特許 6882172 神経変性疾患の治療に有用なＴＤＰ−４３結合性ポリペプチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】特許公報(B2)

(11)【特許番号】6882172

(24)【登録日】2021年5月10日

(45)【発行日】2021年6月2日

(54)【発明の名称】神経変性疾患の治療に有用なＴＤＰ−４３結合性ポリペプチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20210524BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20210524BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20210524BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20210524BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20210524BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20210524BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20210524BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20210524BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20210524BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20210524BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20210524BHJP

   A61P 21/02 20060101ALI20210524BHJP

   A61P 25/28 20060101ALI20210524BHJP

   A61P 25/00 20060101ALI20210524BHJP

   A61P 25/16 20060101ALI20210524BHJP

   A61P 9/10 20060101ALI20210524BHJP

【ＦＩ】

   C12N15/13ZNA

   C12N15/63 Z

   C07K16/18

   C07K16/46

   A61K39/395 N

   C12P21/08

   C12N15/09 Z

   C12N5/10

   C12N1/15

   C12N1/19

   C12N1/21

   A61P21/02

   A61P25/28

   A61P25/00

   A61P25/16

   A61P9/10

【請求項の数】18

【全頁数】56

(21)【出願番号】特願2017-529766(P2017-529766)

(86)(22)【出願日】2015年12月7日

(65)【公表番号】特表2018-502561(P2018-502561A)

(43)【公表日】2018年2月1日

(86)【国際出願番号】CA2015051280

(87)【国際公開番号】WO2016086320

(87)【国際公開日】20160609

【審査請求日】2018年12月6日

(31)【優先権主張番号】2,874,083

(32)【優先日】2014年12月5日

(33)【優先権主張国】CA

(31)【優先権主張番号】62/088,012

(32)【優先日】2014年12月5日

(33)【優先権主張国】US

(73)【特許権者】

【識別番号】516151612

【氏名又は名称】ユニバルシテ ラバル

(74)【代理人】

【識別番号】100107456

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 成人

(74)【代理人】

【識別番号】100162352

【弁理士】

【氏名又は名称】酒巻 順一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100123995

【弁理士】

【氏名又は名称】野田 雅一

(72)【発明者】

【氏名】ジュリアン， ジャン−ピエール

(72)【発明者】

【氏名】グラヴェル， クロード

(72)【発明者】

【氏名】ポッツィ， シルヴィア

【審査官】 池上 京子

(56)【参考文献】

【文献】 Molecular Therapy，２０１４年 ５月，vol.22, Supplement 1，p.S149-S150

(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）

Ｃ０７Ｋ １６／００−１６／４６

Ｃ１２Ｎ ５／００−５／２８

Ｃ１２Ｎ １５／００−１５／９０

Ｃ１２Ｐ ２１／００−２１／０８

ＣＡｐｌｕｓ（ＳＴＮ）、ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ）、ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ）、ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）

(57)【特許請求の範囲】

【請求項1】

３つのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域ＶＨを含む、ＴＡＲ−ＤＮＡ結合タンパク質４３ｋＤａ（ＴＤＰ−４３）に特異的に結合する抗原結合性構築物であって、
（ａ）Ｅ６＿ＶＨ１のＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号８）及びＣＤＲ３（配列番号９）、並びにＥ６＿Ｖκ９のＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）及びＣＤＲ３（配列番号１５）；及び
（ｂ）Ｅ６＿ＶＨ７のＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）及びＣＤＲ３（配列番号１２）、並びにＥ６＿Ｖκ９のＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）及びＣＤＲ３（配列番号１５）；
からなる群より選択される３つのＶＨ ＣＤＲ及び３つのＶＬ ＣＤＲを含む、
抗原結合性構築物。

【請求項2】

（ａ）Ｅ６＿ＶＨ１又はＥ６＿ＶＨ７のＶＨ；あるいは
（ｂ）Ｅ６＿ＶＨ１又はＥ６＿ＶＨ７のＶＨに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるＶＨ
を含む、請求項１に記載の抗原結合性構築物。

【請求項3】

（ａ）Ｅ６＿ＶＨ１のＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号８）及びＣＤＲ３（配列番号９）、並びにＥ６＿Ｖκ９のＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）及びＣＤＲ３（配列番号１５）を含む、請求項１又は２に記載の抗原結合性構築物。

【請求項4】

Ｅ６＿ＶＨ７のＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）及びＣＤＲ３（配列番号１２）、並びにＥ６＿Ｖκ９のＣＤＲ１（配列番号１３）、ＣＤＲ２（配列番号１４）及びＣＤＲ３（配列番号１５）を含む、請求項１又は２に記載の抗原結合性構築物。

【請求項5】

抗原結合ポリペプチドを含み、前記抗原結合ポリペプチドが、
（ａ）Ｅ６＿Ｖκ９のＶＬか；又は
（ｂ）Ｅ６＿Ｖκ９のＶＬに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるＶＬ；
及び／あるいは、
（ｃ）Ｅ６＿ＶＨ１若しくはＥ６＿ＶＨ７のＶＨ領域と、Ｅ６＿Ｖκ９のＶＬ領域と、
を含む、請求項３又は４に記載の抗原結合性構築物。

【請求項6】

ｉ）Ｅ６＿ＶＨ７のＶＨ及びＥ６＿Ｖκ９のＶＬ；又は
ｉｉ）Ｅ６＿ＶＨ１のＶＨ及びＥ６＿Ｖκ９のＶＬ
を含む、請求項４又は５に記載の抗原結合性構築物。

【請求項7】

ＶＨとＶＬとの間にペプチドリンカーを含み、任意選択的に、前記リンカーがアミノ酸配列ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４７）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項8】

Ｅ６＿ＶＨ７Ｖκ９及びＥ６＿ＶＨｌＶκ９の少なくとも１つを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項9】

ＭＧＤＮＤＩＨＦＡＦＬＳＴＧＶＨＳＱＶＱ（配列番号４８）であってもよい分泌シグナルペプチドを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項10】

（ａ）ｓｃＦｖフォーマット、Ｆａｂフォーマット、単一ドメイン抗体フォーマット、若しくは（Ｆａｂ’）_２フォーマットを有する、請求項３〜９のいずれか一項；
（ｂ）Ｆｃドメインを有する、請求項１〜９のいずれか一項；及び／又は
（ｃ）ヒト化されている、請求項１〜９のいずれか一項
に記載の抗原結合性構築物。

【請求項11】

Ｆｃドメインを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項12】

ヒト化されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項13】

請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物と、医薬的に許容される添加剤とを含む医薬組成物。

【請求項14】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、パーキンソン病、前頭側頭脳葉変性症（ＦＴＬＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レーヴィ小体疾患、脳損傷及び脳虚血から選択される疾患又は障害を治療又は予防するための、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、パーキンソン病、前頭側頭脳葉変性症（ＦＴＬＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レーヴィ小体疾患、脳損傷及び脳虚血から選択される疾患又は障害を治療又は予防するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物。

【請求項16】

筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、パーキンソン病、前頭側頭脳葉変性症（ＦＴＬＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レーヴィ小体疾患、脳損傷及び脳虚血から選択される疾患又は障害を治療又は予防するための、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗原結合性構築物をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。

【請求項17】

請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、抗原結合性構築物の発現に適した条件下で培養するステップと、前記構築物を精製するステップとを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物を製造する方法。

【請求項18】

請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物の少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、ポリヌクレオチド若しくは単離されたポリヌクレオチドのセット；１つ若しくは複数の前記ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む、ベクター若しくはベクターのセット；前記ポリヌクレオチド若しくはポリヌクレオチドのセットを含む単離細胞；又は請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗原結合性構築物と使用説明書とを含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

[0001]本願は、ＴＤＰ−４３に特異的に結合する抗体及びその断片などのＴＤＰ４３（４３ｋＤＡのＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）特異的結合性構築物に関する。本願はまた、ＴＤＰ−４３タンパク質症を特徴とする疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー病（Ａｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、運動ニューロン疾患、パーキンソン病及び前頭側頭脳葉変性症などの診断及び治療においてＴＤＰ−４３結合ポリペプチドを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

[0002]神経変性疾患は、脳及び脊髄の特定範囲における選択的な神経変性を特徴とする。「ルーゲーリッグ病」として一般に知られている筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、病因不明の進行性神経変性疾患である。この疾患は、随意筋の運動を制御する個体の能力を次第に損なっていく。この疾患は急速に進行し、ほとんどの症例で診断の２〜５年以内に麻痺及び死亡に至る傾向がある。

【0003】

[0003]ＴＤＰ−４３関連の比較的最近の発見により、ＡＬＳで機能する病理的機序に対し基本的な洞察がもたらされてきた。ＴＤＰ−４３は、ＡＬＳ患者から得られた脊髄サンプル中の核内因子−κΒ（ＮＦ−κΒ）のｐ６５サブユニットの炎症制御転写因子に関連しているが、対照患者の脊髄サンプルではそうでないことが示された（Ｖ．Ｓｗａｍｐ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０８：２４２９−２４４７）。

【0004】

[0004]現在、ＡＬＳに罹患する患者にとって治療上の選択肢はほとんどない。ＡＬＳの治療用としてＦＤＡにより唯一承認された医薬品は１９９５年に導入されたリルテック（Ｒｉｌｕｔｅｋ）（登録商標）であり、これはＡＬＳに罹患している個体の平均寿命を数ヶ月延長する。したがって、ＡＬＳなどの神経変性疾患に対する新規の治療上のアプローチが必要とされている。

【0005】

[0005]ＴＤＰ−４３タンパク質障害を特徴とする神経変性疾患の症状が他の神経筋障害の症状と似ているので、ＡＬＳなどの疾患は診断が困難である。診断は、通常、完全な神経学的検査及び臨床試験に基づいている。したがって、ＡＬＳ及びＦＴＬＤ−Ｕなどの神経変性疾患を発症しやすい対象、又はＡＬＳ及びＦＴＬＤ−Ｕなどの神経変性疾患に罹患しやすい対象を評価するための方法及び試薬が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

[0006]本明細書では、ＴＤＰ−４３（４３ｋＤａのＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）に結合する抗原結合性構築物、例えば、断片、誘導体及び変異体を含む抗体などを提供する。一実施形態において、抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインに特異的に結合する。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、細胞で発現される場合、細胞におけるＮＦ−κΒのｐ６５サブユニットへのＴＤＰ−４３の結合を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％ ５０％、７０％、８０％又は９０％まで阻害する。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、細胞で発現される場合、細胞においてＬＰＳに応答するＮＦ−κΒの活性化を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％ ５０％、７０％、８０％又は９０％までに低減する。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、細胞で発現される場合、細胞における核ＴＤＰ−４３のレベルを少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％ ５０％、７０％、８０％又は９０％まで低減する。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、エタクリン酸処理したＨｅｋ２９３細胞で発現される場合、ＴＤＰ−４３不溶性を少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％ ５０％、７０％、８０％又は９０％まで低減する。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、ＴＮＦαと共にインキュベートしたＨｅｋ２９３細胞で発現される場合、細胞ＴＤＰ−４３のリジンアセチル化のレベルを少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％ ５０％、７０％、８０％又は９０％まで低減する。

【0007】

[0007]本明細書では、（配列番号７）、（配列番号８）、（配列番号９）（配列番号１０）、（配列番号１１）、（配列番号１２）、（配列番号１２）、（配列番号１４）、（配列番号１５）（配列番号１６）、（配列番号１７）、（配列番号１８）（配列番号１９）、（配列番号２０）、（配列番号２１）（配列番号２２）、（配列番号２３）及び（配列番号２４）に記載したアミノ酸配列から選択される、少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＴＤＰ−４３に特異的に結合する抗原結合性構築物を提供する。

【0008】

[0008]また本明細書では、３つのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域ＶＨを含む、ＴＤＰ−４３に特異的に結合する抗原結合性構築物であって、上記ＶＨが、
Ｅ６＿ＶＨ１ ＣＤＲ１、Ｅ６＿ＶＨ７ ＣＤＲ１、Ｃ１０＿ＶＨ３ ＣＤＲ１及びＣ１０＿ＶＨ４ ＣＤＲ１から選択されるＣＤＲ；
Ｅ６＿ＶＨ１ ＣＤＲ２、Ｅ６＿ＶＨ７ ＣＤＲ２、Ｃ１０＿ＶＨ３ ＣＤＲ２及びＣ１０＿ＶＨ４ ＣＤＲ２から選択されるＣＤＲ；並びに／又は、
Ｅ６＿ＶＨ１ ＣＤＲ３、Ｅ６＿ＶＨ７ ＣＤＲ３、Ｃ１０＿ＶＨ３ ＣＤＲ３及びＣ１０＿ＶＨ４ ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲ
のうちの１つ、２つ又は３つを含む、抗原結合性構築物を提供する。

【0009】

[0009]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、これらのＶＨ ＣＤＲに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である１つ、２つ又は３つのＶＨ ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿ＶＨ１、Ｅ６＿ＶＨ７、Ｃ１０＿ＶＨ３若しくはＣ１０＿ＶＨ４のＶＨ領域、又はＥ６＿ＶＨ１、Ｅ６＿ＶＨ７、Ｃ１０＿ＶＨ３又はＣ１０＿ＶＨ４のＶＨと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるＶＨ領域を含む。

【0010】

[0010]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、可変軽鎖領域ＶＬであって、上記ＶＬが３つのＶＬ ＣＤＲを含み、上記ＶＬが、
１．Ｅ６＿Ｖκ９ ＣＤＲｌ及びＣ１０＿Ｖκ３ ＣＤＲ１から選択されるＣＤＲ；
２．Ｅ６＿Ｖκ９ ＣＤＲ２及びＣ１０＿Ｖκ３ ＣＤＲ２から選択されるＣＤＲ；並びに／又は、
３．Ｅ６＿Ｖκ９ ＣＤＲ３若しくはＣ１０＿Ｖκ３ ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲ
のうちの１つ、２つ又は３つを含む、可変軽鎖領域ＶＬをさらに含み、並びに、抗原結合性構築物はこれらのＶＬ ＣＤＲと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿Ｖκ９若しくはＣ１０＿Ｖκ３のＶＬを含み、又は、Ｅ６＿Ｖκ９若しくはＣ１０＿Ｖκ３のＶＬと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるＶＬを有している抗原結合性構築物を含む。

【0011】

[0011]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿ＶＨ１又はＥ６＿ＶＨ７のＶＨ領域及びＥ６＿Ｖκ９のＶＬ領域を含む。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｃ１０＿ＶＨ３又はＣ１０＿ＶＨ４のＶＨ領域及びＣ１０＿Ｖκ３のＶＬ領域を含む。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿ＶＨ７のＶＨ及びＥ６＿Ｖκ９のＶＬ、Ｅ６＿ＶＨ１のＶＨ及びＥ６＿Ｖκ９のＶＬ、Ｃ１０＿ＶＨ３のＶＨ及びＣ１０＿Ｖκ３のＶＬ、又はＣ１０＿ＶＨ４のＶＨ及びＣ１０＿Ｖκ３のＶＬを含む。

【0012】

[0012]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、ＶＨとＶＬの間にペプチドリンカーを含み、任意選択的にアミノ酸配列ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。

【0013】

[0013]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿Ｖｈ７Ｖκ９、Ｅ６＿Ｖｈｌ Ｖκ９、Ｃ１０＿ＶＨ３Ｖκ３又はＣ１０＿ＶＨ４Ｖκ３である。

【0014】

[0014]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿ＶＨ７Ｖκ９の６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿Ｖｈ１Ｖκ９の６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｃ１０＿ＶＨ３Ｖκ３の６つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｃ１０＿ＶＨ４Ｖκ３の６つのＣＤＲを含む。

【0015】

[0015]いくつかの実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は分泌シグナルペプチドを含む。特定の実施形態において、分泌シグナルペプチドは、ＭＧＤＮＤＩＨＦＡＦＬＳＴＧＶＨＳＱＶＱである。いくつかの実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物はｓｃＦｖフォーマットを有する。別の実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物はＦａｂフォーマットを有する。一実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は単一ドメイン抗体（ラクダ科）フォーマットを有する。いくつかの実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は（Ｆａｂ’）_２フォーマットを有する。ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物はまた、Ｆｃドメインを含んでいてもよい。抗原結合性構築物はまた、ヒト化されていてもよく、又は脱免疫化されていてもよい。

【0016】

[0016]本明細書にはまた、ＶＨ及びＶＬを含む、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインに特異的に結合する抗原結合性構築物が包含され、それにより、この構築物が細胞内で発現される場合、細胞ＴＤＰ−４３ポリペプチドと細胞ＮＦ−κΒ ｐ６５ポリペプチドの相互作用の低減、及び／又はＬＰＳへの応答の際の細胞におけるＮＦ−κΒの活性化の低減が生じる。いくつかの実施形態において、細胞ＴＤＰ−４３ポリペプチドと細胞ＮＦ−κΒ ｐ６５ポリペプチドの相互作用は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上低減される。いくつかの実施形態において、ＬＰＳへの応答の際の細胞におけるＮＦ−κΒの活性化は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上低減される。

【0017】

[0017]また本明細書では、Ｅ６＿ＶＨｌＶｋ９、Ｅ６＿ＶＨ７Ｖｋ９、Ｃ１０＿ＶＨ３Ｖｋ３又はＣ１０＿ＶＨ４Ｖｋ３のいずれかのＴＤＰ−４３又はＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインのいずれかへの結合を５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上阻害する抗原結合性構築物を提供する。

【0018】

[0018]また本明細書には、上記の抗原結合性構築物と医薬的に許容される添加剤とを含む医薬組成物が記載されている。

【0019】

[0019]また、本明細書で提供したＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の治療上有効な量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質障害を特徴とする疾患又は障害を治療又は予防する方法が記載されている。

【0020】

[0020]本明細書では、少なくとも１つのＴＤＰ−４３抗原結合性構築物をコードする少なくとも１つの核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの治療上有効な量を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質障害を特徴とする疾患又は障害を治療又は予防する方法を提供する。

【0021】

[0021]本明細書では、ＴＤＰタンパク質障害を特徴とする疾患又は障害を治療又は予防する医薬品を製造するための本明細書で定義した抗原結合性構築物の使用を提供する。

【0022】

[0022]本明細書では、ＴＤＰタンパク質障害を特徴とする疾患又は障害を治療又は予防するための本明細書で記載した抗原結合性構築物の使用を提供する。

【0023】

[0023]いくつかの実施形態において、治療される疾患又は障害は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー病、運動ニューロン疾患、パーキンソン病、前頭側頭脳葉変性症（ＦＴＬＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、レーヴィ小体疾患、脳損傷又は脳虚血である。

【0024】

[0024]また、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を抗原結合性構築物の発現に適した条件下で培養するステップと、上記構築物を精製するステップとを含む、抗原結合性構築物を製造する方法も提供する。

【0025】

[0025]また本明細書では、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の少なくとも１つをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むポリヌクレオチド又は単離されたポリヌクレオチドのセットを提供する。一実施形態において、ポリヌクレオチドはｃＤＮＡである。

【0026】

[0026]また本明細書には、抗原結合性構築物をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドのセットを含むベクター又はベクターのセットが記載されている。

【0027】

[0027]いくつかの実施形態において、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター及び組換え発現ベクターである。特定の実施形態において、ベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。また、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む単離宿主細胞も記載されている。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ＴＤＰ−４３のＲＲＭＩドメインに対して生じた３つの例示的なモノクローナル抗ＴＤＰ−４３抗体Ｃ１０、Ｇ８及びＥ６で処理した、ＢＶ−２細胞の核抽出物のイムノブロットである。３つの抗体は、ＬＰＳで刺激した、又は刺激していないＢＶ−２細胞の核抽出物中のＴＤＰ−４３を検出した。

【図2】ヒト組換えｐ６５＿Ｈｉｓ−Ｔａｇがヒト組換えＴＤＰ−４３＿ＧＳＴ Ｔａｇと直接相互作用することを示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。結果は、アッセイに０．０１〜０．８μｇ／ｍｌで添加されたヒト組換えＴＤＰ−４３の量を様々に変化させて記録した４５０ｎｍでの吸光度（ＡＢＳ）として示す。

【図3】組換えＴＤＰ−４３とＮＦ−κＢ ｐ６５との間の相互作用が、例示的なモノクローナル抗ＴＤＰ−４３抗体Ｃ１０、Ｇ８、及びＥ６によってブロックされることを示すＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す棒グラフである。結果は、異なる組換え抗ＴＤＰ−４３抗体について記録した４５０ｎｍでの吸光度（ＡＢＳ）として示す。

【図4A】例示的な抗ＴＤＰ−４３ ｓｃＦｖ抗体をコードするベクターの概略図である。ｓｃＦｖベクターは、可撓性の２０アミノ酸リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３と共にＶＨ−リンカー−Ｖκフォーマットで構築した。ｓｃＦｖ構築物は、効率的な分泌用のマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）κ−分泌シグナル及び検出を容易にするヒトｃ−ｍｙｃエピトープを含む。

【図4B】例示的な抗ＴＤＰ−４３ ｓｃＦｖ抗体をコードするベクターの概略図である。ｓｃＦｖベクターは、可撓性の２０アミノ酸リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３と共にＶＨ−リンカー−Ｖκフォーマットで構築した。ｓｃＦｖ構築物は、効率的な分泌用のマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）κ−分泌シグナル及び検出を容易にするヒトｃ−ｍｙｃエピトープを含む。

【図5】抗ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物Ｅ６＿ＶＨ１ Ｖκ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖκ９をコードするＳｃＦｖ９発現プラスミドでトランスフェクションしたＨｅｋ２９３細胞の核及び細胞質画分のＳＤＳ ＰＡＧＥゲルのイムノブロットである。

【図6】Ｅ６＿ＶＨ１Ｖκ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖκ９抗原結合性構築物がＴＤＰ−４３のアミノ酸１−２０６に結合することを示すドットブロットである。

【図7】ｓｃＦｖフォーマットを有する例示的な抗ＴＤＰ−４３抗体Ｅ６＿ＶＨ１Ｖκ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖκ９が、組換えＴＤＰ−４３とＮＦ−κＢ ｐ６５との間の相互作用をブロックすることを実証するＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す。

【図8】ｓｃＦｖフォーマットの例示的な抗ＴＤＰ−４３抗体Ｅ６＿ＶＨ１Ｖκ９が、ＴＤＰ−４３に対するポリクローナル抗体によって検出した場合にＴＤＰ−４３と共免疫沈降することを示す。（Ｅ６＿ＶＨ１Ｖκ９をコードするＳｃＦｖ９発現プラスミドによるトランスフェクション後のＨｅｋ２９３細胞の培地中に発現される）。

【図9】ｓｃＦｖフォーマットを有する例示的な抗ＴＤＰ−４３抗体Ｅ６＿ＶＨ１Ｖκ９が、Ｈｅｋ２９３細胞におけるＴＤＰ−４３とＮＦ−κＢｐ６５との相互作用をブロックすることを示す。これは、Ｅ６＿ＶＨ１Ｖκ９を発現するＨｅｋ２９３細胞からの細胞抽出物を抗ＴＤＰ−４３ポリクローナル抗体で免疫沈降させたアッセイによって、空のＳｃＦｖ９発現ベクターでトランスフェクトした細胞に対し、ＶＨ１Ｖκ９を発現する細胞においてＮＦ−κＢ ｐ６５レベルの低下が示された。

【図10】ＢＶ２ミクログリア細胞に安定的に組み込まれたＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーター構築物によって測定した場合、ＬＰＳに応答するＮＦ−κＢ活性を弱化させる、ＴＤＰ−４３に対する例示的ｓｃＦｖ抗体をコードする発現ベクターの能力を示す。

【図11】Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるｓｃＦｖ抗ＴＤＰ−４３抗体の発現によって引き起こされる核ＴＤＰ−４３のレベルの低下を示す。

【図12A】エタクリン酸で処理したＥ６＿ＶＨ１Ｖκ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖκ９トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞におけるＴＤＰ−４３不溶性を低下させる抗ＴＤＰ−４３抗体の能力を示す。図１２Ａはウエスタンブロットを示す。

【図12B】エタクリン酸で処理したＥ６＿ＶＨ１Ｖκ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖκ９トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞におけるＴＤＰ−４３不溶性を低下させる抗ＴＤＰ−４３抗体の能力を示す。図１２Ｂはドットブロット分析を示す。

【図13】Ｅ６＿ＶＨ１Ｖκ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖκ９トランスフェクトＨｅｋ２９３細胞におけるリジンアセチル化からＴＤＰ−４３を保護する抗ＴＤＰ−４３抗体の能力を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

[0041]本明細書には、ＴＤＰ−４３結合性構築物並びにＴＤＰ−４３タンパク質障害を特徴とする神経変性疾患の診断及び治療におけるＴＤＰ−４３結合性構築物の使用が記載されている。

【0030】

ＴＤＰ−４３
[0042]本明細書で使用する場合、「ＴＤＰ４３」という用語は、４３ｋＤａの転写活性化応答性ＤＮＡ結合タンパク質又は４３ｋＤＡのＴＡＲ−ＤＮＡ結合タンパク質を意味し、天然の形態を含むＴＰＤ−４３のすべてのタイプ及び形態、並びに、例えばＴＤＰ−４３のリン酸化形態を含むＴＤＰ−４３の別のコンフォーマー、ＴＤＰ−４３の凝集体、ＴＤＰ−４３のユビキチン関連凝集体及び天然ＴＤＰ−４３と比べて１つ又は複数の変異を有するＴＤＰ−４３変異体、及び病原形態を意味するために使用される。ＴＤＰ−４３はまた、ＴＤＰ−４３ポリペプチドの断片も含む。ＴＤＰ−４３は、Ｎ末端ドメイン、２つのＲＮＡ認識モチーフ、及びタンパク質相互作用の媒介に重要であると思われるグリシン高含有のＣ末端ドメインを含有するＤＮＡ／ＲＮＡ結合タンパク質である。ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列は、当技術分野において公知である；例えば、以下を参照されたい、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、ＴＡＲＤＢＰタンパク質（ホモサピエンス）ＧｅｎＢａｎｋ Ｐｕｂｍｅｄ：ヒトＴＤＰ４３のアミノ酸配列は、その全体を参照により本明細書に組み入れる、ＡＡＨ７１６５７バージョンＧＬ４７９３９５２０に示されている。天然ヒトＴＤＰ−４３のアミノ酸配列は、下記及び表Ａ（配列番号２９）に示したとおりである。ＲＲＭ１ドメインは、アミノ酸１０１〜１７６に対応する。

【0031】

【化1】

【0032】

ＮＦ−ｋＢ ｐ６５
[0043]本明細書で使用する場合、「ＮＦｋＢ ｐ６５」又は「ＮＦＫＢ」という用語は、核因子カッパＢを意味し、「ＮＦ−ｋＢ ｐ６５」又は「ｐ６５」は、ＮＦｋＢ ｐ６５のｐ６５サブユニット又は鎖を意味するように本明細書において同義的に使用される。ｐ６５ポリペプチド並びにポリヌクレオチドは当技術分野において公知である。例えば、ＮＣＢＩ Ｍ６２３９９．１を参照されたい。ヒトＮＦ−κΒ ｐ６５に関するアミノ酸配列を以下に示す。また本明細書におけるｐ６５への言及は、ｐ６５の断片も包含されている。

【0033】

【化2】

【0034】

ＴＤＰ−４３タンパク質障害を特徴とする神経変性疾患
[0044]「ＴＤＰ−４３タンパク質障害」という用語は神経系疾患、特に神経変性疾患に関係し、ＴＤＰ−４３異常、特に異常な又はミスフォールドされたＴＤＰ−４３ポリペプチドの蓄積及び／又は凝集との関連によって結び付けて考えられる障害の異種の群として知られている。ＴＤＰタンパク質障害としては、限定するものではないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、前頭側頭脳葉変性症（ＦＴＬＤ）、運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、レーヴィ体型認知症、ハンチントン病、又はレーヴィ小体疾患が挙げられる。異常なＴＤＰ−４３蓄積は、神経損傷、脳損傷、脳虚血（脳卒中）によって誘発され得る。

【0035】

[0045]「前頭側頭脳葉変性症」という用語は、前頭葉及び側頭葉における萎縮に関連した一連の障害を意味する。前頭側頭脳葉変性症（ＦＴＬＤ）としては、タウ含有を特徴とするＦＴＬＤ−タウ、ユビキチンを特徴とするＦＴＬＤ−ＴＤＰ４３及びＴＤＰ−４３含有体（ＦＴＬＤ−Ｕ）、ＦＵＳ細胞質含有体を特徴とするＦＴＬＤ−ＦＵＳ及び特殊な組織構造を欠損している認知症（ＤＬＤＨ）を挙げることができる。

【0036】

[0046]「筋萎縮性側索硬化症」（ＡＬＳ）という用語は、通常、上位運動ニューロン及び下位運動ニューロンの両方を攻撃し、脳及び脊髄全体にわたって変性を引き起こす、任意の神経変性疾患を意味するように本明細書において使用する。

【0037】

抗原結合性構築物
[0047]本明細書には、ＴＤＰ−４３（４３ｋＤａのＴＡＲ ＤＮＡ結合タンパク質）に結合する抗原結合性構築物、例えば、ＴＤＰ−４３に特異的に結合することができる抗体の断片、誘導体及び変異体を含む抗体などを記載している。「ＴＤＰ−４３に特異的に結合する」、「ＴＤＰ−４３に／に対して特異的な抗体」及び「抗ＴＤＰ−４３抗体」及び「ＴＤＰ−４３抗体」とは、詳細には、一般的には、総体的には、ＴＤＰ−４３、又はミスフォールドされた若しくはオリゴマー化された、若しくは凝集した若しくは翻訳後に修飾されたＴＤＰ−４３、又はＴＤＰ−４３の変異体に対する抗体を意味する。一実施形態によれば、本明細書に記載の抗体（抗原結合性抗体断片及び誘導体を含む）は、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインに特異的に結合する。一実施形態において、ＴＤＰ−４３特異的抗原結合性構築物は、本明細書に記載の抗体の免疫学的結合特性を有する抗体（その抗原結合性断片又は誘導体を含む）である。いくつかの実施形態において、本抗原結合性構築物は、ＴＰＤ−４３のＮＦ−ＫＢ ｐ６５への結合をブロックする。

【0038】

[0048]また本明細書では、３つのＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つの重鎖可変領域ＶＨを含む、ＴＤＰ−４３に特異的に結合する抗原結合性構築物であって、上記ＶＨが、
Ｅ６＿ＶＨ１ ＣＤＲ１、Ｅ６＿ＶＨ７ ＣＤＲ１、Ｃ１０＿ＶＨ３ ＣＤＲ１及びＣ１０＿ＶＨ４ ＣＤＲ１から選択されるＣＤＲ；
Ｅ６＿ＶＨ１ ＣＤＲ２、Ｅ６＿ＶＨ７ ＣＤＲ２、Ｃ１０＿ＶＨ３ ＣＤＲ２及びＣ１０＿ＶＨ４ ＣＤＲ２から選択されるＣＤＲ；並びに／又は、
Ｅ６＿ＶＨ１ ＣＤＲ３、Ｅ６＿ＶＨ７ ＣＤＲ３、Ｃ１０＿ＶＨ３ ＣＤＲ３及びＣ１０＿ＶＨ４ ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲ
のうちの１つ、２つ又は３つを含む、抗原結合性構築物が記載されている。

【0039】

[0049]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、これらのＶＨ ＣＤＲと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である１つ、２つ又は３つのＶＨ ＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿ＶＨ１、Ｅ６＿ＶＨ７、Ｃ１０＿ＶＨ３若しくはＣ１０＿ＶＨ４のＶＨ、又はＥ６＿ＶＨ１、Ｅ６＿ＶＨ７、Ｃ１０＿ＶＨ３又はＣ１０＿ＶＨ４のＶＨと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるＶＨを含む。

【0040】

[0050]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、可変軽鎖領域ＶＬであって、上記ＶＬが３つのＶＬ ＣＤＲを含み、上記ＶＬが、
Ｅ６＿Ｖκ９ ＣＤＲ１及びＣ１０＿Ｖκ３ ＣＤＲ１から選択されるＣＤＲ；
Ｅ６＿Ｖκ９ ＣＤＲ２及びＣ１０＿Ｖκ３ ＣＤＲ２から選択されるＣＤＲ；並びに／又は、
Ｅ６＿Ｖκ９ ＣＤＲ３若しくはＣ１０＿Ｖκ３ ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲ
のうちの１つ、２つ又は３つを含む、可変軽鎖領域ＶＬをさらに含み、並びに、抗原結合性構築物はこれらのＶＬ ＣＤＲと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿Ｖκ９若しくはＣ１０＿Ｖκ３のＶＬを含み、又は、Ｅ６＿Ｖκ９若しくはＣ１０＿Ｖκ３のＶＬと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％同一であるＶＬを有している抗原結合性構築物を含む。

【0041】

[0051]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿ＶＨ１又はＥ６＿ＶＨ７のＶＨ領域及びＥ６＿Ｖκ９のＶＬ領域を含む。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｃ１０＿ＶＨ３又はＣ１０＿ＶＨ４のＶＨ領域及びＣ１０＿Ｖκ３のＶＬ領域を含む。別の実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿ＶＨ７のＶＨ及びＥ６＿Ｖκ９のＶＬ、Ｅ６＿ＶＨ１のＶＨ及びＥ６＿Ｖκ９のＶＬ、Ｃ１０＿ＶＨ３のＶＨ及びＣ１０＿Ｖκ３のＶＬ、又はＣ１０＿ＶＨ４ のＶＨ及びＣ１０＿Ｖκ３のＶＬを含む。

【0042】

[0052]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、
（ａ）Ｅ６＿ＶＨ１のＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号８）及びＣＤＲ３（配列番号９）並びにＥ６＿Ｖκ９のＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号８）及びＣＤＲ３（配列番号９）；
（ｂ）Ｅ６＿ＶＨ７のＣＤＲ１（配列番号１０）、ＣＤＲ２（配列番号１１）及びＣＤＲ３（配列番号１２）並びにＥ６＿Ｖκ９のＣＤＲ１（配列番号７）、ＣＤＲ２（配列番号８）及びＣＤＲ３（配列番号９）；
（ｃ）Ｃ１０＿ＶＨ３のＣＤＲ１（配列番号１６）、ＣＤＲ２（配列番号１７）及びＣＤＲ３（配列番号１８）、並びにＣＤＲ１（配列番号２２）、ＣＤＲ２（配列番号２３及びＣ１０＿Ｖκ３のＣＤＲ３（配列番号２４）；
（ｄ）Ｃ１０＿ＶＨ４のＣＤＲ１（配列番号１９）、ＣＤＲ２（配列番号２０）及びＣＤＲ３（配列番号２１）並びにＣＤＲ１（配列番号２２）、ＣＤＲ２（配列番号２３及びＣ１０＿Ｖκ３のＣＤＲ３（配列番号２４）
から選択される６つのＣＤＲを含む。

【0043】

[0053]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、ＶＨとＶＬの間のペプチドリンカーを含み、任意選択的にアミノ酸配列ＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳを含む。

【0044】

[0054]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿Ｖｈ７Ｖκ９、Ｅ６＿Ｖｈｌ Ｖκ９、Ｃ１０＿ＶＨ３ Ｖκ３又はＣ１０＿ＶＨ４Ｖκ３を含む。

【0045】

[0055]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は分泌シグナルペプチドを含む。特定の実施形態において、分泌のシグナルペプチドは、ＭＧＤＮＤＩＨＦＡＦＬＳＴＧＶＨＳＱＶＱである。

【0046】

[0056]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物はｓｃＦｖフォーマットを有する。別の実施形態において、抗原結合性構築物はＦａｂフォーマットを有する。一実施形態において、抗原結合性構築物は単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科）フォーマットを有する。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は（Ｆａｂ’）_２フォーマットを有する。別の実施形態において、抗原結合性構築物はＦａｂ’フォーマットを有する。抗原結合性構築物はまた、Ｆｃドメインを含んでいてもよい。抗原結合性構築物はまた、ヒト化されていてもよく、又は脱免疫化されていてもよい。

【0047】

[0057]本明細書にはまた、ＶＨ及びＶＬを含む、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインに特異的に結合する抗原結合性構築物が提供され、それにより、この構築物は、細胞内で発現される場合、細胞ＴＤＰ−４３ポリペプチドと細胞ＮＦ−κΒ ｐ６５ポリペプチドの相互作用の低減、及び／又はＬＰＳへの応答の際の細胞におけるＮＦ−κΒの活性化の低減が生じる。いくつかの実施形態において、細胞ＴＤＰ−４３ポリペプチドと細胞ＮＦ−κΒ ｐ６５ポリペプチドの相互作用は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上低減される。いくつかの実施形態において、ＬＰＳへの応答の際の細胞におけるＮＦ−κΒの活性化は、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上低減される。

【0048】

[0058]また本明細書では、ＶＨ及びＶＬを含む、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインに特異的に結合する抗原結合性構築物であって、上記構築物が、細胞で発現される場合、
ｉ）Ｈｅｋ２９３細胞における細胞内ＴＤＰ−４３ポリペプチドの細胞内ＮＦ−κΒ ｐ６５ポリペプチドとの相互作用を１０％以上低減し；
ｉｉ）ＬＰＳに応答するＢＶ−２細胞のＮＦ−κΒの活性化を１０％以上低減し；
ｉｉｉ）Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞の核ＴＤＰ−４３のレベルを低減し；
ｉｖ）ＴＮＦαに応答するＨｅｋ２９３細胞のＴＤＰ−４３のリジンアセチル化を１０％以上低減し；又は、
ｖ）エタクリン酸共にインキュベートしたＨｅｋ２９３細胞のＴＤＰ−４３の不溶性を低減する、
構築物を提供する。

【0049】

[0059]また本明細書では、Ｅ６＿ＶＨｌＶｋ９、Ｅ６＿ＶＨ７Ｖｋ９、Ｃ１０＿ＶＨ３Ｖｋ３又はＣ１０＿ＶＨ４Ｖｋ３のいずれかのＴＤＰ−４３又はＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインのいずれかへの結合を５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％以上阻害する抗原結合性構築物を提供する。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、Ｅ６＿ＶＨｌＶｋ９、Ｅ６＿ＶＨ７Ｖｋ９、Ｃ１０＿ＶＨ３Ｖｋ３又はＣ１０＿ＶＨ４Ｖｋ３のいずれかのＴＤＰ−４３又はＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインのいずれかへの結合を５０％以上阻害する。

【0050】

[0060]「抗原結合性構築物」という用語はまた、任意の薬剤、例えば、抗原に結合することができるポリペプチド又はポリペプチド複合体を意味する。いくつかの態様において、抗原結合性構築物は、目的の抗原に特異的に結合するポリペプチドである。抗原結合性構築物は、単量体、二量体、多量体、タンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体；抗体、抗体断片、又はその抗原結合性断片；ｓｃＦｖなどであり得る。抗原結合性構築物は、単一特異的、二重特異的又は多重特異的であるポリペプチド構築物であり得る。いくつかの態様において、抗原結合性構築物は、例えば、１つ又は複数のＦｃに連結されている１つ又は複数の抗原結合性成分（例えば、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ）を含み得る。抗原結合性構築物のさらなる例を下記に記載し、実施例において提供する。

【0051】

[0061]「二重特異的」という用語は、２つの異なる結合特異性を有する任意の薬剤、例えば、抗原結合性構築物又は抗体を含むものとする。

【0052】

[0062]「多重特異的」又は「異種特異的」という用語は、２つ以上の異なる結合特異性を有する任意の薬剤、例えば抗原結合性構築物又は抗体を含むものとする。したがって、本明細書に記載されている抗原結合性構築物の実施形態は、限定するものではないが、二重特異的、三重特異的、四重特異的、及び他の多重特異的分子を含む。

【0053】

[0063]抗原結合性構築物は、抗体又はその抗原結合性部分であり得る。本明細書で使用する場合、「抗原」又は「免疫グロブリン」は、分析物（例えば、抗原）に特異的に結合し認識する、１種若しくは複数の免疫グロブリン遺伝子又はその断片によって実質的にコードされているポリペプチドを意味する。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミューの定常域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパ又はラムダのいずれかに分類される。抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、その重鎖が有している定常ドメイン又は定常領域のタイプを意味する。５つの主なクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかのものは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧｉ、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡｉ、ＩｇＡ_２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ及びμとそれぞれ呼ばれる。

【0054】

[0064]例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は２対のポリペプチド鎖から構成されており、各々の対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各々の鎖のＮ末端ドメインは、抗原認識に主として関与し得る約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖及び重鎖のドメインをそれぞれ意味する。ＩｇＧｌ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端までのＶＨドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインをそれぞれ含む。軽鎖はＮ末端からＣ末端までのＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む。ＩｇＧ１重鎖は、ＣＨＩとＣＨ２のドメインの間にヒンジを含む。特定の実施形態において、免疫グロブリン構築物は、治療用ポリペプチドに連結されているＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ又はＩｇＥ由来の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されている抗原結合性構築物で確認された免疫グロブリンドメインは、ダイアボディ又はナノボディなどの免疫グロブリンに基づく構築物に由来するか、又は誘導される。特定の実施形態において、本明細書に記載の免疫グロブリン構築物は、ラクダ抗体などの重鎖抗体由来の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。特定の実施形態において、本明細書で提供している免疫グロブリン構築物は、ウシ抗体、ヒト抗体、ラクダ抗体、マウス抗体又は任意のキメラ抗体などの哺乳動物抗体由来の少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。

【0055】

[0065]「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、本明細書で使用する場合、配列が超可変であり、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの各々の領域を意味する。一般に、天然の４鎖抗体は６つのＨＶＲ；ＶＨの３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬの３つ（ＬＩ、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは、一般に超可変のループ及び／又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は最も高い配列可変性であり、及び／又は抗原認識に関与している。ＶＨのＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般に超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。超可変領域（ＨＶＲ）は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）とも呼ばれ、これらの用語は、抗原結合領域を形成する可変領域の部分に関して本明細書において同義的に使用される。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８３）、及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１−９１７（１９８７）によって開示されており、その定義には、相互に比較した場合のアミノ酸残基のオーバーラッピング又はサブセットが含まれている。しかしながら、抗体又はその変異体のＣＤＲを意味するよういずれかの定義を適用することは、本明細書で定義及び使用した用語の範囲内にあるものとする。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が提供される特定のＣＤＲをどの残基が含むかを慣例的に決定することができる。

【0056】

[0066]「Ｆａｂ分子」又は「Ｆａｂ」とは、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨ及びＣＨ１ドメインと軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬ及びＣＬドメインからなるタンパク質又はポリペプチド構築物を意味する。Ｆａｂは一価である。

【0057】

[0067]「Ｆ（ａｂ’）_２」分子は、ヒンジ領域の一部によって互いに連結している２つのＦａｂからなるタンパク質又はポリペプチド構築物を意味するが、Ｆｃのほとんどが欠けている。Ｆ（ａｂ’）_２分子は、パパイン又はペプシンで免疫グロブリンを消化することにより得ることができる。

【0058】

[0068]本明細書で使用する場合、「一本鎖」という用語は、ペプチド結合によって直鎖状に連結されているアミノ酸単量体を含む分子を意味する。特定の実施形態において、抗原結合性部分の１つは一本鎖Ｆａｂ分子、すなわち、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖がペプチドリンカーによって連結されペプチド一本鎖を形成するＦａｂ分子である。特定のこうした実施形態において、Ｆａｂ軽鎖のＣ末端は、一本鎖Ｆａｂ分子中のＦａｂ重鎖のＮ末端に連結されている。特定の別の実施形態において、抗原結合性部分の１つは一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）である。本明細書でより詳細に記載されているように、「ｓｃＦｖ」は、そのＣ末端から重鎖（ＶＨ）の可変ドメインのＮ末端にポリペプチド鎖によって連結されている軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインを有するか、或いは、ＶＨのＣ末端はＶＬのＮ末端にポリペプチド鎖によって連結されている。このタイプの抗体は、本明細書では「ｓｃＦｖフォーマット」と呼ばれている。

【0059】

[0069]本明細書に記載のいくつかの実施形態において、ｓｃＦｖフォーマットは、抗原結合性構築物（すなわち、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成されている抗原結合性ドメイン）において使用される。一実施形態において、前記ｓｃＦｖ分子はヒトである。別の実施形態において、前記ｓｃＦｖ分子はヒト化されている。一実施形態において、前記ｓｃＦｖ分子はマウスである。可変領域は、直接連結され得るか、又は、典型的には、機能性の抗原結合性部分を形成することができるリンカーペプチドを介して結合され得る。典型的なペプチドリンカーは約２〜２０個のアミノ酸を含み、本明細書に記載されているか、又は当技術分野で公知である。適切な非免疫原性リンカーペプチドとしては、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ、Ｇ４（ＳＧ４）ｎ又はＧ２（ＳＧ２）ｎリンカーペプチドが挙げられ、式中、ｎは一般に１〜１０の間の数であり、典型的には２〜４の間の数である。ｓｃＦｖ分子は、例えば、Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １４，１２３９−１２４５（１９９６））により開示されているように、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの間のジスルフィド架橋によってさらに安定し得る。当技術分野で公知であるように、ｓｃＦｖはまた、 ［Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ．２０１０ Ｊｕｌ；２３（７）：５４９−５７；Ｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ．２０１１ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３（３）：２４３−５；Ｐｅｒｃｈｉａｃｃａ ＆ Ｔｅｓｓｉｅｒ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｍｏｌ Ｅｎｇ．２０１２；３：２６３−８６．］に開示されているように、ＣＤＲ配列の変異によっても安定し得る。いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖフォーマットのＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、細胞膜を通過し、細胞に入るその能力にとって好ましい。ｓｃＦｖフォーマット抗体の概略図を図４Ｂに示す。

【0060】

[0070]いくつかの実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、単一ＶＨポリペプチド（ラクダフォーマット）からなっていてもよい。

【0061】

[0071]「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」ともいう）とは、可変領域又はＦａｂ重鎖及び軽鎖の定常領域のいずれかが交換されているＦａｂ分子を意味し、すなわち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変領域及び重鎖定常領域を含んでなるペプチド鎖と、重鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含んでなるペプチド鎖を含む。明確にするために、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常領域を含むペプチド鎖は、本明細書では、クロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。反対に、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の定常領域が交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変領域を含むペプチド鎖は、本明細書では、クロスオーバーＦａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。

【0062】

[0072]「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのＦＲは、一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）の以下の配列で示される：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。

【0063】

[0073]抗原結合性構築物は、Ｆｃ領域又はドメイン、例えば、二量体Ｆｃを含み得る。

【0064】

[0074]本明細書における用語「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」は、少なくとも定常領域の一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用する。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。本明細書において別段の定めがない限り、Ｆｃ領域又は定常領域のアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に開示されているように、ＥＵ指数とも呼ばれるＥＵ番号方式によるものである。本明細書で使用される場合のＦｃドメインの「サブユニット」とは二量体Ｆｃドメインを形成している２つのポリペプチドのうちの１つ、すなわち、安定的な自己会合が可能である免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ Ｃ_Ｈ２及びＩｇＧ Ｃ_Ｈ３定常ドメインを含む。

【0065】

[0075]いくつかの態様において、Ｆｃは、少なくとも１つ又は２つのＣ_Ｈ３配列を含む。いくつかの態様において、Ｆｃはホモ二量体Ｆｃである。いくつかの態様において、Ｆｃはヘテロ二量体型ＦＣである。いくつかの態様において、ＦｃはヒトＦｃである。いくつかの態様において、ＦｃはマウスＦｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ又はＩｇＧ１ Ｆｃである。いくつかの態様において、Ｆｃは、少なくとも１つ又は２つのＣ_Ｈ２配列を含む。

【0066】

[0076]いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ３配列の少なくとも１つに１つ又は複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは、Ｃ_Ｈ２配列の少なくとも１つに１つ又は複数の修飾を含む。いくつかの態様において、Ｆｃは単一のポリペプチドである。いくつかの態様において、Ｆｃは複数のペプチド、例えば、２つのポリペプチドである。

【0067】

[0077]融合又は連結されているとは、成分（例えば、Ｆａｂ分子又はｓｃＦｖ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、直接的に又は１つ又は複数のペプチドリンカーを介してペプチド結合により連結されていることを意味する。

【0068】

[0078]抗原結合性構築物は抗原に結合する。本明細書で使用する場合、「抗原決定基」という用語は「抗原」及び「エピトープ」と同義であり、抗原結合性部分が結合し、抗原結合性部分−抗原複合体を形成するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続的長さ又は非連続アミノ酸の異なる領域から構成される構造上の配置）を意味する。本明細書に記載されている抗原結合性構築物によって結合された抗原はＴＰＤ−４３であり、いくつかの実施形態において、ＴＤＰ−４３のＲＲＭ−１ドメインである。

【0069】

[0079]「特異的に結合する」、「特異的結合」又は「選択的結合」とは、結合が抗原に対して選択的であり、望ましくない、又は非特異的な相互作用から区別され得ることを意味する。抗原結合性部分が特異的な抗原決定基に結合する能力は、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている別の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置による解析）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ ｅｔ ａｌ，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３−３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７−２２９（２００２））のいずれかによって測定することができる。一実施形態において、非関連タンパク質への抗原結合性部分の結合の程度は、例えばＳＰＲによって測定した場合、抗原結合性部分の抗原への結合は約１０％未満である。特定の実施形態において、抗原に結合する抗原結合性部分、又はその抗原結合性部分を含む抗原結合性分子は、＜１μΜ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜０．１ｎＭ、＜０．０１ｎＭ、又は＜０．００１ｎＭ（例えば１０^−８Ｍ以下、例えば１０^−８Ｍ〜１０^−１３Ｍまで、例えば１０^−９Ｍ〜１０^−１３Ｍ）の解離定数（ＫＤ）を有する。

【0070】

[0080]目的の抗原に「結合する」抗体は、抗体が診断薬及び／又は治療薬として有用であるようにその抗原に十分な親和性で結合することができるものである。

【0071】

[0081]「親和性」とは、分子（例えば受容体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えばリガンド）との間の非共有相互作用の強さの総計を意味する。他に指示のない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗原結合性構築物と抗原、又は受容体とそのリガンド）のメンバー間の１：１相互作用を反映する内在性の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離速度定数と会合速度定数（それぞれ、ｋ_ｏｆｆ及びｋ_ｏｎ）の比である、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。したがって、同等の親和性は、速度定数の比が同じである限り、異なる速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載されているものを含め、当技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。

【0072】

[0082]本明細書に記載の抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３を結合する少なくとも１つの抗原結合性ポリペプチドを含む。表Ａは、例示的な抗ＴＤＰ−４３抗原結合ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。（ ）＝Ｉｇｋ分泌シグナル；｛ ｝＝リンカー配列；［ ］＝ｃ−ｍｙｃ検出シグナル。

【0073】

[0083]また本明細書では、例示的な抗原結合性構築物をコードする核酸配列も提供する。表Ｂはこれらの例示的な核酸配列を示す。

【0074】

【表1-1】

【0075】

【表1-2】

【0076】

【表1-3】

【0077】

【表1-4】

【0078】

【表2-1】

【0079】

【表2-2】

【0080】

【表2-3】

【0081】

【表2-4】

【0082】

ポリペプチド及びポリヌクレオチド
[0084]本明細書に記載の抗原結合性構築物は、少なくとも１つのＴＤＰ−４３結合ポリペプチドを含む。また、本明細書に記載のＴＤＰ−４３結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載されている。

【0083】

[0085]本明細書で使用する場合、「単離された」とは、その天然の細胞培養環境の成分から同定及び単離及び／又は回収された作用物質（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を意味する。その天然環境の不純物成分は、抗原結合性構築物の診断又は治療上の使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性又は非タンパク性溶質を挙げることができる。また、単離されたとは、例えば人が介入することによって合成的に製造された作用物質も意味する。

【0084】

[0086]「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを意味するために本明細書では同義で使用される。すなわち、ポリペプチドに関する記載は、ペプチドの記載及びタンパク質の記載に等しく適用され、また逆も同様に適用される。この用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、並びに、１つ又は複数のアミノ酸残基が天然にコードされていないアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で使用する場合、この用語は、アミノ酸残基が共有結合ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。

【0085】

[0087]「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び天然に存在しないアミノ酸、並びに、天然に存在するアミノ酸と同様の方法で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸ミメティックを意味する。天然にコードされているアミノ酸は、２０種の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プラリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）並びにピロリシン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムに結合されている炭素を有する化合物を意味する。こうした類似体は、修飾されたＲ基（例えばノルロイシン）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ根本的な化学構造を保持する。アミノ酸への言及は、例えば、天然に存在するプロテオジェニックＬ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学修飾アミノ酸、例えば、アミノ酸変異体及び誘導体；天然に存在する非プロテオジェニックアミノ酸、例えば、β−アラニン、オルニチンなど；並びに当技術分野でアミノ酸の特性であることが知られている特性を有する化学的合成化合物を含む。天然に存在しないアミノ酸の例としては、限定するものではないが、α−メチルアミノ酸（例えばα−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖中に過剰のメチレンを有しているアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置き換えられているアミノ酸（例えばシステイン酸）が挙げられる。本明細書に記載のタンパク質への合成非天然アミノ酸、置換アミノ酸、又は１つ若しくは複数のＤ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸の導入は、多くの異なる方法で有利であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチドなどは、Ｌ−アミノ酸含有相当物と比較して、インビトロ又はインビボで安定性の増大を示す。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み込んだペプチドなどの構築物は、より大きな細胞内安定性が望まれるか必要とされる場合、特に有用であり得る。より詳細には、Ｄ−ペプチドなどは内在性ペプチダーゼ及びプロテアーゼに対して耐性があり、それにより分子のバイオアベイラビリティの改善が提供され、こうした特性が望ましい場合、インビボでの持続時間が延長される。さらに、Ｄ−ペプチドなどは、ヘルパーＴ細胞に対する組織適合性主複合体クラスＩＩ制限提示について効率的に処理することができず、したがって、生物全体において体液性免疫応答を誘導する可能性は低い。

【0086】

[0088]アミノ酸は、それらの一般に知られている３文字表記によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会により推奨されている１文字表記によって本明細書では表すことができる。ヌクレオチドも同様に、それらの一般に容認されている一文字表記によって表すことができる。

【0087】

[0089]また、抗原結合性構築物のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含まれる。「ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続する伸長を示すものとする。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成若しくは合成起源、又はそれらの任意の組合せであり得る。

【0088】

[0090]「核酸」という用語は、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及びそれらのポリマーを意味する。特に限定されていない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有しており、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。他に特に限定されていない限り、この用語はまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含むオリゴヌクレオチド類似体、及びアンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオエート、ホスホロアミデートなど）を意味する。特に明記しない限り、特定の核酸配列はまた、それらの保存的に改変された変異体（限定するものではないが、縮重コドン置換を含む）及び相補配列並びに明示的に示した配列を暗黙的に包含する。詳細には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択された（又は全部の）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。

【0089】

[0091]「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された変異体」は、同一若しくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードするこれらの核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしない場合の本質的に同一の配列を意味する。遺伝子コードの縮重のため、多くの機能的に同一の核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全部、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって規定されるすべての位置で、コドンは、コードされたポリペプチドを改変せずに、記載された対応するコドンのいずれかに改変することができる。こうした核酸変異体は、保存的に改変された変異体の１種である「サイレントの変異体」である。ポリペプチドをコードする本明細書のすべての核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能性のあるサイレント変異体を記載する。当業者には、核酸中のそれぞれのコドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く）を修飾して、機能的に同一の分子を得ることができることが理解されよう。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のそれぞれのサイレント変異体は、記載したそれぞれの配列に潜在的に含まれている。

【0090】

[0092]アミノ酸配列に関して、当業者には、コードされた配列中の単一アミノ酸又は少数パーセントのアミノ酸を改変、付加又は欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加は、その変化がアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換をもたらす「保存的に改変された変異体」であることは理解されよう。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に公知である。こうした保存的に改変された変異体は、本明細書に記載の多型変異体、異種間相同体、及び対立遺伝子に加えられ、除外はされない。

【0091】

[0093]機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に公知である。以下の８つのグループは、互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；及び［０１３９］８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ Ｈ Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．；２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９３）を参照されたい）。

【0092】

[0094]「同一の」という用語又は「同一性」パーセントとは、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈において、同じである２つ以上の配列又は部分配列を意味する。以下の配列比較アルゴリズム（若しくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを使用して、又は手動による配列比較及び目視検査によって測定した際に、比較ウィンドウ又は指定された領域にわたって最大の一致について比較及び配列比較した場合、配列が、同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドのパーセント（すなわち、特定した領域にわたって約６０％同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、又は約９５％の同一性）を有するならば、配列は「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列の相補性を意味する。同一性は、少なくとも長さが約５０個のアミノ酸若しくはヌクレオチドである領域にわたって、又は長さが７５〜１００個のアミノ酸又はヌクレオチドである領域にわたって、或いは、特定されていない場合、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの全配列にわたって存在し得る。ヒト以外の種由来の相同体を含む、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列又はその断片を有する標識化プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングするステップと、前記ポリヌクレオチド配列を含有する完全長ｃＤＮＡ及びゲノミッククローンを単離させるステップとを含む方法によって得ることができる。こうしたハイブリダイゼーション技術は、当業者には公知である。

【0093】

[0095]配列比較に関し、典型的には、１つの配列が、試験配列と比較される参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、部分配列座標を指定し、必要に応じ、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータを使用することができ、又は、代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。

【0094】

[0096]「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、２つの配列を最適に整列させた後、配列を同数の連続的な位置の参照配列と比較することができる、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、さらに通常は約１００〜約１５０からなる群から選択される連続的な位置の数のいずれか１つのセグメントへの言及を含む。比較のための配列のアラインメント方法は当業者には公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、限定するものではないが、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性方法の捜索によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化されたシステム稼働によって、又は手動によるアラインメント及び目視検査によって（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５ 補遺）を参照）行うことができる。

【0095】

[0097]配列同一性及び配列類似性パーセントを決定するのに適し得るアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に開示されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．のＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手可能なＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを介して公的に入手することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較をデフォルトとして用いる。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長、及び１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５を参照）、５０のアラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較をデフォルトとして用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的には、「低複雑度」フィルターをオフにして実施する。

【0096】

[0098]ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の１つは、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供するものである。例えば、試験核酸と参照核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、又は約０．０１未満、又は約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると考えられる。

【0097】

[0099]「選択的に（又は特異的に）〜にハイブリダイズする」という句は、その配列が複合混合物（限定するものではないが、全細胞ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む）中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列のみに対する分子の結合、二重鎖形成又はハイブリダイズすることを意味する。

【0098】

[00100]「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という句は、当技術分野で公知の低イオン強度及び高温条件下における、ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の核酸又はそれらの組合せの配列のハイブリダイゼーションを意味する。典型的には、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（限定するものではないが、全細胞ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はライブラリーＤＮＡ若しくはＲＮＡを含む）中のその標的部分配列にハイブリダイズするが、複合混合物中の別の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、様々な状況において異なる。長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに関する広範囲にわたる手引きは、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓｓａｙｓ”（１９９３）で確認することができる。

【0099】

[00101]本明細書で使用する場合、「操作する、操作された、操作」という用語は、ペプチド骨格の任意の操作、又は天然に存在するか組換えのポリペプチド若しくはその断片の翻訳後修飾を含むものと考える。操作には、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、並びにこれらの手法の組合せが含まれる。操作されたタンパク質は、標準の分子生物学技術によって発現及び産生される。

【0100】

[00102]「単離された核酸分子又はポリヌクレオチド」とは、その天然環境から取り出された、核酸分子、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。例えば、ベクター中に含有されているポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは単離されたと考えられる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞に維持されている組換えポリヌクレオチド又は溶液中の（部分的又は実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたポリヌクレオチドは、通常、ポリヌクレオチド分子を含有する細胞中に含有されているポリヌクレオチド分子を含むが、そのポリヌクレオチド分子は、染色体外に存在するか、又はその天然染色体の位置とは異なる染色体位置に存在する。単離されたＲＮＡ分子としては、インビボ又はインビトロのＲＮＡ転写物、並びに、正及び負の鎖形態、及び二本鎖形態が挙げられる。本明細書に記載の単離されたポリヌクレオチド又は核酸は、例えば、ＰＣＲ合成又は化学合成を介して合成的に生成された、こうした分子をさらに含む。さらに、ポリヌクレオチド又は核酸は、特定の実施形態において、制御エレメント、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位又は転写ターミネーターなどを含む。

【0101】

[00103]「ポリメラーゼ連鎖反応」又は「ＰＣＲ」という用語は、一般に、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に開示されているように、インビトロにおいて所望のヌクレオチド配列を増幅する方法を意味する。一般に、ＰＣＲ方法は、鋳型核酸に優先的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、プライマー伸長合成の繰り返しサイクルを含む。

【0102】

[00104]本明細書に記載の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば９５％「同一である」ヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドに対して５個以下の点突然変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であるものとする。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの５％以下が欠失され得る、若しくは別のヌクレオチドで置換され得るか、又は、参照配列中の全ヌクレオチドの５％以下の数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの改変は、参照ヌクレオチド配列の５’末端若しくは３’末端位置で生じていてもよいし、それらの末端位置の間の任意の場所で生じていてもよいし、参照配列内の残基においてそれぞれ個別に、若しくは参照配列内の１個若しくは複数の連続する群に散在していてもよい。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が本明細書に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるか否かは、ポリペプチドに関して上記で論じたような公知のコンピュータプログラムを使用して（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）、慣例的に決定することができる。

【0103】

[00105]ポリペプチドの誘導体又は変異体は、誘導体又は変異体のアミノ酸配列がオリジナルのペプチド由来の１００アミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する場合、ペプチドと「相同性」を有する、又は「相同」であると言われる。特定の実施形態において、誘導体又は変異体は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチド又はペプチド断片のいずれかと少なくとも７５％同一である。特定の実施形態において、誘導体のアミノ酸配列は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチド又はペプチドの断片のいずれかと少なくとも８５％同一である。特定の実施形態において、誘導体のアミノ酸配列は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチド又はペプチドの断片のいずれかと少なくとも９０％同一である。一部の実施形態において、誘導体又は変異体は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチド又はペプチドの断片のいずれかと少なくとも９５％同一である。特定の実施形態において、誘導体又は変異体は、誘導体と同じ数のアミノ酸残基を有するペプチド又はペプチドの断片のいずれかと少なくとも９９％同一である。

【0104】

[00106]本明細書で使用される場合の「修飾された」という用語は、例えば、ポリペプチドの長さ、アミノ酸配列、化学構造、ポリペプチドの翻訳時修飾又は翻訳後修飾などの所定のポリペプチドに対して行われた任意の変化を意味する。形式「（修飾された）」という用語は、論じられているポリペプチドが任意選択的に修飾されていることを意味し、すなわち、論じられているポリペプチドは修飾されていてもよく、修飾されていなくてもよい。

【0105】

[00107]いくつかの態様において、抗原結合性構築物は、本明細書に開示されている表（複数可）又は受託番号（複数可）に示した関連のアミノ酸配列又はその断片に対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、単離された抗原結合性構築物は、本明細書に開示されている表（複数可）又は受託番号（複数可）に示した関連のヌクレオチド配列又はその断片に対して少なくとも８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％同一であるポリヌクレオチドによってコードされているアミノ酸配列を含む。

【0106】

[00108]特定の実施形態において、抗原結合性ポリペプチドは、これらの抗体のヒト化バージョン又はキメラバージョンに由来する。

【0107】

[00109]非ヒト（例えば、げっ歯類）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分については、ヒト化抗体は、移植体の超可変領域由来残基が、非ヒトの種（ドナー抗体）、例えば、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの超可変領域由来残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（移植体抗体）である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられる。さらに、ヒト化抗体は、移植体抗体又はドナー抗体で確認されていない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体性能をさらに改良するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、典型的には２つの、実施的にすべての可変ドメインを含み、全部又は実質的に全部の超可変ループは非ヒト免疫グロブリンのループに対応し、全部又は実質的に全部のＦＲはヒト免疫グロブリン配列のＦＲである。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含み得る。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。いくつかの実施形態において、抗ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物はヒト化されている。一実施形態において、ヒト化抗ＴＤＰ−４３抗体は、マウスＣＤＲのアミノ酸を含む。

【0108】

[00110]また、脱免疫化を使用して、抗体の免疫原性を減少させることができる。

【0109】

[00111]本明細書では、「脱免疫化」という用語は、Ｔ細胞エピトープを修飾する抗体の改変を含む。例えば、国際公開第９８／５２９７６号及び国際公開第００／３４３１７号を参照されたい。例えば、出発抗体由来のＶＨ配列及びＶＬ配列を分析し、ヒトＴ細胞エピトープを、相補性決定領域（ＣＤＲ）及びその配列内の他の重要な残基に関するエピトープの位置を示すそれぞれのＶ領域から「マッピングする」。最終抗体の活性を変化さえるリスクの低い代替アミノ酸置換を同定するために、Ｔ細胞エピトープ地図から個々のＴ細胞エピトープを分析する。一連の代替ＶＨ配列及びＶＬ配列は、アミノ酸置換の組合せを含んで設計され、続いて、本明細書に記載の診断方法及び治療方法で使用するために、これらの配列は、一連の結合性ポリペプチド、例えば、その免疫特異的断片を含むＴＤＰ−４３特異的抗体に組み入れられ、その後、これは機能に関して試験される。典型的には、１２〜２４個の変異抗体が産生され、試験される。次いで、修飾されたＶ領域及び／又はＣ領域を含む完全な重鎖遺伝子及び軽鎖遺伝子を発現ベクターへクローニングし、その後のプラスミドを、全抗体産生用の細胞株に導入する。次いで、抗体を適切な生化学アッセイ及び生物学的アッセイにおいて比較し、最適な変異体を同定する。

【0110】

医薬組成物
[00112]本明細書に記載の抗原結合性構築物を含む医薬組成物もまた本明細書で提供される。こうした組成物は、構築物及び医薬的に許容される担体を含む。

【0111】

[00113]「医薬的に許容される」という用語は、連邦政府又は州政府の監督官庁によって承認されているか、又は米国薬局方、若しくは動物、特にヒトにおける使用に対して一般に認められている他の薬局方に挙げられていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、添加剤、又はビヒクルを意味する。こうした医薬担体は、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの鉱油、動物、植物又は合成起源のものを含む、水及び油などの滅菌液体であり得る。いくつかの態様において、担体は、天然では確認されていない人工担体である。医薬組成物が静脈内投与される場合、水を担体として使用することができる。生理食塩水及び水性デキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射液用の液体担体として使用することができる。適切な医薬添加剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。本組成物は、所望により、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を含有することもできる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの剤型を取ることができる。本組成物は、従来の結合剤及び担体、例えばトリグリセリドなどを使用し、坐剤として処方することができる。経口製剤は、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。こうした組成物は、患者に適切な投与剤型を提供するため、好ましくは精製形態の治療上有効な量の本化合物を適切な量の担体と共に含む。製剤は投与方法に適合するものとする。

【0112】

[00114]特定の実施形態では、本構築物を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として、日常的な手順に従って製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌等張水性緩衝液の溶液である。必要に応じて、本組成物はまた、注入部位の痛みを緩和するため、可溶化剤及び局所麻酔剤、例えばリグノカインなどを含むことができる。一般に、成分は、単位剤形で、例えば、活性剤の量を示すアンプル又はサシェットなどの密封容器中の凍結乾燥粉末又は水非含有の濃縮物として、個別に、又は一緒に混合して提供される。本組成物が輸液によって投与される場合、滅菌された医薬グレードの水又は生理食塩水を含有する輸液ボトルを用いて投与することができる。本組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分を混合することができるように、注射用の滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。

【0113】

[00115]特定の実施形態において、本明細書に記載の組成物は、中性又は塩の形態として製剤化される。医薬的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの陰イオンで形成されるもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの陽イオンで形成されるものが挙げられる。

【0114】

ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の調製方法
[00116]また、抗ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物を産生する方法も本明細書に記載されている。特定の実施形態において、本抗原結合性構築物は、細胞、例えば、酵母、細菌などの微生物、又はヒト若しくは動物の細胞株における発現によって組換え分子として産生される。実施形態において、抗ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、細胞から分泌される。

【0115】

[00117]抗原結合性構築物は、抗原結合性構築物をコードする発現カセットを使用して、宿主細胞中で発現させることができる。「発現カセット」という用語は、標的細胞の特定の核酸を転写することができる一連の特定の核酸エレメントを用いて、組換えにより、又は合成により産生されるポリヌクレオチドを意味する。組換え発現カセットは、ベクター、例えば、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、又は核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、他の配列中に、転写される核酸配列及びプロモーターを含む。特定の実施形態において、本明細書に記載の発現カセットは、本明細書に記載の抗原結合性構築物又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む。

【0116】

[00118]「ベクター」又は「発現ベクター」という用語は、「発現構築物」と同義であり、標的細胞においてそれが操作可能に会合される特定遺伝子の発現を導入及び誘導するために使用される核酸分子を意味する。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれているベクターを含む。本明細書に記載の発現ベクターは、発現カセットを含む。発現ベクターは、多量の安定的なｍＲＮＡを転写することができる。発現ベクターが標的細胞の内部に存在すると、遺伝子によってコードされているリボ核酸分子又はタンパク質が細胞転写及び／又は翻訳機構によって産生される。一実施形態において、本明細書に記載の発現ベクターは、本明細書に記載の抗原結合性構築物又はその断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む。例示的なベクターは本明細書に記載されている。

【0117】

[00119]典型的には、宿主細胞は、抗原結合性構築物をコードする発現ベクターで形質転換される。「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、本明細書では互換的に使用され、こうしたすべての用語は、細胞の増殖又は培養から生じる後代を含むものと理解されたい。「形質転換」及び「トランスフェクション」は、ＤＮＡを細胞に導入するプロセスを意味するよう互換的に使用される。宿主細胞は、継代回数に関係なく、初代形質転換細胞及びそれに由来する後代を含む「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含む。特定の実施形態において、後代は、核酸内容物が親細胞と完全に同一ではないが、突然変異を含み得る。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたのと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異後代が本明細書に含まれる。

【0118】

[00120]宿主細胞は、本明細書中に記載の抗原結合性構築物を生成するために使用することができる任意のタイプの細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳類培養細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞など、細菌（例えば、大腸菌及び枯草菌）、酵母菌（例えば、サッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）及びピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））、糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ））、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられ、ごく少数ではあるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。宿主細胞のさらなる例は、本明細書に記載されている。

【0119】

[00121]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、哺乳動物細胞において産生される。選択実施形態において、哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２、及びＭＤＣＫ細胞、並びにそれらのサブクラス及び変異体からなる群から選択される。

【0120】

発現ベクター
[00122]本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードするポリヌクレオチドを含有すベクター、宿主細胞、並びに合成技術及び組換え技術による抗原結合性構築物タンパク質の産生を提供する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロウイルスベクターであってもよい。レトロウイルスベクターは、複製コンピテント又は複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、相補的宿主細胞においてのみ生じ得る。

【0121】

[00123]特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖用選択マーカーを含有するベクターに連結されている。一般に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物中に、又は荷電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を用いてインビトロでパッケージングし、次いで宿主細胞に形質導入することができる。

【0122】

[00124]特定の実施形態において、ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター、例えば、少し名称を挙げるとすれば、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ及びｒａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどに作動可能に連結されている。他の適切なプロモーターは、当業者には公知である。本発現構築物は、転写開始、終止に関する部位、及び転写領域において、翻訳用のリボソーム結合部位をさらに含む。構築物によって発現される転写物のコード部分は、最初に翻訳開始コドン、及びポリペプチド翻訳の最後に適切に位置している終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含むのが好ましい。

【0123】

[00125]示したように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むのが好ましい。こうしたマーカーとしては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、又は真核細胞培養用のネオマイシン耐性、並びに大腸菌及び他の細菌培養用のテトラサイクリン、カナマイシン又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、限定するものではないが、大腸菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）及びサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、サッカロマイセス・セレビジエ又はピキア・パストリス（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、及びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；並びに植物細胞が挙げられる。上記の宿主細胞に関する適切な培養培地及び条件は、当技術分野において公知である。

【0124】

[00126]細菌における使用に好ましいベクターとしては、ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＮＨ４６Ａ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。好ましい真核生物ベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬが挙げられる。酵母系における使用に好ましい発現ベクターとしては、限定するものではないが、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、及びＰＡ０８１５（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられる。他の適切なベクターは、当業者には容易に理解されるであろう。

【0125】

[00127]一実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に記載のタンパク質の局在を原核細胞若しくは真核細胞の特定の区画に導くシグナル配列、及び／又は原核細胞若しくは真核細胞からの本明細書に記載のタンパク質の分泌を指示するシグナル配列に融合される。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、タンパク質の発現をペリプラズム空間に向けることを考えることができる。細菌のペリプラズム空間にポリペプチドの発現を導くために抗原結合性構築物タンパク質が融合されるシグナル配列又はタンパク質（若しくはその断片）の例としては、限定するものではないが、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズム大腸菌熱不安定性エンテロトキシンＢ−サブユニットのシグナル配列、及びアルカリホスファターゼのシグナル配列が挙げられる。いくつかのベクターは、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なベクターのｐＭＡＬシリーズ（特にｐＭＡＬ−ｒｈｏシリーズ）など、タンパク質の局在を指示する融合タンパク質を構築するために市販されている。特定の実施形態において、本明細書に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列に融合させ、グラム陰性細菌におけるこうしたポリペプチドの発現及び精製の効率を向上させることができる。米国特許第５，５７６，１９５号及び同第５，８４６，８１８号を参照されたい。なお、その内容は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。

【0126】

[00128]哺乳動物細胞においてその分泌を導くために抗原結合性構築物タンパク質に融合されているシグナルペプチドの例としては、限定するものではないが、ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１−２１）、スタニオカルシンシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ（配列番号５１））、及びコンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ（配列番号５２））が挙げられる。バキュロウイルス発現系と共に使用可能な適切なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１−１９）である。一実施形態において、シグナル配列は、アミノ酸配列（ＭＧＤＮＤＩＨＦＡＦＬＳＴＧＶＨＳＱＶＱ（配列番号５３））を含むＩｇκ分泌シグナルである。一実施形態において、Ｉｇκ分泌シグナルは、ＴＤＰ−４３結合ポリペプチドのＮ末端に融合されている。

【0127】

[00129]選択マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）又はＤＨＦＲを使用するベクターは、それぞれ、薬剤メチオニンスルホキシミン又はメトトレキセートの存在下で増幅させることができる。グルタミンシンターゼ系のベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性である細胞株（例えば、マウス骨髄腫細胞株、ＮＳＯ）が利用できることである。グルタミンシンターゼ発現系はまた、内在性遺伝子の機能を阻止するさらなる阻害剤を提供することによって、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）において機能させることができる。グルタミンシンターゼ発現系及びその構成要素は、ＰＣＴ公報：国際公開第８７／０４４６２号；国際公開第８６／０５８０７号；国際公開第８９／１００３６号；国際公開第８９／１０４０４号；及び国際公開第９１／０６６５７号に記載されており、これらは参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ、Ｎ．Ｈ．）から入手することができる。マウス骨髄腫細胞におけるＧＳ発現系を使用するモノクローナル抗体又は抗原結合性構築物の発現及び産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９（１９９２）及びＢｉｂｌｉａ ａｎｄ Ｒｏｂｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１１：１（１９９５）に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れるものとする。

【0128】

宿主細胞
[00130]また、本明細書に記載のベクター構築物を含有する宿主細胞、さらには、当技術分野で公知の技術を用いて１つ又は複数の異種制御領域（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）と作動的に連結しているヌクレオチド配列を含有する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）などの高等真核細胞、又は酵母細胞などの低級真核細胞であってもよく、又は宿主細胞は、原核細胞、例えば、細菌細胞であり得る。挿入遺伝子配列の発現をモジュレートするか、又は所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主株を選択することができる。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物質の存在下で上昇させることができる。したがって、遺伝子操作されたポリペプチドの発現を調節することができる。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳及び翻訳後プロセシング及び修飾（例えば、リン酸化、切断）に関する特徴及び特異的メカニズムを有する。適切な細胞株を選択することで、発現される外来タンパク質の所望の修飾及びプロセシング確実にすることができる。

【0129】

[00131]発現用の宿主として利用できる哺乳動物細胞株は当技術分野で周知であり、限定するものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、ヒト上皮腎臓２９３細胞、及び他の多数の細胞株を含む、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な多数の不死化細胞株が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有し、構成的なＭａｎＬＡＭ結合特性を有する抗体を産生するかを決定することによって選択される。

【0130】

[00132]本明細書に記載の核酸及び核酸構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション；ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、又は他の方法によって実施することができる。こうした方法は、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）などの多数の標準実験室マニュアルに記載されている。本明細書に記載のポリペプチドは、実際には、組換えベクターを欠損している宿主細胞によって発現させることができることを具体的に検討している。

【0131】

[00133]本明細書中で論じているベクター構築物を含有する宿主細胞を包含することに加えて、一実施形態はまた、内在性遺伝物質を欠失又は置換するように（例えば、カーゴポリペプチドに対応するコード配列は、カーゴポリペプチドに対応する抗原結合性構築物タンパク質と置き換えられる）及び／又は遺伝物質を含むように操作された脊椎動物起源の、特に哺乳動物起源の一次、二次及び不死化宿主細胞も包含する。内在性ポリヌクレオチドと作動可能に連結している遺伝物質は、内在性ポリヌクレオチドを活性化、変化及び／又は増幅させることができる。

【0132】

[00134]さらに、当技術分野で知られている技術を使用して、異種ポリヌクレオチド（例えば、タンパク質、又はその断片若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド）及び／又は異種制御領域（例えば、プロモーター及び／又はエンハンサー）を、相同組換えを介して治療用タンパク質をコードする内在性ポリヌクレオチド配列と作動可能に連結させることができる（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号、１９９７年６月２４日発行；国際公開第９６／２９４１１号；国際公開第９４／１２６５０号；Ｋｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；及びＺｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照されたい、なお、それぞれの開示内容は、その全体を参照により組み入れるものとする）。

【0133】

精製
[00135]本明細書に記載の抗原結合性構築物タンパク質は、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えばタンパク質Ａなどとのアフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィー、及びレクチンクロマトグラフィーなどを含む周知の方法によって、組換え細胞培養物から回収及び精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いるのが最も好ましい。

【0134】

[00136]特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物タンパク質は、限定するものではないが、Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ポロスＨＳ、ポロスＤＥＡＦ、トヨパールＱ、トヨパールＱＡＥ、トヨパールＤＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ Ｑ及びＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｑ、及びＤＥＡＥカラムによるクロマトグラフィーを含む、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する。

【0135】

[00137]特定の実施形態において、本明細書に記載のタンパク質は、限定するものではないが、ＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ポロスＨＳ、ポロスＣＭ、トヨパールＳＰ、トヨパールＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ Ｓ及びＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ Ｓ及びＣＭカラム、並びにそれらの同等物及び類似物を含む、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する。

【0136】

化学合成及び無細胞発現
[00138]さらに、本明細書に記載の抗原結合性構築物タンパク質は、当技術分野で公知の技術を使用して化学的に合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ ａｎｄ Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）を参照されたい）。例えば、ポリペプチド断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成装置を用いることにより合成することができる。さらに、所望により、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体をポリペプチド配列への置換又は付加として導入することができる。非古典的アミノ酸としては、限定するものではないが、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、設計アミノ酸、例えばβ−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及び一般のアミノ酸類縁体が挙げられる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）又はＬ（左旋性）であり得る。

【0137】

[00139]特定の実施形態において、無細胞タンパク質発現系を利用して、生存細胞を使用することなく、ポリペプチド（例えば、重鎖及び軽鎖ポリペプチド）を同時発現させる。代わりに、ＤＮＡをＲＮＡに転写し、ＲＮＡをタンパク質に翻訳するのに必要とされるすべての成分（例えば、リボソーム、ｔＲＮＡ、酵素、補因子、アミノ酸）を、インビトロで使用するための溶液として提供する。特定の実施形態において、インビトロでの発現は、（１）重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドをコードする遺伝子鋳型（ｍＲＮＡ又はＤＮＡ）、並びに（２）必要な転写及び翻訳分子機構を含有する反応溶液が必要である。特定の実施形態において、細胞抽出物は、反応溶液の成分、例えば、ｍＲＮＡ転写用のＲＮＡポリメラーゼ、ポリペプチド翻訳用のリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノ酸、酵素補因子、エネルギー源、及び適切なタンパク質折りたたみに必須の細胞成分などを実質的に供給する。無細胞タンパク質発現系は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、又はそれらの組合せに由来する溶解物を使用して調製することができる。こうした細胞溶解物は、翻訳に必要とされる酵素及びビルディングブロックの正確な組成及び割合を提供することができる。いくつかの実施形態において、細胞膜は、細胞の細胞質ゾル及びオルガネラ成分のみを残して除去する。

【0138】

[00140]いくつかの無細胞タンパク質発現系は、Ｃａｒｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０：１１８５−１１９４で論述されているように、当分野で公知である。例えば、無細胞タンパク質発現系は、原核細胞又は真核細胞に基づいて利用することができる。原核生物の無細胞発現系の例としては、大腸菌由来のものが挙げられる。真核生物の無細胞タンパク質発現系は、例えば、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽及び昆虫細胞由来の抽出物に基づいて利用することができる。こうした原核及び真核細胞無細胞タンパク質発現系は、Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｑｉａｇｅｎ及びＮｏｖａｇｅｎなどの会社から市販されている。当業者は、相互に対を形成することができるポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチド）を産生し得る適切な無細胞タンパク質発現系を容易に選択することができる。さらに、無細胞タンパク質発現系は、シャペロン（例えば、ＢｉＰ）及びイソメラーゼ（例えば、ジスルフィドイソメラーゼ）を補充し、ＩｇＧフォールディングの効率を改善することもできる。

【0139】

[00141]いくつかの実施形態において、無細胞発現系を利用して、ＤＮＡ鋳型（転写及び翻訳）又はｍＲＮＡ鋳型（翻訳のみ）から重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドを同時発現させる。

【0140】

酵母における発現
[00142]いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、酵母細胞において産生される。酵母は、通常のいずれかの方法、例えばエレクトロポレーションで所望のタンパク質のコード配列で形質転換される。エレクトロポレーションによって酵母を形質転換する方法は、Ｂｅｃｋｅｒ ＆ Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示されている。

【0141】

[00143]有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３−４０６及びｐＲＳ４１３−４１６が挙げられ、一般に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．９２０３７，ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５及びｐＲＳ４０６は、酵母組込みプラスミド（Ｙｉｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２及びＵＲＡ３を組み込んでいる。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は酵母セントロメアプラスミド（Ｙｃｐ）である。

【0142】

[00144]タンパク質を発現する宿主としての一実施形態において有用であると考えられる酵母の例示的な属は、（以前はハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）として分類されていた）ピチュア（Ｐｉｃｈｕａ）、サッカロマイセス、クリベロマイセス、アスペルギルス、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）、スチゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シテロマイセス（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メチニコビア（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）、ロードスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ボトリオアスクス（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドマイコプシス（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）などが挙げられる。好ましい属は、サッカロマイセス、スチゾサッカロマイセス、クルベロマイセス、ピキア及びトラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）からなる群から選択されるものである。サッカロマイセス種の例は、サッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイセス・イタリカス（Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ）及びサッカロマイセス・ロキシ（Ｓ．ｒｏｕｘｉｉ）である。

【0143】

[00145]クリベロマイセス種の例は、クリベロマイセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、クリベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）及びクリベロマイセス・マルキアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）である。適切なトルラスポラ種は、トルラスポラ・デルブルエッキ（Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）である。ピキア（ハンセヌラ）種の例は、ピキア・アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）（以前はハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、ピキア・アノマラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）（以前はハンセヌラ・アノマラ（Ｈ．ａｎｏｍａｌａ））及びピキア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。サッカロマイセス・セレビジエを形質転換するための方法は、欧州特許出願公開第２５１７４４号、欧州特許出願公開第２５８０６７号、及び国際公開第９０／０１０６３号に一般的に教示されており、これらはすべて参照により本明細書に組み入れるものとする。

【0144】

[00146]本明細書に記載の抗原結合性構築物の合成に有用な例示的なサッカロマイセスの種としては、サッカロマイセス・セレビジエ、サッカロマイセス・イタリカス、サッカロマイセス・ディアスタティクス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）及びチゴサッカロマイセス・ロキシ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ）が挙げられる。クリベロマイセスの好ましい例示的な種としては、クリベロマイセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）及びクリベロマイセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）が挙げられる。ハンセヌラの好ましい典型的な種としては、ハンセヌラ・ポリモルファ（現在のピキア・アングスタ）、ハンセヌラ・アノマラ（現在のピキア・アノマラ）及びピキア・カプスラータ（Ｐｉｃｈｉａ ｃａｐｓｕｌａｔａ）が挙げられる。ピキアのさらなる好ましい例示的な種としては、ピキア・パストリスが挙げられる。アスペルギルスの好ましい例示的な種としては、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）が挙げられる。ヤロウィアの好ましい典型的な種としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が挙げられる。多くの好ましい酵母の種は、ＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の好ましい酵母の種は、ＡＴＣＣから入手可能であり、タンパク質の発現に有用である：サッカロマイセス・セレビジエ、Ｈａｎｓｅｎ、テレモルフ株ＢＹ４７４３ ｙａｐ３突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２２７３１）；サッカロマイセス・セレビジエ、Ｈａｎｓｅｎ、テレモルフ株ＢＹ４７４３ ｈｓｐｌ５０突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２１２６６）；サッカロマイセス・セレビジエ、Ｈａｎｓｅｎ、テレモルフ株ＢＹ４７４３ ｐｍｔ１突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２３７９２）；サッカロマイセス・セレビジエ、Ｈａｎｓｅｎ、テレモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４；及び６２９９５）；サッカロマイセス・ディアスタティクス Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｘ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ、テレモルフ（ＡＴＣＣ受託番号６２９８７）；クリベロマイセス・ラクティス（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ、テレモルフ（ＡＴＣＣ受託番号７６４９２）；ピキア・アングスタ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．）Ｋｕｒｔｚｍａｎ、テレモルフ（ハンセヌラ・ポリモルファ ｄｅ Ｍｏｒａｉｓ ｅｔ Ｍａｉａ、テレモルフとして寄託されているもの）（ＡＴＣＣ受託番号２６０１２）；アスペルギルス・ニガー ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ、ａｎａｍｏｒｐｈ（ＡＴＣＣ受託番号９０２９）；アスペルギルス・ニガー ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号１６４０４）；アスペルギルス・ニデュランス（Ｅｉｄａｍ）Ｗｉｎｔｅｒ、アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号４８７５６）；並びにヤロウィア・リポリティカ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．）、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ ｅｔ ｖｏｎ Ａｒｘ、テレモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２０１８４７）。

【0145】

[00147]サッカロマイセス・セレビジエに適したプロモーターとしては、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１又はＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨ０５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α−交配因子フェロモン、［交配因子フェロモン］、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、及び５’制御領域の部分と他のプロモーター５’制御領域の部分又は上流の活性化部位とのハイブリッドに関与しているハイブリッドプロモーター（例えば、欧州特許出願公開第２５８０６７号のプロモーター）に関する遺伝子が挙げられる。

【0146】

[00148]スチゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）において使用するための簡便な制御可能なプロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，１０８５７−１０８６４に記載されているｎｍｔ遺伝子由来のチアミン抑制性プロモーター、及びＨｏｆｆｍａｎ ＆ Ｗｉｎｓｔｏｎ（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２４，８０７−８１６に記載されているグルコース抑制性ｊｂｐ１遺伝子プロモーターが挙げられる。

【0147】

[00149]外来遺伝子を発現させるためにピキアを形質転換する方法は、例えば、Ｃｒｅｇｇら（１９９３年）及び様々なＰｈｉｌｌｉｐｓの特許（例えば、米国特許第４，８５７，４６７号参照、これは参照により本明細書に組み入れるものとする）に教示されており、ピキア発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ，Ｌｅｅｋ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから市販されている。適切なプロモーターとしては、ＡＯＸ１及びＡＯＸ２が挙げられる。Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２，３４５９−３４６５は、ハンセヌラベクター及び形質転換に関する情報を含み、適切なプロモーターはＭＯＸ１及びＦＭＤ１である；欧州特許出願公開第３６１９９１号、Ｆｌｅｅｒら（１９９１）及びＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒの他の出版物は、クリベロマイセスの種において外来タンパク質を発現する方法を教示しており、適切なプロモーターはＰＧＫＩである。

【0148】

[00150]転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結及びポリアデニル化のための適切なシグナルを含有する真核生物遺伝子の３’隣接配列である。適切な３’隣接配列は、例えば、使用される発現制御配列に自然に連結されている遺伝子のものであってもよく、すなわちプロモーターに対応していてもよい。或いは、これらは異なっていてもよく、この場合、サッカロマイセス・セレビジエＡＤＨＩ遺伝子の終止シグナルが好ましい。

【0149】

[00151]特定の実施形態において、所望の抗原結合性構築物タンパク質は、選択した酵母において有効な任意のリーダーであり得る、分泌リーダー配列でまず発現される。サッカロマイセス・セレビジエにおいて有用なリーダーとしては、交配因子αポリペプチド（ＭＦα−１）由来のもの及び欧州特許出願公開第３８７３１９号のハイブリッドリーダーが挙げられる。こうしたリーダー（又はシグナル）は、成熟タンパク質が周囲の培地に放出される前に、酵母によって切断される。さらに、こうしたリーダーとしては、特開昭６２−０９６０８６号公報（９１１０３６５１６として付与）に記載されているＳ．セレビシエインベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）、ＭＦα−１のプレ配列、Ｏグルカナーゼ（ＢＧＬ２）及びキラートキシン；サッカロマイセス・ディアスタティクスグルコアミラーゼＩＩ；サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓ．ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）α−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；クリベロマイセス・ラクティスキラー毒素；並びにカンジダグルコアミラーゼが挙げられる。

【0150】

翻訳後修飾：
[00152]特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は翻訳中又は翻訳後に差異的に修飾されている。いくつかの実施形態において、その修飾は、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、及び抗体分子若しくは抗原結合性構築物又は他の細胞リガンドへの結合のうちの少なくとも１つである。いくつかの実施形態において、抗原結合性構築物は、限定するものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ_４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；及びツニカマイシン存在下における代謝合成を含む、公知の技術によって化学的に修飾することができる。

【0151】

[00153]本明細書に記載の抗原結合性構築物のさらなる翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ−結合型又はＯ−結合型の炭水化物鎖、Ｎ末端又はＣ末端のプロセシング、化学的部分のアミノ酸骨格への結合、Ｎ結合型又はＯ結合型の炭水化物鎖の化学修飾、及び原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加又は欠失が挙げられる。本明細書に記載の抗原結合性構築物は、タンパク質の検出及び単離することができる酵素標識、蛍光標識、同位体標識又は親和性標識などの検出可能な標識で修飾される。特定の実施形態において、適切な酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジンビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド又はフィコエリトリンが挙げられ；発光性材料の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光性物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。

【0152】

[00154]特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、放射性金属イオンと会合する大環状キレート剤に結合されている。

【0153】

[00155]いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、又は当技術分野で周知の化学修飾技術のいずれかによって修飾される。特定の実施形態において、同じタイプの修飾が、所定のポリペプチドのいくつかの部位で、同一程度又は異なる程度で存在し得る。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物由来のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝しており、いくつかの実施形態において、分枝を有するか又は有さない環状である。環状ポリペプチド、分枝状ポリペプチド及び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後天然プロセスの結果によるものであるか、又は合成方法によって作製される。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質又は脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル反応、共有結合架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸の転写−ＲＮＡ媒介付加、及びユビキチン化などが挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｇｓ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）を参照されたい）。

【0154】

[00156]特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、本明細書に記載のタンパク質によって結合されているか、タンパク質に結合しているか、又はタンパク質と会合するポリペプチドのイムノアッセイ又は精製に特に有用な固相担体に結合される。こうした固相担体としては、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンが挙げられる。

【0155】

神経変性疾患の治療における抗原結合性構築物の使用
[00157]特定の実施形態において、ＴＤＰ−４３タンパク質障害を特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、こうした治療、予防又は改善が望まれる対象に、本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物を、疾患又は障害を治療、予防又は改善するのに有効な量で投与することを含む、方法が提供される。

【0156】

[00158]「障害」又は「疾患」とは、本明細書に記載の抗ＴＤＰ−４３抗体による治療又は方法の効果を享受し得る任意の症状を意味する。これには、哺乳動物を当該の疾患に罹患しやすくするそれらの病的症状を含む、慢性及び急性の障害又は疾患が含まれる。好ましい実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物で治療される疾患は、ＴＤＰタンパク質障害に関連する。これらの障害としては、限定するものではないが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）運動ニューロン疾患、アルツハイマー病、レーヴィ小体型痴呆、ハンチントン病、レーヴィ小体疾患、軽度認知障害（ＭＣＩ）、又は神経損傷、脳損傷、脳虚血（脳卒中）によって引き起こされたＴＤＰ−４３異常が挙げられる。

【0157】

[00159]「対象」という用語は、治療、観察又は実験の目的である動物、いくつかの実施形態においては哺乳動物を意味する。動物は、ヒト、非ヒト霊長類、ペット動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、又は実験動物（例えば、ラット、マウス、モルモットなど）であり得る。

【0158】

[00160]本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、限定するものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ及びブタが挙げられる。いくつかの実施形態において、抗ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物で治療される対象は、マウス又はヒトである。

【0159】

[00161]「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然経過を変化させる試みにおける臨床上の介入を意味し、予防のため、又は臨床病理の経過中に実施することができる。治療の望ましい効果としては、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の低減、疾患の進行速度の減速、疾患状態の改善又は軽減、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、疾患又は障害の発症を遅らせるために使用される。

【0160】

[00162] 治療の望ましい効果としては、限定されないが、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の低減、疾患の進行速度の減速、疾患状態の改善又は軽減、及び寛解又は予後の改善が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構築物は、疾患の発症を遅らせるため、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。

【0161】

[00163]本明細書で使用される「有効な量」という用語は、列挙した方法の目標を達成する、例えば、治療しようとする疾患、症状又は障害の病状のうちの１つ又は複数をある程度まで緩和する、投与される構築物の量を意味する。治療用タンパク質の異常発現及び／又は活性に関連する疾患又は障害の治療、阻害及び予防において有効である、本明細書に記載の組成物の量は、標準の臨床技術によって決定することができる。さらに、最適な投与量範囲を同定しやすくするために、インビトロアッセイを任意で使用することもできる。製剤で使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度によって決まり、医療関係者の判断及びそれぞれの患者の状況に従って決定されるものとする。有効な用量は、インビトロ系又は動物モデル試験系から得られた用量反応曲線から推定される。

【0162】

[00164]本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、対象に投与される。各種送達系が知られており、本明細書に記載の抗原結合性構築物製剤を投与するために使用することができる。例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、化合物の発現が可能な組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ 、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）を参照）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などである。投与方法としては、限定するものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外及び経口経路が挙げられる。本化合物又は組成物は、任意の都合のよい経路、例えば、注入又はボーラス注射によって、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、他の生物活性物質と共に投与することができる。投与は全身的又は局所的であり得る。

【0163】

[00165]さらに、特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物組成物は、脳室内及び髄腔内注射を含む任意の適切な経路によって、中枢神経系に導入することが望ましい。脳室内注射は、例えば、Ｏｍｍａｙａリザーバーなどのリザーバーに取り付けられている脳室内カテーテルによって促進され得る。また肺投与は、例えば、吸入器又はネブライザー、及びエアロゾル化剤を用いた製剤を使用することによって使用することができる。

【0164】

[00166]特定の実施形態において、治療を必要とする領域に局所的に本明細書に記載の抗原結合性構築物又は組成物を投与することが望ましい。これは、例えば、限定するものではないが、手術中の局所注入よって、例えば外科手術後の創傷包帯との併用時の局所適用によって、注射によって、カテーテルによって、坐剤手段によって、或いは、インプラント手段によって達成することができ、前記インプラントは、シアラスティック膜などの膜又は繊維を含む、多孔性、非多孔性又はゼラチン状の材料である。本明細書に記載したような抗原結合性構築物を含むタンパク質を投与する場合、タンパク質が吸収しない物質を使用するように注意することが好ましい。

【0165】

[00167]別の実施形態において、本抗原結合性構築物又は組成物は、小胞、特にリポソームで送達することができる（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同文献，ｐｐ．３１７−３２７；一般に同文献を参照）。

【0166】

[00168]さらに別の実施形態において、本抗原結合性構築物又は組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態において、ポンプを使用することができる（Ｌａｎｇｅｒ，上掲；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）を参照）。別の実施形態において、ポリマー材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）を参照されたい；また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）を参照されたい）。さらに別の実施形態において、制御放出系を治療標的、例えば脳の近傍に置くことができ、その結果、全身投与量のごく一部しか必要ではない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照されたい）。

【0167】

遺伝子治療
[00169]いくつかの実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物をコードする核酸は、適切な核酸発現ベクターの一部として核酸を構築し、核酸を細胞内に導入するように投与することによって、例えば、レトロウイルスベクターを使用することによって（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、又は直接注入によって、又は微粒子衝撃の使用によって（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション剤によるコーティングによって、又は核内に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して投与することによって（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１）を参照）、インビボにおいて投与し、そのコードされたタンパク質の発現を促進することができる。或いは、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。

【0168】

[00170]特定の実施形態において、抗原結合性構築物をコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに挿入されている（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２（３）４９８−５１０（２０１４）、及び本明細書の実施例１２を参照）。ウイルスベクターは、例えば髄腔内注射によって、全身的又は局所的に、対象に投与することができる。

【0169】

[00171]特定の実施形態において、本明細書に記載の抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３上の非オーバーラップ結合標的エピトープを有する抗原結合性構築物との組合せとして投与される。

【0170】

[00172]疾患又は障害の治療、阻害及び予防で有効である抗原結合性構築物の量は、標準の臨床技術によって決定することができる。さらに、インビトロアッセイを任意に使用し、最適な投与量の範囲を同定しやすくすることができる。また、製剤で使用される正確な用量は、投与経路、及び疾患又は障害の重篤度にも依存し、医療関係者の判断及びそれぞれの患者の状況に従って決定されるものとする。有効用量は、インビトロ系又は動物モデル試験系から得られる用量反応曲線から推定される。

【0171】

[00173]本明細書には、それを必要とする対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質障害の少なくとも１つの病状の発症を予防又は遅延する方法であって、本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の治療上有効な量を投与するステップを含む、方法が包含される。一実施形態において、対象は実験生物であり、例えば、限定するものではないが、トランスジェニックマウスである。一実施形態において、対象はヒトである。

【0172】

[00174]本明細書に記載の抗原結合性構築物は、単独で投与することができ、又はＲｉｌｕｔｅｋ（登録商標）などの神経変性疾患に使用される他のタイプの治療と組み合わせて投与することができる。

【0173】

抗原結合性構築物を特徴付ける方法
[00175]本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３タンパク質障害の任意のインビボモデル又はインビトロモデルを用いて特徴付けすることができる。ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物が、ＴＤＰ−４３タンパク質障害に関するマウスモデル、例えば、Ｓｗａｍｐ ｅｔ ａｌ．Ｂｒａｉｎ １３４：２６１０−２６２６（２０１１）に記載されているＴＤＰ−４３タンパク質障害に関する動物モデルの１つにおいて特徴付けすることができることは、当業者には理解されよう。Ｓｗａｒｕｐ ｅｔ ａｌ．２０１１には、ＴＤＰタンパク質障害の３つのトランスジェニックマウスモデル：野生型、Ｇ３４８Ｃ及びＡ３１５Ｔが記載されている。これらのトランスジェニックマウスは、運動及び認知障害を示す（Ｂａｒｎｅｓ迷路試験、受動回避試験及び加速回転棒試験によるステップによって測定した場合）。さらに、マウスは、細胞質ＴＤＰ−４３陽性ユビキチン含有封入体、中間フィラメント異常、軸索障害及び神経炎症を示す。さらなる動物モデルは、Ｗｅｇｏｒｚｅｗｓｋａ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６（２００９），１８８０９−１４；Ｇｕｒｎｅｙ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６４（１９９４），１ ７７２−７５；Ｓｈａｎ ｅｔ ａｌ，Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５８（２００９），７０−７４；Ｗｉｌｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０６（２０１０），３８５８−６３；Ｄｕｃｈｅｎ ａｎｄ Ｓｔｒｉｃｈ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ，Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３１（１９６８），５３５−４２；Ｄｅｎｎｉｓ ａｎｄ Ｃｉｔｒｏｎ，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １８５（２００９），７４５−５０；Ｓｗａｍｐ ｅｔ ａｌ，Ｂｒａｉｎ １３４（２０１１），２６１０−２６２６；Ｓｇａｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｃｌｉｎ ｉｎｖｅｓｔ．１２１（２）：７２６−３８（２０１１）；Ｃａｃｃａｍｏ ｅｔ ａｌ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ．１８０（ｌ）：２９３−３０２（２０１２），Ｃａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ，Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．１２３（６）：８０７−２３（２０１２），Ｃｕｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍ Ｍｏｉ Ｇｅｎｅｔ．１９（９）：１７４１−５５（２０１０）：及びＴａｔｏｍ ｅｔ ａｌ，ｏＬ Ｔｈｅｒ．１７（２００９），６０７−６１３に記載されている。これらの動物モデルを用いて、本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物を評価することができる。

【0174】

[00176]ＴＤＰ−４３タンパク質障害の実験モデルは、予防的な設定で使用することができ、又は治療的な設定で使用することができる。予防的な設定においては、動物への投与は、ＴＤＰ−４３タンパク質障害又はその病状の発症よりも前に開始する。本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３タンパク質障害又はその病状の発症を予防、軽減又は遅延させるその能力について評価することができる。治療モデルにおいて、動物への投与は、ＴＤＰ−４３タンパク質障害又はその病状の発症の後に開始する。治療の設定において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３タンパク質障害又はその病状を治療、軽減又は緩和するその能力について評価される。ＴＤＰ−４３タンパク質障害の病状としては、限定するものではないが、実験対象のニューロン、脳、脊髄、脳脊髄液又は血清における病理学的ＴＤＰ−４３沈着物の蓄積、病理学的ＴＤＰ−４３分布、リン酸化ＴＤＰ−４３、又は不溶性ＴＤＰ−４３画分が挙げられる。ＴＤＰ−４３タンパク質障害の任意の動物モデルにおける陽性の予防的又は治療的結果は、特定のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物が、実験モデル生物以外の対象において予防的又は治療的目的のために使用できることを示し、例えば、それを必要とするヒト対象においてＴＤＰ−４３タンパク質障害を治療するために使用される。

【0175】

[00177]一実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３タンパク質障害マウスモデル及び対応する対照野生型マウスに投与することができる。投与される抗原結合性構築物は、マウス抗体又はヒト−マウスキメラであってもよい。ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、当技術分野で公知の任意の手段によって、例えば、腹腔内、頭蓋内、筋肉内、くも膜下腔内、静脈内、皮下、経口及びエアロゾル投与によって投与することができる。実験動物には、１、２、３、４、５回又はそれ以上の用量のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物又は対照組成物、例えばＰＢＳを投与することができる。一実施形態において、実験動物に１又は２回用量のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物を投与する。別の実施形態において、動物は、数週間又は数ヶ月にわたって、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物を常習的に投与される。当業者は、実験目的、例えば、急性試験のための投薬計画、慢性試験のための投薬計画、毒性試験のための投薬計画、予防的又は治療的研究のための投薬計画などの投薬計画を容易に設計することができる。実験動物の特定の組織区画、例えば、限定するものではないが、血清、血液、脳脊髄液、脳又は脊髄組織におけるＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の存在は、当分野の周知の方法を用いて確立することができる。一実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、血液脳関門を貫通することができる。別の実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、ニューロンに入ることができる。ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の用量及び投与頻度を調節することによって、実験動物において所望の濃度を維持することができる。ＴＤＰ−４３タンパク質障害モデルにおける本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の効果は、治療動物及び対照動物におけるＴＤＰ−４３のレベル、生化学的特性又は分布を比較することによって評価することができる。一実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、動物モデルにおける脳又は脊髄におけるＴＤＰ−４３封入体のレベル、量又は濃度を低下させることができる。構築物は、ＴＤＰ−４３封入体のレベル、量又は濃度を、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％又はそれ以上低下させることができる。別の実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、動物モデルにおける脳又は脊髄におけるＴＤＰ−４３包接陽性ニューロンの数又は頻度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％又はそれ以上低下させることができる。ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の効果は、投与後のＴＤＰ−４３の分布及び生化学的特性を試験することによって評価することもできる。一実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、動物モデルの脳又は脊髄における細胞質又は核ＴＤＰ−４３タンパク質の量又は濃度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％又はそれ以上低下させることができ、別の実施形態において、それは、動物モデルの脳又は脊髄における神経性ＴＤＰ−４３タンパク質の量又は濃度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％又はそれ以上低下させることができ、さらなる実施形態において、それは動物モデルにおける脳又は脊髄におけるリン酸化ＴＤＰ−４３タンパク質の量又は濃度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％又はそれ以上低下させることができる。リン酸化ＴＤＰ−４３は、ＴＤＰ−４３の病理学的にリン酸化された形態、例えばｐ４０３／ｐ４０４及びｐ４０９／ｐ４１０に特異的な抗体を用いて検出することができる。Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，６４：６０−７０（２００８）。ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物はまた、例えば、動物モデルの血液、血清又は脳脊髄液中のＴＤＰ−４３濃度を、例えば、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％又はそれ以上、変化させる、例えば低下又は増加させることができ、一実施形態において、減少又は増加の％は、治療前に存在したレベル、数、頻度、量若しくは濃度との相対比較であり、又は未治療対象／対照治療対象に存在するレベル、数、頻度、量若しくは濃度との相対比較である。

【0176】

[00178]一実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質障害の少なくとも１つの病状の発症を予防又は遅延させることができる。一実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質障害の少なくとも１つの病状を軽減又は解消することができる。病状は、病理学的ＴＤＰ−４３沈着、リン酸化ＴＤＰ−４３沈着、又は不溶性ＴＤＰ−４３沈着の形成であり得る。また病状は、血清、血液、尿又は脳脊髄液中のＴＤＰ−４３の存在又は濃度若しくは量の上昇であってもよく、この場合、濃度又は量の上昇は健全な対象と比較される。特定の一実施形態において、病状は、ＴＤＰ−４３関連ＮＦ−ｋＢの存在である。この病状は、神経学的症状、例えば、運動機能の喪失又は認知障害などであり得る。一実施形態において、記憶障害は、バーンズ迷路試験又は受動回避試験によるステップを使用して評価される。一実施形態において、運動機能障害は、加速ロータロッド試験を用いて評価される。一実施形態において、少なくとも１つの病状は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、５０％、７０％、又は９０％低減する。別の実施形態において、ロータロッド装置における潜伏時間は、治療した対象において、対照の対象よりも有意に高い。特定の実施形態において、ロータロッド潜伏時間は、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％増加する。

【0177】

キット及び製造品
[00179]また本明細書には、１つ又は複数の抗ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物を含むキットも記載されている。キットの個別の成分は別々の容器に包装され、こうした容器に付随して、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって規定された形態の通知であってもよく、通知は製造、使用又は販売の政府機関による承認を示している。キットは、任意選択的に、抗原結合性構築物の使用方法又は投与計画を概説する説明書又は指示書を含むことができる。

【0178】

[00180]キットの１つ又は複数の成分が溶液、溶液として、例えば水溶液又は滅菌水溶液として提供される場合、容器手段それ自体は吸入器、シリンジ、ピペット、点眼容器又は他の類似の器具であってもよく、それらから溶液が対象に投与されるか、又はキットの他の成分に適用し、混合することができる。

【0179】

[00181]キットの成分はまた、乾燥形態又は凍結乾燥形態で提供することができ、キットは、凍結乾燥成分を再構成するための適切な溶媒をさらに含むことができる。本明細書に記載のキットは、容器の数又は種類にかかわらず、組成物を患者に投与するのを補助する器具を含んでいてもよい。こうした器具は、吸入器、鼻用スプレー器具、シリンジ、ピペット、鉗子、定量スプーン、点眼容器又は同様の医学的に承認されている送達ビヒクルであり得る。

【0180】

[00182]本明細書に記載の別の態様において、上記の障害の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含有する製品を提供する。製品は、容器及びラベル又は容器上の若しくは容器内に同封された添付文書を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、組成物を単独で収納するか、又は症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な別の組成物と組み合わせた組成物を収納し、滅菌アクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は静脈用溶液バッグ又は皮下注射針によって穿刺可能なストッパーバイアル）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本明細書に記載のＴ細胞活性化抗原結合性構築物である。ラベル又は添付文書は、本組成物が選択された症状の治療に使用されることを示している。さらに、製品は、（ａ）中に含まれている本明細書に記載の抗原結合性構築物が入っている第１の容器と、（ｂ）中に含まれているさらなる細胞傷害性薬又は他の治療薬を含む組成物が入っている第２の容器を含んでいてもよい。本明細書に記載の本実施形態の製品は、組成物が特定の症状の治療に使用することができることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。或いは、又は追加的に、製品は、医薬的に許容される緩衝液、例えば、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などを含む第２（又は第３）容器をさらに含んでいてもよい。製品は、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商品及びユーザーの観点から望ましい他の物質をさらに含んでいてもよい。

【0181】

ＴＤＰ−４３タンパク質障害の診断及びモニタリングにおけるＴＤＰ−４３結合構築物の使用
[00183]ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３タンパク質障害、特に筋萎縮性側索硬化症及び／又は前頭側頭葉変性症の診断に使用することができる。本明細書は、神経変性疾患を発症しやすい対象若しくは発症が疑われる対象、又は神経変性疾患に罹患している対象の診断及び／又はモニタリングにおけるＴＤＰ−４３抗原結合性構築物の使用を提供する。ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物はまた、ＴＤＰタンパク質障害に罹患している対象に投与される治療の有効性をモニターする場合にも使用することができる。

【0182】

[00184]対象の生体試料中のＴＤＰ−４３ポリペプチド又はその断片とＮＦ−κＢｐ６５ポリペプチド又はその断片との間の相互作用のレベルを決定するためのアッセイ方法は、国際公開第２０１２／１７４６６６Ａ１号（参照により本明細書に組み入れるものとする）として公表されている共同所有特許出願で提供されている。こうしたアッセイ方法は、本明細書に記載のＴＤＰ−４３結合構築物を使用することができる。ＴＤＰ−４３ポリペプチド又はその断片とｐ６５ポリペプチド又はその断片との間の相互作用の参照レベルと比較して、生体試料中のＴＤＰ−４３ポリペプチド又はその断片とそのｐ６５ポリペプチド又はその断片との間の相互作用のレベルが高いとは、対象が神経変性疾患を発症しやすい、若しくは発症が疑われるか、又は対象が神経変性疾患に罹患していることを示している。ＴＤＰ−４３とＮＦ−κＢとの会合の検出に、本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物を使用するさらなる方法は、以下の実施例で提供している。

【0183】

[00185]別の実施形態において、ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物又はそれらをコードする核酸は、免疫系又は核酸系の診断方法における試薬として、診断用組成物で使用することができる。本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物は、例えば、それらが液相中で利用され得るか、又は固相担体に結合され得るイムノアッセイにおける使用に好適である。本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物が利用可能なイムノアッセイの例は、直接的又は間接的な形式の競合的及び非競合的イムノアッセイである。こうしたイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリー及びウエスタンブロットアッセイである。

【0184】

[00186]本明細書に記載の抗原結合性構築物は、アッセイで使用するために標識化することができる。当業者に公知の多数の異なる標識及び標識方法がある。一実施形態において使用することができる標識のタイプの例としては、酵素、放射性同位元素、コロイド金属、蛍光性化合物、化学発光性化合物、及び生物発光性化合物が挙げられる。

【0185】

[00187]さらなる実施形態において、本明細書に記載のＴＤＰ−４３抗原結合性構築物はまた、血液試料、リンパ試料、脳脊髄液又は神経組織生検試料であり得る被験個体から試料を取得し、試料とＴＤＰ−４３抗原結合性構築物とを、抗体−抗原複合体を形成させることができる条件下で接触させることにより、個体における障害を診断する方法において使用することができる。次いで、こうした複合体のレベルは、当技術分野で公知の方法によって決定される。対照試料で形成されたレベルよりも有意に高いレベルは、被験個体の疾患を示している。一実施形態は、対象におけるＴＤＰ−４３タンパク質障害を診断する方法であって、（ａ）ＴＤＰ−４３抗原結合性構築物で診断される対象由来の試料中のＴＤＰ−４３のレベルを評価するステップと、（ｂ）観察されたＴＤＰ−４３のレベルを、対照の１名又は複数の対象におけるＴＤＰ−４３のレベルを示す参照標準と比較するステップを含み、ＴＤＰ−４３のレベルと参照標準のレベルとの間の相違又は類似性が、ＴＤＰ−４３タンパク質障害に対象が罹患していることを示す、方法である。診断しようとする対象は、疾患に関して無症候性又は症状発症前であり得る。一実施形態において、対照としての対象は、ＴＤＰ−４３タンパク質障害、例えばＡＬＳ又はＦＴＬＤを有しており、ＴＤＰ−４３のレベルと参照標準のレベルとの間の類似性は、診断しようとする対象がＴＤＰ−４３タンパク質障害を有することを示す。

【0186】

[00188]ＴＤＰ−４３のレベルは、ウエスタンブロット、免疫沈降、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）及びゲル電気泳動から選択される１つ又は複数の技術によってＴＤＰ−４３を分析するステップを含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって評価することができる。

【0187】

[00189]実施例
[00190]以下は、本発明を実施するための特定の実施形態の例である。これらの実施例は、単なる例示の目的で提供しており、本発明の範囲を決して限定するものではない。使用されている数値（例えば、量、温度など）に関しては、正確性を保つように努めたが、いくらかの実験誤差及び偏差は、言うまでもなく許容されたい。本発明の実施は、特に明記しない限り、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を当業者の範囲内で使用する。こうした技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄ Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照されたい。

【0188】

[00191]実施例１：ＴＤＰ−４３のＴＤＰ−４３ ＲＲＭ１ドメインに対する例示的モノクローナル抗体の生成
[00192]ＴＤＰ−４３のＲＲＭ１ドメインをコードする組換えタンパク質に対する一連の例示的モノクローナル抗体を生成した。抗原として使用したＴＤＰ−４３断片は、以下のようにして生成及び精製した。ＲＲＭ１をコードするＥｃｏＲＩ−Ｎｏｔ１ ４２８ｂｐ ｈＴＤＰ４３ ｃＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅させ、ｐＧＥＸ−６Ｐ−１ベクター（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にクローニングした。この組換えプラスミドを使用し、ｈＴＤＰ４３の全部のＲＲＭ１ドメインをコードする１３６ａａタンパク質を発現させるために大腸菌宿主ＢＬ２１を形質転換した。続いて、１５．６８ｋＤａの組換えタンパク質をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）遺伝子融合システム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。

【0189】

[00193]Ｃ５７Ｂ１６マウスを、ＴＤＰ−４３のアミノ酸４０−１７６を含むこのポリペプチド断片で免疫化した（配列については表Ａを参照）。標準ハイブリドーマ技術を使用して得た例示的な抗ＴＤＰ−４３モノクローナル抗体は、非トランスジェニックマウス並びにヒトＴＤＰ−４３を過剰発現するトランスジェニックマウス由来の脊髄抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にイムノブロッティングによって試験した場合、ＴＤＰ−４３タンパク質に対する免疫検出シグナルを生じた（データは示さず）。また、３つのハイブリドーマクローン、Ｃ１０、Ｇ８及びＥ６由来の抗体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画したマウス小グリアＢＶ−２細胞由来の核抽出物のイムノブロットでもＴＤＰ−４３を検出した（図１に示した）。

【0190】

[00194]実施例２：ヒト組換えＦ−κＢ ｐ６５はヒト組換えＴＤＰ−４３と直接的に相互作用する
[00195]ＢＳＡ ０．８μｇ／ｍｌ又はヒト組換えＴＤＰ−４３の０．８μｇ／ｍｌから０．０１２５μｇ／ｍｌの連続希釈液をＰＢＳで調製し、ＥＬＩＳＡマイクロプレート（条件当たり６ウェル）に加え、一晩インキュベートした。ヒト組換えｐ６５−Ｈｉｓ−Ｔａｇ（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を０．２μｇ／ｍｌの濃度で調製し、すべてのウェルに加え、２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中で２時間インキュベートした後、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＨＲＰ（１：１０．０００）（Ａｂｅａｍ）を希釈溶液中で調製し、プレートに加え、２時間インキュベートした。基質溶液を添加し、吸光度を４５０ｎｍで記録した。結果を図２に示す。値は平均±ｓｅｍとして表している。

【0191】

[00196]実施例３：組換えＴＤＰ−４３とＮＦ−κＢ ｐ６５との間の相互作用は、例示的な二価モノクローナル抗ＲＲＭ１−ＴＤＰ−４３抗体のＣ１０、Ｇ８及びＥ６によって阻害される
[00197]ヒト組換えＴＤＰ−４３を０．２ｕｇ／ｍｌの濃度で調製し、ＥＬＩＳＡマイクロプレートに加え、一晩インキュベートした。ｐ６５−Ｈｉｓ−Ｔａｇ（０．４ｕｇ／ｍｌ）を、ＰＢＳ、ＢＳＡ（０．４ｕｇ／ｍｌ）、抗ＴＤＰ−４３ポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ）（０．４ｕｇ／ｍｌ ＩｇＧ）又は抗ＲＲＭ１−ＴＤＰ−４３モノクローナル抗体（Ｆｃドメインを有するＦａｂ／Ｆａｂフォーマットを除いたＣ１０、Ｇ８又はＥ６モノクローナル）（０．４ｕｇ／ｍｌ ＩｇＧ）と１：１で混合し、０．２ｕｇ／ｍｌのｐ６５及び０．２ｕｇ／ｍｌの干渉抗体の最終濃度にさせた。混合溶液をプレートに加え（条件当たり８ウェル）、２時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液中で２時間インキュベートした後、抗Ｈｉｓ−Ｔａｇ−ＨＲＰ（１：１０．０００）を希釈溶液中で調製し、プレートに加え、２時間インキュベートする。基質溶液を添加し、吸光度を４５０ｎｍで記録する。結果を図３に示すが、モノクローナル抗体Ｃ１０、Ｇ８及びＥ６の３つのすべてが、ＴＤＰ−４３とＮＦ−κＢ ｐ６５との相互作用を、ポリクローナル抗ＴＤＰ抗体よりもはるかに著しく阻害することを示す。値は、平均±ｓｅｍとして表している。

【0192】

[00198]実施例４：一本鎖抗ＴＤＰ−４３抗体の誘導
[00199]ｍＲＮＡを実施例１の適切なハイブリドーマ細胞株から単離し、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ｓｃＦｖ抗体をコードするｃＤＮＡを誘導した。ＰＣＲプライマーの混合物を使用することによって、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（Ｖｋ）の可変領域を第１鎖ｃＤＮＡとは別に増幅し、ｐＢＺＵＴ７（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｎ，２２（３），４９８−５１０ ２０１４に開示されている）ベクターにクローニングし、配列決定した。ＶＨドメイン及びＶｋドメインを構築し、相互に連結して完全長ｓｃＦｖ遺伝子を得た。ｓｃＦｖ遺伝子は、標準的な可撓性２０アミノ酸リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３と一緒にＶＨ−リンカー−Ｖｋフォーマットに構築され、次いで、Ｍｙｃタグ付きＰｓｗ１ ｓｃＦＶＤ１．３ Ｔａｇ１発現ベクター（Ｐａｔｅｌ ｅｔ ａｌ．ｏｐ．ｃｉｔ．）の上流にサブクローニングし、ｓｃＦｖ−ＴＤＰ−４３を生成した。次いで、例示的なクローンを配列決定した。生成されたｓｃＦｖは、効率的に分泌させるマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）κ−分泌シグナルと検出を容易にするためのヒトｃ−ｍｙｃエピトープを含有していた。これらの構築物の概略図を図４に示す。

【0193】

[00200]実施例５：ｓｃＦｖフォーマットを有する抗ＴＤＰ−４３抗体は、ＨＥＫ２９３細胞の細胞質及び核に局在し、分泌される
[00201]Ｈｅｋ２９３細胞を、Ｉｇκドメイン、Ｍｙｃ−ｔａｇ、及びＥ６クローンから得られた２つのＶＨ及びＶｋの組合せ、すなわち、ＶＨ１Ｖｋ９、ＶＨ１Ｖｋ１１、ＶＨ７Ｖｋ９及びＶＨ７Ｖｋ１１を含有するｐＳｃＦｖ９発現プラスミドで一時的にトランスフェクトした。構築物の概略図を図４Ａに示す。細胞を４μｇのプラスミドで４８時間トランスフェクションし、次いで回収した。細胞質画分及び核画分を取得し、１２％ゲルに加えた。ウサギポリクローナル抗ｍｙｃ抗体（Ａｂｅａｍ）を使用し、細胞内のＳｃＦｖ抗体を検出した。トランスフェクションされた細胞の培地を回収し、５０００ｒｐｍで、１５分間４℃で遠心分離してデブリを除去し、−２０℃で一晩沈殿させた。ペレットをローディングバッファーに再懸濁し、１２％ゲルにロードした。ｓｃＦｖ抗体は、マウスモノクローナル抗ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で膜をブロッティングすることにより検出した。結果から、Ｅ６＿ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９ ｓｃＦｖ抗体がＨｅｋ２９３細胞の細胞質及び核の両方に局在していたことが明らかである（図５）。またｓｃＦｖ抗体は培地中にも分泌された（図５）。

【0194】

[00202]実施例６：ｓｃＦｖフォーマットを有する抗ＴＤＰ−４３抗体はＴＤＰ−４３ ＲＲＭ１ドメインを検出する
[00203]ＲＲＭ１ドメインを含有する様々な濃度のＴＤＰ−４３ １−２０６アミノ酸断片をドットブロットにより膜上にロードした。膜は、Ｅ６＿ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９をコードする核酸を含有するｐＳｃＦｖ９発現プラスミドでトランスフェクトしたＨｅｋ２９３細胞からの培地で一晩インキュベートした。ｍｙｃシグナルは、抗ｍｙｃ ＨＲＰ抗体インキュベーションを使用して検出した。図６に示した結果は、Ｅ６＿ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９ ｓｃＦｖ抗体がＴＤＰ−４３を特異的に認識できることを示している。

【0195】

[00204]実施例７：ｓｃＦｖフォーマットにおけるＥ６＿ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９の例示的な抗原結合性構築物は、ＴＤＰ−４３とＦ−κＢ ｐ６５との相互作用をブロックする
[00205]抗体供給源としてＥ６＿ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９発現細胞からの馴化培地を使用し、実施例２に記載のようにしてＥＬＩＳＡアッセイを実施した。空のｐＳｃＦｖ９細胞又は無関係な挿入物（Ｄ１．３）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞からの培地を対照として使用した。結果からは、Ｅ６＿ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９は両方とも、ＮＦ−κＢ ｐ６５とのＴＤＰ−４３相互作用をブロックし得ることが明らかである（図７）。０．４ｕｇ／ｍｌ濃度の二価Ｆａｂ／Ｆａｂフォーマット抗体Ｅ６は、ＮＦ−κＢ ｐ６５とのＴＤＰ−４３相互作用をさらに著しく阻害し、ＴＤＰ−４３ポリクローナル抗体は、阻害はしたが、モノクローナルよりも程度は低かった。

【0196】

[00206]実施例８：ＨＥＫ２９３細胞で発現された抗体は細胞内でＴＤＰ−４３と相互作用する
[00207]細胞溶解物は、Ｅ６＿ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９発現ＨＥＫ２９３細胞から調製した。溶解物をポリクローナル抗ＴＤＰ４３に曝露し、細胞ＴＤＰ−４３を免疫沈降させた。免疫沈降物はＰＡＧＥを用いて分離させた。結果を図８に示すが、ｓｃＦｖ抗体Ｅ６＿ＶＨｌＶｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９（ｍｙｃ ｔａｇによって検出）はＴＤＰ−４３と共免疫沈降したことが明らかである。これは、抗原結合性構築物Ｅ６＿ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９が細胞内ＴＤＰ−４３に結合したことを実証している。

【0197】

[00208]実施例９：ＶＨ１Ｖｋ９抗体はＨＥＫ２９３細胞においてＴＤＰ−４３とＮＦ−κＢ ｐ６５の相互作用をブロックする
[00209]細胞溶解物は、ＴＮＦαで４時間処理したＥ６＿ＶＨｌＶｋ９発現ＨＥＫ２９３細胞から調製した。溶解物をポリクローナル抗ＴＤＰ４３抗体に曝露し、細胞ＴＤＰ−４３を免疫沈降させた。免疫沈降物はＰＡＧＥを用いて分離させた。図９は、免疫沈降物を検出するためｐ６５に対する抗体を用いたイムノブロットを示す。結果からは、ＶＨ１Ｖｋ９がＨＥＫ２９３細胞で発現された場合に、ＮＦ−κＢ ｐ６５のレベルの低下が存在したことが明らかである。このことは、ＶＨ１Ｖｋ９が、ＴＰＤ−４３の細胞内のＮＦ−κＢ ｐ６５への結合に干渉したことを示している。

【0198】

[00210]実施例１０：培養細胞系におけるＴＤＰ−４３に対するｓｃＦｖ例示的抗体によるＮＦ−κＢ活性化の阻害
[00211]細胞株は、ルシフェラーゼレポーター４ｋＢｗｔルシフェラーゼプラスミドの安定的挿入とその後のハイグマイシンによる選択によるＢＶ−２ミクログリア細胞の安定的なトランスフェクションにより以前に調製されている（Ｓｗａｍｐ，２０１１ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．ｏｐ ｃｉｔ）。ｓｃＦｖ抗ＴＤＰ−４３抗体をコードする発現プラスミドベクターを、これらのＢＶ−２培養細胞にトランスフェクトし、４８時間一時的に発現させた。最後の４時間の間、細胞をＰＢＳ（対照）又は５００ｎｇ／ｍｌのＬＰＳのいずれかに曝露した。細胞をＧｌｏ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解させ、５０μｌの溶解物を９６ウェルプレートに複製してロードした。アッセイの手順（Ｂｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ）に従い、ルシフェラーゼ基質を添加した。ルミネッセンスのＲＬＵ（相対光単位）を、自動プレートリーダーを用いて測定し、タンパク質定量（Ｂｉｏｒａｄ）によって測定した場合、ウェル中に存在する総タンパク質（μｇ）に対して標準化した。

【0199】

[00212]図１０に示した結果は、ｓｃＦｖ抗体ＶＨ１Ｖｋ９又はＥ６＿ＶＨ７Ｖｋ９のいずれかを発現するＢＶ２細胞においてＬＰＳで処理した後に、ＮＦ−κＢレポーター遺伝子の活性化が低下したことを示している。ＢＶ２細胞の生存率に対する抗体の効果はなかった（データ示さず）。本発明者らは、ｓｃＦｖ ＶＨ７−Ｖｋ９抗体がｓｃＦｖ ＶＨ１Ｖｋ９抗体よりもＢＶ２細胞のＮＦ−κＢ活性を低下させるのにより有効であったことに注目する。ｓｃＦｖ ＶＨ７−Ｖｋ９はＮＦ−κＢ活性を３２％低下させたのに対し、ｓｃＦｖ ＶＨ１Ｖｋ９はＮＦ−κＢ活性を１３％低下させた。これらの２つのｓｃＦｖ抗体はたった１つのアミノ酸が異なり、ｓｃＦｖ ＶＨ７−Ｖｋ９のＥ（グルタミン酸）の代わりにＱ（グルタミン）であることから、興味深い。何らかの理由で、このわずかな変異は、ｓｃＦｖ Ｅ６＿ＶＨ７Ｖｋ９の核内に分配される傾向が亢進されるようであり（図５に示す）、核内でのＮＦ−κＢ ｐ６５とのＴＤＰ−４３相互作用のより効率的な阻害を説明する要因である。

【0200】

[00213]実施例１１：Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞におけるｓｃＦｖ抗体の発現は核ＴＤＰ−４３のレベルを低下させた
[00214]Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞は、実施例５のようにして、Ｅ６＿ＶＨ１Ｖｋ９、Ｅ６＿Ｖｈ７Ｖｋ９又は空ベクターで一時的にトランスフェクトした。４８時間後、核抽出物を細胞から取得し、核ＴＤＰ−４３の量をポンソー染色により定量した。結果を図１１に示す。Ｅ６＿ＶＨｌＶｋ９、Ｅ６＿Ｖｈ７Ｖｋ９は両方とも、核ＴＤＰ−４３の量を有意に低減した。ＡＬＳにおいては、ＴＤＰ−４３ ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルのアップレギュレーションが存在する（Ｓｗａｒｕｐ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｅｘｐ ｍｅｄ ２０１１）。この結果は、抗ＴＤＰ−４３ ｓｃＦｖ抗体が、ＡＬＳにおけるＴＤＰ−４３のアップレギュレーションを弱化することによって保護をもたらし得ることを示唆している。

【0201】

[00215]実施例１２：ｓｃＦｖ抗体を含有するアデノ随伴ウイルスＡＡＶベクターの産生
[00216]以下のプロトコルを用いて、Ｅ６由来一本鎖抗体を含有するｐｓｃＡＡＶベクターを産生した。まず、未分泌一本鎖抗体（−ＩｇＫ）を生成するため、ＶＨ配列の前にＸｂａＩ制限部位を導入し、ｍｙｃ配列の末端にＮｏｔＩを導入するＰＣＲにより、ｐＳｃＦｖ９＿Ｅ６ＶＨｌＶｋ９及びｐＳｃＦｖ９＿Ｅ６ＶＨＶｋ９から７７３ｂｐの断片を取得した。ＸｂａＩ及びＮｏｔＩ制限酵素によるｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．８：１２４８−１２５４，２００１に記載）の消化によって、ＥＧＦＰ配列をＥ６ＶＨ１Ｖｋ９（−ＩｇＫ）及びＥ６ＶＨ７Ｖｋ９（−ＩｇＫ）で置き換えることができた。続いて、ＩｇＫ配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩの制限酵素を使用しｐｓｃＦｖ９プラスミドにより得た。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有するＸｂａＩ／ＰｓｔＩ断片は、ＶＨ配列の前のｐｓｃＡＡＶ＿Ｅ６ＶＨｌＶｋ９＿ＮＳ及びＥ６ＶＨ７Ｖｋ９＿ＮＳプラスミドの対応する制限部位に挿入した。最後に、ｐｓｃＡＡＶプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＰｓｔＩで消化し、ＩｇＫ配列を挿入し、分泌シグナルを有するｐｓｃＡＡＶ＿Ｅ６ＶＨｌＶｋ９及びＥ６ＶＨ７Ｖｋ９を得た。分泌された一本鎖抗体は、標準の方法（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．，７６：７９１−８０１（２００２））によって取得した。簡単に説明すると、ｐｓｃＦｖ９−Ｅ６ＶＨ１Ｖｋ９及びＥ６ＶＨ７Ｖｋ９中にＳｃＦｖ発現カセットを包含する断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＶを使用して切り出し、プラスミドＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｎａｄａ）にクローニングした。次いで、ＧＦＰコード配列を置き換え、ＡＡＶ組換えウイルスの産生で使用するｐｓｃＡＡＶ＿Ｅ６ＶＨ１Ｖｋ９及びｐｓｃＡＡＶ＿Ｅ６ＶＨ７Ｖｋ９プラスミドを作製している、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩで消化したｓｃＡＡＶ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミド（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０１１）に、それをＳａｌＩ／ＮｏｔＩ断片として再クローニングした。配列決定により、正しい挿入がプラスミド内で確認された。

【0202】

[00217]実施例１３：Ｅ６ ｓｃＦｖ抗体はエタクリン酸処理細胞におけるＴＤＰ−４３不溶性を低減する
[00218]Ｈｅｋ２９３細胞を、７２時間、２μｇのＤＮＡ及び５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＯｐｔｉｍｅｍ中で、Ｅ６＿Ｖ１及びＥ６＿Ｖ７ ｓｃＦｖ抗体、空プラスミド又は抗Ｄ１．３ ｓｃＦｖ抗体でトランスフェクションし、５０μＭのエタクリン酸（ＥＡ）で一晩処理してＴＤＰ−４３凝集物を誘導するか、又は対照としての同量のＤＭＳＯ希釈剤で一晩処理した。ＲＩＰＡ（放射性免疫沈降アッセイ緩衝液）不溶性画分が得られた。代表的なウエスタンブロットを図１２Ａに示し、ＴＤＰ−４３の代表的なドットブロット分析を図１２Ｂに示す。これらの結果からは、Ｅ６＿Ｖ１及びＥ６＿Ｖ７ ｓｃＦｖ抗体の両方が、ＥＡ処理後に検出した不溶性ＴＤＰ−４３の量を低減したことが明らかである（ｎ＝３／条件）。＊、ｐ＜０．０５、対空。

【0203】

[00219] Ｈｅｋ２９３トランスフェクト細胞の免疫蛍光染色を実施し、ＴＤＰ−４３を細胞に局在化させた（データは示さず）。非トランスフェクト細胞においては、ＴＤＰ−４３がＥＡ処理後に細胞質に誤って局在化された。しかし、Ｅ６＿Ｖ１及びＥ６＿Ｖ７ ＴＤＰ−４３を発現するトランスフェクト細胞においては、ＥＡ処理後、核内に残り、細胞質の局在及び凝集が回避された。

【0204】

[00220]実施例１４：Ｅ６ ＳｃＦｖ抗体はＴＤＰ−４３をリジンアセチル化から保護する
[00221]Ｈｅｋ２９３細胞を、４８時間、２μｇのＤＮＡ及び５μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＯｐｔｉｍｅｍ中で、Ｅ６ ＳｃＦｖ抗体Ｖ１及びＶ７、空プラスミド又は抗Ｄ１．３ ｓｃＦｖ抗体でトランスフェクションし、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦアルファで４時間処理した。リジンアセチル化タンパク質を、３００μｇの全タンパク質溶解物中で抗アセチル−リジン抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して一晩免疫沈降させ、リジンアセチル化ＴＤＰ−４３の存在をＴＤＰ−４３のウエスタンブロッティングによって検出した（図１３）。この結果からは、Ｅ６ ｓｃＦｖ抗体がリジンアセチル化からＴＤＰ−４３を保護したことが明らかである。空のトランスフェクションベクター（ＥＭＴ）は保護されておらず、トランスフェクションされた対照抗体Ｄ１．３も保護されてなかった。リジンアセチル化は、ＴＤＰ−４３の機能及び凝集を制御する新しい翻訳後修飾として提案されており、ＴＤＰ−４３アセチル化がＲＮＡ結合を低下させ、ＡＬＳ及びＦＴＬＤ−ＴＤＰにおける病理学的介在物にほとんど類似している不溶性の高リン酸化ＴＤＰ−４３種の蓄積を促進するという証拠がある（Ｃｏｈｅｎ Ｔ．Ｊ．，Ｈｗａｎｇ Ａ．Ｗ．，Ｒｅｓｔｒｅｐｏ Ｃ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍ ２０１４）。

【0205】

[00222]上記の様々な実施形態は、組み合わせてさらなる実施形態を提供することができる。本明細書で言及されている、及び／又は出願データシートに列挙されているすべての米国特許、米国特許出願公開公報、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び特許以外の刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み入れるものとする。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願及び刊行物の概念を使用するために変更し、さらなる実施形態を提供することができる。整合性のない場合には、本開示が優先する。

【0206】

[00223]これらの及び他の変更は、上記の詳細な説明に照らして実施形態に行うことができる。一般に、以下の特許請求の範囲において、使用されている用語は、特許請求の範囲を明細書及び特許請求の範囲に開示されている特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではなく、そのような特許請求の範囲が権利を付与する均等物の全範囲と共にすべての可能な実施形態を含めるものと解釈すべきである。特許請求の範囲は、実施例に記載されている好ましい実施形態によって限定されるものではなく、全体としての説明と一致する最も広い解釈が付与されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【配列表】

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