【図1】Ｓｉｘ２−ＧＦＰマウスの腎臓からのＭＭの採取、および培養の概略を示した図である。ＭＭは、個々の単一の細胞に分散させることなく培養される。

【図2】７日間、ｉＭａｔｒｉｘまたはフィブロネクチン（Ｆｎ）で被覆したプレート上で培養したＭＭのネフロン前駆細胞マーカーのｑＰＣＲ分析の結果である。Ｅ１１．５で新たに単離したＭＭは、ポジティブコントロール（Ｅ１１．５ＭＭ）として使用した。ＦＴ：コントロール；ＬＹ：ＬＩＦ＋Ｙ２７６３２；ＬＹＤ：ＬＹ＋ＤＡＰＴ。

【図3】Ｅ１１．５の腎臓から調製した細胞を用いて、ＣＤＬＹおよびＣＤＢＬＹの条件で培養した結果である。培養７日目での総細胞数およびＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞数を示す。図中の数値は、ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）である。ＦＴは、基本培地（コントロール）である。

【図4】Ｅ１５．５またはＰ０の腎臓から調製した細胞を用いてＣＤＢＬＹの条件で培養した結果である。培養７日目での総細胞数およびＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞数を示す。図中の数値は、ＧＦＰ陽性細胞の割合（％）である。

【図5】Ｅ１５．５またはＰ０の腎臓から調製した細胞を用いて増殖させた細胞からの３次元ネフロン構造の再構成の結果である。左列：ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。右側の白抜き矢印は糸球体を、左側の黒矢印は尿細管を示している。

【図6】Ｅ１１．５のＳｉｘ２−ＧＦＰマウスの腎臓からの細胞の増殖に対するＦＧＦ２およびＦＧＦ９の影響を確認した結果である。Ｅ１１．５からのＧＦＰ陽性細胞は、ＦＧＦ２（５０ｎｇ／ｍｌ）またはＦＧＦ９（５０ｎｇの／ｍｌ）にて７日間培養し、その後、ＦＡＣＳにより分析した。培養開始時のＦＡＣＳ分析の結果を左上のパネルに、７日間培養後のＦＡＣＳ分析の結果を右上のパネルに示した。下の左パネルは、培養開始時（Ｅ１１．５）および培養７日目での総細胞数およびＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞の数である。下の右パネルは、各条件におけるネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、およびＷｔ１）の発現を示す。

【図7】Ｅ１１．５の腎臓から調製した細胞を用いて増殖させた細胞からの３次元ネフロン構造の再構成の結果である。左列：ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。白抜き矢印は糸球体を、黒矢印は尿細管を示している。

【図8】ネフロン前駆細胞の増殖におけるＣＨＩＲとＢｍｐ７の最適濃度の検討を示している。精製されたＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞を、示された濃度のＣＨＩＲまたはＢｍｐ７と、ＦＧＦ９を含む最適化条件（ＣＤＢＬＹ＋Ｆｇｆ９）で７日間培養した後、ＦＡＣＳ分析を行った。総細胞数およびＧＦＰ陽性細胞の数を右のパネルに示す。

【図9】ネフロン前駆細胞の増殖におけるＬＩＦとＢｍｐ７の必須性を検討した結果である。Ｅ１１．５のＧＦＰ陽性細胞を、ＦＧＦ９を添加した最適化された状態（全因子を含む）または図に示された因子の非存在下で培養した。総細胞数およびＧＦＰ陽性細胞の数は、右のパネルに示す。

【図10】Ｅ１１．５からＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞の連続継代培養の概略図である。ソートした前駆細胞（緑）は２日間培養して凝集し、さらに、６日間（８日目）プレート上で培養した。次いで、細胞は、１：３に希釈し、１９日目まで培養した。

【図11】最適化された条件（全ての因子を含む）、または示された因子の非存在下での、培養１９日目の総細胞数およびＧＦＰ陽性細胞の数を示す。

【図12】培養中のＧＦＰ陽性細胞のパーセンテージを示している。

【図13】ネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１）の定量ＰＣＲ解析の結果を示す。

【図14】１９日間培養した細胞からの３次元ネフロン構造の再構成の結果である。左列：ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。白抜き矢印は糸球体を、黒矢印は尿細管を示している。

【図15】生体内での状態と比較して、インビトロでのネフロン前駆細胞の増幅細胞数を計算した結果である。左パネル：各発達段階における１つの腎臓の総細胞数とＳｉｘ２−ＧＦＰ陽性細胞数の計算値である（ｎ＝４）。右パネル：１つのＥ１１．５の腎臓の前駆細胞から、インビトロで８日間および１９日間増幅培養したＧＦＰ陽性細胞数の計算値である。

【図16】培養７日目における、総細胞数およびＯＳＲ１−ＧＦＰ陽性細胞の数（左パネル）、ネフロン前駆細胞マーカー（Ｓｉｘ２、Ｐａｘ２、Ｓａｌｌ１、Ｗｔ１およびＯｓｒ１）の定量ＰＣＲ解析の結果（右パネル）を示している。

【図17】ＯＳＲ１−ＧＦＰ ＥＳ細胞由来の７日間増幅培養したネフロン前駆細胞からのネフロン構造の再構成の結果である。左列：ＨＥ染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。白抜き矢印は糸球体を、黒矢印は尿細管を示している。

【図18】ヒトｉＰＳ細胞由来のネフロン前駆細胞の培養の概略を示した図である。ＭＭは、個々の単一細胞に分散されることなく培養される。

【図19】培養０日目と８日目のネフロン前駆細胞の細胞数を測定した結果を左図に、ネフロン前駆細胞マーカーの発現レベルを測定した結果を右図に示す。

【図20】ヒトｉＰＳ細胞由来ネフロン前駆細胞を用いて増殖させた細胞からの３次元ネフロン構造の再構成の結果である。左列：ＨＥ染色；真ん中の列：糸球体のためのマーカーであるネフリン（赤）とＷＴ１（緑）の免疫染色；右列：それぞれ遠位端と近位尿細管のマーカーである、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１（赤）とＣａｄｈｅｒｉｎ６（緑）の免疫染色。スケールバー：２０μｍ。右側２つの白抜き矢印は糸球体を、左側２つの黒矢印は尿細管を示している。