍａｘアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，米国ウィスコンシン州マディソン）を、製造社の説明書に従って使用して、ｃＡＭＰの産生を測定した。簡潔に説明すると、細胞を、異なる濃度のα−ＭＳＨペプチド単独、またはＣｌｐＢ免疫群もしくはアジュバント対照群からのマウスのＩｇＧプールとα−ＭＳＨとを共に室温で１５分間インキュベートし、これらはα−ＭＳＨの直前に細胞に添加した。ｃＡＭＰ標準物質（キットにより提供）の段階希釈液を同じマイクロプレートでアッセイした。ｃＡＭＰ検出溶液を各ウェルに添加し、次に細胞を、撹拌してホモジナイズし、２分間、１０００ｒｐｍで遠心沈降させ、次に２３℃で２０分間インキュベートした。キナーゼ‐Ｇｌｏ試薬の基質を各ウェルに添加し、２３℃で１０分間インキュベートした後、発光を、バイオルミネセンス機器（Ｓａｆａｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ、モナコ）で読み取った。各希釈液の３回の試験を、別々のウェルで実施し、別の日に２回反復し、天然のＩｇＧを使用する場合のｃＡＭＰ活性化の曲線の各点でＮ＝６を得た。α−ＭＳＨ ＩｇＧ画分からの天然のＩｇＧを枯渇させた後、上述の各α−ＭＳＨの濃度およびＩｇＧで、同じ実験を行った。

【0254】

マウスにおける大腸菌の強制経口投与
１か月齢のＣ５７Ｂｌ６マウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、動物施設に１週間馴化させ、上述のように維持した。マウスを以下の４つの群（それぞれｎ＝８）に分けた：（ｉ）１０８個の大腸菌Ｋ１２細菌の強制経口投与；（ｉｉ）ＣｌｐＢを欠損する１０８個の大腸菌Ｋ１２細菌の強制経口投与；（ｉｉｉ）ＬＢ培地のみの強制経口投与；（ｉｖ）いかなる治療も受けていない対照。ＣｌｐＢ変異細胞株は、Ｂｅｒｎｄ Ｂｕｋａｕの研究室（ＺＭＢＨ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ドイツハイデルベルク）で作製され、Ｄｒ Ａｘｅｌ Ｍｏｇｋにより、対応する野生型（ＷＴ）の大腸菌の細胞と共に供与された。マウスを個々にＢｉｏＤＡＱケージ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ）に入れ、細菌を含む、または含まない０．５ｍｌのＬＢ培地を、暗サイクルの始まる前に強制経口投与により２１日間毎日投与した。強制経口投与の最終日に、マウスの糞便を回収し、凍結した。強制経口投与の後、マウスを断頭により屠殺し、体躯の血液を、ＥＤＴＡ含有チューブに回収した。血漿を、４℃で１０分間３５００ｒｐｍで遠心することにより分離し、アッセイするまで−８０℃で保存した。抗ＣｌｐＢおよび抗α−ＭＳＨ ＩｇＧおよびＩｇＭの血漿中レベルを上述のようにアッセイした。

【0255】

ＣｌｐＢ ＤＮＡアッセイ
ＤＮＡを、ＷＴおよびＣｌｐＢの変異細胞株の培養物から抽出した。同様に、ＱＩＡａｍｐＲ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、フランス）を使用してマウスの糞便からも精製した。細菌を水に溶解し、５分間１００℃で煮沸し、１１，０００ｒｐｍで１分間遠心沈降させた後、ＤＮＡを含有する上清を−２０℃で保存した。ＮＣＢＩプライマー設計ツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｉｍｅｒ−ｂｌａｓｔ／）を使用して、本出願人は、同定された１つのα−ＭＳＨ様エピトープを含むＣｌｐＢタンパク質フラグメントをコードする１８０塩基対のＤＮＡ領域を増幅する以下のヌクレオチドプライマーを設計した（図１ｅ）：フォワード：５’−ＧＣＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＣＴＡ−３’（配列番号：４）およびリバース：５’−ＡＣＣＧＣＴＴＣＧＴＴＣＴＧＡＣＣＡＡＴ−３’（ＳＥＤＩＤＮＯ：５）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｕｓｔｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ，フランスセルジー ポンドワーズ）。ＰＣＲを、ＭｉｃｒｏＡｍｐチューブ（エッペンドルフ，ドイツハンブルク）中でサーマルサイクラーにおいて実施した。反応を、２５μｌのＧｏ Ｔａｑ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ２×（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１μｌ（２０ｐｍｏｌ）の各プライマー、２１μｌの２回蒸留水、および１μｌの細菌ＤＮＡを含む５０μｌ容量で行った。ＰＣＲの条件は以下の通りであった：９４℃で３分間の後に、３０秒で９４℃、３０秒で６０℃、および１．５分で７２℃を３５サイクル。ＰＣＲ生成物を、１％のアガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）で可視化し、予想サイズ１８０塩基対および特異性を、ＣｌｐＢ変異細胞株を使用してバリデートした。

【0256】

細菌ＣｌｐＢタンパク質の血漿中濃度
細菌ＣｌｐＢの血漿中濃度を、以下のプロトコルに従い酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（ベルギーゴスリ）によりカスタム生成されたウサギポリクローナル抗ＣｌｐＢ ＩｇＧを、１００ｍＭのＮａＨＣＯ_３バッファー（ｐＨ９．６）中で１００μｌおよび２μｇ／ｍｌの濃度を使用して９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ， ニューヨーク州ロチェスター）に、４℃で２４時間コーティングした。プレートを、０．５％のＴｗｅｅｎ ２００（ｐＨ７．４）を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄（５分間×３）した。標準物質としてのＤｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによりカスタム生成された組み換えＣｌｐＢタンパク質を、サンプルバッファー（ＰＢＳ、アジ化ナトリウム０．０２％、ｐＨ７．４）中で５、１０、２５、５０、７０、１００、および１５０ｐＭに段階希釈し、２回の反復実験でウェルに添加した。摂食障害の患者および健康な対照からの血漿試料（サンプルバッファー中１：２５）を、２回の反復実験で残りのウェルに添加し、ＣｌｐＢの標準物質および血漿試料を室温（ＲＴ）で２時間インキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２００（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳで洗浄した（５分間×３）。Ｄｅｌｐｈｉ Ｇｅｎｅｔｉｃｓによりカスタム生成され、α−ＭＳＨと交差反応性がないようにあらかじめ選別したマウスモノクローナル抗ＣｌｐＢ ＩｇＧ（サンプルバッファー中１：５００）をウェルに添加し、室温で９０分間インキュベートした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ ２００（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳで洗浄した（５分間×３）。Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ（ペンシルベニア州ウェスト・グローブ）製の、アルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（サンプルバッファー中１：２０００）をウェルに添加し、室温で９０分間インキュベートした。プレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２００（ｐＨ７．４）を含むＰＢＳで洗浄し（５分間×３）、次に１００μｌのｐ−ニトロフェニルリン酸溶液（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）を、アルカリホスファターゼの基質として添加した。室温で４０分間インキュベートした後、反応を、３ＮのＮａＯＨを添加することにより停止させた。マイクロプレートリーダーＭｅｔｅｒｔｅｃｈ ９６０（Ｍｅｔｅｒｔｅｃｈ Ｉｎｃ、台湾、台北市）を使用して、吸光度（ＯＤ）を４０５ｎｍで決定した。血漿試料またはＣｌｐＢタンパク質標準物質希釈液を添加していないプレートの読み取りから得たブランクのＯＤ値を、試料のＯＤ値から減算した。ＣｌｐＢの血漿中濃度を、ＣｌｐＢ標準曲線のＯＤに基づき計算し、血漿の希釈に関して補正した。

【0257】

統計分析
データを分析し、グラフを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ ソフトウェア Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州サンディエゴ）を使用してプロットした。正規性を、コルモゴロフ‐スミルノフ検定により評価した。群の差異を、正規性の結果に従って、テューキーまたはダンの事後検定を用いた分散分析（ＡＮＯＶＡ）またはノンパラメトリックのクラスカル・ワリス検定により分析した。体重の変化を、二元配置繰り返し測定の分散分析およびボンフェローニの事後検定で分析した。個々の群を、正規性の結果に従って、スチューデントのｔ検定またはマン・ホイットニー検定を使用して比較した。α−ＭＳＨによるＣｌｐＢ抗体の吸収作用を、対応のあるｔ検定を使用して分析した。ピアソンまたはスピアマンの相関係数を、変数の正規性に従い計算した。ｃＡＭＰの産生を、非線形回帰適合（ｌｏｇ（α−ＭＳＨ）対正規化ｃＡＭＰ応答）を使用して分析し、この等式はＹ＝１００／（１＋１０（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ×ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ）であった。データは、平均値±標準偏差として示されており、すべての検定でｐ＜０．０５は、統計的に有意であると考えられた。

【0258】

結果
細菌α−ＭＳＨ模倣体のプロテオミクスの同定
α−ＭＳＨに対して分子模倣性を有する細菌タンパク質を同定するために、プロテオミクス技術に基づく研究戦略を開発した。総タンパク質を、大腸菌Ｋ１２培養物から抽出し、細胞質分画を、２Ｄゲル電気泳動（図１ａ）により分離し、フッ化ポリビニリデンのメンブレンに移した。細菌タンパク質における多数のα−ＭＳＨ様エピトープの検出の可能性を上げるために、メンブレンを、ポリクローナル抗α−ＭＳＨＩｇＧを用いて明らかにした。１３個の免疫陽性タンパク質のスポットが見出され（図１ｂ）、このうちスポット１〜８は、１０^−６Ｍのα−ＭＳＨによって抗体をあらかじめ吸着させた後に消失し（図１ｃ）これにより特異的α−ＭＳＨ模倣体エピトープが確認された。質量分析を使用して、最も強力なα−ＭＳＨ様染色を示すタンパク質のスポット１、２、３、および４は、ＣｌｐＢ、ａ８５７−ａ．ａタンパク質、すなわち８５７アミノ酸タンパク質脱凝集シャペロン、またはＣｌｐＢ（ＭＷ ９５５２６）（分子量：９５５２６Ｄａ、アクセッション番号：ＮＰ＿４１７０８３．１、配列番号：１）と命名される熱ショックタンパク質のアイソフォームとして同定された。より強度の低い染色されたα−ＭＳＨ様スポット５〜８（それぞれ８８０、８７７、８７４、および８００の最高ＭＡＳＣＯＴスコアを有する）は、５４８ａ．ａタンパク質シャペロンＧｒｏＥＬ(分子量：５７２９３Ｄａ；アクセッション番号：ＹＰ＿００１７３２９１２．１)のアイソフォームであった。大腸菌タンパク質の分離の代替戦略も、同様に、ＯＦＦＧＥＬ フラクショネーターの後に１次元ゲル電気泳動、およびα−ＭＳＨであらかじめ吸着または吸着されていない抗α−ＭＳＨ ＩｇＧによるウェスタンブロットを使用して、使用した（データは示していない）。１つのバンドが、抗α−ＭＳＨ ＩｇＧにより特異的に認識され、ＣｌｐＢタンパク質を含むことが見出された（最高ＭＡＳＣＯＴスコア：１０６５）。これら結果に基づき、ＣｌｐＢを、α−ＭＳＨとの分子模倣体のさらなるバリデーションのための標的タンパク質として選択した。α−ＭＳＨと細菌ＣｌｐＢとの間のアミノ酸配列相同性を解析するために、両方の配列を、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／）を使用するＥｍｂｏｓｓ Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒプログラムでアライメントした。このアライメントにより、α−ＭＳＨとの不連続なアミノ５個の配列相同性を示すＣｌｐＢタンパク質の部位が明らかとなった（図１ｄ）。この推定上のα−ＭＳＨ様エピトープは、ＣｌｐＢタンパク質の構造のらせん間ループに位置し、このことはタンパク質の表面に暴露されることを示し、すなわち、自己抗体結合のために近づくことができることを示した。抗α−ＭＳＨ ＩｇＧにより明らかにされた組み換えＣｌｐＢタンパク質のウェスタンブロットにより、９６ｋＤａのバンドを示し（図１ｅ）、これにより、ＣｌｐＢタンパク質がα−ＭＳＨ様エピトープを含むことが確認された。これらの結果は、分子模倣体の概念に従う少なくとも５連続アミノ酸配列の相同性の存在が、細菌タンパク質が、神経ペプチドと交差反応性であるＩｇＧにより認識されるために必須の条件ではないことを示す。

【0259】

ＣｌｐＢを用いたマウスの免疫
大腸菌のＣｌｐＢがα−ＭＳＨと交差反応性である自己抗体であり、食行動および不安に影響するか否かを試験するために、マウスを組み換え細菌ＣｌｐＢタンパク質で免疫した。アジュバントを含むＣｌｐＢまたはアジュバントのみを投与したマウスは、注射後数日間、より低い体重を示した（図２ａ）。しかしながら、４週間後、ＣｌｐB免疫マウスは、対照と比較して高い体重を有した（＋５％）（図２ａ）。少なくとも１０日間の実験の間測定した平均１日食物摂取量も同様に、他の群と比較して、ＣｌｐＢ免疫マウスにおいて増加した（図１３％）（図２ｂ）。食事の回数は変化しなかったため（図２ｄ）、食物摂取の増加は、食事量の増加によるものであり（図２ｃ）、ＣｌｐＢ免疫が、空腹機構よりむしろ満腹感に干渉したことを示している。これは、満腹感を誘導するα−ＭＳＨの既知の役割と一致するものである。α−ＭＳＨ食欲不振誘発作用に対するＣｌｐＢ免疫の関連性をさらにバリデートするために、マウスにα−ＭＳＨをｉ．ｐ．注射した。２４時間後では、食物摂取量および体重は、ＣｌｐＢ免疫化マウスにおいて影響を受けず（図２ｅ）、これは、マウスが、非免疫マウスに存在する投与されたα−ＭＳＨの食欲不振誘発性作用に感受性ではないことを示した。給餌実験の後、マウスの自発運動活性および不安に関連する行動を、オープンフィールドおよびＯ迷路試験で試験した。総自発運動活性およびオープン領域対境界領域で費やした時間は、試験群間で有意差はなかった（データは示していない）。しかしながら、Ｏ迷路のクローズドアームでは、ＣｌｐＢ免疫マウスは、対照と比較してより短い距離を移動し（データは示していない）、他のすべての群と比較して短い時間を費やし（データは示していない）、このことから、不安の減少が示された。免疫の有効性を確認するために、抗ＣｌｐＢ ＩｇＧの血漿中レベルをアッセイし、その親和性を測定した。ＣｌｐＢ免疫マウスでは、より親和性の低い（図２ｇ）抗ＣｌｐＢ ＩｇＧレベルの強い増加（図２ｆ）が見いだされ、近年のＩｇＧの誘導と一致した。α−ＭＳＨ反応性ＩｇＧの血漿中レベルの増加もまた、ＣｌｐＢ免疫マウスで見出された（図２ｈ）；これらのＩｇＧは、同様に、対照と比較してα−ＭＳＨに対する低い親和性を特徴とした（図２ｉ）。α−ＭＳＨによるマウスの血漿の吸着は、抗ＣｌｐＢ ＩｇＧの血漿中レベルを有意に減少さ、抗ＣｌｐＢ ＩｇＧのすべてではない一分画がα−ＭＳＨと交差反応性であることを確認した（図２ｆ）。α−ＭＳＨ ＩｇＭの自己抗体の血漿中レベルは、群の間で有意差はなかった（データは示していない）。ＣｌｐＢ免疫が、副腎刺激ホルモンと交差反応する自己抗体を誘導し得るか否かによらず、α−ＭＳＨ配列を含有するアミノ酸３９個のペプチドも同様に解析した。血漿中の副腎皮質刺激ホルモン反応性ＩｇＧに有意差は見出されず（データは示していない）、ＣｌｐＢとα−ＭＳＨとの間で立体構造模倣体の選択性を示した。

【0260】

ＭＣ４Ｒシグナリングに及ぼすマウスのＩｇＧ作用
ＭＣ４Ｒシグナリングに及ぼす、ＣｌｐＢ免疫誘導型α−ＭＳＨ交差反応性ＩｇＧの影響を決定するために、ＭＣ４Ｒ発現細胞におけるα−ＭＳＨ誘導型ｃＡＭＰ産生に及ぼすそれらの作用を試験した。α−ＭＳＨをＣｌｐＢ免疫マウス由来のＩｇＧと共にプレインキュベートした場合、α−ＭＳＨ単独、またはアジュバント注射マウス由来のＩｇＧとプレインキュベートしたα−ＭＳＨと比較して、ｃＡＭＰの濃度が低いことが見出され、２つのα−ＭＳＨの最高濃度での減少は８〜１０％であった（図２ｊ）。プールしたＩｇＧからα−ＭＳＨ反応性ＩｇＧを枯渇させた後、ＣｌｐＢ免疫マウス由来の残りのＩｇＧはα−ＭＳＨ誘導型ｃＡＭＰの放出に全く作用を示さず（図２ｋ）、これは、ＣｌｐＢ免疫マウスにおける抗α−ＭＳＨ交差反応性ＩｇＧが、α−ＭＳＨに応答するｃＡＭＰ産生の低下の原因であることを示した。よって、ＭＣ４Ｒの活性化およびシグナリングの減少は、ＣｌｐＢ免疫マウスで観察される食物摂取の増加および不安の減少を説明し得るものである。

【0261】

マウスにおける大腸菌の強制経口投与
大腸菌が、ＣｌｐＢタンパク質に対する免疫原性の応答を誘導し、α−ＭＳＨと交差反応性である抗ＣｌｐＢ自己抗体の産生をもたらし得るか否かを試験するために、大腸菌Ｋ１２の野生型およびΔＣｌｐＢ株を、強制経口投与によりマウスに３週間毎日与えた。別のマウスの群には、細菌培養物の培地のみを強制経口投与して、対照群にはいずれの処置も行わなかった。強制経口投与の最初は、野生型大腸菌を投与したマウスにおいて体重および食物摂取量の減少を伴ったが、その後対照レベルへと徐々に回復した（図３ａおよびｂ）。再度、強制経口投与の最終週では、野生型大腸菌を投与したマウスにおいて給餌パターンが影響を受け、食事量の減少を示したが、食事の回数は増加した（図３ｃおよびｄ）。顕著に、ΔＣｌｐＢ大腸菌を投与したマウスは、いずれの時点でも、体重の増加、食物摂取量、または給餌パターンのいずれにおいても対照と有意差がなかった。これらのデータは、宿主の食物摂取量の急性的な減少、ならびに大腸菌感染後の給餌パターンの長期的調節に細菌ＣｌｐＢが特異的に関与していることを裏付けるものである。予測されるように、ＣｌｐＢのＤＮＡは、野生型大腸菌を投与されたマウスの糞便にはより多く存在したが、一部の対照マウスでは低いレベルが検出された（図３ｅ）。強制経口投与の３週間後、抗ＣｌｐＢ ＩｇＭおよびＩｇＧの両方の血漿中レベルは、対照およびΔＣｌｐＢ大腸菌群と比較して野生型大腸菌を投与したマウスで増加した（図３ｆおよびｇ）。α−ＭＳＨによる血漿の吸着は、野生型大腸菌を強制経口投与したマウスにおける抗ＣｌｐＢ ＩｇＧのレベルを減少させ（図３ｇ）、このことは、α−ＭＳＨと交差反応性である抗ＣｌｐＢ ＩｇＧの存在を示すものである。興味深いことに、抗ＣｌｐＢ自己抗体のＩｇＭクラスの血漿中レベルは、α−ＭＳＨによる吸着後に増加し、これはα−ＭＳＨが、野生型大腸菌の強制経口投与マウスで増加したＣｌｐＢと交差反応性であるα−ＭＳＨ ＩｇＭ免疫複合体の解離を引き起こしたことを示唆している（図３ｆ）。抗α−ＭＳＨ ＩｇＭの血漿中レベルもまた、他のすべての群と比較して野生型大腸菌の送達により増加したが（図３ｈ）、抗α−ＭＳＨ反応性ＩｇＧは、ごくわずかに増加したに過ぎず、有意性に達しなかった（図３ｉ）。しかしながら、α−ＭＳＨ ＩｇＧの親和性動態解析は、会合または解離の比率が有意に変化することなく（データは示していない）、大腸菌を強制経口投与で投与したマウスでは平衡解離定数の値がより低いことが明らかとなった（図３ｊ）。α−ＭＳＨ反応性自己抗体のＩｇＭクラスのレベルの増加を含むこれらの変化は、新規抗原に関するＣｌｐＢに対する免疫応答を反映し得る。実際、野生型大腸菌を投与していないマウスの糞便においてＣｌｐＢ ＤＮＡのレベルが低いか又は検出不能であることは、ＣｌｐＢ発現微生物が、試験したマウスにおいて主要な腸内共生細菌ではなかったことを示している。よって、食事量および体重増加に関連する低親和性抗α−ＭＳＨ ＩｇＧのレベルの増加を示したＣｌｐＢ免疫化マウスとは対照的に、大腸菌を強制経口投与したマウスは、抗α−ＭＳＨ反応性ＩｇＭおよびＩｇＧの両方の産生の増加を示し、食事量および体重の減少に関連する親和性が増加した。

【0262】

ＥＤ患者における抗ＣｌｐＢ抗体
α−ＭＳＨ交差反応性自己抗体の産生を刺激する大腸菌ＣｌｐＢタンパク質の能力をバリデートするため、次に、ＥＤに対する細菌性ＣｌｐＢの関連性を、ＡＮ、ＢＮ、またはＢＥＤの患者における抗ＣｌｐＢ抗体を試験することにより決定した。抗ＣｌｐＢ ＩｇＧおよびＩｇＭはいずれも、ＥＤ患者、ならびに健康な対照の血漿中で容易に検出可能であることが見出されたが、両者の平均レベルに有意な差異はなかった（図４ａおよびｂ）。しかしながら、すべての試験群で高い変動が存在し、これは、ＣｌｐＢ様抗原に直面した個体の既往が異なることを示している。ヒトの抗ＣｌｐＢ抗体が同様にα−ＭＳＨと交差反応性であるか否かを確認するために、血漿試料を、１０^−６Ｍのα−ＭＳＨによって吸着させると、すべての試験群で抗ＣｌｐＢ ＩｇＧおよびＩｇＭの検出可能なレベルの有意な減少をもたらした（図４ｃおよびｄ）。さらにα−ＭＳＨ交差反応性抗ＣｌｐＢ ＩｇＧの相対的なレベルは、ＥＤ患者の３つすべての群、特にＢＳおよびＢＥＤ対健康な対照で増加した（図４ｅ）。α−ＭＳＨ交差反応性抗ＣｌｐＢ ＩｇＭのレベルの増加は、ＢＮと比較してＡＮで見出された（図４ｆ）。ＥＤに対する抗ＣｌｐＢ ＩｇＧおよびＩｇＭの関連性をさらに決定するために、これらの血漿中レベルが、ＥＤ患者の行動特徴およびＥＤＩ−２により測定した対照と相関し得るか否を試験した。対照では、ＣｌｐＢ ＩｇＧは、数個の心理学的な特徴の正常な範囲と反比例するが、ＡＮ患者では、ＣｌｐＢ ＩｇＧのレベルは、身体の不満および痩せ願望などの中心となる精神病理学的特徴と正に相関することが見出された（表１）。さらに、ＡＮおよびＢＥＤ患者では、ＥＤＩ−２のサブスケールスコアがＣｌｐＢ ＩｇＭと正反対に相関し、ＡＮでは陰性であったが、ＢＥＤでは陽性であった（表１）。しかしながら、ＢＥＤ患者では、ＣｌｐＢ ＩｇＭが、年齢と負に相関し、抗ＣｌｐＢ ＩｇＭの最高レベルが、疾患の急性型に関連することが示唆された。明らかに、ＡＮ患者において、ＣｌｐＢ ＩｇＧまたはＩｇＭと、痩せ願望または対人不信との間に見出された相関は、それぞれ、同じ心理学的な特徴と、これまでの試験でのＡＮ患者の異なる群で見出されたα−ＭＳＨ反応性ＩｇＧまたはＩｇＭとの相関と厳密に類似であった。

【表2】

【0263】

細菌ＣｌｐＢタンパク質の血漿中濃度
ＣｌｐＢタンパク質は、１０ｐＭ〜１８０ｐＭの範囲で、すべての試験対象の血漿試料で検出され、健康な対照では、平均レベルが約３０ｐＭであった。ＣｌｐＢの平均血漿中レベルは、ＡＮ、ＢＮ、およびＢＥＤを含む摂食障害の患者のすべての群で有意に増加した（図５参照）。２標準偏差に等しいまたは２標準偏差を超える、診断上関連する濃度変化の一般的な基準を当てはめることにより、ＡＮの２１．７％、ＢＮの３２％、およびＢＥＤの２５％の患者が、血漿中ＣｌｐＢのレベルの増加を示した。

【0264】

結論
これら結果は、ＣｌｐＢ発現腸内細菌とＣｌｐＢタンパク質およびα−ＭＳＨと交差反応性の抗ＣｌｐＢ抗体の産生を介した動機づけ行動および感情の調節との間の分子的な関連を明らかにする。これらの結果は、腸内細菌叢の特異的変化が、ＥＤ患者で観察される行動および感情の異常をもたらし得ることを示している。ＥＤ患者においてＣｌｐＢタンパク質およびα−ＭＳＨと交差反応性の抗ＣｌｐＢ ＩｇＧのレベルが増加したこと、ならびに患者の精神病理学的な特徴と抗ＣｌｐＢ抗体が相関するという知見は、ＣｌｐＢ抗体の産生の増加、ならびに異常な摂食行動および感情の確立におけるＣｌｐＢ発現微生物の関与を裏付けるものである。

【0265】

結論として、これら結果は、ＣｌｐＢを、ＥＤ患者における精神病理学的特徴と関連するα−ＭＳＨと交差反応性の自己抗体起源の原因であるタンパク質と同定し、よって、Ｃｌｐ発現微生物をＥＤの診断および治療のための新規の特異的な標的として同定するものである。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3-1】

【図3-2】

【図3-3】

【図4】

【図5】

【配列表】

[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]