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特許6883292カルボシランデンドリマーを用いた標的組織特異的送達型ドラッグデリバリーシステム用カプセル
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】特許公報(B2)
(11)【特許番号】6883292
(24)【登録日】2021年5月12日
(45)【発行日】2021年6月9日
(54)【発明の名称】カルボシランデンドリマーを用いた標的組織特異的送達型ドラッグデリバリーシステム用カプセル
(51)【国際特許分類】
A61K 47/42 20170101AFI20210531BHJP
A61K 9/48 20060101ALI20210531BHJP
A61K 31/403 20060101ALI20210531BHJP
A61K 31/655 20060101ALI20210531BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20210531BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20210531BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20210531BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20210531BHJP
【ＦＩ】
A61K47/42ZNA
A61K9/48
A61K31/403
A61K31/655
A61P29/00
A61P35/00
C07K7/06
C07K14/00
【請求項の数】9
【全頁数】47
(21)【出願番号】特願2018-519636(P2018-519636)
(86)(22)【出願日】2017年5月26日
(86)【国際出願番号】JP2017019735
(87)【国際公開番号】WO2017204337
(87)【国際公開日】20171130
【審査請求日】2020年3月11日
(31)【優先権主張番号】特願2016-106700(P2016-106700)
(32)【優先日】2016年5月27日
(33)【優先権主張国】JP
(73)【特許権者】
【識別番号】504190548
【氏名又は名称】国立大学法人埼玉大学
(73)【特許権者】
【識別番号】512139205
【氏名又は名称】株式会社Ｃｙｓａｙ
(74)【代理人】
【識別番号】110002332
【氏名又は名称】特許業務法人綾船国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 美穂
(72)【発明者】
【氏名】幡野 健
(72)【発明者】
【氏名】吉田 彰次郎
(72)【発明者】
【氏名】山下 靖弘
【審査官】
松村 真里
(56)【参考文献】
【文献】
国際公開第２０１６／０８４９７９（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０１１−０６３５８７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
国際公開第２０１１／０５０１７８（ＷＯ，Ａ１）
【文献】
特開２０１０−１１２７７７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特表２０１３−５０６６９７（ＪＰ，Ａ）
【文献】
特許第６７８６５１８（ＪＰ，Ｂ２）
(58)【調査した分野】（Int.Cl.，ＤＢ名）
Ａ６１Ｋ ４７／００−４７／６９
Ａ６１Ｋ ９／００−９／７２
Ａ６１Ｋ ３１／００−３３／４４
ＪＳＴＰｌｕｓ／ＪＭＥＤＰｌｕｓ／ＪＳＴ７５８０（ＪＤｒｅａｍＩＩＩ）
ＣＡｐｌｕｓ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＥＭＢＡＳＥ／ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ）
(57)【特許請求の範囲】
【請求項1】
下記式（Ｉ）で表される標的配列提示部を備える凝集性分子が凝集して構成されるエンドサイトーシス増強剤であって、
前記エンドサイトーシス増強剤は、前記凝集性分子によって構成された凝集体の内部に、水性溶媒又は有機溶媒を包含し得る内部空間を備え、
カベオラエンドサイトーシス、脂質ラフトエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス及びファゴサイトーシスからなる群から選ばれるいずれかの細胞内移行経路により細胞内に取り込まれ、
前記標的配列提示部（TSPP）は、蛍光タンパク質と、前記エンドサイトーシス増強剤を標的組織特異的に送達するためのタンパク質又はペプチドで構成される標的認識部位とからなり；
前記エンドサイトーシス増強剤の前記内部空間には、水性溶媒に溶解された分子量２０万以下のタンパク質又は核酸、又は有機溶媒に溶解された疎水性分子が内包される、エンドサイトーシス増強剤。
（式中、Tは、臭素原子又は下記式（II）で表される標的配列提示部を表す。また、ｎ１及びｎ２はそれぞれ前記標的配列提示部の数を表し、（３−ｎ１）及び（３−ｎ２）は臭素原子の数を表す。ｎ１及びｎ２は、０〜３の整数であり、これらが同時に０になることはない。）
前記エンドサイトーシス増強剤は、前記凝集性分子によって構成された凝集体の内部に、水性溶媒又は有機溶媒を包含し得る内部空間を備え、
カベオラエンドサイトーシス、脂質ラフトエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス及びファゴサイトーシスからなる群から選ばれるいずれかの細胞内移行経路により細胞内に取り込まれ、
前記標的配列提示部（TSPP）は、蛍光タンパク質と、前記エンドサイトーシス増強剤を標的組織特異的に送達するためのタンパク質又はペプチドで構成される標的認識部位とからなり；
前記エンドサイトーシス増強剤の前記内部空間には、水性溶媒に溶解された分子量２０万以下のタンパク質又は核酸、又は有機溶媒に溶解された疎水性分子が内包される、エンドサイトーシス増強剤。
【化1】
【化2】
【請求項2】
前記凝集体は、５０〜５００ｎｍの直径を有することを特徴とする、請求項１に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項3】
前記水性溶媒は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、トリス塩酸緩衝液、HEPES緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、及び炭酸‐重炭酸緩衝液からなる群から選ばれるいずれかの緩衝液であることを特徴とする、請求項１に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項4】
前記ペプチドは、組織特異的送達機能と前記組織特異的に送達された前記凝集体の細胞内への取込みを促進する機能とを有し、かつ、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれる標的タンパク質と特異的に結合するものであることを特徴とする、請求項１に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項5】
前記ペプチドは、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることを特徴とする、請求項１に記載のエンドサイトーシス増強剤。
DMPGTVLPGG（配列表の配列番号１）
VPTDTDYSGG（配列表の配列番号２）
DMPGTVLPGG GGGSEGEWQ QQQHQWAKQE（配列表の配列番号３）
DMPGTVLPGG（配列表の配列番号１）
VPTDTDYSGG（配列表の配列番号２）
DMPGTVLPGG GGGSEGEWQ QQQHQWAKQE（配列表の配列番号３）
【請求項6】
前記ペプチドは、配列表の配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることを特徴とする、請求項１に記載のエンドサイトーシス増強剤。
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG
KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF
KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG
IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL
LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号４）
MASMTGGQQMGR VPTDTDYSGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG
KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF
NDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG
IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNDKRDHMVL
LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号５）
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG GGGSEGEWQQQQHQWAKQE MSKGEELFTG VVPILVELDG
DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR
HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK
LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY
LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGTC ELYK GG HHHHHH（配列表
の配列番号６）
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG
KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF
KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG
IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL
LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号４）
MASMTGGQQMGR VPTDTDYSGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG
KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF
NDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG
IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNDKRDHMVL
LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号５）
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG GGGSEGEWQQQQHQWAKQE MSKGEELFTG VVPILVELDG
DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR
HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK
LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY
LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGTC ELYK GG HHHHHH（配列表
の配列番号６）
【請求項7】
前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞で構成される組織、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることを特徴とする、請求項１に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【請求項8】
前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（III）〜（VI）からなる群から選ばれるいずれかの構造を有する分子で表されるものであることを特徴とする請求項１に記載のエンドサイトーシス増強剤：
式中、TSPPは、標的配列提示部を有する蛍光タンパク質を表す。
式中、TSPPは、標的配列提示部を有する蛍光タンパク質を表す。
【化3】
【化4】
【化5】
【化6】
【請求項9】
前記蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることを特徴とする、請求項８に記載のエンドサイトーシス増強剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、薬物送達システムに使用可能な、カルボシランデンドリマーを用いた標的組織特異的送達型ドラッグデリバリーシステム用標的型カプセルに関する。【背景技術】
【0002】
現在、抗体、ペプチドアプタマー、核酸等の生体高分子が、次世代医薬品として注目を集めている。こうした生体高分子は、製造工程における品質管理、製剤の保存、及び投与方法その他の点で、従来の低分子化合物を有効成分とする医薬品とは大きく異なっている。【0003】
一般に、医薬製剤を投与する場合、治療を要する疾病と薬剤の性質にもよるが、標的部位にどれだけの有効成分を送達できるかが奏効率に影響する。例えば、生体高分子であるタンパク質や抗体を有効成分とする場合には、投与時の剤形によって、これらに対する抗体が生成されて有効性が低下し、それによって奏効率（治療効果）も下がるといった問題が生じることも知られている。【0004】
このため、こうした医薬製剤を標的部位に適切に送達する手段として、様々な薬剤送達システム（ＤＤＳ：ドラッグデリバリーシステム）が、盛んに開発されている。ＤＤＳに使用する担体としては、例えば、リポソーム、ミセル、合成樹脂粒子等を挙げることができる。また、こうした担体を使用した製剤としては、例えば、標的部位に局在する分子と特異的に結合するリガンドをリポソーム等に結合させたもの（特許文献１、及び２参照）、リポソームや合成樹脂粒子等の表面にＮ−アセチルグルコサミンその他の糖を露出させたもの（特許文献３及び４参照）、及びミセルに抗体を結合させたもの（特許文献５参照）などが報告されている。【0005】
また、ミセル構造となるデンドリマーを利用した担体についても、開発が進められつつある（特許文献６、７及び８参照）。デンドリマーとは、ギリシャ語の「ｄｅｎｄｒａ」（樹木）を語源とする、規則正しく分岐した樹状高分子化合物の総称である。デンドリマーは数分子が会合すると球状となり、その内部にナノメートルスケールの空間が形成される。このため、この空間に様々な官能基が現れるように分子を組み込むことや会合度を数10〜数100に上げる事もでき、設計の自由度が高い。こうしたことから、現在、ナノテクノロジーの分野においては、様々な新規デンドリマーの開発が盛んに行われている。【0006】
これまでに、ウイルスや細菌への感染によって生じる疾患を予防及び／又は治療するために、デンドリマーを利用したＤＤＳ担体の開発が行われてきている（特許文献９参照）。【0007】
一方、ＡＩＥ（aggregation-induced emission；非発光性化合物が互いに凝集し合うことで、特定の波長の光を照射することによって、高効率発光を惹起する現象）効果を有するシロール基を含有するデンドリマー（以下、本明細書においては、「カルボシランデンドリマー」という。）は、通常、ミセルを形成すると凝集体の形成がなされたことと等価となり蛍光発光することが知られている（非特許文献１参照）。【0008】
人間の体は約60兆個の細胞から出来ており、これら全ての細胞が細胞外から栄養素、ホルモン又は神経伝達物質その他の細胞外情報伝達物質等を取込んで、人体の恒常性を維持している。このとき、細胞外に存在する種々の物質が、細胞内へ取込まれる現象をエンドサイトーシスという。【0009】
代表的なエンドサイトーシスとしては、カベオラエンドサイトーシス、脂質ラフトエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、レセプター依存性エンドサイトーシス及びクラスリン依存性エンドサイトーシスが挙げられる。【0010】
エンドサイトーシスによって、分子量の大きな分子であっても細胞内に取り込むことができることが知られており、シロール含有カルボシランデンドリマーと、標識タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）とを水性溶媒中、又は前記水性溶媒と有機溶媒との混合溶媒中で混合して、前記デンドリマーとタンパク質との複合体である凝集性分子が形成されることが報告されている。【0011】
そして、上記蛍光タンパク質をデンドリマーに担持させると、上記蛍光タンパク質が外側に向いた状態でのリポソーム(以下、「ベジクル」ということがある。)、又はミセル形成が誘導されること、上記ベジクルは、例えば、色素、レクチン、抗体等を内包し得ることも報告されている（特許文献10参照、以下、「従来技術１」という。）。【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】ＷＯ２００５／０１１６３２
【特許文献2】ＷＯ２００５／０１１６３３
【特許文献3】特開２００７− １９２３
【特許文献4】特開２００９− ４６４１３
【特許文献5】特開２０１４− ７３９７５
【特許文献6】特開２００１−２０６８８５
【特許文献7】特開２００５−１２００６８
【特許文献8】特開２００７−２３８８６０
【特許文献9】特許第５６２９８８８号
【特許文献10】ＷＯ２０１６／０８４９７９
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Chem Commun (Camb). 2009 Aug 7;(29):4332-53. doi: 10.1039/b904665h. Epub 2009 May 13
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
上述のように、ＤＤＳ用の担体の研究は精力的に行われてはいるものの、生体高分子を有効成分とする薬剤を、その特性を損なうことなく、効率的に標的とする部位へ送達することは非常に難しい。【0015】
経口投与の場合には、胃酸という強酸で担体が分解されないようにしない限り、有効成分である生体高分子は腸には到達し得ず、吸収もされない。また、静脈投与（静脈注射、以下、集合的に「静注」ということがある。）の場合には、血流中に一時に高濃度の薬剤を投与することはできるが、上記のような胃酸による分解とは別の問題があり、標的部位に有効濃度で送達させることは、以下のような理由から難しい。すなわち、血中の薬剤濃度は、尿中への排出、肝臓での代謝、種々の組織への蓄積等により時間と共に急速に低下すること、また、標的性が無いまま血中に留まることもあるからである。【0016】
また、標的部位に送達する薬剤の量を増やすと、重篤な副作用が発生する場合もある。例えば、パーキンソン病の治療薬であるレボドパは、血液脳関門の通過量が非常に少ないため、奏効率が上がらない。そして、レボドパの投与量を増やすと、標的部位である脳以外にもレボドパの分解酵素があるため、重篤な副作用が現れて、それ以上治療が続けられなくなるということが実際に起こっている。一方、少量の薬剤を１日に何度も投与することは、患者や医療従事者への負荷が大きくなるという問題につながる。【0017】
生体高分子用の担体は、分子量の大きな有効成分をその内部に取り込むことができるという特性に加えて、それ自身が生体との適合性の高いものでなければならない。生体適合性が低いと、生体側で種々の反応が起こり、担体の投与自体が生体に対して悪影響を与えることになるからである。さらに、標的部位に送達されるまでは安定した構造を保ち、標的部位に送達されたときに、有効成分である生体高分子を速やかに放出できるものでなければならない。【0018】
従来技術１は、分子量の大きな有効成分をその内部に取り込むことができ、それ自身が生体との適合性の高いものであるという点では優れた発明である。しかし、内包したモデル薬剤を、標的組織に効率的に送達することができないという課題を抱えていた。【0019】
これまで、内包したモデル薬剤を、標的組織に特異的に送達することができ、安全性の高い生体高分子用の担体は実用化されておらず、こうした特性・性質を有する担体に対する強い社会的要請があった。【課題を解決するための手段】
【0020】
本発明は、以上のような状況の下で完成されたものであり、種々の分子量の化合物や生体高分子を取り込むことができ、生体内で安定性が高く、有効成分を標的組織特異的に送達する、さらに、特定のルートを通じた細胞内へ取込みを促進する、エンドサイトーシス増強剤を提供することを目的とする。【0021】
本発明は、以下の態様を含むものである。本発明の一の実施態様においては、本発明は、下記式（Ｉ）で表される標的配列提示部を備える凝集性分子が凝集して構成されるエンドサイトーシス増強剤であって：前記エンドサイトーシス増強剤は、前記凝集性分子によって構成された凝集体の内部に、水性溶媒又は有機溶媒を内部に包含し得る空間を備え；カベオラエンドサイトーシス、脂質ラフトエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス及びファゴサイトーシスからなる群から選ばれるいずれかの細胞内移行経路により細胞内に取り込まれ；前記標的配列提示部（TSPP）は、蛍光タンパク質と、前記エンドサイトーシス増強剤を標的組織特異的に送達するためのタンパク質又はペプチドで構成される標的認識部位とからなり；前記エンドサイトーシス増強剤の前記内部空間には、水性溶媒に溶解された分子量２０万以下のタンパク質又は核酸、又は有機溶媒に溶解された疎水性分子が内包される、エンドサイトーシス増強剤である。【0022】
【化1】
【0023】
（式中、Ｔは、臭素原子又は下記式（ＩＩ）で表される標的配列提示部を表す。また、ｎ１及びｎ２はそれぞれ前記標的配列提示部の数を表し、（３−ｎ１）及び（３−ｎ２）は臭素原子の数を表す。ｎ１及びｎ２は、０〜３の整数であり、これらが同時に０になることはない。）。
【0024】
【化2】
【0025】
前記凝集体は、５０〜５００ｎｍの直径を有することが好ましい。このサイズの直径を有するカプセルは、抗がん剤のドラッグデリバリーにおいて癌細胞周辺の新生血管へのＥｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ Ｅｆｆｅｃｔに最適なサイズになっているからである。【0026】
ここで、前記水性溶媒は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」ということがある。）、トリス塩酸緩衝液（以下、「Ｔｒｉｓ塩酸バッファ」ということがある。）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（以下、「ＨＥＰＥＳバッファ」ということがある。）、クエン酸ナトリウム緩衝液（以下、「クエン酸バッファ」ということがある。）、及び炭酸‐重炭酸緩衝液（以下、「炭酸バッファ」ということがある。）からなる群から選ばれるいずれかの緩衝液であることが、均一で安定なカプセルを作製できること、タンパク質その他の生体高分子を変性させることなく内包させることができる点で好ましい。【0027】
また、前記ペプチドは、組織特異的送達機能と前記組織特異的に送達された凝集体の細胞内への取込みを促進する機能とを有するものであり、かつ、前記標的組織に発現されている、表面抗原、受容体、ゲート、トランスポーター及びチャンネルからなる群から選ばれる標的タンパク質と特異的に結合するものであることが好ましい。【0028】
具体的には、前記ペプチドは、配列表の配列番号１〜３からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることが好ましい。【0029】
【0030】
前記ペプチドは、配列表の配列番号４〜６からなる群から選ばれるいずれかに記載の配列を有するものであることが好ましい。【0031】
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号４）【0032】
MASMTGGQQMGR VPTDTDYSGG MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF NDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNDKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGT ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号５）【0033】
MASMTGGQQMGR DMPGTVLPGG GGGSEGEWQQQQHQWAKQE MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFISTT GKLPVPWPTL VTTLTYGVQC FSRYPDHMKR HDFFKSAMPE GYVQERTISF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLV NRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YITADKQRNG IKANFKTRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHY LSTQSALLKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGSGIT DEVDGTC ELYK GG HHHHHH（配列表の配列番号６）【0034】
ここで、前記標的組織は、炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞で構成される組織、及び腫瘍細胞で構成された組織からなる群から選ばれるいずれかの組織であることが好ましい。【0035】
ここで、前記炎症を起こしている正常組織としては、自己免疫疾患として顕著な特徴を有する組織等を挙げることができる。また、好ましくない遺伝子発現の見られる細胞を含む組織としては、SNP解析により病態と一塩基置換等遺伝子変異との関連が明らかな組織等を挙げることができる。好ましくない遺伝子発現の見られる細胞としては、前述の好ましくない遺伝子発現の見られる組織由来の細胞等を挙げることができる。さらに、腫瘍細胞で構成された組織としては、乳癌組織、肺癌組織、肝癌組織、子宮頸癌組織等を挙げることができる。以上のような標的認識部位としては、配列表の配列番号１〜３を挙げることができ、標的提示部としては、配列表の配列番号７〜11に示すアミノ酸配列を挙げることができる。【0036】
また、前記式（Ｉ）で表される凝集性分子は、下記式（III）〜（VI）からなる群から選ばれるいずれかの構造を有する分子で表されるものであることが好ましく、下記式中、TSPPは標的配列提示部を有する蛍光タンパク質である。【0037】
【化3】
【0038】
【化4】
【0039】
【化5】
【0040】
【化6】
【0041】
ここで、前記蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。【0042】
また、前記細胞内への取込みが、カベオラエンドサイトーシス、脂質ラフトエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス及びファゴサイトーシスからなる群から選ばれるいずれかの細胞内移行経路により行われることが好ましい。【発明の効果】
【0043】
本発明によれば、薬剤等を標的組織特異的に送達し、その後、送達された組織の細胞内へ、特定のルートによる取込みを促進する、エンドサイトーシス増強剤を提供することができる。そして、前記エンドサイトーシス増強剤に内包させた生体高分子その他の薬剤の標的組織に存在する細胞内への取り込みを、増強させることができる。【図面の簡単な説明】
【0044】
【0045】
【0046】
【0047】
【0048】
【0049】
【0050】
【0051】
【0052】
【0053】
【0054】
【0055】
【0056】
【0057】
【0058】
【0059】
【0060】
【0061】
【0062】
【発明を実施するための形態】
【0063】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明は、上述した通りのエンドサイトーシス増強剤である。【0064】
本発明のエンドサイトーシス増強剤は、標的配列提示部を備える、下記式（Ｉ）で表される前記凝集性分子が凝集することによって形成され、生体高分子を内包することができる。前記エンドサイトーシス増強剤は、ａ１）前記凝集性分子によって構成された凝集体の内部に、水性溶媒又は有機溶媒を内部に包含し得る空間を備え、ａ２）カベオラエンドサイトーシス、脂質ラフトエンドサイトーシス、マクロピノサイトーシス及びファゴサイトーシスからなる群から選ばれるいずれかの細胞内移行経路により細胞内に取り込まれる。【0065】
【化7】
【0066】
式中、Ｔは、臭素原子又は下記式（ＩＩ）で表される標的配列提示部を表す。また、ｎ１及びｎ２はそれぞれ前記標的配列提示部の数を表し、（３−ｎ１）及び（３−ｎ２）は臭素原子の数を表す。ｎ１及びｎ２は、０〜３の整数であり、これらが同時に０になることはない。【0067】
【化8】
【0068】
前記標的配列提示部（ＴＳＰＰ）は、蛍光タンパク質と、前記エンドサイトーシス増強剤を標的組織特異的に送達するためのタンパク質又はペプチドで構成される標的認識部位とからなり；前記内部空間が、水性溶媒に溶解された分子量２０万以下のタンパク質又は核酸、又は有機溶媒に溶解された疎水性分子を内包する。複数の種類の上記タンパク質を同時に内包させることもでき、上記タンパク質と核酸及び／又は疎水性高分子とを同時に内包させることもできる。【0069】
上述したように、本発明で使用する凝集性分子はカルボシランデンドリマー（以下、「シロールデンドリマー」ということがある。）であり、上記式（Ｉ）に示す化合物であることが、凝集性と、標的組織特異的な送達を可能にし、かつ送達された組織の細胞内への内包薬物のエンドサイトーシスによる取り込みを増強するために必要な、上記式（ＩＩ）に模式的に示す標的配列提示部（ＴＳＰＰ）を備える上で好ましい。【0070】
一般的なカルボシランデンドリマーは、図１Ａ〜Ｃに示すような構造となっている。図１Ａに示す化合物はファン（０）３と呼ばれ、ベンゼン環をコアとしている。図１Ｂに示す化合物はダンベル（１）６と呼ばれ、図１Ａに示す２分子のファン（０）３分子のコアであるベンゼン環が２つのメチル基がついたケイ素（Ｍｅ−Ｓｉ−Ｍｅ）に置換され、コアを除いた２分子のファン（０）３で結合された構造となっている。図１Ｃに示す化合物はボール（１）６と呼ばれ、ダンベルのＭｅ−Ｓｉ−Ｍｅのメチル基の部分が（Ｓｉ）５に置換され、ここにファン（０）３のコアが外れた分子が結合して球状構造となっている（図２参照）。【0071】
これに対し、本発明のカルボシランデンドリマーは、上記式（Ｉ）及び（ＩＩ）に示すように、従来のカルボシランデンドリマーとは全く異なる構造のものであり、分子の末端に結合している臭素原子を介して、タンパク質分子を含む標的配列提示部を有している。ここで、標的配列提示部は、上記式（ＩＩ）で模式的に表すことができ、標的組織への特異的送達を可能にする標的認識部位を構成し、送達された組織の細胞内への内包薬物のエンドサイトーシスによる取り込みを増強するタンパク質又はペプチドと、蛍光タンパク質とで構成されている。【0072】
また、標的認識部位を有するタンパク質又はペプチドは、配列表の配列番号１〜３に示す配列を有するものであることが、上記デンドリマーで形成されるＤＤＳ用カプセルの標的組織特異的な送達を可能にし、送達された組織の細胞内への内包薬物のエンドサイトーシスによる取り込みを増強する上で好ましい。【0073】
そして、上記標的配列を構成するタンパク質は、唯一の反応性チオール基を有するものであり、前記チオール基はフォールディングされたタンパク質の外側、すなわちタンパク質表面に位置していることが好ましい。【0074】
チオール基は、上記デンドリマー中に存在するハロゲン原子と反応し、タンパク質とデンドリマーとを結合させる役割を担うため、フォールディングされたタンパク質の内側に位置していても、結合に関与できないからである。ここで、「チオール基を有するタンパク質」には、元々チオール基を有しているタンパク質のほか、遺伝子工学的手法等を用いて新たにチオール基を導入したもの、及びシステインを含むタンパク質のシステインが還元されて、チオール基となったもの等が含まれる。【0075】
タンパク質中のチオール基の存在位置は特に限定されないが、タンパク質上の特定の領域にチオール基が存在することが好ましい場合もある。さらに、カプセルの発光特性の制御が可能になる場合がある。なお、「システインを含むタンパク質」に含まれるシステインは、既存の任意のアミノ酸との置換による方法、所望の位置への挿入による方法その他の遺伝子工学的手法等により、所望の位置に導入されたものであってもよい。タンパク質の所望のアミノ酸の位置にシステイン残基を導入することは、部位特異的突然変異導入法その他の公知の遺伝子工学的手法を使用することにより、当業者であれば容易に実施することができる。【0076】
上記の標的配列提示部を構成するタンパク質は、会合する性質（以下、「会合性」ということがある。）を有するものであればよく、特に限定されないが、緑色蛍光タンパク質（以下、下記のような緑色以外の蛍光を発する蛍光タンパク質を集合的に「GFP」ということがある。）及びその変異体を含む蛍光タンパク質を使用することが好ましい。こうした蛍光タンパク質が結合した上記カルボシランデンドリマーは、タンパク質が会合すると強い蛍光を発し、会合状態を容易に検出できるからである。【0077】
本発明において使用することができるGFPとしては、例えば、配列表の配列番号７に示すGFP、配列番号８に示すGFP、配列表の配列番号９に示すＢＦＰ（青色蛍光タンパク質)、配列表の配列番号１０に示すＹＦＰ等のほか、クロンテック社から市販されているＣＦＰやＲＦＰその他のGFP誘導体を挙げることができる。これら以外にも、配列表の配列番号５に示すイソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質なども使用することができるが、配列表の配列番号７に示すGFPが、蛍光の強さ及び扱いやすさから好適に使用することができる。さらには、MBL社より市販のアザミグリーンやその他の色変異体も好適に使用可能であることは、構造上の特性から想定できる。【0078】
また、こうしたGFPは、公知の方法（例えば、Biochim.Biophys.Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460等を参照されたい）を用いて産生してもよく、こうしたタンパク質の産生を受託生産する企業に依頼して作製したものを使用してもよい。【0079】
シロールその他のＡＩＥ効果を惹起する官能基を含む分子をデンドリマーの骨格として用い、標的配列提示部を蛍光タンパク質等の会合性タンパク質で構成された本発明の凝集性担体を作製し、これを用いてミセルを形成させると、シロール基が凝集した部分からも蛍光が生じ、蛍光タンパク質−シロール間で蛍光共鳴エネルギー移動（FRET：Fluorescence resonance energy transfer）が生じて、強い蛍光となる。そして、ミセルが崩壊するとFRETは消失する。【0080】
このため、本発明の凝集性担体と標的配列提示部とを用いて作製したミセルを、薬剤送達のための担体として用いると、上記担体（ミセル）の生体内における状態を、FRETの変化を指標としてモニターすることができる。さらに、このようなモニターが可能となることによって、こうした担体の存在位置および存在状態を追跡することができる。【0081】
蛍光タンパク質とシロールデンドリマーとの間でFRETを生じさせるには、標的配列提示部を構成する蛍光タンパク質のどの位置が、上記シロールデンドリマーに固定されるかが重要になってくる。デンドリマーと結合する上記蛍光タンパク質上の位置は、当業者であれば、予備的な実験等により容易に決定することができる。上記標的配列提示部を構成する蛍光タンパク質としてGFPを用いる場合には、Ｎ末端領域、Ｃ末端領域、Ｎ末端領域又はＣ末端領域のいずれかに隣接するループ領域と、デンドリマーとが結合することが望ましく、これらの領域中にチオール基を有するシステインなどのアミノ酸が存在していることが好ましい。【0082】
ここで、「Ｎ末端領域」での結合は、Ｎ末端近傍に存在する10アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。Ｃ末端領域との結合も同様に、Ｃ末端領域に存在する10アミノ酸程度のコア部分から突出した部分と、上記シロールデンドリマーとが結合した場合をいう。【0083】
本発明のシロールデンドリマーに担持されるハロゲン基の位置は、特に限定されないが、上記シロールデンドリマーの側鎖に存在することが好ましい。より好ましくは、上記式（Ｉ）に示すように、側鎖の末端（シロール基から最も遠い位置）に存在することがさらに好ましい。【0084】
上述したように、本発明の方法に使用されるシロールデンドリマーは、上記式（Ｉ）で示す化合物であることが好ましい。この化合物は、例えば、後述するスキーム１に示すように、シロールコア２（1,1-ジアリール-2,3,4,5-テトラフェニルシロール）を、公知の中間体18を経て、1,2-ジフェニルアセチレンから合成することができる。【0085】
次いで、触媒としてH2PtCl6・6H2Oを使用して、トリクロロシランで２のヒドロシル化を行い、アリールマグネシウムブロマイドを用いたグリニャール反応によって、シロールコアデンドリマー３を得ることができる。得られたデンドリマー３をジクロロヘキシルボランで処理し、その後アルカリ溶液中にて過酸化水素で加水分解し、ヘキサヒドロキシ誘導体４を得る。次いで、ヘキサヒドロキシ誘導体のO-メシル化を行なうことにより、臭素アニオンと置換し５を得ることができる（Tetrahedron Lett., 2007 48:4365-4368）。【0086】
【化9】
【0087】
式中、Tは、臭素原子又は上記式（II）で表される標的配列提示部を表す。また、ｎ１及びｎ２はそれぞれ前記標的配列提示部の数を表し、（３−ｎ１）及び（３−ｎ２）は臭素原子の数を表す。ｎ１及びｎ２は、０〜３の整数であり、これらが同時に０になることはない。【0088】
前記標的配列提示部を構成する標的認識部位を有するタンパク質は、会合をする性質を有するものであればよく、特に限定されない。しかし、前記タンパク質は、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、及び緑色蛍光タンパク質からなる群から選ばれるいずれかの蛍光タンパク質であることが好ましい。【0089】
入手が容易であり、また、蛍光タンパク質自体の蛍光強度が大きいことから、FRETによって強い蛍光が生じるためである。ここで、前記青色蛍光タンパク質は、ブルー又はシアンの蛍光を呈するものがいずれも含まれる。【0090】
本発明の凝集性分子は、チオール基を有する上述したタンパク質（標的配列提示部）と、側鎖にハロゲン基を有するデンドリマー化合物（式（Ｉ））とを混合し、インキュベートして、タンパク質のチオール基とデンドリマー化合物のハロゲン基とを反応させ、デンドリマー化合物にタンパク質を結合させる。このとき、タンパク質は、DTTなどの還元剤で予め処理をして、-SH基が酸化されていない状態にしておくことが望ましい。この反応で、１分子のGFPが組み込まれた場合の反応を、スキーム１に示す。【0091】
【化10】
【0092】
例えば、上記のスキーム１に示す反応は、適当な水性溶媒中で行うことができる。ここで、上記水性溶媒としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、生理食塩水、トリス塩酸バッファ、HEPESバッファ、クエン酸バッファ、炭酸‐重炭酸バッファその他の水溶性溶媒を挙げることができる。上記の反応をさせる場合の温度条件は、使用するタンパク質によって異なるが、反応温度が使用するタンパク質の変性温度を下回ってさえいればよく、例えば、約0〜約50℃、好ましくは約30℃〜約45℃、より好ましくは約37℃程度とすることができる。GFPを用いると、42℃までは、温度依存的に反応性を向上させることができることから、GFPを使用することがDDS用凝集性担体材料を作製する上では好適である。
【0093】
また、反応時間は、反応温度によっても異なるが、例えば、約1時間〜約24時間、好ましくは、約10時間〜約19時間、より好ましくは、約15時間〜約18時間程度とすることが好ましい。この程度の反応時間とすることにより、使用したチオール基を有するタンパク質が上記シロールデンドリマーに結合するとともに、リポソーム又はミセルが形成されるからである。【0094】
すなわち、タンパク質−デンドリマー複合体が形成されるにつれて、タンパク質（親水性部分）を水溶性溶媒側に、デンドリマーのコアの部分（疎水性部分）を疎水性部分同士で会合する様な構造を有するようにしたリポソーム又はミセルが形成される。すなわち、上記のような会合性のタンパク質をデンドリマーの側鎖に結合させることにより、タンパク質の会合が駆動力となってリポソーム又はミセルが形成されていくものと考えられる。【0095】
ここで、上記シロールデンドリマーには、少なくとも１個以上のタンパク質が、側鎖末端のハロゲン原子と置換されて結合する。このため、上記の反応で得られるドラッグデリバリーシステム用凝集性担体材料は、上述した化学式（III）〜（VI）で表される結合体の混合物として得られることになる。【0096】
チオール基を有するタンパク質が蛍光タンパク質である場合には、こうしたタンパク質とデンドリマーとの混合比（モル比）は、タンパク質を１として、デンドリマーが例えば、１〜２０とすることができ、好ましくは、１：５〜１：１５、より好ましくは、１：１０程度である。ただし、この比率は濃度に依存して最適な値が変動する。【0097】
また、上記の反応を行なう際には、標的配列提示部であるタンパク質に、標的認識部位となるアミノ酸配列を組み込んでおくことが、後述するＤＤＳでの効率のよい送達を実現する上で好ましい。こうした標的認識部位の組み込みは、インバースＰＣＲによって簡便に行うことが好ましい。こうして作製された変異体をコードしたプラスミドを大腸菌に組み込んで発現させれば容易に変異体タンパク質を得る事ができ、ＤＤＳ用凝集性分子を得ることができるからである。【0098】
上記のような標的認識部位を標的配列提示部であるタンパク質に組み込んでおくことにより、前記炎症を起こしている正常組織、好ましくない遺伝子発現の見られる組織、腫瘍細胞で構成された組織等に、特異的に、本発明のエンドサイトーシス増強剤に内包された所望の薬剤を、活性を維持したまま送達することができる。【0099】
上記のような構造を有するエンドサイトーシス増強剤を作製し、これに所望の薬剤を内胞させることにより、薬剤の有効性を維持しつつ、標的組織に対して特異的にこうした薬剤を送達し、細胞内への取込み量を有意に増強することができる。【実施例】
【0100】
以下の実施例は、あくまでも例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。（実施例１）ＤＤＳ用凝集性分子及びミセルの作製
本実施例においては、標的提示部作製用のタンパク質として下記の通りのＧＦＰを、また、デンドリマーとしてシロールデンドリマーを用いた。
（１）ＤＤＳ用凝集性分子の作製
本実施例において、ハロゲン基を有するデンドリマーとして、下記の化学式（Ｘ）に示す化合物（以下、「ジメチルダンベル（１）６−Ｂｒ」ということがある。）を使用し、チオール基を有するタンパク質として、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）（配列番号７）を用いた。
【0101】
【化11】
【0102】
ここで使用したGFP（配列表の配列番号７）は、既に発明者らが報告した方法に従って（Biochim.Biophys.Acta 1679 (2004) 222-229; Biochem. Biophys. Res. Commun. 330 (2005) 454-460を参照されたい）、配列番号７に示すGFPのアミノ酸配列のＣ末端領域の251番目のアミノ酸をシステインに置換するとともに、元々存在していたシステイン（48番目及び70番目）をセリン及びバリンにそれぞれ置換した。【0103】
まず、20μＭ濃度のGFP溶液（PBS中）に、最終濃度１mMとなるようにDTTを加え、10分間室温で処理し、GFP表面に存在するシステインの還元を行った。システインを還元した、400〜450μLの20μMのGFP溶液（PBS中）に、最終濃度10倍モル等量になるように、200μMの上記式(VI)に示すシロールデンドリマー溶液（DMSO溶媒）を10μL加えてボルテックスで混合した。【0104】
混合後、37℃で静置した状態で、終夜インキュベートし、GFPと上記シロールデンドリマーとを結合させ、引き続き、ミセルを形成させた。このときのインキュベート時間は、約16〜18時間であった。得られたミセルを含む溶液中のミセルの粒子の特性を、動的光散乱法（DLS; Dynamic light scattering）により測定した。結果を表１に示す。【0105】
【表1】
【0106】
また、上記反応液を、25℃にてZETASIZER NANO-S（マルバーン社製）を用いて、レーザー光の波長を532 nmとして、粒径を測定した。結果を図３に示す。図３（Ａ）はGFPのみでインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。図３（Ｂ）は式（VI）のシロールデンドリマーのみでインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。図３CはGFPと式（VI）のシロールデンドリマーとを混合してインキュベートし、得られた産物の粒径分布を調べた結果である。横軸は得られた産物の粒径を、縦軸は横軸に示すサイズの産物の全体に占める％を表す。【0107】
GFPと上記シロールデンドリマーとをインキュベートした場合（上記表１中、「GFP-Silole only」と表示。）には、得られたミセルの粒径はおよそ150nmであった。これに対し、GFPのみをインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ４nm、上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径はおよそ650nmであった。上記シロールデンドリマーのみでインキュベートした場合に観察された粒径がこのように大きくなったのは、おそらく、シロールデンドリマー同士で凝集し、大きな凝集体が形成されたためと考えられた。【0108】
次に、得られたミセルの粒子を走査型電子顕微鏡（SEM; Scanning Electron Microscope）で観察したところ、粒子径がおよそ100〜500nmの多数の粒子と、粒子径が500nm程度の少数の粒子とが確認された（図４参照）。【0109】
以上の結果から、本発明のＤＤＳ用凝集性担体を用いて形成されたミセルの粒子径は、およそ100〜500nmであり、およそ100〜200nm程度の粒子径のものが多いことが明らかになった。また、SEMを用いた電顕微鏡写真の像から、球状のミセル構造を形成していることも確認された。【0110】
（２）蛍光共鳴エネルギー移動の確認本実施例において使用したシロールデンドリマーは、疎水性のシロールのコア部分が凝集すると発光する（ＡＩＥ効果を発揮する）性質を有しているため、ミセル構造をとった場合にも発光することが確認されていた。そこで、シロールデンドリマーにGFPを結合させたGFP-シロールデンドリマーからなるミセルを作製した場合に、シロールとGFPとの間において蛍光共鳴エネルギー移動（FRET：Fluorescence resonance energy transfer）が生じるかどうかを検討した。
【0111】
発光特性の実験は、上記の反応液から、未反応の蛍光タンパク質及びデンドリマー（遊離している分子）を除去した後に行った（図５参照）。シロールデンドリマーのみでインキュベートした産物は370nmの波長で励起し（白抜きの四角：□）、GFPのみでインキュベートした産物は488nmの波長で励起し（白抜きの三角：△）、GFPおよびシロールデンドリマーを用いてインキュベートした産物（本発明のミセル）は370nmの波長で励起し（黒丸：●）、各々の発光波長の特性を調べた。GFP-シロールデンドリマー複合体からなるミセル（GFPおよび式（Ｘ）のシロールデンドリマーでインキュベートして得られた産物）は、シロールからGFPへのFRETによる発光が、510nm付近に観察された。【0112】
図５に示すように、シロールデンドリマーの発光のピークは480nm付近で観察された。また、GFPとシロールデンドリマーとの結合体の発光では、シャープなピークは認められず、510nm付近でもっとも高い値を示した。これに対し、GFPの発光は、510nm付近にシャープなピークとして観察され、これは上記シロールデンドリマーからGFPへのFRETによるものと考えられた。また、ミセルが崩壊したときに、FRETに起因すると考えられるGFPの発光も消失した。【0113】
すなわち、ＡＩＥ効果を有するデンドリマーと、蛍光タンパク質等の会合性のタンパク質とを結合させた分子（GFP-シロールデンドリマー複合体）を作製し、こうした分子を用いてミセルを形成させると、ミセルの状態でもデンドリマーと蛍光タンパク質との間でFRETが生じること、ミセルの崩壊によってFRETも消失した。以上から、本発明のミセルをＤＤＳ用凝集性担体として使用すると、送達された組織・器官を確認できることが示された。また、標的組織・器官に送達されたミセルが崩壊した後であっても、蛍光タンパク質の蛍光を追跡することはでき、これによって、蛍光タンパク質が送達された細胞内の環境等を感知することもできる。
【0114】
（３）GFP−シロールデンドリマー複合体からなるミセルへの薬剤等の内包実験次に、本発明のミセルを用いて、薬剤等を内包するミセルが作製できるか否かを確認した。本実施例では、モデル薬剤として、DiI（1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate、Promokine PK-CA707-60010, PromoCell GmbH製）、Oil orange SS（東京化成工業（株）製、T0553）、ヤギ抗マウスIgG（abcam社製、ab6708）-Alexa610（Molecular Probes社製、A30050）およびＷＧＡ（Wheat Germ Agglutinin：小麦胚芽レクチン、Molecular Probes社製）（WGA-Alexa Fluoro (登録商標) 594 conjugate、W11262）を用いた。
【0115】
システインを還元した20μMのGFPに、最終濃度10倍モル等量になるように、200μMの上記式（Ｘ）に示すシロールデンドリマー（DMSO溶媒）を10μL加え、さらに、DiI（最終濃度；1μＭ、蛍光色素）、Oil orange SS（最終濃度；20μＭ、蛍光色素）、ヤギ抗マウスIgG-Alexa610（最終濃度；0.1μＭ）及びＷＧＡ（最終濃度；2μＭ）のいずれかを加えてボルテックスで混合し、37℃で静置して終夜インキュベートした（約16〜18時間）。【0116】
各モデル薬剤を加えた試料中で、各薬剤を内包するミセルが形成されているか否か、及びミセルが形成されている場合には、それらのミセルの粒子径を、上述した動的光散乱法により測定した。結果を表２に示す。ここで、薬剤モデルとしては、DiI、Oil orange SS、及びヤギ抗マウスIgG-Alexa 610を使用した。【0117】
図６のＡ〜Ｃに、上記のモデル薬剤を用いた場合の粒径の分布を示す。図６のＡはDiIの存在下、図６のＢはOil orange SSの存在下、図６のＣはヤギ抗マウスIgG-Alexa 610の存在下で、各々、ミセルを作製した場合の粒径分布である。横軸は得られたミセルの粒径を、縦軸は各横軸に示すサイズのミセルの全体に占める％を表す。DiIを加えた場合のミセルの粒径はおよそ95nm、Oil orange SSを加えた場合もおよそ95nm、IgG-Alexa610を加えた場合はおよそ180nmであった。【0118】
【表2】
【0119】
蛍光色素であるDiIを内包するミセルの発光特性を調べた結果を、図７に示す。図７のＢは、図７のＡの500nm付近のスペクトルを拡大した図である。横軸は波長（nm）を、縦軸は相対的蛍光強度(a.u.)を表す。まず、DiIを内包するミセルを作製し、該ミセルをＰＢＳで３回洗浄した試料、その後、この反応溶液を0.45μmの孔径のフィルターでろ過して遊離色素を除いた試料、及び0.45μmのフィルターに代えて0.22μmのフィルターでろ過して遊離色素を除いた試料をそれぞれ調製し、これらの試料の蛍光を測定した。【0120】
図７のＡ及びＢに示すように、370nmの波長で励起した場合には、480nm波長付近に肩ピークが確認され、シロールの発光によるものと考えられた。510nm付近のピークはシロールからGFPへのFRETによるものを考えられ、570nm付近のピークはシロールからDiIへのFRETに起因するものと考えられた。以上の結果から、DiIがミセル内に封入されていることが確認された。【0121】
次に、Alexa594で標識したＷＧＡを内包させたミセルの発光特性を調べた（図８のＡ及びＢ参照）。図８のＡは、Alexa594標識ＷＧＡを添加したときの反応液をそのまま測定した結果である。また、図８のＢは、限外濾過スピンカラム（Millipore社製）を用いて、反応液から未反応タンパク質等（Alexa594で標識したＷＧＡ、シロールデンドリマー、GFP等その他のミセルに取り込まれなかったもの）を除去した後、測定を行った結果である。図８中、実線はGFP-シロールデンドリマー複合体とＷＧＡを混合処理して得られた産物の蛍光特性を示し、破線はGFPとＷＧＡを混合処理して得られた産物の蛍光特性を示す。【0122】
図中、実線は、GFP−シロールデンドリマー複合体からなるミセルにAlexa594標識ＷＧＡを内包させたもの、また、破線は、GFPとAlexa594標識ＷＧＡを混合したものを内包させたものを、それぞれ測定した結果を示す（励起波長はいずれも370nm）。【0123】
限外濾過スピンカラム処理を行っていない反応液をそのまま測定した結果を示す図８のＡには、シロールデンドリマーからの蛍光が480nm付近に、GFPからの蛍光が510nm付近に、また、ＷＧＡからの蛍光が610nm付近にそれぞれ検出された。これに対し、図８のＢに示されるように、限外濾過スピンカラム処理を行うとフリーのシロールデンドリマー、GFPおよびＷＧＡが除去され（点線）るため、これらからの発光はほとんど検出でされなかった。以上より、作製されたミセルにAlexa594標識ＷＧＡが内包されていることが確認できた。【0124】
（実施例２）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の調製本願発明のミセルとＣ末端で結合し、かつ、ガン細胞の表面に発現する受容体と結合する標的ペプチドとＮ末端で結合する、標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を以下のように調製した。
【0125】
（１）インバースPCR（１−１）ペプチド配列の選定
選定した標的結合部位に組み込んだペプチドのアミノ酸配列を下記表３に記載した。MCF7-1は、下記表３に示す配列を含む、ヒト乳腺癌由来細胞であるMCF7であり（以下、「標的タイプ１型」ということがある。）、MCF-2は、下記表３に示す配列を含むMCF-1の変異体（以下、「標的タイプ２型」ということがある。）である。また、MCF7-1＋αスタンドは、下記表３に示すように、上記のMCF7-1にαへリックス構造の短いペプチド（以下、「αスタンド」という。）をつないだ構造を有するMCF7-1の別の変異体である（以下、「タイプ１強化型」ということがある。）。
【0126】
【表3】
【0127】
（１−２）プライマーの作成表３に示された上記ペプチド配列についてインバースPCRを行なうためのプライマーを下記表４に記載した。これらプライマーは、配列表の配列番号１及び３については上記ペプチド配列のDMとPGTVLPの間から、配列番号２については上記ペプチド配列のVPとTDTDYSGGの間から伸長反応が開始するように設計した。これはインバースPCRが最適に行われることを鑑みている。
【0128】
【表4】
【0129】
（１−３）インバースPCR用テンプレートプラスミドの調製インバースPCR用テンプレートプラスミドは、以下の論文に記載の方法で調製した。
「Protease-sensitive signalling by chemically engineered intramolecular fluorescent resonance energy transfer mutants of green fluorescent protein. - Miho Suzuki, et al. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Structure and Expression
Volume 1679, Issue 3, 17 September 2004, Pages 222-229」
【0130】
（１−３−１）GFPuv5変異体のプラスミド構築GFPuv5は、pGFPgcn4から以下のようにして得た。まず、I167T突然変異＋フォワードプライマー 5’CATTGAAGATGGCTCCGTTCAA（配列番号１８）及びリバースプライマー5’TTGTGGCGAGTTTTGAAGTTAG（配列番号１９）を用いたインバースPCRを用いて遺伝子マニピュレーション用の同義の突然変異を生じさせたPCR産物を得て、引き続きこのPCR産物を環化処理して作製された。以上のようにして得られたコンストラクトを、pGFPgcn5と命名した。
【0131】
その後、GFPuv5のcDNAをpET21a（Novagen社製）にクローニングしてタンパクを発現させた。ここで発現したタンパク質を精製し、GFPuv5tagと命名した。そのコード領域を、プライマー5’CTCGACCAT[ATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGT]CGCATGAGTAAAGGAGAAGAACTTTTCA（配列番号２０）（GFPuv5シリーズのＮ末端向きのT7遺伝子の10タンパク質用の最初の11アミノ酸のエピトープタグに接着する、接着するタグは［ ］で示した。）、及びGFPuv5シリーズのＣ末端にHisタグを提供する、5’TGACGTGAATTCATTA[GTGATGGTGATGGTGATG]TTTGTAGAGCTCATCCATGC（配列番号２１）（Hisタグを[ ]で示す）を用いて増幅させた。【0132】
配列番号1〜３に示した塩基配列をこれらをpET21aに挿入し、NdeI及びEcoRIで消化した。このpGFPgcnプラスミドを遺伝子マニュピレーションに使用し、pET21aプラスミドをT7プロモーターの制御下でのタンパク質発現に使用した。GFPuv5の遺伝子及びその突然変異体の遺伝子の塩基配列を、ＤＮＡシーケンシングにより確認した(ABI PRISM 3100 Genetic Analyser社製)。実験中に、さらに３つの同義の突然変異が発見された(Ser-30 agtがagcへ、His-78 catがcacへ、Gln-183 caaがcagへ)。【0133】
それらの突然変異は蛍光タンパク質にとっては有害ではないため、これらの突然変異を含んだまま実験を継続した。精製されたGFPuv5tagの蛍光強度は、GFPuv4tagの約1.9倍であった。その後、48位又は70位のいずれかのシステイン残基を、pGFPgcn5を用いたインバースPCRによってランダム化されたアミノ酸で置換した。【0134】
オリゴヌクレオチドである、5’CTTAAATTTATTNNKACTGGAAAAC（配列番号２２）及び5’GGTAAGTTTTCCGTATGTTG（配列番号２３）をシステイン48の突然変異に使用し、5’GTGTTCAANNKTTTTCCCGTTATCCG（配列番号２４）及び5’CATACGTCAGAGTAGTGACAAG（配列番号２５）をシステイン70の突然変異に使用した。大腸菌BL21(DE3)の培養物を、得られたプラスミドで形質転換し、昼光励起の下で、強い蛍光についてスクリーニングを行ない、寒天培地上で選択した。48では、幾つかの強い蛍光を発する変異体が得られた(Ala, Asp, Glu, Gly, Ile, Leu, Asn, Pro, Ser, Thr, Val, 及びTyr置換)。しかし、70位のアミノ酸を置換した突然変異体では、C70Vシステイン変異体のみが適切な蛍光を与えた。【0135】
強い蛍光強度を有する二重システイン突然変異GFPuv5を作製するために、一重突然変異を有するプラスミドをNcoI及びEcoRIで消化し、それぞれの領域に再度ライゲーションした。選択は一重突然変異体で行った。UV5C0 tag (C48S/C70V) が全ての組換体の中で最も高い蛍光強度を示した。次に、システインを6位及び229位にそれぞれインバースPCRによって導入した。この導入には、C48S突然変異を有するプラスミドと、以下のプライマーのセットをそれぞれの突然変異に使用した。
【0136】
Glu置換用：5’TGTCTTTTCACTGGAGTTGTCCC（配列番号２６）及び5’TTCTCCTTTACTCATTTTTTC（配列番号２７）Ile置換用：5’TGCACACATGGCATGGATGAGCTC（配列番号２８）及び5’CCCAGCAGCAGTTACAAACTC（配列番号２９）
トリプシン標的配列(Gln-Gly-Arg)からなる３つのプロテアーゼタグは、種々のスペーサー配列を有し（スペーサーなし、Thrスペーサー又はGly-Thrスペーサー）、必要なシステインがHis-231とAsp-234との間で置換されている。このコンストラクトを、puvC48Stagと得られたプラスミド（テンプレート）と、下記表５に示すプライマーとを用いて得た。
【0137】
【表5】
【0138】
（１−３−２）GFPuv5tag突然変異体の精製全てのプラスミドで大腸菌BL 21(DE3)を形質転換した。アンピシリン(50Ag/ml)及びIPTG (0.5mM)を添加したＬＢ培地(38mL)に、定常期の終夜培養した大腸菌(12ml)を播種し、37℃で８時間インキュベートした。2,500xgで20分間遠心して細胞を集め、10mLのＰＢＳに再懸濁した。細胞のペレットを、50mMトリス及び8M尿素を含む10mLの溶解バッファー（pH8.0）中で、15分間、室温にて溶解させ、ボルテックスした。1,200xgで15分間遠心し、上清をＰＢＳ中に懸濁したNi2+-NTA 樹脂(Qiagen Co. Ltd.製)と混合した。この樹脂を、ＰＢＳ及び20mMのイミダゾールで順番に洗浄した後に、結合したGFPuv5tag突然変異体を250mMのイミダゾール溶液で溶出させた。
【0139】
バッファー交換のために、溶出物を10倍希釈したＰＢＳで平衡化したPD-10ゲル電気泳動濾過カラム(Amersham Bioscience Co. Ltd.製)にアプライした。溶出されたGFPuv5tag突然変異体タンパク質を集め、それらの濃度をクマジータンパクアッセイ試薬(Pierce社製)で定量した。精製されたGFPuv5tag突然変異体を、15％ SDS-PAGEによって分析した。インバースPCR用テンプレートプラスミドの塩基配列を配列番号２６に示した。
【0140】
（１−４）PCRの条件下記表６に示す反応液を調製し、下記表７の条件でインバースPCRを行った。
【0141】
【表6】
【0142】
【表7】
【0143】
（１−５）電気泳動による確認上記PCR反応液の一部をとって、0.8％PAGE、電圧100V、印圧時間30分間のゲル電気泳動を行い、各サンプル中で増幅されたペプチドを確認した。泳動結果を図９に示す。
【0144】
（２）非依存的Ａ配列の除去及びPCR産物の精製下記表８の反応液を調製し、120℃で30分間反応させ、上記PCRによって生じた非依存的Ａ配列を除去した。その後、QIAquick（登録商標） PCR Purification Kit（QIAGEN社製）を使用して、キットに添付の説明書に従って上記PCR産物を精製した。
【0145】
【表8】
【0146】
（３）ライゲーション反応引き続き、下記表９に示す反応液を調製し、16℃で３時間以上反応させて、後述する大腸菌ＤＨ５αの形質転換用環状プラスミドを作製した。変異体に応じて、25℃、37℃等を使い分けた。
【0147】
【表9】
【0148】
（４）大腸菌ＤＨ５αの形質転換大腸菌ＤＨ５αのコンピテントセル（BioDynamics Laboratory社製）10μlを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液にライゲーション反応液を1μL加え、氷上で30分間放置した。その後、42℃で30秒間インキュベートした後に、氷上で2分間冷却した。ここに、SOC（東洋紡（株）製）培地を90μL加え、37℃で1時間シェーカー上において反応させた。その後、アンピシリン含有LB選択培地（東洋紡（株）製）に播種し、37℃で一晩静置した。
【0149】
（５）コロニーPCR上記形質転換で得られたコロニーからコロニーPCRを行い、想定されるインサートを確認した。
（５−１）PCR用反応液溶液の調製
下記表１０のコロニーPCR用反応液を調製した。
【0150】
【表10】
【0151】
上記コロニーPCR用反応液をPCR用チューブに入れ、上記アンピシリン含有ＬＢ培地で増殖した大腸菌を採取し、これを加えた。PCRは下記の表１１に示すプログラムで行った。【0152】
【表11】
【0153】
（５−２）電気泳動上記PCR反応液の1.2％アガロースゲルで印加電圧100V、時間30分間の電気泳動を行い、増幅が確認できたコロニーを、ＬＢ液体培地（東洋紡（株）製）が入った培養ボトルに移植し、37℃でインキュベートした。
【0154】
（６）プラスミドの精製上記ＬＢ液体培地で培養した大腸菌中の上記プラスミドを、Wizard Plus SV Minipreps. DNA Purification System（プロメガ（株）製）を用い、製品に添付された説明書に従って精製した。その後、精製したプラスミドの配列をユーロフィンジェノミクス（株）に依頼して解析した。
【0155】
（７）大腸菌BL21(DE3）の形質転換大腸菌BL21(DE3）コンピテントセル（BioDynamics Laboratory社製）10μLを使用直前に氷上で融解させ、コンピテントセル溶液を調製した。このコンピテントセル溶液に、上記シーケンスにより目的とする配列が入っていることが確認できたプラスミド液1μlを加え、氷上で30分間放置した。
【0156】
その後、42℃で30秒間インキュベート後、氷上で２分間冷却した。ここに、ＳＯＣ（東洋紡（株）製）培地を90μL加え、37℃で１時間シェーカー上において反応させた。その後、アンピシリン含有LB選択培地に播種し、37℃で一晩静置した。翌日、形質転換されて緑色の蛍光を発しているコロニーを取り、アンピシリン含有ＬＢ液体培地１mlが入った培養ボトルに入れ、37℃で一晩静置して前培養を行った。【0157】
（８）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の精製（８−１）コロニーの培養
50mLチューブにアンピシリン含有ＬＢ液体培地４mLを入れ、ここに上記前培養液290μLを加えたものを試料として４本用意し、28℃で４時間シェーカー上で培養した。その後、100mMのIPTG（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を43μL加え、28℃で一晩シェーカー上で培養した。
【0158】
（８−２）タンパク質の回収翌日、上記の４本のチューブの培養液を１本のチューブに集約した。内容物を移した３本のチューブを、それぞれ１ｍlのＰＢＳ（-）バッファー（和光純薬工業（株）製）で洗浄し、この洗浄液もまとめたチューブに加えた。以上のように培養物を集約したチューブを、室温にて、5,000rpm（遠心機名：KUBOTA3740、ローター番号KUBOTA AF2018、久保田商事（株）製）で５分間遠心した。
【0159】
その後、(i)上清を捨て、沈殿したペレットに、ＰＢＳ（-）バッファーを３ml加えて、(ii)よく攪拌した後、5,000rpmで５分間遠心した。上記の(i)と(ii)とを２回繰り返した。沈殿したペレットに、B-PER Lysis バッファ（Reagent社製）を４mL加え、蓋を締めて室温にて一晩シェーカーで攪拌した。【0160】
（８−３）His-tagによる精製Ni-NTA Agarose（QlAGEN社製）を15mLチューブに２mLとり、(i)1,000rpmで１分間遠心し、(ii)上清を捨てて、１×ＰＢＳバッファーを1mL加えてよく攪拌した。上記(i)と(ii)とを３回繰り返し、Ni-NTA樹脂を調製した。
【0161】
上記B-PER Lysis バッファ溶液が入ったチューブを、12,000rpmで10分間、室温にて遠心した後、上清を15mLのファルコンチューブに移した。ここに、よく撹拌した上記Ni-NTA樹脂400μLを加え、回転シェーカーで10分間、室温にて攪拌した。その後、1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。ここに、(iii)１×ＰＢＳバッファーを４mL加えてよく攪拌し、(iv)1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。(iii)と(iv)とを２回繰り返した。【0162】
その後、(v)20ｍMのイミダゾール（和光純薬工業（株）製）を４mL加えてよく攪拌し、(vi)1,000rpmで１分間、室温にて遠心し、上清を捨てた。(v)と(vi)とを２回繰り返した。ここに、250ｍMのイミダゾールを500μL加え、回転シェーカーで10分間、室温にて攪拌した。その後、1,000rpmで１分間遠心し、緑色蛍光を発している上清を、新しい15mLのファルコンチューブに入れ、次のゲルろ過用タンパク質精製溶液とした。【0163】
（８−４）ゲルろ過による精製上記タンパク質精製溶液中のイミダゾールとPBSバッファーとを置換し、精製して目的の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を得た。以上の操作では、GEヘルスケア・ジャパン株式会社のNAP5カラムを使用し、製品に添付の説明書に従って精製を行った。
【0164】
（９）標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質の選択上記精製作業で得られた標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質濃度の吸光度（280nm）、及び発色団濃度（形成能）の吸光度（488nm）を常法に従って計測し、A488/A280の値が1.5を超えたものを、目的の標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質として選択した。結果を表１２に示した。
【0165】
【表12】
【0166】
（実施例３）標的ペプチド配列結合凝集体（蛍光タンパク質会合駆動型ミセル）の作製タンパク質としてＧＦＰに代えて、実施例２で調製した標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質を用いて、実施例１と同様にして、標的ペプチド配列が結合したミセル（蛍光タンパク質会合駆動型ミセル）を作成した。
【0167】
（１）発光特性上記作製した標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質会合駆動型ミセルの発光特性を、実施例１と同様にして測定した（図１０参照）。図１０の凡例中、反応物は、シロールデンドリマーと標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質が結合した複合体を、未反応物は、それらが結合していない状態のものを示し、各数値は励起光の波長（ｎｍ）を示す。標的ペプチド配列結合ミセルでも、実施例１と同様に、５１０ｎｍ付近に発光のピークが観察された。
【0168】
（２）粒子特性上記標的ペプチド配列結合リポソーム又はミセルの粒子特性を、実施例１と同様に動的光散乱法により測定した（図１１参照）。図１１中、横軸は得られたミセルの粒径を、縦軸は各横軸に示すサイズのミセルの全体に占める％を表す。その結果、実施例１と同様に、およそ１００ｎｍ〜２００ｎｍの粒子径を有する粒子が確認された。
以上から、標的ペプチド配列を有する蛍光タンパク質結合ミセルも、標的配列を有しないそれと同等のミセルを形成することが示された。さらに、実施例１で得られたミセルも、本実施例で得られたミセルのいずれもが、蛍光タンパク質の会合によって形成される、蛍光タンパク質会合駆動型ミセルであると推定された。
【0169】
（実施例４）ＤＤＳミセル・リポソーム（ベジクル）形態判定実験（１）基本リポソーム又はミセルの作製
リポソーム又はミセルを以下のようにして作製した。まず、GFP含有溶液を、10K アミコンフィルタカラム（Amicon社製）を用いて、14,000ｘgで15分間遠心して濃縮し、1 x PBSを加えて99μLにメスアップした。20μMのGFP含有溶液を使用して、50μM/50μLのミセルを作製するために、137.5μLのGFPを濃縮した。
【0170】
次いで、この溶液に1μLの100mMのDTTを加え、室温にて10分間インキュベーションした。インキュベートした溶液の全量をNICKカラム（GEヘルスケアジャパン社製）にアプライし、365μLの1 x PBSを加えた。さらに、380μLの1ｘPBSを加えて、ほぼ全量を回収した。【0171】
次いで、回収した溶液中に含まれるGFPに対して、7.78 mMのTPS（2，3，4，5−テトラフェニル−1，1−ジメチルシロール）を、モル比で1:10になるように3.53 μL加え、37℃にて終夜、溶液中の分子を凝集させた。次いで、終夜で凝集させた約380 μLの溶液全量を100 Kアミコンフィルタカラムに入れ、14,000 x gで10分間遠心して濃縮し、約30μLをカラム上液として取った。ここに100 μLの1 x PBSを加えて14,000 x gで10分間遠心して洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返し、洗浄液約300 μLを集めた。
【0172】
14,000 x gで10分間の遠心後、カラムを逆さまにして卓上遠心機にてカラムの上液を回収した。空になったカラムに適量の1 x PBSを加え、目的としていた体積の1.2倍となるように1 x PBSでメスアップした。4℃にて1日置いて平衡化し、20倍に希釈して粒度を測定した。また、蛍光測定は島津:RF5300-PCを用いて、励起波長370 nm、測定波長488 nmとし、80倍希釈のサンプルを測定した（レンジは3 x 5）。【0173】
また、100 Kアミコンフィルタカラムに入れて14,000 x gで10分間遠心した後の溶液のうち、約350 μLをカラム下液とした。上記の洗浄液を合わせて650 μLとし、20倍に希釈して、粒度を測定した。また、蛍光測定は、励起波長370 nm、測定波長488 nmとし、25倍希釈のサンプルを測定した（レンジは3 x 5）。ここで得られた未標的型リポソーム又はミセルを、NSS25及びNSS26と命名した。【0174】
（２）電子顕微鏡による判定結果低温低真空走査型電子顕微鏡（日立ハイテクノロジー社製、カタログ番号 S-3400N）を用いて、リポソーム又はミセルの判別を行ったところ、概ね観察された分子はリポソーム（ベジクル）であった。液体窒素雰囲気下で切片の観察を行なった。
【0175】
この電子顕微鏡では、入射電子ビームの反射電子像をBSE像として、また虹電子像をSE像として得た。また、X線による元素分析も同時に行った。BSE像を図12(A)〜(C)に示した。図中、白い円及び白い矢印で示した構造物は、塩の結晶であると考えられた。また、黒の円及び黒の矢印で示した構造物は、ベジクル様物質と思われた。低解像度の走査型電子顕微鏡画像では主にベジクル型様分子が多く観察された。その一部に元素分析を行ったところケイ素が検出された分子もあった（図12参照）。【0176】
（実施例５）リポソーム（ベジクル）或はミセルの濃度依存的安定性試験（１）試料ミセル（標的結合部位を有するミセル）の作製
50μM x 50μL分の試料ミセルを、以下のようにして作製した。基本ミセルとして、上記実施例４で作製した未標的型ミセル（NSS25及びNSS26）を、それぞれ16.1μM及び31.6μM使用した。標的認識部位としてMCF7の配列を含む標的型ミセル（配列表の配列番号12及び13）を11.3μM使用した。
【0177】
上記の各リポソーム又はミセルを含むミセル溶液を、それぞれAmicon 10Kフィルタに入れ、14,000 x g で15分間遠心し、上清をそれぞれ回収した。各ミセル溶液を1 x PBSで99μLにメスアップし、1 mMのDTTを1μL加えて10分間室温にて静置した。ついで、各リポソーム又はミセル溶液をNICKカラムで処理し、得られた各処理液にTPSを3.21μL加え、37℃で終夜置いた。
【0178】
（２）リポソーム（ベジクル）或はミセルの濃度依存性の確認上記（１）のようにして得た各ミセル溶液を、それぞれ380μLずつAmicon 100Kフィルタに入れ、14,000 x g で10分間遠心した。約350μLがフィルタを抜けて落ちるため、これを下液、フィルタ上に残った約30μLを上液とした。
【0179】
上液をそのまま残し、ここに100μLの 1 x PBSを加えて、14,000 x gで10分間遠心し、フィルタを抜けた約100μLの溶液を回収した。この操作を3回繰り返して、得られた溶液を下液と合わせ、20倍希釈して基本ミセルと同様にDLS（粒度分布）を測定した。【0180】
上液を含むフィルタを卓上遠心機（KUBOTA社製）にかけて、2〜3分間遠心して回収した。ついで、空になったフィルタに適量の1 x PBSを加えて10分間静置した。その後、このフィルタを逆さまにして卓上遠心機にかけて2〜3分間遠心し、フィルタ内の溶液を回収し、1 x PBSを加えて60μLにメスアップし、50μM/50μLの原液（1x）とした。【0181】
この原液を1xPBSで5倍、10倍、及び50倍希釈し、平衡化するために室温にて1日置いた。その後、基本ミセルの場合と同様にして、粒度測定及び蛍光測定を行った。臨界ミセル濃度以上で作成されたミセルは、1ヶ月後でも安定に存在する可能性があることが示された。【0182】
（実施例６）ＤＤＳミセルの構成タンパク質物性確認試験（１）タンパク質の精製
上記のミセルの構成タンパク質の物性を確認するために、Ni NTA Super flow（Qiagen社製）を用いて上記構成タンパク質を以下の手順で精製した。
【0183】
（１−１）タンパク質の凝集分子からの溶出まず、基本ミセル（50μM/50μL）を50μL取って50mLのファルコンチューブ（ファルコン社製）に入れ、20mMのイミダゾールで洗浄し、その後、250mMのイミダゾールを加えた。回転シェーカーで終夜反応させ、ミセルからタンパク質を溶出させた。このファルコンチューブをそのまま遠心機（KUBOTA社製）にセットして、12,000 rpmで10分間遠心し、得られた上清を15mLのファルコンチューブに移した。
【0184】
（１−２）Ni NTA樹脂スラリーの調製上記のようにファルコンチューブを遠心している間に、Ni NTA樹脂（Ni NTA Super flow中に含まれている）の準備を行なった。まず、Ni NTAアガロースを2.5 mL取り、防腐剤を除去した。次いで、Ni NTAアガロースゲルを含むこの溶液を、よく振って均一に混合し、15mLのファルコンチューブに移した。
【0185】
その後、卓上遠心機にて、1,000rpmで1分間遠心してゲルを沈殿させ、上清をピペットで除き、1xPBSを1mL加えて振り混ぜ、ボルテックスした。この操作を3回繰り返した。3回目の遠心後に上清をピペットで除き、スラリーとした。使用する分以外は、4℃にて保存した。【0186】
（１−３）各タンパク質の精製15mLのファルコンチューブ中の上記の構成タンパク質溶液中に、上記スラリーがチューブの内壁につかないように注意しながら、400μLを滴下した。その後、回転シェーカーにセットして最速にメモリを合わせて10分間反応させた。
【0187】
ついで、回転シェーカーからチューブを外し、動物細胞用遠心機（TAITEC社製）にて1,000 prmで1分間遠心し、上清を捨てた。チューブの底に残っているペレットに1xPBSを4mL加えてボルテックスし、上記遠心機を用いて1,000rpmで1分間遠心した。この操作を2回繰り返した。【0188】
得られたペレットに20mMのイミダゾールを4mL加えてボルテックスし、上記遠心機を用いて1,000rpmで1分間遠心した。この操作を2回繰り返した。次いで、得られたペレットに250mMのイミダゾールを500μL加え、回転シェーカーにセットして最速にメモリを合わせて10分間反応させた。ついで、回転シェーカーからチューブを外し、上記動物細胞用遠心機にて1,000 prmで1分間遠心し、上記の新しい15 mLのファルコンチューブに移した。【0189】
古いチューブに残ったペレットに250mMのイミダゾールを再度加え、回転シェーカーにセットして最速にメモリを合わせて5分間反応させた。ついで、回転シェーカーからチューブを外し、上記動物細胞用遠心機にて1,000 prmで1分間遠心し、上清をとって先ほどの上清と合わせた。この操作を5回繰り返した。【0190】
（１−４）ゲル電気泳動以上のようにして精製した各タンパク質（GFP）についてゲル電気泳動を以下のようにして行った。まず、5μMの各タンパク質を含む溶液を約10μLずつ準備し、1.5mLの蓋付きチューブに入れた。分子量マーカー（ラダー）として、Precision Protein Standards Prestained Broad Range（BioRad社製）も10μLを取って、同様に1.5mLチューブに入れた。下記表13に示す組成のランニングゲル（12％）及び表14に示す組成のスタッキングゲル（4％）を調製した。
【0191】
【表13】
【0192】
【表14】
【0193】
各精製タンパク質溶液及び分子量マーカーをアプライし、200V、20mAで60分、泳動させ、その後、さらに75分泳動させた。また、以下の表15に示す組成を有する泳動バッファを使用した。【0194】
【表15】
【0195】
結果を図19に示す。図19 （A)は染色前、(B)はクマシーブリリアントブルー（CBB）で染色した結果である。ゲル電気泳動結果から、標的タイプ２型（MCF7-2）は、カルボシランデンドリマーで構成される籠状構造が締まっているため、蛍光強度は強いが標的性が低いことが明らかになった。また、タイプ１強化型（MCF7-1＋αスタンド）では、上記の籠状の構造が緩く、標的性は高いが蛍光が弱いことが明らかになった。以上から、籠状構造の締まり方と、標的認識部位の構造とが重要であることが示された。
【0196】
（実施例７）ＤＤＳリポソーム又はミセルへの薬剤内包実験内包させる薬剤として、orange0Tを使用した。80μMのGFP含有溶液を使用し、7.78mMのTPSを10.28μL炭化した以外は、上記基本ミセルの作製工程と同じ手順でミセル溶液を調製した。ついで、OrangeOT（8mMのOrangeOTのストック溶液）を、GFPに対して、モル比（終濃度）で1:1となるよう1μL加えた。次いで、DiI282（400μMのDiI282のストック溶液）を、GFPに対して、モル比（終濃度）で20:1になるよう加え、37℃にて終夜で取り込ませた。
【0197】
次いで、カラムの上液を、目的としていた体積の1.2倍となるように1ｘPBSでメスアップした後に、PVDFフィルタ（孔径0.45μm又は0.22μm）に通す点を除いて、基本ミセルの作製と同じ手順で処理して回収し、同じ希釈倍率で、粒度及び蛍光測定を行った。上液については、基本リポソーム又はミセルの作製と同じ手順で処理し、同じ希釈倍率で、粒度及び蛍光測定を行った。薬剤の内包は疎水性、親水性物質ともに可能と思われるがミセル形成条件の最適化が各々必要であると考えられた。【0198】
（実施例８）ＤＤＳリポソーム又はミセルの細胞取込み実験（１）実験方法
コンフレントになっているMCF7細胞を、0.25% trypsin溶液にて剥がし、細胞懸濁液（1x109個/mL）を調製した。この細胞懸濁液を、3mLずつ、コラーゲンコードディッシュ（MatTek社製）又はポリ-d-リジンディッシュ（MatTek社製）に、5枚ずつ播種した。
【0199】
細胞がウェルの底面に付着した後に、各ウェルから培地をピペットで除き、適当量のDMEM(+)を加えて付着細胞は剥がさないように洗浄する操作を3回繰り返した。【0200】
3時間及び24時間観察用のコラーゲンコートディッシュの各ウェルに、450μLのDMEM(+)を加えた。次いで、陰性対照のウェルに、1xPBSを50μL加えた。7.3μLのタイプ１強化型のストック溶液に42.7μLの1xPBSを加えて50μLとしたサンプル1を、ディッシュ2枚の各ウェルに加えた。また、8.4μLの未標的型のストック溶液に41.6μLの1xPBSを加えたサンプル2を別の2枚のディッシュに加えた。【0201】
ポリ-d-リジンディッシュの陰性対照のウェルにも、1xPBSを50μL加えた。また、24時間観察用の1枚のディッシュに、8.1μLの未標的型（NSS26）のストック溶液に41.9μLの1xPBSを加えたサンプル2を加えた。直後に写真撮影を行ない、37℃5％CO2の存在下にて、3時間又は24時間の培養を行なった。培養終了後に、1mLのDMEM(+)を加えて細胞を洗浄した。この操作を3回繰り返した。【0202】
（２）共焦点顕微鏡FV-100（Olympus社製 FV 1000D）による観察結果DAPIについては405nmのレーザーで励起し、460nmの発光を観察して、デンドリマーの部分を観察した。また、GFP部分は515〜520nmの発光を観察した。観察結果を図20A〜20Cに示す。図20(A)及び図20(C)の上段はいずれも取込み実験の開始後３時間、下段は24時間の蛍光顕微鏡像である。3時間の結果（図20C上段）と24時間の観察結果（図20C下段）とを比較したところ、24時間でも、標的性を持たせたミセルの方が、標的細胞に正しく取り込まれているように思われた（図16〜18参照）。
図16(A)及び18(A)は未標的型（NSS25）の結果を、また、図16(B)及び18(B)は未標的型（NSS26）の結果をそれぞれ示す。図18(C)は標的タイプ１型ミセルの結果を示す。
【0203】
（３）解析方法解析ソフトにはImage Jを用いた。それぞれのエリアの蛍光強度を数値化し、ミセルの蛍光強度と蛍光タンパク質の蛍光強度の比率より、ミセルの崩壊、蛍光タンパク質の残存を確認するに至った。
【0204】
FACSの計測に関して解析用ソフトウェアとしてFlowJoを使用した。解析に当たっては、細胞のみのデータを使用し、自家蛍光している細胞集団を選択した。また、全てのデータから自家蛍光している細胞集団を差し引いた。結果を図13〜15に示した。【0205】
図13(A)は、HepG2標的タイプ１型タンパク質(-)(-)及びMCF7標的タイプ１型タンパク質(-)(-)の取り込みを、また、図13(B)は、HepG2標的タイプ１型タンパク質(+)(+)及びMCF7標的タイプ１型タンパク質(+)(+)の取り込みを示す。図13(C)は、HepG2標的タイプ１型ミセル(-)(-)及びMCF7標的タイプ１型ミセル(-)(-)の取り込みを、また、図13(D)は、HepG2標的タイプ１型タンパク質(+)(+)及びMCF7標的タイプ１型タンパク質(+)(+)の取り込みを示す。【0206】
図14(A)はミセルなし、(B)及び(C)は未標的型ミセルを使用した場合、(D)及び(E)は標的型ミセルを使用した場合の結果を示す。図15(A)〜(E)で使用したミセルは、図14と同様である。図中に示した数字は、自家蛍光を差し引いた残りの細胞数/全測定細胞数である。下記の表16に、自家蛍光の細胞集団を５通り判定しその平均を示した。【0207】
【表16】
【0208】
以上より、細胞のコンディションが良ければ標的化されること、及び、長時間の細胞へのミセルの接触は未標的ミセルも一般的なエンドサイトーシスにて大量に取り込まれることが示された。ただし、標的化型のミセルの方が非標的化型のものよりも速く取込まれる可能性がある。また、取り込まれたミセルは細胞内で壊れ得ると考えられた。【0209】
（実施例９）Tris塩酸バッファ中での蛍光タンパク質会合駆動型ミセル形成実施例１のミセル作製時に使用していたPBSに代えて、Tris塩酸バッファを用いて本願の蛍光タンパク質会合駆動型ミセルを作製した。まず、実施例２で調製した配列番号１のペプチド配列を、50μM含む標的ペプチド配列結合蛍光タンパク質（以下、「MCF7-1蛍光タンパク質」ということがある）を調整し、その溶液の219.2μLを、10K アミコンフィルタカラム（Amicon社製）を用いて、14,000ｘｇで15分間遠心して濃縮し、50mM Tris塩酸バッファ(pH8.0)を加えて、99μLにメスアップした。
【0210】
次いで、この溶液に100mM DTTを1μL加え、室温で10分間インキュベーションした。インキュベーションした溶液の全量（100μL）を、予め0.05M Tris塩酸バッファ(pH8.0)で5回洗浄しておいたNICKカラム（GEヘルスケアジャパン社製）にアプライし、0.05μM Tris塩酸バッファ(pH8.0)を365μLで溶出した。さらに、0.05M Tris塩酸バッファ(pH8.0)を380μL加えて溶出させ、溶出液のほぼ全量を回収した。【0211】
回収した溶液に、7.78mM TPS（（株）ヨーユーラボ製）を10.28μL加えて10分間撹拌した後、37℃にて終夜、溶液中の分子を凝集させ、ミセル反応液とした。上記ミセル反応液を100K アミコンフィルタカラム（Merck社製）に入れ、14,000ｘｇで10分間遠心して濃縮し、その後、このフィルタ付きカラム上液に1ｘPBSを加えて14,000ｘｇで10分間遠心して洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返してバッファ交換を行った。約300μLの洗浄液を回収し、これらをまとめてミセル未反応液とした。【0212】
100K アミコンフィルタカラムをさかさまにして小型遠心機で遠心し、カラム上液（精製ミセル液）を回収し、空になったアミコンフィルタカラムに適量の１ｘPBSを加えて10分静置した。再度アミコンフィルタカラムを逆さまにして、遠心、回収後１ｘPBSを加えて160μLにメスアップし、精製ミセル液を得た。形成されたミセルの粒径及び溶液中での安定性を確認するために、以下の実験を行った。【0213】
得られた精製ミセル液を１ｘPBSを用いて20倍希釈した測定用試料1、及び50倍希釈した測定用試料2をそれぞれ調製した。ミセル未反応液を１ｘPBSで25倍希釈して測定用試料3とした。これらの希釈液は、溶液中における安定性を検討するために、室温にて4日間静置した。【0214】
測定用試料1中の粒子の粒径は、ZETASIZER NANO-S（マルバーン社製）を用いて測定した。その結果、約100〜200nmの均一なミセルが形成されていることが示された（図21）。測定用試料2中の粒子の蛍光スペクトルは、RF5300-PC（（株）島津製作所製）を用いて、励起波長370nm、測定波長488nmとして測定した。測定用試料3に含まれる粒子の蛍光スペクトルは、測定試料2と同様の条件で測定した。【0215】
図22Aに上記測定試料1〜3の調整時の測定結果を、また、図22Bにそれらの４日後の測定結果を示す。また図中、未反応物はMCF7-1蛍光タンパク質とSDとが未結合状態のものを示し、反応物はそれらが結合している状態のものを示す。各数値は励起光の波長（nm）を示す。図22A及び22Bより、MCF7-1蛍光タンパク質とSDとが結合したミセルが形成されていること、及び形成されたミセルは4日後でも安定して存在していることが確認された。【0216】
以上のことから、本発明のSDは、Tris塩酸バッファ中でも標的提示配列を有するGFPと結合して、均一で安定したミセルを形成することが確認された。【0217】
（実施例10)HEPES バッファを中での蛍光タンパク質会合駆動型ミセル形成Tris塩酸バッファ(pH8.0)を50mM HEPES バッファ(pH7.6)に代えた点を除いて、実施例９と同様の条件下に、バッファ中におけるミセル形成、形成されたミセルの粒径及び安定性を確認した。
【0218】
図23に示すように、約100〜200nmの均一なミセルが形成されていた。また、図24に示すように、ミセル作製後1日を経過しても、ミセルが安定して存在していた。図25（A）はミセル作製時、（B）はミセル作製後1日目に測定した結果を示す。【0219】
図25A及び25Bに示すように、蛍光測定結果より、MCF7-1蛍光タンパク質とSDとが結合したミセルが形成されていること、ミセル作製後1日は当該ミセルが安定に存在していることが確認された。【0220】
以上より、Tris塩酸バッファに代えてHEPES バッファを使用した場合でも、均一で安定したミセルが形成されることが確認された。【0221】
（実施例11）クエン酸ナトリウムバッファ中での蛍光タンパク質会合駆動型ミセル形成Tris塩酸バッファ(pH8.0)に代えて50mM クエン酸ナトリウムバッファ（pH7.6）を用いた点以外は実施例９と同様の条件として、バッファ中におけるミセル形成、形成されたミセルの粒径及び安定性を確認した。
【0222】
図26に示すように、クエン酸ナトリウムバッファ中でも、約100〜200nmの均一なミセルが形成されていた。また、図27に示すように、ミセル作製から1日を経過しても、粒径にほぼ変化はなく、このバッファ中でミセルが安定に存在することが示された。【0223】
図28(A)はミセル作製時、(B)はミセルを作製して1日経過後、及び（C）はミセルを作製して2日経過後の測定結果である。図28(A)〜28(C)に示すように、MCF7-1蛍光タンパク質とSDとが結合したミセルが形成されていること、少なくともミセル形成後2日目までは当該ミセルは安定に存在していることが示された。以上より、Tris塩酸バッファに代えてクエン酸ナトリウムバッファを使用した場合でも、均一で安定したミセルが形成されることが確認された。
【0224】
（実施例12）炭酸‐重炭酸バッファ中での蛍光タンパク質会合駆動型ミセル形成Tris塩酸バッファ (pH8.0)を炭酸‐重炭酸バッファ（pH8.0）に代えた点以外は実施例９と同様の条件として、バッファ中におけるミセル形成、形成されたミセルの粒径及び安定性を確認した。
【0225】
図29〜30に示すように、炭酸‐重炭酸バッファ中でも約100〜200nmの均一なミセルが形成されること、また、ミセル作製から1日を経過しても粒径にほぼ変化はなく、当該ミセルはバッファ中で安定して存在することが示された。【0226】
図31(A）はミセル作製時、（B）はミセルを作製して1日経過後、及び（C）はミセルを作製して2日経過後に、それぞれ測定した結果を示す。図31(A)〜31(C)に示すように、MCF7-1蛍光タンパク質とSDとが結合したミセルが形成されていること、形成されたミセルは、少なくとも調製後2日目までは安定して存在していることが確認された。【0227】
（実施例13）分散媒中のタンパク質のミセルに対する影響生体内における送達時に併存するタンパク質が形成されたミセルに対してどのような影響を及ぼすかについて検討するために、in vitroで試験を行なった。モデル系として、分散媒に含まれるタンパク質（BSA）のミセル形成に対する影響を経時的に検討した。GFPと同程度の分子量を有すること、及び血中に多く含まれるタンパク質であること、及び入手しやすいことから、BSAを選択した。
【0228】
先ず、実施例３で作製した、50μMの蛍光タンパク質駆動型ミセル（MCF7-1を標的提示配列として有する、以下、「MCF7-1ミセル」ということがある）を、100K アミコンフィルタカラムで濃縮し、100μMのMCF7-1ミセル液を作製した。【0229】
続いて、200μLの100μM MCF7-1ミセル液に100μLの4% BSA（SHIGMA-ALDRICH社製）を加えて、BSA‐ミセル混合液（試料）を調製した。また、コントロールには、100μLのPBSを加え、PBS‐ミセル混合液（対照）を調製した。これらの調製時及び4℃で保存後の試料及び対照の粒径及び溶液中でのミセル安定性を、実施例９と同様の条件下で行った。【0230】
図31及び33に示すように、約50〜200nmの粒径のミセルが形成されていた。また、4℃で保存した場合、6日後でもミセルの粒径に変化はなく、安定した状態で存在していることが示された。【0231】
図34（A）は保存開始時、（B）は6日間保存した後に測定したグラフである。図34Aに示すように、BSA‐ミセル混合液でもミセルの状態に影響は見られなかった。図34Bに示すように、370nmのPBS-ミセル混合液の蛍光強度よりもBSA-ミセル混合液の蛍光強度の方が若干高く、保存6日後でも、BSAが存在していてもミセルの状態に影響がないことが確認された。以上より、分散媒中にタンパク質が存在していても、少なくとも6日間はミセルが安定に存在することが示された。
【0232】
（実施例14）ミセルの細胞内への取込み経路の検討エンドサイトーシス阻害剤を使用して、本発明のミセルの細胞内への取込み経路を調べた。先ず、コンフルエントになっているMCF−７細胞を、0.25% トリプシン溶液にて剥がし、細胞懸濁液（1x109個/mL）を調製した。この細胞懸濁液を、1.5mLずつ、35mm dish(12 穴連結シャーレ使用)に播種した。
【0233】
細胞がウェルの底面に付着した後に、各ウェルから培地をピペットで除き、適当量のDMEM(+)を加えて付着細胞を剥がさないように洗浄した。この操作を3回繰り返した。【0234】
各ウェルに440μLのDMEM(+)を加え、PBSで調製した1mM クロルプロマジン（和光純薬工業（株）製）、DMSO又はエタノールで調製した500mM メチル‐β‐シクロデキストリン（和光純薬工業（株）製）、並びにDMSO又はエタノールで調製した1mM サイトカラシンＢ（和光純薬工業（株）製）を、それぞれ別々のウェルに30μL加え、37℃にて、5％CO2のインキュベータ中にて30分間インキュベートした。【0235】
その後、実施例３で作製した50μM MCF7-1ミセルを各ウェルに50μL加え、37℃にて5％CO2のインキュベータ中にて6時間〜7.5時間培養した。培養終了後に、1mLのDMEM(+)を加えて細胞を洗浄した。この操作を3回繰り返した。【0236】
FACSを用いてミセルの細胞への取込み率及び蛍光寿命の相関を調べた。図35に示すように、結果、ミセルの細胞取込み率と蛍光寿命には正の相関があった。【0237】
また、表17に示す阻害剤の調製に使用した溶媒と、FACS測定時に使用した溶媒とを組み合わせた各溶媒のセットを調製し、FACS測定時に用いる溶媒の影響を検討した。【0238】
【表17】
【0239】
図36に示すように、メチル‐β‐シクロデキストリン又はサイトカラシンBで処理した細胞の場合、ミセルの細胞取込み率が100％を下回り、細胞内への取込みが阻害されていた。一方、クロルプロマジン処理細胞では、ミセルの細胞への取込み率が100％を上回り、細胞内への取込みが促進されていた。以上より、ミセルの細胞への取込み経路は、カベオラエンドサイトーシス、脂質ラフトエンドサイトーシス、ファゴサイトーシス又はマクロピノサイトーシスであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【0240】
本願発明は、医薬製剤分野、特に薬剤送達の分野において有用である。【配列表フリーテキスト】
【0241】
配列番号１：GFPに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-1）配列番号２：GFPに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-2）
配列番号３：GFPに組み込む標的認識配列ペプチド（MCF7-1＋αスタンド）
配列番号４：MCF7-1を組み込んだGFP
配列番号５：MCF7-2を組み込んだGFP
配列番号６：MCF7-1＋αスタンドを組み込んだGFP
配列番号７：GFPのアミノ酸配列
配列番号８：GFPのアミノ酸配列
配列番号９：ＢＦＰのアミノ酸配列
配列番号１０：ＹＦＰのアミノ酸配列
配列番号１１：イソギンチャクモドキ由来の蛍光タンパク質のアミノ酸配列
配列番号１２：MCF7-1の増幅用フォワードプライマー
配列番号１３：MCF7-1の増幅用リバースプライマー
配列番号１４：MCF7-2増幅用フォワードプライマー
配列番号１５：MCF7-2増幅用リバースプライマー
配列番号１６：MCF7-1＋αスタンド増幅用フォワードプライマー
配列番号１７：MCF7-1＋αスタンド増幅用リバースプライマー
配列番号１８：インバースPCR用フォワードプライマー
配列番号１９：インバースPCR用リバースプライマー
配列番号２０：インバースPCR用フォワードプライマー
配列番号２１：インバースPCR用リバースプライマー
配列番号２２：オリゴヌクレオチド
配列番号２３：オリゴヌクレオチド
配列番号２４：オリゴヌクレオチド
配列番号２５：オリゴヌクレオチド
配列番号２６：インバースPCR用フォワードプライマー
配列番号２７：インバースPCR用リバースプライマー
配列番号２８：インバースPCR用フォワードプライマー
配列番号２９：インバースPCR用リバースプライマー
配列番号３０：インバースPCR用フォワードプライマー
配列番号３１：インバースPCR用リバースプライマー
配列番号３２：インバースPCR用フォワードプライマー
配列番号３３：インバースPCR用リバースプライマー
配列番号３４：インバースPCR用フォワードプライマー
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【配列表】
[この文献には参照ファイルがあります.J-PlatPatにて入手可能です(IP Forceでは現在のところ参照ファイルは掲載していません)]