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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6880554
(24)【登録日】2021年5月10日
(45)【発行日】2021年6月2日
(54)【発明の名称】カビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6834 20180101AFI20210524BHJP
C12Q 1/6895 20180101ALI20210524BHJP
C12N 15/09 20060101ALI20210524BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6834 ZZNA
C12Q1/6895 Z
C12N15/09 Z
【請求項の数】11
【全頁数】25
(21)【出願番号】特願2016-45460(P2016-45460)
(22)【出願日】2016年3月9日
(65)【公開番号】特開2017-158470(P2017-158470A)
(43)【公開日】2017年9月14日
【審査請求日】2019年2月15日
(73)【特許権者】
【識別番号】000003768
【氏名又は名称】東洋製罐グループホールディングス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002354
【氏名又は名称】特許業務法人平和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】大津 貴義
(72)【発明者】
【氏名】田辺 卓
(72)【発明者】
【氏名】一色 淳憲
【審査官】
小林 薫
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１２／１６９０９９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０１０−０４２００５（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００７−１７４９０３（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１４−００３９４６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１３−０９９２５６（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２０１０−００４８８１（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特開２００８−２７８８４８（ＪＰ，Ａ）
【文献】
Mycotoxins, 2002, Vol.52, No.1, p.45-55
【文献】
第２９回ＧＭＰとバリデーションをめぐる諸問題に関するシンポジウム要旨集, 2014, p.45-50
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ｃ１２Ｑ １／００− ３／００
Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の（a）乃至（ｇ）に記載の塩基配列からなる第一乃至第七のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブを固定化し、二以上の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体。
（ａ）ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１、２及び４に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
（ｂ）リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
（ｃ）モナスカス・ルバー（Monascus ruber）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
（ｄ）サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
（ｅ）サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、
（ｆ）サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群、並びに、
（ｇ）ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群。
（ａ）ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１、２及び４に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
（ｂ）リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
（ｃ）モナスカス・ルバー（Monascus ruber）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
（ｄ）サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
（ｅ）サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、
（ｆ）サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群、並びに、
（ｇ）ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群。
【請求項2】
請求項１記載の第一乃至第七のプローブ群のプローブを固定化し、前記（ａ）乃至（ｇ）に記載の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体。
【請求項3】
以下の（ｈ）乃至（ｋ）に記載の塩基配列からなる第八乃至第十一のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブを固定化し、二以上の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体。
（ｈ）ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
（ｉ）エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
（ｊ）タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、並びに、
（ｋ）タラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群。
（ｈ）ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
（ｉ）エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
（ｊ）タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、並びに、
（ｋ）タラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群。
【請求項4】
請求項３記載の第八乃至第十一のプローブ群のプローブを固定化し、前記（ｈ）乃至（ｋ）に記載の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体。
【請求項5】
請求項１記載の第一乃至第七のプローブ群のプローブ、及び、請求項３記載の第八乃至第十一のプローブ群のプローブを固定化し、前記（ａ）乃至（ｋ）に記載の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体。
【請求項6】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域としてＩＴＳ領域を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、及びニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項１、２又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
前記標的領域としてＩＴＳ領域を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、及びニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項１、２又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項7】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域としてβ-チューブリン遺伝子を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項３、４又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
前記標的領域としてβ-チューブリン遺伝子を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項３、４又は５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項8】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、
前記標的領域としてＩＴＳ領域及びβ-チューブリン遺伝子を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項１記載の第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び請求項３記載の第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、請求項５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
前記標的領域としてＩＴＳ領域及びβ-チューブリン遺伝子を用い、
ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、
前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、
前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、
得られた増幅産物を、請求項１記載の第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び請求項３記載の第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、請求項５記載のカビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる
ことを特徴とするカビの検出方法。
【請求項9】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項１、２又は５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。
前記プライマーセットが、
配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項１、２又は５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。
【請求項10】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項３、４又は５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。
前記プライマーセットが、
配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項３、４又は５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。
【請求項11】
検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、
前記プライマーセットが、
配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項１記載の第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び請求項３記載の第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、請求項５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。
前記プライマーセットが、
配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、
前記担体が、請求項１記載の第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び請求項３記載の第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、請求項５記載のカビ検出用担体である
ことを特徴とするカビ検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、耐熱性カビを検出するためのカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットに関する。
【背景技術】
【0002】
近年、食品製造現場や臨床現場、農業現場、文化財保護環境等において、カビなどの微生物が存在するか否かを検査して安全性、健全性を確認するとともに、その繁殖を防止することが重要となっている。このようなカビの検査では、一般的に、環境中からカビを採取して前培養し、次いで菌種ごとに最適な培地で２０日程度の培養を行った後に、形態的特徴を観察することで、カビを同定する形態観察法（培養法）が行われている（特許文献１参照）。
【0003】
しかしながら、この方法では、カビ種ごとに分離培養することが必要であるため、検査工程が煩雑になるという問題があった。また、培養に長期間を要するため、例えばヒトが生活する屋内の検査や食物の検査、農業現場での植物病害診断など、迅速性が要求される検査には不適切であるという問題があった。さらに、形態的特徴を表す胞子が形成されないと同定ができず、労力が無駄になってしまう場合があるという問題もあった。
【0004】
また、最近は、カビの検査において遺伝子を用いた同定法も行われている。例えば、環境中から採取したカビを培養した後、培養されたカビからＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法などにより標的領域を増幅し、その増幅産物を解析することで、環境中のカビを同定することが行われている。増幅産物を解析する方法としては、電気泳動によって増幅産物のサイズを分析する方法や、増幅産物と相補的に結合するプローブを固定化したＤＮＡチップを用いる方法などが提案されている（特許文献２、３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２００７−１９５４５４号公報
【特許文献2】特許第５６７０６２３号公報
【特許文献3】特許第５１９６８４８号公報
【特許文献4】特開２０１０−４２００５号公報
【特許文献5】特開２００７−１７４９０３号公報
【特許文献6】特開２０１４−３９４６号公報
【特許文献7】特開２０１３−９９２５６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
ＤＮＡチップを用いる場合は、まず検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域に特異的に結合するプローブを作成して、ＤＮＡチップに固定化する。そして、環境もしくは製品や植物の検体中から採取したカビを培養して、カビのＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法などによりカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅する。さらに、その増幅産物をＤＮＡチップに滴下して、増幅産物をプローブにハイブリダイズさせ、増幅産物に含まれる標識の蛍光強度等を測定することでカビを検出する。ところで、環境中の検出対象のカビには様々な種類があるため、１個のＤＮＡチップにより複数のカビを同時に検出できることが望ましい。そのためには、ＤＮＡチップ上に複数のカビから選択されたプローブを固定化する必要がある。
【0007】
一方、プローブにハイブリダイズさせる標的領域の増幅産物は、所定のプライマーセットを用いてＰＣＲ法などにより得られるが、カビの種類によっては、単一の標的領域のみでは偽陽性反応が生じやすいものがあるため、複数のプライマーセットにより、複数の標的領域を同時に増幅させることが望ましい場合がある。また、培養したカビを個別に増幅させるのではなく、複数種類のカビを同時に増幅し、これら複数種類のカビから選択されたプローブを固定化したＤＮＡチップによるカビの検出を行えば、検査の迅速性は向上する。しかしながら、複数の標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行う場合には、プローブにもより高い精度で機能するものが求められる。また、同時に増幅させる検出対象のカビの数が増加すれば、プローブに要求される精度は一層高くなる。
【0008】
本発明者らは、耐熱性カビである、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の１１種類を検出対象のカビとし、これらを検出可能なカビ検出用担体を作成するために鋭意研究を行った。これら複数種類のカビのそれぞれのＤＮＡにおける特定の標的領域のうち、それぞれのカビにのみ特異的に結合する塩基配列を有し、かつ他の種類のカビには結合しない塩基配列を選択してプローブを作成すれば、理論上、各プローブによりこれら複数種類のカビをそれぞれ特異的に検出することが可能である。
【0009】
しかし、実際にはこのようにして得られたプローブであっても有効に機能するとは限らない。このため、各プローブを作成するためには、実験によってプローブの効果を確認しつつ、試行錯誤を繰り返すことによって、有効に機能するプローブを見いだすことが必要であった。
【0010】
ここで、ムーコル・ラセモサスとリクテイミア・コリムビフェラを検出するためのプローブが特許文献４に記載されている。また、モナスカス・ルバー、ニューロスポラ・クラッサのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲ法によって増幅させて検出するためのプライマーセットが特許文献５に記載されており、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラスのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲ法によって増幅させて検出するためのプライマーセットが特許文献６に記載されており、タラロマイセス・フラバス、タラロマイセス・バチリスポラスのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲ法によって増幅させて検出するためのプライマーセット等が特許文献７に記載されている。しかしながら、ムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの１１種類のカビを、それぞれ精度高く特異的に検出することが可能なプローブを固定化したカビ検出用担体は知られていない。
【0011】
本発明は、上記事情に鑑みなされたものであり、耐熱性カビであるムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの１１種類のカビを、迅速かつ精度高く特異的に検出することが可能なカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
上記目的を達成するため、本発明のカビ検出用担体は、以下の（a）乃至（ｇ）に記載の塩基配列からなる第一乃至第七のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブを固定化し、二以上の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体としてある。（ａ）ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１、２及び４に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
（ｂ）リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
（ｃ）モナスカス・ルバー（Monascus ruber）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
（ｄ）サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
（ｅ）サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第五のプローブ群、
（ｆ）サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第六のプローブ群、並びに、
（ｇ）ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群。
【0013】
また、本発明のカビ検出用担体は、上記第一乃至第七のプローブ群のプローブを固定化し、上記（ａ）乃至（ｇ）に記載の検出対象のカビを同時に検出する構成とすることが好ましい。
【0014】
また、本発明のカビ検出用担体は、以下の（ｈ）乃至（ｋ）に記載の塩基配列からなる第八乃至第十一のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブを固定化し、二以上の検出対象のカビを同時に検出することを特徴とするカビ検出用担体としてある。（ｈ）ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
（ｉ）エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
（ｊ）タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十のプローブ群、並びに、
（ｋ）タラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブ、当該プローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群。
【0015】
また、本発明のカビ検出用担体は、上記第八乃至第十一のプローブ群のプローブを固定化し、上記（ｈ）乃至（ｋ）に記載の検出対象のカビを同時に検出する構成とすることが好ましい。また、上記第一乃至第七のプローブ群のプローブ、及び、上記第八乃至第十一のプローブ群のプローブを固定化し、上記（ａ）乃至（ｋ）に記載の検出対象のカビを同時に検出する構成とすることが好ましい。
【0016】
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、前記標的領域としてＩＴＳ領域を用い、ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、及びニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記第一乃至第七のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、上記第一乃至第七のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、又は上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
【0017】
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、前記標的領域としてβ-チューブリン遺伝子を用い、ＰＣＲ用反応液に、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記第八乃至第十一のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、上記第八乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、又は上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
【0018】
また、本発明のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、前記標的領域としてＩＴＳ領域及びβ-チューブリン遺伝子を用い、ＰＣＲ用反応液に、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、前記試料に、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、前記ＰＣＲ用反応液を使用して、前記試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を、上記第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び上記第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体に滴下して、相補的な塩基配列を有するプローブと結合させる方法としてある。
【0019】
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、上記第一乃至第七のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、上記第一乃至第七のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、又は上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体である構成としてある。
【0020】
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、上記第八乃至第十一のプローブ群から選択された二以上のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、上記第八乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体、又は上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体である構成としてある。
【0021】
また、本発明のカビ検出用キットは、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定された担体を含むカビ検出用キットであって、前記プライマーセットが、配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び、配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマーと配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーからなるβ-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットを含み、前記担体が、上記第一乃至第七のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブ及び上記第八乃至第十一のプローブ群から選択された一以上のプローブ群のプローブが固定化されたカビ検出用担体、又は、上記第一乃至第十一のプローブ群のプローブが固定化された上記カビ検出用担体である構成としてある。
【0022】
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「プローブ群」は、プローブの集合を意味しており、複数のプローブからなる場合のみを意味するものではなく、一のプローブからなるものを含めてプローブ群と称している。
【発明の効果】
【0023】
本発明によれば、耐熱性カビであるムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、又はタラロマイセス・バチリスポラスを、精度高く特異的かつ多重で検出することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化されるプローブ（検出対象のカビ：ムーコル・ラセモサス（１）、リクテイミア・コリムビフェラ（２）、モナスカス・ルバー（３）、サーモアスカス・クラスタセウス（４）、サーモアスカス・オーランティアカス（５）、サーモアスカス・サーモフィラス（６）、ニグロスポラ・オリゼー（７））の塩基配列を示す図である。
【図2】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化されるプローブ（検出対象のカビ：ニューロスポラ・クラッサ（８）、エメリセラ・ニデュランス（９）、タラロマイセス・フラバス（１０）、タラロマイセス・バチリスポラス（１１）、ペシロマイセス・バリオッティ（１２）、ビソクラミス・ゾラニアエ（１３））の塩基配列を示す図である。
【図3】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体により検出する対象のカビの標的領域を増幅させるためのプライマーの塩基配列を示す図である。
【図4】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化したプローブ（検出対象のカビ：ムーコル・ラセモサス（１）、リクテイミア・コリムビフェラ（２）、モナスカス・ルバー（３）、サーモアスカス・クラスタセウス（４）、サーモアスカス・オーランティアカス（５）、サーモアスカス・サーモフィラス（６）、ニグロスポラ・オリゼー（７））について検出された蛍光強度のＳ／Ｎ比値を示す図である。
【図5】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体に固定化したプローブ（検出対象のカビ：ニューロスポラ・クラッサ（８）、エメリセラ・ニデュランス（９）、タラロマイセス・フラバス（１０）、タラロマイセス・バチリスポラス（１１）、ペシロマイセス・バリオッティ（１２）、ビソクラミス・ゾラニアエ（１３））について検出された蛍光強度のＳ／Ｎ比値を示す図である。
【図6】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体により検出する対象のカビを５種類ずつ含めた試料と各検出対象のカビに対応するプローブの配列番号を示す図である。
【図7】本発明の実施形態に係るカビ検出用担体により検出する対象のカビを５種類ずつ含めた試料について検出されたプローブ毎の蛍光強度のＳ／Ｎ比値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0025】
以下、本発明のカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの一実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の本実施形態及び後述する実施例の具体的な内容に限定されるものではない。
【0026】
［カビ検出用担体］（検出対象カビ）
本実施形態のカビ検出用担体により検出する対象のカビは、耐熱性カビである、ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）、リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）、モナスカス・ルバー（Monascus ruber）、サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）、サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）、サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）、ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）、ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）、タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）、及びタラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）の１１種類である。また、これらに、同じく耐熱性カビである、ペシロマイセス・バリオッティ（Paecilomyces variotii）、ビソクラミス・ゾラニアエ（Byssochlamys zollerniae）を加えた１３種類とすることも好ましい。
【0027】
これらの耐熱性カビは、例えば子嚢胞子のような耐熱性の高い構造を形成し、７５℃で３０分間の加熱処理を行っても生残することができる。耐熱性カビは、低温殺菌では完全な殺滅が困難であることから、食品や環境中においてこれらのカビの存在の有無を確認可能にすることが望ましい。
【0029】
配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプローブは、ムーコル・ラセモサスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブは、リクテイミア・コリムビフェラを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブは、モナスカス・ルバーを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・クラスタセウスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・オーランティアカスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブは、ニグロスポラ・オリゼーを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブである。
【0030】
配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブは、ニューロスポラ・クラッサを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブは、エメリセラ・ニデュランスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・フラバスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・バチリスポラスを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。
【0031】
また、図２に示す配列番号２３に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・バチリスポラスを検出するためのＩＴＳ領域から選択されたプローブであり、配列番号２４〜２５に示す塩基配列からなるプローブは、ペシロマイセス・バリオッティを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブであり、配列番号２６に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ゾラニアエを検出するためのβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブである。本実施形態のカビ検出用担体において、これらのプローブを固定化しても良い。
【0032】
本実施形態のカビ検出用担体では、上記の通り、プローブとして、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβ-チューブリン遺伝子から選択されたものを用いている。具体的には、図１に示すムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼーの７種類については、ＩＴＳ領域から選択されたプローブの特異性が高く、偽陽性反応が比較的生じにくいため、これらのプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。
また、図２に示すニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの４種類については、β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブの特異性が高く、偽陽性反応が比較的生じにくいため、これらのプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。
【0033】
なお、図２に示すタラロマイセス・バチリスポラスについては、ＩＴＳ領域から選択された配列番号２３に示す塩基配列からなるプローブも、当該カビの存否の判定に用いることができる。また、同図に示すペシロマイセス・バリオッティ、ビソクラミス・ゾラニアエの２種類についても、β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができる。
【0034】
（プローブの合成）本実施形態のカビ検出用担体に固定化される上記プローブは、いずれも１８〜３０塩基程度の長さであり、一般的なＤＮＡ合成装置により合成できる。後述する実施例でカビ検出用担体に固定化した配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブは、いずれもＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。なお、後述する実施例でＰＣＲに用いた配列番号２７〜３０に示す塩基配列からなるプライマーも１９〜２６塩基程度の長さであり、ＤＮＡ合成装置により合成したものを使用した。
【0035】
また、本実施形態における配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブは、当該配列そのものに限定されず、配列番号１〜２６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブを用いることができる。また、配列番号１〜２６に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブを用いることもできる。また、これらのプローブや、配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブを用いることもできる。
【0036】
なお、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡに対して高い相同性（相同性が９０％以上、好ましくは９５％以上）を有するＤＮＡが、配列番号１に示す塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡと、ハイブリダイズする条件が挙げられる。通常、完全ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）より約５℃〜約３０℃、好ましくは約１０℃〜約２５℃低い温度でハイブリダイゼーションが起こる場合をいう。ストリンジェントな条件については、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、特に11.45節「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｏｂｅｓ」に記載されている条件等を使用することができる。
【0037】
なお、図３に示す配列番号２７〜３０の塩基配列からなる各プライマー（配列番号２７及び２８のプライマーセット、配列番号２９及び３０のプライマーセットにおける各プライマー）についても同様に、当該配列そのものに限定されず、配列番号２７〜３０に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプライマーであって、配列番号２７〜３０に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。また、配列番号２７〜３０に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対して特異的にアニーリングできる核酸断片からなるプライマーであって、配列番号２７〜３０に示す塩基配列からなるプライマーを用いた場合と同一の領域を増幅できるものを用いることもできる。
【0038】
（カビ検出用担体の作成）本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブを用いて、既存の一般的な方法で製造することができる。
例えば、本実施形態のカビ検出用担体として貼り付け型のＤＮＡチップを作成する場合は、ＤＮＡスポッターによりプローブをガラス基板上に固定化して、各プローブに対応するスポットを形成することにより作成することができる。また、合成型ＤＮＡチップを作成する場合は、光リソグラフィ技術により、ガラス基板上で上記配列を備えた一本鎖オリゴＤＮＡを合成することにより作成することができる。さらに、基板はガラス製に限定されず、プラスチック基板やシリコンウエハー等を用いることもできる。また、基板の形状は平板状のものに限定されず、様々な立体形状のものとすることもでき、その表面に化学反応が可能となるように官能基を導入したものなどを用いることもできる。
【0039】
本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブの全部又は一部を固定化したものとすることができる。また、本実施形態のカビ検出用担体は、配列番号１〜２６に示す塩基配列において１又は数個の塩基が欠失、置換又は付加されたプローブの全部又は一部を固定化したものとすることも、配列番号１〜２６に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸断片に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブの全部又は一部を固定化したものとすることもでき、これらのプローブ又は配列番号１〜２６に示す塩基配列からなるプローブに対して相補的な塩基配列からなるプローブの全部又は一部を固定化したものとすることもできる。さらに、本実施形態のカビ検出用担体は、ＩＴＳ領域から選択されたプローブ、及びβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブのグループ毎に、それぞれのグループのカビを検出するためのプローブを固定化したものとすることができる。
【0040】
［カビの検出方法］本実施形態のカビの検出方法は、検出対象のカビのＤＮＡにおける標的領域をＰＣＲにより増幅させて、増幅産物の有無を確認する工程を含むカビの検出方法であって、標的領域の増幅を行うためのＰＣＲ用反応液において、上記のＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセット、及び／又は、β-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットと、試料とを含有させ、試料に検出対象のカビの少なくともいずれかのＤＮＡが含有されている場合、ＰＣＲ用反応液を使用して、試料に含有されるＤＮＡにおける標的領域を増幅させ、得られた増幅産物を上述したカビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させる方法であれば良く、具体的な実施形態及び実施例の構成に限定されるものではないが、例えば（１）カビの採取、（２）ＤＮＡの抽出、（３）標的領域の増幅、及び（４）増幅産物の確認を含むものとすることができる。
【0041】
（１）カビの採取例えば空中浮遊カビを採取する場合、検査対象の環境中における室内又は屋外の空気を採取する。そして、採取した空気を専用培地に吹き付けて、空気中に含まれるカビの培養を行う。培地としては、所定の寒天培地などをエアーサンプラー用にストリップ形状にしたものを使用することが好ましい。培養条件としては、２５℃で暗所に６５時間以上静置することが好ましい。
次に、ストリップにおいて培養されたカビのコロニーを、コロニー毎に個別に採取し、又は二以上のコロニーを一括して採取し、液体窒素などによりコロニーを凍結して、コロニーに含まれるカビの細胞を破砕する。
例えば植物検体のカビを採取する場合、ハサミやカッターなどを用いて、検査対象の罹病組織片あるいは健全組織片を採取する。そして採取した植物組織片を次亜塩素酸やエタノールで表面殺菌後、専用培地に置床して、植物組織中に含まれるカビの培養を行う。培養条件としては、２０℃〜２５℃の範囲内で６５時間以上静置することが好ましい。
【0042】
（２）ＤＮＡの抽出次に、このようにして得られたカビの細胞の破砕物からゲノムＤＮＡを抽出する。ゲノムＤＮＡの抽出は、ＣＴＡＢ法（Cetyl trimethyl ammonium bromide）による方法やＤＮＡ抽出装置を用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
また土壌中から直接カビのＤＮＡを抽出することもできる。ＤＮＡの抽出は直接溶菌法（Direct Lysis Method）による方法や土壌ＤＮＡ抽出キットを用いる方法など、一般的な手法により行うことができる。
【0043】
（３）標的領域の増幅次に、抽出したゲノムＤＮＡにおける標的領域を増幅させる。すなわち、ゲノムＤＮＡにおける標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅させる。この標的領域の増幅方法は、特に限定されないが、ＰＣＲ法を好適に用いることができる。ＰＣＲ法では、標的領域を増幅させるためのプライマーセットを含有するＰＣＲ反応液を用いて、標的領域を増幅させる。ＰＣＲ装置としては、一般的なサーマルサイクラーなどを用いることができる。
本実施形態のカビの検出方法では、例えば以下のような反応条件でＰＣＲを行うことにより、各種カビの標的領域を好適に増幅させることができる。
（ａ）９５℃ １０分、（ｂ）９５℃（ＤＮＡ変性工程） ３０秒、（ｃ）５６℃（アニーリング工程） ３０秒、（ｄ）７２℃（ＤＮＡ合成工程） ６０秒（（ｂ）〜（ｄ）を４０サイクル）、（ｅ）７２℃ １０分
【0044】
ＰＣＲ用反応液としては、例えば以下の組成からなるものを使用することが好ましい。すなわち、核酸合成基質（ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（dCTP、dATP、dTTP、dGTP）など）、プライマーセット、核酸合成酵素（Ｎｏｖａ Ｔａｑ ＨｏｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅなど）、蛍光標識試薬（Ｃｙ５−ｄＣＴＰなど）、試料のゲノムＤＮＡ、緩衝液、及び残りの成分として水を含むＰＣＲ反応液を好適に使用することができる。なお、緩衝液としては、例えばＡｍｐｄｉｒｅｃｔ（登録商標）（株式会社島津製作所製）を用いることができる。
【0045】
本実施形態では、カビのゲノムＤＮＡにおけるＩＴＳ領域及び／又はβ-チューブリン遺伝子を標的領域として、ＤＮＡ断片の増幅が行われる。このとき、ＩＴＳ領域を増幅させるためのプライマーセットとしては、図３に示す配列番号２７及び２８の塩基配列からなるもの（配列番号２７：フォワードプライマー、配列番号２８：リバースプライマー）を用いることが好ましい。
また、β-チューブリン遺伝子を増幅させるためのプライマーセットとしては、同図に示す配列番号２９及び３０の塩基配列からなるもの（配列番号２９：フォワードプライマー、配列番号３０：リバースプライマー）を用いることが好ましい。
【0046】
（４）増幅産物の確認次に、増幅産物を本実施形態のカビ検出用担体に滴下し、このカビ検出用担体に固定化されたプローブにハイブリダイズした増幅産物の標識を検出することで、増幅産物の有無を確認する。これによって、検査対象の環境中に存在しているカビを特定することができる。
標識の検出は、蛍光スキャニング装置など一般的な標識検出装置を用いて行うことができ、例えば東洋鋼鈑株式会社のＢＩＯＳＨＯＴ（登録商標）を用いて、増幅産物の蛍光強度を測定することにより行うことができる。測定結果は、Ｓ／Ｎ比（Signal to Noise ratio）値として得ることが好ましい。Ｓ／Ｎ比値にもとづいて、測定結果が陽性であるか陰性であるかを精度高く判定することができるためであり、一般にＳ／Ｎ比値が３以上の場合に、陽性と判定することができる。本明細書中に記載のＳ／Ｎ比値は、（メディアン蛍光強度値−バックグラウンド値）÷バックグラウンド値にて算出される。なお、標識としては蛍光に限定されず、その他のものを用いることもできる。
【0047】
［カビ検出用キット］本実施形態のカビ検出用キットには、カビのＤＮＡにおける標的領域を含む核酸断片を増幅させるためのプライマーセットと、増幅産物の有無を確認するためのプローブが固定されたカビ検出用担体とが含まれる。本実施形態のカビ検出用キットは、プライマーセットを用いて増幅された増幅産物をカビ検出用担体に滴下して、増幅産物を相補的な塩基配列を有するプローブに結合させることによってカビを検出するために用いられる。
プライマーセット及びカビ検出用担体は、上述したＩＴＳ領域から選択されたプローブ、及びβ-チューブリン遺伝子から選択されたプローブのグループ毎に、それぞれ以下の構成とすることができる。
【0048】
ＩＴＳ領域から選択されたプローブのグループ：検出対象のカビが、ムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼーの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
【0049】
また、カビ検出用担体としては、具体的には、以下の構成とすることが好ましい。ムーコル・ラセモサス（Mucor racemosus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第一のプローブ群、
リクテイミア・コリムビフェラ（Lichtheimia corymbifera）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第二のプローブ群、
モナスカス・ルバー（Monascus ruber）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号８〜９に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第三のプローブ群、
サーモアスカス・クラスタセウス（Thermoascus crustaceus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１０〜１１に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第四のプローブ群、
サーモアスカス・オーランティアカス（Thermoascus aurantiacus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブからなる第五のプローブ群、
サーモアスカス・サーモフィラス（Thermoascus thermophilus）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブからなる第六のプローブ群、並びに、
ニグロスポラ・オリゼー（Nigrospora oryzae）を検出するための、ＩＴＳ領域から選択された配列番号１４〜１５に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第七のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
【0050】
β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブのグループ： 検出対象のカビが、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスの少なくともいずれかの場合、プライマーセットとしては、β-チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いることが好ましい。
【0051】
また、カビ検出用担体としては、具体的には、以下の構成とすることが好ましい。ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１６〜１７に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第八のプローブ群、
エメリセラ・ニデュランス（Emericella nidulans）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号１８〜１９に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第九のプローブ群、
タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブからなる第十のプローブ群、並びに、
タラロマイセス・バチリスポラス（Talaromyces bacillisporus）を検出するための、β-チューブリン遺伝子から選択された配列番号２１〜２２に示す塩基配列からなるプローブの少なくともいずれかからなる第十一のプローブ群のプローブを固定化したカビ検出用担体。
【0052】
また、本実施形態のカビ検出用キットとして、ＩＴＳ領域を増幅させるための配列番号２７に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２８に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセット、並びに、β-チューブリン遺伝子を増幅させるための配列番号２９に示す塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３０に示す塩基配列からなるリバースプライマーを備えたプライマーセットを用いると共に、上記全ての群のプローブを固定化したカビ検出用担体を用いることも好ましい。
【0053】
本実施形態のカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットによれば、上記１１種類の耐熱性カビを特異的に識別できるプローブを用いることにより、これらのカビを適切に検出することができる。このため、本実施形態により、カビの存否を確認するための環境検査等において、これらのカビを迅速かつ精度高く検出することが可能となる。
【実施例】
【0054】
以下、本発明の実施形態に係るカビ検出用担体、カビの検出方法、及びカビ検出用キットの実施例の効果を確認するために行った試験について、具体的に説明する。
【0055】
［試験１］カビ検出用担体としては、ジーンシリコン（登録商標）（東洋鋼鈑株式会社製）を用い、図１〜２に示される配列番号１〜２６のプローブを固定化したものを使用した。各プローブは、シグマ アルドリッチジャパン株式会社により合成したものを使用した。また、各プローブの基板への固定化は、マイクロアレイヤーにより行った。
【0056】
検出対象のカビとしては、独立行政法人理化学研究所 バイオリソースセンター 微生物材料開発室（Japan Collection of Microorganisms）及び独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジー本部 生物遺伝資源部門（NITE Biological Resource Center）から入手した菌株を使用した。具体的には、以下の１３種類のカビにつき、１３種類の菌株を使用した。
【0057】
（１）ムーコル・ラセモサス NBRC4555（２）リクテイミア・コリムビフェラ NBRC4009
（３）モナスカス・ルバー NBRC4483
（４）サーモアスカス・クラスタセウス NBRC9129
（５）サーモアスカス・オーランティアカス NBRC6766
（６）サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
（７）ニグロスポラ・オリゼー NBRC32860
（８）ニューロスポラ・クラッサ NBRC6067
（９）エメリセラ・ニデュランス NBRC4340
（１０）タラロマイセス・フラバス NBRC7232
（１１）タラロマイセス・バチリスポラス NBRC31150
（１２）ペシロマイセス・バリオッティ NBRC100534
（１３）ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
【0058】
これらのカビを上記菌株毎に培養した。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。さらに、培養したカビのコロニーを採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に個別に入れ、液体窒素に浸して試料を凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。
次いで、ＤＮＡ抽出装置によりカビのゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域又はβ-チューブリン遺伝子を菌株毎に増幅した。
【0059】
ＰＣＲ用反応液には、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとβ-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットの両方を含有させて、これらの標的領域の増幅反応を行った。ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットとしては、図３に示す配列番号２７の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号２８の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。また、β-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットとしては、同図に示す配列番号２９の塩基配列からなるフォワードプライマー及び配列番号３０の塩基配列からなるリバースプライマーを用いた。これらのプライマーは、シグマ アルドリッチジャパン株式会社により合成したものを使用した。
【0060】
なお、図１に示すカビについては、ＩＴＳ領域から選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができるため、ＰＣＲ用反応液にＩＴＳ領域増幅用プライマーセットを含有させ、β-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを含有させることなく、標的領域の増幅反応を行うようにすることもできる。同様に、図２に示すカビについては、β-チューブリン遺伝子から選択されたプローブにおいて陽性反応が得られた場合に、当該カビが存在していると判定することができるため、ＰＣＲ用反応液にβ-チューブリン遺伝子増幅用プライマーセットを含有させ、ＩＴＳ領域増幅用プライマーセットを含有させることなく、標的領域の増幅反応を行うようにすることもできる。
【0061】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（株式会社島津製作所製）を使用し、１３種類の菌株毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。１．Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
２．Ampdirect(addition-4) 4.0μl
３．dNTPmix 1.0μl
４．Cy-5dCTP 0.2μl
５．ITS1-Fw primer（配列番号２７）(2.5μM) 1.0μl
６．ITS1-Rv primer（配列番号２８）(2.5μM) 1.0μl
７．BtF primer（配列番号２９）(10μM) 1.0μl
８．BtR primer（配列番号３０）(10μM) 1.0μl
９．Template DNA 1.0μl
１０．NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【0062】
上記ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（登録商標） Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。（a）９５℃ １０分
（b）９５℃ ３０秒
（c）５６℃ ３０秒
（d）７２℃ ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃ １０分
【0063】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、上記カビ検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ，東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定して、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を算出した。その結果を図４〜図５に示す。
【0064】
これらの図に示すように、配列番号１〜２６に示される塩基配列をそれぞれ有するプローブにおけるＳ／Ｎ比値は、いずれも３以上となっており、陽性と判断できる。したがって、これらのプローブは、ぞれぞれの対象カビを検出するために、有効に機能していることがわかる。
【0065】
［試験２］検出対象の複数のカビのＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合に、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブが有効に機能するかを確認するための試験を行った。
【0066】
カビ検出用担体は、試験１と同じものを使用した。また、検出対象のカビも試験１と同じく１３種類のカビについて、１３種類の菌株を使用した。本試験では、図６に示すように、これらのカビをランダムに５種類ずつ組み合わせ、以下の５つのグループの混合ＤＮＡ試料を作成した。したがって、一部のカビは、複数の試料に重複して含まれている。培養は、ＰＤＡ培地またはＭ４０Ｙ培地を用いて、２５℃の暗所で、７日間静置させて行った。
【0067】
（試料１）（１）ムーコル・ラセモサス NBRC4555
（４）サーモアスカス・クラスタセウス NBRC9129
（６）サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
（９）エメリセラ・ニデュランス NBRC4340
（１１）タラロマイセス・バチリスポラス NBRC31150
【0068】
（試料２）（２）リクテイミア・コリムビフェラ NBRC4009
（５）サーモアスカス・オーランティアカス NBRC6766
（８）ニューロスポラ・クラッサ NBRC6067
（１０）タラロマイセス・フラバス NBRC7232
（１３）ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
【0069】
（試料３）（３）モナスカス・ルバー NBRC4483
（６）サーモアスカス・サーモフィラス NBRC9643
（７）ニグロスポラ・オリゼー NBRC32860
（１２）ペシロマイセス・バリオッティ NBRC100534
（１３）ビソクラミス・ゾラニアエ JCM12808
【0070】
そして、培養したカビのコロニーを採取し、φ０．５ｍｍジルコニアビーズを入れたバイアル瓶に入れ、液体窒素に浸してコロニーを凍結した後、振盪装置を用いて、カビの細胞を破砕した。次いで、ＤＮＡ抽出装置により各カビのゲノムＤＮＡを抽出したものを、上記試料１〜３に示す通りに混合した。そして、ＰＣＲ法により、各カビのＩＴＳ領域及び／又はβ-チューブリン遺伝子を試料毎に同時に増幅した。ＰＣＲ法で用いたプライマーセットは、試験１におけるものと同一であり、ＩＴＳ領域を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号２７及び２８に示される塩基配列からなるプライマーを使用し、β-チューブリン遺伝子を増幅するためのプライマーセットとして、配列番号２９及び３０に示される塩基配列からなるプライマーを使用した。
【0071】
ＰＣＲ用反応液としては、Ａｍｐｄｉｒｅｃｔ（株式会社島津製作所製）を使用し、試料毎に、次の組成のものを２０μｌ作成した。１．Ampdirect(G/Crich) 4.0μl
２．Ampdirect(addition-4) 4.0μl
３．dNTPmix 1.0μl
４．Cy-5dCTP 0.2μl
５．ITS1-Fw primer(2.5μM) 1.0μl
６．ITS1-Rv primer(2.5μM) 1.0μl
７．BtF primer(10μM) 1.0μl
８．BtR primer(10μM) 1.0μl
９．Template DNA（1.0μl／菌株） 1.0μl×菌株数
１０．NovaTaq HotStart DNA polymerase 0.2μl
１１．水（全体が２０．０μｌになるまで加水）
【0072】
上記各ＰＣＲ用反応液を使用して、核酸増幅装置（ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｇｒａｄｉｅｎｔ タカラバイオ株式会社製）により、試験１と同様に、次の条件でＤＮＡの増幅を行った。（a）９５℃ １０分
（b）９５℃ ３０秒
（c）５６℃ ３０秒
（d）７２℃ ６０秒（（b）〜（d）を４０サイクル）
（e）７２℃ １０分
【0073】
次に、ＰＣＲ増幅産物に緩衝液（３×ＳＳＣクエン酸−生理食塩水＋０．３％ＳＤＳ）を混合して、９４℃で５分間加温し、カビ検出用担体（ＤＮＡチップ）に滴下した。このカビ検出用担体を４５℃で１時間静置し、上記緩衝液を用いてハイブリダイズしなかったＰＣＲ産物をＤＮＡチップから洗い流した。そして、標識検出装置（ＢＩＯＳＨＯＴ，東洋鋼鈑株式会社製）を用いて、カビ検出用担体に固定化された各プローブにおける蛍光強度（プローブに結合した増幅産物の蛍光強度）を測定し、各プローブにおけるＳ／Ｎ比値を取得した。その結果を図７に示す。
【0074】
試料１に含まれるカビを検出するためのプローブは、図６に示すように、配列番号１〜４，１０，１１，１３，１８，１９，２１〜２３に示す塩基配列からなるプローブである。配列番号１〜４に示す塩基配列からなるプローブは、ムーコル・ラセモサスを検出するためのプローブである。このうち、配列番号１，２，４については、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。配列番号３については、５種類のカビを含むマルチプレックスＰＣＲを行った試験２では陽性反応は示さなかったが、１種類のカビのみを個別に増幅した試験１においては、陽性反応を示している。
配列番号１０，１１に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・クラスタセウスを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１８，１９に示す塩基配列からなるプローブは、エメリセラ・ニデュランスを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２１〜２３に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・バチリスポラスを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料１に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【0075】
試料２に含まれるカビを検出するためのプローブは、図６に示すように、配列番号５〜７，１２，１６，１７，２０，２６に示す塩基配列からなるプローブである。配列番号５〜７に示す塩基配列からなるプローブは、リクテイミア・コリムビフェラを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１２に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・オーランティアカスを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１６，１７に示す塩基配列からなるプローブは、ニューロスポラ・クラッサを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２０に示す塩基配列からなるプローブは、タラロマイセス・フラバスを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２６に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ゾラニアエを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料２に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【0076】
試料３に含まれるカビを検出するためのプローブは、図６に示すように、配列番号８，９，１３，１４，１５，２４，２５，２６に示す塩基配列からなるプローブである。配列番号８，９に示す塩基配列からなるプローブは、モナスカス・ルバーを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１３に示す塩基配列からなるプローブは、サーモアスカス・サーモフィラスを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号１４，１５に示す塩基配列からなるプローブは、ニグロスポラ・オリゼーを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２４，２５に示す塩基配列からなるプローブは、ペシロマイセス・バリオッティを検出するためのプローブである。これらについては、Ｓ／Ｎ比値はいずれも３以上であり、陽性反応を示している。
配列番号２６に示す塩基配列からなるプローブは、ビソクラミス・ゾラニアエを検出するためのプローブである。これについては、Ｓ／Ｎ比値は３以上であり、陽性反応を示している。
また、これら以外のプローブについては、陽性反応は見られない。すなわち、これら以外のプローブについて偽陽性反応は生じておらず、試料３に含まれるカビを検出するための各プローブによれば、検出対象のカビ以外のカビが、誤って検出されないことが示されている。
【0077】
以上の通り、本実施形態のカビ検出用担体に固定化したプローブは、検出対象の複数のカビのＤＮＡにおける標的領域を同時に増幅させるマルチプレックスＰＣＲを行った場合でも、ほぼ有効に機能することが明らかとなった。また、これらのプローブは、特異性が高く、偽陽性反応が見られないことも明らかとなった。
【0078】
本発明は、以上の実施形態や実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲内において、種々の変更実施が可能であることは言うまでもない。例えば、本実施形態のカビ検出用担体に固定化するプローブは、１種類につき１スポットずつに限定されるものではなく、それぞれのプローブを複数スポットずつ固定化しても良い。また、本実施形態の検出対象カビ以外のカビを検出するためのその他のプローブが、本実施形態におけるプローブと共に本実施形態のカビ検出用担体に固定化されていても良く、適宜変更することが可能である。
また、本発明における対象カビに関連するアナモルフ型・テレオモルフ型・異名を持つカビも当然検出可能であり、検出対象カビ名は最新の系統分類研究に準ずるものとする。
【産業上の利用可能性】
【0079】
本発明は、環境検査、食品検査、疫学的環境検査、臨床試験、家畜衛生、植物病害診断等において、耐熱性カビであるムーコル・ラセモサス、リクテイミア・コリムビフェラ、モナスカス・ルバー、サーモアスカス・クラスタセウス、サーモアスカス・オーランティアカス、サーモアスカス・サーモフィラス、ニグロスポラ・オリゼー、ニューロスポラ・クラッサ、エメリセラ・ニデュランス、タラロマイセス・フラバス、及びタラロマイセス・バチリスポラスを特異的かつ多重に検出する場合に好適に利用することが可能である。
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]