特許 6879480 新規の化合物、これを含む化粧料組成物および薬学的組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6879480

(24)【登録日】2021年5月7日

(45)【発行日】2021年6月2日

(54)【発明の名称】新規の化合物、これを含む化粧料組成物および薬学的組成物

(51)【国際特許分類】

   C07K 5/062 20060101AFI20210524BHJP

   A61K 8/64 20060101ALI20210524BHJP

   A61Q 19/02 20060101ALI20210524BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20210524BHJP

   A61K 38/05 20060101ALI20210524BHJP

   C07K 5/037 20060101ALI20210524BHJP

【ＦＩ】

   C07K5/062

   A61K8/64

   A61Q19/02

   A61P17/00

   A61K38/05

   C07K5/037

【請求項の数】17

【外国語出願】

【全頁数】39

(21)【出願番号】特願2019-111503(P2019-111503)

(22)【出願日】2019年6月14日

(65)【公開番号】特開2019-218343(P2019-218343A)

(43)【公開日】2019年12月26日

【審査請求日】2019年6月20日

(31)【優先権主張番号】10-2018-0069587

(32)【優先日】2018年6月18日

(33)【優先権主張国】KR

(31)【優先権主張番号】10-2019-0062620

(32)【優先日】2019年5月28日

(33)【優先権主張国】KR

(73)【特許権者】

【識別番号】519217135

【氏名又は名称】インコスファーム コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100116872

【弁理士】

【氏名又は名称】藤田 和子

(72)【発明者】

【氏名】チュン ファ−ジ

(72)【発明者】

【氏名】コー ミュン ホ

(72)【発明者】

【氏名】キム フン ジェ

(72)【発明者】

【氏名】キム スン ウ

(72)【発明者】

【氏名】ユン ソク ジョン

(72)【発明者】

【氏名】ジュン ジュ ヨン

(72)【発明者】

【氏名】シン カ ユン

(72)【発明者】

【氏名】ジョン セ キョ

(72)【発明者】

【氏名】パク キー ドン

【審査官】 福澤 洋光

(56)【参考文献】

【文献】 国際公開第２０１７／２２２３４５（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 国際公開第２０１３／１６２０１２（ＷＯ，Ａ１）

【文献】 特表２０１４−５１６９７２（ＪＰ，Ａ）

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ１２Ｎ １／００−１５／９０

ＣＡ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）

ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ）

ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）

ＰｕｂＭｅｄ

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩。

【化1】

前記化学式１中、
ＡＡは、置換または非置換のプロリンを含むアミノ酸残基である。

【請求項2】

前記ＡＡは、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルおよびカルボキシから選択される１つ以上の置換体で置換または非置換のプロリンを含むアミノ酸残基である、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【請求項3】

前記化学式１は、下記化学式２で表される、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【化2】

前記化学式２中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルであり；
Ｒ_２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。

【請求項4】

前記化学式１で表される化合物は、下記化学式３で表される、請求項１に記載の化合物またはその薬学的に許容される塩。

【化3】

前記化学式３中、
Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−１０アルキルであり；
Ｒ_４は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。

【請求項5】

下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、皮膚美白用化粧料組成物。

【化4】

前記化学式１中、
ＡＡは、置換または非置換のプロリンを含むアミノ酸残基である。

【請求項6】

前記有効成分は、
下記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ）である、請求項５に記載の皮膚美白用化粧料組成物。

【化5】

前記化学式２中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルであり；
Ｒ_２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。

【請求項7】

前記有効成分は、
下記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ）である、請求項５に記載の皮膚美白用化粧料組成物。

【化6】

前記化学式３中、
Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−１０アルキルであり；
Ｒ_４は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。

【請求項8】

前記有効成分は、
下記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ）と、下記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ）との混合物である、請求項５に記載の皮膚美白用化粧料組成物。

【化7】

【化8】

前記化学式２および化学式３中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルであり；
Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−１０アルキルであり；
Ｒ_２およびＲ_４は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。

【請求項9】

前記有効成分は、
１：０．１〜１：１の重量比（Ａ：Ｂ）で混合されている、請求項８に記載の皮膚美白用化粧料組成物。

【請求項10】

全重量に対して、前記有効成分を０．０００１〜１０重量％含む、請求項５から９のいずれか１項に記載の皮膚美白用化粧料組成物。

【請求項11】

下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む、メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物。

【化9】

前記化学式１中、
ＡＡは、置換または非置換のプロリンを含むアミノ酸残基である。

【請求項12】

前記有効成分は、
下記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ）である、請求項１１に記載のメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物。

【化10】

前記化学式２中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルであり；
Ｒ_２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。

【請求項13】

前記有効成分は、
下記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ）である、請求項１１に記載のメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物。

【化11】

前記化学式３中、
Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−１０アルキルであり；
Ｒ_４は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。

【請求項14】

前記有効成分は、
下記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ´）と、下記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ´）との混合物である、請求項１１に記載のメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物。

【化12】

【化13】

前記化学式２および化学式３中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルであり；
Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−１０アルキルであり；
Ｒ_２およびＲ_４は、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。

【請求項15】

前記有効成分は、
１：０．１〜１：１の重量比（Ａ´：Ｂ´）で混合されている、請求項１４に記載のメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物。

【請求項16】

前記メラニン色素の過剰沈着疾患は、
ソバカス、老人性色素斑、肝斑、シミ、茶色または黒のホクロ、日光性色素斑、青色黒皮症、薬物使用後の過剰な色素沈着、妊娠性褐色斑または炎症後の過剰な色素沈着である、請求項１１に記載のメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物。

【請求項17】

全重量に対して、前記有効成分を０．０００１〜１０重量％含む、請求項１１から１６のいずれか１項に記載のメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、新規の化合物、これを含む化粧料組成物および薬学的組成物に関し、より詳細には、オートファジー活性化によるメラノソーム分解を誘導し、角化細胞内へのエンドサイトーシスを抑制する新規の化合物、これを含む皮膚美白用化粧料組成物およびメラニン色素の過剰沈着疾患の予防および治療用薬学的組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

肌色は、大きく、メラニンの量、ヘモグロビン、カロチンなどによって決定されるが、このうち、メラニンが最も重要な役割をする。メラニンは、人の肌色を決定するだけでなく、皮膚保護作用の役割をするが、紫外線への過量露出、大気汚染、ストレス、炎症など外部環境変化によって、皮膚内に過剰に生成されると、色素沈着現象が起こり、肌色が黒くなるか、シミ、ソバカスなどの原因になることがある。前記の外部刺激要因のうち、紫外線が最大のメラニン生合成の刺激源であり、メラニンの生成に関連する様々な過程に影響を与えることがある。すなわち、紫外線は、メラニン生成細胞であるメラノサイトの活性促進、メラニン生合成刺激ホルモン分泌促進、メラニンの酸化促進またはチロシナーゼ活性促進などによって過剰なメラニン生成を誘導する主な要因として作用する。

【0003】

かかるメラニンの生合成は、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、ＴＲＰ−１（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ１）、ＴＲＰ−２（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、Ｐｍｅｌ１７などの様々な遺伝子とそれに相当する酵素の働きによって行われる。また、ａｌｐｈａ−ＭＳＨホルモン（α−Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＩＬ−１、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ−α）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）などのサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の相互作用に影響を受けている。

【0004】

現在開発されているほとんどの美白素材は、チロシナーゼ活性を抑制する素材である。しかし、チロシナーゼ活性を抑制する一部の美白素材は、白斑症、刺激およびアレルギー反応などの安全性の問題をもたらす。一例として、チロシナーゼを最も効果的に抑制すると知られているヒドロキシキノンの場合、メラノサイトを死滅させる副作用を有する知られている。そのため、チロシナーゼの発現とメラノサイトのメラニン含量に影響を与えず、且つ角化細胞内のメラニン細胞のエンドサイトーシスを調節する美白素材の開発が切実に求められる。

【0005】

オートファジー（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）は、細胞内のエネルギー源が枯渇するか、細胞内のストレス要因が過剰に生じたときに老朽化あるいは損傷した細胞内物質および器官を分解することで、エネルギー再生および損傷物質を除去するメカニズムであり、正常な細胞の維持を可能とするものを意味する。最近、様々な研究を経て、老化が進むほどまたは老化を加速化するほど細胞内のオートファジー活性が急減すると報告されている。すなわち、オートファジーを抑制した場合、細胞内に老朽化したミトコンドリアや誤って折り畳まれたタンパク質などが過剰に蓄積され、細胞内の自由ラジカルおよび酸化ストレスが増加することになり、結局、細胞死による遺伝子断片が生じ、この断片は、メラニン細胞を刺激することになり、メラノソームの成熟化および角質細胞への輸送が導かれると知られている。

【0006】

すなわち、オートファジー活性化により、細胞内の老朽化した物質および器官を分解してリサイクルし、抗酸化タンパク質の活性化により細胞死を予防し、変形したタンパク質と脂質およびミトコンドリアなどを迅速に除去することで、結果として細胞がより健康な状態で生存できる環境を提供し、メラノソームの成熟化要因を除去する。それだけでなく、最近の報告によると、肌色がオートファジー活性化により調節され、これにより人工皮膚の肌色が明るくなるという研究結果も報告されている。

【0007】

また、角化細胞から発現したプロテアーゼ−活性型受容体２（ＰＡＲ−２）が、メラノソームの角化細胞に流入されるエンドサイトーシスに関連しており、これによって色素沈着を調節できるという研究結果も報告されている。すなわち、トリプシンによるＰＡＲ−２の活性化は、色素沈着を誘発し、これは、色素の過剰沈着または肌の色ムラを誘発することがある。

【0008】

したがって、本発明者らは、オートファジー活性化により角化細胞内のメラノソームを効果的に分解し、皮膚色素沈着を効果的に抑制し、且つＰＡＲ−２抑制を促進してメラノソームの角化細胞内への流入を効果的に抑制できる新規の化合物およびこれを含む美白用途を提供するために本発明を完成するに至った。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ． Ａｕｔｏｐｈａｇｙ， ２００９， ５， ４， ５０２−５１０

【非特許文献2】Ｈｅａｒｉｎｇ ＆ Ｊｉｍｅｎｅｚ， Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９８７， １９（１２）， １１４１−７

【非特許文献3】Ｆｕｎａｓａｋａ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． １９９９， Ｊｕｌ；４０（７）， １３１２−６

【非特許文献4】Ｑｉ ｅｔ ａｌ． ＰＬＯＳ ｏｎｅ， ２０１２， ７， １０， ｅ４６８３４

【非特許文献5】Ｘｉｌｏｕｒｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｒａｉｎ， ２０１３， １３６， ２１３０−２１４６

【非特許文献6】Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ， ２０１４， １２４， ８， ３３１１−３３２４

【非特許文献7】Ｓｅｉｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０００， ２５４， ２５−３２

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

本発明の目的は、オートファジー活性化によるメラノソーム分解を誘導することができる新規の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供することにある。

【0011】

本発明の目的は、ＰＡＲ−２活性阻害によるメラノソームの流入を減少させることができる新規の化合物またはその薬学的に許容される塩を提供することにある。

【0012】

本発明の目的は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む皮膚美白用化粧料組成物を提供することにある。

【0013】

本発明の目的は、前記化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含むメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0014】

上述の目的のために、本発明では、オートファジー活性化によるメラノソーム分解を誘導することができる、下記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩が提供される。

【化1】

［前記化学式１中、
ＡＡは、置換または非置換のプロリンを含むアミノ酸残基である。］

【0015】

化学式１中、前記ＡＡは、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルおよびカルボキシなどから選択される１つ以上の置換体で置換または非置換のプロリンを含むアミノ酸残基であってもよい。

【0016】

化学式１は、下記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩であってもよい。

【化2】

［前記化学式２中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルであり；Ｒ_２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。］

【0017】

化学式１は、下記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩であってもよい。

【化3】

［前記化学式３中、
Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−１０アルキルであり；
Ｒ_４は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。］

【0018】

上述の目的のために、本発明では、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含む皮膚美白用化粧料組成物が提供される。

【0019】

皮膚美白用化粧料組成物において、前記有効成分は、前記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ）から選択されてもよい。

【0020】

皮膚美白用化粧料組成物において、前記有効成分は、前記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ）から選択されてもよい。

【0021】

皮膚美白用化粧料組成物において、前記有効成分は、前記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ）および前記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ）の混合物であってもよい。

【0022】

皮膚美白用化粧料組成物において、前記有効成分は、１：０．１〜１：１の重量比（Ａ：Ｂ）で混合されてもよい。

【0023】

皮膚美白用化粧料組成物において、前記有効成分は、全重量に対して、０．０００１〜１０重量％含まれてもよい。

【0024】

上述の目的のために、本発明では、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含むメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物が提供される。

【0025】

メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物において、前記有効成分は、前記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ）から選択されてもよい。

【0026】

メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物において、前記有効成分は、前記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ）から選択されてもよい。

【0027】

メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物において、前記有効成分は、前記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ´）および前記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ´）の混合物であってもよい。

【0028】

メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物において、前記有効成分は、１：０．１〜１：１の重量比（Ａ´：Ｂ´）で混合されてもよい。

【0029】

メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物において、前記メラニン色素の過剰沈着疾患は、ソバカス、老人性色素斑、肝斑、シミ、茶色または黒のホクロ、日光性色素斑、青色黒皮症、薬物使用後の過剰な色素沈着、妊娠性褐色斑および炎症後の過剰な色素沈着などから選択されてもよい。

【0030】

メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物において、前記有効成分は、全重量に対して、０．０００１〜１０重量％含まれてもよい。

【発明の効果】

【0031】

本発明による化合物またはその薬学的に許容される塩は、オートファジー関連タンパク質の発現を増加させることでオートファジーを活性化し、酸化ストレスから細胞を保護することができる。また、酸化ストレスによる各種の疾患および現象を改善、予防および治療することができる。特に、メラノソーム分解を誘導してメラニン生成を低減するオートファジー活性化により、驚くほどの美白効果を実現できるという利点がある。

【0032】

本発明による化合物またはその薬学的に許容される塩は、メラノソーム分解を誘導してメラニン沈着を低減するとともに角化細胞内へのエンドサイトーシスを効果的に抑制することで、メラノソームの流入を阻止する。すなわち、メラニンから誘導される色素の過剰沈着疾患の改善、予防および治療に非常に効果的である。

【図面の簡単な説明】

【0033】

【図1】本発明による角化細胞の色素沈着過程を抑制するメカニズムを図式化した図である。

【図2】本発明による実施例化合物がチロシナーゼ活性を抑制するか否かを確認した結果を示す図である。

【図3】本発明による実施例化合物の細胞毒性がない処理濃度を確認するために、メラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）でＭＴＴアッセイを行った結果を示す図である。

【図4】本発明による実施例化合物の細胞毒性がない処理濃度を確認するため、角化細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）でＭＴＴアッセイを行った結果を示す図である。

【図5】本発明による実施例化合物の処理によって、メラノソーム成熟化に関連する遺伝子（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の発現変化に影響を与えるか否かを分析した結果を示す図である。

【図6】本発明による実施例化合物の処理によって、メラノソーム成熟化に関連する遺伝子（ＭＩＴＦ）の発現変化に影響を与えるか否かを分析した結果を示す図である。

【図7】本発明による実施例化合物の処理によって、変化したメラニン含量を分析した結果を示す図である。

【図8】本発明による実施例化合物の処理によって、オートファジー活性化に関連するタンパク質の発現変化およびエンドサイトーシスに関連する遺伝子のｍＲＮＡの変化を分析した結果を示す図である。

【図9】本発明による実施例化合物の処理によって、メラニン沈着に与える影響を比較分析した結果を示す図である。

【図10】本発明による実施例化合物の処理によって、メラニン沈着抑制能がオートファジーに依存的であるか否かを確認したものであり、ＡＴＧ５をｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎした角化細胞で変化したメラニン含量とオートファジー活性化関連タンパク質変化を比較分析した結果を示す図である。

【図11】本発明による実施例化合物の処理によって、活性化したオートファジーによるメラノソーム分解可否を共焦点顕微鏡により分析した結果を示す図である。

【図12】本発明による実施例化合物の処理によって、活性化したオートファジーによるメラノソーム分解可否を電子顕微鏡（スケールバー：２μｍ／５００ｎｍ／２μｍ／５００ｎｍ）により定量的に分析した結果を示す図である。

【図13】本発明による実施例化合物の処理によって、メラノソームの沈着抑制および分解を定量的に分析した結果を示す図である。

【図14】本発明による実施例化合物の処理によって、人工皮膚モデルでメラニン沈着が減少するかを確認した結果を示す図である。

【図15】本発明による実施例化合物の処理によって、人工皮膚モデルでメラニン沈着が減少することをＦ＆Ｍ ｓｔａｉｎｉｎｇにより定量的に分析した結果を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0034】

本発明による新規の化合物、これを含む化粧料組成物および薬学的組成物について以下で詳述するが、ここで使用される技術用語および科学用語において他の定義がない限り、本発明が属する技術分野において通常の知識を有する者が通常理解している意味を有しており、下記の説明で本発明の要旨を不明瞭にし得る公知の機能および構成に関する説明は省略する。

【0035】

本明細書において、「アルキル」、「アルコキシ」およびその他の「アルキル」部分を含む置換体は、直鎖または分岐鎖の形態をいずれも含む。また、本発明によるアルキル、アルコキシなどは、直鎖状の炭素数１〜１０を有するものまたは前記炭素数に直鎖状を有するものが優先されるが、炭素数１１〜３０を有するものも本発明の一態様であることは言うまでもない。

【0036】

本明細書において、「アルキルカルボニル」は、＊−Ｃ（＝Ｏ）アルキルを意味し、この際、前記アルキルは、上述の定義に従う。

【0037】

本明細書において、「薬学的に許容される塩」は、当業界に知られている通常の技術を使用して製造されるものであって、薬学的に許容される無機酸、有機酸または塩基から誘導された塩を含む。前記無機酸または有機酸の一例としては、塩酸、臭素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ホルム酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸またはベンゼンスルホン酸などが挙げられる。また、前記塩基の一例としては、カリウム、ナトリウムなどのアルカリ金属；マグネシウムなどのアルカリ土類金属；またはアンモニウム；などが挙げられる。

【0038】

本明細書において、「改善」は、本発明による組成物の塗布により状態が緩和または好転したり良好に変更するすべての行為を言う。

【0039】

また、本明細書において使用される単数形態は、文脈で特に断らない限り、複数の形態も含むと意図し得る。

【0040】

また、本明細書において特に断らず使用された単位は、重量を基準とし、一例として、％または比の単位は、重量％または重量比を意味する。

【0041】

また、本明細書において使用される数値範囲は、下限値と上限値とその範囲内でのすべての値、定義される範囲の形態と幅で論理的に誘導される増分、二重限定されたすべての値および互いに異なる形態に限定された数値範囲の上限および下限のすべての可能な組み合わせを含む。

【0042】

また、本明細書において、「含む」と言う表現は、「備える」、「含む」、「有する」または「特徴とする」などの表現と等価の意味を有する開放型記載であり、さらに挙げていない要素、材料または工程を排除しない。

【0043】

本発明者らは、美白素材について鋭意研究を重ねたところ、オートファジー活性化により効果的にメラノソーム分解を誘導することができる新規の化合物を考案した。本発明による化合物は、オートファジー活性化能力に優れており、メラニン色素の過剰沈着による疾患の改善、予防および治療に積極活用できることが期待される。

【0044】

具体的には、本発明による化合物は、オートファジー活性化関連タンパク質の発現を増大し、これによりメラノソームの分解を誘導する。これにより、メラノソームの生成を効果的に抑制することができる。したがって、これを有効成分として含む組成物は美白効果は言うまでもなく、メラニン色素の過剰沈着疾患の改善、予防および治療に卓越した効果を発現することができる。

【0045】

同時に、本発明による化合物は、角化細胞で発現されたプロテアーゼ−活性型受容体２（ＰＡＲ−２）の活性化を抑制し、角化細胞のエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）を有効に抑制することで、メラノソームの流入を効果的に阻止することができる。

【0046】

以下、本発明を具体的に説明する。

【0047】

本発明の一実施形態による化合物は、下記化学式１で表されてもよく、その薬学的に許容される塩であってもよい。

【化4】

［前記化学式１中、
ＡＡは、置換または非置換のプロリンを含むアミノ酸残基である。］

【0048】

前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩は、細胞内のオートファジーを活性化するとともに、メラノソーム分解を誘導し、ＭＩＴＦ（Ｍｅｌａｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ）の発現を効果的に抑制する。また、メラニン細胞のメラノソーム成熟化を抑制し、角化細胞内のエンドサイトーシスを抑制することで、驚くほどの美白効果を実現する。すなわち、本発明による前記化学式１で表される化合物は、オートファジー活性化機能を有する美白素材として有用に活用されることができる。

【0049】

細胞内のオートファジー活性化は、若い人の組織および細胞では活溌に起こるが、老化が進むにつれて細胞内のオートファジー関連タンパク質の発現量が急激に減少するため、オートファジー活性度が急激に低下する。そのため、細胞内老朽タンパク質、脂質およびミトコンドリアが適時に除去されず、細胞老化現象が急速に生じることになる。本発明によると、オートファジー活性化により、各細胞、各組織および各個体の老化を最初から抑制し、老化によってもたらされる各種疾患の予防、改善および治療を可能とする。

【0050】

また、オートファジーの活性化は、細胞内の有害なタンパク質および器官の除去により老化した細胞の生存率を向上させ、さらに、各個体の寿命増加と非常に密接な関係がある。

【0051】

したがって、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩は、様々な原因によるメラニン細胞内のメラノソームの成熟化を抑制し、メラニン色素の過剰沈着疾患の予防および治療に対してより有用に作用する。

【0052】

前記化学式１において、前記ＡＡは、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルおよびカルボキシから選択される１つ以上の置換体で置換または非置換のプロリンを含むアミノ酸残基であってもよい。

【0053】

一例として、前記化学式１において、前記ＡＡは、アミド結合で結合されたプロリンを含むアミノ酸残基であってもよい。この際、前記プロリンおよびプロリン以外のアミノ酸残基は、上述の置換体で置換または非置換のものであってもよい。また、前記アミノ酸残基は、プロリンを含み２個以上のアミノ酸がアミド結合で結合されていてもよい。

【0054】

一例として、前記化学式１において、前記ＡＡは、アミド結合で結合されたプロリンを含むアミノ酸残基であり、前記アミノ酸残基は、２個のＮ−末端を有するＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓなどから選択される１つ以上を含むアミノ酸残基であってもよい。

【0055】

一例として、前記化学式１において、前記ＡＡは、上述の置換体で置換または非置換のプロリンが直接結合されたアミノ酸残基であってもよい。

【0056】

本発明の一実施形態による化合物は、下記化学式２で表される化合物であってもよい。

【化5】

［前記化学式２中、
Ｒ_１は、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルであり；
Ｒ_２は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。］

【0057】

前記化学式２で表される化合物は、オートファジー活性化によるメラノソーム分解効果に卓越しており、本明細書では、オートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物を意味し得る。

【0058】

一例として、前記化学式２において、前記Ｒ_１は、Ｃ_１−４アルキルカルボニルであり；前記Ｒ_２は、水素、ヒドロキシまたはＣ_１−４アルコキシであってもよい。

【0059】

一例として、前記化学式２において、前記Ｒ_１は、直鎖Ｃ_１−４アルキルカルボニルであり；前記Ｒ_２は水素またはヒドロキシであってもよい。

【0060】

一例として、前記化学式２において、前記Ｒ_１は、Ｃ_１−２アルキルカルボニルであり；前記Ｒ_２は、水素またはヒドロキシであってもよい。

【0061】

また、前記化学式２で表される化合物は、１つ以上のキラル非対称炭素原子を含む。これにより、前記化学式２で表される化合物は、ラセミ体および光学的活性形態で存在することができる。すなわち、前記化学式２で表される化合物のジアステレオマーおよびエナンチオマーは、いずれも本発明の範疇に含まれる。

【0062】

本発明の一実施形態による化合物は、下記化学式３で表される化合物であってもよい。

【化6】

［前記化学式３中、
Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−１０アルキルであり；
Ｒ_４は、水素、ヒドロキシ、Ｃ_１−１０アルコキシ、Ｃ_１−１０アルキルカルボニルまたはカルボキシである。］

【0063】

前記化学式３で表される化合物は、エンドサイトーシス抑制による角化細胞内でメラノソーム流入を効果的に抑制することができ、本明細書では、エンドサイトーシス抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物を意味し得る。

【0064】

一例として、前記化学式３において、前記Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−４アルキルであり；前記Ｒ_４は、水素、ヒドロキシまたはＣ_１−４アルコキシであってもよい。

【0065】

一例として、前記化学式３において、前記Ｒ_３は、ヒドロキシまたは直鎖Ｃ_１−４アルキルであり；前記Ｒ_４は、水素、ヒドロキシまたは直鎖Ｃ_１−４アルコキシであってもよい。

【0066】

一例として、前記化学式３において、前記Ｒ_３は、ヒドロキシまたはＣ_１−２アルキルであり；前記Ｒ_４は、水素またはヒドロキシであってもよい。

【0067】

また、前記化学式３で表される化合物は、１つ以上のキラル非対称炭素原子を含む。これにより、前記化学式３で表される化合物は、ラセミ体および光学的活性形態で存在することができる。すなわち、前記化学式３で表される化合物のジアステレオマーおよびエナンチオマーは、いずれも本発明の範疇に含まれる。

【0068】

以下、本発明の用途について具体的に説明する。

【0069】

本発明の一実施形態による一態様の用途は、皮膚美白用化粧料組成物であってもよい。

【0070】

本発明の一実施形態による皮膚美白用化粧料組成物は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含んでもよい。

【0071】

前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩は、活性を示す濃度範囲内で細胞毒性を誘発せず、非常に低い濃度範囲（例えば、１μｍ）でも美白効果を発現する。また、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩は、通常の化粧料組成物に剤形化する場合にも剤形の安定性および保存性を低下させない。

【0072】

本発明の一実施形態による皮膚美白用化粧料組成物は、有効成分として、前記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ）を含んでもよい。この際、前記（Ａ）は１つまたは２つ以上の混合物であってもよい。

【0073】

本発明の一実施形態による皮膚美白用化粧料組成物は、有効成分として、前記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ）を含んでもよい。この際、前記（Ｂ）は、１つまたは２つ以上の混合物であってもよい。

【0074】

本発明の一実施形態による皮膚美白用化粧料組成物は、有効成分として、前記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ）と前記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ）を含む混合物であってもよい。

【0075】

本発明の一実施形態による皮膚美白用化粧料組成物は、実質的なオートファジー活性化効果を実現するための面において、全重量に対して、前記有効成分を０．０００１〜１０重量％含んでもよい。含量に対する効果を考慮すると、前記有効成分は、具体的には０．０００５〜５重量％、より具体的には０．００１〜１重量％、最も具体的には０．００１〜０．１重量％含んでもよい。

【0076】

さらに、本発明の一実施形態による皮膚美白用化粧料組成物は、より向上した美白効果の実現のために、オートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物およびエンドサイトーシス抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物の混合物を同時に有効成分として含むことができる。

【0077】

一例として、前記オートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物は、前記化学式２で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物（Ａ）であってもよく、前記エンドサイトーシス抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物は、前記化学式３で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物（Ｂ）であってもよい。

【0078】

本発明の一実施形態による皮膚美白用化粧料組成物は、適用形態、使用目的および所望の効果によって適切な重量比で前記オートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物およびエンドサイトーシス抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物の混合物を使用することができることは言うまでもない。

【0079】

一例として、前記混合物は、１：０．１〜１：１の重量比（Ａ：Ｂ）で混合されてもよい。

【0080】

一例として、前記混合物は、１：０．１〜１：０．８の重量比（Ａ：Ｂ）で混合されてもよい。

【0081】

一例として、前記混合物は、１：０．１〜１：０．５の重量比（Ａ：Ｂ）で混合されてもよい。

【0082】

前記皮膚美白用化粧料組成物は、通常知られている製造方法を用いて、一般的な乳化剤形および可溶化剤形などに剤形化されることができる。

【0083】

一例として、前記皮膚美白用化粧料組成物は、柔軟化粧水、収斂化粧水、栄養化粧水、アイクリーム、栄養クリーム、マッサージクリーム、パウダー、エッセンス、パックなどから構成された群から選択される剤形に剤形化されてもよい。

【0084】

一例として、前記皮膚美白用化粧料組成物は、石けん、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォータなどから構成された群から選択される剤形に剤形化されてもよい。

【0085】

また、前記皮膚美白用化粧料組成物は、目的に応じて、適切にさらなる添加剤をさらに含んでもよい。一例として、前記添加剤は、安定化剤、乳化剤、粘増剤、保湿剤、液晶膜強化剤、ｐＨ調節剤、抗菌剤、水溶性高分子、被膜剤、金属イオン封鎖剤、アミノ酸、有機アミン、高分子エマルジョン、ｐＨ調整剤、皮膚営養剤、酸化防止剤、酸化防止助剤、防腐剤、香料などから選択される１つ以上の水性添加剤；油脂類、ワックス類、炭化水素油、高級脂肪酸油、高級アルコール、合成エステル油およびシリコン油などから選択される１つ以上の油性添加剤；などが挙げられる。

【0086】

この際、前記各添加剤は、組成物の全重量に対して、０．００１〜２０重量％含まれてもよく、具体的には０．０１〜１０重量％、０．０５〜１０重量％含まれてもよいが、これに限定されるものではない。

【0087】

本発明の一実施形態による他の一態様の用途は、メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物であってもよい。

【0088】

また、本発明の一実施形態による一態様の用途は、メラニン色素の過剰沈着疾患を緩和または治療する方法であってもよい。具体的には、前記方法は、有効量の前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を、これを要する対象の皮膚に適用させることであってもよく、これを要する対象の皮膚は、メラニン色素の過剰沈着疾患の皮膚であってもよい。

【0089】

この際、前記有効量は、上述の有効成分の使用量の範囲であれば制限されない。

【0090】

本発明の一実施形態によるメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩を有効成分として含んでもよい。

【0091】

前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩は、卓越した美白効果の実現により、メラニン色素の過剰沈着疾患の改善、予防および治療に卓越した効果を発現する。具体的には、前記化学式１で表される化合物またはその薬学的に許容される塩は、オートファジー関連タンパク質の発現を増加させてオートファジーを活性化し、酸化ストレスから細胞を保護することができ、酸化ストレスによる各種疾患および現象を改善、予防および治療することができる。特に、メラノソーム分解を誘導してメラニン生成を低減するとともに、メラノソームの成熟化を抑制し、角質細胞のエンドサイトーシスを効果的に抑制してメラノソームの流入を阻止し、メラニンから誘導される色素の過剰沈着疾患の改善、予防および治療に非常に効果的である。

【0092】

前記色素の過剰沈着疾患は、ソバカス；老人性色素斑；肝斑；シミ；茶色または黒のホクロ；日光性色素斑；青色黒皮症；薬物使用後の過剰な色素沈着；妊娠性褐色斑；または炎症後の過剰な色素沈着；などが挙げられるが、これに限定されるものではない。

【0093】

本発明の一実施形態によるメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は有効成分として、前記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ´）を含んでもよい。この際、前記（Ａ´）は１つまたは２つ以上の混合物であってもよい。

【0094】

本発明の一実施形態によるメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は有効成分として、前記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ´）を含んでもよい。この際、前記（Ｂ´）は１つまたは２つ以上の混合物であってもよい。

【0095】

本発明の一実施形態によるメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は有効成分として、前記化学式２で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ａ´）と前記化学式３で表される化合物またはその薬学的に許容される塩（Ｂ´）を含む混合物であってもよい。

【0096】

本発明の一実施形態によるメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は、実質的なオートファジー活性化効果を実現するための面において、全重量に対して、前記有効成分を０．０００１〜１０重量％含んでもよい。含量に対する効果を考慮すると、前記有効成分は、具体的には０．００１〜５重量％、より具体的には０．００１〜１重量％、最も具体的には０．００１〜０．１重量％含んでもよい。

【0097】

さらに、本発明の一実施形態によるメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は、より向上した効果の実現のために、オートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物およびエンドサイトーシス抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物の混合物を有効成分として含むことができる。

【0098】

一例として、前記オートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物は、前記化学式２で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物（Ａ´）であってもよく、前記エンドサイトーシス抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物は、前記化学式３で表される化合物から選択される少なくとも１つの化合物（Ｂ´）であってもよい。

【0099】

本発明の一実施形態によるメラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は、適用形態、使用目的および所望の効果に応じて適切な重量比で前記オートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物およびエンドサイトーシス抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物の混合物を使用することができることは言うまでもない。

【0100】

一例として、前記混合物は１：０．１〜１：１の重量比（Ａ´：Ｂ´）で混合されてもよい。

【0101】

一例として、前記混合物は１：０．１〜１：０．８の重量比（Ａ´：Ｂ´）で混合されてもよい。

【0102】

一例として、前記混合物は１：０．１〜１：０．５の重量比（Ａ´：Ｂ´）で混合されてもよい。

【0103】

前記メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は、通常知られている製造方法を用いて、薬剤学的に許容される担体を含む剤形に剤形化されることができる。

【0104】

一例として、前記メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、パッチ、噴霧剤などから構成された群から選択される皮膚外用剤形に剤形化されてもよい。

【0105】

一例として、前記メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は、経口（錠剤、カプセル剤、粉末剤）、口腔内、舌下、直腸内、膣内、鼻腔内、局所または非経口（静脈内、海綿体内、筋肉内、皮下および管こう内を含む）投与剤形に剤形化されてもよい。

【0106】

また、前記メラニン色素の過剰沈着疾患の改善または治療用薬学的組成物は、目的に応じて適切にさらなる薬剤学的に許容される担体を含んでもよい。一例として、ラクトース、デックストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウムまたはミネラルオイルであってもよく、これに限定されるものではない。また、前記担体の他に、滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤または保存剤などの担体をさらに含んでもよい。

【0107】

この際、前記各担体は、組成物の全重量に対して、０．００１〜２０重量％含まれてもよく、具体的には０．０１〜１０重量％、０．０５〜１０重量％含まれてもよいが、これに限定されるものではない。

【0108】

以下、本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するだけであって、本発明は下記実施例によって限定されるものではない。

【0109】

（実施例１）化合物１の合成
ステップ１．化合物１ａ（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂）の合成

【化7】

１０ｍｌの反応容器に２−クロロトリチルクロライド樹脂（２−ｃｈｌｏｒｏ ｔｒｉｔｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｒｅｓｉｎ、１００−２００ｍｅｓｈ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ１００ｍｇ、１当量）とＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨ（Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−Ｄｄｅ−Ｌ−リジン、Ｎα−Ｆｍｏｃ−Ｎε−［１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル］−Ｌ−リジン）（１０６．５ｍｇ、２当量）およびジイソプロピルアミン（ＤＩＰＥＡ、６９．７μｌ、４当量）を５ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解して添加し、常温（２３℃）で１２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのジクロロメタンとメタノール（ＭｅＯＨ）、ジクロロメタンおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて順に洗浄し、化合物１ａを定量的に得た。

【0110】

ステップ２．化合物１ｂ（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂）の合成

【化8】

ステップ１の反応容器（ステップ１で得られた化合物１ａ）に５ｍｌの２０％ピペリジン（ｉｎ ＤＭＦ）を入れて常温で５分間反応させた後、濾過して反応液を除去した。５ｍｌの２０％ピペリジン（ｉｎ ＤＭＦ）をさらに加え、常温で５分間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄した後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（２３６．３ｍｇ、４当量）とＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール、５４．１ｍｇ、４当量）およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）（６１．９μｌ、４当量）を５ｍｌのＤＭＦに溶解して加え、常温で２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄し、化合物１ｂを定量的に得た。

【0111】

ステップ３．化合物１ｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）２−Ｌｙｓ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）２−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂）の合成

【化9】

ステップ２の反応容器（ステップ２で得られた化合物１ｂ）に５ｍｌの２０％ピペリジン（ｉｎ ＤＭＦ）を入れて常温で５分間反応させた後、濾過して反応液を除去した。５ｍｌの２０％ピペリジン（ｉｎ ＤＭＦ）をさらに加え、常温で５分間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ５００ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄した後、ｔ−ブチルブロモアセテート（ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌ ｂｒｏｍｏａｃｅｔａｔｅ、１４７．７μｌ、１０当量）とＤＩＰＥＡ（２６１．３μｌ、１５当量）を５ｍｌのＤＭＦに溶解して加え、常温で４８時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄し、化合物１ｃを定量的に得た。

【0112】

ステップ４．化合物１ｄ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）２−Ｌｙｓ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）２−Ｌｙｓ（ＮＨ２）−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂）の合成

【化10】

ステップ３の反応容器（ステップ３で得られた化合物１ｃ）に５ｍｌの２％ヒドラジン（ｉｎ ＤＭＦ）を入れて５分間常温で反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂を１０ｍｌ ＤＭＦを用いて洗浄した後、１０ｍｌの１０％ＤＩＰＥＡ（ｉｎ ＤＭＦ）を加え、常温で５分間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄し、化合物１ｄを定量的に得た。

【0113】

ステップ５．化合物１の合成

【化11】

ステップ４の反応容器（ステップ４で得られた化合物１ｄ）にＮ−アセチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ、１３８．５ｍｇ、８当量）とＨＯＢｔ（１８０．１ｍｇ、８当量）およびＤＩＣ（１２３．９μｌ、８当量）を５ｍｌのＤＭＦに溶解して加え、常温で３時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＤＭＦ、ＤＣＭを用いて順に洗浄した。

【0114】

真空乾燥した後、５ｍｌのｃｌｅａｖａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ（トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ＤＷ＝９５：２．５：２．５）を加え、常温で３時間反応させた。濾過して反応液を集め、これに４５ｍｌのジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。遠心分離機を用いて固体生成物を集め、４５ｍｌのジエチルエーテルで２回洗浄した。得られた固体生成物をＰｒｅｐ−ＨＰＬＣ（ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｍｍ×２２ｍｍ）用いて精製した後、凍結乾燥して化合物１（ＬＣ ｍａｓｓで測定された分子量：６６１．６６）を５５％全収率で３６．４ｍｇ得た。

【0115】

（実施例２）化合物２の合成
ステップ１．化合物２ａ（Ｆｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂）の合成

【化12】

１０ｍｌの反応容器に２−クロロトリチルクロライド樹脂（１００−２００ｍｅｓｈ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ ２００ｍｇ、１当量）とＦｍｏｃ−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−ＯＨ（Ｆｍｏｃ−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｌ−ヒドロキシプロリン）（１６３．８ｍｇ、２当量）およびＤＩＰＥＡ（１３９．３μｌ、４当量）を５ｍｌのＤＣＭに溶解して添加し、常温で１２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄し、化合物２ａを定量的に得た。

【0116】

ステップ２．化合物２ｂ（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂）の合成

【化13】

ステップ１の反応容器（ステップ１で得られた化合物２ａ）に５ｍｌの２０％ピペリジン（ｉｎ ＤＭＦ）を入れて常温で５分間反応させた後、濾過して反応液を除去した。５ｍｌの２０％ピペリジン（ｉｎ ＤＭＦ）をさらに加え、常温で５分間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄した後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（４７２．６ｍｇ、４当量）とＨＯＢｔ（１０８．１ｍｇ、４当量）およびＤＩＣ（１２３．９μｌ、４当量）を５ｍｌのＤＭＦに溶解して加え、常温で２時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄し、化合物２ｂを定量的に得た。

【0117】

ステップ３．化合物２ｃ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）２−Ｌｙｓ（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルメチル）２−Ｈｙｐ（ｔＢｕ）−Ｏ−２−クロロトリチル樹脂）の合成

【化14】

ステップ２の反応容器（ステップ２で得られた化合物２ｂ）に５ｍｌの２０％ピペリジン（ｉｎ ＤＭＦ）を入れて常温で５分間反応させた後、濾過して反応液を除去した。５ｍｌの２０％ピペリジン（ｉｎ ＤＭＦ）をさらに加え、常温で５分間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ５００ｍｌのＤＣＭとＭｅＯＨ、ＤＣＭおよびＤＭＦを用いて順に洗浄した後、ｔ−ブチルブロモアセテート（２９５．３μｌ、１０当量）とＤＩＰＥＡ（５２２．５μｌ、１５当量）を５ｍｌのＤＭＦに溶解して加え、常温で４８時間反応させた。濾過して反応液を除去し、合成された樹脂をそれぞれ１０ｍｌのＤＣＭとＤＭＦおよびＤＣＭを用いて順に洗浄し、化合物２ｃを定量的に得た。

【0118】

ステップ４．化合物２の合成

【化15】

ステップ３の反応容器（ステップ３で得られた化合物２ｃ）に５ｍｌのｃｌｅａｖａｇｅ ｃｏｃｋｔａｉｌ（トリフルオロ酢酸：トリイソプロピルシラン：ＤＷ＝９５：２．５：２．５）を加え、常温で３時間反応させた。濾過して反応液を集め、これに４５ｍｌのジエチルエーテルを加えて生成物を沈殿させた。遠心分離機を用いて固体生成物を集め、４５ｍｌのジエチルエーテルで２回洗浄した。得られた固体生成物をＰｒｅｐ−ＨＰＬＣ（ｃｏｌｕｍｎ Ｃ１８、１０μｍ、２５０ｍｍ×２２ｍｍ）用いて精製した後、凍結乾燥して化合物２（ＬＣ ｍａｓｓで測定された分子量：４９１．４５）を６０％全収率で５９ｍｇ得た。

【0119】

（実施例３）チロシナーゼ抑制能の確認
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２がチロシナーゼ活性を抑制するのか分析するために、チロシナーゼ活性阻害試験（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）を行った。

【0120】

具体的な実験方法として、マッシュルームチロシナーゼ（Ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）を０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）に２ｕｎｉｔ／μｌで希釈し、チロシン（Ｔｙｒｏｓｉｎｅ）０．０３重量％で水に溶解した。下記表１に記載の各実験群も０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液に１０ｐｐｍ、１００ｐｐｍ、１０００ｐｐｍ、１００００ｐｐｍで希釈し、表１のように混合した。３７℃で１時間反応させ、吸光度をそれぞれ測定した（波長：４９０ｎｍ、Ｅｐｏｃｈ、バイオテック社製）。その結果に基づき、コントロールに対するチロシナーゼ抑制率で計算した。

【0121】

その結果を図２に示した。

【0122】

図２に示されているように、化合物１と化合物２は、全濃度においてチロシナーゼ活性を抑制しないことを確認した。

【0123】

【表1】

【0124】

（実施例４）適正処理濃度の確認
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２による細胞毒性のない処理濃度を確認するために、ＭＴＴアッセイを行った。

【0125】

具体的な実験方法として、化合物１と化合物２の処理濃度による細胞毒性を確認するために、メラニン細胞（ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ、ＨＥＭｎ−ＤＰ、ｃａｔ＃ Ｃ２０２５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）と角化細胞（ｈｕｍａｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ、ＨＥＫｎ、ｃａｔ＃ Ｃ００１５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）で細胞死分析を行った。９６ウェルプレートに細胞数を１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで分注し、２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２の条件でインキュベータで培養した。

【0126】

前記実施例で得られた、化合物１と化合物２それぞれを１００ｍＭの濃度で蒸留水（ＤＷ）に溶解して濃縮液とし、これを培地で希釈して５μＭ、１０μＭ、５０μＭの濃度で処理した。４日後にプレートの培地を除去し、ＭＴＴ試薬（シグマアルドリッチ社製、０．５ｍｇ／ｍｌ）１００μｌを処理した。４時間後、試薬を除去し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を入れた後、吸光度を測定した（波長：５７０ｎｍ、Ｅｐｏｃｈ、バイオテック社製）。この際、細胞生存率は、化合物で処理されていないコントロール（Ｂｌａｎｋ）の吸光度に対する百分率で計算した。

【0127】

その結果を図３および図４に示した。

【0128】

図３および図４に示されているように、化合物１と化合物２は、５μＭ、１０μＭ、５０μＭの濃度でも細胞毒性がほとんどないことを確認した。すなわち、本発明による化合物は、前記濃度でメラニン細胞および角化細胞のいずれにおいて細胞毒性がないことを確認した。したがって、以降の実験では、１０μＭの濃度で実験を行った。

【0129】

（実施例５）メラノソーム成熟化関連遺伝子の変化とメラニン含量の変化の確認
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２が、メラノソーム成熟化にどのような影響を与えるのか分析するために、化合物１と化合物２を処理した後、メラノソーム成熟化関連ｍＲＮＡの量をＱＰＣＲで分析し、メラニン含量を吸光度で測定した。

【0130】

具体的な実験方法として、ヒト由来のメラニン細胞（ＨＥＭｎ−ＤＰ、ｃａｔ＃ Ｃ２０２５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）を培養用６ウェルプレートに１×１０^５個の細胞数で一定に分注し、Ｍ２５４（ｃａｔ＃ Ｍ−２５４−５００、Ｇｉｂｃｏ社製）で２４時間、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で、インキュベータで培養した。化合物１と化合物２それぞれを１００ｍＭの濃度でＤＷに溶解して濃縮液とし、これを培地で希釈して２０μＭの濃度で希釈した後、各ウェルに１ｍｌの培地がまず入っている状態で各希釈液を１ｍｌずつ入れて処理した後、４８時間培養し、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ｃａｔ＃ ７４１０６、キアゲン社製）を用いてメラニン細胞からＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは、ｃＤＮＡ合成キット（ｃａｔ＃ ＦＳＱ−２０１、東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡ合成を行い、ＭＩＴＦ（Ｆ：ＴＡＡ ＣＣＴ ＧＴＡ ＣＡＡ ＣＡＡ ＣＴＣ ＴＣＧ ＡＴＣ ＴＣＡ；Ｒ：ＧＴＴ ＧＧＣ ＣＴＣ ＡＧＴ ＣＣＣ ＡＧＴ ＴＣ）、チロシナーゼ（Ｆ：ＡＧＣ ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＡＡ ＡＴＣ ＣＴＡ ＡＣＴ ＴＡＣ；Ｒ：ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＴＴ ＧＴＡ ＣＴＣ ＣＴＣ ＣＡＡ ＴＣ）プライマーとＰＯＷＥＲ ＳＹＢＲ ＭＡＳＴＥＲ ＭＩＸ（ｃａｔ＃ ４３６７６５９、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を合成したｃＤＮＡとともに適正割合で混合し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３装備（ｃａｔ＃ Ａ２８１３１、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でｑＰＣＲを行った。また、同様に実験を行って培養を終了した後、培地を除去し、トリプシン−ＥＤＴＡ（ｃａｔ＃ ＬＳ−０１５−０９、ＷＥＬＧＥＮＥ社製）を用いてメラニン細胞をプレートから分離し、１．５ｍｌのチューブに移した後、スピンダウン（ｓｐｉｎ ｄｏｗｎ）してペレットの写真を撮影し、そのペレットを１Ｎ ＮａＯＨに溶解した溶液の吸光度を測定した（波長：４００ｎｍ、Ｅｐｏｃｈ、バイオテック社製）。

【0131】

その結果を図５〜図７に示した。

【0132】

図５〜図７に示されているように、前記実施例で得られた、化合物１と化合物２は、メラニン細胞内のメラノソーム成熟化活性にはほとんど影響を与えないことが分かる。

【0133】

（実施例６）角化細胞のオートファジー活性増加とエンドサイトーシス関連遺伝子の発現減少の確認
前記実施例で得られた、化合物１の処理による細胞内オートファジー分析のために、ＬＣ３（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ３；オートファジーマーカー）タンパク質に対するウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行った。また、前記実施例で得られた、化合物２の処理によるエンドサイトーシス関連遺伝子の変化を分析するために、ＰＡＲ２、ＡＡＫ１（ＡＰ２ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ１）に対してｑＰＣＲを行った。

【0134】

具体的な実験方法として、化合物１を角化細胞（ＨＥＫｎ、ｃａｔ＃ Ｃ００１５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）に処理し、タンパク質分解阻害剤が含まれている細胞溶解緩衝液（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて溶解させた。前記溶解された溶液を遠心分離機を用いて全溶液を分画した後、タンパク質が含まれた溶液のみ抽出した。前記抽出されたタンパク質は、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）方法によって定量化した。２０μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ゲル電気泳動法で分離し、ニトロセルローズ（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）膜に移した。タンパク質が移された膜は、非特異的な結合を減少させるために、５％脱脂乳（ｎｏｎ−ｆａｔ ｍｉｌｋ）が含まれたＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝生理食塩水／０．０５％ツイン−２０）溶液で常温で１時間遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、１次抗体を４℃の条件で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）反応させた後、２次抗体を１時間常温で反応させた。視覚化のためには、化学発光システム（Ｅｎｈａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ）を用いた。

【0135】

具体的な実験方法として、化合物２を処理した角化細胞（ＨＥＫｎ、ｃａｔ＃ Ｃ００１５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）は、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ｃａｔ＃ ７４１０６、キアゲン社製）を用いてＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡ合成キット（ｃａｔ＃ ＦＳＱ−２０１、東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡ合成した後、ＰＡＲ２（Ｆ：ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＣ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＴ；Ｒ：ＧＡＴ ＧＴＧ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＣＣ ＴＴＡ ＣＣＡ Ａ）プライマーとＰＯＷＥＲ ＳＹＢＲ ＭＡＳＴＥＲ ＭＩＸ（ｃａｔ＃ ４３６７６５９、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を合成したｃＤＮＡとともに適正割合で混合し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３装備（ｃａｔ＃ Ａ２８１３１、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）でｑＰＣＲを行った。

【0136】

その結果を図８に示した。

【0137】

図８に示されているように、化合物１によりＬＣ３−ＩＩ（成熟したオートファゴソーム）の生成が増加することを確認することができ、化合物２によりＰＡＲ−２遺伝子の発現が減少することが分かった。

【0138】

（実施例７）メラニン沈着減少の確認
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２が、メラニン沈着にどのような影響を与えるのか分析するために、メラニン処理による沈着抑制程度を分析した。

【0139】

具体的な実験方法として、ヒト由来の角化細胞（ＨＥＫｎ、ｃａｔ＃ Ｃ００１５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）を培養用６ウェルプレートに１×１０^５個の細胞数で一定に分注し、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標、ｃａｔ＃ ＭＥＰＩ５００ＣＡ、Ｇｉｂｃｏ社製）で２４時間、３７℃、５％のＣＯ_２条件でインキュベータで培養した。前記実施例で得られた化合物１または化合物２それぞれを１００ｍＭの濃度で溶解して濃縮液とし、これを培地で希釈して２０μＭの濃度で希釈した後、各ウェルに１ｍｌの培地がまず入っている状態で各希釈液を１ｍｌずつ入れて処理した後、４８時間培養し、メラニン１０ｍｇ／ｍｌを２μｌずつ添加し、２時間さらに培養した。培養終了後、培地を除去し、トリプシン−ＥＤＴＡ（ｃａｔ＃ ＬＳ−０１５−０９、ＷＥＬＧＥＮＥ社製）を用いて細胞をプレートから分離して１．５ｍｌのチューブに移した後、スピンダウンしてペレットの写真を撮影し、そのペレットを１Ｎ ＮａＯＨに溶解した溶液の吸光度を測定した（波長：４００ｎｍ、Ｅｐｏｃｈ、バイオテック社製）。

【0140】

その結果を図９に示した。

【0141】

図９に示されているように、化合物１または化合物２によって角化細胞へのメラニン沈着が効果的に抑制されることを確認することができた。

【0142】

また、化合物１または化合物２を単一化合物で処理した場合よりも、これらを混合した場合に、メラニン沈着がさらに抑制されることが分かった。

【0143】

（実施例８）メラニン沈着抑制活性がオートファジー活性に依存的であるかに関する分析
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２の処理による角化細胞へのメラニン沈着抑制活性が、オートファジー活性に依存的であるか分析するために、オートファジー活性に必要なタンパク質であるＡＴＧ５をＫｎｏｃｋ−Ｄｏｗｎした後、メラニン処理による沈着抑制活性の変化を分析した。

【0144】

具体的な実験方法として、ＡＴＧ５ ｓｉＲＮＡをトランスフェクション試薬（ＲＮＡｉＭＡＸ、ｃａｔ♯１３７７８−０７５、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）の方法で混合した後、角化細胞（ＨＥＫｎ、ｃａｔ＃ Ｃ００１５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）に分注した。８時間後、化合物１と化合物２をサプリメント（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）と抗生剤のないＥｐｉＬｉｆｅ（ｃａｔ＃ ＭＥＰＩ５００ＣＡ、Ｇｉｂｃｏ社製）に最終濃度が１０μＭになるよう希釈して処理し、６４時間さらに培養した細胞をタンパク質分解阻害剤が含まれている細胞溶解緩衝液（ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）を用いて溶解させた。前記溶解された溶液を遠心分離機を用いて全溶液を分画した後、タンパク質が含まれた溶液のみを抽出した。前記抽出されたタンパク質は、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）方法によって定量化した。２０μｇのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミド（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）ゲル電気泳動法で分離し、ニトロセルローズ（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）膜に移した。タンパク質が移された膜は、非特異的な結合を減少させるために、５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、Ｇｅｎｄｅｐｏｔ社製、Ｃａｔ＃ Ａ０１００−０１０）が含まれたＴＢＳ−Ｔ（トリス緩衝生理食塩水／０．０５％ツイン−２０）溶液で常温で１時間遮断（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した後、１次抗体を４℃の条件で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ）反応させた後、２次抗体を１時間常温で反応させた。視覚化のためには、化学発光システム（Ｅｎｈａｎｃｅ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ）を用いた。また、メラニン沈着抑制活性を分析するために、トランスフェクションと化合物の処理まで同様に行った後、メラニン１０ｍｇ／ｍｌを２μｌずつ添加して２時間さらに培養した。培養終了後、培養液を除去し、トリプシン−ＥＤＴＡ（ｃａｔ＃ ＬＳ−０１５−０９、ＷＥＬＧＥＮＥ社製）を用いて細胞をプレートから分離し、１．５ｍｌのチューブに移した後、スピンダウン（ｓｐｉｎ ｄｏｗｎ）してペレットの写真を撮影し、そのペレットを１Ｎ ＮａＯＨに溶解した溶液の吸光度を測定した（波長：４００ｎｍ、Ｅｐｏｃｈ、バイオテック社製）。

【0145】

その結果を図１０に示した。

【0146】

図１０に示されているように、オートファジー活性に必要なタンパク質であるＡＴＧ５をＫｎｏｃｋ−ｄｏｗｎさせると、化合物１と化合物２による角化細胞でのメラニン量が減少しないことを確認した。また、ＡＴＧ５がｋｎｏｃｋ−ｄｏｗｎした条件で、化合物１と化合物２によるオートファジータンパク質であるＬＣ３−ＩＩとＡＴＧ５の発現活性が抑制されることを確認した。したがって、化合物１と化合物２によるメラニン沈着抑制活性が、オートファジー活性に依存的であることが分かった。

【0147】

（実施例９）メラノソーム分解効果
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２の処理により、メラノソームとオートファゴソームがｃｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎするのか確認するために、電子顕微鏡と共焦点顕微鏡で分析した。

【0148】

具体的な実験方法として、ヒト由来の高濃度のメラニンが入っているメラニン細胞（ＨＥＭｎ−ＤＰ、ｃａｔ＃ Ｃ２０２５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）に溶解緩衝液（トリス２０ｍｍ、ＮａＣｌ１５０ｍｍ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、スクロース２５０ｍｍ ｉｎ ＤＷ）を入れて冷却してから解凍することを２回繰り返して細胞膜を壊し、１０００ｘ ｇで５分間遠心分離して上澄み液を得る。Ｃｕｓｈｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス２０ｍｍ、ＮａＣｌ１５０ｍｍ、ＥＤＴＡ１ｍＭ、スクロース１．５Ｍ ｉｎ ＤＷ）を超遠心分離機チューブに満たし、同一量の上澄み液を入れた後、２５，０００ｒｐｍ、３０分、４℃の条件で遠心分離し、メラノソームを得た。メラノソームの濃度は、合成メラニン（ｃａｔ＃ Ｍ８６３１、シグマアルドリッチ社製）を標準物として測定した。角化細胞（ＨＥＫｎ、ｃａｔ＃ Ｃ００１５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）を６ウェルに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ分注し、１日間培養した。化合物１と化合物２を１０μＭずつ処理して１日間培養した後、分離したメラノソーム（５μｇ／ｗｅｌｌ）を添加し、さらに２日培養した。培養終了後、培養液を除去し、電子顕微鏡用固定液を用いて細胞を固定した後、抗体（Ｐｍｅｌ１７、ＬＣ３）で蛍光標識を行った後、共焦点顕微鏡でメラノソームとオートファゴソームがＣｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎするかを確認した。また、同様に実験した細胞を透過電子顕微鏡で細胞内小器官の様相を観察した。

【0149】

その結果を図１１および図１２に示した。

【0150】

図１１に示されているように、化合物１と化合物２によって増加したオートファゴソームがメラノソームとＣｏ−ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎされることを共焦点顕微鏡で確認した。また、角化細胞内にメラノソームが多く存在するコントロールとは異なり、化合物１と化合物２の混合物を処理すると、メラノソームが迅速に分解され、その量が著しく減少することを確認することができた。

【0151】

また、図１２に示されているように、化合物１と化合物２の混合物を処理すると、全メラノソームに対する８６％がオートファゴソームの中に入っている現象を透過電子顕微鏡で確認することができた。

【0152】

（実施例１０）メラノソームの沈着抑制効果
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２を処理して角化細胞でメラノソームの沈着が抑制されるのか分析するために、角化細胞から分離したメラノソームを処理し、メラニン含量とメラノソーム指標を分析した。

【0153】

具体的な実験方法として、角化細胞（ＨＥＫｎ、ｃａｔ＃ Ｃ００１５Ｃ、Ｇｉｂｃｏ社製）を６ウェルに１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ分注して１日培養した後、化合物１と化合物２を１０μＭずつ１日間処理し、実施例９のように分離したメラノソームを（５μｇ／ｗｅｌｌ）を添加した後、さらに２日間培養した。培養終了後、培養液を得てトリプシン−ＥＤＴＡ（ｃａｔ＃ ＬＳ−０１５−０９、ＷＥＬＧＥＮＥ社製）を用いて細胞をプレートから分離し、１．５ｍｌチューブに移した後、スピンダウンしてペレットの写真を撮影し、そのペレットを１Ｎ ＮａＯＨに溶解した溶液の吸光度を測定した（波長：４００ｎｍ、Ｅｐｏｃｈ、バイオテック社製）。

【0154】

また、これを定量分析するために、合成メラニン（ｃａｔ＃ Ｍ８６３１、シグマアルドリッチ社製）を標準品として培養液とセルペレット（ｃｅｌｌ ｐｅｌｌｅｔ）内部のメラノソームの量を分析した。得られた培養液は、凍結乾燥の後、ペレットと同様に１Ｎ ＮａＯＨに溶解した後、吸光度を測定した（波長：４００ｎｍ、Ｅｐｏｃｈ、バイオテック社製）。

【0155】

その結果を図１３に示した。

【0156】

図１３に示されているように、化合物１と化合物２の混合物を処理すると、角化細胞の内部のメラノソーム量が減少し、培養液のメラノソーム量が増加することを確認することができた。かかる結果は、化合物１と化合物２の混合物の処理によって角化細胞へのメラノソームの流入を効果的に抑制したことを意味する。これにより、化合物１と化合物２の混合物を処理すると、メラノソームによる色素沈着を有意に抑制することができる。

【0157】

また、本発明による角質細胞の色素沈着過程を抑制するメカニズムを下記の図１に図示した。

【0158】

（実施例１１）メラニン沈着抑制効果
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２が組織学的にメラニン沈着抑制にどのような影響を与えるのか分析するために、人工皮膚モデルを用いてメラニン色素沈着抑制程度を分析した。

【0159】

具体的な実験方法として、肌の黒い人由来の人工皮膚モデル（ＭｅｌａｎｏＤｅｒｍ（商標）、ＭＥＬ−３００−Ｂ、ＭａｔＴｅｋ社製）を専用培地（ＥＰＩ−１００−ＮＭＭ−ＰＲＦ）で１５日間、３７℃、５％ＣＯ_２の条件でインキュベータで培養した。前記実施例で得られた化合物１と化合物２を１００ｐｐｍの濃度で人工皮膚モデルの表面に２５μｌずつ２４時間ごとに一度処理した。化合物１と化合物２の処理時に既存に存在する化合物１と化合物２は除去してから処理し、培地も２４時間ごとに取り替えた。実験の進行中に１日目、９日目、１５日目に組織表面の写真を撮影し、この結果を用いて組織表面の色変化程度（Ｌ＊ｖａｌｕｅ）を分析した。

【0160】

その結果を図１４に示した。

【0161】

図１４に示されているように、コントロールに比べて化合物１と化合物２の混合物が処理された群において、メラニン色素沈着が統計的に有意に減少したことを確認することができた。

【0162】

（実施例１２）メラニン分解効果
前記実施例で得られた、化合物１と化合物２のメラニン分解効果を分析するために、人工皮膚モデルを用いてメラニン含量を分析した。

【0163】

具体的な実験方法として、前記実施例１１に述べられたように人工皮膚モデルを培養した。１５日目に組織を得て、４％リン酸緩衝ホルマリンで２４時間固定した。固定した組織を流れる水で１２時間洗浄し、アルコール濃度の上昇順に脱水を行った後、キシレンで置換し、パラフィンで包埋した。パラフィンで包埋した組織を５μｍの厚さで薄切りし、フォンタナ・マッソン染色法でメラニンを染色した後、分析に使用した。全組織の写真と角質層部分の写真をそれぞれｉｍａｇｅ Ｊで分析して比較した。

【0164】

その結果を図１５に示した。

【0165】

図１５に示されているように、コントロールに比べて、化合物１と化合物２の混合物が処理された群においてメラニンが統計的に有意に減少したことを確認することができた。また、角質層に上行するメラニンの量が４３．２５％であり、コントロールに比べ、統計的に有意に減少したことを確認することができた。

【0166】

上述の結果から、本発明による化合物は、オートファジー活性化により効果的にメラノソーム分解を誘導し、且つＰＡＲ−２抑制を促進することで、メラノソームの流入を効果的に抑制することができることを確認した。

【0167】

具体的には、化合物１は、オートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物として、メラニン細胞のオートファジー活性を誘導してメラノソームを効果的に分解し、化合物２は、エンドサイトーシス抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物として、メラノソームが角化細胞に入って来ることを阻止する役割に卓越した効果を発揮することを確認した。これにより、結果として、角化細胞内のメラニンを減少させて皮膚色素沈着の緩和、治療および予防に非常に効果的に使用可能になることが期待される。特に、本発明による化学式２および化学式３で表される化合物を混合して使用する場合、美白効果は言うまでもなく、メラニン色素の過剰沈着による疾患の改善、予防および治療に卓越した効果を実現することができる。

【0168】

（実施例１３〜実施例１４および比較例１）皮膚美白用化粧料組成物の製造
下記表２に記載の成分および含量で、乳化反応器に投入して混合攪拌しながら７５℃に加熱して乳化させた。以降、乳化が終了すると、攪拌機で攪拌させて徐々に常温に冷却させて皮膚美白用化粧料組成物（ｏ／ｗクリーム）を製造した。

【0169】

【表2】

【0170】

（実施例１５）美白効果
前記方法で製造された実施例の皮膚美白用化粧料組成物の美白効果を調べるために臨床試験を行った。

【0171】

具体的な実験方法として、色素沈着過剰症のある平均年齢３７歳（３６．５７±５．９０）の成人男女２０名（女性１５名、男性５名）の肌をＵＶ露出で黒化を誘導した後、前記表２のように、化合物１および化合物２が含まれている高濃度および低濃度含有クリーム（試験試料）と、化合物１および化合物２が含まれていないクリーム（比較例１、対照試料）を１日２回塗布した。各クリームを塗布した後、４週目、８週目にＭｅｘａｍｅｔｅｒとＣｈｒｏｍａｍｅｔｅｒを使用して機器のマニュアルに
したがって測定し、測定値は、正規性検定の後、評価時間による変化はＡＮＯＶＡを実施し、対応のあるｔ検定（ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ）により、試料適用の前後および週差別の試験試料／対照試料間の有意性可否を仮説平均差５％（Ｐ＜０．０５）で確認した。統計分析プログラムは、ＩＢＭ ＳＰＳＳ ｖｅｒｓｉｏｎ１８．０を用いた。

【0172】

その結果を下記表３および表４に示した。

【0173】

【表3】

【0174】

【表4】

【0175】

表３、表４に示されているように、本発明のオートファジー活性化によるメラノソーム分解誘導化合物とエンドサイトーシスの抑制によるメラノソーム流入抑制誘導化合物を含む化粧料組成物を使用したグループにおいてメラニン色素沈着および肌の明るさの変化が改善したことを確認することができた。また、メラニン色素沈着および肌の明るさの変化の改善率は、使用時間が経過するにつれて、より向上した効果を発現することを確認できた。

【0176】

以上、本発明は、特定された事項と限定された実施例により説明されているが、これは、本発明のより全般的な理解を容易にするために提供されたものであって、本発明は、前記の実施例に限定されるものではなく、本発明が属する分野において通常の知識を有する者であれば、かかる記載から様々な修正および変形が可能である。

【0177】

したがって、本発明の思想は、上述の実施例に限定して定まってはならず、後述する特許請求範囲だけでなく、本特許請求の範囲と均等または等価的な変形があるすべてのものなどは、本発明の思想の範疇に属するといえる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】